RS59380B1 - Jedinjenja za ciljanje isporuke leka i pojačavanje sirnk aktivnosti - Google Patents

Jedinjenja za ciljanje isporuke leka i pojačavanje sirnk aktivnosti

Info

Publication number
RS59380B1
RS59380B1 RSP20191142A RS59380B1 RS 59380 B1 RS59380 B1 RS 59380B1 RS P20191142 A RSP20191142 A RS P20191142A RS 59380 B1 RS59380 B1 RS 59380B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
peg
retinoid
bis
mmol
sirna
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
C Nagarajan Sridhar
Priya Karmali
Joseph E Payne
Zheng Hou
John A Gaudette
Victor Knopov
Richard P Witte
Mohammad Ahmadian
Loren A Perelman
Yasunobu Tanaka
Violetta Akopian
Yoshiro Niitsu
Original Assignee
Nitto Denko Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nitto Denko Corp filed Critical Nitto Denko Corp
Publication of RS59380B1 publication Critical patent/RS59380B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/32—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C07C235/34—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/08—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/06—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C213/00—Preparation of compounds containing amino and hydroxy, amino and etherified hydroxy or amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C213/06—Preparation of compounds containing amino and hydroxy, amino and etherified hydroxy or amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton from hydroxy amines by reactions involving the etherification or esterification of hydroxy groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C213/00—Preparation of compounds containing amino and hydroxy, amino and etherified hydroxy or amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C213/08—Preparation of compounds containing amino and hydroxy, amino and etherified hydroxy or amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton by reactions not involving the formation of amino groups, hydroxy groups or etherified or esterified hydroxy groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C231/00—Preparation of carboxylic acid amides
    • C07C231/02—Preparation of carboxylic acid amides from carboxylic acids or from esters, anhydrides, or halides thereof by reaction with ammonia or amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C231/00—Preparation of carboxylic acid amides
    • C07C231/12—Preparation of carboxylic acid amides by reactions not involving the formation of carboxamide groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/22—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton having nitrogen atoms of amino groups bound to the carbon skeleton of the acid part, further acylated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C319/00—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides
    • C07C319/14—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of sulfides
    • C07C319/20—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of sulfides by reactions not involving the formation of sulfide groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/52—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/60—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton with the carbon atom of at least one of the carboxyl groups bound to nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C333/00—Derivatives of thiocarbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C333/02—Monothiocarbamic acids; Derivatives thereof
    • C07C333/04—Monothiocarbamic acids; Derivatives thereof having nitrogen atoms of thiocarbamic groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNE REFERENCE KOJE UPUĆUJU NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava se poziva na United States Provisional Application Nos.61/494,840 i 61/494,710, koje su podnete 08.06.2011. godine.
PODRUČJE TEHNIKE
[0002] Ovaj pronalazak je usmeren na jedinjenje za olakšavanje isporuke leka i kompoziciju koja sadrži takvo jedinjenje.
POZADINA OVOG PRONALASKA
[0003] Fibrozu jetre mogu izazvati aktivirane stelatne ćelije jetre (HSC), što dovodi do deponovanja mnoštva vrsta molekula kolagena i fibronektina u crevnom tkivu. Ovo može da dovede do ciroze jetre, otkazivanja jetre, i/ili hepatocelularnog karcinoma. Dalje, hronični pankreatitis nastaje kao rezultat fibroze pankreasa istim mehanizmom kao što je onaj kod fibroze jetre (Madro, et al., 2004; Med Sci Monit.
10:RA166-70.; Jaster, 2004, Mol Cancer.6:26). Štaviše, stelatne ćelije su prisutne u poremećajima glasnih žica i ždrela kao što su polipi na glasnim žicama, fibroza sluznice glasne žice, i laringalna fibroza. Da bi se fibroza u ovim organima i bilo gde u organizmu sprečila ili lečila, postoji želja za razvojem nosača leka i kompleta za nosač leka.
[0004] Stelatne ćelije predstavljaju jedan od važnih ciljnih kandidata za lečenje fibroze (Fallowfield et al., 2004, Expert Opin Ther Targets.8:423-35; Pinzani, et al., 2004, Dig Jetra Dis.36:231-42). Tokom fibroze, stelatne ćelije aktiviraju citokini iz obližnjih ćelija i one se aktiviraju. Stelatne ćelije su poznate kao ćelije za skladištenje vitamina A, i pripadaju miofibroblastičnoj porodici, i proizvode mnogo faktora koji izazivaju fibrozu jetre.
[0005] Terapeutske metode za sprečavanje ili lečenje fibroze pokušavaju da kontrolišu metabolizam kolagena, unapređenje sistema razgrađivanja kolagena, i inhibiciju aktivacije stelatnih ćelija. Međutim, u svim slučajevima, budući da su specifičnost delovanja i/ili specifičnost organa niske, postoje problemi sa ograničenom efikasnošću i sa neželjenim dejstvima.
[0006] Inhibicija sinteze proteina kolagena nije utvrđena kao terapeutska metoda. Potencija molekula koji ciljaju proizvodnju kolagena je ograničena zbog mogućnosti izazivanja neželjenih dejstava. Inhibicija proizvodnje bi predstavljala očiglednu terapeutsku metodu za sprečavanje ili lečenje fibroze. Da bi se ovo sprovelo, potrebna je kontrola jedne ili više vrsta kolagena Tipa I do IV. Metoda za postizanje ovoga može biti putem HSP47, molekulskog šaperona specifičnog za kolagen koji je od suštinskog značaja za intracelularni transport i molekulsko sazrevanje neophodno za različite vrste kolagena. Stoga, ukoliko se funkcija HSP47 može kontrolisati konkretno u stelatnim ćelijama organa, postoji mogućnost inhibiranja fibroze jetre u tom organu.
[0007] Dostupno je dosta tehnika za isporučivanje terapeutskog agensa kao što je siRNK u ćeliju, uključujući upotrebu sistema viralne transfekcije i sistema neviralne transfekcije. Sistemi ne-viralne transfekcije mogu da uključe, na primer, polimere, lipide, lipozome, micele, dendrimeri, i nanomaterijali. Primeri polimera koji su prethodno ispitivani radi transfekcije ćelije uključuju katjonske polimere kao što su poli(L-lizin) (PLL), polietileneimin (PEI), citosan, i poli(2-dimetilamino)etil metakrilat (pDMAEMA).
[0008] Svaka vrsta sistema ima svoje prednosti i nedostatke. Na primer, viralni sistemi mogu da doprinesu visokoj efikasnosti transfekcije, ali nisu toliko bezbedni kao neki ne-viralni sistemi. Pored toga, viralni sistemi mogu biti komplikovani i/ili skupi za pripremu. Prijavljeno je da ne-sistemi viralne transfekcije, kao što su katjonski polimeri, da prenose DNK plazmide u ćelije. Međutim, neki nedostaci upotrebe katjonskih polimera uključuju njihovu toksičnost za ćelije i/ili njihov nedostatak stabilnosti.
[0009] Budući da je to tako, postoji hitna potreba za novim jedinjenjima, kompozicijama, i metodama korišćenja katjonskih komponenti kako bi se unapredila isporuka terapeutskih lekova, uključujući nukleinske kiseline, do ćelija, tkiva i organizama.
[0010] WO 03/037385 A daje opis konjugata polimera retinoinske kiseline rastvorljivih u vodi. Opisani konjugati se pripremaju kovalentnim dodavanjem ne-peptidnih polimera rastvorljivih u vodi kao što je polietilen glikol retinoidu kao što je retinoinska kiselina. Taj deo polimera konjugata može biti linearan (tj. pripremljen upotrebom s kraja zatvorenih ili metoksi PEG ili linearni dvofunkcionalni PEG), razgranati ili račvast. Opisani konjugati su rastvorljivi u vodi, i određenije, za njih se smatra da su korisni u terapiji inhalacijama kod stanja respiratornog trakta koja reaguju na terapiju retinoidima.
KRATAK PREGLED OVOG PRONALASKA
[0011] Jedan aspekt ovog opisa se odnosi na jedinjenje za olakšavanje isporuke leka do ciljne ćelije kako je naznačeno u zahtevu 1. Poželjni primeri izvođenja ovog pronalaska ovog aspekta su naznačeni u međusobno zavisnim priloženim zahtevima 2 do 4.
[0012] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata jedinjenje za olakšavanje isporuke leka ciljnoj ćeliji kako je naznačeno priloženim zahtevom 5. Poželjni primeri izvođenja ove kompozicije ovog pronalaska su naznačeni u međusobno zavisnim priloženim zahtevima 5 do 10.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0013]
Na Fig.1 je dat prikaz efikasnosti nokdauna određenih primera izvođenja ovog opisa. Ovo uključuje HEDC lipozome u poređenju sa DC-6-14 kontrolama lipopleksa.
Na Fig.2 je dat prikaz in vitro poređenja nokdauna gena upotrebom katjonskog lipida.
Na Fig.3 je dat prikaz procene ekspresije gena in vivo sa primerom HEDODC formulacija lipozoma ovog pronalaska (*označava p<0.05).
Na Fig.4 je dat prikaz procene ekspresije gena in vitro sa primerom HEDC formulacija lipozoma Primera 15. Stupci greške označavaju standardne devijacije (n=3). Sigmoidna doza-odgovor kriva je prikazana na osnovu najboljeg uklapanja. EC50vrednost se izračunava iz krive. Ovo je naznačeno da je 11.8 nM.
Na Fig.5 su prikazani rezultati merenja in vivo upotrebom DMNQ kod modela pacova. Nakon oduzimanja pozadine gp46 mRNK nivoa određenih u „naivnoj“ grupi, sve vrednosti ispitivane grupe su normalizovane do prosečnog gp46 mRNK grupe nosača (izraženo kao procenat grupe nosača). Srednja vrednost gp46 mRNK nivoa nakon lečenja je pokazala odgovor koji je dozno-zavisan i krivu koja se uklapa u sigmoidnu krivu dozno-zavisnog odgovora. Izračunata ED50vrednost iznosi 0.79 mg/kg.
Na Fig.6 su prikazani rezultati merenja in vivo upotrebom DMNC kod modela pacova. Nakon oduzimanja pozadine gp46 mRNK nivoa određenih u „naivnoj“ grupi, sve vrednosti ispitivane grupe su normalizovane do prosečnog gp46 mRNK grupe nosača (izraženo kao procenat grupe nosača). Nivoi MRPL19 mRNK su određuju ogledom sa kvantitativnom RT-PCR (TaqMan®). Niovi mRNK za gp46 se normalizuju do nivoa MRPL19. (*** označava p<0.02.)
Na Fig.7 su prikazani rezultati merenja in vivo upotrebom bleomicina za pluća kod modela pacova. Grafikon sa stupcima daje kratak prikaz fibroze, (T. Ashcroft) obojenih delova pluća metodom Azan za svaku grupu. Statistička analiza je izvedena upotrebom jednosmerne ANOVA, Bonferroni testa za višestruko poređenje sa Prism5 softverom.
Fig.8 Dodavanje VA-konjugata lipozomu putem dekorisanja pojačava aktivnost siRNK
Fig.9 Dodavanje VA-konjugata lipozomu putem zajedničkog rastvaranja pojačava aktivnost siRNK Fig.10 Dodavanje VA-konjugata lipozomu putem zajedničkog rastvaranja pojačava aktivnost siRNK Fig.11 Dodavanje VA-konjugata lipopleksima putem zajedničkog rastvaranja pojačava aktivnost siRNK
Fig.12 Dodavanje VA-konjugata lipopleksima putem zajedničkog rastvaranja nasuprot dekorisanja. Fig.13 in vivo efikasnost kod miša, CCl4model
Fig.14 in vivo efikasnost dekorisanog nasuprot zajednički rastvorenih konjugata retinoida Fig.15 in vitro efikasnost (pHSC), efekat konjugata retinoida u formulacijama sa lipozomima.
Na Fig.16 je prikazana korelacija sadržaja konjugata retinoida (mol%) i in vivo (pacov DMNQ) efikasnosti. Mužjacima Sprague-Dawley pacova su intravenski ubrizgane ili formulacije koje sadrže 0, 0.25, 0.5, 1, i 2% DiVA u dozi od 0.75 mg/kg siRNK, ili PBS (nosač), sat vremena nakon poslednje injekcije DMN.
DETALJAN OPIS ILUSTRATIVNIH PRIMERA IZVOĐENJA OVOG PRONALASKA
[0014] U sklopu područja ovog opisa su jedinjenja formule I
pri čemu su R1i R2nezavisno odabrani iz grupe koju čine C10do C18alkil, C12do C18alkenil, i oleil grupa; pri čemu su R3i R4nezavisno izabrani iz grupe koju čine C1do C6alkil, i C2do C6alkanol; pri čemu je X odabran iz grupe koju čine -CH2-, -S-, i -O-, ili je izostao; pri čemu je Y odabran iz -(CH2)n, -S(CH2)n, -O(CH2)n-, tiofena, -SO2(CH2)n-, i estra, pri čemu je n = 1-4; pri čemu je a = 1-4; pri čemu je b=1-4; pri čemu je c=1-4; i pri čemu Z predstavlja kontrajon.
[0015] Jedinjenja opisana u ovom tekstu se takođe u ovom tekstu odnose na klasu jedinjenja poznatu kao „katjonski lipidi“. Katjonski lipidi su jedinjenja koja uključuju najmanje jednu polovinu lipida i pozitivno naelektrisan azot združen sa kontrajonom. Za"lipide" se u tehnici smatra da obuhvataju hidrofobni alkil ili polovinu alkenila i karboksilnu kiselinu ili polovinu estra.
[0016] Do sada je otkriveno da polovina amino-alkil-hidroksil (-N-alkil-OH) jedinjenja formule I dodeljuje svojstva formulacijama koje sadrže ova jedinjenja koja nisu pre primećena sa drugim katjonskim lipidima koji su prethodno prijavljeni. Formulacije ove vrste koje uključuju jedinjenja formule I dovode do superiornijeg smanjenja ekspresije proteina, u poređenju sa formulacijama koje ne uključuju jedinjenja formule I. Naročito iznenađujuća je sposobnost formulacija ovog pronalaska, koje uključuju jedinjenja formule I, da smanje ekspresiju HSP47.
[0017] Poželjna jedinjenja ovog dela ovog opisa uključuju ona gde R1i R2svako nezavisno predstavlja C10-C30alkil. U poželjnijim primerima izvođenja ovog pronalaska, R1i R2svako nezavisno predstavlja C10-C20alkil. U još poželjnijim primerima izvođenja ovog pronalaska, R1i R2svako nezavisno predstavlja C12-C18alkil. Naročito poželjni primeri izvođenja ovog pronalaska uključuju ona gde R1i R2svako nezavisno predstavlja C13-C17alkil. Najpoželjnija su jedinjenja gde R1i R2svako predstavlja C13alkil.
[0018] U drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, R1i R2svako nezavisno predstavlja C10-C30alkenil. U poželjnijim primerima izvođenja ovog pronalaska, R1i R2svako nezavisno predstavlja C10-C20alkenil. U još drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, R1i R2svako nezavisno predstavlja C12-C18alkenil. U opet drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, R1i R2svako nezavisno predstavlja C13-C17alkenil.
Najpoželjnija jedinjenja ovog dela ovog opisa uključuju ona gde R1i R2svako posebno predstavlja C17alkenil.
[0019] Takođe za jedinjenja formule I, R3i R4su nezavisno izabrani iz grupe koju čine C1do C6alkil. U poželjnim primerima izvođenja ovog pronalaska, R3i R4svako nezavisno predstavlja C1-C3alkil.
Najpoželjnije, R3i R4svako posebno predstavlja metil. U drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, najmanje jedan od R3i R4predstavlja -CH2CH2OH.
[0020] Najpoželjnija su ona jedinjenja formule I pri čemu je a = b = c = 1.
[0021] Z može predstavljati bilo koju koncentraciju azota, budući da se taj izraz lako razume u tehnici.
Poželjni kontrajoni azota uključuju halogene, sa hloridom i bromidom koji su naročito poželjni i mezilat (SO3CH3-). Nasuprot drugih prethodno opisanih katjonskih lipida gde efekat katjonskog lipida zavisi od kontrajona, efikasnost jedinjenja formule I, iznenađujuće, izgleda da nije povezana sa odabranim kontrajonom.
[0022] Primeri jedinjenja formule I
uključuju:
[0023] U područje ovog pronalaska spada jedinjenje za olakšavanje isporuke leka do ciljne ćelije, koje obuhvata strukturu (retinoid)m-veznik-(retinoid)n, pri čemu je retinoid odabran iz grupe koju čine vitamin A, retinoinska kiselina, tretinoin, adapalen, 4-hidroksi(fenil)retinamid (4-HPR), retinil palmitat, retinal, zasićena retinoinska kiselina, i zasićena, demetilisana retinoinska kiselina; i pri čemu m i n nezavisno predstavljaju 2, ili 3;i pri čemu je veznik odabran iz grupe koju čine bis-amido-PEG, tris-amido-PEG, tetra-amido-PEG, Lysbis-amido-PEG-Lys, Lys-tris-amido-PEG-Lys, Lys-tetra-amido-PEG-Lys, Lys-PEG-Lys, PEG2000, PEG1250, PEG1000, PEG750, PEG550, i PEG-Glu.
[0024] Ovaj opis takođe uključuje jedinjenje za olakšavanje isporuke leka do ciljne ćelije, koje obuhvata strukturu (lipid)m-veznik-(ciljni molekul)n, pri čemu je ciljni molekul retinoid ili masni rastvorljivi vitamin koji ima specifičan receptor na ciljnoj ćeliji; pri čemu m i n nezavisno predstavljaju 0, 1, 2, ili 3;i pri čemu veznik obuhvata polietilen glikol (PEG) molekul sličan PEG-u i označen je kao „Formula B“.
[0025] Do sada je otkriveno da jedinjenja Formule A dodeljuju svojstva formulacijama ovog pronalaska koja nisu prethodno primećena. Formulacije ovog pronalaska koje uključuju jedinjenja Formule A dovode do superiornog smanjenja ekspresije gena, u poređenju sa formulacijama koje ne uključuju ova jedinjenja. Naročito je iznenađujuća sposobnost formulacija ovog pronalaska koje uključuju jedinjenja Formule A da smanje ekspresiju HSP47.
[0026] Poželjan primer izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje jedinjenje u kom je Formula A odabrana iz grupe koju čine (retinoid)2-PEG-(retinoid)2, (retinoid)2-bis-amido-PEG-(retinoid)2, (retinoid)2-Lys-bis-amido-PEG-Lys-(retinoid)2.
[0027] U drugom poželjnom primeru izvođenja ovog pronalaska, jedinjenje je predstavljeno formulom
pri čemu q, r, i s svako nezavisno predstavlja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10.
[0028] U drugim poželjnim primerima izvođenja ovog pronalaska, formula ovog jedinjenja obuhvata
[0029] Drugi primeri izvođenja ovog pronalaska uključuju strukture prikazane u Tabeli 1
Tabela 1
[0030] Kompozicije ovog pronalaska mogu obuhvatati najmanje jedno jedinjenje formule I i lipozom i jedan ili više retinoidnih konjugata kako je naznačeno priloženim zahtevima 1 do 4. U poželjnim primerima izvođenja ovog pronalaska, retinoidni konjugat je prisutan u koncentraciji od oko 0.3 do oko 30 masenog procenta, na osnovu ukupne mase kompozicije ili formulacije, što je jednako oko 0.1 do oko 10 mol.%, što je jednako molarnom odnosu od oko 0.1 do oko 10. Retinoidni konjugat predstavlja molekul retinoidveznik-retinoid kako je naznačeno priloženim zahtevima 1 do 4.
[0031] Primer retinoidnih konjugata ovog pronalaska, kako je naznačeno priloženim zahtevom 3, su ona jedinjenja formule II:
gde q, r, i s svako nezavisno predstavlja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10, i njihove enantiomere i diastereomere.
[0032] Poželjna jedinjenja formule II uključuju ona gde q, r, i s svako nezavisno predstavlja 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7. Poželjnija su ona jedinjenja formule II gde q, r, i s svako nezavisno predstavlja 3, 4, ili 5. Najpoželjnija su ona jedinjenja formule II gde q predstavlja 3, r predstavlja 5, a s predstavlja 3. Jedan primer jedinjenja formule II je
[0033] DiVA-PEG-DiVA uključuje stereocentre i smatra se da svi enantiomeri i diastereomeri spadaju u
1
područje ovog pronalaska.
[0034] Koncentracija katjonskih lipida u kompozicijama ovog pronalaska, uključujući i one katjonske lipide formule I, može biti od 1 do oko 80 masenog procenta, na osnovu ukupne mase lipidne kompozicije.
Poželjnije, koncentracija je od 1 do oko 75 masenog procenta. Još poželjnije, koncentracija je od oko 30 do oko 75 masenog procenta. Koncentracija od oko 30 do oko 75 masenog procenta odgovara oko 30 do 60 mol.% i molarnom odnosu od oko 30-60. Najpoželjnije su one kompozicije koje imaju koncentraciju katjonskog lipida od oko 50 masenog procenta. U formulacijama koje sadrže mešavinu katjonskog lipida koji može da jonizuje i katjonski lipid kvaternarnog amina formule I, poželjan mol% je od 5% do 45 mol%, sa još poželjnijom mešavinom od približno 20 mol% katjonskog lipida koji može da jonizuje i 20 mol% katjonskog lipida kvaternarnog amina formule I.
[0035] Takve kompozicije mogu takođe da uključe i vodenu podlogu. Katjonski lipidi, uključujući one od formule I, se mogu inkapsulirati unutar lipozoma u takvim primerima izvođenja ovog pronalaska i mogu biti nepristupačni za vodenu podlogu. Štaviše, katjonski lipidi, uključujući one od formule I, se mogu lokalizovati na spoljašnjoj površini lipozoma i mogu biti pristupačni za vodenu podlogu.
[0036] Kompozicije ovog pronalaska koje uključuju najmanje jedno jedinjenje formule I i lipozom, i retinoidni konjugat kako je naznačeno u priloženim zahtevima 1 do 4, kao što je jedinjenje formule II, takođe mogu da uključe siRNK. U područje ovog pronalaska takođe spadaju i formulacije koje obuhvataju najmanje jedno jedinjenje Formula A i siRNK.
[0037] Predviđeno je da se bilo koji molekul siRNK može koristiti u području ovog pronalaska. siRNK može da uključi antisens sekvencu u mRNK kodirajućoj sekvenci za humani hsp47 što je ilustrovano primerima SEQ ID NO:1, koja je prikazana kao što sledi.
[0038] Na primer,
Sens (5'->3') GGA CAGGCCUCUACAACUATT (SEQ. ID. NO.2)
Antisens (3'->5') TTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU (SEQ. ID. NO.3).
[0039] Takve kompozicije takođe mogu da uključe vodenu podlogu. Takve kompozicije uključujući jedinjenje formule I i siRNK mogu dalje da obuhvataju tečnu podlogu. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, tečna podloga je pogodna za davanje injekcije u živi organizam. Tečne podloge u području ovog pronalaska bilo kog opisanog primera izvođenja ovog pronalaska mogu biti vodene, odnosno, mogu u potpunosti obuhvatati vodeni rastvor, i mogu da uključuju soli, pufere, i/ili druge farmaceutske ekscipijense. U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, tečna podloga može da obuhvata vodeni rastvarač u kombinaciji sa drugim vodenim rastvaračem kao što je, na primer, organski rastvarač. Tečne podloge u području bilo kog opisanog primera izvođenja ovog pronalaska takođe mogu da uključe najmanje jedan organski rastvarač. Organski rastvarači su poznati u tehnici per se i uključuju C1do C4alkohole, dimetil sulfoksid ("DMSO"), i njemu slične. Te tečne podloge koje uključuju mešavinu vode i najmanje jednog organskog rastvarača takođe spadaju u područje bilo kog od opisanih primera izvođenja ovog pronalaska.
[0040] Takođe u područje ovog pronalaska spadaju kompozicije koje obuhvataju najmanje jedno jedinjenje formule A i lipozom. Neki primeri izvođenja ovog pronalaska mogu da uključe mešavine jedinjenja formule I i lipozoma. Drugi primeri izvođenja ovog pronalaska mogu da uključe lipozom i jedno ili više jedinjenja formule I pored katjonskih lipida koji nisu u sklopu formule I.
[0041] U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, siRNK je inkapsuliran lipozomom tako da je siRNK nepristupačna za vodenu podlogu. U drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, siRNK nije inkapsuliran lipozomom. U takvim primerima izvođenja ovog pronalaska, siRNK može obrazovati kompleks na spoljašnjoj površini lipozoma. U ovim primerima izvođenja ovog pronalaska, siRNK je pristupačna za vodenu podlogu.
[0042] Drugi primeri izvođenja ovog pronalaska uključuju nosač leka specifičan za stelatnu ćeliju koji obuhvata lipozomalnu konstrukciju. Ta lipozomalna konstrukcija može da obuhvati lipidnu vezikulu koja obuhvata dvosloj lipidnih molekula. U određenim primerima izvođenja ovog pronalaska može biti poželjno da je molekul retinoida bar delimično izložen spoljašnosti nosača leka pre nego što nosač leka stigne do stelatne ćelije.
[0043] Određeni primeri izvođenja ovog pronalaska omogućavaju lipidnim molekulima da obuhvate jedan ili više lipida odabranih iz grupe koju čine HEDC, DODC, HEDODC, DSPE, DOPE, i DC-6-14. U drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, lipidni molekuli mogu dalje da obuhvate S104.
1
[0044] U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, siRNK je inkapsuliran lipozomom tako da je siRNK pristupačna za vodenu podlogu. U drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, siRNK nije inkapsulirana lipozomom. U takvim primerima izvođenja ovog pronalaska, siRNK može obrazovati kompleks na spoljašnjoj površini lipozoma. U ovim primerima izvođenja ovog pronalaska, siRNK je pristupačna za vodenu podlogu.
[0045] Drugi primeri izvođenja ovog pronalaska uključuju nosač leka specifičan za stelatnu ćeliju koji obuhvata lipozomalnu konstrukciju. Lipozomalna konstrukcija može da obuhvati lipidnu vezikulu koja obuhvata dvosloj lipidnih molekula. U drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, retinoidni molekul prema zahtevima 1 do 4 iz dodatka, je bar delimično izložen spoljašnosti nosača leka pre nego što lek stigne do stelatne ćelije.
[0046] U određenim poželjnim primerima izvođenja ovog pronalaska, retinoid je 0.1 mol% do 20 mol% lipidnih molekula.
[0047] Prethodne kompozicije takođe mogu da uključe PEG-konjugovane lipide, koji su poznati u tehnici per se, uključujući PEG-fosfolipide i PEG-ceramide, uključujući jedan ili više molekula odabranih od: PEG2000-DSPE, PEG2000-DPPE, PEG2000-DMPE, PEG2000-DOPE, PEG1000-DSPE, PEG1000-DPPE, PEG1000-DMPE, PEG1000-DOPE, PEG550-DSPE, PEG550-DPPE, PEG-550DMPE, PEG-1000DOPE, PEG-holesterol, PEG2000-ceramid, PEG1000-ceramid, PEG750-ceramid, i PEG550-ceramid.
[0048] Prethodne kompozicije ovog pronalaska mogu da uključe jedan ili više fosfolipida kao što su, na primer, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin ("DSPC"), dipalmitoilfosfatidilholin ("DPPC"), 1,2-dipalmitoilsn-glicero-3-fosfoetanolamin ("DPPE"), i 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin ("DOPE"). Poželjno, fosfolipid pomoćnik je DOPE.
[0049] Na primer, lipozomi koji spadaju u područje ovog pronalaska se pripremaju upotrebom različitih PEG-lipida, inkorporisanih pomoću metoda zajedničkog rastvaranja opisanih u ovom tekstu. Ove formulacije obuhvataju katjonski lipid:DOPE:holesterol:DiVA-PEG-DiVA:PEG-Lipid (50:10:38:5:2 molarni odnos) i svaka formulacija je ispitana u pHSC in vitro ogledu opisanom u ovom tekstu upotrebom humane/pacovske HSP-47-C siRNK u koncentraciji od 200 nM. Rezultati su prikazani u narednoj tabeli:
[0050] Prethodne kompozicije ovog pronalaska mogu da uključe jedan ili više fosfolipida kao što su, na primer, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin ("DSPC"), dipalmitoilfosfatidilholin ("DPPC"), 1,2-dipalmitoilsn-glicero-3-fosfoetanolamin ("DPPE"), i 1.2-diolkoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin ("DOPE"). Poželjno, lipid pomoćnik je DOPE.
[0051] Pored katjonskog lipida Formule 1, drugi lipidi mogu biti korisni. Oni uključuju katjonske lipide koji mogu da jonizuju, uključujući S104, prikazan dole ispod.
[0052] Formulacije isporuke mogu da se sastoje od katjonskog lipida Formule I u kombinaciji sa katjonskim lipidom koji može da jonizuje. Katjonski lipid koji može da jonizuje može da uključi, npr., S104. Katjonski lipid koji može da jonizuje može biti prisutan u koncentraciji od 0 do 45 mol %, uključujući koncentraciju odabranu od 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, i 45 mol %.
1
[0053] Takođe u područje ovog pronalaska spadaju farmaceutske formulacije koje uključuju bilo koju od gorepomenutih kompozicija ovog pronalaska pored farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača. Farmaceutske formulacije ovog pronalaska uključuju najmanje jedan terapeutski agens. Poželjno, taj terapeutski agens je siRNK. Predviđeno je da se bilo koji molekul siRNK može koristiti u području ovog pronalaska.
[0054] Takođe u područje ovog pronalaska spadaju farmaceutske formulacije koje uključuju bilo koje od gorepomenutih jedinjenja ovog pronalaska kako je naznačeno u zahtevima 1 do 4 iz dodatka pored farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača. Farmaceutske formulacije ovog pronalaska uključuju najmanje jedan terapeutski agens. Poželjno, taj terapeutski agens je siRNK. Predviđeno je da se bilo koji molekul siRNK može koristiti u području ovog pronalaska. Kako je prethodno opisano, siRNK uključuje sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, i SEQ ID NO: 4.
[0055] U poželjnim formulacijama ovog pronalaska uključujući siRNK, siRNK je inkapsulirana lipozomom. U drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, siRNK može biti izvan lipozoma. U tim primerima izvođenja ovog pronalaska, siRNK može obrazovati kompleks izvan lipozoma.
[0056] Koristan opseg katjonskog lipida:siRNK (odnos azota lipida i fosfata siRNK, "N:P") je 0.2 do 5.0. Naročito poželjan opseg N:P je 1.5 do 2.5 za kompozicije i formulacije ovog pronalaska.
[0057] Poželjne formulacije ovog pronalaska uključuju one koje obuhvataju HEDC:S104:DOPE:holesterol:PEG-DMPE:DiVA-PEG-DiVA (20:20:30:25:5:2 molarni odnos) iHEDC:S104:DOPE:holesterol:PEG-DMPE:DiVA-PEG-DIVA (20:20:30:25:5:2 molarni odnos) pri čemu DiVA-PEG-DiVA je zajednički rastvoren. DODC:DOPE;holesterol:Peg-Lipid:DiVA-PEG-DiVA (50:10:38:2:5 molarni odnos) i DODC:DOPE;holesterol:Peg-Lipid:DiVA-PEG-DiVA formulacije pri čemu DiVA-PEG-DiVA je zajednički rastvoren.
[0058] Druge formulacije ovog pronalaska uključuju one koje obuhvataju HEDODC:DOPE:holesterol-PEG-lipid:DiVA-PEG-DiVA (50:1038:2:5 molarni odnos) i HEDODC:DOPE:holesterol-PEG-lipid:DiVA-PEG-DiVA formulacija pri čemu je DiVA-PEG-DiVA zajednički rastvoren.
[0059] Druge poželjne formulacije ovog pronalaska uključuju one koje obuhvataju DC-6-14:DOPE:holesterol: DiVA-PEG-DiVA (40:30:30:5, molarne odnose) i DC-6-14:DOPE:holesterol: DiVA-PEG-DiVA, pri čemu je DiVA-PEG-DiVA koji je zajednički rastvoren.
[0060] U područje ovog opisa takođe spadaju i metode za isporučivanje terapeutskog agensa pacijentu. Ove metode obuhvataju obezbeđivanje farmaceutske formulacije uključujući bilo koju od gorepomenutih kompozicija i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač; i davanje farmaceutske formulacije pacijentu.
DEFINICIJE
1
[0061] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "alkil" se odnosi na normalnu ili razgranatu u potpunosti zasićenu (bez duplih ili trostrukih veza) ugljovodoničnu grupu, na primer, grupu koja ima opštu formulu -CnH2n+1. Alkilna grupa može da ima od 1 do 50 atoma ugljenika (kad god da se pojavi u ovom tekstu, numerički opseg kao što je "1 do 50" se odnosi na svaki ceo broj u datom opsegu; npr.. "1 do 50 atoma ugljenika" znači da alkilna grupa može da se sastoji od 1 atoma ugljenika, 2 atoma ugljenika, 3 ugljenika javljanje izraza „alkil“ tamo gde numerički opseg nije naznačen). Alkilnu grupu takođe može predstavljati i alkil srednje veličine koji ima 1 do 30 atoma ugljenika. Alkilnu grupu takođe može predstavljati niži alkil koji ima 1 do 5 atoma ugljenika. Alkilna grupa jedinjenja može biti označena kao "C1-C4alkil" ili može imati sličnu oznaku. Samo kao primer, "C1-C4alkil" ukazuje da alkilni lanac sadrži jedan do četiri atoma ugljenika odabranih iz grupe koju čine metil, etil, propil, izo-propil, n-butil, izo-butil, sek-butil, i t-butil. Uobičajene alkilne grupe uključuju, ali ni na koji način nisu ograničeni na, metil, etil, propil, izopropil, butil, izobutil, tercijarni butil, pentil, heksil i njima slični.
[0062] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "alkenil" se odnosi na alkilnu grupu koja u normalnom ili razgranatom lancu ugljovodonika sadrži jednu ili više duplih veza. Alkenilska grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana. Kada je supstituisana, supstituent(i) mogu biti odabrani iz istih gore opisanih grupa vezano za supstituciju alkilne grupe ukoliko nije drugačije naznačeno.
[0063] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "alkinil" se odnosi na alkilnu grupu koja u normalnom ili razgranatom lancu ugljovodonika sadrži tri veze. Alkinilska grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana. Kada je supstituisana, supstituent(i) mogu biti odabrani iz istih gore opisanih grupa vezano za supstituciju alkilne grupe ukoliko nije drugačije naznačeno.
[0064] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "halogen" se odnosi na F, Cl, Br, i I.
[0065] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "mezilat" se odnosi na -OSO2CH3.
[0066] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, izraz "farmaceutska formulacija" se odnosi na mešavinu kompozicije opisane u ovom tekstu sa jednom ili više hemijskih komponenti, kao što su razblaživači ili dodatni farmaceutski nosači. Ova farmaceutska formulacija olakšava davanje ove kompozicije organizmu. U tehnici postoje višestruke tehnike davanja farmaceutske formulacije, uključujući ali bez ograničenja injekciju i parenteralnu primenu.
[0067] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, izraz "farmaceutski nosač" se odnosi na hemijsko jedinjenje koje olakšava ugradnju jedinjenja u ćelije ili tkiva. Na primer dimetil sulfoksid (DMSO) je nosač koji se uobičajeno koristi budući da olakšava unos mnogih organskih jedinjenja u ćelije ili tkiva organizma.
[0068] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, izraz "razblaživač" se odnosi na hemijska jedinjenja razblažena u vodi koja rastvaraju formulaciju od interesa (npr., formulacija koja može da uključi jedinjenje, retinoid, drugi lipid, stabilizator, i/ili terapeutski agens) i takođe stabilizuju biološki aktivan oblik formulacije. Soli razblažene u puferovanim rastvorima se u tehnici koriste kao razblaživači. Jedan puferovani rastvor koji se
1
obično koristi je fosfatni puferovani slani rastvor zato što on oponaša slane uslove humane krvi. Pošto puferovane soli mogu da kontrolišu pH rastvora pri niskim koncentracijama, puferovani razblaživač retko modifikuje biološku aktivnost formulacije. Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "ekscipijens" se odnosi na inertnu supstancu koja se dodaje formulaciji da bi se obezbedili, bez ograničenja, zapremina, konzistentnost, stabilnost, sposobnost vezivanja, lubrikacija, sposobnost dezintegrisanja, itd. kompozicije. "Razblaživač" je vrsta ekscipijensa.
[0069] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "terapeutski agens" se odnosi na jedinjenje koje, nakon primene kod sisara u terapeutski efektivnoj količini, obezbeđuje terapeutsku korist sisaru. Terapeutski agens se u nastavku ovog teksta može nazivati lek. Stručnjaci će shvatiti ukoliko se izraz "terapeutski agens" ne ograničava na registrovane lekove. "Terapeutski agens" operativno može biti združen sa jedinjenjima opisanim u ovom tekstu, retinoidom, i/ili drugim lipidom. Na primer, drugi lipid kako je opisano u ovom tekstu može formirati lipozom, a terapeutski agens može operativno biti združen sa lipozomom, npr. kako je opisano u ovom tekstu.
[0070] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "formulacije lipopleksa" se odnosi na one formulacije u kojima je siRNK izvan lipozoma. U poželjnim formulacijama lipopleksa, siRNK obrazuje kompleks izvan lipozoma. Druge poželjne formulacije lipopleksa uključuju one gde je siRNK pristupačna za bilo koju podlogu izvan lipozoma.
[0071] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "formulacije lipozoma" se odnosi na one formulacije gde je siRNK inkapsulirana unutar lipozoma. U poželjnim formulacijama lipozoma, siRNK je nepristupačna za bilo koju podlogu prisutnu izvan lipozoma.
[0072] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, izraz "zajednički rastvoren" se odnosi na dodavanje komponente mešavini katjonskog lipida pre formiranja prazne vezikule.
[0073] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, izraz "dekorisan" se odnosi na dodavanje komponente nakon formiranja vezikule.
[0074] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "DC-6-14" se odnosi na sledeće jedinjenje katjonskog lipida:
[0075] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "DODC" se odnosi na sledeće jedinjenje katjonskog lipida:
1
[0076] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "HEDODC" se odnosi na sledeće jedinjenje katjonskog lipida:
[0077] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "retinoid" je član klase jedinjenja koja se sastoje od četiri jedinice izoprenoida spojenih od „glave do pete“, videti G. P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents," 2nd Ed. Portland Press, pp.247-251 (1992). "Vitamin A" je generički opis za retinoide koji kvalitativno ispoljavaju biološku aktivnost retinola. Kako je upotrebljen u ovom tekstu, retinoid se odnosi na prirodne i sintetičke retinoide uključujući prvu generaciju, drugu generaciju, i treću generaciju retinoida. Primeri retinoida koji se prirodno javljaju, ali nisu ograničeni na, (1) 11-cis-retinal,
(2) trans retinol, (3) retinil palmitat, (4) trans retinoinska kiselina, i (5) 13-cis-retinoinske kiseline. Štaviše, izraz "retinoid" obuhvata retinole, retinale, retinoinske kiseline, reksinoide, demetilisane i/ili zasićene retinoinske kiseline, i njihove derivate. Među ovim retinoidima, ovaj pronalazak koristi retinoid odabran iz grupe koju čine vitamin A, retinoinska kiselina, tretinoin, adapalen, 4-hidroksi(fenil)retinamid (4-HPR), retinil palmitat, retinal, zasićena retinoinska kiselina, i zasićena, demetilisana retinoinska kiselina.
[0078] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "retinoidni konjugat" se odnosi na molekul koji uključuje najmanje jednu polovinu retinoida.
[0079] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "molekul retinoid-veznik-lipid" se odnosi na molekul koji uključuje najmanje jednu polovinu retinoida dodatu na najmanje jednu polovinu lipida putem najmanje jednog veznika kao što je, na primer, PEG polovina.
[0080] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "retinoid veznik-retinoidni molekul" se odnosi na molekul koji uključuje najmanje jednu polovinu retinoida dodatu na najmanje jednu polovinu retinoida (koja može biti ista ili različita) putem najmanje jednog veznika kao što je, na primer, PEG polovina.
[0081] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "Vitamin D" je generički opis za grupu vitamina koja ima antirahitičnu aktivnost. Grupa vitamina D uključuje: vitamin D2(kalciferol), vitamin D3(ozračeni 22-dihidroergosterol), vitamin D4(ozračeni dehidrositosterol) i vitamin D5(ozračeni dehidrositosterol).
[0082] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "Vitamin E" je generički opis za grupu molekula sa antioksidantskom aktivnošću. Porodica vitamina E uključuje α-tokoferol, β-tokoferol, γ-tokoferol i δtokoferol, pri čemu je α-tokoferol najzastupljeniji. (Brigelius-Flohe and Traber, The FASEB Journal.
1999;13:1145-1155).
1
[0083] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "Vitamin K" je generički opis za antihemoragijski faktor i uključuje vitamin K1(fitonodion), vitamin K2(menakvinon), vitamin K3, vitamin K4i vitamin K5. Vitamini K1i K2su prirodni, dok su K3-5 sintetički.
[0084] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "molekul retinoid-veznik-lipid" se odnosi na molekul koji uključuje najmanje jednu polovinu retinoida koja je dodata na najmanje jednu polovinu lipida putem najmanje jednog veznika kao što je, na primer, PEG polovina.
[0085] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "retinoid veznik-retinoidni molekul" se odnosi na molekul koji uključuje najmanje jednu polovinu retinoida koja je dodata na najmanje jednu drugu polovinu retinoida (koja može biti ista ili različita) putem najmanje jednog veznika kao što je, na primer, PEG polovina.
[0086] Kako su upotrebljeni u ovom tekstu, izrazi "lipid" i "lipofilni" se u ovom tekstu upotrebljavaju u svojim uobičajenim značenjima, onako kako ih stručnjaci shvataju. Ne-ograničavajući primeri lipida i lipofilnih grupa uključuju masne kiseline, sterole, C2-C50alkil, C2-C50heteroalkil, C2-C50alkenil, C2-C50heteroalkenil, C5-C50aril, C5-C50heteroaril, C2-C50alkinil, C2-C50heteroalkinil, C2-C50karboksialkenil, i C2-C50karboksiheteroalkenil. Masna kiselina je zasićena ili nezasićena monokarboksilna kiselina dugog lanca koja sadrži, na primer, 12 do 24 atoma ugljenika Lipid je okarakterisan kao suštinski rastvorljiv u vodi, čija je rastvorljivost u vodi manja od oko 0.01% (masene osnove). Kako su upotrebljeni u ovom tekstu, izrazi "polovina lipida" i "lipofilna polovina" se odnose na lipid ili njegov deo koji je postao vezan za drugu grupu. Na primer, lipidna grupa može postati vezana za drugo jedinjenje (npr. monomer) hemijskom reakcijom između funkcionalne grupe (kao što je grupa karboksilne kiseline) lipida i odgovarajuće funkcionalne grupe monomera.
[0087] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "siRNK" se odnosi na manju interferenciju RNK, koja je u tehnici takođe poznata i kao kratka interferencija RNK ili utišavanje RNK. siRNK je klasa molekula RNK dvostrukog lanca koji imaju različite efekte poznate u tehnici od kojih je najupečatljiviji mešanje sa ekspresijom specifičnih gena i ekspresijom proteina.
[0088] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "inkapsuliran lipozomom" se odnosi na komponentu koja je suštinski ili u celosti unutar strukture lipozoma.
[0089] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "pristupačni za vodenu podlogu" se odnosi na komponentu koja je sposobna da bude u kontaktu sa vodenom podlogom.
[0090] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "nepristupačni za vodenu podlogu" se odnosi na komponentu koja nema sposobnost da bude u kontaktu sa vodenom podlogom.
[0091] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "obrazovan kompleks na spoljašnjoj površini lipozoma" se odnosi na komponentu koja je operativno povezana sa spoljašnjom površinom lipozoma.
[0092] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "lokalizovan na spoljašnjoj površini lipozoma" se odnosi na komponentu koja je na ili blizu spoljašnjoj površini lipozoma.
2
[0093] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, "naelektrisan kompleks" se odnosi na elektrostatičko povezivanje.
[0094] Kako je upotrebljen u ovom tekstu, izraz "operativno povezani" se odnosi na elektronsku interakciju između jedinjenja kako je opisano u ovom tekstu, terapeutskog agensa, retinoida, i/ili drugog lipida. Takva interakcija može imati oblik hemijske veze, uključujući ali bez ograničenja, kovalentnu vezu, polarnu kovalentnu vezu, jonsku vezu, elektrostatičko povezivanje, koordinaciona kovalentna veza, aromatična veza, vodonična veza, dipol, ili van der Waals interakcija. Stručnjaci obično znaju da relativne jačine takvih interakcija mogu u velikoj meri da variraju.
[0095] Izraz "lipozom" se u ovom tekstu upotrebljava u svom uobičajenom značenju koje je poznato stručnjacima, i odnosi se na dvoslojnu strukturu lipida koja sadrži lipide dodate na polarne, hidrofilne grupe koje obrazuju suštinski zatvorenu strukturu u vodenoj podlozi. U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, lipozom može biti operativno povezan sa jednim ili više jedinjenja, ka što su terapeutski agens i retinoid ili retinoidni konjugat. Lipozom može da obuhvati jedan dvosloj lipida (tj. jednolameralni) ili može obuhvatati dva ili više koncentričnih dvosloja lipida (tj. višelemelarni). Pored toga, lipozom može biti prilično sferičnog ili elipsoidnog oblika.
[0096] Izraz "olakšavanje isporuke leka do ciljne ćelije" se odnosi na pojačanu sposobnost prisutnog retinoida ili masnih rastvorljivih vitaminskih jedinjenja kako bi se pojačala isporuka terapeutskog molekula kao što je siRNK do ćelije. Iako u teoriji retinoid ili masno-rastvorljivo jedinjenje vitamina nema tendenciju ka vezivanju, isto stupa u interakciju sa specifičnim receptorom ili [aktivacija/mesto vezivanja] na ciljnoj ćeliji sa specifičnošću koja se može izmeriti. Na primer, vezivanje se generalno smatra specifičnim kada je afinitet vezivanja (Ka) 10<6>M<-1>ili više, poželjno 10<7>M<-1>ili više, poželjnije 10<8>M<-1>ili više, i najpoželjnije 10<9>M<-1>ili više. Stručnjak brzo može odrediti afinitet vezivanja, na primer, Scatchard analizom (Scatchard, Ann. NYAcad. Sci.51:660, 1949)
[0097] Sistemi za isporuku nukleinske kiseline mogu da uključe, na primer, vodene ili nevodene gelove, kreme, višestruke emulzije, mikoremulzije, lipozome, masti, vodene i nevodene rastvore, losione, aerosoli, ugljovodonične baze i praškove, i mogu da sadrže ekscipijense kao što su sredstva za rastvaranje, pojačavači prodiranja (npr., masne kiseline, estri masnih kiselina, masni alkoholi i amino-kiseline), i hidrofilne polimere (npr., polikarbofiln i polivinilpirolindon).
[0098] Pored katjonskog lipida Formule I, drugi lipidi mogu biti korisni. Ovi lipidi uključuju katjonske lipide koji mogu da jonizuju, uključujući
[0099] Opisane su formulacije isporuke koje mogu da sadrže katjonski lipid Formule I u kombinaciji sa katjonskim lipidom koji može da jonizuje. Katjonski lipid koji može da jonizuje može da uključi npr., S104. Katjonski lipid koji može da jonizuje može biti prisutan u koncentraciji od 0 do 45 mol %, uključujući koncentraciju odabranu od 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, i 45 mol %.
[0100] Lipid konjugovan u molekul polietilen glikola (PEG), može biti prisutan u česticama lipozoma. PEG-lipidi uključuju
● 1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-PEG (PEG-DMPE)
● 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-PEG (PEG-DPPE),
● 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-PEG (PEG-DSPE), ili
● 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-PEG (PEG-DOPE) i/ili
● PEG-ceramid.
[0101] Formulacije isporuke mogu da se sastoje od katjonskog lipida Formule I u kombinaciji sa PEG-lipidom. Taj PEG-lipid može biti prisutan u koncentraciji od 0 do 15 mol %, poželjno 1 do 10 mol %, uključujući koncentraciju odabranu od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, i 10 mol %.
[0102] Ne-ograničavajući primeri ne-katjonskih lipida uključuju fosfolipide kao što su lecitin, fosfatidiletanolamin, lizolecitin, lizofosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinositol, sfingomijelin, sfingomijelin iz jajeta (ESM), cefalin, kardiolipin, fosfatidina kiselina, cerebrozidi, dicetilfosfat, distearoilfosfatidilholin (DSPC), dioleoilfosfatidilholin (DOPC), dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC), dioleoilfosfatidiglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidiglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamin (DOPE), palmitoiloleoil-fosfatidilholin (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamin (POPE), palmitoiloleiolfosfatidiglicerol (POPG), dioleoilfosfatidiletanolamin 4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksilat (DOPE-mal), dipalmitoil-fosfatidiletanolamin (DPPE), dimiristoil-fosfatidiletanolamin (DMPE), distearoilfosfatidiletanolamin (DSPE), monometil-fosfatidiletanolamin, dimetil-fosfatidiletanolamin, dielaidoilfosfatidiletanolamin (DEPE), stearoiloleoil-fosfatidiletanolamin (SOPE), lizofosfatidilholin, dilinoleoilfosfatidilholin, i njihove mešavine. Drugi fosfolipidi diacilfosfatidilholina i diacilfosfatidiletanolamina se takođe mogu koristiti. Grupe akila u ovim lipidima predstavljaju poželjno grupe akila dobijene od masnih kiselina koje imaju C10-C24lance ugljenika, npr., lauroil, miristoil, palmitoil, stearoil, ili oleoil.
[0103] U određenim primerima izvođenja ovog pronalaska, količina fosfolipida prisutna u česticama obuhvata od oko 0 mol % do oko 55 mol %, određenije u koncentraciji odabranoj od 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, i 55%. Kao ne-ograničavajući primer, fosfolipid je DOPE.
[0104] Dodatni primeri ne-katjonskih lipida uključuju sterole kao što su holesterol i njegovi derivati kao što su holestanol, holestanon, holestenon, koprostanol, holesteril-2'-hidroksietil etar, holesteril-4'-hidroksibutil etar, i njihove mešavine.
[0105] U određenim primerima izvođenja ovog pronalaska, holesterol ili derivat holesterola prisutan u česticama obuhvata od oko 0 mol % do oko 55 mol %, određenije u koncentraciji odabranoj od 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, i 55 mol %. Kao ne-ograničavajući primer, holesterol je prisutan u česticama lipida.
[0106] U određenim drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, holesterol koji je prisutan u česticama lipida koji sadrži mešavinu fosfolipida i holesterola obuhvata od oko 30 mol % do oko 40 mol %, od oko 30 mol % do oko 35 mol %, ili od oko 35 mol % do oko 40 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici. Kao neograničavajući primer, čestica lipida koja obuhvata mešavinu fosfolipida i holesterola može obuhvatati holesterol na oko 34 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0107] U daljim primerima izvođenja ovog pronalaska, holesterol prisutan u česticama lipida koji sadrži mešavinu fosfolipida i holesterola obuhvata od oko 10 mol % do oko 30 mol %, od oko 15 mol % do oko 25 mol %, ili od oko 17 mol % do oko 23 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici. Kao ne-ograničavajući primer, čestica lipida koja obuhvata mešavinu fosfolipida i holesterola može da obuhvati holesterol na oko 20 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0108] Retinoid ili retinoidni konjugat koristan za isporuku nukleinske kiseline je u stanju u kom je rastvoren ili mešan sa medijumom koji ga može rastvoriti ili zadržati.
[0109] Bilo koji retinoid ili retinoidni konjugat se mogu koristiti u ovom opisu sve dokle god ga stelatne ćelije aktivno akumuliraju; primeri retinoida uključuju, ali nisu ograničeni na, tretinoin, adapalen, retinol palmitat, i određenije vitamin A, zasićeni vitamin A, retinoinska kiselina, i retinal. Primeri retinoid-konjugata uključuju PEG-retinoidne konjugate. Ovaj opis koristi svojstvo stelatnih ćelija da pozitivno ugrađuju retinoid i/ili retinoidni konjugat, i upotrebom retinoida i/ili retinoidnog konjugata kao nosača leka ili vezivanjem za ili uključivanjem u komponentu drugog nosača leka, željeni materijal ili telo se prenosi određenije do stelatnih ćelija. Retinoid je član klase jedinjenja koji ima skeleton u kom su četiri jedinice izoprenoida vezane od „glave do pete“. Videti G. P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents," 2nd Ed. Portland Press, pp.247-251 (1992). Vitamin A je generički opis retinoida koji kvalitativno pokazuje biološku aktivnost retinola. Retinoid u ovom opisu pospešuje isporuku supstance do ćelije kancera i CAF (odnosno, supstanca je usmerena na ove ćelije). Takav retinoid nije naročito ograničen, i njegovi primeri uključuju retinol, Vitamin A, zasićeni vitamin A, retinal, retinoinsku kiselinu, estar retinola i masnu kiselinu, estar alifatskog alkohola i retinoinske kiseline, etretinat, tretinoin, izotretinoin, adapalen, acitretin, tazaroten, i retinol palmitat, i analoge vitamin A kao što su fenretinid, i beksaroten. Od ovih retinoida, ovaj pronalazak koristi retinoid odabran iz grupe koju čine vitamin A, retinoinska kiselina, tretinoin, adapalen, 4-hidroksi(fenil)retinamid (4-HPR), retinil palmitat, retinal, zasićena retinoinska kiselina, i zasićena,
2
demetilisana retinoinska kiselina. Retinoid-konjugati uključuju PEG-konjugate, npr., diVA-PEG-diVA (u skladu sa ovim pronalaskom) i VA-PEG-VA (nije u skladu sa ovim pronalaskom).
[0110] Nosač leka u ovom opisu stoga može sadržati komponentu nosača leka koja nije retinoid i/ili retinoid-konjugat. Takva komponenta nije naročito ograničena, i bilo koja komponenta poznata u polju medicine i farmacije se može koristiti, ali je za istu poželjno da može da uključi retinoid i/ili retinoidni konjugat. Štaviše, nosač leka u ovom opisu može da sadrži supstancu koja poboljšava ugrađivanje u stelatne ćelije, na primer, retinol-vezujući protein (RBP). Vezivanje ili uključivanje retinoida i/ili retinoidnog konjugata sa nosačem leka u ovom opisu se može sprovesti vezivanjem ili uključivanjem retinoida i/ili retinoidnog konjugata sa drugom komponentom nosača leka hemijskim i/ili fizičkim metodama.
Alternativno, vezivanje ili uključivanje retinoida i/ili retinoidnog konjugata sa nosačem leka u ovom opisu se može sprovesti mešanjem retinoida i/ili retinoidnog konjugata koji ima afinitet ka formiranju i osnovne komponente nosača leka, u komponentama nosača leka tokom pripreme nosača leka.
[0111] Količina retinoida i/ili retinoidnog konjugata vezanog ili uključenog u nosač leka u ovom opisu može biti 0.1 mol % do 20 mol% kao maseni odnos u odnosu na komponentu nosača leka, poželjno 0.2% do 10%, i poželjnije 0.5% do 5 mol %, uključujući koncentraciju odabranu od vrednosti 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0.2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, i 5.0 mol %.
[0112] U određenim primerima izvođenja ovog pronalaska, ovaj opis obezbeđuje proizvodnju lipozoma mešanjem u komori. Ovo uključuje proces koji obezbeđuje vodeni rastvor koji obuhvata nukleinsku kiselinu kao što je RNK koja interferira u prvom rezervoaru, obezbeđujući organski rastvor lipida u drugom rezervoaru, mešajući vodeni rastvor sa organskim rastvorom lipida u drugom rezervoaru, i mešajući vodeni rastvor sa organskim rastvorom lipida tako da se organski rastvor lipida meša sa vodenim rastvorom tako da proizvede lipozom koji inkapsulira nukleinsku kiselinu (npr., siRNK) u gradijentu koncentracije organskog rastvarača.
[0113] Lipozom formiran upotrebom metode mešanja obično ima veličinu od oko 40 nm do oko 250 nm, od oko 50 nm do oko 150 nm, od oko 60 nm do oko 150 nm. Čestice formirane na taj način se ne gomilaju i opciono postižu uniformnu veličinu čestica.
[0114] Nosač leka u ovom opisu može biti u bilo kom obliku sve dok se željeni materijal ili telo mogu transportovati do ciljne stelatne ćelije, a primeri oblika uključuju, ali nisu ograničeni na, micelu polimera, lipozom, emulziju, mikrosferu, i nanosferu. Štaviše, nosač leka u ovom opisu može u svojoj unutrašnjosti da uključi supstancu koju je potrebno transportovati, dodati na spoljašnost supstance koju je potrebno transportovati, ili mešati sa supstancom koju je potrebno transportovati sve dok retinoid i/ili retinoidni konjugat uključen u njihov sastav je bar delimično izložen na spoljašnosti preparata pre nego što dospe najmanje do stelatnih ćelija.
[0115] Nosač leka u ovom opisu specifično cilja stelatne ćelije i omogućava željenom efektu kao što je, na primer, inhibicija ili sprečavanje fibroze da bude izložena maksimalnom efektu i minimalnim neželjenim dejstvima efikasnim transportovanjem do stelatnih ćelija željenog materijala ili tela kao što je, na primer, lek za kontrolisanje aktivnosti ili rasta stelatnih ćelija. Materijal ili telo koje ovaj nosač leka isporučuje nije određeno ograničeno, ali poželjno je da ima veličinu koja omogućava fizičko kretanje u živom telu od mesta primene do jetre, pankreasa itd., gde su prisutne stelatne ćelije. Nosač leka u ovom opisu stoga može da transportuje ne samo materijal kao što je atom, molekul, jedinjenje, protein ili nukleinska kiselina veća takođe i telo kao što je vektor, čestica virusa, ćelija, sistem za otpuštanje leka koga čini jedan ili više elemenata, ili mikromašinu. Materijal ili telo, poželjno ima svojstvo da vrši neki uticaj na stelatne ćelije, a njegovi primeri uključuju ono koje obeležava stelatne ćelije i ono koje kontroliše aktivnost ili rast stelatnih ćelija.
[0116] Stoga, u jednom primeru izvođenja ovog opisa, nosač leka isporučuje lek za kontrolisanje aktivnosti i rasta stelatnih ćelija. Ovo može biti bilo koji lek koji direktno ili indirektno inhibira fizičko-hemijske aktivnosti stelatnih ćelija uključenih u napredovanje fibroze, a njegovi primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore TGFβ aktivnosti kao što su skraćeni receptor TGFβ tipa II receptor i rastvorljivi receptor TGFβ tipa II, preparate faktora rasta kao što su HGF i njihovi vektori ekspresije, promoteri MMP proizvodnje kao što su MMP vektor adenovirusa koji sadrži gen, inhibitori TIMP proizvodnje kao što su antisens TIMP nukleinske kiseline, PPAPγ ligand, inhibitori aktivacije ćelija i/ili inhibitori rasta ćelije kao što je inhibitor aktivnosti angiotensina, inhibitor PDGF aktivnosti, i inhibitor kanala natrijuma, a takođe i izazivači apoptoze kao što je jedinjenje 864 i gliotoksin, adiponectin, i jedinjenje koje ima inhibitorsku aktivnost Rho kinaze kao što je (+)-trans-4-(1-aminoetil)-1-(4-piridilkarbamoil)cikloheksan. Štaviše, 'lek za kontrolisanje aktivnosti i rasta stelatnih ćelija' u ovom opisu može biti bilo koji lek koji direktno ili indirektno unapređuje fizičkohemijske aktivnosti selatnih ćelija, direktno ili indirektno uključen u inhibiciju fibroze, a njegovi primeri stoga uključuju, ali nisu ograničeni na, lek za unapređivanje sistema za razgradnju kolagena, npr., promoteri MMP proizvodnje kao što su MMP vektor ekspresije, HGF, i lekovi čija je aktivnost slična aktivnosti HGF kao što su analozi HGF i njihovi vektori ekspresije.
[0117] Drugi primeri leka za kontrolisanje aktivnosti i rasta stelatnih ćelija u ovom opisu uključuju lek za kontrolisanje metabolizma ekstracelularne matrice kao što je kolagen, na primer, supstanca koja ima efekta u inhibiranju ekspresije ciljnog molekula, kao što je siRNK, ribozom, i antisens nukleinska kiselina (uključujući RNK, DNK, PNK, i njihov kompozit), supstanca koja ima dominantno negativni efekat, i vektori koji eksprimiraju isti taj cilj, na primer, molekul konstituenta ekstracelularne matrice koga proizvode stelatne ćelije ili cilja jedan ili više molekula koji imaju funkciju proizvodnje ili izlučivanja molekula konstituenta ekstracelularne matrice.
2
[0118] Ovaj opis se takođe odnosi na lek za lečenje poremećaja koji je povezan sa stelatnim ćelijama, pri čemu taj lek sadrži nosač leka i lek za kontrolisanje aktivnosti i rasta stelatnih ćelija, i odnosi se na upotrebu nosača leka u proizvodnji farmaceutske kompozicije za lečenje poremećaja koji je povezan sa stelatnim ćelijama. Poremećaj povezan sa stelatnim ćelijama koji se pominje u ovom tekstu označava poremećaj u kom su stelatne ćelije direktno ili indirektno uključene u proces poremećaja, odnosno, početak, pogoršanje, poboljšanje, remisija, lek, itd. ovog poremećaja, a njegovi primeri uključuju hepatične poremećaje kao što je hepatitis, određenije hronični hepatitis, fibroza jetre, ciroza jetre, i kancer jetre, i poremećaji pankreasa kao što su pankreatitis, određenije hronični pankreatitis, fibroza pankreasa, i kancer pankreasa.
[0119] U leku ovog opisa, nosač leka može da uključi lek u svojoj unutrašnjosti, koji je dodat na spoljašnost supstance koja sadrži lek, ili je pomešan sa lekom dokle god je retinoid i/ili retinoid-konjugat uključen u nosač leka bar delimično izložen na spoljašnosti preparata pre nego što najmanje dospe u stelatne ćelije. Stoga, u zavisnosti od puta ili načina primene u kom se lek otpušta, lek može biti prekriven odgovarajućim materijalom, kao što je, na primer, enterični omotač ili materijal koji se tokom vremena dezintegriše, ili može biti ugrađen u odgovarajući sistem za otpuštanje leka.
[0120] Ovaj opis stoga uključuje nosač leka ili komplet medicinskog preparata koji sadrži jednu ili više posuda koje sadrže jedan ili više nosača konstituenta leka, retinoid i/ili retinoidni konjugat, i/ili lek, a takođe uključuje suštinsku komponentu za nosač leka ili lek koji je obezbeđen u obliku takvog kompleta. Komplet ovog opisa može da sadrži, pored gore opisanih, opis, itd. u kom je opisana metoda pripreme ili metoda primene nosača leka i medicinskog preparata ovog opisa. Štaviše, komplet ovog opisa može da sadrži sve komponente za kompletiranje nosača leka ili medicinskog preparata ovog opisa ali ne mora nužno da sadrži sve komponente. Komplet ovog opisa stoga ne mora da sadrži reagens ili rastvarač, koji je normalno dostupan na mestu medicinskog lečenja, eksperimentalne ustanove itd. kao što je, na primer, sterilna voda, fiziološki rastvor, ili rastvor glukoze.
[0121] Ovaj opis se dalje odnosi na metodu lečenja poremećaja povezanog sa stelatnim ćelijama, metodu koja uključuje davanje efektivne količine medicinskog preparata subjektu ukoliko mu je potrebna. Efektivna količina iz ovog teksta predstavlja količinu koja potiskuje početak ciljnog poremećaja, smanjuje njegove simptome, ili sprečava napredovanje njegove bolesti, i poželjno količinu koja sprečava početak ciljnog poremećaja ili leči ciljni poremećaj. Takođe je poželjno da ta količina ne izaziva neželjeno dejstvo koje prevazilazi korist od same primene. Takva količina se može odrediti odgovarajućim in vitro ispitivanjem pomoću ćelija kulture, itd. ispitivanjem u modelu životinje kao što je miš, pacov, pas ili svinja, i takve metode ispitivanja su dobro poznate jednom stručnjaku.
[0122] U metodi ovog opisa, izraz 'subjekat' označava bilo kog živog pojedinca, poželjno životinju, poželjnije sisara, a opet najpoželjnije ljudsko biće. U ovom opisu, subjekat može biti zdrav ili sa nekim poremećajem, a
2
u slučaju lečenja poremećaja, subjekat obično označava subjekat sa poremećajem ili subjekat koji je pod rizikom da isti dobije.
[0123] Štaviše, izraz 'lečenje' uključuje sve vrste medicinski prihvatljive profilaktičke i/ili terapeutske intervencije radi lečenja, prolazne remisije, sprečavanja itd. poremećaja. Na primer, kada je poremećaj fibroza jetre, izraz „lečenje“ obuhvata medicinski prihvatljivu intervenciju za razne svrhe uključujući odlaganje ili zaustavljanje napredovanja fibroze, povlačenje ili nestanak lezija, sprečavanje nastanka fibroze, ili sprečavanje ponovnog javljanja bolesti.
[0124] Ovaj opis se takođe odnosi na metodu isporučivanja leka stelatnim ćelijama pomoću nosača leka. Ova metoda uključuje, ali bez ograničenja na, fazu podržavanja isporuke supstance na nosaču leka, i fazu primene ili dodavanja nosača leka koji nosi supstancu koju je potrebno isporučiti živom telu ili podlozi koja sadrži stelatne ćelije, kao što je na primer podloga za kulturu. Ove faze se mogu postići na prikladan način u skladu sa bilo kojom poznatom metodom, pri čemu je ta metoda opisana u ovim specifikacijama itd. Ova metoda isporuke se može kombinovati sa drugom metodom isporuke, na primer, drugom metodom isporuke u kojoj organ sa stelatnim ćelijama predstavlja ciljni organ itd.
[0125] Molekuli nukleinske kiseline se mogu prilagoditi za upotrebu u prevenciji ili lečenju fibroza (npr., jetre, bubrega, peritonealne, i plućne fibroze) bolesti, osobina, stanja i/ili poremećaja, i/ili bilo koje druge osobine, bolesti, poremećaja ili stanja koje je povezano sa ili koje će odreagovati na nivoe hsp47 u ćeliji ili tkivu, sami ili u kombinaciji sa drugim terapijama. Molekul nukleinske kiseline mogu da uključe nosača isporuke, uključujući lipozome, za davanje subjektu, nosioce ili razblaživače i njihove soli, i/ili može biti prisutan u farmaceutski prihvatljivim formulacijama.
[0126] Molekuli nukleinske kiseline ovog opisa mogu da obuhvate sekvence prikazane u Tabeli 3. Primeri takvih molekula nukleinske kiseline se suštinski sastoje od sekvenci datih u Tabeli 3.
[0127] Molekuli nukleinske kiseline se mogu primenjivati putem isporuke u pluća, kao što je putem inhalacije aerosoli ili prskanjem osušene formulacije primenjene pomoću uređaja za inhalaciju ili raspršivača, čime se obezbeđuje brz lokalni unos molekula nukleinske kiseline u odgovarajuća plućna tkiva. Čvrste kompozicije od čestica koje sadrže suve čestice koje se mogu udisati kompozicija mikronizovane nukleinske kiseline se mogu pripremiti mlevenjem osušenih ili liofiziranih kompozicija nukleinske kiseline, a zatim prolaskom mikronizovane kompozicije kroz, na primer ekran promera 400 pora kako bi se razbili ili razdvojili veliki aglomerati. Čvrsta kompozicija od čestica koja obuhvata kompozicije nukleinske kiseline ovog opisa može opciono sadržati sredstvo za dispergovanje koje služi dase olakša formulacija aerosoli kao i druga terapeutska jedinjenja. Odgovarajuće sredstvo za dispergovanje je laktoza, koja se može samleti sa jedinjenjem nukleinske kiseline u bilo kom prigodnom odnosu, kao što je 1 na 1 maseni odnos.
[0128] Aerosoli tečnih čestica mogu da obuhvate molekule nukleinske kiseline opisane u ovom tekstu i mogu biti proizvedene pomoću prigodnih sredstava, kao što je raspršivač (videti npr., U.S. Pat. No.
2
4,501,729). Raspršivači su komercijalno dostupni uređaji koji pretvaraju rastvore ili suspenzije aktivnog sastojka u maglu terapeutske aerosoli ili pomoću sredstava ubrzavanja komprimovanog gasa, obično vazduha ili kiseonika, kroz uzane venturijeve cevi ili pomoću ultrasoničnog mešanja. Prigodne formulacije za upotrebu u raspršivačima uključuju aktivni sastojak u tečnom nosaču u količini od do 40 mas. % poželjno manje od 20 mas. % formulacije. Nosač je obično voda ili razblaženi vodeni alkoholni rastvor, poželjno napravljen izotoničnim pomoću telesnih tečnosti dodavanjem, npr., natrijum-hlorida ili drugih prigodnih soli. Opcioni aditivi uključuju konzervanse ukoliko formulacija nije pripremljena kao sterilna, npr., metilhidroksibenzoat, antioksidanse, arome, eterična ulja, sredstva za puferovanje i emulgatore kao i druga površinski aktivna sredstva formulacije. Aerosoli čvrstih čestica uključujući aktivnu kompoziciju ili sredstvo aktivno po površini mogu na sličan način da budu proizvedeni sa bilo kojim generatorom čvrstih aerosoli od čestica. Generatori aerosoli za davanje čvrstih terapeutskih agenasa od čestica subjektu proizvode čestice koje se mogu udisati, kako je gore objašnjeno, i proizvode zapreminu aerosoli koja sadrži prethodno određenu odmerenu dozu terapeutske kompozicije pri brzini pogodnoj za humanu primenu. Jedan ilustrativni tip generatora čvrstih aerosoli od čestica je insuflator. Prigodne formulacije za davanje putem insuflacije uključuju fino usitnjene praškove koji mogu biti isporučeni pomoću insuflatora. U insuflatoru, prašak, npr., njegova odmerena doza efektivna da se sa njom sprovede ovde opisano lečenje, se nalazi u kapsulama ili ulošcima, obično želatinastim ili plastičnim, koje su ili probušene ili otvorene in situ a prašak se isporučuje putem vazduha koji je usisan kroz uređaj po udisanju ili pomoću pumpe za ručno upravljanje. Prašak koji se koristi u insuflatoru se sastoji ili samo od jednog aktivnog sastojka ili od usitnjenog praška koji obuhvata aktivni sastojak, odgovarajući razblaživač praška, kao što je laktoza, i opcionog sredstva aktivnog po površini. Aktivni sastojak obično uključuje od 0.1 do 100 masenog % formulacije. Drugi tip ilustrativnog generatora aerosoli uključuje inhalator sa odmerenim dozama. Inhalatori sa odmerenim dozama predstavljaju dozatore aerosoli pod pritiskom, koji obično sadrže suspenziju ili formulaciju rastvora aktivnog sastojka u tečnom organskom gorivu. Tokom upotrebe ovi uređaji otpuštaju formulaciju kroz ventil podešen da isporuči odmerenu zapreminu kako bi se proizveo sprej finih čestica koji sadrži aktivni sastojak. Prigodna organska goriva obuhvataju određena jedinjenja hlorofluorougljenika, npr., dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan i njihove mešavine. Ova formulacija pored toga može da sadrži jedan ili više zajedničkih rastvarača, na primer, etanol, emulgatore i druga sredstva formulacije aktivna po površini, kao što su oleinska kiselina ili sorbitan trioleat, antioksidanse i prigodna sredstva za davanje ukusa. Ostale metode za isporuku u pluća su opisane u, npr., US20040037780, US6592904, US6582728, i US6565885. WO08132723 se odnosi na isporuku aerosoli oligonukleotida generalno, i određenije siRNK, u respiratorni sistem.
[0129] Molekuli nukleinske kiseline se mogu primenjivati i na centralnom nervnom sistemu (CNS) ili perifernom nervnom sistemu (PNS). Eksperimenti su pokazali efikasan in vivo unos nukleinskih kiselina
2
putem neurona. Videti, npr., Sommer et al., 1998, Antisens Nuc. Acid Drug Dev., 8:75; Epa et al., 2000, Antisens Nuc. Acid Drug Dev., 10:469; Broaddus et al., 1998, J. Neurosurg., 88:734; Karle et al., 1997, Eur. J. Pharmocol., 340:153; Bannai et al., 1998, Brain Research, 784:304; Rajakumar et al., 1997, Synapse, 26:199; Wu-pong et al., 1999, BioPharm, 12:32; Bannai et al., 1998, Brain Res. Protoc., 3:83; and Simantov et al., 1996, Neuroscience, 74:39. Molekuli nukleinske kiseline su odgovorni za isporuku i apsorpciju od strane ćelija CNS i/ili PNS.
[0130] Isporuka molekula nukleinske kiseline u CNS je omogućena različitim strategijama. Tradicionalni pristupi isporuci u CNS koji su u upotrebi uključuju, ali nisu ograničeni na, intratekalnu i intracerebroventrikularnu primenu, plasiranje katetera i pumpi, direktno ubrizgavanje ili perfuzija na mestu povrede ili lezije, ubrizgavanje u arterijski sistem mozga, ili hemijskim ili osmotskim otvorom krv-mozakbarijere. Ostali pristupi mogu da uključe različite sisteme prenosa i nosača, na primer putem upotrebe konjugata i biorazgradivih polimera. Štaviše, pristupi u vidu genske terapije, npr., kako je opisano u Kaplitt et al., U.S. Pat. No.6,180,613 u Davidson, WO 04/013280, se mogu koristiti za eksprimiranje molekula nukleinske kiseline u CNS.
[0131] Molekuli nukleinske kiseline mogu obrazovati formulaciju ili kompleks sa polietileniminom (npr., linearni ili razgranati PEI) i/ili derivatima polietilenimina, uključujući na primer nakalemljene PEIs kao što su galaktoza PEI, holesterol PEI, antitelo nastalo kao derivat PEI, i derivati polietilen glikola PEI (PEG-PEI) (videti na primer Ogris et al., 2001, AAPA PharmSci, 3, 1-11; Furgeson et al., 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847; Kunath et al., 2002, Pharm Res 19:810-17; Choi et al., 2001, Bull. Korean Chem. Soc., 22:46-52; Bettinger et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10:558-561; Peterson et al., 2002, Bioconjugate Chem. 13:845-54; Erbacher et al., 1999, J Gene Med 1:1-18; Godbey et al., 1999., PNAS, 96:5177-81; Godbey et al., 1999, J Controlled Release, 60:149-60; Diebold et al., 1999, J Biol Chem, 274:19087-94; Thomas et al., 2002, PNAS, 99, 14640-45; and Sagara, U.S. Pat. No.6,586,524).
[0132] Molekuli nukleinske kiseline mogu da uključe biokonjugat, na primer konjugat nukleinske kiseline kako je opisano u Vargeese et al., U.S. Ser. No.10/427,160; U.S. Pat. No.6,528,631; U.S. Pat. No.
6,335,434; U.S. Pat. No.6,235,886; U.S. Pat. No.6,153,737; U.S. Pat. No.5,214,136; U.S. Pat. No.5,138,045.
[0133] Kompozicije, metode i kompleti opisani u ovom tekstu mogu da uključe vektor ekspresije koji uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan molekul nukleinske kiseline ovog opisa na način koji omogućava ekspresiju molekula nukleinske kiseline. Metode uvođenja molekula nukleinske kiseline ili jednog ili više vektora koji mogu da eksprimiraju lance dsRNK u sredinu zavise od vrste ćelije i uređenja sredine. Molekul nukleinske kiseline ili konstrukt vektora se mogu direktno uvesti u ćeliju (tj., intracelularno); ili se mogu uvesti ekstracelularno u šupljinu, prostor u crevu, u cirkulaciju organizma, ili se mogu uvesti oralnim putem, ili se mogu uvesti kupanjem organizma ili ćelije u rastvoru koji sadrži dsRNK. Ta ćelija poželjno predstavlja ćeliju sisara; poželjnije humanu ćeliju. Molekul nukleinske kiseline vektora
2
ekspresije može da uključi sens region i antisens region. Antisens region može da obuhvati sekvencu koja je komplementarna sa RNK ili DNK sekvencom koja kodira hsp47 a sens region može da obuhvati sekvencu koja je komplementarna sa antisens regionom. Molekul nukleinske kiseline može da obuhvati dva različita lanca koja imaju komplementarne sens i antisens regione. Molekul nukleinske kiseline može da obuhvati jedan lanac koji ima komplementarne sens i antisens regione.
[0134] Molekuli nukleinske kiseline koji su u interakciji sa ciljnim RNK molekulima i koji nishodno regulišu gen koji kodira ciljne RNK molekule (npr., ciljni RNK molekuli numerisani prema Genbank Accession datom u ovom tekstu) mogu biti eksprimirani iz jedinica transkripcije umetnutih u DNK ili RNK vektore.
Rekombinantni vektori mogu biti DNK plazmidi ili viralni vektori. Molekul nukleinske kiseline koji eksprimira viralne vektore može biti konstruisan na osnovu, ali bez ograničenja na, adeno- virus, retrovirus, adenovirus, ili alfavirus. Rekombinantni vektori mogu da eksprimiraju molekule nukleinske kiseline mogu biti isporučeni kako je opisano u ovom tekstu, i mogu ostati u ciljnim ćelijama. Alternativno, viralni vektori se mogu koristiti radi obezbeđivanja prolazne ekspresije molekula nukleinske kiseline. Primena takvih vektora se može ponavljati po potrebi. Jednom eksprimirani, molekuli nukleinske kiseline se vezuju i nishodno regulišu funkciju gena ili ekspresiju preko RNK interferencije (RNKi). Isporuka molekula nukleinske kiseline koji eksprimiraju vektore može biti sistemska, kao što je intravenskom ili intramuskularnom primenom, primenom na ciljne ćelije eksplantirane iz subjekta nakon čega se ponovo ubacuju u subjekat, ili bilo kojim drugim sredstvima koja će omogućiti ubacivanje u željenu ciljnu ćeliju.
[0135] U drugom aspektu, ovaj opis se odnosi na farmaceutsku formulaciju koja obuhvata jedan ili više fiziološki prihvatljivih sredstava aktivnih po površini, farmaceutskih nosača, razblaživača, ekscipijenasa, i agenasa za suspenziju, ili njihovu kombinaciju; i formulaciju (npr., formulaciju koja može da uključi jedinjenje, retinoid, drugi lipid, stabilizator, i/ili terapeutski agens) opisan u ovom tekstu. Prihvatljivi dodatni farmaceutski nosači ili razblaživači za terapeutsku upotrebu su dobro poznati u oblasti farmacije, i opisani su, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Konzervansi, stabilizatori, boje, i njima slični mogu biti obezbeđeni u farmaceutskoj formulaciji. Na primer, natrijum benzoat, askorbinska kiselina i estri p-hidroksibenzoične kiseline mogu da se dodaju kao konzervansi. Pored toga, antioksidansi i sredstva za suspenziju se mogu koristiti. U raznim primerima izvođenja ovog pronalaska, alkoholi, estri, sulfatni alifatični alkoholi, i njima slični se mogu koristiti kao agensi aktivni po površini; saharoza, glukoza, laktoza, skrob, kristalizovana celuloza, manitol, blagi bezvodni silikat, magnezijum aluminat, magnezijum metasilikat aluminat, sintetički aluminijum silikat, kalcijum karbonat, natrijum kiseli karbonat, kalcijum vodonik fosfat, kalcijum karboksimetil celuloza, i njima slični se mogu koristiti kao ekscipijensi; kokosovo ulje, maslinovo ulju, susamovo ulje, ulje od kikirikija, soja se mogu koristiti kao sredstva za suspenziju ili lubrikanti; celuloza acetat ftalat kao derivat ugljenog hidrata kao što je celuloza ili šećer, ili metilacetat-metakrilat kopolimer kao derivat polivinila se mogu koristiti kao sredstva za suspenziju; a plastifikatori kao što su ester ftalati i njima slični se mogu koristiti kao sredstva za suspenziju.
[0136] Farmaceutske formulacije opisane u ovom tekstu se mogu davati humanom pacijentu per se, ili u farmaceutskim formulacijama gde su pomešane sa drugim aktivnim sastojcima, kao u kombinovanoj terapiji, ili prigodnim farmaceutskim nosačima ili ekscipijens(om)ima. Tehnike za formulaciju i davanje jedinjenja za instant primenu se mogu naći u "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition, 1990.
[0137] Prikladni putevi primene mogu da uključe, na primer, parenteralnu isporuku, uključujući intramuskularnu, supkutanu, intravensku, intramedularne injekcije, kao i intratekalne, direktne intraventrikularne, intraperitonealne, intranazalne, ili intraokularne injekcije. Formulacija (npr., formulacija koja može da uključi jedinjenje, retinoid, drugi lipid, stabilizator, i/ili terapeutski agens) se takođe može primenjivati u obliku doznih oblika sa produženim ili kontrolisanim otpuštanjem, uključujući depo injekcije, osmotske pumpe, i njima slične, za produženu i/ili vremenski određenu, pulsirajuću primenu pri prethodno ustanovljenoj brzini. Pored toga, put primene može biti lokalni ili sistemski.
[0138] Farmaceutske formulacije mogu biti proizvedene na način koji je sam po sebi poznat, npr., putem konvencionalnog mešanja, rastvaranja, granulacije, pravljenja dražeja, sprašivanjem, emulgovanjem, kapsuliranjem, ili procesima hvatanja ili tabletiranja.
[0139] Farmaceutske formulacije mogu biti formulisane na bilo koji konvencionalan način upotrebom jednog ili više fiziološki prihvatljivih farmaceutskih nosača koji obuhvataju ekscipijense i pomoćna sredstva koja olakšavaju preradu aktivnih jedinjenja u preparate koji mogu da se koriste u farmaceutske svrhe.
Ispravna formulacija zavisi od odabranog puta primene. Bilo koja od dobro poznatih tehnika, farmaceutski nosači, i ekscipijensi se mogu koristiti kako prigodni i shvaćeni u tehnici; npr., u Remington's Pharmaceutical Sciences, navedenim gore.
[0140] Preparati za ubrizgavanje se mogu pripremiti na konvencionalan način, ili kao tečni rastvori ili suspenzije, čvrsti oblici prigodni za rastvor ili suspenziju u tečnosti pre ubrizgavanja, ili kao emulzije.
Prigodni ekscipijensi su, na primer, voda, fiziološki rastvor, saharoza, glukoza, dekstroza, manitol, laktoza, lecitin, albumin, natrijum glutamat, cistein hidrohlorid, i njima slični. Pored toga, po želji, farmaceutske formulacije za ubrizgavanje mog uda sadrže manje količine netkosičnih poželjnih supstanci, kao što su sredstva za kvašenje, sredstva za puferovanje pH, i njima slična. Fiziološki kompatibilni puferi uključuju, ali bez ograničenja na, Hankov rastvor, Ringerov rastvor, ili pufer fiziološkog rastvora. Po želji, apsorpcija koja pojačava preparate se može koristiti.
[0141] Farmaceutske formulacije za parenteralnu primenu, npr., bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom, uključuju vodene rastvore aktivne formulacije (npr., formulacija koja može da uključi jedinjenje, retinoid, drugi lipid, stabilizator, i/ili terapeutski agens) u obliku koji je rastvorljiv u vodi. Pored toga, suspenzije aktivnih jedinjenja se mogu pripremiti u formi prigodnih uljanih suspenzija za injekcije. Vodene
1
suspenzije za injekciju mogu sadržati supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, kao što je natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, ili dekstran. Opciono, ova suspenzija takođe može da sadrži prigodne stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja kako bi se omogućila priprema visoko koncentrovanih rastvora. Formulacije za injekciju mogu biti upakovane kao jedinični dozni oblik, npr., u ampulama ili višedoznim sudovima, sa dodatim konzervansom. Formulacije mogu imati takve oblike kao suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim nosačima, i mogu sadržati formulacijska sredstva kao što su sredstva za suspenziju, stabilizatori i/ili sredstva za disperziju. Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praška za konstituisanje sa prigodnim nosačem, npr., sterilnom vodom koja ne sadrži pirogen, pre upotrebe.
[0142] Pored prethodno opisanih preparata, formulacije takođe mogu biti formulisane kao depo preparati. Takve formulacije sa dugotrajnim dejstvom se mogu primenjivati kao intramuskularna injekcija. Na taj način, na primer, formulacije (npr., formulacija koja može da uključi jedinjenje, retinoid, drugi lipid, stabilizator, i/ili terapeutski agens) mogu biti formulisane sa prigodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili jonoizmenjivačke smole, ili slabo rastvorljivi derivati, na primer, kao slabo rastvorljiva so.
[0143] Neki primeri izvođenja ovog pronalaska dati u ovom tekstu su usmereni na metodu isporuke terapeutskog agensa ćeliji. Na primer, neki primeri izvođenja ovog pronalaska su usmereni na metodu isporuke terapeutskog agensa kao što je siRNK u ćeliju. Prigodne ćelije za upotrebu prema ovim metodama opisanim u ovom tekstu uključuju prokariote, plesni, ili više eukarotične ćelije, uključujući biljne i životinjske ćelije (npr., ćelije sisara). U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, te ćelije mogu biti ćelije humanog fibrosarkoma (npr., HT1080 ćelijska linija). U drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, ove ćelije mogu biti ćelije kancera. Ćelijske linije koje predstavljaju sisteme modela za kancer se mogu koristiti, uključujući ali bez ograničenja na kancer dojke (MCF-7, MDA-MB-438 ćelijske linije), U87 ćelijska linija glioblastoma, B16F0 ćelije (melanoma), HeLa ćelije (kancer grlića materice), A549 ćelije (kancer pluća), i ćelijske linije tumora kod pacova GH3 i 9L. U ovim primerima izvođenja ovog pronalaska, formulacije opisane u ovom tekstu se mogu koristiti da transfektuju ćeliju. Ovi primeri izvođenja ovog pronalaska mogu da uključe kontaktiranje ćelijske linije sa formulacijom opisanom u ovom tekstu koja uključuje terapeutski agens, kako bi se samim tim terapeutski agens isporučio do te ćelije.
[0144] U ovom tekstu su opisane metode za lečenje stanja koje karakteriše abnormalna fibroza, koja može da obuhvati davanje terapeutski efektivne količine formulacija opisane u ovom tekstu. Stanja koje karakteriše abnormalna fibroza mogu da uključe kancer i/ili fibrotičnu bolest. Vrste kancera koje mogu da se leče ili čije stanje može da se poboljša formulacijama opisanim u ovom tekstu uključuju, ali bez ograničenja na, kancer pluća, kancer pankreasa, kancer dojke, kancer jetre, kancer želuca, i kancer debelog creva. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, kancer koji može da se leči ili čije stanje može da se
2
poboljša je kancer pankreasa. U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, kancer koji može da se leči ili čije stanje može da se poboljša je kancer pluća. Vrste fibrotične bolesti koje se mogu lečiti ili čija se stanja mogu poboljšati formulacijama opisanim u ovom tekstu uključuju, ali bez ograničenja na, hepatičnu fibrozu, cirozu jetre, pankreatitis, fibrozu pankreasa, cističnu fibrozu, polipe na glasnim žicama, fibrozu sluznice glasne žice, laringalnu fibrozu, pulmonarnu fibrozu, idiopatsku pulmonarnu fibrozu, cističnu fibrozu, mijelofibrozu, retroperitonealnu fibrozu, i nefrogensku sistemsku fibrozu. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, stanje koje se može lečiti ili poboljšati je hepatična fibroza.
[0145] Formulacije ili farmaceutske kompozicije opisane u ovom tekstu se mogu davati subjektu pomoću bilo kojih prigodnih sredstava. Ne-ograničavajući primeri metoda primene uključuju, između ostalih, (a) primenu putem injekcije, supkutano, intraperitonealno, intravenski, intramuskularno, intradermalno, intraorbitalno, intrakapsularno, intraspinalno, intrasternalno, ili njima slično, uključujući isporuku putem pumpe za infuziju; (b) lokalnu primenu direktno injekcijom u renalni ili srčani deo, npr., ugradnjom depoa; kao i na način koji stručnjaci smatraju prikladnim da se aktivno jedinjenje dovede u kontakt sa živim tkivom.
[0146] Farmaceutske kompozicije prigodne za primenu uključuju formulacije (npr., formulacija koja može da uključi jedinjenje, retinoid, drugi lipid, stabilizator, i/ili terapeutski agens) pri čemu su aktivni sastojci prisutni u količini koja je efektivna da se postigne ciljna svrha. Terapeutski efektivna količina jedinjenja opisanih u ovom tekstu je potrebna budući da doza zavisi od puta primene, vrste životinje, uključujući čoveka, koja se leči, i fizičkih osobina specifične životinje koja je u razmatranju. Doza se može prilagoditi kako bi se postigao željeni efekat, ali zavisi i od faktora kao što su ishrana, istovremenog uzimanja leka i drugih faktora koje medicinski stručnjaci prepoznaju. Određenije, terapeutski efektivna količina označava količinu kompozicije koja je efektivna da spreči, ublaži ili poboljša simptome bolesti ili da produži život subjekta koji se leči. Određivanje terapeutski efektivne količine je u domenu stručnjaka, posebno imajući u vidu detaljan opis iz ovog teksta.
[0147] Kao što brzo postane očigledno jednom stručnjaku, korisna in vivo doza koju je potrebno primeniti i određeni režim primene zavise od uzrasta, težine i vrste sisara koji se leči, određenog jedinjenje koje se koristi , i specifične upotrebe zbog koje se ova jedinjenja upotrebljavaju. Određivanje nivoa efektivne doze, odnosno nivoa doze potrebnih da bi se postigao željeni rezultat, može realizovati stručnjak upotrebom rutinskih farmakoloških metoda. Obično, humane kliničke primene proizvoda počinju sa nižim dozama, pri čemu se nivo doze povećava dok se ne postigne željeni efekat. Alternativno, prihvatljiva in vitro ispitivanja mogu da se upotrebljavaju kako bi se utvrdile korisne doze i putevi primene kompozicija identifikovanih ovim metodama upotrebom ustanovljenih farmakoloških metoda.
[0148] U ne-humanim ispitivanjima sprovedenim nad životinjama, primene potencijalnih proizvoda su započete sa višim nivoima doza, pri čemu se doza smanjuje dok se prestane sa postizanjem željenog efekta ili dok neželjena dejstva ne nestanu. Dozni oseg može biti prilično širok, u zavisnosti od željenih efekata i terapeutske indikacije. Obično, doze mogu iznositi oko 10 mikrograma/kg do oko 100 mg/kg telesne mase, poželjno oko 100 mikrograma/kg do oko 10 mg/kg telesne mase. Alternativno doze mogu biti bazirane i izračunate na osnovu površine pacijenta, prema shvatanju stručnjaka.
[0149] Tačnu formulaciju, put primene i dozu za farmaceutske kompozicije može odabrati doktor u zavisnosti od stanja pacijenta. (Videti npr., Fingl et al.1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", sa posebnim pozivanjem na Ch.1, p.1). Obično, dozni opseg kompozicije koja se primenjuje kod pacijenta može biti od oko 0.5 do oko 1000 mg/kg telesne mase pacijenta. Doza može biti jedna ili to može biti serija od dve ili više da tih doza tokom jednog ili više dana, prema potrebi pacijenta. U slučajevim gde su humane doze za jedinjenja ustanovljene za najmanje neko stanje, doze će biti oko iste, ili doze koje su oko 0.1% do oko 500%, poželjnije oko 25% do oko 250% ustanovljene humane doze. Tamo gde je humana doza ustanovljena, kao što je to slučaj sa novo-otkrivenim farmaceutskim kompozicijama, prigodna humana doza može biti izvedena iz ED50ili ID50vrednosti, ili drugih odgovarajućih vrednosti izvedenih iz in vitro ili in vivo ispitivanja, kako je kvalifikovano ispitivanjima toksičnosti i efikasnosti kod životinja.
[0150] Trebalo bi imati u vidu da bi doktor znao kako i kada da završi, prekine ili prilagodi primenu usled toksičnosti ili poremećaja funkcije organa. Nasuprot tome, odlazak kod doktora bi takođe odgovorio na to kako prilagoditi terapiju višim nivoima ukoliko klinički odgovor nije adekvatan (isključujući toksičnost). Značaj primenjene doze u lečenju poremećaja od interesa zavisi od ozbiljnosti stanja koje se leči i puta primena. Ozbiljnost stanja može, na primer, biti procenjena, delom, standardnim prognostičkim metodama procene. Dalje, doza i možda učestalost doziranja, takođe variraju prema starosnoj dobi, telesnoj težini, i odgovoru pojedinačnog pacijenta. Program koji se može uporediti sa ovim o kom je bilo reči gore iznad se može koristiti i u veterinarskoj medicini.
[0151] Iako se tačna doza određuje po principu od leka-do-leka, u većini slučajeva, neke generalne činjenice vezano za doziranje mogu biti ustanovljene. Dnevni režim doziranja za odraslog humanog pacijenta može biti, na primer, doza od oko 0.1 mg do 2000 mg svakog aktivnog sastojka, poželjno oko 1 mg do oko 500 mg, npr.5 do 200 mg. U drugim primerima izvođenja ovog pronalaska, intravenska, supkutana, ili intramuskularna doza svakog aktivnog sastojka od oko 0.01 mg do oko 100 mg, poželjno oko 0.1 mg do oko 60 mg, npr. oko 1 do oko 40 mg se upotrebljava. U slučajevima primene farmaceutski prihvatljive soli, doze se mogu izračunati kao slobodna baza. U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, formulacija se primenjuje 1 do 4 puta dnevno. Alternativno formulacije se mogu primenjivati putem kontinuirane intravenske infuzije, poželjno sa dozom svakog aktivnog sastojka do oko 1000 mg dnevno. Stručnjaci to shvataju da u nekim situacijama može biti neophodno da se primene formulacije opisane u ovom tekstu u količinama koje su više ili, značajno više, od gore navedenog, poželjnog doznog opsega kako bi se efektivno i agresivno lečile naročito agresivne bolesti ili infekcije. U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska,
4
formulacije se primenjuju za vreme trajanja kontinuirane terapije, na primer tokom jedne nedelje ili više, ili mesecima ili godinama.
[0152] Količina doze i interval se mogu individualno prilagoditi kako bi se obezbedili nivoi plazme aktivne polovine koji su dovoljni za održavanje efekata moduliranja, ili minimalne efektivne koncentracije (MEC). MEC se razlikuje za svako jedinjenje ali može da se proceni na osnovu in vitro podataka. Doze koje su neophodne da bi se postigla MEC zavise od individualnih karakteristika i puta primene. Međutim, ogledi ili biološki ogledi sa HPLC-om se mogu koristiti kako bi se odredile koncentracije u plazmi.
[0153] Dozni intervali se takođe mogu odrediti upotrebom MEC vrednosti. Kompozicije bi trebalo davati koristeći režim koji održava nivoe u plazmi iznad MEC za 10-90% vremena, poželjno između 30-90% a najpoželjnije između 50-90%.
[0154] U slučajevima lokalne primene ili selektivnog unošenja, efektivna lokalna koncentracija leka ne sme biti povezana sa koncentracijama u plazmi.
[0155] Količina formulacija koja se primenjuje može da zavisi od subjekta koji se leči, od telesne mase subjekta, ozbiljnosti bolesti, načina primene i mišljenja doktora koji taj lek prepisuje.
[0156] Efikasnost i toksičnost formulacija opisanih u ovom tekstu (npr., formulacija koja može da uključi jedinjenje, retinoid, drugi lipid, stabilizator, i/ili terapeutski agens) se može proceniti upotrebom poznatih metoda. Na primer, toksikologija određenog jedinjenja, ili podskupa jedinjenja, koja dele iste hemijske polovine, može biti utvrđena određivanjem in vitro toksičnosti prema ćelijskoj liniji, kao što je ćelijska linija sisara, poželjno, čoveka. Rezultati takvih ispitivanja su često predvidivi kada se radi o toksičnosti kod životinja, kao što su sisari, ili određenije, ljudi. Alternativno, toksičnost određenih jedinjenja u modelu životinja, kao što su miševi, pacovi, zečevi, ili majmuni se može odrediti upotrebom poznatih metoda. Efikasnost određenog jedinjenja se može ustanoviti upotrebom nekoliko priznatih metoda, kao što su in vitro metode, modeli životinja, ili klinička ispitivanja sprovedena među ljudima. Priznati in vitro modeli postoje gotovo za svaku klasu stanja, uključujući, ali bez ograničenja na kancer, kardiovaskularnu bolest, i razne poremećaje funkcije imunog sistema. Slično, prihvatljivi modeli životinja se mogu koristiti za utvrđivanje efikasnosti hemikalija kojima se leče takva stanja. Prilikom odabira modela za određivanje efikasnosti, stručnjak bi trebalo da se rukovodi stanjem tehnike kako bi odabrao odgovarajući model, dozu, i put primene, i režim. Naravno, klinička ispitivanja sprovedena među ljudima se takođe mogu koristiti za određivanje efikasnosti jedinjenja kod ljudi.
[0157] Formulacije mogu, po želji, biti prezentovane u pakovanju ili uređaj za doziranje koji može da sadrži jedan ili više jediničnih doznih oblika koji sadrže aktivni sastojak. Pakovanje može na primer da obuhvata metalnu ili plastičnu foliju, kao što je blister pakovanje. Pakovanje ili dozator mogu biti zajedno sa uputstvom za primenu. Uz pakovanje ili dozator takođe može biti priloženo i obaveštenje koja se odnosi na kontejner u formi koju pripisuje vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu, ili prodaju farmaceutskih preparata, pri čemu to obaveštenje odražava odobrenje od strane agencije oblika leka za humanu ili veterinarsku primenu. Takvo obaveštenje, na primer, može biti obeležavanje koje je odobrene od strane Američke agencije za hranu i lekove, ili odobreno uputstvo za pacijenta. Kompozicije koje obuhvataju jedinjenje formulisano u kompatibilnom farmaceutskom nosaču može takođe biti pripremljeno, i obeleženo za lečenje naznačenog stanja.
[0158] Smatra se da u bilo kom jedinjenju opisanom u ovom tekstu koje ima jedan ili više stereocentara, ukoliko apsolutna stereohemija nije izričito naznačena, onda svaki centar nezavisno može imati R-konfiguraciju ili S-konfiguraciju ili njihovu mešavinu. Stoga, jedinjenja data u ovom tekstu mogu biti enantiomerično čista ili mogu predstavljati stereoizomerne mešavine. Pored toga smatra se da, u bilo kom jedinjenju koje ima jednu ili više duplih veza koje generišu geometrijske izomere koji mogu biti definisani kao E ili Z, svaka dupla veza nezavisno može biti E ili Z ili njihova mešavina. Slično tome, predviđeno je i da svi tautomerni oblici takođe budu uključeni.
[0159] Ovaj pronalazak može dalje biti prikazan pozivanjem na sledeće primere. Ovi primeri su samo ilustrativni, i njihova svrha nije da ograniče ovaj pronalazak kako je definisano priloženim patentnim zahtevima.
PRIMERI
Primer 1 (referentni primer): Priprema 2-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetan-aminijum bromida (HEDC)
[0160]
Priprema intermedijera 1: 2,2'-(tert-butoksikarbonilazanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat (HEDC-BOC-IN)
[0161]
[0162] Rastvor N-BOC-dietanolamina (194 g, 0.946 mol), trietilamina (201 g, 2.03 mol) i diaminopiridina (23.1 g, 0.19 mol) u DCM-u (1750 mL) se ohladi do 0°C. Dodaje se rastvor miristoil-hlorida (491 g, 1.99 mol) u DCM-u (440 mL) tokom perioda od 50 minuta na 0-10°C, a zatim se mešavina ostavi da se ugreje do sobne temperature. TLC je pokazao potpunu konverziju nakon 1.5 sata na 20-24°C. Dodaje se voda (1750 mL) i pH 8.3 se izmeri pH metrom. Odvoji se organska faza, opere sa (1) 6% NaHCO3(500 mL), (2) 0.3 M HCl (1700 mL), (3) 12.5% natrijum hloridom (1700 mL), i osuši sa bezvodnim magnezijum sulfatom (120 g). Isparavanje filtrata na 50°C i 50 mBar stvara 622 g 2,2'-(tert-butoksikarbonilazanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoata, (HEDC-BOC-IN). Ovaj ostatak nakon destilacije, koji postaje čvrst nakon stajanja, se koristi u narednoj fazi.
Priprema intermedijera 2: 2,2'-(tert-butoksikarbonilazanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat (HEDC-amin-IN) so TFA
[0163]
[0164] HEDC-BOC-IN (620 g, 0.990 mol) se pretvara u tečnost kratkim zagrevanjem u 50°C-kupatilu a zatim se hladi do 25°C. Dodaje se TFA (940 mL, 1.39 kg, 1.18 mol) u tečnost tokom perioda od 30 minuta, umerenim hlađenjem kako bi se temperatura održavala da ne prelazi 25°C. Nakon dodavanja dve trećine količine TFA, primećeno je značajno razvijanje gasa. Reakciona mešavina se meša preko noći na sobnoj temperaturi. TLC ukazuje na tragove HEDC-BOC-IN. Reakciona mešavina se greje radi destilacije TFA pod smanjenim pritiskom (125-60 mBar) iz vodenog kupatila od 50-55°C, i destilacija se nastavlja dok ne postane veoma spora. TFA isparenja se apsorbuju u prečistaču vazduha sa 10% natrijum-hidroksidom. Dodaje se heptan (2000 mL), meša, i destiluje pod smanjenim pritiskom. Heptan (2000 mL) se dodaje ostatku koji je u delimično čvrstom stanju, i mešavina se zagreje do 45°C, i na toj temperaturi se formira blago zamućen rastvor. Rastvor se ohladi, zaseje na 40°C, i formira se ostatak mešanjem tokom perioda od 25 minuta na 40-36°C. Nakon hlađenja i mešanja tokom perioda od 40 minuta na sobnoj temperaturi, filtracijom se izoluje talog teških kristala, a filter kolač se opere sa heptanom (1000 mL). Vlažan filter kolač (914 g) se osuši preko noći na sobnoj temperaturi pod smanjenim pritiskom (<1 mBar) kako bi se dobilo 635 g (100%) 2,2'-(tert-butoksikarbonilazanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoata (HEDC-amin-IN) soli TFA u obliku belih kristala.
Priprema intermedijera 3: 2,2'-(2-(dimetilamino)acetilazanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradeka-noat (HEDC-DiMeGli-IN)
[0166] N,N-dimetilglicin (56.6 g, 548 mmol), HOBt hidrat (83.9 g, 548 mmol) i EDC hidrohlorid (105 g, 548 mmol) se dodaju u DMF (3.5 L), i mešavina se meša na sobnoj temperaturi tokom perioda od sat vremena. Dobija se bistar rastvor. HEDC-amin-IN so TFA (270 g, 442 mmol) se meša sa DCM (1.15 L) i 6% natrijum bikarbonatom (1.15 L). Odvojena organska faza sa slobodnim aminom se dodaje mešavini za kuplovanje u DMF, i primećuje se kako talog tako i porast temperature od oko približno 9°C. Dodaje se trietilamin (47.0 g, 464 mmol), i reakciona mešavina se meša na 25-30°C tokom perioda od pet sati. TLC ukazuje na nepotpunu konverziju, i dodaje se dodatni EDC hidrohlorid (29.5 g, 154 mmol). Nakon mešanja preko noći na sobnoj temperaturi, primećen je bistar rastvor, a TLC sada ukazuje na potpunu konverziju. Reakciona mešavina se meša sa DCM (2.3 L) i 2% natrijum bikarbonatom (7 L). Organska faza se dva puta opere sa 1.25% natrijum hloridom (5 L svaki put) i osuši sa bezvodnim magnezijum sulfatom (186 g). Filtrat se upari na 50°C i 30 mBar da bi se dobilo 253 g sirovog ulja. Sirovim materijalom se napuni kolona koja sadrži 2.6 kg Silika Gela 60 (40-63µ). Proizvod eluira sa toluen:etil acetatom (8:2) (4 L), a zatim sa etil acetat:metanolom (1:1) (5 L). Proizvod koji sadrži frakcije (3.5-8 L) isparava (50°C/250-20 mBar) kako bi se dobilo 208 g (66%) 2,2'-(2-(dimetilamino)acetilazanedil)bis(etan-2,1 -dil) ditetradekanoata (HEDC-DiMeGli-IN) u obliku ulja.
Priprema HEDC: 2-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksetanaminijum bromid
[0167]
[0168] Mešavina HEDC-DiMeGli-IN (206 g, 337 mmol) i 2-bromoetanola (274 g, 2.19 mol) se meša na 80°C tokom perioda od dva sata. HPLC je pokazao 8.1% neizreagovanog dimetilglicin-intermedijera. Nakon dodatnog perioda od 40 minuta na 80°C, HPLC je pokazao 7.8% neizreagovanog dimetilglicin-intermedijera. Dodaje se topao (65°C) etil acetat (2 L). Slepa filtracija toplog rastvora se opere sa toplim etil-acetatom (0.5 L). Kombinovani filtrati se ohlade do 0°C, i kristalizacija se započinje sejanjem. Suspenzija proizvoda se polako ohladi i meša na -16 do -18°C tokom perioda od 40 minuta. Talog se izdvaja filtracijom, a filter kolač se opere sa hladnim etil-acetatom (200 mL). Sušenjem preko noći (20°C/<1mBar) se dobija 211 g sirovog materijala. Ovaj materijal se zatim ponovo kristališe iz mešavine etil-acetata (2.1 L) i etanola (105 mL) zagrevanjem do 35°C i sejanjem na 25°C. Talog se izdvaja na 10°C, opere sa hladnim etil-acetatom (300 mL) i osuši (20°C/<1 mBar) preko noći kako bi se dobilo 161 g (66%) 2-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetanaminijum bromida (HEDC). HPLC je pokazao 99.5% čistoće. QTOF MS ESI+: m/z 655.6 (M H).
Primer 2 (referentni primer): Priprema 2-(bis(3-(tetradekanoiloksi)propil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-okso-etanaminijum bromida (Pr-HEDC)
[0169]
Priprema intermedijera 1: 3,3'-azanedilbis(propan-1-ol)
[0170]
[0171] Mešavina 3-amino-1-propanola (14.5 mL, 19.0 mmol), 1-hloro-3-hidroksi propana (8 mL, 95.6 mmol) i H2O (∼50 mL) je pod stalnim vrenjem tokom 24 sata. Zatim se dodaje kalijum-hidroksid (5.40 g). Nakon rastvaranja, sva H2O isparava i ostaje viskozno ulje i velike količine kalijum-hlorida. Oni se profilitriraju i operu sa suvim acetonom i dihlorometanom. Organska faza se osuši preko Na2SO4, filtrira, i koncentruje. Proizvod se zatim prečisti hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom kako bi se dobilo 12.5 g 3,3'-azanedilbis(propan-1-ol)-a.
Priprema intermedijera 2: tert-butil bis(3-hidroksipropil)karbamat
[0172]
[0173] 3,3'-Azanedilbis(propan-1-ol) (12.5g, 95.4mmol) se razblaži u DCM-u (25mL). Rastvor di-tert-butil dikarbonata (26g, 119.25mmol) u DCM-u (25mL) se polako dodaje uz mešanje pod omotačem Ar gasa. Reakcija se ostavi da se meša preko noći. Reakciona mešavina se koncentruje. Prečišćavanjem hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom se dobija tert-butil bis(3-hidroksipropil)karbamat.
Priprema intermedijera 3: ((tert-butoksikarbonil)azanedil)bis(propan-3,1-dil) ditetradekanoat
[0174]
[0175] tert-Butil bis(3-hidroksipropil)karbamat (4.00 g, 17.3 mmol), trietilamin (4.80 ml, 34.6 mmol) i 4-dimetilaminopiridin (529 mg, 4.33 mmol) se rastvore u hloroformu (50 mL). Dok se meša u ledenom kupatilu, rastvor miristoil-hlorida se dodaje za ∼15 min. Dodavanje se sprovodi tako da temperatura reakcije ne prelazi 30°C. Reakcija se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Narednog dana, MeOH (50 mL) i 0.9% fiziološki rastvor (50 mL) se dodaju da bi se ugasila reakcija. Izdvaja se organski sloj i opere sa 1M NaHCO3. Rastvarač se osuši sa Na2SO4, filtrira, i koncentruje in vacuo kako bi se dobio ((tertbutoksikarbonil)azanedil)bis(propan-3,1-dil) ditetradekanoat u obliku ulja.
Priprema intermedijera 4: azanedilbis(propan-3,1-dil) ditetradekanoata so TFA
[0176]
[0177] ((tert-butoksikarbonil)azanedil)bis(propan-3,1-dil) ditetradekanoat (11.3g, 17.3 mmol) se rastvori u TFA/CHCl3(1:1, 20mL) a zatim se mešavina ostavi da se meša na sobnoj temperaturi 15 minuta. Zatim se mešavina koncentruje in vacuo. Ovo je ponovljeno drugi put. Zatim se ostatak rastvara u DCM-u i opere sa H2O, osuši sa Na2SO4, i koncentruje in vacuo. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje azanedilbis(propan-3,1-dil) ditetradekanoat u obliku soli TFA (750mg).
Priprema intermedijera 5: ((2-(dimetilamino)acetil)azanedil)bis(propan-3,1-dil) ditetradekanoat [0178]
[0179] Azanedilbis(propan-3,1-dil) ditetradekanoat so TFA (750mg, 1.35 mmol) se razblaži sa DCM (5mL) i dodaje se prethodno aktiviranoj mešavini N,N-dimetilglicina (154mg, 1.49mmol), HATU (616mg, 1.62mmol) i DIEA (495uL, 2.84mmol) u DCM-u (5mL). Proizvod se ispira argonom i meša na sobnoj temperaturi preko
4
noći, a zatim koncentruje. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje 465 mg ((2-(dimetilamino)acetil)azanedil)bis(propan-3,1-dil)ditetradekanoata.
Priprema Pr-HEDC: 2-(bis(3-(tetradekanoiloksi)propil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetanaminijum bromid
[0180]
[0181] U zatvorenom sistemu, ((2-(dimetilamino)acetil)azanedil)bis(propan-3,1-dil) ditetradekanoat (246 mg, 0.385 mmol) se rastvori u ACN (10 mL), i dodaje se 2-bromoetanol (500 uL). Reakcioni sud se ispira inertnim gasom a zatim zatvara. Mešavina se zagreje do 80°C, meša preko noći, a zatim ohladi i koncentruje in vacuo. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje 99 mg 2-(bis(3-(tetradekanoiloksi)propil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetanaminijum bromida. QTOF MS ESI+: m/z 683.6 (M H).
Primer 3 (referentni primer): Priprema 2-(bis(3-(oleoiloksi)propil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetanaminijum bromida (Pr-HE-DODC)
[0182]
Priprema intermedijera 1: (Z)-((tert-butoksikarbonil)azanedil)bis(propan-3,1-dil) dioleat
[0183]
[0184] tert-Butil bis(3-hidroksipropil)karbamat (prethodno opisana sinteza), trietilamin i DMAP se rastvore u hloroformu. Dok se meša u ledenom kupatilu, rastvor oleoil-hlorida se dodaje za 15 min. Dodavanje se sprovodi tako da temperatura reakcije ne prelazi 30°C. Reakcija se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Narednog dana, MeOH (50 mL) i 0.9% fiziološki rastvor (50mL) se dodaju da bi se ugasila reakcija. Izdvaja se organski sloj i opere sa 1M NaHCO3. Rastvarač se osuši sa Na2SO4, filtrira i koncentruje kako bi se dobilo ulje. (Z)-((tert-butoksikarbonil)azanedil)bis(propan-3,1-dil) dioleat je prenesen bez i daljeg prečišćavanja.
Priprema intermedijera 2: (Z)-azanedilbis(propan-3,1-dil) dioleat so TFA
[0185]
[0186] (Z)-((tert-Butoksikarbonil)azanedil)bis(propan-3,1-dil) dioleat (13.2 g, 17.3 mmol) se rastvori u TFA/CHCl3(1:1, 20 mL) a zatim se mešavina ostavi da se meša na sobnoj temperaturi 15 min. Zatim se mešavina koncentruje in vacuo. Ovo je ponovljeno drugi put. Zatim se ostatak rastvara u DCM-u i opere sa H2O, osuši sa Na2SO4i koncentruje. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje (Z)-azanedilbis(propan-3,1-dil) dioleat so TFA (750 mg).
Priprema intermedijera3: (Z)-((2-(dimetilamino)acetil)azanedil)bis(propan-3,1-dil) dioleat
[0187]
[0188] (Z)-azanedilbis(propan-3,1-dil) dioleat so TFA (750 mg, 1.13 mmol) se razblaži sa DCM (5 mL) i dodaje se prethodno aktiviranoj mešavini N,N-dimetilglicina (128 mg, 1.24 mmol), HATU (517 mg, 1.36 mmol) i DIEA (413 uL, 2.37 mmol) u DCM-u (5 mL). Sud se ispere argonom i ostavi se da se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina se koncentruje, i podvrgava hromatografiji sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom kako bi se dobio (Z)-((2-(dimetilamino)acetil)azanedil)bis(propan-3,1-dil) dioleat.
Priprema Pr-HE-DODC: 2-(bis(3-(oleoiloksi)propil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetanaminijum bromid
[0189]
[0190] U zatvorenom sistemu, (Z)-((2-(dimetilamino)acetil)azanedil)bis(propan-3,1-dil) dioleat (269 mg, 0.360 mmol) se rastvori u ACN (10 mL) i dodaje se 2-bromoetanol (200 uL). Reakcioni sud se ispira inertnim gasom a zatim zatvara. Reakcija se zagreje do 80°C i ostavi da se meša preko noći. Reakciona mešavina se ohladi i koncentruje. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje 2(bis(3-(oleoiloksi)propil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetanaminijum bromid (129 mg). QTOF MS ESI+: m/z 791.7 (M H).
Primer 4 (referentni primer): Priprema 3-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-3-oksopro-pan-1-aminijum bromid (HE-Et-DC)
[0191]
Priprema intermedijera 1: ((3-(dimetilamino)propanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradeka-noat [0192]
[0193] Sinteza azanedilbis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat soli TFA prethodno opisana. Azanedilbis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat so TFA (1.5 g, 2.85 mmol) se razblaži sa DCM (10 mL) i dodaje se prethodno aktiviranoj mešavini HCL soli 3-(dimetilamino)propionske kiseline (482mg, 3.14 mmol), HATU (1.30 g, 3.42 mmol) i DIEA (1.04 mL, 5.98 mmol) u DCM-u (10 mL). Sud sa okruglim dnom se ispere argonom a reakciona mešavina se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina se koncentruje. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje ((3-(dimetilamino)propanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat.
Priprema HE-Et-DC: 3-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-3-oksopropan-1-aminijum bromid
[0194]
[0195] U zatvorenom sistemu, ((3-(dimetilamino)propanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat (606mg, 0.970mmol) se rastvori u ACN (10 mL) i dodaje se 2-bromoetanol (500 uL). Reakcioni sud se ispira inertnim gasom a zatim zatvara. Reakcija se zagreje do 80°C i meša preko noći, zatim se ohladi i koncentruje. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje 3-(bis(2-
4
(tetradekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-3-oksopropan-1-aminijum bromid (80 mg). QTOF MS ESI+: m/z 669.6 (M H).
Primer 5 (referentni primer): Priprema 3-(bis(2-(oleoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-3-oksopropan-1-aminijum bromid (HE-Et-DODC)
[0196]
Priprema intermedijera 1: (Z)-((tert-butoksikarbonil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat
[0197]
[0198] N-Boc dietanolamin (Aldrich 15268, Lot# 0001406013, MW 205.25; 17.81 g, 0.087 mol), trietilamin (Aldrich, MW 101.19; 24.4 ml, 0.176 mol) i 4-(dimetilamino)piridin (Aldrich, MW 122.17; 2.76 g, 1.3 g, 0.023 mol) se rastvore u 350 ml hloroforma. Dok se meša, dodaje se rastvor oleoil-hlorida (MW 300.91; 61.6 g, 0.174 mol) u 100 ml hloroforma u roku od 10 minuta (Alternativno, rastvor hloroforma N-Boc dietanolamina se uroni u ledeno/vodeno kupatilo dok se oleoil-hlorid dodaje). Dodavanje se sprovodi tako da temperatura reakcione mešavine ne prelazi 50°C. Reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 2 sata. Dodaje se mešavina 200 ml metanola (EMD MX0485-5, Lot 50350) i 200 ml 0.9% fiziološkog rastvora (natrijum-hlorid, BDH, BDH8014, Lot# 92717) da bi se ugasila reakcija. Izdvaja se organski sloj i opere se sa 2 × 100 ml razblaženog vodenog natrijum bikarbonata (Aldrich S6014, Batch# 095K0143). Rastvarač se uklanja rotacionim isparavanjem kako bi se dobilo 59.5 g sirovog proizvoda u obliku bledo žutog ulja (MW 734.14; 59.5 g, 0.081 mol, 100% prinos). Ovaj materijal se koristi za narednu fazu bez daljeg prečišćavanja.
1H NMR (400 MHz, CDC13) 0.87 (t,6H, CH3), 1.20-1.40 (m, 40H, CH2), 1.45 (s, 9H, tBu CH3), 1.59 (m, 4H, CH2CH2C(=O)), 2.00(m, 8H, CH2CH=CH), 2.33 (t, 4H, CH2C(=O)), 3.48 (m, 4H, NCH2CH2O), 4.18 (m, 4H,NCH2CH2O), 5.33 (m, 4H, CH=CH).
Priprema intermedijera 2: (Z)-azanedilbis(etan-2,1-dil) dioleata so TFA
[0200] (Z)-((tert-butoksikarbonil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat (59.5 g, 0.081 mol) se tretira dva puta sa 100 ml trifluoroacetičnom kiselinom (Alfa Aesar Stock# A12198, Lot# D07W005, MW 114.02; 100 ml, 1.35 mol) i 100 ml hloroforma (Aldrich 154733, Lot# KBF5943V). Svaki se sastoji od mešanja na sobnoj temperaturi deset minuta, i rastvarač se uklanja rotacionim isparavanjem na kraju svakog tretmana. Nakon drugog tretmana, reakciona mešavina se koncentruje rotacionim isparavanjem. Ostatak se rastvori u 200 ml metilen-hlorida i mešavina se opere sa 100 ml vode dva puta. Ostatak se prečišćava hromatografijom sa silika gelom upotrebom mešavina metanola (EMD MX0485-5, Lot 50350) i metilen-hlorida (EMD DX0835-5, Lot 51090) u funkciji eluensa kako bi se dobilo 44 g (Z)-azanedilbis(etan-2,1-dil) dioleat soli TFA (44.0 g).1H NMR (400 MHz, CDC13) 0.87 (t, 6H, CH3), 1.20-1.40 (m, 40H, CH2), 1.59 (m, 4H, CH2CH2C(=O)),2.00 (m, 8H, CH2CH=CH), 2.33 (t, 4H, CH2C(=O)), 3.31 (m, 4H, NCH2CH2O), 4.38 (m, 4H, NCH2CH2O), 5.33 (m, 4H, CH=CH).
Priprema intermedijera 3: (((Z)-((3-(dimetilamino)propanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat
[0201]
[0202] (Z)-azanedilbis(etan-2,1-dil) dioleat so TFA (1.50 g, 2.37 mmol) se razblaži sa DCM (10 mL) i dodaje se prethodno aktiviranoj mešavini HCl soli 3-(dimetilamino)propionske kiseline (383 mg, 2.49 mmol), HATU (1034 mg, 2.72 mmol) i DIEA (831 uL, 4.77 mmol) u DCM-u (10 mL). Sud sa okruglim dnom se ispere argonom a reakciona mešavina se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina se koncentruje. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje (Z)-((3-(dimetilamino)propanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat.
Priprema HE-Et-DODC: 3-(bis(2-(oleoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-3-okso-propan-1-aminijum bromid
[0203]
4
[0204] U zatvorenom sistemu, (((Z)-((3-(dimetilamino)propanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat (588 mg, 0.802 mmol) se rastvori u ACN (10 mL) i dodaje se 2-bromoetanol (200 uL). Reakcioni sud se ispira inertnim gasom a zatim zatvara. Reakcija se zagreje do 80°C i meša preko noći, zatim se ohladi i koncentruje in vacuo. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje 3-(bis(2-(oleoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-3-oksopropan-1 -aminijum bromid (160 mg). QTOF MS ESI+: m/z 764.3 (M H).
Primer 6 (referentni primer): Priprema 4-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-4-oksobutan-1-aminijum bromid (HE-Pr-DC)
[0205]
Priprema intermedijera 1: ((4-(dimetilamino)butanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetra-dekanoat [0206]
[0207] Sinteza azanedilbis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat soli TFA prethodno opisana. Azanedilbis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat so TFA (1.00 g, 1.90 mmol) se razblaži sa DCM (5 mL) i dodaje se prethodno aktiviranoj mešavini 4-(dimetilamino) HCl soli buterne kiseline (382 mg, 2.28 mmol), HATU (867 mg, 2.28mmol) i DIEA (728 uL, 4.18 mmol) u DCM-u (5 mL). Sud se ispere argonom i reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi preko noći, a zatim koncentruje. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje ((4-(dimetilamino)butanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat.
Priprema HE-Pr-DC: 4-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-4-oksobutan-1-aminijum bromid
[0208]
[0209] U zatvorenom sistemu, ((4-(dimetilamino)butanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat (300 mg, 0.469 mmol) se rastvori u ACN (5 mL) i dodaje se 2-bromoetanol (500 uL). Reakcioni sud se ispira
4
inertnim gasom a zatim zatvara. Reakcija se zagreje do 80°C i meša preko noći, a zatim koncentruje.
Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje 4-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-4-oksobutan-1-aminijum bromid (140 mg). LCMS ESI+: m/z 684.4 (M H).
Primer 7 (referentni primer): Priprema 4-(bis(2-(oleoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-4-oksobutan-1-aminijum bromida (HE-Pr-DODC)
[0210]
Priprema intermedijera 1: (Z)-((4-(dimetilamino)butanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil)dioleat
[0211]
[0212] Sinteza (Z)-azanedilbis(etan-2,1-dil) dioleat soli TFA prethodno opisane. (Z)-azanedilbis(etan-2,1-dil) dioleat so TFA (1.00 g, 1.58 mmol) se razblaži sa DCM (5 mL) i dodaje se prethodno aktiviranoj mešavini 4-(dimetilamino) HCl soli buterne kiseline (317 mg, 1.89 mmol), HATU (719 mg, 1.89 mmol) i DIEA (606 uL, 3.48 mmol) u DCM-u (5 mL). Sud se ispere argonom i reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi preko noći, a zatim koncentruje. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje (Z)-((4-(dimetilamino)butanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat.
Priprema HE-Pr-DODC: 4-(bis(2-(oleoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-4-oksobutan-1-aminijum bromid
[0213]
[0214] U zatvorenom sistemu, ((4-(dimetilamino)butanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat (400 mg, 0.535 mmol) se rastvori u ACN (5 mL) i dodaje se 2-bromoetanol (500 uL). Reakcioni sud se ispira inertnim gasom a zatim zatvara. Reakcija se zagreje do 80°C i meša preko noći, a zatim koncentruje.
4
Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje 4-(bis(2-(oleoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-4-oksobutan-1-aminijum bromid (255 mg). LCMS ESI+: m/z 792.5 (M H).
Primer 8 (referentni primer): Priprema 2-(bis(2-(oleoiloksi)etil)amino)-N,N-bis(2-hidroksietil)-N-metil-2-oksoetanaminijum bromid (HE2DODC)
[0215]
Priprema intermedijera 1: (Z)-((2-bromoacetil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat
[0216]
[0217] Sinteza (Z)-azanedilbis(etan-2,1-dil) dioleat soli TFA prethodno opisane. (Z)-azanedilbis(etan-2,1-dil) dioleat so TFA (1.50 g, 2.34 mmol) se rastvori u DCM-u (20mL) i stavi u ledeno kupatilo. Dodaje se bromoacetil bromid (214 uL, 2.46 mmol), nakon čega se dodaje trietilamin (685 uL, 4.91 mmol). Ledeno kupatilo se uklanja i reakcija se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi pod inertnim gasom, zatim se razblaži do DCM do 100 mL, i opere sa 1M HCl (75 mL), H2O (75 mL), zasićenim NaHCO3rastvorom (75 mL) i zasićenim fiziološkim rastvor (75 mL). Sve vodene isplake se ponovo ekstrahuju sa DCM (25 mL). Osušene organske materije sa MgSO4, se filtriraju i koncentruju in vacuo. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa etil-acetatom daje (Z)-((2-bromoacetil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat (1.22 g).
Priprema HE2DODC: 2-(bis(2-(oleoiloksi)etil)amino)-N,N-bis(2-hidroksietil)-N-metil-2-oksoetanaminijum bromid
[0218]
[0219] U zatvorenom sistemu, dodaje se (Z)-((2-bromoacetil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat (2.08 g, 2.75 mmol) kombinovan sa N-metildietilaminom (1.58 mL, 13.8 mmol). Reakcioni sud se ispira inertnim gasom a zatim zatvara. Reakcija se zagreje do 50°C i meša preko noći, a zatim koncentruje. Prečišćavanje
4
hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje 2-(bis(2-(oleoiloksi)etil)amino)-N,N-bis(2-hidroksietil)-N-metil-2-oksoetanaminijum bromid (479 mg). LCMS ESI+: m/z 793.7 (M H).
Primer 9 (referentni primer): Priprema 2-(bis(2-((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetanaminijum bromid (HEDC-DLin)
[0220]
[0221] 2-(bis(2-((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetanaminijum bromid se priprema na sličan način kao HEDC sa supstitucijom (9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienoil-hlorida za miristoil-hlorid.
Primer 10 (referentni primer): Priprema 2-(bis(2-(dodekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetanaminijum bromid (HEDC-12)
[0222]
[0223] 2-(bis(2-(dodekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetanaminijum bromid se priprema na sličan način kao HEDC sa supstitucijom dodekanoil-hlorida za miristoil-hlorid.
Primer 11 (referentni primer): Priprema 2-((2-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-2-oksoetil)tio)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetiletanaminijum bromid (HES104)
[0224]
Priprema intermedijera 1: ((2-((2-(dimetilamino)etil)tio)acetil)azanedil)bis(etan-2,1-dil)ditetradekanoat (S104).
4
[0226] Sinteza azanedilbis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat soli TFA prethodno opisane. Azanedilbis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat so TFA (152 g, 238 mmol) se meša sa DCM (2.3 L) i 10% kalijum bikarbonatom (1.15 L) na 0-5°C. Odvoji se organska faza a vodena faza se dalje ekstrahuje sa DCM (1.15 L). Kombinovane organske faze se mešaju sa magnezijum-sulfat hidratom (236 g) tokom perioda od 30 minuta na 0-5°C, filtriraju i operu sa DCM (1.15 L). Kombinovanim filtratima se dodaju 2-((2-(dimetilamino)etil)tio)sirćetna kiselina hidrohlorid (57.0 g, 285 mmol), EDC hidrohlorid (68.4 g, 357 mmol) i DMAP (2.91 g, 23.8 mmol), i suspenzija se meša preko noći na sobnoj temperaturi, i nakon tog perioda se dobija bistar rastvor. MQ-voda (2.3 L) i metanol (460 mL) se dodaju i nakon mešanja tokom perioda od 10 minuta, izdvaja se bistra organska faza. Zamućena vodena faza (pH 3.0) se ekstrahuje sa DCM (575 mL). Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju obezbeđujući 143 g sirovog materijala u obliku hidrohloridne soli. Sirov materijal (142.6g) se prebaci u sud za destilaciju sa DCM (500 mL), i dodaje se etil-acetat (1 L). Rastvor se zagreje do destilacije pri atmosferskom pritisku, i destilacija se nastavlja tokom perioda od 70 minuta kako bi se dobila temperatura ostatka od 76°C. Ukupna zapremina od 1.4 L se dobija dodavanjem etil-acetata (800 mL), i dodaje se etanol (70 mL). Bistar rastvor na 50°C se ohladi do 37°C i dodaju se posejani kristali. Nakon primećene značajne kristalizacije tokom perioda od 10 minuta na 37-35°C, suspenzija ohladi i meša na 0°C preko noći i talog se izdvaja filtracijom, i opere sa hladnim etil-acetatom (210 mL). Sušenje do konstantne mase na sobnoj temperaturi u vakuumu uljane pumpe tokom perioda od 4.5 sata je dalo 134 g ponovno kristalizovanog materijala kao što je hidrohloridna so, bela kristalna čvrsta materija. Trikalijum fosfat (85 g, 0.40 mol) i dikalijum vodonik fosfat (226 g, 1.30 mol) se dodaju prečišćenoj vodi (1.7 L), i rastvor formiran sa pH 10.9 se ohladi do 18-20°C. DCM (1.3 L) i ponovno kristalizovani S104 hidrohlorid (133 g, 0.188 mol) se dodaju, i mešavina se meša tokom perioda od 10 minuta. Izdvaja se bistra organska faza pri umerenoj brzini (tokom perioda od 35 minuta), i zamućena vodena faza se dalje ekstrahuje sa DCM (650 mL). Kombinovane organske faze se mešaju sa bezvodnim magnezijum sulfatom (65 g) tokom perioda od 40 min, i mešavina se filtrira, opere sa DCM (200 mL). Kombinovani filtrati se upare u vodenom kupatilu na temperaturi od 50°C pod smanjenim pritiskom (do 20 mBar, pri kom se uparavanje pod pritiskom nastavlja za još sat vremena). Dodatno uparavanje od 15-20°C vodenog kupatila u vakuumu uljane pumpe, dovodi do 126 g ulja u delimično čvrstom stanju. Hlađenje u - 20°C hladnom kupatilu je dalo potpunu solidifikaciju, i nakon sušenja na -20°C u vakuumu uljane pumpe, dobili smo 126 g ((2-((2-(dimetilamino)etil)tio)acetil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoata (S104). HPLC je pokazao 98.1% čistoću.
Priprema HES104: 2-((2-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-2-oksoetil)tio)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetiletanaminijum bromid
[0227]
U zatvorenom sistemu, dodaje se ((2-((2-(dimetilamino)etil)tio)acetil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat (1.00 g, 1.49 mmol) kombinovan sa 2-bromoetanol (687 uL, 9.69 mmol). Reakcioni sud se ispira inertnim gasom a zatim zatvara. Reakcija se zagreje do 75°C i ostavi da se meša preko noći, zatim se ohladi, i koncentruje in vacuo. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje 2-((2-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-2-oksoetil)tio)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetiletanaminijum bromid (HES104) (790 mg). LCMS ESI+: m/z 715.7 (M H).
Primer 12 (referentni primer): Priprema 2-((2-(bis(2-(oleoiloksi)etil)amino)-2-oksoetil)tio)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetiletanaminijum bromid (HES104-DO)
[0228]
Priprema intermedijera 1: (Z)-((2-((2-(dimetilamino)etil)tio)acetil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat [0229]
[0230] Sinteza (Z)-azanedilbis(etan-2,1-dil) dioleat soli TFA prethodno opisane. (Z)-azanedilbis(etan-2,1-dil) dioleat so TFA (4.06 g, 6.41 mmol) se meša u DCM-u (60 mL) sa 10% K2CO3(30 mL) na 0-5°C. Nakon 30 min, odvoji se organska faza a vodena faza se dalje ekstrahuje sa DCM (30 mL). Kombinovane organske faze se mešaju sa bezvodnom MgSO4tokom perioda od 30 minuta na 0-5°C, filtriraju se, i operu sa DCM (30 mL). Kombinovani filtrati se dodaju 2-((2-(dimetilamino)etil)tio)sirćetnoj kiselini (1.26 g, 7.70 mmol), EDC HCl so (1.84 g, 9.62 mmol), DMAP (78.3 mg, 0.64 mmol). Tanka suspenzija se meša preko noći na sobnoj temperaturi; nakon tog perioda, rastvor postaje bistar. Narednog dana, dodaju se dejonizovana voda (60 mL) i metanol (30 mL). Nakon mešanja od 10 minuta, izdvaja se bistar organski sloj. Zamućena vodena faza se ekstrahuje sa DCM-om. Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju. Sirovi materijal se filtrira kroz
1
čep silika gela i uzima se u DCM-u (40 mL) i dodaje se PBS (pH=11, 50 mL). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi 10 min. Zatim se odvoji organska faza i vodena faza se ponovo ekstrahuje sa DCM (15 mL). Kombinovane organske faze se mešaju sa bezvodnom MgSO4tokom perioda od 30 min. Mešavina se zatim filtrira, i opere sa DCM. Kombinovani filtrati se koncentruju in vacuo kako bi se dobio (Z)-((2-((2-(dimetilamino)etil)tio)acetil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat (3.44 g).
Priprema HES104-DO
[0231]
[0232] U zatvorenom sistemu, dodaje se (Z)-((2-((2-(dimetilamino)etil)tio)acetil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat (540mg, 0.693mmol) kombinovan sa 2-bromoetanolom (319uL, 4.50). Reakcioni sud se ispira inertnim gasom a zatim zatvara. Reakcija se zagreje do 75°C i ostavi da se meša preko noći. Narednog dana, ohladi se i koncentruje in vacuo. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje 2-((2-(bis(2-(oleoiloksi)etil)amino)-2-oksoetil)tio)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetiletanaminijum bromid (324mg).
LCMS ESI+: m/z 823.8 (M H).
Primer 13 (referentni primer): Priprema 2-((bis(2-(oleoiloksi)etil)karbamoil)tio)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetiletan-aminijum bromid (HETU104-DO)
[0233]
Priprema intermedijera 1: (Z)-((((2-(dimetilamino)etil)tio)karbonil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat [0234]
[0235] Sinteza (Z)-((tert-butoksikarbonil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat prethodno opisana. (Z)-((tertbutoksikarbonil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat (4.2 g, 5.72 mmol) se rastvori u DCM-u (20mL) i ohladi do 0°C u ledenom kupatilu. Dodaje se TFA (20mL) a zatim se mešavina ostavi da se meša pod omotačem
2
inertnog gasa 20 minuta. Nakon toga, mešavina se koncentruje in vacuo. Ostatak je izdeljen između 10% K2CO3(20 mL) i DCM (20 mL). Mešavina se meša u ledenom kupatilu 20 minuta. Sakupi se organski deo, a zamućeni vodeni sloj se ekstrahuje sa DCM (2 x 10 mL). Kombinovani organski ekstrakti se dodaju sa bezvodnom MgSO4i mešaju na 0°C 20 minuta. Suspenzija se filtrira i opere DCM (10 mL). Materijalu (Z)-azanedilbis(etan-2,1-dil) dioleata u DCM-u- se dodaje difozgen (1.38 mL, 11.4 mmol) i meša pod omotačem inertnog gasa na sobnoj temperaturi. Narednog dana, DCM i višak difozgena se uklanjaju in vacuo. HCl so 2-(dimetilamino)etan tiola (4.05 g, 28.6 mmol) se uzima u DCM-u (50 mL) i trietilaminu (5.2 mL, 37.2 mmol) i dodaje se ostatku (Z)-((hlorokarbonil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleata. Reakciona mešavina se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Narednog dana, mešavina se razblaži sa DCM i opere sa 0.3M HCl (75 mL), vodom (75 mL) i 10% K2CO3(75mL). Sva vodena ispiranja se ekstrahuju nazad sa DCM (25mL). Organske materije se osuše preko bezvodne MgSO4, filtriraju se, i koncentruju in vacuo. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje (Z)-((((2-(dimetilamino)etil)tio)karbonil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat (1.90 g).
Priprema HETU104DO
[0236]
[0237] U zatvorenom sistemu, dodaje se (Z)-((((2-(dimetilamino)etil)tio)karbonil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) dioleat (615 mg, 0.804 mmol) kombinovan sa 2-bromoetanolom (370 uL, 5.22 mmol). Reakcioni sud se ispira inertnim gasom a zatim zatvara. Reakcija se zagreje do 75°C i ostavi da se meša preko noći, zatim se ohladi i koncentruje in vacuo. Prečišćena hromatografija sa silika gelom sa DCM/MeOH gradijentom daje 2-((bis(2-(oleoiloksi)etil)karbamoil)tio)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetiletanaminijum bromid (473 mg). LCMS ESI+: m/z 809.8 (M H).
Primer 14 (referentni primer): Sinteza Dope-Glu-VA
[0238] Priprema (Z)-(2R)-3-(((2-(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraen-1-il)oksi)-5-oksopentanamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleata (DOPE-Glu-VA)
Priprema intermedijera 1: 5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraen-1 -il)oksi)-5-oksopentanoična kiselina
[0240] Glutarni anhidrid (220 mg, 1.93 mmol) i retinol (500 mg, 1.75 mmol) se rastvore u dihlorometanu (5 mL) u fioli braon boje. Dodaje se trietilamin (513 ul, 3.68 mmol) i fiola se ispere argonom. Reakciona mešavina se ostavi da se meša na sobnoj temperaturi 4 sata. Materijal se koncentruje i prečišćava hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola. Frakcije se udružuju i koncentruju kako bi se dobilo žućkasto ulje (700 mg). Proizvod je potvrđen NMR-om.
Priprema DOPE-Glu-VA: (Z)-(2R)-3-(((2-(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraen-1-il)oksi)-5-oksopentanamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleat [0241]
[0242] 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (500 mg, 0.672 mmol), N,N,N’,N’-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat (306.5mg, 0.806 mmol) i 5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraen-1-il)oksi)-5-oksopentanoična kiselina (269 mg, 0.672 mmol) se rastvore u hloroformu/DMF (10 mL, 1:1 mešavina) u fioli braon boje ispranoj sa argonom i dodaje se N,N-diisopropiletilamin (300 uL, 1.68 mmol). Reakciona mešavina se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina se koncentruje a zatim prečišćava hromatografijom sa silika gelom pomoću gradijenta dihlorometana/metanola. Frakcije se udružuju i koncentruju kako bi se dobilo žućkasto ulje (460 mg, 61%). Proizvod je potvrđen NMR-om.<1>H NMR (400 MHz), δH: 8.6 (d, 1H), 8.27 (d, 1H), 6.57-6.61 (dd, 1H), 6.08-6.25 (m, 4H), 5.57 (t, 1H), 5.30-5.34 (m, 4H), 5.18 (m, 1H), 4.68-4.70 (d, 2H), 4.28-4.35 (m, 1H), 4.05-4.15 (m, 1H), 3.81-3.97 (m, 4H), 3.52-3.62 (m, 1H), 3.35-3.45 (m, 2H), 2.95-3.05 (m, 1H), 2.33-2.35 (t, 3H), 2.2-2.3 (m, 7H), 1.9-2.05 (m, 17H), 1.85 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.5-1.65 (m, 6H), 1.4-1.5 (m, 2H), 1.18-1.38 (m, ∼40H), 1.01 (s, 3H), 0.84-0.88 (m, 12H).
Primer 15 (referentni primer): DOPE-Glu-NH-VA
4
[0243] Priprema (Z)-(2R)-3-(((2-(4-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)butanamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleata (DOPE-Glu-NH-VA)
Priprema intermedijera 1: (Z)-(2R)-3-(((2-(4-aminobutanamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleat
[0244]
[0245] 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (2500 mg, 3.36 mmol), Boc-GABA-OH (751 mg, 3.70 mmol) i N,N,N’,N’-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat (1531 mg, 4.03 mmol) se rastvore u DMF/hloroformu (25 mL, 1:1 mešavina). Dodaje se N,N-diisopropiletilamin (880 uL, 5.05 mmol) a zatim se mešavina ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi pod omotačem argona. Reakciona mešavina se razblaži sa ∼200 mL H2O i proizvod se ekstrahuje sa dihlorometanom (3x100 ml). Proizvod se opere sa ∼75 mL pH 4.0 PBS puferom, osušene organske materije sa natrijum-sulfatom, zatim se proizvod filtrira i koncentruje. Materijal se zatim prečišćava hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola, i koncentruje kako bi se dobilo bezbojno ulje (2.01 g, 64%). Proizvod je potvrđen NMR-om. Materijal se zatim uzima u 30 mL 2 M HCl/dietil etra. Reakcija se ostavi da se meša na sobnoj temperaturi u H2O kupatilu. Nakon 2 sata, rastvor se koncentruje kako bi se dobio (Z)-(2R)-3-(((2-(4-aminobutanamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleat.
Priprema DOPE-Glu-NH-VA: (Z)-(2R)-3-(((2-(4-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)butanamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleat
[0247] (Z)-(2R)-3-(((2-(4-aminobutanamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleat (1200 mg, 1.45 mmol), retinoinska kiselina (500 mg, 1.66 mmol) i N,N,N’,N’-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat (689 mg, 1.81 mmol) su suspendovani u DMF/hloroformu (10 mL, 1:1 mešavina). Dodaje se N,N-diisopropiletilamin (758 uL, 4.35 mmol). Sud sa okruglim dnom se ispere argonom i prekrije aluminijumskom folijom. Reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 4 sata, izdeli u dihlorometanu (75 mL) i H2O (75 mL), ekstrahuje sa dihlorometanom, osuši (natrijum-sulfat), filtrira i koncentruje. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom koristeći gradijent dihlorometana/metanola daje (Z)-(2R)-3-(((2-(4-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)butanamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleata (292 mg, 18%). Proizvod je okarakterisan LCMS-om i NMR-om.<1>H NMR (400 MHz), δH: 8.55 (s, 1H), 8.2 (d, 1H), 7.3 (s, 1H), 6.6 (dd, 1H), 6.10-6.27 (m, 5H), 5.5 (t, 1H), 5.31 (s, 4H), 5.1-5.2 (m, 2H), 4.68 (d, 2H), 4.3 (d, 2H), 4.1 (m, 2H), 3.9 (m, 8H), 3.58 (q, 4H), 3.4 (s, 4H), 3.0 (q, 4H), 2.33-2.35 (t, 3H), 2.2-2.3 (m, 7H), 1.9-2.05 (m, 17H), 1.85 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.5-1.65 (m, 6H), 1.4-1.5 (m, 2H), 1.18-1.38 (m, ∼40H), 1.01 (s, 3H), 0.84-0.88 (m, 12H) . MS: m/z 1112.44 (M H<+>).
Primer 16 (referentni primer): DSPE-PEG550-VA
[0248] Priprema (2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-dimetil-4,44-diokso-52-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-dodekaoksa-3,43-diazadopentakonta-45,47,49,51-tetraen-1-il)oksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil distearata (DSPE-PEG550-VA)
Priprema intermedijera 1: (2R)-3-((((2,2-dimetil-4,44-diokso-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-tridekaoksa-5,45-diazaheptatetrakontan-47-il)oksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil distearat
[0250] 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (200 mg, 0.267 mmol), t-Boc-N-amido-dPEG12-kiselina (211 mg, 0.294 mmol) i N,N,N’,N’-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofos-fat (122 mg, 0.320 mmol) se rastvore u hloroformu/metanolu/H2O (6 mL, 65:35:8) u 20 mL fioli za scintilaciju opranu sa argonom. Dodaje se N,N-diisopropiletilamin (116 uL, 0.668 mmol). Reakcija se ostavi da se meša na 25°C 4 sata i koncentruje. Materijal se zatim prečišćava hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola kako bi se dobio (2R)-3-((((2,2-dimetil-4,44-diokso-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-tridekaoksa-5,45-diazaheptatetrakontan-47-il)oksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil distearat u obliku ulja (252 mg, 65%).
Priprema DSPE-PEG550-VA: (2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-dimetil-4,44-diokso-52-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-dodekaoksa-3,43-diazadopentakonta-45,47,49,51-tetraen-1-il)oksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil distearat
[0251]
[0252] (2R)-3-((((2,2-dimetil-4,44-diokso-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-tridekaoksa-5,45-diazaheptatetrakontan-47-il)oksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil distearat (252 mg, 0.174 mmol) se rastvori u dietil etru (5 mL). Reakcija se stavi u H2O kupatilo na sobnoj temperaturi. Dodaje se 2 M HCl/dietil etar (2 mL, 4 mmol) a zatim se mešavina ostavi da se meša približno 1 sat. Nakon toga, rastvarač i višak HCl se uklone in vacuo. Suspendovan materijal u 2 mL N,N-dimetilformamidu u sudu sa okruglim dnom se ispere argonom. Dodaju se retinoinska kiselina (57.5 mg, 0.191 mmol), N,N,N’,N’-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat (79 mg, 0.209 mmol) i N,N-diisopropiletilamin (106 uL, 0.609 mmol). Materijal se ne rastvara u potpunosti i stoga se dodaje još hloroforma/metanola/H2O (1 mL, 65:35:8 v:v:v mešavina) kako bi reakcija postala homogena. Nakon 3.5 sata, reakciona mešavina se koncentruje. Materijal se zatim prečišćava hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola kako bi se dobio (2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-dimetil-4,44-diokso-52-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-dodekaoksa-3,43-diazadopentakonta-45,47,49,51-tetraen-1-il)oksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil distearat u obliku žućkasto smeđe čvrste materije (210 mg, 74%). Proizvod je potvrđen NMR-om i LCMS-om.<1>H NMR (400 MHz), δH: 8.6 (s, 1H), 8.25 (d, 1H), 6.8-6.9 (dd, 1H), 6.3-6.4 (m, 1H), 6.12-6.25 (dd, 5H), 5.71 (s, 1H), 5.18 (m, 2H), 4.33 (dd, 2H), 4.13 (m, 2H), 3.95 (m, 2H), 3.74 (m, 8H), 3.63 (s, ∼48H), 3.0 (q, 2H), 2.5 (t, 3H), 2.35 (s, 3H), 2.25 (t, 8H), 1.97 (m, 7H), 1.7 (3, 3H), 1.5 (m, 2H), 1.36 (m, 12H), 1.23 (m, ∼56H), 1.01 (s, 6H), 0.86 (t, 12H). MS: m/z 1630.28 (M H<+>).
Primer 17 (referentni primer): DSPE-PEG2000-Glu-VA
Priprema DSPE-PEG2000-Glu-VA
[0253]
Priprema intermedijera 1: 5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraen-1-il)oksi)-5-oksopentanoična kiselina
[0254]
[0255] Glutarni anhidrid (115 mg, 1.01 mmol) i retinol (240 mg, 0.838 mmol) se rastvore u dihlorometanu (3 mL) u fioli braon boje. Dodaje se trietilamin (257 ul, 1.84 mmol) i fiola se ispere argonom. Reakcija se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina se koncentruje a zatim prečišćava hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola kako bi se dobila 5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraen-1-il)oksi)-5-oksopentanoična kiselina u obliku žućkastog ulja (700 mg, 78%). Materijal je okarakterisan NMR-om.
Priprema DSPE-PEG2000-Glu-VA
[0256]
[0257] 5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraen-1-il)oksi)-5-oksopentanoična kiselina (43 mg, 0.108 mmol), DSPE-PEG2000-NH2(250 mg, 0.090 mmol) i N,N,N',N'-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat (45 mg, 0.117 mmol) se rastvore u N,N-dimetilformamidu (2 mL) u fioli za scintilaciju braon boje koja se ispira sa gasom argona. Dodaje se N,N-diisopropiletilamin (47 uL, 0.270 mmol) i reakcija se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi, zatim se prečišćava hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola kako bi se dobilo žućkasto ulje (59 mg, 20.7%). Proizvod je potvrđen NMR-om.<1>H NMR (400 MHz), δH: 706 (m, 1H), 6.59-6.66 (dd, 1H), 6.06-6.30 (m 5H), 5.56-5.60 (t, 1H), 5.17-5.23 (m, 2H), 4.35-4.42 (dd, 2H), 4.12-4.25 (m, 5H), 3.96-3.97 (m, 6H), 3.79-3.81 (t, 1H), 3.66 (m, ∼180H), 3.51-3.58 (m, 2H), 3.4-3.48 (m, 4H), 3.3-3.38 (m, 2H), 2.25-2.45 (m, 14H), 1.5-2.0 (m, 15H), 1.23-1.32 (m, ∼56H), 1.01 (s, 3H), 0.85-0.88 (t, 12H).
Primer 18 (referentni primer): DOPE-Gly3-VA
[0258] Priprema (Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-dimetil-4,7,10,13-tetraokso-21-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-3,6,9,12-tetraazahenikoza-14,16,18,20-tetraen-1-il)oksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleata (DOPE-Gli3-VA)
Priprema intermedijera 1: (Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-aminoacetamido)acetamido)acetamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleat
[0259]
[0260] Boc-Gli-Gli-Gli-OH (382 mg, 1.34 mmol) i N,N,N’,N’-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat (532 mg, 1.4 mmol) se rastvore u DMF (5 mL). Dodaje se N,N-diisopropiletilamin (488 uL, 2.8 mmol), a zatim se mešavina ostavi da se meša na sobnoj temperaturi 10-15 minuta. Nakon toga, rastvor Dodaje se 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (833 mg, 1.12 mmol) u hloroformu (5 mL) i reakcioni sud se opere sa argonom. Nakon 16 sati na sobnoj temperaturi, reakciona mešavina se koncentruje i izdeli između dihlorometana (50 mL) i H2O (50 mL), ekstrahuje sa dihlorometanom (3 x 50 mL), osuši sa natrijumsulfatom, filtrira i koncentruje. Materijal se prečišćava hromatografijom sa silika gelom upotrebom gradijenta dihlorometana/metanola kako bi se dobio ostatak bezbojnog ulja. Ovome se dodaje 2 M HCl/Dietil etar(5 mL) i reakciona mešavina se ostavi da se meša u H2O kupatilu približno 2 sata. Reakciona mešavina se koncentruje i ostatak se iskoristi u dihlorometanu (75 mL), opere sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (75 mL), ekstrahuje proizvod sa dihlorometanom (3x75 mL), osuši sa natrijumsulfatom, filtrira i koncentruje kako bi se dobio (Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-aminoacetamido)acetamido)acetamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleat u obliku polučvrste materije (765 mg, 90%). Potvrđen NMR-om.
Priprema DOPE-Gly3-VA: (Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-dimetil-4,7,10,13-tetraokso-21-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-3,6,9,12-tetraazahenikoza-14,16,18,20-tetraen-1-il)oksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleat
[0262] (Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-aminoacetamido)acetamido)acetamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleat (765 mg, 0.836 mmol), retinoinska kiselina (301 mg, 1.00 mmol), i N,N,N’,N’-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat (413 mg, 1.09 mmol) se suspenduju u N,N-Dimetilformamidu (5 mL). Dodaje se N,N-diisopropiletilamin (437uL, 2.51 mmol) i reakcioni sud se ispere sa gasom argona. Dodaje se hloroform (5 mL) kako bi pomogao u solvataciji materijala. Reakcija se ostavi da se meša ∼4 sata na sobnoj temperaturi u sudu sa okruglim dnom prekrivenim aluminijumskom folijom.
Izdeljen materijal između H2O (100 mL) i dihlorometana (100 mL). Ekstrahuje sa dihlorometanom (3 x 100 mL), osuši sa natrijum-sulfatom, filtrira i koncentruje. Materijal se zatim prečišćava hromatografijom sa silika gelom koristeći gradijent dihlorometana/metanola kako bi se dobio (Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-dimetil-4,7,10,13-tetraokso-21-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-3,6,9,12-tetraazahenikoza-14,16,18,20-tetraen-1-il)oksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleat u obliku narandžastog ulja (704 mg, 70%). Proizvod je potvrđen LCMS-om i NMR-om.<1>H NMR (400 MHz), δH: 6.90 (t, 1H), 6.21 (q, 2H), 6.08-6.12 (d, 2H), 5.83 (s, 1H), 5.31 (s, 4H), 5.30 (s, 2H), 4.37 (d, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.91 (m, 8H), 3.59 (m, 2H), 3.29 (m, 2H), 3.01 (m, 2H), 2.28 (m, 6H), 1.95-1.98 (m, 12H), 1.44 (s, 3H), 1.5-1.6 (m, 2H), 1.44 (m, 6H), 1.24 (m, ∼48H), 1.00 (s, 6H), 0.86 (t, 3H). MS: m/z 1198.42 (M H<+>).
Primer 19 (uporedni primer): VA-PEG-VA
[0263] Priprema N1,N19-bis((16E,18E,20E,22E)-17,21-dimetil-15-okso-23-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-4,7,10-trioksa-14-azatricosa-16,18,20,22-tetraen-1-il)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamida (VA-PEG-VA)
Priprema VA-PEG-VA: N1,N19-bis((16E,18E,20E,22E)-17,21-dimetil-15-okso-23-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-4,7,10-trioksa-14-azatricosa-16,18,20,22-tetraen-1-il)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid
1
[0265] Retinoinska kiselina (2913 mg, 9.70 mmol), N,N,N’,N’-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat (3992mg, 10.50 mmol) i diamido-dPEG11-diamin (3000 mg, 4.04 mmol) se suspenduju u N,N-dimetilformamidu (10 mL). Dodaje se N,N-diisopropiletilamin (4222 µL, 24.24 mmol) i sud se ispere argonom. Reakcija se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi u sudu sa okruglim dnom prekrivenim aluminijumskom folijom. Narednog dana, izdeljen je materijal između etil acetata (125 mL) i vode (125 mL). Ekstrahuje se sa etil-acetatom (3x125 mL), osuši sa natrijum-sulfatom, filtrira i koncentruje. Materijal se zatim prečišćava hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola. Frakcije se udruže i koncentruje kako bi se dobilo žuto ulje (2900 mg, 54.9%). Proizvod je potvrđen LCMS-om i NMR-om.<1>H NMR (400 MHz), δH: 7.1 (s, 2H), 6.87 (t, 2H), 6.51 (t, 2H), 6.12-6.20 (dd, 8H), 5.66 (s, 2H), 3.6-3.8 (m, ∼44H), 3.4 (q, 4H), 3.3 (q, 4H), 2.46 (t, 4H), 2.32 (s, 6H), 1.9-2.05 (m, 10H), 1.7-1.85 (m, 15H), 1.6 (m, 4H), 1.3-1,5 (m, 6H), 1.01 (s, 12H). QTOF MS: m/z1306 (M H<+>).
Primer 20 (uporedni primer): VA-PEG2000-VA
[0266] Priprema (2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96, 99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-heksatetrakontaoksatetrakontahektan-1,140-dil)bis(3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamida) (VA-PEG2000-VA)
Priprema VA-PEG2000-VA: (2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96, 99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-heksatetrakontaoksatetrakontahektan-1,140-dil)bis(3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamid)
2
[0268] Retinoinska kiselina (109mg, 0.362 mmol), N,N,N’,N’-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat (149 mg, 0.392 mmol) i amin-PEG2K-amin (333 mg, 0.151 mmol) se suspenduju u N,N-Dimetilformamidu (3 mL). Dodaje se N,N-diisopropiletilamin (158 µL, 0.906 mmol) i sud se ispere argonom. Reakcija se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi u sudu sa okruglim dnom prekrivenim aluminijumskom folijom. Narednog dana, izdeljen je materijal između etil-acetata (30 mL) i vode (30 mL). Ekstrahuje se sa etil-acetatom (3x30 mL), osuši sa natrijum-sulfatom, filtrira i koncentruje. Materijal se zatim prečišćava hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola. Frakcije se udružuju i koncentruju kako bi se dobio (2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96, 99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-heksatetrakontaoksatetrakontahektan-1,140-dil)bis(3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamid) u obliku žutog ulja (97 mg, 23%). Proizvod je potvrđen LCMS i NMR.<1>H NMR (400 MHz), δH: 6.85-6.92 (t, 2h), 6.20-6.32 (M, 6H), 6.08-6.12 (d, 4H), 5.72 (s, 2H), 3.55-3.70 (m, ∼180H), 3.4-3.5 (m, 4H), 2.79 (m, 4H), 2.78 (s, 6H), 2.33 (s, 6H), 2.05 (m, 4H), 1.97 (s, 6H), 1.80 (m, 2H), 1.79 (s, 6H), 1.69 (s, 6H), 1.60 (m, 4H), 1.45 (m, 4H), 1.01 (s, 12H). QTOF MS: m/z 2651 (M H<+>)..
Primer 21 (referentni primer): DSPE-PEG2000-VA
[0269]
Priprema DSPE-PEG2000-VA
[0271] DSPE-PEG2000-NH2(250 mg, 0.090 mmol), retinoinska kiselina (33 mg, 0.108 mmol) i N,N,N’,N’-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat (45 mg, 0.117 mmol) se rastvore u N,N-Dimetilformamidu. Mešavini se dodaje N,N-diisopropiletilamin (47 µL, 0.270 mmol). Fiola za scintilaciju braon boje se ispere argonom i ostavi se da se meša 3 dana na sobnoj temperaturi. Materijal se zatim prečišćava hromatografijom sa silika gelom koristeći gradijent dihlorometana/metanola. Frakcije se udružuju i koncentruju kako bi se dobio DSPE-PEG2000-VA u obliku žutog ulja (245 mg, 89%). Proizvod je potvrđen NMR-om.<1>H NMR (400 MHz), δH: 6.86 (dd, 1H), 6.25 (m, 1H), 6.09-6.21 (dd, 4H), 5.71 (s, 1H), 5.1-5.2 (m, 1H), 4.3-4.4 (d, 1H), 4.1-4.2 (m, 3H), 3.85-4.0 (m, 4H), 3.8 (t, 1H), 3.5-3.75 (m, ∼180H), 3.4-3.5 (m, 8H), 3.3 (m, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.26 (m, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.55-1.65 (m, 6H), 1.47 (m, 2H), 1.23 (s, ∼60H), 1.01 (s, 6H), 0.85 (t, 6H).
Primer 22: diVA-PEG-diVA, takođe poznatog kao "DiVA"
[0272] Priprema N1,N19-bis((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilciklo-heks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-24,28-dimetil-15,22-diokso-30-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-4,7,10-trioksa-14,21-diazatriakonta-23,25,27,29-tetraen-1-il)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamida (diVA)
Priprema intermedijera 1: tetrabenzil ((5S,57S)-6,22,40,56-tetraokso-11,14,17,25,28,31,34,37, 45,48,51-undekaoksa-7,21,41,55-tetraazahenheksakontan-1,5,57,61-tetrail) tetrakarbamata, takođe poznatog kao Z-DiVA-PEG-DiVA-IN
4
[0274] A 1 L reakcioni sud ohlađen do 5 - 10°C se prečisti sa azotom i naelektriše sa dihlorometanom (300 mL), d-PEG-11-diamin (Quanta lot EK1-A-1100-010, 50.0 g, 0.067 mol), Z-(L)-Lys(Z)-OH (61.5 g, 0.15 mol), i HOBt hidratom (22.5 g, 0.15 mol). Dodaje se 4-Metilmorfolin (4-MMP) (15.0 g, 0.15mol) u suspenziju i posmatra se blaga egzotermička reakcija. Suspenzija EDC hidrohlorida (43.5 g, 0.23 mol) i 4-MMP (20.0 g, 0.20 mol) u dihlorometanu (150 mL) se dodaje tokom perioda od 30 minuta, i potrebno je umereno hlađenje kako bi se održavala temperatura od 20-23°C. Blago zamućen rastvor se meša preko noći na sobnoj temperaturi, a HPLC pokazuje kraj reakcije. Dodaje se dejonizovana voda (300 mL) i nakon mešanja od 10 minuta, primećeno je brzo odvajanje faza. Vodena faza se ekstrahuje sa dihlorometanom (150 mL) – sa nešto sporijim odvajanjem faza. Kombinovani organski ekstrakti se operu sa 6% natrijum bikarbonatom (300 mL) i osuše sa magnezijum-sulfatom (24 g). Isparavanje iz 40-45°C vodenog kupatila pod smanjenim pritiskom daje 132 g sirovog proizvoda. Rastvor sirovog proizvoda (131 g) u 8% metanolu u etil-acetatu napunjen u koloni silika gela 60 (40-63µ), upakovan sa 8% metanola u etil-acetatu. Kolona je eluisana sa 8% metanolom u etil-acetatu (7.5 L). Frakcije koje sadrže dovoljno čist proizvod (5.00-7.25 L) isparavaju iz 45°C vodenog kupatila pod smanjenim pritiskom i 83.6 g prečišćenog proizvoda. Rastvor prečišćenog proizvoda (83.6 g) u dihlorometanu (200 mL) se napuni u kolonu Dowex 650 C (H<+>) (200 g), koja se ispira sa dihlorometanom (250 mL). Kolona je eluisana sa dihlorometanom (200 mL). Kombinovani proizvod koji sadrži frakcije (300-400 mL) se osuši sa magnezijum-sulfatom (14 g) i upari se iz 45°C vodenog kupatila pod smanjenim pritiskom kako bi se dobio tetrabenzil ((5S,57S)-6,22,40,56-tetraokso-11,14,17,25,28,31,34,37,45,48,51-undekaoksa-7,21,41,55-tetraazahenheksakontan-1,5,57,61-tetrail)tetrakarbamat, takođe poznat kao Z-DiVA-PEG-DiVA-IN (77.9 g, HPLC čistoća 94.1%).
Priprema intermedijera 2: N1,N19-bis((S)-16,20-diamino-15-okso-4,7,10-trioksa-14-azaikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid, takođe poznatog kao DiVA-PEG-DiVA-IN
[0276] A 1 L reakcioni sud se prečisti azotom i naelektriše metanolom (600 mL) i Z-DiVA-PEG-DiVA-IN (92.9, 60.5 mmol). Mešavina se meša pod azotom dok se ne dobije rastvor. Dodaje se katalizator, 10% Pd/C/50%voda (Aldrich, 10 g). Mešavina se evakuiše, i zatim se pritisak izjednači azotom. Mešavina se evakuiše, a zatim se pritisak izjednači vodonikom. Da bi se obezbedio stabilan, nizak protok vodonika tokom reakcione mešavine, pokreće se mešalica. Vodonikacija se nastavlja u protoku vodonika jedan sat. Sistem se zatim zatvara, a vodonifikacija se nastavlja na ∼0.1 bara za jedan sat. Mešavina se evakuiše i zatim se ponovo stavlja pod pritisak do ∼0.1 bara sa vodonikom. Nakon drugog sata vodonikacije, mešavina se evakuiše i ponovo stavlja pod pritisak do 0.1 bara sa vodonikom. Mešanje pod vodonikom se nastavlja 15 sati nakon čega HPLC ne može da detektuje polazni materijal. Mešavina se evakuiše, i zatim se pritisak izjednači azotom. Mešavina se evakuiše, i zatim se pritisak izjednači azotom. Reakciona mešavina se zatim filtrira na lopatici celite 545. Filter kolač se opere sa metanolom (100 mL). Kombinovani filtrat se koncentruje, konačno na 45°C i pri pritisku manjem od 50 mbara.Dodaje se toluen (100 mL) i dobijena mešavina se ponovo koncentruje konačno na 45°C i pod pritiskom manjim od 40 mbara kako bi se dobio N1,N19-bis((S)-16,20-diamino-15-okso-4,7,10-trioksa-14-azaikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid, takođe poznat kao DiVA-PEG-DiVA-IN (63.4 g), u obliku ulja koje prelazi u čvrst oblik nakon stajanja.
Priprema DiVA-PEG-DiVA: N1,N19-bis((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-24,28-dimetil-15,22-diokso-30-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-4,7,10-trioksa-14,21-diazatriakonta-23,25,27,29-tetraen-1-il)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid
[0278] A 2 L reaktor se napuni argonom i naelektriše sa dihlorometanom (500 mL), DiVA-PEG-DiVA-IN (52.3 g, 52.3 mmol), retinoinskom kiselinom (70.6 g, 235 mmol) i 4-N,N-dimetilaminopiridinom (2.6 g, 21.3 mmol). Mešavina se meša pod argonom dok se ne rastvori (∼20 minuta). Temperatura reakcije se održava na 10 - 20°C, dodaje se 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid) (EDCI) (70.6 g, 369 mmol) u delovima tokom perioda od 10 - 15 minuta (reakcija je blago egzotermička u prvih 30-60 minuta). Reaktor je prekriven aluminijumskom folijom i mešavina se meša na 18 - 21°C 15 - 20 sati. Dodaje se butilisan hidroksitoluen (BHT) (25 mg) i reakciona mešavina se zatim izliva na vodeni 6% natrijum-vodonik karbonat (500 mL) pri čemu se održava atmosfera argona tokom mešavine. Odvoji se organska faza. Vodena faza se opere sa dihlorometanom (50 mL). Kombinovana organska faza se osuši sa magnezijum-sulfatom (150 g) u atmosferi inertnog gasa i zaštićena od svetlosti. Agens koji se suši se filtrira (poželjan je filter pod pritiskom) i filter kolač se opere sa dihlorometanom (500 mL). Filtrat se koncentruje uparavanjem pri smanjenom pritisku koristeći vodeno kupatilo od 35 - 40°C. Uljani ostatak se dodaje toluenu (150 mL) i ponovo uparava kako bi se dobio polučvrsti ostatak od 210 g. Ovaj ostatak se rastvori u dihlorometanu (250 mL) i nanese se na kolonu pripremljenu od silika gela 60 (1.6 kg) i 0.5% metanola u dihlorometanu) (4 L). Kolona je eluisana sa dihlorometanom (7.2 L), 2), 3% metanolom u u dihlorometanu (13 L), 5% metanolom u dihlorometanu (13 L), 10% metanolom u dihlorometanu (18 L). Uzme se jedna frakcija od 10 L, a zatim se uzimaju frakcije od 2.5 L. Frakcije zaštićene od svetla su uzorkovane, isprane sa argonom i zatopljene. Uzete frakcije se analiziraju pomoću TLC (10% metanol u dihlorometanu, UV). Frakcije koje imaju DiVA-PEG-DiVA se dalje analiziraju pomoću HPLC.5 frakcija sa čistoćom čisto < 85% (je dalo 32 g ostataka nakon uparavanja), se ponovo prečiste na isti način ,upotrebom samo 25% originalnih količina silika gela i rastvarača. Frakcije sa čistoćom >85% po HPLC se kombinuju i uparavaju pod smanjenim pritiskom, upotrebom vodenog kupatila od 35 - 40°C. Ostatak nakon uparavanja (120 g) se ponovo rastvara u dihlorometanu (1.5 L) i polako prolazi (približno 1 sat) kroz kolonu pripremljenu od zamenjivača jona Dowex 650C, H<+>oblik (107 g). Kolona se zatim opere sa dihlorometanom (1 L). Kombinovani eluans (3277.4 g) se dobro izmeša a uzorak (25 mL, 33.33 g) isparava, konačno na sobnoj temperaturi i pod pritiskom od < 0.1 mbara kako bi se dobilo 0.83 g pene. Iz ovih podataka, ukupna količina čvrstog materijala je tako izračunata da doprinosi 80.8 g (72.5%). Preostala 3.24 kg rastvora se koncentruju do 423 g.266 g ovog rastvora se koncentruje dalje kako bi se dobio sirup a zatim se ponovo rastvara u apsolutnom etanolu (200 mL). Uparavanje pod smanjenim pritiskom, upotrebom vodenog kupatila od 35 - 40°C, se nastavlja kako bi se dobio konačan rastvor etanola od 94.8 g koji sadrži 50.8 g (53.6 mas. %) N1,N19-bis((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-24,28-dimetil-15,22-diokso-30-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-4,7,10-trioksa-14,21-diazatriakonta-23,25,27,29-tetraen-1-il)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamida, takođe poznatog kao DiVA-PEG-DiVA, takođe poznatog kao "DiVA". Okarakterisan NMR-om i QTOF-om.<1>H NMR (400 MHz), δH: 7.07 (t, 2H), 7.01 (t, 2H), 6.87-6.91 (m, 4.0H), 6.20-6.24 (m, 10H), 6.10-6.13 (m, 8H), 5.79 (s, 2H), 5.71 (s, 2H), 4.4 (q, 2H), 3.70 (t, 6H), 3.55-3.65 (m, ∼34H), 3.59 (t, 6H), 3.4 (m, 2H), 3.25-3.33 (m, 10H), 3.16 (m, 2H), 2.44 (t, 4H), 2.33 (s, 12H), 1.97-2.01 (m, 12H), 1.96 (s, 6H), 1.7-1.9 (m, 12H), 1.69 (s, 12H), 1.5-1.65 (m, 12H), 1.35-1.5(m, 24H), 1.01 (s, 24H). QTOF MS ESI+: m/z 2128 (M H<+>).
Primer 23 (referentni primer): DOPE-VA
[0279] Priprema (Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleata (DOPE-VA)
Priprema DOPE-VA: (Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleata
[0280]
[0281] Rastvoru retinoinske kiseline (250 mg, 0.83 mmol) u dietil etru pri mešanju (20 mL) na -78° C, se špricem dodaje rastvor (dietilamino)sulfur-trifluorida (130 µl, 0.90 mmol) u hladnom etru (20 mL).
Reakciona mešavina se izvadi iz hladnog kupatila a mešanje se nastavlja na sobnoj temperaturi još 2 sata. Na kraju, rastvarač se uklanja rotacionim isparavanjem. Ostatak predstavlja ponovo rastvoreni hloroform (50 mL) u prisustvu čvrstog Na2CO3(50 mg). Ovom rastvoru se dodaje 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (600mg, 0.81 mmol) i reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi dodatna 24 sata. Rastvarač se uklanja rotacionim isparavanjem. Ostatak se prečišćava hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola kako bi se dobio Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1 -en-1 -il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)etoksi)(hidroksi)fosforil)oksi)propan-1,2-dil dioleat (240 mg, 28%).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.87 (t, 6H, CH3), 1.01 (s, 6H, CH3) 1.20-1.40 (m, 40H, CH2), 1.40-1.60 (m, 8H, CH2), 1.70 (s, 3H, CH3-C=C), 1.80-2.10 (m, 8H), 2.32 (m, 4H, CH2C(=O)), 3.50 (m, 2H), 3.92-4.18 (m, 5H), 4.35 (m, 2H), 5.20 (m, 1H, NHC(=O)), 5.31 (m, 4H, CH=CH), 5.80-6.90 (m, 6H, CH=CH).
Primer 24 (referentni primer): DC-VA
[0282] Priprema (((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoata (DC-VA)
Priprema DC-VA: (((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat
[0283]
[0284] Rastvoru retinoinske kiseline (600 mg, 2.0 mmol) u dietil etru (25 mL) koji se meša na -78° C, špricem se dodaje rastvor (dietilamino)sulfur-trifluorida (0.3 ml, 2.1 mmol) u 5 mL hladnog etra. Reakciona mešavina se izvadi iz hladnog kupatila a mešanje se nastavlja na sobnoj temperaturi dodatnih sat vremena. Nakon što se rastvarač ukloni rotacionim isparavanjem, ostatak se ponovo rastvori u dihlorometanu (20 mL) u prisustvu 2 čvrsta Na2CO3(25 mg). Ovom rastvoru se dodaje azanedilbis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat (1.05 g, 2.0 mmol), i reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi dodatna 24 sata. Reakciona mešavina se razblaži sa dihlorometanom (50mL) i osuši se preko MgSO4. Nakon uklanjanja rastvarača rotacionim isparavanjem, ostatak se prečišćava hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola kako bi se dobio(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil)ditetradekanoat (800 mg, 50%).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.87 (t, 6H, CH3), 1.02 (s, 6H, CH3) 1.20-1.40 (m, 40H, CH2), 1.40-1.60 (m, 8H, CH2), 1.70 (s, 3H, CH3-C=C), 1.97(s, 3H, CH3-C=C), 2.05 (m, 2H, CH2), 2.15(s, 3H, CH3-C=C), 2.32 (m, 4H, CH2C(=O)), 3.67 (m, 4H, NCH2CH2O), 4.15-4.30 (m, 4H, NCH2CH2O), 5.80-6.90 (m, 6H, CH=CH).
Primer 25 (referentni primer): DC-6-VA
[0285] Priprema ((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)heksanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil)ditetradekanoata (DC-6-VA)
Priprema intermedijera 1: ((6-aminoheksanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat so TFA [0286]
[0287] Mešavina azanedilbis(etan-2,1-dil) ditetradekanoata (2.5 g, 4.8 mmol), Boc-amino kaproične kiseline (1.3 g, 5.6 mmol), N,N'-dicikloheksilkarbodiimids (1.3 g, 6.3 mmol) i N,N-diisopropiletilamina (2.6 mL, 0.015 mmol) se rastvore u piridinu (40 mL). Rastvor se meša na 60° C preko noći. Mešavina se razblaži sa dihlorometanom (50 mL) i opere sa fiziološkim rastvorom (3x50 mL). Nakon koncentrovanja rotacionim isparavanjem, ostatak se tretira trifluoroacetičnom kiselinom/dihlorometanom (100mL, 1:1). Mešavina se koncentruje i ponovo rastvara u dihlorometanu (50 mL) i opere sa fiziološkim rastvorom (3x50 mL).
Organski sloj se izdvaja i koncentruje kako bi se dobila ((6-aminoheksanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat so TFA (1.5 g, 33%).
Priprema DC-6-VA: ((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)heksanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil)
[0289] Rastvoru retinoinske kiseline (800 mg, 2.67 mmol) u dietil etru (40 mL) pri mešanju na -78° C, se špricem dodaje rastvor (dietilamino)sulfur-trifluorida (0.4 mL, 22.80 mmol) u hladnom etru (7 mL).
Reakciona mešavina se izvadi iz hladnog kupatila a mešanje se nastavlja na sobnoj temperaturi dodatnih sat vremena. Nakon što se rastvarač ukloni rotacionim isparavanjem, ostatak se ponovo rastvori u dihlorometanu (25 mL) u prisustvu čvrstog Na2CO3(40 mg). Ovom rastvoru se dodaje ((6-aminoheksanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) ditetradekanoat so TFA (1.5 g, 1.6 mmol) i reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi dodatna 24 sata. Reakciona mešavina se razblaži sa dihlorometanom (50 mL) i osuši preko MgSO4. Nakon što se rastvarač ukloni rotacionim isparavanjem, ostatak se prečišćava hromatografijom kolone upotrebom 5% metanola/dihlorometana kao eluensa kako bi se dobio ((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)heksanoil)azanedil)bis(etan-2,1-dil) (360 mg, 24%).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.87 (t, 6H, CH3), 1.02 (s, 6H, CH3) 1.20-1.40 (m, 42H, CH2), 1.40-1.60 (m, 12H, CH2), 1.70 (s, 3H, CH3-C=C), 1.97(s, 3H, CH3-C=C), 2.05 (m, 2H, CH2), 2.15(s, 3H, CH3-C=C), 2.32 (m, 6H, CH2C(=O)), 3.20 (m, 2H, CH2NHC(=O)), 3.56 (m, 4H, NCH2CH2O), 4.15-4.30 (m, 4H, NCH2CH2O), 5.10 (m, 1H), 5.80-6.90 (m, 6H, CH=CH).
Primer 26 (uporedni primer): SINTEZA satDiVA
[0290] Priprema N1,N19-bis((16S)-16-(3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanamido)-24,28-dimetil-15,22-diokso-30-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-4,7,10-trioksa-14,21-diazatriakontil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamida (satDIVA).
Priprema intermedijera 1: 3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)pelargonska kiselina
1
[0292] Trans retinoinska kiselina (2000 mg, 6.66 mmol) se rastvori u heksanima/IPA (3:1, 40mL) uz pomoć sonikacije. Materijal se stavi u Parr-shaker bocu i ispere sa inertnim gasom. Dodaje se 10% Pd/C (200mg) i sud se još jednom ispere inertnim gasom. Materijal se stavi na Parr-Shaker preko noći pod pritiskom gasa vodonika > 4.83 bara (70 psi). Reakciona mešavina se zatim filtrira kroz lopaticu celite i koncentruje kako bi se dobila 3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)pelargonska kiselina (2 g).
Priprema satDIVA: N1,N19-bis((16S)-16-(3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanamido)-24,28-dimetil-15,22-diokso-30-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-4,7,10-trioksa-14,21-diazatriakontil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamida
[0293]
[0294] N1,N19-bis((16S)-16-(3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanamido)-24,28-dimetil-15,22-diokso-30-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-4,7,10-trioksa-14,21-diazatriakontil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid, takođe poznat kao satDIVA, se priprema na sličan način kao diva-PEG-diVA iz prethodno opisanog N1,N19-bis((S)-16,20-diamino-15-okso-4,7,10-trioksa-14-azaikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamida sa supstitucijom 3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanoične kiseline za trans retinoinsku kiselinu. QTOF MS ESI+: m/z 2161, 2163, 2165 i 2167 (M H+)
Primer 27 (uporedni primer): SINTEZA simDiVA
[0295] Priprema N1,N19-bis((S)-15,22-diokso-30-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-16-(9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanamido)-4,7,10-trioksa-14,21-diazatriakontil)-4,7,10,13,16-
2
pentaoksanonadekan-1,19-diamida (simDiVA).
Priprema intermedijera 1: 2,6,6-trimetilcikloheks-1 -en-1 -il trifluorometansulfonat
[0297] Rastvoru 2,2,6-trimetilcikloheksanona u suvom THF na -78 °C pod azotom se u kapima dodaje rastvor 2 M littijum-diizopropilamida. Mešavina se meša na -78 °C 3 h. Rastvor N-fenilbis(trifluorometansulfonimida) u THF se zatim u kapima dodaje (na -78 °C). Reakcioni sud se pakuje u u suvi led i meša preko noći. Mešanje se nastavlja na sobnoj temperaturi 3 sata i za to vreme sav materijal se rastvori. Reakciona mešavina se koncentruje a ostatak se polako dodaje heksanu (350 mL) prilikom energičnog mešanja. Čvrst materijal se uklanja filtracijom i pere sa heksanom (2 x 50 mL). Filtrat se koncentruje i dodaje se još heksana (150 mL). Čvrst materijal se uklanja filtracijom a filtrat se koncentruje. Talog se ponavlja još jednom nakon čega se ostatak prečišćava „flash“ hromatografijom (silika, heksan) kako bi se dobio 2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il trifluorometansulfonat u obliku bezbojnog ulja (23.2 g, 60% prinos).
Priprema intermedijera 2: etil 9-(bromocinkio)nonanoat
[0298]
[0299] U suvoj reakciji, epruveta pod azotom je napunjena prašinom cinka (3.70 g, 56.6 mmol), jodom (479 mg, 1.89 mmol) i suvim DMA (20 mL). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi dok boja joda ne nestane. Dodaje se etil 9-bromononanoat, i mešavina se meša na 80 °C 4 sata i onda preko noći na sobnoj temperaturi. (Završetak reakcije umetanja cinka se proverava GCMS analizom hidrolizovane reakcione mešavine.) Reakciona mešavina se koristi bez daljeg tretmana u narednoj fazi. GCMS m/z 186 [M]+ (etilnonanoat).
Priprema intermedijera 3: etil 9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1 -en-1 - il)nonanoat
[0301] Sveže pripremljenom etil 9-(bromocinkio)nonanoatu (37.7 mmol) u dimetilacetamidu poda azotom u reakcionoj epruveti se dodaje 2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il trifluorometansulfonat (10.8 g, 39.6 mmol) a nakon toga tetrakis(trifenilfosfin)paladium(0) (872 mg, 0.754 mmol). Epruveta se zatvara i mešavina se meša na 95 °C 2 sata. Reakciona mešavina se ostavi da se ohladi a zatim se izlije u dietil etar (100 mL). Gornji sloj se odekantuje a donji sloj se dva puta opere sa dietil etrom (2 x 25 mL). Kombinovani slojevi etra se operu sa zasićenim NH4Cl i fiziološkim rastvorom, osuše (MgSO4) i koncentruju kako bi se dobio sirovi materijal (∼12 g). Materijal je prečišćen „flash“ hromatografijom (silika, 0 do 1.5% EtOAc u heksanu). Dobijeno ulje se meša pod vakuumom 8 sati kako bi se uklonila većina sporednih proizvoda, etil nonanoat, a zatim se prečišćava drugom „flash“ hromatografijom (silika, 0 do 15% toluen u heksanu). Frakcije se analiziraju LCMS i GCMS. Najčistije frakcije se sakupljaju i koncentruju na temperaturi ispod 25 °C kako bi se dobio etil 9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanoat u obliku bezbojnog ulja (6.16 g, 53% prinos tokom dve faze). LCMS ESI+ m/z 309 [M+H]+; GCMS m/z 308 [M]+.
Priprema intermedijera 4: 9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1 -en-1-il)pelargonska kiselina
[0302]
[0303] Etil 9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanoatu (13.2 g, 42.9 mmol) u etanolu (80 mL) se dodaje 4 M KOH (43 mL). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi 1.5 sata. Dodaje se voda (350 mL) i rastvor se opere sa tert-butil metil etrom (2 x 100 mL). SimVA, vodena faza se ohladi, zakiseli sa 4 M HCl (∼45 mL) i ekstrahuje sa pentanom (3 x100 mL). Kombinovani ekstrakti pentana se operu sa vodom (200 mL), osuše (MgSO4), filtriraju, koncentruju i osuše pod visokim vakuumom. Materijal se ponovo rastvori u pentanu (100 mL), koncentruje i osuši pod visokim vakuumom još jednom kako bi se dobila 9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)pelargonska kiselina u obliku bezbojnog ulja (11.1 g, 92% prinos). MS ESI- m/z 279 [M-H]-.
Priprema simdiVA: N1,N19-bis((S)-15,22-diokso-30-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-16-(9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanamido)-4,7,10-trioksa-14,21-diazatriakontil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid.
4
[0305] simDIVA se priprema na sličan način kao diVA iz prethodno opisanog N1,N19-bis((S)-16,20-diamino-15-okso-4,7,10-trioksa-14-azaikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamida sa supstitucijom 9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)pelargonske kiseline za trans retinoinsku kiselinu. QTOF MS ESI+: m/z 2050 (M H+)
Primer 28: SINTEZA DiVA-PEG18
[0306] Priprema (2E,2'E,2"E,4E,4'E,4"E,6E,6'E,6"E,8E,8'E,8"E)-N,N',N"-((5R,69R,76E,78E,80E,82E)-77,81-dimetil-6,68,75-triokso-83-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64-nonadekaoksa-7,67,74-triazatrioktakonta-76,78,80,82-tetraen-1,5,69-triil)tris(3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamida)(DIVA-PEG18).
[0307] (2E,2'E,2"E,4E,4'E,4"E,6E,6'E,6"E,8E,8'E,8"E)-N,N',N"-((5R,69R,76E,78E,80E,82E)-77,81-dimetil-6,68,75-triokso-83-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52, 55,58,61,64-nonadekaoksa-7,67,74-triazatrioktakonta-76,78,80,82-tetraen-1,5,69-triil)tris(3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamid), takođe poznat kao DIVA-PEG18 se priprema na sličan način kao diVA sa supstitucijom PEG18diamina za diamido-dPEG11-diamin. LCMS ESI+: m/z 2305 (M Na).
Primer 29: SINTEZA TriVA
Priprema TriVA
Priprema intermedijera 1: (S)-metil 6-(((benziloksi)karbonil)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benziloksi) karbonil)amino)heksanamido) heksanoat
[0309]
[0310] Sud se prečisti sa inertnim gasom i Lys(Z)-OMe HCl so (4g, 12.1mmol), HOBt hidrat (1.84 g, 13.6 mmol), Z-Lys(Z)-OH (5.64g, 13.6mmol) se suspenduju u dihlorometanu (50 mL). NMM (1.5mL, 13.6mmol)se dodaje u suspenziju i rastvor postaje bistar. Suspenzija EDC HCl soli (4.01g, 20.9 mmol) i NMM (2.0 mL, 18.2 mmol) u dihlorometanu (50 mL) se dodaje tokom perioda od 10 minuta. Reakcija se meša preko noći na sobnoj temperaturi, zatim se opere sa 1M HCl (100 mL), H2O (100 mL), zasićenim rastvorom bikarbonata (100 mL) i zasićenim fiziološkim rastvorom (100 mL). Sve vodene isplake se ekstrahuju nazad sa dihlorometanom (50 mL). Osušene organske materije sa Na2SO4, filtriraju se i koncentruju. Materijal se prečisti hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola kako bi se dobio (S)-metil 6-(((benziloksi)karbonil)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benziloksi)karbonil)amino)heksanamido) heksanoat (6.91g).
Priprema intermedijera 2: (S)-6-(((benziloksi)karbonil)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benziloksi)karbonil) amino)heksanamido)kapronska kiselina
[0312] 6-(((benziloksi)karbonil)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benziloksi)karbonil)amino)heksanamido) heksanoat (6.91g, 10mmol) se rastvori sa metanolom (50mL). Dodaje se KOH (2.24g, 40mmol) i mešavina se ostavi da se meša na 35°C. Nakon 2 sata, reakcija se ugasi dodavanjem H2O (200mL) i mešavina se opere sa dietil etrom (50mL). Nakon toga, pH se podesi na ∼2 sa 1M HCl kiselinom. Proizvod se ekstrahuje sa dihlorometanom (3x100mL), osuši sa Na2SO4, filtrira i koncentruje kako bi se dobila (S)-6-(((benziloksi)karbonil)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benziloksi)karbonil)amino)heksanamido)kapronska kiselina (4g).
Priprema intermedijera 3: (Cbz)6-zaštićen N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutil)-15,18-diokso-4,7,10-trioksa-14,17-dizatrikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid
[0313]
[0314] Sud sa okruglim dnom se prečisti sa inertnim gasom a diamido-dPEG11-diamin (1g, 1.35mmol), (S)-6-(((benziloksi)karbonil)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benziloksi)karbonil)amino)heksanamido)kapronska kiselina (2.05 g, 3.03 mmol), HOBt hidrat (409 mg, 3.03mmol) se suspenduju u dihlorometanu (25 mL). NMM (333 uL, 3.03 mmol) se dodaje u suspenziju i rastvor postaje bistar. Suspenzija EDC HCl soli (893 mg, 4.66 mmol) i NMM (445 uL, 4.05 mmol) u dihlorometanu (25 mL) se dodaje tokom perioda od 10 minuta. Reakcija se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi, zatim opere sa 1M HCl (100 mL), H2O (100 mL), zasićenim rastvorom bikarbonata (100 mL) i zasićenim fiziološkim rastvorom (100 mL). Sve vodene isplake se ekstrahuju nazad sa dihlorometanom (50 mL). Organske materije se osuše sa Na2SO4, filtriraju i koncentrujuju. Materijal se prečisti hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola kako bi se dobio (Cbz)6-zaštičen N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutil)-15,18-diokso-4,7,10-trioksa-14,17-dizatrikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid (480 mg).
Priprema intermedijera 4: N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutil)-15,18-diokso-4,7,10-trioksa-14,17-dizatrikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid
[0315]
[0316] (Cbz)6-zaštićen N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutil)-15,18-diokso-4,7,10-trioksa-14,17-dizatrikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid se rastvori u metanolu (30mL) u sudu sa okruglim dnom i ispere sa inertnim gasom. Dodaje se 10% Pd/C (135mg) i sud se još jednom ispere sa inertnim gasom a zatim se sav vazduh uklanja vakuum pumpom. Dodaje se 20.3 cm (8") H2balon i reakcija se ostavi da se meša na sobnoj temperaturi. Nakon 2 sata, Pd/C se uklanja filtriranjem kroz lopaticu celite-a, pere sa metanolom, i koncentruje kako bi se dobio N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutil)-15,18-diokso-4,7,10-trioksa-14,17-dizatrikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid (823 mg).
Priprema TriVA
[0318] N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutil)-15,18-diokso-4,7,10-trioksa-14,17-dizatrikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid se meša u dihlorometanu i dodaju se DMAP i retinoinska kiselina. Dodaje se NMM i rastvor se meša u sudu sa okruglim dnom prekrivenim aluminijumskom folijom sa inertnim gasom na sobnoj temperaturi. Suspenzija EDC HCl soli i NMM u dihlorometanu (20 mL) se polako dodaje reakciji tokom perioda od 10 minuta. Reakcija se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Narednog dana, razblaži se sa dihlorometanom do 100 mL. Opere sa H2O (100 mL), zasićenim rastvorom bikarbonata (100 mL) i zasićenim fiziološkim rastvorom (100 mL). Sve vodene isplake se ekstrahuju nazad sa dihlorometanom (50 mL). Organske materije se osuše sa Na2SO4, filtriraju i koncentruju. Materijal se prečisti osnovnom alumina hromatografijom koji eluira sa gradijentom dihlorometana/etanola kako bi se dobio TriVA (780 mg). LCMS ESI+: m/z 2972 (M Na).
Primer 30 (komparativni primer): SINTEZA 4TTNPB
[0319] Priprema N1,N19-bis((R)-1,8-diokso-7-(4-((E)-2-(5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-naftalen-2-il)prop-1-en-1-il)benzamido)-1-(4-((E)-2-(5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-il)prop-1-en-1-il)fenil)-13,16,19-trioksa-2,9-diazadokozan-22-il)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid (4TTNPB).
[0320] N1,N19-bis((R)-1,8-diokso-7-(4-((E)-2-(5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-naftalen-2-il)prop-1-en-1-il)benzamido)-1-(4-((E)-2-(5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-il)prop-1-en-1-il)fenil)-13,16,19-trioksa-2,9-diazadokozan-22-il)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid, takođe poznat kao 4TTNPB, se priprema na sličan način kao N1,N19-bis((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9(2,6,6-trimetilciklo-heks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-24,28-dimetil-15,22-diokso-30-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-4,7,10-trioksa-14,21-diazatriakonta-23,25,27,29-tetraen-1-il)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid, takođe poznat kao diVA, iz N1,N19-bis((S)-16,20-diamino-15-okso-4,7,10-trioksa-14-azaikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamida sa supstitucijom TTNPB za trans retinoinsku kiselinu. LCMS ESI+: m/z 2343 (M Na).
Primer 31 (komparativni primer): SINTEZA 4Myr
[0321] Priprema N1,N19-bis((R)-15,22-diokso-16-tetradekanamido-4,7,10-trioksa-14,21-diazapentatriakontil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamida (4Myr).
Priprema 4Myr: N1,N19-bis((R)-15,22-diokso-16-tetradekanamido-4,7,10-trioksa-14,21-diaza-pentatriakontil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid
[0322]
[0323] N1,N19-bis((S)-16,20-diamino-15-okso-4,7,10-trioksa-14-azaikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid (prethodno opisana sinteza) se rastvori u dihlorometanu i stavi u ledeno kupatilo. Dodaje se miristoil-hlorid, a nakon njega trietilamin. Ledeno kupatilo se uklanja i reakcija se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi pod omotačem inertnog gasa. Narednog dana, razblaži se sa dihlorometanom do 100 mL i opere sa 1M HCl (75 mL), H2O (75 mL), zasićenim rastvorom bikarbonata (75 mL) i zasićenim fiziološkim rastvorom (75mL). Sve vodene isplake se ekstrahuju nazad sa dihlorometanom (25mL). Organske materije se osuše sa MgSO4, filtriraju i koncentruju. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola daje N1,N19-bis((R)-15,22-diokso-16-tetradekanamido-4,7,10-trioksa-14,21-diaza-penta-triakontil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid (410mg). LCMS ESI+: m/z 1841 (M H).
Primer 32: SINTEZA DiVA-242
[0324] Priprema N1,N16-bis((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetil-cikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-19,23-dimetil-10,17-diokso-25-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-3,6-dioksa-9,16-diazapentakoza-18,20,22,24-tetraen-1-il)-4,7,10,13-tetraoksaheksadekan-1,16-diamida, takođe poznatog kao DIVA-242
Priprema intermedijera 1: di-tert-butil (10,25-diokso-3,6,13,16,19,22,29,32-oktaoksa-9,26-diazatetratriakontan-1,34-dil)dikarbamat
[0325]
[0326] Sud sa okruglim dnom koji sadrži dihlorometan (25 mL) se prečišćava sa inertnim gasom i dodaju se Bis-dPeg4kiselina (1000 mg, 3.40 mmol), N-Boc-3,6-dioksa-1,8-oktan diamin (1816 uL, 7.65 mmol) i HOBt hidrat (1034 mg, 7.65 mmol). NMM (841 uL, 7.65 mmol) se dodaje u suspenziju i rastvor postaje bistar. Suspenzija EDC HCl soli (2249 mg, 11.7 mmol) i NMM (1121 uL, 10.2 mmol) u dihlorometanu (25 mL) se dodaju a nakon toga se dodaje DMAP (62 mg, 0.51 mmol). Reakcija se ostavi da se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Zatim se razblaži sa dihlorometanom do 100 mL i opere sa H2O (100 mL), 10% K2CO3(100 mL) i zasićenim fiziološkim rastvorom (100 mL), sve vodene isplake se ekstrahuju nazad sa dihlorometanom (30 mL), osuše sa MgSO4, filtriraju i koncentruju. Prečišćavanje hromatografijom sa silika gelom sa gradijentom dihlorometana/metanola daje di-tert-butil (10,25-diokso-3,6,13,16,19,22,29,32-oktaoksa-9,26-diazatetratriakontan-1,34-dil)dikarbamat (2.57 g).
Priprema intermedijera 2: N1,N16-bis(2-(2-(2-aminoetoksi)etoksi)etil)-4,7,10,13-tetraoksaheksa-dekan-1,16-diamid so TFA
1
[0328] di-tert-butil(10,25-diokso-3,6,13,16,19,22,29,32-oktaoksa-9,26-diazatetratriakontan-1,34-dil) dikarbamat se rastvori u dihlorometanu (15 mL) i stavi se u ledeno kupatilo. Sud sa okruglim dnom se ispira inertnim gasom i dodaje se TFA (15 mL). Mešavina se ostavi da se meša 20 minuta. Nakon toga, reakciona mešavina se koncentruje kako bi se dobila N1,N16-bis(2-(2-(2-aminoetoksi)etoksi)etil)-4,7,10,13-tetraoksaheksadekan-1,16-diamid so TFA (1885 mg).
Priprema DIVA-242: N1,N16-bis((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-19,23-dimetil-10,17-diokso-25-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-3,6-dioksa-9,16-diazapentakoza-18,20,22,24-tetraen-1-il)-4,7,10,13-tetraoksaheksadekan-1,16-diamid
[0329]
[0330] Sinteza N1,N16-bis((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-19,23-dimetil-10,17-diokso-25-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)-3,6-dioksa-9,16-diazapentakoza-18,20,22,24-tetraen-1-il)-4,7,10,13-tetraoksaheksadekan-1,16-diamida (DIVA-242) se odvija po istom protokolu kao i kod diVA od N1,N16-bis(2-(2-(2-aminoetoksi)etoksi)etil)-4,7,10,13-tetraoksaheksadekan-1,16-diamida so TFA. LCMS ESI+: m/z 1940 (M H).
Primer 33: Formiranje čestica nukleinske kiseline-lipida
[0331] SiRNK koja se pominje u protokolima formulacije predstavlja dvostruki lanac siRNK sekvence sa 21-mer ciljajućim HSP47/gp46 pri čemu HSP47 (miš) i gp46 (pacov) predstavljaju homologe - isti gen u različitim vrstama:
pacov HSP47-C dvostruki lanac siRNK koji se koristi u in vitro ogledima (pacov pHSCs)
Sens (5'->3') GGACAGGCCUCUACAACUATT (SEQ. ID NO.2)
Antisens (3'->5') TTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU (SEQ. ID NO.3)
2
miš HSP47-C dvostruki lanac siRNK koji se koristi u formulacijama za in vivo ogled (miš CCl4 model) Sens (5'->3') GGACAGGCCUGUACAACUATT (SEQ. ID NO.4)
Antisens (3'->5') TTCCUGUCCGGACAUGUUGAU (SEQ. ID NO.5)
[0332] Priprema osnovnog rastvora katjonskog lipida. Osnovni rastvori katjonskih lipida se pripremaju kombinovanjem katjonskog lipida sa DOPE-om, holesterolom, i diVA-PEG-diVA u etanolu u koncentracijama od 6.0, 5.1 i 2.7 i 2.4 mg/mL. Ukoliko je potrebno, rastvori se zagreju do oko 50 °C kako bi se olakšalo rastvaranje katjonskih lipida u rastvoru.
[0333] Priprema praznog lipozoma. Osnovni rastvor katjonskog lipida se ubrizgava u vodenu mešavinu koja se brzo meša na 35-40 °C putem injekcije/injekcija pri brzini od 1.5 mL/min po priključku za injekciju. Odnos osnovnog rastvora katjonskog lipida i vodenog rastvora (po zapremini) je utvrđen na 35:65. Nakon mešanja, prazne vezikule se spontano formiraju. Dobijene vezikule se zatim ostave da se ekvilibrišu na 35-40°C 10 minuta pre nego što se sadržaj etanola smanji na ∼ 12%. Prazan lipozom se zatim diafiltrira naspram 10x zapremina vodenog pufera kako bi se uklonio etanol.
[0334] Priprema lipopleksa. Prazna vezikula pripremljena prema gore opisanoj metodi se razblaži do konačne zapremine od 1 mM koncentracije katjonskog lipida 9% saharozom. Rastvoru koji se meša, dodaje se 100 µL 5% glukoze u vodi koja ne sadrži RNase, za svaki mL razblažene prazne vezikule ("EV") i temeljno promeša. 150 µL 10 mg/mL siRNK rastvora se zatim dodaje u vodu koja ne sadrži RNase odjednom i temeljno se promeša. Mešavina se zatim razblaži sa 5% rastvorom glukoze sa 1.750 mL za svaki mL upotrebljene EV. Mešavina se meša na oko 200 rpm na sobnoj temperaturi 10 minuta. Koristeći polupropusnu membranu sa ∼100000 MWCO u sistemu ultrafiltracije ukrštnog protoka upotrebom adekvatno odabrane peristatičke pumpe (npr. Midgee Hoop, UFP-100-H24LA), mešavina se koncentruje do oko 1/3 originalne zapremine (ili željene zapremine) a zatim se diafiltrira naspram zapremine veće 5 puta od zapremine uzorka upotrebom vodenog rastvora koji sadrži 3% saharozu i 2.9% glukozu. Proizvod se zatim filtrira kroz kombinovani filter veličine pora 0.8/0.2 mikrona u aseptičnim uslovima pre upotrebe.
[0335] Formiranje lipozoma koji ne sadrži diVA siRNK. Katjonski lipid, DOPE, holesterol, i PEG-konjugovani lipid se rastvore u apsolutnom etanolu (200 dokazan) u molarnom odnosu od 50:10:38:2. SiRNK se rastvori u 50 mM puferu citrata i temperatura se podesi na 35-40°C. Mešavina etanol/lipid se zatim dodaje puferu koji sadrži siRNK pri čemu se meša da bi se spontano formirao lipozom napunjen siRNK. Lipidi se kombinuju sa siRNK da bi se postigao konačni odnos lipida i siRNK od 15:1 (maseni procenat). Opseg može biti 5:1 do 15:1, poželjno 7:1 do 15:1. Lipozom napunjen sa SiRNK se diafiltrira naspram 10X zapremina od PBS (pH 7.2) kako bi se uklonio etanol i razmenio pufer. Krajnji proizvod se filtrira kroz 0.22 µm, sterilišući stupanj, PES filter za smanjenje biološkog tereta. Ovaj proces daje lipozom sa srednjim prečnikom čestice od 50-100 nm, PDI <0.2, i >85% efikasnosti hvatanja.
[0336] Formiranje lipozoma koji sadrži siRNK koja je zajednički rastvoren sa diVA. siRNK-diVA-formulacije lipozoma se pripremaju upotrebom gore opisane metode. DiVA-PEG-diVA se zajednički rastvara u apsolutnom etanolu sa drugim lipidima (katjonski lipid, DOPE, holesterol, i PEG-konjugovani lipid u odnosu od 50:10:38:2) pre dodavanja puferu koji sadrži siRNK. Opseg molarnog sadržaja diVA-PEG-diVA je od 0.1 do 5 molarnog odnosa (50:10:38:2:0.1 do 50:10:38:2:5). Ovaj proces daje lipozom sa srednjim prečnikom čestice od 50-100 nm, PDI <0.2, i >85% efikasnosti hvatanja..
[0337] Formiranje lipozoma koji sadrži siRNK sa katjonskim lipidima.siRNK-diVA-formulacije lipozoma i siRNK-formulacije lipozoma se pripremaju upotrebom gore opisane metode. Katjonski lipid može biti, na primer, HEDC, HEDODC, DC-6-14, ili bilo koja kombinacija ovih katjonskih lipida.
[0338] Formiranje lipozoma koji sadrži siNRK dekorisanih sa diVA.siRNK-formulacije lipozoma se pripremaju upotrebom gore opisane metode i razblaže se do koncentracije siRNK od 0.5 mg/mL u PBS. Katjonski lipid može biti HEDC, HEDODC, DC-6-14, ili bilo koja kombinacija ovih katjonskih lipida. diVA-PEG-diVA se rastvori u apsolutnom etanolu (200 dokazan) do konačne koncentracije koja je u opsegu od 10 do 50 mg/mL.
Odgovarajuća količina rastvora etanola se dodaje rastvoru siRNK-lipozoma kako bi se dobio krajnji molarni procenat između 2 i 10 mol%. Rastvor se uranja više puta gore-dole sa pipetom kako bi se izmešao.
Koncentracija diVA-PEG-diVA i dodavanje zapremine etanola se podese da održavaju zapreminu dodavanja >1.0 µL i krajnju koncentraciju etanola < 3% (vol/vol). Dekorisani lipozomi se zatim blago promućkaju na sobnoj temperaturi 1 sat na orbitalnoj mešalici pre in vitro ili in vivo procene.
[0339] U sledećim tabelama su navedeni poželjni primeri izvođenja ovog pronalaska izraženi u smislu molarnog odnosa, kao i ekvivalenta mol % i masenih procenata.
4
Primer 34: Transfekcija sa lipozomalnim formulacijama
[0340] Metoda transfekcije je ista za LX-2 i pHSCs. Formulacije lipozoma ili formulacije lipopleksa ovog pronalaska se mešaju sa podlogom za rast u željenim koncentracijama. Ćelijama u ploči sa 96 bunara se dodaje 100 µl mešavine i ćelije se inkubiraju 30 min na 37 °C u inkubatoru sa 5% CO2. Nakon 30 minuta, podloga se zameni svežom podlogom za rast. Nakon 48 sati transfekcije, ćelije se obrađuju korišćenjem Cell-to-Ct® reagensima lize (Applied Biosystems) u skladu sa uputstvima proizvođača.
[0341] Kvantitativna RT-PCR za merenje HSP47 mRNK ekspresije (qRT-PCR) HSP47 i GAPDH TaqMan® ogledi i glavna mešavina RT-PCR od jedne faze su nabavljeni od Applied Biosystems. Svaka PCR reakcija sadrži sledeću kompoziciju: mešavina RT-PCR od jedne faze 5 µl, TaqMan® RT mešavina enzima 0.25 µl, TaqMan® test za ogled ekspresije gena (HSP47) 0.25 µl, TaqMan® test za ogled ekspresije gena (GAPDH) 0.5 µl, voda koja ne sadrži RNase 3.25 µl, ćelijski lizat 0.75 µl, ukupna zapremina od 10 µl. GAPDH se koristi kao endogena kontrola za relativnu kvantifikaciju HSP47 mRNK nivoa. Kvantitativna RT-PCR se izvodi u ViiA 7 real-time PCR sistemu (Applied Biosciences) koristeći ugradnu metodu relativne kvantifikacije. Sve vrednosti su normalizovane do prosečne HSP47 ekspresije lažno transfektovanih ćelija i izražene su kao procenat HSP47 ekspresije u poređenju sa lažnim.
In vivo eksperimenti: Ženke miševa C57B1/6 odgajivača u penziji (Charles River) sa masenim opsegom od 24-30 grama se koriste za ovo ispitivanje. Životinje su nasumično podeljene prema težini u 10 grupa, od kojih svaka grupa broji 10 životinja. Sve postupke sa životinjama je odobrio Bio-Quant's IACUC i/ili Prisutni veterinar ukoliko je potrebno i sva pitanja vezana za dobrobit životinja su obrađena i dokumentovana. Miševima se daje anestezija sa Izofluranom i uzima im se krv putem donje šuplje vene.
[0342] Ushodna regulacija proteina toplotnog šoka 47 (HSP47) je izazvana preko intraperitonealnog ubrizgavanja CCl4(CCl4u maslinovom ulju, 1:7 (vol/vol), 1 µL po gramu telesne mase) koji se daje svakog drugog dana u periodu od 7 dana (0., 2., 4., 6. dan). Trećeg dana miševi su bili tretirani 4 uzastopna dana (3., 4., 5., 6. dan) sa lipozomom ili formulacijama lipopleksa ovog pronalaska ili PBS injekcijom u venu repa. Jedna grupa od deset miševa (naivni) nije primila ni CCl4tretman ni intravensku injekciju i poslužili su kao kontrolna grupa za normalnu ekspresiju HSP47 gena.
Vremenski okvir eksperimenta
[0343] Sedmog dana i približno 24 sata nakon poslednje IV injekcije, svi preostali miševi su žrtvovani i jetre su bile stavljene na PBS infuziju pre sakupljanja uzoraka jetre za PCR analizu. Približno 150 mg uzorka od jetre svakog miša se uzima i stavlja 1.5 mL reagensa za stabilizaciju RNKlater (Qiagen) i čuva se na temperaturi 2-8°C do analize. Uzorci jetre se ne sakupljaju iz delova jasnog i označenog oštećenja jetre i/ili nekroze.
[0344] Ukupna RNK iz jetre miševa se ekstrahuje koristeći RNeasy kolone (Qiagen) prema protokolu proizvođača.20 ng od ukupne RNK se koristi za kvantitativnu RT- PCR za merenje ekspresije HSP47. HSP47 i GAPDH TaqMan® ogledi i glavna mešavina RT-PCR od jedne faze se nabavljaju od Applied Biosystems. Svaka PCR reakcija sadrži sledeću kompoziciju: mešavina RT-PCR od jedne faze 5 µl, TaqMan® RT mešavinu enzima 0.25 µl, TaqMan® test za ogled ekspresije gena (HSP47) 0.25 µl, TaqMan® test za ogled ekspresije gena (GAPDH) 0.5 µl, voda koja ne sadrži RNase 3.25 µl, RNK 0.75 µl, ukupna zapremina od 10 µl. GAPDH se koristi kao endogena kontrola za relativnu kvantifikaciju HSP47 mRNK nivoa. Kvantitativna RT-PCR se izvodi u ViiA 7 realtime PCR sistemu (Applied Biosciences) koristeći ugradnu metodu relativne kvantifikacije. Sve vrednosti su normalizovane do prosečne ekspresije HSP47 grupe naivnih životinja i izražene su kao procenat Ekspresije HSP47 u poređenju sa grupom naivnih.
[0345] Formulacije opisane na Fig.1 su sledeće:
[0346] Formulacije opisane na Fig.2 su sledeće
[0347] Formulacije opisane na Fig.3 su sledeće.
Primer 35: in vitro efikasnost (pHSC) – odgovor na dozu
Opis pHSC in vitro ogleda:
[0348] Primarne stelatne ćelije jetre (pHSCs) u ploči sa 96 bunara se inkubiraju sa formulacijama (HEDC:S104:DOPE:Chol:Peg-DMPE:DiVA, 20:20:30:25:5:2) rastućih siRNK koncentracija. Nakon 30 minuta, ćelije se operu i tretiraju sa svežom podlogom za rast i inkubiraju se na 37°C 48 sati. Za to vreme, ćelije podležu lizi i nivoi gp46 i GAPDH mRNK se mere ogledom kvantitativne RT-PCR (TaqMan®) ogledom. Nivoi mRNK gp46 se normalizuju do GAPDH nivoa. Normalizovani nivoi gp46 su izraženi kao procenat netretiranih kontrolnih ćelija. Na Fig.4 su prikazani rezultati. Stupci greške pokazuju standardne devijacije (n=3).
Uklapanje podataka u sigmoidnu krivu doza-odgovor upotrebom Graphpad-a je dalo EC50od 11.8 nM.
Primer 36: Toksičnost
Opis ogleda HepG2 citotoksičnosti:
[0349] HepG2 ćelije, adherentna ćelijska linija dobijena iz humanog hepatocelularnog karcinoma, je kultivisana u MEM/EBSS (Hyclone, Logan, Utah, Cat# SH30024.01) sa dodatkom od 10% FBS (Hyclone, Logan, Utah Cat# SH30910). HepG2 ćelije su zasejane u Optilux crnim pločama sa 96 bunara (BD Falcon, Cat # BD353220) pri gustini od 5000 ćelija/bunara preko noći. Formulacije se dodaju u svaki bunar do konačne naznačene siRNK koncentracije (n=3). Nakon 48 sati od dodavanja formulacije, određuje se vijabilnost ćelije koristeći komplet za luminiscentno ispitivanje ćelijske vijabilnosti CellTiter-Glo (Promega, Cat #G7572) prema uputstvima proizvođača. Hemiluminescenti signal se meri pomoću Clarity čitača mikroploče u luminiscentnom ispitivanju (502-Biotek, Winooski, Vermont). Vijabilnost se računa na osnovu % hemiluminescentnog signala u bunaru tretiranom formulacijom normalizovanom naspram bunara tretiranih sa lažnim formulacijama.
[0350] Nakon istraživanja formulacija sa našim najpotentnijim kvaternarnim aminskim katjonskim lipidima formule I, procenili smo kombinacije kvaternarnih aminskih katjonskih lipida formule I sa njihovim odgovarajućim sintetičkim prekursorima koji mogu da jonizuju (kako je prikazano u primerima dole ispod, i-DC i HEDC, INT4 i DODC, S104 i HES104).
[0351] U sledećoj tabeli su prikazani primeri rezultata od različitih formulacija. Kombinacije kvaternarnih aminskih katjonskih lipida sa katjonskim lipidima koji mogu da jonizuju su iznenađujuće i neočekivano bili manje toksični nego lipozomi koji sadrže jedan katjonski lipid (videti primere HEDC nasuprot HEDC+ iDC; i DODC nasuprot DODC+INT4 u tabeli dole ispod). HEDC+S104 kombinacija je identifikovana kao druga poželjna formulacija.
Samo varijante sa sadržajem DiVA većim od 0 mol% su u skladu sa ovim pronalaskom
in vivo toksičnost
[0352] HEDC:S104 (20:20) formulacija se izuzetno dobro toleriše u preliminarnim in vivo ispitivanjima toksičnosti. Toksičnost nije primećena kada se formulacija ubrizgava intravenski u dozama do 25 mg/kg (pacov) i 12 mg/kg (majmun). Ovo se smatra superiornim u ovom polju. Na primer, Alnylam
1
Pharmaceuticals je 1. marta 2012. godine otkrio na konferenciji AsiaTIDES da je njihova najmanje toksična treća generacija lipidnih nanočestica imala NOAEL od 10 mg/kg (jedna doza, pacov).
Primer 37: in vivo efikasnost (pacov DMNQ)
[0353] In vivo aktivnost ciljne formulacije je procenjena u modelu kratkoročnog oštećenja jetre (označenom kao Brzi model, DMNQ). U ovom modelu, kratkoročno oštećenje jetre izazvano tretmanom hepatoksičnim agensom kao što je dimetilnitrosamin (DMN) je praćeno procenom nivoa gp46 mRNK. Da bi se izazvale ove promene, mužjacima pacova Sprague-Dawley se intrapertionealno ubrizgava DMN 6 uzastopnih dana . Na kraju perioda lečenja DMN-om, životinje su nasumično grupisane na osnovu svojih individualnih telesnih masa. Formulacije se primenjuju u vidu jedne intravenske doze, jedan sat nakon poslednje injekcije DMN. Dvadeset četiri sata kasnije, režnjevi jetre se iseku i nivoi i gp46 i MRPL19 mRNK se odrede ogledom kvantitativne RT-PCR (TaqMan®). Nivoi gp46 mRNK se normalizuju do nivoa MRPL19.
[0354] Mužjaci pacova Sprague-Dawley se tretiraju DMN-om u dozi od 10 mg/kg 1., 2., 3. I 5. Dana i u dozi od 5 mg/kg 4., 5., 6. dana intraperitonealnim doziranjem kako bi se izazvalo oštećenje jetre. Životinjama (n = 8/grupa) se intravenski daje ili sa formulacijom u dozi od 0.5, 0.75, 1.0, 2 mg/kg siRNK u formualciji koja se sastoji od HEDC:S104:DOPE:Chol:Peg-DMPE:DiVA (20:20:30:25:5:2), ili PBS (nosač), jedan sat nakon poslednje injekcije DMN. Dvadeset četiri sata kasnije, ukupna siRNK se prečišćava iz dela desnog režnja jetre od svake životinje i čuva se na temperaturi 4°C do izolovanja RNK. Kontrolne grupe izazivaju grupu PBS nosača (tretiranih DMN-om) i grupu naivnih (netretiranih; bez DMN). Na Fig.5 su prikazani rezultati merenja. Nakon oduzimanja pozadine gp46 mRNK nivoa određenih u grupi naivnih, sve vrednosti ispitivane grupe su normalizovane do prosečnog gp46 mRNK grupe nosača (izraženo kao procenat grupe nosača). Srednja vrednost gp46 mRNK nivoa nakon tretmana je pokazala odgovor koji je zavistan od doze a kriva koja se uklapa u sigmodialnu doza-odgovor krivu je dala EC50od 0.79 mg/kg.
Primer 38: in vivo efikasnost (pacov DMNC)
[0355] Mužjaci pacova Sprague Dawley (130-160 g) su tretirani sa DMN-om intraperitonealnim doziranjem kako bi se izazvala fibroza jetre. Režim tretmana DMN-om je podrazumevao 3 puta svake nedelje (poned., uto., i pet.) sa 10 mg/kg (tj., 5.0 mg/mL DMN u dozi od 2.0 mL/kg telesne mase) za prve 3 nedelje i pola doze od 5 mg/kg (tj., 5 mg/mL DMN u dozi od 1.0 mL/kg) od 22., do 57. dana. Životinjama iz lažne grupe je ubrizgan PBS (rastvarač za DMN) koristeći isti raspored.22. dana, 24 sata nakon poslednjeg tretmana DMN-om, uzimaju se uzorci krvi i ispituju se na biomarkere bolesti jetre kako bi se potvrdila efektivnost tretmana DMN-om. Životinje koje su tretirane DMN-om su dodeljene različitim grupama na osnovu telesne mase kako bi se osiguralo da se srednja vrednost telesnih masa i opseg telesnih masa životinja u svakoj grupi, značajno ne razlikuje. Životinje iz grupe za predtretman se žrtvuju 25. dana kako bi se odredila faza
2
napretka bolesti pre početka tretmana. Tretmani sa formulacijama koje sadrže gp46 siRNK su započeti 25. dana sa 2 tretmana/nedeljno u specifičnoj dozi siRNK za ukupno 10 puta.59. dana, 48 sati nakon poslednjeg tretmana sa formulacijom i 72 sata nakon poslednjeg tretmana sa DMN-om, životinje se žrtvuju udisanjem CO2. Režnjevi jetre se iseku i nivoi i gp46 i MRPL19 mRNK se određuju kvantitativnim RT-PCR (TaqMan®) ogledom. Nivoi mRNK za gp46 se normalizuju do nivoa MRPL19.
[0356] Mužjaci pacova Sprague-Dawley se tretiraju sa DMN u dozi od 10 mg/kg u periodu od tri nedelje (tri puta/nedeljno) a zatim u dozi od 5 mg/kg od 22. do 57. dana (tri puta/nedeljno) intraperitonealnim doziranjem kako bi se izazvala fibroza jetre. Životinjama (n = deset/grupa) se intravenski daju ili formulacije koje sadrže HEDC:S104:DOPE:Chol:Peg-DMPE:DiVA (20:20:30:25:5:2) u dozama od 1.5, 1.0, 0.75, i 0.5 mg/kg siRNK ili PBS (nosač) 10 puta (2 puta/nedeljno), jedan sat nakon poslednje injekcije DMN. 59. dana, ukupna siRNK se prečišćava iz dela desnog režnja jetre od svake životinje i čuva se na temperaturi od 4°C do analize. Kontrolne grupe izazivaju grupu PBS nosača (izazvanu DMN-om, tretirani PBS-om, n=7) i lažnu grupu (tretirani PBS-om umesto DMN formulacijom, n=10) . Na Fig.6 su prikazani rezultati merenja. Nakon oduzimanja pozadine gp46 mRNK nivoa određenih u grupi naivnih, sve vrednosti ispitivane grupe su normalizovane do prosečnog gp46 mRNK grupe nosača (izraženo kao procenat grupe nosača). Životinje iz grupe za predtretman (n=7) su žrtvovane 25. dana kako bi se procenio nivo napretka bolesti pre nego što se počne sa tretmanom. Anova analiza u jednom smeru nakon Dunnett's test-a pokazuje značajan nokdaun gena gp46 u svim tretiranim grupama u poređenju sa grupom nosača (***, P<0.001).
[0357] U sledećoj tabeli je dat kratak prikaz jedinjenja opisanih u ovom tekstu, i rezultata dobijenih ispitivanjem ovih jedinjenja in vivo i in vitro.
4
Primer 39: In vivo anti-plućna-fibroza
[0358] Mužjacima S-D pacova (8 pacova/grupa, starosti 8 nedelja, Charles River Laboratories Japan, Inc.) se jednom daje doza od 0.45 mg bleomicina (BLM) rastvorena u 0.1 mL fiziološkog rastvora u plućno krilo intratrahealno kanilom (MicroSprayer, Penn-Century, Inc.) pod anestezijom, kako bi se stvorio model plućne fibroze. Sa ovom metodom, značajna fibroza se javlja u plućnom krilu generalno nakon približno 2 nedelje. Formulacija lipozoma (1.5 mg/kg kao količina siRNK, 1 ml/kg u zapremini, tj., 200 µl za pacova od 200 g) ili PBS (1 ml/kg u zapremini) se daje pacovima putem vene u repu, počev od 2 nedelje nakon primene bleomicina, ukupno deset puta (svakog drugog dana). Pacovi se žrtvuju na dva dana nakon poslednjeg tretmana, sprovodi se histološko ispitivanje tkiva plućnog krila (videti Fig.7). Jednosmerna ANOVA i Bonferroni testovi za višestruko poređenje se koriste za procenu statistički značajne razlike.
[0359] Deo uklonjenog plućnog krila je fiksiran za formalin u skladu sa rutniskom metodom, i podleže bojenju azanom (azokarmin, plavo narandžasti G rastvor anilina)..
[0360] Kako je pokazano rezultatima histološkog vrednovanja (T. Ashcroft rezultat) na Fig.7, u grupi za primenu formulacije (Tretman), rezultat fibroze je značajno smanjen.
Primer 40: In vitro procena VA-siRNK-formulacije lipozoma za efikasnost nokdauna u LX-2 ćelijskoj liniji i primarnim stelatnim ćelijama jetre kod pacova (pHSCs)
[0361] LX2 ćelije (Dr. S.L. Friedman, Mount Sinai School of Medicine, NY) se gaje u DMEM (Invitrogen) dopunjenoj sa 10 % fetalnim serumom govečeta (Invitrogen) na 37 °C u inkubatoru sa 5% CO2. Ćelije se tretiraju tripsinom koristeći TryPLExpress rastvor (Invitrogen) 3 minuta na 37 °C u inkubatoru. Koncentracija u ćeliji se određuje brojanjem ćelija u hemocitometru i 3000 ćelija/bunar se posadi u ploče sa 96 bunara. Ćelije se gaje 24 sata pre transfekcije.
[0362] Primarne stelatne ćelije jetre kod pacova (pHSCs) se izoluju od Sprague-Dawley pacova prema prethodno objavljenoj metodi (Nat. Biotechnol.2008, 26(4):431-42). pHSCs se gaje u DMEM dopunjenoj sa 10% fetalnim serumom govečeta. Ćelije se gaje do dva prolaza nakon izolovanja pre njihovog korišćenja za n vitro skeniranje. Ćelije se zaseju pri gustini ćelija od 100 ćelija/bunar u ploči sa 96 bunara i gaje se 48 sati pre njihovog uzimanja za transfekciju.
[0363] Transfekcija sa VA-siRNK-formulacijama lipozoma. Metoda transfekcije je ista za LX-2 i pHSC ćelije. VA-siRNK-lipozom ili VA-siRNK-formulacije lipopleksa se mešaju sa podlogom za rast u željenim koncentracijama. Ćelijama u ploči sa 96 bunara se dodaje 100 µl mešavine i ćelije se inkubiraju 30 min na 37 °C u inkubatoru sa 5% CO2. Nakon 30 minuta, podloga se zameni svežom podlogom za rast. Nakon 48 sati transfekcije, ćelije se obrađuju korišćenjem Cell-to-Ct reagenasa lize (Applied Biosystems) u skladu sa uputstvima proizvođača.
[0364] Kvantitativna (q) RT-PCR za merenje ekspresije HSP47 mRNK. HSP47 i GAPDH TaqMan® ogledi i glavna mešavina RT-PCR od jedne faze se nabavljaju od Applied Biosystems. Svaka PCR reakcija sadrži sledeću kompoziciju: mešavina RT-PCR od jedne faze 5 µl, TaqMan® RT mešavina enzima 0.25 µl, TaqMan® test za ogled ekspresije gena (HSP47) 0.25 µl, TaqMan® test za ogled ekspresije gena (GAPDH) 0.5 µl, voda koja ne sadrži RNase 3.25 µl, ćelijski lizat 0.75 µl, ukupna zapremina od 10 µl. GAPDH se koristi kao endogena kontrola za relativnu kvantifikaciju HSP47 mRNK nivoa. Kvantitativna RT-PCR se izvodi u ViiA™ 7 realtime PCR sistemu (Applied Biosciences) koristeći ugradnu metodu relativne kvantifikacije. Sve vrednosti su normalizovane do prosečne HSP47 ekspresije lažno transfektovanih ćelija i izražene su kao procenat HSP47 ekspresije u poređenju sa lažnim.
[0365] SiRNK koja se pominje u protokolima formulacije predstavlja dvostruki lanac siRNK sekvence sa 21-mer ciljajućim HSP47/gp46 pri čemu HSP47 (miš) i gp46 (pacov) predstavljaju homologe - isti gen u različitim vrstama:
Pacov HSP47-C dvostruki lanac siRNK koji se koristi u in vitro ogledima (pacov pHSCs)
Sens (5'->3') GGACAGGCCUCUACAACUATT (SEQ. ID NO.1)
Antisens (3'->5') TTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU (SEQ. ID NO.2).
[0366] Priprema osnovnog rastvora katjonskog lipida. Osnovni rastvori katjonskih lipida se pripremaju kombinovanjem katjonskog lipida sa DOPE-om, holesterolom, i diVA-PEG-DiVA u etanolu u koncentracijama od 6.0, 5.1 i 2.7 i 2.4 mg/mL. Ukoliko je potrebno, rastvori se zagreju do oko 50° C kako bi se olakšalo rastvaranje katjonskih lipida u rastvoru.
[0367] Priprema praznog lipozoma. Osnovni rastvor katjonskog lipida se ubrizgava u vodenu mešavinu 9% saharoze koja se brzo meša na 40±1° C putem injekcije/injekcija na 1.5 mL/min po priključku za injekciju. Odnos osnovnog rastvora katjonskog lipida i vodenog rastvora (po zapremini) iznosi 35:65. Nakon mešanja, prazne vezikule se spontano formiraju. Dobijene vezikule se zatim ostave da se ekvilibrišu na 40° C 10 minuta pre nego što se sadržaj etanola smanji na ∼ 12%.
[0368] Priprema lipopleksa. Prazna vezikula pripremljena prema gore opisanoj metodi se razblaži do konačne zapremine od 1 mM koncentracije katjonskog lipida 9% saharozom. Rastvoru koji se meša, dodaje se 100 µL 5% glukoze u vodi koja ne sadrži RNase za svaki mL razblažene prazne vezikule ("EV") i temeljno promeša. Zatim se odjednom dodaje 150 µL 10 mg/mL siRNK rastvora u vodi koja ne sadrži RNasee i temeljno promeša. Mešavina se zatim razblaži sa 5% rastvorom glukoze sa 1.750 mL za svaki mL EV koja se koristi. Mešavina se meša na oko 200 rpm na sobnoj temperaturi 10 minuta. Koristeći polupropusnu membranu sa ∼100000 MWCO u sistemu ultrafiltracije ukrštnog protoka upotrebom adekvatno odabrane peristatičke pumpe (npr. Midgee Hoop, UFP-100-H24LA), mešavina se koncentruje do oko 1/3 originalne zapremine (ili željene zapremine) a zatim se diafiltrira naspram zapremine veće 5 puta od zapremine uzorka upotrebom vodenog rastvora koji sadrži 3% saharoze i 2.9% glukoze. Proizvod se zatim filtrira kroz kombinovani filter veličine pora 0.8/0.2 mikrona u aseptičnim uslovima pre upotrebe.
[0369] Formiranje lipozoma koji ne sadrži diVA siRNK. Katjonski lipid, DOPE, holesterol, i PEG konjugovani lipidi (npr., Peg-Lipid) se rastvore u apsolutnom etanolu (200 dokazan) u molarnom odnosu od 50:10:38:2. SiRNK se rastvori u 50 mM puferu citrata, i temperatura se podesi na 35-40° C. Mešavina etanol/lipid se zatim dodaje puferu koji sadrži siRNK pri čemu se meša da bi se spontano formirao lipozom napunjen siRNK. Lipidi se kombinuju sa siRNK da bi se postigao konačni odnos lipida i siRNK od 15:1 (maseni procenat) Opseg može biti 5:1 do 15:1, poželjno 7:1 do 15:1. Lipozom napunjen sa SiRNK se diafiltrira naspram 10X zapremina PBS-a (pH 7.2) kako bi se uklonio etanol i razmenio pufer. Krajnji proizvod se filtrira kroz 0.22 µm, sterilišući stupanj, PES filter za smanjenje biološkog tereta. Ovaj proces daje lipozome sa srednjim prečnikom čestice od 50-100 nm, PDI <0.2, >85% efikasnosti hvatanja.
[0370] Formiranje lipozoma koji sadrže siRNK zaednički rastvorenu sa diVA. siRNK-diVA-formulacije lipozoma se pripremaju upotrebom gore opisane metode. diVA-PEG-diVA se zajednički rastvara u apsolutnom etanolu sa drugim lipidima (katjonski lipid, DOPE, holesterol, i PEG-konjugovani lipide u odnosu od 50:10:38:2) pre dodavanja puferu koji sadrži siRNK. Opseg molarnog sadržaja diVA-PEG-diVA je od 0.1 do 5 molarnog odnosa. Ovaj proces daje lipozom sa srednjim prečnikom čestice od 50-100 nm, PDI <0.2, >85% efikasnosti hvatanja.
[0371] Formiranje lipozoma koji sadrži siRNK sa katjonskim lipidima.siRNK-diVA-Formulacije lipozoma i siRNK-formulacije lipozoma se pripremaju upotrebom gore opisane metode. Katjonski lipid može biti, na primer, DODC, HEDC, HEDODC, DC-6-14, ili bilo koja kombinacija ovih katjonskih lipida.
[0372] Formiranje lipozoma koji sadrži siRNK dekorisanog sa diVA. siRNK-formulacije lipozoma se pripremaju upotrebom gore opisane metode i razblaže se do koncentracija siRNK od 0.5 mg/mL u PBS. Katjonski lipid može biti DODC, HEDC, HEDODC, DC-6-14, ili bilo koja kombinacija ovih katjonskih lipida. diVA-PEG-diVA se rastvori u apsolutnom etanolu (200 dokazan) do konačne koncentracije koja je u opsegu od 10 do 50 mg/mL. Odgovarajuća količina rastvora etanola se dodaje rastvoru siRNK-lipozoma kako bi se dobio krajnji molarni procenat između 2 i 10 mol%. Rastvor se uranja više puta gore-dole sa pipetom kako bi se izmešao. Koncentracija diVA-PEG-diVA i dodavanje zapremine etanola se podese da održavaju zapreminu dodavanja >1.0 µL i krajnju koncentraciju etanola < 3% (vol/vol). Dekorisani lipozomi se zatim blago promućkaju na sobnoj temperaturi 1 sat na orbitalnoj mešalici pre in vitro ili in vivo procene.
Rezultati
[0373] Na Fig.8 je prikazano da dodavanje VA-konjugata lipozomu putem dekorisanja poboljšava efikasnost nokdauna siRNK, pojačavajući siRNK aktivnost. Peg-Lipid. Doza svih uzoraka je 867 nM siRNK HSP47-C. Rezultati pokazuju da u svakom primeru gde se VA-konjugat dodaje lipozomima, siRNK aktivnost se pojačava u poređenju sa lipozomom bez retinoida i u poređenju sa lipozomom dekorisanim sa slobodnim (nekonjugovanim) retinolom. RNKiMAKS predstavlja komercijalni reagens transfekcije.
[0374] Na Fig.9 je prikazano da dodavanje VA-konjugata lipozomima putem zajedničkog rastvaranja poboljšava efikasnost nokdauna siRNK. Ovi su lipozomi koji sadrže DOC sa VA-konjugatima koji se dodaju putem zajedničkog rastvaranja. Formulacija je 50:10:38:2:X, gde je X = 1 do 10 (DODC:DOPE:holesterol:PEG-Lipid:VA-konjugat, molarni odnos). Koncentracija je u svakom primeru 100 nM siRNK HSP47-C. Rezultati pokazuju da dodavanje VA-konjugata lipozomima putem zajedničkog rastvaranja pojačava aktivnost siRNK.
[0375] Na Fig.10 je pokazano da dodavanje VA-konjugata lipozomima putem zajedničkog rastvaranja dramatično poboljšava efikasnost nokdauna siRNK. Rezultati izazivaju tri različita lipozoma, DC-6-14, DODC, HEDODC sa VA-konjugatima koji se dodaju putem zajedničkog rastvaranja. Formulacija je ista za sve, 50:10:38:2, katjonski lipid:DOPE:holesterol:Peg-Lipid, pri čemu samo katjonski lipid varira. Koncentracija siRNK od 200 nM siRNK HSP47-C je ista za sve. Rezultati pokazuju da dodavanje VA-konjugata lipozomima sa različitim katjonskim lipidima značajno pojačava siRNK aktivnost, kada se pripremi putem zajedničkog rastvaranja.
[0376] Na Fig.11 je prikazano da dodavanje VA-konjugata lipopleksesima koji ima DC-6-14 katjonski lipid putem zajedničkog rastvaranja, i obmotavanje spoljašnosti sa siRNK pojačava aktivnost siRNK. Formulacija je 40% lipopleks formulacije, 40:30:30, DC-6-14:DOPE:holesterol. Koncentracija svih uzoraka iznosi 867 nM siRNK HSP47-C. Rezultati pokazuju da dodavanje VA-konjugata lipopleksima putem zajedničkog rastvaranja pojačava aktivnost siRNK.
[0377] Na Fig.12 je pokazano da dodavanje VA-konjugata lipopleksima formiranim putem zajedničkog rastvaranja u poređenju sa lipopleksima sa VA-konjugatom dodatim putem dekorisanja. Ovi rezultai su od DC-6-14 i DODC lipopleksa. Formulacija se sastoji od 40:30:30, DC-6-14:DOPE:holesterol. Koncentracija u svakom uzorku je 867 nM siRNK HSP47-C. Dodavanje VA-konjugata putem zajedničkog rastvaranja značajno poboljšava efikasnost nokdauna in vitro, u odnosu na VA-konjugate koji se dodaju putem dekorisanja.
Primer 41: In vivo eksperimenti
[0378] Korišćene su ženke miševa C57Bl/6 od penzionisanog uzgajivača miševa (Charles River) sa masenim opsegom od 24-30 gram. Životinje su nasumično podeljene prema težini u 10 grupa, od kojih svaka grupa broji 10 životinja. Sve postupke sa životinjama je odobrio Bio-Quant's IACUC i/ili Prisutni veterinar ukoliko je potrebno i sva pitanja vezana za dobrobit životinja su obrađena i dokumentovana. Miševima se daje anestezija sa Izofluranom i uzima im se krv putem donje šuplje vene.
[0379] Miš sa HSP47-C dvostrukim lancem siRNK koji se koristi u formulacijama za in vivo ogled (miš CCl4 model)
Sens (5'->3') GGACAGGCCUGUACAACUATT (SEQ. ID NO.3)
Antisens (3'->5') TTCCUGUCCGGACAUGUUGAU (SEQ. ID NO.4)
[0380] Ushodna regulacija proteina toplotnog šoka 47 (HSP47) je izazvana putem intraperitonealne injekcije CCl4(CCl4u maslinovom ulju, 1:7 (vol/vol), 1 µL po gramu telesne mase) koji se daje svakog drugog dana u periodu od 7 dana (0., 2., 4., 6., dana). Trećeg dana miševi su bili tretirani 4 uzastopna dana (3., 4., 5., 6. dana) sa lipozomom ili formulacijama lipopleksa ovog pronalaska ili PBS injekcijom u venu repa. Jedna grupa od deset miševa (naivni) nije primala ni tretman CClCCl4ni IV injekciju i služila je kao kontrolna grupa za normalnu ekspresiju HSP47 gena.
Vremenski okvir eksperimenta
[0381] Sedmog dana i približno 24 sata nakon poslednje IV injekcije, svi preostali miševi su žrtvovani i jetre su bile stavljene na PBS infuziju pre sakupljanja uzoraka jetre za PCR analizu. Približno 150 mg uzorka od jetre svakog miša se uzima i stavlja 1.5 mL reagensa za stabilizaciju RNKlater (Qiagen) i čuva se na temperaturi 2-8° C do analize. Uzorci jetre se ne uzimaju iz delova jasnog i označenog oštećenja jetre i/ili nekroze.
[0382] Ukupna RNK iz jetri miševa se ekstrahuje korišćenjem RNeasy® kolona (Qiagen) u skladu sa protokolom proizvođača.20 ng ukupne RNK se koristi za kvantitativnu RT-PCR za merenje ekspresije HSP47. HSP47 i GAPDH TaqMan® ogledi i glavna mešavina RT-PCR od jedne faze se nabavljaju od Applied Biosystems. Svaka PCR reakcija sadrži sledeću kompoziciju: mešavina RT-PCR od jedne faze 5 µl, TaqMan® RT mešavina enzima 0.25 µl, TaqMan® test za ogled ekspresije gena (HSP47) 0.25 µl, TaqMan® test za ogled ekspresije gena (GAPDH) 0.5 µl, voda koja ne sadrži RNase 3.25 µl, RNK 0.75 µl, ukupna zapremina od 10 µl. GAPDH se koristi kao endogena kontrola za relativnu kvantifikaciju HSP47 mRNK nivoa. Kvantitativna RT-PCR se izvodi u ViiA™ 7 realtime PCR sistemu (Applied Biosciences) koristeći ugradnu metodu relativne kvantifikacije. Sve vrednosti su normalizovane do prosečne ekspresije HSP47 grupe naivnih životinja i izražene su kao procenat ekspresije HSP47 u poređenju sa grupom naivnih.
Primer 42: IN VITRO EFIKASNOST VITAMINA RASTVORLJIVOG U MASTI KOJI CILJA KONJUGAT HEDC:S104:DOPE:Chol:PEG-DMPE:DiVA
[0383] Ispituju se formulacije lipozoma sa 50 nM siRNK. Lipozomi su ili: HEDC:S104:DOPE:Chol:PEG-DMPE:DiVA (+DiVA) ili kontrole kojima nedostaju polovine vitamina A (-DiVA) i inkubirane su 30 minuta u pločama kultura sa 96 bunara koje sadrže stelatne ćelije jetre pacova. Nakon 30 minuta, podloga se zameni svežom podlogom za rast. Četrdeset osam sati kasnije, ćelije podležu lizi i nivoi gp46 i GAPDH mRNK izmereni ogledom sa kvantitativnom RT-PCR (TaqMan®®), i nivoi gp46 se normalizuju do GAPDH nivoa.
[0384] In vitro efikasnost (pHSC), pri čemu je efekat 2% DiVA siRNK bio efikasan sa 2 % diVA i imao je EC50od 14 nM. PHSCs u ploči sa 96 bunara su inkubirani sa formulacijom kojoj nedostaju polovine vitamina A za ciljanje (-DiVA), ili sa formulacijom koja uključuje polovine vitamin A (+DiVA) na 50 nM siRNK. Nakon 30 minuta, podloga se zameni svežom podlogom za rast. Četrdeset osam sati kasnije, ćelije podležu lizi i mere se nivoi gp46 i GAPDH mRNK ogledom sa kvantitativnom RT-PCR (TaqMan®), a nivoi gp46 se normalizuju do GAPDH nivoa. Normalizovani nivoi gp46 su izraženi kao procenat lažnih kontrolnih ćelija. Stupci greške pokazuju standardne devijacije (n=3). Srednja vrednost gp46 nivoa nakon tretmana koji sadrži DiVA je značajno drugačija od lažnog kontrolnog tretmana (P < 0.001) na osnovu jednostranog t-ispitivanja.
POREĐENJE DiVA I satDiVA
[0385] Formulacije lipozoma su transfektovane u pacov pHSCs 30 minuta u ploči sa 96 bunara. Nakon 48 sati, ćelije se obrađuju korišćenjem Cells-to-Ct® reagenasa lize (Applied Biosystems) a nivoi HSP47 mRNK se kvantifikuju qRT-PCR-om. Ekspresija HSP47 predstavlja normalizovanu lažnu kontrolu. EC50se određuje merenjem nokdauna (KD) HSP47 na šest polovina doza siRNK i uklapanjem podataka u "Klasičnu sigmoidnu funkciju odgovora na dozu“ u Graphpad Prism® 5.04.
1
[0386] Rezultati pokazuju da i DiVA i Sat DiVA povećavaju KD efikasnost (tabela ispod i takođe Fig 15). EC50je 12 nM za DiVA i EC50je 14 nM za Sat DiVA.
Retinoidni konjugat vs non-retinoidni konjugat
[0387] Za retinoidne konjugate je zaključeno da su konzistentno potentniji in vitro u poređenju sa nereti2noidnim ekvivalentima (videti 4TTNBB i 4Myr nasuprot ekvivalenata satDiVA i DiVA retinoidnog konjugata
Primer 43: IN VIVO EFIKASNOST VITAMINA RASTVORLJIVOG U MASTI KOJI CILJA KONJUGAT HEDC:S104:DOPE:Chol:PEG-DMPE:DiVA
[0388] In vivo aktivnost ciljne formulacije je procenjena u modelu kratkoročnog oštećenja jetre (označenom kao Brzi model, DMNQ). U ovom modelu, kratkoročno oštećenje jetre je izazvano tretmanom hepatoksičnim agensom kao što je dimetilnitrosamin (DMN), i praćeno je procenom nivoa gp46 mRNK. Da bi se izazvale ove promene, mužjacima pacova Sprague-Dawley se intrapertionealno ubrizgava DMN 6
1 1
uzastopnih dana . Na kraju perioda lečenja DMN-om, životinje su nasumično grupisane na osnovu individualne telesne mase životinje. Formulacije se primenjuju u vidu jedne IV doze, i daju se jedan sat nakon poslednje injekcije DMN. Dvadeset četiri sata kasnije, režnjevi jetre se iseku i nivoi i gp46 i MRPL19 mRNK se određuju ogledom sa kvantitativnom RT-PCR (TaqMan®®). Nivoi mRNK za gp46 se normalizuju do nivoa MRPL19.
[0389] Rezultati (Fig.16) pokazuju korelaciju između količine retinoidnog konjugata a efikasnost je očigledna. Samo 0.25 mol% je potrebno da bi se video značajan efekat kod DMNQ modela pacova. Sa 2 mol % DiVA primećuje se robusni nokdaun ekspresije gp46. Na Fig 16 su prikazani mužjaci Sprague-Dawley pacova koji su tretirani sa DMN-om na 10 mg/kg, 1., 2., 3. dana i sa 5 mg/kg 4., 5., 6. dana intraperitonealno kako bi se izazvalo oštećenje jetre. Životinjama (n = 8/grupa) se intravenski daje ili formulacija koja sadrži 0, 0.25, 0.5, 1, i 2% DiVA u dozi od 0.75 mg/kg siRNK, ili PBS (nosač), jedan sat nakon poslednje injekcije DMN. Dvadeset četiri sata kasnije, ukupna siRNK se prečišćava iz dela desnog režnja jetre od svake životinje i čuva se na temperaturi 4° C do izolovanja RNK. Kontrolne grupe izazivaju grupu PBS nosača (tretiranih DMN-om) i grupu naivnih (netretiranih; bez DMN). Nakon oduzimanja pozadine nivoa gp46 mRNK određenih iz grupe naivnih, sve vrednosti ispitivane grupe su normalizovane do prosečnog gp46 mRNK grupe nosača (izraženo kao procenat grupe nosača).
[0390] Mužjaci pacova Sprague Dawley (130-160 g) su tretirani sa DMN-om intraperitonealno kako bi se izazvala fibroza jetre. Režim tretmana DMN-om je bio 3 puta svake nedelje(poned., sred., i pet.) sa 10 mg/kg (tj., 5.0 mg/mL DMN u dozi od 2.0 mL/kg telesne mase) za prve 3 nedelje i pola doze od 5 mg/kg (tj., 5 mg/mL DMN u dozi od 1.0 mL/kg) od 22. do 57. dana. Životinjama iz lažne grupe se ubrizgava PBS (rastvarač za DMN) koristeći isti raspored.22. dana, 24 sata nakon poslednjeg tretmana DMN-om, uzimaju se uzorci krvi i ispituju se na biomarkere bolesti jetre kako bi se potvrdila efektivnost tretmana DMN-om. Životinje koje su tretirane DMN-om su dodeljene različitim grupama na osnovu telesne mase i obezbeđuju da se srednje vrednosti telesnih masa i opseg telesnih masa životinja u svakoj grupi značajno ne razlikuju. Životinje iz grupe za predtretman se žrtvuju 25. dana kako bi se odredila faza napretka bolesti pre početka tretmana. Tretmani sa formulacijama koje sadrže gp46 siRNK su započeti 25. dana sa 2 tretmana/nedeljno u specifičnoj dozi siRNK za ukupno 10 puta.59. dana, 48 sati nakon poslednjeg tretmana sa formulacijom i 72 sata nakon poslednjeg tretmana sa DMN-om, životinje se žrtvuju udisanjem CO2. Režnjevi jetre se iseku i nivoi gp46 i MRPL19 mRNK se određuju kvantitativnim RT-PCR (TaqMan®) ogledom. Nivoi mRNK za gp46 se normalizuju do nivoa MRPL19.
[0391] Stručnjaku je odmah jasno da se razne supstitucije i modifikacije mogu uraditi na opisu datom u ovom dokumentu. Stoga, takvi dodatni primeri izvođenja ovog pronalaska su u domenu ovog opisa i zahteva koji slede. Ovaj opis podučava stručnjaka da ispita razne kombinacije i/ili supstitucije hemijskih modifikacija opisanih u ovom tekstu prema generisanju konstrukata nukleinske kiseline poboljšane
1 2
aktivnosti za posredovanje u RNKi aktivnosti. Takva poboljšana aktivnost može da obuhvati poboljšanu stabilnost, poboljšanu bioraspoloživost, i/ili poboljšanu aktivaciju celularnih odgovora koji posreduju u RNKi. Stoga, specifični primeri izvođenja ovog pronalaska opisani u ovom tekstu nisu ograničeni, i jedan stručnjak može odmah da shvati, da se specifične kombinacije modifikacija opisane u ovom tekstu mogu ispitati bez nepravovremenih eksperimentisanja u smeru identifikovanja molekula nukleinske kiseline poboljšane RNKi aktivnosti.
[0392] Opisi koji su ilustrativno predstavljeni u ovom tekstu se mogu prikladno primeniti u praksi u odsustvu bilo kog elementa ili elemenata, ograničenja ili više ograničenja, koja nisu specifično opisana u ovom tekstu. Tako, na primer, izraze "a" i "an" i "the" i slične odrednice u kontekstu opisivanja opisa (naročito u kontekstu zahteva koji slede), bi trebalo tumačiti tako da se oni odnose i na imenice u jednini kao i u množini, ukoliko nije drugačije naznačeno u ovom tekstu ili ukoliko to očigledno nije kontraindikovano kontekstom. Izraz "obuhvata", "ima," "uključuje,"sadrži", itd. bi trebalo tumačiti tako da imaju široko značenje bez ograničenja (npr., značenje "uključujući ali bez ograničenja,"). Navođenje opsega vrednosti u ovom tekstu ima za cilj da služi kao skraćena metoda označavanja svake pojedinačne vrednosti navedene u ovom tekstu u okviru datog opsega, ukoliko nije drugačije naznačeno u ovom tekstu, i svaka ta pojedinačna vrednost predstavlja deo ovih specifikacija kao da je pojedinačno navedena u ovom tekstu. Sve metode opisane u ovom tekstu se mogu izvoditi po bilo kakvom prikladnom redosledu ukoliko nije drugačije naznačeno u ovom tekstu ili ukoliko nije drugačije jasno kontraindikovano kontekstom. Upotreba bilo kog i svih primera, ili jezik u kontekstu primera (npr., "kao što je") u ovom tekstu, ima za cilj da bolje razjasni opis i ne predstavlja ograničenje područja primene ovog opisa ukoliko se ne zahteva drugačije. Nijedan jezik u ovoj specifikaciji ne bi trebalo tumačiti kao ukazivanje na ne-zahtevani element koji je suštinski za praksu ovog opisa. Pored toga, pojmovi i izrazi koji se koriste u ovom tekstu se koriste kao pojmovi u svrhu opisa i nisu ograničeni, i ne postoji namera da se prilikom korišćenja takvih pojmova i izraza isključe bilo koji ekvivalenti prikazanih karakteristika ili njihovih delova, ali se primećuje da su razne modifikacije moguće u području primene ovog opisa. Stoga bi trebalo imati na umu da iako je ovaj opis specifično ilustrovan poželjnim primerima izvođenja ovog pronalaska i opcionim karakteristikama, modifikacija i varijacija ovih opisa primera izvođenja opisanih ovde ili tamo kojima pribegavaju stručnjaci, i takve modifikacije i varijacije se smatraju da su području ovog opisa.
[0393] Opis u ovom tekstu je opširan i generički. Svaka od užih vrsta i podgeneričkih grupa koje potpadaju pod generički opis takođe formiraju deo ovog opisa. Ovo uključuje generički segment ovog opisa sa odredbom ili negativnim ograničenjem kojim se uklanja bilo koji predmet iz roda, nevezano od toga da li je ili ne isečeni materijal specifično naveden u ovom tekstu. Drugi primeri izvođenja ovog pronalaska su dati u okviru narednih zahteva. Pored toga, tamo gde su karakteristike ili aspekti ovog opisa opisani u smislu
1
Markush grupa, stručnjaci će prepoznati da je i opis samim tim dat u smislu pojedinačnog člana ili podgrupe članova Markush grupe.
1 4
1
1
1

Claims (13)

  1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje za olakšavanje isporuke leka do ciljne ćelije, koje obuhvata strukturu (retinoid)m-veznik-(retinoid)n; pri čemu je retinoid odabran iz grupe koju čine vitamin A, retinoinska kiselina, tretinoin, adapalen, 4-hidroksi(fenil)retinamid (4-HPR), retinil palmitat, retinalna, zasićena retinoinska kiselina, i zasićena, demetilisana retinoinska kiselina; pri čemu m i n odvojeno predstavljaju 2 ili 3; i pri čemu je veznik odabran iz grupe koju čine bis-amido-PEG, tris-amido-PEG, tetra-amido-PEG, Lys-bis-amido-PEG-Lys, Lystris-amido-PEG-Lys, Lys-tetra-amido-PEG-Lys, Lys-PEG-Lys, PEG2000, PEG1250, PEG1000, PEG750, PEG550, i PEG-Glu.
  2. 2. Jedinjenje prema zahtevu 1, odabrano iz grupe koju čine (retinoid)2-PEG-(retinoid)2, (retinoid)2-bisamido-PEG-(retinoid)2, i (retinoid)2-Lys-bis-amido-PEG-Lys-(retinoid)2.
  3. 3. Jedinjenje prema zahtevu 2, pri čemu to jedinjenje ima formulu
    u kojoj q, r, i s svako posebno predstavljaju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10.
  4. 4. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je to jedinjenje odabrano od bilo koje od struktura prikazanih dole ispod:
  5. 5. Kompozicija koja obuhvata jedinjenje prema zahtevu 1-4.
  6. 6. Kompozicija prema zahtevu 5, dalje obuhvata lipozomalnu kompoziciju.
  7. 7. Kompozicija prema zahtevu 6, pri čemu lipozomalna kompozicija obuhvata lipidnu vezikulu, koja obuhvata dvosloj molekula lipida.
  8. 8. Kompozicija prema zahtevu 7, pri čemu molekuli lipida obuhvataju jedan ili više lipida odabranih iz grupe koju čine
    1
    i DC-6-14.
  9. 9. Kompozicija prema zahtevu 8, pri čemu molekuli lipida dalje obuhvataju
    S104.
  10. 10. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 5-9, dalje obuhvata nukleinsku kiselinu.
  11. 11. Farmaceutska formulacija koja uključuje jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 4 ili kompoziciju prema zahtevu 5, farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač i najmanje jedan terapeutski agens.
  12. 12. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 11, pri čemu je taj terapeutski agens siRNK. 11
  13. 13. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 12, pri čemu siRNK ima sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, i SEQ ID NO: 4.
RSP20191142 2011-06-08 2012-06-08 Jedinjenja za ciljanje isporuke leka i pojačavanje sirnk aktivnosti RS59380B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161494710P 2011-06-08 2011-06-08
US201161494840P 2011-06-08 2011-06-08
EP15181729.3A EP2998289B1 (en) 2011-06-08 2012-06-08 Compounds for targeting drug delivery and enhancing sirna activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59380B1 true RS59380B1 (sr) 2019-11-29

Family

ID=46317540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191142 RS59380B1 (sr) 2011-06-08 2012-06-08 Jedinjenja za ciljanje isporuke leka i pojačavanje sirnk aktivnosti

Country Status (20)

Country Link
EP (2) EP2718261B1 (sr)
JP (3) JP5873553B2 (sr)
KR (3) KR102038300B1 (sr)
CN (3) CN107043334B (sr)
AU (2) AU2012267467B8 (sr)
CA (2) CA2837101C (sr)
CY (2) CY1117433T1 (sr)
DK (2) DK2718261T3 (sr)
ES (2) ES2743540T3 (sr)
HR (1) HRP20191463T8 (sr)
HU (1) HUE045821T2 (sr)
LT (1) LT2998289T (sr)
PL (2) PL2998289T3 (sr)
PT (1) PT2998289T (sr)
RS (1) RS59380B1 (sr)
RU (2) RU2632888C2 (sr)
SI (1) SI2998289T1 (sr)
SM (1) SMT201900523T1 (sr)
TW (2) TWI569814B (sr)
WO (1) WO2012170952A2 (sr)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2802414C (en) * 2010-06-17 2018-01-09 Nitto Denko Corporation Agent for treating renal fibrosis
US9011903B2 (en) 2011-06-08 2015-04-21 Nitto Denko Corporation Cationic lipids for therapeutic agent delivery formulations
CA2853685C (en) * 2011-11-04 2019-09-03 Nitto Denko Corporation Single use system for sterilely producing lipid-nucleic acid particles
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
SI2858974T1 (sl) 2012-06-08 2019-01-31 Nitto Denko Corporation Lipidi za formulacije za dostavo terapevtskega sredstva
JP6340162B2 (ja) 2012-12-20 2018-06-06 日東電工株式会社 アポトーシス誘導剤
JP6076076B2 (ja) 2012-12-21 2017-02-08 日東電工株式会社 組織再生促進剤
US9593077B2 (en) 2013-11-18 2017-03-14 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
US9365610B2 (en) 2013-11-18 2016-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. Asymmetric ionizable cationic lipid for RNA delivery
CA2944417A1 (en) 2014-04-02 2015-10-08 Nitto Denko Corporation A targeting molecule and a use thereof
JP6727765B2 (ja) 2014-06-17 2020-07-22 日東電工株式会社 アポトーシス誘導剤
EP2966068A1 (en) * 2014-07-08 2016-01-13 Incella GmbH Synthesis and use of amino lipids
CN104174034A (zh) * 2014-08-20 2014-12-03 南京大学 肝星状细胞靶向的基因药物输送载体及其制备方法和应用
AU2015337909B2 (en) * 2014-10-30 2018-12-13 Delta-Fly Pharma, Inc. New production method of lipoplex for local administration and antitumor drug using lipoplex
KR102380363B1 (ko) * 2014-11-18 2022-03-29 아크투루스 쎄라퓨틱스, 인크. Rna 전달을 위한 이온성 양이온 지질
US10264976B2 (en) 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
US11045488B2 (en) 2014-12-26 2021-06-29 Nitto Denko Corporation RNA interference agents for GST-π gene modulation
EP3313449B1 (en) 2015-06-24 2020-09-23 Nitto Denko Corporation Ionizable compounds and compositions and uses thereof
EP3349802B1 (en) 2015-09-14 2021-08-04 The Board of Regents of the University of Texas System Lipocationic dendrimers and uses thereof
CN105194689A (zh) * 2015-10-10 2015-12-30 湖南中楚博生物科技有限公司 一种基于siRNA的双偶联复合物
CN109414451B (zh) * 2016-05-16 2022-08-12 德克萨斯大学系统董事会 用于作为纳米粒递送tRNA的组合物及其使用方法
CA3024129A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Cationic sulfonamide amino lipids and amphiphilic zwitterionic amino lipids
JP6833456B2 (ja) 2016-11-02 2021-02-24 日東電工株式会社 皮膚線維症処置剤
US10383952B2 (en) 2016-12-21 2019-08-20 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
US10526284B2 (en) 2016-12-21 2020-01-07 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
US11148998B2 (en) 2017-05-23 2021-10-19 The Regents Of The University Of Michigan Dimethyl-nonatetraenyl-trimethyl-cyclohexyl compounds and uses thereof
US11786607B2 (en) 2017-06-15 2023-10-17 Modernatx, Inc. RNA formulations
EP3662913A4 (en) 2017-08-04 2021-06-30 Kyowa Kirin Co., Ltd. Nucleic-acid-containing lipid nanoparticles
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
US11298371B2 (en) 2017-10-11 2022-04-12 Nitto Denko Corporation Regulation of nucleic acid molecule expression
AU2018359904B2 (en) 2017-11-06 2023-02-23 Nitto Denko Corporation Fusogenic compounds for delivery of biologically active molecules
CN112437674A (zh) * 2018-04-11 2021-03-02 新墨西哥科技大学研究园公司 用于药物递送的脂质前药
PL3805198T3 (pl) 2018-06-08 2024-02-12 Fujifilm Corporation Związek, jego sól i cząstki lipidowe
US12357580B2 (en) 2018-06-19 2025-07-15 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Lipid nanoparticle compositions for delivery of mRNA and long nucleic acids
JP7453145B2 (ja) * 2018-08-22 2024-03-19 日東電工株式会社 Ｈｓｐ４７の阻害物質を用いた、化学療法剤感受性の増強
WO2020051220A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 The Board of the Regents of the University of Texas System Compositions and methods for organ specific delivery of nucleic acids
CN112996519B (zh) 2018-09-04 2025-02-28 德克萨斯大学系统董事会 用于核酸的器官特异性递送的组合物和方法
CN113271926A (zh) 2018-09-20 2021-08-17 摩登纳特斯有限公司 脂质纳米颗粒的制备及其施用方法
CN110124049B (zh) * 2019-04-29 2023-09-22 大连医科大学 聚乙二醇化芬维a胺前体药物及其用途
WO2020246581A1 (ja) 2019-06-07 2020-12-10 富士フイルム株式会社 脂質組成物
KR102228271B1 (ko) 2019-07-16 2021-03-17 한국과학기술연구원 항암활성을 갖는 면역조절 단백질-siRNA 복합체
CN111248152A (zh) * 2020-03-17 2020-06-09 上海市中医医院 一种肝硬化腹水动物模型及其构建方法
MX2022013081A (es) * 2020-04-23 2022-11-10 Purdue Research Foundation Compuestos para el tratamiento de sars.
KR102361479B1 (ko) * 2020-06-18 2022-02-11 고려대학교 산학협력단 ｓｉＲＮＡ의 생성 및 기능 증진 활성을 갖는 ＣＭＴＲ１의 신규용도
IL299271A (en) 2020-06-24 2023-02-01 Bristol Myers Squibb Co A process for the synthesis of cationic lipids
MX2022016519A (es) * 2020-06-24 2023-01-30 Bristol Myers Squibb Co Proceso para la sintetizacion de lipidos.
IL299197A (en) * 2020-06-24 2023-02-01 Bristol Myers Squibb Co A process for the synthesis of targeting molecules
KR20230167008A (ko) * 2020-08-06 2023-12-07 모더나티엑스, 인크. 지질 나노입자의 제조 방법
WO2022034946A1 (ko) 2020-08-14 2022-02-17 한국과학기술연구원 항암활성을 갖는 면역조절 단백질-siRNA 복합체
CN114391008B (zh) * 2020-08-20 2024-05-03 苏州艾博生物科技有限公司 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
CN114306278A (zh) * 2021-12-30 2022-04-12 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种EV装载CPP-siRNA纳米颗粒的制备方法及其产品和应用
CN114805113B (zh) * 2022-01-22 2023-09-15 苏州天澜生物材料科技有限公司 一种安全高效的可降解脂质纳米颗粒及其制备方法和应用
CN114522244B (zh) * 2022-01-28 2023-09-01 浙江大学医学院附属第四医院 视黄酸修饰的lytac分子及其制备方法和应用
US20250197865A1 (en) 2022-03-03 2025-06-19 Kyushu University, National University Corporation Pharmaceutical composition for treatment or prevention of fibrotic disease
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024160826A1 (en) * 2023-01-31 2024-08-08 BioNTech SE Compositions and methods
EP4480943A1 (en) * 2023-06-22 2024-12-25 Oz Biosciences New class of lipids for delivering active ingredients into cells
WO2025006799A1 (en) 2023-06-27 2025-01-02 Capstan Therapeutics, Inc. Extracorporeal and ex vivo engineering of select cell populations from peripheral blood
CN117185942B (zh) * 2023-07-04 2025-09-12 清华大学 一种可用于靶向肺部递送广谱中和抗体的脂质纳米颗粒及其制备方法与应用
WO2025261607A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 BioNTech SE Particles, compositions and methods
WO2026013203A1 (en) * 2024-07-12 2026-01-15 Dsm Ip Assets B.V. Improved lipid nanoparticles

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4501729A (en) 1982-12-13 1985-02-26 Research Corporation Aerosolized amiloride treatment of retained pulmonary secretions
JPS6189286A (ja) * 1984-10-08 1986-05-07 Tokuyama Soda Co Ltd 液晶組成物
JPS61136584A (ja) * 1984-12-07 1986-06-24 Tokuyama Soda Co Ltd 液晶組成物
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US6582728B1 (en) 1992-07-08 2003-06-24 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Spray drying of macromolecules to produce inhaleable dry powders
US6235886B1 (en) 1993-09-03 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of synthesis and use
JP3029354B2 (ja) * 1992-12-22 2000-04-04 三菱電機株式会社 ディジタルビデオ信号符号化装置および復号化装置
AU679566B2 (en) 1993-09-03 1997-07-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
FR2714382B1 (fr) * 1993-12-27 1996-02-02 Roussel Uclaf Phospholipides vecteur de molécule active, leur préparation et leur utilisation dans des compositions cosmétiques ou dermatologiques.
US6051256A (en) 1994-03-07 2000-04-18 Inhale Therapeutic Systems Dispersible macromolecule compositions and methods for their preparation and use
CA2187626C (en) 1994-04-13 2009-11-03 Michael G. Kaplitt Aav-mediated delivery of dna to cells of the nervous system
US5650386A (en) * 1995-03-31 1997-07-22 Emisphere Technologies, Inc. Compositions for oral delivery of active agents
DE19640092A1 (de) * 1996-09-28 1998-04-16 Beiersdorf Ag Strukturen mit Lipid-Doppelmembranen, in deren lipophilen Bereich längerkettige Moleküle eintauchen oder durch hydrophobe Wechselwirkungen an solche Moleküle angedockt sind
DE19641672A1 (de) * 1996-10-10 1998-04-16 Beiersdorf Ag Kosmetische oder dermatologische Zubereitungen auf der Basis von ethylenoxidfreien und propylenoxidfreien Emulgatoren zur Herstellung von Mikroemulsionsgelen
US6565885B1 (en) 1997-09-29 2003-05-20 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Methods of spray drying pharmaceutical compositions
US6586524B2 (en) 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
KR20050042013A (ko) * 2001-10-30 2005-05-04 넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션 레티노산의 수용성 중합체 콘쥬게이트
AUPR894201A0 (en) 2001-11-19 2001-12-13 Women's And Children's Hospital Respiratory delivery for gene therapy and lentiviral delivery particle
US20050106731A1 (en) 2002-08-05 2005-05-19 Davidson Beverly L. siRNA-mediated gene silencing with viral vectors
WO2004089311A2 (en) * 2003-03-31 2004-10-21 Vectramed, Inc. Polymeric drug agents for the treatment of fibrotic disorders
JP2006254877A (ja) * 2005-03-18 2006-09-28 Fukuoka Prefecture 糖脂質を含んだキャリア及びそれを用いた遺伝子導入法
US9006487B2 (en) * 2005-06-15 2015-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
RU2009103003A (ru) * 2006-06-30 2010-08-10 Хоккайдо Систем Сайенс Ко., Лтд. (Jp) Композиция для трансфекции нуклеиновой кислоты
US20100215588A1 (en) 2007-04-26 2010-08-26 Rami Skaliter Therapeutic delivery of inhibitory nucleic acid molecules to the respiratory system
KR20100065190A (ko) * 2007-09-14 2010-06-15 닛토덴코 가부시키가이샤 약물 담체
WO2009059450A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Shanghai Jiaotong University Peptide ligand directed drug delivery
AU2008359989A1 (en) * 2008-07-30 2010-02-04 Nitto Denko Corporation Drug carriers
JP5744723B2 (ja) * 2008-09-12 2015-07-08 日東電工株式会社 線維性疾患のイメージング剤
KR101727333B1 (ko) * 2008-11-26 2017-04-14 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 베시클 제제
RU2546005C2 (ru) * 2009-09-15 2015-04-10 Кью Эл Ти ИНК. Фармацевтические составы, содержащие 9-цис-ретиниловые сложные эфиры в липидном наполнителе
TWI658830B (zh) * 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
JP6301742B2 (ja) * 2014-06-05 2018-03-28 ヨシモトポール株式会社 鋼管ポールおよびその設置方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012267467B2 (en) 2017-06-01
WO2012170952A9 (en) 2013-02-21
DK2998289T3 (da) 2019-09-16
CN107082747A (zh) 2017-08-22
AU2012267467B8 (en) 2017-06-15
CA3094645C (en) 2023-01-03
WO2012170952A3 (en) 2013-04-11
AU2012267467A8 (en) 2017-06-15
JP2018065804A (ja) 2018-04-26
EP2718261B1 (en) 2016-02-24
TWI712422B (zh) 2020-12-11
ES2743540T3 (es) 2020-02-19
JP6590888B2 (ja) 2019-10-16
TWI569814B (zh) 2017-02-11
SMT201900523T1 (it) 2019-11-13
PT2998289T (pt) 2019-09-19
KR20180134425A (ko) 2018-12-18
JP2014529328A (ja) 2014-11-06
CN107082747B (zh) 2020-11-20
KR20180134424A (ko) 2018-12-18
HRP20191463T8 (hr) 2020-02-21
CA2837101A1 (en) 2012-12-13
RU2017135548A3 (sr) 2021-01-14
EP2998289B1 (en) 2019-08-07
CN103857654A (zh) 2014-06-11
CA2837101C (en) 2020-12-15
HRP20191463T1 (hr) 2019-11-15
HUE045821T2 (hu) 2020-01-28
CA3094645A1 (en) 2012-12-13
JP2016153477A (ja) 2016-08-25
LT2998289T (lt) 2019-10-25
KR102038300B1 (ko) 2019-10-31
AU2017203075A1 (en) 2017-06-01
WO2012170952A4 (en) 2013-05-30
JP5873553B2 (ja) 2016-03-01
JP6232083B2 (ja) 2017-11-15
PL2998289T3 (pl) 2020-01-31
EP2998289A1 (en) 2016-03-23
PL2718261T3 (pl) 2016-08-31
RU2632888C2 (ru) 2017-10-11
DK2718261T3 (en) 2016-03-29
AU2012267467A1 (en) 2014-01-16
CY1117433T1 (el) 2017-04-26
ES2570184T3 (es) 2016-05-17
KR102029657B1 (ko) 2019-10-08
SI2998289T1 (sl) 2019-11-29
CY1123807T1 (el) 2021-10-29
TW201313256A (zh) 2013-04-01
RU2017135548A (ru) 2019-02-08
RU2013158456A (ru) 2015-07-20
KR20140033492A (ko) 2014-03-18
CN103857654B (zh) 2017-03-15
CN107043334A (zh) 2017-08-15
TW201711706A (zh) 2017-04-01
KR102029654B1 (ko) 2019-10-08
RU2769872C2 (ru) 2022-04-07
CN107043334B (zh) 2020-06-16
EP2718261A2 (en) 2014-04-16
WO2012170952A2 (en) 2012-12-13
AU2017203075B2 (en) 2019-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS59380B1 (sr) Jedinjenja za ciljanje isporuke leka i pojačavanje sirnk aktivnosti
US10669229B2 (en) Compounds for targeting drug delivery and enhancing siRNA activity