RS59426B1 - Ppar jedinjenja za upotrebu u tretmanu fibroznih bolesti - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu pan-PPAR agonista, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži pomenuti agonist, za tretiranje fibroznih bolesti.

Osnova pronalaska

[0002] Fibroza jetre je rezultat kompleksnog uzajmnog dejstva između različitih tipova ćelija. Karakteriše se regrutacijom inflamatornih ćelija kao odgovor na hroničnu povredu i aktivacijom zvezdastih ćelija jetre (HSCs), što dovodi do akumulacije ekstracelularnog matriksa. Steatoza uobičajeno koegzistira sa inflamacijom jetre i hepatocelularnom povredom. Povećani oksidativni stres je zajednički faktor u svim hroničnim bolestima jetre koje vode fibrozi, bez obzirana na njihovu etiologiju. Povređene hepatocite, HSCs, i infiltrirajuće inflamatorne ćelije su glavni izvori reaktivnih vrsta kiseonika (ROS). Zaista, oksidativni stres će indukovati regrutaciju inflamatornih ćelija i aktivaciju HSCs. Stoga, u kontekstu hronične povrede jetre, pojaviće se začarani krug oštećenja hepatocita, ROS proizvodnje, HSC aktivacije, i regrutacije inflamatornih ćelija, pojačavajući fibrinogeni odgovor na povredu.

[0003] Sredstva za efikasni tretman fibroznih bolesti jetre, kao što je bolest ne-alkoholne masne jetre (NAFLD) i nealkoholni steatohepatitis (NASH), su još uvek nedovoljna. Nije ustanovljen nijedan tretman za pacijenta sa NASH, i nekoliko terapeutskih opcija je testirano u kliničkim studijama (Vuppalanchi R and Chalasani N, Hepatology 2009, 49(1): 306-317; Dowman J.K et al., Q. J. Med. 2010, 103(2):71-83). Ove studije uključuju upotrebu mnogih različitih familija hemijskih jedinjenja (fibrati, tiazolidindioni, biguanidi, statini, kanabinoidi) i terapeutskih targeta (jedarni receptori, angiotenzin receptori, kanabinoidni receptori, HMG-CoA reduktaza). Nedavno, studije koje uključuju tiazolidindione (rosiglitazon i pioglitazon) su pokazale da ovi lekovi mogu popraviti stanje jetre ali tretman sa ovim lekovima nije bez neželjenih efekata kao što su viši rizici kongestivne srčane insuficijencije i osteoporoza, kao i povećanje težine sa psihološkim efektima na pacijenta (Dowman J.K et al., op. cit.; Shiri-Sverdlov R et al., J. Hepatol. 2006, 44: 732-41; Neuschwander-Tetri et al., Hepatology 2003, 38:1008-1017). Kliničke studije koje uključuju primenu kanabinoida razvile su zabrinutost neuropsihijatrijske disrupcije (Vuppalanchi R and Chalasani N, op. cit.). Druge terapije trenutno u toku procenjuju NASH lekove kao antioksidante ali nijedan od ovih tretmana još uvek nije pokazao ubedljive rezultate (Nelson A et al., J. Clin. Gastroenterol. 2009, 43: 990-994). Kandidati za tretman bolesti jetre su otkriveni u WO 2011/064350 i US 2013/108573. Međutim, još uvek postoji potreba za jedinjenjima koja su pogodna za tretman bolesti jetre, naročito jedinjenja koja mogu ciljano delovati na nekoliko komponenti fibroznog procesa kao što su steatoza, inflamacija i odlaganje kolagena i koja nemaju sporedne efekte uočene sa lekovima koji se trenutno procenjuju.

[0004] Hronična bolest bubrega (CKD), takođe poznata kao hronična renalna bolest, je progresivni gubitak renalne funkcije tokom perioda od meseci ili godina. CKD ima svoje opšte značenje u tehnici i koristi se za klasifikaciju brojnih stanja koja utiču na bubreg, destrukciju renalnog parenhima i gubitak funkcionalnih nefrona ili glomerula. Treba dodatno napomenuti da CKD može biti rezutlat različitih uzroka, ali finalni put ostaje renalna fibroza. Primeri etiologije CKD uključuju, ali nisu ograničeni na, kardiovaskularne bolesti, hipertenziju, dijabetes, glomerulonefritis, policistična bolest bubrega, i odbacivanje grafta bubrega. Renalna fibroza, karakterisana glomerulosklerozom i tubulointersticijalnom fibrozom, je zajednička manifestacija veoma raznovrsnih hroničnih bolesti bubrega. Patogeneza renalne fibroze je, suštinski, monotoni proces koji se karakteriše prekomernom akumulacijom i deponovanjem komponenti ekstracelularnog matriksa (ECM). Renalna fibroza je progresivni proces koji na kraju dovodi do krajnjeg stadijuma bubrežne insuficijencije, razornog poremećaja koji zahteva dijalizu ili transplantaciju bubrega. Međutim, ne postoji specifični tretman za koji je nedvosmisleno pokazano da usporava pogoršanje hronične bolesti bubrega. Povreda bubrega je povezana sa oslobađanjem citokina/faktora rasta kao što su TGF-β, epidermalni faktor rasta (EGF), i faktor rasta izvden iz trombocita (PDGF) od strane oštećenih ili infiltrirajućih ćelija. Povećanje u proizvodnji TGF-β je jedan od najvažnijih mehanizama u patogenezi renalne fibrogeneze. TGF-β1 strimuliše aktivaciju ćelija fibroblasta i indukuje ekspresiju matriksa preko njegove interakcije sa TGF-β receptorima, koji su uglavnom sastavljeni od dve familije proteina – receptora tipa I (TβRI) i tipa II (TβRII). TGF-β1 se vezuje za TβRII, što rezultuje u regrutaciji TβRI da bi se formirao heteromerni TGF-β receptor kompleks. Kompleks fosforiliše i aktivira Smad2 i Smad3, dva glavna Smads koji posreduju u profibroznim događajima. Drugi signalni putevi kao što je ekstracelularno regulisana kinaza 1/2 (ERK1/2) mogu se takođe aktivirati kao odgovor na aktivaciju TGF- β receptora. Aktivirana ERK1/2 doprinosi apoptozi tubularnih ćelija u opstruktivnom bubregu. Kako se smatra da je aktivacija TGF-β signalizacije glavni mehanizam koji direktno promoviše aktivaciju fibroblasta i progresiju fibroze, terapeutska intervencija na ovom putu može se smatrati strategijom za zaustavljanje ili prevenciju renalne fibroze. Kandidati za tretman CKD su otkriveni u WO 2012/159107 i WO 2014/013005. Još uvek postoji potreba, međutim, za jedinjenjima koja su pogodna za tretman CKD.

[0005] Fibrozno remodelovanje pluća dešava se kod stanja plućne bolesti kao što su respiratorni distres sindrom, hronična opstruktivna bolest pluća i astma. Plućna fibroza se karakteriše prekomernim deponovanjem ekstracelularnog matriksa u intersticijumu, što rezultuje u respiratornoj insuficijenciji. Plućna fibroza može biti izazvana brojnim različitim stanjima, uključujući sarkoidozu, hipersenzitivni pneumonitis, kolagenu vaskularnu bolest, i izlaganje inhalantu. U značajnom broju pacijenata, ne može se naći uzork plućne fibroze. Ova stanja nepoznate etiologije su označena kao idiopatske intersticijalne upale pluća. Najčešći oblik idiopatkse intersticijalne pneumonije je idiopatska plućna fibroza (IPF). Primarni histopatološki nalaz IPF je onaj koji je od uobičajene intersticijalne pneumonije sa temporalnom heterogenošću alternirajućih zona intersticijalne fibroze sa fibroblastnim fokusima (tj., novijom fibrozom), inflamacijom, promene u vidu saća (tj., starija fibroza), i normalnom arhitekturom pluća (tj., bez dokaza fibroze). Kandidati za tretman IPF su otkriveni u WO 2004/103296. Kandidati za tretman plućnih fibroznih poremećaja su otkriveni u WO 2009/149188. Nedavno, studije koje uključuju tiazolidindione kao što je rosiglitazon pokazale su da ovi lekovi mogu poboljšati fibrozu ali tretman sa ovim lekovima nije bez neželjenih efekata kao što su veći rizik od kongestivne srčane insuficijencije (Kung J et al., Expert Opin. Drug Saf.2012, 11(4):565-579). Pirfenidon (5-metil-1-fenil-2-(1H)-piridon) ima anti-fibrozne osobine i odobren je u Evropi i Japanu za tretman IPF. I dalje postoji potreba, međutim, za alternativnim jedinjenjima koja su pogodna za tretman plućnih fibroznih poremećaja.

[0006] Fibrozni poremećaji se karakterišu abnormalnim i prekomernim deponovanjem kolagena i drugih komponenti ekstracelularnog matriksa (ECM) u različitim tkivima. Iako je njihova etiologija veoma raznovrsna, prisustvo fibroblasta koji proizvode ECM koji pokazuju aktivirani fenotip u pogođenim tkivima je tipično za fibrozne bolesti. Aktivacija fibroblasta se karakteriše izrazitim povećanjem u transkripcionoj aktivnosti gena koji kodriaju tip I i tip III kolagene i fibronektin, inicijaciji ekspresije alfa-aktina glatkog mišića (a-SMA), i smanjenju ECM degradativnih aktivnosti. Najčešći sistemski fibrozni poremećaj je sistemska fibroza koja je retka hronična bolest nepoznatog uzroka. Klinički je heterogeni, sistemski poremećaj koji utiče na vezivno tkivo kože, unutrašnjih organa i zidova krvnih sudova. Karakteriše se izmenom mikrovaskulature, poremećajima imunog sistema i masivnim deponovanjem kolagena i drugih supstanci matriksa u vezivnom tkivu. Poznato je da su osnovne funkcije različitih tipova ćelija (endotelne ćelije, T-limfociti, monociti, fibroblasti, mast ćelije) kao i proizvodnja i efekti citokina, faktora rasta, i adhezionih molekula uključeni u razvoj ove bolesti. Sistemska fibroza se često označava kao skleroderma. Spektar sklerodermnih bolesti sadrži veoma raznovrsne kliničke entitete kao što je morfea (mestimična, linearna, i generalizovana), pseudo-skleroderma i preklapajući sindromi sa sličnim kožnim i histopatološkim manifestacijama. Dodatno, kompleksna patofiziologija sistemske fibroze, koja uključuje gentske faktore, sredinske faktore, funkcije vaskularnog i imunog sistema, kao i supstance fibroblasta i matriksa, i kompleksnost uključivanja unutrašnjih organa, rezultuje u sklerodermatoznim bolestima koje se često proučavaju kao autoimune ili bolesti vezivnog tkiva. Stoga, sistemska fibroza je bila izazov za kliničke stručnjake u odnosu na dijagnostičke procedure i terapijske režime. Klinička dijagnoza sistemske fibroze često uključuje saradnju nekoliko disciplina (npr. dermatologa, reumatologa, pulmologa, nefrologa, i gastroenterologa) i može uključiti invazivnu proceduru kao što je biopsija fibroznog tkiva i/ili kože za potvrđivanje. Kandidati za tretman sistemske fibroze su otkriveni u US 2013/0287794 i US 2014/0038956. Međutim, još uvek postoji potreba za alternativnim jedinjenjima koja su pogodna za tretman sistemske fibroze.

[0007] Peroksizom proliferator-aktivirani receptori (PPARs) su grupa proteina jedarnog receptora koji funkcionišu kao transkripcioni faktori koji regulišu ekspresiju gena. PPARs igraju esencijalne uloge u regulaciji diferencijacije ćelija, razviću, i metabolizmu (ugljenih hidrata, lipida, proteina). Identifikovana su tri podtipa PPARs:

• PPARα, koji su uglavnom eksprimirani u jetri, bubregu, srcu, mišićima, adipoznom tkivu i plućima;

• PPARγ, koji su eksprimirani u praktično svim tkivima;

• PPARδ, koji se uočavaju na raznovrsnim tkivima/ćelijama naročito u kardiovaskularnom, urinarnom, respiratornom, digestivnom i mišićno-skeletnom sistemu.

[0008] PPAR agonisti su lekovi koji deluju na PPARs. Koriste se za tretiranje simptoma metaboličkih bolesti, uglavnom za snižavanje triglicerida i šećera u krvi. PPARα agonisti se suštinski sastoje od klase fibrata (npr. fenofibrat). PPARγ agonisti se suštinski sastoje od tiazolidindiona (npr. rosiglitazon i pioglitazon). PPARδ agonisti uključuju GW501516, kandidat jedinjenje koje je konačno ukinuto usled bezbednosnih problema.

[0009] Ekspresija PPAR receptora je modifikovana u fibroznim bolestima. Na primer, smanjena ekspresija PPARγ je reproducibilno opisana u biopsijama kože, kao i kod eksplantiranih fibroblasta kože od pacijenata sa sistemskom sklerodermom (Lakota et al, Arthritis Res. Ther.

2012 May 1;14(3)). Niža ekspresija PPARγ je takođe zabeležena kod fibroblasta pluća kod pacijenata sa sklerodermom (Bogatkevich et al, Pulm. Med. Vol 2012; 2012). PPARγ agonisti rosiglitazon i pioglitazon štite glodare od bleomicin-indukovane fibroze kože i pluća in vivo i sprečavaju aktivaciju profibroznih puteva i procesa in vitro u ćelijskim linijama fibroblasta i u primarnim fibroblastima (Aoki et al, Respiration. 2009;77(3):311-9; Samah et al, Eur J Pharmacol. 2012 Aug 15; 689(1-3)). PPARα receptori takođe moduliraju profibrozni odgovor na različite stimuluse. U plućima, fenofibrat, specifični PPARα agonist, sprečio je bleomicinindukovanu fibrozu (Samah et al 2012 op cit). Dodatno, pokazano je da PPARδ agonist GW0742 smanjuje inflamaciju pluća indukovanu instilacijom bleomicina u miševe (Galuppo et al, Int J Immunopathol Pharmacol. 2010 Oct-Dec;23(4):1033-46).

[0010] Efekti dvostrukog PPAR α/γ agonista aleglitazar na kontrolu glikemije i zaštitu organa kod Zucker dijabetičkog gojaznog pacova objavljeni su od strane Bénardeau et al. (Diabetes, Obesity and Metabolism 2013, 15:164-174). Hepatoprotektivni efekti dvostrukog PPAR α/δ agonista GFT505 u modelima NAFLD/NASH kod glodara objavljeni su od strane Staels et al. (Hepatology 2013, 58:1941-1952). JP-A-2007 191 424 otkriva upotrebu bezafibrata kao aktivatora adiponektin receptora.

Rezime pronalaska

[0011] Sada je pronađeno da pan-PPAR agonist, tj. jedinjenje koje aktivira sva tri PPAR receptora (PPARα, PPARγ i PPARδ), daje korisne efekte u tretmanu različitih fibroznih stanja. Stoga predmetni pronalazak obezbeđuje pan-PPAR agonist, koji je 5-hloro-1-[(6-benzotiazolil)sulfonil]-1H-indol-2-buterna kiselina, za upotrebu u postupku tretmana fibroznog stanja. Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije i postupke za tretiranje fibroznog stanja.

[0012] U jednom primeru izvođenja, fibrozno stanje je stanje koje pogađa bilo koji organ koji može razviti fibrozu, kao što je srce, pluća, jetra, bubreg, gastrointestinalni trakt, koža, itd.

[0013] U sledećem primeru izvođenja, fibrozno stanje je izabrano od: fibroze jetre, bolesti masne jetre, ne-alkoholnog steatohepatitisa, hronične bolesti bubrega, pulmonalnog fibroznog poremećaja kao što je idiopatska plućna fibroza, i sistemske skleroderme.

[0014] U sledećem primeru izvođenja, koji se može kombinovati sa prethodnima, pan-PPAR agonist je namenjen za oralnu primenu.

Kratak opis crteža

[0015] Slika 1 prikazuje nivoe triglicerida u plazmi CCl4-izloženih miševa tretiranih sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 2 prikazuje deponovanje kolagena u CCl4-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 3 prikazuje TGFβ-1 ekspresiju u CCl4- izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 4 prikazuje Colla ekspresiju u CCl4- izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 5 prikazuje α-SMA ekspresiju u CCl4- izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 6 prikazuje MCP-1 ekspresiju u CCl4- izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 7 prikazuje ekspresiju fibronektina u CCl4- izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Legenda za Slike 1 do 7: u grupi sa uljem barovi predstavljaju, sa leva na desno, vehikulum, jedinjenje A (100 mg/kg) i rosiglitazon; u CCl4 grupi barovi predstavljaju, sa leva na desno, vehikulum, jedinjenje A (30 mg/kg), jedinjenje A (100mg/kg) i rosiglitazon.

Slika 8 prikazuje nivoe uree u serumu anti-GBM izloženih miševa tretiranih sa vehikulumom, kaptoprilom, rosiglitazonom, pioglitazonom i jedinjenjem A.

Slika 9 prikazuje urinarne zapremine anti-GBM izloženih miševa tretiranih sa vehikulumom, kaptoprilom, rosiglitazonom, pioglitazonom i jedinjenjem A.

Slika 10 prikazuje nivoe urinarnog albumina anti-GBM izloženih miševa tretiranih sa vehikulumom, kaptoprilom, rosiglitazonom, pioglitazonom i jedinjenjem A.

Slika 11 prikazuje nivoe osteopontina anti-GBM izloženih miševa tretiranih sa vehikulumom, kaptoprilom, rosiglitazonom, pioglitazonom i jedinjenjem A.

Slika 12 prikazuje nivoe MCP-1 anti-GBM izloženih miševa tretiranih sa vehikulumom, kaptoprilom, rosiglitazonom, pioglitazonom i jedinjenjem A.

Slika 13 prikazuje TGFβR1 ekspresiju anti-GBM izloženih miševa tretiranih sa vehikulumom, kaptoprilom, rosiglitazonom, pioglitazonom i jedinjenjem A.

Slika 14 prikazuje Colla ekspresiju anti-GBM izloženih miševa tretiranih sa vehikulumom, kaptoprilom, rosiglitazonom, pioglitazonom i jedinjenjem A.

Slika 15 prikazuje Col3a ekspresiju anti-GBM izloženih miševa tretiranih sa vehikulumom, kaptoprilom, rosiglitazonom, pioglitazonom i jedinjenjem A.

Slika 16 prikazuje broj patoloških glomerula kod anti-GBM izloženih miševa tretiranih sa vehikulumom i jedinjenjem A.

Legenda za Slike 8 do 15: barovi predstavljaju, sa leva na desno, kontrolne miševe, anti-GBM izložene miševe tretirane sa vehikulumom, anti-GBM izložene miševe tretirane sa kaptoprilom, anti-GBM izložene miševe tretirane sa rosiglitazonom, anti-GBM izložene miševe tretirane sa pioglitazonom, anti-GBM izložene miševe tretirane sa jedinjenjem A (30 mg/kg) i anti-GBM izložene miševe tretirane sa jedinjenjem A (100mg/kg).

Legenda za Sliku 16: barovi predstavljaju, sa leva na desno, anti- GBM izložene miševe tretirane sa vehikulumom i anti-GBM izložene miševe tretirane sa jedinjenjem A (100 mg/kg).

Slika 17 prikazuje deponovanje kolagena u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 18 prikazuje nivoe TIMP-1 u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 19 prikazuje nivoe MCP-1 u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 20 prikazuje nivoe osteopontina u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 21 prikazuje TGFβR1 ekspresiju u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 22 prikazuje Colla ekspresiju u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 23 prikazuje Col3a ekspresiju u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 24 prikazuje TIMP-1 ekspresiju u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 25 prikazuje MCP-1 ekspresiju u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 26 prikazuje ekspresiju osteopontina u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 27 prikazuje ekspresiju fibronektina u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Legenda za Slike 17 do 27: u grupi sa fiziološkim rastvorom barovi predstavljaju, sa leva na desno, vehikulum, jedinjenje A (100 mg/kg) i rosiglitazon; u bleomicin grupi barovi predstavljaju, sa leva na desno, vehikulum, jedinjenje A (30 mg/kg), jedinjenje A (100 mg/kg) i rosiglitazon.

Slika 28 prikazuje debljinu kože bleomicin-izloženih miševa tretiranih sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 29 prikazuje sadržaj hidroksiprolina u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Slika 30 prikazuje sadržaj kolagena u bleomicin-izloženim miševima tretiranim sa vehikulumom, jedinjenjem A i rosiglitazonom.

Legenda za Slike 28 do 30: Bleo = bleomicin; IVA30 = jedinjenje A (30 mg/kg); IVA100 = jedinjenje A (100 mg/kg); Ros = rosiglitazon.

Slika 31 prikazuje aktivaciju PPARα, γ i δ humanih receptora sa jedinjenjem A u funkciji koncentracije pomenutog jedinjenja.

Slika 32 prikazuje aktivaciju PPARα, γ i δ mišjih receptora sa jedinjenjem A u funkciji koncentracije pomenutog jedinjenja.

Slika 33 prikazuje efekat jedinjenja A, fenofibrinske kiseline i rosiglitazona na PDGF-indukovanu proliferaciju u primarnim fibroblastima humanih pluća.

Slika 34 prikazuje efekat jedinjenja A, fenofibrinske kiseline i rosiglitazona na PDGF-indukovanu proliferaciju in primarnim humanim dermalnim fibroblastima.

Slika 35 prikazuje efekat jedinjenja A, fenofibrinske kiseline i rosiglitazona na TGFβindukovanu FMT u primarnim fibroblastima humanih pluća.

Slika 36 prikazuje efekat jedinjenja A, fenofibrinske kiseline i rosiglitazona na TGFβ-indukovani FMT u primarnim humanim dermalnim fibroblastima.

Legenda za Slike 33 do 36: Rosi = rosiglitazon; Feno = fenofibrinska kiselina.

[0016] Na Slikama 1 do 36, jedinjenje A je 5-hloro-1-[(6-benzotiazolil)sulfonil]-1H-indol-2-buterna kiselina.

Detaljan opis pronalaska

[0017] Hronična povreda jetre izazvana sa mastima, alkoholom, virusom ili hemijskom supstancom može indukovati aktivaciju zvezdastih ćelija jetre sa sekrecijom velikih količina ekstracelularnog matriksa kao što je kolagen, koji može dovesti do fibroze jetre kao posledice prekomernog deponovanja ekstracelularnog matriksa.

[0018] Hronična bolest bubrega (CKD) je rezultat različitih povreda bubrega, koja pogađa oko 10% noramlne populacije. To je progresivni proces naznačen sa intersicijalnom fibrozom. Primarni cilj tretmana kod pacijenata sa CKD je prevencija ili najmanje usporavanje progresije CKD.

[0019] Plućna fibroza takođe nazvana idiopatska plućna fibroza (IPF), intersticijalna difuzna plućna fibroza, inflamatorna plućna fibroza, ili fibrozni alveolitis, je inflamatorni poremećaj pluća i heterogena grupa stanja karakterisanih abnormalnim formiranjem fibroznog tkiva između alveola izavanog alveolitisom koji sadrži inflamatornu ćelijsku infiltraciju u alveolarne septe sa rezultujućom fibrozom. Efekti IPF su hronični, progesivni, i često fatalni. Brojna istraživanja plućne fibroze ukazala su da produžena ili poboljšana povećana ekspresija nekih citokina u plućima su relevantni za regrutaciju inflamatornih ćelija i akumulaciju komponenti ekstracelularnog matriksa što je praćeno sa remodelovanjem arhitekture pluća. Naročito, pokazano je da proinflamatorni citokini kao što je TNF-α i interleukin IL- 1β igraju glavne uloge u formiranju pneumonitisa i plućne fibroze. Dodatno, profibrozni citokini kao što su TGF-α i CTGF takođe igraju kritične uloge u patogenezi plućne fibroze.

[0020] Skleroderma je bolest koja izaziva zadebljanje kože i različite stepene disfunkcije organa koje su rezultat vaskulopatije malih krvnih sudova i imuno-posredovane fibroze. Kliničke manifestacije ove bolesti su ekstremno heterogene i zavise od prisustva i stepena uključivanja unutrašnjih organa. Pacijenti mogu imati spektar bolesti koje su u opsegu od samo lokalizovane fibroze kože (lokalizovana skleroderma) do sistemskog poremećaja koij uključuje i kožu i unutrašnji organ. Lokalizovana skleroderma uključuje različite oblike kožnih skleroza bez uključivanja unutrašnjih organa. Ovi oblici skleroderme mogu biti unakažavajući ali samo retko zahtevaju sistemsku terapiju da bi se kontrolisala aktivnost bolesti. Sistemska skleroza je dodatno podeljena na dva subseta bolesti, u zavisnosti od stepena uključenja kože i organa. Prisustvo difuzne sistemske skleroze označava prisustvo ekstenzivne kožne skleroze na proksimalnim udovima, trupu, i licu. Pacijenti sa ograničenom sistemskom sklerozom imaju fibrozu ograničenu na ruke, podlaktice, stopala, noge i lice. I difuzna i ograničena sistemska skleroza su povezane sa uključivanjem unutrašnjih organa; međutim, pacijenti sa difuznom sistemskom sklerozom su u većem riziku od klinički značajne disfunkcije glavnih organa. Neki pacijenti sa ograničenom sistemskom sklerozom mogu se dodatno klasifikovati da imaju CREST sindrom, sa pratećom kalcinozom, Raynaud-ov fenomen, ezofagijalni dismotilitet, sklerodaktiliju, i kožne telangiektazije. Skleroderma sine sklerozis je redak poremećaj u kojem pacijenti razvijajau vaskularna i fibrozna oštećenja unutrašnjih organa u odsustvu kožne skleroze. Patofiziologija sistemske skleroze uključuje vaskularno oštećenje i aktivaciju fibroblasta, i kolagen i drugi ekstracelularni proteini u različitim tkivima su prekomerno proizvedeni. Skleroderma se karakteriše aktivacijom imunog sistema, endotelnom disfunkcijom, i poboljšanom aktivnošću fibroblasta. Tačni uzročni događaji koji dovode do razvoja sistemske skleroze su trenutno nepoznati. Nekoliko citokina uključujući interleukin-4 i transformišući faktor rasta-beta (TGF-β) implicirani su u aktivaciju fibroblasta kod pacijenata sa sklerodermom. Ovi citokini se oslobađaju iz aktiviranih imunih ćelija, fibroblasta, i endotelnih ćelija. Aktivirani fibroblasti proizvode strukturno normalni kolagen i druge proteine ekstracelularnog matriksa u koži i različitim unutrašnjim organima.

[0021] Predmetni pronalazak je zasnovan na nalazu da pan-PPAR agonist izaziva korisne efekte u tretmanu fibroznih stanja kao što su ona opisana prethodno. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "pan-PPAR agonist" označava jedinjenje koje značajno aktivira svaki od PPARα, PPARγ i PPARδ receptora, tj. jedinjenje koje bi se pojedinačno smatralo PPARα agonistom, PPARγ agonistom, i PPARδ agonistom na osnovu njegovih respektivnih EC50vrednosti. Prema predmetnom pronalasku, značajna aktivacija PPARα, PPARγ i PPARδ receptora je postignuta kada je EC50za svaki receptor ≤ 10<-6>M. EC50za tri podtipa receptora poželjno se razlikuju po manje od 2 reda veličine (tj. odnos EC50za dva podtipa receptora je ili manji od 100 ili veći od 0.01). U jednom primeru izvođenja pan-PPAR agonist nije bezafibrat.

[0022] U jednom aspektu, pronalazak stoga obezbeđuje pan-PPAR agonist, koji je 5-hloro-1-[(6-benzotiazolil)sulfonil]-1H-indol-2-buterna kiselina, za upotrebu u tretmanu fibroznog stanja.

[0023] U jednom primeru izvođenja, fibrozno stanje je stanje koje pogađa bilo koji organ koji može razviti fibrozu, kao što je srce, pluća, jetra, bubreg, gastrointestinalni trakt, koža, itd.

[0024] U sledećem primeru izvođenja, fibrozno stanje je izabrano od: fibroze jetre, bolesti masne jetre, ne-alkoholnog steatohepatitisa, hronične bolesti bubrega, pulmonalne fibrozne bolesti, sistemske skleroderme.

[0025] U sledećem primeru izvođenja, fibrozno stanje je bolest jetre, poželjno fibroza jetre, bolest masne jetre, ili ne-alkoholni steatohepatitis.

[0026] U sledećem primeru izvođenja, fibrozno stanje je hronična bolest bubrega. Bolest je naročito izabrana od nefropatije (npr. membranske nefropatije, dijabetičke nefropatije i hipertenzivne nefropatije), glomerulonefritisa (npr. membranskog glomerulonefritisa i membranoproliferativnog glomerulonefritisa kao što je glomerulonefritis sa rapidnom progresijom), intersticijalni nefritis, lupus nefritis, sindrom idiopatskog nefritisa (npr. nefrozni sindrom minimalne promene i fokalna segmentirana glomeruloskleroza), opstruktivna uropatija, bolest policističnog bubrega (npr. autozomalno dominantna bolest policističnih bubrega i autozomalno recesivna bolest policističnih bubrega), i odbacivanje grafta bubrega (npr. akutno i hronično odbacivanje bubrega).

[0027] U sledećem primeru izvođenja, fibrozno stanje je plućni fibrozni poremećaj, poželjno idiopatska plućna fibroza.

[0028] U sledećem primeru izvođenja, fibrozno stanje je fibroza kože kao što je sistemska skleroderma.

[0029] U sledećem primeru izvođenja, koji sde može kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, pan-PPAR agonist je namenjen za oralnu primenu.

[0030] Pan-PPAR agonist se može formulisati u farmaceutsku kompoziciju za primenu.

[0031] U sledećem aspektu, pronalazak stoga obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju uključujući pan-PPAR agonist, koji je 5-hloro-1-[(6-benzotiazolil)sulfonil]-1H-indol-2-buterna kiselina, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, za upotrebu u tretmanu fibroznog stanja kao što je prethodno opisano u različitim primerima izvođenja prvog aspekta pronalaska. U jednom primeru izvođenja, kompozicija sadrži terapeutski efikasnu količinu pan-PPAR agonista. U kontekstu pronalaska, termim "terapeutski efikasna količina" označava dovoljnu količinu pan-PPAR agonista da se obezbedi željeni efekat. U krajnjem slučaju, zaduženi lekar određuje odgovarajuću količinu i dozni režim.

[0032] Pan-PPAR agonist će se generalno primenjivati kao formulacija zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. Termin ’ekscipijent’ je ovde korišćen da opiše bilo koji sastojak različit od pan- PPAR agonista. Izbor ekscipijenta (ekscipijenata) će u velikom stepenu zavisiti od faktora kao što su određeni način primene, efekat ekscipijenta na rasstvorljivost i stabilnost, i prirode doznog oblika.

[0033] Farmaceutske kompozicje pogodne za isporuku pan-PPAR agonista i postupci za njihovu pripremu biće očigledni stručnjacima. Takve kompozicije i postupci za njihovu pripremu mogu se naći, na primer, u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995).

Oralna primena

[0034] Pan-PPAR agonist se može primeniti oralno. Oralna primena može uključivati gutanje, tako da jedinjenje ulazi u gastrointestinalni trakt, i/ili bukalnom, lingvalnom, ili sublingvalnom primenom kojom jedinjenje ulazi u krvotok direktno iz usta. Formulacije pogodne za oralnu primenu uključuju čvrste, polu-čvrste i tečne sisteme kao što su tablete; meke ili čvrste kapsule, multi- ili nano-čestice, tečnosti, ili praškovi; lozenge (uključujući napunjene tečnošću); sredstva za žvakanje; gelovi; dozni oblici sa brzom disperzijom; filmovi; ovule; sprejevi; i bukalne/mukoadhezivne flastere.

[0035] Tečne formulacije uključuju suspenzije, rastvore, sirupe i eliksire. Takve formulacije mogu se upotrebiti kao punioci u mekim ili čvrstim kapsulama (napravljene, na primer, od želatina ili hidroksipropilmetilceluloze) i tipično sadrže nosač, na primer, vodu, etanol, polietilen glikol, propilen glikol, metilcelulozu, ili pogodno ulje, i jedan ili više sredstva za stvaranje emulzije i/ili suspenzije. Tečne formulacije se takođe mogu pripremiti rekonstitucijom čvrste supstance, na primer, iz kesice.

[0036] Za dozne oblike tablete ili kapsule, zavisno od doze, lek može činiti od 1 težinskih % do 80 težinskih % doznog oblika, tipičnije od 5 težinskih % do 60 težinskih % doznog oblika. Kao dodatak leku, tablete generalno sadrže sredstvo za raspadanje. Primeri sredstava za raspadanje uključuju natrijum skrob glikolat, natrijum karboksimetil celulozu, kalcijum karboksimetil celulozu, kroskarmeloza natrijum, krospovidon, polivinilpirolidon, metil celulozu, mikrokristalnu celulozu, niži alkil-supstituisanu hidroksipropil celulozu, skrob, preželatinizirani skrob i natrijum alginat. Generalno, sredstvo za raspadanje će sadržati od 1 težinskih % do 25 težinskih %, poželjno od 5 težinskih % do 20 težinskih % doznog oblika.

[0037] Vezujuća sredstva se generalno koriste da uvedu kohezivni kvalitet formulaciji tablete. Pogodna vezujuća sredstva uključuju mikrokristalnu celulozu, želatin, šećere, polietilen glikol, prirodne i sintetičke gume, polivinilpirolidon, preželatinizirani skrob, hidroksipropil celulozu i hidroksipropil metilcelulozu. Tablete mogu takođe sadržati razblaživače, kao što je laktoza (monohidrat, monohidrat sušen sprejem, anhidrovana i slično), manitol, ksilitol, dekstroza, saharoza, sorbitol, mikrokristalna celuloza, skrob i dvobazni kalcijum fosfat dihidrat.

[0038] Tablete ili kapsule mogu takođe izborno sadržati površinski aktivna sredstva, kao što je natrijum lauril sulfat i polisorbat 80, i klizajuća sredstva kao što su silicijum dioksid i talk. Kada su prisutna, površinski aktivna sredstva mogu sadržati 0.2 težinskih % do 5 težinskih % tablete, i klizajuća sredstva mogu sadržati od 0.2 težinskih % do 1 težinskih % tablete.

[0039] Tablete takođe generalno sadrže lubrikante kao što su magnezijum stearat, kalcijum stearat, cink stearat, natrijum stearil fumarat, i smeše magnezijum stearata sa natrijum lauril sulfatom. Lubrikanti generalno čine od 0.25 težinskih % do 10 težinskih %, poželjno od 0.5 težinskih % do 3 težinskih % tablete.

[0040] Drugi mogući sastojci uključuju anti-oksidante, boje, aromatizere, konzervanse i sredstva za maskiranje ukusa.

[0041] Primeri tableta sadrže do oko 80 težinskih % leka, od oko 10 težinskih % do oko 90 težinskih % vezujućeg sredstva, od oko 0 težinskih % do oko 85 težinskih % razblaživača, od oko 2 težinskih % do oko 10 težinskih % sredstva za raspadanje, i od oko 0.25 težinskih % do oko 10 težinskih % lubrikanta.

[0042] Mešavine tableta mogu se kompresovati direktno ili valjkom da bi se formirale tablete. Mešavine tableta ili delovi mešavina tableta mogu alternativno biti vlažno-, suvo-, ili topljenogranulisani, istopljeni zamrzavanjem, ili ekstrudirani pre tabletiranja. Finalna formulacija može sadržati jedan ili više slojeva i može biti obložena ili neobložena; može čak biti inkapsulirana.

Parenteralna primena

[0043] Pan-PPAR agonist može se takođe primeniti direktno u krvotok, u mišić, ili u unutrašnji organ. Pogodna sredstva za parenteralnu primenu uključuju intravenski, intraarterijalni, intraperitonealni, intratekalni, intraventrikularni, intrauretralni, intrasternalni, intrakranijalni, intramuskularni, intrasinovijalni i potkožni. Pogodni uređaji za parenteralnu primenu uključuju injektore sa iglom (uključujući mikroiglu), injektore bez igle i tehnike infuzije.

[0044] Parenteralne formulacije su tipično vodeni rastvori koji mogu sadržati ekscipijente kao što su soli, ugljeni hidrati i puferi (poželjno do pH od 3 do 9), ali, za neke primene, mogu biti pogodnije formulisane kao sterilni ne-vodeni rastvor ili kao osušeni oblik koji se koristi zajedno sa pogodnim vehikulumom kao što je sterilna voda bez pirogena.

[0045] Priprema parenteralnih formulacija pod sterilnim uslovima, na primer, liofilizacijom, može se lako postići korišćenjem standardnih farmaceutskih tehnika dobro poznatih stručnjaku.

[0046] Rastvorljivost pan-PPAR agonista korišćenog u pripremi parenteralnih rastvora može se povećati upotrebom odgovarajućih tehnika formulisanja, kao što je inkorporacija sredstava koja poboljšavaju rastvorljivost ili tehnologija kao što su SMEDDS (Self Micro Emulsifying Drug Delivery System).

[0047] Formulacije za parenteralnu primenu mogu se formulisati da budu sa trenutnim i/ili modifikovanim oslobođanjem. Formulacije sa modifikovanim oslobađanjem uključuju odloženo-, produženo-, pulsno-, kontrolisano-, ciljano i programirano oslobađanje. Pan- PPAR agonist se može formulisati kao suspenzija ili čvrsta supstanca, polu-čvrsta supstanca, ili tiksotropna tečnost za primenu kao implantirani depo koji obezbeđuje modifikovano oslobađanje aktivnog jedinjenja. Primeri takvih formulacija uključuju stentove obložene lekom i polučvrste supstance i suspenzije koje sadrže poli(dl-mlečna-koglikolna)kiselina (PGLA) mikrosfere napunjene lekom.

Inhalaciona/intranazalna primena

[0048] Pan-PPAR agonist može se takođe primeniti intranazalno ili inhalacijom, tipično u obliku suvog praška (ili zasebno, kao smeša, na primer, u suvoj mešavini sa laktozom, ili kao čestica u smeši komponenata, na primer, u smeši sa fosfolipidima, kao što je fosfatidilholin) iz inhalatora suvog praška, kao aerosol sprej iz spremnika pod pritiskom, pumpe, spreja, atomizera (poželjno atomizera koji koristi elktrohidrodinamiku da proizvede finu maglu), ili nebulizatora, sa ili bez korišćenja pogodnog propelenta, kao što je 1,1,1,2-tetrafluoroetan ili 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropan, ili kao kapi za nos. Za intranazalnu upotrebu, prašak može sadržati bioadhezivno sredstvo, na primer, hitozan ili ciklodekstrin.

[0049] Spremnik pod pritiskom, pumpa, sprej, atomizer, ili nebulizator sadrži rastvor ili suspenziju pan-PPAR agonista koja sadrži, na primer, etanol, vodeni rastvor etanola, ili pogodno alternativno sredstvo za disperziju, povećanje rastvorljivosti, ili produžavanje oslobađanja aktivnog, propelenta (propelenata) kao rastvarača i izbornog površinski aktivnog sredstva, kao što je sorbitan trioleat, oleinska kiselina, ili oligomlečna kiselina.

[0050] Pre upotrebe u formulaciji suvog praška ili suspenzije, proizvod leka je mikronizovan do veličine pogodne za isporuku inhalacijom (tipično manje od 5 mikrona). Ovo se može postići bilo kojim pogodnim postupkom pretvaranja u prašak, kao što je spiralno mlazno mlevenje, mlazno mlevenje u struji fluida, obrada superkritičnog fluida da bi se formirale nanočestice, homogenizacija visokim pritiskom, ili sušenje sprejem.

[0051] Kapsule (napravljene, na primer, od želatina ili hidroksipropilmetilceluloze), blisteri i kertridži za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu se formulisati da sadrže smešu praška pan-PPAR agonista, pogodnu bazu za prašak kao što je laktoza ili skrob i modifikator performansi kao što je l-leucin, manitol, ili magnezijum stearat. Laktoza može biti anhidrovana ili u obliku monohidrata, poželjno poslednje pomenutog. Drugi pogodni ekscipijenti uključuju dekstran, glukozu, maltozu, sorbitol, ksilitol, fruktozu, saharozu i trehalozu.

[0052] Pogodna formulacija rastvora za upotrebu u atomizeru korišćenjem elektrohidrodinamike da bi se proizvela fina magla može sadržati od 1 mg do 20 mg pan-PPAR agonista po aktuaciji i aktuaciona zapremina može varirati od 1 ml do 100 ml. Tipična formulacija može sadržati pan-PPAR agonist, propilen glikol, sterilnu vodu, etanol i natrijum hlorid. Alternativni rastvarači koji se mogu koristiti umesto propilen glikola uključuju glicerol i polietilen glikol.

[0053] Pogodni aromatozeri, kao što je mentol i levomentol, ili zaslađivači, kao što je saharin ili saharin natrijum, mogu se dodati onim formulacijama prema pronalasku koje su namenjene za primenu inhalacijom/intranazalno.

[0054] Formulacije za primenu inhalacijom/intranazalno mogu se formulisati da budu sa trenutnim i/ili modifikovanim oslobađanjem korišćenjem, na primer, PGLA. Formulacije sa modifikovanim oslobađanjem uključuju odloženo-, produženo-, pulsno-, kontrolisano-, ciljano i programirano oslobađanje.

[0055] U slučaju inhalatora sa suvim praškom i aerosola, dozna jedinica je određena preko ventila koji isporučuje odmerenu količinu. Jedinice u skladu sa pronalaskom su tipično uređene da se primeni odmerena doza ili "puf’ koji sadrži od 1 mg do 10 mg pan-PPAR agonista. Ukupna dnevna doza će tipično biti u opsegu 1 mg do 200 mg koja se može primeniti u jednoj dozi ili, češće, kao podeljene doze tokom dana.

Topikalna primena

[0056] Pan-PPAR agonist se takođe može primeniti topikalno, (intra)dermalno, ili transdermalno, na kožu ili sluzokožu. Tipične formulacije za ovu svrhu uključuju gelove, hidrogelove, losione, rastvore, kreme, masti, praškove za posipanje, prelive, pene, filmove, kožne flastere, vafere, implante, sunđere, vlakna, zavoje i mikroemulzije. Takođe se mogu koristiti lipozomi. Tipični nosači uključuju alkohol, vodu, mineralno ulje, tečni vazelin, beli vazelin, glicerin, polietilen glikol i propilen glikol. Mogu se inkorporisati sredstva za poboljšanje penetracije.

[0057] Drugi načini topikalne primene uključuju isporuku elektroporacijom, jontoforezom, fonoforezom, sonoforezom i injekcijom sa mikroiglom ili bez igle (npr. Powderject™, Bioject™, itd.).

[0058] Formulacije za topikalnu primenu mogu se formulisati da budu sa trenutnim i/ili modifikovanim oslobađanjem. Formulacije sa modifikovanim oslobađanjem uključuju odloženo-, produženo-, pulsno-, kontrolisano-, ciljano i programirano oslobađanje.

[0059] Oralne i parenteralne primene su pogodne bez obzira na tip fibroznog stanja. Topikalna primena je pogodna gde je fibrozno stanje npr. sistemska skleroderma. Primena inhalacijom/intranazalno je pogodna kada je fibrozno stanje npr. plućna fibroza ili sistemska skleroderma.

[0060] Za oralnu primenu, pan-PPAR agonist se može primeniti na pacijenta na doznim nivoima u opsegu od oko 100 mg do oko 3,000 mg na dan, poželjno, od oko 500 mg do oko 3,000 mg na dan. Ukupna dnevna doza može se primeniti u pojedinačnoj ili podeljenim dozama. Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može tipično sadržati od oko 100 do oko 1000 mg pan-PPAR agonista, na primer 100, 200, 500, 750 ili 1000 mg pan-PPAR agonista.

[0061] Tipično su pripremljene suspenzije pan-PPAR agonista u 1% rastvoru metilceluloze i u 1% metilcelulozi 0.5% poloksamer. Takođe su pripremljene kapsule koje sadrže 25, 50 ili 200 mg pan-PPAR agonista. Takođe su pripremljene IV formulacije gde je pan-PPAR agonist rastvoren u 30%/70% tež/tež PEG400/0.05 M fosfatnom puferu, pH 8 (25-100 mg/ml).

[0062] Pan-PPAR agonist je 5-hloro-1-[(6-benzotiazolil)sulfonil]-1H-indol-2-buterna kiselina (takođe označen kao "jedinjenje A"). Jedinjenje A i postupak njegove pripreme su opisani u WO 2007/026097. Pronađeno je da jedinjenje A aktivira svaki od PPARα, PPARγ i PPARδ receptora. Jedinjenje A se može koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska u obliku jedne od njegovih farmaceutski prihvatljivih soli ili solvata. Termin ’solvat’ je ovde korišćen da se opiše molekulski kompleks koji sadrži jedinjenje A i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih molekula rastvarača, na primer, etanola. Termin ’hidrat’ je upotrebljen kada je pomenuti rastvarač voda. Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja A uključuju njihove kisele adicione i bazne soli.

[0063] Pogodne kisele adicione soli se formiraju od kiselina koje formiraju netoksične soli. Primeri uključuju acetat, adipat, aspartat, benzoat, bezilat, bikarbonat/karbonat, bisulfat/sulfat, borat, kamzilat, citrat, ciklamat, edizilat, ezilat, format, fumarat, gluceptat, glukonat, glukuronat, heksafluorofosfat, hibenzat, hidrohlorid/hlorid, hidrobromid/bromid, hidrojodid/jodid, izetionat, laktat, malat, maleat, malonat, mezilat, metilsulfat, naftilat, 2-napsilat, nikotinat, nitrat, orotat, oksalat, palmitat, pamoat, fosfat/hidrogen fosfat/dihidrogen fosfat, piroglutamat, saharat, stearat, sukcinat, tanat, tartarat, tozilat, trifluoroacetat i ksinofoat soli.

[0064] Pogodne bazne soli se formiraju od baza koje formiraju netoksične soli. Primeri uključuju aluminijum, arginin, benzatin, kalcijum, holin, dietilamin, diolamin, glicin, lizin, magnezijum, meglumin, olamin, kalijum, natrijum, trometamin i cink soli. Hemisoli kiselina i baza mogu se takođe formirati, na primer, hemisulfat i hemikalcijum soli.

[0065] Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja A mogu se pripremiti sa jednim ili više od tri postupka: (i) reakcijom jedinjenja sa željenom kiselinom ili bazom; (ii) uklanjanjem kiselina- ili baza-labilne zaštitne grupe sa pogodnog prekursora jedinjenja ili otvaranjem prstena pogodnog cikličnog prekursora, na primer, laktona ili laktama, korišćenjem željene kiseline ili baze; ili (iii) konverzijom jedne soli jedinjenja u drugu reakcijom sa odgovarajućom kiselinom ili bazom ili putem pogodne jonoizmenjivačke kolone.

[0066] Sve tri reakcije se tipično izvode u rastvoru. Rezultujuća so se može istaložiti i sakupiti filtracijom ili može biti rekuperovana uparavanjem rastvarača. Stepen jonizacije u rezultujućoj soli može varirati od kompletno jonizovane do skoro nejonizovane.

[0067] Pronalazak je ilustrovan sledećim primerima.

Primer 1: efekat jedinjenja A na razvoj fibroze jetre izazavane ugljen tetrahloridom kod miševa, i poređenje sa poznatim PPAR γ agonistom

[0068] Objavljeno je (Yao T et al., Am J Physiol. 1994 Sep;267(3 Pt 1):G476-84) da ugljen tetrahlorid (CCl4) indukuje u mišjem modelu kod hepatocita mitohondrijalnu disfunkciju i oksidativni stres, što dovodi do deponovanja kolagena i fibroze jetre. Efekat jedinjenja A i rosiglitazona, poznatog PPAR γ agonista, je uskladu sa tim procenjen u mišjem modelu fibroze jetre indukovane sa CCl4.

[0069] Miševi su dnevno oralno tretirani 22 dana sa jedinjenjem A na dve različite doze (30 i 100 mg/kg/dan) i sa PPARγ referentnim jedinjenjem rosiglitazonom sa 5 mg/kg/dan. Na kraju tretmana, životinje su žrtvovane i plazma uzorci i jetre su sakupljeni. Deponovanje kolagena i ekspresija gena za koje se zna da su uključeni u inflamaciju jetre i fibrozu kvantifikovani su i izmereni su neki povezani biomerkeri plazme.

[0070] CCl4-izložene miševe oralno tretirane sa vehikulumom 22 dana pokazivali su fibrozu jetre kao što je pokazano statistički značajnim povećanjem nivoa kolagena u tkivu jetre. Tretman sa jedinjenjem A značajno je smanjio fibrozu jetre sa 80% (30 mg/kg/dan) i 89% (100 mg/kg/dan), respektivno i poboljšao mnoge od povezanih markera. Tretman sa rosiglitazonom je smanjio fibrozu jetre sa samo 54% dok su većina markera bili ili nepromenjeni ili čak pogoršani.

MATERIJALI I POSTUPCI

[0071] Eksperimenti su izvedeni korišćenjem 56 mužjaka C57BL/6J miševa (JANVIER LABS, C.S. 4105, Saint-Berthevin, France), težine 21-24 g na početku eksperimenta. Životinje su smeštene u grupe od 3-10 u polipropilenskim kavezima (površina poda = 1032 cm<2>) pod standardnim uslovima: sobna temperatura (22±2°C), higrometrija (55±10%), svetlo/mrak ciklus (12 č/12 č), zamena vazduha (15-20 zapremina/čas), voda i hrana (SDS, RM1) ad libitum. Miševima je dozvoljeno da se naviknu najmanje 5 dana pre eksperimentisanja. Miševi su numerisani obeležavanjem njihovog repa korišćenjem neizbrisivih markera.

[0072] Suspenzije jedinjenja A spremne za upotrebu (3 mg/mL i 10 mg/mL) i rosiglitazona (0.5 mg/mL) uskladištene su na 5±3°C. Formulacije vehikuluma spremne za upotrebu (metil celuloza 400 cP 1% 0.1% Poloxamer 188) su takođe uskladištene na 5±3°C. Ugljen tetrahlorid (CCl4) (Sigma Chemical co, Saint Quentin Fallavier, France) je sveže pripremljen svaki dan doziranja u suncokretovom ulju (v/v, 1/11).

Doziranje

[0073] Miševi su dodeljeni u sledeće grupe:

1. Suncokretovo ulje (dva puta nedeljno 3 nedelje, ip) / vehikulum (jednom dnevno 22 dana po), n=7,

2. Suncokretovo ulje (dva puta nedeljno 3 nedelje, ip) / jedinjenje A (100 mg/kg/d jednom dnevno 22 dana po), n=8,

3. Suncokretovo ulje (dva puta nedeljno 3 nedelje, ip) / rosiglitazon (5 mg/kg/d jednom dnevno 22 dana po), n=8

4. CCl4(3.5 mL/kg, dva puta nedeljno 3 nedelje, ip) / vehikulum (jednom dnevno 22 dana po), n=8

5. CCl4(3.5 mL/kg, dva puta nedeljno 3 nedelje, ip) / jedinjenje A (30 mg/kg/d jednom dnevno 22 dana po), n=8,

6. CCl4(3.5 mL/kg, dva puta nedeljno 3 nedelje, ip) / jedinjenje A (100 mg/kg/d jednom dnevno 22 dana po), n=7

7. CCl4(3.5 mL/kg, dva puta nedeljno 3 nedelje, ip) / rosiglitazon (5 mg/kg/d jednom dnevno 22 dana po), n=8.

[0074] Dva dana nedeljno 3 nedelje, miševima je intraperitonealno ujutru primenjeno ili 100 mL CCl4(3.5 mL/kg u suncokretovom ulju (tež/tež, 1/11)) ili 100mL suncokretovog ulja. Paralelno, miševi su oralno tretirani jednom dnevno 22 dana (dan 0 do dan 21) sa vehikulumom, jedinjenjem A ili rosiglitazonom. Na dane sa istovremenim primenama vehikuluma, jedinjenja A ili rosiglitazona i CCl4, vehikulum, jedinjenje A ili rosiglitazon je primenjen 6 časova pre primene suncokretovog ulja ili CCl4. Zapremina primene test jedinjenja bila je 10 mL/kg telesne težine za oralne primene.

Terminalno uzorkovanje krvi

[0075] Na dan 21, 2 časa nakon doziranja, životinje su anestezirane sa pentobarbitalom (60 mg/kg, ip) i krv je sakupljena korišćenjem srčane punkcije. Tačno vreme doziranja i vreme sakupljanja uzoraka je zabeleženo sa svaku životinju. Uzorci krvi (0.9 mL ukupne krvi) su stavljeni u prethodno ohlađene 2-mL litijum-heparin epruvete za sakupljanje. Uzorci krvi su nežno promešani, stavljeni na mrvljeni led i centrifugirani unutar 30 min od uzorkovanja na približno 1500 x g 10 min na približno 4°C. Za svako uzorkovanje krvi, rezultujuća plazma je razdvojena u 2 alikvote (najmanje 100 mL svaka) i preneta korišćenjem potrošnog plastičnog materijala u polipropilenske epruvete. Uzorci su odmah preneti u uspravnom položaju u zamrzivač gde su držani na -20°C.

[0076] Nakon terminalnog uzorkovanja krvi, tkivo jetre je uklonjeno:

- Prvi uzorak krvi (oko 50 mg) je sakupljen i fiksiran sa paraformaldehidom, i na 5±3°C,

- Drugi uzorak krvi (200 mg) je zamrznut u tečnom azotu i držan na -20°C.

Mereni parametri

Kolagen

[0077] Za kvantifikaciju kolagena, preseci su obojeni sa Picro-Sirius crvenim i diferencijalnim bojenjem sa Mayer hematoksilinom. Svi preseci su digitalizovani i 5 nepreklapajućih preseka od 3 različita dela preseka su nasumično analizirani sa image J softverom (verzija 1.42, N.I.H., USA). Za sve preseke, analiza je izvedena od strane jednog izvođača u istim uslovima.

Ekspresija gena

[0078] Ekstrakcija iRNK je izvedena na malim uzorcima zamrznute jetre (50-100 mg). Ukratko, uzorci su kriogeno izmrvljeni sa tučkom i avanom. Uzorci su nakon toga homogenizovani korišćenjem mermera (2X5 mn) i 1ml Qiazol lizirajućeg reagensa (Qiagen Ref 79306) u Retsch MM300 aparatu. Ekstrakcija RNK iz homogenata jetre je finalizovana sa Qiagen Rneasy lipid Kit (Ref 74804) prateći instrukcije proizvođača. Količina RNK je određena sa Nanodrop (ND2000 Thermo Scientific) i kvalitet RNK je verifikovan sa Bioanalyzer (2100 Agilent Technology).

[0079] Random-prajmovana cDNK sinteza je izvedena na 100 ng ukupne RNK korišćenjem Iscript kit (BIORAD ref 170-8891) prateći uputstva proizvođača. Real-time PCR je izveden sa 7.5 ng RNK ekvivalenata na ABI Prism 7900 Sequence Detection System (APPLIED BIOSYSTEMS) korišćenjem Iq ITaq SYBR Green Universal Rox (Ref 1725124 Biorad) i korišćenjem za to namenjenih QPCR prajmera. Za neke iRNK transkripte, kvantifikacija je izvedena korišćenjem TaqMan proba obeleženih sa fluorohormom FAM i korišćenjem Universal PCR MasterMix No AmpErase UNG (APPLIED BIOSYSTEMS ref 4324020). Prajmeri korišćeni za analize su navedeni u sledećoj tabeli:

[0080] Real Time PCR je izveden na ABI PRISM 7900 aparatu. Sirovi podaci iz ABI7900 su izvezeni u tekst formatu. Analiza je izvedena u Excel, relativna količina transkripta je izračunata korišćenjem "Delta Delta CT method" (Livak et al. Methods 2001), korišćenjem Rplp0 kao housekeeping gena za normalizaciju i srednje vrednosti podataka iz netretiranih životinja (grupa sa vehikulumom) kao referentne kontrole. Svaki od RNK uzoraka je reverzno transkribovan i kvantifikovan u triplikatu.

Biomarkeri jetre

Protokoli za ekstrakciju proteina jetre:

[0081] Ekstrakcija sa T-PER®: Tissue Protein Extraction Reagent, prod#78510 (lot: NG174004), Thermo Scientific sa: Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail, EDTA-free (100X) - Prod # 78425 - Lot # NL178051 Thermo Fischer.

[0082] Uzorci jetre i supernatanti su držani na ledu tokom celog eksperimenta. Za ekstrakciju, proizvođač preporučuje 10 mg tkiva za 100 µl T-Per 1 µl "Halt-protease" (100X).

[0083] 50 ml T-Per pufera je pripremljeno, kome je dodato 500 µl "Halt-protease" (100X), i smeša je držana na ledu. Uzorci od 50 do 70 mg jetre koji su tek odmrznuti izmereni su i isečeni na male delove, i 1ml hladnog PBS je dodat da bi se ispralo tkivo. Smeša je centrifugirana na 500g tokom 5min na 4°C, i supernatant je odbačen. Dodato je 100 µl/10 µg of T-Per antiproteaze (100X), usitnjavajući jetru sa Potter, sa 5 ili 6 uvrtanja, gore i dole. Smeša je centrifugirana na 10000 g tokom 5min na 4°C. Supernatant je uklonjen, alikvotiran i držan na -20°C za naredno merenje biomarkera. Uzorci od 10 µl su korišćeni za doziranje proteina sa BCA tehnikom, nakon razblaženja 1/10<ème>u H2O mq prateći proceduru opisanu u MOS : BAP-03-062-01 (Kit BCA - Pierce BCA protein assay kit - Pierce Thermo scientific, Ref: 23225).

[0084] Svi proteini su kvantifikovani sa ELISA Kit, prema uputstvu proizvođača:

TIMP-1: Mouse TIMP-1, R&D SYSTEMS®, Ref: TM100

TGF-β1: Quantikine Mouse/Rat/Porcine/Canine TGF-β1 immunoassay, R&D SYSTEMS®, ref: MB100B

Obrada podataka i statistička analiza

[0085] Svi parametri su analizirani korišćenjem Graphpad softvera (verzija 5.1). Parametri su analizirani kao što sledi:

- Korišćenje studentovog t testa za nezavisne uzorke za poređenje grupe 1 nasuprot gupe 4 da bi se validirao eksperiment (efekat CCl4),

- Korišćenje studentovog t testa za nezavisne uzorke za poređenje grupe 1 nasuprot grupe 2 i grupe 1 nasuprot grupe 3 da bi se istražio efekat jedinjenja A ili samog rosiglitazona,

- Korišćenje jednofaktorske ANOVA (tretman) za poređenje grupe 4 nasuprot grupa koje su tretirane jedinjenjem A (5, 6) da bi se istražio efekat jedinjenja A na CCl4-indukovanu fibrozu jetre. Kako je ANOVA bila značajna, korišćen je Dunnett test,

- Korišćenje studentovog t testa za nezavisne uzorke za poređenje grupe 4 nasuprot grupe tretirane sa rosiglitazonom (grupa 7) da bi se istražio efekat rosiglitazona na CCl4-indukovanu fibrozu jetre.

[0086] Na Slikama 1 do 7, * označava p-vrednost < 0.05; ** označava p-vrednost < 0.01; *** označava p-vrednost < 0.001.

REZULTATI

1/ Trigliceridi u plazmi

[0087] Kod CCl4-izloženih miševa, jedinjenje A (30 i 100 mg/kg/dan) značajno je smanjilo trigliceride u plazmi u poređenju sa nosačem (p<0.05 i p<0.01, respektivno) dok je rosiglitazon povećao trigliceride u plazmi bez dostizanja značajnosti (Slika 1).

2/ Deponovanje kolagena

[0088] Kod CCl4-izloženih miševa, jedinjenje A (30 i 100 mg/kg/dan) značajno je smanjilo nivoe kolagena u pređenju sa vehikulumom (-80%, p<0.01 i -89%, p<0.001, respektivno), i rosiglitazon je značajno smanjio nivoe kolagena (-54%, p<0.05) (Slika 2).

3/ TGFβ-1 ekspresija

[0089] Kod CCl4-izloženih miševa, jedinjenje A (30 i 100 mg/kg/dan) značajno je inhibiralo ekspresiju TGFβ-1 u poređenju sa vehikulumom (p<0.01 i p<0.001, respektivno) dok je rosiglitazon značajno ushodno regulisao ekspresiju TGFβ-1 (p<0.001) (Slika 3).

4/ Ekspresija kolagena tipa I, alfa I (Col1a)

[0090] Kod CCl4-izloženih miševa, jedinjenje A (30 i 100 mg/kg/dan) značajno je inhibiralo ekspresiju Colla u poređenju sa vehikulumom (p<0.05 i p<0.001, respektivno) dok je rosiglitazon ushodno regulisao ekspresiju Colla bez dostizanja značajnosti (Slika 4).

5/ α-SMA ekspresija

[0091] Kod CCl4-izloženih miševa, jedinjenje A (100 mg/kg/dan) inhibiralo je ekspresiju α-SMA u poređenju sa vehikulumom bez dostizanja značajnosti dok je rosiglitazon ushodno regulisao ekspresiju α-SMA bez dostizanja značajanosti (Slika 5).

6/ MCP-1 ekspresija

[0092] Kod CCl4-izloženih miševa, jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je inhibiralo ekspresiju MCP-1 u poređenju sa vehikulumom (p<0.05) dok rosiglitazon nije imao efekat (Slika 6).

7/ Ekspresija fibronektina

[0093] Kod CCl4-izloženih miševa, jedinjenje A (30 i 100 mg/kg/dan) značajno je inhibiralo ekspresiju fibronektina u poređenju sa vehikulumom (p<0.001) dok je rosiglitazon ushodno regulisao ekspresiju fibronektina bez dostizanja značajnosti (Slika 7).

[0094] Prethodni rezultati pokazuju da oralna primena jedinjenja A (30 ili 100 mg/kg/dan) 22 dana kod mužjaka C57BL/6J miša smanjila je CCl4-indukovanu fibrozu jetre. Dozno zavisni efekat je dobijen sa jedinjenjem i maksimalno 90% smanjenje nivoa kolagena je uočeno sa jedinjenjem A na 100 mg/kg/dan i značajno je poboljšalo većinu povezanih markera. Nasuprot tome, rosiglitazon je imao mnogo manje uočljiv efekat dok u najboljem slučaju nije imao efekat na druge markere.

Primer 2: Efekat jedinjenja A na razvoj anti-GBM indukovanog glomerulonefritisa kod miševa, i poređenje sa poznatim PPAR γ agonistima i sa poznatim ICE.

[0095] Anti-GBM (glomerularna bazalna membrana) indukovani glomerulonefritis kod miševa je uobičajeno korišćen in vivo model za procenu potencijala novih hemijskih entiteta protiv CKD). Efekat jedinjenja A, rosiglitazona i pioglitazona (poznatih PPAR γ agonista), i kaptoprila (poznatog ICE - inhibitora (angiotenzin) konvertujućeg enzima), je prikladno procenjen u takvom modelu.

[0096] Miševi su dnevno tretirani 7 dana sa jedinjenjem A na dve različite doze (30 i 100 mg/kg/dan), sa PPARγ referentnim jedinjenjima rosiglitazonom (na 3 mg/kg/dan) i pioglitazonom (na 30 mg/kg/dan), i sa referentnim ICE jedinjenjem kaptoprilom na 10 mg/kg/dan. Na kraju tretmana, životinje su žrtvovane i uzorci plazme i bubrega su sakupljeni.

Ekspresija gena za koje se zna da su uključeni u CKD je kvantifikovana nivoi paramatara bubrega u plazmi su izmereni.

[0097] Anti-GBM izloženi miševe oralno tretirani sa vehikulumom 7 dana pokazali su glomerulonefritis i fibrozu kao što je pokazano sa statistički značajnim povećanjem urinarne uree, albuminurijom, osteopontinom bubrega, MCP-1 protein nivoa bubrega, Coll i Col3 iRNK ekspresijom u poređenju sa vehikulumom. Tretman sa jedinjenjem A na 30 i 100 mg/kg/dan 7 dana smanjio je urinarnu ureu, albuminuriju, osteopontin bubrega, MCP-1 protein nivoe bubrega, Coll i Col3 iRNK ekspresiju u poređenju sa vehikulumom (sa značajnošću na 100 mg/kg/dan). Kao poređenje, kaptopril je imao efekat sličan onom kod jedinjenja A rinarnu ureu, albuminuriju, osteopontin bubrega, MCP-1 protein nivoe bubrega ali nije značajno smanjio Coll i Col3 ekspresiju; rosiglitazon i pioglitazon, međutim, značajno su povećali osteopontin bubrega i MCP-1 nivoe bubrega u poređenju sa vehikulumom.

MATERIJALI I POSTUPCI

[0098] Eksperimenti su izvedeni korišćenjem ženki C57BL/6J miševa (CERJ Janvier, route des Chênes secs, Le Genest Saint Isle - France), starosti 8-10 nedelja na početku eksperimenta. Životinje su po principu slučajnosti dodeljene u polipropilenske kutije (površina poda = 1032 cm<2>) po grupama od 3-4, na osnovu težine. Miševi su individualno obeleženi na uhu. Dozvoljeno ime je da se naviknu nedelju dana pre eksperimenta pod standardnim uslovima: sobna temepratura (22±2°C), higrometrija (55±10%), svetlo/mrak ciklus (12 č/12 č), zamena vazduha (15-20 zapremina/čas), voda i hrana (SDS, RM1) ad libitum.

[0099] Suspenzije jedinjenja A (3 mg/mL i 10 mg/mL, koje odgovaraju dozi od 30 mg/kg i 100 mg/kg, respektivno) spremne za upotrebu u vehikulumu [1% metilceluloza (METOLOSE SM400, 400Cps) 0.1% Poloxamer 188] su uskladištene na 5°C do upotrebe. Suspenzije rosiglitazona (0.3 mg/mL, koja odgovara dozi od 3 mg/kg) i spremna za upotrebu u vehikulumu su uskladištene na 5°C do upotrebe.

[0100] Suspenzije pioglitazona (3 mg/mL, koja odgovara dozi od 30 mg/kg) spremne za upotrebu u vehikulumu uskladištene su na 5°C do upotrebe.

[0101] Suspenzije kaptoprila (1 mg/mL, koja odgovara dozi od 10 mg/kg) spremne za upotrebu u vehikulumu uskladištene su na 5°C do upotrebe.

[0102] Priprema IgG antitela ovce (ab37385, Abcam) izvedena je na 4°C na ledu. Antitelo je rastvoreno u fiziološkom serumu da bi se dobio 4 mg/ml rastvor. Zasebno, kompletni Freund ađuvant (CFA) je homogenizovan sa vorteksom. 5ml špric sa luer vezom je ispunjen sa 2.5 ml CFA. Dodatnih 5ml špric sa luer vezom je ispunjen sa 2.5 ml rastvora IgG ovce. Oba šprica su povezana sa mikroemulzionom iglom vodeći računa da se uklone svi mehurići vazduha. Rastvor IgG ovce je pasažiran u CFA. Smeša između dva šprica je ponovljeno propuštana tokom 5 minuta do uočavanja uočljivog povećanja otpora. Mikroemulziona igla je zatim zamenjena sa inoks kuplerom luer ženskim / luer ženskim. Smeša između dva šprica je ponovo propuštana tokom nekoliko minuta. Površinska tenzija u vodi je zatim testirana. 1ml špricevi sa luer vezom su napunjeni, vodeći računa da se uklone mehurići vazduha. 23G igla je dodata tako da su špricevi uskladišteni na 4°C do upotrebe.

[0103] Ovčiji anti-pacovski serum glomerula (GBM) ((PTX-001S, Probetex) je uskladišten na 5 °C do upotrebe.

Doziranje

[0104] Miševi su dodeljeni u sledeće grupe:

[0105] 5 dana pre primene anti-GBM antitela, životinje su imunizovane sa potkožnom injekcijom na tri mesta (jedna iznad svakog kuka i jedna u ogoljeni deo vrata) 100 µl ovčije IgG/CFA emulzije (200 µg ovčijeg IgG/500 µg Mycobacterium tuberculosis H37Ra), pod O2/izofluran (1L/3%) anestezijom.

[0106] Na dan 0, miševma je izmerena težina i postavljeni su pod lampom za zagrevanje oko 20-30 minuta da bi se omogućila vazodilatacija repnih vena i bolja vidljivost za injekciju. Svaka životinja je zadržana u konusu za injekciju. Miševima su date intravenske injekcije od 300 µl anti-GBM antitelo seruma. Miševima je zatim oralno primenjeno jedinjenje A, rosiglitazon, pioglitazon i kaptopril, i tretman je nastavljen jednom dnevno (ujutru) dodatnih 7 dana. Miševima je izmerena težina približno svaki drugi dan.

[0107] Na dan 6 miševima je izmerena težina i preneti su u boks za diurezu gde su ostali 24 č. Gutljaji su mereni pre i posle diureze da bi se izmerila količina uzete vode. Na dan 7 miševima je izmerena težina, primili su oralni tretman i vraćeni su u njihov inicijalni boks. Urini su sakupljeni, centrifugirani, mereni i nekoliko alikvota je zamrznuto na -80°C za naknadne analize (urea, kreatinin, albumin...).

[0108] Popodne dana 7 miševi su anestezirani sa smešom O2/izoflurana (1L/3%) i izvedeno je uzorkovanje krvi, u retroorbitalnom sinusu, sa Pasterovom pipetom.400 µl cele krvi je preneto u suvu mikroepruvetu. Serumi su dobijeni nakon 30 min zgrušavanja i 2 centrifugiranja na 6000 rpm 15 minuta, na 4°C. Serumi su alikvotirani i zamrznuti na -80°C za sledeće analize (urea, kreatinin, proteini, adiponektin). Zatim, miševi su eutanazirani cervikalnom dislokacijom, i bubrezi su sakupljeni i izmereni. Izolovana je kora jednog bubrega po mišu. Mali delovi su držani za naknadnu analizu ekspresije RNK kao što je detaljno dato u nastavku. Ostatak je direktno zamrznut u tečnom azotu za sledeće analize (TGFbeta-1, OPN, MCP-1 ...). Od preostalog bubrega, polovina je stavljena u individualne histološke kasete u 10% puferovanom formalinu 24 časa za histološku analizu.

Mereni parametri

Ekspresija gena

[0109] Ekstrakcija iRNK je izvedena na malim uzorcima zamrznutih bubrega (50-100mg). Ukratko, uzorci su kriogeno usitnjeni sa avanom i tučkom. Uzorci su nakon toga homogenizovani korišćenjem mermera (2X5mn) i 1ml Qiazol lizirajućeg reagensa (Qiagen Ref 79306) u Retsch MM300 aparatu. Ekstrakcija RNK u homogenatima bubrega je finalizovana sa Qiagen Rneasy lipid Kit (Ref 74804) prema uputstvima proizvođača. Količina RNK je određena sa Nanodrop (ND2000 Thermo Scientific) i kvalitet RNK je verifikovan sa Bioanalyzer (2100 Agilent Technology).

[0110] Random-prajmovana cDNK sinteza je izvedena na 100 ng ukupne RNK korišćenjem Iscript kit (BIORAD ref 170-8891) prema uputstvima proizvođača. Real-time PCR je izveden sa 7.5 ng RNK ekvivalenata na ABI Prism 7900 Sequence Detection System (APPLIED BIOSYSTEMS) korišćenjem Iq ITaq SYBR Green Universal Rox (Ref 1725124 Biorad) i korišćenjem za to namenjenih QPCR prajmera. Za neke iRNK transkripte, kvantifikacija je izvedena korišćenjem TaqMan proba obleženih sa fluorohrom FAM i korišćenjem Universal PCR MasterMix No AmpErase UNG (APPLIED BIOSYSTEMS ref 4324020). Prajmeri korišćeni za analize su navedeni u sledećoj tabeli:

[0111] Real Time PCR je izveden na ABI PRISM 7900 aparatu. Sirovi podaci iz ABI7900 su izvezeni u tekst formatu. Analiza je izvedena u Excel, relativna količina transkripta je izračunata korišćenjem "Delta Delta CT method" (Livak et al. Methods 2001), korišćenjem Rplp0 kao housekeeping gena za normalizaciju i srednje vrednosti podataka iz netretiranih životinja (grupa sa vehikulumom) kao referentne kontrole. Svaki od RNK uzoraka je reverzno transkribovan i kvantifikovan u triplikatu.

Urin, plazma i bubrežni biomarkeri

[0112] Analize seruma i urina (urea, kreatinin, albumin, i proteini) izvedeni su sa Konelab aparatom i odgovarajućim kolorimetrijskim testovima.

[0113] Mikro-albuminurija je analizirana sa fluorescentnim kitom: Albumin Blue Fluorescent Assay (Active Motif, Ref: 15002).

[0114] Svi proteini bubrega su kvantifikovani sa ELISA Kit, prema uputstvima proizvođača: - Osteopontin: Quantikine Mouse Osteopontin immunoassay, R&D SYSTEMS®, Ref :MOST00 - MCP-1: Quantikine Mouse CCL2/JE/MCP-1 ELISA Kit, R&D SYSTEMS®, ref: MJE00

Obrada podataka i statistička analiza

[0115] Svi parametri su analizirani korišćenjem Graphpad softvera (verzija 5.1). Parametri su analizirani korišćenjem jednofaktorske ANOVA (tretman) da bi se poredile grupe (1, 2, 34, 5, 6 i 7). Kada je nađeno da je ANOVA značajna, Dunnett test je korišćen za poređenje grupe 2 sa svim drugim grupama.

[0116] Na Slikama 8 do 16, * označava p vrednost < 0.05; ** označava p vrednost < 0.01; *** označava p vrednost < 0.001.

REZULTATI

1/ Serum urea

[0117] Kod anti-GBM-izloženih miševa, jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je smanjilo nivoe uree u poređenju sa vehikulumom (p<0.01) dok je kaptopril smanjio nivo uree bez dostizanja značajnosti i oba rosiglitazon i pioglitazon povećali su nivoe uree bez dostizanja značajnosti (Slika 8).

2/ Urinarna zapremina

[0118] Kod anti-GBM-izloženih miševa, jedinjenje A (30 mg/kg/dan i 100 mg/kg/dan) smanjilo je urinarnu zapreminu u odnosu na vehikulum bez dostizanja značajnosti, dok je kaptopril takođe smanjio urinarnu zapreminu bez dostizanja značajnosti, i svaki od rosiglitazona i pioglitazona je povećao urinarnu zapreminu bez dostizanja značajnosti (Slika 9).

3/ Urinarni albumin

[0119] Kod anti-GBM-izloženih miševa, jedinjenje A (100 mg/kg/dan) smanjilo je nivoe albumina u poređenju sa vehikulumom bez dostizanja značajnosti, dok je kaptopril takođe smanjio nivoe albumina bez dostizanja značajnosti, rosiglitazon je povećao nivoe albumina bez dostizanja značajnosti, i pioglitazon je značajno povećao nivoe albumina (p<0.001) (Slika 10).

4/ Osteopontin burega

[0120] Kod anti-GBM-izloženih miševa, jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je smanjilo nivoe osteopontina u poređenju sa vehikulumom (p<0.05), dok je kaptopril takođe značajno smanjio nivoe osteopontina (p<0.05), i svaki od rosiglitazona i pioglitazona je značajno smanjio nivoe osteopontina (p<0.01 i p<0.05, respektivno) (Slika 11).

5/ MCP-1 bubrega

[0121] Kod anti-GBM-izloženih miševa, jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je smanjilo MCP-1 nivoe u poređenju sa vehikulumom (p<0.001), dok je kaptopril takođe značajno redukovao MCP-1 nivoe (p<0.01), i svaki od rosiglitazona i pioglitazona je značajno smanjio MCP-1 nivoe (p<0.05) (Slika 12).

6/ TGFβR-1 ekspresija

[0122] Kod anti-GBM-izloženih miševa, jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je inhibiralo TGFβR-1 ekspresiju u poređenju sa vehikulumom (p<0.01), dok kaptopril nije imao efekat na TGFβ-R1 ekspresiju, i svaki od rosiglitazona i pioglitazona je ushodno regulisao TGFβR-1 ekspresiju bez dostizanja značajnosti, (Slika 13).

7/ Kolagen tip I, alfa I (Colla) ekspresija

[0123] Kod anti-GBM-izloženih miševa, jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je inhibiralo Colla ekspresiju u poređenju sa vehikulumom (p<0.01), dok kaptopril nije imao efekat na Colla ekspresiju, i svaki od rosiglitazona i pioglitazona je značajno ushodno regulisao Colla ekspresiju (p<0.001) (Slika 14).

8/ Kolagen tip III, alfa I (Col3a) ekspresija

[0124] Kod anti-GBM-izloženih miševa, jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je inhibiralo Col3a ekspresiju u poređenju sa vehikulumom (p<0.001), dok kaptopril nije imao efekat na Col3a ekspresiju, rosiglitazon je značajno ushodno regulisao Col3a ekspresiju (p<0.05), i pioglitazon je ushodno regulisao Col3a ekspresiju bez dostizanja značajnosti (Slika 15).

9/ Patološki glomeruli

[0125] Kod anti-GBM-izloženih miševa, jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je smanjilo broj patoloških glomerula (p<0.001) (Slika 16).

Primer 3: Efekat jedinjenja A na razvoj bleomicin-indukovane plućne fibroze kod miševa, i poređenje sa poznatim PPAR γ agonistom

[0126] Bleomicin-indukovana plućana fibroza kod miševa je in vivo model koji se uobičajeno koristi za procenu anti-fibrotičkog potencijala novih hemijskih entiteta (Corbel et al, 2001; Manoury et al, 2006). Efekat jedinjenja A i rosiglitazona, poznatog PPAR γ agonista, je prikladno procenjen u takvom modelu. C57BL/6J miševi su izabrani za procenu efekata test jedinjenja jer su skloni razvoju ranog inflamatornog odgovora praćenog sa fibroznim remodelovanjem u plućima nakon primene bleomicina.

[0127] Miševi su dnevno oralno tretirani 15 dana sa jedinjenjem A na dve različite doze (30 i 100 mg/kg/dan) i sa rosiglitazonom na 5 mg/kg/dan. Na kraju tretmana, životinje su žrtvovane i uzorci plazme i jetre su sakupljeni. Ekspresija gena za koje se zna da su implicirani u proces plućne inflamacije su kvantifikovani i nivoi u plazmi parametara pluća su izmereni.

[0128] Bleomicin-izloženi miševi oralno tretirani sa vehikulumom 15 dana prikazivali su plućnu fibrozu kao što je pokazano statistički značajnim povećanjem u nivoima osteopontina pluća, MCP-1 pluća i TIMP-1 pluća. Tretman sa jedinjenjem A na 30 i 100 mg/kg/dan 15 dana značajno je smanjio nivoe TIMP-1 pluća u poređenju sa vehikulumom; nivoi MCP-1 pluća i osteopontina su takođe smanjeni u poređenju sa vehikulumom bez dostizanja statističke značajnosti. Nasuprot tome, kada su bleomicin-izloženi miševi oralno dnevno tretirani sa rosiglitazonom na 5 mg/kg/dan 15 dana, nivoi osteopontin pluća, MCP-1 pluća i TIMP-1 pluća su povećani u poređenju sa vehikulumom bez dostizanja statističke značajnosti

MATERIJALI I METODE

[0129] Eksperimenti su izvedeni korišćenjem 77 mužjaka C57BL/6J miševa (JANVIER LABS, C.S. 4105, Saint-Berthevin F-53941, France), težine 20-25 g na početku eksperimenta. Životinje su smeštene u grupama od 3-10 u polipropilenskim kavezima (površina poda = 1032 cm<2>) pod standardnim uslovima: sobna temepratura (22±2°C), higrometrija (55±10%), svetlo/mrak ciklus (12 č/12 č), zamena vazduha (15-20 zapremina/čas), voda i hrana (SDS, RM1) ad libitum. Miševima je dozvoljeno da se prilagode najmanje 5 dana pre eksperimenta. Miševi su numerisani obeležavanjem repa korišćenjem neizbrisivih markera.

[0130] Jedinjenje A (3 mg/mL i 10 mg/mL) i rosiglitazon (0.5 mg/mL) su formulisani u 1% metilcelulozi (METOLOSE SM400, 400Cps) 0.1% Poloxamer 188 kao suspenzije spremne za upotrebu i uskladištene na 5±3°C tokom studije. 1% metilceluloza (METOLOSE SM400, 400Cps) 0.1% Poloxamer 188 su korišćeni kao vehikulum i uskladišteni na 5±3°C tokom studije. Bleomicin (Laboratoire Bellon) je rastvoren u 0.9% NaCl (CDM Lavoisier, France) neposredno pre upotrebe.

Doziranje

[0131] Miševi su dodeljeni u sledeće grupe:

1. 0.9% NaCl vehikulum (jednom dnevno 15 dana po), n=11,

2. 0.9% NaCl jedinjenje A (100 mg/kg/dan jednom dnevno 15 dana po), n=11,

3. 0.9% NaCl rosiglitazon (5 mg/kg/dan jednom dnevno 15 dana po), n=11,

4. bleomicin (0.3 mg) vehikulum (jednom dnevno 15 dana po), n=10,

5. bleomicin (0.3 mg) jedinjenje A (30 mg/kg/dan jednom dnevno 15 dana po), n=9,

6. bleomicin (0.3 mg) jedinjenje A (100 mg/kg/dan jednom dnevno 15 dana po), n=7,

7. bleomicin (0.3 mg) rosiglitazon (5 mg/kg/dan jednom dnevno 15 dana po), n=6.

[0132] Na dan 1, miševi su anestezirani sa etomidatom (15-20 mg/kg, ip) i zatim im je intranazalno primenjen bleomicin sulfat (0.3 mg (300 IU) u 0.9% NaCl (50 µL/mišu (25 µL/nozdrvi)) ili sa 0.9% NaCl (50 µL/mišu (25 µL/nozdri)). Miševi su oralno tretirani jednom dnevno 15 dana (dan 0 do dana 14) sa vehikulumom, jedinjenjem A ili rosiglitazonom. Primena vehikuluma, jedinjenja A ili rosiglitazona na dan 1 je izvedena 6 časova pre 0.9% NaCl ili primene bleomicina. Zapremina primene test jedinjenja bila je 10 mL/kg telesne težine za oralne primene.

Terminalno uzorkovanje krvi

[0133] Na dan 14, 2 časa nakon doziranja životinje su anestezirane sa pentobarbitalom (60 mg/kg, ip) i krv je sakupljena korišćenjem srčane punkcije. Tačno vreme doziranja i vreme uzimanja uzorka je zabeleženo za svaku životinju. Uzorci krvi (0.9 mL ukupne krvi) su stavljeni u prethodno rashlađene 2-mL litijum-heparin kolektor epruvete. Uzorci krvi su nežno promešani, stavljeni na mrvljeni led i centrifugirani unutar 30 min od uzorkovanja na približno 1500 x g 10 min na približno 4°C. Za svako uzorkovanje krvi, rezultujuća plazma je razdvojena u 2 alikvote (najmanje 100 mL svaka) i preneta korišćenjem potrošnog plastičnog materijala u polipropilenske epruvete. Uzorci su odmah preneti u uspravnom položaju u frižider gde su držani na -20°C.

Uklanjanje pluća

[0134] Nakon terminalnog uzorkovanja krvi, tkivo pluća je uklonjeno:

• Prvi uzorak tkiva (srednji režanj) je sakupljen i fiksiran sa paraformaldehidom, i držan na 5±3°C.

• Drugi uzorak tkiva (desni režanj) je zamrznut u tečnom azotu i držan na - 20°C.

Mereni parametri

Kolagen

[0135] Za kvantifikaciju kolagena, preseci su obojeni sa Picro-Sirius crvenim i diferencijalnim bojenjem sa Mayer hematoksilinom. Svi preseci su digitalizovani i 5 nepreklapajućih preseka od 3 različita dela preseka su nasumično analizirani sa image J softverom (verzija 1.42, N.I.H., USA). Za sve preseke, analiza je izvedena od strane jednog izvođača striktno u istim uslovima.

Ekspresija gena

[0136] Ekstrakcija iRNK je izvedena na malim uzorcima zamrznutih pluća (50-100 mg). Ukratko, uzorci su kriogeno izmrvljeni sa tučkom i avanom. Uzorci su nakon toga homogenizovani korišćenjem mermera (2X5 mn) i 1ml Qiazol lizirajućeg reagensa (Qiagen Ref 79306) u Retsch MM300 aparatu. Ekstrakcija RNK iz homogenata pluća je finalizovana sa Qiagen Rneasy lipid Kit (Ref 74804) prateći uputstva proizvođača. Količina RNK je određena sa Nanodrop (ND2000 Thermo Scientific) i kvalitet RNK je verifikovan sa Bioanalyzer (2100 Agilent Technology).

[0137] Random-prajmovana cDNK sinteza je izvedena na 100 ng ukupne RNK korišćenjem Iscript kit (BIORAD ref 170-8891) prateći uputstva proizvođača. Real-time PCR je izveden sa 7.5 ng RNK ekvivalenata na ABI Prism 7900 Sequence Detection System (APPLIED BIOSYSTEMS) korišćenjem Iq ITaq SYBR Green Universal Rox (Ref 1725124 Biorad) i korišćenjem za to namenjenih QPCR prajmera. Za neke iRNK transkripte, kvantifikacija je izvedena korišćenjem TaqMan proba obeleženih sa fluorohormom FAM i korišćenjem Universal PCR MasterMix No AmpErase UNG (APPLIED BIOSYSTEMS ref 4324020). Prajmeri i proba korišćeni za analize su navedeni u sledećoj tabeli:

[0138] Real Time PCR je izveden na ABI PRISM 7900 aparatu. Sirovi podaci iz ABI7900 su izvezeni u tekst formatu. Analiza je izvedena u Excel, relativna količina transkripta je izračunata korišćenjem "Delta Delta CT method" (Livak et al. Methods 2001), korišćenjem Rplp0 kao housekeeping gena za normalizaciju i srednje vrednosti podataka iz netretiranih životinja (grupa sa vehikulumom) kao referentne kontrole. Svaki od RNK uzoraka je reverzno transkribovan i kvantifikovan u triplikatu.

Proteinski biomarkeri pluća

Protokol za ekstrakciju proteina pluća:

[0139] Ekstrakcija sa T-PER®: Tissue Protein Extraction Reagent, prod#78510 (lot: NG174004), Thermo Scientific sa: Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail, EDTA-free (100X) - Prod # 78425 - Lot # NL178051 Thermo Fischer.

[0140] Uzorci pluća i supernatanti su držani na ledu tokom celog eksperimenta. Za ekstrakciju, proizvođač predlaže 10mg tkiva za 100 µl T-Per 1 µl "Halt-protease" (100X).

[0141] 50 ml T-Per pufera je pripremljeno, kome je dodato 500 µl of "Halt-protease" (100X), i smeša je držana na ledu. Uzorci od 50 do 70 mg pluća koji su upravo odmrznuti su izmereni i isečeni u male komade, i 1ml hladnog PBS je dodat za ispiranje tkiva. Smeša je centrifugirana na 500g tokom 5min na 4°C, i supernatant je odbačen. Dodato je 100 µl/10 mg T-Per antiproteaze (100X), usitnjavajući pluća sa Potter, sa 5 ili 6 uvrtanja, gore i dole. Smeša je centrifugirana na 10000 g tokom 5min na 4°C. Supernatant je uklonjen, alikvotiran i držan na -20°C za naknadno merenje biomarkera. Uzorci od 10 ml su korišćeni za doziranje proteina sa BCA tehnikom, nakon razblaženja 1/10<ème>u H2O mq prateći proceudu opisanu u MOS : BAP-03-062-01 (Kit BCA - Pierce BCA protein assay kit - Pierce Thermo scientific, Ref: 23225).

[0142] Svi proteini su kvantifikovani sa ELISA Kit, prema uputstvima proizvođača:

- osteopontin: Quantikine Mouse Osteopontin immunoassay, R&D SYSTEMS®, Ref :MOST00 - MCP-1: Quantikine Mouse CCL2/JE/MCP-1 ELISA Kit, R&D SYSTEMS®, ref: MJE00 - TIMP-1: Mouse TIMP-1, R&D SYSTEMS®, Ref: TM100.

Obrada podataka i statistička analiza

[0143] Svi parametri su analizirani korišćenjem Graphpad softvera (verzija 5.1). Parametri su analizirani kao što sledi:

- Korišćenjem jednofaktorske ANOVA (tretman) za poređenje grupa (1, 2 i 3). Kada je nađeno da je ANOVA značajna, Dunnett test je korišćen za poređenje grupe 1 sa grupom 2 i sa grupom 3.

- Korišćenje jednofaktorske ANOVA (tretman) za poređenje grupa (1, 4, 5, 6 i 7). Kada je nađeno da je ANOVA značajna, Dunnett test je korišćen za poređenje grupe 1 sa grupom 4, sa grupom 5, sa grupom 6 i sa grupom 7).

[0144] Na Slikama 17 do 27, * označava p-vrednost < 0.05; ** označava p-vrednost <0.01; *** označava p-vrednost < 0.001.

REZULTATI

1/ Deponovanje kolagena

[0145] Kod bleomicin-izloženih miševa jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je smanjilo nivoe deponovanog kolagena u poređenju sa vehikulumom (p<0.05). Rosiglitazon je takođe značajno smanjio nivoe kolagena (p<0.05) (Slika 17).

2/ TIMP-1 puća

[0146] Kod bleomicin-izloženih miševa jedinjenje A (30 mg/kg/dan i 100 mg/kg/dan) značajno je smanjilo TIMP-1 nivoe u poređenju sa vehikulumom (p<0.05) dok je rosiglitazon povećao TIMP-1 nivoe bez dostizanja značajnosti (Slika 18).

3/ MCP-1 pluća

[0147] Kod bleomicin-izloženih miševa jedinjenje A (30 mg/kg/dan i 100 mg/kg/dan) je smanjilo MCP-1 nivoe u poređenju sa vehikulumom bez dostizanja značajnosti dok je rosiglitazon povećao MCP-1 nivoe bez dostizanja značajnosti (Slika 19).

4/ Osteopontin pluća

[0148] Kod bleomicin-izloženih miševa jedinjenje A (30 mg/kg/dan i 100 mg/kg/dan) je smanjilo nivoe osteopontina u poređenju sa vehikulumom bez dostizanja značajnosti dok je rosiglitazon povećao nivoe osteopontina bez dostizanja značajnosti (Slika 20).

5/ TGFβR-1 ekspresija

[0149] Kod bleomicin-izloženih miševa jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je inhibiralo TGFβR-1 ekspresiju u poređenju sa vehikulumom (p<0.05). Rosiglitazon je takođe značajno inhibirao TGFβ-1 ekspresiju (p<0.05) (Slika 21).

6/ Kolagen tip I, alfa I (Colla) ekspresija

[0150] Kod bleomicin-izloženih miševa jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je inhibirao Colla ekspresiju u poređenju sa vehikulumom (p<0.001) dok je rosiglitazon ushodno regulisao Colla ekspresiju bez dostizanja značajnosti (Slika 22).

7/ Kolagen tipa III, alfa I (Col3a) ekspresija

[0151] Kod bleomicin-izloženih miševa jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je inhibiralo Col3a ekspresiju u poređenju sa vehikulumom (p<0.001) dok je rosiglitazon inhibirao Col3a ekspresiju bez dostizanja značajnosti (Slika 23).

8/ TIMP-1 ekspresija

[0152] Kod bleomicin-izloženih miševa jedinjenje A (30 mg/kg/dan i 100 mg/kg/dan) smanjilo je TIMP-1 ekspresiju u poređenju sa vehikulumom bez dostizanja značajnosti dok je rosiglitazon značajno ushodno regulisao TIMP-1 ekspresiju (p<0.05) (Slika 24).

9/ MCP-1 ekspresija

[0153] Kod bleomicin-izloženih miševa jedinjenje A (30 mg/kg/dan i 100 mg/kg/dan) je inhibiralo MCP-1 ekspresiju u poređenju sa vehikulumom bez dostizanja značajnosti dok je rosiglitazon ushodno regulisao TIMP-1 ekspresiju bez dostizanja značajnosti (Slika 25).

10/ Ekspesija osteopontina

[0154] Kod bleomicin-izloženih miševa jedinjenje A (30 mg/kg/dan i 100 mg/kg/dan) značajno je inhibiralo ekspresiju osteopontina u poređenju sa vehikulumom (p<0.05) dok rosiglitazon nije imao efekat na osteopontin (Slika 26).

11/ Ekspresija fibronektina

[0155] Kod bleomicin-izloženih miševa jedinjenje A (100 mg/kg/dan) značajno je inhibralo ekspresiju u poređenju sa vehikulumom (p<0.05) dok je rosiglitazon ushodno regulisao ekspresiju fibronektina bez dostizanja značajnosti (Slika 27).

[0156] Prethodni rezultati pokazuju da je oralna primena jedinjenja A (30 ili 100 mg/kg/dan) u mužjacima C57BL/6J miševa smanjila povećanje nivoa inflamatornih/fibroznih biomarkera indukovanih sa uvođenjem bleomicina u pluća dok rosiglitazon nije imao efekat, ili je čak imao štetan efekat na ove biomarkere. Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da je jedinjenje A smanjilo bleomicin-indukovanu plućnu fibrozu kod miševa.

Primer 4: Efekat jedinjenja A na razvoj bleomicin-indukovane fibroze kože kod miševa, i poređenje sa poznatim PPAR γ agonistom

[0157] Jedinjenje A je testirano u mišjem modelu bleomicin-indukovane fibroze kože. Miševi su dnevno oralno tretirani 21 dan sa jedinjenjem A na dve različite doze (30 i 100 mg/kg/dan) i sa PPARγ referentnim jedinjenjem rosiglitazonom na 5 mg/kg/dan. Na kraju tretmana, životinje su žrtvovane i uzeti su uzorci kože. Ekspresija gena za koje se zna da su uključeni u put sistemske fibroze su kvantifikovani i određena je dermalna debljina i sadržaj kolagena.

[0158] Bleomicin-izloženi miševi oralno tretirani sa vehikulumom 21 dan pokazali su fibrozu kože kao što je pokazano sa statistički značajnim povećanjem dermalne debljine i sadržajem kolagena. Tretman sa jedinjenjem A na 30 i 100 mg/kg/dan 21 dan značajno je smanjio dermalnu debljinu i sadržaj kolagena u poređenju sa vehikulumom. Sličan efekat je uočen kod bleomicinizloženih miševa oralno dnevno tretiranih sa rosiglitazonom na 5 mg/kg/dan 21 dan, iako je efekat bio manje uočljiv u odnosu na debljinu kože.

MATERIJALI I POSTUPCI

[0159] Eksperimenti su izvedeni na 6-nedelja starim mužjacima C56BL/6 miševa (Janvier, Le Genest-Saint-Isle, France). Životinje su smeštene u grupama od 3-10 u polipropilenskim kavezima (površina poda = 1032 cm<2>) pod standardnim uslovima: sobna temperatura (22±2°C), higrometrija (55±10%), svetlo/mrak ciklus (12 č/12 č), zamena vazduha (15-20 zapremina/čas), voda i hrana (SDS, RM1) ad libitum. Miševima je dozvoljeno da se naviknu najmanje 5 dana pre eksperimentisanja. Miševi su numerisani obeležavanjem njihovog repa korišćenjem neizbrisivih markera.

[0160] Jedinjenje A (3 mg/mL i 10 mg/mL) i rosiglitazon (0.5 mg/mL) su formulisani u 1% metilcelulozi (METOLOSE SM400, 400Cps) 0.1% Poloxamer 188 kao suspenzije spremne za upotrebu i uskladištene na 5±3°C tokom studije. 1% metilceluloza (METOLOSE SM400, 400Cps) 0.1% Poloxamer 188 su korišćeni kao vehikulum i uskladišteni na 5±3°C tokom studije.

Doziranje

[0161] Miševi su dodeljeni u sledeće grupe:

1. 0.9% NaCl vehikulum (jednom dnevno 21 dana po), n=7,

2. 0.9% NaCl jedinjenje A (100 mg/kg/dan jednom dnevno 21 dana po), n=8, 3.

0.9% NaCl jedinjenje A (30 mg/kg/dan jednom dnevno 21 dana po), n=8,

4. bleomicin (0.3 mg) rosiglitazon (5 mg/kg/dan jednom dnevno 21 dana po), n=8,

5. bleomicin (0.3 mg) vehikulum (jednom dnevno 21 dana po), n=6,

6. bleomicin (0.3 mg) jedinjenje A (100 mg/kg/dan jednom dnevno 21 dana po), n=7,

7. bleomicin (0.3 mg) jedinjenje A (30 mg/kg/dan jednom dnevno 21 dana po), n=7.

[0162] Fibroza kože je indukovana dnevnim injekcijama bleomicina (100 µL bleomicina (Laboratoire Bellon, France) razblaženog u 0.9 % NaCl (CDM Lavoisier, France) na koncentraciji od 0.5 mg/ml, primenjenoj 6 dana/nedeljno u definisanu površinu od 1 cm<2>na gornjem delu leđa).0.9% NaCl je korišćen kao kontrola (100 µL potkožne injekcije).

[0163] Miševi su oralno tretirani jednom dnevno 21 dan sa vehikulumom, jedinjenjem A ili rosiglitazonom. Primena vehikuluma, jedinjenja A ili rosiglitazona na dan 1 je izvedena 4 časa pre primene 0.9% NaCl ili bleomicina.

Uzorkovanje kože

[0164] Na dan 21, miševi su žrtvovani cervikalnom dislokacijom, i uzorci kože su uzeti i obrađeni za analizu.

Mereni parametri:

Debljina dermalnog i adipoznog sloja

[0165] Površine sa lezijama kože su isečene, fiksirane u 4% formalinu i ukalupljene u parafin. Preseci debljine pet mm su obojeni sa hematoksilinom i eozinom. Dermalna debljina je analizirana na uveličanju od 100-puta merenjem razdaljine između spoja epidermisa-dermisa i spoja dermis-potkožna mast na četiri mesta od kože sa lezijom svakog miša. Dva nezavisna ispitivača izvela su procenu pre konsnzusa u slučaju od više od 10% varijabilnosti mera.

Sadržaj kolagena u koži

Hidroksiprolin analiza

[0166] Sadržaj kolagena u koži sa lezijom je istraživan sa hidroksiprolin analizom. Nakon digestije ubodnih biopsija (Ø 3mm) u 6M HCl tri časa na 120 °C, pH uzoraka je podešena na 7 sa 6M NaOH. Nakon toga, uzorci su pomešani sa 0.06 M hloramin T i inkubirani 20 min na sobnoj temepraturi. Sledeće, dodati su 3.15M perhlorna kiselina i 20% pdimetilaminobenzaldehid i uzorci su inkubirani dodatnih 20 min na 60°C. Apsorbanca je određena na 557 nm sa Spectra MAX 190 spektrofotometrom za mikroploče (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Sircol analiza

[0167] Ukupni rastvorljivi kolagen u supernatantima ćelijske kulture je kvantifikovan korišćenjem Sircol kolagen analize (Biocolor). Ukratko, supernatant ćelijske kulture je mešan sa sirius red bojom 30 minuta na sobnoj temepraturi. Nakon centrifugiranja, pelet je rastvoren u alkalnom reagensu. Merenje je izvedeno korišćenjem SpectraMax 190 spektrofotometra za mikroploče (Molecular Devices) na talsnoj dužini od 540 nm.

Obrada podataka i statistička analiza

[0168] Podaci su izraženi kao ± standardna greška srednje vrednosti. Student t-test je korišćen za statističke analize. p vrednost manja od 0.05 smatrana je statistički značajnim rezultatom.

[0169] Na Slikama 28 do 30 * označava p-vrednost ≤0.05; ** označava p-vrednost <0.01; *** označava p-vrednost <0.001.

REZULTATI

[0170] Injekcija bleomicina na miševe rezultovala je u povećanju dermalne debljine u poređenju sa miševima koji primali NaCl (videti Slika 28: povećanje od 57% u grupi bleomicin vehikulum u poređenju sa grupom NaCl vehikulum). Rosiglitazon i jedinjenje A (30 mg/kg) značajno su smanjili dermalnu debljinu kod bleomicin-izloženih miševa u poređenju sa vehikulumom (p≤0.05). Jedinjenje A (100 mg/kg) je značajnije smanjilo dermalnu debljinu kod bleomicin-izloženih miševa u poređenju sa vehikulumom (p<0.001).

[0171] Konzistentno sa smanjenom dermalnom debljinom, sadržaj hidroksiprolina u koži sa lezijom miševa tretiranih sa jedinjenjem A (30 i 100 mg/kg) i rosiglitazonom bio je značajno niži nego u koži sa lezijama miševa tretiranih sa vehikulumom, pri čemu je jedinjenje A (30 mg/kg) bilo efikasnije od rosiglitazona (Slika 29).

[0172] Jedinjenje A (30 i 100 mg/kg) i rosiglitazon su takođe značajno smanjili sadržaj kolagena u poređenju sa vehikulumom (Slika 30).

[0173] Zajedno rezultati pokazuju da jedinjenje A je efikasno u prevenciji fibroze kože. Jedinjenje A (100 mg/kg) čak daje bolje efekte na dermalnu debljinu u poređenju sa rosiglitazonom.

Primer 5: aktivacija humanih i mišjih PPAR receptora sa jedinjenjem A

[0174] Sposobnost jedinjenja A da aktivira sva tri podtipa PPAR receptora određeno je analizama prolazne transaktivacije. Ove ćelijski zasnovane analize su izvedene korišćenjem Cos-7 ćelija transfektovanih sa himernim humanim ili mišjim PPARα-Gal4 receptor ekspresionim plazmidom (ili PPARδ-Gal4, ili PPARy-Gal4) i 5Gal4 pGL3 TK Luc reporter plazmidom. Trasfekcije su izvedene hemijskim sredstvom (Jet PEI). Transfektovane ćelije su raspoređene u ploče sa 384-bunarčića i dozvoljeno je da se oporave 24 č. Medijum kulture je zatim uklonjen i dodat je svež medijum koji sadrži jedinjenje koje se testira (5 µM) (finalna koncentracija u opsegu od 10<-4>M do 3 10<-10>M). Nakon inkubacije preko noći, ekspresija luciferaze je merena dodavanjem SteadyGlo u skladu sa uputstvima proizvođača (Promega). Fenofibrinska kiselina na 10<-5>M, GW501516 na 10<-8>M, i Rosiglitazon na 10<-6>M korišćeni su kao referentne vrednosti. Rezultati su eksprimirani kao procenat aktivnosti u poređenju sa referentnim vrednostima (fenofibrinska kiselina za PPARα, rosiglitazon za PPARγ, i GW501516 za PPARδ) uzeti kao 100%. Za humane receptore, rezultati su srednje vrednosti 6 eksperimenata, svaki u kvadriplikatu. Za mišje receptore, rezultati su srednja vrednost od 5 (PPARδ) ili 6 (PPARα i γ) eksperimenata, svaki u kvadriplikatu. Kriva doza-efekat i EC50su izračunate korišćenjem softvera Assay Explorer (MDL). Rezultati su predstavljeni u tabeli u nastavku i na Slikama 31 i 32.

* r n n l ni i n

[0175] Ovi rezultati pokazuju da jedinjenje A aktivira sva tri podtipa PPAR receptora sa EC50od manje od 1 µM za svaki podtip. Dalje se može videti da jedinjenje A ima uravnoteženu aktivnost između tri podtipa PPAR receptora.

[0176] Sveukupno, rezultati Primera 1-5 sugerišu da je neophodna dobra PPARδ agonistička aktivnost zajedno sa PPARα i PPARγ agonistčkim aktivnostima da bi se dobio pan-antifibrozni efekat.

Primer 6: efekat jedinjenja A na proliferaciju plućnih i dermalnih fibroblasta, i poređenje sa poznatim PPAR γ i PPAR α agonistima

[0177] Određena je sposobnost jedinjenja A da inhibira PDGF-indukuju proliferacije plućnih i dermalnih fibroblasta putem izvođenja analiza inkorporacije EdU (5-etinil-2’-dezoksiuridin). Ove analize su izvedene korišćenjem primarnih fibroblasta humanih pluća ili fibroblasta kože (Promocell). Ćelije su postavljene na ploče sa 96-bunarčića u punom medijumu za rast 24 č, praćeno sa 24 č gladovanjem u medijumu bez seruma. Medijum je zatim zamenjen sa svežim medijumom koji sadrži PDGF i jedinjenje A koje se testira (na koncentracijama u opsegu od 10<-4>M do 4.5 10<-8>M) dodatna 24 č. EdU je dodat ćelijama zadnjih 16 č tretmana jedinjenjem. Medijum kulture je zatim uklonjen, ćelije su fiksirane sa formaldehidom i EdU inkorporisan u DNK ćelija koje se dele je kvantifikovan korišćenjem fluorescentnog Click-it testa u skladu sa uputstvima proizvođača (Invitrogen). Fenofibrinska kiselina na koncentracijama u opsegu od 3 10<-4>M do 1.410<-7>M (PPARα) i Rosiglitazon na koncentracijama u opsegu od 310<-5>M do 1.4 10<-8>M (PPARγ) korišćeni su kao reference. Rezultati su izraženi kao % EdU-pozitivnih ćelija od ukupnog broja ćelija. Rezultati predstavljaju srednju vrednost bioloških triplikata. Krive dozaefekat i IC50vrednosti su izračunate korišćenjem softvera GraphPad Prism. Rezutlati su predstavljeni u tabeli u nastavku i na Slikama 33 i 34.

Primer 7: efekat jedinjenja A na prelazak plućnih i dermalnih fibroblasta u miofibroblaste, i poređenje sa poznatim PPAR γ i PPAR α agonistima

[0178] Sposobnost jedinjenja A da inhibira TGFβ-indukovani prelazak plućnih i dermalnih fibroblasta u miofibroblaste (FMT) određena je izvođenjem imunocitohemijskih analiza za marker miofibroblasta, aktin α-glatkog mišića (a-SMA). Ove analize su izvedene korišćenjem primarnih fibroblasta humanih pluća ili kože (Promocell). Ćelije su postavljene na ploče sa 96-bunarčića u punom medijumu za rast 24 č, praćeno sa 24 č gladovanja u medijumu bez seruma. Medijum je zatim zamenjen sa svežim medijumom koji sadrži TGFβ i jedinjenje A koje se testira (na koncentracijama u opsegu od 10<-4>M do 4.510<-8>M) dodatnih 48 č. Medijum kulture je zatim uklonjen, ćelije su fiksirane sa formaldehidom i obojene sa primarnim mišjim α-SMA antitelom (Sigma) i sekundarnim fluorescentno obeleženim kozjim-anti-mišjim antitelom (Invitrogen). α-SMA ekspresija je kvantifikovana korišćenjem Meta Xpress softvera. Fenofibrinska kiselina na koncentracijama u opsegu od 310<-4>M do 1.410<-7>M (PPARα) i Rosiglitazon na koncentracijama u opsegu od 310<-5>M do 1.4 10<-8>M (PPARγ) su korišćeni kao reference. Rezultati su izraženi kao % α-SMA-pozitivnih želija od ukupnog broja ćelija. Podaci su normalizovani na sam TGFβ tretman, koji je uzet kao 100%. Rezutlati predstavljaju srednju vrednost bioloških triplikata. Krive doza-efekat i IC50vrednosti su izračunate korišćenjem GraphPad Prism softvera. Rezultati su prikazani u tabeli u nastavku i na Slikama 35 i 36.

[0179] Zajedno, ovi in vitro funkcionalni podaci pokazuju da jedinjenje A efikasno inhibira PDGF-indukovanu proliferaciju i TGFβ-indukovanu miofibroblast tranziciju kod primarnih humanih plućnih i dermalnih fibroblasta, čime se obezbeđuje veza sa anti-fibroznim efektima uočenim in vivo. Dodatno, ovi rezultati sugerišu da pan-PPAR agonizam može biti superioran u odnosu na individualnu PPAR aktivaciju u njegovim anti-fibroznim efektima u target ćelijama na dva ključna puta fibrogeneze.

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Pan-PPAR agonist za upotrebu u postupku tretmana fibroznog stanja, naznačeno time da pomenuti pan-PPAR agonist je 5- hloro-1-[(6-benzotiazolil)sulfonil]-1H-indol-2-buterna kiselina.

2. Agonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da je fibrozno stanje stanje koje pogađa bilo koji organ koji može razviti fibrozu, kao što su srce, pluća, jetra, bubreg, gastrointestinalni trakt, koža.

3. Agonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time da fibrozno stanje je izabrano od: fibroze jetre, bolesti masne jetre, ne-alkoholnog steatohepatitisa, hronične bolesti bubrega, plućnog fibroznog poremećaja, sistemske skleroderme.

4. Agonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time da fibrozno stanje je plućni fibrozni poremećaj.

5. Agonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time da plućni fibrozni poremećaj je idiopatska plućana fibroza.

6. Agonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time da je fibrozni poremećaj sistemska skleorderma.

7. Agonist za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time da pomenuti agonist je nameravan za oralnu primenu.

8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži pan-PPAR agonist za upotrebu u postupku tretiranja fibroznog stanja, naznačeno time da pan-PPAR-agonist je 5-hloro-1-[(6-benzotiazolil)sulfonil]-1H-indol-2-buterna kiselina.

9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačeno time da fibrozno stanje je stanje koje pogađa bilo koji organ koji može razviti fibrozu, kao što su srce, pluća, jetra, bubreg, gastrointestinalni trakt, koža.

10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, naznačeno time da je fibrozno stanje izabrano od: fibroze jetre, bolesti masne jetre, ne-alkoholnog steatohepatitisa, hronične bolesti bubrega, plućnog fibroznog poremećaja, sistemske skleroderme.

11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačeno time da je fibrozno stanje plućno fibrozno stanje.

12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačeno time da je plućni fibrozni poremećaj idiopatska plućna fibroza.

13. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačeno time da je fibrozni poremećaj sistemska skleroderma.

14. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 13, koja je kompozicija za oralnu, parenteralnu, topikalnu, primenu inhalacijom ili intranazalnu primenu.