RS59444B1

RS59444B1 - Spirociklični inhibitori katepsina c

Info

Publication number: RS59444B1
Authority: RS
Inventors: Viktor Vintonyak; Matthias Grauert; Marc Grundl; Alexander Pautsch
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 2014-09-12
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2019-11-29
Also published as: IL250262A0; MY188382A; CO2017002268A2; PH12017500453A1; CN108047240B; AP2017009733A0; DK3191487T3; EP3191487A1; ES2749009T3; EA201790576A1; USRE47636E1; CN107074870B; NZ728684A; US9540373B2; CY1123033T1; CL2017000432A1; MX2017003156A; EP3511331A1; EA031376B1; AU2015314355B2

Description

OBLAST PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi njedinjenje sa formulom I

naznačeno time da A i Cy imaju jedno od značenja kao što je naznačeno u specifikaciji i na njihovu upotrebu kao inhibitora katepsina C, farmaceutske kompozicije koje sadrže isto kao i postupak i upotrebu istog kao sredstva za lečenje i/ili sprečavanje bolesti povezanih sa aktivnostima dipeptidil peptidaze I, na pr. bolesti disajnih organa.

STANJE TEHNIKE

• WO2004110988 opisuje peptidil nitrilne inhibitore kao inhibitore dipeptidil-peptidaze I (DPPI) za lečenje niza bolesti.

• WO2009074829 i WO2010142985 takođe opisuju peptidil nitrilne inhibitore kao inhibitore dipeptidil-peptidaze I (DPPI) za lečenje astme, COPB ili alergijskog rinitisa.

• WO2013041497 opisuje supstituisane N-[l-cijano-2-(fenil)etil]-2-azabiciklo[2.2.1]heptan-3-karboksamide kao inhibitore dipeptidil-peptidaze I (DPPI) za lečenje na pr. bolesti disajnih organa.

KRATAK OPIS PRONALASKA

Dipeptidil-aminopeptidaza I (DPPI ili Katepsin C; EC3.4.141), je lizozomalna cisteinska proteaza sposobna da uklanja dipeptide sa amino kraja proteinskih supstrata. DPPI su prvi otkrili Gutman i Fruton 1948. godine (J. Biol. Chem 174: 851-858, 1948). cDNK iz humanog enzima opisana je 1995. (Paris et al .; FEBS Lett 369: 326-330, 1995). DPPI protein se procesira u zreli proteolitički aktivni enzim koji se sastoji od teškog lanca, lakog lanca i propeptida koji ostaje povezan sa aktivnim enzimom (Volters et al; J. Biol. Chem.273:

15514-15520, 1998). Dok su ostali cistein katepsini (na pr. B, H, K, L i S) monomeri, DPPI je 200-kD tetramer sa 4 identične podjedinice, a svaka je sastavljena od 3 različita lanca polipeptida. DPPI se konstitutivno eksprimira u mnogim tkivima sa najvišim nivoom u plućima, bubrezima, jetri i slezini (Kominami et al; Biol. Chem. Hoppe Seiler 373: 367-373, 1992). U skladu sa svojom ulogom u aktiviranju serinskih proteaza iz hematopoetskih ćelija, DPPI je takođe relativno vizoko eksprimirana u neutrofilima, citotoksičnim limfocitima, prirodnim ćelijama ubicama, alveolarnim makrofagama i mastocitima. Nedavni podaci rada na DPPI deficijentnim miševima ukazuju na do da, osim što je važan enzim u razgradnji lizozomalnog proteina, DPPI deluje i kao ključni enzim u aktivaciji granularnih serin proteaza u citotoksičnim T limfocitima i prirodnim ćelijama ubicama (granzimi A i B; Pham et al.; Proc. Nat. Acad. Sci.96: 8627-8632, 1999), mastocitima (himaza i triptaza; Wolter et al; J Biol. Chem.276: 18551-18556, 2001) i neutrofilima (Katepsin G, elastaza i proteinaza 3; Adkizon et al; J Clin. Invest. 109: 363.371, 2002). Jednom aktivirane, ove proteaze su sposobne da razgrade različite komponente vanćelijskog matriksa, što može dovesti do oštećenja tkiva i hronične upale.

Prema tome, inhibitori katepsina C mogu biti korisni terapeutici za lečenje upalnih bolesti dominirajućih neutrofila, kao što su hronična opstruktivna plućna bolest (COPB), plućni emfizem, astma, multipla skleroza i cistična fibroza (Guay et al; Curr. Topics Med Chem.10: 708-716, 2010; Laine i Busch-Petersen; Expert Opin. Ther. Patents 20: 497-506, 2010). Reumatoidni artritis je takođe druga hronična inflamatorna bolest u kojoj DPPI izgleda da ima ulogu. Neutrofili se regrutuju na mesto upale zglobova i oslobađaju Katepsin G, elastazu i proteinazu 3, proteaze za koje se veruje da su odgovorne za uništavanje hrskavice povezano sa reumatoidnim artritizom. Zaista, miševi sa nedostatkom DPPI bili su zaštićeni od akutnog artritisa indukovanog pasivnim prenosom monoklonskih antitela protiv kolagena tipa II (Adkizon et al .; J Clin. Invest. 109: 363.371, 2002).

U svetlu uloge koju DPPI igra u aktiviranju određenih proinflamatornih serinskih proteaza, problem iz ovog pronalaska je da se pripreme jedinjenja koja inhibiraju njegovu aktivnost, koja na taj način inhibiraju aktivnost serinske proteaze.

Iznenađujuće je utvrđeno da spirociklična jedinjenja iz ovog pronalaska poseduju

• snažnu katepsin C (DPPI) aktivnost, koja poželjno pokazuje inhibiciju DPPI IC50[PM] < 0.0050, posebno poželjno < 0.0030,

Štaviše, jedinjenja iz iz ovog pronalaska pokazuju sledeće kapacitete koji su povoljni za njihovu farmakološku efikasnost:

• vizoku ćelijsku aktivnost, na pr. inhibiciju procesiranja neutrofilne elastaze u ćelijskoj liniji U937, poželjno pokazuje IC50 [PM] <0.5, naročito poželjno <0,003.

• vizoku selektivnost u odnosu na ostale katepsine, na pr. Katepsin K i

• generalno poželjna farmakokinetička svojstva, na pr. metabolička stabilnost, poželjno pokazuje u vitro stabilnost u mikrozomnim inkubacijama jetre čoveka t l/2 [min] >110, posebno poželjno >120.

Takođe je iznenađujuće otkriveno da jedinjenja iz predmetnog pronalaska pokazuju vizoku inhibiciju aktivnosti neutrofilne elastaze u BALF ćelijskom lizatu (bronhoalveolarna ispirajuća tečnost) u ciljnom angažovanom modelu na miševima.

Štaviše, iznenađujuće je utvrđeno da spirociklična jedinjenja iz iz ovog pronalaska formiraju dodatni solni most ka Glu275 katepsinu C što dovodi do velike enzimske i ćelijske aktivnosti ove klase jedinjenja. Ova dodatna interakcija spirocikličkog amina (na pr. spiro-azetidin u Primeru 11 i spiro-pirolidin u Primeru 16) verifikovana je eksperimentima ko-kristalizacije proteina Katepsin C sa primerima 11 i 16. U oba slučaja osnovni atom azota formira solni most do Glu275.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Iznenađujuće je utvrđeno da je gore pomenuti problem rešen jedinjenjem sa formulom I iz ovog pronalaska.

Predmetni pronalazak se prema tome odnosi na jedinjenje sa formulom I ili njegovu farmaceutsku prihvatljivu so,

gde

Cy je

gde

W je izabran iz grupe koju čine CH i N;

X je izabran iz grupe koju čine CH i N;

Y je izabran iz grupe koju čine CH i N;

pod uslovom da najviše jedan od W, X i Y može biti N;

D-E je izabran iz grupe koju čine N(R<2>)-C(O), CH2CH2, C(O)-O i CH2-O;

R<2>je izabran iz grupe koju čine H i C1-3-alkil;

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, C1-3-alkil, CH3OCH2CH2-, oksetanil, tetrahidrofuranil, 4-tetrahidropiranil i 3-tetrahidropiranil; i je 1, 2 ili 3;

j je 1, 2 ili 3;

pod uslovom da suma od i+j je 2, 3 ili 4.

POŽELJNA IZVOĈENJA

Posebno poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde

Cy je

Poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde

Cy je

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3- i oksetanil;

R<2>je izabran iz grupe koju čine H i CH3;

R<2>je H.

R<2>je CH3;

D-E je CH2-O

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3i oksetanil;

R<2>je CH3;

W je izabran iz grupe koju čine CH i N;

X je izabran iz grupe koju čine CH i N;

Y je izabran iz grupe koju čine CH;

pod uslovom da najviše jedan od W, X i Y može biti N;

D-E je izabran iz grupe koju čine N(R<2>)-C(O), CH2CH2, C(O)-O i CH2-O;

i je 1 ili 2;

j je 1 ili 2;

pod uslovom da suma od i+j je 2, 3 ili 4.

A je izabran iz grupe koju čine formule Al do A14:

A je izabran iz grupe koju čine A2, A3, A4, A5, A6, A7, A10, A13, i A14.

A je izabran iz grupe koju čine A2 i A13

A je grupa sa formulom A2.1.

A2.1

A je grupa sa formulom A13.1

A13.1

Poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulomI, izabran iz grupe koju čine primeri 1, 5, 8, 10, 12, 13, 14, 19, 22, 23, 24, 25 i 27.

1

R<1>je izabran iz grupe koju čine H i CH3.

R<1>je oksetanil.

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3i oksetanil;

R<2>je izabran iz grupe koju čine H i CH3-.

R<1>je izabran iz grupe koju čine H i CH3;

R<2>je izabran iz grupe koju čine H i CH3.

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2- O, C(O)- O i N(R<2>)-C(O).

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2-O i C(O)-O.

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3i oksetanil;

R<2>je izabran iz grupe koju čine H i CH3.

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2-O, C(O)-O i N(R2)-C(O).

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3, oksetanil;

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2-O i C(O)- O.

R<1>je izabran iz grupe koju čine oksetanil;

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2- O i C(O)- O.

W je CH;

1

X je CH;

Y je CH.

W je CH;

X je N;

Y je CH.

W je N;

X je CH;

Y je CH.

W je CH;

X je CH;

Y je N.

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3- i oksetanil;

R<2>je izabran iz grupe koju čine H i CH3-;

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2-O, C(O)-O i N(R2)-C(O);

W je CH;

X je CH;

Y je CH.

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3- i oksetanil;

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2-O i C(O)-O;

W je CH;

X je CH;

Y je CH.

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3- i oksetanil;

R<2>je izabran iz grupe koju čine H i CH3-;

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2-O, C(O)-O i N(R2)-C(O);

W je N;

X je CH;

Y je CH.

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3- i oksetanil;

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2-O i C(O)-O;

W je N;

X je CH;

Y je CH.

1

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3- i oksetanil;

R<2>je izabran iz grupe koju čine H i CH3-;

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2-O, C(O)-O i N(R2)-C(O);

W je CH;

X je N;

Y je CH.

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3- i oksetanil;

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2-O i C(O)-O;

W je CH;

X je N;

Y je CH.

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3- i oksetanil;

R<2>je izabran iz grupe koju čine H i CH3-;

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2-O, C(O)-O i N(R2)-C(O);

W je CH;

X je CH;

Y je N.

1

R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3- i oksetanil;

D-E je izabran iz grupe koju čine CH2-O i C(O)-O;

W je CH;

X je CH;

Y je N.

Posebno poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde A je izabran iz grupe koju čine A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, Al1, A12, A13 i A14.

Posebno poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gdeA je izabran iz grupe koju čine Al, A2, A3, A4, A6, A7, A9, A10, A13 i A14.

Posebno poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde A je izabran od A4, A5, A6, A7 A8, A9 i A14.

Posebno poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde A je izabran iz grupe koju čine A10, Al 1 i A12.

Posebno poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde A je izabran iz grupe koju čine A2, A3, A9, A13 i A14.

Posebno poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde A je izabran iz grupe koju čine A2, A3 i A13.

Posebno poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde A je A2.

Posebno poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde A je A13.

Poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde i je 2 i j je 1.

1

Poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde i je 1 i j je 1.

Posebno poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde i je 2 i j je 2.

Posebno poželjna su gore navedena jedinjenja sa formulom I, gde su jedinjenja odabrana iz grupe koju čine primeri 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26 i 27.

Bilo koja i svaka od definicija za R<1>, R<2>, Cy, A, D, E, W, X, Y, i i j mogu se kombinovati jedni sa drugima.

Sledeće izvođenje iz ovog pronalaska je jedinjenje sa formulom I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu kao lek.

Sledeće izvođenje iz ovog pronalaska je jedinjenje sa formulom I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu kao lek za lečenje astme i alergijskih bolesti, gastrointestinalnih upalnih bolesti, glomerulonefritisa, eozinofilnih bolesti, hronične opstruktivne plućne bolesti, infekcije patogenim mikroorganizmima, reumatoidnog artritisa, neutrofilnih bolesti, cistične fibroze (CF), ne-cistične fibroze, idiopatske plućne fibroza, bronhiektazije, ANCA-pridruženog vaskulitisa, raka pluća, emfizema, hroničnog bronhitisa, akutne povreda pluća (ALI), sindroma akutnog respiratornog distresa (ARDS), plućne hipertenzije, plućne arterijske hipertenzije (PAH) i deficijencije alfa-1-antitripsina (AATD), upale povezane sa gojaznošću, rezistentnosti na insulin, dijabetesa, masne jetre i steatoze jetre.

Poželjno je jedinjenje sa formulom I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu kao leka za lečenje astme i alergijskih bolesti, gastrointestinalnih zapaljenskih bolesti, eozinofilnih bolesti, hroničnih opstruktivnih plućnih bolesti, emfizema, infekcije patogenim mikroorganizmima, reumatoidnog artritisa i ateroskleroze. Posebno poželjno je jedinjenje sa formulom I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu kao leka za lečenje hronične opstruktivne plućne bolesti i emfizema.

Sledeće izvođenje iz ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži jedno ili više jedinjenja formule ili njegovu farmaceutsku aktivnu so.

Sledeće izvođenje iz ovog pronalaska je postupak lečenja ili sprečavanja bolesti kod kojih inhibitori aktivnosti DPPI imaju terapijsku korist, gde postupak uključuje davanje terapeutski ili preventivno efektivne količine jedinjenja formule 1 pacijentu kome je do potrebno.

1

Sledeće izvođenje iz ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži dodatno jedinjenju sa formulom I, farmaceutski aktivno jedinjenje izabrano iz grupe koju čine betamimetici, antiholinergici, kortikosteroidi, inhibitori PDE4, antagonisti LTD4, EGFR inhibitori, inhibitori CRTH2, 5 LO inhibitori, antagonisti histaminskih receptora, CCR9 antagonisti i SYK inhibitori, NE inhibitori, MMP9 inhibitori i MMP12 inhibitori, ali takođe i kombinacije dve ili tri aktivne supstance.

KORIŠûENI TERMINI I DEFINICIJE

Termini koji nisu ovde posebno definisani trebalo bi da imaju značenja koja bi im dodelio stručnjak iz ove oblasti u svetlu otkrića i konteksta. Međutim, kako se koristi u specifikaciji, ukoliko nije drugačije navedeno, naredni izrazi imaju naznačeno značenje i sledeće konvencije koje su pridružene.

U grupama, radikalima ili ostacima definisanim ispod, broj atoma ugljenika često je naveden ispred grupe, na primer, C1-6-alkil znači alkil grupu ili radikal koji ima 1 do 6 atoma ugljenika.

Uopšteno, u pojedinačnim grupama kao što su HO, H2N, S(O), S(O)2, NC (cijano), HOOC, F3C ili slično, iskusni stručnjak može videti tačku(e) vezanosti radikala za molekul iz slobodne valence same grupe. Za kombinovane grupe koje sadrže dve ili više podgrupa, poslednja imenovana podgrupa je radikalska vezna tačka, na primer, supstituent „aril- C1-4-alkil-“ znači arilna grupa koja je vezana za C1-4-alkil grupu, gde je poslednja vezana za jezgro ili za grupu za koju je supstituent vezan. Alternativno, "*" u hemijskom entitetu označava tačku vezivanja.

U slučaju da je jedinjenje ovog pronalaska prikazano u obliku hemijskog imena i kao formula u slučaju bilo kakve razlike, formula će prevladati. Zvezdica se može koristiti u podformulama da označi vezu koja je povezana sa osnovnim molekulom kako je definisano.

Mnogi sledeći pojmovi mogu se više puta koristiti u definiciji formule ili grupe i u svakom slučaju imaju jedno od gore pomenutih značenja, nezavisno jedan od drugog.

Izraz "supstituisani" kao što je ovde korišćen, znači da je bilo koji ili više vodonika na označenom atomu zamenjeno izborom iz naznačene grupe, pod uslovom da normalna valencija određenog atoma nije premašena i da supstitucija dovodi do stabilnog jedinjenja.

Izrazi "prevencija", "profilaksa", "profilaktički tretman" ili "preventivni tretman" koji se ovde koriste treba da se razumeju sinonimno u smislu da je rizik od razvoja stanja pomenutog

1

ranije smanjen, posebno kod pacijenta sa povećanim rizikom za pomenuta stanja ili odgovarajućih anamneza, na pr. povišen rizik za razvoj metaboličkog poremećaja poput dijabetesa ili gojaznosti ili drugog poremećaja pomenutog ovde. Stoga izraz "prevencija bolesti" kako se ovde koristi znači upravljanje i brigu o pojedincu koji je u riziku od razvoja bolesti pre kliničkog početka bolesti. Svrha prevencije je borba protiv razvoja bolesti, stanja ili poremećaja i uključuje davanje aktivnih jedinjenja radi sprečavanja ili odlaganja pojave simptoma ili komplikacija i sprečavanja ili odlaganja razvoja povezanih bolesti, stanja ili poremećaja. Uspeh pomenutog preventivnog lečenja statistički se odražava smanjenom Xčestalošću navedenog stanja unutar populacije pacijenata koja je u riziku za ovo stanje u poređenju sa ekvivalentnom populacijom pacijenata bez preventivnog lečenja.

Izraz "lečenje" ili "terapija" znači terapijski tretman pacijenata koji su već razvili jedno ili više navedenih stanja u manifestnom, akutnom ili hroničnom obliku, uključujući simptomatsko lečenje u cilju ublažavanja simptoma specifične indikacije ili kauzalnog lečenja u cilju preokreta ili delimičnog preokreta stanja ili odlaganja napredovanja indikacije koliko je do moguće, u zavisnosti od stanja i njegove ozbiljnosti. Stoga izraz "lečenje bolesti", kako se ovde koristi, znači upravljanje i negu pacijenta koji je razvio bolest, stanje ili poremećaj. Svrha lečenja je borba protiv bolesti, stanja ili poremećaja. Lečenje uključuje davanje aktivnih jedinjenja za eliminaciju ili kontrolu bolesti, stanja ili poremećaja kao i za ublažavanje simptoma ili komplikacija povezanih sa bolešću, stanjem ili poremećajem.

Ako nije izričito naznačeno, kroz specifikaciju i pridodate zahteve, data hemijska formula ili naziv treba da obuhvata tautomere i sve stereo, optičke i geometrijske izomere (na pr. enantiomere, dijastereomere, E/Z izomere itd ...), kao i njihove racemate, kao i smeše u različitim odnosima pojedinačnih enantiomera, smeše dijastereomera ili smeše bilo kojeg od prethodnih oblika gde postoje takvi izomeri i enantiomeri, kao i soli, uključujući njihove farmaceutski prihvatljive soli i njihove solvate, kao što su na primer hidrati, uključujući solvate slobodnih jedinjenja ili solvate soli tog jedinjenja.

Izraz "farmaceutski prihvatljiv" ovde je korišćen da se odnosi na ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili oblike doziranja koji su, unutar opsega zdrave medicinske procene, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i životinja bez preterane toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih problema ili komplikacija, a srazmerno sa razumnim odnosom koristi i rizika.

2

Kao što se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljive soli" odnose se na derivate otkrivenih jedinjenja naznačeno time da se matično jedinjenje modifikuje tako što će se napraviti kiselinske ili bazne soli istih. Primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, ali nisu ograničeni na, soli mineralnih ili organskih kiselina iz baznih ostataka kao što su amini; alkalne ili organske soli iz kiselih ostataka kao što su karboksilne kiseline; i slično.

Na primer, takve soli uključuju soli iz amonijaka, L-arginina, betaina, benetamina, benzatina, kalcijumovog hidroksida, holina, deanola, dietanolamina (2,2’-iminobis(etanol)), dietilamina, 2-(dietilamino)-etanola, 2-aminoetanola, etilendiamina, N-etil-glukamina, hidrabamina, 1H-imidazola, lizina, magnezijum hidroksida, 4-(2-hidroksietil)-morfolina, piperazina, kalijum hidroksida, 1-(2-hidroksietil)-pirolidina, natrijum hidroksida, trietanolamina (2,2’,2"-nitrilotris(etanol)), trometamina, cink hidroksida, sirćetne kiseline, 2,2-dihlor-sirćetne kiseline, adipinske kiseline, alginske kiseline, askorbinske kiseline, L-asparaginske kiseline, benzensulfonske kiseline, benzojeve kiseline, 2,5-dihidroksibenzojeve kiseline, 4-acetamidobenzojeve kiseline, (+)-kamforne kiseline, (+)- kamfor-10-sulfonske kiseline, ugljene kiseline, cimetne kiseline, limunske kiseline, ciklamske kiseline, dekanoične kiseline, dodecilsulfatne kiseline, etan-1,2-disulfonske kiseline, etansulfonske kiseline, 2-hidroksietansulfonske kiseline, etilendiamintetrasirćetne kiseline, mravlje kiseline, fumarne kiseline, galaktarične kiseline, gentizične kiseline, D-glukoheptonske kiseline, D-glukonske kiseline, D-glukuronske kiseline, glutaminske kiseline, glutanske kiseline, 2-okso- glutarenske kiseline, glicerofosforne kiseline, glicina, glikolne kiseline, heksanske kiseline, hipurne kiseline, bromovodonične kiseline, hlorovodonične kiseline, izobutirinske kiseline, DL-mlečne kiseline, laktobionske kiseline, laurinske kiseline, lizina, maleinske kiseline, (-)-L-jabučne kiseline, malonske kiseline, DL-mandelinske kiseline, metansulfonske kiseline, galaktarične kiseline, naftalen-1,5,5-disulfonske kiseline, naftalen-2-sulfonske kiseline, 1-hidroksi-2-naftojeve kiseline, nikotinske kiseline, azotne kiseline, oktanske kiseline, oleinske kiseline, orotske kiseline, oksalne kiseline, palmitinske kiseline, pamojske kiseline (embonska kiselina), fosforne kiseline, propionske kiseline, (-)-L-piroglutaminske kiseline, salicilne kiseline, 4-amino-salicilne kiseline, sebačne kiseline, stearinske kiseline, jantarne kiseline, sumporne kiseline, taninske kiseline, (+)-L-vinske kiseline, tiocijanske kiseline, ptoluensulfonske kiseline i undecilenske kiseline. Daljnje farmaceutski prihvatljive soli mogu biti formirane sa katjonima iz metala poput aluminijuma, kalcijuma, litijuma, magnezijuma, kalijuma, natrijuma, cinka i sl. (Videti takođe: Pharmaceutical sos, Berge, SM et al., J.

Pharm. Sci., (1977) 66, 1-19).

Farmaceutski prihvatljive soli ovog pronalaska mogu se sintetizovati iz matičnog jedinjenja koje sadrži bazni ili kiseli ostatak konvencionalnim hemijskim postupcima. Uopšteno, takve soli mogu biti pripremljene reakcijom slobodnih kiselinskih ili baznih oblika ovih jedinjenja sa dovoljnom količinom odgovarajuće baze ili kiseline u vodi ili u organskom rastvaraču kao što su eter, etil acetat, etanol, izopropanol, ili acetonitril, ili njihova smeša.

Soli drugih kiselina pored onih gore pomenutih, koje su na primer korisne za prečišćavanje ili izolovanje jedinjenja iz ovog pronalaska (na pr. soli trifluoro acetata) takođe su deo pronalaska.

Izraz halogen generalno označava fluor, hlor, brom i jod.

Izraz "C1-n-alkil", naznačeno time da je n celi broj izabran od 2, 3, 4, 5 ili 6, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim radikalom, označava aciklični, zasićeni, razgranati ili linearni ugljovodonični radikal sa 1 do n C atoma. Na primer, termin C1-5-alkil obuhvata radikale H3C-, H3C-CH2-, H3C-CH2-CH2-, H3C-CH(CH3)-, H3C-CH2-CH2-CH2-, H3C-CH2-CH(CH3)-, H3C-CH(CH3)-CH2-, H3C-C(CH3)2-, H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-, H3C-CH2-CH2-CH(CH3)-, H3C-CH2-CH(CH3)-CH2-,H3C-CH(CH3)-CH2-CH2-, H3C-CH2-C(CH3)2-, H3C-C(CH3)2-CH2-, H3C-CH(CH3)-CH(CH3)- i H3C-CH2-CH(CH2CH3)-.

Izraz "oksetanil" označava četveročlani ciklični, zasićeni prsten koji sadrži atom kiseonika u 3 položaju u odnosu na tačku vezanosti.

DOBIJANJE

OPŠTE METODE SINTEZE

Pronalazak takođe obezbeđuje postupke za dobijanje jedinjenja sa formulom I.

Optimalni uslovi reakcije i vremena reakcije mogu varirati u zavisnosti od konkretnih upotrebljenih reaktanata. Ako nije drugačije naznačeno, stručnjak u oblasti tehnike može lako izabrati rastvarače, temperature, pritiske i druge reakcione uslove. Specifični postupci su navedeni u odeljku Primeri sinteze. Obično se napredak reakcije može nadgledati tankoslojnom hromatografijom (TLC) ili LC-MS, po želji, i međuprodukti i proizvodi mogu se prečistiti hromatografijom na silika gelu, HPLC i/ili rekristalizacijom. Primeri koji slede su ilustrativni i kao što se mogu prepoznati od strane stručne osobe, određeni reagensi ili uslovi mogu se menjati prema potrebi za pojedinačna jedinjenja bez nepotrebnog eksperimentiranja. Polazni materijali i intermedijeri koji se koriste u niže navedenim metodama su ili komercijalno dostupni ili se lako pripremaju iz komercijalno dostupnih materijala od strane stručnjaka.

Jedinjenje sa formulom I može se napraviti metodom opisanom u šemi 1, 2, 3 ili 4:

Šema 1

Kao što je prikazano u Šemi 1, zaštita i uklanjanje zaštite sa funkcionalnih grupa opisani su u ‘Protective Groups u Organic Synthesis’, T. V. Greene i P. G. M. Wuts, Wiley-Interscience. Na primer, za uklanjanje zaštite sa terc-butoksikarbonilne grupe, kiselina kao što je mravlja kiselina, trifluorosirćetna kiselina, p-toluensulfonska kiselina ili HCl može se koristiti u

2

pogodnom rastvaraču kao što je voda, DCM ili dioksan da bi se obezbedilo jedinjenje sa formulom III.

Reakcijom kiseline sa formulom IV, gde PG1predstavlja zaštitnu grupu (na pr. tercbutoksikarbonil) koristeći standardne literaturne postupke za formiranje amida, na primer, u prisustvu baze kao što je N,N-diizopropiletilamin (DIPEA) i nekog aktivirajućeg sredstva kao što je HATU ili TBTU, sa aminom sa formulom III u pogodnom rastvaraču, obezbeđuje se jedinjenje sa formulom V. Standardne reakcije spajanja peptida poznate u struci (videti na primer M. Bodanszki, 1984, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag) mogu se koristiti u ovim sintezama.

Dehidratacija amida, kao što je jedinjenje sa formulom V do odgovarajućeg nitrila sa formulom VI, može se izvesti upotrebom sredstva za dehidraciju, kao što je (metoksikarbonilsulfamoil)trietil amonijum hidroksid, u pogodnom rastvaraču kao što je dihlorometan (DCM).

Jedinjenja sa formulom VI (X1= I, Br) mogu se konvertovati u odgovarajuće derivate boronske kiseline VII, naznačeno time da R može biti H ili niži alkil nezavisno i ostaci R mogu da formiraju prsten. Na primer, VI može da reaguje sa bis(neopentil glikolato)diboronom u prisustvu pogodnog katalizatora, kao što je [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihlor-paladijum(II), i pogodnom bazom kao što je kalijum acetat ili natrijum, kalijum ili cezijum karbonat ili fosfat, u pogodnom rastvaraču kao što je dioksan, dimetilformamid (DMF) ili dihlorometan (DCM) da bi se dobili derivati boronske kiseline VII.

Oni mogu biti uključeni u (tranzicionu) metalom katalizovanu reakciju jedinjenja sa formulom VIII (X2= CI, Br). Spajanje ovih halogenida VIII obezbeđuje jedinjenje sa formulom IX. Na primer, reakcija ovih halogenida sa boronskom kiselinom ili odgovarajućim estrom boronske kiseline VII, u pogodnom rastvaraču kao što je dioksan, u prisustvu pogodnog katalizatora, kao što je 1,1’-bis(di-terc-butilfosfino)ferocen paladijum dihlorid I pogodne baze kao što je natrijum, kalijum ili cezijum karbonat, obezbeđuje se jedinjenje sa formulom IX.

Zaštita i uklanjanje zaštite sa funkcionalnih grupa opisani su u ‘Protective Groups u Organic Synthesis’, T. W. Greene i P. G. M. Wuts, Wiley-Interscience. Na primer, za uklanjanje zaštite sa terc-butoksikarbonilne grupe, neka kiselina kao što je p-toluensulfonska kiselina monohidrat može da se koristi u pogodnom rastvaraču kao što je acetonitril da se dobije jedinjenje sa formulom I.

Šema 2

Kao što je prikazano u Šemi 2 reakcija neke kiseline sa formulom IV, gde PG1predstavlja zaštitnu grupu (na pr. terc-butoksikarbonil) koristeći standardne literaturne postupke za formiranje amida, na primer u prisustvu baze poput N,N-diizopropiletilamina (DIPEA) i aktivirajućeg sredstva kao što je HATU ili TBTU, sa aminom sa formulom III u pogodnom rastvaraču, obezbeđuje se jedinjenje sa formulom V. Standardne reakcije spajanja peptida poznate u struci (videti na primer M. Bodanszky, 1984, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag) mogu biti korišćene u ovim sintezama.

2

Jedinjenja sa formulom V mogu biti konvertovana u odgovarajuće derivate boronske kiseline X analogno reakcionom postupku opisanom u Šemi 1. Oni mogu biti uključeni u (tranzicionu) metalom katalizovanu reakciju jedinjenja sa formulom VIII (X2= Cl, Br) kako bi se dobilo jedinjenje sa formulom XI analogno reakcionom postupku opisanom u Šemi 1.

Jedinjenje sa formulom XI može biti konvertovano u jedinjenje sa formulom XII korišćenjem redukcionog sredstva kao što je litijum ili natrijum borhidrid u pogodnom rastvaraču kao što je tetrahidrofuran.

Jedinjenje sa formulom XII može biti konvertovano u jedinjenje sa formulom XIII korišćenjem reagensa kao što je p-toluensulfonski anhidrid ili metansulfonil hlorid u prisustvu baze kao što je trietilamin ili N,N-diizopropiletilamin (DIPEA) u pogodnom rastvaraču kao što je tetrahidrofuran.

Dehidratacija amida kao što je u jedinjenju sa formulom XIII do odgovarajućeg nitrila sa formulom XIV može se izvršiti upotrebom sredstva za dehidrataciju, kao što je (metoksikarbonilsulfamoil)trietil amonijum hidroksid, u pogodnom rastvaraču kao što je dihlorometan (DCM).

Na primer, za uklanjanje zaštite sa terc-butoksikarbonilne grupe, neka kiselina kao što je ptoluensulfonska kiselina monohidrat može da se koristi u pogodnom rastvaraču kao što je acetonitril da se dobije jedinjenje sa formulom I.

2

Šema 3

Kao što je prikazano u Šemi 3 reakcijom neke kiseline sa formulom XV, gde PG1predstavlja zaštitnu grupu (na pr. terc-butoksikarbonil) koristeći standardne literaturne postupke za formiranje amida, na primer u prisustvu baze poput N-metilmorfolina i aktivirajućeg sredstva kao što je ciklični anhidrid 1-propanfosfonska kiselina (PPA) sa aminom formule III u pogodnom rastvaraču, dobija se jedinjenje sa formulom XVI. Standardne reakcije spajanja peptida poznate u struci (videti na primer M. Bodanszky, 1984, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag) mogu biti korišćene u ovim sintezama.

2

Zaštita i uklanjanje zaštite sa funkcionalnih grupa je opisana u ‘Protective Groups u Organic Synthesis’, T. W. Greene i P. G. M. Wuts, Wiley-Interscience. Na primer, za zaštitu amina sa formulom XVI, di-terc-butil-dikarbonat može da se koristi u pogodnom rastvaraču, kao što je dihlorometan, da se dobije jedinjenje sa formulom XVII.

Dehidratacija amida kao što je u jedinjenju sa formulom XVII do odgovarajućeg nitrila sa formulom XVIII može se izvršiti upotrebom sredstva za dehidrataciju, kao što je (metoksikarbonilsulfamoil)trietil amonijum hidroksid, u pogodnom rastvaraču kao što je dihlorometan (DCM).

Jedinjenja sa formulom XVIII (X1= I, Br) mogu biti konvertovana u odgovarajuće derivate boronske kiseline XIX, gde R može biti H niži alkil nezavisno i ostaci R mogu da formiraju prsten.

Na primer, XVIII može da reaguje sa bis(pinakolato)diboronom u prisustvu pogodnog katalizatora, kao što je [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihlor-paladijum(II), i pogodnom bazom kao što je kalijum acetat ili natrijum, kalijum ili cezijum karbonat ili fosfat, u pogodnom rastvaraču kao što je dioksan, dimetilformamid (DMF) ili dihlorometan (DCM) da bi se dobili derivati boronske kiseline XIX.

Oni mogu biti uključeni u (tranzicionu) metalom katalizovanu reakciju jedinjenja sa formulom VIII (X2= Cl, Br). Spajanje ovih halogenida VIII obezbeđuje jedinjenje sa formulom XX. Na primer, reakcija ovih halogenida sa boronskom kiselinom ili odgovarajućim estrom boronske kiseline XIX, u pogodnom rastvaraču kao što je dioksan, u prisustvu pogodnog katalizatora, kao što je 1,1’-bis(di-terc-butilfosfino)ferocen paladijum dihlorid i pogodne baze kao što je natrijum, kalijum ili cezijum karbonat, obezbeđuje se jedinjenje sa formulom XX.

Zaštita i uklanjanje zaštite sa funkcionalnih grupa je opisana u ‘Protective Groups u Organic Synthesis’, T. W. Greene i P. G. M. Wuts, Wiley-Interscience. Na primer, za uklanjanje zaštite sa terc-butoksikarbonilne grupe, neka kiselina kao što je p-toluensulfonska kiselina monohidrat može da se koristi u pogodnom rastvaraču kao što je acetonitril da se dobije jedinjenje sa formulom I.

2

Šema 4

Kao što je prikazano u Šemi 4 jedinjenje sa formulom II mogu biti konvertovana u odgovarajuće derivate boronske kiseline XXI, gde R može biti H ili niži alkil nezavisno i ostaci R mogu da formiraju prsten. Na primer, II može da reaguje sa bis(neopentil glikolato)diboronom u prisustvu pogodnog katalizatora, kao što je [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihlor-paladijum(II), i pogodne baze kao što je kalijum acetat ili natrijum, kalijum ili cezijum karbonat ili fosfat, u pogodnom rastvaraču kao što je dioksan, dimetilformamid (DMF) ili dihlorometan (DCM) da bi se dobili derivati boronske kiseline XXI.

Oni mogu biti uključeni u (tranzicionu) metalom katalizovanu reakciju jedinjenja sa formulom VIII analogno reakcionom postupku opisanom u Šemi 1 kako bi se dobilo jedinjenje sa formulom XXII.

Dehidratacija nekog amida kao što je u jedinjenju sa formulom XXII do odgovarajućeg nitrila sa formulom XXIII može se izvršiti upotrebom sredstva za dehidrataciju, kao što je

2

(metoksikarbonilsulfamoil)trietil amonijum hidroksid, u pogodnom rastvaraču kao što je dihlorometan (DCM).

Zaštita i uklanjanje zaštite sa funkcionalnih grupa je opisana u ‘Protective Groups u Organic Synthesis’, T. W. Greene i P. G. M. Wuts, Wiley-Interscience. Na primer, za uklanjanje zaštite sa terc-butoksikarbonilne grupe, neka kiselina kao što je p-toluensulfonska kiselina monohidrat može da se koristi u pogodnom rastvaraču kao što je acetonitril da se dobije jedinjenje sa formulom XXIV.

Reakcijom neke kiseline sa formulom XV, gde PG1predstavlja zaštitnu grupu (na pr. tercbutoksikarbonil) koristeći standardne literaturne postupke za formiranje amida, na primer u prisustvu baze poput N-metilmorfolina i nekog aktivirajućeg sredstva kao što je ciklični anhidrid 1-propanefosfonske kiseline (PPA), sa aminom sa formulom XXIV u pogodnom rastvaraču, obezbeđuje se jedinjenje sa formulom XXV. Standardne reakcije spajanja peptida poznate u struci (videti na primer M. Bodanszky, 1984, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag) mogu se koristiti u ovim sintezama.

Dalje modifikacije jedinjenja sa formulom I postupcima poznatim u struci i ilustrovanim u Primeri ispod, mogu se koristiti za pripremu dodatnih jedinjenja iz ovog pronalaska.

PRIMERI SINTEZE

Sledeća su reprezentativna jedinjenja iz ovog pronalaska koja mogu biti napravljena opštim sintetičkim šemama, primerima, i poznatim postupcima u struci. Polazni materijali i međuprodukti bili su komercijalno dostupni ili su nabavljeni iz kataloga ABCR, ACROS, ABLOCK PHARMATECH, ACTIVATE, ALDRICH, APOLLO SCIENTIFIC, ARK PHARM INC, ATLANTIC SCIENTIFIC TECHNOLOGY, BETAPHARM, BEFARM, CHEMBRIDGE CORPORATION, CNH-TECH, ENAMIN LTD, GOLDENBRIDGE PHARMA INC, GVK BIO, MERCACHEM, MOLBRIDGE, WUXI APPTEC, ZERENEX ili su sintetisani prema literaturi ili kako je dole opisano u "Sinteza polaznih materijala/edukta" Tečna hromatografija - masena spektroskopija (LCMS), retenciono vreme i opaženi m/z podaci za jedinjenje ispod dobijeni su jednim od sledećih metoda:

LC-MS Metod V001_007

LC-MS Metod V003_003

1

LC-MS Metod V011_S01

LC-MS Metod V012_S01

2 LC-MS Metod X001_004

LC-MS Metod X011_S03

LC-MS Metod X012_S02

LC-MS Metod Z011_S03

4 LC-MS Metod Z012_S04

LC-MS Metod Z018_S04

LC-MS Metod Z020_S01

LC-MS Metod Z021_S01

Postupci sinteze:

Metod A

Sinteza (1S,2S,4R)-N-[(1 S)-l-cijano-2-[2-fluoro-4-[1’-(oksetan-3-il)spiro[1H-izobenzofuran-3,4’-piperidin]-5-il]fenil]etil]-3-azabiciklo[2.2.1] heptan-2-karboksamid (Primer 1)

Primer 1

Korak 1: Sinteza intermedijera I-1.1

U R1 (20.00 g, 55.37 mmol) u dihlormetanu (50 mL) dodata je trifluorosirćetna kiselina (17.09 mL, 221.48 mmol) i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. Reakciona smeša je koncentrovana, ostatak je rastvoren u dihlormetanu (15 mL) i u diizopropil etru (140 mL). Talog je otfiltriran, ispran sa diizopropil etrom i osušen kako bi se dobio I-1.1 kao TFA so. Prinos 99%, m/z 261 [M+H]+, rt 0.50 min, LC-MS Metod Z018_S04.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-1.2

U R2 (13.86 g, 55.72 mmol) u DMF (65 mL) dodat je DIPEA (9.02 mL, 50.67 mmol) i ohlađen do 5°C. TBTU (17.89 g, 55.72 mmol) je dodat i reakciona smeša je mešana u toku 15 minuta. Nakon toga I-1.1 (TFA so) (19.0 g, 50.65 mmol), DMF (65 mL) i DIPEA (13.52 mL, 75.98 mmol) su dodati i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t. Reakciona smeša je razblažena sa etil acetatom i ekstrahovana sa vodom. Vodeni sloj je ekstrahovan sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi su isprani sa vodom, 1 mol/L vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline, vodom, vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (5%) i ponovo sa vodom. Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen uz pomoć fleš hromatografije (eluent: dihlorometan/metanol 95:5).

Prinos 82%, m/z 484 [M+H]+, rt 0.91 min, LC-MS Metod Z018_S04.

Korak 3: Sinteza intermedijera I-1.3

U I-1.2 (20.0 g, 41.29 mmol) u dihlormetanu (200 mL) dodat je R3 (19.68 g, 82.58 mmol) i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu, ostatak je rastvoren u etil acetatu i ekstrahovan sa vodom, 1 mol/L vodenim rastvorom sirćetne kiseline, i vodom. Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je rekristalizovan iz acetonitrila i odfiltriran.

Prinos 71%, m/z 466 [M+H]+, rt 0.98 min, LC-MS Metod Z018_S04.

Korak 4: Sinteza intermedijera I-1.4

U I-1.3 (1.5 g, 3.22 mmol) u dioksanu (20 mL) R4 (799.22 mg, 3.54 mmol), kalijum acetatu (0.947 g, 9.65 mmol) i [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijum(II), kompleks sa dihlorometanom (1:1) (52.54 mg, 0.064 mmol) su dodati. Reakciona smeša je pročišćena sa azotom i zagrejana do 70 °C u toku 1.5 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom i vodom. Organski sloj je izdvojen i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC.

Prinos 94% m/z 332 [M+H-Boc]+, rt 0.96 min, LC-MS Metod Z020_S01.

Korak 5: Sinteza intermedijera I-1.5

U I-1.4 (400.0 mg, 0.93 mmol) u acetonitrilu (18 mL) dodato je R5 (301.0 mg, 0.93 mmol) i smeša je pročišćena sa argonomom. Vodeni rastvor natrijum-karbonata 2 mol/L (928 PL, 1.86 mmol) i 1,1’-bis(di-terc-butilfosfino)ferocen paladijum dihlorida (60.5 mg, 0.09 mmol) su dodati, reakciona smeša je ponovo pročišćena sa argonomom i mešana na 80°C u mikrotalasnom reaktoru u toku 45 minuta. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije na silika gelu (DCM : MeOH = 98:2 do 92:8) kako bi se dobio I-1.5.

Prinos 79% m/z 631 [M+H]+, rt 1.09 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Alternativna sinteza intermedijera I-1.5

Sinteza intermedijera I-1.4.1

U I-1.3 (20 g, 42.89 mmol) u dioksanu (255 mL) bis(pinakolato)diboron (13.07 g, 51.46 mmol), kalijum acetat (12.63 g, 128.66 mmol) i [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihlorpaladijum(II), kompleks sa dihlorometanom (1:1) (1.75 g, 2.14 mmol) su dodati. Smeša je pročišćena sa azotom u toku 5 minuta, zagrevana do 70 °C i mešana preko noći na toj temperaturi. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom i vodom. Organski sloj je izdvojen i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije na silika gelu (petroletar: EtOAc = 92:8 do 34:66).

Prinos 64% m/z 332 [M+H - Boc - ((CH3)2CH)2]+, rt 0.73 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Sinteza intermedijera I-1.5

U I-1.4.1 (3.96 g, 7.71 mmol) u acetonitrilu (60 mL) dodat je R5 (2.50 g, 7.71 mmol) i smeša je pročišćena sa argonomom. Vodeni rastvor natrijum-karbonata 2 mol/L (7.71 mL, 15.42 mmol) i 1,1’-bis(di-terc-butilfosfino)ferocen paladijum dihlorid (502.6 mg, 0.77 mmol) su dodati, reakciona smeša je ponovo pročišćena sa argonomom i mešana na 80°C u toku 90 minuta. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije na silika gelu (DCM : MeOH = 99:1 do 94:6) kako bi se dobio I-1.5.

Prinos 75% m/z 631 [M+H]+, rt 1.09 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Sledeći intermedijeri, kao što je prikazano u Tabeli 1, sintetišu se na sličan način iz intermedijera I-1.4 i odgovarajućih edukta:

Tabela 1

4

Korak 6: Sinteza primera 1

U I-1.5 (3.64 g, 5.78 mmol) u acetonitrilu (60 mL) dodaje se monohidrat p-toluensulfonske kiseline (5.49 g, 28.88 mmol) i reakciona smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana nekoliko puta sa etil acetatom. Organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen iznad MgSO4, filtriran i koncentrovan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen pomoću reverzno fazne HPLC.

Prinos 84% m/z 531 [M+H , rt 1.00 min, LC-MS postupak Z011_S03.

Sinteza (1S,2S,4R)-N-[(1S)-1-cijano-2-[2-fluor-4-[1’-(oksetan-3-il)spiro[3H-furo[3,4-c]piridin-1,4‘-piperidin]-6-il]fenil] etil]-3-azabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksamida (Primer 23)

Primer 23

Korak 1: Sinteza intermedijera I-1.5.22

U I-1.4 (92.2 mg, 0.17 mmol) u acetonitrilu (3 mL) dodat je R17 (48.0 mg, 0.17 mmol) i smeša je pročišćena sa argonom. Vodeni rastvor cezijum-karbonata 2 mol/L (171 PL, 0.34 mmol) i 1,1’-bis(di-terc-butilfosfino)ferocen paladijum dihlorida (11.1 mg, 0.02 mmol) su

4

dodati, reakciona smeša je ponovo pročišćena sa argonom i mešana na 80°C u mikrotalasnom reaktoru u toku 45 minuta. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC kako bi se dobio I-1.5.22.

Prinos 52% m/z 632 [M+H]+, rt 1.04 min, LC-MS Metod Z011S03.

Korak 2: Sinteza Primera 23

U I-1.5.22 (56.0 mg, 0.09 mmol) u acetonitrilu (2 mL) dodat je monohidrat p-toluensulfonske kiseline (84.3 mg, 0.44 mmol) i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. Reakciona smeša je zaalkalisana sa TEA, filtrirana kroz membranski filter i prečišćena uz pomoć reverzno fazne HPLC.

Prinos 83% m/z 532 [M+H]+, rt 0.96 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Sinteza (1S,2S,4R)-N-[(1S)-1-cijano-2-[2-fluoro-4-[1’-(oksetan-3-il)spiro[5H-furo[3,4-b]piridin-7,4’-piperidin]-2-il]fenil]etil]-3-azabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksamida (Primer 25)

Primer 25

Korak 1: Sinteza intermedijera I-1.5.24

U I-1.4 (2.304 g, 5.34 mmol) u acetonitrilu (50 mL) dodat je R19 (1.50 g, 5.34 mmol) i smeša je pročišćena sa argonom. Vodeni rastvor natrijum-karbonata 2 mol/L (5.343 mL, 10.69

4

mmol) i 1,1’-bis(di-terc-butilfosfino)ferocen paladijum dihlorid (348.2 mg, 0.53 mmol) su dodati, reakciona smeša je ponovo pročišćena sa argonom i mešana na 70°C u mikrotalasnom reaktoru u toku 45 minuta. Dodatna količina I-1.4 (150 mg, 0.35 mmol) dodata je i reakciona smeša je mešana na 70°C u toku 25 minuta. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije na silika gelu (DCM : MeOH = 99:1 do 9:1) kako bi se dobio I-1.5.24.

Prinos 55% m/z 632 [M+H]+, rt 1.05 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 2: Sinteza Primera 25

U I-1.5.24 (1.85 g, 2.93 mmol) u acetonitrilu (50 mL) dodat je monohidrat p-toluensulfonske kiseline (2.78 g, 14.64 mmol) i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC.

Prinos 88% m/z 532 [M+H]+, rt 0.97 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Metod B

Sinteza (1S,2S,4R)-N-[(1S)-1-cijano-2-[2-fluoro-4- metilspiro[3H-furo[3,4-c]piridin-1,4’-piperidin]-6-il)fenil]etil]-3-azabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksamida (Primer 26)

4

Primer 26

Korak 1: Sinteza intermedijera I-2.1

U I-1.2 (1.0 g, 2.07 mmol) u dioksanu (10 mL) R4 (512.99 mg, 2.27 mmol), kalijum acetatu (607.92 mg, 9.65 mmol) i [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihlor-paladijum(II), kompleks sa dihlorometanom (1:1) (33.72 mg, 0.041 mmol) su dodati. Reakciona smeša je pročišćena sa azotom i zagrejana do 70 °C preko noći. Ponovo R4 (100 mg, 0.44 mmol) i [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijum(II), kompleks sa dihlorometan (1:1) (10 mg, 0.01 mmol) su dodati i reakciona smeša je mešana na 70°C u toku 2 sata. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu.

Ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC.

Prinos 50% m/z 450 [M+H]+.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-2.2

U I-2.1 (204.46 mg, 0.46 mmol) u acetonitrilu (4 mL) dodat je R10.7 (115 mg, 0.46 mmol) i smeša je pročišćena sa argonom. Rastvor cezijum karbonata 2mol/L (455.09 PL, 0.91 mmol)

4

i 1,1’-bis(di-terc-butilfosfino)ferocen paladijum dihlorid (29.66 mg, 0.046 mmol) su dodati, reakciona smeša je ponovo pročišćena sa argonom i mešana na 80°C u mikrotalasnom reaktoru u toku 45 minuta. Reakciona smeša je razblažena sa vodom, i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC.

Prinos 75%.

Korak 3: Sinteza intermedijera I-2.3

U I-2.2 (212 mg, 0.34 mmol) u THF (5 mL) dodat je litijum borhidrid (2 mol/L, 0.26 mL, 0.51 mmol) i reakciona smeša je mešana u toku 3 sata na s.t.. Reakciona smeša je kvenčovana sa metanolom, razblažen sa vodom i etil acetatom. Organski sloj je ispran sa rastvorom natrijum bikarbonata i slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos 91%.

Korak 4: Sinteza intermedijera I-2.4

U I-2.3 (194 mg, 0.31 mmol) u THF (5 mL) su dodati TEA (0.22 mL, 1.55 mmol) i ptoluensulfonski anhidrid (121.43 mg, 0.37 mmol) na 0°C. Reakciona smeša je ostavljena da dostigne do s.t. i mešana preko noći. Reakciona smeša je kvenčovana sa vodom i skoncentrisana u vakuumu. Ostatak je rastvoren sa rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovan sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC.

Prinos 34% m/z 608 [M+H]+.

Korak 5: Sinteza intermedijera I-2.5

U I-2.4 (65 mg, 0.11 mmol) u dihlormetanu (2.5 mL) dodat je R3 (63.72 mg, 0.27 mmol) i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. Reakciona smeša je razblažena sa etil acetatom i ekstrahovana sa vodom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos >95%.

Korak 6: Sinteza Primera 26

4

U I-2.5 (68 mg, 0.10 mmol) u acetonitrilu (2 mL) dodat je monohidrat p-toluensulfonske kiseline (98.70 mg, 0.52 mmol) i reakciona smeša je mešana u toku 1 h na s.t.. Reakciona smeša je zaalkalisana sa TEA i prečišćena uz pomoć reverzno fazne HPLC.

Prinos 28% m/z 490 [M+H]+, rt 0.96 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Metod C

Sinteza N-[(1S)-1-cijano-2-[2-fluoro-4-[l’-(oksetan-3-il)spiro[1H-izobenzofuran-3,4’-piperidin]-5-il]fenil]etil]-3-azabiciklo[2.2.2]oktan-4-karboksamida ( Primer 27)

Primer 27

Korak 1: Sinteza intermedijera I-3.1

U ohlađen do 0°C rastvor sa I-1.1 (5.80 g, 22.2 mmol), 3-terc-butoksikarbonil-3-azabiciklo[2.2.2]oktan-4-karboksilna kiselina, dobijena kako je opisano u Radchenko et al. J. Org. Chem. 2009, 5541-5544 (5.67 g, 22.2 mmol) i N-metil-morfolin (12.2 mL, 111.0 mmol) u suvom dihlormetanu (67 mL) dodat je PPA (13.08 mL (50% u etil acetatu), 22.2 mmol).

Reakciona smeša je ostavljena da dostigne s.t. i mešana je preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa dihlorometanom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu kako bi se dobio I-3.1, koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Prinos 73%, m/z 398/400 [M+H]+, rt 0.87 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-3.2

U ohlađen do 0°C rastvor sa I-3.1 (8.625 g, 21.66 mmol) u 300 mL suvog dihlormetana dodat je u kapimrastvor sa di-terc-butil dikarbonatom (6.26 g, 28.70 mmol) u 20 ml suvog dihlormetana. Reakciona smeša je mešana u toku 2 h na 0°C, ostavljen da dostigne s.t., i mešana u toku 2 dana. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu kako bi se dobio I-3.2 koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Prinos 98%, m/z 398/400 [M+H - Boc]+, rt 1.04 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 3: Sinteza intermedijera I-3.3

U suspenziju sa I-3.2 (5.52 g, 11.07 mmol) u suvom dihlorometanu (70 mL) dodat je R3 (3.96 g, 16.60 mmol) u četiri porcije i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. Dodatna količina R3 (791.0 mg, 3.32 mmol) dodata je i reakciona smeša je mešana u toku 6 h na s.t.. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% vodeniog rastvora sa vinskom kiselinom, zasićena rastvorom natrijum bikarbonata, slanim rastvorom, osušena preko MgSO4, filtrirana i skoncentrisana u vakuumu. Dobijeni ostatak je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije na silika gelu (petroletar: EtOAc = 94:6 do 69:31) kako bi se dobio I-3.3.

Prinos 77% m/z 380/382 [M+H - Boc]<+>, rt 1.10 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 4: Sinteza intermedijera I-3.4

U I-3.3 (3.61 g, 7.52 mmol) u dioksanu (45 mL) bis(pinakolato)diboron (3.24 g, 12.78 mmol), kalijum acetat (2.21 g, 22.55 mmol) i [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihlorpaladijum(II), kompleks sa dihlorometanom (1:1) (61.4 mg, 0.08 mmol) su dodati. Smeša je pročišćena sa azotom u toku 5 minuta i grejana na 70 °C u toku 3 h. Reakciona smeša je razblažena sa vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz

1

pomoć kolonske hromatografije na silika gelu (petroletar: EtOAc = 100:0 do 91:9) kako bi se dobio I-3.4.

Prinos 68% m/z 346 [M+H - Boc - ((CH3)2CH)2]+, rt 0.77 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 5: Sinteza intermedijera I-3.5

U I-3.4 (1.14 g, 2.16 mmol) u acetonitrilu (30 mL) dodat je R5 (0.70 g, 2.16 mmol) i smeša je pročišćena sa argonom. Vodeni rastvor natrijum-karbonata 2 mol/L (2.16 mL, 4.32 mmol) i 1,1’-bis(di-terc-butilfosfino)ferocen paladijum dihlorid (141.0 mg, 0.22 mmol) su dodati, reakciona smeša je ponovo pročišćena sa argonom u toku 5 minuta i mešana na 80°C u toku 70 minuta u mikrotalasnom reaktoru. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije na silika gelu (DCM : MeOH = 99:1 do 9:1) kako bi se dobio I-3.5.

Prinos 81% m/z 645 [M+H]+, rt 1.11 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 6: Sinteza Primera 27

U I-3.5 (923.0 mg, 1.43 mmol) u acetonitrilu (40 mL) dodat je monohidrat p-toluensulfonske kiseline (681.0 mg, 3.58 mmol) i reakciona smeša je mešana u toku 3 dana na s.t.. Reakciona smeša je neutralisana sa TEA i skoncentrisana u vakuumu. Voda je dodata i reakciona smeša je ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC.

Prinos 61%, m/z 545 [M+H]+, rt 1.02 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Metod D

Alternativna sinteza N-[(1S)-1-cijano-2-[2-fluoro-4-[1’-(oksetan-3-il)spiro[1H-izobenzofuran-3,4’-piperidin]-5-il]fenil]etil]-3-azabiciklo[2.2.2]oktan-4-karboksamida (Primer 27)

2

Primer 27

Korak 1: Sinteza intermedijera I-4.1

U Rl (340 mg, 0.94 mmol) u dioksanu (7 mL) R4 (288 mg, 1.28 mmol), kalijum acetat (277 mg, 2.82 mmol) i [l,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijum(II), kompleks sa dihlorometan (1:1) (15.3 mg, 0.02 mmol) su dodati. Smeša je pročišćena sa azotom i zagrejana do 70 °C u toku 2h. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC kako bi se dobio I-4.1.

Prinos 90%, m/z 325 [M-H]-, rt 0.94 min, LC-MS Metod Z020_S01.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-4.2

U I-4.1 (228 mg, 0.70 mmol) u acetonitrilu (10 mL) dodat je R5 (239 mg, 0.70 mmol) i smeša je pročišćena sa argonom. Vodeni rastvor kalijum karbonata 2mol/L (700 PL, 1.4 mmol) i 1,1-bis(di-terc-butilfosfino)ferocen paladijum dihlorid (46 mg, 0.07 mmol) su dodati, reakciona smeša je ponovo pročišćena sa argonom i mešana na 80°C u toku 45 minuta u mikrotalasnom reaktoru. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC kako bi se dobio I-4.2.

Prinos 80%, m/z 526 [M+H]<+>, rt 0.83 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 3: Sinteza intermedijera I-4.3

U I-4.2 (294 mg, 0.56 mmol) u dihlormetanu (10 mL) dodat je R3 (333 mg, 1.4 mmol) i reakciona smeša je mešana u toku 40 minuta na s.t.. DCM je uklonjen u vakuumu, dobijeni ostatak je razdeljen između etil acetata i 10% vodenog rastvora sa vinskom kiselinom, faze su razdvojene i vodena faza je ekstrahovana sa etil acetatom. Kombinovani organski sloj je ispran sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu kako bi se dobio I-4.3.

Prinos 95%, m/z 508 [M+H]<+>, rt 1.06 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 4: Sinteza intermedijera I-4.4

U I-4.3 (320 mg, 0.63 mmol) u acetonitrilu (8 mL) dodat je monohidrat p-toluensulfonske kiseline (600 mg, 3.15 mmol) i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom tri puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos 80%, m/z 408 [M+H]+, rt 0.90 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 5: Sinteza Primera 27

U I-4.4 (30 mg, 0.07 mmol) u DMF (1 mL) su dodati 3-terc-butoksikarbonil-3-azabiciklo[2.2.2]-oktan-4-karboksilna kiselina, dobijena kako je opisano u Radchenko et al. J. Org. Chem. 2009, 5541-5544 (19 mg, 0.07 mmol), N-metil-morfolin (16 PL, 0.15 mmol) i PPA (43 PL, 50% u DMF) na s.t.. Reakciona smeša je mešana u toku 2.5 sata na s.t., razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC kako bi se dobio Primer 27 (tokom izrade i/ili prečišćavanja javlja se uklanjanje zaštite Boc grupe). Prinos 32%, m/z 545 [M+H]+, rt 1.02 min, LC-MS Metod Z011_S03.

4

Sinteza polaznih materijala/edukta

Sinteza terc-butil N-[(1S)-2-amino-1-[(4-brom-2-fluor-fenil)metil]-2-oksoetil]karbamata (R1)

Korak 1: Sinteza intermedijera I-5.1

(2R)-(-)-2,5-dihidro-3,6-dimetoksi-2-izopropilpirazin (212 g, 1151 mmol) u suvom tetrahidrofuranu (600 mL) je ohlađen do -78°C. Zatim n-butillitijum (2.5 M u heksanu, 552 mL, 1381 mmol) dodat je u kapima, uz održavanje temperature ispod -78°C. Nakon 30 min 4-brom-2-fluorobenzil bromid (324g, 1209 mmol) u suvom tetrahidrofuranu (120 mL) dodat je u kapima. Reakciona smeša je mešana na -78°C u toku 1 h. Smeša je kvenčovana sa zasićenim NH4Cl rastvorom i ekstrahovana tri puta sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i uparen u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz pomoć fleš hromatografije (heptan/ etilacetat = 80/20).

Prinos 60%.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-5.2

U I-5.1 (104 g, 265 mmol) u acetonitrilu (600 mL) vod.0.2 M HC1 (2788 mL, 558 mmol) je dodat. Smeša je mešana na ST u toku 12 h. Smeša je ekstrahovana sa dietiletrom i pH vodenog sloja je podešen na ~8 sa zasićenim NaHCO3rastvorom. Zatim je on ekstrahovan tri puta sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan.

Prinos 80%.

Korak 3: Sinteza intermedijera I-5.3

I-5.2 (62.4 g, 211 mmol) je mešan u vodenom 3 M HC1 (3 mol/L, 1000 mL) na 60°C u toku 16 h. Smeša je prohlađena i pH je podešen na ~7 sa vodenim rastvorom 6 M NaOH. Zatim reakciona smeša je filtrirana, isprana tri puta sa vodom i osušena u vakuum sušnici na 40°C u toku 12 h.

Prinos 74%.

Korak 4: Sinteza intermedijera I-5.4

U I-5.3 (151g, 546 mmol) u 1,4-dioksanu (2.2 L) dodat je vodeni rastvor 2 M natrijum karbonata (301 mL, 602 mmol) i di-terc-butil dikarbonata (138 g, 632 mmol). Smeša je mešana u toku 4h. Zatim voda je dodata i pH je podešen na ~4-5 sa limunskom kiselinom. Smeša je ekstrahovana tri puta sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Ostatak je mešan u heptanu u toku 15 min i proizvod je odfiltriran.

Prinos 87%.

Korak 5: Sinteza R1

U I-5.4 (181 g, 476 mmol) u suvom DMF (1200 mL) N-metilmorfolin (72 g, 713 mmol) i TBTU (153 g, 476 mmol) su dodati i reakciona smeša je mešana u toku 30 min. Zatim reakciona smeša je ohlađena do 0°C i vodeni rastvor 35% amonijum hlorida (47 mL, 856 mmol) dodat je i smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku 12 h. Voda je dodata i formirani proizvod je odfiltriran i ispran tri puta sa vodom. Proizvod je osušen u vakuum sušnici na 40°C u toku 72 h.

Prinos 64%.

Sinteza (1S,2S,4R)-3-[(terc-butoksi)karbonil]-3-azabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilata (R2)

Jedinjenje je komercijalno dostupno ili se može sintetisati analogno opisu u Tararov et al, Tetrahedron Asymmetry 13 (2002), 25-28.

Korak 1: Sinteza intermedijera I-6.1

Rastvor sa etil oksoacetatom (44.9g, 0.44 mol), sveže destilisan iz komercijalno dostupnog rastvora u toluenu (na 50 mbar, 55°C) u dietiletru (300 ml) je ohlađen na -10°C, nakon čega sledi u kapima dodavanje (R)-(+)-1-feniletanamin (53 g, 440 mmol), uz održavanje temperature ispod 0°C. Nakon kompletnog dodavanja, MgSO4*H2O (91g, 660 mmol) je dodat, i rezultujuća smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Smeša je filtrirana, polazni likvor je skoncentrisan u vakuumu i ostatak je destilisan pod smanjenim pritiskom kako bi se dobio I-6.1 (47g, m/z 206 [M+H]+, rt 1.29 min, LC-MS Metod V003_003).

Proizvod je korišćen bez daljeg prečišćavanja.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-6.2

Rastvor sa I-6.1 (47g, 229 mmol) i 1,3-ciklopentadienom (30g, 458 mmol) (sveže destilisan iz diciklopentadiena) u DMF (150 ml) i 120 Pl vode je ohlađen do 0°C, pre nego je TFA (18 ml, 234 mmol) dodat u kapima. Smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi, zatim je dodata u rastvor sa 40g NaHCO3u 1200 ml vode i ekstrahovana sa dietiletrom. Organski sloj je izdvojen, ispran naknadno sa vodenim rastvorom NaHCO3i vodom, osušen preko MgSO4, i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije na silika gelu (cikloheksan/etilacetat = 9:1) kako bi se dobio I-6.2

(Prinos 52% m/z 272 [M+H]+, rt 0.42 min, LC-MS Metod X001_004).

Korak 3: Sinteza intermedijera I-6.3

U rastvor sa I-6.2 (24.8 g, 91 mmol) u etanolu (250 ml), dodat je Reni-nikl (2.5 g) i reakcija je izvođena na 50 psi pod atmosferom vodonika na sobnoj temperaturi. Katalizator je odfiltriran, rastvor je skoncentrisan u vakuumu i ostatak je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije na silika gelu (cikloheksan/etilacetat 9:1). Nakon evaporacije organskog rastvarača, dobijeni proizvod je ponovo rastvoren u dietiletru i trituriran sa rastvorom HCl u dioksanu, skoncentrisan u vakuumu, ponovo rastvoren u 200 ml etanola i skoncentrisan u vakuumu kako bi se dobio I-6.3

(Prinos 78% m/z 274 [M+H]+, rt 0.42 min, LC-MS Metod X001_004).

Korak 4: Sinteza intermedijera I-6.4

U rastvor sa I-6.3 (22 g, 71 mmol) u etanolu (250 ml), 10% Pd/C dodat je (2.5 g) i reakcija je izvođena na 15 bar pod atmosferom vodonika na sobnoj temperaturi. Katalizator je odfiltriran, rastvor je skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je ispran sa diizopropil etrom kako bi se dobio I-6.4

(Prinos 98% m/z 170 [M+H]+, rt 0.48 min, LC-MS Metod V001_007).

Korak 5: Sinteza intermedijera I-6.5

U I-6.4 (14.3 g, 69.3 mmol) u rastvoru sa trietilaminom (24.6 ml, 175.3 mmol), THF (150 ml) i voda (2 mL), di-terc-butil dikarbonat (15.9 g, 73 mmol) dodati su i rezultujuća smeša je mešana u toku 40 sata na sobnoj temperaturi, zatim je skoncentrisana u vakuumu. Etilacetat je dodat u ostatak, naknadno je ekstrahovan sa vodom, 1N vodenim rastvorom sirćetne kiseline i vodom, pre nego je organski sloj osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu kako bi se dobio I-6.5

(Prinos 95% m/z 270 [M+H]+, rt 1.33 min, LC-MS Metod V003_003).

Korak 6: Sinteza R2

Smeša sa I-6.5 (16.9 g; 63 mmol) u acetonu (152 ml), vodom (50 ml) i litijum hidroksidom (3g, 126 mmol) je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Voda (100 ml) je dodata, zapremina je smanjena u vakuumu pre nego je ohlađena do 0°C nakon čega sledi dodavanje u vodeni rastvor HCl kako bi se zakiselilo do pH od 2-3, odmah nakon čega sledi ekstrakcija sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa vodom, osušen (MgSO4) i koncentrovan. U ostatak, dihlorometan (100 ml) i cikloheksan (100 ml) su dodati, zapremina je smanjena u vakuumu za polovinu i smeša je temperirana na 15°C. Talog je otfiltriran, ispran sa cikloheksanom kako bi se dobio R2

(Prinos 66%, m/z 242 [M+H]+).

Sinteza 5-bromo-1’-(oksetan-3-il)spiro[1H-izobenzofuran-3,4’-piperidin] (R5)

Korak 1: Sinteza intermedijera I-7.1

Metil 2-amino-4-brombenzoat (10 g, 43.47 mmol) je suspendovan u sumpornoj kiselini 20% (200 mL) i dobijeni rastvor je ohlađen do 0°C. Natrijum nitrit (3.60 g, 52.16 mmol), rastvoren u vodi (40 mL), dodat je u kapima između 0°C - 5°C i reakciona smeša je mešana u toku daljih 40 minuta na toj temperaturi. Nakon toga ohlađen rastvor (ca.0°C) kalijum jodida (14.43 g, 86.93 mmol) u vodi (40 mL) dodat je u kapima i reakciona smeša je mešana u toku 1 h na 5°C. Reakciona smeša je smeštena na smešu led-voda i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa vodom, 10% vod. natrijum tiosulfatnim rastvorom, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos 94%.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-7.2

I-7.1 (9.42 g, 27.63 mmol) i terc-butil 4-oksopiperidin-1-karboksilat (6.24 g, 30.40 mmol) u suvom THF (200 mL) je ohlađen do -70°C. Izopropilmagnezijum hlorid-litijum hlorid kompleks (1.3 mol/L u THF, 23.38 mL, 30.40 mmol) dodat je u kapima i reakciona smeša je mešana u toku daljih 20 minuta na toj temperaturi, zatim je ostavljena da dostigne do s.t. i mešana u toku 45 minuta. Reakciona smeša je kvenčovana sa vodom i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4i skoncentrisan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen uz pomoć fleš kolonske hromatografije (petroletar: EtOAc = 95:5 do 40:60) kako bi se dobio I-7.2.

Prinos 74%, m/z 326,328 [M+H - terc-Bu]+, rt 1.09 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Sledeći intermedijeri, kako su prikazani u Tabeli 2 sintetisani su na sličan način iz odgovarajućih intermedijera:

Tabela 2

Alternativna sinteza intermedijera I-7.1

U 4-brom-2-jodbenzoevu kiselinu (9.0 g, 27.53 mmol) u metanolu (50 mL) dodata je koncentrovana sumporna kiselina (10 mL) i reakciona smeša je mešana u toku 90 minuta na 80°C. Reakciona smeša je smeštena na kupatilo sa smešom led voda, natrijum bikarbonat dodat je do postizanja pH vrednosti od 7 i reakciona smeša je ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos 95%.

Korak 3: Sinteza intermedijera I-7.3

U I-7.2 (8.11 g, 21.22 mmol) u THF (100 mL) dodat je litijum borhidrid (2 mol/L u THF, 21.22 mL, 42.44 mmol) i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. HPLC-MS analiza ukazuje na 20% konverzije. Dodatni litijum borhidrid (2 mol/L u THF, 27.0 mL, 54.0 mmol) dodat je u kapima i reakciona smeša je mešana u toku 6 dana na s.t.. Reakciona smeša je pažljivo kvenčovana sa vodom uz istovremeno hlađenje do oko 0°C uz pomoć ledenog kupatila. Zasićen rastvor natrijum bikarbonata dodat je u reakcionu smešu, dobijeni talog je odfiltriran, i polazni likvor je ekstrahovan sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos >95%, m/z 312/314 [M+H - terc-Butil - H2O]+, rt 1.01 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 4: Sinteza intermedijera I-7.4

I-7.3 (605 mg, 1.57 mmol) je rastvoren u suvom THF (20 mL) i ohlađen do 0°C, TEA (1.09 mL, 7.83 mmol) i p-toluensulfonski anhidrid (613.44 mg, 1.88 mmol) su dodati. Reakciona smeša je ostavljena da dostigne do s.t. i mešana je preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa vodom i zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC.

Prinos 72%, m/z 368; 370 [M+H]+

Korak 5: Sinteza intermedijera I-7.5

I-7.4 (240 mg, 1.57 mmol) je rastvoren u suvom DCM (2 mL) i TFA (500 PL, 6.53 mmol) je dodat. Reakciona smeša je ostavljena u toku 70 minuta na s.t.. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu, ostatak je ponovo rastvoren u metanolu, filtriran kroz čvrstu fazu kertridža (StratoSpheres™ PL-HC03 MP Resin) i metanol je uklonjen u vakuumu.

Prinos 97%, m/z 268; 270 [M+H]+, rt 0.93 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Alternativna sinteza intermedijera I-7.5

1

I-7.3 (8.39 g, 21.71 mmol) je rastvoren u suvom THF (25 mL), 5N vodeni rastvor HCl (25 mL) dodat je i reakciona smeša je mešana na 90°C u toku 30 h. Reakciona smeša je ohlađen do s.t., zaalkalisana sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos 76%, m/z 268; 270 [M+H]+, rt 0.93 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 6: Sinteza R5

I-7.5 (5.0 g, 18.49 mmol) je rastvoren u suvom tetrahidrofuranu (20 mL), 3-oksetanon (1.78 mL, 27.73 mmol) i sirćetna kiselina (1.06 mL, 18.49 mmol) su dodati i reakciona smeša je mešana u toku 25 minuta na na s.t.. Natrijum triacetoksiborhidrid (6.82 g, 30.57 mmol) dodat je i i reakciona smeša je mešana u toku daljih 30 minuta na s.t.. Reakciona smeša je kvenčovana sa MeOH, razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4i skoncentrisan u vakuumu kako bi se dobio R5.

Prinos 89%, m/z 324, 326 [M+H]+, rt 0.93 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Sinteza 6-bromo-1’-metil-spiro[indan-l,4’-piperidin] (R7)

Korak 1: Sinteza intermedijera I-8.1

U R6, koji je nabavljen od WUXI APPTEC (200 mg, 0.55 mmol) u dihlormetanu (3 mL) dodata je trifluorosirćetna kiselina (0.25 mL) i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu, ostatak je ponovo rastvoren u metanolu,

2

filtriran kroz čvrstu fazu kertridža (StratoSpheres™ PL-HC03 MP Resin) i metanol je uklonjen u vakuumu.

Prinos >95%.

Korak 2: Sinteza R7

U I-8.1 (152 mg, 0.57 mmol) u metanolu (4 mL) su dodati formaldehid (37% u vodi, 0.21 mL, 2.86 mmol) i sirćetna kiselina (0.05 mL, 0.86 mmol). Reakciona smeša je mešana 2 h na s.t.. Natrijum triacetoksiborhidrid (302.6 mg, 1.43 mmol) dodat je i reakciona smeša je mešana 80 minuta na s.t. Reakciona smeša je koncentrovana, triturirana sa vodom i zasićena rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i slanim rastvorom. Talog je otfiltriran i filtrat je osušen preko Na2SO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu kako bi se dobio R7.

Prinos 89%.

Sinteza 5-bromo-1,1’-dimetil-spiro[indolin-3,4’-piperidin]-2-on (R10)

Korak l: Sinteza R9

U R8, koji je nabavljen od ACTIVATE (200 mg, 0.53 mmol) u DMF (4 mL) dodat je natrijum hidrid (60% disperzija u mineralnom ulju, 31.5 mg, 0.79 mmol) uz hlađenje do 0°C i reakciona smeša je mešana u toku daljih 30 minuta na s.t.. Metil jodid (36 uL, 0.58 mmol) dodat je i reakciona smeša je mešana u toku 40 minuta na s.t.. Reakciona smeša je razblažena sa vodom i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa vodom i slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu kako bi se dobio R9. Prinos 98%.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-9.1

U R9 (191 mg, 0.48 mmol) u dihlormetanu (5 mL) dodata je trifluorosirćetna kiselina (0.5 mL) i reakciona smeša je mešana u toku 20 minuta na s.t.. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu, ostatak je ponovo rastvoren u metanolu, filtriran kroz čvrstu fazu kertridža (StratoSpheres™ PL-HC03 MP Resin) i metanol je uklonjen u vakuumu.

Prinos > 95%

Sledeći intermedijeri, kako su prikazani u Tabeli 3 sintetisani su na sličan način iz odgovarajućih intermedijera:

Tabela 3

Korak 3: Sinteza R10

U I-9.1 (152 mg, 0.52 mmol) u metanolu (5 mL) su dodati formaldehid (37% u vodi, 0.19 mL, 2.58 mmol) i sirćetna kiselina (0.044 mL, 0.77 mmol). Reakciona smeša je mešana u toku 2 sata na s.t.. Natrijum triacetoksiborhidrid (273.0 mg, 1.29 mmol) dodat je i reakciona smeša je mešana u toku 40 minuta na s.t.. Reakciona smeša je koncentrovana, razblažena sa vodom i zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski

4

sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Prinos >95%, 309; 311 [M+H]+, rt 0.75 min, LC-MS Metod Z012_S04.

Sledeći intermedijeri, kako su prikazani u Tabeli 4 sintetisani su na sličan način iz odgovarajućih intermedijera:

Tabela 4

Sinteza TFA soli 5-bromospiro[indolin-3,4’-piperidin]-2-ona (R11)

U R8, koji je nabavljen od ACTIVATE (150 mg, 0.39 mmol) u dihlormetanu (3 mL) dodata je trifluorosirćetna kiselina (0.5 mL) i reakciona smeša je mešana u toku 45 minuta na s.t.. Reakciona smeša je koncentrovana.

Prinos 100%.

Sinteza terc-butil 5-bromo-2-okso-spiro[indolin-3,3’-pirolidin]-1’-karboksilata (R12)

U terc-butil 2-oksospiro[indolin-3,3’-pirolidin]-1’-karboksilat, koji je nabavljen od Zerenex (50.0 mg, 0.17 mmol) u acetonitrilu (1.5 mL) dodat je N-bromsukcinimid (30.5 mg, 0.17 mmol) i reakciona smeša je mešana u toku 5 h na s.t.. Reakciona smeša je razblažena sa vodom i zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos 80%, m/z 367; 369 [M+H]+

Sinteza 5-bromo-1-metil-spiro[indolin-3,3’-piperidin]-2-ona (R13)

Korak 1: Sinteza intermedijera I-10.1

U 1-metilspiro[indol-3,3’-piperidin]-2(1H)-on, koji je nabavljen od ChemBridge Corporation (1.0 g, 4.62 mmol) u dihlormetanu (20 mL) su dodati TEA (0.64 mL, 4.62 mmol) i di-tercbutil dikarbonat (958.6 mg, 4.39 mmol). Reakciona smeša je mešana u toku 10 minuta na s.t., razblažena sa vodom i zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa dihlorometanom. Faze su razdvojene i vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM. Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4i skoncentrisani u vakuumu.

Prinos >95%, m/z 261 [M+H - terc-Butil]+, rt 1.06 min, LC-MS Metod Z020_S01.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-10.2

U I-10.1 (1.54 g, 4.87 mmol) u acetonitrilu (35 mL) dodat je N-bromsukcinimid (856.7 mg, 5 mmol) i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. Reakciona smeša je razblažena sa vodom i zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos 93%, m/z 340 [M+H - terc-Butil]+, rt 1.13 min, LC-MS Metod Z020_S01.

Korak 3: Sinteza R13

U I-10.2 (200 mg, 0.51 mmol) u dihlormetanu (10 mL) dodata je trifluorosirćetna kiselina (5 mL) i reakciona smeša je mešana u toku 15 minuta na s.t.. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu i liofilizovana. Ostatak je rastvoren u dihlormetanu i ekstrahovan sa 1 mol/L vodenog rastvora natrijum hidroksida i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos 88%, m/z 295; 297 [M+H]+, rt 0.59 min, LC-MS Metod Z020_S01.

Sinteza terc-butil 6-hlor-3-okso-spiro[furo[3,4-c]piridin-1,4’-piperidin]-1’-karboksilata (R14)

Korak 1: Sinteza intermedijera I-11.1

Sinteza intermedijera I-11.1 je opisana u EP2072519 A1, p.36.

Na -78°C, heksanski rastvor (94 mL, 150.81 mmol) sa 1.6 M n-butillitijumom je dodat

u kapima u THF rastvor (110 mL) sa 2,2,6,6-tetrametilpiperidinom (16.14 g, 113.10

mmol) i dobijeni rastvor je mešan u toku 1 sata. Nakon toga THF rastvor (50 mL) sa 6-hlornikotinskom kiselinom (6.0 g, 37.70 mmol) dodat je u kapima tokom 1 sata i reakciona smeša je mešana u toku 2 sata. THF rastvor (50 mL) sa 1-benzil-4-piperidonom (21.6 g, 113.10 mmol) dodat je u kapima na -78°C. Nakon mešanja u toku 2 sata, voda (70 mL) je dodata, i reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature.

Vodeni sloj je odvojen, i organski sloj je ekstrahovan sa vodenim rastvorom 1 N natrijum hidroksida (2 x 75 mL). Dobijeni vodeni sloj je ekstrahovan sa dietiletrom (100 mL), i vodeni sloj je zakišeljen (pH ~l) dodavanjem koncentrovane hlorovodonične kiseline.

Nakon mešanja u toku 1 sat, talog je otfiltriran, ispran sa vodom, i rastvoren u etilacetatu. Organski sloj je ispran sa vodenim zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, osušen preko Na2SO4i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je ispran sa dietiletrom.

Prinos 66%, m/z 329 [M+H]+, rt 0.72 min, LC-MS Metod Z012_S04.

Sledeći intermedijer, kako je prikazan u Tabeli 5 sintetisan je na sličan način iz odgovarajućeg intermedijera:

Tabela 5

Korak 2: Sinteza intermedijera I-11.2

I-11.1 (2.0 g, 6.08 mmol) u dihloretanu (15 mL) je ohlađen do 0°C. Rastvor sa 1-hloroetil hlorformatom (1.98 mL, 18.25 mmol) u dihloretanu (5 mL) dodat je polako i reakciona smeša je mešana u toku daljih 15 minuta na 0°C. Nakon toga reakciona smeša je zagrejana do refluksa i mešana preko noći. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu. Ostatak je rastvoren u metanolu i zagrejan do refluksa u toku 30 minuta, tokom tog vremena formiran je talog. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom i talog je otfiltriran kako bi se dobio I-11.2 (hidrohlorid).

Prinos 61%.

Korak 3: Sinteza R14

U I-11.2 (500 mg, 1.82 mmol) u dihlormetanu (10 mL) su dodati TEA (0.51 mL, 3.64 mmol) i di-terc-butil dikarbonat (396.6 mg, 1.82 mmol). Reakciona smeša je mešana u toku 20 minuta na s.t., razblažena sa vodom i zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa dihlorometanom. Organski sloj je osušen i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos 91%.

Sinteza 3-hlor-1’-metil-spiro[furo[3,4-b]piridin-5,4’-piperidin]-7-ona (R15)

Na -78°C, heksanski rastvor (2.38 mL, 3.81 mmol) sa 1.6 M n-butillitijuma dodat je u kapima u THF rastvor (5 mL) sa 2,2,6,6-tetrametilpiperidina (0.76 mL, 4.43 mmol) i dobijeni rastvor je mešan u toku 1 sata na toj temperaturi. Nakon toga THF rastvor (1 mL) sa 5-hlor-2-piridinkarboksilne kiseline (0.2 g, 1.27 mmol) dodat je u kapima tokom 5 minuta i reakciona smeša je mešana u toku 45 minuta. THF rastvor (1 mL) sa 1-metil-4-piperidona (0.44 mL, 3.81 mmol) dodat je u kapima na -78°C. Nakon 1 sata, voda (10 mL) je dodata, i reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature. Etilacetat (15 mL) i vodeni zasićen NaHCO3rastvor (15 mL) su dodati u reakcionu smešu i vodeni sloj je odvojen. Organski sloj je ekstrahovan sa vodenim zasićenim NaHCO3rastvorom (2 x 10 mL). Kombinovana vodena faza je zakišeljena (pH ~l) dodavanjem koncentrovane hlorovodonične kiseline.

Nakon mešanja u toku 1 sata reakciona smeša je zaalkalisana dodavanjem vodenog zasićenog NaHCO3rastvora i ekstrahovana sa etil acetatom (4 x 25 mL). Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4i skoncentrisan u vakuumu kako bi se dobio R15. Prinos 21%, m/z 253, 255 [M+H]+, rt 0.41 min, LC-MS Metod Z012_S04.

Sinteza 6-hlor-1‘-(oksetan-3-il)spiro[furo[3,4-c]piridin-1,4’-piperidin]-3-ona (R16)

a) Generisanje slobodne baze:

I-11.2 (200 mg, 0.73 mmol) je delimično rastvoren u osušenom metanolu, za polimer vezan tetraalkil-amonijum karbonat (Aldrich, 540293) je dodat i ova smeša je mešana u toku 2 sata na s.t. Za polimer vezan tetraalkil-amonijum karbonat je odfiltriran i metanol je uklonjen u vakuumu kako bi se dobila slobodna baza iz I-11.2.

b) Slobodna baza iz I-11.2 je rastvorena u smeši suvog dihlormetana (3 mL)/suvog tetrahidrofurana (1 mL), 3-oksetanon (0.23 mL, 3.64 mmol) i sirćetna kiselina (0.06 mL, 1.1 mmol) su dodati. Reakciona smeša je mešana u toku 75 minuta na s.t., zatim je dodat natrijum triacetoksiborhidrid i reakciona smeša je mešana u toku 15 minuta na s.t. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4i skoncentrisan u vakuumu.

Prinos 80%, m/z 295 [M+H]+, rt 0.75 min, LC-MS Metod Z011S03.

Sinteza 6-hlor-1‘-(oksetan-3-il)spiro[3H-furo[3,4-c]piridin-1,4’-piperidin] (R17)

Korak 1: Sinteza intermedijera I-11.3

U I-11.1 (1.00 g, 3.04 mmol) u metanolu (15 mL) dodat je natrijum borhidrid (345 mg, 9.12 mmol) u malim porcijama i reakciona smeša je mešana u toku 20 h na s.t.. Dodatni natrijum borhidrid (750 mg, 19.82 mmol) dodat je u 3 porcije (each 250 mg) u toku 5 h u reakcionu smešu. Reakciona smeša je kvenčovana sa vodom i razblažena sa etil acetatom. Organski sloj je izdvojen i vodeni sloj je ekstrahovan sa etil acetatom. Kombinovani organski sloj je ispran

1

sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4i skoncentrisan u vakuumu. Ostatak je prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC kako bi se dobio I-11.3.

Prinos 40%, m/z 333 [M+H]+, rt 0.91 min, LC-MS Metod Z011S03.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-11.4

U I-11.3 (378 mg, 1.14 mmol) u suvom THF (5 mL) su dodati TEA (0.95 mL, 6.81 mmol) i metansulfonil hlorid (0.26 mL, 3.5 mmol) na 0°C. Reakciona smeša je ostavljena da dostigne do s.t. i mešana je u toku 1 h. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvoromom, osušen preko Na2SO4i skoncentrisan u vakuumu kako bi se dobio sirovi proizvod koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Prinos 95%, m/z 315 [M+H]+, rt 1.06 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 3: Sinteza intermedijera I-11.5

U rastvor sa I-11.4 (246 mg, 0.78 mmol) u dihloretanu (4 mL) dodat je 1-hloretil hlorformat (0.42 mL, 3.91 mmol) i reakciona smeša je zagrejana do refluksa i mešana u toku 3 sata. Dihloretan je uklonjen u vakuumu, dobijeni ostatak je ponovo rastvoren u metanolu (3 mL) i dobijeni rastvor je refluksovan u toku 30 min. Reakciona smeša je ohlađena do s.t. i prečišćena uz pomoć reverzno fazne HPLC kako bi se dobio I-11.5.

Prinos 72%, m/z 225 [M+H]+, rt 0.71 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 4: Sinteza R17

I-11.5 (114 mg, 0.51 mmol) je rastvoren u suvom tetrahidrofuranu (2 mL), 3-oksetanon (0.05 mL, 0.76 mmol) i sirćetna kiselina (0.044 mL, 0.76 mmol) su dodati i reakciona smeša je mešana u toku 1 sat na s.t.. Natrijum triacetoksiborhidrid (269 mg, 1.27 mmol) dodat je i reakciona smeša je mešana u toku daljih 15 min na s.t.. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4i skoncentrisan u vakuumu kako bi se dobio R17.

Prinos 62%, m/z 281 [M+H]+, rt 0.76 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Sinteza 2-hlor-1‘-(oksetan-3-il)spiro[furo[3,4-b]piridin-7,4’-piperidin]-5-ona (R18)

2

Korak 1: Sinteza intermedijera I-12.1

2-amino-6-hlorinonikotinonitril, koji je nabavljen od ABLOCK PHARMATECH (2.0 g, 13.02 mmol) je rastvoren u suvom tetrahidrofuranu (40 mL), bakar (I) jodid (3.72 g, 19.54 mmol), dijodmetan (8.39 mL, 104.2 mmol) i terc-butil nitrit (6.20 mL, 52.1 mmol) su dodati. Reakciona smeša je refluksovana u toku 1.5 h, ohlađena do RT i sve isparljive komponente su uklonjene u vakuumu. Dobijeni ostatak je rastvoren u etil acetatu (100 mL) i ispran sa 10% vodenim natrijum tiosulfatnim rastvorom (25 mL), zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (25 mL), osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen uz pomoć fleš kolonske hromatografije kako bi se dobio I-12.1 (eluent: petroletar/etilacetat).

Prinos 74%, m/z 265 [M+H]+, rt 0.90 min, LC-MS Metod Z012_S04.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-12.2

I-12.1 (1.0 g, 3.78 mmol) i terc-butil 4-oksopiperidin-1-karboksilat (753 mg, 3.78 mmol) su rastvoreni u suvom THF (10 mL) i reakciona smeša je ohlađena do -65°C. Izopropilmagnezijum hlorid-litijum hlorid kompleks (1.3 mol/L u THF, 3.78 mL, 4.92 mmol) dodat je u kapima i reakciona smeša je mešana u toku daljih 10 min na toj temperaturi. Nakon toga reakciona smeša je ostavljena da dostigne s.t., mešana je u toku 20 minuta i metanol (0.8 mL, 19.7 mmol) je dodat. Reakciona smeša je ohlađena do 0°C i 50% vodeni rastvor sumporne kiselinae (2.0 mL) dodat je u kapima. Reakciona smeša je zagrejana do s.t. i mešana preko noći. Beli talog koji je formiran je odfiltriran, ispran sa THF i osušen u vakuumu kako bi se dobio sirovi prozvod I-12.2 (sulfatna so) u vidu bele čvrste supstance. Sirovi proizvod je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Prinos 94%, m/z 239 [M+H]+, rt 0.69 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 3: Sinteza R18

a) Generisanje slobodne baze:

I-12.2 (150 mg, 0.45 mmol) je rastvoren u metanol (2 mL)/voda (2 mL) smeši, za polimer vezan tetraalkilamonijum karbonat (Aldrich, 540293) dodat je i ova smeša je mešana u toku 1 sata na s.t.. Za polimer vezan tetraalkilamonijum karbonat je odfiltriran, metanol i voda su uklonjeni u vakuumu kako bi se dobila slobodna baza iz I-12.2.

b) Dobijeni ostatak je ponovo rastvoren u THF (2 mL)/voda (0.1 mL) smeši, 3-oksetanon (0.04 mL, 0.67 mmol) i sirćetna kiselina (0.038 mL, 0.67 mmol) su dodati i reakciona smeša je mešana u toku 1 sata na s.t.. Natrijum triacetoksiborhidrid dodat je i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4i skoncentrisan u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen uz pomoć fleš kolonske hromatografije kako bi se dobio R18 (eluent: DCM / MeOH).

Prinos 18%, m/z 295 [M+H]+, rt 0.74 min, LC-MS Metod Z011S03.

Sinteza 2-hlor-1‘-(oksetan-3-il)spiro[5H-furo[3,4-b]piridin-7,4’-piperidin] (R19)

Korak 1: Sinteza intermedijera I-12.3

U I-12.2 (3.25 g, 9.65 mmol) u dihlormetanu (50 mL) dodat je TEA (4.04 mL, 28.95 mmol), reakciona smeša je mešana u toku 20 minuta na s.t., i di-terc-butil dikarbonat (2.11 g, 9.65 mmol) je dodat. Reakciona smeša je mešana u toku 90 minuta na s.t., razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, skoncentrisan u vakuumu i dobijeni

4

ostatak je prečišćen uz pomoć fleš kolonske hromatografije (petroletar: EtOAc = 95:5 do 60:40) kako bi se dobio I-12.3.

Prinos 49%, m/z 239 [M-Boc+H]+, rt 1.03 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 2: Sinteza intermedijera I-12.4

U I-12.3 (10.0 g, 29.52 mmol) u etanolu (500 mL) dodat je natrijum borhidrid (2.23 g g, 59.03 mmol) i kalcijum hlorid (6.55 g, 59.03 mmol) u dve porcije i reakciona smeša je mešana preko noći na s.t.. HPLC-MS ukazuje na 85% konverzije do željenog proizvoda. Dodatna količina natrijum borhidrida (350 mg, 9.25 mmol) dodata je i reakciona smeša je mešana u toku 6 h na s.t.. Reakciona smeša je kvenčovana sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, etanol je uklonjen u vakuumu i dobijeni ostatak je trituriran sa etil acetatom. Precipitat koji je formiran je odfiltriran i polazni likvor je ekstrahovan sa etil acetatom nekoliko puta. Kombinovani organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, filtriran i skoncentrisan u vakuumu. Dobijeni ostatak je trituriran sa acetonitrilom, precipitat koji je formiran je odfiltriran, polazni likvor je skoncentrisan u vakuumu i ova procedura je ponovljena još dva puta. Precipitati su kombinovani i osušeni u vakuumu kako bi se dobio I-12.4.

Prinos 54%, m/z 243 [M+H-Boc]+, rt 0.97 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 3: Sinteza intermedijera I-12.5

U I-12.4 (6.77 g, 17.77 mmol) u suvom THF (75 mL) su dodati TEA (14.84 mL, 106.64 mmol) i metansulfonil hlorid (5.50 mL, 71.09 mmol) na 0°C. Reakciona smeša je ostavljena da dostigne s.t. i mešana u toku 1 h. Reakciona smeša je razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa dihlorometanom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4, skoncentrisan u vakuumu i dobijeni ostatak je prečišćen uz pomoć fleš kolonske hromatografije (petroletar: EtOAc = 95:5 do 72:28) kako bi se dobio I-12.5.

Prinos 65%, m/z 225 [M+H-Boc]+, rt 1.07 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 4: Sinteza intermedijera I-12.6

U I-12.5 (4.13 g, 12.07 mmol) u dihlormetanu (15 mL) dodata je trifluorosirćetna kiselina (5 mL) i reakciona smeša je mešana u toku 3 h na s.t.. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu, dobijeni ostatak je ponovo rastvoren u metanolu (50 mL), za polimer vezan tetraalkil-amonijum karbonat (Aldrich, 540293) je dodat i ova smeša je mešana u toku 30 minuta na s.t. Za polimer vezan tetraalkil- amonijum karbonat je odfiltriran i metanol je uklonjen u vakuumu kako bi se dobio I-12.6.

Prinos 99%, m/z 225 [M+H]+, rt 0.74 min, LC-MS Metod Z011_S03.

Korak 5: Sinteza R19

I-12.6 (3.62 g, 12.08 mmol) je rastvoren u suvom tetrahidrofuranu (40 mL), 3-oksetanon (1.16 mL, 18.13 mmol) i sirćetna kiselina (691 uL, 12.08 mmol) su dodati i reakciona smeša je mešana u toku 20 minuta na s.t.. Natrijum triacetoksiborhidrid (6.74 g, 30.21 mmol) dodat je i reakciona smeša je mešana u toku 25 min na s.t.. Reakciona smeša je kvenčovana sa metanolom, razblažena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana sa etil acetatom nekoliko puta. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko MgSO4i skoncentrisan u vakuumu. Dobijeni ostatak je trituriran sa acetonitril/metanol smešom (9:1), precipitat koji je formiran je odfiltriran, polazni likvor je skoncentrisan u vakuumu i ova procedura je ponovljena još dva puta. Precipitati su kombinovani i osušeni u vakuumu kako bi se dobilo 2.47 g R19. Polazni likvor je skoncentrisan u vakuumu, dobijeni ostatak je ponovo rastvoren u acetonitrilu i prečišćen uz pomoć reverzno fazne HPLC kako bi se dobila dodatna količina (0.32 g) Rl9.

Prinos 78%, m/z 281 [M+H]+, rt 0.78 min, LC-MS Metod Z011_S03.

PRIMERI

(rt = retenciono vreme). Metode uklanjanja zaštite: TSA (toluen sulfonska kiselina cf. Primer 1). Stereohemija na atomu ugljenika pored nitrilne grupe je dodeljena: stereo veza znači S-izomer.

Tabela 6

1

2

ANALITIýKI PODACI PRIMERA

Tabela 7

Tabela 8

Spisak skraćenica

4

FARMAKOLOŠKI PODACI

Ostale karakteristike i prednosti ovog pronalaska postaće jasne iz sledećih detaljnijih primera koji ilustruju, pomoću primera, principe pronalaska.

INHIBICIJA HUMANOG DPPI (KATEPSIN C)

Materijali: Mikrotitarske ploče (Optiplate-384 F) su nabavljene od PerkinElmer (Prod.No.10 6007270). Supstrat Gly-Arg-AMC je nabavljen od Biotrend (Prod.-No.808756 Custom peptide).

Goveđi serumski albumin (BSA; Prod.No. A3059) i Ditiotreitol (DTT; Prod.No D0632) su nabavljeni od Sigma. TagZyme pufer je nabavljen od Riedel-de-Haen (Prod.-No.04269), NaCl je nabavljen od Merck (Prod.-No.1.06404.1000) i morfolinoetan sulfonska kiselina (MES), je nabavljena od Serva (Prod.-No.29834). DPPI inhibitor Gly-Phe-DMK je nabavljen od MP Biomedicals (Prod.-No.03DK00625). Rekombinantni humani DPPI je nabavljen od Prozymex. Svi ostali materijali bili su najvišeg korakena čistoće komercijalno dostupnih.

Sledeći puferi su korišćeni: MES pufer: 25 mM MES, 50 mM NaCl, 5 mM DTT, podešen na pH 6.0, koji sadrži 0.1% BSA; TAGZyme Pufer: 20 mM NaH2P04, 150 mM NaCl podešen na pH 206.0 sa HC1

Uslovi analize: Rekombinantni humani DPPI je razblažen u TAGZyme pufer do 1 U/ml (38.1 Pg/ml, respektivno), i zatim je aktiviran uz pomoć mešanja u 1:2 odnosu sa Cysteamin vodenim rastvorom (2mM) i inkubiran u toku 5 min na sobnoj temperaturi.

Pet PL testiranog jedinjenja (finalne koncentracije od 0.1 nM do 100 (PM) u bidestilovanoj vodi 5 (koja sadrži 4% DMSO, finalna DMSO koncentracija 1%) je pomešano sa 10 PL DPPI u MES puferu (finalne koncentracije od 0.0125 ng/PL) i inkubirano u toku 10 min. Zatim, 5 PL supstrata u MES puferu (finalne koncentracije od 50 PM) je dodato.

Mikrotitarske ploče su zatim inkubirane na sobnoj temperaturi u toku 30 min. Zatim, rakcija je zaustavljena dodavanjem 10 PL sa Gly-Phe-DMK u 10 MES puferu (finalne koncentracije od 1 PM). Fluorescencija u bunarčLćima je određena primenom Molecular Devices SpectraMax M5 čitača fluorescencije (Ex 360 nm, Em 460 nm) ili Envision čitača fluorescencije (Ex 355 nm, Em 460 nm).

Svaka mikrotitarska ploča iz analize je sadržala bunarčLće sa kontrolnim medijumom (1% DMSO u bidest 0.075% 15 BSA) kao referncom za neinhibiranu enzimsku aktivnost (100% Ctl; visoka vrednost) i bunarčLće sa inhibitorom (Gly-Phe-DMK, u bidest 1% DMSO 0.075% BSA, finalne koncentracije od 1 PM) kao kontrolom za pozadinsku fluorescenciju (0% Ctl; niska vrednost). Analiza podataka je izvedena uz pomoć izračunavanja procenta fluorescencije u prisustvu testiranog jedinjenja u odnosu na fluorescenciju kontrolnog medijuma nakon 20 oduzimanja pozadinske fluorescencije uz pomoć sledeće formule:

(RFU(uzorka)-RFU(pozadinski))* 100/(RFU(kontrole)-RFU(pozadinski))

Podaci iz tih izračuna korišćeni su za generisanje IC50vrednosti za inhibiciju DPPI, respektivno.

Tabela 9

ODREĈIVANJE AKTIVNOSTI NEUTROFILNE ELASTASE U U937 PRIPREMI CITOZOLSKOG LIZATA NAKON INKUBACIJE SA TESTIRANIM JEDINJENJEM

Materijali:

Optiplate 384F je nabavljen od PerkinElmer (Prod. No. #6007270). Nunclon

ploče za kulture ćelija sa 24 bunarčLća (No.142475) i ploče sa 96 bunarčLća (No.267245) su nabavljene od Nunc.

Dimetilsulfoksid (DMSO) je nabavljen od Sigma (Prod.No. D8418). Nonidet-P40 (NP40) je nabavljen od USBiological (Prod.No. N3500)

Supstrat, specifičan za Neutrofilnu elastazu, je nabavljen od Bachem (MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC; Prod.No. I-1270).

Humana neutrofilna elastaza je nabavljena od Calbiochem (Prod.No.324681)

Puferi:

Tris-pufer (l00 mM Tris; 1M NaCl; pH 7.5)

Tris-pufer HSA 0.1%; Humani serumski albumin od Calbiochem (Cat#. 126658)

Pufer serinske proteaze (20mM Tris;100 mM NaCl; pH 7.5) 0.1%HSA

Lizirajući pufer serinske proteaze: 20mM Tris-HCl; lOOmM NaCl pH 7.5; 0.2% Nonidet-P40;

PBS: rastvor fosfatnog pufera, bez Ca i Mg, od Gibco

ûelijske kulture:

U937 od ECACC (Cat.No.85011440) kultivisane u suspenziji na 37°C i sa 5% CO2.

Gustina ćelija: 0.2-1 Mio. ćelija/ml.

Medijum: RPMI1640 GlutaMAX (No.61870) sa 10% FCS od Gibco

Gajenje i tretman ćelija:

Jedinjenja u 100% DMSO su razblažena u medijumu (-FCS) sa 10% DMSO i dalje razblaživana u skladu sa planiranim eksperimentom.

20 Pl rastvora jedinjenja je prebačeno u odgovarajuće bunarčLće na ploči sa 24 bunarčLća i razblaženo sa 2ml ćelijske suspenzijepo bunarčLću koji sadrži l x 10<5>ćelija/ml (finalne koncentracije od DMSO = 0.1%). Faktor razblaženja jedinjenja = 100

Jedinjenja (do 7 koncentracija) su testirana u triplikatu sa 3 bunarčLća za DMSO 0.1% kontrola, inkubirane u toku 48 sata bez izmene medijuma na 37°C, uz 5% CO2i 95% relativne vlage.

Sakupljanje ćelija i lizata ćelija:

Transfer ćelijske suspenzije u 2 ml iz bloka analize sa 96 bunarčLća. Odvajanje ćelija od medijuma centrifugiranjem (500 X g; 10 min; RT); odbacivanje supernatanta.

Resuspendovanje u 1 ml PBS; centrifugiranje (500 X g; 10 min; RT); ispiranje ćelija dva puta sa PBS. Dodatak 80 Pl Lizirajućeg pufera serinske proteaze (ohlađen na ledu) u ćelijski pelet; resuspendovanje peleta i stavljanje na led u toku 10 minuta. Uklanjanje načistoća uz pomoć centrifugiranja na 1000 X g u toku 10 min na 4°C. Transfer 80-100 Pl supernatanta sa lizatom u ploče sa 96 bunarčLća i odmah skladištenje na -80°C.

Ispitivanje aktivnosti neutrofilne elastaze:

Zamrznuti lizati su otopljeni na 37°C u toku 10 minuta i skladišteni na ledu. Sadržaj proteina određen je Bradford testom za protein. Lizati su razblaženi do 0.2-0.5 mg/ml proteina u puferu serin proteaze HSA.

Standard: NE (100 Pg/ml stok rastvora u Tris-puferu; čuvan na -80°C) je razblažen u Trispuferu HSA do 750 ng/ml, i dalje je serijski razblaživan 1:2 za standardnu krivu.

Pufer, slepa proba, standard i uzorci lizata su prebačeni u ploču sa 384 bunarčLća.

Plan pipetiranja

Slepa proba: 5 Pl Tris-pufer 10 Pl Pufer serin proteaze 5 Pl Supstrat

Standard: 5 Pl Tris-pufer 10 Pl NE (dif. konc.) 5 Pl Supstrat

Lizat: 5 Pl Tris-pufer 10 Pl Lizat 5 Pl Supstrat

Povećanje u fluorescenciji (Ex360nm/Em 460nm) određeno je nakon 30 minuta sa čitača fluorescencije uređaja Molecular Device Spectramax M5. Rezultat je interpoliran na ng/mg lizat proteina korišćenjem funkcija ekscel formula. Procenat inhibicije u uzorcima lizata tretiranim sa jedinjenjem izračunava se u odnosu na kontrolni uzorak tretiran sa DMSO

(100-(jedinjenje-uzorak * 100) / kontrolni uzorak)

Testrano jedinjenje će dati vrednosti između 0% i 100% inhibicije neutrofilne elastaze. Vrednost IC50se izračunava pomoću Graphpad Prism; nelinearno fitovanje (log(inhibitor) naspram odgovora - promenljivi nagib). IC50vrednost interpolirana je kao koncentracija testiranog jedinjenja koja dovodi do smanjenja aktivnosti neutrofilne elastaze za 50% (u odnosu na kontrolu tretiranu sa DMSO).

Tabela 10

INHIBICIJA HUMANOG KATEPSIN K

Materijali:

Mikrotitarske ploče (Optiplate-384 F were koji je nabavljen od PerkinElmer (Prod.No. 6007270). Supstrat Z-Gly-Pro-Arg-AMC je nabavljen od Biomol (Prod.-No. P-142). L-Cistein (Prod.No.168149) je nabavljen od Sigma. Natrijum actetat je nabavljen od Merck (Prod.-No. 6268.0250), EDTA je nabavljen od Fluka (Prod.-No.03680). Inhibitor E-64 je nabavljen od Sigma (Prod.-No. E3132). Rekombinantni humani Katepsin K proenzim je nabavljen od Biomol (Prod.No. SE-367). Svi ostali materijali bili su najvišeg korakena čistoće komercijalno dostupnog.

Sledeći puferi su korišćeni: Aktivacioni pufer: 32.5 mM natrijum acetat, podešen na pH 3.5 sa HCl; Pufer za analizu: 150 mM natrijum acetat, 4 mM EDTA, 20 mM L-Cistein, podešen na pH 5.5 sa HCl,

Uslovi analize:

1

Za aktiviranje proenzima, 5 PL prokatepsin K je pomešano sa 1 Pl aktivacionog pufera i inkubiran na sobnoj temperaturi u toku 30 min.

5 PL testiranog jedinjenja (finalne koncentracije od 0.1 nM do 100 PM) u bidestilovanoj vodi (koji sadrži 4% DMSO, finalna DMSO koncentracija 1%) je pomešano sa 10 PL Katepsin K u puferu za analizu (finalne koncentracije od 2 ng/PL) i inkubirano u toku 10 min. Zatim 5 PL supstrata u puferu za analizu (finalne koncentracije od 12.5 PM) je dodato. Ploče su zatim inkubirane na sobnoj temperaturi u toku 60min. Zatim, rakcija je zaustavljena dodavanjem 10 PL E64 u pufer za analizu (finalne koncentracije od 1 PM). Fluorescencija u bunarčLćima je određena primenom Molecular Devices SpectraMax M5 čitača fluorescencije (Ex 360 nm, Em 460 nm).

Svaka mikrotitarska ploča iz analize sadrži bunarčLće sa kontrolnim medijumima (1% DMSO u bidest) kao referncom za neinhibiranu enzimsku aktivnost (100% Ctl; visoka vrednost) i bunarčLće sa inhibitorom (E64 u bidest 1% DMSO, finalne koncentracije od 1 PM) kao kontrolom za pozadinsku fluorescenciju (0% Ctl; niska vrednost). Analiza podataka je izvedena uz pomoć izračunavanja procenta fluorescencije u prisustvu testiranog jedinjenja u odnosu na fluorescenciju kontrolnog medijuma nakon oduzimanja pozadinske fluorescencije:

(RFU(uzorak)-RFU(pozadinski))* 100/(RFU(kontrola)-RFU(pozadinski))

Podaci iz tih obračuna korišćeni su za generisanje IC50vrednosti za inhibiciju Katepsin K, respektivno.

ODREĈIVANJE METABOLIýKE STABILNOSTI SA MIKROZOMIMA HUMANE JETRE

Metabolička razgradnja ispitivanog jedinjenja testira se na 37 °C sa sakupljenim mikrozomima humane jetre. Konačna inkubaciona zapremina od 100 Pl po vremenskoj tački sadrži TRIS pufer sa pH 7,6 (0,1 M), magnezijum hlorid (5 mM), mikrozomalni protein (1 mg/ml) i ispitivano jedinjenje u krajnjoj koncentraciji od 1 Pl. M Nakon kratkog perioda predinkubacije na 37 °C, reakcije se započinju dodavanjem beta-nikotinamid adenin dinukleotid fosfata, redukovanog oblika (NADPH, 1 mM) i završavaju se prenošenjem alikvota u acetonitril nakon različitih vremenskih tačaka. Pored toga, NADPH -nezavisna degradacija se nadgleda u inkubacijama bez NADPH, koja se završava u poslednjoj tački. [%] preostalog ispitivanog jedinjenja posle NADPH nezavisne inkubacije odražava se parametrom c (kontrola) (metabolička stabilnost). Kvenčovane inkubacije su peletirane uz

2

pomoć centrifugiranja (10000 g, 5 min). Alikvot supernatanta je testiran uz pomoć LC-MS/MS na količinu polaznog jedinjenja.

Poluživot (t l/2 INVITRO) određuje se nagibom polulogaritmičkog grafikona profila koncentracije i vremena. Unutrašnji klirens (CLINTRINSIC) se izračunava uzimajući u obzir količinu proteina u inkubaciji:

CLINTRINSIC [(Pl/min/mg protein] = (In 2/(poluživot [min] * sadržaj protein [mg/ml]))

*1.000.

Vrednosti poluživota (t l/2 INVITRO) za odabrana jedinjenja u gore opisanom testu metaboličke stabilnosti navedene su u sledećoj tabeli.

Tabela 11

TARGETIRANO ANGAŽOVANJE NA MODELU SA MIŠEVIMA

Tretman jedinjenjima:

Da bi se pratio uticaj test jedinjenja na aktivnost neutrofilne elastaze u perifernim neutrofilima, ženke Crl: NMRI tretirane su na sledeći način:

Grupa 1 (6 životinja): 0,5 mg/kg ispitivanog jedinjenja u 0,5% Natrosola (pH 2-3)

Grupa 2 (6 životinja): 0,5% Natrosola (pH 2-3)

Grupa 3 (2 životinje): 0,5% Natrosola (pH 2-3)

Ispitivana jedinjenja ili Natrosol rastvor primenjeni su od ponedeljka do petka u 7:00 h i 16:00 h svakog dana prve nedelje studije i ponedeljka i utorka (7:00 h i 16:00 h) druge nedelje. Ispitivana jedinjenja ili Natrosol primenjeni su oralno.

LPS izazov test i preparat bronhioalveolarnog ispiranja:

U sredu, druge nedelje, životinje su tretirane testiranim jedinjenjem ili rastvorom Natrosola kao što je gore opisano (7:00 h) posle čega je usledio LPS (lipopolisaharid) inhalacioni izazov:

Grupe 1 i 2: 20-minutna inhalacija sa LPS (E.coli serotip 055:B5; l mg/ml u PBS-u) korišćenjem kontinualnog nebulizatora MiniHeart Hi-Flo (Westmed)

Grupa 3: Bez izazova sa LPS

4 sata nakon izazivanja sa LPS-om, od svih životinja pripremljeno je bronhioalveolarno ispiranje korišćenjem 2 x 1 ml rastvore Hank-ove soli po životinji i broj ćelija u tečnosti za ispiranje određen je korišćenjem Sysmex XT-1800i. ûelije u tečnosti za ispiranje su

4

razdvojene centrifugiranjem i lizirane u puferu za lizu (100 mM TRIS pH 7,5, 1 M NaCl, 0,2% NP40).

Merenje neutrofilne elastaze (NE):

Aktivnost NE u lizatu ćelija iz BALF (bronhioalveolarna tečnost za ispiranje) je izmerena uz pomoć fluorescentnog NE supstrata MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC (Bachem): 10 Pl ćelijskog lizata je pomešano sa 5 Pl pufera (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% humanog serumskog albumina) i 5 Pl supstrata (1 mM u puferu za ispitivanje) na ploči sa 384 bunarčLća (Optiplate 384f, PerkinElmer). Reakciona smeša je inkubirana 60 minuta na sobnoj temperaturi i izmerena je fluorescencija (360 nm ekscitacija, 460 nm emisija). Dobijene vrednosti fluorescencije su normalizovane na BALF broj neutrofila za svaku životinju. Da bi se izračunala inhibicija aktivnosti NE ispitivanim jedinjenjima, srednja vrednost fluorescencije grupe 3 oduzeta je od vrednosti fluorescencije za grupe 1 i 2, a % inhibicije aktivnosti NE u grupi 1 u poređenju sa srednjom vrednosti fluorescencije u grupi 2, obračunato.

Aktivnost neutrofilne elastaze u BALF lizatu nakon prethodne obrade inhibitorima katepsina C (7d ukupno (dva puta dnevno)) je navedena u sledećoj tabeli:

Tabela 12

KRISTALNA STRUKTURA KATEPSIN C LIGAND KOMPLEKSA

METODE

Protein:

Rekombinantni humani katepsin C (Cat C) je proizveden u skladu sa standardnim molekularno-biološkim protokolima (Literatura: 1 - 3)

Kristalizacija i namakanje:

Pre kristalizacije proteina pufer je izmenjen do 20 mM Bis-Tris pH 7.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM DTT sa NAP 10 kolonom (GE Healthcare). Uzorak proteina je koncentrovan do 9-10 mg/mL. Kristali su rasli na 20 °C u visećim kapima koristeći 1,0 PL proteina i 1,0 PL rastvora za bunarčLće (0,1 M Bis-Tris-propan pH 6,0-6,5, 18-20% (m/v) PEG 3350, 200 mM NaF, 1 mM DDT). Kristali su se pojavili preko noći i narasli do pune veličine u roku od 2-3 dana. Kostrukture liganda su dobijene namakanjem apo-kristala u rastvoru u bunarčLćima snabdevenim sa 1 mM odgovarajućeg liganda (razblaživanjem od 100 mM osnovnog rastvora u DMSO) preko noći. Kristali su zatim zamrznuti u tečnom azotu pre prikupljanja podataka korišćenjem 20% glicerola i rastvora iz bunarčLća kao krio zaštitnog sredstva.

Prikupljanje podataka, rastvaranje strukture i rafinacija:

Svi difrakcioni podaci prikupljeni su na 100 K na rotirajućem anodnom generatoru (Rigaku) koristeći CuKĮ zračenje i obrađeni su sa XDS (Literatura: 4). Ligandske kostrukture su rešene furijer metodom razlike i refinisane sa programom autoBuster (Global Phasing Ltd.), koji je ponovljen ručnim rebildingom pomoću programskog paketa (Literatura: 5). Konačna statistika obrade i rafinacija podataka navedena je u Tabeli 13. Za pripremu slike korišćen je program PyMOL (DeLano Scientific LLC).

REZULTATI

Struktura ligand Katepsin C kompleksa:

Struktura humanog Katepsin C (Cat C) je u literaturi (Literatura 2) opisana kao tetramer koji sadrži četiri identične podjedinice. Svaka podjedinica se sastoji od tri lanca: laki i teški lanci formiraju katalitički domen, dok takozvani isključujući domen blokira aktivno mesto izvan S2 džepa i odgovoran je za aktivnost egzopeptidaznu aktivnost Cat C. Strukture Cat C u kompleksu sa primerima 11 i 16 (tabela 14, slika 1) su određen kako bi se razjasnio način vezivanja ove klase jedinjenja. Primeri 11 i 16 vezuju se putem kovalentne interakcije nitrilne grupe sa Cys234. Primer 11 je jedan enantiomer sa atomom ugljenika pored nitrilne grupe u (S) konfiguraciji, dok je primer 16 (spirociklični atom ugljenika ima RS stereohemiju) smeša dijastereomera. Biciklička aminokiselina dospeva u džep enzima SI gde je usidrena vodoničnim vezama na atome okosnice Gly277 i Asn380 kao i na bočni lanac Aspl. Bis-arilni sistem je orijentisan u džep S2 gde je uključen u van der Vaalsove interakcije u ostacima Aspl i Pro3 isključujućeg domena. Iznenađujuće, primetili smo dodatnu interakciju spirocikličkog amina: spiro-azetidin u Primeru 11 i spiro-pirolidin u Primeru 16. U oba slučaja osnovni atom azota formira slani most u Glu275 u skladu sa velikom enzimskom aktivnošću ove klasa jedinjenja.

Tabela 13. Statistika prikupljanja i rafinacije podataka

Prikupljanje podataka<1>

Set podataka Primer 11 Primer 16

Detektor Saturn944 Mar345

Prostorna grupa 1222 1222

Dimenzije ćelije jedinice 86.0, 89.3, 86.5, 88.7,

a, b, c (A) 114.6 114.5

Rerastvor (A) 1.7 1.5

Completnost (%) 81.0(9.1) 93.3 (43.5)

Rsym(%) 4.2(31.6) 3.5 (28.0)

< I/V(I) >32.1 (2.9) 32.5 (4.7)

Rafinacija<2>

R-faktor/R-slobodan (%) 17.8/19.2 21.3/21.7

Rmsd dužina veze (A) 0.008 0.008

Rmsd ugao veze (°) 0.90 0.93

<1>Vrednosti u zagradama su za ljusku sa najvišom rezolucijom;

-slobodni je izračunat korišćenjem 5% podataka isključenih iz rafinacije; Rmsd, srednja kvadratna devijacija korena.

Tabela 14. Jedinjenja ispitana u X rendgenskoj kristalografiji

Jedinjenje Primer 11 Primer 16

Struktura

Stereo izomer Pojedinačan smeša dijastereomera

dijastereomer

CatC IC50(nM) 0.7 0.5

FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE

Pogodni preparati za primenu jedinjenja sa formulom I biće očigledni onima koji imaju uobičajenu stručnost i uključuju na primer tablete, pilule, kapsule, supozitorije, pastile, kašike, rastvore, sirupe, eliksire, vrećice, injekcije, inhalatore i praškove itd.., poželjno tablete.

Pogodne tablete mogu se dobiti, na primer, mešanjem jednog ili više jedinjenja u skladu sa formulom I sa poznatim ekscipijensima, na primer, inertnim razblaživačima, nosačima, dezintegratorima, adjuvansima, površinski aktivnim sredstvima, vezivima i/ili mazivima. Tablete se takođe mogu sastojati od više slojeva.

KOMBINACIJE

Jedinjenja sa opštom formulom I mogu se koristiti samostalno ili u kombinaciji sa drugim aktivnim supstancama sa formulom I prema pronalasku. Jedinjenja sa opštom formulom I mogu opciono da se kombinuju sa drugim farmakološki aktivnim supstancama. Tu spadaju B2-adrenoceptor-agonisti (kratko i dugo delujući), anti-holinergici (kratko i dugo delujući), anti-inflamatorni steroidi (oralni i topikalni kortikosteroidi), hromoglikati, metilksantin, disocirani glukokortikoidmimetici, PDE3 inhibitori, PDE4 inhibitori, inhibitori PDE7, LTD4 antagonisti, EGFR-inhibitori, agonisti Dopamina, PAF antagonisti, derivati lipoksina A4, FPRL1 modulatori, antagonisti receptora LTB4 (BLT1, BLT2), antagonisti receptora Histamina HI, antagonisti Histamin H4 receptora, dualni antagonisti Histamin H1/H3 receptora, inhibitori PI3-kinaze, inhibitori ne-receptorskih tirozin-kinaza kao na primer LYN, LCK, SYK, ZAP-70, FYN, BTK ili ITK, inhibitori MAP kinaze, na primer p38, ERK1, ERK2, JNK1, JNK2, JNK3 ili SAP, inhibitori NF-kB signalnog puta kao na primer inhibitori kinaze IKK2, inhibitori iNOS, inhibitori MRP4, inhibitori leukotrien biosinteze kao na primer inhibitori 5-lipoksigenaze (5-LO), cPLA2 inhibitori, Leukotrien A4 Hidrolaza inhibitori ili inhibitori FLAP, nesteroidni anti-inflamatorni agensi (NSAID), antagonisti CRTH2, modulatori DPI-receptora, antagonisti receptora tromboksana, antagonisti CCR3, antagonisti CCR4, antagonisti CCR1, antagonisti CCR5, CCR6 antagonisti, CCR7 antagonisti, CCR8 antagonisti, CCR9 antagonisti, CCR30 antagonisti, CXCR3 antagonisti, CXCR4 antagonisti, CXCR2 antagonisti, CXCR1 antagonisti, CXCR5 antagonisti, CXCR6 antagonisti, CX3CR3 antagonisti, neurokininski (NK1, NK2) antagonisti, modulatori receptora sfingozin I-fosfata, inhibitori sfingosin 1 fosfatne liaze, modulatori receptora adenozina kao na primer A2aagonisti, modulatori purinergičkih receptora kao na primer, inhibitori P2X7, histon deacetilaze (HDAC)aktivatori, bradykinin antagonisti (BK1, BK2), inhibitori TACE, PPAR gama modulatori, inhibitori Ro-kinaze, inhibitori interleukina I-beta konvertujućeg enzima (ICE), modulatori Tol-sličnih receptora (TLR), inhibitori HMG-CoA reduktaze, antagonisti VLA-4, ICAM -1 inhibitori, agonisti SHIP, antagonist receptora GABAa, inhibitori ENaC, inhibitori prostasina, inhibitori matriptaze, modulatori melanocortin receptora (MC1R, MC2R, MC3R, MC4R, MC5R), CGRP antagonisti, antagonisti endotelina, antagonisti TNFD, anti-TNF antitela, anti-GM-CSF antitela, anti CD46 antitela, anti IL-1 antitela, anti IL-2 antitela, anti-IL-4 antitela, anti-IL-5 antitela, anti IL-13 antitela, anti IL-4/IL-13 antitela, anti TSLP antitela, anti OX40 antitela, mukoregulatori, imunoterapeutska sredstva, jedinjenja protiv oticanja disajnih puteva, jedinjenja protiv kašlja, inhibitori VEGF, NE-inhibitori, inhibitori MMP9, inhibitori MMP12, ali takođe i kombinacije dve ili tri aktivne supstance.

Poželjni su betamimetici, antiholinergici, kortikosteroidi, PDE4-inhibitori, LTD4-antagonisti, EGFR-inhibitori, inhibitori CRTH2, 5-LO-inhibitori, antagonisti Histaminskih receptora i SYK-inhibitori, NE-inhibitori, inhibitori MMP9, inhibitori MMP12, ali i kombinacije od dve ili tri aktivne materije, tj:

• Betamimetici sa kortikosteroidima, PDE4-inhibitorima, CRTH2-inhibitorima ili LTD4-antagonistima,

• Antiholinergici sa betamimeticima, kortikosteroidima, PDE4-inhibitorima, CRTH2-inhibitorima ili LTD4-antagonistima,

• Kortikosteroidi sa PDE4-inhibitorima, CRTH2-inhibitorima ili LTD4-antagonistima

• PDE4-inhibitori sa CRTH2-inhibitorima ili LTD4-antagonistima

• CRTH2-inhibitori sa LTD4-antagonistima.

INDIKACIJE

Jedinjenja iz pronalaska i njihove farmaceutski prihvatljive soli imaju dejstvo kao farmaceutski lekovi, naročito kao inhibitori aktivnosti dipeptidil peptidaze I, i na taj način se mogu koristiti u lečenju:

1. respiratornog trakta: opstruktivne bolesti disajnih puteva, uključujući: astmu, uključujući bronhijalnu, alergijsku, intrinzičnu, ekstrinzičnu, vežbama indukovanu, lekovima indukovanu (uključujući aspirin i NSAID-indukovanu) i astmu izazvanu prašinom, isprekidanu i perzistentnu i svih jačina i drugih uzroka hiper-reakcije disajnih puteva; hronična opstruktivna bolest pluća (COPB); bronhitis, uključujući infektivni i eozinofilni bronhitis; emfizem; deficit alfa I-antitripsina, bronhiektazije; cistična fibroza; sarkoidoza; bolesti farmera i srodne bolesti; hipersenzitivni pneumonitis; plućna fibroza, uključujući kriptogeni fibrozirajući alveolitis, idiopatske intersticijske pneumonije, fibrozom komplikujuća antineoplastična terapija i hroničnu infekciju, uključujući tuberkulozu i aspergilozu i druge gljivične infekcije; komplikacije transplantacije pluća; vaskulitični i trombotski poremećaji u plućnoj vaskulaturi, poliangiitis (Vegenerova Granulomatoza) i plućna hipertenzija; antitusivne aktivnosti, uključujući lečenje hroničnog kašlja povezanog sa upalnim i sekretornim stanjem disajnih puteva, i jatrogenim kašljem; akutni i hronični rinitis, uključujući medicinski rinitis, i vazomotorni rinitis; višegodišnji i sezonski alergijski rinitis, uključujući rinitis nervoze (polensku groznicu); nosnu polipozu; akutnu virusnu infekciju, uključujući prehladu i infekciju zbog respiratornog sincitijalnog virusa, grip, koronavirusa (uključujući SARS) i adenovirusa;

2. kože: psorijaza, atopijski dermatitis, kontaktni dermatitis ili druge ekzematozne dermatoze, reakcije hipersenzitivnosti odloženog tipa; fito-i fotodermatitis; seboroični dermatitis, dermatitis herpetiformis, lihen planus, lihen sklerosus et atrofika, pioderma gangrenozum,

1

sarkoid kože, diskoidni lupus eritematozus, pemfigus, pemfigoid, epidermoliza buloza, urtikarija, angioedema, vaskulitidis, toksična eritema, kožna eozinofilija, alopecija areata, ćelavost muškog tipa, Svit-ov sindrom, Veber-Kristijan-ov sindrom, multiformni eritem; celulitis, i zarazan i neinfektivan; panikulitis; kožni limfomi, ne-melanomski rak kože i druge displastične lezije; poremećaji izazvani lekovima, uključujući fiksne erupcije lekova;

3. očiju: blefaritis; konjuktivitis, uključujući višegodišnji i vernalni alergijski konjuktivitis; iritis; anteriorni i posteriorni uveitis; horoiditis; autoimuni, degenerativni ili inflamatorni poremećaji koji utiču na mrežnicu; oftalmitis uključujući simpatički oftalmitis; sarkoidoza; infekcije, uključujući virusne, gljivične, i bakterijske;

4. genitourinarnih: nefritis uključujući intersticijski i glomerulonefritis; nefrotLčni sindrom; cistitis, uključujući akutni i hronični (intersticijski) cistitis i Hunerov ulcer akutni i hronični uretritis, prostatitis, epididimitis, ooforitis i salpingitis; vulvo-vaginitis; Pejronijeva bolest; erektilna disfunkcija (i muško i žensko);

5. odbacivanje alografta: akutno i nastajuće hronično na primer, transplantacija bubrega, srca, jetre, pluća, koštane srži, kože ili rožnice ili nakon transfuzije krvi; ili hronična transplantacija nasuprot bolesti domaćina;

6. druge auto-imune i alergijske poremećaje, uključujući reumatoidni artritis, sindrom iritabilnog creva, sistemski eritematozni lupus, multipla skleroza, Hašimotov tiroiditis, Graves-ova bolest, Atkinson-ova bolest, dijabetes melitus, idiopatski trombocitopenična purpurea, eozinofilni fasciitis, hiper-IgE sindrom, antifosfolipidni sindrom i Sazarijev sindrom;

7. onkologija: lečenje uobičajenih karcinoma, uključujući prostatu, dojku, pluća, jajnike, pankreas, crevo i debelo crevo, želudac, kožu i mozak, tumore i malignitete koji pogađaju koštanu srž (uključujući leukemije) i limfoproliferativne sisteme, kao što su Hodgkinov i ne-Hodgkinov limfom ; uključujući prevenciju i lečenje metastatske bolesti i recidiva tumora, i paraneoplastičnih sindroma; i,

8. infektivne bolesti: virusne bolesti poput genitalnih bradavica, običnih bradavica, plantarnih bradavica, hepatitisa B, hepatitisa C, virusa herpes simpleksa, moluskum kontagiozum, variole, virusa humane imunodeficijencije (HIV), humanog papiloma virusa (HPV), citomegalovirusa (CMV), virus varičela zoster (VZV), rinovirus, adenovirus, koronavirus, influenca, para-influenca; bakterijske bolesti kao što su tuberkuloza i Micobacterium avium, lepre; druge infektivne bolesti, kao što su gljivične bolesti, hlamidija, Candida, Aspergillus,

1 1

kriptokokni meningitis, Pneumocistis carnii, kriptosporidioza, histoplazmoza, toksoplazmoza, tripanozomska infekcija i leihmanijaze.

9. bol: nedavni literaturni podaci o miševima sa nedostatkom Katepsina C ukazuju na modulacijsku ulogu Katepsina C u osećaju boli. Prema tome, inhibitori Katepsina C takođe mogu biti korisni u kliničkom okruženju različitih oblika hroničnog bola, na pr. inflamatorni ili neuropatski bol.

Za lečenje gore opisanih bolesti i stanja, terapeutski efektivna doza će obično biti u opsegu od oko 0.01 mg do oko 100 mg/kg telesne težine po dozi jedinjenja iz ovog pronalaska; poželjno, od oko 0,1 mg do oko 20 mg/kg telesne težine po dozi. Na primer, za davanje osobi od 70 kg, raspon doza bi bio od oko 0,7 mg do oko 7000 mg po dozi jedinjenja iz ovog pronalaska, poželjno od oko 7,0 mg do oko 1400 mg po dozi. Možda će biti potreban određeni koraken rutinske optimizacije doze da bi se odredio optimalni nivo doziranja i šeme davanja. Aktivni sastojak može se davati od 1 do 6 puta dnevno.

Stvarna farmaceutski efektivna količina ili terapijska doza će naravno zavisiti od faktora koji poznaju stručnjaci, kao što su starost i težina pacijenta, način primene i težina bolesti. U svakom slučaju, aktivni sastojak će se primenjivati u dozama i na način koji omogućava davanje farmaceutski efektivne količine, na osnovu jedinstvenog stanja pacijenta.

1 2

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje sa formulom I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,

I gde Cy je

, gde W je izabran iz grupe koju čine CH i N; X je izabran iz grupe koju čine CH i N; Y je izabran iz grupe koju čine CH i N; pod uslovom da najviše jedan od W, X i Y može biti N; D-E je izabran iz grupe koju čine N(R<2>)-C(O), CH2CH2, C(O)-O i CH2-O; R<2>je izabran iz grupe koju čine H i C1-3-alkil; R<1>je izabran iz grupe koju čine H, C1-3-alkil, CH3OCH2CH2-, oksetanil, tetrahidrofuranil, 4-tetrahidropiranil i 3-tetrahidropiranil; i je 1, 2 ili 3; j je 1, 2 ili 3; pod uslovom da suma od i+j je 2, 3 ili 4.
2. Jedinjenje formule I prema zahtevu 1, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati, gde Cy je .
3. Jedinjenje formule I prema zahtevu 1, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati, gde Cy je

.
4. Jedinjenje formule I prema zahtevu 1, 2 ili 3, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati, gde R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3- i oksetanil.
5. Jedinjenje formule I prema bilo kom od zahteva 1 do 4, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati, gde R<2>je izabran iz grupe koju čine H i CH3.
6. Jedinjenje formule I prema bilo kom od zahteva 1 do 5, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati, gde 1 4 D-E je CH2-O.
7. Jedinjenje formule I prema zahtevu 1 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati, gde R<1>je izabran iz grupe koju čine H, CH3i oksetanil; R<2>je CH3; W je izabran iz grupe koju čine CH i N; X je izabran iz grupe koju čine CH i N; Y je CH; pod uslovom da najviše jedan od W, X i Y može biti N; D-E je izabran iz grupe koju čine N(R<2>)-C(O), CH2CH2, C(O)-O i CH2-O; i je 1 ili 2; j je 1 ili 2; pod uslovom da suma od i+j je 2, 3 ili 4.
8. Jedinjenje formule I prema bilo kom od zahteva 1 do 7, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati, gde A je izabran iz grupe koju čine formule A1 do A14: 1

A13 A14
9. Jedinjenje formule I prema zahtevu 8, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati, gde A je izabran iz grupe koju čine A2, A3, A4, A5, A6, A7, A10, A13, i A14. 1

1
10. Jedinjenje formule I prema zahtevu 8 ili 9, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati, gde A je izabran iz grupe koju čine A2 i A13

.
11. Jedinjenje formule I prema bilo kom od zahteva 1 do 10 izabran iz grupe koju čine primeri 1, 5, 8, 10, 12, 13, 14, 19, 22, 23, 24, 25 i 27,

1

1

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati.
12. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
13. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati, 11
14. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
15. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
16. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
17. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
18. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
19. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
20. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
21. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
22. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
23. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
24. Jedinjenje formule I prema zahtevu 11, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati,
25. Jedinjenje formule I prema bilo kom od zahteva 1 do 24 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati za upotrebu kao lek.
26. Jedinjenje formule I prema bilo kom od zahteva 1 do 24 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati za upotrebu kao lek za lečenje astme i alergijskih bolesti, upalnih bolesti gastrointestinalnog sistema, glomerulonefritisa, eozinofilnih bolesti, hroničnog opstruktivnog plućnog oboljenja, infekcije patogenim mikroorganizmima, reumatoidnog artritisa, neutrofilnih bolesti, cistične fibroze (CF), ne-cistične fibroze, idiopatske plućne fibroze, bronhiektaze, vaskulitis povezan sa ANCA, rak pluća, emfizem, hronični bronhitis, akutna povreda pluća (ALI), sindrom akutnog respiratornog distresa (ARDS), plućna hipertenzija, plućna arterijska hipertenzija (PAH) i deficijencija alfa-I-antitripsina (AATD), gojaznost i s tim povezane upale, insulinska rezistencija, dijabetes, masna jetra i steatoza jetre.
27. Farmaceutske kompozicije, naznačene time, što sadrže jedno ili više jedinjenja formule I prema bilo kom od zahteva 1 do 24 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvate.
28. Farmaceutska kompozicija koja sadrži dodatak na jedinjenje z formule I, prema bilo kom od zahteva 1 do 24, farmaceutski aktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od betamimetika, antiholinergika, kortikosteroida, PDE4 inhibitora, LTD4 antagonista, EGFR inhibitora, CRTH2 inhibitora, 5 LO inhibitora, antagonista Histaminskih receptora, CCR9 antagonista i SYK inhibitora, NE inhibitora, MMP9 inhibitora, MMP12 inhibitora, ali takođe i kombinacije dve ili tri aktivne supstance.