RS59458B1 - N-[2-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2h)-il]-3,5-difluorofenil}etil]-l-alanin i njegov tetrabutil ester - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na soli jedinjenja aminokiselinskih kiselina i na preparat koji

sadrži jedinjenje soli estera amino kiseline. Pronalazak se prema tome odnosi na jedinjenje ili smešu za upotrebu u inhibiciji enzima p38 MAP kinaze. Pored toga, pronalazak se odnosi na kiselinu koja je dobijena hidrolizom estarske grupe opisanog estarskog jedinjenja

aminokiseline.

Osnova pronalaska

[0002] Neodgovarajuća aktivacija leukocita uključujući monocite, makrofage i neutrofile koja dovodi do proizvodnje povišenih nivoa citokina kao što su TNF-α, IL1-β i IL-8, je karakteristika patogeneze nekoliko inflamatornih bolesti uključujući reumatoidni artritis, ulcerozni kolitis, Crohn-ovu bolest, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD), astmu i psorijazu, i ćelijske proliferativne bolesti sa inflamatornom komponentom. Proizvodnja citokina od strane inflamatornih ćelija je rezultat odgovora na različite spoljašnje stimuluse, i dovodi do aktivacije određenog broja intracelularnih mehanizama prenosa signala. Među njima se ističe superfamilija mitogen-aktiviranih protein kinaza (MAPK) koja se sastoji od visoko konzervativnih signalnih kinaza koje regulišu rast ćelija, diferencijaciju i odgovore na stres. Ćelije sisara sadrže najmanja tri familije MAPKs: p42/44 kinaza regulisana ekstracelularnim signalom (ERK) MAPKs, c-Jun NH2-terminalne kinaze (JNKs) i p38 MAPK (takođe označena kao p38a/Mpk2/RK/SAPK2a/CSBP1/2). p38 MAPK je prvi put klonirana nakon njene identifikacije kao kinaze kod koje je tirozin fosforilisan nakon stimulacije monocita sa lipopolisaharidom (LPS) [Han et al, Science 1994,265,808]. Opisani su dodatni homologi sisarske p38 i uključuju p38β [Jiang et al, J. Biol. Chem, 1996, 271, 17920], p38γ [Li et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 228, 334] i p38δ [Jiang et al, J.Biol.Chem. 1997, 272, 30122]. Dok su p38α i p38 β svuda eksprimirane, p38 γ je ograničena primarno na skeletni mišić i p38 δ je pretežno eksprimirana u plućima i bubregu.

[0003] Oslobađanje citokina od strane odbrambenih ćelija domaćina i odgovor leukocita na citokine i druge proinflamatorne stresove su do različitog stepena regulisani sa p38 MAPK [Cuenda et al, FEBS Lett, 1995, 364, 229-233]. U drugim ćelijskim tipovima, p38 MAPK kontroliše odgovore na stres kao što je proizvodnja IL-8 od strane bronhijalnih epitelnih ćelija stimulisanih sa TNF-α i ushodna regulacija molekula ćelijske adhezije ICAM-1 kod LPSstimulisanih endotelnih ćelija. Po aktivaciji, preko dvostruke fosforilacije TGY motiva sa dvostruko specifičnim kinazama MKK3 i MKK6, p38 MAPK ispoljava svoje efekte preko fosforilacije transkripcionih faktora i drugih kinaza. MAP kinaza-aktivirana protein kinaza-2 (MAPKAPK2) identifikovana je kao ciljno mesto za p38 fosforilaciju. Pokazano je da miševi [Kotlyarov et al, Nat. Cell Biol. 1999, 1, 94-97] kojima nedostaje MAPKAP-K2 oslobađaju snižene nivoe TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 i IFN-γ kao odgovor na LPS/galaktozaminom posredovani endotoksični šok. Regulacija nivoa ovih citokina kao i COX-2 je na nivou iRNK. Nivoi TNF-α su regulisani preko translacione kontrole preko AU-bogatih elemenata 3’-UTR TNF-α iRNK, sa MAPKAP-K2 signalizacijom koja povećava translaciju iRNK TNF-α. MAPKAP-K2 signalizacija dovodi so povećane stabilnosti iRNK u odnosu na COX-2, IL-6 i inflamatorni protein makrofaga. MAPKAP-K2 određuje lokaciju p38 MAPK u ćeliji kao i prenos p38 MAPK signala, jer poseduje jedarni lokalizacioni signal na njenom karboksi terminusu i jedarni eksportni signal kao deo svog autoinhibitornog domena [Engel et al, EMBO J.1998, 17, 3363-3371]. U ćelijama pod stresom, MAPKAP-K2 i p38 MAPK migriraju iz jedra u citoplazmu, gde se ova migracija dešava samo kada je p38 MAPK katalitički aktivna. Smatra se da je ovaj događaj vođen izlaganjem MAPKAP-K2 jedarnom eksportnom signalu, kao rezltat fosforilacije sa p38 MAPK [Meng et al, J. Biol. Chem. 2002, 277, 37401-37405]. Dodatno p38 MAPK ili direktno ili indirektno dovodi do fosforilacije nekoliko transkripcionih faktora za koje se smatra da posreduju u inflamaciji, uključujući ATF1/2 (aktivirajuće transkripcione faktore 1/2), CHOP-10/GADD-153 (gen 153 koji indukuje zaustavljanje rasta i oštećenje DNK), SAP-1 (pomoćni protein-1 faktora serumskog odgovora) i MEF2C (faktor-2 pojačanja miocita) [Foster et al, Drug News Perspect.2000, 13, 488-497].

[0004] U nekoliko slučajeva je pokazano da je inhbicija p38 MAPK ativnosti sa malim molekulima, korisna za tretman nekoliko bolesnih stanja sa neodgovarajućom proizvodnjom citokina uključujući reumatoidni artritis, COPD, astmu i cerebralnu ishemiju. Ovaj modalitet je bio predmet nekoliko preglednih radova [Salituro et al, Current Medicinal Chemistry, 1999, 6, 807-823 i Kumar et al, Nature Reviews Drug Discovery 2003, 2, 717-726].

[0005] Pokazno je da su inhibitori p38 MAPK efikasni u modelima reumatoidnog artritisa kod životinja, kao što je kolagenom indukovani artritis kod pacova [Revesz et al, Biorg. Med. Chem. Lett., 2000, 10, 1261-1364] i ađuvansom indukovani artritis kod pacova [Wadsworth et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1999, 291, 1685-1691]. U modelima sa miševima sa pankreatitisom izazvanom povredom pluća, prethodni tretman sa p38 MAPK inhibitorom smanjio je oslobađanje TNF-α u disajnim putevima i plućni edem [Denham et al, Crit. Care Med., 2000, 29, 628 i Yang et al, Surgery, 1999, 126, 216]. Inhibicija p38 MAPK pre imunizacije sa ovalbuminom (OVA) kod miševa osetljivih na OVA smanjila je akumulaciju citokina i inflamatornih ćelija u disajnim putevima u modelu alergijske inflamacije disajnih puteva [Underwood et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2000,293, 281]. Povećana aktivnost p38 MAP kinaze je uočena kod pacijenata koji boluju od inflamatorne bolesti creva [Waetzig et al, J.

Immunol, 2002,168, 5432-5351]. Pokazano je da su inhibitori p38 MAPK efikasni u modelima srčane hipertrofije kod pacova [Behr et al, Circulation, 2001, 104, 1292-1298] i cerebralne fokalne ishemije [Barone et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2001, 296, 312-321].

[0006] WO 2007/129040 i WO 2009/060160 obe opisuju estre alfa aminokiselina koji su inhibitori p38 MAP kinaze. U opisanim jedinjenjima, estarska grupa je estarska grupa koja se može hidrolizovati sa jednim ili više intracelularnih esteraznih enzima do karboksilne grupe kiseline; i susptituenti na ugljeniku estra alfa aminokiseline formiraju bočni lanac, koji je bočni lanac prirodne ili ne-prirodne alfa-aminokiseline.

[0007] Tvrdi se da su opisana jedinjenja potentni i selektivni inhibitori p38 MAPK (p38α, β, γ i δ) i njihovih izoformi i splajs varijanti naročito p38α, p38β i p38β2. Jedinjenja se stoga mogu upotrebiti u medicini, na primer u lečenju i profilaksi ovde opisanih imunih i inflamatornih poremećaja. Jedinjenja se karakterišu prisustvom aminokiselinskog motiva ili motiva estra aminokiseline -NH-CHR1R2 u molekulu koji se može hidrolizovati sa intracelularnom karboksilesterazom. Jedinjenja koja imaju lipofilni motiv estra aminokiseline prolaze ćelijsku membranu, i hidrolizovana su do kiseline sa intracelularnim karboksilesterazama. Proizvod polarne hidrolize akumulira se u ćeliji jer ne prolazi lako kroz ćelijsku membranu. Stoga je aktivnost p38 MAP kinaze produžena i pojačana unutar ćelije. Jedinjenja tog pronalaska su srodna sa inhibitorima p38 MAP kinaze obuhvaćenim opisima u međunarodnoj patentnoj prijavi WO03076405, ali se razlikuju po tome što imaju prethodno pomenuti motiv estra aminokiseline.

[0008] WO 2007/129040 takođe opisuje da jedinjenja o kojima se radi uključuju ona koja se selektivno akumuliraju u makrofagama. Poznato je da makrofage imaju ključnu ulogu u inflamatornim poremećajima preko oslobađanja citokina naročito TNFα i IL-1 (van Roon et al, Arthritis and Rheumatism, 2003, 1229-1238). Kod reumatoidnog artritisa oni najviše doprinose održavanju upale zglobova i uništavanju zglobova. Makrofage su takođe uključene u rast i razvoj tumora (Naldini and Carraro, Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2005, 3-8). Stoga sredstva koja selektivno ciljno deluju na proliferaciju ćelija makrofaga mogu biti od značaja u tretmanu kancera i autoimune bolesti. Bilo bi očekivano da ciljno delovanje na specifične tipove ćelija dovodi do smanjenja sporednih efekata. Način na koji je esterazni motiv vezan sa inhibitorom p38 kinaze određuje da li je hidrolizovan, i stoga da li se akumulira u različitim tipovima ćelija. Specifično, makrofage sadrže humanu karboksilesterazu hCE-1 dok drugi ćelijski tipovi ne sadrže. U opštoj formuli (I) iz WO 2007/129040, kada azot esteraznog motiva R1CH(R2)NH- nije direktno vezan za karbonil (-C(=O)-), tj. kada Y nije -C(=O), -C(=O)O- ili -C(=O)NR3- radikal, estar će biti hidrolizovan samo sa hCE-1 i stoga će se inhibitori akumulirati samo u makrofagama. Ovde, osim ukoliko je "monocit" ili "monociti" naznačen, termin makrofag ili makrofage biće korišćen da označi makrofage (uključujući makrofage povezane sa tumorom) i/ili monocite.

[0009] WO 2009/060160 opisuje grupu specifičnih jedinjenja koje spadaju u opšti opis WO 2007/129040, ali nisu specifično u njoj identifikovana ili ilustrovana primerom. Jedinjenja prikazuju prethodno razmatranu osobinu selektivnosti makrofaga.

Rezime pronalaska

[0010] Pronalazači predmetnog pronalaska su pronašli da je jedinjenje terc-butil N-[2-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}etil)-L-alaninat iznenađujuće dobro u inhibiciji aktivnosti p38 MAP kinaze. Testovi su pokazali da je vrednost IC50za inhibiciju estra TNF-α u humanoj krvi značajno niža nego što bi to bilo očekivano za vrednosti IC50za inhibiciju estra TNF-α u humanoj krvi uočenoj za srodna jedinjenja. Dodatno, testovi izvedeni od strane pronalazača pokazali su da je biodostupnost jedinjenja pronalaska mnogo veća nego što bi bilo predviđeno na osnovu strukturno sličnih, poznatih jedinjenja.

[0011] Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je: terc-butil N-[2-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}etil)-L-alaninat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, hidrat ili solvat.

[0012] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili ekscipijenasa.

[0013] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje jedinjenje kao što je prethodno definisano ili kompoziciju kao što je prethodno definisana za upotrebu u postupku lečenja terapijom humanog ili životinjskog tela.

[0014] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje kao što je prethodno definisano ili kompoziciju kao što je prethodno definisana za upotrebu u inhibiciji aktivnosti enzima p38 MAP kinaze in vitro ili in vivo. Dodatno je obezbeđeno jedinjenje kao što je prethodno definisano ili kompozicija kao što je prethodno definisana za upotrebu u prevenciji ili lečenju autoimune ili inflamatorne bolesti. Takođe je obezbeđeno jedinjenje kao što je definisano prethodno ili kompozicija kao što je definisana prethodno za upotrebu u tretmanu ćelijske proliferativne bolesti.

[0015] Ovde je takođe pomenuta kiselina koja je: N-[2-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}etil)-L-alanin.

Detaljan opis pronalaska

[0016] Pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je: terc-butil N-[2-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}etil)-L-alaninat. ili (b) metansulfonatna so tert-butilN- [2- {4- [6-amino-5- (2,4-difluorobenzoil) -2-oksopiridin-1 (2H) -il] -3,5-difluorfenil} etil) -L-alaninati.

[0017] Tipično, so je farmaceutski prihvatljiva so.

[0018] Da bi se izbegla sumnja, jedinjenje pronalaska može se koristiti u bilo kom tautomernom obliku.

[0019] Jedinjenje pronalaska uključuje hiralni centar. Jedinjenje je tipično u obliku L-alaninat derivata (tj. kao što je prikazano u Primeru 1). Međutim, jedinjenje može postojati kao D-alaninat derivat ili kao smeša D- i L- oblika. Gde je prisutna smeša, poželjno najmanje 90%, 95% ili 99% je prisutno kao L-alaninat derivat.

[0020] Pogodna šema i postupak za proizvodnju terc-butilN- [2- {4- [6-amino-5- (2,4-difluorobenzoil) -2-oksopiridin-1 (2H) -il] -3 , 5-difluorofenil} etil) -L-alaninat, sa referencom na sledeći odeljak primera, je diskutiran u nastavku.

[0021] Početni materijali su tipično 4-hlorofenil 3-(2,4-difluorofenil)-3-oksopropanimidotioat hidro-hlorid i 2-(4-Amino-3,5-difluorofenil)etanol. 2-(4-Amino-3,5-difluorofenil)etanol se može pripremiti korišćenjem sledeće šeme, koja je analogna šemi 1 iz odeljka primera:

[0022] Difluoronitrobenzen je komercijalno dostupan. Stadijum 1 zahteva dodavanje terc-butil acetat grupe fenil prstenu, para u odnosu na nitro grupu. Stadijum 2 zahteva hidrolizu estarske grupe da bi se formirala odgovarajuća kiselina. Kiselina je redukovana do primarnog alkohola u stadijumu 3. U stadijum 4 nitro grupa je redukovana do amina.

[0023] 4-hlorofenil 3-(2,4-difluorofenil)-3-oksopropanimidotioat hidrohlorid može se pripremiti korišćenjem eksperimentalnih procedura opisanih u WO 2003076405.

[0024] Jedinjenje, terc-Butil N-(2-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}etil)-L-alaninat se onda može sintetisati korišćenjem sledeće šeme, koja je analogna šemi 2 iz odeljka primera.

[0025] U stadijumu 1, 2-(4-Amino-3,5-difluorofenil)etanol i 4-hlorofenil 3-(2,4-difluorofenil)-3-oksopropanimidotioat hidrohlorid su zajedno reagovali da bi se formirao 2-(4-{[3-(2,4-difluorofenil)-3-oksopropanimidoilamino}-3,5-difluorofenil)etil acetat. U stadijumu 2, dodata je propiolna kiselina da bi se formirao 2-{4-[6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}etil acetat. U stadijumu 3, acetat grupa je hidrolizovana da bi ostao alkohol i u stadijumu 4 rezultujuća alkoholna grupa je oksidovana do aldehida. Jedinjenje pronalaska je zatim formirano u stadijumu 5, dodavanjem terc-butil L-alaninat hidrohlorida. Terc-butil L-alaninat hidrohlorid je komercijalno dostupan.

[0026] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili ekscipijenasa. Pomenuta farmaceutska kompozicija tipično sadrži do 85 tež% jedinjenja pronalaska. Tipičnije, sadrži do 50 tež% jeidnjenja pronalaska. Poželjne farmaceutske kompozicije su sterilne i bez pirogena.

[0027] Jedinjenje pronalaska može se primeniti u različitim doznim oblicima. Stoga, mogu biti primenjena oralno, na primer kao tablete, pilule, kapsule, lozenge, vodene ili uljane suspenzije, disperzibilni prahovi ili granule. Jedinjenja pronalaska mogu se takođe primeniti parenteralno, ili potkožno, intravenski, intramuskularno, intrasternalno, transdermalno ili tehnikama infuzije. Zavisno od korišćenog vehikuluma i koncentracije, lek može biti ili suspendovan ili rastvoren u vehikulumu. Kao prednost, ađuvansi kao što su lokalni anestetik, konzervans i pufer mogu se rastvoriti u vehikulumu. Jedinjenja se takođe mogu primeniti kao supozitorije. Jedinjenja se mogu primeniti inhalacijom u obliku aerosola preko inhalatora ili nebulizatora.

[0028] Jedinjenje pronalaska je tipično formulisano za primenu sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem. Na primer, čvrsti oralni oblici mogu sadržati, zajedno sa aktivnim jedinjenjem, sredstva za povećanje rastvorljivosti, npr. ciklodekstrine ili modifikovane ciklodekstrine; razblaživače, npr. laktozu, dekstrozu, saharozu, celulozu, kukuruzni skrob ili skrob krompira; lubrikante, npr. silicijum dioksid, talk, stearinsku kiselinu, magnezijum ili kalcijum stearat, i/ili polietilen glikole; sredstva za vezivanje; npr. skrobove, gumu arabiku, tragantovu gumu, želatin, sirup, akaciju, sorbitol, metilcelulozu, karboksimetilcelulozu ili polivinil pirolidon; sredstva za razbijanje agregacija, npr. skrob, alginsku kiselinu, alginate ili natrijum skrob glikolat; efervescentne smeše; boje; zaslađivače; sredstva za vlaženje, kao što je lecitin, polisorbati, laurilsulfati; i, generalno, netoksične i farmakološki neaktivne supstance korišćene u farmaceutskim formulacijama. Takvi farmaceutski preparati mogu se proizvesti na poznat način, na primer, putem postupka mešanja, granulisanja, tabletiranja, oblaganja šećerom, ili oblaganja filmom.

[0029] Tečne disperzije za oralnu primenu mogu biti rastvori, sirupi, emulzije i suspenzije. Tečni preparati mogu sadržati konvencionalne aditive kao što su suspendujuća sredstva, na primer sorbitol, sirup, metil celuloza, glukozni sirup, želatinske hidrogenizovane jestive masti; sredstva za stvaranje emulzije, na primer lecitin, sorbitan monooleat, ili akacija; ne-vodeni vehikulumi (koji mogu uključivati jestiva ulja), na primer bademovo ulje, frakcionisano kokosovo ulje, uljane estre kao što je glicerin, propilen glikol, ili etil alkohol; konzervanse, na primer metil ili propil p-hidroksibenzoat ili sorbinska kiselina, i ukoliko je poželjno konvencionalne aromatizere ili sredstva za bojenje. Rastvori mogu sadržati sredstva za povećanje rastvorljivosti npr. ciklodekstrine ili modifikovane ciklodekstrine. Sirupi mogu sadržati nosače, na primer, saharozu ili saharozu sa glicerinom i/ili manitol i/ili sorbitol.

[0030] Suspenzije i emulzije mogu kao nosač sadržati, na primer prirodnu gumu, agar, natrijum alginat, pektin, metilcelulozu, karboksimetilcelulozu, ili polivinil alkohol. Suspenzije ili rastvori za intramuskularne injekcije mogu sadržati, zajedno sa aktivnim jedinjenjem, farmaceutski prihvatljiv nosač, npr. sterilnu vodu, maslinovo ulje, etil oleat, glikole, npr. propilen glikol; sredstva za povećavanje rastvorljivosti, npr. ciklodekstrine ili modifikovane ciklodekstrine, ukoliko je poželjno, pogodnu količinu lidokain hidrohlorida.

[0031] Rastvori za intravensku primenu ili infuzije mogu kao nosač sadržati, na primer, sterilnu vodu i sredstva za povećanje rastvorljivosti, npr. cikodekstrine ili modifikovane ciklodekstrine ili poželjno mogu biti u obliku sterilnih, vodenih, izotoničnih slanih rastvora.

[0032] Za topikalnu primenu na kožu, lek se može napraviti kao krema, losion ili mast. Formulacije kreme ili masti koje se mogu koristiti za lek su konvencionalne formulacije dobro poznate u tehnici, na primer, kao što je opisano u standardnim farmaceutskim udžbenicima kaošto je British Pharmacopoeia.

[0033] Za topikalnu primenu inhalacijom, lek se može formulisati za dopremanje aerosolom na primer, mlaznim atomizerima pod pritiskom ili ultrazvučnim atomizerima, ili poželjno aerosolovima sa merenom dozom sa propelantom ili primenom bez propelanta mikronizovanog praška, na primer, inhalacionim kapsulama ili drugim sistemima dopremanja sa "suvim praškom". Ekscipijensi, kao što su, na primer, propelanti (npr. Frigen u slučaju aerosola sa merenom dozom), površinski aktivne supstance, sredstva za stvaranje emulzije, stabilizatori, konzervansi, aromatizeri, i punioci (npr. laktoza u slučaju prašaka za inhalaciju) mogu biti prisutni u takvim formulacijama za inhalaciju. Za svrhe inhalacije, dostupan je veliki broj aparata sa kojima se mogu stvoriti i primeniti aerosolovi optimalne veličine čestica, koristeći tehnike inhalacije koje su pogodne za pacijenta. Pored korišćenja adaptera (spejsera, ekspandera) i kruškastih spremnika (npr. Nebulator®, Volumatic®), i automatskih uređaja za emitovanje puferskog spreja (Autohaler®), za aerosolove sa merenom dozom, naročito u slučaju inhalatora sa prahom, dostupan je određen broj tehničkih rešenja (npr. Diskhaler®, Rotadisk®, Turbohaler® ili inhalatora na primer kao što su opisani u evropskoj patentnoj prijavi EP 0505321).

[0034] Za topikalnu primenu na oko, lek se može napraviti u rastvoru ili suspenziji u pogodnom sterilnom ili ne-vodenom vehikulumu. Mogu se takođe koristiti aditivi, na primer puferi kao što je natrijum metabisulfit ili dinatrijum edeat; takođe se mogu koristiti konzervansi uključujući baktericidne i fungicidne agense kao što je fenil merkuri acetat ili nitrat, benzalkonijum hlorid ili hlorheksidin, i sredstva za zgušnjavanje kao što je hipromeloza mogu takođe biti uključena.

[0035] Terapeutski efikasna količina jedinjenja pronalaska je primenjena na subjekta. Shvatiće se da će specifični nivo doze za bilo kog određenog subjekta zavisiti od različtiih faktora uključujući aktivnost primenjenog specifičnog jedinjenja, starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol, ishranu, vreme primene, put primene, stopu ekskrecije, kombinaciju lekova i težinu određene bolesti koja se tretira. Optimalni nivoi doze i učestalost doziranja će obično biti određeni kliničkim ispitivanjem.

[0036] Tipična dnevna doza je do 50 mg po kg telesne težine, na primer od 0.001 do 50 mg po kg telesne težine, u skladu sa aktivnošću specifičnog jedinjenja, starosti, težinom i stanjem subjekta koji se tretira, tipom i težinom bolesti i učestalosti i putem primene. Poželjno, dnevni dozni nivoi su od 0.05 mg do 2 g, poželjno od 0.1 mg do 10 mg. Jedinjenje pronalaska se tipično primenjuje na pacijenta u netoksičnoj količini.

[0037] Pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje kao što je ovde definisano ili kompoziciju kao što je ovde definisana za upotrebu u postupku tretiranja humanog ili životinjskog tela terapijom.

[0038] Pronađeno je da jedinjenja i kompozicije pronalaska inhibiraju aktivnost enzima p38 MAP kinaze. Jedinjenje i kompozicije su stoga korisne u prevenciji i tretmanu bolesti i stanja moduliranih sa aktivnošću p38 MAP kinaze. Bolesti i stanja modulirana sa aktivnošću p38 MAP kinaze uključuju ćelijske proliferativne bolesti kao što su kancer i psorijaza, poliglutaminska bolest kao što je Huntingdon-ova bolest, neurodegenerativna bolest kao što je Alzheimer-ova bolest, autoimuna bolest kao što je reumatoidni artritis, dijabetes, hematološka bolest, inflamatorna bolest, kardiovaskularna bolest, ateroskleroza, i inflamatorna sekvela infekcije. Naročiti primeri su ćelijska proliferativna bolest, autoimuna bolest i inflamatorna bolest.

[0039] Autoimuna bolest često ima inflamatornu komponentu. Takva stanja uključuju akutnu diseminirajuću alopeciju univerzalis, ANCA pozitivne bolesti, Behcet-ovu bolest, Chagas-ovu bolest, sindrom hroničnog umora, disautonomiju, encefalomijelitis, ankilozni spondilitis, aplastičnu anemiju, gnojni hidradenitis, autoimuni hepatitis, autoimuni ooforitis, celijačnu bolest, inflamatornu bolest creva, Crohn-ovu bolest, dijabetes melitus tip 1, Fanconi sindrom, arteritis džinovskih ćelija, glomerulonefritis, Goodpasture-ov sindrom, Grave-ovu bolest, Guillain-Barre sindrom, Hashimoto-ovu bolest, Henoch-Schönlein purpura, Kawasaki-jevu bolest, sistemski lupus eritematozus, mikroskopski kolitis, mikroskopski poliarteritis, mešovitu sistemsku bolest vezivnog tkiva, multiplu sklerozu, miasteniju gravis, sindrom opsoklonus -mioklonus, optički neuritis, Ord-ov tiroiditis, pemfigus, nodozni poliarteritis, polimijalgiju, reumatoidni artritis, Reiter-ov sindrom, Sjogren-ov sindrom, temporalni arteritis, Wegener-ov granulomatozis, toplu autoimunu hemolitičku anemiju, intersticijalni cistitis, lajmsku bolest, morfeu, psorijazu, sarkoidozu, sklerodermu, ulcerativni kolitis, i vitiligo.

[0040] Druga inflamatorna stanja koja se mogu sprečiti ili tretirati sa jedinjenjima i kompozicijama pronalaska uključuju, na primer, apendicitis, dermatitis, dermatomiozitis, endokarditis, fibrozitis, gingivitis, glositis, hepatitis, gnojni hidradenitis, iritis, laringitis, mastitis, miokarditis, nefritis, otitis, pankreatitis, parotitis, perikarditis, peritonoitis, faringitis, pleuritis, pneumonitis, prostatitis, pijelonefritis, i stomatitis, odbacivanje transplanta (uključujući organe kao što je bubreg, jetra, srce, pluća, pankreas (npr., ćelije ostrvaca), kostna srž, rožnjača, tanko crevo, kožni alograftovi, kožni homograftovi, i ksenograftovi srčanog zaliska, serumska bolest, i bolest transplanta protiv domaćina), akutni pankreatitis, hronični pankreatitis, akutni respiratorni disteres sindrom, Sexary-jev sindrom, kongenitalnu adrenalnu hiperplaziju, nesupurativni tiroiditis, hiperkalcemiju povezanu sa kancerom, pemfigus, bulozni dermatitis herpetiformis, tešku eritemu multiforme, eksfolijativni dermatitis, seboreični dermatitis, sezonski ili stalni alergijski rinitis, bronhijalnu astmu, kontaktni dermatitis, atopijski dermatitis, reakcije preosetljivost na lek, alergijski konjuktivitis, keratitis, oftalmički herpes zoster, iritis i oiridociklitis, horioretinitis, optički neuritis, simptomatsku sarkoidozu, hemoterapiju iznenadne ili diseminirane plućne tuberkuloze, idiopatsku trombocitopeniju purpuru kod odraslih, sekundarnu trombocitopeniju kod odraslih, stečenu (autoimunu) hemolitičku anemiju, leukemiju i limfome kod odraslih, akutnu leukemiju kod dece, regionalni enteritis, autoimuni vaskulitis, multiplu sklerozu, hroničnu opstruktivnu bolest pluća, odbacivanje transplanta čvrstog organa, sepsu, primarnu bilijarnu cirozu i primarni sklerozni holangitis.

[0041] Jedinjenja i kompozicije pronalaska su korisna u prevenciji i tretmanu inflamatornih i autoimunih bolesti i stanja. Inflamatorne i autoimune bolesti i stanja koja se mogu tretirati korišćenjem jedinjenja i kompozicija pronalaska uključuju reumatoidni artritis, psorijatični artritis, dijabetes tip 1, astmu, inflamatornu bolest creva, sistemski lupus eritematozus, i inflamaciju koja prati stanja infekcije (npr., sepsa), psorijazu, Crohn-ovu bolest, ulcerativni kolitis, hroničnu opstruktivnu bolest pluća, multiplu sklerozu, atopijski dermatitis, i bolest transplanta protiv domaćina.

1

[0042] Jedinjenja i kompozicije pronalaska su takođe korisni u tretmanu ćelijske proliferativne bolesti, na primer kancera. Primeri kancera koji se mogu tretirati uključuju kancer dojke, kancer ovarijuma, kancer pluća, kancer pankreasa, kancer jetre, kancer debelog creva, kancer bubrega, limfom i melanom. Na primer, kanceri koji se mogu tretirati uključuju kancer dojke, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer pluća, kancer debelog creva, kancer bubrega, limfom ili melanom.

[0043] Ovde je takođe pomenuta kiselina koja je:

N-[2-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}etil)-L-alanin.

[0044] Kiselina se može pripremiti hidrolizom jedinjenja pronalaska.

[0045] Kao što je ovde razmatrano, jedinjenje pronalaska je selektivno za makrofage. Stoga, estarska grupa jedinjenja pronalaska se može hidrolizovati od strane ćelija koje sadrže humanu karboksilesterazu hCE-1, a ne od strane ćelija koje sadrže hCE-2 ili hCE-3. Kiselina je stoga proizvedena unutar ćelija koje sadrže hCE-1 za hidrolizu estarske grupe jedinjenja pronalaska i kiselina se selektivno akumulira unutar takvih ćelija.

[0046] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan u Primerima koji slede.

Primeri

[0047] Jedinjenje pronalaska može se pripremiti prema sledećem Primeru.

Skraćenice

[0048]

CDI = karbonildiimidazol

DCM = dihlorometan

DMF = dimetilformamid

EtOAc = etil acetat

HCl = hlorovodonična kiselina

LCMS = tečna hromatografija visokih performansi /masena spektrometrija

MeOH = metanol

MgSO4= magnezijum sulfat

Na2CO3= natrijum karbonat

NaHCO3= natrijum bikarbonat

NMR = nuklearna magnetna rezonanca

STAB = natrijum triacetoksiborohidrid

THF = tetrahidrofuran

g = gram(i)

mg = milligram(i)

mL = mililitar(i)

mmol = milimol(ovi)

[0049] Komercijalno dostupni reagensi i rastvarači (HPLC kvaliteta) korišćeni su bez dodatnog prečišćavanja. Rastvarači su uklonjeni korišćenjem Buchi rotacionog evaporatora. Mikrotalasno zračenje je izvedeno korišćenjem Biotage Initiator™ Eight microwave synthesizer. Prečišćavanje jedinjenja sa „flash“ hromatografijom na koloni izvedeno je korišćenjem silika gela, veličine čestice 40-63 µm (230-400 rešetka) dobijenim od Fluorochem.

<1>H NMR spektri su zabeleženi na Bruker 300 MHz AV spektrometru u deuterisanim rastvaračima. Hemijska pomeranja (d) su u delovima na milion. Analiza tankoslojnom hromatografijom (TLC) izvedena je sa Kieselgel 60 F254(Merck) pločama i vizuelizovana korišćenjem UV svetlosti.

[0050] Analitička HPLC/MS izvedena je na Agilent HP 1100 LC sistemu korišćenjem Luna C18 kolone reverzne faze (3 mm, 50 x 4.6 mm), gradijent 5-95% B (A = voda / 0.1% mravlja kiselina, B = acetonitril/ 0.1% mravlja kiselina) tokom 2.25 min, protok = 2.25 mL/min. UV spektri su zabeleženi na 220 i 254 nm korišćenjem G1315B DAD detektora. Maseni spektri su dobijeni u opsegu m/z 150 do 800 na LC/MSD SL G1956B detektoru. Podaci su integrisani i objavljeni korišćenjem ChemStation i ChemStation Data Browser programa.

Intermedijeri

Intermedijer 1: 4-hlorofenil 3-(2,4-difluorofenil)-3-oksopropanimidotioat hidrohlorid

[0051]

[0052] Intermedijer 1 može se pripremiti eksperimentalnim postupcima opisanim u WO 2003076405.

Intermedijer 2: 2-(4-Amino-3,5-difluorofenil)etanol

[0053]

[0054] Intermedijer 2 je sintetisan korišćenjem puta prikazanog na Šemi 1 u nastavku.

Šema 1

Stadijum 1 - terc-Butil (3,5-difluoro-4-nitrofenil)acetat

[0055] Rastvor difluoronitrobenzena (24.96 g, 157 mmol) i terc-butil hloroacetata (38.0 mL, 267 mmol) u anhidrovanom DMF (200 mL) dodat je u kapima tokom jednog sata hladnoj (-35°C) suspenziji kalijum terc-butoksida (61.61 g, 549 mmol) u anhidrovanom DMF (200 mL) pod azotom. Reakciona smeša je mešana na -35°C 1.5 čas, ugašena sa 2N HCl (240 mL) i ekstrahovana sa heptanima (4x200 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom (3x200 mL), fiziološkim rastvorom (200 mL), osušeni (MgSO4), filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi ostalo žuto ulje. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (10 % EtOAc u heptanima) dalo je žuto ulje (37.64 g). Druge dve serije (10.00 g i 23.54 g difluoronitrobenzena) dalo je 14.30 g i 31.39 g proizvoda, respektivno.<1>H NMR sve tri serije pokazali su smešu željenog jedinjenja i male količine neidentifikovanih nečistoća.3 serije su kombinovane i korišćene u sledećem stadijumu bez dodatnog prečišćavanja.

<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) 7.05 (2H, d, J=8.5 Hz), 3.56 (2H, s), 1.46 (9H, s).

Stadijum 2 - (3,5-Difluoro-4-nitrofenil)sirćetna kiselina

1

[0056] Trifluorosirćetna kiselina (150 mL) dodatna je u kapima tokom 20 minuta hladnom (0°C) rastvoru terc-butil (3,5-difluoro-4-nitrofenil)acetata (83.33 g, 305 mmol) u DCM (300 mL). Nakon završetka dodavanja, dozvoljeno je da se reakciona smeša zagreje do sobne temperature i mešana je 3 časa. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi ostala lepljiva braon supstanca. Trituracija sa heptanima dala je jedinjenje iz naslova kao žutu čvrstu supstancu (53.29 g, 67 % prinos iz dva koraka).

<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) 7.08 (2H, d, J=8.5 Hz), 3.74 (2H, s), -CO2H nije vidljiv.

Stadijum 3 - 2-(3,5-Difluoro-4-nitrofenil)etanol

[0057] Bor-dimetil sulfid kompleks (35 mL, 368 mmol) dodat je u kapima tokom 20 minuta hladnom (0°C) rastvoru (3,5-difluoro-4-nitrofenil)sirćetne kiseline (53.29 g, 245 mmol) u anhidrovanom THF (500 mL) pod azotom. Nakon završetka dodavanja, dozvoljeno je da se reakciona smeša zagreje do sobne temeprature, mešana 16 časova, ohlađena do 0°C, pažljivo ugašena sa MeOH (300 mL) i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi ostalo braon ulje. Prečišćavanjem suvom „flash“ hromatografijom (60-80 % EtOAc u heptanima) dalo je jedinjenje iz naslova kao narandžasto ulje (38.90 g, 78 % prinos).

<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) 7.01 (2H, d, J=8.7 Hz), 3.93 (2H, t, J=6.2 Hz), 2.92 (2H, t, J=6.2 Hz), 2.34 (1H, br s).

Stadijum 4 - 2-(4-Amino-3,5-difluorofenil)etanol

[0058] 2-(3,5-Difluoro-4-nitrofenil)etanol (38.90 g, 191 mmol) je rastvoren u EtOAc (250 mL). Reakcioni sud je evakuisan i napunjem sa azotom tri puta. Paladijum na ugljeniku (10 tež%, 4.00 g) dodat je i sud je ispražnjen i napunjen sa azotom tri puta. Konačno, sud je evakuisan i napunjen sa vodonikom i opremljen sa balonom koji sadrži vodonik. Nakon toga, mešanje na sobnoj temperaturi pod vodonikom 15 časova, balon sa vodonikom je ponovo napunjen i smeša je mešana dodatnih 25 časova. Reakciona smeša je filtrirana kroz Celite® i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi ostalo braon ulje. Prečišćavanje suvom „flash“ hromatografijom (50% EtOAc u heptanima) dalo je jedinjenje iz naslova kao bež čvrstu supstancu (20.70 g, 62 % prinos).

<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) 6.73-6.70 (2H, m), 3.81 (2H, t, J=6.4 Hz), 2.75 (2H, t, J=6.4 Hz), -OH i -NH2nisu vidljivi.

Primer 1: terc-Butil N-(2-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}etil)-L-alaninat

[0059]

[0060] Primer 1 je sintetisan korišćenjem puta prikazanog na Šemi 2 u nastavku.

Šema 2

Stadijum 1 - 2-(4-{[3-(2,4-Difluorofenil)-3-oksopropanimidoil]amino}-3,5-difluorofenil)etil acetat

[0061] 2-(4-Amino-3,5-difluorofenil)etanol (20.71 g, 120 mmol) dodat je rastvoru 4-hlorofenil 3-(2,4-difluorofenil)-3-oksopropanimidotioat hidrohlorida (41.26 g, 114 mmol) u glacijalnoj sirćetnoj kiselini (400 mL). Reakciona smeša je mešana na 80°C 2.5 časa i dodat je anhidrid sirćetne kiseline (21 mL, 228 mmol). Nakon dodatnih 45 minuta na 80°C, dozvoljeno je da se reakciona smeša ohladi do sobne temperature i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi ostalo braon ulje. Trituracija sa EtOAc dala je bež čvrstu supstancu, koja je isprana sa dietil etrom. Čvrsta supstanca je preneta u zasićeni vodeni rastvor NaHCO3i snažno mešana 30 minuta. Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana vodom i dozvoljeno je da se osuši

1

pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bež čvrsta supstanca (23.36 g, 52 % prinos).

LCMS: m/z 397 [M+H]<+>.

Stadijum 2 - 2-{4-[6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-l(2H)-il]-3,5-difluorofenil} etil acetat

[0062] Propiolna kiselina (5.4 mL, 88 mmol) dodata je u kapima tokom 5 minuta hladnom (0°C) rastvoru CDI (14.27 g, 88 mmol) u anhidrovanom THF (400 mL) pod azotom. Nakon završetka dodavanja, dozvoljeno je da se reakciona smeša ohladi do sobne temperature i mešana je jedan čas. Dodat je rastvarač 2-(4-{[3-(2,4-difluorofenil)-3-oksopropanimidoil]amino}-3,5-difluoro-fenil)etil acetat (23.26 g, 59 mmol) u anhidrovanom THF (200 mL) i reakciona smeša je mešana na refluksu 6.5 časova. Dozvoljeno je da se reakciona smeša ohladi do sobne temperature i ostavljen da stoji 16.5 časova. Propiolna kiselina (5.4 mL, 88 mL), CDI (14.27 g, 88 mmol) i THF (200 mL) su tretirani kao što je prethodno opisano i dodati reakcionoj smeši, koja je nakon toga mešana na refluksu dodatnih 6 časova. Zatim je dozvoljeno da se reakciona smeša ohladi do sobne temperature i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi ostalo braon ulje. Prečišćavanje suvom „flash“ hromatografijom (5% MeOH u DCM) dalo je tamno braon čvrstu supstancu, koja je dalje prečišćena trituracijom sa EtOAc da bi se dobilo jedinjejne iz naslova kao žuta čvrsta supstanca (7.45 g, 28 % prinos).

LCMS: m/z 449 [M+H]<+>i 471 [M+Na]<+>.

Stadijum 3 - 6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-1-[2,6-difluoro-4-(2-hidroksietil)fenil]piridin-2(1H)-on

[0063] 2-{4-[6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}etil acetat (7.45 g, 17 mmol) suspendovan je u 6N HCl (80 mL) i reakciona smeša je refluksovana 21.5 časova. Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, preneta u zasićeni vodeni rastvor NaHCO3(200 mL) i snažno mešana 30 minuta. Čvrsta usptanca je sakupljena filtracijom, isprana sa vodom i osušena u vakuumskoj peći (40°C) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bež čvrsta supstanca.

LCMS: m/z 407 [M+H]<+>i 429 [M+Na]<+>.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 7.57 (1H, td, J=6.6, 8.3 Hz), 7.41 (1H, td, J=2.4, 9.7 Hz), 7.37-7.29 (3H, m), 7.23 (1H, td, J=2.3, 8.5 Hz), 5.74 (1H, d, J=9.8 Hz), 4.78 (1H, t, J=5.1 Hz), 3.76-3.70 (2H, m), 2.86 (2H, t, J=6.7 Hz), -NH2nije vidljiv

Stadijum 4 - {4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}-acetaldehid

1

[0064] Dess-Martin perjodinan (1.03 g, 2. 4 mmol) dodat je suspenziji 6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-1-[2,6-difluoro-4-(2-hidroksietil)fenil]piridin-2(1H)-ona (823 mg, 2.0 mmol) u DCM (20 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 časa, ugašena sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(10 mL) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum tiosulfata (10 mL) i snažno mešana 30 minuta. Vodeni sloj je odvojen i dodatno ekstrahovan sa DCM (2x20 mL). Kombinovani organski ekstrakti su osušeni (MgSO4), filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bledo braon čvrsta supstanca (819 mg). Ona je korišćena bez dodatnog prečišćavanja u sledećem stadijumu.

Stadijum 5 - terc-butil N-(2-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}etil)-L-alaninat

[0065] terc-butil L-alaninat hidrohlorid (552 mg, 3.0 mmol) i STAB (1.29 g, 6.1 mmol) dodati su rastvoru {4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-2-oksopiridin-1(2H)-il]-3,5-difluorofenil}-acetaldehida (819 mg, 2.0 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3.5 časa, ugašena sa zasićenim vodenim rastvorom Na2CO3(20 mL) i snažno mešana 20 minuta. Vodeni sloj je razdvojen i dodatno ekstrahovan sa EtOAc (2x20 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani sa fiziološkim rastvorom (20 mL), osušeni (MgSO4), filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi ostalo žuto ulje. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (5% MeOH u DCM) dalo je jedinjenje iz naslova kao bledu žutu čvrstu supstancu (492 mg, 78 % prinos iz dva koraka).

LCMS: čistoća 98 %, m/z 534 [M+H]<+>.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 7.58 (1H, td, J=6.8, 8.3 Hz), 7.41 (1H, td, J=2.3, 9.8 Hz), 7.37-7.30 (3H, m), 7.23 (1H, td, J=2.3, 8.5 Hz), 5.74 (1H, d, J=9.8 Hz), 3.20 (1H, d, J=7.0 Hz), 2.89-2.70 (4H, m), 1.42 (9H, s), 1.16 (3H, d, J=7.0 Hz), -NH2i -NH- nisu vidljivi

Primer 2: Merenje bioloških aktivnosti

Aktivnost p38 MAP kinaze

[0066] Sposobnost jedinjenja da inhibiraju aktivnost p38 MAP kinaze merena je u testu izvedenom od strane Upstate (Dundee UK). U finalnoj reakcionoj zapremini od 25µL, p38 MAP kinaza (5-10 mU) je inkubirana as 25mM Tris pH 7.5, 0.002 mMEGTA, 0.33 mg/mL mijelin baznim proteinom, 10mM Mg acetata i [g-33p-ATP] (specifična aktivnost približno 500cpm/pmol, koncentracija po potrebi). Reakcija je inicirana dodavanjem MgATP smeše. Nakon inkubacije od 40 minuta na sobnoj temperaturi, reakcija je zaustavljena dodavanjem

1

5µL 3% rastvora fosforne kiseline.10µL reakcije je zatim istačkano na P30 filtermat i isprano tri puta po 5 minuta u 75 mM fosforne kiseline i jednom u metanolu pre sušenja i scintilacionog brojanja.

[0067] Duplirane tačke podataka stvorene su iz 1/3 log serija razblaženja stok rastvora u DMSO. Načinjeno je devet koraka razblaženja od najviše koncentracije od 10µM, i uključena je blanko ’bez jedinjenja’. Standardna radiometrijska filter-vezujuća analiza je izvedena na ATP koncentraciji na, ili blizu, Km. Podaci za scintilaciono brojanje su sakupljeni i podvrgnuti „freefit“ analizi sa Prism programom. Iz generisane krive, određena je i saopštena 50% inhibicija.

LPS-stimulacija THP-1 ćelija

[0068] THP-1 ćelije su stavljene na ploču u 100µl sa gustinom od 4 x 10<4>ćelije/komorici u 96 komornu ploču sa V-dnom tretiranom kulturom tkiva i inkubiranom na 37°C u 5% CO216 č.2 č nakon dodavanja inhibitora u 100µl medijuma kulture tkiva, ćelije su stimulisane sa LPS (E coli soj 005:B5, Sigma) na finalnoj koncentraciji od 1µg/ml i inkubirane na 37°C u 5% CO26 č. Nivoi TNF-α su mereni u supernatantima bez ćelija sa sendvič ELISA (R&D Systems #QTA00B).

LPS-stimulacija cele humane krvi

[0069] Cela krv je uzeta venskom punkcijom korišćenjem heparinizovanih vakutejnera (Becton Dickinson) i razblažena u jednakoj zapremini RPMI1640 medijuma kulture tkiva (Sigma).100µl je stavljeno u 96 komornu ploče sa V-dnom tretiranom kulturom tkiva. 2 č nakon dodavanja inhibitora u 100µl RPMI1640 medijuma, krv je stimulisana sa LPS (E. coli soj 005:B5, Sigma) na finalnoj koncentraciji od 100ng/ml i inkubirano na 37°C u 5% CO26 č. Nivoi TNF-α su mereni iz supernatanta bez ćelija sa sendvič ELISA (R&D Systems #QTA00B).

Izlaganje plazme kod miševa

[0070] Jedinjenja su formulisana u 8% DMSO, 92% 11.25% hidroksipropil-β-ciklodekstrinu u vodi korišćenjem sledeće procedure: jedinjenja su potpuno rastvorena u 100% DMSO i zatim je dodat rastvor hidroksipropil-β-ciklodekstrina. Formirani fini precipitat je ponovo rastvoren dodavanjem vodenog rastvora HCl i pH je podešena na 4 sa vodenim rastvorom natrijum hidroksida.

[0071] Svako jedinjenje je primenjeno oralno sa 10 mg/kg, u ukupnoj zapremini doze od 5 ml/kg, na mužjake CD1 miševa (25-20g). Tri miša su korišćena za svaku vremensku tačku. Uzorci krvi su uzeti u sledećim vremenskim tačkama: 5, 15, 30, 60, 120, 240 i 360 minuta, terminalnom kardijalnom punkturom, pod anestezijom halotan/izofluoran. Uzorci krvi su

1

sakupljeni u prethodno ohlađene epruvete sa NaF/EDTA i mešani. Uzorci su centrifugirani na 7-7.5 x g 2 minuta. Plazma je aspirirana i zamrznuta.

[0072] Uzorci plazme su pripremljeni precipitacijom proteina korišćenjem tri zapremine acetonitrila koji sadrži interni standard. Supernatanti su analizirani sa LCMS (Sciex API 3000, HP 1100 binarna pumpa, CTC PAL). Hromatografija je bazirana na Acentis C8 (50 x 2.1 mm) koloni i mobilna faza od 5-95% acetonitrila u vodi/0.1% mravljoj kiselini.

[0073] Izlaganje (AUC) je izračunato iz plazma koncentracije nasuprot vremenskog profila korišćenjem PK Solutions 2.0 (Summit Research Services, Montrose, Colorado).

1

a nj jein jed a dn sro nor tu uk str i u ask al

pron a

pre a enj inj jed st no iv aktka ošiolB

– 1la abe

T

Tabela 2 – Izlaganje plazme kod miševa

Zaključci

[0075] Tabela 1 pokazuje da je jedinjenje predmetnog pronalaska dobar inhibitor p38 MAP kinaze. Pored toga, IC50 vrednosti za estarsku inhibiciju TNF-α u THP-1 ćelijama i humanoj krvi su veoma niske. Naročito, estarska inhibicija TNF-α u humanoj krvi je značajno niža nego što bi se očekivalo imajući u vidu IC50 vrednosti za estarsku inhibiciju TNF-α u humanoj krvi zabeležene za srodna jedinjenja.

[0076] AUC podaci predstavljeni u Tabeli 2 pokazuju da je biodostupnost jedinjenja prema pronalasku mnogo viša nego kod strukturno-sličnih, poznatih jedinjenja.

2

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Kiselina koja je:

N- [2- {4- [6-amino-5- (2,4-difluorobenzoil) -2-oksopiridin-l (2H) -il] -3,5-difluorofenil} etil) -L-alanin.

2. Jedinjenje koje je:

(a) etansulfonatna so tert-butil N- [2- {4- [6-amino-5- (2,4-difluorobenzoil) -2-oksopiridin-1 (2H) -il] -3,5-difluorofenil } etil) -L-alaninate; ili

(b) metan sulfonatna so tert-butilN- [2- {4- [6-amino-5- (2,4-difluorobenzoil) -2-oksopiridin-1 (2H) -il] -3,5-difluorofenil } etil) -L-alaninate.

3. Jedinjenje prema zahtevu 2, koje je etansulfonatna so tert-butil N- [2- {4- [6-amino-5- (2,4-difluoro-upozoil) -2-oksopiridin-1 (2H) - il] -3,5-dif} etil) -L-alaninates.

4. Jedinjenje prema zahtevu 2, koje je metansulfonatna so tert-butil N- [2- {4- [6-amino-5-(2,4-difluoro-upozoil) -2-oksopiridin-1 (2H) - il] -3,5-difluorofenil} etil) -L-alaninata.

5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema patentnom zahtevu 2 ili 4 zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili ekscipijenasa.

6. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2 do 4 ili kompozicija prema patentnom zahtevu 2 za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog ili životinjskog tela pomoću terapije.

7. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2 do 4 ili kompozicija prema patentnom zahtevu 2 za upotrebu u inhibiciji aktivnosti enzima p38 MAP kinaze in vitro ili in vivo.

8. Jedinjenje ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 naznačeno time što jedinjenje ili kompozicija je za upotrebu u prevenciji ili lečenju autoimune ili inflamatorne bolesti.

9. Jedinjenje ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8 naznačeno time što je jedinjenje ili kompozicija za upotrebu u prevenciji ili lečenju reumatoidnog artritisa, psorijatičnog artritisa, dijabetesa tipa 1, astme, inflamatorne bolesti creva, sistemskog lupus eritematozusa, infektivnih stanja koja prate inflamaciju, psorijaze, Crohn-ove bolesti, ulceroznog kolitisa, hronične opstruktivne bolesti pluća, multiple skleroze, atopijskog dermatitisa ili bolesti transplanta protiv domaćina.

2

10. Jedinjenje ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 naznačeno time što jedinjenje ili kompozicija je za upotrebu u lečenju ćelijske proliferativne bolesti.

11. Jedinjenje ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 10 naznačeno time što je jedinjenje ili kompozicija za upotrebu u lečenju kancera.

12. Jedinjenje ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11 naznačeno time što jedinjenje ili kompozicija je za upotrebu u lečenju kancera dojke, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera pluća, kancera debelog creva, kancera bubrega, limfoma ili melanoma.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5