RS59476B1 - Upotreba artemizinin jedinjenja i gefirin agonista u medicini - Google Patents

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na artemizinin jedinjenje, kako je definisano u patentnim zahtevima, za upotrebu u tretmanu pacijenata sa dijabetesom za povećanje nivoa insulina.

POREKLO PRONALASKA

[0002] Kod pacijenata sa dijabetesom tip 1 često postoji gubitak svih funkcionalnih beta ćelija, na šta ukazuje potpuno otsustvo insulin C-peptida iz njihovog seruma. Pokazano je da transplantacija pankreatičnih ostrvaca u osnovi leči, ali je ograničena raspoloživošću ostrvaca donora, imunološkim komplikacijama i preživljavanjem transplanta. Prema tome, učinjeni su pokušaji da se regenerišu ćelije ćelije pacijenta specifične za produkciju insulina koristeći kao izvore različita tkiva, uključujući embrionalne stem ćelije (ES), indukovane višepotentne stem ćelije (iPS), hepatične, egzokrine i alfa ćelije (Al-Hasani i saradnici, 2013; Collombat i saradnici, 2009; Zhou i saradnici, 2008). U većini slučajeva, pristupi za povećanje mase beta ćelija su bili zasnovani na prekomernoj ekspresiji glavnih faktora regulacije transkripcije uključenih u normalni razvoj pankreasa a samo u nekoliko slučajeva su korišćene male molekule ili biološki izvori. Alfa ćelije su posebno atraktivne kao početna tačka jer je njihov razvoj blisko povezan sa beta ćelijama. Pokazano je da su ove ćelije sposobne da ispune masu ćelija koje produkuju insulin nakon velikog gubitka beta ćelija. U genetičkom modelu, prekomerna ekspresija Pax4 faktora transkrpcije može u toku razvoja da prevede alfa ćelije miševa u beta ćelije (Collombat i saradnici, 2009) i kada se nadraže kod odraslih (Al-Hasani i saradnici, 2013). Na molekularnom nivou, Pax4 faktor beta ćelija deluje direktnim suzbijanjem Arx faktora glavne regulatorne transkripcije alfa ćelije a gubitak samo Arx je dovoljan da konvertuje alfa u beta ćelije (Courtney i saradnici, 2013).

[0003] U nekim antidijabetičnim tretmanima se koriste ekstrakti biljaka; za više od 800 biljaka je zabeleženo da imaju antihiperglikemične efekte sa manje neželjenih efekata i manjom toksičnošću u poređenju sa sintetičkim jedinjenjima. Na primer, ekstrakciju nadzemnih delova Artemisia indica su, na primer, opisali Ahmad i saradnici (2014). Nađeno je da se glavne funkcije ovih ekstrakta zasnivaju na zaštitnom delovanju na glavna tkiva kao što su bubrezi, jetra i pankreas.

[0004] Artemizinin je seskviterpen lakton endoperoksid ekstrahovan i izolovan iz lišća Artemisia annua i dobro je poznat kao antimalarični lek. Artemizinin i njegovi derivati su opisani u WHO monografiji za dobru praksu gajenja i sakupljanja (GACP) za Artemisia annua L. (WHO monografija 2006).

[0005] U potpuno različitoj oblasti, to jest oblasti GABA receptora (to jest, receptora gamaaminobuterne kiseline, ovde označene kao GABAR) koji je jonotropični receptor i ligand jona ulaznog kanala i njegovog endogenog liganda koji je gama-aminobuterna kiselina (GABA) mehanizmi formiranja i plastičnost GABAergične sinapse i uloga GABA receptora u regulaciji neurogeneze kod odraslih su bili predmet istraživanja za razumevanje funkcije CNS (Tyagarajan i saradnici, 2010). Gepirin se smatra matričnom molekulom inhibitornih sinapsi i doprinosi nagomilavanju GABAR. Poznato je da BTB domeni proteina stupaju u interakciju sa Cullin familijom ubikvitin ligaza i odgovorni su za ciljanje specifičnih proteina substrata za ubikvitinaciju a zatim degradaciju (Stogios i saradnici Genome biology 2005, Genau i saradnici Mol. Cell 2015). Poznato je da su GABA receptori ubikvitinirani (Arancibia-Cárcamo i saradnici PNAS 2009).

[0006] WO 2012/033266 A1 opisuje specifične artemizinin derivate koji su specifični glikolipidni hibrid derivati, njihovu antiangiogeničnu aktivnost i upotrebu u prevenciji i lečenju angiogeničnih bolesti, među kojima, angiogeničnih bolesti povezanih sa dijabetesom.

[0007] Davis i saradnici (Br. J. Clin. Pharmacol.1997, 44(1):1-7) opisuju potencijalni efekat antimalaričnih lekova na koncentraciju glukoze i insulina u plazmi.

[0008] Suresh i saradnici (International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research 2011, 3081) opisuju fitohemijske i farmakološke osobine Artemisia pallens, Walls. Ex DC, obično poznate kao Davana, aromatične trave otkrivene u Indiji, koja se koristi za tretman dijabetes melitusa.

[0009] Ahmad i saradnici (Journal of Ethnopharmacology 2014, 151(1): 618-623) opisuju antidijabetičnu aktivnost Artemisia indica linn (nadzemni delovi) kod Streptozotinom indukovanog dijabetesa kod pacova.

[0010] Ribnicky i saradnici (International Journal of Pharmaceutics 2009, 370(1-2):87-92) opisuju antidijabetični ekstrakt Artemisia dracunculus.

[0011] Mannan i saradnici (Archives of Pharmaceutical Research 2011, 34(10):1657-1661) opisuju biosintezu artemizinina u nekoliko Artemisia vrsta.

[0012] WO2014/048788A1 opisuje produkciju pankreatičnih beta ćelija inhibicijom ekspresije ili aktivacije Arx u populaciji pankreatičnih alfa ćelija.

[0013] Suckow i saradnici (Endocrinology 2008, 149(12):6006-6017) opisuju vanćelijsku mašineriju pankreatičnih beta ćelija i razvojni put beta ćelija.

[0014] WO2014/007853A1 opisuje dihidromiricitin za tretman bolesti i poremećaja glutamatergičkog sistema.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

[0015] Cilj ovog pronalaska je da identifikuje jedinjenja koja imaju potencijal da indukuju ili pojačaju produkciju insulina u pankreatičnim ćelijama i koja imaju potencijal da se koriste kao medikament zasnovan na novom načinu delovanja.

[0016] Cilj je postignut predmetom ovog pronalaska.

[0017] U skladu sa pronalaskom, ovde je obezbeđeno artemizinin jedinjenje za upotrebu u tretmanu pacijenata sa dijabetesom, kao što je povećanje nivoa insulina, posebno povećanje broja beta ćelija, ekspresije insulina ili nivoa glukoza-zavisnog insulina u krvi kod pacijenta, pri čemu je artemizinin jedinjenje opšte formule I

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

----- je jednostruka ili dvostruka veza;

R1, R2, R3, R4i R6predstavljaju nezavisno H, halogen, -CF3, = CH2, -OR<a>, -NR<a>R<b>, -(CH2)nCOOR<a>, -(CH2)nC(=O)R<a>, -(CH2)nCONR<a>R<a>, C1-6alkil, C2-6alkenil,

C2-6alkinil, C3-7cikloalkil, C3-7heterocikloalkil, aril ili heteroaril grupe; i

R5predstavlja H, halogen, =O, -OR<a>, -NR<a>R<b>, -(CH2)nCF3, -(CH2)nCHF2, -(CH2)nC(=O)R<a>, -O(CH2)nCOOR<a>, -OC(=O)(CH2)nCOOR<a>, -OC(=O)R<a>, C1-6alkil, C2-6alkenil, C2-6alkinil, C3-7cikloalkil, C3-7heterocikloalkil, aril ili heteroaril grupu; i X predstavlja O ili -NR<a>;

R<a>predstavlja H ili opciono supstituisanu C1-6alkil, C2-6alkenil ili C2-6alkinil grupu; i R<b>predstavlja H ili opciono supstituisanu C1-6alkil, C2-6alkenil, C2-6alkinil, cikloalkil, aril, heteroaril ili aralkil grupu; ili

R<a>i R<b>zajedno sa susednim atomom azota predstavljaju heterocikličnu grupu, gde je heterociklični atom N, O ili S; i gde je heterociklični atom opciono supstituisan (artemizon); i

n je 0, 1, 2 ili 3.

[0018] Preciznije, artemizinin jedinjenje je bez artemizinin derivata koji je hibrid sa glikoliptidnom komponentom.

[0019] Preciznije, artemizinin jedinjenje se koristi za lečenje pacijenata obolelih od dijabetesa ili poremećaja povezanih sa dijabetesom, na primer dijabetesa tip I, dijabetesa tip II, C-peptid negativnog ili pozitivnog dijabetesa ili poremećaja povezanih sa dijabetesom.

[0020] Preciznije, jedinjenje se primenjuje na pacijentu u terapeutski efektivnoj količini da poveća ekspresiju ili nivo insulina, a posebno za lečenje hipoinsulinemije, preferirano sistemskom ili lokalnom primenom.

[0021] U skladu sa specifičnim aspektom, jedinjenje je izabrano iz grupe koja se sastoji od artelinske kiseline, artemetra, artemotila (arteetar, β-arteetar), artenimola (dihidroartemizinin, β-dihidroartemizinin), artemizona i artesunata ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0022] Preciznije, jedinjenje je udvojeno sa ligandom ili ostatkom nosača.

[0023] Specifična otelotvorenja se odnose na tretman u kome se jedinjenje primenjuje u farmaceutskom preparatu za oralnu, parenteralnu, sistemsku, mukozalnu, topičnu, rektalnu, sublingvalnu, bukalnu ili implantnu upotrebu, pri čemu preparat uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač, preferirano kada je farmaceutski preparat tabletna, dermalna ili transdermalna formulacija, mast, gel, krem, losion, flaster, rastvor, injektabilni rastvor, oftalmički rastvor, disperzni sistem, emulzija, sistem mikroenkapsuliranog leka, osmotska pumpa, subdermalni inplant, granula, mikrosfera, sistem modifikovanog oslobađanja, sistem ciljanog oslobađanja, granule ili pilule.

[0024] U skladu sa specifičnim aspektom, jedinjenje se primenjuje najmanje jedanput dnevno, preferirano u dozi od 0.01 - 2000 mg/dan, preferirano 0.1 - 500 mg/dan, u jednoj dozi ili više doza ili kada je doza data u formulaciji ili sredstvu sa sporim oslobađanjem. Ovakve doze su posebno indikovane za oralnu primenu.

[0025] U skladu sa posebnim otelotvorenjem, tretman se kombinuje sa drugom antidijabetičnom terapijom, preferirano terapijom sa antidijabetičnim sredstvom, preferirano nekim od insulina, sulfonilurea, inkretina, drugih sekretogoga, glitazona, metformina, GLP-1 agonista ili DPP4 inhibitora, inhibitora glukozidaze, amilin analoga, SGLT2 inhibitora, operacije gastričnog bajpasa ili transplantacije pankreatičnih ostrvaca.

[0026] U skladu sa narednim specifičnim otelotvorenjem, terapija se kombinuje sa imunomodulatornim lekom, uključujući pristupe na bazi vakcine koristeći autoantigene beta ćelija, anti-CD3 antitela, anti-CD20 antitela, anti-CTLA4 antitela, nikotinamid, rapamicin, ciklosporin A, azatiopirin, antitimocit globulin (ATG) ili prednizolon.

[0027] Preciznije, jedinjenje se primenjuje u kombinaciji sa drugim gepirin agonistom ili inhibitorom humanog BTB (POZ) domena koji sadrži 9 (BTBD9, Gene ID 114781).

[0028] Ovde je dalje otkriven postupak za identifikaciju sredstva kao vodećeg kandidata koje je efikasno u lečenju dijabetesa kod pacijenta, pri čemu postupak uključuje: ispitivanje jednog ili više test jedinjenja u analizi na bazi ćelija, koja uključuje faze:

a) obezbeđivanje pankreatičnih alfa-ćelija ili pankreatičnih beta-ćelija koje prekomerno ekspresuju ARX;

b) dovođenje u kontakt ćelija sa test jedinjenjem; i

c) detekciju ukoliko test jedinjenje

i) povećava ekspresiju insulina sa tim ćelijama; i/ili

ii) suzbija ARX u tim ćelijama; i/ili

iii) inhibira interakciju BTBD9 sa CUL3;

iv) povećava nivo ili nagomilava gepirin; i/ili

v) povećava signalizaciju GABAR posredstvom gepirina;

čime se sredstvo identifikuje kao vodeći kandidat za lečenje dijabetesa.

[0029] Preciznije, test jedinjenje je izabrano iz grupe koja se sastoji od malih molekula, peptida, proteina, protein domena, kao što su antitela ili fragmenti antitela, aptamera i nukleinskih kiselina, preferirano test jedinjenja dobijenog pregledom biblioteke test jedinjenja.

[0030] Ovde je takođe otkriven postupak za identifikaciju sredstva vodećeg kandidata za medicinsku upotrebu, pri čemu postupak uključuje: projekciju jednog ili više test jedinjenja u analizi na bazi ćelija, koja uključuje faze:

a) dovođenje u kontakt ćelija sisara sa test jedinjenjem pod uslovima koji dozvoljavaju interakciju test jedinjenja sa BTBD9 ili gepirinom produkovanim od strane ćelije; i b) određivanje da li test jedinjenje

i) povećava termalnu stabilnost BTBD9; i/ili

ii) inhibira vezivanje BTBD9 za CUL3; i/ili

iii) povećvava nivo ili grupisanje gepirina; i/ili

iv) povećava, pojačava, stimuliše ili promoviše vezivanje gepirina za GABAR; i/ili v) povećava signalizaciju GABAR posredstvom gepirina

čime se identifikuje sredstvo vodeći kandidat za medicinsku upotrebu, posebno za tretman dijabetesa ili za antidijabetičnu upotrebu.

[0031] U skladu sa pronalaskom, ovde je dalje obezbeđeno aktivno sredstvo koje vezuje BTBD9 ili koje vezuje gepirin, za upotrebu u tretmanu pacijenata sa dijabetesom da se poveća nivo insulina, pri čemu je aktivno sredstvo bilo koje od artemizinin jedinjenja iz pronalaska. Kako je ovde otkriveno, alternativne male molekule mogu da budu proverene iz odgovarajućih izvora, na primer, velike biblioteke malih molekula koje se podvrgavaju analizama vezivanja i funkcionalnim testovima. Ova aktivna sredstva bi posebno inhibirala BTBD9 za indirektno agoniziranje gepirina inhibicijom njegove funkcionalne degradacije aktivirajućeg gepirina ili direktnim vezivanjem i agoniziranjem gepirina.

[0032] Ovde je dalje opisan produkt farmaceutske kombinacije koja uključuje:

a) sredstvo koje vezuje BTBD9 ili koje vezuje gepirin, kao što je preferirano artemizinin jedinjenje; i

b) antidijabetično sredstvo, kao što je preferirano bilo koje od insulina, sulfonilurea, inkretina, drugih sekretagoga, glitazona, metformina, GLP=1 agonista, DPP4 inhibitora, inhibitora glukozidaze, analoga amilina ili SGLT2 inhibitora,

i/ili

c) imunomodulatorni lek, uključujući pristup na bazi vakcine korišćenjem autoantigena beta ćelija, anti-CD3 antitela, anti-CD20 antitela, anti-CTLA4 antitela, nikotinamida, rapamicina, ciklosporina A, azatiopirina, antitimocit globulina (ATG) ili prednizolona.

[0033] Ovakav produkt kombinacije može posebno da bude u obliku miksture ili kao delovi kita.

SLIKE

[0034]

Slika 1. Celularni model za pankreatičnu transdiferencijaciju sa PAX4 i ARX. a.

Inducibilnost GFP (kontrola), PAX4 i ARX nakon 24 sata indukcije Myc-pridodate prekomerne ekspresije izrađene sa 1 ug/ml doksiciklina u kondicionalnim Min6-teta ćelijskim linijama. Histon H2B se koristi kao kontrola punjenja. b. Western blot sa antitelima koja detektuju prekomernu ekspresiju ARX i PAX4 proteina. Smatra se da prekomerna ekspresija ARX smanjuje nivoe endogenog PAX4 što je detektovano nakon dugog izlaganja. c. Analiza rezultata sekvenciranja RNK u ovim ćelijskim linijama, koja ukazuje na transkript obilja PAX4 i ARX određenih kao broj očitavanja po kilobazi po milion označenih očitavanja (RPKM). d. Venn dijagram koji predstavlja gene značajno izmenjene (p-vrednost < 0.05) između indukovanog faktora transkripcije i GFP indukovanih ćelija za 24 sata. e. Vrednosti Ngn3 RNK su suprotno regulisani nakon 24 h prekomerne ekspresije ARX i PAX4. f. Ngn3 protein detektovan imunofluorescencijom je neregulisan nakon prekomerne ekspresije ARX u toku 24 h. g. Log2-puta promena ekspresije pankreatičnih endokrinih faktora nakon prekomerne ekspresije Arx u toku 144 sata ispitane pomoću RNK-sek u tri različita klona pojedinačnih ćelija.

Slika 2. Provera visoke propusnosti za funkcionalne represore ARX. a. Prekomerna ekspresija ARX u toku 3 dana u Min6 ćelijama snižava nivoe insulin proteina kako je detektovano imunofluorescentnim bojenjem. *, p<0.01 u poređenju sa neindukovanim ćelijama. b. Pregled rezultata skrininga u Min6 ćelijama indukovanim za prekomernu ekspresiju ARX. c. Validacija rezultata iz primarnog praćenja imunofluorescentnim bojenjem alfa ćelijske linije aTC1 za insulin protein. d. Tretman artemetrom povećava nivoe insulin proteina u alfaTC1 ćelijama, detektovano imunofluorescencijom. *, p<0.01 u poređenju sa kontrolom.

Slika 3. Aktivnost artemizinina u alfa ćelijama.

a. Artezunat je takođe aktivan u indukciji ekspresije insulina u alfa ćelijama. b. Deoksiartetar analog artemizina bez endoperoksidne grupe je inaktivan. c. Odgovor na dozu artemetra prekomernom ekspresijom ARX u Min6 ćelijama detektovano imunofluorescencijom. d. Odgovor na dozu artemetra u indukciji ekspresije insulina u alfa ćelijama detektovano imunofluorescencijom.

Slika 4. Btbd9 i gepirin su ciljevi artemizinina kod sisara. a. Prikaz hemijske proteomikne hemijske analize. b. Lista proteina sa značajnim obogaćenjem identifikovanih u odnosu na uporedni eksperiment. c. Rezultati artemetra u promenama termalne stabilnosti Btbd9 i Cul3 u testu ćelijske termo promene. d. Artemetar smanjuje termalnu stabilnost gepirina u testu ćelijske termo promene.

Slika 5. Artemizinini inhibiraju interakciju Btbd9-Cul3, stabilizuju gepirin i aktiviraju GABA signalizaciju. a. Western bloti za gepirin i subjedinice GABA receptora u aTC1 ćelijama tretiranih sa artemetrom. b. Western blot za GABAR u aTC1 ćelijama tretiranih sa artemetrom. c. Imunoprecipitacija u aTC1 lizatima potvrđuje da artemetar inhibira interakciju između Btbd9 i Cul3. d. Postavljanje gen obogaćenih analiza GO uslova povezanih sa genima neregulisanim tretmanom aTC1 ćelija artemetrom. e. Artemetar povećava vrednosti gepirin proteina u alfa ćelijama kako je detektovano imunofluorescencijom. f. Tretman artemetrom povećava aktivnost Moco sintaze gepirina. g. Artemetar povećava koncentraciju intracelularnog hlorida. h. GABAR antagonist bikukulin inhibira efekte artemetra na aTC1 ćelijama, detektovano imunofluorescencijom. *, p<0.01 u poređenju sa ćelijama tretiranim samo Artemetrom. i. GABAR antagonist Gabazin inhibira efekte artemetra na aTC1 ćelijama, detektovano imunofluorescencijom. *, p<0.01 u poređenju sa ćelijama tretiranim samo Artemetrom. j. GABAR agonist tiagabin povećava produkciju insulina u aTC1 ćelijama, detektovano imunofluorescencijom. *, p<0.01 u poređenju sa kontrolom.

Slika 6. Artemetar indukuje promene tipa ćelija u humanim pankreatičnim ostrvcima. a. Imunofluorescentno bojenje za insulin i glukagon u humanim ostrvcima sa tretmanom artemetrom i DMSO kontrolom u toku 72 sata. b. Kvantifikacija zastupljenosti gepirina i GABA receptora mereno imunofluorescentnim bojenjem humanih ostrvaca 72 h nakon tretmana sa artemetrom i DMSO kontrolom. c. Glukozom-stimulisana sekrecija insulina mereno ELIZA testom supernatanta iz humanih ostrvaca 72 h nakon tretmana sa artemetrom i DMSO kontrolom. d. Kvantifikacija insulin/glukagon dvostruko-pozitivnih ćelija u humanim pankreatičnim ostrvcima.

Slika 7: Primer sekvenci

DETALJAN OPIS

[0035] Naziv "aktivno sredstvo" se ovde podrazumeva na sledeći način. Aktivno sredstvo, kako je ovde opisano za medicinsku upotrebu, je prvenstveno mala molekula ili bilo koji odgovarajući peptid, uključujući polipeptide, proteine, uključujući fragmente proteina kao što su protein domeni, posebno antitela i fragmenti antitela ili domeni antitela, alternativna matrična veziva, aptamere i nukleinske kiseline.

[0036] Na primer, aktivno sredstvo može da bude molekula koja može da se sintetiše tehnikama organske hemije ili tehnikama molekularne biologije ili biohemije i preferirano je mala molekula koja može da bude manja od 5000 Daltona i koja može da bude rastvorljiva u vodi. Kako je ovde opisano, aktivno sredstvo može da bude artemizinin jedinjenje i/ili koje posebno ispoljava osobine selektivne interakcije sa gepirinom, na primer slično sa agonističkim delovanjem artemizinin jedinjenja iz pronalaska.

[0037] Kako se ovde koristi, naziv "primena" obuhvata načine unošenja aktivnog sredstva, kao što je artemizinin jedinjenje iz pronalaska, na subjektu kome je to potrebno, da ispolji svoju namenjenu funkciju. Primeri načina primene koji mogu da se koriste uključuju oralnu primenu. Sredstvo takođe može da se primeni bilo kojim drugim uobičajenim načinom, na primer, kontinuiranom infuzijom ili bolus injekcijom; apsorpcijom kroz epitelijalne ili mukokutane slojeve (na primer, oralne, rektalne, vaginalne i intestinalne mukoze, itd.) i može da se primeni zajedno sa drugim terapeutskim sredstvom. Primena može da bude sistemska ili lokalna. Mogu da se koriste različiti poznati sistemi oslobađanja, uključujući enkapsulaciju u lipozomima, mikropartikulama, mikrokapsulama i kapsulama. specifični sistemi oslobađanja koriste flastere za topično, transdermalno ili mukozno oslobađanje ili implante. Posebno su preferirani preparati ili formulacije sa usporenim oslobađanjem i sistemi oslobađanja koji obezbeđuju dugo-delujući tretman.

[0038] Postupci primene aktivnog sredstva iz ovog pronalaska uključuju, ali bez ograničenja na, intradermalno, intramuskularno, intraperitonealno, intravenozno, subkutano, intranazalno,

1

epiduralno, oralno, sublingvalno, intracerebralno, intravaginalno, transdermalno, rektalno, inhalacijom ili topično. Aktivno sredstvo može da se primeni samo ili u kombinaciji ili konjukciji ili sa drugim sredstvom ili nekim drugim terapeutskim tretmanom korišćenim u indikaciji, na primer korišćenim za lečenje pacijenata sa dijabetesom. Aktivno sredstvo može da se primeni pre primene drugog sredstva, istovremeno sa sredstvom ili nakon primene sredstva. Osim toga, aktivno sredstvo iz pronalaska može takođe da se primeni u obliku proleka koji se konvertuje u svoj aktivni metabolit ili još aktivniji metabolit in vivo.

Obezbeđen je alternativni sistem oslobađanja za aktivno sredstvo zajedno sa ili vezano za molekule nosača čije je delovanje, na primer, usmereno na specifično mesto. Primeri sistema za oslobađanje koji uključuju artemizinin jedinjenja koja su vezana za molekule koje vezuju gvožđe i molekule usmerene na receptore ćelija za selektivno oslobađanje terapeutski efektivne količine u ciljanim obolelim ćelijama, kao što su molekule nosača za ciljano oslobađanje. Naredni primeri se odnose na oslobađanje konjugata koji uključuju najmanje dva artemizinin jedinjenja ili konjugata sa drugim sredstvima, uključujući na primer (pro)hormone ili peptide, kao što je glukagonu sličan peptid 1 (GLP-1).

[0039] Naziv "inhibitor" u odnosu na BTBD9 aktivnost, kako se ovde koristi, treba posebno da se odnosi na jedinjenje ili sredstvo sposobno da se kombinuje sa (na primer, da se veže za, stupi u interakciju sa) BTBD9 za započinjanje farmakoloških delovanja, posebno povećanja nivoa i/ili aktivnosti gepirina. Agonističko delovanje test jedinjenja je posebno dokazano bilo kojom pokazanom analizom kako je ovde opisano.

[0040] Naziv "agonist" u odnosu na gepirin ili aktivnost gepirina, kako se ovde koristi, treba posebno da se odnosi na jedinjenje ili sredstvo sposobno da se kombinuje sa (na primer, da se veže za, stupi u interakciju sa) gepirinom za započinjanje farmakološkog delovanja, na primer direktnu agonizaciju nivoa ili aktivnosti gepirina ili indirektno povećanje nivoa ili aktivnosti gepirina inhibicijom bilo kog antagonista, kao što je BTBD9. Agonističko delovanje test jedinjenja je posebno dokazano bilo kojom pokazanom analizom kako je ovde opisano.

[0041] Naziv "artemizinin jedinjenje" kako se ovde koristi, treba konkretno da se odnosi na artemizinin i artemizinin derivate.

[0042] Artemizinin

((3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)-oktahidro-3,6,9-trimetil-3,12-epoksi-12H-pirano[4,3-j]-1,2-benzodioksepin-10(3H)-on) sadrži strukturu 1,2,4-trioksan prstena a Artemisia annua i povezane Artemisia vrste su poznate kao jedini prirodan izvor. Ima sledeću strukturu:

[0043] Artemizinin derivati su posebno poznati kao endoperoksidi sa različitim ostacima, kao što je ovde opisano u formuli I. Primeri jedinjenja su izabrani iz grupe koja se sastoji od artelinske kiseline, artemetra, artemotila (takođe označen kao arteetar, β-arteetar), artenimola (takođe označen kao dihidroartemizinin, β-dihidroartemizinin) i artesunata ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili njihovih derivata ili uprošćenih analoga.

[0044] Pored prirodnih artemizinin jedinjenja, mogu da se koriste polusintetski ili sintetski derivati, na primer sa poboljšanom rastvorljivošću ili bioraspoloživošću. Posebno, takođe mogu da se koriste sintetska jedinjenja sa sličnom trioksolan strukturom, kao što je arterolan.

[0045] Specifični derivati uključuju artemizon, dihidroartemizinin hemisukcinat, dihidrodroartemizinin sukcinat, dihidroartemizinin glukuronid, natrijum artesunat, stabilizovane oblike artesunata, stabilizovane oblike natrijum artesunata, dihidroartemisiten dimere, 11-aza-artemizinin derivative, aminofunkcionalizovane 1,2,4-trioksane, artemizinin endoperokside, deoksiartemizinine, spiro i dispiro 1,2,4-trioksolane, smešu steroidnih 1,2,4,5-tetraoksan jedinjenja, ssupstituisane 1,2,4- trioksane, Artemisia annua ekstrakte ili frakcije ovih ekstrakta, derivate trioksana na bazi artemizinina, sekooacrtemizinina, jedinjenja trioksan dimera, konjugate arteetara artelinske kiseline od dihidroartemizinina, artemizinina ili artemizinen derivativa, C-10 ugljenik supstituisanom artemizininu slična trioksan jedinjenja, alfa arteetre trioksana rastvorljive u vodi, artemizinin dimere, (+)-deoksoarteminizinin i analoge (+)-deoksoartemizinina i 10-supstituisane derivate dihidroartemizinina, kao i njihove soli i njihove druge derivate kako je poznato stručnjaku sa iskustvom u tehnici.

[0046] Specifični derivati mogu da se dobiju dimerizacijom ili oligomerizacijom, sa ili bez upotrebe linkera, konjugacijom sa drugim radikalima, kao što su peptidi, nosači ili sredstva za oslobađanje, uključujući molekule usmere ka receptoru, kombinaciju sa helatorima koji vezuju jone metala.

[0047] Kako se ovde koristi, naziv "dijabetes" se posebno odnosi na bolest ili poremećaj povezan sa Diabetes mellitus-om, nezavisno od geneze, posebno uključujući dijabetes tip I i tip II, C-peptid negativni i pozitivni dijabetes i povezane poremećaje, uključujući dijabetične ketoacetoze, hiperglikemično hiperosmolarno stanje, dijabetičnu kardiomiopatiju, dijabetičnu nefropatiju, dijabetičnu encefalopatiju, dijabetičnu neuropatiju, dijabetičnu retinopatiju, bolest koronarne arterije, bolest perifernih krvnih sudova, dijabetične mionekroze, šlog, dijabetičnu komu i gojaznost.

[0048] Tip I diabetes mellitus (takođe poznat kao juvenilni dijabetes) je oblik dijabetes melitusa koji nastaje od autoimune destrukcije beta ćelija u pankreasu koje produkuju insulin. Tip II dijabetes mellitus, koji ima i insulin-zavisni i ne-insulin-zavisni tip, se obično javlja kasnije u životu osobe kao rezultat genske predispozicije, neodgovarajuće ishrane, nedostatka fizičke aktivnosti ili njihove kombinacije. Oba oblika dijabetes melitusa menjaju sposobnost organizma da preuzme i metaboliše glukozu u krvi, što dovodi do povećanih vrednosti glukoze u krvi. Dugotrajne visoke vrednosti glukoze u kvri mogu da povećaju rizik od poremećaja povezanih sa dijabetesom, kao što su dugotrajne vaskularne komplikacije, na primer koronarna bolest, srčani napad, šlog, insuficijencija srca, insuficijencija bubrega, slepilo, erektivna disfunkcija, neuropatija (gubitak osetljivostisi posebno u stopalima), gangrena i gastropareze (usporeno pražnjenje želuca). Neodgovarajuća kontrola glukoze u krvi takođe povećava rizik od kratkotrajnih komplikacija nakon operacije, kao što je sporo zarastanje rana.

[0049] Vezujući peptid ili C-peptid je kratak protein od 31-amino-kiseline koji vezuje A-lanac insulina za njegov B-lanac u molekuli proinsulina. Kod novo dijagnostikovanih pacijenata sa dijabetesom se često mere nivoi njihovih C-peptida kao način da se razlikuje tip I dijabetesa od tip II dijabetesa.

[0050] Posebna ostvarenja pronalaska se odnose na tretman dijabetesa, posebno dijabetesa tip I ili II ili C-peptid negativnog dijabetesa ili poremećaja povezanih sa povećanom vrednošću glukoze u krvi, na primer uključujući metaboličke i insulin rezistentne poremećaje, kao što je bilo koji od prethodno navedenih poremećaja povezanih sa dijabetesom ili gojaznosti kod pacijenata koji boluju od dijabetesa ili odgovarajućeg poremećaja. Ovakav anti-dijabetični tretman posebno uključuje farmaceutske preparate bilo kog od artemizinin jedinjenja iz pronalaska.

[0051] Naziv "vodeći" u vezi sa aktivnim sredstvom ili sredstvom kandidatom je dobro

1

poznat u tehnici i treba da označi da je sredstvo izabrano za razvoj farmaceutskog produkta zbog toga što je njegov potencijal dokazan u nekim analizama, međutim, potrebno je da bude dodatno okarakterisan daljim testovima i (prekliničkim ili kliničkim) ispitivanjima da se potvri njegova pogodnost korišćenja kao leka.

[0052] Test jedinjenja se obično odgovarajućim test sistemima karakterišu da li su pogodna za korišćenje kao aktivno sredstvo za medicinsku upotrebu.

[0053] Uobičajeno, ukoliko sredstvo kandidat inhibira BTBD9 ili stupa u interakciju sa gepirinom, kao što je da agonizira njegovu aktivnost ili izazove povećanje ekspresije insulina iz pankreatičnih ćelija, na primer kako je određeno u ovde dalje opisanom test sistemu u poređenju sa aktivnošću ili ekspresijom bez prisustva sredstva kandidata, tako da se sredstvo kandidat karakteriše kao "sredstvo vodeći kandidat". Dalje, sredstvo vodeći kandidat može da se potvrdi ispitivanjem koje može da pokaže prednosti delovanja i osobina za određivanje njegovog potencijala da se koristi kao terapeutski aktivno sredstvo.

[0054] Ovakvi testovi mogu da budu kvalitatitni, kvantitativni ili semi-kvantitativni.

[0055] Naziv "subjekt" kako se ovde koristi, treba da se odnosi na toplokrvne sisare, posebno na ljude ili životinje sisare, uključujući pse, mačke, majmune, svinje, ovce i konje. Posebno, medicinska upotreba iz pronalaska ili odgovarajući tretman se primenjuje na subjektu kome je potrebna profilaksa ili tretman bolesnog stanja (koji uključuje bolest ili poremećaj povezan sa tom bolešću). Subjekt može da bude pacijent oboleo od bolesti, uključujući rano stanje ili kasno stanje bolesti. Naziv "pacijent" uključuje ljude i druge sisare koji primaju ili profilaktički ili terapeutski tretman. U ovom značenju naziv "tretman" uključuje i profilaktički i terapeutski tretman.

[0056] Subjekt je na primer tretiran za profilaksu ili terapiju dijabetesa ili poremećaja povezanih sa dijabetesom. Prema tome, specifična ostvarenja se odnose na tretman pacijenata koji boluju od dijabetesa.

[0057] Kako se ovde koristi, naziv "farmaceutski prihvatljiv" se odnosi, na primer, na jedinjenja, materijale, kompozicije i/ili dozne oblike koji su pogodni za upotrebu u kontaktu sa ili u ljudima i životinjama bez povećane toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih problema ili komplikacija srazmerno sa prihvatljivim odnosom korist/rizik.

[0058] Aktivno sredstvo iz pronalaska može, na primer, da bude formulisano u efektivnoj količini sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem. Farmaceutski prihvatljivi nosači generalno uključuju bilo koji i sve pogodne rastvarače, disperzione medijume, oblagače, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična i sredstva za odlaganje apsorpcije i slično koja su fiziološki kompatibilna sa aktivnim sredstvom ili određenom kompozicijom ili kombinacijom datom u pronalasku. Dalji primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju sterilnu vodu, fiziološki rastvor, puferovane fosfatne soli, dekstrozu, glicerol, etanol i slično, kao i kombinacije bilo kog od njih.

[0059] U jednom ovakvom aspektu, aktivno sredstvo može da se kombinuje sa jednim ili više nosača pogodnih za željeni način primene, aktivna sredstva mogu, na primer, da se izmešaju bilo sa laktozom, saharozom, skrobom, celuloznim estrima alkanoinske kiseline, stearinskom kiselinom, talkom, magnezijum stearatom, magnezijum oksidom, natrijumovim i kalcijumovim solima fosforne i sumporne kiseline, akacijom, želatinom, natrijum alginatom, polivinil pirolidinom, polivinil alkoholom i opciono dalje tabletira ili enkapsulira za uobičajenu primenu.

[0060] Primeri formulacija koje se koriste za parenteralnu primenu uključuju subkutane, intramuskularne ili intravenozne injekcije u obliku, na primer, sterilnog rastvora ili suspenzije. Formulacije za topičnu aplikaciju uključuju brojne oblike kao što su kreme ili masti, flasteri, paste i geli.

[0061] Preferirani farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju podloge, kao što su šećeri, na primer laktoza, glukoza i saharoza, skrobove, kao što su kukuruzni skrob i krompirov skrob, celulozu i njene derivate, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celuloza acetat ili poliole, kao što su glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol ili druge razblaživače i ekscipijente poznate u tehnici za upotrebu u farmaceutskim formulacijama. Pogodni primeri za tečne nosače za oralnu i parenteralnu primenu uključuju vodu, koja često sadrži aditive kako su prethodno navedeni, na primer derivate celuloze, uključujući rastvor natrijum karboksimetil celuloze, alkohole uključujući monohidratne alkohole i polihidratne alkohole i želatin, skrob, talk, keratin, koloidni silicijum dioksid, urea i slično. Pored toga, mogu da se koriste pomoćna sredstva, stabilizatori, učvršćivači, lubrikansi i sredstva za bojenje.

[0062] Aktivno sredstvo(a) mogu takođe da se formulišu tako da obezbede kontinuirano ili kontrolisano oslobađanje aktivnog sastojka korišćenjem na primer, hidroksipropilmetil celuloze, drugih polimer matriksa, gela, permeabilnih membrana, osmotskih sistema, višeslojnih omotača, mikropartikula, lipozoma, mikrosfera ili njihove kombinacije u različitim odnosima da se obezbedi željeni profil oslobađanja. Aktivno sredstvo može takođe da bude u mikro-enkapsuliranom obliku sa jednim ili više prethodno opisanih ekscipijenata.

[0063] Na primer, u farmaceutski prihvatljivoj formulaciji data je efektivna količina koja obezbeđuje kontinuirano oslobađanje jedinjenja iz pronalaska na subjektu najmanje 12 sati,

1

24 sata, 36 sati, 48 sati, jednu nedelju, dve nedelje,

[0064] U nekim ostvarenjima, pogodna je formulacija farmaceutske kompozicije sa usporenim oslobađanjem za mukoznu, subkutanu bolus ili implantnu, topičnu ili oralnu primenu na subjektu, uključujući tablete, lozenge, bukalne oblike, troheje, vodene ili uljane suspenzije ili rastvore, granule, praškove, paste, emulzije, kapsule, sirupe, eliksire, lipozomalne formulacije, konjugate lek-polimer ili formulacije sa nano česticama.

[0065] I drugi farmaceutski prihvatljivi nosači i farmaceutske kompozicije su poznate u tehnici i opisane u, na primer, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SClENCES.

[0066] Specifične farmaceutske kompozicije su razmatrane kada su formulisani aktivno sredstvo, kao što je artemizinin jedinjenje iz ovog pronalaska i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i opciono jedno ili više dodatnih terapeutski aktivnih sredstava. Stabilne formulacije za čuvanje aktivnog sredstva su izrađene mešanjem navedenog sredstva koje ima traženi stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijentima ili stabilizatorima u obliku liofiliziranih formulacija ili vodenih rastvora.

[0067] Naziv "proveravanje" kako se ovde koristi, treba da se odnosi na identifikaciju sredstva kandidata koje prolazi kroz specifični skrining test, na primer, da inhibira aktivnost BTBD9 ili agonizira aktivnost gepirina, što je indikacija da sredstvo kandidat bude potencijalno terapeutski aktivno sredstvo koje može da bude korisno u tretmanu bolesti ili stanja kao što je dijabetes. Na primer, ovde opisani skrining testovi su korisni za odabir sredstva vodećeg kandidata između većeg broja test sredstava. U skladu sa ovde otkrivenim specifičnim aspektom, sprovodi se ispitivanje direktnog vezivanja kojim se određuje interakcija test sredstva sa gepirinom.

[0068] Sposobnost test sredstva da se veže za ili stupi u interakciju sa BTBD9 ili gepirinom može da se meri bilo kojim postupkom detekcije/merenja proteina/interakcije proteina ili drugih interakcija jedinjenje/protein. Specifični postupci određivanja sredstva koje je sposobno da se veže za BTBD9 ili gepirin su oni u kojima je BTBD9 ili gepirin izložen sredstvu a bilo koje vezivanje sredstva za gepirin se detektuje i/ili meri. Može da se odredi konstanta vezivanja za vezivanje sredstva za BTBD9 ili gepirin. Pogodni postupci za detekciju i/ili merenje (kvantifikaciju) vezivanja sredstva za BTBD9 ili gepirin su dobro poznati u tehnici i mogu da se izvedu, na primer, korišćenjem postupka ko-prečišćavanja, ELISA, ko-imunoprecipitacije, izotermalne titracione kalorimetrije, diferencijalne skenirajuće fluorometrije (Thermofluor), fluorescentne polarizacije, fluorescentnog rezonantnog energetskog transfera, scintilacionog proksimatnog ispitivanja i postupaka rezonance

1

površinskih plazmona a posebno postupak sposoban za rad sa visokom propusnošću, na primer postupak na bazi čipa.

[0069] Drugi postupci detekcije interakcija polipeptid/polipeptid uključuju ultrafiltraciju sa jonskom sprej masenom spektroskopijom/HPLC postupcima ili druge fizičke i analitičke postupke. Mogu takođe da se koriste postupci fluorescentnog rezonantnog energetskog transfera (FRET), pri čemu vezivanje dva fluorescentno obeležena entiteta može da se meri merenjem interakcije fluorescentnih oznaka kada su međusobno bliski.

[0070] U skladu sa specifičnim aspektom, aktivnost BTBD9 se određuje merenjem vezivanja BTBD9 za CUL3 koimunoprecipitacijom koristeći antitelo protiv BTBD9 i detekcijom količine vezanog CUL3 sa primarnim antitelom koje specifično prepoznaje CUL3, ili direktno obeleženim sa fluoroforom ili drugom odgovarajućom signal-generišućom molekulom (na primer peroksidaza rena, luciferaza) ili indirektnom detekcijom sa slično obeleženim sekundarnim antitelom. Alternativno, imunoprecipitacija se izvodi sa antitelom protiv CUL3 i detektuje se količina vezanog BTBD9 sa primarnim antitelom koje specifično prepoznaje BTBD9, ili direktno obeleženim sa fluoroforom ili drugom odgovarajućom signalgenerišućom molekulom (na primer peroksidaza rena, luciferaza) ili indirektnom detekcijom sa slično obeleženim sekundarnim antitelom. Alternativni postupci detekcije uključuju imunohemijsku ili maseno-spektrometrijsku kvantifikaciju iste vezujuće interakcije. Drugi alternativni postupak uključuje direktno obeležavanje gepirina sa zelenim fluorescentnim proteinom ili drugom celularno enkodiranom fluoroforom ili na drugi način lako detektabilnim repićem ubacivanjem kodirajuće sekvence u endogeni gepirin lokus, obeležavanjem CUL3 sa drugom fluoroforom i detekcijom interakcije Förster rezonantnim energetskim transferom. Naredni alternativni postupak uključuje kvantifikaciju interakcije BTBD9 i CUL3 rezonancijom površinskih plazmona, izotermalnom kalorimetrijom ili ekvivalentnim biofizičkim postupcima.

[0071] BTBD9 vezivo (na primer artemizinin jedinjenja kako je ovde opisano) će posebno inhibirati interakciju između BTBD9 i E3 ubikvitin ligaze CUL3, sprečavajući ubikvitinaciju a nakon toga degradaciju gepirina. Na taj način, ova jedinjenja deluju kao BTBD9 inhibitori, a indirektno takođe kao agonisti gepirina jer dovode do povećanja nivoa gepirin proteina.

[0072] U skladu sa narednim specifičnim aspektom, nivo ili gomilanje gepirina je određeno merenjem količine i intracelularne lokacije gepirina imunofluorescentnom analizom koristeći primarno antitelo koje posebno prepoznaje gepirin, ili direktno obeleženo sa fluoroforom ili drugom odgovarajućom signal generišućom molekulom (na primer peroksidaza rena,

1

luciferaza) ili indirektnom detekcijom sa slično obeleženim sekundarnim antitelom.

Alternativni postupci detekcije uključuju imunohemijsku ili maseno-spektrometrijsku kvantifikaciju gepirina u lizatima generisanim od cele ćelije ili specifičnih membranomobogaćenih frakcija. Naredni alternativni postupak uključuje direktno obeležavanje gepirina sa zelenim fluorescentnim proteinom ili drugom celularno enkodiranom fluoroforom ili na drugi način lako detektabilnim repićem ubacivanjem kodirajuće sekvence u endogeni gepirin lokus.

[0073] U skladu sa narednim specifičnim aspektom, povećanje, obogaćenje, stimulacija ili promocija vezivanja gepirina za GABAR se određuje na sledeći način: korišćenjem koimunoprecipitacije, anti-gepirin antitela se koriste za imunoprecipitaciju gepirina a sa njim u vezi GABA receptor se meri Western blot ili ELISA testom. Alternativni postupci uključuju upotrebu pridodatih proteina i detekcijom fluorescentno rezonantnim energetskim transferom FRET ili alternativnim analizama, na primer LUMIERE.

[0074] U skladu sa narednim specifičnim aspektom, povećanje signalizacije Gabar posredstvom gepirina se određuje na sledeći način: direktno, merenjem nastalih influksa jona hlorida u ćeliji upotrebom, na primer, boja osetljivih na hloride, na primer N-(6-metoksihinolil)-acetoetil estra (MQAE) ili indirektno, elektrofiziološkim merenjem potencijala ćelijske membrane ili nastalih intracelularnih promena u ekspresiji gena.

[0075] Primeri analiza za ispitivanje aktivnosti test jedinjenja kao agonista gepirina se zasnivaju na određivanju njegovih aktivnosti na

i) povećanju termalne stabilnosti BTBD9; i/ili

ii) inhibiranju vezivanja BTBD9 za CUL3; i/ili

iii) povećanju nivoa ili nagomilavanja gepirina; i/ili

iv) povećanju, pojačanju, stimulisanju ili unapređenju vezivanja gepirina za GABAR; i/ili

v) povećanju signalizacije GABAR posredstvom gepirina.

[0076] Ovakva ispitivanja su, na primer, ispitivanja direktnog vezivanja, analize imunofluorescentnim bojenjem, imunohemijski postupci, bioifizički postupci i elektrofiziološki postupci.

[0077] Na primer, odgovarajuće ispitivanje vezivanja je dalje opisano u niže datim primerima.

[0078] Specifična test jedinjenja mogu da se provere na svoj potencijal za upotrebu u

1

tretmanu dijabetesa. Prema tome, mogu da se koriste specifični testovi provere koji predstavljaju testove na bazi ćelija. Primeri ispitivanja za proveru antidijabetične aktivnosti test jedinjenja su zasnovani na njegovoj aktivnosti da ekspresuje insulin u pankreatičnim ćelijama, posebno, alfa ćelijama ili beta ćelijama, tako što se prekomerno ekspresuje ARX, i određivanje se da li test jedinjenje

i) povećava ekspresiju insulina sa tom ćelijom; i/ili

ii) smanjuje pojavu ARX u toj ćeliji; i/ili

iii) inhibira vezivanje BTBD9 za CUL3; i/ili

iv) povećava nivo ili nagomilavanje gepirina; i/ili

v) povećava signalizaciju GABAR posredstvom gepirina.

[0079] Na primer, odgovarajuće ispitivanje ekspresije insulina je dalje opisano u niže datim primerima.

[0080] Opciono, ovde otkriven postupak provere može da uključi ponavljanje faza postupka testa, na primer u visoko propusnoj proveri. Na taj način veći broj sredstava kandidata može da se testira da se identifikuje sredstvo vodeći kandidat za medicinsku upotrebu.

[0081] Na primer, objedinjene hemijske biblioteke ili hemijske biblioteke, uključujući zbirke različitih hemijskih jedinjenja generisanih ili hemijskim sintezama ili biološkim sintezama, na primer, linearne objedinjene hemijske biblioteke kao što su biblioteke polipeptida ili peptida mogu da se koriste kao izvor test jedinjenja. Ovi članovi biblioteke, hemijske vrste ili podgrupe mogu da se izaberu po tome što ispoljavaju željene karakteristične aktivnosti, na primer, sposobnost agonističkog vezivanja za gepirin ili povećanje ekspresije insulina u pankreatičnim ćelijama (u in vitro ili ex vivo analizama).

[0082] Razumljivo je da identifikacija sredstva koje se vezuje za ili stupa u interakcije sa BTBD9 ili gepirinom može da bude početni korak na putu provere leka a identifikovano sredstvo može dalje da bude karakterisano i izabrano, na primer, po sposobnosti da agonizira aktivnost gepirina. Prema tome, ovde otkriven postupak može dalje da uključi ispitivanja sredstva vodećeg kandidata u analizama aktivnosti da se odredi da li se sredstvo vodeći kandidat kvalifikuje za terapeutski aktivno sredstvo.

[0083] Naziv "efektivna količina", kako se ovde koristi, treba da označi količinu jedinjenja koja je dovoljna za lečenje, prevenciju ili inhibiciju tih bolesti ili poremećaja. U kontekstu bolesti, efektivne količine aktivnog sredstva, kako je ovde opisano, su posebno korišćene za

1

prevenciju, lečenje, moduliranje, ublažavanje, preokret ili uticaj na bolest ili stanje koje donose korist od interakcije aktivnog sredstva sa ćelijskim komponentama ili molekulama, na primer, uključujući interakcije sa BTBD9 ili gepirinom, a posebno na dijabetes. Naziv posebno uključuje i terapeutske i profilaktičke efektivne količne.

[0084] Naziv "profilaktički efektivna količina" se posebno odnosi na količinu aktivnog sredstva koje je efikasno, nakon jedne ili više doza primenjenih na pacijentu, u prevenciji ili lečenju bolesti ili poremećaja.

[0085] Količina aktivnog sredstva koja odgovara ovoj efektivnoj količini će da varira u zavisnosti od različitih faktora, kao što su dati lek ili jedinjenje, farmaceutska formulacija, način primene, tip bolesti ili poremećaja, identitet subjekta ili domaćina koji se tretira i slično, ali će je i pored toga rutinski odrediti stručnjak sa iskustvom u tehnici.

[0086] Terapeutski efektivna količna aktivnog sredstva koje je artemizinin jedinjenje kako je ovde opisano, ako se primenjuje na humanom pacijentu kome je to potrebno, može preciznije da bude u rasponu od 0.01 - 2000 mg/dan, prednost je 0.1 - 500 mg/dan, u jednoj dozi ili više doza. Specifična ostvarenja se odnose na formulacije ili uređaje sa usporenim oslobađanjem, koji mogu da budu u prednosti pri primeni aktivnog sredstva u dužem vremenskom periodu, kao što je tretman hroničnih bolesti, na primer, tretman u toku najmanje 2 nedelje, najmanje 3 nedelje ili najmanje 4 nedelje. U specifičnom ostvarenju, formulacija sa usporenim oslobađanjem obezbeđuje konstantni nivo artemizinin jedinjenja u krvi, koji je u opsegu od 0.01-500 mg/dan, u toku celog perioda tretmana. U još jednom specifičnom ostvarenju, ove koncentracije se dostižu trenutno, na primer u ponovljenom režimu od 1 nedelje na tretmanu, 1 nedelje bez tretmana. U narednom ostvarenju, specifična formulacija dovodi do selektivnog obogaćenja aktivnog sredstva u pankreasu ili pankreatičnim ostrvcima bez prisustva merljivih vrednosti u krvi.

[0087] Režim tretmana ili prevencije subjekta sa terapeutski efektivnom količinom aktivne supstance iz ovog pronalaska može da se sastoji od jedne primene, ili alternativno da uključi serijske aplikacije. Na primer, aktivno sredstvo može da se primeni čak jedanput godinšnje, čak jedanput u pola godine ili čak jedanput mesečno. Međutim, u narednom ostvarenju, aktivno sredstvo može da se primeni na subjektu od približno jedanput nedeljno do približno jedanput dnevno za dati tretman. Dužina perioda tretmana zavisi od različitih faktora, kao što su ozbiljnost bolesti, ili akutne ili hronične bolesti, godine starosti pacijenta, koncentracija i delovanje aktivnog sredstva. Takođe je razumljivo da efektivna doza korišćena za tretman ili profilaksu može da se poveća ili smanji u toku trajanja određenog tretmana ili režima

2

profilakse. Promene u dozi mogu da budu rezultat i da postanu očigledne standardnim dijagnostičkim analizama poznatim u tehnici. U nekim slučajevima, može da bude potrebna trajna primena.

[0088] Biološke osobine artemizinin jedinjenja ili aktivnog sredstva i farmaceutski preparati iz pronalaska mogu da se karakterišu u ex vivo eksperimentima u ćeliji, tkivu i celom organizmu. Kako je poznato u tehnici, lekovi se često testiraju in vivo na životinjama, uključujući ali bez ograničenja na, miševe, pacove, zečeve, pse, mačke, svinje i majmune, da se izmeri efikasnost leka za tretman na modelu bolesti ili poremećaja, ili za merenje farmakokinetike, farmakodinamike, toksičnosti i drugih osobina leka. Životinje mogu da budu označene kao modeli bolesti. Lekovi se često testiraju na miševima, uključujći ali bez ograničenja na, bezdlake miševe, SClD miševe, ne-gojazne dijabetične (NOD) miševe, ksenograft miševe i transgenične miševe (uključujući genetski modifikovane i nemodifikovane). Ovi eksperimenti mogu da obezbede značajne podatke za određivanje potencijala aktivnog sredstva za njegovo korišćenje kao terapeutskog ili profilaktičkog sredstva. Bilo koji organizam, poželjni su sisari, može da se koristi za testiranje. Na primer, zbog svoje genetske sličnosti sa ljudima, primati, majmuni mogu da budu pogodni terapeutski modeli i zbog toga mogu da se koriste za ispitivanje efikasnosti, toksičnosti, farmakokinetike, farmakodinamike, polu-života ili drugih osobina određenog sredstva ili kompozicije. Na kraju se za dozvolu da se lek koristi zahteva test na ljudima i prema tome se naravno razmatraju ovi eksperimenti. Prema tome, aktivno sredstvo i odgovarajuće farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu da se testiraju na ljudima da se odredi njihova terapeutska ili profilaktička efikasnost, toksičnost, imunogeničnost, farmakokinetika i/ili druge kliničke osobine.

[0089] U skladu sa pronalaskom, preferirana aktivna sredstva, kao što je mala molekula artemizinin jedinjenja, su ona komercijalno raspoloživa jedinjenja koja se koriste u antimalarijskoj ili anti-virusnoj terapiji za različite ciljeve, kao što su arteetar; Artemotil; artemetar; Artemizon; Artezunat; Artemizinin; Artemisiten; artelinska kiselina; 9-epiartemizinin; Dihidroartemizinin; Dihidro Artemizinin Dimer; Dihidroartemizinin glukuronid; 3,6,9-trimetildekahidro-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-ol;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,12R,12aR)-dekahidro-3,6,9-trimetil-3,12-epoksi-12H-pirano[4;

3,12-epoksi-12H-pirano[4,3-j]-1,2-benzodioksepin-10(3H)-on, oktahidro-3,6,9-trimetil-; (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-ol;

3,12-epoksi-12H-pirano[4,3-j]-1,2-benzodioksepin-10(3H)-on;

oktahidro-3,6,8-trimetil-, (3R,5aS,6R,8R,12S,12aR)-;

3,12-epoksi-12H-pirano[4,3-j]-1,2-benzodioksepin-10-ol, dekahidro-3,6,9-trimetil-, (3S,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-dekahidro-10-etoksi-3,6,9-trimetil-3,12-epoksi-12H-pirano[4,3-j]-1,2-benzodioksepin;

3,12-epoksi-12H-pirano[4,3-j]-1,2-benzodioksepin, 10-fluorodekahidro-3,6,9-trimetil-, (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12S,12aR)-;

3,12-epoksi-12H-pirano[4,3-j]-1,2-benzodioksepin-10-ol, dekahidro-10-d-3,6,9-trimetil-, (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-(9Cl);

4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)buterna kiselina;

sukcinska kiselina, 1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-dekahidro-3,6,9-trimetil-3,12-epoksi-12H-pirano[4,3-j]-1,2-benzodioksepin-10-il] estar;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetil-dekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il 4-(izobutilamino)-4-oksobutanoat;

2,5-dioksopirolidin-1-il

((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetil-dekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)sukcinat;

N,N-Dimetil-N-[2-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetilperhidro-3,12-epoksipirano[4,3-j]-1,2-benzodioksepin-10-iloksi]etil]amin oksalat;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetil-dekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il-4-okso-4-((1-feniletil)amino)butanoat;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il 4-((4-metoksibenzil)amino)-4-oksobutanoat; 6-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)heksanska kiselina;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetil-dekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il-4-((cikloheksilmetil)amino)-4-oksobutanoat; (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il 4-((furan-2-ilmetil)amino)-4-oksobutanoat; 2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3, 12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)propionska kiselina;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetil-dekahidro-3H-3,12epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il 4-((4-fluorofenetil)amino)-4-oksobutanoat; (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il-4-((2,2-dimetoksietil)amino)-4-oksobutanoat; (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il-4-((4-hidroksifenetil)amino)-4-oksobutanoat; (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il 4-((4-metoksifenetil)amino)-4- oksobutanoat; (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il-4-okso-4-((piridin-4-ilmetil)amino)butanoat; 3-hidroksi-2-(4-(4-okso-4-(((5aS,6R,12S)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)butanamido)buterna kiselina; (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetil-dekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il-4-((2-(1H-indol-3-il)etil)amino)-4-oksobutanoat;

4-((4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)metil)benzojeva kiselina; 4-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)-3-fenil buterna kiselina; (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il-4-((2-(1H-imidazol-5-il)etil)amino)-4-oksobutanoat;

(5aS,6R,12S)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il 4-((4-((2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi)-4-oksobutil)amino)-4-oksobutanoat;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetil-dekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il-4-okso-4-(((tetrahidrofuran-2-il)metil)amino)butanoat;

3-(1H-indol-3-il)-2-(4-(4-okso-4-(((5aS,6R,12S)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butan-amido)butanamido)propionska kiselina;

4-(metiltio)-2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)buterna kiselina;

5-amino-5-okso-2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)pentanska kiselina;

2

2-((S)-4-metil-2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3, 12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)pentanamido)sirćetna kiselina;

(S)-3-metil-2-(4-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)butanamido)buterna kiselina;

estar 4-[[2-(3,4-dihidroksifenil)etil]amino]-4-okso-, (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-dekahidro-3,6,9-trimetil-3,12-epoksi-12H-pirano[4,3-j]-1,2-benzodioksepin-10-il buterne kiseline;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il-4-(((S)-3-(1H-indol-3-il)-1-metoksi-1-oksopropan-2-il)amino)-4-oksobutanoat;

(S)-2-((S)-4-metil-2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)pentanamido)propionska kiselina;

(S)-2-((S)-4-metil-2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)pentanamido)glutarna kiselina;

(S)-3-metil-2-((S)-4-metil-2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetil)dekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)pentanamido)buterna kiselina;

(S)-2-((S)-4-metil-2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)pentanamido)-3-fenilpropionska kiselina;

(S)-4-metil-2-((S)-4-metil-2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)pentanamido)pentanska kiselina;

3-(2,2-dimetiltetrahidro-2H-piran-4-il)-3-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)propionska kiselina;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il 4-(((S)-1-((4-hidroksifenetil)amino)- 4-metil-1-oksopentan-2-il)amino)-4-oksobutanoat;

(R)-3-merkapto-2-((S)-4-metil-2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)pentanamido)propionska kiselina;

(2S,3R)-3-metil-2-((S)-4-metil-2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)pentanamido)pentanska kiselina;

(S)-3-(1H-indol-3-il)-2-((S)-4-metil-2-(4-okso-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il)oksi)butanamido)pentanamido)propionska kiselina;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetildekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il- 4-(((S)-1-(((S)-1-etoksi-3-(4-hidroksi-fenil)-1-oksopropan-2-il)amino)-4-metil-1-oksopentan-2-il)amino)-4-oksobutanoat;

(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimetil-dekahidro-3H-3,12-epoksi[1,2]dioksepino[4,3-i]izohromen-10-il- 4-(((S)-1-(((S)-3-(1H-indol-3-il)-1-metoksi-1-oksopropan-2-il)amino)-4-metil-1-oksopentan-2-il)amino)-4-oksobutanoat; ili njihovi funkcionalni derivati sa dokazanom anti-dijabetičnim delovanjem.

[0090] Drugi funkcionalni derivati artemizinina ili bilo kog od specifičnih artemizinin jedinjenja, kako je ovde opisano, mogu da budu sintetizovani ili mogu da se identifikuju odgovarajućim tehnologijama provere, uključujući test za vezivanje BTBD9, vezivanje gepirina ili agonističku aktivnost gepirina ili inhibitornu aktivnost BTBD9.

[0091] Takođe su preferirana aktivna sredstva koja podržavaju strukturu artemizinin jedinjenja ili drugih partnera koji vezuju gepirin ili koja su specifični ligandi gepirina, kao agonistička antitela ili fragmenti antitela.

[0092] U jednom ostvarenju pronalaska, aktivno sredstvo je pojedinačno terapeutski aktivno sredstvo primenjeno na subjektu, na primer, kao monoterapija koja modifikuje ili sprečava bolest

[0093] U još jednom ostvarenju, aktivno sredstvo je kombinovano sa drugim aktivnim sredstvima u koktelu, na primer kombinovano u miksturi ili delovima kita, tako da koktel sadrži više od jednog terapeutski aktivnog sredstva primenjenog na subjektu, na primer kao kombinovana terapija za modifikaciju ili prevenciju bolesti.

[0094] Preciznije, aktivno sredstvo može takođe da se primeni u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih ili profilaktičkih sredstava, uključujući ali bez ograničenja na, standardni tretman za lečenje iste ciljane indikacije, na primer aktivna sredstva za lečenje dijabetesa

2

uključujući bilo koji od insulina, sulfonilurea, inkretina, drugih sekretogoga, glitazona, mefromina, GLP-1 agonista ili DPP4 inhibitora, inhibitora glukozidaze, analoga amilina, SGLT2 inhibitora, bajpas hirurgije želuca ili transplantacije pankreatičnih ostrvaca.

[0095] U kombinovanoj terapiji, aktivno sredstvo može da se primeni kao smeša ili zajedno sa jednim ili više drugih terapeutskih režima, na primer ili pre, istovremeno ili nakon dodatnog leka.

[0096] Primeri farmaceutski aktivnih anti-dijabetičnih jedinjenja uključuju insulin, sulfoniluree, druge sekretagoge, glitazone, metformin ili druge bigvanide, GLP-1 agoniste ili DPP4 inhibitore, druge inkretine, inhibitore glukozidaze, analoge amilina, SGLT2 inhibitore, bajpas hirurgiju želuca ili transplantaciju pankreatičnih ostrvaca. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na kitove koji sadrže aktivno sredstvo iz pronalaska i lekove koji se koriste za kombinovanu terapiju.

[0097] Aktivno sredstvo iz pronalaska i druga farmaceutski aktivna jedinjenja mogu da se primene na subjektu u istoj farmaceutskoj kompoziciji ili u različitim farmaceutskim kompozicijama, na primer u isto vreme ili u različita vremena.

[0098] Naziv "Moco deficijencija" se odnosi na bolest zbog nedostatka aktivne sulfit oksidaze, ksantin dehidrogenaze/oksidaze, aldehid oksidaze ili bilo kog drugog enzima koji za svoju aktivnost zahtevaju prisustvo i dovoljan nivo molibden kofaktora, nezavisno od geneze. Dijagnoza Moco deficijencije uključuje, ali se ne ograničava samo na, rane napade, niske vrednosti mokraćne kiseline u krvi a visoke vrednosti sulfita, ksantina i mokraćne kiseline u urinu.

[0099] Naziv "epilepsija temporalnog režnja" se koristi da opiše ponavljajuću epilepsiju koja potiče od temporalnog režnja. Temporalni režanj je region cerebralnog korteksa koji se nalazi ispod lateralne fizure na obe cerebralne hemisfere u mozgu sisara. Epilepsija je poremećaj u mozgu koji se karakteriše trajnom predispozicijom za generisanje epileptičkih napada i neurobiološkim kognitivnim, psihološkim i socijalnim konsekvencama ovog stanja.

Definisanje epilepsije zahteva pojavu bar jednog epileptičkog napada.

[0100] Moco deficijencija je nasledna bolest izazvana mutacijom u MCOS1, MCOS2 ili gepirinu, dovodeći do odsustva aktivnosti ksantin dehidrogenaze/oksidaze i aldehid oksidaze (Reiss and Johnson, 2003). Objavljeno je nekoliko slučajeva Moco deficijencije a samo jedan pacijent je do sada izlečen. Zbog činjenice da ne postoji odobrena terapija raspoloživa za Moco deficijenciju, artemetar, zbog svog agonističkog efekta na gepirin, ima potencijal da postane “orphan” lek za Moco deficijenciju.

2

[0101] Novije studije su otkrile jedinstvenu ulogu gepirina u epilepsiji temporalnog režnja. Niska vrednost gepirina je detektovana kod pacijenata sa epilepsijom temporalnog režnja kao i u eksperimentalnom modelu miševa, a ovo može da bude zbog neodgovarajućeg spajanja mRNK gepirina (Forstera i saradnici, 2010). Na osnovu naše studije, tretman artemetrom može da poveća stabilnost gepirina i u ćelijama miševa i u ćelijama ljudi. Ovi rezultati pokazuju mogućnost da se artemetar uključi u terapijska sredstva epilepsije temporalnog režnja.

[0102] U narednom aspektu ovog otkrića, obezbeđen je postupak za identifikaciju aktivnog sredstva pogodnog za antidijabetički tretman. Funkcionalna ispitivanja obuhvataju ex vivo upotrebu pankreatičnih ćelija, na primer pankreatičnih alfa ćelija ili pankreatičnih beta ćelija u kojima je prekomerna ekspresija ARX, za ispitivanje da li test jedinjenje

i) povećava ekspresiju insulina u tim ćelijama; i/ili

ii) smanjuje ekspresiju ARX u tim ćelijama; i/ili

iii) inhibira vezivanje BTBD9 za CUL3; i/ili

iv) povećava nivo ili nagomilavanje gepirina; i/ili

v) povećava signalizaciju GABAR posredstvom gepirina.

[0103] Postupci za određivanje interakcije BTBD9 ili interakcije gepirina, na primer, agonističke aktivnosti gepirina in vitro uključuju ko-prečišćavanje, ELISA test, koimunoprecipitaciju, izotermalnu titracionu kalorimetriju, diferencijalnu skenirajuću fluorometriju (Thermofluor), fluorescentnu polarizaciju, fluorescentno rezonantni energetski transfer, ispitivanje proksimalne scintilacije i postupke rezonance površinskih plazmona i posebno postupak sposoban za operaciju visoke propusnosti, na primer postupak na bazi čipa.

[0104] Jedinjenja mogu takođe da budu kompjuterski oblikovana u ili na kristalnoj strukturi BTBD9 ili gepirina. Kada su potencijalno modulirajuća jedinjenja identifikovana, jedinjenja mogu da se provere pomoću in vitro, in vivo ili ex vivo celularnim analizama. Jedinjenja identifikovana na ovaj način su korisna kao analozi aktivnih sredstava iz pronalaska kojima je data prednost.

[0105] Prethodno dati opis biće potpunije razjašnjen niže datim primerima. Međutim, ovi primeri predstavljaju samo postupke primene jednog ili više ostvarenja iz ovog pronalaska i ne treba ih shvatati kao ograničenje okvira ovog pronalaska.

2

PRIMER

Materijali i postupci

Reagensi

[0106] Antitela korišćena u ovom projektu su insulin (Sigma 18510), glukagon (Sigma G2654), Pax4 (R&D AF2614, Lot No.UZY0110121), Pax4 (Santa Cruz 98942, Lot No. H1610), Arx (R&D AF7068, Lot No. CFOM0211121), Myc (Cell Signaling Technology CST2276, Lot 19), histon H2B (Cell Signaling Technology CST2934, Lot 1), gepirin (Abcam, ab25784), gepirin (Synaptic Systems, 147111), Cul3 (Abcam, ab75851), Btbd9 (Abnova, H00114781-D01), Btbd9 (Abcam, ab174976). Artemetar i prajmeri su nabavljeni od firme Sigma. Sekvence prajmera su pokazane na Slici 7. Cy-3-obeleženo magareće-αzamorca antitelo nabavljeno od firme Jackson ImmunoResearch. Sva druga fluorescentno obeležena antitela su nabavljena od Life Technologies Corporation. Sva HRP-obeležena antitela su nabavljena od Jackson Lab.

Ćelijska kultura

[0107] Mišje pankreatične ćelijske linije αTC1 (nabavljene od Novo Nordisk) i βTC3 (nabavljene od Novo Nordisk) su uzgajane u DMEM sa smanjenom glukozom obogaćenim sa 10% FBS, 50U/mL penicilina i 50 mg/mL streptomicina. Mišje pankreatične ćelijske linije Min6 (nabavljene od Novo Nordisk) sa doksicilin inducibilnim konstruktorom su uzgajane u DMEM sa visokim sadržajem glukoze obogaćenim sa 15% Tet System Approved FBS (Clonetech 631106), 71 uM 2-merkaptoetanola, 50U/mL penicilina i 50 ug/mL streptomicina. Ćelijska kultura za humana ostrvca je pratila utvrđene protokole (Walpita i saradnici, 2012).

Visokopropusni skrining

[0108] Jedinjenja (50 nL) se prenesu u crne optički pogodne ploče sa 384 udubljenja (Corning 3712) iz rezervnih DMSO ploča koristeći akustični transfer (Labcyte Inc.). Min6 ćelije (3000 ćelija po udubljenju) se u 50 ul medijuma prenesu na vrh jedinjenja. Tri dana nakon tretmana, ćelije se fiksiraju u 3.7% formaldehidu deset minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja sa

2

PBS, ćelije se fiksiraju sa čistim hladnim metanolom 10 minuta na -20 °C, permeabilišu sa 1% Triton X-100 u PBS u toku 30 minuta i blokiraju sa 3% BSA u PBS u toku 30 minuta. Dvadeset mikrolitara primarnog anti-insulin antitela, razblaženog u odnosu 1:2000 u 1.5% BSA, se doda u svako udubljenje i inkubira u toku noći na 4 °C. Nakon dva ispiranja sa PBS, u svako udubljenje se doda 20 mL Cy-3-obeleženog magarećeg-α-zamorca antitela razblaženog u odnosu 1:1000 i 10ug/mL Hoechst 3342 u PBS i inkubira 1 h. Nakon dva ispiranja sa PBS ploče se ostave na 4 °C zaštićene od svetlosti do analize.

[0109] Snimci se uzimaju automatskim mikroskopom (Perkin Elmer Operetta) koristeći objektiv 20X. Snimci se izlažu 10 ms u Hoechst kanalu i 500 ms u Alexa Fluor 548 kanalu. Snimci se analiziraju pomoću Harmony (Perkin Elmer) softvera. Identifikuju se jedra (Harmony Method C) a citoplazma se definiše na osnovu jedra (Harmony Method C).

Provereno je ukupno 1152 udubljenja koja su sadržala 280 jedinjenja iz kolekcije klinički odobrenih lekova sa jedinstvenom strukturom (CeMM, Vienna, Austria) u triplikatima sa kontrolnim udubljenjima. Najbolja su izabrana na osnovu intenziteta insulina u Alexa Fluor 548 kanalu i broja ćelija u Hoechst kanalu.

RNK-seq

[0110] Nakon inkubacije sa ili bez doksicilina u toku 24, 72 i 144 h, ćelije se liziraju a RNK izoluje pomoću RNeasy Mini Kit (Qiagen) u skladu sa protokolom proizvođača. Izradi se biblioteka za RNK-seq sa Ribo-zero Kit i Scriptseq v2 Kit (Epicenter) ili sa potpuno automatski robotski izrađenom bibliotekom. Duboko sekvenciranje je izvršeno na Biomedical Sequencing Facility na CeMM. Sirovi rezultati su poređani i kvantifikovani pomoću tophat i Bowtie 2.0.

RT-qPCR

[0111] Nakon što je RNK izolovana sa RNeasy Mini Kit-om (Qiagen), ponovo se transkribuje sa nasumice izabranim primerima koristeći High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Kvantitativni PCR se vrši sa Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) na Lightcycler 480 qPCR mašini(Roche).

Western blot

2

[0112] Ekstrakti celih ćelija se generišu liziranjem ćelija u NP-40 puferu koji sadrži 150 mM natrijum hlorida, 1.0% NP-40 i 50 mM Tris, pH 8.0 obogaćenim sa koktelom inhibitora proteaze (Roche). Lizat celih ćelija (30 mg) se nanese na SDS-poliakrilamidni gel za elektroforeze sa 30 mA po gelu a nakon toga elektroforezom prenese na nitroceluloznu membranu (GE Healthcare Life Science). Svi blotovi se inkubiraju sa odgovarajućim primarnim antitelima razblaženim u odnosu 1:1000 u 5% mleku na 4 °C u toku noći i sa HRP-obeleženim sekundarnim antitelima (razblaženim 1:20000) u toku 1 h. Signali se detektuju pomoću ECL Prime Western blotting reagensa za detekciju (Amersham).

Hemijske proteomike

[0113] NMR spektar je beležen na Bruker Avance III 400 (Bruker, Billerica, MA, U.S).

Hemijske promene su date u ppm a konstante udvajanja su date u hercima. Maseni spektri su beleženi na XeVo-UP-LC-TQ-MS sistemu (Waters, Milford, MA, U.S.). Prečišćavanje fleš hromatografijom na koloni (FCC) je izvršeno upotrebom silika gela 60 (Merck, Darmstadt, Germany), MPLC je izvedena na Biotage Isolera sistemu (Biotage, Uppsala, Sweden).

Čistoća sintetizovanih jedinjenja je određena i potvrđena UPLC analizama.

[0114] Sve hemikalije za sinteze su nabavljene od Sigma-Aldrich i korišćene su bez naknadnog prečišćavanja.

[0115] Matrice afiniteta leka su u osnovi izrađene kako je prethodno opisano (Huber i saradnici, 2014). Ukratko, etilendiamin (2.7 mL, 40 mmol), etanolamin (9.7 mL, 160 mmol) i trietilamin (15 mL, 108 mmol) se dodaju u 500 mL NHS-aktivirane sefaroza 4 perlice brzog protoka (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden) i reakcija se prenese na rotacioni šejker naredna 24 h. Perlice se isperu i resuspenduju u DMSO a NHS-aktivirani artesunat (100 mL, 1.00 mmol) se doda u suspenziju i smeša se prenese na rotacioni šejker u toku 24 h. Neizreagovane perlice se blokiraju dodavanjem NHS-acetata (10 mmol) i trietilamina (25 mL, 180 mmol), a nakon toga agitacijom na rotacionom šejkeru naredna 24 h. Nakon ispiranja sa DMSO i puferom za analizu, perlice se inkubiraju sa lizatima ćelija.

[0116] Hromatografija i eluacija afiniteta se izvodi u duplikatu kako je prethodno opisano (Huber i saradnici, 2014), upotrebom 10 mg ukupnog lizata ćelija kao ulaz proteina po replikatu.

[0117] Nakon eluacije, obogaćeni proteini se redukuju sa ditiotreitolom, ostaci cisteina alkiluju inkubacijom sa jodoacetamidom a uzorci digestuju sa modifikovanim tripsinom svinje (Promega, Madizon, WI). Tri procenta (i njihove multiplikacije) digestiranih eluata se prečiste i koncentruju pomoću C18 reverzno faznog materijala za naredne analize u duplikatu sa jednodimenzionalnom tečnom hromatografijom masenom spektrometrijom bez gela (1D-LCMS). Detalji LCMS metodologije su kako je prethodno opisano.

[0118] Pik ekstrakcije i konverzija RAW formata u MGF format za dalju identifikaciju proteina se izvodi sa msconvertom (ProteoWizard Library v2.1.2708). Inicijalna pretraga baze podataka se izvodi sa širom masenom tolerancijom za re-kalibraciju masenih lista za identifikaciju optimalnog finalnog proteina. Za inicijalnu pretragu baze podataka proteina, koristi se Mascot verzija 2.3.02 (Matrix Science Ltd., London, UK). Tolerancija na greške za prekursor i fragmentne jone je 610 ppm i 60.6 Da, tim redom a pretraga baze podataka ograničena na cele triptične peptide sa maksimum 1 promašenim cepanjem, oksidacija karbamidometil cisteina i metionina su podešeni kao fiksne i promenljive modifikacije, tim redom. Prag rezultata jona Mascot peptida je podešen na 30 a potrebna je identifikacija najmanje 3 peptida po proteinu. Istraživanje je izvršeno po humanoj Uni-ProtKB/SwissProt bazu podataka, izdanje 2012-05 uključujući sve izooblike proteina.

[0119] Inicijalne identifikacije peptida se koriste za dedukciju nezavisnih linearnih transformacija za prekursor i framgente mase koji bi umanjili kvadrat srednjeg odstupanja izmerene mase od teoretskih vrednosti. Lista fajlova re-kalibrisane mase je istražena nasuprot listi podataka istih humanih proteina kombinacijom Mascot i Phenyx (GeneBio, SA, verzija 2.5.14) pretraživača korišćenjem smanjene tolerancije mase (64 ppm i 60.3 Da). Dozvoljeno je jedno preskočeno mesto cepanja tripsina. Karbamidometil cistein se uzima kao fiksna modifikacija a oksidovani metionin se uzima kao varijabilna modifikacija. Za validaciju proteina, Mascot i Phenyx izlazne datoteke su obrađene interno razvijenim parserima. Proteini sa ≥2 jedinstvenih peptida iznad rezultata T1 ili sa jednim peptidom iznad rezultata T2 su izabrani kao nedvosmislene identifikacije. Drugi peptidi sa rezultatom > T3, uz ovako validirane proteine su takođe uzeti u obzir. Za Mascot pretrage su korišćeni sledeći pragovi: T1=14, T2=40 i T3=10; Phenyx pragovi su podešeni na 4.2, 4.75 i 3.5, tim redom (P-vrednost < 10-3). Validirani proteini dobijeni sa dva algoritma su spojeni, bilo koji konfliktni spektri su odbačeni i grupisani su u skladu sa peptidima koji su im zajednički. Nivo lažnog otkrića (FDR) od <1% za identifikaciju proteina i <0.1% za peptide (uključujući odbačene sa peptidima niskih rezultata) je određen primenom iste procedure na bazu podataka reverznih sekvenci proteina.

1

[0120] Ne-specifična veziva su dobijena filtracijom iz izmrvljenih lekova pomoću SAINT softvera (verzija 2.3.4) Koristeći brojanje spektra proteina kao meru zastupljenosti proteina i poređenjem stvarnih rezultata eksperimenata sa usitnjenim lekovima u odnosu na negativnu kontrolu, SAINT izračunava verovatnoću da taj protein bude pravi izazov za interakciju. Takođe smo uporedili SAINT verovatnoće sa brojem smanjenja spektra nakon kompeticije čistog jedinjenja što predstavlja magnitudu efekta. Stepen redukcije se računa kao odnos srednjeg brojanja spektra uočenog u usitnjenim lekovima sa/bez kompeticije. U svim uslovima su prosečno bila raspoloživa četiri spektralna brojanja (2 biološka replikata i 2 tehnička za svaki).

Ispitivanje ćelijskih termopromena

[0121] Ispitivanje ćelijske termopromene se vrši kako je opisano u literaturi (Martinez Molina i saradnici, Science 2013). Ukratko, lizati alfa ćelija se zagreju na date temperature u rasponu od 40-64 stepena Celzijusa i precipitirani proteini se uklone centrifugiranjem. Supernatanti se koriste u Western blot analizama ispitujući nivoe Btbd9 (Abeam), Cul3 i gepirina (Synaptic sistem) sa specifičnim antitelima.

Ko-imunoprecipitacija

[0122] Koriste se lizati alfa ćelija prethodno tretirani ili sa artemetrom ili kontrolnim DMSO a imunoprecipitacija se izvodi sa specifičnim antitelom usmerenim na Btbd9 (Abnova).

Kompleksi antitela se imobilišu na Protein A Dyna perlicama, isperu i eluiraju sa puferom za dopunjavanje koji sadrži SDS. Količina vezanih proteina se procenjuje poređenjem sa 5% korišćenih uzoraka. Western blot analiza sa specifičnim antitelom usmerenim na CUL3 se koristi za određivanje interakcije između BTBD9 i CUL3.

Statističke metode

[0123] Sve p-vrednosti su izračunate sa student t testom, ukoliko nisu navedeni drugi postupci. Nazivi obogaćenja gen ontologije su izvedeni koristeći Gorilla.

Rezultati

2

[0124] Da bi pravili razliku autonomnih efekata prekomerne ekspresije Pax4 i Arx iz fenotipova ćelija što zahteva signalizaciju parakrina i endokrina u mikrookruženju ostrvaca, izradili smo Min6 liniju beta ćelija miševa da se omogući induktabilna prekomerna ekspresija PAX4, ARX ili kontrola GFP (Slik 1a i slika 1b). U ovim ćelijskim linijama su merene promene ekspresije gena indukovane prekomernom ekspresijom faktora trnskripcije u toku jedan (slika 1c), tri i šest dana. Više od 800 gena je suprotno regulisano sa PAX4 i ARX na početku 24 h vremenskog raspona što ukazuje na direktnu regulaciju sa dva faktora (Slika 1d). Zanimljivo, endokrini progenitor faktor Ngn3 je bio u vrhu gena koji su različito regulisani sa dva faktora transkripcija. Dok Ngn3 suzbija prekomernu ekspresiju PAX4, ovaj faktor prolazno aktivira prekomernu ekspresiju ARX (Slike 1e i 1f). Jedno moguće objašnjenje aktivacije Ngn3 je da beta ćelije stiču povećanu plastičnost nakon prekomerne ekspresije ARX. Osim toga, indukcija ARX suzbija Pax4 nakon 24h i aktivira transkripciju nekoliko gena alfa ćelija uključujući glukaton u kasnijem vremenskom periodu od 6 dana (Slika 1g). Ove promene su indikativne za naš sistem koji verno modelira sudbinu prelaska beta u alfa ćelije nakon pekomerne ekspresije ARX što je prethodno uočeno samo u životinjskim modelima. Prema tome, generisali smo ćelijski sistem koji dozvoljava visoku propusnost i veliki broj provera za visok sadržaj funkcionalnih represora ARX. Za identifikaciju ovih jedinjenja, indukovali smo ekspresiju ARX u isto vreme kada smo dodali jedinjenja a nakon toga smo merili vrednosti insulina nakon 72 sata. U kontrolnim uzorcima tretiranim sa DMSO uočen je pad od 50% vrednosti insulina u poređenju sa neindukovanim ćelijama (Slika 2a). Nakon toga smo proveravali biblioteku od 280 klinički odobrenih malih molekula izabranih zbog svoje strukturne i ciljne raznovrsnosti. Hit jedinjenja su izabrana zbog svoje sposobnosti da održavaju visoke vrednosti insulina čak i u prisustvu ARX bez ugrožavanja vitalnosti ćelija (Slika 2b). Zanimljivo, dva artemizinina, artemetar i dihidroartemizinin, su u samom vrhu, potpuno inhibirajući fenotip prekomerne ekspresije ARX. Ovo su jedina hit jedinjenja koja takođe indukuju insulin i ekspresiju Pax4 u pankreatičnim alfa ćelijama, kako je predviđeno za funkcionalne inhibitore ARX (Slike 2c, d). Na osnovu ovih nalaza, ispitali smo efekte drugih artemizinin analoga u alfa i beta ćelijama. Dok artesunat pokazuje slične efekte (Slika 3a), analozi koji nemaju endoperoksidnu grupu, kao deoksiartemetar, ne ispoljavaju efekte na ekspresiju insulina u alfa ćelijama (Slika 3b). Ispitivanje odgovora na dozu pokazuje polovinu maksimalnih efektivnih koncentracija ispod 1 uM koje prekomerno ekspresuju ARX (Slika 3c) i ispod 10 uM u alfa ćelijama (Slika 3d).

[0125] Uprkos širokoj upotrebi u tretmanu malarije, mehanizam delovanja molekule artemizinina nije jasan. Predloženi su različiti ciljevi molekule uključujući oksidaciju gvožđa u eritrocitima ljudi i inhibiciju plazmodijum endoplazmatičnog retikulin Ca2+ ATPaze SERCA (O’Neill i saradnici, 2010). Pored toga, uočeni su potentni efekti ovih jedinjenja na ćelije sisara a artemizinini su opisani kao antiinflamatorna i antikancerogena sredstva. Efekat izolovanih artemizinina u pankreasu još uvek nije procenjen, ali postoje ograničeni dokazi za pozitivne efekte Artemisia ekstrakta na ljude i u životinjskim modelima dijabetesa tip 1 (Ahmad i saradnici, 2014). Za otkrivanje mehanizma delovanja moekula artemizinina u pankreatičnim alfa ćelijama, koristili smo pristup hemijske proteomike. Spojili smo artesunat, aktivni artemizinin u alfa ćelijama i beta ćelije sa prekomernom ekspresijom ARX, sa čvrstom podlogom i sproveli pull-down eksperimente u prisustvu i bez prisustva čistog artemetra (Slika 4a). Masensom spektrometrijom je identifikovan gepirin kao vodeći specifični interaktor i pokazano je veliko povećanje E3 ubikvitin ligaza uključujući CUL3 i njihovog verovatnog substrat adaptora Btbd9 (Slika 5b). Nakon toga smo koristili analizu ćelijske termopromene (Martinez Molina i saradnici Science 2013) da potvrdimo ove faktore kao interaktore artemizinina. Uobičajeno, interakcija sa malom molekulom stabiliše proteine na povećanje temperature i mi smo uočili ovakvu stabilizaciju za BTBD9 nakon tretmana artemetrom (Slika 4c). Nasuprot tome, gepirin je destabilizovan (Slika 4d). Gepirin ispoljava različite funkcije uključujući enzimatičku aktivnost u sintezi molibden kofaktora MoCo, regulaciji signalizacije mTOR preko interakcije sa RAFT1 i ima strukturnu ulogu u transportu glicina i GABA receptora do membrane. U alfa ćelijskoj liniji smo Wester blot analizom i imunofluorescencijom (Slika 5a i Slika 5e) uočili doza-zavisno povećanje nivoa gepirin proteina nakon tretmana artemizinom. Ovo zapažanje sugeriše povećanje stabilnosti gepirina posredstvom artemizinina. U skladu sa tim, uočili smo povećani kapacitet sinteze MoCo u lizatima tretiranim jedinjenjem (Slika 5f). U liniji sa povećanim vrednostim i nagomilavanjem gepirina, takođe smo uočili veće koncentracije intracelularnog hloridnog jona (Slika 5g) i povećano prisustvo GABA receptora u membrani (Slika 5b). Da bi proverili da li alternacije u sistemu Cul3-Btbd9 ubikvitinacije mogu da budu odgovorne za povećanje stabilnosti gepirina, sproveli smo eksperimente ko-imunoprecipitacije. Uočili smo snažnu interakciju BTBD9 sa CUL3 koja je bila potpuno blokirana dodavanjem artemetra (Slika 5c).

[0126] Eksperimenti sekvenciranja RNK su dalje istakli efekte artemetra na signalizaciju GABA receptora. Set analize obogaćivanja gena identifikuje proces sinaptičke transmisije između značajno izmenjenih puteva i uočili smo značajno povećanu regulaciju u putevima

4

Nrxn3, Sv2b i Shc3 gena (Slika 5d). Zanimljivo, GABA je predložen kao faktor koji može da preobrati dijabetes indukcijom proliferacije beta ćelija (Soltani i saradnici, 2011). Kako bi dokazali da signalizacija GABA receptora igra ulogu u mehanizmu delovanja artemizinina u pankreatičnim alfa ćelijama, kombinovali smo artemetar sa bikukulinom (Slika 5h) ili gabazinom (Slika 5i), dva antagonista GABA receptora. Prisustvo antagonista GABA receptora je inhibiralo efekte artemetra u TC1 ćelijama. Značajno je, tretman tiagabinom, GABAR agonistom, takođe povećava ekspresiju insulina u alfa ćelijama (Slika 5j). Da bi potvrdili značaj našeg otkrića za biologiju čoveka, ispitali smo efekte artemetra u humanim primarnim pankreatičnim ostrvcima. U skladu sa otkrićima u ćelijskim linijama miševa, uočili smo povećane vrednosti gepirin proteina i povećano bojenje membrane za GABA receptor (Slika 6b). Tretman sa artemetrom u toku 3 dana povećava sekreciju insulina (Slika 6b) i broj dvostruko pozitivnih ćelija koje ekspresuju i insulin i glukagon (Slika 6a,d). Na nivo ekspresije gena, ukupne kulture ostrvaca tretirane artemetrom dramatično redukuju ekspresiju ARX i PPY faktora alfa ćelija, dok je blago povećana ekspresija faktora beta ćelija uključujući PAX6 i PAX4.

[0127] Terapija kombinacijom artemizinina je tretman izbora za malariju i godišnje se podeli više od 300 miliona tretmana. Uprkos ovom velikom broju pacijenata, nisu objavljeni klinički podaci o efektima artemizinina na pankreatičnu endokrinu funkciju kod ljudi i iz više razloga je to toliko dugo moglo da ostane neprimećeno. Stanje akutno životno ugroženih pacijenata inficiranih plazmodijumom zajedno sa poznatom sklonošću plazmodijum infekcije da dovede do hipoglikemije u kratkom roku, dovodi do velikih poremećaja nivoa glukoze u krvi. Osim toga, kod zdravih pojedinaca se ne očekuje da čak i dramatično povećanje broja beta ćelija izazove fenotip zato što oni samo izlučuju insulin na glukozom regulisani način.

Neočekivano, trenutno ne postoje raspoloživi postupci za direktno ispitivanje mase humanih beta ćelija. Idealan subjekt za studiju efekata artemizinina na funkciju pankreasa bi bio pacijent sa dijabetesom tip 1 sa potpunim odsustvom detektabilnog insulin C-peptida, stanjem u kome se nalazi približno 60% T1D pacijenata ili jedno na 1500 dece. Trenutno pokušavamo da dobijemo uzorke krvi od takvih pacijenata koji su još dodatno inficirani sa malarijom i primaju tretman kombinovane artemizinin terapije. Ukoliko artemizinini takođe indukuju transdiferencijaciju, mi očekujemo da bude moguća detekcija C-peptida u uzorcima krvi nakon tretmana ali ne u uzorcima uzetim za dijagnozu.

[0128] Ciklus kratkotrajnog tretmana, negativni efekti plazmodijuma ili drugih lekova u kombinovanom tretmanu ili dostižni nivoi artemizinina u pankreasu bi još uvek mogli da ograniče kliničku korist u ovim okolnostima. Međutim, čak i u tom slučaju naši nalazi otvaraju potpuno nove puteve za otkriće leka za tretman dijabetesa tip 1 transdiferencijacijom alfa u beta ćelije. Ovo bi uključilo strukturno različite gepirin stabilizatore i takođe jedinjenja koja ciljaju druge učesnike u putevima signalizacije GABA receptora.

REFERENCE

[0129]

Ahmad, W., Khan, I., Khan, M.A., Ahmad, M., Subhan, F. i Karim, N. (2014). Evaluation of antidiabetic and antihyperlipidemic activity of Artemisia indicalinn (aeriel parts) in Streptozotocin induced diabetic rats. J Ethnopharmacol.151: 618-623.

Al-Hasani, K., Pfeifer, A., Courtney, M., Ben-Oth- man, N., Gjernes, E., Vieira, A., Druelle, N., Avolio, F., Ravassard, P., Leuckx, G., i saradnici (2013). Adult Duct-Lining Cells Can Reprogram into beta-like Cells Able to Counter Repeated Cycles of Toxin-Induced Diabetes. Dev Cell 26, 86-100.

Arancibia-Cárcamo, I.L., Yuen, E.Y., Muir, J., Lumb, M.J., Michels, G., Saliba, R.S., Smart, T.G., Yan, Z., Kittler, J.T., Moss, S.J..(2009). Ubiquitin-dependent lysosomal targeting of GABA(A) receptors regulates neuronal inhibition. Proc Natl Acad Sci U S A.106:17552-17557. Collombat, P., Xu, X., Ravassard, P., Sosa-Pineda, B., Dussaud, S., Billestrup, N., Madsen, O.D., Serup, P., Heimberg, H. i Mansouri, A. (2009). The ectopic expression of Pax4 in the mouse pancreas converts progenitor cells into alpha and subsequently beta cells. Cell 138, 449-462.

Courtney, M., Gjernes, E., Druelle, N., Ravaud, C., Vieira, A., Ben-Othman, N., Pfeifer, A., Avolio, F., Leuckx, G., Lacas-Gervais, S., i saradnici (2013). The Inactivation of Arx in Pancreatic alpha-Cells Triggers Their Neogenesis and Conversion into Functional beta-Like Cells. PLoS Genet 9, e1003934.

Forstera, B., Belaidi, A.A., Juttner, R., Bernert, C., Tsokos, M., Lehmann, T.N., Horn, P., Dehnicke, C., Schwarz, G. i Meier, J.C. (2010). Irregular RNK splicing curtails postsynaptic gepirin in the cornu ammonis of patients with epilepsy. Brain 133, 3778-3794.

Genau, H.M., Huber, J., Baschieri, F., Akutsu, M., Dötsch, V., Farhan, H., Rogov, V., Behrends, C. (2015). CUL3-KBTBD6/KBTBD7 Ubiquitin Ligase Cooperates with GABARAP Proteins to Spatially Restrict TIAM1-RAC1 Signaling. Mol Cell 57:995-1010.

Huber, K i saradnici (2014) Stereospecific targeting of MTH1 by (S)-crizotinib as anticancer strategy. Nature, 508, 222-227.

Martinez Molina, D., Jafari, R., Ignatushchenko, M., Seki, T., Larsson, E.A., Dan, C., Sreekumar, L., Cao, Y, Nordlund, P. (2013) Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science.341, 84-7.

O’Neill, P.M., Barton, V.E. i Ward, S.A. (2010). The molecular mechanism of action of artemizinin--the debate continues. Molecules 15, 1705-1721.

Pagliuca, F.W. i Melton, D.A. (2013). How to make a functional beta-cell. Development 140, 2472-2483.

Reiss, J. i Johnson, J.L. (2003). Mutations in the molybdenum cofactor biosynthetic genes MOCS1, MOCS2 i GEPH. Hum Mutat 21, 569-576.

Soltani, N., Qiu, H., Aleksic, M., Glinka, Y., Zhao, F., Liu, R., Li, Y., Zhang, N., Chakrabarti, R., Ng, T., i saradnici (2011). GABA exerts protective and regenerative effects on islet beta cells and reverses diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 11692-11697.

Stogios, P.J., Downs, G.S., Jauhal, J.J., Nandra, S.K., Privé, G.G. (2005). Sequence and structural analysis of BTB domain proteins. Genome Biol.6:R82.

Tyagarajan, S.K. i Fritschy, J.M. (2010). GABA(A) receptors, gepirin and homeostatic synaptic plasticity.J Physiol.588, 101-106.

Walpita, D., Hasaka, T., Spoonamore, J., Vetere, A., Takane, K.K., Fomina-Yadlin, D., Fiaschi-Taesch, N., Shamji, A., Clemons, P.A., Stewart, A.F., i saradnici (2012). A human islet cell culture system for highthroughput screening. J Biomol Screen 17, 509-518.

Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J. i Melton, D.A. (2008). In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature 455, 627-632.

4

4

4

4

4

4

4

Claims (9)

1. Patentni zahtevi 1. Artemizinin jedinjenje za upotrebu u tretmanu pacijenta sa dijabetesom za povećanje nivoa insulina, naznačeno time što je artemizinin jedinjenje jedinjenje opšte formule I

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: ----- je jednostruka ili dvostruka veza; R1, R2, R3, R4i R6predstavljaju nezavisno H, halogen, -CF3, = CH2, -OR<a>, -NR<a>R<b>, -(CH2)nCOOR<a>, -(CH2)nC(=O)R<a>, -(CH2)nCONR<a>R<a>, C1-6alkil, C2-6alkenil, C2-6alkinil, C3-7cikloalkil, C3-7heterocikloalkil, aril ili heteroaril grupu; i R5predstavlja H, halogen, =O, -OR<a>, -NR<a>R<b>, -(CH2)nCF3, -(CH2)nCHF2, -(CH2)nC(=O)R<a>, -O(CH2)nCOOR<a>, -OC(=O)(CH2)nCOOR<a>, -OC(=O)R<a>, C1-6alkil, C2-6alkenil, C2-6alkinil, C3-7cikloalkil, C3-7heterocikloalkil, aril ili heteroaril grupu; i X predstavlja O ili -NR<a>; R<a>predstavlja H ili opciono supstituisanu C1-6alkil, C2-6alkenil ili C2-6alkinil grupu; i R<b>predstavlja H ili opciono supstituisanu C1-6alkil, C2-6alkenil, C2-6alkinil, cikloalkil, aril, heteroaril ili aralkil grupu; ili R<a>i R<b>zajedno sa susednim atomom azota predstavljaju heterocikličnu grupu, gde je heterociklični atom N, O ili S; i gde je heterociklični atom opciono supstituisan (artemizon); i n je 0, 1, 2 ili 3.
2. 2. Artemizinin jedinjenje za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što pacijent boluje od dijabetesa tip I, dijabetesa tip II, C-peptid negativnog ili C-peptid pozitivnog dijabetesa ili poremećaja povezanih sa dijabetesom.
3. 3. Artemizinin jedinjenje za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačeno time što se jedinjenje primenjuje na pacijentu u terapeutski efektivnoj količini za lečenje hipoinsulinemije, preferirano sistemskom ili lokalnom primenom.
4. 4. Artemizinin jedinjenje za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time što je jedinjenje izabrano iz grupe koja sadrži artelinsku kiselinu, artemetar, artemotil, artenimol, artemizon i artesunat ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so.
5. 5. Artemizinin jedinjenje za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time što je jedinjenje udvojeno sa ligandom ili radikalom nosača.
6. 6. Artemizinin jedinjenje za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time što se jedinjenje primenjuje u farmaceutskom preparatu za oralnu, parenteralnu, sistemsku, mukoznu, topičnu, rektalnu, sublingvalnu, bukalnu ili implantnu upotrebu, gde preparat uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu je farmaceutski preparat preferirano tableta, dermalna ili transdermalna formulacija, mast, gel, krem, losion, flaster, rastvor, injektabilni rastvor, oftalmički rastvor, disperzni sistem, emulzija, sistem mikroenkapsuliranog leka, osmotska pumpa, subdermalni implant, granula, mikrosfera, sistem modifikovanog oslobađanja, sistem ciljanog oslobađanja, granule ili pilule.
7. 7. Artemizinin jedinjenje za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time što se jedinjenje primenjuje u dozi najmanje jedanput dnevno, preferirano u dozi od 0.01 - 2000 mg/dan, prednost je 0.1 - 500 mg/dan, u pojedinačnoj dozi ili višestrukim dozama, pri čemu je doza obezbeđena u formulaciji ili uređaju za usporeno oslobađanje.
8. 8. Artemizinin jedinjenje za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 7, naznačeno time što se tretman kombinuje sa drugom antidijabetičnom terapijom, prednost je tretman sa antidijabetičnim sredstvom, preferirano bilo kojim od insulina, sulfonilurea, inkretina, drugih sekretogoga, glitazona, metformina, GLP-1 agonista ili DPP4 inhibitora, inhibitora glukozidaze, analoga amilina, SGLT2 inhibitora, operacijom bajpasa želuca ili transplantacijom pankreatičnih ostrvaca.
9. 9. Artemizinin jedinjenje za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 8, naznačeno time što se jedinjenje primenjuje u kombinaciji sa drugim agonistom gepirina ili BTBD9 inhibitorom.