RS59538B1 - 3' utr sekvence za stabilizaciju rnk - Google Patents

3' utr sekvence za stabilizaciju rnk

Info

Publication number
RS59538B1
RS59538B1 RS20191347A RSP20191347A RS59538B1 RS 59538 B1 RS59538 B1 RS 59538B1 RS 20191347 A RS20191347 A RS 20191347A RS P20191347 A RSP20191347 A RS P20191347A RS 59538 B1 RS59538 B1 RS 59538B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nucleic acid
acid sequence
fragment
rna
cells
Prior art date
Application number
RS20191347A
Other languages
English (en)
Inventor
Von Niessen Alexandra Orlandini
Stephanie Fesser
Britta Vallazza
Tim Beissert
Andreas Kuhn
Ugur Sahin
Marco Alexander Poleganov
Original Assignee
Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh
Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh, Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh filed Critical Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh
Publication of RS59538B1 publication Critical patent/RS59538B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B13/00—Details of tables or desks
    • A47B13/02—Underframes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B3/00—Folding or stowable tables
    • A47B3/002—Folding or stowable tables with foldable underframe
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B33/00—Kitchen or dish-washing tables
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B43/00—Cabinets, racks or shelf units, characterised by features enabling folding of the cabinet or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B77/00—Kitchen cabinets
    • A47B77/02—General layout, e.g. relative arrangement of compartments, working surface or surfaces, supports for apparatus
    • A47B77/022—Work tops
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B77/00—Kitchen cabinets
    • A47B77/04—Provision for particular uses of compartments or other parts ; Compartments moving up and down, revolving parts
    • A47B77/06—Provision for particular uses of compartments or other parts ; Compartments moving up and down, revolving parts for incorporating sinks, with or without draining boards, splash-backs, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B77/00—Kitchen cabinets
    • A47B77/04—Provision for particular uses of compartments or other parts ; Compartments moving up and down, revolving parts
    • A47B77/08—Provision for particular uses of compartments or other parts ; Compartments moving up and down, revolving parts for incorporating apparatus operated by power, including water power; for incorporating apparatus for cooking, cooling, or laundry purposes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B77/00—Kitchen cabinets
    • A47B77/04—Provision for particular uses of compartments or other parts ; Compartments moving up and down, revolving parts
    • A47B77/16—Provision for particular uses of compartments or other parts ; Compartments moving up and down, revolving parts by adaptation of compartments or drawers for receiving or holding foodstuffs; by provision of rotatable or extensible containers for foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B77/00—Kitchen cabinets
    • A47B77/04—Provision for particular uses of compartments or other parts ; Compartments moving up and down, revolving parts
    • A47B77/18—Provision for particular uses of compartments or other parts ; Compartments moving up and down, revolving parts by special arrangements for accommodating removable containers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B95/00—Fittings for furniture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B95/00—Fittings for furniture
    • A47B95/008—Suspension fittings for cabinets to be hung on walls
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47C—CHAIRS; SOFAS; BEDS
    • A47C4/00—Foldable, collapsible or dismountable chairs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47C—CHAIRS; SOFAS; BEDS
    • A47C4/00—Foldable, collapsible or dismountable chairs
    • A47C4/04—Folding chairs with inflexible seats
    • A47C4/08—Folding chairs with inflexible seats having a frame made of wood or plastics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47C—CHAIRS; SOFAS; BEDS
    • A47C7/00—Parts, details, or accessories of chairs or stools
    • A47C7/002—Chair or stool bases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47C—CHAIRS; SOFAS; BEDS
    • A47C7/00—Parts, details, or accessories of chairs or stools
    • A47C7/002—Chair or stool bases
    • A47C7/006—Chair or stool bases with castors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47K—SANITARY EQUIPMENT; ACCESSORIES THEREFOR, e.g. TOILET ACCESSORIES
    • A47K3/00—Baths; Showers; Appurtenances therefor
    • A47K3/28—Showers or bathing douches
    • A47K3/283—Fixed showers
    • A47K3/284—Pre-fabricated shower cabinets
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60B—VEHICLE WHEELS; CASTORS; AXLES FOR WHEELS OR CASTORS; INCREASING WHEEL ADHESION
    • B60B33/00—Castors in general ; Anti-clogging castors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E04—BUILDING
    • E04H—BUILDINGS OR LIKE STRUCTURES FOR PARTICULAR PURPOSES; SWIMMING OR SPLASH BATHS OR POOLS; MASTS; FENCING; TENTS OR CANOPIES, IN GENERAL
    • E04H1/00—Buildings or groups of buildings for dwelling or office purposes; General layout, e.g. modular co-ordination or staggered storeys
    • E04H1/12—Small buildings or other erections for limited occupation, erected in the open air or arranged in buildings, e.g. kiosks, waiting shelters for bus stops or for filling stations, roofs for railway platforms, watchmen's huts or dressing cubicles
    • E04H1/125—Small buildings, arranged in other buildings
    • E04H1/1266—Cubicles for dressing; Toilets
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F16—ENGINEERING ELEMENTS AND UNITS; GENERAL MEASURES FOR PRODUCING AND MAINTAINING EFFECTIVE FUNCTIONING OF MACHINES OR INSTALLATIONS; THERMAL INSULATION IN GENERAL
    • F16C—SHAFTS; FLEXIBLE SHAFTS; ELEMENTS OR CRANKSHAFT MECHANISMS; ROTARY BODIES OTHER THAN GEARING ELEMENTS; BEARINGS
    • F16C11/00—Pivots; Pivotal connections
    • F16C11/04—Pivotal connections
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B3/00—Folding or stowable tables
    • A47B3/002—Folding or stowable tables with foldable underframe
    • A47B2003/006—Folding or stowable tables with foldable underframe having X/Y-crossed legs rotating around a central vertical axis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
    • A47B—TABLES; DESKS; OFFICE FURNITURE; CABINETS; DRAWERS; GENERAL DETAILS OF FURNITURE
    • A47B2200/00—General construction of tables or desks
    • A47B2200/0011—Underframes
    • A47B2200/0017—Nodal leg assembly for table
    • A47B2200/0018—Nodal leg assembly for table in two parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Architecture (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Civil Engineering (AREA)
  • Structural Engineering (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)

Description

Opis
[0001] Upotreba RNK nudi atraktivnu alternativu DNK kako bi se zaobišli potencijalni bezbednosni rizici povezani sa terapeutskom upotrebom DNK. In vitro-transkribovana RNK (IVT-RNK) je od posebnog interesa u terapeutskim pristupima. Prednosti terapeutske upotrebe RNK uključuju prolaznu ekspresiju i netransformišući karakter. RNK nema potrebu da uđe u nukleus da bi se eksprimirala i osim toga ne može se integrisati u genom domaćina, čime se eliminiše rizik od onkogeneze. Kada se upotrebljava za vakcinaciju, injektiranje RNK može indukovati i ćelijske i humoralne imunske odgovore in vivo. Međutim, upotreba RNK za kliničke primene je u velikoj meri ograničena posebno kratkim poluživotom RNK.
[0002] IVT vektori se mogu upotrebljavati na standardizovani način kao matrica za in vitro transkripciju. Takvi IVT vektori mogu imati sledeću strukturu: 5' promotor RNK polimeraze koji omogućava transkripciju RNK, koji prati gen od interesa od koga se bočno bilo sa 3' i/ili 5' strane nalaze netranslatirajući regioni (UTR), i 3' poliadenilna kaseta koja sadrži A nukleotide. Pre in vitro transkripcije, cirkularni plazmid se linearizuje nizvodno od poliadenilne kasete restrikcionim enzimima tipa II (sekvenca za prepoznavanje odgovara mestu isecanja). Prema tome, poliadenilna kaseta odgovara kasnijoj poli(A) sekvenci u transkriptu.
[0003] Humane nezrele dendritske ćelije (hiDC) se široko upotrebljavaju za razvoj i poboljšanje imunoterapija za lečenje kancera. Napunjene in vitro transkribovanom (IVT)-iRNK koja kodira specifični tumorski antigen (TA), hiDC mogu da indukuju efikasan anti-tumorski odgovor. Međutim, preduslov za efikasan imunski odgovor uz pomoć vakcina za kancer na bazi RNK je visoka stabilnost i efikasnost translacije RNK. Obe se mogu unaprediti strukturnim modifikacijama 5'-kape, 3' poli(A)-repa, kao i 5' i 3' netranslatirajućim regionima (UTR). Elementi sekvence unutar UTR utiču na efikasnost translacije (uglavnom 5'-UTR) i stabilnost RNK (uglavnom 3'-UTR).
[0004] U prethodnom radu smo pokazali da dve uzastopne kopije 3'-UTR humanog beta-globina (sada zvane 2hBg; prethodno takođe 2βgUTR) doprinose većoj stabilnosti transkripta i efikasnosti translacije (Holtkamp (2006) Blood 108:4009-4017). Međutim, prisustvo dve identične kopije 3ꞌ-UTR sekvence humanog beta-globina u plazmidnoj DNK, koja se na kraju upotrebljava kao matrica za in vitro transkripciju RNK, nosi rizik od rekombinacije tokom njene propagacije u E. coli. Slično tome, svaki pristup kloniranja, posebno upotrebljavanje PCR-zasnovane amplifikacije, je veoma teško. Isto važi za PCR-zasnovanu amplifikaciju RNK-kodirajućeg regiona sa 2hBg na 3ꞌ-kraju koji će se upotrebiti kao matricu za in vitro transkripciju, jer je ovde primećeno pogrešno sparivanje prajmera, koje dovodi do izostavljanja jedne kopije 3ꞌ-UTR humanog beta-globina. Da bi izbegli ove probleme nastojali smo da identifikujemo nove sekvence koje imaju stabilizirajući efekat na in vitro transkribovanu iRNK barem sličan, idealno čak i bolji od, 2hBg sekvence.
[0005] Xia et al. (International Journal of Molecular Medicine, 2013, 31(5):1081-1086) odnosi se na gen "Amino-terminalni pojačivač razdvajanja" (AES).
[0006] Cilj ovog pronalaska bio je da obezbedi RNK povećane stabilnosti i/ili efikasnosti translacije i sredstva za dobijanje takve RNK. Trebalo bi biti moguće dobiti povećane stepene ekspresije upotrebom navedene RNK u terapiji.
[0007] Ovaj cilj je postignut u skladu sa pronalaskom po predmetu patentnih zahteva.
[0008] Ovaj pronalazak se odnosi na stabilizaciju RNK, naročito iRNK, i povećanje translacije iRNK. Ovaj pronalazak se posebno odnosi na modifikaciju RNK, naročito in vitrotranskribovane RNK, što rezultira u povećanoj stabilnost transkripta i/ili efikasnosti translacije.
[0009] U skladu sa pronalaskom, pokazano je da određene sekvence u 3'-netranslatirajućem regionu (UTR) RNK molekula poboljšavaju stabilnost i efikasnost translacije.
[0010] Upotrebom RNK modifikovane u skladu sa pronalaskom u transfekciji dendritskih ćelija (DC), biće moguće, na primer, povećati gustinu antigen-specifičnih peptidnih/MHC kompleksa na transfektovanim ćelijama i njihovu sposobnost da stimulišu i ekspanduju antigen-specifične CD4+ i CD8<+>T ćelije. Pronalazak se prema tome, u jednom primeru izvođenja, odnosi na strategiju za optimizaciju RNK vakcina za transfekciju DC ili RNK-transfektovanih DC vakcina upotrebom RNK koja je modifikovana RNK modifikacijama opisanim u skladu sa pronalaskom.
[0011] U skladu sa pronalaskom, modifikacija, i time i stabilizacija i/ili povećanje efikasnosti translacije, RNK je poželjno postignuta genetskim modifikovanjem ekspresionih vektora koji ponajprije služe kao matrica za RNK transkripciju in vitro. Ovi ekspresioni vektori omogućavaju transkripciju RNK sa 3'-netranslatirajućim regionom opisanim u skladu sa pronalaskom, i poželjno između sekvence koja kodira peptid ili protein (otvoren okvir čitanja) i poli(A) sekvence.
[0012] Ovi vektori takođe mogu omogućiti transkripciju RNK sa poli(A) sekvencom koja poželjno ima otvoreni kraj u navedenoj RNK, tj. nema nukleotida drugih nego A nukleotida bočno od navedene poli(A) sekvence na njenom 3' kraju. Poli(A) sekvenca sa otvorenim krajem u RNK može se postići uvođenjem restrikcionog mesta isecanja tipa IIS u ekspresioni vektor koji omogućava da se RNK transkribuje pod kontrolom 5' promotora RNK polimeraze i koji sadrži poliadenilnu kasetu, pri čemu se sekvenca za prepoznavanje nalazi 3' od poliadenilne kasete, dok se mesto isecanja nalazi uzvodno i samim tim unutar poliadenilne kasete. Restrikciono isecanje na restrikcionom mestu isecanja tipa IIS omogućava plazmidu da bude linearizovan unutar poliadenilne kasete. Linearizovani plazmid može se zatim upotrebiti kao matrica za in vitro transkripciju, što rezultira transkriptom koji se završava nemaskiranom poli(A) sekvencom. Osim toga, opciono narušavanje 3ꞌ poliadenilne kasete nasumičnom nukleotidnom sekvencom, sa jednakom distribucijom 4 nukleotida (linker), povećava stabilnost 3' poliadenilne kasete u E.coli.
SAŽETAK PRONALASKA
[0013] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na molekul nukleinske kiseline kako je definisano u priloženom patentnom zahtevu 1.
[0014] U jednom primeru izvođenja, (c-8) sekvenca nukleinske kiseline sadrži kombinaciju (c-4) i (c-6). U jednom primeru izvođenja, (c-4) se nalazi 5ꞌ u odnosu na (c-6). U jednom primeru izvođenja, kombinacija (c-4) i (c-6) sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 174, njen fragment, ili varijantu navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu.
[0015] U jednom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska dalje sadrži (d) sekvencu nukleinske kiseline koja, kada se transkribuje pod kontrolom promotora (a), kodira sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A. U jednom primeru izvođenja, navedena poliadenilna sekvenca sadrži najmanje 20 A nukleotida, poželjno najmanje 40, najmanje 80, najmanje 100 ili najmanje 120 A nukleotida, poželjno uzastopnih A nukleotida. U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A je sekvenca, poželjno proizvoljna sekvenca, 2 ili više uzastopnih nukleotida, pri čemu je prvi i poslednji nukleotid navedene sekvence 2 ili više uzastopnih nukleotida nukleotid drugi nego A nukleotid. U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca nukleinske kiseline (d) je sekvenca nukleinske kiseline koja, kada se transkribuje pod kontrolom promotora (a), kodira sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koji sadrže nukleotide koji nisu nukleotidi A i koja pokazuje veću stabilnost nakon propagacije navedenog molekula nukleinske kiseline u Escherichia coli u poređenju sa molekulom nukleinske kiseline koji sadrži umesto navedene sekvence nukleinske kiseline (d) sekvencu nukleinske kiseline (d)' koja, kada se transkribuje pod kontrolom promotora (a), kodira poliadenilnu sekvencu iste dužine kao navedena sekvenca nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A. U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A sadrži najmanje 80 nukleotida, poželjno najmanje 90 ili 100 nukleotida. U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A sadrži najmanje 90 nukleotida, poželjno najmanje 100 nukleotida, poželjno najmanje 110 nukleotida. U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A sadrži oko 120 nukleotida. U konkretnim primerima izvođenja, navedena sekvenca nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A sadrži do 200, poželjno do 150, i naročito, do 130 nukleotida. U jednom primeru izvođenja, najmanje 90%, poželjno najmanje 92%, poželjno najmanje 95%, 97% ili 98% nukleotida navedene sekvence nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A su A nukleotidi u navedenoj poliadenilnoj sekvenci (ne uključuju A nukleotide u navedenoj sekvenci jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A).
[0016] U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A se nalazi unutar regiona od pozicije 21 do pozicije 80, poželjno od pozicije 21 do pozicije 60, još poželjnije od pozicije 31 do pozicije 50 navedene poliadenilne sekvence.
[0017] U jednom primeru izvođenja, navedenoj sekvenci jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A prethodi najmanje 20 A ostataka, poželjno najmanje 30, 40 ili 50 A ostataka u navedenoj poliadenilnoj sekvenci. U posebnim primerima izvođenja, navedenoj sekvenci jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A prethodi do 80 A ostataka, poželjno do 70 ili 60 A ostataka u navedenoj poliadenilnoj sekvenci.
[0018] U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A praćena je sa najmanje 20 A ostataka, poželjno najmanje 30, 40, 50, 60 ili 70 A ostataka u pomenutoj poliadenilnoj sekvenci. U posebnim primerima izvođenja, navedena sekvenca jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A praćena je sa do 100 A ostataka, poželjno do 80 A ostataka u navedenoj poliadenilnoj sekvenci.
[0019] U jednom primeru izvođenja, navedenoj sekvenci jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A prethodi 20 do 50, poželjno 30 do 40 A ostataka u navedenoj poliadenilnoj sekvenci i praćena je sa 30 do 80, poželjno 40 do 70 A ostataka u navedenoj poliadenilnoj sekvenci.
[0020] U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca jednog ili više uzastopnih nukleotida koji sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A ima dužinu od najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 8, poželjno najmanje 10, poželjnije najmanje 15 nukleotida.
[0021] U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca jednog ili više uzastopnih nukleotida koji sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A ima dužinu ne veću od 50, poželjno ne veću od 30, poželjnije ne veću od 20 nukleotida.
[0022] U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca jednog ili više uzastopnih nukleotida koji sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A ne sadrži više od 3, poželjno ne više od 2, poželjno nema uzastopne A ostatke.
[0023] U jednom primeru izvođenja, sekvence nukleinske kiseline (b), (c) i (d) pod kontrolom promotora (a) mogu biti transkribovane da daju zajednički transkript. U jednom primeru izvođenja, sekvence nukleinske kiseline transkribovane sa sekvenci nukleinske kiseline (c) i opciono (d) su aktivne tako da povećaju efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline koja je transkribovana sa transkriptabilne sekvence nukleinske kiseline (b).
[0024] U jednom primeru izvođenja, u transkriptu navedena sekvenca nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A se nalazi na 3' kraju.
[0025] U jednom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska je DNK molekul. U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul nukleinske kiseline je ekspresioni vektor ili plazmid kao što je IVT vektor.
[0026] U jednom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska je zatvoreni cirkularni molekul ili linearni molekul.
[0027] U jednom primeru izvođenja, transkriptabilna sekvenca nukleinske kiseline sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein i sekvenca nukleinske kiseline za uvođenje transkriptabilne sekvence nukleinske kiseline je višestruko mesto za kloniranje.
[0028] U jednom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska dalje sadrži jedan ili više članova odabranih iz grupe koja se sastoji od: (i) reporterskog gena; (ii) selektabilnog markera; i (iii) oridžina replikacije.
[0029] U jednom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska je pogodan, naročito nakon linearizacije, za in vitro transkripciju RNK, naročito iRNK.
[0030] Pre in vitro transkripcije, cirkularni IVT vektori su uglavnom linearizovani nizvodno od poliadenilne kasete restrikcionim enzimima tipa II (sekvenca za prepoznavanje odgovara mestu isecanja). Poliadenilna kaseta stoga odgovara kasnijoj poli(A) sekvenci u transkriptu. Kao rezultat ovog postupka, neki nukleotidi ostaju kao deo mesta isecanja enzimom nakon linearizacije i produžuju ili maskiraju poli(A) sekvencu na 3' kraju. Međutim, otkriveno je da se RNK koja ima poli(A) sekvencu otvorenih krajeva translatira efikasnije od RNK koja ima poli(A) sekvencu sa maskiranim terminusom.
[0031] U skladu sa tim, molekuli nukleinske kiseline iz ovog pronalaska kada se koriste kao ekspresioni vektori poželjno omogućavaju transkripciju RNK sa poli(A) sekvencom koja poželjno ima otvoreni kraj u navedenoj RNK, tj. nema nukleotida drugih nego A nukleotida bočno od navedene poli(A) sekvence na njenom 3' kraju. Poli(A) sekvenca sa otvorenim krajem u RNK može se postići uvođenjem restrikcionog mesta isecanja tipa IIS u ekspresioni vektor koji omogućava da se RNK transkribuje pod kontrolom 5' promotora RNK polimeraze i koji sadrži poliadenilnu kasetu, pri čemu se sekvenca za prepoznavanje nalazi nizvodno od poliadenilne kasete, dok se mesto isecanja nalazi uzvodno i samim tim unutar poliadenilne kasete. Restrikciono isecanje na restrikcionom mestu isecanja tipa IIS omogućava plazmidu da bude linearizovan unutar poliadenilne kasete. Linearizovani plazmid može se zatim upotrebiti kao matrica za in vitro transkripciju, što rezultira transkriptom koji se završava nemaskiranom poli(A) sekvencom.
[0032] U skladu sa tim, u jednom primeru izvođenja poželjno je da se molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska može iseći, poželjno enzimatski ili na drugi biohemijski način, unutar sekvence nukleinske kiseline (d) na takav način da navedeno isecanje rezultira molekulom nukleinske kiseline koji sadrži, u 5' → 3' smeru transkripcije, promotor (a), sekvence nukleinske kiseline (b) i (c), i najmanje deo sekvence nukleinske kiseline (d), pri čemu najmanje deo sekvence nukleinske kiseline (d), kada se transkribuje pod kontrolom promotora (a), kodira navedenu sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A i pri čemu je u transkriptu 3ꞌ- terminalni nukleotid A nukleotid navedene sekvence nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A.
[0033] Poželjno, nakon isecanja, molekul nukleinske kiseline, na kraju lanca koji služi kao matrica za sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A, ima T nukleotid koji je deo sekvence nukleinske kiseline koji služi kao matrica za sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A.
[0034] Molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska je poželjno zatvoreni cirkularni molekul pre isecanja i linearni molekul posle isecanja.
[0035] Poželjno, isecanje se vrši uz pomoć restrikcionog mesta isecanja koje je poželjno restrikciono mesto isecanja za restrikcionu endonukleazu tipa IIS.
[0036] U jednom primeru izvođenja, sekvenca za prepoznavanje za restrikcionu endonukleazu tipa IIS se nalazi 5-26 baznih parova, poželjno 24-26 baznih parova, nizvodno od 3' kraja sekvence nukleinske kiseline (d).
[0037] U jednom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline u skladu sa pronalaskom je u zatvorenoj cirkularnoj konformaciji i poželjno pogodan za in vitro transkripciju RNK, naročito iRNK, naročito nakon linearizacije.
[0038] U daljim aspektima, pronalazak se odnosi na RNK koju je moguće dobiti transkripcijom, poželjno in vitro transkripcijom, kako je definisano u priloženom patentnom zahtevu 8.
[0039] Prema tome, pronalazak se u jednom aspektu odnosi na RNK kako je definisano u priloženom patentnom zahtevu 9.
[0040] U jednom primeru izvođenja, RNK dalje sadrži (d) sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A. U jednom primeru izvođenja, navedena sekvenca nukleinske kiseline (d) se nalazi na 3' kraju navedene RNK.
[0041] U jednom primeru izvođenja, sekvence nukleinske kiseline (c) i opciono (d) su aktivne tako da povećavaju efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein.
[0042] U jednom primeru izvođenja, RNK dalje sadrži (e) 5' kapu.
[0043] Primeri izvođenja 3ꞌ-netranslatiranog regiona i sekvence nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A su kao gore opisani za molekule nukleinske kiseline iz ovog pronalaska.
[0044] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak dobijanja RNK kako je definisano u priloženom patentnom zahtevu 12.
[0045] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak dobijanja peptida ili proteina kako je definisano u priloženom patentnom zahtevu 13.
[0046] U jednom primeru izvođenja, postupak dobijanja RNK ili postupak dobijanja peptida ili proteina dalje sadrži, pre transkripcije molekula nukleinske kiseline, isecanje molekula nukleinske kiseline.
[0047] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak dobijanja RNK kako je definisano u priloženom patentnom zahtevu 15.
[0048] U jednom primeru izvođenja, postupak dalje sadrži spajanje sekvence nukleinske kiseline (c) koja, kada je transkribovana, kodira sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A, na 3' kraju sekvence nukleinske kiseline (b).
[0049] U jednom primeru izvođenja, sekvence nukleinske kiseline (a), (b) i (c) mogu biti transkribovane da daju zajednički transkript u kojem su sekvence nukleinske kiseline transkribovane sa sekvenci nukleinske kiseline (b) i, opciono, (c) aktivne tako da povećaju efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline koja je transkribovana sa transkriptabilne sekvence nukleinske kiseline (a).
[0050] Primeri izvođenja 3ꞌ-netranslatiranog regiona i sekvence nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A su kao gore opisani za molekule nukleinske kiseline iz ovog pronalaska.
[0051] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak dobijanja peptida ili proteina kako je definisano u priloženom patentnom zahtevu 17.
[0052] U jednom primeru izvođenja bilo kog postupka iz ovog pronalaska, transkripcija se vrši in vitro.
[0053] U jednom primeru izvođenja, postupak dobijanja RNK ili postupak dobijanja peptida ili proteina dalje sadrži, pre transkripcije molekula nukleinske kiseline, isecanje molekula nukleinske kiseline.
[0054] U jednom primeru izvođenja, isecanje je unutar sekvence nukleinske kiseline koja, kada se transkribuje kodira sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A na takav način da transkripcija nukleinske kiseline dobijene na ovaj način generiše transkript koji ima na svom 3ꞌ-terminalnom kraju navedene sekvence nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A, pri čemu je 3ꞌ-terminalni nukleotid navedenog transkripta A nukleotid iz sekvence nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A.
[0055] U svim aspektima postupaka u skladu sa pronalaskom, isecanje se poželjno vrši uz pomoć restrikcionog mesta isecanja koje je poželjno restrikciono mesto isecanja za restrikcionu endonukleazu tipa IIS.
[0056] U jednom primeru izvođenja, sekvenca za prepoznavanje za restrikcionu endonukleazu tipa IIS je 5-26 baznih parova, poželjno 24-26 baznih parova, nizvodno od 3' kraja sekvence nukleinske kiseline koja, kada je transkribovana, kodira sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A.
[0057] Pronalazak se takođe odnosi na RNK koja se može dobiti postupcima u skladu sa pronalaskom dobijanja RNK.
[0058] Pronalazak se može upotrebljavati, na primer, za povećanje ekspresije rekombinantnih proteina u ćelijskoj transkripciji i ekspresiji. Tačnije, moguće je, kada se proizvode rekombinantni proteini, upotrebiti ekspresione vektore pronalaska za transkripciju rekombinantnih nukleinskih kiselina i ekspresiju rekombinantnih proteina u sistemima zasnovanim na ćelijama. Ovo uključuje, na primer, pripremu rekombinantnih antitela, hormona, citokina, enzima, i slično. Ovo omogućava između ostalog redukovanje troškova proizvodnje.
[0059] Takođe je moguće upotrebiti molekule nukleinske kiseline ovog pronalaska za primene u genskoj terapiji. U skladu sa tim, molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska može biti vektor genske terapije i upotrebiti se za ekspresiju transgena. U tu svrhu, bilo koji vektorski sistemi zasnovani na nukleinskoj kiselini (DNK/RNK) (na primer plazmidi, adenovirusi, poksvirusni vektori, influenca virusni vektori, alfavirusni vektori, i slično) mogu se upotrebiti. Ćelije mogu biti transfektovane ovim vektorima in vitro, na primer u limfocitima ili dendritskim ćelijama, ili inače in vivo direktnom primenom.
[0060] RNK ovog pronalaska (npr. dobijena upotrebom ovde opisanog molekula nukleinske kiseline kao transkripcione matrice) mogu se upotrebiti, na primer, za prolaznu ekspresiju gena, pri čemu su moguća polja primene vakcine zasnovane na RNK koje se transfektuju u ćelije in vitro ili se primenjuju direktno in vivo, prolazna ekspresija funkcionalnih rekombinantnih proteina in vitro, na primer da bi se inicirali procesi diferencijacije u ćelijama ili radi proučavanja funkcija proteina, i prolazna ekspresija funkcionalnih rekombinantnih proteina kao što su eritropoetin, hormoni, inhibitori koagulacije, itd., in vivo, naročito kao farmaceutski proizvodi.
[0061] RNK ovog pronalaska može se upotrebiti posebno za transfekciju antigen-prezentujućih ćelija i time kao sredstvo za isporučivanje antigena koji će biti prezentovan i za punjenje antigenprezentujućih ćelija, pri čemu navedeni antigen koji će biti prezentovan odgovara peptidu ili
1
proteinu eksprimiranom sa navedene RNK ili je iz nje izveden, posebno putem unutarćelijske obrade kao što je isecanje, tj. antigen koji će biti prezentovan je, na primer, fragment peptida ili proteina koji je eksprimiran sa RNK. Takve antigen-prezentujuće ćelije mogu se upotrebiti za stimulisanje T ćelija, posebno CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelija.
[0062] U skladu s tim, u daljem aspektu, pronalazak se odnosi na RNK ovog pronalaska za upotrebu u postupku transfektovanja ćelije domaćina. U jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit ili makrofag.
[0063] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na RNK ovog pronalaska za upotrebu u terapiji, naročito za upotrebu u postupku vakcinacije.
[0064] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju kao što je kompozicija vakcine koja sadrži RNK ovog pronalaska.
[0065] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na RNK ovog pronalaska za ovde opisane upotrebe.
Detaljan opis pronalaska
[0066] Iako je ovaj pronalazak detaljno opisan u daljem tekstu, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen za određene metodologije, protokole i reagense opisane ovde pošto oni mogu varirati. Takođe treba razumeti da se ovde upotrebljena terminologija upotrebljava samo u svrhu opisa određenih primera izvođenja, i nije joj namena da ograniči opseg ovog pronalaska koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde upotrebljavaju imaju ista značenja kao što ih obično razume onaj koji je prosečno stručan u oblasti.
[0067] U daljem tekstu biće opisani elementi ovog pronalaska. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, treba razumeti da se oni mogu kombinovati na bilo koji način i u bilo kojem broju da bi se stvorili dodatni primeri izvođenja. Razne opisane primere i poželjne primere izvođenja ne bi trebalo tumačiti da ograniče ovaj pronalazak na samo izričito opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba razumeti tako da podrži i prati primere izvođenja koji kombinuju izričito opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem objavljenih i/ili poželjnih elemenata. Osim toga, sve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi trebalo bi smatrati objavljenim opisom ove prijave, osim ako kontekst ne naznači drugačije. Na primer, ako u poželjnom primeru izvođenja sekvenci jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A prethodi najmanje 20 A ostataka u navedenoj poliadenilnoj sekvenci i ako je u drugom poželjnom primeru izvođenja sekvenca jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A praćena sa najmanje 20 A ostataka u navedenoj poliadenilnoj sekvenci, očekivan je poželjan primer izvođenja po kome sekvenci jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A prethodi i prati je najmanje 20 A ostataka u navedenoj poliadenilnoj sekvenci.
[0068] Poželjno, termini koji su ovde upotrebljeni su definisani kako je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)).
[0069] Praksa ovog pronalaska će upotrebljavati, ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke hemije, biohemije, ćelijske biologije, imunologije i rekombinantne DNK tehnike koje su objašnjene u literaturi u ovom polju (upor., npr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0070] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne nalaže drugačije, reč "sadržati", i varijacije kao što su "sadrži" i "koji sadrži" podrazumevaće uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključenje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Neodređene i određene članove i slične reference koje se koriste u kontekstu opisivanja pronalaska (naročito u kontekstu patentnih zahteva) treba tumačiti tako da pokrivaju i jedninu i množinu, osim ako je ovde drugačije naznačeno ili je jasno suprotstavljeno kontekstu. Navođenje raspona vrednosti ovde je samo zamišljeno da služi kao skraćeni postupak upućivanja pojedinačno na svaku odvojenu vrednost koja spada u raspon. Ako ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost uključena je u specifikaciju kao da je pojedinačno ovde navedena. Svi ovde opisani postupci mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redosledom, osim ako je ovde drugačije naznačeno ili na drugi način jasno suprotstavljeno kontekstu. Upotreba bilo kog i svih primera, ili uzornog jezika (npr., "kao što je"), koji su ovde dati namenjena je samo da bolje ilustruje pronalazak i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska koji je inače zahtevan. Nijedan jezik u specifikaciji ne bi trebalo tumačiti kao da ukazuje na bilo koji nezaštićen element esencijalan za praksu pronalaska.
[0071] Nekoliko dokumenata je citirano u tekstu ove specifikacije. Ništa se ovde ne treba tumačiti kao priznanje da pronalazak nema pravo da antidatira takvu objavu na osnovu prethodnog pronalaska.
[0072] Ovaj pronalazak opisuje molekule nukleinske kiseline kao što su DNK plazmidi korisni kao vektori ekspresije RNK koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju modifikovane 3' netranslatirajuće regione (UTR) u RNK koji imaju stabilizirajući efekat na RNK i/ili povećavaju efikasnost translacije RNK.
[0073] Termin "sekvenca nukleinske kiseline koja, kad se transkribuje, kodira 3'-netranslatirajući region u transkriptu" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži matrični lanac koji kodira navedeni 3'-netranslatirajući region. Poželjno, navedena sekvence nukleinske kiseline sadrži kodirujući lanac koji sadrži istu sekvencu nukleinske kiseline kao navedeni 3'-netranslatirajući region proizvedenog transkripta RNK (mada je timin zamenjen uracilom). Prema tome, u skladu sa pronalaskom "sekvenca nukleinske kiseline koja, kad se transkribuje, kodira 3'-netranslatirajući region u transkriptu", u jednom primeru izvođenja, sadrži kodirujući lanac koji sadrži 3'-netranslatirajući region kao što je ovde navedeno (mada je timin zamenjen uracilom).
[0074] Termin "FCGRT" odnosi se na Fc fragment IgG-a, receptor, transporter, alfa i uključuje FCGRT gen. Ovaj gen kodira receptor koji vezuje Fc region monomernog imunoglobulina G. Kodirani protein prenosi imunoglobulin G antitela od majke do fetusa kroz placentu. Ovaj protein takođe vezuje imunoglobulin G da bi zaštitio antitelo od degradacije.
[0075] Termin "sekvenca nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona FCGRT, njen fragment, ili varijanta navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do 50 iz liste sekvence ili njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do 50. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 27 ili koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO: 27.
[0076] Termin "LSP1" odnosi se na limfocitni specifični protein 1 i uključuje LSP1 gen. Ovaj gen kodira vezujući protein unutarćelijskog F-aktina. Protein se eksprimira u limfocitima, neutrofilima, makrofagima, i endotelu i može regulisati pokretljivost neutrofila, adheziju za fibrinogen proteine matriksa, i transendotelsku migraciju.
[0077] Termin "sekvenca nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona LSP1, njen fragment, ili varijanta navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 51 do 72 iz liste sekvence ili njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske
1
kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 51 do 72. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 52 ili koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO: 52.
[0078] Termin "CCL22" odnosi se na hemokinski (C-C motiv) ligand 22 i uključuje CCL22 gen. Proizvod ovog gena se vezuje za hemokinski receptor CCR4. Ovaj hemokin može igrati ulogu u putovanju aktiviranih T limfocita do mesta upale i u drugim aspektima fiziologije aktiviranog T limfocita.
[0079] Termin "sekvenca nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona CCL22, njen fragment, ili varijanta navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta " odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 73 do 85 iz liste sekvence ili njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 73 do 85. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 79 ili koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO: 79.
[0080] Termin "AES" odnosi se na amino-terminalni pojačivač razdvajanja i uključuje AES gen. Protein kodiran ovim genom pripada groucho/TLE porodici proteina, može funkcionisati kao homooligomer ili kao heteroologimer sa drugim članovima porodice da dominantno represiraju ekspresiju gena drugih članova porodice.
[0081] Termin "sekvenca nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona AES, njen fragment, ili varijanta navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 86 do 89 iz liste sekvence ili njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 86 do 89. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 86 ili koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO: 86. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline sa pozicija 1 do 68, pozicija 1 do 102, pozicija 35 do 102, pozicija 35 do 136, ili pozicija 68 do 136 SEQ ID NO: 86 ili koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline sa pozicija 1 do 68, pozicija 1 do 102, pozicija 35 do 102, pozicija 35 do 136, ili pozicija 68 do 136 SEQ ID NO: 86.
[0082] Termin "PLD3" odnosi se na član 3 porodice fosfolipaze D, i uključuje PLD3 gen. Ovaj gen kodira člana fosfolipaze D (PLD) porodice enzima koji katalizuje hidrolizu membranskih fosfolipida. Kodirani protein je membranski protein tipa II sa jednim prolazom i sadrži dva PLD fosfodiesterazna domena. Ovaj protein utiče na obradu prekursor proteina amiloid-beta. Mutacije u ovom genu povezane su sa rizikom od Alchajmerove bolesti.
[0083] Termin "sekvenca nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona PLD3, njen fragment, ili varijanta navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 90 do 104 iz liste sekvence ili njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 90 do 104. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 96 ili koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO: 96.
[0084] Termin "MT_RNR1" odnosi se na mitohondrijalno kodiranu 12S RNK i uključuje MT_RNR1 gen. Ovaj RNK gen pripada Mt_rRNK klasi. Bolesti povezane sa MT-RNR1 uključuju restriktivnu kardiomiopatiju i slušnu neuropatiju. Među njegovim povezanim putevima su ribozomalna biogeneza kod eukariota i CFTR vernost translacije (mutacije klase I).
[0085] Termin "sekvenca nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona MT_RNR1, njen fragment, ili varijanta navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 105 do 121 iz liste sekvence ili njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta. U jednom primeru
1
izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 105 do 121. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 115 ili koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO: 115. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline sa pozicija 1 do 71, pozicija 1 do 107, pozicija 37 do 107, pozicija 37 do 142, ili pozicija od 71 do 142 SEQ ID NO: 115 ili koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline sa pozicija 1 do 71, pozicija 1 do 107, pozicija 37 do 107, pozicija 37 do 142, ili pozicija 71 do 142 SEQ ID NO: 115.
[0086] Termin "HLA-DRB4" odnosi se na glavni kompleks histokompatibilnosti, klase II, DR Beta 4 i uključuje HLA-DRB4 gen. HLA-DRB4 spada u paraloge beta lanca HLA klase II. Ovaj molekul klase II je heterodimer koji se sastoji od alfa (DRA) i beta (DRB) lanca, oba usidrena u membrani. On igra centralnu ulogu u imunskom sistemu prezentujući peptide koji su izvedeni iz vanćelijskih proteina. Molekuli klase II se eksprimiraju u antigen prezentujućim ćelijama (APC: B limfociti, dendritske ćelije, makrofagi).
[0087] Termin "sekvenca nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona HLA-DRB4, njen fragment, ili varijanta navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 122 do 143 iz liste sekvence ili njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 122 do 143. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 126 ili koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO: 126.
[0088] Termin "bilo koja kombinacija dve ili više sekvenci nukleinske kiseline, fragmenata i/ili varijanti" u odnosu na sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućih regiona određenih gena,
1
njihovih fragmenata, ili varijanti navedenih sekvenci nukleinske kiseline ili fragmenata označava da su 2 ili više, 3 ili više ili 4 ili više i poželjno do 6 ili do 5 navedenih sekvenci nukleinske kiseline, fragmenata i/ili varijanti postrojene glava-uz-rep, opciono razdvojene linkerima. U jednom primeru izvođenja, kombinacija dve ili više sekvenci nukleinske kiseline, fragmenata i/ili varijanti sadrži dve ili više različitih i/ili dve ili više identičnih sekvenci nukleinske kiseline, fragmenata i/ili varijanti. U jednom primeru izvođenja, kombinacija dve ili više sekvenci nukleinske kiseline, fragmenata i/ili varijanti sadrži dve ili više različitih sekvenci nukleinske kiseline, fragmenta i/ili varijante 3'-netranslatirajućeg regiona istih i/ili različitih gena.
[0089] U jednom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144 do 220, poželjno SEQ ID NO: 174 i 208 do 220. U jednom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144 do 220, poželjno SEQ ID NO: 174 i 208 do 220 ili njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, termin se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 174 ili koja sadrži, poželjno se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 98% identična sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO: 174.
[0090] Termin "linker" u skladu sa pronalaskom odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja je dodata između dve sekvence nukleinske kiseline da bi povezala navedene dve sekvence nukleinske kiseline. Ne postoji posebno ograničenje u vezi sa sekvencom linkera.
[0091] U skladu sa pronalaskom, molekul nukleinske kiseline ili sekvenca nukleinske kiseline označava nukleinsku kiselinu koja je poželjno dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK). U skladu sa pronalaskom, nukleinske kiseline sadrže genomske DNK, cDNK, iRNK, rekombinantno pripremljene i hemijski sintetisane molekule. U skladu sa pronalaskom, nukleinska kiselina može biti u obliku jednolančanog ili dvolančanog i linearnog ili kovalentno zatvorenog cirkularnog molekula.
[0092] U kontekstu ovog pronalaska, termin "RNK" odnosi se na molekul koji sadrži ribonukleotidne ostatke i poželjno je u potpunosti ili pretežno sastavljen od ribonukleotidnih ostataka. Termin "ribonukleotid" odnosi se na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2'-poziciji u β-D-ribofuranozil grupe. Termin "RNK" sadrži dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično ili potpuno prečišćena RNK, u osnovi čistu RNK, sintetička RNK, i rekombinantno generisanu RNK kao što je modifikovana RNK koja se razlikuje od RNK koja se
1
javlja u prirodi adicijom, delecijom, supstitucijom i/ili promenom jednog ili više nukleotida. Takve promene mogu uključivati adiciju ne-nukleotidnog materijala, kao na kraj(eve) RNK ili interno, na primer u jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u molekulima RNK takođe mogu da sadrže nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljaju u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ove promenjene RNK se mogu nazvati analozi, naročito analozi RNK koje se javljaju u prirodi. U skladu sa pronalaskom, RNK uključuje iRNK.
[0093] Termin "iRNK" označava "informacionu RNK" i odnosi se na transkript koji je generisan upotrebom DNK matrice i kodira peptid ili protein. Obično, iRNK sadrži 5'-UTR, protein kodirajući region, 3'-UTR, i poli(A) sekvencu. iRNK se može generisati in vitro transkripcijom sa DNK matrice. Metodologija in vitro transkripcije je poznata stručnoj osobi. Na primer, postoji mnoštvo komercijalno dostupnih in vitro kitova za transkripciju. U skladu sa pronalaskom, iRNK se može modifikovati dodatnim stabilizirajućim modifikacijama i dodavanjem kape, pored modifikacija u skladu sa pronalaskom.
[0094] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, RNK je samo-replicirajuća RNK, kao što je jednolančana samo-replicirajuća RNK. U jednom primeru izvođenja, samo-replicirajuća RNK je jednolančana pozitivna RNK. U jednom primeru izvođenja, samo-replicirajuća RNK je virusna RNK ili RNK izvedena iz virusne RNK. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK je alfavirusna genomska RNK ili je izvedena iz alfavirusne genomske RNK. U jednom primeru izvođenja, samo-replicirajuća RNK je ekspresioni vektor virusnog gena. U jednom primeru izvođenja, virus je virus Semliki šume. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK sadrži jedan ili više transgena. U jednom primeru izvođenja, ako je RNK virusna RNK ili je izvedena iz virusne RNK, transgeni mogu delimično ili potpuno zameniti virusne sekvence kao što su virusne sekvence koje kodiraju strukturne proteine. U jednom primeru izvođenja, samo-replicirajuća RNK je in vitro transkribovana RNK.
[0095] Termin "5'-kapa" označava strukturu kape koja se nalazi na 5'-kraju molekula iRNK i obično se sastoji od guanozin nukleotida spojenog sa iRNK preko neobične 5' do 5' trifosfatne veze. U jednom primeru izvođenja, ovaj guanozin je metilovan na poziciji 7. Termin "konvencionalna 5'-kapa" odnosi se na 5'-kapu RNK koja se javlja u prirodi, poželjno na kapu 7-metilguanozina (m7G). U kontekstu ovog pronalaska, termin "5'-kapa" uključuje 5'-kapa analog koji podseća na strukturu kape RNK i modifikovana je tako da poseduje sposobnost stabilizacije RNK ako je prikačena na nju, poželjno in vivo i/ili u ćeliji. Obezbeđivanje RNK sa 5'-kapom ili 5'-kapa analogom može se postići in vitro transkripcijom DNK matrice u prisustvu navedene 5'-kape ili 5'-kapa analoga, pri čemu je navedena 5'-kapa ko-transkripciono ugrađena u generisani RNK lanac, ili RNK može biti generisana, na primer, in vitro transkripcijom i 5'-kapa može biti
1
generisana post-transkripciono upotrebom enzima za dodavanje kape, na primer, enzima za dodavanje kape vakcinija virusa.
[0096] Termin "nukleinska kiselina" u skladu sa pronalaskom takođe sadrži hemijsku derivatizaciju nukleinske kiseline na nukleotidnoj bazi, na šećeru ili na fosfatu, i nukleinske kiseline koje sadrže neprirodne nukleotide i analoge nukleotida.
[0097] "Fragment" ili "fragment sekvence nukleinske kiseline" odnosi se na deo sekvence nukleinske kiseline, tj. sekvencu koja predstavlja sekvencu nukleinske kiseline skraćenu na 5'-i/ili 3'-kraju/krajevima. Poželjno, fragment kada zamenjuje navedenu sekvencu nukleinske kiselina u molekulu RNK zadržava stabilnost RNK i/ili efikasnost translacije. Poželjno, fragment sekvence nukleinske kiseline sadrži najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% nukleotidnih ostataka iz navedene sekvence nukleinske kiseline.
[0098] Termin "varijanta" u odnosu na, na primer, sekvence nukleinske kiseline i aminokiseline, u skladu sa pronalaskom uključuje bilo koje varijante, posebno mutante, varijante obrade, konformacije, izoforme, alelske varijante, varijante vrsta i homologe vrsta, posebno one koje su prirodno prisutne. Alelska varijanta odnosi se na promenu u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Sekvenciranje kompletnog gena često identifikuje brojne alelske varijante za dati gen. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiselina ili aminokiseline različitog porekla vrste od one za datu sekvencu nukleinske kiseline ili aminokiseline.
[0099] U skladu sa pronalaskom, varijante nukleinske kiseline uključuju jednu ili više nukleotidnih delecija, adicija, mutacija i/ili insercija u poređenju sa referentnom nukleinskom kiselinom. Delecije uključuju uklanjanje jednog ili više nukleotida iz referentne nukleinske kiseline. Varijante adicije sadrže 5'- i/ili 3'-terminalne fuzije jednog ili više nukleotida, kao što su 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više nukleotida. Mutacije mogu uključivati ali nisu ograničene na supstitucije, pri čemu se uklanja najmanje jedan nukleotid u sekvenci i na njegovo mesto se inserira drugi nukleotid (kao što su transverzije i tranzicije), mesta na kojima nedostaje baza, unakrsno povezana mesta, i hemijski promenjene ili modifikovane baze. Insercije uključuju adiciju najmanje jednog nukleotida u referentnu nukleinsku kiselinu.
[0100] U odnosu na molekule nukleinske kiseline, termin "varijanta" uključuje degenerisane sekvence nukleinske kiseline, pri čemu degenerisana nukleinska kiselina u skladu sa pronalaskom je nukleinska kiselina koja se razlikuje od referentne nukleinske kiseline u kodon sekvenci zbog degeneracije genetskog koda.
[0101] Poželjno stepen identičnosti između date sekvence nukleinske kiseline i sekvence nukleinske kiseline koja je varijanta navedene date sekvence nukleinske kiseline biće najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90% ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Stepen identičnosti je
1
poželjno dat za region od najmanje oko 30, najmanje oko 50, najmanje oko 70, najmanje oko 90, najmanje oko 100, najmanje oko 150, najmanje oko 200, najmanje oko 250, najmanje oko 300, ili najmanje oko 400 nukleotida. U poželjnim primerima izvođenja, stepen identičnosti je dat za celokupnu dužinu referentne sekvence nukleinske kiseline.
[0102] "Sličnost sekvence" ukazuje na procenat aminokiselina koje su ili identične ili predstavljaju konzervativne supstitucije aminokiselina. "Identičnost sekvence" između dve sekvence polipeptida ili nukleinske kiseline ukazuje na procenat aminokiselina ili nukleotida koji su identični između sekvenci.
[0103] Termin "% identičan" ima namenu da označi, posebno, procenat nukleotida koji su identični u optimalnom poravnanju između dve sekvence koje se upoređuju, sa navedenim procentom koji je čisto statistički, i razlike između dve sekvence mogu biti nasumično raspoređene po celoj dužini sekvence i sekvenca koja se upoređuje može da sadrži adicije ili delecije u poređenju sa referentnom sekvencom, kako bi se dobilo optimalno poravnanje između dve sekvence. Poređenja dve sekvence obično se vrše upoređivanjem navedenih sekvenci, nakon optimalnog poravnanja, u odnosu na segment ili "prozor upoređivanja", kako bi se identifikovali lokalni regioni odgovarajućih sekvenci. Optimalno poravnanje za poređenje može se izvršiti ručno ili uz pomoć lokalnog algoritma homologije Smita i Vatermana (Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482), uz pomoć lokalnog algoritama homologije Nedlmana i Vunša (Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443), i uz pomoć algoritma pretrage sličnosti Pirsona i Lipmana (Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444) ili uz pomoć računarskih programa koji upotrebljavaju navedene algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Viskonsin Genetiks softverskom paketu (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)).
[0104] Procenat identičnosti dobija se određivanjem broja identičnih pozicija u kojima sekvence koje se upoređuju odgovaraju, deleći ovaj broj sa brojem upoređenih pozicija i množenjem ovog rezultata sa 100.
[0105] Na primer, može se upotrebiti BLAST program "BLAST 2 sequences" koji je dostupan na veb lokaciji http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/ wblast2.cgi.
[0106] Nukleinska kiselina je "sposobna za hibridizaciju" ili "hibridizuje" sa drugom nukleinskom kiselinom ako su dve sekvence komplementarne jedna drugoj. Nukleinska kiselina je "komplementarna" drugoj nukleinskoj kiselini ako su dve sekvence sposobne da formiraju stabilan dupleks jedna sa drugom. U skladu sa pronalaskom, hibridizacija se poželjno vrši pod uslovima koji omogućavaju specifičnu hibridizaciju između polinukleotida (strogi uslovi). Strogi uslovi opisani su, na primer, u delu Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York,
2
1989, ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York, i odnose se, na primer, na hibridizaciju na 65 °C u hibridizacionom puferu (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinilpirolidon, 0,02% albumina goveđeg seruma, 2,5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0,5% SDS, 2 mM EDTA). SSC je 0,15 M natrijum hlorid/0,15 M natrijum citrat, pH 7. Posle hibridizacije, membrana na koju je DNK preneta se ispere, na primer, u 2 x SSC na sobnoj temperaturi i zatim u 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS na temperaturama do 68 °C.
[0107] Procentualna komplementarnost ukazuje na procenat susednih ostataka u molekulu nukleinske kiseline koji mogu da formiraju vodonične veze (npr. Watson-Crick sparivanje baza) sa drugom sekvencom nukleinske kiseline (npr. 5, 6, 7, 8, 9, 10 od 10 je 50%, 60%, 70%, 80%, 90% i 100% komplementarnost). "Savršeno komplementarni" ili "potpuno komplementarni" označava da će se svi susedni ostaci sekvence nukleinske kiseline vezati vodoničnom vezom sa istim brojem susednih ostataka u drugoj sekvenci nukleinske kiseline. Poželjno, stepen komplementarnosti u skladu sa pronalaskom je najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90% ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Najpoželjnije, stepen komplementarnosti u skladu sa pronalaskom je 100%.
[0108] Termin "derivat" sadrži bilo koju hemijsku derivatizaciju nukleinske kiseline na nukleotidnoj bazi, na šećeru ili na fosfatu. Termin "derivat" takođe sadrži nukleinske kiseline koje sadrže nukleotide i analoge nukleotida koji se ne javljaju prirodno. Poželjno, derivatizacija nukleinske kiseline povećava njenu stabilnost.
[0109] Fragmenti ili varijante specifičnih sekvenci nukleinske kiseline ili sekvence nukleinske kiseline koje imaju određeni stepen identičnosti specifičnim sekvencama nukleinske kiseline poželjno imaju najmanje jedno funkcionalno svojstvo od navedenih specifičnih sekvenci i poželjno su funkcionalno ekvivalentne navedenim specifičnim sekvencama, npr. sekvence nukleinske kiseline koje pokazuju svojstva identična ili slična onima iz specifičnih sekvenci nukleinskih kiselina.
[0110] Jedno važno svojstvo je zadržavanje ili poboljšanje stabilnosti RNK molekula i/ili efikasnosti translacije i uključuje posebno sposobnost povećanja, u funkcionalnoj povezanosti sa transkriptabilnom nukleinskom kiselinom u RNK (sekvenca nukleinske kiseline koja može biti transkribovana) ili sekvencom nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein, stabilnosti i/ili efikasnost translacije RNK proizvedene sa ove nukleinske kiseline ili sekvence nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein u kompletnom molekulu RNK.
[0111] U jednom primeru izvođenja, ako je specifična sekvenca nukleinske kiseline aktivna tako da povećava efikasnost translacije i/ili stabilnost druge sekvence nukleinske kiseline, fragmenta ili varijante specifične sekvence nukleinske kiseline ili sekvence nukleinske kiseline koja ima određeni stepen identičnosti sa specifičnom sekvencom nukleinske kiseline takođe je aktivna tako da povećava efikasnost translacije i/ili stabilnost druge sekvence nukleinske kiseline (kada zamenjuje specifičnu sekvencu nukleinske kiseline). Fragment ili varijanta specifične sekvence nukleinske kiseline ili sekvence nukleinske kiseline koja ima određeni stepen identičnosti sa specifičnom sekvencom nukleinske kiseline može biti jednako aktivna ili aktivnija od specifične sekvence nukleinske kiseline ili aktivnost fragmenata ili varijante specifične sekvence nukleinske kiseline ili sekvence nukleinske kiseline koja ima određeni stepen identičnosti sa specifičnom sekvencom nukleinske kiseline može biti najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, ili najmanje 90% aktivnosti specifične sekvence nukleinske kiseline.
[0112] U skladu sa pronalaskom, "funkcionalna povezanost" ili "funkcionalno povezana" odnosi se na vezu unutar funkcionalnog odnos. Nukleinska kiselina je "funkcionalno povezana" ako je funkcionalno u relaciji sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promotor je funkcionalno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju navedene kodirajuće sekvence. Funkcionalno povezane nukleinske kiseline su obično jedna uz drugu, gde su prikladno razdvojene daljim sekvencama nukleinske kiseline, i, u posebnim primerima izvođenja, transkribuju se RNK polimerazom da daju jedan molekul RNK (zajednički transkript). Poželjno, sekvenca koja je varijanta u odnosu na specifičnu sekvencu, kada zamenjuje specifičnu sekvencu u molekulu RNK zadržava stabilnost RNK i/ili efikasnost translacije.
[0113] U skladu sa pronalaskom, "sekvenca nukleinske kiseline koja je izvedena iz sekvence nukleinske kiseline" označava nukleinsku kiselinu koja je varijanta nukleinske kiseline iz koje je izvedena.
[0114] "3' kraj nukleinske kiseline" označava u skladu sa pronalaskom onaj kraj koji ima slobodnu hidroksilnu grupu. U šematskom prikazu dvolančanih nukleinskih kiselina, posebno DNK, 3' kraj je uvek s desne strane. "5' kraj nukleinske kiseline" označava u skladu sa pronalaskom onaj kraj koji ima slobodnu fosfatnu grupu. U šematskom prikazu dvolančanih nukleinskih kiselina, posebno DNK, 5' kraj je uvek na levoj strani.
5' kraj 5'--P-NNNNNNN-OH-3' 3' kraj
3'-HO-NNNNNNN-P--5'
[0115] U posebnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno povezana u skladu sa pronalaskom za sekvence kontrole ekspresije koje mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na nukleinsku kiselinu.
[0116] Sekvenca nukleinske kiseline koja može biti transkribovana, posebno sekvenca nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein, i sekvenca kontrole ekspresije su "funkcionalno" povezane jedna za drugu, ako su kovalentno povezane jedna za drugu na takav način da su transkripcija ili ekspresija one koja može biti transkribovana i posebno kodirajuće sekvence nukleinske kiseline pod kontrolom ili pod uticajem sekvence kontrole ekspresije. Ako se sekvenca nukleinske kiseline translatira u funkcionalni peptid ili protein, indukcija sekvence kontrole ekspresije koja je funkcionalno povezana sa kodirajućom sekvencom rezultira transkripcijom pomenute kodirajuće sekvence, bez uzrokovanja pomeranja okvira u kodirajućoj sekvenci ili nemogućnosti translatiranja kodirajuće sekvence u željeni peptid ili protein.
[0117] Termin "sekvenca kontrole ekspresije" sadrži u skladu sa pronalaskom promotore, sekvence koje se vezuju za ribozome i druge kontrolne elemente koji kontrolišu transkripciju gena ili translaciju izvedene RNK. U posebnim primerima izvođenja ovog pronalaska, sekvence kontrole ekspresije mogu biti regulisane. Precizna struktura sekvenci kontrole ekspresije može varirati u zavisnosti od vrste organizma ili tipa ćelije ali obično uključuje 5'-netranskribovane i 5'- i 3'-netranslatirajuće sekvence uključene u pokretanje transkripcije i translacije, respektivno, kao što su TATA boks, kapa sekvenca, CAAT sekvenca i slične. Tačnije, 5'-netranskribovane sekvence kontrole ekspresije uključuju region promotora koji obuhvata promotor sekvencu za kontrolu transkripcije funkcionalno povezanog gena. Sekvence kontrole ekspresije mogu takođe uključivati sekvence pojačivača ili sekvence uzvodnog aktivatora.
[0118] Sekvence nukleinske kiseline opisane u ovom tekstu, posebno one koje se mogu transkribovati i kodirajuće sekvence nukleinske kiseline, mogu biti kombinovane sa bilo kojom sekvencom kontrole ekspresije, posebno sa promotorima, koji mogu biti homologni ili heterologni navedenim sekvencama nukleinske kiseline, pri čemu se termin "homologan" odnosi na činjenicu da je sekvenca nukleinske kiseline takođe prirodno funkcionalno povezana sa sekvencom kontrole ekspresije, i termin "heterologan" se odnosi na činjenicu da sekvenca nukleinske kiseline nije prirodno funkcionalno povezana sa sekvencom kontrole ekspresije.
[0119] Termin "promotor" ili " region promotora" označava DNK sekvencu uzvodno (5') od kodirajuće sekvence gena, koji kontroliše ekspresiju navedene kodirajuće sekvence pružajući mesto za prepoznavanje i vezivanje za RNK polimerazu. Region promotora može da uključuje dalja mesta za prepoznavanje ili vezivanje za dalje faktore koji su uključeni u regulisanje transkripcije navedenog gena. Promotor može kontrolisati transkripciju prokariotskog ili eukariotskog gena. Promotor može biti "indukujući" i inicirati transkripciju kao odgovor na induktor, ili može biti "konstitutivan" ako transkripcija nije kontrolisana od strane induktora. Indukujući promotor se eksprimira samo u veoma maloj meri ili se uopšte ne eksprimira ako
2
induktor nije prisutan. U prisustvu induktora, gen je "uključen" ili je nivo transkripcije povećan. Ovo se obično postiže vezivanjem specifičnog faktora transkripcije.
[0120] Primeri promotora poželjnih u skladu sa pronalaskom su promotori za SP6, T3 ili T7 polimerazu.
[0121] U skladu sa pronalaskom, termin "ekspresija" se upotrebljava u svom opštem značenju i sadrži proizvodnju RNK ili RNK i proteina. Takođe sadrži delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Osim toga, ekspresija može biti prolazna ili stabilna. U odnosu na RNK, termin "ekspresija" ili "translacija" odnosi se na postupak u ribozomima ćelije kojim lanac informacione RNK usmerava sklapanje sekvence aminokiselina da bi se napravio peptid ili protein.
[0122] Termin "sekvence nukleinske kiseline koje mogu biti transkribovane da daju zajednički transkript" označava da su navedene sekvence nukleinske kiseline funkcionalno povezane jedna sa drugom na takav način da, gde je to potrebno nakon linearizacije kao što je isecanje restrikcionim enzimom molekula nukleinske kiseline koja sadrži navedene sekvence nukleinske kiseline, posebno zatvorenog cirkularnog molekula nukleinske kiseline, transkripcija pod kontrolom promotora rezultira RNK molekulom koji sadrži transkripte pomenutih sekvenci nukleinske kiseline koji su kovalentno vezani jedan za drugi, gde je prikladno razdvojeni su sekvencama smeštenim između njih.
[0123] U kontekstu ovog pronalaska, termin "transkripcija" odnosi se na postupak, pri kom se genetski kod u DNK sekvenci transkribuje u RNK. Posle toga, RNK može biti translatirana u protein. U skladu sa ovim pronalaskom, termin "transkripcija" sadrži "in vitro transkripciju", pri čemu se termin "in vitro transkripcija" odnosi na postupak gde se RNK, naročito iRNK, in vitro sintetiše u sistemu bez ćelija. Poželjno, vektori za kloniranje se primenjuju za stvaranje transkripata. Ovi vektori za kloniranje se uglavnom označavaju kao transkripcioni vektori i u skladu sa ovim pronalaskom obuhvaćeni su terminom "vektor". U skladu sa ovim pronalaskom, RNK je poželjno in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) i može se dobiti in vitro transkripcijom odgovarajuće DNK matrice. Promotor za kontrolu transkripcije može biti bilo koji promotor bilo koje RNK polimeraze. DNK matrica za in vitro transkripciju može se dobiti kloniranjem nukleinske kiseline, posebno cDNK, i njenim intodukovanjem u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNK se može dobiti reverznom transkripcijom RNK.
[0124] Termin "sekvenca nukleinske kiseline transkribovana sa sekvence nukleinske kiseline" označava RNK, gde je prikladno kao deo kompletnog molekula RNK, koji je proizvod transkripcije kasnije sekvence nukleinske kiseline.
[0125] Termin "sekvenca nukleinske kiseline koja je aktivna da bi povećala efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline" označava da je prva sekvenca nukleinske kiseline sposobna da modifikuje, u zajedničkom transkriptu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline, efikasnost translacije i/ili stabilnost navedene druge sekvence nukleinske kiseline na takav način da se navedena efikasnost translacije i/ili stabilnost povećavaju u poređenju sa efikasnošću translacije i/ili stabilnošću navedene druge sekvence nukleinske kiseline bez navedene prve sekvence nukleinske kiseline. U ovom kontekstu termin "efikasnost translacije" odnosi se na količinu proizvoda translacije koji daje RNK molekul unutar određenog vremenskog perioda i termin "stabilnost" odnosi se na poluživot molekula RNK.
[0126] Modifikacija, i time i stabilizacija i/ili povećanje efikasnosti translacije, RNK može se postići u skladu sa pronalaskom genetički modifikujući molekule eksprimirajuće nukleinske kiseline ovog pronalaska kada se koriste kao ekspresioni vektori na takav način da omogućavaju transkripciju RNK sa 3'-netranslatirajućim regionima kao što je ovde opisano na svom 3' kraju, i poželjno između sekvence koja kodira peptid ili protein (otvoren okvir čitanja) i poli(A) sekvence
[0127] Izraz "3'-netranslatirajući region" odnosi se na region koji se nalazi na 3' kraju gena, nizvodno od terminacionog kodona regiona koji kodira protein, i koji je transkribovan ali nije translatiran u aminokiselinsku sekvencu, ili na odgovarajući region u molekulu RNK.
[0128] U skladu sa pronalaskom, smatra se da se prvi polinukleotidni region nalazi nizvodno od drugog polinukleotidnog regiona, ako je 5' kraj navedenog prvog polinukleotidnog regiona deo navedenog prvog polinukleotidnog regiona najbliži 3' kraju navedenog drugog polinukleotidnog regiona.
[0129] Obično se 3'-netranslatirajući region pruža od terminacionog kodona za proizvod translacije do poli(A) sekvence koja se obično veže nakon postupka transkripcije. 3'-netranslatirajući regioni iRNK sisara obično imaju region homologije poznat kao AAUAAA heksanukleotidna sekvenca. Ova sekvenca je verovatno signal za vezivanje poli(A) i često se nalazi od 10 do 30 baza uzvodno od mesta za vezivanje poli(A).
[0130] 3'-netranslatirajući regioni mogu da sadrže jedan ili više invertovanih ponovaka koji se mogu saviti kako bi se dobile strukture ukosnice koje deluju kao barijere za egzoribonukleaze ili interaguju sa proteinima za koje se zna da povećavaju stabilnost RNK (npr. RNK-vezujući proteini).
[0131] 5'- i/ili 3'-netranslatirajući regioni mogu, u skladu sa pronalaskom, biti funkcionalno povezani sa onom koja može biti transkribovana i posebno kodirajućom nukleinskom kiselinom, tako da su ovi regioni povezani sa nukleinskom kiselinom na takav način da su povećane stabilnost i/ili efikasnost translacije RNK transkribovane sa navedene nukleinske kiseline koja može biti transkribovana.
[0132] 3'-netranslatirajući regioni iRNK imunoglobulina su relativno kratki (manje od oko 300 nukleotida), dok su 3'-netranslatirajući regioni drugih gena relativno dugi. Na primer, 3'-
2
netranslatirajući region tPA je dužine od oko 800 nukleotida, dužina faktora VIII je oko 1800 nukleotida i dužina eritropoetina je oko 560 nukleotida.
[0133] Može se odrediti u skladu sa pronalaskom, da li 3'-netranslatirajući region ili sekvenca nukleinske kiseline izvedena od njega povećava stabilnost i/ili efikasnost translacije RNK, inkorporisanjem 3'-netranslatirajućeg regiona ili sekvence nukleinske kiseline izvedene od njega u 3'-netranslatirajući region gena i merenjem da li je navedena inkorporacija povećala količinu sintetisanog proteina.
[0134] Gore navedeno se prema tome odnosi na slučaj u kojem u skladu sa pronalaskom nukleinska kiselina sadrži dva ili više 3'-netranslatirajuća regiona koji su poželjno spojeni sekvencijalno sa ili bez linkera između njih, poželjno u " odnosu glava-prema-repu" (tj. 3'-netranslatirajući regioni imaju istu orijentaciju, poželjno orijentaciju koja se prirodno javlja u nukleinskoj kiselini).
[0135] U skladu sa pronalaskom, termin "gen" označava određenu sekvencu nukleinske kiseline koja je odgovorna za proizvodnju jednog ili više ćelijskih proizvoda i/ili za postizanje jedne ili više međućelijskih ili unutarćelijskih funkcija. Konkretnije, navedeni termin se odnosi na deo DNK koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira specifični protein ili funkcionalni ili strukturalni RNK molekul.
[0136] Poliadenilacija je dodavanje poli(A) sekvence ili repa primarnom transkriptu RNK. Poli(A) sekvenca se sastoji od više adenozin monofosfata. Drugim rečima, to je niz RNK koji ima samo adeninske baze. Kod eukariota, poliadenilacija je deo postupka koji stvara zrelu informacionu RNK (iRNK) za translaciju. To, prema tome, čini deo šireg postupka ekspresije gena. Postupak poliadenilacije započinje kada se transkripcija gena završi, ili posle terminacije. Najudaljeniji 3' segment novo-napravljene pre-iRNK prvo se iseca setom proteina; ovi proteini zatim sintetišu poli(A) sekvencu na 3' kraju RNK. Poli(A) sekvenca je važna za eksport iz nukleusa, translaciju, i stabilnost iRNK. Sekvenca se skraćuje tokom vremena i, kada je dovoljno kratka, iRNK se enzimski razgrađuje.
[0137] Termini "poliadenilna sekvenca", "poli(A) sekvenca" ili "poli(A) rep" označavaju sekvencu adenilnih ostataka koja se obično nalazi na 3' kraju molekula RNK. Pronalazak daje takvu sekvencu koja će se vezati tokom RNK transkripcije putem DNK matrice na osnovu ponovljenih timidilnih ostataka u lancu komplementarnom kodirajućem lancu, dok navedena sekvenca obično nije kodirana u DNK ali je vezana za slobodni 3' kraj RNK pomoću RNK polimeraze nezavisne od matrice nakon transkripcije u nukleusu. U skladu sa pronalaskom, u jednom primeru izvođenja, poli(A) sekvenca ima najmanje 20, poželjno najmanje 40, poželjno najmanje 80, poželjno najmanje 100 i poželjno do 500, poželjno do 400, poželjno do 300,
2
poželjno do 200, i posebno do 150, A nukleotida, poželjno uzastopnih A nukleotida, i posebno oko 120 A nukleotida. Termin "A nukleotidi" ili "A" odnosi se na adenilne ostatke.
[0138] U poželjnom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline u skladu sa pronalaskom je vektor. Termin "vektor" se ovde upotrebljava u svom najopštijem značenju i sadrži bilo koje intermedijarne nosače za nukleinsku kiselinu koji, na primer, omogućavaju da navedena nukleinska kiselina bude uvedena u prokariotske i/ili eukariotske ćelije domaćina i, gde je to prikladno, bude integrisana u genom. Takvi vektori se poželjno repliciraju i/ili eksprimiraju u ćeliji. Vektori sadrže plazmide, fagemide ili genome virusa. Termin "plazmid", kako se ovde upotrebljava, generalno se odnosi na konstrukciju vanhromozomskog genetskog materijala, obično cirkularni DNK dupleks, koji se može replicirati nezavisno od hromozomske DNK.
[0139] Ovde opisane nukleinske kiseline mogu biti rekombinantni i/ili izolovani molekuli.
[0140] "Izolovani molekul" kako se ovde upotrebljava, namenjen je da označi molekul koji je suštinski bez drugih molekula kao što je drugi ćelijski materijal. Termin "izolovana nukleinska kiselina" označava u skladu sa pronalaskom da je nukleinska kiselina (i) amplifikovana in vitro, na primer lančanom reakcijom polimeraze (PCR), (ii) rekombinantno proizvedena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer isecanjem i gel-elektroforetskim frakcionisanjem, ili (iv) sintetisana, na primer hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja je dostupna manipulacijama rekombinantnim DNK tehnikama.
[0141] Termin "rekombinantni" u kontekstu ovog pronalaska označava "načinjen genetskim inženjeringom". Poželjno, "rekombinantni objekat" kao što je rekombinantna ćelija u kontekstu ovog pronalaska ne javlja se prirodno.
[0142] Termin "prirodno se javlja" kako se ovde upotrebljava označava činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) i može biti izolovana iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji je ona koja se prirodno javlja.
[0143] U skladu sa pronalaskom, termin "ćelija domaćin" označava bilo koju ćeliju koja može biti transformisana ili transfekovana egzogenom nukleinskom kiselinom. Termin "ćelija domaćin" sadrži, u skladu sa pronalaskom, prokariotske (npr. E.coli) ili eukariotske ćelije (npr. ćelije kvasca i ćelije insekata). Posebna prednost se daje ćelijama sisara kao što su ćelije ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza, primata. Ćelije mogu biti izvedene iz mnoštva tipova tkiva i sastoje se od primarnih ćelija i ćelijskih linija. Specifični primeri uključuju keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije kostne srži i embrionalne matične ćelije. U drugim primerima izvođenja, ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit ili makrofag. Nukleinska kiselina može biti prisutna u ćeliji domaćinu u jednoj ili u više kopija i, u jednom primeru izvođenja je eksprimirana u ćeliji domaćinu.
2
[0144] E.coli je gram-negativna, fakultativno anaerobna, bakterija štapićastog oblika roda Escherichia koja se obično nalazi u donjem delu creva toplokrvnih organizama. Bakterija se može uzgajati lako i jeftino u laboratorijskim uslovima, i intenzivno se istražuje više od 60 godina. E.coli je najšire proučavan prokariotski model organizam, i važna vrsta u oblastima biotehnologije i mikrobiologije, gde je služila kao organizam domaćin za većinu radova sa rekombinantnom DNK. E.coli sojevi u skladu sa pronalaskom uključuju: AG1, AB1157, B2155, BL21, BNN93, BNN97, BW26434, C600, CSH50, D1210, DB3.1, DH1, DH5α, DH10B, DH12S, DM1, E. cloni(r), E.coli K12 ER2738, ER2566, ER2267, HB101, IJ1126, IJ1127, JM83, JM101, JM103, JM105, JM106, JM107, JM108, JM109, JM110, JM2.300, LE392, Mach1, MC1061, MC4100, MFDpir, MG1655, OmniMAX2, RR1, RV308, SOLR, SS320, STBL2, STBL3, STBL4, SURE, SURE2, TG1, TOP10, Top10F’, W3110, WM3064, XL1-Blue, XL2-Blue, XL1-Red i XL10-Gold.
[0145] U skladu sa ovim pronalaskom, termin "peptid" sadrži oligo- i polipeptide i označava supstance koje sadrže dva ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 20 ili više, i do poželjno 50, poželjno 100 ili poželjno 150, uzastopnih aminokiselina međusobno povezanih peptidnim vezama. Termin "protein" odnosi se na velike peptide, poželjno peptide koji imaju najmanje 151 aminokiselinu, ali termini "peptid" i "protein" ovde se obično upotrebljavaju kao sinonimi.
[0146] Termini "peptid" i "protein" sadrže u skladu sa pronalaskom supstance koje ne sadrže samo aminokiselinske komponente, nego i komponente neaminokiselinske komponente poput šećera i fosfatnih struktura, i takođe sadrže supstance koje sadrže veze poput estarskih, tioetarskih ili disulfidnih veza.
[0147] U skladu sa ovim pronalaskom, nukleinska kiselina poput RNK može da kodira peptid ili protein. Prema tome, sekvenca nukleinske kiseline koja može biti transkribovana ili njen transkript može sadržati otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira peptid ili protein. Navedena nukleinska može eksprimirati kodirani peptid ili protein. Na primer, navedena nukleinska kiselina može biti nukleinska kiselina koja kodira i eksprimira antigen ili farmaceutski aktivan peptid ili protein kao što je imunološki aktivno jedinjenje (koje poželjno nije antigen).
[0148] U skladu sa pronalaskom, termin "nukleinska kiselina koja kodira peptid ili protein" označava da nukleinska kiselina, ako je prisutna u odgovarajućem okruženju, poželjno unutar ćelije, može usmeravati sklapanje aminokiselina kako bi se proizveo peptid ili protein tokom procesa translacije. Poželjno, RNK u skladu sa pronalaskom može da interaguje sa ćelijskom translacionom mašinerijom omogućavajući translaciju peptida ili proteina.
2
[0149] U skladu sa pronalaskom, u jednom primeru izvođenja, RNK sadrži ili se sastoji od farmaceutski aktivne RNK. "Farmaceutski aktivna RNK" može biti RNK koja kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein.
[0150] "Farmaceutski aktivan peptid ili protein" ima pozitivan ili povoljan uticaj na stanje ili stanje bolesti subjekta kada se primeni na subjekta u terapeutski efikasnoj količini. Poželjno, farmaceutski aktivan peptid ili protein ima lekovita ili palijativna svojstva i može biti primenjen za poboljšavanje, ublažavanje, olakšavanje, preokretanje, odlaganje početka ili umanjivanje ozbiljnosti jednog ili više simptoma bolesti ili poremećaja. Farmaceutski aktivan peptid ili protein mogu imati profilaktička svojstva i mogu se upotrebljavati za odlaganje početka bolesti ili za smanjenje ozbiljnost takve bolesti ili patološkog stanja. Termin "farmaceutski aktivan peptid ili protein" uključuje cele proteine ili polipeptide, i može se takođe odnositi na njihove farmaceutski aktivne fragmente. Takođe može da uključuje farmaceutski aktivne analoge peptida ili proteina. Termin "farmaceutski aktivan peptid ili protein" uključuje peptide i proteine koji su antigeni, tj. peptid ili protein izazivaju imunski odgovor kod subjekta koji može biti terapeutski ili delimično ili potpuno zaštitan.
[0151] Primeri farmaceutski aktivnih proteina uključuju, ali nisu ograničeni na, citokine i proteine imunskog sistema kao što su imunološki aktivna jedinjenja (npr. interleukini, faktor stimulacije rasta kolonije (CSF), faktor stimulacije rasta kolonije granulocita (G-CSF), faktor stimulacije rasta kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), eritropoetin, faktor nekroze tumora (TNF), interferoni, integrini, adresini, seletini, homing receptori, receptori T ćelija, imunoglobulini, rastvorljivi antigeni glavnog kompleksa histokompatibilnosti, imunološki aktivni antigeni poput bakterijskih, parazitskih, ili virusnih antigena, alergeni, autoantigeni, antitela), hormone (insulin, hormon štitne žlezde, kateholamini, gonadotropini, trofični hormoni, prolaktin, oksitocin, dopamin, goveđi somatotropin, leptini i slični), hormone rasta (npr. humani hormon rasta), faktore rasta (npr. epidermalni faktor rasta, faktor rasta nerava, faktor rasta sličan insulinu i slični), receptore faktora rasta, enzime (tkivni aktivator plazminogena, streptokinaza, holesterol biosintetički ili degradativni, steriodogeni enzimi, kinaze, fosfodiesteraze, metilaze, demetilaze, dehidrogenaze, celulaze, proteaze, lipaze, fosfolipaze, aromataze, citohromi, adenilat ili guanilast ciklaze, neuramidaze i slični), receptore (receptori steroidnog hormona, receptori peptida), vezujuće proteine (hormon rasta ili faktor rasta vezujući proteini i slični), faktore transkripcije i translacije, proteine za suzbijanje rasta tumora (npr. proteini koji inhibiraju angiogenezu), strukturne proteine (kao što su kolagen, fibroin, fibrinogen, elastin, tubulin, aktin, i miozin), proteine krvi (trombin, albumin seruma, Faktor VII, Faktor VIII, insulin, Faktor IX, Faktor X, tkivni aktivator plazminogena, protein C, fon Vilebrandov faktor, antitrombin III,
2
glukocerebrozidaza, eritropoetin, faktor stimulacije rasta kolonije granulocita (GCSF) ili modifikovani Faktor VIII, antikoagulanse i slične.
[0152] U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivan protein u skladu sa pronalaskom je citokin koji je uključen u regulisanje limfoidne homeostaze, poželjno citokin koji je uključen u i poželjno indukuje ili pojačava razviće, prajmiranje, ekspanziju, diferencijaciju i/ili preživljavanje T ćelija. U jednom primeru izvođenja, citokin je interleukin. U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivan protein u skladu sa pronalaskom je interleukin odabran iz grupe koja se sastoji od IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, i IL-21.
[0153] Termin "imunološki aktivno jedinjenje" odnosi se na bilo koje jedinjenje koje menja imunski odgovor, poželjno indukovanjem i/ili suzbijanjem sazrevanja imunskih ćelija, indukovanjem i/ili suzbijanjem biosinteze citokina, i/ili promenom humoralnog imuniteta stimulisanjem proizvodnje antitela od strane B ćelija. Imunološki aktivna jedinjenja poseduju snažnu imunostimulišuću aktivnost koja uključuje, ali nije ograničena na, antivirusnu i antitumorsku aktivnost, i može takođe da smanjuje druge aspekte imunskog odgovora, na primer prebacivanje imunskog odgovora od TH2 imunskog odgovora, što je korisno za lečenje širokog spektra TH2 posredovanih bolesti. Imunološki aktivna jedinjenja mogu biti korisna kao adjuvansi vakcine.
[0154] Ako je, u skladu sa ovim pronalaskom, poželjno indukovati ili pojačati imunski odgovor upotrebom RNK kako je ovde opisano, imunski odgovor može biti izazvan ili pojačan pomoću RNK. Na primer, proteini ili peptidi kodirani od strane RNK ili proizvoda njihove obrade mogu biti prezentovani posredstvom proteina glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) eksprimiranim na antigen-prezentujućim ćelijama. MHC peptidni kompleks tada može biti prepoznat od strane imunskih ćelija kao što su T ćelije što dovodi do njihove aktivacije.
[0155] U jednom primeru izvođenja, RNK koja kodira antigen kao što je antigen povezan sa bolešću primenjuje se na sisara, posebno ako se želi lečenje sisara koji ima bolest koja uključuje antigen. RNK preuzimaju antigen-prezentujuće ćelije sisara (monociti, makrofagi, dendritske ćelije ili druge ćelije). Antigeni proizvod translacije RNK je formiran i proizvod se prikazuje na površini ćelija radi prepoznavanja od strane T ćelija. U jednom primeru izvođenja, antigen je prikazan na ćelijskoj površini radi prepoznavanja pomoću CAR-konstruisanih T ćelija usmerenih na antigen. U jednom primeru izvođenja, antigen ili proizvod proizveden njegovom opcionom obradom je prikazan na ćelijskoj površini u kontekstu MHC molekula za prepoznavanje od strane T ćelija posredstvom njihovog T ćelijskog receptora.
[0156] Alternativno, ovaj pronalazak predviđa primere izvođenja u kojima se RNK koja eksprimira antigen uvodi u antigen-prezentujuće ćelije ex vivo, npr. antigen-prezentujuće ćelije uzete od pacijenta, i antigen-prezentujuće ćelije, opciono klonalno umnožene ex vivo, transplantiraju se nazad u istog pacijenta. Transfektovane ćelije mogu se ponovo uvesti u pacijenta upotrebljavajući bilo koja sredstva poznata u struci, po mogućnosti u sterilnom obliku intravenske, intrakavitarne, intraperitonealne ili intratumorske primene.
[0157] Postupci pronalaska mogu uključivati antigen prezentujuću ćeliju za eksprimiranje RNK koja kodira antigen. U tu svrhu, postupci ovog pronalaska mogu uključivati uvođenje RNK koja kodira antigene u antigen prezentujuće ćelije kao što su dendritske ćelije. Za transfekciju antigen-prezentujućih ćelija kao što su dendritske ćelije može se upotrebiti farmaceutska kompozicija koja sadrži RNK koja kodira antigen. Dostavni prenosnik koji cilja RNK na dendritsku ili drugu antigen prezentujuću ćeliju može se primeniti pacijentu, što rezultira transfekcijom koja se događa in vivo.
[0158] U skladu sa pronalaskom poželjno je da se upotrebljavaju formulacije RNK koja kodira antigen koje dostavljaju RNK sa visokom selektivnošću antigen-prezentujućim ćelijama kao što su dendritske ćelije (DC) u slezini nakon sistemske primene. Na primer, nanočestične RNK formulacije sa definisanom veličinom čestice pri čemu je neto naelektrisanje čestica blizu nule ili negativno, kao što su elektro-neutralni ili negativno naelektrisani lipopleksi od RNK i lipozoma, npr. lipopleksi koji sadrže DOTMA i DOPE ili DOTMA i holesterol dovode do značajne ekspresije RNK u slezini DC nakon sistemske primene. Snažna ekspresija u ciljnim ćelijama (slezini) je determinisana dok je ekspresija u drugim organima bila niska.
[0159] Kako se ovde upotrebljava, termin "nanočestica" označava bilo koju česticu koja ima prečnik koji čini česticu pogodnom za sistemsku, posebno parenteralnu, primenu, posebno, nukleinskih kiselina, obično prečnika manjeg od 1000 nanometara (nm). U nekim primerima izvođenja, nanočestica ima prečnik manji od 600 nm. U nekim primerima izvođenja, nanočestica ima prečnik manji od 400 nm.
[0160] Kako se ovde upotrebljava, termin "nanočestična formulacija" ili slični termini označavaju bilo koju supstancu koja sadrži najmanje jednu nanočesticu. U nekim primerima izvođenja, nanočestična kompozicija je uniformna kolekcija nanočestica. U nekim primerima izvođenja, nanočestične kompozicije su disperzije ili emulzije. Uopšteno, disperzija ili emulzija se formira kada se kombinuju najmanje dva nemešljiva materijala.
[0161] Termin, "lipopleks" ili "lipopleks nukleinske kiseline", posebno "RNK lipopleks", označava kompleks lipida i nukleinskih kiselina, posebno RNK. Lipopleksi se formiraju spontano kada se katjonski lipozomi, koji često takođe uključuju neutralne lipide "pomagače", pomešaju sa nukleinskim kiselinama.
[0162] Ako ovaj pronalazak označava naelektrisanje kao što je pozitivno naelektrisanje, negativno naelektrisanje ili neutralno naelektrisanje ili katjonsko jedinjenje, negativno jedinjenje ili neutralno jedinjenje ovo uopšteno označava da je pomenuto naelektrisanje prisutno na
1
izabranom pH, kao što je fiziološki pH. Na primer, termin "katjonski lipid" označava lipid koji ima neto pozitivno naelektrisanje na izabranom pH, kao što je fiziološki pH. Termin "neutralni lipid" označava lipid koji nema neto pozitivno ili negativno naelektrisanje i može biti prisutan u obliku ne-naelektrisanog ili neutralnog amfoternog jona na izabranom pH, kao što je fiziološki pH. Pod "fiziološkim pH" ovde se podrazumeva pH od oko 7,5.
[0163] Nanočestični nosači kao što su lipidni nosači predviđeni za upotrebu u ovom pronalasku uključuju bilo koje supstance ili prenosnike sa kojima se može povezati nukleinska kiselina kao što je RNK, npr. formiranjem kompleksa sa nukleinskom kiselinom ili formiranjem vezikula u kojima je nukleinska kiselina zatvorena ili inkapsulirana. To može rezultirati povećanom stabilnošću nukleinske kiseline u poređenju sa golom nukleinskom kiselinom. Posebno, stabilnost nukleinske kiseline u krvi može biti povećana.
[0164] Katjonski lipidi, katjonski polimeri i druge supstance sa pozitivnim naelektrisanjem mogu formirati komplekse sa negativno naelektrisanim nukleinskim kiselinama. Ovi katjonski molekuli mogu se upotrebiti za kompleksovanje nukleinskih kiselina, time formirajući npr. takozvane lipoplekse ili poliplekse, respektivno, i pokazano je da ovi kompleksi dostavljaju nukleinske kiseline u ćelije.
[0165] Preparati nanočestične nukleinske kiseline za upotrebu u ovom pronalasku mogu se dobiti različitim protokolima i od različitih kompleksujućih jedinjenja nukleinske kiseline. Lipidi, polimeri, oligomeri, ili amfipili su tipični kompleksujući agensi. U jednom primeru izvođenja, kompleksujuće jedinjenje sadrži najmanje jedan agens odabran iz grupe koja se sastoji od protamina, polietilenimina, poli-L-lizina, poli-L-arginina ili histona.
[0166] U skladu sa pronalaskom, protamin je koristan kao katjonski agens nosač. Termin "protamin" označava bilo koji od različitih snažno baznih proteina relativno niske molekulske mase koji su bogati argininom i koji se nalaze povezani posebno sa DNK na mestu somatskih histona u spermatozoidima različitih životinja (kao ribe). Posebno, termin "protamin" odnosi se na proteine koji se nalaze u spermi riba koji su snažno bazni, rastvorljivi su u vodi, ne koagulišu toplotom, i daju uglavnom arginin nakon hidrolize. U prečišćenom obliku, upotrebljavaju se u dugo-delujućoj formulaciji insulina i da neutrališu antikoagulantne efekte heparina.
[0167] U skladu sa pronalaskom, termin "protamin" kako se ovde upotrebljava, podrazumeva da sadrži bilo koju protamin aminokiselinsku sekvencu dobijenu ili izvedenu iz nativnih ili bioloških izvora uključujući njihove fragmente i multimerne oblike navedene aminokiselinske sekvence ili njenog fragmenta. Osim toga, termin obuhvata (sintetisane) polipeptide koji su veštački i specifično dizajnirani za specifične svrhe i ne mogu se izolovati iz nativnih ili bioloških izvora.
2
[0168] Protamin koji se upotrebljava u skladu sa ovim pronalaskom može biti sulfovani protamin ili hidrohlorid protamin. U poželjnom primeru izvođenja, izvor protamina koji se upotrebljava za proizvodnju ovde opisanih nanočestica je protamin 5000 koji sadrži više od 10 mg/ml protamina (5000 jedinica za neutralisanje heparina po ml) u izotoničnom rastvoru soli.
[0169] Lipozomi su mikroskopske lipidne vezikule koje često imaju jedan ili više dvosloja lipida koji formiraju vezikulu, kao što je fosfolipid, i sposobni su da inkapsuliraju lek. U kontekstu ovog pronalaska mogu se koristiti različite vrste lipozoma, uključujući, bez ograničenja na njih, multilamelarne vezikule (MLV), male unilamelarne vezikule (SUV), velike unilamelarne vezikule (LUV), sterično stabilizovane lipozome (SSL), multivezikularne vezikule (MV), i velike multivezikularne vezikule (LMV) kao i drugi dvoslojni oblici poznati u stanju tehnike. Veličina i lamelarnost lipozoma zavisiće od načina pripreme i izbor tipa vezikula koje će se upotrebljavati zavisiće od poželjnog načina primene. Postoji nekoliko drugih oblika supramolekularne organizacije u kojima lipidi mogu biti prisutni u vodenom medijumu, koji sadrže lamelarne faze, heksgonalne i inverzne heksgonalne faze, kubne faze, micele, reverzne micele sastavljene od monoslojeva. Ove faze mogu se takođe dobiti u kombinaciji sa DNK ili RNK, i interakcija sa RNK i DNK može značajno uticati na fazno stanje. Opisane faze mogu biti prisutne u formulacijama nanočestične nukleinske kiseline ovog pronalaska.
[0170] Za formiranje lipopleksa nukleinske kiseline od nukleinske kiseline i lipozoma, bilo koji pogodan postupak formiranja lipozoma se može upotrebiti sve dok obezbeđuje predviđene lipoplekse nukleinske kiseline. Lipozomi se mogu formirati upotrebom standardnih postupaka kao što su postupak reverzne evaporacije (REV), postupak ubrizgavanja etanola, postupak dehidratacije-rehidratacije (DRV), sonikacija ili drugi pogodni postupci.
[0171] Posle formiranja lipozoma, lipozomi se mogu izmeriti kako bi se dobila populacija lipozoma koja ima suštinski homogeni opseg veličine.
[0172] Lipidi koji formiraju dvosloj obično imaju dva ugljovodonična lanca, posebno acilne lance, i glavnu grupu, bilo polarnu ili nepolarnu. Lipidi koji formiraju dvosloj su ili sačinjeni od lipida koji se prirodno javljaju ili su sintetičkog porekla, uključujući fosfolipide, kao što su fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, fosfatidna kiselina, fosfatidilinozitol, i sfingomijelin, gde su dva lanca ugljovodonika obično dužine između oko 14-22 atoma ugljenika, i imaju različite stepene nezasićenosti. Drugi pogodni lipidi za upotrebu u kompoziciji ovog pronalaska uključuju glikolipide i sterole kao što je holesterol i njegovi različiti analozi koji se takođe mogu upotrebljavati u lipozomima.
[0173] Katjonski lipidi obično imaju lipofilni deo, kao što je sterol, acilni ili diacilni lanac, i imaju ukupno neto pozitivno naelektrisanje. Glavna grupa lipida obično nosi pozitivno naelektrisanje. Katjonski lipid poželjno ima pozitivno naelektrisanje od 1 do 10 valenci, poželjnije pozitivno naelektrisanje od 1 do 3 valence, i još poželjnije pozitivno naelektrisanje od 1 valence. Primeri katjonskih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na 1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijum propan (DOTMA); dimetildioktadecilamonijum (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum-propan (DODAP); 1,2-diaciloksi-3-dimetilamonijum propane; 1,2-dialkiloksi-3- dimetilamonijum propane; dioktadecildimetil amonijum hlorid (DODAC), 1,2-dimiristoiloksipropil-1,3-dimetilhidroksietil amonijum (DMRIE), i 2,3-dioleoiloksi-N-[2 (spermin karboksamid)etil]-N,N-dimetil-1-propanamijum trifluoroacetat (DOSPA). Poželjni su DOTMA, DOTAP, DODAC, i DOSPA. Najpoželjniji je DOTMA.
[0174] Pored toga, nanočestice opisane ovde poželjno dalje uključuju neutralni lipid u pogledu strukturne stabilnosti i slično. Neutralni lipid se može na odgovarajući način odabrati u pogledu efikasnosti dostave nukleinska kiselina-lipid kompleksa. Primeri neutralnih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, 1,2-di-(9Z-oktadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-dioleoilsn-glicero-3-fosfoholin (DOPC), diacilfosfatidil holin, diacilfosfatidil etanol amin, ceramid, sfingoemijelin, cefalin, sterol, i cerebrozid. Poželjan je DOPE i/ili DOPC. Najpoželjniji je DOPE. U slučaju gde katjonski lipozom uključuje oba i katjonski lipid i neutralni lipid, molarni odnos katjonskog lipida prema neutralnom lipidu može se na odgovarajući način odrediti u pogledu stabilnosti lipozoma i slično.
[0175] U skladu sa jednim primerom izvođenja, nanočestice opisane ovde mogu da sadrže fosfolipide. Fosfolipidi mogu biti glicerofosfolipid. Primeri glicerofosfolipida uključuju, bez ograničavanja na njih, tri vrste lipida: (i) cviterjonske fosfolipide, koji uključuju, na primer, fosfatidilholin (PC), fosfatidilholin iz žumanca, PC izveden iz zrna soje u prirodnom, delimično hidrogenizovanom ili potpuno hidrogenizovanom obliku, dimiristoil fosfatidilholin (DMPC) sfingomijelin (SM); (ii) negativno naelektrisane fosfolipide: koji uključuju, na primer, fosfatidilserin (PS), fosfatidilinozitol (PI), fosfatidinsku kiselinu (PA), fosfatidilglicerol (PG) dipalmipoil PG, dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG); sintetičke derivate u kojima konjugat čini cviterjonski fosfolipid negativno naelektrisanim kao što je slučaj sa metoksi-polietilenom, glikol-distearoil fosfatidiletanolaminom (mPEG-DSPE); i (iii) katjonske fosfolipide, koji uključuju, na primer, fosfatidilholin ili sfingomijelin čiji je fosfomonoestar O-metilovan da formira katjonske lipide.
[0176] Asocijacija nukleinske kiseline sa lipidnim nosačem može se dogoditi, na primer, tako što nukleinska kiselina popunjava intersticijalne prostore nosača, tako da nosač fizički zarobi nukleinsku kiselinu, ili kovalentnim, jonskim, ili vodoničnim vezivanjem, ili adsorpcijom nespecifičnim vezama. Bez obzira na način asocijacije, nukleinska kiselina mora zadržati svoja terapeutska, tj. antigen-kodirajuća, svojstva.
4
[0177] Termin "bolest" označava nenormalno stanje koje utiče na telo pojedinca. Bolest je često shvaćena kao zdravstveno stanje povezano sa specifičnim simptomima i znacima. Bolest može biti uzrokovana faktorima koji potiču iz spoljašnjeg izvora, kao što je zarazna bolest, ili može biti uzrokovana unutrašnjim disfunkcijama, kao što su autoimune bolesti.
[0178] U skladu sa pronalaskom, termin "bolest" takođe označava bolesti kancera. Termini "bolest kancera" ili "kancer" (medicinski termin: maligna neoplazma) odnosi se na klasu bolesti u kojima grupa ćelija pokazuje nekontrolisani rast (deoba izvan granica normale), invaziju (upad i uništavanje susednih tkiva), i ponekad metastazu (širenje na druge lokacije u telu putem limfe ili krvi). Ova tri maligna svojstva kancera razlikuju ih od benignih tumora, koji su samoograničeni, i ne invadiraju ili metastaziraju. Većina kancera formira tumor, tj. oticanje ili leziju formiranu abnormalnim rastom ćelija (koje se nazivaju neoplastične ćelije ili ćelije tumora), ali neki, poput leukemije, to ne čine. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom, gliom i leukemiju. Tačnije, primeri takvih kancera uključuju kancer kostiju, kancer krvi, kancer pluća, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožni ili intraokularni maligni melanom, kancer materice, kancer jajnika, kancer rektuma, kancer analne regije, kancer želuca, kancer kolona, kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, karcinom seksualnih i reproduktivnih organa, Hočkinovu bolest, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer štitne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega, karcinom renalnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), neuroektodermalni kancer, tumore kičmene moždine, gliom, meningiom, i adenom hipofize. Termin "kancer" u skladu sa pronalaskom takođe sadrži metastaze kancera.
[0179] Termin "infektivna bolest" označava bilo koju bolest koja se može preneti sa pojedinca na pojedinca ili sa organizma na organizam, i uzrokuje je mikrobni agens (npr. obična prehlada). Primeri infektivnih bolesti uključuju virusne infektivne bolesti, kao što su AIDS (HIV), hepatitis A, B ili C, herpes, herpes zoster (male boginje), nemačke ospice (virus rubella), žuta groznica, denga itd. flavivirusi, virusi gripa, hemoragične infektivne bolesti (virusi Marburg ili Ebola), i teški akutni respiratorni sindrom (SARS), bakterijske infektivne bolesti, poput legionarske bolesti (Legionella), seksualno prenosive bolesti (npr. hlamidija ili gonoreja), čir na želucu (Helicobacter), kolera (Vibrio), tuberkuloza, difterija, infekcije E.coli, Staphylococci, Salmonella ili Streptococci (tetanus); infekcije protozojskim patogenima kao što su malarija, bolest spavanja, lišmanijoza; toksoplazmoza, tj. Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania i Toxoplasma infekcije; ili gljivične infekcije, koje su uzrokovane npr. od strane Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis ili Candida albicans.
[0180] Termin "autoimuna bolest" označava bilo koju bolest u kojoj telo proizvodi imunogeni (tj. imunskog sistema) odgovor na neki konstituent sopstvenog tkiva. Drugim rečima, imunski sistem gubi svoju sposobnost prepoznavanja nekog tkiva ili sistema unutar tela kao sopstvenog i cilja i napada ga kao da je strano. Autoimune bolesti se mogu klasifikovati u one u kojima je pogođen pretežno jedan organ (npr. hemolitična anemija i anti-imunski tiroiditis), i one kod kojih je proces autoimune bolesti raširen kroz mnoga tkiva (npr. sistemski eritematozni lupus). Na primer, smatra se da multiplu sklerozu uzrokuju T ćelije koje napadaju omotače koji okružuju nervna vlakna mozga i kičmene moždine. To dovodi do gubitka koordinacije, slabosti, i zamagljenog vida. Autoimune bolesti su poznate u struci i uključuju, na primer, Hašimotov tiroiditis, Gravesovu bolest, lupus, multipla sklerozu, reumatski artritis, hemolitičnu anemiju, anti-imuni tiroiditis, sistemski eritematozni lupus, celijakiju, Kronovu bolest, kolitis, dijabetes, sklerodermu, psorijazu, i slične.
[0181] U skladu sa pronalaskom, imunski odgovor može se stimulisati uvođenjem u subjekta pogodne iRNK koja kodira antigen ili njegov fragment, npr., antigen povezan sa bolešću.
[0182] Termin "antigen" odnosi se na agens koji sadrži epitop prema kom imunski odgovor treba da bude generisan. Termin "antigen" uključuje posebno proteine, peptide, polisaharide, nukleinske kiseline, naročito RNK i DNK, i nukleotide. Termin "antigen" takođe uključuje agense, koji postaju antigeni - i senzibilišući - samo transformacijom (npr. neposredno u molekulu ili završavanjem sa telesnim proteinom). Antigen je poželjno prezentabilan putem ćelija imunskog sistema kao što su antigen prezentujuće ćelije poput dendritskih ćelija ili makrofaga. Pored toga, antigen ili njegov proizvod obrade se poželjno prepoznaje putem receptora T ili B ćelije, ili putem molekula imunoglobulina kao što je antitelo. U poželjnom primeru izvođenja, antigen je antigen povezan sa bolešću, kao što je antigen povezan sa tumorom, virusni antigen, ili bakterijski antigen.
[0183] Termin "antigen povezan sa bolešću" se upotrebljava u najširem smislu da označi bilo koji antigen povezan sa bolešću. Antigen povezan sa bolešću je molekul koji sadrži epitope koji će stimulisati imunski sistem domaćina da napravi ćelijski antigen-specifični imunski odgovor i/ili humoralni odgovor antitelom protiv bolesti. Antigen povezan sa bolešću može se stoga koristiti u terapeutske svrhe. Antigeni povezani sa bolešću poželjno su povezani sa infekcijom mikrobima, obično mikrobnim antigenima, ili su povezani sa kancerom, tipično tumorima.
[0184] Termin "bolest koja uključuje antigen" označava bilo koju bolest koja implicira antigen, npr. bolest koju karakteriše prisustvo i/ili ekspresija antigena. Bolest koja uključuje antigen može biti infektivna bolest, autoimuna bolest, ili bolest kancera ili jednostavno kancer. Kao što je gore pomenuto, antigen može biti antigen povezan sa bolešću, kao što je antigen povezan sa tumorom, virusni antigen, ili bakterijski antigen.
[0185] U jednom primeru izvođenja, antigen povezan sa bolešću je antigen povezan sa tumorom. U ovom primeru izvođenja, ovaj pronalazak može biti koristan u lečenju kancera ili metastaze kancera. Poželjno, oboleli organ ili tkivo su okarakterisani bolesnim ćelijama kao što su ćelije kancera koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću i/ili se karakterišu povezivanjem antigena koji je povezan sa bolešću sa njihovom površinom. Imunizacija sa intaktnim ili suštinski intaktnim antigenima povezanim sa tumorom ili njihovim fragmentima, kao što su peptidi MHC klase I i klase II ili nukleinske kiseline, posebno iRNK, koja kodira takav antigen ili fragment omogućava izazivanje MHC klase I i/ili klase II vrstu odgovora i, prema tome, stimuliše T ćelije kao što su CD8+ citotoksični T limfociti koji su sposobni da liziraju ćelije kancera i/ili CD4+ T ćelije. Takva imunizacija takođe može da izazove humoralni imunski odgovor (B-ćelijski odgovor) što rezultira proizvodnjom antitela prema antigenu povezanim sa tumorom. Osim toga, antigen-prezentujuće ćelije (APC) kao što su dendritske ćelije (DC) mogu biti napunjene peptidima prezentovanim sa MHC klase I transfekcijom nukleinskim kiselinama koje kodiraju tumorske antigene in vitro i primenjene pacijentu. U jednom primeru izvođenja, termin "antigen povezan sa tumorom" odnosi se na konstituent ćelija kancera koji može biti izveden iz citoplazme, ćelijske površine i ćelijskog nukleusa. Posebno, odnosi se na one antigene koji se proizvode, poželjno u velikoj količini, unutarćelijski ili kao površinski antigeni na ćelijama tumora. Primeri za antigene tumora uključuju HER2, EGFR, VEGF, CAMPATH1-antigen, CD22, CA-125, HLA-DR, Hočkin-limfom ili mucin-1, ali nisu ograničeni na njih.
[0186] U skladu sa ovim pronalaskom, antigen povezan sa tumorom poželjno sadrži bilo koji antigen koji je karakterističan za tumore ili kancere kao i za ćelije tumora ili kancera s obzirom na tip i/ili nivo ekspresije. U jednom primeru izvođenja, termin "antigen povezan sa tumorom" odnosi se na proteine koji su u normalnim uslovima, tj. u zdravom subjektu, specifično eksprimirani u ograničenom broju organa i/ili tkiva ili u specifičnim razvojnim stadijumima, na primer, antigen povezan sa tumorom može biti u normalnim uslovima specifično eksprimiran u stomačnom tkivu, poželjno u želudačnoj mukozi, u reproduktivnim organima, npr. u testisima, u tkivu trofoblasta, npr. u placenti, ili u ćelijama germinativne linije, i eksprimirani su ili aberantno eksprimirani u jednom ili više tkiva tumora ili kancera. U tom kontekstu, "ograničen broj" poželjno označava ne više od 3, poželjnije ne više od 2 ili 1. Antigeni povezani sa tumorom u kontekstu ovog pronalaska uključuju, na primer, antigene diferencijacije, poželjno antigene diferencijacije specifične za ćelijski tip, tj. proteine koji su u normalnim uslovima specifično eksprimirani u određenom ćelijskom tipu u određenom stadijumu diferencijacije, antigene kancera/testisa, tj. proteine koji su u normalnim uslovima specifično eksprimirani u testisima i ponekad u placenti, i antigene specifične za germinativnu liniju. U kontekstu ovog pronalaska, antigen povezan sa tumorom se poželjno ne ili se samo retko eksprimira u normalnim tkivima ili je mutiran u ćelijama tumora. Poželjno, antigen povezan sa tumorom ili aberantna ekspresija antigena povezanog sa tumorom identifikuje ćelije kancera. U kontekstu ovog pronalaska, antigen povezan sa tumorom koji eksprimira ćelija kancera kod subjekta, npr. pacijenta koji pati od bolesti kancera, poželjno je samo-protein kod navedenog subjekta. U poželjnim primerima izvođenja, antigen povezan sa tumorom u kontekstu ovog pronalaska se eksprimira u normalnim uslovima specifično u tkivu ili organu koji je ne-esencijalan, tj. tkivima ili organima koji kada se oštete imunskim sistemom ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koji imunskom sistemu nisu ili su teško dostupni. Poželjno, antigen povezan sa tumorom prezentuje u kontekstu MHC molekula ćelija kancera u kojoj je eksprimiran.
[0187] Primeri za diferencijacijske antigene koji idealno ispunjavaju kriterijum za antigene povezane sa tumorom kako je nagovešteno ovim pronalaskom kao ciljne strukture u imunoterapiji protiv tumora, posebno, u vakcinisanju protiv tumora su ćelijski površinski proteini iz porodice klaudina (Claudin), kao što su CLDN6 i CLDN18.2. Ovi diferencijacijski antigeni se eksprimiraju kod tumora različitog porekla, i posebno su pogodni kao ciljne strukture u vezi sa imunoterapijom protiv kancera koja je posredovana antitelom zbog njihove selektivne ekspresije (bez ekspresije u toksično relevantnom normalnom tkivu) i lokalizacije u ćeliskoj membrani.
[0188] Dadatni primeri za antigene koji mogu biti korisni u ovom pronalasku su p53, ART-4, BAGE, beta-katenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (ili hTRT), LAGE, LD-LR/FUT, MAGE-A, poželjno MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, ili MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinase 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ili RU2, SAGE, SART-1 ili SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE i WT, poželjno WT-1.
[0189] Termin "virusni antigen" označava bilo koju virusnu komponentu koja ima antigena svojstva, tj. sposobna je da izazove imunski odgovor kod pojedinca. Virusni antigen može biti virusni ribonukleoprotein ili protein omotača.
[0190] Termin "bakterijski antigen" označava bilo koju bakterijsku komponentu koja ima antigena svojstva, tj. sposobna je da izazove imunski odgovor kod pojedinca. Bakterijski antigen može biti izveden iz ćelijskog zida ili membrane citoplazme bakterije.
[0191] "Obrada antigena" označava degradaciju antigena u proizvode obrade, koji su fragmenti navedenog antigena (npr. degradacija proteina u peptide) i povezivanje jednog ili više ovih fragmenata (npr., vezivanjem) sa MHC molekulima za prezentovanje od strane ćelija, poželjno antigen prezentujućim ćelijama specifičnim T ćelijama.
[0192] Termin "imunski odgovor", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na reakciju imunskog sistema kao što je na imunogenske organizme, kao što su bakterija ili virusi, ćelije ili supstance. Termin "imunski odgovor" uključuje urođeni imunski odgovor i adaptivni imunski odgovor. Poželjno, imunski odgovor je povezan sa aktivacijom imunskih ćelija, indukcijom biosinteze citokina i/ili proizvodnjom antitela. Poželjno je da imunski odgovor sadrži korake aktivacije antigen prezentujućih ćelija, kao što su dendritske ćelije i/ili makrofagi, prezentovanje antigena ili njegovog fragmenta od strane navedenih antigen prezentujućih ćelija i aktiviranje citotoksičnih T ćelija usled ovog prezentovanja.
[0193] Termin "lečiti" ili "lečenje" odnosi se na bilo koje lečenje koje poboljšava zdravstveno stanje i/ili produžava (povećava) životni vek pojedinca. Navedeno lečenje može eliminisati bolest kod pojedinca, zaustaviti ili usporiti razvoj bolesti kod pojedinca, inhibirati ili usporiti razvoj bolesti kod pojedinca, smanjiti učestalost ili ozbiljnost simptoma kod pojedinca, i/ili smanjiti recidiv kod pojedinca koji trenutno ima ili je prethodno imao bolest.
[0194] Posebno, termin "lečenje bolesti" uključuje izlečenje, skraćenje trajanja, ublažavanje, usporavanje ili inhibiranje napredovanja ili pogoršanja bolesti ili njenih simptoma.
[0195] Termin "imunoterapija" odnosi se na lečenje koji poželjno uključuje specifičnu imunsku reakciju i/ili funkciju(e) imunskog efektora.
[0196] Termin "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuje postupak lečenja subjekta iz terapijskih ili profilaktičkih razloga.
[0197] Termin "subjekat" ili "pojedinac", kako se ovde upotrebljava, poželjno se odnosi na sisare. Na primer, sisari u kontekstu ovog pronalaska su ljudi, primati koji nisu ljudi, pripitomljene životinje kao što su psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci itd., kao i životinje u zatočeništvu, kao što su životinje u zoološkim vrtovima. U poželjnom primeru izvođenja, subjekat je čovek.
[0198] Termin "antigen prezentujuća ćelija" (APC) odnosi se na ćeliju od mnoštva ćelija sposobnih da prikažu, steknu, i/ili prezentuju najmanje jedan antigen ili antigeni fragment na (ili u) svojoj ćelijskoj površini. Antigen-prezentujuće ćelije mogu se razdvojiti u profesionalne antigen prezentujuće ćelije i ne-profesionalne antigen prezentujuće ćelije.
[0199] Termin "profesionalne antigen prezentujuće ćelije" odnosi se na antigen prezentujuće ćelije koje konstitutivno eksprimiraju molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (MHC klasa II) koji su potrebni za interakciju sa naivnim T ćelijama. Ako T ćelija interaguje sa kompleksom molekula MHC klase II na membrani antigen prezentujuće ćelije, antigen prezentujuća ćelija proizvodi ko-stimulatorni molekul indukujući aktivaciju T ćelije. Profesionalne antigen prezentujuće ćelije sadrže dendritske ćelije i makrofage.
[0200] Termin "ne-profesionalne antigen prezentujuće ćelije" odnosi se na antigen prezentujuće ćelije koje konstitutivno ne eksprimiraju molekule MHC klase II, već nakon stimulacije određenim citokinima kao što je interferon-gama. Na primer, ne-profesionalne antigen prezentujuće ćelije uključuju fibroblaste, epitelne ćelije timusa, epitelne ćelije štitne žlezde, glijalne ćelije, beta ćelije pankreasa ili vaskularne endotelske ćelije.
[0201] Termin "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenica "MHC" uključuju molekule MHC klase I i MHC klase II i odnose se na kompleks gena koji se javlja kod svih vertebrata. MHC proteini ili molekuli su važni za signalizaciju između limfocita i antigen prezentujuće ćelija ili obolelih ćelija u imunskim reakcijama, pri čemu MHC proteini ili molekuli vezuju peptide i prezentuju ih za prepoznavanje od strane receptora T ćelija. Proteini kodirani sa MHC se eksprimiraju na površini ćelija, i prikazuju oba i svoje (self) antigene (peptidni fragmenti iz same ćelije) i nesvoje (nonself) antigene (npr. fragmenti invazivnih mikroorganizama) T ćeliji.
[0202] U skladu sa pronalaskom, termin "himerni antigenski receptor (CAR)" je sinonim sa terminima "himerni receptor T ćelije" i "veštački receptor T ćelije".
[0203] Ovi termini se odnose na konstruisane receptore, koji daju proizvoljnu specifičnost kao što je specifičnost monoklonalnog antitela na imunskoj efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija. Na ovaj način, veliki broj T ćelija specifičnih za kancer može se generisati za adoptivni ćelijski transfer. Prema tome, CAR može biti prisutan na T ćelijama, npr. umesto ili pored T ćelijskog sopstvenog receptora T ćelije. Takve T ćelije ne zahtevaju nužno obradu i prezentovanje antigena za prepoznavanje ciljne ćelije ali pre mogu prepoznati poželjno sa specifičnošću bilo koji antigen prisutan na ciljnoj ćeliji. Poželjno, navedeni CAR se eksprimira na površini ćelija. U svrhu ovog pronalaska T ćelije koje sadrže CAR su sadržane u terminu "T ćelija" kako se ovde upotrebljava.
[0204] U skladu sa pronalaskom, termin "CAR" (ili "himerni antigenski receptor") odnosi se na veštački receptor koji sadrži jedan molekul ili kompleks molekula koji prepoznaje, tj. vezuje se za ciljnu strukturu (npr. antigen) na ciljnoj ćeliji kao što je ćelija kancera (npr. vezanjem antigenvezujućeg domena za antigen eksprimiran na površini ciljne ćelije) i može dati specifičnost imunskoj efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija koja eksprimira navedeni CAR na ćelijskoj površini. Poželjno, prepoznavanje ciljne strukture pomoću CAR dovodi do aktiviranja imunske efektorske ćelije koja eksprimira navedeni CAR. CAR može da sadrži jednu ili više proteinskih jedinica navedene proteinske jedinice sadrže jedan ili više domena kako je ovde opisano. Termin "CAR" ne uključuje receptore T ćelije.
4
[0205] U jednom primeru izvođenja, jednolančani varijabilni fragment (scFv) izveden iz monoklonalnog antitela je fuzionisan sa CD3-zeta transmembranskim endodomenom. Takvi molekuli rezultiraju prenosom zeta signala kao odgovor na prepoznavanje od strane scFv njgovog antigenskog cilja na ciljnoj ćeliji i ubijanjem ciljne ćelije koja eksprimira ciljni antigen. Domeni za prepoznavanje antigena koji se takođe mogu upotrebiti uključuju između ostalih alfa i beta pojedinačne lance receptora T ćelije (TCR). U stvari gotovo bilo šta što veže dati cilj sa visokim afinitetom može biti upotrebljeno kao domen prepoznavanja antigena.
[0206] Posle prepoznavanja antigena, receptori se grupišu i signal se prenosi u ćeliju. U tom pogledu, "signalni domen T ćelije" je domen, poželjno endodomen, koji prenosi signal aktivacije u T ćeliju pošto je antigen vezan. Najčešće upotrebljavana endodomenska komponenta je CD3-zeta.
[0207] Terapija adoptivnog ćelijskog transfera sa CAR-konstruisanim T ćelijama koje eksprimiraju himerne antigenske receptore je obećavajući terapeutik protiv kancera pošto T-ćelije modifikovane sa CAR mogu biti konstruisane da ciljaju praktično bilo koji tumorski antigen. Na primer, T ćelije pacijenta mogu biti genetski konstruisane (genetski modifikovane) da eksprimiraju CAR specifično usmeren ka antigenima na pacijentovim tumorskim ćelijama, a zatim se infuzijom vraćaju u pacijenta.
[0208] U skladu sa pronalaskom CAR može da zameni funkciju receptora T ćelije i, posebno, može dati reaktivnost kao što je citolitička aktivnost ćeliji kao što je T ćelija. Međutim, za razliku od vezivanja receptora T ćelije za antigenski peptid-MHC kompleks, CAR se može vezati za antigen, posebno kada je eksprimiran na površini ćelije.
[0209] U skladu sa pronalaskom, CAR obično mogu da sadrže tri domena.
Prvi domen je vezujući domen koji prepoznaje i vezuje antigen.
Drugi domen je ko-stimulatorni domen. Ko-stimulatorni domen služi da poboljša proliferaciju i preživljavanje citotoksičnih limfocita nakon vezivanja CAR na ciljni deo. Identitet kostimulatornog domena je ograničen samo time što ima sposobnost da poboljša ćelijsku proliferaciju i preživljavanje nakon vezivanja ciljanog dela od strane CAR. Pogodni kostimulatorni domeni uključuju CD28, CD137 (4-1BB), člana porodice receptora faktora nekroze tumora (TNF), CD134 (OX40), člana TNFR-superporodice receptora, i CD278 (ICOS), kostimulatorni molekul CD28-superporodice eksprimiran na aktiviranim T ćelijama. Stručnjak će razumeti da se varijante sekvenci ovih napomenutih ko-stimulatornih domena mogu upotrebljavati bez nepovoljnog uticaja na pronalazak, gde varijante imaju istu ili sličnu aktivnost kao domen po kome su modelovane. Takve varijante će imati najmanje oko 80% identične sekvence aminokiselinskoj sekvenci domena iz kojeg su izvedene. U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, CAR konstrukti sadrže dva ko-stimulatorna domena. Dok određene kombinacije uključuju sve moguće varijacije četiri navedena domena, specifični primeri uključuju CD28+CD137 (4-1BB) i CD28+CD134 (OX40).
Treći domen je aktivacioni signalni domen (ili signalni domen T ćelije). Aktivacioni signalni domen služi da aktivira citotoksične limfocite nakon vezivanja CAR za antigen. Identitet aktivacionog signalnog domena je ograničen samo time što ima sposobnost da indukuje aktivaciju odabranog citotoksičnog limfocita nakon vezivanja antigena od strane CAR. Odgovarajući aktivacioni signalni domeni uključuju CD3 [zeta] lanac T ćelije i Fc receptor [gama]. Iskusni stručnjak će razumeti da se varijante sekvenci ovih napomenutih aktivacionih signalnih domena mogu upotrebljavati bez negativnog uticaja na pronalazak, gde varijante imaju istu ili sličnu aktivnost kao domen po kome su modelovane. Takve varijante će imati najmanje oko 80% identične sekvence aminokiselinskoj sekvenci domena iz kojeg su izvedene.
[0210] CAR mogu da sadrže tri domena, zajedno u obliku fuzionog proteina. Takvi fuzioni proteini će uopšteno sadržati vezujući domen, jedan ili više ko-stimulatornih domena, i aktivacioni signalni domen, vezane u smeru od N-terminusa ka C-terminusu. Međutim, CAR nisu ograničeni na ovaj aranžman i ostali aranžmani su prihvatljivi i uključuju vezujući domen, aktivacioni signalni domen, i jedan ili više ko-stimulatorna domena. To podrazumeva da će pošto vezujući domen mora biti slobodan da veže antigen, postavljanje vezujućeg domena u fuzionom proteinu generalno biti takvo da se postiže prikaz regiona na spoljnoj strani ćelije. U istom maniru, pošto ko-stimulatorni domeni i aktivacioni signalni domeni služe da indukuju aktivnost i proliferaciju citotoksičnih limfocita, fuzioni protein će generalno prikazati ova dva domena u unutrašnjosti ćelije. CAR mogu da uključuju dodatne elemente, kao što je signalni peptid da se obezbedi pravilan eksport fuzionog proteina na površinu ćelija, transmembranski domen da se obezbedi održavanje fuzionog proteina kao integralnog membranskog proteina, i zglobni domen (ili region razmaka (spacer region)) koji daje fleksibilnost vezujućem domenu i omogućava snažno vezivanje za antigen.
[0211] Ćelije koje se upotrebljavaju u vezi sa CAR sistemom ovog pronalaska su poželjno T ćelije, posebno citotoksični limfociti, poželjno odabrani od citotoksičnih T ćelija, ćelija prirodnih ubica (NK), i ćelija ubica aktiviranih limfokinom (LAK). Nakon aktivacije, svaki od ovih citotoksičnih limfocita pokreće uništenje ciljnih ćelija. Na primer, citotoksične T ćelije pokreću uništavanje ciljnih ćelija na bilo koji ili oba sledeća načina. Prvo, nakon aktivacije T ćelije oslobađaju citotoksine kao što su perforin, granzimi, i granulizin. Perforin i granulizin stvaraju pore u ciljnoj ćeliji, i granzimi ulaze u ćeliju i pokreću kaspaznu kaskadu u citoplazmi koja indukuje apoptozu (programirana ćelijska smrt) ćelije. Drugo, apoptoza se može indukovati putem Fas-Fas ligand interakcije između T ćelija i ciljnih ćelija. Citotoksični limfociti će poželjno biti autologne ćelije, iako heterologne ćelije ili alogenske ćelije mogu budi upotrebljene.
[0212] Različiti postupci se mogu upotrebiti za uvođenje CAR konstrukata u T ćelije uključujući ne-virusno zasnovanu DNK transfekciju, transpozonski-zasnovane sisteme i virusno-zasnovane sisteme. Ne-virusno zasnovana DNK transfekcija ima mali rizik od insercione mutageneze. Transpozonski-zasnovani sistemi mogu integrisati transgene efikasnije od plazmida koji ne sadrže integrišući element. Virusno-zasnovani sistemi uključuju upotrebu γ-retrovirusa i lentivirusnih vektora. γ-Retroviruse je relativno lako proizvesti, efikasno i trajno transdukuju T ćelije, i preliminarno su dokazano sigurni sa stanovišta integracije u primarne humane T ćelije. Lentivirusni vektori takođe efikasno i trajno transdukuju T ćelije ali su skuplji za proizvodnju. Takođe su potencijalno sigurniji od sistema zasnovanih na retrovirusima.
[0213] Ovde opisana RNK (npr. dobijena upotrebom ovde opisanog molekula nukleinske kiseline kao transkripcione matrice) takođe je korisna za reprogramiranje ili de- diferencijaciju somatskih ćelija u ćelije nalik matičnim, tj. ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije, in vitro ili in vivo. Ovo može uključivati prolaznu ekspresiju faktora reprogramiranja in vitro ili in vivo kako bi se pokrenuli postupci reprogramiranja ili de-diferencijacije u ćelijama. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, peptid ili protein kodiran nukleinskom kiselinom kao što je ovde opisana RNK je faktor koji omogućava reprogramiranje somatskih ćelija do ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije. Ćelije nalik matičnim se mogu obezbediti u skladu sa pronalaskom bez generisanja embriona ili fetusa. De-diferencijacija somatskih ćelija do ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije, posebno pluripotentnost, može se postići uvođenjem kodirajućih faktora RNK koji indukuju de-diferencijaciju somatskih ćelija u somatske ćelije (za koje se takođe upotrebljava termin transkripcioni faktori reprogramiranja (rTF) i kultivacijom somatskih ćelija omogućavajući ćelijama da se de-diferenciraju. Nakon što se de-diferenciraju, ćelije se mogu indukovati da se re-diferenciraju u isti ili različiti tip somatskih ćelija poput neuronskih, hematopoetskih, mišićnih, epitelskih, i druge tipove ćelija. Prema tome, takve ćelije nalik matičnim imaju medicinsku primenu za lečenje degenerativnih bolesti pomoću "ćelijske terapije" i mogu se koristiti u novim terapijskim strategijama u lečenju srčanih, neuroloških, endokrinoloških, vaskularnih, retinalnih, dermatoloških, mišićno-skeletnih poremećaja, i drugih bolesti.
[0214] Shodno tome, pronalazak se takođe odnosi na postupak za obezbeđivanje ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije koji sadrži korake (i) obezbeđivanja ćelijske populacije koja sadrži somatske ćelije, (ii) uvođenja RNK ovog pronalaska sposobne da eksprimira jedan ili više faktora koji omogućavaju reprogramiranje somatskih ćelija u ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije u somatske ćelije, i (iii) omogućavanja razvoja ćelija koje imaju karakteristike
4
matične ćelije. U jednom primeru izvođenja, postupak dalje sadrži uvođenje miRNK u somatske ćelije koja pojačava reprogramiranje somatskih ćelija u ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije.
[0215] U jednom primeru izvođenja, jedan ili više faktora sadrže OCT4 i SOX2. Jedan ili više faktora mogu dalje da sadrže KLF4 i/ili c-MYC i/ili NANOG i/ili LIN28. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više faktora sadrže OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC i mogu dalje da sadrže LIN28 i opciono NANOG. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više faktora sadrže OCT4, SOX2, NANOG i LIN28.
[0216] U jednom primeru izvođenja, postupak dalje sadrži korak kultivacije somatskih ćelija u prisustvu najmanje jednog inhibitora deacetilaze histona, pri čemu najmanje jedan inhibitor histon deacetilaze poželjno sadrži valproičnu kiselinu, natrijum butirat, trihostatin A i/ili skriptaid.
[0217] U jednom primeru izvođenja, korak (iii) sadrži kultivaciju somatskih ćelija u uslovima kulture embrionalne matične ćelije.
[0218] U jednom primeru izvođenja, karakteristike matične ćelije sadrže morfologiju embrionalne matične ćelije.
[0219] U jednom primeru izvođenja, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije imaju normalne kariotipove, eksprimiraju telomeraznu aktivnost, eksprimiraju markere ćelijske površine koji su karakteristični za embrionalne matične ćelije i/ili eksprimiraju gene koji su karakteristični za embrionalne matične ćelije.
[0220] U jednom primeru izvođenja, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije pokazuju pluripotentno stanje.
[0221] U jednom primeru izvođenja, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije imaju razvojni potencijal da se diferenciraju u napredne derivate sva tri primarna klicina lista.
[0222] U jednom primeru izvođenja, somatske ćelije su fibroblasti kao što su fibroblasti pluća, fibroblasti prepucijuma ili dermalni fibroblasti. Poželjno, somatske ćelije su humane ćelije.
[0223] U jednom primeru izvođenja, RNK se uvodi u somatske ćelije elektroporacijom ili lipofekcijom. U jednom primeru izvođenja, RNK se uvodi u somatske ćelije repetitivno.
[0224] U jednom primeru izvođenja, uvođenje RNK koja može eksprimirati određene faktore kao što je ovde objavljeno u somatske ćelije rezultira ekspresijom navedenih faktora tokom dužeg vremenskog perioda, poželjno tokom najmanje 10 dana, poželjno tokom najmanje 11 dana i poželjnije tokom najmanje 12 dana. Da bi se postigla takva dugoročna ekspresija, poželjno je da se RNK periodično (tj. repetitivno) uvodi u ćelije više od jednog puta, poželjno upotrebljavajući elektroporaciju. Poželjno, RNK se uvodi u ćelije najmanje dva puta, poželjnije najmanje 3 puta, poželjnije najmanje 4 puta, još poželjnije najmanje 5 puta do poželjno 6 puta, poželjnije do 7 puta ili čak do 8, 9 ili 10 puta, poželjno tokom vremenskog perioda od najmanje 10 dana, poželjno najmanje 11 dana i poželjnije najmanje 12 dana da bi se osigurala ekspresija jednog ili više faktora tokom dužeg vremenskog perioda. Poželjno je da su vremenski periodi koji proteknu između ponovljenih uvođenja RNK od 24 sata do 120 sati, poželjno 48 sati do 96 sati. U jednom primeru izvođenja, vremenski periodi koji proteknu između ponovljenih uvođenja RNK nisu duži od 72 sata, poželjno nisu duži od 48 sati ili 36 sati. U jednom primeru izvođenja, pre sledeće elektroporacije, ćelijama je omogućeno da se oporave od prethodne elektroporacije. U bilo kom slučaju, uslove treba odabrati tako da se faktori eksprimiraju u ćelijama u količinama i tokom vremenskih perioda koji podržavaju postupak reprogramiranja.
[0225] "Matična ćelija" je ćelija sa sposobnošću da se samo-obnavlja, ostane nediferencirana, i da postane diferencirana. Matična ćelija može se deliti bez ograničenja, tokom najmanje životnog veka životinje u kojoj prirodno boravi. Matična ćelija nije terminalno diferencirana; nije u krajnjoj fazi puta diferencijacije. Kada se matična ćelija deli, svaka ćerka ćelija može ili ostati matična ćelija ili krenuti putem koji vodi ka terminalnoj diferencijaciji.
[0226] Totipotentne matične ćelije su ćelije koje imaju svojstva totipotentne diferencijacije i koje su sposobne da se razviju u kompletan organizam. Ovo svojstvo imaju ćelije do 8-ćelijske faze nakon fertilizacije oocite spermom. Kada se ove ćelije izoluju i transplantiraju u matericu, one se mogu razviti u kompletan organizam.
[0227] Pluripotentne matične ćelije su ćelije sposobne da se razviju u različite ćelije i tkiva izvedena iz ektodermalnih, mezodermalnih i endodermalnih slojeva. Pluripotentne matične ćelije koje su izvedene iz unutrašnje ćelijske mase koja se nalazi unutar blastocista, nastale 4-5 dana nakon fertilizacije nazivaju se "embrionalne matične ćelije" i mogu se diferencirati u ćelije različitih drugih tkiva ali ne mogu formirati nove žive organizme.
[0228] Multipotentne matične ćelije su matične ćelije koje se normalno diferenciraju samo u tipove ćelija koji su specifični za njivo tkivo i organ od kog su potekle. Multipotentne matične ćelije učestvuju ne samo u rastu i razvoju različitih tkiva i organa tokom fetalnog, neonatalnog i adultnog perioda već i u održavanju homeostaze adultnog tkiva i funkciji indukujuće regeneracije nakon oštećenja tkiva. Tkivno-specifične multipotentne ćelije kolektivno se nazivaju "adultne matične ćelije".
[0229] "Embrionalna matična ćelija" ili "ESC" je matična ćelija koja je prisutna u embrionu ili je izolovana iz embriona. Ona može biti pluripotentna, imajući kapacitet da se diferencira u svaku ćeliju koja postoji u organizmu, ili multipotentna, sa sposobnošću diferencijacije u više od jednog tipa ćelije.
[0230] Kako se ovde upotrebljava, "embrion" se odnosi na životinju u ranim stadijumima njenog razvoja. Ovi stadijumi su okarakterisani implantacijom i gastrulacijom, gde su tri klicina lista
4
definisana i uspostavljena i diferencijacijom klicinih listova u odgovarajuće organe i sisteme organa. Tri klicina lista su endoderm, ektoderm i mezoderm.
[0231] "Blastocist" je embrion u ranom stadijumu razvoja u kojoj je oplođeno jajašce pretrpelo brazdanje, i sferični sloj ćelija koji okružuje šupljinu ispunjenu tečnošću se formira, ili je formiran. Ovaj sferični sloj ćelija je trofektoderm. Unutar trofektoderma je klaster ćelija koji se naziva unutrašnja ćelijska masa (ICM). Trofektoderm je prekursor placente, i ICM je prekursor embriona.
[0232] Adultna matična ćelija, koja se takođe naziva i somatska matična ćelija, je matična ćelija koja se nalazi kod adulta. Adultna matična ćelija je pronađena u diferenciranom tkivu, može se samo-obnavljati, i može se diferencirati, uz određena ograničenja, dajući specijalizovane tipove ćelija tkiva od kog potiče. Primeri uključuju mezenhimske matične ćelije, hematopoetske matične ćelije, i nervne matične ćelije.
[0233] "Diferencirana ćelija" je zrela ćelija koja je doživela progresivne razvojne promene ka specijalizovanijem obliku ili funkciji. Ćelijska diferencijacija je proces koji ćelija prolazi kako sazreva u jasno specijalizovan ćelijski tip. Diferencirane ćelije imaju posebne karakteristike, obavljaju specifične funkcije, i manje je verovatno da se dele od svojih manje diferenciranih pandana.
[0234] "Nediferencirana" ćelija, na primer, nezrela, embrionalna, ili primitivna ćelija, obično ima nespecifičan izgled, može da obavlja višestruke, nespecifične aktivnosti, i može da obavlja loše, ako uopšte može, funkcije koje obično obavljaju diferencirane ćelije.
[0235] "Somatska ćelija" označava bilo koju i sve diferencirane ćelije i ne uključuje matične ćelije, germinativne ćelije ili gamete. Poželjno, "somatska ćelija" kako se ovde upotrebljava odnosi se na terminalno diferenciranu ćeliju.
[0236] Kao što se ovde upotrebljava, "opredeljene" označava ćelije za koje se smatra da su trajno opredeljene specifičnoj funkciji. Opredeljene ćelije se takođe označavaju kao "krajnje diferencirane ćelije".
[0237] Kao što se ovde upotrebljava, "diferencijacija" označava adaptaciju ćelija za određeni oblik ili funkciju. U ćelijama, diferencijacija dovodi do više opredeljene ćelije.
[0238] Kao što se ovde upotrebljava, "de-diferencijacija" označava gubitak specijalizacije u obliku ili funkciji. U ćelijama, de-diferencijacija dovodi do manje opredeljene ćelije.
[0239] Kao što se ovde upotrebljava, "reprogramiranje" označava resetovanje genetskog programa ćelije. Reprogramirana ćelija poželjno pokazuje pluripotentnost.
[0240] Termini "de-diferencirani" i "reprogramirani" ili slični termini se ovde upotrebljavaju naizmenično za označavanje ćelija izvedenih od somatske ćelije sa karakteristikama matične
4
ćelije. Međutim, navedeni termini nisu namenjeni da ograniče temu ovde objavljenu mehaničkim ili funkcionalnim aspektima.
[0241] Termin "RNK koja indukuje razvoj karakteristika matične ćelije" ili "RNK sposobna da eksprimira jedan ili više faktora koji omogućavaju reprogramiranje somatskih ćelija u ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije" označava RNK koja kada se uvodi u somatsku ćeliju indukuje ćeliju da se de-diferencira.
[0242] Kao što se ovde upotrebljava, "germinativna ćelija" označava reproduktivnu ćeliju kao što je spermatocita ili oocita, ili ćeliju koja će se razviti u reproduktivnu ćeliju.
[0243] Kao što se ovde upotrebljava, "pluripotentne" označava ćelije koje mogu dati bilo koji tip ćelije osim ćelija placente ili druge potporne ćelije materice.
[0244] Termini kao što su "ćelija koja ima karakteristike matične ćelije", "ćelija koja ima svojstva matične ćelije" ili "ćelija slična matičnoj" se ovde upotrebljavaju za označavanje ćelija koje, iako su izvedene iz diferenciranih somatskih ne-matičnih ćelija, pokazuju jednu ili više odlika tipičnih za matične ćelije, posebno embrionalne matične ćelije. Takve karakteristike uključuju morfologiju embrionalne matične ćelije kao što su kompaktne kolonije, visoki odnos nukleusa prema citoplazmi i istaknute nukleoluse, normalne kariotipove, ekspresiju telomerazne aktivnosti, ekspresiju ćelijskih površinskih markera koji su karakteristični za embrionalne matične ćelije, i/ili ekspresiju gena koji su karakteristični za embrionalne matične ćelije. Ćelijski površinski markeri koji su karakteristični za embrionalne matične ćelije su, na primer, odabrani iz grupe koja se sastoji od embrionalnog antigena-3 specifičnog za stadijum (SSEA-3), SSEA-4, tumor-povezanog antigena-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81, i TRA-2-49/6E. Geni koji su karakteristični za embrionalne matične ćelije su odabrani, na primer, iz grupe koja se sastoji od endogenog OCT4, endogenog NANOG, faktora rasta i diferencijacije 3 (GDF3), smanjene ekspresije 1 (REX1), faktora rasta fibroblasta 4 (FGF4), specifičnog gena za embrionalnu ćeliju 1 (ESG1), povezan sa razvojnom pluripotentnošću 2 (DPPA2), DPPA4, i reverzne transkriptaze telomeraze (TERT). U jednom primeru izvođenja, jedna ili više odlika tipičnih za matične ćelije uključuju pluripotentnost.
[0245] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, karakteristike matičnih ćelija sadrže morfologiju embrionalne matične ćelije, pri čemu navedena morfologija embrionalne matične ćelije poželjno sadrži morfološke kriterijume odabrane iz grupe koja se sastoji od kompaktnih kolonija, visokog odnosa nukleusa prema citoplazmi i istaknutih nukleolusa. U određenim primerima izvođenja, ćelije koje imaju karakteristike matičnih ćelija imaju normalne kariotipove, eksprimiraju telomeraznu aktivnost, eksprimiraju ćelijske površinske markere koji su karakteristični za embrionalne matične ćelije i/ili eksprimiraju gene koji su karakteristični za embrionalne matične ćelije. Ćelijski površinski markeri koji su karakteristični za embrionalne
4
matične ćelije mogu biti odabrani iz grupe koja se sastoji od embrionalnog antigena-3 specifičnog za stadijum (SSEA-3), SSEA-4, tumor-povezanog antigena-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81, i TRA-2-49/6E i geni koji su karakteristični za embrionalne matične ćelije mogu biti odabrani iz grupe koja se sastoji od endogenog OCT4, endogenog NANOG, faktora rasta i diferencijacije 3 (GDF3), smanjene ekspresije 1 (REX1), faktora rasta fibroblasta 4 (FGF4), specifičnog gena za embrionalnu ćeliju 1 (ESG1), povezan sa razvojnom pluripotentnošću 2 (DPPA2), DPPA4, i reverzne transkriptaze telomeraze (TERT).
[0246] Poželjno, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije su de-diferencirane i/ili reprogramirane somatske ćelije. Poželjno, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije pokazuju suštinske karakteristike embrionalne matične ćelije kao što je pluripotentno stanje. Poželjno, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije imaju razvojni potencijal da se diferenciraju u napredne derivate sva tri osnovna klicina lista. U jednom primeru izvođenja, osnovni klicin list je endoderm i napredni derivat je epitelno tkivo nalik crevu. U daljem primeru izvođenja, osnovni klicin list je mezoderm i napredni derivat je prugasti mišić i/ili hrskavica. U još daljem primeru izvođenja, osnovni klicin list je ektoderm i napredni derivat je nervno tkivo i/ili epidermalno tkivo. U jednom poželjnom primeru izvođenja, ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije imaju razvojni potencijal da se diferenciraju u ćelije neurona i/ili srčane ćelije.
[0247] U jednom primeru izvođenja, somatske ćelije su somatske ćelije sa mezenhimskim fenotipom izvedene iz embrionalne matične ćelije. U poželjnom primeru izvođenja, somatske ćelije su fibroblasti kao što su fetalni fibroblasti ili postnatalni fibroblasti ili keratinociti, poželjno keratinociti koji potiču iz folikula dlake. U daljim primerima izvođenja, fibroblasti su fibroblasti pluća, fibroblasti prepucijuma ili dermalni fibroblasti. U posebnim primerima izvođenja, fibroblasti su fibroblasti deponovani u Američkoj zbirci tipova kultura (ATCC) pod kataloškim br. CCL-186, deponovani u Američkoj zbirci tipova kultura (ATCC) pod kataloškim br. CRL-2097 ili deponovani u Američkoj zbirci tipova kultura (ATCC) pod kataloškim br. CRL-2522, ili kako ih distribuira System Biosciences pod kataloškim br. PC501A-HFF. U jednom primeru izvođenja, fibroblasti su adultni humani dermalni fibroblasti. Poželjno, somatske ćelije su humane ćelije. U skladu sa ovim pronalaskom, somatske ćelije mogu biti genetski modifikovane.
[0248] Termin "faktor" u skladu sa pronalaskom kada se upotrebljava zajedno sa njegovom ekspresijom od strane RNK uključuje proteine i peptide kao i njihove derivate i varijante. Na primer, termin "faktor" sadrži OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 i c-MYC.
[0249] Faktori mogu biti od bilo koje životinjske vrste; npr. sisari i glodari. Primeri sisara uključuju ali nisu ograničeni na ljude i primate koji nisu ljudi. Primati uključuju ali nisu ograničeni na ljude, šimpanze, babune, cinomolgus majmune, i bilo koje druge majmune novog
4
ili starog sveta. Glodari uključuju ali nisu ograničeni na miša, pacova, zamorca, hrčka i skočimiša.
[0250] U skladu sa ovim pronalaskom, jedan ili više faktora koji mogu da omoguće reprogramiranje somatskih ćelija u ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije sadrže skup faktora odabranih iz grupe koja se sastoji od (i) OCT4 i SOX2, (ii) OCT4, SOX2, i jednog ili oba od NANOG i LIN28, (iii) OCT4, SOX2 i jednog ili oba od KLF4 i c-MYC. U jednom primeru izvođenja, navedeni jedan ili više faktora koje može eksprimirati RNK sadrže OCT4, SOX2, NANOG i LIN28 ili OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC. Poželjno, RNK se uvodi u navedene somatske ćelije elektroporacijom ili mikroinjekcijom. Poželjno, pronalazak dalje sadrži omogućavanje razvoja ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije, npr. kultivacijom somatske ćelije u uslovima kulture embrionalne matične ćelije, poželjno uslovima pogodnim za održavanje pluripotentnih matičnih ćelija u nediferenciranom stanju.
[0251] OCT4 je transkripcioni faktor eukariotskih POU transkripcionih faktora i pokazatelj pluripotentnosti embrionalne matične ćelije. To je majčinski eksprimirani oktomer vezujući protein. Primećeno je da je prisutan u oocitama, unutrašnjoj ćelijskoj masi blastocita i takođe u primordijalnoj germinativnoj ćeliji. Gen POU5F1 kodira OCT4 protein. Sinonimi za naziv gena uključuju OCT3, OCT4, OTF3 i MGC22487. Prisustvo OCT4 u specifičnim koncentracijama je neophodno da bi embrionalne matične ćelije ostale nediferencirane. Poželjno, "OCT4 protein" ili jednostavno "OCT4" se odnosi na humani OCT4.
[0252] Sox2 je član Sox (HMG boks povezan sa SRY) porodice gena koji kodira transkripcione faktore sa jednim HMG DNK-vezujućim domenom. Otkriveno je da SOX2 kontroliše nervne progenitorske ćelije tako što inhibira njihovu sposobnost da se diferenciraju. Suzbijanje faktora rezultira delaminacijom iz ventrikularne zone, nakon čega sledi izlazak iz ćelijskog ciklusa. Ove ćelije takođe počinju da gube svoj progenitorski karakter gubitkom progenitorskih i markera rane nervne diferencijacije. Poželjno, "SOX2 protein" ili jednostavno "SOX2" se odnosi na humani SOX2.
[0253] NANOG je homeodomenski gen tipa NK-2, za koji je predloženo da igra ključnu ulogu u održavanju pluripotentnosti matične ćelije verovatno regulisanjem ekspresije gena kritičnih za obnavljanje i diferencijaciju embrionalne matične ćelije. NANOG se ponaša kao aktivator transkripcije sa dva neobično jaka aktivaciona domena koja su ugrađena u njegov C terminus. Smanjenje ekspresije NANOG indukuje diferencijaciju embrionalnih matičnih ćelija. Poželjno, "NANOG protein" ili jednostavno "NANOG" se odnosi na humani NANOG.
[0254] LIN28 je konzervirani citoplazmatski protein sa neobičnim sparivanjem RNK-vezujućih motiva: domen hladnog šoka i par cinkanih prstiju CCHC retrovirusnog tipa. Kod sisara, on je obilat u različitim vrstama nediferenciranih ćelija. U pluripotentnim ćelijama sisara, LIN28 je
4
primećen u RNaza-osetljivim kompleksima sa poli(A)-vezujućim proteinom, i u polizomskim frakcijama gradijenta saharoze, što sugeriše da je povezan sa translacijom iRNK. Poželjno, "LIN28 protein" ili jednostavno "LIN28" se odnosi na humani LIN28.
[0255] Kruepel-sličan faktor (KLF4) je transkripcioni faktor cinkanog-prsta, koji se snažno eksprimira u postmitotičkim ćelijama epitela različitih tkiva, npr. kolona, želuca i kože. KLF4 je neophodan za terminalnu diferencijaciju ovih ćelija i uključen je u regulaciju ćelijskog ciklusa. Poželjno, "KLF4 protein" ili jednostavno "KLF4" se odnosi na humani KLF4.
[0256] MYC (cMYC) je protoonkogen, koji je prekomerno eksprimiran u širokom spektru humanih kancera. Kada je specifično-mutiran, ili prekomerno eksprimiran, povećava proliferaciju ćelija i funkcioniše kao onkogen. MYC gen kodira transkripcioni faktor koji reguliše ekspresiju 15% svih gena vezivanjem na sekvence pojačivača (E-boxes) i regrutovanjem histon acetiltransferaza (HAT). MYC pripada porodici MYC transkripcionih faktora, koja takođe uključuje N-MYC i L-MYC gene. Transkripcioni faktori MYC porodici sadrže domen bHLH/LZ (osnovni spirala-petlja-spirala leucinski zatvarač). Poželjno, "cMYC protein" ili jednostavno „cMYC" se odnosi na humani cMYC.
[0257] Pozivanje ovde na specifične faktore kao što su OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 ili c-MYC treba shvatiti tako da uključuje sve varijante ovih faktora. Posebno, treba shvatiti tako da uključuje sve varijante obrade, posttranslaciono modifikovane varijante, konformacije, izoforme i homologe vrsti tih faktora koje ćelije prirodno eksprimiraju.
[0258] Termin "miRNK" (mikroRNK) odnosi se na 21-23-nukleotida-dugačke nekodirajuće RNK koje se nalaze u eukariotskim ćelijama koje, indukujući degradaciju i/ili sprečavajući translaciju ciljnih iRNK, modulišu mnoštvo ćelijskih funkcija, uključujući one povezane sa ESC samoobnavljanjem/diferencijacijom i napredovanjem ćelijskog ciklusa. miRNK su posttranskripcioni regulatori koji se vezuju za komplementarne sekvence na ciljne RNK transkripte (iRNK), obično rezultirajući translacionom represijom ili degradacijom cilja i utišavanjem gena. Utvrđeno je da su miRNK u pravoj kombinaciji sposobne da indukuju direktno ćelijsko reprogramiranje somatskih ćelija u ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije in vitro. Na primer, primećeno je da miRNK klaster 302-367 pojačava reprogramiranje somatske ćelije.
[0259] Poželjno, korak omogućavanja razvoja ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije sadrži kultivaciju somatskih ćelija u uslovima kulture embrionalne matične ćelije, poželjno uslovima pogodnim za održavanje pluripotentnih matičnih ćelija u nediferenciranom stanju.
[0260] Poželjno, da bi se omogućio razvoj ćelija koje imaju karakteristike matične ćelije, ćelije se kultivišu u prisustvu jednog ili više inhibitora DNK metiltransferaze i/ili jednog ili više inhibitora deacetilaze histona. Poželjna jedinjenja su odabrana iz grupe koja se sastoji od 5'-azacitidina (5'-azaC), suberoilanilid-hidroksamske kiseline (SAHA), deksametazona, trihostatina A (TSA), natrijum butirata (NaBu), Skriptaida i valproične kiseline (VPA). Poželjno, ćelije se kultivišu u prisustvu valproične kiseline (VPA), poželjno u koncentraciji između 0,5 i 10 mM, poželjnije između 1 i 5 mM, najpoželjnije u koncentraciji od oko 2 mM.
[0261] Postupci ovog pronalaska mogu se upotrebljavati za postizanje dediferencijacije bilo kog tipa somatske ćelije. Ćelije koje se mogu upotrebljavati uključuju ćelije koje se mogu dediferencirati ili reprogramirati postupcima ovog pronalaska, posebno ćelije koje su u potpunosti ili delimično diferencirane, poželjnije terminalno diferencirane. Poželjno, somatska ćelija je diploidna ćelija izvedena iz pre-embrionalnih, embrionalnih, fetalnih, i post-natalnih višećelijskih organizama. Primeri ćelija koje se mogu upotrebljavati uključuju ali nisu ograničeni na fibroblaste, kao što su fetalni i neonatalni fibroblasti ili adultni fibroblasti, keratinocite, posebno primarni keratinociti, poželjnije keratinociti dobijeni iz dlake, masne ćelije, ćelije epitela, epidermalne ćelije, hondrocite, ćelije kumulusa, nervne ćelije, glijalne ćelije, astrocite, ćelije srca, ćelije jednjaka, mišićne ćelije, melanocite, hematopoetske ćelije, osteocite, makrofage, monocite, i mononuklearne ćelije.
[0262] Ćelije sa kojima se mogu upotrebljavati postupci pronalaska mogu biti bilo koje životinjske vrste; npr. sisara i glodara. Primeri ćelija sisara koje se mogu de-diferencirati i rediferencirati ovim pronalaskom uključuju ali nisu ograničeni na ćelije ljudi i primata koji nisu ljudi. Ćelije primata sa kojima pronalazak može biti izveden uključuju ali nisu ograničene na ćelije ljudi, šimpanzi, babuna, cinomolgus majmuna, i bilo koje druge majmune novog ili starog sveta. Ćelije glodara sa kojima pronalazak može biti izveden uključuju ali nisu ograničene na ćelije miša, pacova, zamorca, hrčka i skočimiša.
[0263] Očekuje se da će de-diferencirane ćelije pripremljene u skladu sa ovim pronalaskom pokazati mnoge od istih zahteva kao pluripotentne matične ćelije i da se mogu proširiti i održavati u uslovima koji se upotrebljavaju za embrionalne matične ćelije, npr. ES ćelijski medijum ili bilo koji medijum koji podržava rast embrionalnih ćelija. Embrionalne matične ćelije zadržavaju svoju pluripotentnost in vitro kada se održavaju na inaktiviranim fetalnim fibroblastima kao što su ozračeni embrionalni fibroblasti miša ili humani fibroblasti (npr. fibroblasti humanog prepucijuma, fibroblasti humane kože, fibroblasti humanog endometrijuma, fibroblasti humanog ovidukta) u kulturi. U jednom primeru izvođenja, humane hraniteljske (feeder) ćelije mogu biti autologne hraniteljske ćelije dobijene iz iste kulture reprogramiranih ćelija direktnom diferencijacijom.
[0264] Osim toga, humane embrionalne matične ćelije mogu se uspešno razmnožavati na Matrigelu u medijumu kondicioniranim mišjim fetalnim fibroblastima. Humane matične ćelije mogu se uzgajati u kulturi tokom dužeg vremenskog perioda i ostati nediferencirane u specifičnim uslovima kulture.
1
[0265] U nekim primerima izvođenja, uslovi ćelijske kulture mogu uključivati kontakt ćelija sa faktorima koji mogu inhibirati diferencijaciju ili na drugi način potencirati de-diferencijaciju ćelija, npr. sprečiti diferencijaciju ćelija u ne-ES ćelije, trofektoderm ili druge ćelijske tipove.
[0266] De-diferencirane ćelije pripremljene u skladu sa ovim pronalaskom mogu se proceniti postupcima koji uključuju praćenje promena u fenotipu ćelija i karakterizacijom njihove ekspresije gena i proteina. Ekspresija gena može se odrediti RT-PCR-om, i proizvodi translacije se mogu odrediti imunocitohemijom i Vestern blotom. Posebno, de-diferencirane ćelije se mogu karakterisati da bi se odredio obrazac ekspresije gena i da li reprogramirane ćelije prikazuju obrazac ekspresije gena sličan obrascu ekspresije koji se očekuje od nediferenciranih, pluripotentnih kontrolnih ćelija kao što su embrionalne matične ćelije upotrebom tehnika dobro poznatih u struci uključujući transkriptomiku.
[0267] Ekspresija sledećih gena de-diferenciranih ćelija može se proceniti u tom pogledu: OCT4, NANOG, faktor rasta i diferencijacije 3 (GDF3), smanjena ekspresija 1 (REX1), faktor rasta fibroblasta 4 (FGF4), specifični gen za embrionalnu ćeliju 1 (ESG1), povezan sa razvojnom pluripotentnošću 2 (DPPA2), DPPA4, reverzna transkriptaza telomeraze (TERT), embrionalni antigen-3 (SSEA-3), SSEA-4, tumor-povezani antigen-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81, i TRA- 2-49/6E.
[0268] Nediferencirane ili embrionalne matične ćelije sa kojima se reprogramirane ćelije mogu uporediti mogu biti iz iste vrste kao i diferencirane somatske ćelije. Alternativno, nediferencirane ili embrionalne matične ćelije sa kojima se reprogramirane ćelije mogu uporediti mogu biti iz drugačije vrste u odnosu na diferencirane somatske ćelije.
[0269] U nekim primerima izvođenja, sličnost u obrascu ekspresije gena postoji između reprogramirane ćelije i nediferencirane ćelije, npr. embrionalne matične ćelije, ako su određeni geni specifično eksprimirani u nediferenciranoj ćeliji takođe eksprimirani u reprogramiranoj ćeliji. Na primer, određeni geni, npr. telomeraza, koji se obično ne mogu detektovati u diferenciranim somatskim ćelijama mogu se upotrebiti za praćenje obima reprogramiranja. Isto, za određene gene, odsustvo ekspresije se može upotrebiti za procenu obima reprogramiranja.
[0270] Kapacitet samoobnavljanja, obeležen indukcijom aktivnosti telomeraze, je još jedna karakteristika matičnih ćelija koja se može pratiti u de-diferenciranim ćelijama.
[0271] Kariotipska analiza se može izvršiti raspršivanjem hromozoma iz mitotskih ćelija, spektralnom kariotipizacijom, testovima dužine telomera, ukupnom genomskom hibridizacijom, ili drugim tehnikama dobro poznatim u struci.
[0272] Upotrebom ovog pronalaska, RNK koja kodira odgovarajuće faktore je ugrađena u jednu ili više somatskih ćelija, npr. elektroporacijom. Posle ugrađivanja ćelije se poželjno kultivišu upotrebom uslova koji podržavaju održavanje de-diferenciranih ćelija (tj. uslovi kulture matične
2
ćelije). De-diferencirane ćelije zatim mogu biti proširene i indukovane da se re-diferenciraju u različite tipove somatskih ćelija koje su potrebne za ćelijsku terapiju. De-diferencirane ćelije dobijene u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti indukovane da se diferenciraju u jedan ili više željenih tipova somatske ćelije in vitro ili in vivo.
[0273] Poželjno, de-diferencirane ćelije dobijene u skladu sa ovim pronalaskom mogu dati ćelije bilo kog od tri embrionalna klicina lista, tj. endoderma, mezoderma, i ektoderma. Na primer, dediferencirane ćelije mogu se diferencirati u skeletni mišić, skelet, derm kože, vezivno tkivo, urogenitalni sistem, srce, krv (limfne ćelije), i slezinu (mezoderm); želudac, kolon, jetru, pankreas, mokraćnu bešiku; oblogu uretre, epitelne delove traheje, pluća, farings, tiroideu, paratiroideu, creva (endoderm); ili centralni nervni sistem, mrežnjaču i sočiva, kranijalne i senzore, ganglije i nerve, pigmentne ćelije, vezivno tkivo glave, epiderm, dlaku, mlečne žlezde (ektoderm). De-diferencirane ćelije dobijene u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti rediferencirane in vitro ili in vivo upotrebom tehnika poznatih u struci.
[0274] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, reprogramirane ćelije proistekle iz postupaka ovog pronalaska upotrebljavaju se za proizvodnju diferenciranog potomstva. Tako, u jednom aspektu, ovaj pronalazak daje postupak za proizvodnju diferenciranih ćelija, koji sadrži: (i) dobijanje reprogramiranih ćelija upotrebom postupaka ovog pronalaska; i (ii) indukovanje diferencijacije reprogramiranih ćelija da proizvode diferencirane ćelije. Korak (ii) se može izvesti in vivo ili in vitro. Osim toga, diferencijacija se može indukovati prisustvom odgovarajućih faktora diferencijacije koji mogu ili da se dodaju ili su prisutni in situ, npr. u telu, organu ili tkivu u koji su uvedene reprogramirane ćelije. Diferencirane ćelije se mogu upotrebiti za dobijanje ćelija, tkiva i/ili organa koji se na pogodan način upotrebljavaju u oblasti transplantacije ćelija, tkiva i/ili organa. Po želji, genetske modifikacije se mogu uvesti, na primer, u somatske ćelije pre reprogramiranja. Diferencirane ćelije ovog pronalaska poželjno ne poseduju pluripotentnost embrionalne matične ćelije, ili embrionalne germinativne ćelije, i, u suštini su, tkivno-specifične delimično ili potpuno diferencirane ćelije.
[0275] Jedna prednost postupaka ovog pronalaska je ta što se reprogramirane ćelije dobijene ovim pronalaskom mogu diferencirati bez prethodne selekcije ili prečišćivanja ili uspostavljanja ćelijske linije. U skladu sa tim u nekim primerima izvođenja, heterogena populacija ćelija koja sadrži reprogramirane ćelije je diferencirana u željeni ćelijski tip. U jednom primeru izvođenja, smeša ćelija dobijena postupcima ovog pronalaska je izložena jednom ili više faktora diferencijacije i kultiviše se in vitro.
[0276] Postupci diferenciranja reprogramiranih ćelija dobijenih ovde objavljenim postupcima mogu sadržati korak permeabilizacije reprogramirane ćelije. Na primer, ćelije generisane ovde opisanim tehnikama reprogramiranja, ili alternativno heterogena smeša ćelija koja sadrži reprogramirane ćelije, može biti permeabilizovana pre izlaganja jednom ili više faktora diferencijacije ili ekstraktu ćelije ili drugom preparatu koji sadrži faktore diferencijacije.
[0277] Na primer, diferencirane ćelije mogu se dobiti kultivacijom nediferenciranih reprogramiranih ćelija u prisustvu najmanje jednog faktora diferencijacije i odabirom diferenciranih ćelija iz kulture. Odabir diferenciranih ćelija može biti zasnovan na fenotipu, kao što je ekspresija određenih ćelijskih markera prisutnih na diferenciranim ćelijama, ili funkcionalnim testovima (npr. sposobnost obavljanja jedne ili više funkcija određenog diferenciranog ćelijskog tipa).
[0278] U drugom primeru izvođenja, ćelije reprogramirane u skladu sa ovim pronalaskom su genetski modifikovane adicijom, delecijom, ili modifikacijom njihove(ih) DNK sekvence(i).
[0279] Reprogramirane ili de-diferencirane ćelije pripremljene u skladu sa ovim pronalaskom ili ćelije izvedene iz reprogramiranih ili de-diferenciranih ćelija su korisne u istraživanjima i u terapiji. Reprogramirane pluripotentne ćelije mogu biti diferencirane u bilo koju od ćelija u telu uključujući, bez ograničenja, ćelije kože, hrskavice, kosti skeletnog mišića, srčanog mišića, renalne, hepatične, krvi i krvotvornih, vaskularnog prekursora i vaskularnog endotela, pankreasne beta, neurona, glije, mrežnjače, nervne, intestinalne, pluća, i jetre.
[0280] Reprogramirane ćelije su korisne za regenerativnu/reparativnu terapiju i mogu se transplantirati pacijentu kojem je to potrebno. U jednom primeru izvođenja, ćelije su autologne sa pacijentom.
[0281] Reprogramirane ćelije dobijene u skladu sa ovim pronalaskom mogu se upotrebljavati, na primer, u terapijskim strategijama u lečenju srčanih, neuroloških, endokrinoloških, vaskularnih, retinalnih, dermatoloških, mišićno-skeletnih poremećaja, i drugih bolesti.
[0282] Na primer, i nije zamišljeno kao ograničenje, reprogramirane ćelije ovog pronalaska mogu se upotrebljavati za obnavljanje ćelija kod životinja čije su prirodne ćelije istrošene zbog starosti ili ablacione terapije kao što su radioterapija i hemoterapija protiv kancera. U drugom neograničavajućem primeru, reprogramirane ćelije ovog pronalaska su korisne u regeneraciji organa i popravci tkiva. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, reprogramirane ćelije se mogu upotrebljavati da se ponovo ojača oštećeno mišićno tkivo uključujući distrofične mišiće i mišiće oštećene ishemijskim događajima kao što su infarkti miokarda. U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, reprogramirane ćelije ovde objavljene mogu se upotrebljavati za ublažavanje formiranja ožiljaka kod životinja, uključujući ljude, nakon traumatične povrede ili operacije. U ovom primeru izvođenja, reprogramirane ćelije ovog pronalaska se primenjuju sistemski, kao što je intravenski, i migriraju na mesto sveže traumatizovanog tkiva regrutovane cirkulišućim citokinima koje sekretuju oštećene ćelije. U drugom primeru izvođenja ovog
4
pronalaska, reprogramirane ćelije mogu se primenjivati lokalno na mestu za lečenje kojem je potrebna ili popravka ili regeneracija.
[0283] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, nukleinske kiseline kao što je RNK se primenjuju na pacijenta ex vivo postupcima, tj. uklanjanjem ćelija iz pacijenta, genetskom modifikacijom navedenih ćelija i ponovnim uvođenjem modifikovanih ćelija u pacijenta. Postupci transfekcije i transdukcije su poznati stručnim radnicima.
[0284] Termin "transfekcija" se odnosi na uvođenje nukleinskih kiselina, posebno RNK, u ćeliju. U svrhe ovog pronalaska, termin "transfekcija" takođe uključuje uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju ili preuzimanje nukleinske kiseline od strane takve ćelije, pri čemu ćelija može biti prisutna u subjektu, npr. pacijentu. Dakle, u skladu sa ovim pronalaskom, ćelija za transfekciju nukleinske kiseline koja je ovde opisana može biti prisutna in vitro ili in vivo, npr. ćelija može da formira deo organa, tkiva i/ili organizma pacijenta. U skladu sa pronalaskom, transfekcija može biti prolazna ili stabilna. Za neke primene transfekcije, dovoljno je ako se transfektovani genetski materijal samo prolazno eksprimira. Pošto nukleinska kiselina uvedena postupkom transfekcije obično nije integrisana u nukleusni genom, strana nukleinska kiselina biće razblažena kroz mitozu ili degradovana. Ćelije koje omogućavaju epizomalnu amplifikaciju nukleinskih kiselina veoma smanjuju stopu razblaženja. Ako je poželjno da transfektovana nukleinska kiselina zapravo ostane u genomu ćelije i njenim ćerkama ćelijama, mora se dogoditi stabilna transfekcija. RNK se može transfektovati u ćelije da prolazno eksprimira svoj kodirani protein.
[0285] U skladu sa ovim pronalaskom, bilo koja tehnika korisna za uvođenje, tj. transfer ili transfekciju, nukleinske kiseline u ćelije može se upotrebljavati. Poželjno, RNK se transfektuje u ćelije standardnim tehnikama. Takve tehnike uključuju elektroporaciju, lipofekciju i mikroinjekciju. U jednom naročito poželjnom primeru izvođenja ovog pronalaska, RNK se uvodi u ćelije elektroporacijom. Elektroporacija ili elektropermeabilizacija se odnosi na značajno povećanje električne provodljivosti i propustljivosti ćelijske plazma membrane prouzrokovane eksterno primenjenim električnim poljem. Obično se upotrebljava u molekularnoj biologiji kao način uvođenja neke supstance u ćeliju. U skladu sa pronalaskom poželjno je da uvođenje nukleinske kiseline koja kodira protein ili peptid u ćelije rezultira ekspresijom navedenog proteina ili peptida.
[0286] U skladu sa pronalaskom, nukleinske kiseline mogu biti usmerene ka određenim ćelijama. U takvim primerima izvođenja, nosač upotrebljen za primenu nukleinske kiseline ćeliji (npr. retrovirus ili lipozom) može imati vezan ciljni molekul. Na primer, molekul kao što je antitelo specifično za protein površine membrane na ciljnoj ćeliji, ili ligand za receptor na ciljnoj ćeliji može biti inkorporisan u ili vezan za nosač nukleinske kiseline. Ako je primena nukleusne kiseline lipozomima poželjna, proteini koji se vezuju za protein površine membrane povezan sa endocitozom mogu biti inkorporisani u formulaciju lipozoma kako bi se omogućilo ciljanje i/ili apsorpcija. Takvi proteini uključuju kapsid proteine ili njihove fragmente koji su specifični za određeni tip ćelije, antitela na proteine koji se internalizuju, proteine koji ciljaju intracelularno mesto, i slične.
[0287] "Reporter" se odnosi na molekul, tipično peptid ili protein, koji je kodiran reporterskim genom i meren u reporterskom testu. Uobičajeni sistemi obično koriste enzimski reporter i mere aktivnost navedenog reportera.
[0288] Termin "mesto višestrukog kloniranja" označava region nukleinske kiseline koji sadrži mesta za restrikcione enzime, bilo koje od njih se može upotrebiti za isecanje, na primer, vektora i inseriranje nukleinske kiseline.
[0289] U skladu sa pronalaskom, dva elementa kao što su nukleotidi ili aminokiseline su uzastopna, ako su direktno jedan uz drugi, bez ikakvog prekida. Na primer, sekvenca x uzastopnih nukleotida N označava sekvencu (N)x.
[0290] "Restrikciona endonukleaza" ili "restrikcioni enzim" označava klasu enzima koji isecaju fosfodiestarske veze u oba lanca DNK molekula unutar sekvenci specifičnih baza. Oni prepoznaju specifična vezujuća mesta, označena kao sekvence za prepoznavanje, na dvolančanom molekulu DNK. Mesta na kojima se fosfodiestarske veze u DNK isecaju pomoću navedenih enzima označena su kao mesta isecanja. U slučaju enzima tipa IIS, mesto isecanja se nalazi na definisanoj udaljenosti od DNK vezujućeg mesta. U skladu sa pronalaskom, termin "restrikciona endonukleaza" sadrži, na primer, enzime SapI, EciI, BpiI, AarI, AloI, BaeI, BbvCI, PpiI i PsrI, BsrD1, BtsI, EarI, BmrI, BsaI, BsmBI, FauI, BbsI, BciVI, BfuAI, BspMI, BseRI, EciI, BtgZI, BpuEI, BsgI, MmeI, CspCI, BaeI, BsaMI, Mva1269I, PctI, Bse3DI, BseMI, Bst6I, Eam1104I, Ksp632I, BfiI, Bso31I, BspTNI, Eco31I, Esp3I, BfuI, Acc36I, AarI, Eco57I, Eco57MI, GsuI, AloI, Hin4I, PpiI, i PsrI.
[0291] Termin "stabilnost" RNK se odnosi na "poluživot" RNK. "Poluživot" se odnosi na vremenski period koji je potreban za eliminaciju polovine aktivnosti, količine, ili broja molekula. U kontekstu ovog pronalaska, poluživot RNK je indikativan za stabilnost navedene RNK.
[0292] Nukleinske kiseline kao što je ovde opisana RNK, posebno kada se upotrebljavaju za ovde opisane tretmane, mogu biti prisutne u obliku farmaceutske kompozicije ili kita koji sadrži nukleinsku kiselinu i opciono jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenata.
[0293] Farmaceutske kompozicije su poželjno sterilne i sadrže efikasnu količinu nukleinske kiseline.
[0294] Farmaceutske kompozicije su obično date u uniformnom obliku za doziranje i mogu se pripremiti na način poznat u struci. Farmaceutska kompozicija može, npr., biti u obliku rastvora ili suspenzije.
[0295] Farmaceutska kompozicija može da sadrži soli, puferske supstance, konzervanse, nosače, razblaživače i/ili ekscipijente koji su svi poželjno farmaceutski prihvatljivi. Termin "farmaceutski prihvatljiv" označava netoksičnost materijala koji ne ometa dejstvo aktivne(ih) komponente(i) farmaceutske kompozicije.
[0296] Soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu se upotrebljavati za proizvodnju farmaceutski prihvatljivih soli i uključene su u pronalazak. Farmaceutski prihvatljive soli ove vrste sadrže, na ne-ograničavajući način, one pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske, jantarnih kiselina, i sličnih. Farmaceutski prihvatljive soli se takođe mogu pripremiti kao soli alkalnog metala ili soli zemnoalkalnog metala, kao što su natrijumove soli, kalijumove soli ili kalcijumove soli.
[0297] Pogodne puferske supstance za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji uključuju sirćetnu kiselinu u soli, limunsku kiselinu u soli, bornu kiselinu u soli i fosfornu kiselinu u soli.
[0298] Pogodni konzervansi za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji uključuju benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.
[0299] Termin "nosač" označava organsku ili neorgansku komponentu, prirodne ili ne-prirodne (sintetičke) prirode, sa kojom se aktivna komponenta kombinuje da bi se olakšala, poboljšala ili omogućila primena. U skladu sa pronalaskom, termin "nosač" takođe uključuje jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih filera, razblaživača ili inkapsulirajućih supstanci, koje su pogodne za primenu pacijentu.
[0300] Moguće supstance nosači za parenteralnu primenu su, npr., sterilna voda, rastvori glukoze, Ringer, Ringer laktat, sterilni rastvor natrijum hlorida, polialkilen glikoli, hidrogenizovani naftaleni i, posebno, biokompatibilni laktidni polimeri, laktid/glikolidni kopolimeri ili polioksietilen/polioksi-propilenski kopolimeri.
[0301] Termin "ekscipijent" kada se ovde upotrebljava ima namenu da označi sve supstance koje mogu biti prisutne u farmaceutskoj kompoziciji i koje nisu aktivni sastojci, kao što su, npr., nosači, veziva, lubrikanti, zgušnjivači, površinski aktivni agensi, konzervansi, emulgatori, puferi, arome, ili boje.
[0302] Ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu se primenjivati bilo kojim uobičajenim putem, kao što je parenteralna primena uključujući injekciju ili infuziju. Primena je poželjno parenteralna, npr. intravenska, intraarterijalna, subkutana, u limfni čvor, intradermalna ili intramuskularna.
[0303] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obično sadrže sterilni vodeni ili ne-vodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je poželjno izotoničan sa krvlju primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, obično sterilna, fiksirana ulja se upotrebljavaju kao medijum rastvora ili suspenzije.
[0304] Ovde opisani agensi i kompozicije su poželjno primenjeni u efikasnim količinama. "Efikasna količina" označava količinu koja postiže željenu reakciju ili željeni efekat sama ili zajedno sa daljim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo sadrži usporavanje napretka bolesti i, posebno, prekidanje ili preokretanje napretka bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti ili stanja takođe može biti odlaganje početka ili sprečavanje nastanka navedene bolesti ili navedenog stanja.
[0305] Efikasna količina ovde opisanog agensa ili kompozicije zavisiće od stanja koje se tretira, težine bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući godine, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje lečenja, vrstu prateće terapije (ako postoji), specifičnog načina primene i sličnih faktora. Prema tome, primenjene doze ovde opisanih agenasa mogu zavisiti od više ovih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna sa početnom dozom, više doze (ili efikasno više doze postignute različitim, lokalizovanijim putem primene) mogu se upotrebljavati.
[0306] Ovaj pronalazak je detaljno opisan sledećim slikama i primerima koje bi trebalo tumačiti samo kao ilustraciju i ne kao ograničenje. Na osnovu opisa i primera, dalji primeri izvođenja su dostupni stručnjaku i takođe su unutar obima pronalaska.
Slike
[0307]
Slika 1: Pregled in vivo postupka selekcije
Da bi se pripremila početna biblioteka, uzgajane su humane nezrele dendritske ćelije u prisustvu Aktinomicina D, inhibitora transkripcije, tokom pet sati da bi se odabrale stabilne RNK. Preostala ćelijska iRNK je ekstrahovana i prečišćena upotrebom Poly(A) Purist Kit (Ambion) i potom fragmentisana sa Nuclease P1 (Roche). Za to, 10 μg RNK je inkubirano 45 min sa 0,3 U NP-1 u 8 μL 50 mM NaAc pufera (pH 5,5) u ukupnoj reakcionoj zapremini od 24 μL. Posle prečišćavanja sa RNeasy kolonama (Qiagen) fragmenti su bili spremni da budu reverzno transkribovani u cDNK. Sinteze prvog i drugog lanca izvršene su upotrebom i prateći protokol RevertAid Premium 1st strand kompleta za sintezu cDNK (Fermentas) i heksamer-prajmera sa definisanom sekvencom prajmera i NotI-restrikcionim mestom. Da bi se popunili 5ꞌ-prepusti i uklonili 3ꞌ- prepusti, cDNK je zatim inkubirana sa 12,5 U T4 DNK polimerazom tokom 5 min na 15 °C. Reakcija je prekinuta dodavanjem 5 μL 0,5 mM EDTA, pH 8,0 i cDNK je prečišćena upotrebom NucleoBond kolona (Macherey-Nagel). Digestija cDNK-biblioteke sa NotI (NEB) dao je fragmente sa tupim i lepljivim krajem. Fragmenti su dodatno izabrani po veličini pomoću gel preparata kako bi se osiguralo uklanjanje svih fragmenata manjih 150 bps. Za kloniranje biblioteke vektor kao što je prikazano na panelu A je digestovan sa EcoRV i NotI ostavljajući tup i lepljiv kraj respektivno. U sledećem koraku izvršena je ligacija biblioteke u vektor upotrebom T4 DNK ligaze (Fermentas). Ligaciona smeša direktno je upotrebljena kao matrica za PCR kako je dato u Tab. 4 upotrebom Phusion™ Hot Start High-Fidelity DNK polimeraze (Finnzymes). Nakon prečišćavanja, PCR-proizvod je upotrebljen kao matrica za T7-transkripciju kao što je prikazano u Tab.5. Inkubacija je rađena na 37 °C. Nakon svakih 30 min dodato je 0,75 μL 100 mM GTP u reakciju. Reakcija je zaustavljena nakon 2,5h dodavanjem TURBO DNaze (2U/μL, Ambion) i inkubiranjem tokom još 15 min na 37 °C. Reakcija je konačno očišćena putem RNeasy kolona (Qiagen). RNK-biblioteka bi mogla tada da se upotrebi za postupak selekcije započinjući sa elektroporacijom RNK u hiDC kao što je prethodno opisano (Kuhn et al, 2010). Posle kultivacije za selekciju, ekstrakcija i prečišćavanje RNK su izvršene upotrebom RNeasy kolona (Qiagen) i prateći uputstva proizvođača. RNK je potom upotrebljena kao matrica za sintezu cDNK upotrebom Superscript II Reverzne transkriptaze (Invitrogen) i prateći uputstva proizvođača i dT18-prajmera. cDNK je zatim upotrebljena kao matrica za PCR kao što je gore opisano. Konačno, PCR proizvodi bi mogli da se upotrebe kao matrica za T7- transkripciju (videti gore) za početak sledećeg kruga selekcije (panel B). Kontrole kvaliteta DNK/cDNK i RNK uzoraka su urađeni putem agaroznog gela i AGILENT 2100 bioanalizatora, respektivno. Slika 2: Šema izgleda uzorka unutar luc2CPmut-vektora
(A) Jedan element ili dva (uzvodni i nizvodni) elementa klonirani su kao 3ꞌ-UTR-ovi u vektor kao što je dato. Prikazani su i kontrolni uzorci NEG (negativna kontrola bez inseriranja 3'UTR), hBg i 2hBg. Priprema RNK za krugove selekcije. (B) Za elektroporaciju u hiDC vektor je upotrebljen kao matrica za PCR upotrebom izduženih prajmera koji sadrže T7-promotor i poli(A)-rep. PCR-proizvod je zatim upotrebljen kao matrica za T7-in vitro sintezu da se dobije odgovarajuća IVT-RNK.
Slika 3: Uticaj selektovanih sekvenci na stabilnost RNK koje kodiraju luc2CPmut Rezultati pokazuju aktivnost luciferaze, polu-život i ukupni protein tokom vremena RNK koje sadrže selektovane sekvence kao 3' UTR u poređenju sa našim zlatnim standardom 2hBg nakon elektroporacije u humane nezrele dendritske ćelije (NEG je kao što je definisano na Sl. 2). Gornji panel prikazuje vremenske tokove tri uzorne RNK sa 3' UTR kao što je naznačeno. U donjem levom panelu, polu-život RNK sa respektivnim 3' UTR kao što je naznačeno u odnosu na RNK sa 2hBg je prikazan. Slično tome, relativna ekspresija ukupnog proteina u poređenju sa RNK sa 2hBG je data u donjem desnom panelu.
Slika 4: Reprezentativna aktivnost luciferaze upotrebom luc2mut kao reporterskog gena i novoselektovanih 3ꞌ-UTR Nakon elektroporacije RNK sa 3' UTR-ovima kao što je naznačeno u humane nezrele dendritske ćelije, merena je aktivnost luciferaze tokom 72h. Slika 5: Reprezentativni rezultati elektroporacije sa IVT-RNK u fibroblaste
levi panel: vektor zasnovan na luc2CPmut. desni panel: vektor zasnovan na luc2mut Slika 6: Reprezentativni rezultati elektroporacije sa IVT-RNK u T ćelije
Levi panel daje relativnu ekspresiju ukupnog proteina RNK sa FI 3' UTR u poređenju sa RNK sa 2hBG u CD4+ i CD8+ T ćelijama. Slično tome, relativna efikasnost translacije i poluživot iRNK RNK sa FI 3' UTR u poređenju sa RNK sa 2hBG u CD4+ i CD8+ T ćelijama dat je u srednjem i u desnom panelu, respektivno.
Slika 7: RNK arhitektura i integritet za testiranje RNK sa modifikovanim nukleotidima A: RNK upotrebljene u testovima luciferaze konstruisane su kako je ovde prikazano. Kao 5' kapa upotrebljen je β-S-ARCA(D2). Kao 5'UTR upotrebljen je 5'UTR humanog alfa globina, uključujući Kozak sekvencu. Posle gena luciferaze svica (Firefly Luciferase gene), klonirana su dva 3'UTR koja se porede. Kao poliA-rep, upotrebljena je sekvenca A30L70.
B: Pre transfekcije, RNK su proverene na njihov integritet na 2100 Bioanalizatoru (Agilent). Sve RNK su imale dovoljno visok i uporediv integritet pa su stoga mogle da se upotrebe u eksperimentima.
Slika 8: Uticaj FI 3' UTR na stabilnost i funkcionalnost RNK in vivo
Luciferaza i gp70 iRNK koja sadrži FI 3'UTR ili 2hBg 3'UTR formulisane su sa F12 i primenjene i.v. u BALB/c miševe. Nakon primene iRNK luciferaze, ekspresija je praćena nakon 6h i 24h; gp70 iRNK je primenjena na dan 0 i dan 6 i imunska aktivacija je analizirana dana 10 putem CD8 i gp70 tet bojenja.
A) Pokazuje nivoe ekspresije luciferaze 6h i 24h posle injekcije nemodifikovane i m1Y modifikovane iRNK koja sadrži FI 3'UTR ili 2hBg 3'UTR. I nemodifikovana i m1Y modifikovana iRNK luciferaze koja sadrži FI 3'UTR pokazuju uporedive nivoe ekspresije kao i odgovarajuća iRNK koja sadrži 2hBg 3'UTR.
B) Prikazuje procenat gp70-specifičnih CD8 T ćelija kao odgovor na gp70 iRNK koja sadrži FI 3'UTR ili 2hBg 3'UTR. Dva 3'UTR deluju podjednako dobro u indukovanju antigen-specifičnog imuniteta posle dve imunizacije, uz značajno povećanje antigen-specifičnih CD8 T ćelija u slezini onih miševa koji su primili gp70 iRNK koja sadrži FI 3'UTR.
Statistika: Jednosmerna ANOVA i Takijev (Tukey's) post test, * p<0,05.
Slika 9: Uticaj stabilizirajućih UTR na stabilnost samo-replicirajuće RNK Destabilizovana luciferaza (Luc2CP) klonirana je neposredno uzvodno od 3' konzerviranog elementa sekvence samo-replicirajuće (replikonske) RNK izvedene od ne-citotoksičnog virusa Semliki šume. Replikonska RNK pripremljena je in vitro transkripcijom iz odgovarajućeg linearizovanog plazmida i elektroporirana u ćelije. Ekspresija luciferaze bila je merena dodavanjem luminescentnog supstrata tokom 96h do 120h. (A) Vremenski tok ekspresije luciferaze u reprezentativnom eksperimentu sa BHK21 ćelijama. (B) Vremenski tok ekspresije luciferaze u reprezentativnom eksperimentu sa fibroblastima humanog prepucijuma (HFF). Da bi se smanjila citotoksičnost oslobođenih interferona tipa I, iRNK vakcinija virusa B18R kotransfektovana je u svaki uzorak. Da bi se inhibirala aktivacija protein kinaze R i povećao ukupni nivo translacije, iRNK vakcinija virusa E3 kotransfektovana je u svaki uzorak.
Slika 10: Homologi nizovi u FI elementu.
Predviđeno je da se podvučeni nizovi sekvence međusobno sparuju. Za konstrukt "8nt mutacije", prvi element je mutiran u aaagggcu da bi se poremetile interakcije sa drugim elementom.
Slika 11: Artefakti u IVT zasnovanoj na PCR- matrici u upotrebom 2hBgUTR.
A: Šematski prikaz stvaranja IVT matrice putem PCR-a. 5' prajmer se vezuje uzvodno od promotora T7, 3' prajmer sadrži 120nt poliA rep i vezuje se za plazmidno kodiran poliA i deo 3'UTR. U slučaju 2hBgUTR, može doći do pogrešnog sparivanja prajmera vezivanjem za prvi ponovak. B: PCR proizvodi iz plazmida koji sadrži 2hBgUTR. Crvena strelica prikazuje sporedni proizvod, koji predstavlja skraćeni 1hBg. C: RNK transkribovana iz takvog PCR proizvoda tako takođe predstavlja i skraćeni nus-proizvod (strelica). D: PCR proizvodi iz plazmida koji sadrži FI element kao 3'UTR. Nije vidljiv nijedan sporedni proizvod. E: Rezultirajuća iRNK je očekivano visokog integriteta bez dodatnih sporednih pikova.
Slika 12: Šematski prikaz skraćenih UTR elemenata i polu-života odgovarajućih iRNK konstrukata.
Gornji panel slike A pokazuje šematski prikaz skraćenih UTR elemenata u odnosu na pozicije nukleinske kiseline sekvence pune dužine F-elementa SEQ ID NO: 86 pokrivene
1
tim skraćenim varijantama. Donji panel slike A pokazuje relativni polu-život iRNK koja sadrži skraćeni UTR u odnosu na iRNK koja sadrži sekvencu pune dužine F-elementa SEQ ID NO: 86. iRNK koje kodiraju reporterske luciferaze su elektroporirane u hiDC i njihova ekspresija je praćena tokom vremena merenjima luciferaze radi određivanja relativnog polu-života RNK.
Gornji panel slike B pokazuje šematski prikaz skraćenih UTR elemenata u odnosu na pozicije nukleinske kiseline sekvence pune dužine I-elementa SEQ ID NO: 115 pokrivene tim skraćenim varijantama. Donji panel slike B pokazuje relativni polu-život iRNK koja sadrži skraćeni UTR u odnosu na iRNK koja sadrži sekvencu pune dužine I-elementa SEQ ID NO: 115. iRNK koje kodiraju reporterske luciferaze su elektroporirane u hiDC i njihova ekspresija je praćena tokom vremena merenjima luciferaze radi određivanja relativnog polu-života RNK.
Slika 13: Relativni polu-život i ekspresija proteina iz iRNK konstrukata koji sadrže F, I ili FI elemenate prema nasumičnim UTR-ovima.
Slika 13 prikazuje relativni polu-život i ekspresiju proteina iz iRNK konstrukata koji sadrže F, I ili FI elemenate prema nasumičnim UTR-ovima. Za ovo su upoređeni pojedinačni F i I elementi pune dužine kao i FI kombinacija prema nasumičnom 3' UTR (257nt u dužini). Svi elementi su klonirani u luciferaza-kodirajuće konstrukte, in vitro transkribovani u iRNK, elektroporirani u hiDC, ekspresija luciferaze je merena tokom vremena, i izračunati su relativni polu-životi i ekspresija ukupnog proteina.
Slika 14: UTR elementi za ćelijsko reprogramiranje.
Slika 14A prikazuje hronologiju za reprogramiranje primarnih fibroblasta humanog prepucijuma. 40.000 ćelija je zasejano na ploču sa 12 bunarčića i lipofektovane su tri (3x) ili četiri (4x) uzastopna dana sa iRNK smešama koje su bile sačinjene od 0,33 μg nemodifikovane in vitro transkribovane (IVT)-RNK koja kodira reprogramiranje TF OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG i LIN28 (OSKMNL) (1:1:1:1:1:1) sa 0,08 μg od svakog B18R, E3 i K3 (EKB) i 0,17 μg miRNK smeše sačinjene od miRNK 302a-d i 367 (1:1:1:1:1:1). RNK-konstrukti time su se razlikovali samo u svom 3'UTR koji se sastoji od tandemskog ponovka 3'UTR humanog β-globina (2hBg), F-I-elementa (FI) ili I-F-elementa (IF). Od dana 9 nadalje posmatrano je formiranje kolonija i analiza kolonija izvedena je na d11.
Slika 14B prikazuje bojenje alkalnom fosfatazom (AP) utvrđenih kolonija i slika 14C prikazuje odgovarajući histogram koji predstavlja izbrojane brojeve AP pozitivnih kolonija.
2
Slika 14D prikazuje morfologiju rezultujućih kolonija iPS-ćelije upotrebom RNK koje sadrže FI-UTR. Bila je hES ćeliji-slična sa gusto napakovanim malim ćelijama u različitim kolonijama i dobro definisanim granicama.
Slika 14E prikazuje kolonije pripremljene kao kod D obojene pozitivno na AP na uveličanju od četiri i deset puta.
Slika 14F prikazuje kolonije pripremljene kao kod D pri živom bojenju hES ćelijskog površinskog markera TRA-1-60.
Slika 14G prikazuje iRNK-ekspresiju hES-markera OCT4 (endogeni), NANOG (endogeni), LIN28 (endogeni), TERT i REX1 koja je procenjena peletiranjem kolonija, izolovanjem ukupne RNK i kvantifikacijom pomoću qRT-PCR.
Primeri
Primer 1: Identifikacija elemenata sekvence koji stabilizuju iRNK
[0308] Da bismo identifikovali nove elemente sekvence koji stabilizuju iRNK, razvili smo in vivo postupak selekcije upotrebom hiDC kao selektivnog okruženja za in vitro transkribovanu RNK. Početna RNK-biblioteka je izgrađena upotrebom iRNK sekvenci koje se prirodno javljaju izvedenih iz hiDC. Pre izolacije RNK, ćelije su uzgajene 5 sati u prisustvu inhibitora transkripcije Aktinomicina D (ActD) da bi se preselektovale stabilne RNK. Preostala iRNK je zatim ekstrahovana i redukovana na fragmente od 200-800 nukleotida, reverzno transkribovana, i klonirana kao 3'-UTR u vektor koji nosi hAg 5'UTR sekvencu i reporterski gen, koji je odabran kao osnova postupka selekcije. Upotrebljena DNK matrica za naknadnu transkripciju biblioteka iRNK amplifikovana je putem PCR, tokom koje je T7 promotor uveden putem 5'- i A60 poliA-rep putem 3' prajmera. Transkribovana iRNK je tada uvedena u in vivo postupak selekcije, koji se sastoji od nekoliko krugova in vitro transkripcije biblioteke, elektroporacije odgovarajućih RNK u hiDC, i ekstrakcije i amplifikacije stabilnih sekvenci nakon definisanih vremenskih tačaka. Amplifikacija selektovanih sekvenci je izvedena putem PCR sa specifičnim prajmerima, nakon sinteze cDNK. Dobijeni PCR proizvodi su kasnije upotrebljeni kao matrice za novu iRNK biblioteku. To je urađeno tokom šest krugova, uz izdvajanje preostalih RNK posle 24 sata u krugu 1, 48 sati u krugovima 2 i 3, 72 sata u krugovima 4 i 5, i na kraju 96 sati kao i jedne i dve nedelje u krugu 6 (nakon elektroporacije, ćelije su podeljene u tri dela i zatim pojedinačno sakupljene u datim vremenskim tačkama).
[0309] Praćenje postupka selekcije nakon krugova 1 do 5 pokazalo je značajno povećanje prosečnog polu-života odgovarajućeg RNK pula, što je indikativno za obogaćivanje stabilizirajućih 3'-UTR-elemenata (Tab. 1). Ipak, povećanje stabilnosti je bilo manje izraženo kod viših krugova. Stoga je postupak selekcije bio zaustavljen nakon finalnog šestog kruga, u kome je RNK ekstrahovana iz ćelija posle 96 sati, jedne nedelje, i dve nedelje. Da bi se okarakterisale selektovane sekvence, sekvencionirano je više od 350 pojedinačnih klonova, 108 iz kruga 5, 88 iz kruga 6/96 sati, 110 iz kruga 6/1 nedelje, i 96 iz kruga 6/2 nedelje. Sve sekvence su upoređene jedna sa drugom kao i BLASTed radi identifikacije njihovog genomskog porekla. Ovde se posebno gledalo, da li su sekvence izvedene iz endogenih 5'- ili 3'-UTR ili iz kodirajućeg regiona. Na kraju, preuzet je njihov nivo ekspresije u hiDC iz NextBio (Illumina). Ukupno, moglo je da se identifikuje sedam grupa, (i) za koje je pronađeno više sekvenci, (ii) koje su potekle od 3'-UTR-ova endogenih RNK ili od endogene nekodirajuće RNK, i (iii) koji su bile jasno eksprimirane u hiDC (Tab. 2). One su izvedene iz sledećih gena: Fc fragmenta IgG, receptora, transportera, alfa (B, FCGRT, NM_001136019), limfocitnog specifičnog proteina 1 (D, LSP1, NM_002339), hemokinskog liganda 22 (E, CCL22, NM_002990), amino-terminalnog pojačivača razdvajanja (F, AES, NM_198969), člana porodice 3 fosfolipaze D (G, PLD3, NM_001031696), mitohondrijski kodirane 12S RNK (I, MT_RNR1, NC_012920), glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II DR beta 4 (J, HLA-DRB4, NM_021983). Imajte na umu da se zbog jednostavnosti velika slova B do I navedena u zagradama u nastavku upotrebljavaju kao skraćenice za ove elemente. Važno je da se u svim slučajevima klonovi za jednu sekvencu razlikuju u svojim tačnim 5'- i 3'- krajevima, pokazujući da oni potiču iz različitih početnih klonova i nisu jednostavno veštački obogaćeni tokom postupka (videti priloge za potpunu listu svih sekvenci identifikovanih u skriningu).
Primer 2: Karakterizacija identifikovanih pojedinačnih elemenata sekvence
[0310] Za karakterizaciju identifikovanih elemenata sekvence izabran je reprezentativni kandidat iz svake grupe (detaljne sekvence su označene u prilogu). Ta sekvenca je zatim klonirana kao 3'-UTR u vektor sa luciferaznim reporterskim genom, čiji se nivo ekspresije može analizirati tokom vremena nakon transfera u ćelije. Prethodno je pokazano da se iz obrasca ekspresije primećenog za protein relativna stabilnost i efikasnost translacije RNK mogu tačno zaključiti (Kuhn 2010 Gene Ther.). Specifični reporter upotrebljen u ovom eksperimentu, luc2CPmut, je destabilizovani oblik luciferaze (Promega). To omogućava detektovanje čak i malih promena u stabilnosti RNK. In vitro transkribovana RNK koja dolazi iz ovih vektora je tada upoređena sa našim zlatnim standardom-iRNK, tj. koja sadrži 2hBg 3'-UTR, u pogledu RNK stabilnosti i efikasnosti translacije. Kao kontrolni uzorci upotrebljene su in vitro transkribovana RNK bez 3'-UTR (tj. koja sadrži samo sekvence koje se upotrebljavaju za kloniranje inserata) i jedna sa samo jednim Beta-globin elementom (lhB).
[0311] Polazeći od vektora koji sadrže UTR, region koji će se transkribovati amplifikovan je PCR-om upotrebom 5' prajmera koji sadrži T7 promotor i 3' prajmera sa poli(A)-repom od 60
4
nukleotida. Izvršeno je čišćenje PCR fragmenata upotrebom AGENCOURT AMPURE XP (Beckman Coulter). U svaku PCR reakciju je dodato 0,6 zapremina perli i pomešano. Posle 15 min inkubacije na RT PCR, PCR proizvodi vezani za perle su odvojeni magnetnim postoljem od viška prajmera, nukleotida, soli, i enzima. Perle su isprane dva puta po 30s sa 80% etanolom kako bi se dalje uklonili kontaminanti. Željeni PCR proizvodi su konačno dva puta eluirani sa 30 μL ddH2O i upotrebljeni kao matrica za in vitro transkripciju odgovarajućih RNK. Za in vitro transkripcije T7 RNK polimeraze (Fermentas), odgovarajući reakcioni pufer i 6 mM NTP su upotrebljeni. Za efikasno dodavanje kape na RNK koncentracija GTP je snižena na 1,5 mM i 6 mM β-S-ARCA(D2) su dodati u reakciju i inkubirani 2,5 h na 37°C. RNK je prečišćena putem karboksilovanih magnetnih perli (Invitrogen) i koncentracija i kvalitet RNK procenjeni su spektrofotometrijom i analizom na 2100 Bionanalizeru (Agilent).
[0312] U skladu sa njihovom identifikacijom u skrining pristupu, sve nove sekvence su pokazale vrlo slične karakteristike u poređenju sa 2hBg u pogledu stabilnosti RNK sa grupom I (mtRNR1) kao najboljom (Slika 3; Tab. 3). Važno je da je svaki pojedinačni element pružio stabilizaciju RNK u poređenju sa RNK bez 3'-UTR pa čak i u poređenju sa RNK sa samo jednom kopijom Beta-globin elementa. Na efikasnost translacije nije bilo značajnog uticaja, kao što je uočeno direktnom korelacijom između stabilnosti RNK i ukupnog proteina eksprimiranog tokom vremena.
Primer 3: Kombinacija pojedinačnih elemenata sekvence
[0313] U daljem eksperimentu, pojedinačne sekvence svake grupe kombinovane su jedna s drugom na par-mudri (pair-wise) način (Slika 2). Obrazloženje iza ovog bilo je naše prethodno zapažanje da je kombinacija dva 3'-UTR-a imala dodatan uticaj na stabilnost i efikasnost translacije RNK (Holtkamp et al.2006). Stabilnost i efikasnost translacije RNK je izračunata u R interpolacijom izmerenih vrednosti luciferaze sa splinom, odakle je najstrmiji nagib uspona definisan kao efikasnost translacije i polu-život signala kao stabilnost. Integral interpoliranog splina se tumači kao ekspresija ukupnog proteina. Klonirano je ukupno 64 kombinacija, tj. sve moguće kombinacije sedam novoidentifikovanih sekvenci i 3'-UTR humanog beta-globina (Tab.
6). Kao što je gore opisano, RNK je bila pripremljena iz ovih DNK matrica, i zatim elektroporirana u hiDC. Kao kontrole, RNK koje sadrže pojedinačne elemente su takođe uključene. Za većinu od sedam novih elemenata primećeno je da najmanje jedna kombinacija sa drugim elementom daje RNK s većom stabilnošću nego sa samo jednim elementom (Tab. 7 do Tab. 13). Zanimljivo je da je u većini slučajeva kombinacija sa I elementom (mtRNR1) povećala polu-život RNK. Ovde, stabilnost RNK bila je generalno još veća u poređenju sa RNK sa 2hBg 3'-UTR (Tab. 7 do Tab. 13). Skoro sve kombinacije imale su pozitivan uticaj na efikasnost translacije RNK. Ukupno, kombinovani efekti na stabilnost RNK i efikasnost translacije rezultuju povećanjem ekspresije ukupnog proteina do 1,74-struko. Tako smo mogli da identifikujemo pojedinačne elemenate (dužine ispod 233 nukleotida) kao i kombinacije dva različita elementa koja daju RNK sa povećanom stabilnošću i/ili efikasnošću translacije, ali istovremeno izbegavajući probleme sa dve identične kopije jednog elementa kao što je opisano gore za 2hBg.
[0314] Da bi verifikovali rezultate dobijene sa destabilizovanim oblikom luciferaze, prethodni eksperimenti su ponovljeni sa RNK koje nose standardnu luciferazu (Promega), i sledećim odabranim 3'-UTR: mtRNR1 (I), mtRNR1-AES (IF), AES-mtRNR1 (FI), mtRNR1-hBg (IhBg) i hBg-mtRNR1 (IhBg). Kao što je prikazano na Slici 4 i Tab. 14, mogu se dobiti ekvivalentni rezultati kao što je gore uočeno, verifikujući da novi elementi, pojedinačno ili u kombinaciji, povećavaju stabilnost iRNK i/ili efikasnost translacije slično kao 2hBg element.
Primer 4: Analiza iRNK koji nose odabrane elemente sekvence u drugim ćelijskim tipovima
[0315] Novoodabrani 3'-UTR-ovi mtRNR1 i AES su takođe testirani u različitim ćelijskim tipovima i ćelijskim linijama da se vidi da li postoji hiDC-specifičnost. Sekvence su testirane na humanim fibroblastima (HFF), mioblastima murina (C2C12) (Slika 5) i T ćelijama (Slika 6) da se proceni da li su one takođe stabilizovane u ovim ćelijama.
[0316] HFF i C2C12 ćelije su sakupljene i pripremljene za elektroporaciju. Zatim je elektroporirano 2,0 μg IVT-RNK zajedno sa 1,0 μg GFP koja kodira RNK koja sadrži naznačene 3'UTR. Posle elektroporacije ćelije su podeljene. 5000 ćelija po bunarčiću raspoređeno je na ploču sa 96 bunarčića u triplikatima u ukupno 7 vremenskih tačaka (2, 4, 8, 24, 48 i 72h) radi merenja aktivnosti luciferaze.2E+05 ćelija po bunarčiću je zasejano u ploče sa 6 bunarčića da bi se sakupile za FACS posle 24 sata (GFP-signal). To je omogućilo praćenje efikasnosti transfekcije. Oni su se razlikovali između 72 i 90% i mogli su biti uključeni u izračunavanje polu-života. Rezultati dobijeni pomoću HFF i C2C12 kao i T ćelija potvrdili su ranije dobijene rezultate sa hiDC. Kombinacija I sa F bila je posebno 2- do 3-struko bolja u polu-životu u poređenju sa 2hBg. Štaviše, FI je pokazao trostruko bolju efikasnost translacije u C2C12 ćelijama i dvostruko bolju proizvodnju proteina tokom vremena u poređenju sa našim zlatnim standardom. Ovi rezultati su pokazali, da I i F nisu hiDC-specifični, već da takođe poboljšavaju stabilnost iRNK i efikasnost translacije u drugim ćelijama.
Primer 5: FI 3 ́UTR povećava ekspresiju sa modifikovane iRNK
[0317] Za neke primene, uključujući terapiju zamene proteina, poželjne su iRNK sa modifikovanim nukleotidima u odnosu na nemodifikovane zbog svoje smanjene imunogenosti (Kariko et al., 2008). Međutim, modifikacije baza mogu imati uticaj na stabilnost iRNK bilo direktnim uticajem na interakciju sa odgovarajućim RNK vezujućim proteinom ili promenom formacije sekundarne strukturne RNK. U skladu sa tim, odabrani 3' UTR-ovi mogu se ponašati drugačije u kontekstu modifikovanih iRNK. Zbog toga smo uporedili kombinaciju F i I sa 2hBgUTR u kontekstu m1Y modifikovane iRNK u hiDC, HFF, CD8+ i CD4+ T-ćelijama i u MEF, C2C12 i bmDC murina. Kao reporter, upotrebljena je luciferaza (videti Sliku 7A za dizajn konstrukta). Za stvaranje modifikovanih iRNK, U je potpuno zamenjen sa m1Y u IVT reakciji. U svim eksperimentima, nemodifikovana RNK je uključena kao kontrola. Integriteti dobijenih iRNK nisu bili afektovani zamenom UTP za mlYTP (Slika 7B). Ćelije su elektroporirane upotrebom podešavanja opisanih u Tab.15, i nivoi luciferaze su mereni na 3, 6, 12, 24, 48, 72 i 96h.
[0318] Elektroporacija nemodifikovane iRNK luciferaze mogla je da reprodukuje ranije viđene efekte: U svim tipovima ćelija FI element je bio jednak ili bolji od 2hBg kontrole u prenošenju stabilnosti RNK (Tab.16A). Dok su u DC murina i humanim T-ćelijama polu-životi iRNK bili uporedivi između dva 3'UTR, FI element je povećao polu-živote iRNK do 1,69-struko u HFF ćelijama. Količina ukupnog proteina povećana je u svim ćelijskim linijama, najviše u HFF ćelijama (2,45-struko).
[0319] Sa modifikovanom iRNK, FI element je takođe doveo do povećanja polu-života iRNK u poređenju sa 2hBg u hiDC, količina ukupnog proteina povećana je više nego dvostruko (Tab.
16B). Rezultati u drugim tipovima ćelija su takođe slični onima koji su dobijeni sa nemodifikovanom iRNK: FI element je bio bolji od 2hBg u svim eksperimentima koji uključuju HFF, MEF i C2C12 ćelije i uporediv u T-ćelijama i DC murina (Tab. 16B). Zbog toga, U modifikacija ne menja sposobnost FI elementa za stabilizaciju iRNK.
Primer 6: FI 3'UTR povećava ekspresiju sa iRNK bez obzira na postupak transfekcije
[0320] Do sada, svi eksperimenti su rađeni sa elektroporacijom kao postupkom transfekcije. Sa elektroporacijom, isporučena iRNK stiže direktno u citoplazmu, zaobilazeći endozomski put usvajanja, kojim se ide prilikom transfekcije putem lipofekcije. Da bismo videli da li FI element takođe funkcioniše u ovim uslovima, ćelije su lipofektovane istim FI i 2hBg koji sadrže iRNK luciferaze kao što je upotrebljeno u prethodnim eksperimentima upotrebljavajući RNAiMAX kao transfekcioni reagens. Takođe nakon lipofekcije, FI element povećao je ekspresiju luciferaze, iako je porast bio manje izražen u poređenju sa eksperimentima gde je RNK isporučena elektroporacijom (Tab. 16C). Stoga, postupak transfekcije nema uticaja na stabilizujući efekat FI elementa.
Primer 7: iRNK koja sadrži FI 3'UTR i 2hBgUTR dovode do uporedive ekspresije proteina i imune aktivacije in vivo.
[0321] Za procenu ekspresije proteina sa iRNK koja sadrži FI 3'UTR in vivo, iste iRNK luciferaze koje sadrže FI i 2hBg kao što su upotrebljene u prethodnim eksperimentima su formulisane sa F12 i primenjene i.v. u BALB/c miševe. Kao što je prikazano na Slici 8, ekspresija luciferaze bila je uporediva za oba 3'UTR-a. Antigen specifični imunski odgovor bio je takođe indukovan u uporedivom obimu, s tim što je uticaj iRNK koja sadrži FI 3'UTR nešto jači u slezini.
Primer 8: IF UTR dovodi do povećane stabilnosti samo-replicirajuće RNK in vitro.
[0322] In vitro transkribovane samo-replicirajuće RNK (replikonska RNK) izvedene iz alfavirusnih genoma moćni su vakcinski vektori. Replikonska RNK kodira na prve dve trećine enzimski kompleks neophodan za citoplazmatsku replikaciju (replikaza) replikonske RNK. Ova replikaza prepoznaje unutrašnju strukturu RNK koja deluje kao subgenomski promotor za replikaza-zavisnu sintezu subgenomskih RNK. Transgeni ili antigeni za vakcinaciju su kodirani na ovoj subgenomskoj RNK koja je značajno kraća od celog replikona. Sveukupno, obe genomska (tj. replikonska RNK pune dužine) i subgenomska RNK liče na ćelijsku iRNK. Obe bočno imaju UTR-ove, obe imaju kape i poliadenilisane su. Enzimi odgovorni za dodavanje kape i poli-adenilaciju nalaze se u replikaza enzimskom kompleksu. Konzervirani elementi sekvence (CSE) unutar UTR-ova – koji se preklapaju sa ORF replikaze u slučaju 5'CSE - potrebni su za vezivanje replikaze i deluju kao promotori sinteze minus lanca (3'CSE) ili sinteze plus-lanca (5'CSE).
[0323] Da bismo procenili da li novi stabilizirajući UTR identifikovan i potvrđen za nereplicirajuće in vitro transkribovane iRNK daje veću stabilnost, i time veću ekspresiju transgena, replikonske RNK, klonirali smo odgovarajuće sekvence u vektore matrice replikonske RNK. Kako 3'CSE treba da se nalazi odmah pored poli-A repa inserirali smo nove UTR-ove odmah uzvodno od 3'CSE replikona koji kodira destabilizovanu luciferazu (Luc2CP). Replikonska RNK sintetisana je in vitro transkripcijom linearizovanih matričnih plazmida sličnih IVT iRNK. Replikonska RNK uvedena je u ćelije (BHK21 i HFF) elektroporacijom, i procenjena je ekspresija luciferaze. Kao što je prikazano na Slici 9, svi inserirani UTR-ovi povećali su translaciju Luc2CP u obe upotrebljene ćelijske linije. Zanimljivo "IF" UTR kombinacija je rezultirala izvanrednim povećanjem translacije.
Primer 9: Nukleotidne zamene do 90% homologije nemaju uticaj na stabilizirajuća svojstva FI elementa
[0324] Zbog postupka selekcije koji je primenjen za identifikaciju novih stabilizirajućih UTR elemenata, dobijene su sekvence u određenom opsegu veličine. Identifikacija istih sekvenci sa produženim 5' i 3' krajevima dala je prvu indikaciju minimalne potrebne dužine. Međutim, minimalni region potreban da svaki element ispolji svoj stabilizirajući efekat može biti i kraći. Pored toga, male varijacije sekvenci mogu i dalje biti funkcionalne, tj. identitet bilo kog pojedinačnog nukleotida možda nije od najveće važnosti za stabilizirajuća svojstva FI elementa. Da se vidi do kog stepena su elementi robusni protiv nukleotidne zamene, 3 'UTR sekvence sa 97,5%, 95,0%, 92,5% i 90,0% homologije prema originalnom FI elementu su ispitivane na ekspresiju ukupnog proteina i polu-život iRNK u hiDC. Nukleotidi koji su promenjeni odabrani su nasumično duž cele dužine sekvence (sekvence 208-211, nasumične modifikacije). iRNK luciferaze sa ovim modifikovanim elementima kao 3'UTR su in vitro transkribovane, elektroporirane u hiDC i njihova ekspresija je praćena tokom vremena merenjima luciferaze nakon 3, 6, 24, 48, i 72h. iRNK luciferaze sa modifikovanim FI elementom dala je istu količinu ukupnog proteina i imala približno isti polu-život (Tab.17).
[0325] Pored nasumičnih supstitucija sa povećanjem stope kako je gore opisano, drugi set modifikovanih FI elemenata je generisan racionalnim uvođenjem nukleotidnih supstitucija koje verovatno mogu poremetiti sekundarnu strukturu FI elementa. Za više prirodnih 3' UTR sekvenci poznato je da je njihova sekundarna struktura važna zato što obezbeđuje vezujuća mesta za regulatorne proteine, koji utiču na stabilnost iRNK (Addess et al., 1997; Putland et al., 2002; Crucs et al., 2000; Adams et al., 2003) Dve 8nt sekvence koje su perfektno komplementarne jedna drugoj su prisutne u FI elementu, jedna u F i druga u I elementu (Slika 10). Sparivanje baza ova dva regiona se takođe može videti u većini mfold predviđanja. mFold (Zuker, 2003) je računarski program koji omogućava predviđanja sekundarne strukture ulaznih sekvenci. Da bi proverili važnost ovog elementa specifične sekundarne strukture, sekvenca je promenjena na način koji ukida sparivanje baza (sekvenca 212, 8nt mutacija). Pored ovih prilično dugih komplementarnih sekvenci, mfold predviđanja za FI 3'UTR pretražena su za strukturne elemente prisutne u većini izlaznih savijanja, zbog čega bi trebalo da postoji velika verovatnoća formiranja in vivo. Nukleotidi koji su učestvovali u sparivanju baza ovih savijanja su promenjeni u 97,5%, 95,0%, 92,5% i 90,0% homologije u odnosu na originalne FI sekvence zamenivši ih sa njihovim partnerima za sparivanje baza, čime zadržavaju sekundarnu strukturu sekvence (sekvence 217-220, modifikacije zadržavanja strukture). Pored toga, iste sekvence su zamenjene na samo jednom lancu dvolančanog dela, time namerno uništavajući sekundarnu strukturu. U tim slučajevima, identičnost prema originalnoj sekvenci je bila 98,75%, 97,50%, 96,25%, i 95,00%, respektivno (sekvence 213-216, modifikacije destabilizovanja strukture).
[0326] RNK luciferaze sa opisanim modifikovanim 3' UTR elementima su in vitro transkribovane, elektroporirane u hiDC i njihova ekspresija je praćena tokom vremena merenjima luciferaze nakon 3, 6, 24, 48 i 72h. Ni sa jednom strategijom modifikacije nikakav značajan uticaj na polu-život iRNK nije se mogao uočiti. Stoga, stabilizirajuća svojstva FI elementa izgleda su robusna na promene u njegovoj nukleotidnoj sekvenci ili sekundarnoj strukturi najmanje do 10,0% različitih nukleotida. Takođe, nije se mogao uočiti pad količine ukupnog proteina nakon modifikacije FI sekvence (Tab.18 A i B).
Primer 10: Upotrebom FI elementa umesto 2hBg izbegava se pogrešno kopiranje u PCR-baziranoj amplifikaciji RNK-kodirajućeg regiona
[0327] Kao što je pokazano, FI element je jednak ili bolji od 2hBg 3'UTR u pogledu stabilnosti iRNK i efikasnosti translacije. Još jedna prednost FI elementa je njegova ne-repetativna sekvenca, dok dve kopije hBg 3ꞌUTR u nekim slučajevima mogu da uzrokuju probleme.
[0328] Ovo je najočiglednije, kada se DNK matrica za RNK transkripciju amplifikuje PCR-om. U takvim slučajevima, poliA-rep pune dužine se dodaje sa 3' prajmer oligo koji se veže na samom 3' kraju 3' UTR (Slika 11 A). U slučaju 2hBgUTR, skraćeni sporedni proizvodi se pojavljuju tokom PCR-a, za koje se nakon sekvenciranja ispostavilo da se sastoje od iRNK sa samo 1hBg ponovkom u UTR (Slika 11B). Nakon transkripcije, skraćenje je takođe vidljivo u iRNK (Slika 11C). Ovaj fenomen se javlja u većini PCR reakcija sa konstruktima koji sadrže 2hBgUTR element i ne može se potpuno ukloniti optimizacijom uključujući temperaturu vezivanja prajmera, kompoziciju pufera, sekvencu prajmera ili alternativne polimeraze. Čak i nakon inseriranja jedinstvene linker sekvence između 3ꞌ UTR i poliA-repa, problem ostaje. Ono što je važno, jačina sporednog pika korelisala je sa prinosom PCR reakcije, što ukazuje na pogrešno kopiranje kratkih skraćenih PCR fragmenata, koji se povećavaju sa svakim PCR ciklusom, kao verovatni uzrok problema. Zbog toga se ne mogu utvrditi zadovoljavajući uslovi za DNK matrice koje kodiraju za RNK sa 2hBg 3ꞌ-UTR.
[0329] Nasuprot tome, PCR DNK matrice sa FI elementom nije dao nikakve skraćene sporedne proizvode (Slika 11 D), i takođe dobijena iRNK nije pokazala nijedan dodatni pik u profilu Bioanalizatora (Slika 11 E). Stoga FI element predstavlja značajno poboljšanje kao 3ꞌUTR u poređenju sa 2hBgUTR u odnosu na integritet PCR matrice i odgovarajući RNK kvalitet.
Primer 11: RNK-stabilizirajuća svojstva subfragmenata F i I elemenata
[0330] Zbog postupka selekcije koji je primenjen za identifikaciju novih stabilizirajućih UTR elemenata, dobijene su sekvence u određenom opsegu veličine. Identifikacija istih sekvenci sa produženim 5' i 3' krajevima dala je prvu indikaciju minimalne potrebne dužine. Međutim, minimalni region potreban da svaki element ispolji svoj stabilizirajući efekat može biti i kraći.
[0331] U tu svrhu, za oba elementa F i I dizajnirano je pet reporterskih konstrukata luciferaze, od kojih svaki sadrži skraćeni UTR koji pokriva različiti fragment originalnog elementa skraćenog na 5' i/ili 3' kraju (videti Sliku 12 gornje panele A i B, respektivno). Ovi reporterski konstrukti transkribovani su in vitro, elektroporirani u hiDC i njihova ekspresija je praćena tokom vremena merenjima luciferaze 3, 6, 24, 48 i 72 h nakon elektroporacije. Rezultirajuće krive ekspresije su analizirane na relativni polu-život RNK sa RNK koja sadrži odgovarajuću punu-dužinu postavljenu na 1 (videti Sliku 12 donje panele A i B, respektivno).
[0332] Za F-element, nije se moglo opaziti značajno smanjenje polu-života iRNK za bilo koje ispitivane subsekvence, što ukazuje na obilnu, ne-kooperativnu uključenost različitih subsekvenci duž F-elementa u njegovoj stabilizirajućoj ulozi. Sličan rezultat mogao se dobiti za I-element, mada se ovde mogao opaziti mali pad performansi kada je samo centralni region (nt37-107) upotrebljen kao 3'UTR.
[0333] Da bi se ovi rezultati stavili u perspektivu, pojedinačni F i I elementi pune dužine kao i FI kombinacija su poređeni sa nasumično odabranim 3' UTR iz početne biblioteke (dužine 257nt) Ovo je dobijeno kloniranjem početnog DNK pula i odabirom jednog nasumičnog klona. Kao što je opisano gore, RNK koje kodiraju luciferazu sa odgovarajućim UTR sekvencama su elektroporirane u hiDC, ekspresija luciferaze je merena tokom vremena, i relativni polu-životi i ekspresija ukupnog proteina su izračunati. U poređenju sa F, I, i FI elementima, RNK sa nasumično selektovanim 3' UTR je značajno manje stabilna (Slika 13, gornji panel). Uticaj selektovanih UTR je još izraženiji za ekspresiju ukupnog proteina (Slika 13, donji panel). Ovo jasno ukazuje da su uticaji fragmenata F i I elemenata opisanih gore specifični za odabrane sekvence i nisu jednostavno uzrokovani prisustvom 3' UTR sekvence. To je u skladu sa uočenim povećanjem stabilnosti RNK pula tokom odabira (videti gore).
Primer 12: Upotreba stabilizirajućih UTR elemenata za reprogramiranje matične ćelije
[0334] 40.000 ćelija je zasejano na ploču sa 12 bunarčića i lipofektovane su tri (3x) ili četiri (4x) uzastopna dana sa iRNK smešama koje su bile sačinjene od 0,33 μg nemodifikovane in vitro transkribovane (IVT)-RNK koja kodira reprogramiranje TF OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG i LIN28 (OSKMNL) (1:1:1:1:1:1) sa 0,08 μg od svakog B18R, E3 i K3 (EKB) i 0,1,7 μg miRNK smeše sačinjene od miRNK 302a-d i 367 (1:1:1:1:1:1). Njihovi RNK-konstrukti su se samo razlikovali po svom 3'UTR koji se sastoji od tandemskog ponovka 3'UTR humanog βglobina (2hBg), F-I elementa (FI) ili I-F elementa (IF). Ćelije su kultivisane u medijumu humane embrionalne matične ćelije (hES) i lipofekcije upotrebom RNAiMAX su izvedene u
1
skladu sa uputstvima proizvođača. Od dana 9 nadalje posmatrano je formiranje kolonija i analiza kolonija izvedena je na d11 (videti Sliku 14A za hronološki pregled). Uspostavljene kolonije obojene su alkalnom fosfatazom (AP) dana 11 upotrebom AP kita za bojenje. Za pregled, reprezentativna bojenja su prikazana na Slici 14B. Postalo je očigledno da inkorporacija FI elementa rezultira u većim količinama AP pozitivnih kolonija (tamno). Kolonije obojene na AP su brojane i rezultati pregleda su potvrđeni: U poređenju sa ranije upotrebljenim 2hBg-UTR, zamena sa FI-UTR dovodi do 3-4-strukog viška kolonija kada su ćelije lipofektovane 3 puta. Zamena sa IF-UTR rezultira dvostrukim viškom. Sa četiri transfekcije ovi uticaji su manje izraženi. Ovde nije primećeno poboljšanje sa IF-UTR. S jedne strane izgleda da je postupak zasićen sa četiri transfekcije, dok je s druge strane brojanje kolonija ovde u izvesnoj meri pristrasno zbog prerastanja kolonija (videti Sliku 14C). Morfologija kolonije rezultujućih kolonija iPS ćelije upotrebom RNK koje sadrže FI-UTR bila je slična hES ćeliji sa gusto napakovanim malim ćelijama u različitim kolonijama i dobro definisanim granicama (Slika 14D). Ove kolonije su se mogle obojiti pozitivno na AP (Slika 14E) i hES ćelijski površinski marker TRA-1-60 (Slika 14F). Izvedeno je TRA-1-60 bojenje živih ćelija sa Stain-Alive TRA-1-60 antitelom (Stemgent) u skladu sa uputstvima proizvođača. Reprezentativne slike kolonija su prikazane. Da bi se dalje procenila pluripotentnost kolonija, ćelije su peletirane, izolovana ukupna RNK i iRNK ekspresija hES-markera OCT4 (endogeni), NANOG (endogeni), LIN28 (endogeni), TERT i REX1 je kvantifikovana qRT-PCR-om. Ekspresija iRNK je normalizovana prema HPRT i prikazana je kao -struka indukcija u poređenju sa nivoom transkripta ulaznih ćelija. Analiza kolonija posle 3 lipofekcije je prikazana na Slici 14G. Svi analizirani markeri su visoko eksprimirani u poređenju sa ulaznim ćelijama što ukazuje na pluripotentnost reprogramiranih ćelija. Superiornost sintetičke iRNK koja sadrži FI potvrđena je većom ekspresijom endogenog markera u poređenju sa reprogramiranjem sa iRNK koje sadrže 2hBg i IF.
[0335] Ovi rezultati pokazuju da zamena 2hBg-UTR sa FI-UTR rezultira bržom i efikasnijom RNK-zasnovanoj tehnologijom reprogramiranja. Ovo se verovatno zasniva na dužoj i većoj ekspresiji reprogramirajućih transkripcionih faktora koji nastaju kao posledica supstitucije sa FI-elementom. Čini se da je orijentacija FI elementa neophodna jer korist nije primećena sa IF-konstrukatima. Uspešno reprogramiranje ćelija pomoću iRNK koje sadrže FI potvrđeno je hES-ćeliji sličnom morfologijom, AP-aktivnošću i ekspresijom markera hES-ćelijske površine i endogenih markera rezultujućih kolonija iPS-ćelije.
TABELE
[0336]
2
Tab. 1 polu-život iRNK u satima (h) izračunat iz podataka eksperimenata reverzne transkriptaze u realnom vremenu-PCR (RT-PCR) da se prati napredak selekcije. iRNK su kvantifikovane 8, 24, i 48 sati nakon elektroporacije. U eksperimentu I (levo), svaki uzorak je analiziran samo jednom. U skladu sa tim, nije data standardna devijacija.
Tab. 2 Pregled 7 glavnih grupa sa vezujućim regionom (BR) unutar 3'-UTR BLASTed sekvence. Prikazane su skraćenice grupe, broj klonova identifikovanih za grupu (br.), genomsko poreklo sa respektivnom skraćenicom (skr.), NCBI kod i pozicija unutar sekvence u odnosu na kodirajući region. U skladu sa NextBio sve sekvence su povećane u hiDC.
4 Tab. 4 PCR-uslovi za amplifikaciju biblioteke i naknadne krugove selekcije.
Tab. 6 Kombinacije klonirane i upoređene sa našim zlatnim standardom 2hBg (donji desni ugao). Pojedinačni elementi klonirani dvaput su istaknuti.
Tab. 15: Podešavanja elektroporacije
Tabela sumira detalje protokola elektroporacije za sve upotrebljene tipove ćelija. Količina ćelija navedena pod broj ćelija pomešana je sa količinom RNK navedenom ili u μg ili pmol, ili u kivetama za elektroporaciju ili pločama za elektroporaciju sa 96 bunarčića (kako je naznačeno pod formatom) u X-VIVO15 medijumu (Lonza). Elektroporacija je izvršena primenom pulsa sa naznačenom dužinom i naponom navedenim pod V. Posle toga, ćelijska suspenzija je bila razblažena u medijumu za rast i raspoređena u 96 bunarčića sa gustinom navedenom pod ćelije/vremenskoj tačci.
1
Tab. 16
Polu-životi i ukupan protein FI-elementa u odnosu na 2hBgUTR koji sadrži nemodifikovanu i modifikovanu iRNK nakon elektroporacije i nemodifikovanu RNK nakon lipofekcije. Plazmidi koji kodiraju za gen luciferaze svica koji sadrže bilo FI ili 2hBg kao 3'UTR su linearizovani nizvodno od poli(dA:dT) restrikcionim enzimom klase IIS time generišući matricu bez dodatnog nukleotida posle poli(dA:dT). Linearizovana plazmidna DNK je prečišćena upotrebom karboksilovanih magnetnih perli (Invitrogen), kvantifikovana spektrofotometrijski i podvrgnuta in vitro transkripcijama. Za in vitro transkripcije ručno-pravljena T7 RNK polimeraza sa dodatkom inhibitora RNaze i pirofosfatazom je upotrebljena sa 7,5mM NTP u 125mM Hepes pH 8,35, 34mM MgOAc2, 10mM DTT i 2mM Spermidin pufera. Za efikasno dodavanje kape na RNK 6 mM β-S-ARCA(D2) je dodato u reakciju i početna koncentracija GTP je snižena na 1,5 mM, koja je podešena na 7,5 mM u fed-batch postupku tokom 2,5h na 37°C. RNK je prečišćena pomoću karboksilovanih magnetnih perli (Invitrogen) i koncentracija i kvalitet RNK su procenjeni spektrofotometrijom i analizom na 2100 Bioanalizatoru (Agilent).
A) Pokazuje da su polu-životi nemodifikovanih iRNK koje sadrže FI element veći ili uporedivi sa onima koji sadrže 2hBg 3'UTR u nekoliko humanih ćelijskih linija i ćelijskih linija murina. Količina humanih fibroblasta (HFF), CD8+ i CD4+ T-ćelija, embrionalnih fibroblasta murina (MEF), ćelija mioblastoma (C2C12) i DC murina kao što je navedeno u Tab.15 pomešana je sa odgovarajućom količinom RNK (Tab. 15) u X-VIVO15 medijumu (Lonza) i podvrgnuta
2
elektroporaciji. Navedeni broj ćelija je zasejan u posude sa 96 bunarčića u 100 μl odgovarajućeg medijuma za rast sa aditivima. Na 2, 6, 24, 48, 72 i 96 sati nakon zasejavanja aktivnosti luciferaze svica utvrđene su dodavanjem Luciferina (Promega) u fluorescentnom čitaču (TECAN).
B) Pokazuje da su polu-životi m1Y modifikovanih iRNK koje sadrže FI element veći ili uporedivi sa onima koji sadrže 2hBg 3'UTR u različitim humanim ćelijskim linijama i ćelijaskim linijama murina. Količina humanih nezrelih dendritskih ćelija (iDC), fibroblasta (HFF), CD8+ i CD4+ T-ćelija, embrionalnih fibroblasta murina (MEF), ćelija mioblastoma (C2C12) i DC murina kao što je navedeno u Tab. 15 pomešana je sa odgovarajućom količinom m1Y modifikovane RNK (Tab. 15) u X-VIVO15 medijumu (Lonza) i podvrgnuta elektroporaciji. Navedeni broj ćelija je zasejan u posude sa 96 bunarčića u 100 μl odgovarajućeg medijuma za rast sa aditivima. Na 2, 6, 24, 48, 72 i 96 sati nakon zasejavanja aktivnosti luciferaze svica utvrđene su dodavanjem Luciferina (Promega) u fluorescentnom čitaču (TECAN).
C) Pokazuje da su polu-životi nemodifikovanih iRNK koje sadrže FI element veći ili uporedivi sa onima koji sadrži 2hBg 3'UTR u različitim ćelijskim linijama takođe kada je RNK transfektovana putem lipofekcije. 50ng RNK je inkubirano tokom 15-30 min sa 0,2 μl RNAiMAX i naneto na 1E04 HFF, MEF ili C2C12 ćelije u 96 bunarčića. Nivoi luciferaze su mereni na 3, 6, 12, 24, 48, 72 i 96h dodavanjem Luciferina (Promega) u fluorescentnom čitaču (TECAN).
Tab. 17: 10 μg RNK koja kodira luciferazu svica koja sadrži ili FI element ili varijacije FI elemanta naznačene homologije sa originalnom FI sekvencom kao 3'UTR elektroporirano je u hiDC u formatu sa 96-bunarčića. Ekspresija luciferaze praćena je tokom vremena na 3, 6, 24, 48, i 72h, i iz rezultujuće krive ekspresije izračunati su polu-život iRNK i količinu ukupnog proteina translatiranih sa RNK.
Tab. 18: 10 μg RNK koja kodira luciferazu svica koja sadrži ili FI element ili varijacije FI elemanta koji sadrži mutacije za zadržavanje ili uništavanje strukture i naznačene homologije sa originalnom FI sekvencom kao 3'UTR elektroporirano je u hiDC u formatu sa 96-bunarčića. Ekspresija luciferaze praćena je tokom vremena na 3, 6, 24, 48, i 72h, i iz rezultujuće krive ekspresije izračunati su polu-život iRNK i količina ukupnog proteina.
A B
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11

Claims (23)

Patentni zahtevi
1. Molekul nukleinske kiseline koji sadrži u 5' → 3' smeru transkripcije:
(a) promotor;
(b) transkriptabilnu sekvencu nukleinske kiseline ili sekvencu nukleinske kiseline za uvođenje transkriptabilne sekvence nukleinske kiseline; i
(c) sekvencu nukleinske kiseline koja, kada se transkribuje pod kontrolom promotora (a), kodira 3'-netranslatirajući region u transkriptu koji nije prirodno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline (b), navedeni 3'-netranslatirajući region sadrži
(i) (c-4) sekvencu nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona aminoterminalnog pojačivača razdvajanja (AES) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 86 do 89, poželjno SEQ ID NO: 86, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu; ili
(ii) (c-8) bilo koju kombinaciju (c-4) i jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline odabranih iz grupe koja se sastoji od:
(c-1) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona Fc fragmenta IgG, receptora, transportera, alfa (FCGRT) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do 50, poželjno SEQ ID NO: 27, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(c-2) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona limfocitnog specifičnog proteina 1 (LSP1) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 51 do 72, poželjno SEQ ID NO: 52, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(c-3) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona hemokinskog liganda 22 (CCL22) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 73 do 85, poželjno SEQ ID NO: 79, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(c-4) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona aminoterminalnog pojačivača razdvajanja (AES) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 86 do 89, poželjno SEQ ID NO: 86, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu, (c-5) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona člana 3 porodice fosfolipaze D (PLD3) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 90 do 104, poželjno SEQ ID NO: 96, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(c-6) sekvence nukleinske kiseline nekodirajuće RNK mitohondrijalno kodirane 12S RNK (MT-RNR1) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 105 do 121, poželjno SEQ ID NO: 115, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu, i
(c-7) nukleinske sekvence 3'-netranslatirajućeg regiona glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II DR Beta 4 (HLA-DRB4) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koji se sastoji od SEQ ID NO: 122 do 143, poželjno SEQ ID NO: 126, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
pri čemu se sekvence nukleinske kiseline (b) i (c) pod kontrolom promotora (a) mogu transkribovati da daju zajednički transkript u kojem je sekvenca nukleinske kiseline transkribovana sa sekvence nukleinske kiseline (c) aktivna tako da povećava efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline transkribovane sa transkriptabilne sekvence nukleinske kiseline (b).
1
2. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline (c-8) sadrži kombinaciju (c-4) i (c-6), pri čemu se, poželjno, (c-4) nalazi 5' do (c-6), i/ili kombinacija (c-4) i (c-6) sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 174, njen fragment, ili varijantu navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu.
3. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji dalje sadrži (d) sekvencu nukleinske kiseline koja, kada se transkribuje pod kontrolom promotora (a), kodira sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca, pri čemu, opciono, poliadenilna sekvenca sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A.
4. Molekul nukleinske kiseline prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 3, koji je zatvoreni cirkularni molekul ili linearni molekul.
5. Molekul nukleinske kiseline prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu transkriptabilna sekvenca nukleinske kiseline sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein i sekvenca nukleinske kiseline za uvođenje transkriptabilne sekvence nukleinske kiseline je mesto višestrukog kloniranja.
6. Molekul nukleinske kiseline prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 5, koji dalje sadrži jedan ili više članova odabranih iz grupe koja se sastoji od: (i) reporterskog gena; (ii) selektabilnog markera; i (iii) oridžina replikacije.
7. Molekul nukleinske kiseline prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6, koji je pogodan, posebno nakon linearizacije, za in vitro transkripciju RNK, posebno iRNK.
8. RNK koja se može dobiti transkripcijom, poželjno in vitro transkripcijom, upotrebom molekula nukleinske kiseline prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 7 kao matrice.
9. RNK koja sadrži u 5' → 3' smeru:
(a) 5'-netranslatirajući region;
(b) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein; i
(c) 3'-netranslatirajući region koji nije prirodno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline (b), navedeni 3'-netranslatirajući region sadrži
1 4
(i) (c-4) sekvencu nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona aminoterminalnog pojačivača razdvajanja (AES) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 86 do 89, poželjno SEQ ID NO: 86, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu; ili
(ii) (c-8) bilo koju kombinaciju (c-4) i jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline odabranih iz grupe koja se sastoji od:
(c-1) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona Fc fragmenta IgG, receptora, transportera, alfa (FCGRT) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do 50, poželjno SEQ ID NO: 27, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(c-2) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona limfocitnog specifičnog proteina 1 (LSP1) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 51 do 72, poželjno SEQ ID NO: 52, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(c-3) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona hemokinskog liganda 22 (CCL22) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 73 do 85, poželjno SEQ ID NO: 79, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(c-4) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona aminoterminalnog pojačivača razdvajanja (AES) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 86 do 89, poželjno SEQ ID NO: 86, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
1
(c-5) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona člana 3 porodice fosfolipaze D (PLD3) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 90 do 104, poželjno SEQ ID NO: 96, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(c-6) sekvence nukleinske kiseline nekodirajuće RNK mitohondrijalno kodirane 12S RNK (MT-RNR1) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 105 do 121, poželjno SEQ ID NO: 115, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(c-7) nukleinske sekvence 3'-netranslatirajućeg regiona glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II DR Beta 4 (HLA-DRB4) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 122 do 143, poželjno SEQ ID NO: 126, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline (c) aktivna tako da povećava efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein.
10. RNK prema patentnom zahtevu 9, koja dalje sadrži (d) sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A, pri čemu se, poželjno, navedena sekvenca nukleinske kiseline (d) nalazi na 3' kraju navedene RNK, i/ili su sekvence nukleinske kiseline (c) i (d) aktivne tako da povećavaju efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein.
11. RNK prema patentnom zahtevu 9 ili 10, koja dalje sadrži (e) 5' kapu.
12. Postupak za dobijanje RNK, koji sadrži:
(i) obezbeđivanje molekula nukleinske kiseline prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 7, i
1
(ii) transkripciju RNK upotrebom molekula nukleinske kiseline kao matrice.
13. Postupak za dobijanje peptida ili proteina, koji sadrži:
(i) dobijanje RNK koja kodira peptid ili protein u skladu sa postupkom prema patentnom zahtevu 12, i
(ii) translaciju RNK.
14. Postupak prema patentnom zahtevu 12 ili 13, naznačen time što dalje sadrži, pre transkripcije molekula nukleinske kiseline, isecanje molekula nukleinske kiseline.
15. Postupak za dobijanje RNK, koji sadrži:
(i) spajanje sekvence nukleinske kiseline (b) koja, kada se transkribuje, kodira 3'-netranslatirajući region, na 3' kraju transkriptabilne sekvence nukleinske kiseline (a), koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline (a) nije prirodno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline (b), i
(ii) transkripciju dobijene nukleinske kiseline,
gde navedeni 3'-netranslatirajući region sadrži
(iia) (b-4) sekvencu nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona aminoterminalnog pojačivača razdvajanja (AES) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 86 do 89, poželjno SEQ ID NO: 86, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu; ili
(iib) (b-8) bilo koju kombinaciju (b-4) i jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline odabranih iz grupe koja se sastoji od:
(b-1) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona Fc fragmenta IgG, receptora, transportera, alfa (FCGRT) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do 50, poželjno SEQ ID NO: 27, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
1
(b-2) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona limfocitnog specifičnog proteina 1 (LSP1) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 51 do 72, poželjno SEQ ID NO: 52, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(b-3) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona hemokinskog liganda 22 (CCL22) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 73 do 85, poželjno SEQ ID NO: 79, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(b-4) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona aminoterminalnog pojačivača razdvajanja (AES) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 86 do 89, poželjno SEQ ID NO: 86, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(b-5) sekvence nukleinske kiseline 3'-netranslatirajućeg regiona člana 3 porodice fosfolipaze D (PLD3) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 90 do 104, poželjno SEQ ID NO: 96, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(b-6) sekvence nukleinske kiseline nekodirajuće RNK mitohondrijalno kodirane 12S RNK (MT-RNR1) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 105 do 121, poželjno SEQ ID NO: 115, njenog fragmenta, ili varijante navedene sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
(b-7) nukleinske sekvence 3'-netranslatirajućeg regiona glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II DR Beta 4 (HLA-DRB4) koja sadrži ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 122 do 143, poželjno SEQ ID NO: 126, njenog fragmenta, ili varijante navedene
1
sekvence nukleinske kiseline ili fragmenta koja je najmanje 90% identična navedenoj sekvenci nukleinske kiseline ili fragmentu,
pri čemu se sekvence nukleinske kiseline (a) i (b) mogu transkribovati da daju zajednički transkript u kojem je sekvenca nukleinske kiseline transkribovana sa sekvence nukleinske kiseline (b) aktivna tako da povećava efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline transkribovane sa transkriptabilne sekvence nukleinske kiseline (a).
16. Postupak prema patentnom zahtevu 15, koji dalje sadrži spajanje sekvence nukleinske kiseline (c) koja, kada se transkribuje, kodira sekvencu nukleinske kiseline koja je poliadenilna sekvenca koja opciono sadrži unutar poliadenilne sekvence sekvencu jednog ili više uzastopnih nukleotida koja sadrži nukleotide koji nisu nukleotidi A, na 3' kraju sekvence nukleinske kiseline (b), pri čemu se, poželjno, sekvence nukleinske kiseline (a), (b), i (c) mogu transkribovati da daju zajednički transkript u kojem su sekvence nukleinske kiseline transkribovane sa sekvenci nukleinske kiseline (b) i (c) aktivne tako da povećavaju efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline transkribovane sa transkriptabilne sekvence nukleinske kiseline (a).
17. Postupak za dobijanje peptida ili proteina, koji sadrži:
(i) dobijanje RNK postupkom prema patentnom zahtevu 15 ili 16, i
(ii) translaciju RNK.
18. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 12 do 17, pri čemu se transkripcija izvodi in vitro.
19. RNK koja se može dobiti postupkom prema bilo kojem od patentnih zahteva 12, 14 do 16 i 18.
20. Postupak za dobijanje peptida ili proteina, koji sadrži translaciju RNK prema bilo kojem od patentnih zahteva 8 do 11 i 19.
21. RNK prema bilo kojem od patentnih zahteva 8 do 11 i 19 za upotrebu u postupku za transfekciju ćelije-domaćina, pri čemu je, poželjno, ćelija-domaćin antigen-prezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit ili makrofag.
1
22. RNK prema bilo kojem od patentnih zahteva 8 do 11 i 19 za upotrebu u postupku vakcinacije.
23. RNK prema bilo kojem od patentnih zahteva 8 do 11 i 19 za upotrebu u postupku za reprogramiranje somatskih ćelija u ćelije koje imaju karakteristike matične ćelije.
2
RS20191347A 2015-10-07 2016-10-05 3' utr sekvence za stabilizaciju rnk RS59538B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2015/073180 WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2015-10-07 3' utr sequences for stabilization of rna
EP16778784.5A EP3337902B1 (en) 2015-10-07 2016-10-05 3' utr sequences for stabilization of rna
PCT/EP2016/073814 WO2017060314A2 (en) 2015-10-07 2016-10-05 3' utr sequences for stabilization of rna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59538B1 true RS59538B1 (sr) 2019-12-31

Family

ID=54293227

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191347A RS59538B1 (sr) 2015-10-07 2016-10-05 3' utr sekvence za stabilizaciju rnk
RS20210311A RS61684B1 (sr) 2015-10-07 2016-10-05 3ꞌ utr sekvence za stabilizaciju rnk

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210311A RS61684B1 (sr) 2015-10-07 2016-10-05 3ꞌ utr sekvence za stabilizaciju rnk

Country Status (26)

Country Link
US (2) US11492628B2 (sr)
EP (3) EP3636764B1 (sr)
JP (6) JP7084302B2 (sr)
KR (4) KR102688535B1 (sr)
CN (1) CN108291230B (sr)
AU (3) AU2016335029B2 (sr)
BR (2) BR112018003486B1 (sr)
CA (2) CA2998554C (sr)
CY (2) CY1122347T1 (sr)
DK (2) DK3636764T3 (sr)
ES (2) ES2866224T3 (sr)
HR (2) HRP20191907T1 (sr)
HU (2) HUE055152T2 (sr)
IL (4) IL326682A (sr)
LT (2) LT3636764T (sr)
MX (2) MX378808B (sr)
NZ (1) NZ740946A (sr)
PL (2) PL3636764T3 (sr)
PT (2) PT3337902T (sr)
RS (2) RS59538B1 (sr)
RU (1) RU2720934C2 (sr)
SG (1) SG10201912558YA (sr)
SI (2) SI3337902T1 (sr)
SM (2) SMT202100157T1 (sr)
WO (2) WO2017059902A1 (sr)
ZA (1) ZA201800835B (sr)

Families Citing this family (176)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
AU2017296195A1 (en) 2016-07-11 2019-01-24 Translate Bio Ma, Inc. Nucleic acid conjugates and uses thereof
ES2993107T3 (en) * 2016-10-17 2024-12-23 Janssen Pharmaceuticals Inc Recombinant virus replicon systems and uses thereof
JP2020532961A (ja) * 2017-08-15 2020-11-19 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をコードする安定化された核酸
WO2019140102A1 (en) 2018-01-10 2019-07-18 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for facilitating delivery of synthetic nucleic acids to cells
AU2019219200B2 (en) 2018-02-12 2025-02-13 BioNTech SE Treatment using cytokine encoding RNA
WO2019213257A1 (en) * 2018-05-01 2019-11-07 Wake Forest University Health Sciences Lentiviral-based vectors and related systems and methods for eukaryotic gene editing
US12522640B2 (en) 2018-07-24 2026-01-13 BioNTech SE IL2 agonists
CN115120716A (zh) * 2019-01-14 2022-09-30 健泰科生物技术公司 用pd-1轴结合拮抗剂和rna疫苗治疗癌症的方法
CA3129100A1 (en) 2019-02-08 2020-08-13 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Treatment involving car-engineered t cells and cytokines
MX2021011258A (es) 2019-03-18 2021-12-10 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Variantes de interleucina-2 (il2) y receptor de interleucina-2 (il2r) para la activacion especifica de celulas efectoras inmunitarias.
WO2020200481A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment involving interleukin-2 (il2) and interferon (ifn)
JP7403777B2 (ja) * 2019-05-30 2023-12-25 ソウル大学校産学協力団 ウイルス感染及び活性抑制方法
TW202115105A (zh) 2019-06-24 2021-04-16 德商拜恩迪克Ｒｎａ製藥有限公司 Ｉｌ２激動劑
JP2022546417A (ja) * 2019-08-29 2022-11-04 チューリッヒ大学 最小ｍＲＮＡおよびその使用
WO2021081261A1 (en) * 2019-10-22 2021-04-29 The Regents Of The University Of California Modulation of engineered immune cell receptor translation using noncoding sequence elements
BR112022015077A2 (pt) 2020-01-31 2022-10-04 Genentech Inc Métodos para induzir células t cd8+ específicas de neoepítopos em um indivíduo com um tumor e para induzir o tráfico de células t cd8+, vacinas de rna, vacina de rna para uso e antagonistas de ligação
IL294771A (en) * 2020-02-11 2022-09-01 Pantherna Therapeutics Gmbh Recombinant nucleic acid construct and use thereof
EP4103228A1 (en) 2020-02-13 2022-12-21 Institut Pasteur Nucleic acid vaccine against the sars-cov-2 coronavirus
AU2021238582A1 (en) 2020-03-16 2022-09-22 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Antigen-specific T cell receptors and T cell epitopes
KR102462990B1 (ko) 2020-03-17 2022-11-07 에이비온 주식회사 인비트로 트랜스크립트 mRNA 및 이를 함유하는 약학조성물
AU2021250814A1 (en) 2020-03-30 2022-10-13 BioNTech SE RNA compositions targeting Claudin-18.2
WO2021197589A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination
CN118490818A (zh) 2020-04-22 2024-08-16 生物技术欧洲股份公司 冠状病毒疫苗
EP4139616A1 (en) 2020-04-22 2023-03-01 Pfizer Inc. Coronavirus vaccine
WO2025056938A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 BioNTech SE Rna compositions for delivery of incretin agents
CN116234568A (zh) 2020-07-07 2023-06-06 生物技术公司 用于hpv阳性癌症的治疗性rna
CN115997254A (zh) 2020-07-17 2023-04-21 基因泰克公司 基于注意力的神经网络用以预测肽结合、呈递和免疫原性
WO2022029011A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 BioNTech SE Binding agents for coronavirus s protein
EP4210864A2 (en) 2020-09-08 2023-07-19 Genentech, Inc. Systems and methods for producing pharmaceutical compositions using peristaltic pumps and dampeners
TW202227478A (zh) 2020-09-15 2022-07-16 德商拜恩迪克公司 對細胞靶向遞送的藥劑及方法
EP4203997A1 (en) 2020-10-26 2023-07-05 Pécsi Tudományegyetem Vaccine platform
KR20230107281A (ko) 2020-11-11 2023-07-14 비온테크 에스이 프로그램된 사멸-1 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 의약에서의 용도
WO2022106860A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Pécsi Tudományegyetem Recombinant peptides for use in therapy
KR20230129432A (ko) 2020-12-09 2023-09-08 비온테크 에스이 Rna 제조
TW202245808A (zh) * 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
CN114717230B (zh) * 2021-01-05 2024-09-03 麦塞拿治疗(香港)有限公司 成纤维细胞生长因子mRNA的无细胞和无载体体外RNA转录方法和核酸分子
US20240383947A1 (en) 2021-04-20 2024-11-21 BioNTech SE Virus vaccine
JP2024518335A (ja) 2021-04-26 2024-05-01 アンスティチュ パスツール ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するヒト中和モノクローナル抗体、及びそれらの使用
EP4329799A4 (en) * 2021-04-30 2025-04-30 Greenlight Biosciences, Inc. Messenger rna therapeutics and compositions
WO2022235847A1 (en) 2021-05-04 2022-11-10 BioNTech SE Technologies for early detection of variants of interest
EP4351633A1 (en) 2021-06-08 2024-04-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Agents and methods for activation and targeting of immune effector cells
TW202317766A (zh) * 2021-06-24 2023-05-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 非自然發生的5’-非轉譯區及3’-非轉譯區及其用途
IL309495A (en) 2021-07-15 2024-02-01 BioNTech SE Agents encoding cldn6 and cd3 binding elements for treating cldn6-positive cancers
JP7689238B2 (ja) * 2021-07-27 2025-06-05 エスケー バイオサイエンス カンパニー リミテッド タンパク質発現のためのｍＲＮＡ、及びそのためのテンプレート
KR20240042414A (ko) 2021-07-29 2024-04-02 비온테크 에스이 흑색종의 치료용 조성물 및 방법
AU2021461416A1 (en) 2021-08-24 2024-02-22 BioNTech SE In vitro transcription technologies
WO2023030635A1 (en) 2021-09-02 2023-03-09 BioNTech SE Potency assay for therapeutic potential of coding nucleic acid
WO2023051926A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination and pd-1 axis binding antagonists
EP4413144A4 (en) * 2021-10-07 2025-11-19 Global Life Sciences Solutions Canada Ulc RNA VACCINE LIPID NANOPARTICLES
TW202333803A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性ｒｎａ（一）
WO2023061550A1 (en) 2021-10-11 2023-04-20 BioNTech SE Therapeutic rna for lung cancer
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
WO2023064612A2 (en) 2021-10-15 2023-04-20 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of viral antigens and related methods
AU2021470029A1 (en) 2021-10-21 2024-05-02 BioNTech SE Coronavirus vaccine
EP4169578A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4285933A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
EP4169580A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4402149A1 (en) 2021-10-22 2024-07-24 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
EP4169579A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
EP4286003A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4285932A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
WO2023067121A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
JP2024543721A (ja) 2021-10-22 2024-11-22 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア オリゴ糖複合体及び用途
EP4238577A3 (en) 2021-10-22 2023-12-06 BioNTech SE Compositions for administration of different doses of rna
US20250002522A1 (en) 2021-10-22 2025-01-02 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
JP2024540979A (ja) 2021-10-22 2024-11-06 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア オリゴ糖複合体及び用途
EP4169534A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
EP4286004A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
EP4286394A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4186528A1 (en) 2021-11-30 2023-05-31 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
US20250122546A1 (en) 2021-10-28 2025-04-17 BioNTech SE Rna constructs and uses thereof
WO2023083434A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Rna encoding peptidoglycan hydrolase and use thereof for treating bacterial infection
US12186387B2 (en) 2021-11-29 2025-01-07 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2023094713A2 (en) 2021-11-29 2023-06-01 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024046572A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 BioNTech SE Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6 expressing cancer
US20250025505A1 (en) 2021-12-09 2025-01-23 BioNTech SE Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6 expressing cancer
WO2023126053A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 BioNTech SE Lipid-based formulations for administration of rna
JP2025508332A (ja) 2022-01-27 2025-03-26 ビオンテック エスエー 単純ヘルペスウイルス抗原の送達のための薬学的組成物及び関連方法
EP4469080A2 (en) 2022-01-28 2024-12-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine
EP4520823A4 (en) * 2022-05-03 2026-05-13 Univ Dankook Iacf UTR sequence for regulating the level and location of protein expression, and mRNA sequence including it
EP4522654A1 (en) 2022-05-12 2025-03-19 BioNTech SE Monoclonal antibodies directed against programmed death-1 protein and their use in medicine
AU2023268051A1 (en) 2022-05-13 2025-01-02 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
WO2023230295A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 BioNTech SE Rna compositions for delivery of monkeypox antigens and related methods
US20250375534A1 (en) 2022-05-30 2025-12-11 BioNTech SE Complexes for delivery of nucleic acids
WO2023237726A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Pantarhei Oncology B.V. An intracellular tumor-specific variant of human zona pellucida glycoprotein 3 and nucleic acids coding therefor for use in the treatment of cancer
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024017479A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 BioNTech SE Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production
IL318534A (en) 2022-08-03 2025-03-01 BioNTech SE RNA for preventing or treating tuberculosis
WO2024027910A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
CN117660494A (zh) * 2022-09-07 2024-03-08 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 用于表达水痘-带状疱疹病毒抗原蛋白的mRNA及其用途
WO2024056856A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 BioNTech SE Systems and compositions comprising trans-amplifying rna vectors with mirna
WO2024063789A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024063788A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
IL319414A (en) 2022-09-23 2025-05-01 BioNTech SE Compositions for delivering antigens at the liver level and related methods
US20260151470A1 (en) 2022-09-23 2026-06-04 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium csp antigens and related methods
JP2025532191A (ja) 2022-09-26 2025-09-29 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア 核酸複合体及びその使用
WO2024074211A1 (en) * 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
CN120129702A (zh) * 2022-10-06 2025-06-10 生物技术公司 靶向密蛋白-18.2的rna组合物
EP4604995A1 (en) 2022-10-17 2025-08-27 BioNTech SE Combination vaccines against coronavirus infection, influenza infection, and/or rsv infection
WO2024083345A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 BioNTech SE Methods and uses associated with liquid compositions
EP4605010A1 (en) 2022-10-21 2025-08-27 BioNTech SE Nucleic acid complexes and uses thereof
EP4619988A1 (en) 2022-11-15 2025-09-24 Genentech Inc. Selection of diverse candidate peptides for peptide therapeutics
JP2026501282A (ja) 2022-12-20 2026-01-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ－１軸結合アンタゴニストおよびｒｎａワクチンを用いて膵臓がんを処置する方法
CN121127490A (zh) 2022-12-28 2025-12-12 生物技术欧洲股份公司 靶向hiv的rna组合物
WO2024153324A1 (en) 2023-01-18 2024-07-25 BioNTech SE Rna formulations for pharmaceutical use
US20260232791A1 (en) 2023-01-27 2026-08-13 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of herpes simplex virus glycoprotein c, glycoprotein d, and glycoprotein e antigens and related methods
WO2024161314A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Seqirus Inc. Capping assay
EP4669348A1 (en) 2023-02-24 2025-12-31 BioNTech SE IMMUNOGENEOUS COMPOSITIONS
CN121002196A (zh) 2023-02-28 2025-11-21 百欧恩泰欧洲股份公司 用于多种编码核酸的接头序列效力测定
WO2024180363A1 (en) 2023-02-28 2024-09-06 BioNTech SE Linker sequence potency assays for multiple coding nucleic acids
CN121127584A (zh) 2023-03-09 2025-12-12 生物技术公司 具有杀细菌活性的肽聚糖水解酶
EP4442276A1 (en) 2023-04-07 2024-10-09 Institut Pasteur Combined antibodies against sarbecoviruses and uses thereof
WO2024213776A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
WO2024216212A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
EP4694920A1 (en) 2023-04-14 2026-02-18 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
CN118853659A (zh) * 2023-04-14 2024-10-29 深圳瑞吉生物科技有限公司 提高mRNA翻译蛋白的输出量的核酸及其应用
CN121038807A (zh) 2023-05-03 2025-11-28 生物技术欧洲股份公司 优化的csp变体及相关方法
WO2024228044A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 BioNTech SE Optimized csp variants and related methods
KR20260011140A (ko) 2023-05-15 2026-01-22 제넨테크, 인크. 종양 내 돌연변이를 페이징하기 위한 시스템 및 방법
WO2024236192A1 (en) 2023-05-17 2024-11-21 Institut Pasteur Heterodimer of poxvirus a16 and g9 proteins as an immunogen
KR20260030125A (ko) 2023-06-21 2026-03-05 센젠 센신 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드 호흡기 세포융합 바이러스(rsv) 백신
AU2024310086A1 (en) 2023-06-30 2026-02-05 Shenzhen Shenxin Biotechnology Co., Ltd. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
KR20250008698A (ko) * 2023-07-07 2025-01-15 에스케이바이오사이언스(주) 단백질 발현을 위한 rna 및 이를 위한 주형
EP4746902A2 (en) 2023-07-21 2026-05-27 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium antigens and related methods
WO2025024324A1 (en) 2023-07-21 2025-01-30 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium antigens and related methods
EP4750488A1 (en) 2023-07-24 2026-06-03 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium antigens and related methods
WO2025026866A1 (en) 2023-07-28 2025-02-06 BioNTech SE Rna therapeutics with reduced toxicity
WO2025026545A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 BioNTech SE Ionizable thioplipids and uses thereof
TW202519509A (zh) 2023-08-01 2025-05-16 德商拜恩技術股份公司 可離子化硫脂質及其用途
CN121866336A (zh) 2023-08-03 2026-04-14 百欧恩泰欧洲股份公司 靶向hiv的rna组合物
EP4754130A2 (en) 2023-08-03 2026-06-10 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
AU2024316307A1 (en) 2023-08-03 2026-02-26 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of herpes simplex virus antigens and related methods
WO2025030154A1 (en) 2023-08-03 2025-02-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmaceutical compositions for delivery of herpes simplex virus glycoprotein b antigens and related methods
AU2024316992A1 (en) 2023-08-03 2026-03-12 BioNTech SE Rna compositions encoding herpes simplex virus glycoprotein b antigens and uses thereof
CN121866069A (zh) 2023-08-03 2026-04-14 宾夕法尼亚大学理事会 编码单纯疱疹病毒糖蛋白e和/或糖蛋白i抗原的rna组合物及其用途
WO2025040709A1 (en) 2023-08-24 2025-02-27 BioNTech SE Systems and compositions comprising highly active trans-amplifying replicases
WO2025054556A1 (en) 2023-09-07 2025-03-13 BioNTech SE Rna compositions for delivery of mpox antigens and related methods
WO2025051381A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 BioNTech SE Methods and compositions for localized expression of administered rna
CN121844046A (zh) 2023-09-11 2026-04-10 C·米库尔卡 用于递送肠促胰岛素剂的rna组合物
EP4527937A1 (en) 2023-09-20 2025-03-26 BioNTech SE One-pot in vitro transcription of multiple dna molecules to multiple rna molecules
CN122070137A (zh) 2023-09-20 2026-05-19 百欧恩泰欧洲股份公司 方法
WO2025064850A1 (en) 2023-09-22 2025-03-27 BioNTech SE Rna constructs with n-terminal degrons to enhance an immune response
TW202516015A (zh) * 2023-09-27 2025-04-16 南韓商韓美藥品股份有限公司 包括非天然３’非轉譯區的傳訊核糖核酸、對其進行編碼的脫氧核糖核酸以及包含其的組成物
CN122055384A (zh) 2023-10-17 2026-05-15 百欧恩泰欧洲股份公司 与cd3特异性结合的抗原结合蛋白及其在医药中的用途
WO2025082594A1 (en) 2023-10-17 2025-04-24 BioNTech SE Antigen binding proteins specifically binding to cd3 and their use in medicine
FR3155424A1 (fr) 2023-11-15 2025-05-23 BioNTech SE Compositions immunogènes contre le sars-cov-2
WO2025106754A1 (en) 2023-11-15 2025-05-22 BioNTech SE Coronavirus vaccine
CN120530193A (zh) 2023-11-30 2025-08-22 传信生物医药(苏州)有限公司 用于提高rna分子的翻译性能的3’utr
WO2025119162A1 (zh) 2023-12-04 2025-06-12 深圳深信生物科技有限公司 偏肺病毒(mpv)疫苗
WO2025124711A1 (en) 2023-12-13 2025-06-19 BioNTech SE Glycolipid compositions
WO2025134066A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Biontech Delivery Technologies Gmbh Ionizable lipids
WO2025134062A2 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Biontech Delivery Technologies Gmbh Ionizable lipids
CN117535295B (zh) * 2024-01-09 2024-04-26 艾斯拓康医药科技(北京)有限公司 一种优化的3`utr序列及其应用
TW202539700A (zh) 2024-01-16 2025-10-16 美商建南德克公司 用ｐｄ－１軸結合拮抗劑及ｒｎａ疫苗治療泌尿上皮癌之方法
WO2025153707A1 (en) 2024-01-19 2025-07-24 Spikimm Broadly sars-cov-2 neutralizing monoclonal antibodies and uses thereof
WO2025196280A1 (en) * 2024-03-22 2025-09-25 Vrije Universiteit Brussel Synthetic dna template for in vitro mrna transcription of antigen receptors
WO2025202937A1 (en) 2024-03-26 2025-10-02 BioNTech SE Cancer vaccines
WO2025201659A1 (en) 2024-03-28 2025-10-02 BioNTech SE Combination therapy comprising therapeutic rna cancer vaccines and anti-ctla4 antibodies for cancer treatment
WO2025213131A1 (en) 2024-04-05 2025-10-09 BioNTech SE Rna compositions for delivery of orthopox antigens and related methods
TW202617177A (zh) 2024-06-18 2026-05-01 德商拜恩技術股份公司 用於治療黑色素瘤之組合物及方法
WO2025262460A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 BioNTech SE Lipid compositions for nucleic acid delivery
WO2026015882A1 (en) 2024-07-12 2026-01-15 BioNTech SE Hsv antigen fragments and related methods
WO2026033380A1 (en) 2024-08-05 2026-02-12 BioNTech SE Process for preparing oligosaccharide complexes
EP4696782A1 (en) 2024-08-14 2026-02-18 Starvax One B.V. Improved split rna replicons
WO2026041793A1 (en) 2024-08-23 2026-02-26 BioNTech SE Chimeric proteins comprising non-human protein domains for enhancing antigenicity
WO2026047603A1 (en) 2024-08-28 2026-03-05 BioNTech SE Sars-cov-2 immunogenic compositions
WO2026047153A1 (en) 2024-08-28 2026-03-05 BioNTech SE Potency assay for multiple coding nucleic acids
WO2026057626A1 (en) 2024-09-11 2026-03-19 BioNTech SE Peptidoglycan hydrolases having multiple enzymatically active domains
WO2026057625A1 (en) 2024-09-11 2026-03-19 BioNTech SE Peptidoglycan hydrolases having a chap domain with engineered active site
WO2026061971A1 (en) 2024-09-17 2026-03-26 Lonza Ltd Nucleic acid untranslated regions
WO2026082899A2 (en) 2024-10-16 2026-04-23 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
WO2026162682A1 (en) 2025-01-29 2026-08-06 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium rh5 antigens and related methods
CN121022839B (zh) * 2025-02-06 2026-05-26 北京臻知医学科技有限责任公司 一种5’UTR序列及其在提高mRNA翻译效率中的应用

Family Cites Families (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
NZ219905A (en) 1986-04-08 1989-04-26 Illinois Tool Works Multi-unit can packaging:resilient band holds cans in resilient carrier
EP0292435B1 (en) 1987-05-20 1995-07-26 Ciba-Geigy Ag Zea mays plants and transgenic zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
RU2126047C1 (ru) * 1987-05-29 1999-02-10 Новартис Аг Способ получения растений zea mays l., устойчивых к повреждениям, вызываемым насекомыми
US5804381A (en) 1996-10-03 1998-09-08 Cornell Research Foundation Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU644203B2 (en) 1990-06-18 1993-12-02 Monsanto Company Increased starch content in plants
US6235525B1 (en) 1991-05-23 2001-05-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof
NL9300646A (nl) * 1992-12-28 1994-07-18 Stichting Scheikundig Onderzoe Werkwijze voor het verkrijgen van transgene planten welke een gemodificeerd fructaan-patroon vertonen.
DE69332803T2 (de) 1992-12-28 2004-03-04 Stichting Scheikundig Onderzoek In Nederland (Son) Verfahren zur herstellung transgener pflanzen mit modifiziertem fructanmuster
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
DE69723434T2 (de) 1996-04-26 2004-05-19 Rijksuniversiteit Te Leiden Verfahren zur selektion und produktion von t-zell-peptide epitope und vakzine mit diese epitope
EP0938298B1 (en) 1996-09-13 2002-12-04 Lipoxen Technologies Limited Liposome-based composition
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US6074645A (en) 1996-11-12 2000-06-13 City Of Hope Immuno-reactive peptide CTL epitopes of human cytomegalovirus
WO1999024566A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Roche Diagnostics Gmbh Tumor-specific antigens, methods for their production and their use for immunization and diagnosis
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
JP2002526421A (ja) 1998-10-05 2002-08-20 ジェンザイム・コーポレーション 癌細胞に差別的に発現する癌ワクチン設計のための遺伝子
WO2000050592A1 (en) 1999-02-24 2000-08-31 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
KR100773109B1 (ko) 1999-05-06 2007-11-02 웨이크 포리스트 유니버시티 면역 반응을 유발하는 항원을 동정하기 위한 조성물과 방법
EP1261704B1 (en) 1999-11-30 2009-07-01 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules encoding cancer associated antigens, the antigens per se, and uses thereof
AU780064B2 (en) 1999-12-28 2005-02-24 Epimmune, Inc. Optimized minigenes and peptides encoded thereby
US7462354B2 (en) 1999-12-28 2008-12-09 Pharmexa Inc. Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby
AR044724A1 (es) 2000-03-27 2005-10-05 Syngenta Participations Ag Promotores del virus de la rizadura amarilla del cestrum
EP1292331A2 (en) 2000-06-07 2003-03-19 Biosynexus Incorporated Immunostimulatory rna/dna hybrid molecules
US6472176B2 (en) 2000-12-14 2002-10-29 Genvec, Inc. Polynucleotide encoding chimeric protein and related vector, cell, and method of expression thereof
ATE291925T1 (de) 2001-06-05 2005-04-15 Curevac Gmbh Stabilisierte mrna mit erhöhtem g/c-gehalt und optimierter codon usage für die gentherapie
US20030224345A1 (en) 2001-08-24 2003-12-04 Advanced Cell Technology Screening assays for identifying differentiation-inducing agents and production of differentiated cells for cell therapy
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
AUPS054702A0 (en) 2002-02-14 2002-03-07 Immunaid Pty Ltd Cancer therapy
KR20050016410A (ko) * 2002-05-17 2005-02-21 베일러 칼리지 오브 메디신 도세탁셀 약제민감성 및 약제내성을 예측하는 특징적인유전자 발현 패턴
ATE519115T1 (de) 2002-06-13 2011-08-15 Merck Patent Gmbh Verfahren für die identifizierung von allo- antigenen und ihre verwendung für krebstherapie und transplantation
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
US7393653B2 (en) * 2002-09-06 2008-07-01 The Burnham Institute Methods of modulating cell death based on the Bit1/AES regulatory pathway
CN1829796B (zh) * 2002-10-09 2010-05-26 Cid株式会社 新的日本脑炎病毒的全长基因组RNA、来自它的感染性的JEV cDNA及其应用
DE10344799A1 (de) 2003-09-26 2005-04-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
WO2005039533A1 (en) 2003-10-15 2005-05-06 Medigene Ag Method of administering cationic liposomes comprising an active drug
BRPI0415533A (pt) 2003-10-24 2006-12-26 Immunaid Pty Ltd método de terapia
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
DE102004023187A1 (de) 2004-05-11 2005-12-01 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
DE102004057303A1 (de) 2004-11-26 2006-06-01 Merck Patent Gmbh Stabile Kristallmodifikationen von DOTAP Chlorid
EP1838342A2 (en) 2004-12-29 2007-10-03 Mannkind Corporation Methods to bypass cd+4 cells in the induction of an immune response
GB0507997D0 (en) 2005-02-01 2005-05-25 Powderject Vaccines Inc Nucleic acid constructs
EP3530736A3 (en) 2005-05-09 2019-11-06 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (pd-1) and methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
KR101704734B1 (ko) 2005-07-01 2017-02-09 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
DE102005041616B4 (de) 2005-09-01 2011-03-17 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Melanom-assoziierte MHC Klasse I assoziierte Oligopeptide und für diese kodierende Polynukleotide und deren Verwendungen
EP1762575A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy
DE102005046490A1 (de) * 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
CA2632900A1 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 Research Corporation Technologies, Inc. Hybrid 3' untranslated regions suitable for efficient protein expression in mammalian cells
JP2009532664A (ja) 2006-02-27 2009-09-10 アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・フォー・アンド・オン・ビハーフ・オブ・アリゾナ・ステイト・ユニバーシティ 癌の治療のためのノボペプチドの同定および使用
CA2639070A1 (en) 2006-04-13 2007-11-01 Oncomethylime Sciences S.A. Novel tumour suppressor
JP2010504356A (ja) 2006-09-20 2010-02-12 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー 抗ｂ７−ｈ１抗体を用いた癌及び感染性疾患の組合せ療法
DE102006060824B4 (de) 2006-12-21 2011-06-01 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Nachweis von individuellen T-Zell-Reaktionsmustern gegen Tumor-assoziierte Antigene (TAA) in Tumorpatienten als Basis für die individuelle therapeutische Vakzinierung von Patienten
CA2673870A1 (en) 2006-12-27 2008-07-10 Emory University Compositions and methods for the treatment of infections and tumors
EP2135080A4 (en) * 2007-03-08 2010-12-01 Switchgear Genomics FUNCTIONAL NETWORKS FOR THE CHARACTERIZATION OF TREATMENT OF REGULATORY ELEMENTS IN NON-TRANSLATED REGIONS OF GENES
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
US8140270B2 (en) 2007-03-22 2012-03-20 National Center For Genome Resources Methods and systems for medical sequencing analysis
PT2170959E (pt) 2007-06-18 2014-01-07 Merck Sharp & Dohme Anticorpos para o receptor humano de morte programada pd-1
DK2205618T3 (en) * 2007-09-26 2017-02-20 Intrexon Corp SYNTHETIC 5 'NON-TRANSLATED REGIONS, EXPRESSION VECTORS AND PROCEDURES FOR INCREASING TRANSGENIC EXPRESSION
EP2060583A1 (en) 2007-10-23 2009-05-20 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
KR101606219B1 (ko) 2008-03-24 2016-03-24 4에스체 악티엔게젤샤프트 신규 치환된 이미다조퀴놀린
AU2009236306B2 (en) 2008-04-17 2015-04-02 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by enantiomers of cationic lipids
WO2010037402A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
DE102008061522A1 (de) 2008-12-10 2010-06-17 Biontech Ag Verwendung von Flt3-Ligand zur Verstärkung von Immunreaktionen bei RNA-Immunisierung
EA022786B1 (ru) 2009-07-31 2016-03-31 Этрис Гмбх Рнк с комбинацией из немодифицированных и модифицированных нуклеотидов для экспрессии белков
WO2011075838A1 (en) 2009-12-21 2011-06-30 Audigen Inc. Method of treating or preventing hearing loss
US9115402B2 (en) 2010-05-14 2015-08-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods of identifying tumor specific neoantigens
EP2857499A1 (en) 2010-10-01 2015-04-08 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3702460A1 (en) 2010-11-12 2020-09-02 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
DE102011102734A1 (de) 2011-05-20 2012-11-22 WMF Württembergische Metallwarenfabrik Aktiengesellschaft Vorrichtung zum Aufschäumen von Milch, Getränkebereiter mit dieser Vorrichtung und Verfahren zum Aufschäumen von Milch
LT2714071T (lt) * 2011-05-24 2019-10-10 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Individualizuotos vakcinos nuo vėžio
EP2771349B1 (en) 2011-09-16 2020-02-26 Iogenetics, LLC. Bioinformatic processes for determination of peptide binding
PT3682905T (pt) 2011-10-03 2022-04-07 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos e ácidos nucleicos modificados e respetivas utilizações
ES2923757T3 (es) 2011-12-16 2022-09-30 Modernatx Inc Composiciones de ARNm modificado
RU2491343C1 (ru) * 2011-12-23 2013-08-27 Общество с ограниченной ответственностью "Биотехнологический центр трансгенеза в фарминдустрии "Трансгенфарм" Генетические конструкции ltf3, ltf5, ltf7, ltf10, ltf11 для получения рекомбинантного лактоферрина человека (варианты)
WO2013106496A1 (en) 2012-01-10 2013-07-18 modeRNA Therapeutics Methods and compositions for targeting agents into and across the blood-brain barrier
WO2013120497A1 (en) * 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
WO2013124701A2 (en) 2012-02-20 2013-08-29 Universita' Degli Studi Di Milano New homo- and heterodimeric smac mimetic compounds as apoptosis inducers
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
JP6295512B2 (ja) * 2012-03-15 2018-03-20 株式会社豊田中央研究所 酵母における外来遺伝子の発現産物の生産方法、酵母における発現調節剤及びその利用
RU2658490C2 (ru) * 2012-03-27 2018-06-21 Кьюрвак Аг Искусственные молекулы нуклеиновых кислот для улучшенной экспрессии белков или пептидов
ES2660129T3 (es) * 2012-03-27 2018-03-20 Curevac Ag Moléculas de ácido nucleico artificiales que comprenden un 5'UTR-TOP
WO2013143698A1 (en) * 2012-03-27 2013-10-03 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules
US20130255281A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 General Electric Company System and method for cooling electrical components
MX364370B (es) 2012-07-12 2019-04-24 Persimmune Inc Vacunas contra el cancer personalizadas y terapias de celulas inmunes adoptivas.
WO2014028295A2 (en) 2012-08-17 2014-02-20 Dow Agrosciences Llc Use of a maize untranslated region for transgene expression in plants
WO2014093924A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
CA2890110C (en) 2012-11-01 2023-05-02 Factor Bioscience Inc. Methods and products for expressing proteins in cells
PT2922554T (pt) 2012-11-26 2022-06-28 Modernatx Inc Arn modificado nas porções terminais
WO2014164253A1 (en) 2013-03-09 2014-10-09 Moderna Therapeutics, Inc. Heterologous untranslated regions for mrna
US20160024181A1 (en) 2013-03-13 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
WO2014160243A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and purity assessment of rna molecules synthesized with modified nucleosides
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
WO2014144711A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
EP4279610A3 (en) 2013-03-15 2024-01-03 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
US20160032273A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
AU2014251207B2 (en) 2013-04-07 2019-06-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for personalized neoplasia vaccines
WO2014184684A2 (en) 2013-05-16 2014-11-20 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection of hematological cancers
RU2535871C1 (ru) * 2013-07-10 2014-12-20 Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом
WO2015014375A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Biontech Ag Tumor antigens for determining cancer therapy
CA2923029A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
WO2015038892A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
EP3049065A1 (en) 2013-09-26 2016-08-03 BioNTech AG Particles comprising a shell with rna
WO2015051173A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc Polynucleotide molecules and uses thereof
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015058780A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Biontech Ag Method and kit for determining whether a subject shows an immune response
US20170173128A1 (en) 2013-12-06 2017-06-22 Moderna TX, Inc. Targeted adaptive vaccines
US20150167017A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
AU2014375402B2 (en) * 2013-12-30 2020-10-01 CureVac SE Artificial nucleic acid molecules
CA2927254C (en) * 2013-12-30 2023-10-24 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
US20170007776A1 (en) 2014-02-05 2017-01-12 Biontech Ag Cannula, an injection or infusion device and methods of using the cannula or the injection or infusion device
BR112016020688B1 (pt) * 2014-03-09 2024-01-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vetores virais recombinantes, vírus adenoassociado recombinante, composição farmacêutica, bem como uso dos mesmos
HRP20220070T1 (hr) 2014-04-23 2022-04-01 Modernatx, Inc. Cjepiva nukleinske kiseline
WO2015172843A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Biontech Diagnostics Gmbh Methods and kits for the diagnosis of cancer
WO2016005004A1 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences
WO2016062323A1 (en) 2014-10-20 2016-04-28 Biontech Ag Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer
EP4023755B1 (en) * 2014-12-12 2023-04-26 CureVac SE Artificial nucleic acid molecules for improved protein expression
BR112017009835A2 (pt) 2014-12-30 2017-12-26 Curevac Ag moléculas de ácido nucleico artificiais
WO2016155809A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Lipid particle formulations for delivery of rna and water-soluble therapeutically effective compounds to a target cell
WO2017059902A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
JP2020190088A (ja) 2019-05-20 2020-11-26 株式会社豊田中央研究所 インフラ敷設管理システム

Also Published As

Publication number Publication date
BR112018003486A2 (pt) 2018-09-25
SI3636764T1 (sl) 2021-07-30
MX2018004160A (es) 2018-08-01
KR102688535B1 (ko) 2024-07-26
JP2024138270A (ja) 2024-10-08
WO2017060314A2 (en) 2017-04-13
BR112018003486B1 (pt) 2023-09-26
WO2017060314A3 (en) 2017-05-18
CY1122347T1 (el) 2021-01-27
AU2021206886B2 (en) 2023-12-14
IL258074A (en) 2018-05-31
JP7084565B2 (ja) 2022-06-15
KR20220025195A (ko) 2022-03-03
LT3337902T (lt) 2019-12-10
IL258074B (en) 2021-07-29
KR102363368B1 (ko) 2022-02-16
CA2998554A1 (en) 2017-04-13
PL3337902T3 (pl) 2020-01-31
BR122021025194A8 (pt) 2023-01-31
JP2018530332A (ja) 2018-10-18
AU2016335029A1 (en) 2018-04-19
PT3337902T (pt) 2019-10-30
JP2021048848A (ja) 2021-04-01
IL293020A (en) 2022-07-01
JP6844060B1 (ja) 2021-03-17
SG10201912558YA (en) 2020-02-27
HUE046982T2 (hu) 2020-04-28
HK1258262A1 (zh) 2019-11-08
EP3636764B1 (en) 2021-03-03
MX378808B (es) 2025-03-10
IL284651A (en) 2021-08-31
RS61684B1 (sr) 2021-05-31
KR20250126878A (ko) 2025-08-25
BR122021025194B1 (pt) 2023-09-26
HRP20210449T1 (hr) 2021-10-01
ES2753201T8 (es) 2020-04-16
IL326682A (en) 2026-04-01
DK3337902T3 (da) 2019-11-04
LT3636764T (lt) 2021-05-10
ES2866224T3 (es) 2021-10-19
AU2023278107A1 (en) 2024-01-04
AU2016335029B2 (en) 2021-04-29
CN108291230B (zh) 2022-12-20
CY1124066T1 (el) 2022-05-27
JP7277506B2 (ja) 2023-05-19
US12516333B2 (en) 2026-01-06
PT3636764T (pt) 2021-03-25
EP3337902A2 (en) 2018-06-27
MX2021000250A (es) 2021-04-12
PL3636764T3 (pl) 2021-07-05
KR20240118189A (ko) 2024-08-02
JP2021129563A (ja) 2021-09-09
NZ780870A (en) 2025-06-27
NZ780867A (en) 2025-05-30
RU2720934C2 (ru) 2020-05-14
NZ740946A (en) 2022-08-26
AU2023278107B2 (en) 2026-05-28
HK1256701A1 (en) 2019-10-04
ZA201800835B (en) 2020-05-27
SI3337902T1 (sl) 2019-12-31
US20190071682A1 (en) 2019-03-07
SMT202100157T1 (it) 2021-05-07
IL284651B (en) 2022-06-01
CA2998554C (en) 2024-04-30
US20230272406A1 (en) 2023-08-31
HUE055152T2 (hu) 2021-11-29
JP2021048847A (ja) 2021-04-01
ES2753201T3 (es) 2020-04-07
KR20180057647A (ko) 2018-05-30
IL293020B2 (en) 2026-07-01
JP7084302B2 (ja) 2022-06-14
JP2022050390A (ja) 2022-03-30
HRP20191907T1 (hr) 2020-02-07
US11492628B2 (en) 2022-11-08
EP3636764A1 (en) 2020-04-15
SMT201900643T1 (it) 2020-01-14
WO2017059902A1 (en) 2017-04-13
KR102848891B1 (ko) 2025-08-21
EP3868885A1 (en) 2021-08-25
RU2018112325A (ru) 2019-11-07
IL293020B1 (en) 2026-03-01
CN108291230A (zh) 2018-07-17
RU2018112325A3 (sr) 2019-11-07
BR122021025194A2 (sr) 2018-09-25
CA3223575A1 (en) 2017-04-13
AU2021206886A1 (en) 2021-08-12
DK3636764T3 (da) 2021-03-22
EP3337902B1 (en) 2019-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12516333B2 (en) 3′-UTR sequences for stabilization of RNA
RU2783165C1 (ru) Последовательности 3&#39;-utr для стабилизации рнк
HK40059835A (en) 3&#39; utr sequences for stabilization of rna
HK40027889B (en) 3&#39; utr sequences for stabilization of rna
HK40027889A (en) 3&#39; utr sequences for stabilization of rna
HK1256701B (en) 3&#39; utr sequences for stabilization of rna
HK1258262B (en) 3&#39; utr sequences for stabilization of rna