RS59549B1 - Novo antitelo na presepsin - Google Patents

Novo antitelo na presepsin

Info

Publication number
RS59549B1
RS59549B1 RS20191464A RSP20191464A RS59549B1 RS 59549 B1 RS59549 B1 RS 59549B1 RS 20191464 A RS20191464 A RS 20191464A RS P20191464 A RSP20191464 A RS P20191464A RS 59549 B1 RS59549 B1 RS 59549B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
presepsin
amino acid
seq
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20191464A
Other languages
English (en)
Inventor
Kamon Shirakawa
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mochida Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Publication of RS59549B1 publication Critical patent/RS59549B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

Oblast pronalaska
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela na presepsin ili na njihove fragmente koji vezuju antigen, koja su od koristi za merenje presepsina u uzorku.
Stanje tehnike
[0002] CD14 je poznati glikoprotein koji se eksprimira na površini membrane monocitnih ćelija i ima funkciju receptora LPS (lipopolisaharida). Postoje 2 oblika molekula CD14. Jedan je oblik CD14 koji se vezuje za membranu (mCD14) i koji se eksprimira na površini ćelije. Drugi oblik je rastvorljivi CD14 (sCD14). sCD14 koji imaju molekulsku težinu od oko 55 kDa i oko 49 kDa (u daljem tekstu označeni kao „visokomolekulski sCD14“) poznati su u struci i za ove sCD14 je objavljeno da ispoljavaju visok nivo u krvi pacijenata sa mnogim oboljenjima, kao što su sepsa, sindrom stečene imunodeficijencije, (AIDS), sindrom akutnog respiratornog distresa (ARDS) sistemski lupus eritematosus (SLE). Zbog toga se ovi visokomolekulski sDC14 ne smatraju kao markeri specifični za bolest. Videti, nepatentna dokumenta 1 i 2<.>
[0003] S druge strane, objavljeno je da postoje nove molekulske vrste sCD14, sCD14- ST (podtip solubilnog CD14 antigena, koji se takođe označava i kao presepsin), čija je koncentracija u krvi karakteristično povećana kod pacijenata sa sepsom.
[0004] sCD14-ST (presepsin) se odlikuje time što u SDS-PAGE pod neredukujućim uslovima svih sCD14 migrira do molekulske težine 13 ± 2 kDa i sadrži N-terminalni region CD14. sCD14-ST (presepsin) ima aminokiselinsku sekvencu u kojoj je C- terminalnii deo u velikoj meri deletiran u odnosu na aminokiselinsku sekvencu visokomolekulskog sCD14. i za razliku od visokomolekulskog sCD14, sCD14-ST (presepsin) nema sposobnost vezivanja kao LPS. Pored toga, presepsin ispoljava različitu imunogenost od visokomolekulskih sCD14, pa se stoga ovi molekuli mogu razlikovati upotrebom antitela. Koncentracija presepsina u krvi specifično raste kod pacijenata sa sepsom (vidi Patent Document 1). Štaviše, objavljeno je da koncentracija presepsina u krvi pacijenata ima više nivoe nego kod pacijenata sa sindromom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), koji se teško razlikuje od sepse. Stoga se presepsin smatra specifičnim dijagnostičkim markerom za sepsu. (vidi nepatentni dokument 3).
[0005] Obelodanjena su: zečje poliklonsko antitelo (S68 antitelo) i monoklonsko antitelo dobijeno iz pacova (F1146-17-2), koja specifično prepoznaju presepsin (vidi, Patentna dokuemnta 1 i 2.
[0006] Sada se praktično za merenje presepsina koristi sistem sa zečjim poliklonskim antitelom kao specifičnim antitelom za presepsin, i kompleti kojima se izvodi merenje nalaze se na tržištima Evrope i Japana (PATHFAST™ Presepsin, Mitsubishi Chemical Medience Corporation).
[0007] Pokušano je dobijanje humanog monoklonskog antitela na presepsin koje bi se moglo praktično primeniti, ali nije dobijeno antitelo zadovoljavajućih osobina.
Dokumenta iz stanja tehnike
Patentna dokumenta
[0008]
Patentni dokument 1: WO 2005/108429.
Patentni dokument 2: WO 2004/044005.
[0009]
Nepatentni dokument 1: Hayashi, et al., Infection and Immunity, 67: 417-420, 1999. Nepatentni dokument 2: Lawn, et al., Clinical & Experimental Immunology, 120: 483-487, 2000.
Nepatentni dokument 3: Yaegashi, et al., Journal of Infection and Chemotherapy, 11: 234-238, 2005.
Opis pronalaska
PROBLEM KOJI SE REŠAVA PREDMETNIM PRONALASKOM
[0010] Predmet ovog pronalaska je obezbeđivanje novog monoklonskog antitela ili fragmenta tog antitela koji vezuje antigen, koji imaju odličnu reaktivnost sa presepsinom i koji su pogodni za merenje presepsina u uzorku.
[0011] Pored toga, drugi predmet ovog pronalaska je obezbeđivanje monoklonskog antitela ili fragmenta tog antitela koji vezuje antigen, koji omogućuju vrednost merenja presepsina koje je povoljno korelisano sa vrednošću merenja dobijenom pomoću antitela S68 (poliklonsko antitelo dobijeno imunizacijom zeca S68 peptidom, opisano u Primeru 1 WO 2004/044005).
[0012] Pored toga, drugi predmet ovog pronalaska je obezbeđivanje monoklonskog antitela ili fragmenta tog antitela koji vezuje antigen, koji omogućuju merenja vrednosti presepsina, na koje ne utiče neka interferirajuća supstanca u uzorku (npr. triglicerid) i koji omogućuju merenje presepsina sa velikom preciznošću, čak i u slučajevima uzorka koji ima čitav niz različitih faktora fona.
Način rešavanja problema
[0013] Kao što je prikazano ovde, dobijen je čitav niz monoklonskih antitela iz mnogih hibridoma dobijenih imunizovanjem zeca S68 peptidom putem više selekcionih stupnjeva, kao što su vezivna aktivnost sa S68 peptidom i vezivna aktivnost sa presepsinom.
Konstruisan je ELISA sistem za merenje presepsina. Kao rezultat ispitivanja reaktivnosti sa presepsinom, dobijena su antitela čija je reaktivnost sa presepsinom poboljšana za oko 10 000 puta u poređenju sa ELISA sistemom koji koristi F1146-17-2 (monoklonsko antitelo dobijeno imunizacijom pacova S68 peptidom, opisanom u Primeru 2 WO 2004/044005 Al). Aminokiselinska sekvenca CDR dela varijabilnog regiona F1146-17-2 opisana je u SEQ ID NO:42 do SEQ ID NO:47.
[0014] Nivoi presepsina u krvi više pacijenata mereni su u ELISA sistemu korišćenjem svakog od ovih zečjih monoklonskih antitela i izvršena je analiza korelacije sa vrednostima merenja ELISA sistemom sa S68 antitelom. U rezultatu, određeno je da postoje neka antitela koja pokazuju visoku korelaciju i neka tela koja pokazuju nisku korelaciju. Dalje je pokazano da u razlici između vrednosti korelacija može učestvovati prisustvo triglicerida (TG) u uzorku. Da bi se dobilo antitelo koje je povoljno korelisano sa merenjem presepsina antitelom S68, na koje ne utiče prisustvo TG u uzorku, i koje je pogodno za merenje presepsina u uzorku, nastavljeno je istraživanje i određeno je da razliku stvara antitelo koje zavisi od epitopa koje antitelo prepoznaje. Drugim rečima, određeno je da do razlike dolazi zbog interferencije triglicerida (označenom i kao TG) u uzorku i/ili epitopa.
[0015] Određeno je da antitelo koje pokazuje bolje performanse u određivanju presepsina prepoznaje aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO.:l (krvdadadpr; ili region koji odgovara položajima 52 do položaja 61 u Sequence No.3 (humani solubilni CD14 pune dužine). To je novi epitop, otkriven u predmetnom pronalasku.
[0016] Aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od P03 sekvence kompetitivno inhibira za oko 50% ili više antitelo koje prepoznaje ovu P03 sekvencu kao epitop u reakciji između antitela i presepsina. S druge strane, kompetitivna inhibicija u reakciji između antitela i presepsina svake aminokiselinske sekvence koja se sastoji od SEQ ID NO:35 do SEQ ID NO:41 bila je manja od 20%, što znači da je kompetitivna inhibicija aminokiselinskom sekvencom koja se sastoji od SEQ ID NO:36 (što odgovara Položaju 49 do Položaja 58 humanog solubilnog CD14 pune dužine: označenog i kao sekvenca P02), aminokiselinskom sekvencom koja se sastoji od SEQ ID NO:37 (što odgovara Položaju 55 do Položaja 64 humanog solubilnog CD14 pune dužine: označenog i kao sekvenca P04 sequence), ili aminokiselinskom sekvencom koja se sastoji od SEQ ID NO:38 (što odgovara Položaju 58 do Položaja 67 humanog solubilnog CD14 pune dužine: označenog i kao sekvenca P05) bila manja od 20%. Tako je time određeno da je antitelo koje prepoznaje Р03 sekvencu kao epitop visoko specifično za sekvencu Р03.
[0017] Istovremeno je uočeno da među antitelima dobijenim iz hibridoma, antitela koja prepoznaju sekvencu P04 i sekvencu P05 u presepsinu, nisu pogodna za merenje presepsina, pošto su ova antitela osetljiva na interferenciju od strane TG u uzorku u vreme merenja presepsina, i tako dalje. Na taj način, bilo je neočekivano da malu razliku u položaju epitopa koji prepoznaje antitelo utiče na performansu antitela.
[0018] Pored toga, u aminokiselinskoj sekvenci, u kojoj je asparaginska kiselina na položaju 8 u P03 sekvenci (SEQ ID NO:1) zamenjena alaninom, kompetitivna inhibicija u reakciji između antitela i presepsina je manja od 20%. S druge strane, nađeno je da aminokiselinska sekvenca u kojoj je bilo koja amino kiselina od položaja 2 do položaja 7, položaja 9 i položaja 10 sekvence P03 (SEQ ID NO:1) zamenjena alaninom (ili glicinom), kompetitivno inhibira reakciju između antitela i presepsina 50% ili više.
[0019] Dalje, da bi se napravilo antitelo bolje performanse za merenje presepsina, učinjene su izmene CDR sekvenci zasnovanih na sekvencama antitela koja prepoznaju P03 sekvencu kao epitop. Osim toga, napravljena su antitela korišćenjem postupka ekspozicije na fazima. Nastala antitela su odabrana na osnovu standarda za dobijanje antitela sa jednakim ili boljim performansama nego antitela dobijena iz hibridoma.
[0020] Dobijena su antitela iz hibridoma koja prepoznaju sekvencu P03 kao epitop, kao i selektovana izmenjena antitela, i potvrđeno je da imaju izuzetno visok afinitet za presepsin, i otporna su na uticaj interferirajućih supstanci u uzorku (naročito triglicerida). Ova antitela su povoljno usaglašena sa sistemom merenja koji koristi antitelo S68. Ova antitela su pogodna za merenje presepsina u uzorku, na primer, sendvič ELISA testom za merenje presepsina.
[0021] Predmetni pronalazak je opisan u nastavku.
(1) Antitelo na presepsin, ili fragment antitela koji vezuje antigen, gde antitelo ili fragment antitela sadrži:
(a) VH koji ima VH CDRl, koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:7, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:97, i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:9, i VL koji ima VL CDRl, koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:22, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:23, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca Sequence NO:24;
(b) VH koji ima VH CDRl, koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:7, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:8, i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:94, i VL koji ima VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:22, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:23, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca Sequence NO:24;
(c) VH koji ima VH CDRl, koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:4, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:5, i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:6, i VL koji ima VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:19, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:20, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca Sequence NO:21;
(d) VH koji ima VH CDRl, koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:7, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:8, i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:9, i VL koji ima VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:22, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:23, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca Sequence NO:24; ili
(e) VH koji ima VH CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:10, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:11, i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:12, i VL koji ima VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:25, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:26, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca Sequence NO:27.
(2) Antitelo ili fragment tog antitela koji vezuje antigen, prema zahtevu 1, gde se antitelo ili fragment vezuju za presepsin sa afinitetom manjim od 10-8 M (KD).
(3) Antitelo ili fragment tog antitela koji vezuje antigen, prema zahtevima 1 ili 2, gde se vezivanje između antitela i presepsina kompetitivno inhibira za 50% ili više u reakcionom sistemu u kome je jedna aminokiselinska sekvenca koju čini sekvenca SEQ ID NO:1, izložena kompetitivnoj reakciji (apsorbanciji), tako da je vezivanje između antitela ili fragmenta za presepsin inhibirano.
(4) Antitelo ili fragment tog antitela koji vezuje antigen, prema bilo kom zahtevu od 1 do 3, gde je kompetitivna inhibicija za vezivanje između antitela i presepsina aminokiselinskom sekvencom manja od 20% u reakcionom sistemu u kome je jedna aminokiselinska sekvenca izložena kompetitivnoj reakciji (apsorbanciji), tako da je vezivanje između antitela ili fragmenta za presepsin inhibirano i gde aminokiselinsku sekvencu čini sekvenca u kojoj je asparaginska kiselina na položaju 8 u SEQ ID NO:1 zamenjena alaninom.
(5) Antitelo ili fragment tog antitela koji vezuje antigen, prema bilo kom zahtevu od 1 do 4, gde
(i) se antitelo ne vezuje specifično za visokomolekulski solubila CD14; i/ili
(ii) odnos uzorka koji ispoljava stepen razdvajanja vrednosti merenja presepsina ±20% ili manji, kada je koncentracija triglicerida (TG) u uzorku 20 mg/mL, ukazuje na 50% ili više u TG interferencionoj probi na mnogo uzoraka urađeno korišćenjem navedenog antitela i/ili (iii) vrednost merenja presepsina u uzorku, dobijena primenom navedenog antitela pokazuje koeficijent korelacije od 0,9 ili veći, sa vrednošću merenja u uzorku korišćenjem antitela S68, i/ili
(iv) fragment antitela koji vezuje antigen je fragment antitela koji vezuje antigen selektovan iz grupe koju čine Fab, Fab', F (ab’)2, jednolančano antitelo (scFv), dimerizovan V region (dijatelo), V region stabilizovan disulfidnim vezama (dsFv), sc (Fv)2, polipeptid koji sadrži CDR, polipeptid koji sadrži varijabilni region teškog lanca i polipeptid koji sadrži varijabilni region lakog lanca.
(6) . Polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, prema bilo kom navedenom članu od (1) do (5).
(7) Rekombinantni vektor koji sadrži polinukleotid prema (6).
(8) Transformisani soj dobijen uvođenjem rekombinantnog vektora prema (7) u ćelijudomaćina
(9) Transformisani soj prema (8), gde je ćelija-domaćin CHO ćelija.
(10) Metod za dobijanje antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, gde metod uključuje kultivisanje transformisanog soja prema navedenim (8) ili (9).
(11) Komplet za merenje presepsina, gde komplet sadrži bar antitelo ili fragment antitela koji vezuje antigen, prema bilo kom od navedenih (1) do (5).
(12) Komplet za detekciju sepse ili pomoć u detekciji/dijagnozi sepse, gde komplet sadrži bar antitelo ili fragment prema bilo kom od navedenih (1) do (5).
(13) Komplet za merenje presepsina prema navedenom (11), gde se komplet za merenje presepsina koristi za detekciju ili evaluaciju najmanje jedne bolesti odabrane za razlikovanje između sepse i sindroma sistemskog zapaljenjskog odgovora (SIRS), procene rizika ozbiljnosti sepse, prognostičkog predviđanja sepse (predviđanja mortaliteta), procenu stepena ozbiljnosti sepse, otkrivanje infekcija na mestu hirurškog zahvata, otkrivanje diseminovane intravaskularne koagulacije (DIC), otkrivanje infektivnog DIC, otkrivanje srčanih oboljenja, otkrivanje respiratornih infekcija povezanih sa bakterijskom infekcijom, otkrivanje zapaljenjske bolesti creva (Kronova bolest, ulcerozni kolitis), otkrivanje febrilne neutropenije (FN), otkrivanje hemofagocitnog sindroma (HPS) i ocenu funkcije fagocita. (14) Postupak za merenje presepsina, koji obuhvata korak kontakta bar sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen, prema bilo kom od navedenih (1) do (5) i uzorka koji sadrži presepsin.
(15) Postupak za detekciju sepse ili pomoć u detekciji/dijagnozi sepse, koji ima bar nižeopisane stupnjeve:
1) stupanj merenja koncentracije presepsina u uzorku subjekta koji koristi antitelo na presepsin ili fragment antitela koji vezuje antigen, prema bilo kom od od navedenih (1) do (5), i
2) stupanj u kome se određuje da li je dobijena koncentracija presepsina u navedenom 1) visoka vrednost u poređenju sa graničnom (cut-off) vrednošću, ili nije.
(16) Metod za skrinovanje antitela na presepsin ili fragmenta koji vezuje antigen, gde metod obuhvata bar nižeopisane stupnjeve:
1) stupanj dobijanja kandidata za antitelo na presepsin ili kandidata za fragment antitela koji vezuje antigen i
2) stupanj odbira antitela ili fragmenta antitela koji vezuje antigen, u kome je vezivanje između antitela i presepsina kompetitivno inhibirano 50% ili više u reakcionom sistemu u kome je aminokiselinska sekvenca koju čini SEQ 1D NO:1 izložena kompetitivnoj reakciji, tako da je vezivanje između datog antitela i presepsina inhibirano
Efekat inhibicije
[0022] Prema ovom pronalasku, obezbeđeno je antitelo i njegov fragment antitela koji vezuje za antigen koji je izuzetan u reaktivnosti sa presepsinom i pogodan za merenje presepsina u uzorku, pri čemu se može poboljšati kvalitet i tačnost merenja presepsina. Predmetni pronalazak pruža mogućnost obezbeđivanja antitela koja imaju visoki afinitet za presepsin koja su takođe prilagodljiva za kvantitativnost manje količine presepsina na nivou normalne osobe i omogućava poboljšanje osetljivosti. Pored toga, predmetni pronalazak pruža mogućnost obezbeđivanja antitela koje je otprono na uticaj interferirajuće (ometajuće) supstance na uzorku, što omogućava merenje u sendvič ELISA sistemu da bi se izbegao uticaj pojedinačne razlike (pozadinski faktor subjekta) uzorka seruma i proizvodi merenja sa velikom preciznošću. Ovakva merenja, koja imaju visoku specifičnost, moguća su samo sa antitelom koje se specifično veže samo za presepsin, a ne vezuje se specifično za sCD14 velike molekulske težine, u sendvič ELISA sistemu.
[0023] Problemi koji se tiču merenja presepsina korišćenjem poliklonskih antitela (uključujući osiguranje homogenosti između serija, probleme dobijanja i troškove) mogu se rešiti, pri čemu se mogu obezbediti antitela izuzetne praktičnosti. Drugim rečima, monoklonsko antitelo ima prednost u tome što ga može proizvesti po niskoj ceni, stabilno i efikasno, i može se održavati ujednačen kvalitet takvog antitela.
Kratak opis crteža
[0024]
Na slici 1 prikazani su rezultati iz niza TG interferencijalnih testova u krvnom serumu normalnog čoveka, koristeći antitela F1466-26 (A), F1466-5 (B) i F1466-19 (C).
Slika 2 je lista varijanti dobijenih u primeru 8 i primeru 12.
Slika 2-1 je lista varijanti dobijenih u primeru 8 i primeru 12 i nastavljena je sa slike 2.
<Slika 2-2 je lista varijanti dobijenih u primeru 8 i primeru 12 i nastavljena je sa slike>2-1<.>
Realizacije za izvođenje pronalaska
[0025] U daljem tekstu, pronalazak je detaljnije opisan.
1. Antitelo na presepsin ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen, pri čemu antitelo ili fragment posebno prepoznaje epitop koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1.
[0026] U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo na presepsin ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen, pri čemu antitelo ili fragment posebno prepoznaje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 kao novi epitop presepsina.
[0027] Izraz "specifično prepoznaje epitop koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1" ukazuje da antitelo specifično prepoznaje, kao epitop, sekvencu koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 1 od sekvenci presepsina.
[0028] Kao što je ovde korišćeno, fraza "fragment antitela koji vezuje antigen" označava deo parcijalnih fragmenata antitela koji specifično prepoznaju epitop koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, fragment koji ima isto svojstvo vezivanja antigena kao originalno antitelo.
[0029] Kao što se ovde koristi, "identitet sekvence" ili "homologija sekvence" odnosi se na odnos između dve ili više polinukleotidnih sekvenci ili aminokiselinskih sekvenci, odnosno referentne sekvence i date sekvence koje treba uporediti sa referentnom sekvencom. Identitet ili homologija sekvenci se određuje upoređivanjem date sekvence sa referentnom sekvencom nakon što su sekvence optimalno usklađene da se dobije najveći stepen sličnosti sekvenci, što je određeno podudaranjem nizova takvih sekvenci. Nakon takvog poravnanja, identitet sekvence utvrđuje se na osnovu položaja prema položaju, npr. sekvence su "identične" na određenom položaju ako su na tom položaju nukleotidi ili ostaci, identični. Ukupni broj takvih položaja identiteta se zatim deli ukupnim brojem nukleotida ili ostataka u referentnoj sekvenci da bi se dobio % identiteta sekvence. Identitet sekvence može se lako izračunati poznatim metodama, uključujući ali ne ograničavajući se na one opisane u Computational Molecular Biology, Lesk A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988);
Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, GrifEn A. M., and GriffEn H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov M. and Devereux J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); i Carillo H., and Lipman D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Poželjni postupci za određivanje identiteta sekvence dizajnirani su tako da daju najveće podudaranje između testiranih sekvenci. Metode za određivanje identiteta sekvence kodirane su u javno dostupnim računarskim programima koji određuju identitet sekvence između datih sekvenci. Primeri takvih programa uključuju, ali nisu ograničeni na, programski paket GCG (Devereuk et al., Nuc. Ac. Res., 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul et al, J. Molec, Biol, 215: 403-410 (1990)). Program BLASTX javno je dostupan od NCBI i drugih izvora.
[0030] Postupak za određivanje epitopa nije posebno ograničen u predmetnom pronalasku, na primer određivanje se može izvršiti postupkom opisanim u Primeru 6.
1
[0031] Antitelo predmetnog pronalaska može se karakterisati kompetitivnom inhibicijom od 50% ili više za vezivanje između antitela i presepsina u skladu sa reakcionim sistemom (poželjno korišćenjem apsorbancije) u kome je P03 peptid (sekvenca aminokiselina predstavljena sa SEQ ID NO: 1) je korišćen za kompetitivnu reakciju za inhibiciju vezivanja između antitela i presepsina. Poželjno, reakcioni sistem je sendvič ELISA. Poželjnije, reakcioni sistem je sendvič ELISA korišćenjem (a) antitela ili fragmenta predmetnog pronalaska i (b) antitela F1106-13-3 ili antitela F1031- 8-3. Sekvenca aminokiselina predstavljena sa SEQ ID NO: 1 odgovara položaju 52 do položaja 61 sekvence aminokiselina (SEQ ID NO: 3) humanog rastvorljivog CD14 cele dužine. Poželjno, kompetitivna inhibicija vezivanja između antitela predmetnog pronalaska i presepsina je manja od 20% Р01 peptida (aminokiselinska sekvenca predstavljena pozicijom 46 do položaja 55 u SEQ ID NO: 3), P02 peptida ( sekvenca aminokiselina predstavljena položajem 49 do položaja 58 iste sekvence), P05 peptida (sekvenca aminokiselina predstavljena položajem 58 do položaja 67 iste sekvence), P06 peptida (sekvenca aminokiselina predstavljena položajem 61 do položaja 70 iste sekvence), P07 peptida (sekvenca aminokiselina predstavljena položajem 64 do položaja 73 iste sekvence) ili P08 peptida (sekvenca aminokiselina predstavljena položajem 67 do položaja 76 iste sekvence). Poželjno, kompetitivna inhibicija vezivanja između antitela predmetnog pronalaska i presepsina je manja od 20% P04 peptida (aminokiselinska sekvenca predstavljena položajem 55 do položaja 64 u SEQ ID NO: 3).
[0032] Alternativno, kao jedan od drugih postupaka za određivanje epitopa, takođe je moguće videti aktivnost vezivanja između parcijalne sekvence (npr. P03 peptid) objektivnog antigena i antitela, kao što je opisano u, na primer, Primeru 9- ( 4).
[0033] Jedna realizacija predmetnog pronalaska obezbeđuje antitelo na presepsin koje vezuje sekvencu u kojoj je jedna ili više amiono kiselina koje nisu aspartanska kiselina položaja 8 u P03 sekvenci (SEQ ID NO: 1) је/ su supstituisani. Broj supstituisanih aminokiselina je, poželjno dve ili manje aminokiselina, i poželjnije, jedna aminokiselina.
[0034] Na primer, u jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo na presepsin koje vezuje P03 ili sekvencu amino kiselina sa 90% identiteta sekvence ili više. Ciljni epitop može da deli 90, 91, 92, 93, 94, 95,96, 97, 98, 99 ili 100% identičnost sekvenci sa P03. U nekim rešenjima, antitelo na presepsin specifično za sekvencu koja deli 90% identitet sekvence ili više sa P03 može biti monoklonsko antitelo.
[0035] Antitelo predmetnog pronalaska je antitelo koje specifično prepoznaje presepsin. Presepsin (sCD14-ST) je rastvoran fragment CD14 i označava supstancu koja ima sledeća svojstva 1) do 3).
- Molekulsku težinu 13 ± 2 kDa prema SDS-PAGE u neredukujućim uslovima, - Ima aminokiselinsku sekvencu iz položaja 1 do pozicije 11 SEQ ID NO: 3 na N-terminalnoj sekvenci, i
- Specifično vezuje antitelo pripremljeno upotrebom peptida koji se sastoji od 16 aminokiselinskih ostataka opisanih u SEQ ID NO: 2 za antigen.
Kako se ovde koristi, presepsin znači ljudski presepsin, osim ako je posebno drugačije opisano.
[0036] Pored toga, u predmetnom pronalasku, presepsin može biti supstanca koja ima aktivnost presepsina, kao što je ne samo standard za presepsin (rsCD14-ST opisan u primeru 16 u WO 2005/108429), već i rsCD14ST-Fc (kao opisano u Primeru 9- (2) u daljem tekstu).
[0037] Kao što je ovde opisano, "antitelo specifično prepoznaje" znači antitelo koje imunološki prepoznaje subjekat za specifično prepoznavanje i / ili antitelo koje pokazuje tipičnu reakciju antigen-antitelo sa subjektom za specifično prepoznavanje. Kada se vezivanje između antitela i subjekta za specifično prepoznavanje izražava afinitetom, konstanta ravnotežne disocijacije (KD) je uglavnom manja od 110<-7>M. Antitelo predmetnog pronalaska specifično prepoznaje jedino presepsin. Glavni rastvoran CD14 prisutan u ljudskoj krvi je rastvorani CD14 od oko 55 kDa i oko 49 kDa (sCD14 velike molekulske težine). Antitelo predmetnog pronalaska se ne vezuje specifično za sCD14 velike molekulske težine. Što se tiče sCD14 velike molekulske težine, može se upotrebiti CD14 čoveka pune dužine koji se sastoji od aminokiselinske sekvence opisane u SEQ ID NO: 3 ili se može pripremiti apsorpcijom na afinitetnoj koloni, upotrebom antitela 3C10 iz telesne tečnosti normalnog čoveka, za primer (vidi, primer 23 u WO 2005/108429).
[0038] U jednom aspektu, antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska ima odličnu reaktivnost za presepsin, i stoga je koristan za merenje presepsina u uzorku. Na primer, presepsin u uzorku se može meriti uspostavljanjem sistema sendvič ELISA upotrebom antitela ili njegovog fragmenta antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska.
[0039] U poređenju sa F1146-17-2 (monoklonskoo antitelo dobijeno iz pacova, opisano u Primeru 2 u WO 2004/044005), antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen je pogodniji za detekciju prisutnog presepsina u količini u tragovima u uzorku, s obzirom na činjenicu da se reaktivnost sa presepsinom povećava za oko 10000 puta u sistemu sendvič ELISA (primer 4). Drugim rečima, u poređenju sa F1146-17-2, antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska mogu da se okarakterišu tako što se reaktivnost sa presepsinom povećava 10000 puta ili više u odnosu na odnos koncentracije presepsina.
[0040] Kod pacijenta sa sepsom, objaveljno je da je koncentracija presepsina u krvi karakteristično povećana. Antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska poželjno se koristi za detekciju sepse. Antitelo predmetnog pronalaska ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen poželjno je antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen za koji je razlika u vrednosti merenja presepsina primećena kada se sendvič ELISA realizovana korišćenjem ovog antitela i meren je uzorak dobijen od pacijenta sa sepsom i uzorak od normalne osobe, kao što je prikazano u primeru 1.
[0041] Antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska je pogodno antitelo koje nema problema sa uticajem ometajuće/interferirajuće supstance u uzorku kada je merenje presepsina u uzorku izvedeno uspostavljanjem sistema za merenje.
[0042] U predmetnom pronalasku, interferirajuća supstanca označava supstancu čije prisustvo potencijalno ima uticaja na mernu vrednost presepsina (u daljem tekstu, takođe nazivan ,,interferirajuća“). Primeri ovoga uključuju trigliceride (takođe označeni kao TG), bilirubin, hemoglobin, reumatoidni faktor i holesterol. U predmetnom pronalasku, poželjna interferirajuća supstanca za procenu antitela je triglicerid (TG).
[0043] Kao jedan pokazatelj evaluacije testa interferencije (ometanja), odstupanje vrednosti merenja presepsina u trenutku dodavanja određene količine interferirajuće supstance uzorku od vrednosti merenja presepsina iz istog uzorka bez dodavanja interferirajuće supstance, može se izraziti kao stepen razdvajanja (%). Dalje, stepen razdvajanja (%) može se koristiti za procenu indikatora testa interferencije (ometanja). Stepen razdvajanja merne vrednosti prema dodatku interferirajuće supstance izražava se na sledeći način:
Stepen razdvajanja (%) = {(merne vrednosti presesina nakon dodavanja interferirajuće susptance)- (merne vrednosti presepsina bez dodavanja interferirajuće supstance)}/ (merne vrednosti presepsina bez dodavanja interferirajuće susptance) х100
[0044] Kao što je ovde korišćen, izraz "nema problema sa uticajem ometajuće / interferirajuće supstance" može se opisati na sledeći način: u interferencijskom testu koji koristi veći broj uzoraka, na primer, odnos uzorka koji pokazuje stepen razdvajanja ± 20% ili manji, a bolje ± 10% ili manji je veliki, pri čemu stepen razdvajanja ukazuje na vrednost dobijenu merenjem presepsina u skladu sa dodatkom
1
određene količine ometajuće supstance. Izraz "odnos uzorka je visok" kode većeg broja uzoraka generalno ukazuje na 50% ili više, poželjno 60% ili više, poželjnije 70% ili više, još poželjnije 80% ili više, a naročito poželjno 90% ili više veći broj uzoraka.
[0045] U vezi sa testom interferencije TG, na primer, moguće je da se test interferencije izvodi na većem broju uzoraka i oni koji imaju visok odnos uzorka koji pokazuju vrednosti merenja stepena razdvajanja presepsina od ± 20% ili manje još bolje ± 10% ili manje, kada koncentracija TG iznosi 20 mg / ml u uzorku dodavanjem TG, koriste se kao jedan indikator. Jedna poželjna realizacija predmetnog pronalaska je kada se TG interferencijalni test izvodi korišćenjem sistema merenja korišćenjem antitela predmetnog pronalaska, pri čemu antitelo pokazuje visoki odnos uzorka u kome je vrednosti merenja stepena razdvajanja presepsina od ± 20% ili manje, a poželjnije ± 10% ili manje, kada je koncentracija TG 20 mg/ml.
[0046] Alternativno, na primer, vrednosti merenja stepen razdvajanja presepsina kada koncentracija TG u uzorku iznosi 20 mg / ml, može se dobiti u većem broju uzoraka, i može se koristiti kao jedan indeks koji predstavlja prosek stepen razdvajanja je ± 20% ili manja, a bolje ± 10% ili manje. Jedna od poželjnih realizacija antitela predmetnog pronalaska je antitelo u kome prosečna vrednost merenja stepena razdvajanja presepsina pri koncentraciji TG u uzorku od 20 mg / ml iznosi ± 20% ili manje, i još bolje ± 10% ili manje, kada je TG interferencijski test sa više uzoraka izveden sistemom merenja koji koristi antitelo.
[0047] U NCEP-ATPIII koji je smernica za dislipidemiju u SAD-u, opisano je da je manje od TG150 mg / dl, normalna vrednost, TG150 do 200 mg / dl je granična vrednost, a TG200 do 499 mg / dl je visoka vrednost (visoka), a 500 mg / dl ili više je izuzetno visoka vrednost (vrlo visoka). Za koncentraciju TG od 20 mg / ml (= 2000 mg / dl) u uzorku može se reći da je stanje u kojem je koncentracija TG izuzetno visoka, u svetlu gore pomenutog standarda.
[0048] U testu interferencije TG ovog primera, vrednosti merenja stepena razdvajanja presepsina meri se u tri tačke koncentracije TG u uzorku od 6,7 mg / ml, 13,3 mg / ml i 20 mg / ml. Primećena je tendencija da je stepen razdvajanja takođe mali pri koncentraciji TG u uzorku od 6,7 mg / ml i 13,3 mg / ml u antitelu u kojem je mali stepen razdvajanja pri koncentraciji TG u uzorku od 20 mg / ml (sistem za merenje) u poređenju sa antitelom kod koga je visok stepen odvajanja.
[0049] TG interferencijski test može se izvesti korišćenjem seruma normalnog čoveka. Kako uzorak nonnalne osobe (tj. neseptične osobe/osobe koje nisu obolele od sepse) ima nisku koncentraciju presepsina, kada se podvrgne interferenciji TG, merne vrednosti stepena razdvajanja inflamacije mogu lako da postanu velike. Postojećim testom, ako se može izmeriti manja količina presepsina u uzorku, indikativno je da test ima dobru preciznost. Na primer, stepen razdvajanja vrednosti merenja presepsina u koncentraciji TG u uzorku poželjno je ± 100% ili manje, još bolje je ± 70% ili manje, dalje poželjno je ± 50% ili manje, a naročito poželjno je ± 20% ili manje . Poželjno je da se test izvede na više uzoraka, kao u gore pomenutom testu.
[0050] Dalje, antitelo ili fragment antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska takođe se može proceniti na osnovu poređenja merene vrednosti stepena razdvajanja presepsina dobijenog dodavanjem interferencijalne supstance za antitelo i stepena razdvajanja S68 antitela pod istim uslovima. Prema jednoj poželjnoj realizaciji, antitelo predmetnog pronalaska i antitelo S68 pokazuju slične stepene razdvajanja.
[0051] U vezi sa TG interferencijskim testom, procena se takođe može izvršiti visokim odnosom uzorka koji pokazuje 20% ili manje, a poželjnije 10% ili manje razlike između vrednosti merenja stepena razdvajanja kada je koncentracija TG 20 mg / mL u uzorku prema dodatku TG u sistem merenja koristeći antitelo predmetnog pronalaska i stepen razdvajanja antitela S68 pod istim uslovima. Što se tiče razlike u stepenu razdvajanja, kada je stepen razdvajanja merne vrednosti dobijene iz antitela predmetnog pronalaska 5%, a stepen razdvajanja merne vrednosti dobijene iz antitela S68 je -10%, na primer, razlika u stepenu razdvajanja izračunata je kao 15%.
[0052] Kao uzorak korišćen u interferencijskom testu, mogu se koristiti uzorci opisani u drugoj realizaciji predmetnog pronalaska. U slučaju TG interferencionog testa, uzorak je poželjno, serum ili plazma.
[0053] Što se tiče antitela ili fragmenta antitela vezuje antigen predmetnog pronalazak, antitelo koje pokazuje dobru korelaciju sa mernom vrednošću dobijenom upotrebom antitela S68 je poželjno kada se presepsin u uzorku meri sistemom merenja. "Dobra korelacija" znači da je koeficijent korelacije poželjno 0,9 ili veći, a poželjnije 0,95 ili veći.
[0054] Antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalazak može specifično da se veže za presepsin, a afinitet za presepsin (ravnotežna konstanta disocijacije, vrednost KD) je poželjno manji od 10<-7>M, poželjnije manje od 10<-8>M, još poželjnije manje od 10<-9>M, posebno poželjno manje od 10<-10>M, i najpoželjnije manje od 10<-11>M. Ravnotežna konstanta disocijacije antitela ili njegovog fragmenta antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska za
1
presepsin је poželjno je u opsegu od 10<-7>M do 10<-14>M, bolje u opsegu od 10<-8>M do 10<-13>M. Kao Presepsin može se koristiti rsCD14ST-Fc.
[0055] Afinitet (ravnotežna konstanta disocijacije, vrednost KD) može se meriti korišćenjem, na primer, BIACORE (GE Healthcare).
[0056] U jednoj od poželjnih realizacija predmetnog pronalaska, afinitet (KD vrednost) antitela za presepsin predmetnog pronalaska ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen je odličan u poređenju sa afinitetom za presepsin antitela S68. Poželjno je da afinitet (KD vrednost) za rsCD14ST-Fc (opisan u Presepsin: Primer 9- (2)) antitela predmetnog pronalaska ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen pokazuje brojčanu vrednost na istom nivou kao, ili niži od afiniteta od 1,08Е-08 (vrednost KD) za rsCD14ST-Fc za antitelo S68, i poželjno je da afinitet ispolji 1/2 KD vrednosti antitela S68 (5,40E-09) ili manje i dalje poželjno 1/10 KD vrednosti S68 antitela (1,08Е-09) ili manje.
[0057] Jedna od poželjnih realizacija predmetnog pronalaska je odlična aktivnost vezivanja antitela predmetnog pronalaska ili njegovog fragmenta antitela koji vezuje antigen sa presepsinom u poređenju sa antitelom S68.
[0058] Na primer, rsCD14ST-Fc (presepsin) je fiksiran na čvrstu fazu i reaguje sa antitelom, a aktivnost vezivanja antitela za presepsin može se proceniti apsorbancijom kao što je opisano u primeru 10- (2).
[0059] Kada se izvodi test u skladu sa primerom 10, a apsorbancija na reakciju antitela S68 i rsCD14ST-Fc je određena da iznosi 1, odnos apsorbancije kada reaguje antitelo predmetnog pronalaska i rsCD14ST-Fc poželjno iznosi 1 ili više, bolje 2 ili više, još bolje 4 ili više, a naročito poželjno 5,5 ili više.
[0060] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo opisano na bilo koji od sledećih načina. Ova antitela su antitela na presepsin. Pošto sledeće antitelo (a), (b) ili (c) i njegov fragment antitela koji vezuje antigen specifično prepoznaju epitop koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 prisutne na presepsinu, oni su poželjni primeri prve realizacije. Još bolje, je antitelo (a) ili (b), ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen.
(a) antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen obuhvata VH koji ima VH CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:4, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:5, i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:6, i VL koji sadrži VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:19, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:20, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:21;
1
(b) antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen obuhvata VH koji ima VH CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:7, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:8, i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:9, i VL koji sa sastoji od VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:22, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:23, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:24; ili
(c) antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen obuhvata VH koji se sastoji od VH CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:10, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:11, i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:12, i VL koji ima VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:25, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:26, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:27.
[0061] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu hipervarijabilnog regiona CDR opisan na slici 2 do slike 2-2. Ova antitela takođe specifično prepoznaju etitop koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 prisutan na presepsinu. Poželjno je antitelo koje sadrži CDR sekvencu aminokiselina 5793, 5810, 5864, 5979, 5983, 5988 ili 6028, ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen.
[0062] Otkriveni su polipeptidi koji sadrže CDR opisan u bilo kom od sledećih (i), (ii), (iv) and (v).
(i) polipeptid koji ima VH CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:4, VH CDR2 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:5, i VH CDR3 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:6
(ii) polipeptid koji ima VH CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:7, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:8, i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:9
(iii) polipeptid koji ima VH CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:10, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:11, i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:12
(iv) polipeptid koji ima VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:19, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:20, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:21
1
(v) polipeptid koji ima VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:22, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:23, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:24
(vi) polipeptid koji ima VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:25, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:26, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:27.
[0063] Otkriveni su polipeptidi koji sadrže VH CDRl, VH CDR2 i VH CDR3 koji se sastoje od svake amino kiselinske sekvence opisane na slici 2 do slike 2-2. U realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji ima VL CDRl, VL CDR2 i VL CDR3 koji se sastoji od svake amino-kiselinske sekvence opisane na slici 2 do slike 2-2. Prednost se daje polipeptidu koji ima VH CDRl koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 7, VH CDR2 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 8 i VH CDR3 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 94 (5793), ili polipeptid koji ima VH CDRl koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 7, VH CDR2 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 97 i VH CDR3 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 9 (5810).
[0064] Predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji ima variajbilni region opisan u bilo kom od sledećih. Poželjniji je polipeptid u (i), (ii), (iv) ili (v).
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) obuhvata CDRl koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:4, CDR2 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:5, CDR3 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:6
(ii) VH koji ima CDRl koji se sastoji od sekvence SEQ 1D NO:7, CDR2 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:8, CDR3 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:9
(iii) VH koij obuvhata CDRl koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:10, CDR2 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:11, CDR3 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:12 (iv) a varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDRl koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:19, CDR2 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:20, CDR3 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:21
(v) VL koji ima CDRl koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:22, CDR2 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:23, CDR3 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:24
(vi) VL koji ima CDRl koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:25, CDR2 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:26, CDR3 koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:27
1
[0065] Otkriven је polipeptid koji ima VH koji sadrži VH CDRl, VH CDR2 i VH CDR3 koji se sastoje od svake aminokiselinske sekvence opisane na slici 2 do slike 2-2.
Otkriven je polipeptid koji ima VL koji sadrži VL CDRl, VL CDR2 i VL CDR3 koji se sastoje od svake sekvence amino kiselina opisane na slici 2 do slike 2-2.
[0066] Polipeptid je poželjno supstanca koja vezuje antigen koja ima vezujuću aktivnost za presepsin.
[0067] Gore navedena antitela ili polipeptid mogu da imaju supstituciju, deleciju, adiviju i / ili inserciju (koje se naziva supstitucija) jedne ili više aminokiselina u sekvenci CDR.
Antitelo ili polipeptid posle supstitucije jedne ili više aminokiselina poželjno ima istu aktivnost ili dejstvo kao i pre izvođenja supstitucije, u smislu aktivnosti vezivanja za antigen, karakteristike za vreme merenja presepsina. Kao što je ovde opisano, antitelo ili polipeptid nakon supstitucije, koji ima istu aktivnost ili delovanje ili bolje nego pre izvođenja supstitucije, uključuje i varijantu dobijenu veštačkom modifikacijom zasnovanom na poznatom postupku genetskog inženjeringa i varijantu koja se javlja u prirodi (tzv. varijanta alela). Veći broj supstitucija aminokiselina nije naročito ograničen i supstitucija može da obuhvati 1 ili više. Međutim, prednost se daje tri ili manje aminokiselina, bolje dve ili manje aminokiselina, i još bolje jedna aminokiselina u jednom CDR. Gore navedeno antitelo ili polipeptid može imati sekvencu aminokiselina CDR sa 90% identiteta ili više u odnosu na aminokiselinsku sekvencu CDR označenu sa SEQ ID NO. kao što je gore opisano. Identitet sekvence može biti 92% ili veći, 95% ili veći, 97% ili veći, ili 99% ili veći. Takvo antitelo ili polipeptid poželjno ima isti nivo aktivnosti ili performansi kao antitelo ili polipeptid označen sa SEQ ID NO.
[0068] Region okvira (FR) antitela koji će biti konjuovan sa CDR je odabran tako da CDR formiraju dobro mesto vezanja antigena. FR koji se koristi u varijabilnom regionu predmetnog pronalaska nije posebno ograničen i može se koristiti bilo koji FR. Po potrebi, jedna ili više aminokiselina FR mogu biti supstituisane, izbrisane, dodate i / ili insertovane tako da CDR može da formira odgovarajuće mesto vezanja antigena. Na primer, prema merenju i proceni aktivnosti vezivanja antitela korsiteći FR sa supstituisanom aminokiselinom za antigen, takođe se može odabrati i varijanta FR sekvenca koja ima željenu osobinu. U jednoj realizaciji, FR može biti aminokiselinska sekvenca koja ima identitet od 80% ili više u odnosu na sekvencu određenu SEQ ID NO. Identitet sekvence može biti 85% ili veći, 90% ili veći, 95% ili veći, 97% ili veči, ili 99% ili veći. Na primer, prema merenju i proceni aktivnosti vezivanja antitela koje
1
koristi FR sa supstituisanom aminokiselinom, za antigen, takođe se može odabrati i varijanta FR sekvence koja ima željenuo osobinu.
[0069] Na primer, dobro poznati FR koji se može dobiti iz baze podataka (npr. GenBank), FR antitela dobijen u ovom pronalasku može se koristiti kao region okvira (npr.
AAO06511.1, AAT02391.1, AAGi3973.1 i AGT29816.1 su primeri amino kiselinske sekvence. AY596429.1, AY171772.1, KC020056.1 i AF294966.1 su primeri polinukleotidne sekvence.) SEQ 1D NO.48 do 84 su pogodni za upotrebu u određenim realizacijama predmetnog pronalaska. To su FR koji se mogu dobiti iz baze podataka, ili FR antitela dobijenih u predmetnom pronalasku. Regioni okvira mogu da se dobiju od različitih životinja, mada je u nekim realizacijama ovog pronalaska upotrebljen je zec. Poželjni FR regioni antitela predmetnog pronalaska uključuju one prikazane u SEQID NOs.: 64-84, ili bolje SEQ ID NOs.: 65, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 75, 76, 78, 79, 81, 82,
83, ili 84.
[0070] U jednoj realizaciji, poželjni primeri antitela varijabilnih regiona predmetnog pronalaska su sledeći.
(1) (i) VH koji ima VH CDRs varijante opisane na Sl.2 do Sl.2-2 (npr. VH CDRl, VH CDR2 i VH CDR3 antitela 5810) i FR sekvence SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:70, i SEQ ID NO:73; i
(ii) VL koji ima VL CDRs varijante opisane na Sl.2 do Sl.2-2 (npr. VL CDRl, VL CDR2 i VL CDR3 antitela 5810) i FR sekvence SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77,
SEQ ID NO:80, i SEQ ID NO:84.
(2) (i) VH koji ima VH CDRs od F1466-5, F1466-26 ili F1466-16 (npr. VH CDRl, VH CDR2 i VH CDR3 od F1466-26) i FR sekvence SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:70, i SEQ ID NO:73; i
(ii) VL koji ima VL CDRs od F1466-5, F1466-26 ili F1466-16 (npr. VL CDRl, VL CDR2 i VL CDR3 ofF 1466-26) i FR sekvence SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, iSEQ ID NO:84.
(3) (i) VH koji ima VH CDRs varijante opisane na Sl.2 do Sl.2-2 (npr. VH CDRl, VH CDR2 i VH CDR3 antitela 5810) i FR sekvence SEQ ID NO:65 (ili 66), SEQ ID NO:68 (ili 69), SEQ ID NO:71(ili 72), i SEQ ID NO:73; i
(ii) VL koji ima VL CDRs varijante opisane na Sl.2 do Sl.2-2 (npr. VL CDRl, VL CDR2 i VL CDR3 antitela 5810) i FR sekvence SEQ ID NO:75 (ili 76), SEQ ID NO:78 (ili 79), SEQ ID NO:81(ili 82 ili 83), i SEQ ID NO:84.
2
(4) (l) VH koji ima VH CDRs od F1466-5, F1466-26 ili F1466-16 (npr. VH CDRl, VH CDR2 i VH CDR3 od F1466-26) i FR sekvence SEQ ID NO:65 (ili 66), SEQ ID NO:68 (ili 69), SEQ ID NO:71 (ili 72), i SEQ ID NO:73; i
(ii) VL koji ima VL CDRs od F1466-5, F1466-26 ili F1466-16 (npr. VL CDRl, VL CDR2 i VL CDR3 antitela 5810) i FR sekvence SEQ ID NO:75(ili 76), SEQ ID NO:78 (ili 79), SEQ ID NO:81 (ili 82 ili 83), i SEQ ID NO:84.
[0071] U varijabilnom regionu, jedna ili više aminokiselina (na primer, pet ili manje aminokiselina, a poželjno tri ili manje aminokiselina) mogu biti supstituisane, izbrisane, dodate i / ili insertovane. Antitelo ili polipeptid posle supstitucije jedne ili više aminokiselina poželjno ima istu aktivnost ili dejstvo kao i pre izvođenja supstitucije, u smislu aktivnosti vezivanja za antigen, karakteristike u vreme merenja presepsina. U jednoj realizaciji, kada je varijabilni region određen sekvencom kao što je gore opisano, varijabilni region može da ima aminokiselinsku sekvencu sa 80% identiteta ili više u odnosu na sekvencu koja je označena sekvencom aminokiselina, kao što je prikazano SEQ ID NO. Identitet sekvence može biti 85% ili veći, 90% ili veći, 95% ili veći, 97% ili veći, ili 99% ili veći. Takv varijabilni region poželjno ima isti nivo aktivnosti ili performansi kao varijabilni region označen aminokiselinskom sekvencom kao što je prikazano SEQ ID NO.
[0072] Konstantan region koji je upotrebljen za antitelo predmetnog pronalaska nije posebno ograničen i može se upotrebiti bilo koji konstantni region. Poželjni primeri konstantnog regiona koji je upotrebljen za antitelo predmetnog pronalaska uključuju konstantni region IgG koji potiče od miša, pacova, zeca ili čoveka. Konstantan region može imati jednu ili više aminokiselina koje su supstituisane, izostavljene, dodate i / ili insertovane u opsegu u kojem na njih ne utiče aktivnost vezivanja za antigen, ne utiče na karakteristike u momentu merenja presepsina.
[0073] Antitelo predmetnog pronalaska poželjno je monoklonsko antitelo, to jest monoklonsko antitelo na presepsin. Monoklonsko antitelo je antitelo koje se izlučuje iz ćelije monoklona koja stvara antitelo. U poređenju sa poliklonskim antitelom, monoklonsko antitelo ima osobinu u tome da može da se dobije antitelo visokog titra i specifičnost homogenog antigena. Teoretski, monoklonsko antitelo ima prednost u tome što ima manju težinu antitela potrebnu za merenje antigena u poređenju sa poliklonskim antitelom. Kao što je ovde opisano, termin "antitelo" se može koristiti u značenju "antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen".
[0074] Monoklonsko antitelo predmetnog pronalaska se može pogodno dobiti upotrebom S68 peptida, opisanog sa SEQ ID NO: 2, kao antigena za administraciju.
Monoklonsko antitelo predmetnog pronalaska može se dobiti na primer imunizovanjem životinje S68 peptidom, dobijanjem hibridoma koristeći ćelije imunizovane životinje i ćelije mijeloma koje proizvode antitelo, odabirom i gajenjem hibridoma pripremljenog kao jedna ćelija, i prečišćavanje supernatanta kulture
[0075] Životinjske vrste od kojih potiče antitelo nisu posebno ograničene, a primeri istih uključuju miša, pacova, hrčaka i zeca. Poželjno zeca. Drugim rečima, antitelo predmetnog pronalaska može biti monoklonsko antitelo na presepsin izvedeno od zeca (koje se takođe naziva i zečje monoklonsko antitelo na presepsin ili zečje anti-presepsin monoklonsko antitelo).
[0076] Kao ćelije mijeloma mogu se koristiti različite poznate ćelije. Primeri istih uključuju SKO-007 dobijen od čoveka, SHM-D33 humani-mišji hetero-mijelom, Р3, NS-1, РЗU1 i SP2 / 0, potiče od miša, i IB2 / 0 i I3-Agl, 2, 3 potiče od pacova. Takođe je moguće koristiti besmrtne B limfocite dobijene od zeca.
[0077] Prema predmetnom pronalasku, takođe je poželjno da se zec-zec hibridom proizvede fuzijom između ćelija slezine zeca i besmrtnih B limfocita dobijenih od zeca ili zec- miša hibridoma, proizvedenim fuzijom sa ćelijama dobijenim iz obesmrćenih ćelijskih linija miša.
[0078] Fuzija između ćelija koja proizvode antitela i ćelija mijeloma može se izvesti poznatim postupkom, a primeri agenasa za potpomaganje fuzije koji se mogu koristiti uključuju polietilen glikol (PEG) i virus Sendai. Po pitanju rastvora za uzgajanje koji se koristi za fuziju ćelija, može se koristiti rastvor za uzgajanje RPMI1640 ili rastvor za uzgajanje MEM.
[0079] Hibridom nastao fuzijom se uzgaja oko nekoliko dana do tri nedelje. Dalje, korišćenjem selekcionog medijuma, kao što je medijum koji sadrži hipoksantin, timidin i aminopterin (HAT medijum), na primer, fuzionisani hibridomi mogu da se odvoje od nefuzionisanih ćelija. Dobijeni hibridom se dalje bira na osnovu antitela koje je on proizveo. Prema pripremi odabranog hibridoma kao jednog klona prema poznatom ograničavajućem razblaženju, on se uspostavlja kao hibridom koji proizvodi antitela.
[0080] Prečišćavanje antitela se može izvesti poznatim postupkom, kao što je jonoizmenjivačka hromatografija, afinitetna hromatografija (kolona Protein A, kolona protein G), metodom isoljavanja, taloženjem alkohola, izoelektričnim fokusiranjem, elektroforezom, centrifugom ili gel filtracijom.
[0081] Antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska se takođe može proizvesti tehnikom genetske rekombinacije koju može da
upotrebi prosečan stručnjak. Na primer, na osnovu sekvence dobijenog antitela na presepsin pripremljen je polinukleotid koji kodira antitelo ili deo antitela i eksprimira se u pogodnom domaćinu nakon uvođenja u ekspresioni vektor.
[0082] Priprema polinukleotida koji kodira antitelo ili deo antitela može se izvesti, na primer, ekstrakcijom mRNK iz hibridoma koji proizvodi antitelo predmetnog pronalaska i sintetizuje cDNK. Može se izvesti pomoću komercijalno dostupnog kompleta.
[0083] Alternativno, antitelo u kome je deo njegove sekvence izmenjen, takođe se može napraviti na osnovu sekvence antitela na presepsin korišćenjem genske rekombinacije, koju može koristiti prosečan stručnjak. Vektor koji ima objektivnu sekvencu može se pripremiti i eksprimirati u pogodnom domaćinu.
[0084] Vektor korišćen u predmetnom pronalasku nije posebno ograničen. Međutim, poželjno je vektor i / ili ekspresionii vektor pogodan za eksprimovanje gena antitela. Primeri toga uključuju, ali nisu ograničeni na, vektor koji sadrži promotor EF-1 a i / ili pojačivač CMV.
[0085] Primeri vektora koji se mogu upotrebiti takođe uključuju plazmid dobijen iz E. coli (na primer, pBR322, pBR325, pUC12 i pUC13), plazmid izveden iz Bacillus subtilis (na primer, pUB110, pTP5 i pC194), plazmid dobijen iz kvasca (na primer, pSH19 i pSH15), bakteriofage kao što je λ fag, i virusa kao što je retrovirus, vakcinija virus i bakulovirus.
[0086] Promoter korišćen u ovom pronalasku može biti bilo koji promotor koji je pogodan za domaćina koji se koristi za ekspresiju gena. Na primer, kada je domaćin ćelija životnje, može se koristiti promoter dobijen iz SV40, promoter retrovirusa, promoter toplotnog šoka, promoter citomegalovirusa, promotor EFlα.
[0087] Po potrebi, vektor može da sadrži pojačivač, signal za obradu, signal za dodavanje poli A, selekcioni marker i poreklo za replikaciju SV40
[0088] Primeri selekcionih markera koji se mogu koristiti uključuju dehidrofolat reduktazu (dhfr), gen rezistentan na metotreksat (MTKS) i gen rezistentan na ampicilin.
[0089] Ćelija domaćin koja se koristi za ovaj pronalazak nije posebno ograničena. Na primer, koristile su se bakterijske ćelije (E. coil), kvasac, ćelije vodozemaca (Xenopus laevis oocitna ćelija), ćelija insekta ili insekta (sf9) i životinjska ćelija. Primeri životinjske ćelije koja se može koristiti uključuju COS-1 ćeliju, COS-7 ćeliju, CHO ćeliju, CHO ćeliju sa osiromašenim genom (dhfr-CHO ćeliju), mišju 3Т3 ćeliju, ljudsku ćeliju HEK293 i ćeliju mijeloma.
2
[0090] Postupak uvođenja vektora ekspresije u ćeliju domaćina može se izvesti poznatim postupkom, a primeri toga uključuju, ali nisu ograničeni na, postupak lipofekcije, metodu kalcijum-fosfata, metodu elektroporacije i metodu mikroinjekcije.
[0091] Nakon uvođenja ekspresionog vektora u ćeliju domaćina, ćelije se uzgajaju u medijumu za kultivaciju pogodnom za svaku ćeliju domaćina. Na primer, u slučaju životinjskih ćelija, može se koristiti medijum za kultivaciju životinjskih ćelija, kao što su RPMI1640 medijum i GIT medijum, ili oni mediji dodati sa različitim aditivima, kao što je FCS. Kultivacijom dobijenih transformisanih ćelija u medijumu, antitelo se može eksprimirati i akumulirati u supernatantu kulture. Za prečišćavanje antitela u supernatantu kulture, može se koristiti gore opisani postupak. Dalje, eksprimovana količina antitela i aktivnost antitela može se meriti sa ELISA.
[0092] Antitelo predmetnog pronalaska ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen može se dobiti metodom fagnog displeja. Dobijanje antitela metodom fagnog displeja može se izvesti tehnikom koju može koristiti prosečan stručnjak (vidi CARLOS F. BARBAS et al, Phage Display: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)). Na primer, gen je dobijen iz slezinog limfocita dobijenog imunizacijom životinje peptidom S68, i veže se fagemidnim vektorom i tako dalje, a nakon toga se izvodi uobičajeni postupak da bi se dobilo antitelo.
[0093] Pored toga, da bi se napravilo izmenjeno antitelo u kome se menja samo određena sekvenca CDR (npr. VH CDR3), takođe je moguće koristiti metodu fagnog displeja. Ovo se takođe može izvesti tehnikom koju može koristiti prosečan stručnjak, koristeći plazmid koji sadrži teški i laki lanac antitela kao model i posebne prajmere.
[0094] Primeri fragmenta antitela za vezivanje antigena predmetnog pronalaska uključuju Fab, Fab ', F (ab') 2, antitelo sa jednim lancem (scFv), dimerizovan V region (dijatelo),V-region stabilizovan disulfidnom vezom (dsFv), sc (Fv ) 2, i polipeptid koji sadrži CDR, polipeptid koji sadrži varijabilni region teškog lanca, polipeptid koji sadrži varijabilni region lakog lanca. Bilo koji od ovih fragmenata antitela ima osobinu vezivanja antigena koje je isto kao antitelo predmetnog pronalaska za prepoznavanje epitopa koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1. Ti fragmenti antitela mogu se pripremiti primenom tehnika genetske rekombinacije koje su poznate prosečnom stručnjaku.
[0095] Fab označava, među fragmentima dobijenim tretiranjem IgG papain proteaza, fragment antitela koji ima osobinu vezivanja antigena u kome je polovina N- terminalne strane H lanca i ceo L lanac povezan disulfidnom vezom.
[0096] F (ab ') 2 ukazuje na fragmente dobijene tretiranjem IgG pepsin proteazom, one koji su dobijeni povezivanjem Fab disulfidnom vezom regiona zgloba.
[0097] Fab ' označava fragment antitela koji ima aktivnost vezanja antigena, a koji se dobija tretiranjem disulfidne veze šarkiranog regiona F (ab') 2. Fab 'se može dobiti tretmanom F (ab') 2 redukcionim reagensom, ditiotritolom.
[0098] scFv je polipeptid u kome su jedan VH i jedan VL povezani međusobno preko odgovarajućeg peptidnog linkera, i to je fragment antitela koji ima aktivnost vezanja antigena.
[0099] Dijatelo ukazuje na fragment antitela koji ima dvovalentnu aktivnost vezanja antigena dobijenu dimerizacijom scFv
[0100] dsFv označava polipeptid koji ima supstituciju jednog aminokiselinskog ostatka iz svakog od VH i VL, cisteinskim ostatkom, koji je povezan disulfidnom vezom.
[0101] sc (Fv) 2 označava fragment antigena koji je dobijen kao jedan lanac zasnovan na povezivanju dva VH i dva VL preko linkera. sc (Fv) 2 se može dobiti povezivanjem scFv preko linkera.
[0102] U poželjnim realizacijama, polipeptid koji ima CDR je isti kao što je prethodno opisano, i to je fragment koji ima aktivnost vezanja antigena. Peptid koji sadrži više CDR-ova može da se poveže direktno ili preko odgovarajućeg linkera.
[0103] Polipeptid koji sadrži varijabilni region teškog lanca i polipeptid koji sadrži varijabilni region lakog lanca su kao što je prethodno opisano.
[0104] U predmetnom pronalasku, svaki peptidni veznik koji se može uvesti genetskim inženjeringom može se upotrebiti kao linker. Linker koja je poželjan u predmetnom pronalasku je peptidna veza. Dužina peptidnog linkera nije posebno ograničena i može se na odgovarajući način odabrati u zavisnosti od svrhe. Međutim, obično je dužine 1 do 100 aminokiselina, poželjno 3 do 50 aminokiselina, i poželjnije 5 do 20 aminokiselina. Kada su povezana četiri varijabilna regiona antitela, uglavnom su potrebna tri linkera. Višestruki linkeri mogu biti isti ili se mogu koristiti različiti linkeri.
[0105] Antitelo predmetnog pronalaska uključuje himerno antitelo i humanizovano antitelo. Himerno antitelo je molekul antitela proizveden kombinovanjem dela molekula antitela od dve ili više različitih vrsta. Poželjno himerno antitelo u predmetnom pronalasku je antitelo koje ima promenljiv (varijabilan) region dobijen iz zečjeg monoklonskog antitela i konstantan region drugih vrsta (na primer, čoveka); međutim, ovde se razmatraju druge himerne kombinacije poznate u tehnici. Humanizovano
2
antitelo је antitelo dobijeno transplantacijom CDR-a sa ne-humane vrste u humano antitelo. Himema antitela i humanizovana antitela mogu se proizvesti opštim metodama koje su poznate u stanju tehnike.
[0106] Predmetni pronalazak obuhvata antitelo u kojem su jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodati u aminokiselinsku sekvencu predmetnog pronalaska. Antitelo predmetnog pronalaska može takođe da sadrži fuzioni protein u kojem je antitelo spojeno sa drugim peptidom ili polipeptidom. Proizvodnja fuzionog proteina može se izvesti primenom postupka poznatog prosečnom stručnjaku. Na primer, nakon povezivanja polinukleotida koji kodira antitelo predmetnog pronalaska sa polinukleotidom koji kodira drugi peptid ili polipeptid tako da imaju preklapajući okvir i njegovim uvođenjem u ekspresioni vektor, može se izvesti ekspresija u ćeliji domaćinu. Drugi peptidi ili polipeptidi koji se koriste za vezivanje sa antitelom predmetnog pronalaska nisu naročito ograničeni. Primeri istih uključuju FLAG, 6 х His koji se sastoji od šest His (histidinskih) ostataka, polihistidinskog segmenta, hemaglutinin influence (HA), T7-taga, HSV-taga, GST (glutation-S-transferaze), konstantnog regiona imunoglobulina (Fc region), β -galaktozidaze i proteina koji vezuje maltozu.
2. Postupak za merenje presepsina
[0107] U drugoj realizaciji predmetnog pronalaska, ovo otkriće obezbeđuje postupak za imunološko merenje presepsina upotrebom barem antitela ili njegovog fragmenta antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska, i uključuje korak kontakta sa antitelom ili njegovim fragmentom antitela za vezivanje antigena predmetnog pronalaska sa uzorkom koji sadrži presepsin. U predmetnom pronalasku, izraz "merenje" može se naizmenično koristiti terminima kao što su "detektovati", "kvantifikovati" ili "testirati" i koristi se kao značenje koje uključuje kvantitativno i kvalitativno određivanje. Merenje presepsina se po mogućnosti vrši in vitro.
[0108] Kako je presepsin poznat kao marker koji se koristi za detekciju sepse, može se reći da je gornja metoda metoda za detektovanje sepse, uključujući korak kontakta sa antitelom ili njegovim fragmentom antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska sa uzorkom koji sadrži presepsin.
[0109] U drugom aspektu, za ovaj pronalazak se takođe može reći da je postupak detekcije sepse ili postupak za pomoć pri otkrivanju sepse, koji obuhvata najmanje 1) korak merenja koncentracije presepsina u uzorku uzetom od subjekta koristeći antitelo predmetnog pronalaska i 2) korak utvrđivanja da li je koncentracija presepsina visoka vrednost u poređenju sa graničnom vrednošćuili ne. Granična
2
vrednost može biti 314 do 600 pg/ml, poželjno 400 do 580 pg/ml, bolje 450 do 550 pg / ml, i još bolje 500 pg/ml.
[0110] Kao što je ovde korišćeno, "otkrivanje / detekcija bolesti", može se koristiti naizmenično sa "pomaganjem u otkrivanju bolesti" ili "pomoć za dijagnostikovanje bolesti".
[0111] Pored toga, antitelo ili fragment antitela koji vezuje antigen može da se koristi za detekciju ili procenu barem jedne bolesti uključujući razliku između sepse i sindroma sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), procenu rizika od težine sepse, prognostičko predviđanje sepse (predviđanje smrtnosti), procenu stepena težine sepse, detekciju infekcija na mestu hirurškog zahvata, detekciju diseminovane intravaskularne koagulacije (DIC), detekciju zarazne DIC, detekciju srčanih bolesti, detekciju respiratornih infekcija povezanih sa bakterijskom infekcijom, detekciju upalne bolesti creva (Kronova bolest, ulcerozni kolitis), detekciju febrilne neutropenije (FN), detekciju hemofagocitnog sindroma (HPS) i procenu funkcije fagocita.
[0112] Izraz "infekcije na mestu hirurškog zahvata", kako se ovde koristi, označava zarazne bolesti koje su nastale posle operacije i obuhvata sve infekcije nastale usled hirurškog zahvata i potrebne dodatne terapije. Infekcije mesta hirurškog zahvata uključuju sve bolesti dijagnostikovane kao infekcije na mestu hirurškog zahvata na osnovu Guideline for prevention of surgical site infection, 1999 (CDC).
[0113] Srčana bolest uključuje akutni koronarni sindrom (ACS), akutno zatajenje srca, akutno dekompenzovano zatajenje srca (ADHF), hronično zatajenje srca, koronarnu bolest arterija, anginu pektoris, infarkt miokarda, ishemijski moždani udar, hemoragični moždani udar i prolazni napad cerebralne ishemije.
[0114] Respiratoma infekcija povezana sa bakterijskom infekcijom može da uključuje infekcije donjih disajnih puteva ili upalu pluća. Infekcije donjih disajnih puteva uključuju akutne infekcije donjih disajnih puteva i hronične infekcije donjih disajnih puteva. Akutne infekcije donjih disajnih puteva uključuju akutni traheitis, akutni bronhitis i akutni bronhiolitis. Većina se razvija virusnim infekcijama gornjih disajnih puteva koje se šire i na donji respiratorni trakt, a kod nekih od ovih bolesti dolazi do sekundarne infekcije bakterijama. Primena (aplikovanje) antibiotika može se prilagoditi ako se primete znakovi sekundarne bakterijske infekcije. Hronična infekcija donjih disajnih puteva je patološko stanje u kome je pronađena trajna bakterijska infekcija u donjim disajnim putevima koja imaju organske poremećaje izazvane bronhiektazijama ili hroničnu opstruktivnu bolest pluća, a uključuju trajnu infekciju i akutno pogoršanje. Bolesti koje izazivaju organske poremećaje na donjim
2
disajnim putevima uključuju bronhiektaziju, hroničnu opstruktivnu bolest pluća, hronični bronhitis, difuzni panbronhiolitis, zastarelu tuberkulozu pluća, pneumokoniozu, netuberkulozne mikobakterijske infekcije, alergijsku bronhopulmonalnu aspergillozu, fibrozu pluća i hroničnu bronhijalnu astmu. U oba slučaja trajne infekcije i akutnog pogoršanja primenjuje se primena antibiotika. Pneumonija uključuje vanbolnički stečenu pneumoniju i pneumoniju stečenu u bolnici. Poželjno je da pneumonija bude vanbolnički stečena penumonija.
[0115] Procena funkcije fagocitnih ćelija podrazumeva (a) merenje fagocitne aktivnosti neutrofila, granulocita i / ili belih krvnih ćelija, (b) procenu imunske funkcije merenjem fagocitne aktivnosti neutrofila, granulocita i / ili belih krvnih ćelija, (c ) procenu kvaliteta implantabilnih ćelija nakon autologne transplantacije ćelija ili alogenu transplantaciju ćelija i (d) detekciju bolesti povezanih sa fagocitoze, fagocitnim ćelijama. Bolesti povezane sa fagocitozom od strane fagocitnih ćelija uključuju autoimunske bolesti, reumatoidni artritis, mastitis, giht, glomerulonefritis, ulcerozni kolitis, mediteransku groznicu, otitis, rinitis, pneumoniju, tuberkulozu, cistitis, infekciju plodove vode (amnionska tečnosti) i piozemiju. Uzorak koji se koristi za otkrivanje bolesti povezanih sa fagocitozom, fagocitnim ćelijama je tkivna tečnost, limfa, sinovijalna tečnost, mleko, cerebrospinalna tečnost, gnoj, slina, suze, sluz, iscedak iz nosa, ispljuvak, mokraća, asciti, amnionska tečnost, telesne tečnosti, poput sperme, kao i tečnost za ispiranje (lavaž) koja se dobija nakon ispiranja nosne šupljine, bronhija, pluća, kože, peritonealne šupljine, različitih organa, zglobova i kostiju.
[0116] Primeri postupka za imunološko merenje presepsina korišćenjem antitela ili njegovog fragmenta antitela za vezivanje antigena predmetnog pronalaska uključuju enzimski imunološki test (ovde, takođe opisan kao ELISA ili EIA), hemiluminiscentni enzimski imunološki test (CLEIA), hemiluminiscencentni imunološki test (CLIA), test fluorescentnih antitela (FAT), imuno test za fluoresventni enzim (FEIA), elektro-hemiluminiscencentni imuno test (ECLIA), radioimuno-test (RIA), imunohromatografiju, metodu aglutinacije i kompetitivni metod. U predmetnom pronalasku, može se koristiti bilo koji od direktnih metoda i indirektnih metoda. Takođe se može koristiti metoda senzibilizacije koja uključuje formiranje i detekciju kompleksa biotin-avidin (streptavidin).
[0117] EIA je jedan primer imunološkog testa koji koristi antitelo obeleženo enzimom, a primeri toga uključuju direktan postupak i indirektnu metodu. Poželjni primeri toga uključuju ELISA (ispitivanje imunosorbentom vezanog za enzim).
2
[0118] Sendvič ELISA je postupak u kome se merenje vrši korišćenjem dva ili više antitela sa različitim mestom prepoznavanja antigena. Jedno antitelo je unapred imobilisano na čvrstoj fazi i formiranjem kompleksa antitelo-antigen-antitelo sa antigenom, moguća je detekcija navedenog antigena, koji je smešten između dve vrste antitela.
[0119] Hemiluminentni imunološki test (CLEIA) je postupak u kojem antitelo imobilisano na magnetnim česticama ili kuglicama reaguje sa antigenom u uzorku, nakon čega sledi reakcija sa antitelom obeleženim enzimom i ispiranje (razdvajanje B/F), enzimska reakcija je izvedena dodavanjem hemiluminiscentnog supstrata i meri se intenzitet luminescencije. Na primer, moguće je da antitelo konjugovano sa biotinom reaguje sa antigenom u uzorku u tečnoj fazi, antitelo je zarobljeno magnetnim česticama povezanim sa streptavidinom, antitelo obeleženo enzimom nakon ispiranja reaguje (razdvajanje B / F), i izvodi se isti tretman kao gore.
[0120] Kada se alkalna fosfataza (ALP) koristi kao obeležavajući enzim, poželjno je da se koristi CDP-Star ™, AMPPD® ili CSPD® kao hemiluminescentni supstrat. Kada je enzim za obeležavanje HRP, poželjno je da se luminol koristi kao hemiluminescentni supstrat.
[0121] Generalno se smatra da je visoka osetljivost detekcije sledećim redosledom hemiluminiscencija> fluorescencija> apsorpcija (generisanje boje), a način merenja može biti odabran u zavisnosti od željene osetljivosti.
[0122] Hemiluminentni imunološki test (CLIA) je postupak u kome antitelo imobilisano na magnetnim česticama ili slično reaguje sa antigenom u uzorku, antitelo obeleženo hemiluminiscentnim supstratom reaguje sa njim, praćeno ispiranjem (razdvajanje B / F) i meri se intenzitet luminiscencije. Kao supstanca za obeležavanje koristi se akridinijum ili slično.
[0123] Fluorescentni enzimski test (FEIA) je postupak u kome imobilisano antitelo reaguje sa antigenom u uzorku, nakon čega sledi reakcija sa antitelom obeleženim enzimom i ispiranje (razdvajanje B / F), a enzimska reakcija se izvodi dodavanjem fluorescentnog supstrata i meri se intenzitet fluorescencije. Kao enzim za obeležavanje koristi se HRP ili ALP ili slično. Kada je enzim za označavanje HRP, Amplex®Red se koristi kao florescentni supstrat. Kada je enzim za obeležavanje ALP, poželjno se koristi 4-MUP (4-metilumbelifenil fosfat), AttoPhos®.
[0124] Elektro-hemiluminescentni imuno test (ECLIA) je postupak u kome antitelo imobilisano na magnetnim česticama, antigen u uzorku i antitelo obeleženo elektrohemiluminescentnom supstancom reaguju jedno sa drugim, praćeno ispiranjem
2
(razdvajanje B / F) i meri se intenzitet luminiscencije koji potiče od električne energije. Kao supstanca za označavanje koristi se rutenijum. Kao supstanca za označavanje koristi se Ru (bpi) 3. Prema oksidaciji zasnovanoj na punjenju na elektrodi i reakciji redukcije tripropilaminom (TPA), ponovljena je luminiscencija ekscitacije.
[0125] Radioimuno test (RIA) je postupak merenja u kojoj se za obeležavanje koristi radioaktivni izotop. Na primer, reakcijom antigena u uzorku i antitela imobilizovanog na kuglicama i reakcijom sa antitelom obeleženim radioizotopom (1251), praćenim ispiranjem (razdvajanje B / F), može se meriti radioaktivnost 1251.
[0126] Imunohromatografija je imunološka metoda merenja u kojoj se primenjuje kapilarna pojava koja je rezultat migracije test materijala, zajedno sa rastvaranjem reagensa na test traci. Posebno, imunokompleks je formiran između tri supstance, odnosno antigena u uzorku, obeleženog antitela na test traci i antitela za hvatanje, i određena je boja obeleženog proizvoda. Za obeležavanje antitela koristi se zlatni koloid, enzim ili fluorescentna supstanca. Kada se koristi antitelo obeleženo enzimima, stvaranje boje se uzrokuje primenom enzimskog supstrata na test traku.
[0127] Postupak protoka je postupak u kojem antigen kao ispitivana supstanca, uz rastvor u uzorku, formira kompleks antitelo-antigen-antitelo na membrani kao nerastvorna membrana. Tada, supstanca koja nije imobilisana na membrani generalno prolazi u nomialnom smeru od površine do zadnje površine membrane i uklanja se.
[0128] Postupak aglutinacije je postupak u kome antigen u uzorku reaguje sa antitelom u reagensu i prati se aglutinacija. Primeri toga uključuju postupak u kojem se ne koristi čvrsta faza, postupak aglutinacije čestica (PA) u kojoj se veštački pripremljene čestice koriste kao čvrsta faza i postupak aglutinacije lateksa (LA) u kojoj se od PA koriste čestice lateksa.
[0129] Prema konkurentskom postupku, na primer, antitelo se veže na čvrstu fazu, a uzorak za testiranje i određena količina obeleženog antigena reaguju istovremeno, pa se na taj način količina antigena u uzorku može meriti od količine vezanog obeleženog proizvoda.
[0130] U jednom aspektu, antitelo predmetnog pronalaska može se upotrebiti u bilo kojem od gore otkrivenih metoda detekcije za upotrebu u postupku detekcije presepsina u uzorku ili dijagnostikovanju osobe za koju sumnja da ima sepsu.
Uzorak korišćen za merenje presepsina nije posebno ograničen. Međutim, poželjan je vodeni uzorak. Primeri toga uključuju telesnu tečnost kao što su krv (puna krv, plazma, serum), urin, tkivna tečnost, limfna tečnost, zglobna tečnost, mleko, cerebrospinalna tečnost, gnoj, slina, suze, tečnost sluzi, nosni iscedak, ispljuvak, abdominalna tečnost, korišćena tečnost ili semena tečnost, tečnost za ispiranje nakon ispiranja nosne šupljine, bronhijalni kanali, pluća, koža, trbušne šupljine, različiti organi, supernatanta kulture ćelija zglobova ili koštanih ćelija, i eluens sa kolone. Ti uzorci se mogu koristiti za merenje direktno ili posle razređivanja ili ekstrakcije raznim puferima, praćenim koncentracijom.
[0131] Pored toga, u slučaju korišćenja pune krvi kao uzorka, uzorak pune krvi može da se analizira u roku od 72 h, u roku od 48 h, u roku od 24 h, u roku od 12 h, u roku od 6 h, ili u roku od 4 h nakon prikupljanja uzoraka pune krvi. Sakupljanje uzorka pune krvi može se obaviti korišćenjem epruvete za prikupljanje krvi sa EDTA ili epruvetama sa heparinom za prikupljanje krvi. Poželjno je da se uzorak pune krvi analizira u roku od 6 sati nakon što je prikupljen u epruvete za prikupljanje krvi sa EDTA, ili u roku od 4 sata nakon što je prikupljen u epruvetu sa heparinom za prikupljanje krvi.
3. Komplet za merenje sCD14-ST
[0132] U trećoj realizaciji predmetnog pronalaska, ovo otkriće obezbeđuje komplet za merenje presepsina koji kao osnovni sastavni element sadrži antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen.
[0133] Komplet za merenje predmetnog pronalaska poželjno uključuje pomoćni reagens za merenje presrpsina. Primeri pomoćnog reagensa uključuju primamo antitelo, sekundarno antitelo, obeleženo antitelo, obeležavajući enzim, obeležavajuću supstancu kao što je zlatni koloid, hromogeni supstrat, fluorescentni supstrat (Amplex® Red, AttoPhos®, 4-MUP), hemiluminescentni supstrat (Luminol, CDP- Star™, AMPPD®, CSPD®), specifičnu vezivujuću supstancu kao što je biotin- streptavidin, nerastvorni nosač, sredstvo za blokiranje, rastvor za razblaživanje, tečnost za pranje i referentni materijal.
[0134] Pomoćni reagens može da se upotrebi u pogodnoj kombinaciji u zavisnosti od postupka merenja presepsina drugog izvođenja. Primarno antitelo je poželjno antitelo koje se vezuje za presepsin. Bolje, to je antitelo koje prepoznaje epitop koji je različit od antitela predmetnog pronalaska. Primeri toga uključuju antitelo F1106-13-3 i antitelo F1031-8-3 koji su opisani u primeru 3 u WO 2004/044005.
[0135] Bilo koja antitela predmetnog pronalaska i primarna antitela mogu da se koriste kao obeležena (označena) antitela. Kada nije obeleženo nijedno antitelo predmetnog pronalaska, a obeleženo je primarno antitelo, može se takođe koristiti obeleženo sekundarno antitelo.
1
[0136] Primeri nerastvornih nosača uključuju magnetne čestice, kuglice, staklo, celulozu, nitrocelulozu, porozni sintetički polimer, stakleno vlakno, poliakrilamid, najlon, polistiren, polivinil hlorid, polipropilen, plastičnu ploču, čestice lateksa, netkanu tkaninu i filter-papir.
[0137] Za obeležavanje antitela poželjno se koriste enzimi poput peroksidaze (HRP), alkalne fosfataze (ALP) i (1 -galaktozidaze, zlatnog koloida.
[0138] Kada se koristi HRP, kao hromogeni supstrati mogu se pomenuti, na primer, 3,3',5,5'-tetrametil benzidin (TMB) ili o-fenilen diamin (OPD). Kada se koristi ALP, kao hromogeni supstrat može se pomenuti p-nitrofenil fosfat (pNPP). Kada se koristi (3 - galaktozidaza, onitrofenil- [1 -D-galaktopiranonozid (ONPD) je dat kao primer za hromogeni supstrat.
[0139] Komplet za merenje za sendvič ELISA, koji može da obuhvati, na primer, antitelo predmetnog pronalaska i primamo antitelo (bilo koje antitelo može biti obeleženo enzimom), hromogeni supstrat, rastvor za razblaživanje ili referentni materijal. Kada nije obeleženo nijedno antitelo predmetnog pronalaska, a obeleženo je primamo antitelo, onda se takođe može uključiti obeleženo sekundarno antitelo.
[0140] Komplet za merenje za hemiluminiscentni enzimski imuno test (CLEIA) može, na primer, da sadrži antitelo imobilisano na magnetnim česticama, antitelo obeleženo enzimom, hemiluminescentni supstrat, rastvor za obeležavanje ili tečnost za ispiranje.
[0141] Komplet za merenje za fluorescentni enzimski imuno test (FEIA) može, na primer, da sadrži antitelo imobilisano na magnetnim česticama, antitelo obeleženo enzimom, fluorescentni supstrat, rastvor za razblaživanje, tečnost za ispiranje.
[0142] Komplet za merenje za hemiluminiscentni enzimski imuno test (ECLIA) može obuhvatati, na primer, biotinilisano antitelo, antitelo obeleženo sa Ru(bpy)3, magnetne čestice presvučene streptavidinom, tripropilaminom.
[0143] Komplet za merenje zasnovan na imunohromatografiji je test traka na kojoj su deo za dodavanje uzorka, deo reagensa, deo za detekciju i apsorpcioni deo postavljeni tako da je tečni uzorak dodat u dodatnom delu gde se test podvrgava migraciji gore navedenim redosledom. Na primer, moguće je obezbediti nerastvorno vezivanje nosača sa primarnim antitelom u detekcionom delu impregniranjem obeleženih sekundarnih antitela u delu reagensa.
[0144] Što se tiče test trake, dat je primer poroznog nosača. Primeri poroznog nosača uključuju nitrocelulozu, celulozu, derivate celuloze, najlon, najlonska vlakna, staklena vlakna i porozni sintetički polimer. Primeri apsorpcionog dela uključuju aposprcioni
2
polimer poput sunđera sačinjenog od materijala koji apsorbuje vodu, celuloznog filtrir papira i filter papira.
[0145] Pošto je objavljeno da je koncentracija presepsina u krvi u karakterističnom porastu kod pacijenta sa sepsom, komplet za merenje presepsina treće realizacije predmetnog pronalaska može da se koristi kao komplet za otkrivanje sepse ili kao komplet za pomoć u otkrivanju ili dijagnozi sepse.
[0146] Takođe komplet za merenje presepsina treće realizacije predmetnog pronalaska može se koristiti kao dijagnostičko sredstvo za sepsu ili pomoćno sredstvo za dijagnostiku sepse. Kada se koristi u svrhu otkrivanja sepse ili pomoć u dijagnozi, utvrđuje mogućnost prisustva sepse kod subjekta, kada je koncentracija presepsina u uzorku subjekta merena upotrebom antitela predmetnog pronalaska vrednost veća od granične vrednosti, a to može pomoći u otkrivanju ili đijagnozi. U jednom aspektu, granična vrednost može biti 314 do 600 pg / ml, poželjno 400 do 580 pg / ml, poželjnije 450 do 550 pg / ml, i dalje poželjno 500 pg / ml.
[0147] Pored toga, komplet za merenje presepsina može se koristiti za otkrivanje ili procenu barem jedne bolesti odabrane od, kao što je razlika između sepse i sindroma sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), procena rizika ozbiljnosti sepse, prognostička predviđanja sepse (predviđanje smrtnosti), procena stepena težine sepse, otkrivanje infekcije mesta hirurškog zahvata, otkrivanje diseminirane intravaskularne koagulacije (DIC), otkrivanje infektivne DIC, otkrivanje srčane bolesti, otkrivanje respiratornih infekcija povezanih sa bakterijskom infekcijom, otkrivanje zapaljenske bolesti creva (Kronova bolest, ulcerozni kolitis), otkrivanje febrilne neutropenije (FN), otkrivanje hemofagocitnog sindroma (HPS) i procena funkcije fagocita. Komplet za merenje presepsina može biti komplet za otkrivanje ili procenu bar jedne gore opisane bolesti.
3. Polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen opisan u prvom aspektu
[0148] U četvrtoj realizaciji predmetnog pronalaska, otkriće obezbeđuje polinukleotid ili nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigena iz prve realizacije predmetnog pronalaska. Polinukleotid uključuje DNK (genomsku DNK, cDNK, sintetičku DNK) i RNK (mRNK). Polinukleotid može biti bilo koji jednostruki lanac (kodirajući ili anti-sens) i dvostruki lanac. Na primer, moguće je da je mRNK ekstrahovana iz hibridoma koji proizvodi antitelo predmetnog pronalaska korišćenjem komercijalno dostupnog kompleta i da se sintetiše cDNK. Ciljni gen se može amplificirati PCR metodom.
[0149] U jednom aspektu, antitelo ovog pronalaska može imati identitet najmanje 80% ili više nukleotidne sekvence koja kodira teški ili laki lanac varijabilnog regiona. U pogledu CDR sekvence, on može imati identitet od najmanje 80% ili više nukleotidne sekvence koja kodira celokupan CDR antitela (VH CDRl do 3 i VL CDRl do 3). Sa gledišta osetljivosti detekcije, može pokazati identitet od 85% ili više, identitet 90% ili više, identitet 95% ili više, identitet 96% ili više, identitet 97% ili više, identitet 98% ili više ili identitet 99% ili više.
[0150] Dalje, prema određenoj realizaciji, antitelo kodirano nukleotidnom sekvencom koja hibridizuje pod strogim uslovima u komplementarnu sekvencu nukleotidne sekvence koja kodira teški ili laki lanac takođe je uključeno u antitelo predmetnog pronalaska.
[0151] Hibridizacija se može izvesti poznatim postupkom ili postupkom zasnovanim na njemu, na primer, postupkom opisanim u Molecular Cloning 3rd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001).
[0152] Strogi uslovi ukazuju na uslove u kojima se formira specifični hibrid dok se ne formira nespecifični hibrid. Tipični strogi uslovi uključuju, na primer, izvođenje hibridizacije pri koncentraciji kalijuma od 25 mM do 50 mM i koncentraciji magnezijuma od 1,0 mM do 5,0 mM. Prosečan stručnjak u ovoj oblasti tehnike, može lako odabrati uslove modifikovanjem reakcije hibridizacije ili koncentracije soli reakcionog rastvora za hibridizaciju.
5. Rekombinantni vektor koji sadrži polinukleotid opisan u četvrtoj realizaciji [0153] U petoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor uveden s polinukleotidom koji kodira aminokiselinu antitela ili fragment antigena koji vezuje antitelo predmetnog pronalaska. Vektor je poželjno vektor i / ili ekspresioni vektor pogodan za gen ekspresije antitela opisan u prvoj realizaciji. Može se proizvesti tehnikom koju koristi prosečan stručnjak .
6. Celije koje proizvode antitelo ili fragment antigena koji vezuje antitelo opisan u prvom aspektu
[0154] U šestoj realizaciji predmetnog pronalaska, otkriće obezbeđuje ćelije koje proizvode antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska. Primeri ćelija uključuju hibridom, transformantnu i genetski rekombinantne ćelije uvedene sa genom antitela predmetnog pronalaska.
[0155] Specifični primeri hibridoma za proizvodnju antitela uključuju klon opisan u Primeru 1.
4
[0156] Transformant se može dobiti uvođenjem vektora uvedenog sa polinukleotidom koji kodira aminokiselinu gore navedenog antitela ili njegov fragment antigena koji vezuje antitelo iz predmetnog pronalaska u ćeliju domaćina opisanu u prvoj realizaciji (na primer, COS-1 ćelije i CHO ćelije).
[0157] Postupak za proizvodnju hibridoma ili transformanta može biti isti kao onaj opisan za prvu realizaciju.
7. Postupak za proizvodnju antitela ili fragmenta antitela koi vezuje antigen koristeći transformant
[0158] U sedmoj realizaciji predmetnog pronalaska, otkriće obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela ili fragmenta antitela koji vezuje antigen, uključujući korak kultivisanja transfonnatora koji sadrži vektor uveden sa nukleotidom koji kodira antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen iz prve realizacije.
[0159] Antitelo ili fragment antitela koji vezuje antigen iz prvog izvođenja se proizvodi u kulturi transformanta, a antitelo ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen je sakupljen iz kulture. Postupci koji se koriste mogu biti isti kao oni opisani u prvoj realizaciji.
8. Metoda za skrinovanje antitela na presepsin
[0160] U osmoj realizaciji predmetnog pronalaska, otkriće obezbeđuje postupak za skrinovanje antitela da bi se dobilo antitelo na presepsin korisno za merenje presepsina u uzorku, pri čemu postupak uključuje najmanje sledeće korake;
- • korak dizajniranja sistema za merenje presepsina upotrebom antitela kandidata, - • korak utvrđivanja uticaja koncentracije TG u uzorku na merenje presepsina na vrednost merenja presepsina korišćenjem mernog sistema
[0161] Drugim rečima, postupak je karakterisan po tome što se TG interferencijski test vrši sa mernim sistemom koji koristi antitelo. Postupak dobijanja antitela kandidata (poželjno, antitelo na presepsin) može biti isti kao onaj opisan u prvoj realizaciji ili sedmoj realizaciji. U nekim realizacijama, sistem za merenje presepsina je sistem za merenje koji omogućava merenje vrednosti presepsina u uzorku i nije posebno ograničen. Primeri toga uključuju merni sistem opisan u drugoj realizaciji, i na primer, može se koristiti sendvič ELISA.
[0162] U vezi sa korakom utvrđivanja uticaja koncentracije TG u uzorku na mernu vrednost presepsina, uticaj se može odrediti s obzirom na razdvajanje dve merne vrednosti, to jest na osnovu poređenja merenja vrednosti presepsina u uzorku bez TG i vrednost merenja presepsina u istom uzorku sa dodatkom određene količine TG. Na primer, kada se test TG interferencije izvodi korišćenjem većeg broja uzoraka, i odnos uzorka koji pokazuje stepen razdvajanja merne vrednosti presepsina u trenutku kada je koncentracija TG iznosila 20 mg/ml u uzorku u poređenju sa vrednošću merenja presepsina u vremenu bez dodavanja TG je ± 20% ili manje i poželjnije ± 10% ili manje je visok, može se utvrditi da je uticaj TG u uzorku na mernu vrednost presepsina mali, i takođe se može utvrditi, da je malo verovatno da će uticati na TG interferencijom, antitelo je korisno za merenje presepsina.
[0163] Alternativno, kao druga metoda evaluacije, evaluacija se može izvršiti upoređivanjem stepena razdvajanja nakon izvođenja TG interferencionog testa korišćenjem antitela kandidata i antitela S68. Kao jedna poželjna realizacija, kada je razdvajanje vrednosti merenja presepsina u vreme izvođenja TG interferencionog testa korišćenjem antitela kandidata slično stepenu razdvajanja antitela S68 pod istim uslovima, antitelo se može naći kao antitelo korisno za merenje presepsina u uzorku.
Kao primer, za sistem merenja u kojem je TG interferencijalni test izveden korišćenjem više uzoraka i koristi se antitelo, razlika između stepena razdvajanja sa koncentracijom TG od 20 mg / ml u uzorku nakon dodavanja TG i određen je stepen razdvajanja mernog sistema koristeći antitelo S68 pod istim uslovima, a ako je odnos uzorka koji pokazuje razliku u stepenu razdvajanja 20% ili manje, a po mogućnosti 10% ili manje, može se utvrditi da antitelo je antitelo korisno za merenje presepsina u uzorku.
[0164] Postupak skrinovanja predmetnog pronalaska može opciono uključivati korak određivanja aktivnosti vezivanja između antitela kandidata i peptida S68 ili presepsina. Dalje, postupak skrinovanja prema predmetnom pronalasku može opciono da obuhvati korak merenja uzorka uzet od normalne osobe (tj. osobe koja nije septična) i pacijenta koji ima sepsu primenom sistema za merenje presepsina koristeći antitela kandidata i upoređivanjem razlike mernih vrednosti. U jednoj realizaciji, skrinovanje se može obaviti u skladu s opisima iz Primera 1.
[0165] Jedna poželjna realizacija postupka skrinovanja je postupak koji obuhvata barem sledeće korake:
1) korak dobijanja antitela na presepsin kandidata korišćenjem proizvodnog postupka opisanog u prvoj realizaciji predmetnog pronalaska, i
2) korak izrade sistema za merenje presepsina upotrebom antitela kandidata, i izbor antitela sa detekcionim odnosom od 50% ili više, koji pokazuje stepen razdvajanja mernih vrednosti presepsina od ± 20% ili manje, kada je TG koncentracija podešena na 20 mg / mL dodavanjem TG.
[0166] U ovom postupku, koncentracija TG (ovde, 20 mg / ml) u uzorku, stepen razdvajanja mernih vrednosti presepsina (ovde, ± 20%) i odnos uzorka mogu se na odgovarajući način promeniti. Alternativno, korak (2) se takođe može izvesti zamenom sa drugim TG interferencionim testovima i / ili metodama evaluacije, opisanim u prvoj realizaciji predmetnog pronalaska.
[0167] Sledeća poželjna realizacija u osmoj realizaciji predmetnog pronalaska je postupak skrinovanja antitela predmetnog pronalaska koji obuhvata barem sledeće korake:
1) korak dobijanja antitela na presepsin kandidata i
2) korak utvrđivanja da li antitelo specifično prepoznaje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 kao epitop ili ne
[0168] U ovom postupku, može se primeniti korak (2) koji može biti postupak za određivanje epitopa opisanog u prvoj realizaciji ovog pronalaska, bez ikakvih ograničenja.
[0169] Na primer, korak (2) može dalje da sadrži sledeći korak:
2) korak odabira antitela, pri čemu je vezivanje između antitela i presepsina kompetitivno inhibirano za 50% ili više u reakcionom sistemu, pri čemu sekvenca aminokiselinskih ostataka se sastoji od SEQ ID NO: 1 podvrgnunta kompetitivnoj reakciji (apsorbancija) tako da je inhibirano vezivanje između navedenog antitela i presepsina.
Sledeći korak (3) može da se opciono doda postupku određivanja epitopa:
3) korak izbora antitela u kome je završetak-inhibicije vezivanja između navedenog antitela i presepsina usled najmanje jedne sekvence aminokiselinskih ostataka koja se sastoje od SEQ 1D NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40 i 41 manji od 20%, u reakcionom sistemu gde je sekvenca aminokiselinskih ostataka podvrgnuta kompetitivnoj reakciji (apsorbancija) tako da je inhibirano vezivanje između navedenog antitela i presepsina.
[0170] Pored toga, još jedna poželjna realizacija u osmoj realizaciji ovog pronalaska je postupak skrinovanja antitela iz predmetnog pronalaska koji obuhvata barem sledeće korake:
1) korak dobijanja antitela na presepsin kandidata korišćenjem proizvodnog postupka opisanog u prvoj realizaciji predmetnog pronalaska, i
2) korak odabira pomenutog antitela u kojem koeficijent korelacije sa vrednostima merenja presepsina u uzorku koji koristi antitelo S68 pokazuje 0,9 ili više
[0171] Ovaj postupak se može izvesti prema opisima prve realizacije predmetnog pronalaska i primera 5. Koeficijent korelacije se takođe može na odgovarajući način promeniti.
[0172] Pored toga, još jedna poželjna realizacija je postupak skrinovanja antitela predmetnog pronalaska koji obuhvata barem sledeće korake:
1) korak dobijanja antitela na presepsin kandidata i
2) korak odabira vezivanja antitela sa presepsinom u afinitetu (ravnotežna konstanta disocijacije, vrednost KD) manjim od 10<-8>M
[0173] Alternativno, korak (2) se može zameniti sledećim korakom:
2) korak odabira antitela u kojem je aktivnost vezivanja antitela sa presepsinom odlična u poređenju sa aktivnostima vezivanja S68 antitela sa presepsinom [0174] Moguće je izvršiti merenje afiniteta (ravnotežna konstanta disocijacije, vrednost KD) i aktivnosti vezivanja u skladu sa opisom prve realizacije predmetnog pronalaska. Aktivnost vezivanja može se proceniti odnosom apsorbancije. Poželjno, odnos apsorbancije kada antitelo predmetnog pronalaska i presepsin reaguju je 2 ili više, kada je nađeno da je apsorbancija S68 antitela i presepsina iznosi 1.
[0175] Postupak skrinovanja antitela predmetnog pronalaska kao što je gore opisano može se izvesti kombinovanjem odgovarajućih koraka. Poželjna kombinacija je, na primer, sledeća:
Postupak skrinovanja antitela na presepsin koji obuhvata najmanje sledeće korake:
1) korak dobijanja antitela na presepsin kandidata,
2) korak odabira antitela u kome je vezivanje između navedenog antitela i presepsina kompetitivno-inhibirano za 50% ili više u reakcionom sistemu (poželjno, apsorbancija) pri čemu je sekvenca aminokiselinskih ostataka koji se sastoji od SEQ ID NO: 1 podvrgnuta kompetitivnoj reakciji tako da je inhibirano vezivanje između pomenutog antitela i presepsina, i
3) korak odabira antitela u kojem je aktivnost vezivanja antitela sa presepsinom odlična u poređenju sa aktivnostima vezivanja S68 antitela sa presepsinom.
9. Postupak lečenja pacijenta sa sepsom
[0176] Takođe je otkriven postupak lečenja pacijenta sa sepsom koji uključuje lečenje sepse kod subjekta koji je podvrgnut postupku pomaganja u otkrivanju sepse pomoću antitela iz prve realizacije ovog pronalaska ili njegovog fragmenta antitela koji vezuje antigen.
[0177] Postupak za pomoć u otkrivanju sepse može biti isti kao što je opisano u drugoj realizaciji predmetnog pronalaska. Lečenje sepse obuhvata primenu antibakterijskog sredstva ili steroida, vazopresora, rastvora za dopunu, primenu kiseonika, vođenje veštačkog disanja, dijalizu kontinuirane filtracije krvi i razmenu plazme.
10. Postupak skrinovania test leka (ili terapeutika)
[0178] Takođe je otkriven postupak skrinovanja leka za testiranje (ili terapeutika), koji obuhvata korak određivanja koncentracije presepsina u uzorku subjekta kome je primenjen/aplikovan test lek (ili terapeutik), korišćenjem antitela iz prve realizacije predmetnog pronalaska ili njegovog fragment antitela koji vezuje antigen, ili komplet treće realizacije. Bolest na koju je upućen test lek nije posebno ograničena sve dok je bolest u kojoj je povećana koncentracija presepsina u uzorku subjekta. Poželjno je da se koncentracija presepsina u uzorku subjekta uporedi između pre i posle primene ispitivanog leka da bi se utvrdilo da li je koncentracija presepsina posle primene ispitivanog leka smanjena u poređenju sa pre primene ili ne. Alternativno, može li se utvrditi da li je koncentracija presepsina u uzorku subjekta nakon primene ispitivanog leka smanjena u poređenju sa normalnom osobom koja nije primila test lek.
[0179] Takođe je otkriven postupak skrinovanja leka koji obuhvata sledeći korak:
1) korak određivanja koncentracije presepsina u uzorku subjekta kojem je aplikovan test lek.
11. rsCD14ST-Fe
[0180] Takođe je otkriven rsCD14ST-Fc koji ima strukturu koja sadrži sekvencu od položaja 1 do položaja 64 u SEQID NO: 3 (humani rastvorljivi CD14 cele dužine) i Fc region teškog lanca antitela.
[0181] rsCD14ST-Fc se može dobiti, na primer, transfekcijom plazmida za prolaznu ekspresiju koja eksprimira rsCD14ST-Fc, koja ima sekvencu koja sadrži trombin koji prepoznaje sekvencu nishodno od sekvence 1 do položaja 64 humanog sCD14, i sekvencu Fc regiona teškog lanca IgGl antitela dobijenog od čoveka, u ćeliji domaćina, kao što je COS-1 ćelija, uzgajajući ćeliju domaćina i regenerisanje i prečišćavanje dobijenog uzgajanog supernatanta.
[0182] Poželjno je da se redosled koji olakšava rezanje bude ubačen između sekvence položaja 1 do položaja 64 humanog sCD14 i Fc, kao dodatak sekvenci koja prepoznaje trombin, na primer, Faktor Ха koji prepoznaje sekvencu i PreScission Proteaza koja prepoznaje sekvencu može da se koristiti bez posebnog ograničenja. Nije bitno da rsCD14ST-Fc ima sekvencu koja olakšava isecanje.
[0183] Fc region teškog lanca antitela u rsCD14ST-Fc nije ograničen. Pored Fc regiona izvedenog iz ljudskog antitela IgGl, mogu se koristiti i Fc regioni svih ostalih poznatih antitela. Ćelija domaćina takođe nije naročito ograničena.
[0184] Budući da je rsCD14ST-Fc dobijen kultivacijom ćelije domaćina, poput ćelije COS-1 eksprimovanje je lako, i kako se Fc specifično veže za protein A, a kolona Proteina A može da se koristi za prečišćavanje, ona ima prednost u proizvodnji zato što je to prečišćavanje takođe jednostavno. Prečišćavanje nakon sečenja Fc regiona moguće je koristeći konvencionalni postupak pored kolone Proteina A, a prečišćavanje se može izvršiti, na primer, korišćenjem postupka opisanog u Primeru 13 u WO 2005/108429.
[0185] Takođe može da se koristi rsCD14ST-Fc kao rsCD14-ST odsecanjem Fc regiona, ili se može koristiti kao rsCD14ST-Fc bez odsecanja Fc regiona, a oba se posebno vezuju za antitelo na presepsin.
[0186] rsCD14ST-Fc dobijen u Primeru 9- (2) ima istu trombinsku sekvencu kao i rsCD14-ST standard, koji je insertovan između rsCDHST i Fc. rsCD14ST dobijen odsecanjem Fc regiona trombinom ima istu sekvencu kao i rsCDMST standard i ima ekvivalentna svojstva (videti WO 2005/108429).
[0187] Prilikom pripreme rsCD14 iz rsCD14ST-Fc, nakon odsecanja Fc, samo Fc se može lako ukloniti tako što se propusti kroz Protein A kolonu, a priprema je takođe jednostavna. Način za odsecanje Fc regiona rsCD14ST-Fc može se na odgovarajući način izabrati u skladu sa umetnutom sekvencom koja olakšava odsecanje.
[0188] Budući da rsCD14ST-Fc ima aktivnost rsCD14-ST bez isecanja Fc regiona, on se može koristiti kao antigen.
[0189] Prethodni rsCD14-ST standard je dobijen ekspresijom rsCD14 u kojoj je mesto za prepoznavanje trombina insertovano između položaja 64 i položaja 65 humanog sCD14, u ćeliji domaćina, i isecanjem rsCD14 na mestu prepoznavanja trombina. Struktura rsCD14 obuhvata rsCD14-ST, ali pokazuje malu reaktivnost kao rsCD14-ST. Tek nakon isecanja i prečišćavanja, rsCD14-ST dobija aktivnost koja postaje upotrebljiva. S druge strane, budući da se rsCD14ST-Fc može koristiti kao rsCD14-ST ili standard bez obzira da li je Fc regija isečena. Tako se tehnikom isecanja može uštedeti i to se može jednostavno koristiti.
Primeri
[0190] Primeri navedeni u daljem tekstu koji nisu obuhvaćeni obimom zahteva su dati u ilustrativne svrhe.
Primer 1: Proizvodnja monoklonskog antitela na sintetički peptid kao antigen
1-(1) Imunizacija zeca
4
[0191] Proizvodnja antigena za administraciju i imunizacija zeca su izvedeni u skladu sa postupkom opisanim u Primeru 1 u WO 2004/044005 А1. Posebno, peptid je proizveden peptidom u koji je cistein insertovan u N-terminalni kraj peptida (u daljem tekstu opisan kao S68 peptid) koji se sastoji od sekvence opisane u SEQ 1D NO: 2 (što odgovara sekvenci na položaju 53 do položaja 68 opisanoj u SEQ ID NO: 3). Ovaj peptid je vezan za KLH (PIERCE) i korišćen je kao antigen za administraciju (u daljem tekstu, opisan kao S68 peptid-KLH).
[0192] 100 μg S68 peptida-KLH je pomešano sa istom zapreminom Freund-ovog kompletnog adjuvansa (DIFCO) i aplikovano je intradermalno na leđima novozelandskog belog zeca (star tri meseca). Dve nedelje nakon toga, kao i nedelju dana nakon toga, 100 μg S68 peptid-KLH je pomešano sa istom zapreminom Freund-ovog nepotpunog adjuvansa (DIFCO) i aplikovano intradermalno na leđima. Dalje, 20 μg S68 peptida-KLH je aplikovano dva puta u ušnu venu.
[0193] Nedelju dana nakon završetka primene, uzet je uzorak krvi iz ušne vene i antiserum je razdvojen standardnim postupkom, a titar antitela i reaktivnost na presepsin su određeni korišćenjem sendvič ELISA. Konkretno, F1106-13-3 je imobilizovan na imunoploču (MAXISORP, C96, 430341, proizvođač Nunc) i blokiran. Svaki antiserum od zeca je razblažen sa D-PBS (pH 7,4) i podvrgnut kvadratnom serijskom razblaženju od xl/1000 do xl/32000 puta (8 tačaka). Referentni standard presepsina (rsCD14-ST opisan u primeru 16 u WO 2005/108429) je razblažen rastvorom za razblaživanje (0,1% BSA / D-PBS) da bi se dobio standardni rastvor od 3 ng / ml. Posle dodavanja serije razblaženja antiseruma na ploču, zatim je dodat standardni rastvor od 3 ng / ml. Ploča je inkubirana tokom jednog sata i nakon toga je ploča isprana pet puta fiziološkim rastvorom koji sadrži 0,05% Tween20. Zatim je dodato 100 ul rastvora dobijenog razblaživanjem anti -zečjeg Igs-HRP (DAKO, P448) i ploča je inkubirana tokom sata na 25<0>C. Nakon sličnog ispiranja ploče pet puta, dodat je rastvor tetrametil benzidina (TMB, proizvođač BioFix) i ostavljeno da reaguje 10 minuta na sobnoj temperaturi. Jednom kada je reakcija završena, reakcija je prekinuta dodatkom 1 M rastvora sumporne kiseline. Apsorbancija na 450/650 nm je merena korišćenjem Multiskan ЈХ (proizvođač Thermolab Systems). Na osnovu rezultata merenja apsorbancije odabran je komad sa visokim titrom antitela.
[0194] Cetiri dana pre prikupljanja slezine, 400 μg S68 peptida-KLH aplikovano je u ušnu venu. Nakon aseptičnog prikupljanja slezine, regenerisani su limfociti.
1-(2) Fuzija ćelija i kloniranje
[0195] Prema postupku opisanom u US patentu br.7429487, 2 х 108 ćelija limfocita i 1 х 108 ćelija imortalizovanih B limfocita dobijenih od zeca za fuzionog partnera je međusobno pomešano i fuzija ćelije je izvedena podeljeno dva puta. Fuzionisane ćelije su zasejane na ploču sa 96 ležišta i uzgajane prema opštem postupku.
[0196] U odnosu na supernatant kulture dobijenih 286 klonova, aktivnost vezivanja za aplikovani antigen je određena korišćenjem S68 peptida-BSA i odabrano je 72 klonova sa potvrđenom aktivnošću vezivanja.
[0197] U vezi sa 72 klonova sa potvrđenom aktivnosti vezivanja za aplikovani antigen, aktivnost vezivanja za referentni standard presepsina je određena sendvič ELISA sistemom, koji je isti kao 1- (1), i odabrani su klonovi sa potvrđenom aktivnošću vezivanja.
[0198] U pogledu klonova sa potvrđenom aktivnošću vezivanja za referentni standard presepsina, određena je specifičnost presepsina u krvi pacijenta. Konkretno, tri seruma od normalne osobe (kupljene od ProMedDx) i tri seruma pacijenta sa sepsom (kupljenom od Bioreclamation) razblaženi su pet puta rastvorom za razblaživanje i određeni su sendvič ELISA sistemom, koji je isti kao 1- (1). Kao rezultat, odabrano je pet klonova u kojima je reaktivnost sa referentnim standardom presepsina dobra, apsorbanca nije povećana u uzorku od normalne osobe, a apsorbanca je povećana u uzorku pacijenta sa sepsom. Svaki klon je kloniran ograničenim razblaženjem i pripremljena je svaka zamrznuta ampula.
1-(3) Analiza režima vezivanja sa BIACORE
[0199] Da bi se odredio režim vezivanja između svakog antitela koje je dobijeno od izabranog klona i presepsina, analiza je izvršena korišćenjem BIACORE3000 (proizvođač GE Health Care). Na CM5 čipu (proizveden od GE Health Care), mobilisano je antitelo F1106-13-3 standardnim postupkom i dalje je dodato sa referentnim standardom presepsina (1 μg / ml). Potom je dodat razblaženi supernatant kulture (0,5 μg / ml) i iscrtan je senzorgram. Svi klonovi su pokazali dobar režim vezivanja kod kojeg nije uočena disocijacija u fazi disocijacije.
1- (4) Priprcma zečjeg monoklonskog antitela
[0200] Korišćenjem dobijenog hibridoma koji proizvodi zečje monoklonsko antitelo na presepsin, proizvedeno je zečje monoklonsko antitelo. Konkretno, prema standardnoj metodi, smrznuta ampula je odmrznuta, a ćelije su sakupljene nakon ku ltivacije u RPMI1640 (proizvođač Sigma) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma i 8% suplementa A (proizvođač Abcam), i ćelije su uzgajane koristeći IS-MAB-CD medijum (proizvođač Irvine) prema protokolu CELLine (proizvođač Integra Bioscience), i sakupljen је supernatant kulture koji sadrži antitelo. Zatim, iz dobijenog supernatanta kulture, antitelo je prečišćeno korišćenjem rmp-Protein A Sepharose FF (proizvođač GE Health Care). Eluirani rastvor koji sadrži prečišćeno antitelo je koncentrovan i potom dijalizovan sa D-PBS (pH 7,4). Koncentracija proteina antitela merena je Bradford metodom koristeći kao standard goveđi IgG (proizvođač BioRad). Dobijeno antitelo je analizirano pomoću SDS-PAGE, i kao rezultat, identifikovan je pojedinačni opseg molekulske težine od oko 150 kDa. Dalje, kao rezultat smanjenja, identifikovan je teški lanac od oko 50 kDa i laki lanac od oko 25 kDa.
Primer 2: Proizvodnja rekombinantnog antitela
2-(1) Konstrukcija plazmida za ekspresiju i određivanje aminokiselinske sekvence u varijabilnom regionu zečjeg monoklonskog antitela
[0201] Iz svakog hibridoma dobijenog iz primera 1, ukupna RNK je ekstrahovana korišćenjem RNeasy Mini Kit (proizvođač Quiagen), a jednolančana cDNK je sintetizovana korišćenjem kompleta za sintezu SuperScript VILO cDN Synthesis Kit (proizvođač Invitrogen). Korišćenjem seta Rabbit Ig-Primer Set (Rader C, et al. JBC 2000; 275: 13668-76, and Lang I, et al. Gene 1996; 172: 295-8) koji koristi dobijenu jednostruku cDNK kao templat, varijabilni region je amplifikovan PCR-om, a nukleotidna sekvenca svakog varijabilnog regiona teškog i lakog lanca određena je standardnom metodom.
[0202] Izvršeno je pretraživanje baze podataka prema informaciji o sekvenci osim varijabilnog regiona i dizajnirani su 5 'bočni prajmer i 3' bočni prajmer. Korišćenjem tih prajmera, PCR je izvršen da bi se amplifikovao svaki teški lanac pune dužine i laki lanac pune dužine, koji su zatim klonirani u pTK-2433 koji ima promotor EF-la i CMV pojačivač, to jest vektor za prolaznu (kratkotrajnu) ekspresiju u ćelijama sisara. Prema standardnoj metodi, određena je nukleotidna sekvenca svakog teškog lanca pune dužine i lakog lanca pune dužine i sekvence aminokiselina koje su njima kodirane. Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona CDR dela antitela prikazane su u Tabeli
1 (Teški lanac) i Tabeli 2 (Laki lanac).
4
2-(2) Dobijanje rekombinantnog antitela za prolaznu ekspresiju
[0203] Plazmidi za prolaznu ekspresiju koji su dobijeni u prethodnom 2- (1) (ekspresioni plazmid koji sadrži sekvencu teškog lanca i ekspresioni plazmid koji sadrži sekvencu lakog lanca) pomešani su jedni sa drugima u istoj količini i ćelije COS- 1 (ATCC: CRL-1650) su transfektovane sa smešom. Konkretno, posle mešanja reagensa za transfekciju od 2 μ1 / ml i plazmida od 4 μg / ml i dodavanja u medijum, ćelije COS-1 su dodate u njih i uzgajane na 37 ° C. Sedamdeset i dva sata kasnije, supernatant kulture je sakupljen i ponovo dodat u svež medijum. Devedeset i šest sati kasnije, supernatant kulture je sakupljen, a frakcije dobijene iz dve kolekcije su pomešane i profiltrirane kroz 0,22 μm filter (Sterivac, proizvođač Millipore). Dobijeni supernatant kulture je prečišćen prethodno opisanom metodom 1- (4), a kao rezultat analize sa SDS-PAGE, identifikovano je rekombinantno antitelo koje pokazuje jednu traku na oko 150 kDa.
2-(3) Konstrukcija plazmida za stabilnu ekspresiju rekombinantnog antitela [0204] Korišćenjem restrikcionog enzima, fragment gena koji kodira teški lanac i fragment gena koji kodira laki lanac su digestovani iz plazmida za prolaznu ekspresiju koji su prethodno dobijeni u 2- (2) i povezani sa plazmidom (pTK-2577; opisano u JP 2007-215546 A) koji sadrži EF-la promotor i mišju jedinicu DHFR ekspresije [SV40 promotor kao promotor (koji ne sadrži pojačivač region), poliA signal izveden iz SV40] da bi se dobio plazmid za stabilnu ekspresiju u životinjskim ćelijama sisara.
Primer 3: Proizvodnja antitela CHO ćelijom
3-(1) Dobijanje CHO ćelije za proizvodnju rekombinantnih antitela zečjeg monoklonskog antitela
[0205] CHO ćelije sa nedostatkom DHFR gena (CHO DXB11) su transfektovane sa plazmidom za stabilnu ekspresiju koji je prethodno konstruisan u 2- (3) i ustanovljene su transformisane CHO ćelije koje proizvode zečja antitela. Konkretno, CHO DXB11 koji je aklimatizovan i uzgojen sa EX-CELL 302 PF CHO (proizvođač JRH Bioscience) koji sadrži HT medijum Suplement (50<x>) Hybri-Max (proizvođač Sigma; koristi se u 1 х finalnoj koncentraciji) i 200 mM L -Glutamin (proizvođač Sigme; korišćen u krajnjoj koncentraciji od 4 mM) je centrifugiran na dan transfekcije i inokulisan u balon u koncentraciji 8 x 10<6>ćelija /150 cm<2>Roux. Korišćenjem 125 pl FuGENE6 (proizvođač Promega), 12,5 μg ekspresionog plazmida je pripremljeno prema protokolu priloženom za FuGENE6 i zatim uvedeno u CHO DXB11. Posle kultivacije tokom dva dana na 37°C, 5% CO<2>, ćelije su sakupljene i isprane dva puta sa HT-free EX-CELL 302 PF CHO medijumom koji sadrži 4 mM L-glutamin (u daljem tekstu, opisano kao EX-CELL (HT-)) i ponovo suspendovan u EX-CELL (HT-). Zatim su ćelije ponovo zasejane na ploču sa 96 ležišta kao 12.500 do 50.000 ćelija / ležištu i neprekidno gajene na 37°C, 5% CO<2>. Polovna zapremine medijuma je zamenjena svežim EX-CELL (HT-) svaka tri ili četiri dana. Posle nastavka gajenja tokom oko dve nedelje, ćelije u ležištima kod kojih je uočena pojava kolonije, prebačene su na novu ploču.
4
[0206] Antitelo u supernatantu kulture ćelija CHO je analizirano ELISA postupkom koji koristi S68 peptidni antigen kao čvrstu fazu, a zatim je odabrano pet vrsta CHO ćelija koje proizvode antitelo koje se vezuje za S68 peptid.
3-(2) Amplifikaciia gena korišćenjem metotreksata
[0207] Izvođenjem procesa amplifikacije gena za koji su transformisane CHO ćelije za ekspresiju rekombinantnog antitela dobijene u 3- (1) odabrane i uzgajane u EX-CELL (HT-) medijumu koji sadrži metotreksat (ovde dole, označen kao МТХ), odabrani su klonovi u kojima je povećana proizvodna količina ciljnog rekombinantnog antitela. Konkretno, transformisane ćelije dobijene iz primera 3- (1) su suspendovane u ЕХ- CELL (HT-) medijumu koji sadrži 30 nM МТХ, a zatim su raspoređene na ploči sa 96 ležišta. Polovna zapremine medijuma je zamenjena svaka tri ili četiri dana sa svežim EX-CELL (HT-) koji sadrži 30 nM МТХ i gajenje je nastavljeno na 37 ° C, 5% CO2 sve do formiranja kolonije. Koncentracija IgG u supernatantu kulture dobijene kolonije određena je ELISA metodom i odabrani su klonovi koji pokazuju povećanu količinu proizvodnje. Kao rezultat, dobijen je transformant koji pokazuje proizvedenu količinu uvećanu za dva do deset puta. U međuvremenu, podvrgavanjem transformanta sa amplifikovanim genom ponovljenoj selekciji i gajenju u medijumu u kojem je koncentracija МТХ povećana tri do deset puta, bilo je moguće dobiti klonove koji su dodatno povećali količinu proizvodnje.
3-(3) Proizvodnja rekombinantnog antitela CHO ćelijom
[0208] Klonovi dobijeni iz 3- (2) inokulirani su u CHO-SFM (HT-) medijum (proizvođača GIBCO) koji sadrži 30 nM МТХ da bi se dobilo 1 > 10<5>ćelija / ml i kultivisao sedam dana na 37°C. Dobijeni supernatant kulture korišćen je za prečišćavanje antitela. Antitelo je prečišćeno iz supernatanta kulture korišćenjem kolone Protein A (Prosep-A, proizvođača Millipore). Kao rezultat analizom prečišćenog rekombinantnog antitela pomoću SDS-PAGE, identifikovano je antitelo koje pokazuje istu molekulsku težinu kao antitelo izvedeno iz hibridoma.
Primer 4: Procena reaktivnosti svakog antitela u sendvič ELISA sistemu
[0209] Reaktivnost sa presepsinom procenjena je za 5 vrsta zečjih monoklonskih antitela pripremljenih u Primeru 2, antitelo S68 opisano u primeru 1 u WO 2004/044005 А1 (poliklonsko antitelo dobijeno imunizacijom zeca sa S68 peptidom) i F1146 -17-2 opisan u primeru 2 u WO 2004/044005 А1 (monoklonsko antitelo dobijeno imunizacijom pacova S68 peptidom). Posebno, svako antitelo je razblaženo na 5 μg / ml sa PBS (pH 7,4), a 50 μl je dodato u svako ležište imuno ploče (Maxisorb, proizvođača NUNC). Nakon reakcije preko noći na 4 ° C, isprano je vodom za izmenu jona pet puta,
4
а blokiranje је izvršeno dodavanjem u svaku ležište 200 џ\ PBS koji sadrži 0,1% StabilGuard (proizvođača SurModics, Inc) i 0,1% Tween20 (proizvođača Wako Pure Chemical Industries, Ltd). Zatim je referentni standard presepsina razblažen na 1.000 ng/ml uz pomoć rastvora za razblaživanje i potom razblažen u odnosu tri puta da bi se pripremilo serijsko razblaživanje referentnog materijala. Serijsko razblaživanje referentnog standarda je dodato u količini od 50 μl po ležištu i ostavljeno da reaguje tokom jednog sata na 25 ° C. Po završetku reakcije, isprano je pet puta fiziološkim rastvorom soli koja sadrži 0,05% Tween20, i 50 μl F1106-13-3 antitela obeleženog peroksidazom, koje je razblaženo do 0,25 μg / ml, pa je dodato u svako ležište. Posle reakcije u trajanju od dva sata na 25°C, ispiranje je izvršeno pet puta na isti način kao gore, i u svako ležište je dodat TMB rastvor. Nakon reakcije u trajanju od 20 minuta na sobnoj temperaturi, reakcija je prekinuta dodatkom 0,5 M rastvora sumporne kiseline i merena je apsorbanca na 450 nm (sub-talasna dužina 650 nm) pomoću spektrofotometra za ploče (proizvođač Molecular Devices).
[0210] Rezultati merenja prikazani su u Tabeli 3. Svaki merni sistem koji koristi svako zečje monoklonsko antitelo pripremljeno u Primeru 2 bio je odličan u reaktivnosti sa referentnim standardom presepsina i pokazao je gotovo ekvivalentnu reaktivnost kao u mernom sistemu koristeći S68 antitelo .
[0211] Sa druge strane, merni sistem koji koristi F1146-17-2 pokazao je nisku reaktivnost i apsorbancu od 0,368 kada je koncentracija presepsina iznosila 1000 ng/ ml. Ova apsorbanca je bila gotovo ekvivalentna apsorbanciji pokazanoj kada je koncentracija presepsina bila 0,03 do 0,1 ng / ml u mernom sistemu koristeći zečja monoklonska antitela. Kao što je gore navedeno, otkriveno je da je sistem za merenje pomoću zečjeg monoklonskog antitela poboljšao reaktivnost za oko 10.000 puta u poređenju sa mernim sistemom koji koristi F1146-17-2. Kako je koncentracija presepsina u uzorku normalne osobe obično oko 50 do 300 pg / ml, pokazalo se da je merenje nemoguće u mernom sistemu koristeći F1146-17-2.
4
Primer 5: Merenje uzorka uzetih od pacijenta i ispitivanja interferencije
[0212] Vrednosti presepsina u uzorcima krvi kod 30 pacijenata sa sepsom merene su sendvič ELISA sistemom opisanom u Primeru 4, koristeći svako antitelo proizvedeno u Primeru 2, i izvršena je analiza korelacije sa vrednostima merenja sendvič ELISA sistemom korsiteći antitelo S68.
[0213] Kao rezultat, u svakom ELISA sistemu koji koristi zečje monoklonsko antitelo postojale su dve vrste sistema, jedan sistem koji pokazuje dobru korelaciju sa mernom vrednošću ELISA sistema koristeći S68 antitelo, i drugi sistem koji pokazuje lošu korelaciju. Rezultati su pokazali da su koeficijenti korelacije zečjih monoklonskih antitela F1466-12 i F1466-19 bili lošiji u odnosu na ostala. Koeficijenti korelacije odgovarajućih antitela bili su F1466-12 = 0,89, F1466-19 = 0,93 i F1466-26 = 0,98.
[0214] Zatim je uticaj interferencijalnih supstanci u krvi (bilirubin F, bilirubin C, hemoglobin, faktor reumatizma i trigliceridi) na vrednost merenja presepsina ispitivan u sendvič ELIS A sistemima proizvedenim koristeći svako monoklonsko antitelo zeca i antitelo S68, redom. Svaka interferentna supstanca u postepenim koncentracijama dodata je u serum zdravih dobrovoljaca sadržana sa fiksnom količinom presepsina i izmerena je koncentracija presepsina, a uticaj svake interferencijalne materije na vrednost merenja procenjen je na osnovu merne vrednost kada nije dodata interferencijalna supstanca.
[0215] Kao rezultat, interferencija bilirubina F, bilirubina C, hemoglobina i faktora reumatizma nije bio problematičnog nivoa u mernim sistemima koji koriste bilo koje antitelo.
[0216] Sa druge strane, trigliceridi (TG) su imali uticaja na merni sistem koristeći neka antitela. TG interferencijski test je izveden kao što je opisano u daljem tekstu. Kao uzorak je korišćen humani semru zdravih dobrovoljaca kome je dodata određena
4
količina presepsina. Serijski razblaženi uzorci do koncentracije od 20 mg/ml TG u uzorcima, korišćenjem 20% intralipidne transfuzije (Fresenius SE & Co. KGaA). TG koji je prvobitno sadržan u serumu uzorka ne uzima se u obzir u ovoj koncentraciji TG. Razblaženi uzorci su dalje razblaženi 20 puta rastvorom za razblaživanje uzorka, a vrednost presepsina je izmerena sa ELISA. Ovaj TG interferencijski test izveden je za veći broj uzoraka.
[0217] Kao rezultat, dodavanje TG uticalo je na vrednost merenja presepsina u mernom sistemu koristeći F1466-12 i F1466-19 antitela, i odnos uzorka koji je veći od ± 20% stepena razdvajanja vrednosti merenja presepsina je bio visok kada je koncentracija TG u uzorku bila 20 mg/ml.
[0218] Pored toga, stepen razdvajanja vrednosti merenja presepsina u koncentraciji TG u uzorku od 20 mg/ml dobijen je u više uzoraka, a prosečna vrednost stepena razdvajanja je izračunata za svako antitelo. Kao rezultat, prosečna vrednost stepena razdvajanja pokazuje ± 20% ili manje u mernom sistemu koristeći S68 antitelo, F1466-5 i F1466-26.
[0219] Sa druge strane, u sistemu merenja koji koristi antitela F1466-12, F1466-19 i F1466-16, rezultat je bio da prosečni stepen razdvajanja prelazi
± 20%.
[0220] Pored toga, poređeni su stepeni disocijacije vrednosti merenja presepsina dodavanjem TG između sistema testiranja koji koristi svako monoklonsko antitelo kod zeca i sistema ispitivanja koji koristi antitelo S68. Dakle, kada je koncentracija TG u uzorku iznosila 20 mg/ml dodavanjem TG, uzorci koji pokazuju više od 20% predstavljaju i razliku između stepena disocijacije mernog sistema F1466-12 i stepena disocijacije mernog sistem antitela S68 i velika je razlika između stepena disocijacije mernog sistema F1466-19 i stepena disocijacije mernog sistema antitela S68.
[0221] Ovo ukazuje na mogućnost da razlika u performansama antitela u TG interferencijskom testu utiče na korelacionu analizu kao što je gore opisano.
[0222] Pokušano je sa testom interferencijalne supstance za F1146-17-2, ali podaci nisu dobijeni zbog niske reaktivnosti.
Primer 6: Specifičnost antitela; Analiza epitopa
[0223] Analizirani su epitopi svakog monoklonskog antitela zeca i F1146-17-2 proizvedeni u Primeru 2 (monoklonsko antitelo dobijeno imunizacijom pacova sa peptidom S68).
[0224] Sintetisano je 8 vrsta peptida koji se sastoje od 10 aminokiselina koje sadrže parcijalni fragment peptidne sekvence SEQ 1D NO: 2, koji je upotrebljen kao administrativni antigen u Primeru 1 (videti Tabelu 4). Sekvenca epitopa je ispitivana
4
posmatranjem reakcije kompetitivne inhibicije sa referentnim standardom prethodno podešenih vrednosti pomoću sendvič ELISA sistema opisanog u Primeru 4. Specifično, ploče za imobilizaciju svakog antitela su pripremljene u skladu sa postupkom opisanim u Primeru 4. Sledeće, 400 pg/ml referentnog standarda presepsina i 20 μg / ml sintetičkih peptida prikazanih u tabeli 4 (P01 do P08) su dodati na ploče kao 25 μl, i reagovali su. Bez dodavanja peptida (opisano kao PBS) i peptid za negativnu kontrolu (opisano kao NC: sekvenca CGDKTTATDIKGKE (SEQ ID NO:34)) korišćeni su kao negativna kontrola. Pored toga, S68 peptid je korišćen kao pozitivna kontrola. Reakcioni sistem je obojen sa TMB nakon završetka reakcije. Ako je sintetički peptid reagovao sa antitelom, apsorpcija se smanjila, jer je inhibirano vezivanje presepsin referentnog standarda za antitelo. Brzina inhibicije svakog peptida je izračunata kada je pretpostavljeno da apsorbancija PBS-a iznosi 100%.
[0225] Kao rezultat toga, antitelo koje prepoznaje samo P03, antitelo koje prepoznaje P03 do P04 i antitelo koje prepoznaje P04 do P05 su potvrđeni kao što je prikazano u Tabeli 5. Pored toga, otkriveno je da F1146-17-2 prepoznaje P04 do P05. Kao rezultat, otkriveno je da je dobijeno monoklonsko antitelo koje prepoznaje lokaciju P03 kao epitop. Otkriveno je da su F1466-12 i F1466-19, koji su pokazali lošije rezultate u TG interferencijskom testu i korelaciji sa sistemom za merenje koristeći S68 antitelo u Primeru 5, prepoznali P04 do P05 i nisu prepoznali P03 kao epitop slično kao monoklonalna antitela pacova (F1146-17-2). Druga antitela su prepoznala P03 kao epitop. Ovo sugeriše da postoji odnos između pogodne sposobnosti za merenje antitela na presepsin i epitopa koju antitelo prepoznaje. Pored toga, presepsin ima aminokiselinsku sekvencu koja je u velikoj meri deficijentna u C-terminalnom delu sCD14 velike molekulske mase, i pretpostavlja se da dužina njegove aminokiseline ima varijaciju. Moguće je da je razlika u specifičnosti antitela uticala na korelaciju sa mernom vrednošću korišćenjem antitela S68 u Primeru 5.
Primer 7: Detaljna analiza epitopa
[0226] U odnosu na zečje monoklonsko antitelo koje prepoznaje P03 peptid, ispitivana je reaktivnost sa peptidima dobijenim modifikovanjem P03 peptida za jednu aminokiselinu. Sintetisani su peptidi (P031 do P039 peptidi) dobijeni supstitucijom aminokiselina na položaju 53 do položaja 61 alaninom (glicin kada je originalna aminokiselina alanin) jednom aminokiselinom u P03 peptidu (što odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 1, i aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od sekvence položaja 52 do položaja 61 u SEQ ID NO: 3), a reaktivnosti između peptida od P031 do P039 i antitela su potvrđene sa sendvič ELISA sistemom u skladu sa opisom primera 4.
[0227] Kao rezultat, aktivnost vezivanja sa antitelom je izgubljena kada je asparaginska kiselina na položaju 59 u SEQ ID NO: 3 u Р0З peptidu (što odgovara položaju 8 u SEQ ID NO: 1) zamenjena alaninom.
1
[0228] Aktivnost vezivanja sa antitelom je održavana kada su aminokiseline na položaju 53 do položaja 58 u SEQ ID NO.: 3 (odgovara aminokiselinama od položaja 2 do položaja 7 u SEQ ID NO: 1), pozicija 60 i položaj 61 u SEQ ID NO: 3 u P03 peptidu (koji odgovara položaju 9 i položaju 10 u SEQ ID NO: 1) supstituisane alaninom (ili glicinom).
[0229] Kao što je gore opisano, potvrđeno je da antitelo koje prepoznaje P03 peptid kao epitop prepoznaje peptide kao epitop koji su peptidi dobijeni supstitucijom aminokiselina na poziciji 53 u položaju 58, položaju 60 i položaju 61 opisano u SEQ ID NO: 3 u P03 peptidu sa alaninom (ili glicinom) za jednu aminokiselinu.
Primer 8: Dobijanje varijante monokionskog antiteia na presepsin dobijenog od zeca [0230] Pripremljene su varijante na osnovu sekvence monoklonskih antitela na presepsin izvedena iz zeca a opisanih u Primeru 1.
8-(1) Analiza sekvence CDR
[0231] Kao rezultat analize sekvence CDR pet vrsta antitela na presepsin koja su dobijena iz Primera 1, pretpostavljeno je da sekvenca svakog antitela ima sekvencu koja utiče na aktivnost antitela i sekvencu koja ne utiče na aktivnost antitela. Stoga, korišćenjem kao baze CDR sekvence F1466-26 antitela, koje je jedno od antitela za koja je jasno pokazano da prepoznaju sekvencu P03 (SEQ ID NO: 1) kao epitop u Primeru 6, modifikacija amino kiselina svake sekvence CDR je izvedena tako što je pripremljena varijanta i procenjena je aktivnost varijante. Pripremljeno je oko 100 varijanti. Modifikacija aminokiselina je izvedena supstitucijom, inservijom ili delecijom aminokiseline ili supstitucijom sekvence sa nekoliko aminokiselina.
[0232] Varijanta koja sadrži punu dužinu teškog lanca antitela F1466-26 i punu dužinu lakog lanca antitela F1466-5 je takođe pripremljena i procenjena na isti način kao što je prethodno opisano.
8-(2) Priprema plazmida za dobijanje modifikovanog proizvoda teškog lanca [0233] Plazmid za modifikovani proizvod teškog lanca je pripremljen na sledeći način. Iako su opisi dati za plazmid pTK-5793, drugi plazmidi su takođe konstruisani po istoj metodi. Korišćenjem kao templet, plazmid za prolaznu ekspresiju teškog lanca (pTK- 5605) koji sadrži punu dužinu teškog lanca F1466-26 dobijenog u primeru 2 i par prajmera (IgG zeca (14-12) -e : 3 'bočni prajmer i Aorl3HI-zečji IgV2: 5' bočni prajmer), izvršena je PCR. Upotrebom umnoženog fragmenta dobijenog kao templat i par prajmera (zečji IgG (14-12) -e i Aorl3HI-zečji IgV2), izvršena je PCR. Dobijeni umnoženi fragment kloniran je u plazmid pT7-Blue, a zatim je pripremljen fragment koji
2
sa r e enu se vencu upotre om restr c onog enz ma or HI. Da e, pTK- 7 (proizvela naša kompanija) koji ima promotor EF-1 α i pojačivač CMV, i dalju sekvencu gena koja sadrži druge delove izuzev varijabilnog regiona teškog lanca zečjeg IgG, koji je vektor za prolaznu ekspresiju u ćelijama sisara, digestovan je restriktivnim enzimom Aorl3HI pri čemu se dobija vektorski fragment. Pripremljeni fragment koji sadrži željenu sekvencu je kloniran u fragment vektora da bi se dobio pTK-5793.
8- (3) Priprema plazmida za dobijanje proizvoda sa modifikovanim lakim lancem [0234] Plazmid za proizvod modifikovanim lakim lancem je pripremljen na sledeći način. Iako su opisani za plazmid pTK-5844, ostali plazmidi su takođe konstruisani po istoj metodi. Korišćenjem kao templat, plazmida za prolaznu ekspresiju lakog lanca (pTK-5608) koji sadrži punu dužinu lakog lanca F1466-26 dobijenog iz Primera 2 i par prajmera (pEF2ce-28: 3 'bočni prajmer i pEF2ce-49: 5 'bočni prajmer), izvršena je PCR. Upotrebom amplificiranog (umnoženog) fragmenta dobijenog kao templat i par prajmera (pEF2ce-28 i pEF2ce-49), izvršena je PCR. Dobijeni umnoženi fragment kloniran je u plazmid pT7-Blue, i zatim je pripremljen fragment koji sadrži željenu sekvencu korišćenjem restrikcionih enzima BamHI i Xbal. Pored toga, pTK-2433 (proizvela naša kompanija), koji je vektor za prolaznu ekspresiju u ćelijama sisara, digestovan je restrikcionim enzimima BamHI i Xbal da bi se pripremio fragment vektora. Pripremljeni fragment koji sadrži željenu sekvencu je kloniran u fragment vektora da bi se dobio pTK-5844.
8- (4) Priprema rekombinantnog antitela u sistemu prolazne ekspresije
[0236] U daljem tekstu, kao reprezentativan primer prikazan je postupak za prolaznu ekspresiju antitela pomoću plazmida pTK-5793 za dobijanje modifikovanog proizvoda teškog lanca. Plazmid (pTK-5793) za pripremu modifikovanog proizvoda teškog lanca koji je pripremljen u Primeru 8- (2) i plazmid (pTK-5608) za prolaznu ekspresiju lakog lanca koji je opisan u Primeru 8- (3) pomešani su u istim količinama i ćelije COS-1 (ATCC: CRL-1650) su transfektovane pomoću reagensa za transfekciju (FuGENE (registrovani žig) 6, Promega KK). Konkretno, koristeći Opti-MEM (registrovani žig) Redukovani serumski medijum (proizvođača Life Technologies) kao tečnost za razblaživanje, reagens za transfekciju i plazmid pripremljeni su kao 0,96 μl/25 μl i 0,48μg/25 μl, respektivno. Posle mešanja i dodavanja u medijum, dodati su ćelijama COS-1, koje su zatim kultivisane na 37°C. Posle kultivacije tokom 72 h, sakupljen je supernatant kulture.
[0237] Slično gore opisanom, plazmid za pripremu svakog modifikovanog proizvoda teškog lanca je korišćen posle mešanja sa plazmidom (pTK-5608) za prolaznu ekspresiju lakog lanca. Plazmid za pripremu svakog modifikovanog proizvoda lakog lanca korišćen je nakon mešanja sa plazmidom (pTK-5605) za prolaznu ekspresiju teškog lanca. Modifikovani proizvod, uključujući teški lanac pune dužine antitela F1466-26 i laki lanac pune dužine antitela F1466-5, pripremljen je mešanjem sa pTK-5605 i plazmidom za prolaznu ekpresiju lakog lanca koji obuhvata punu dužinu lakog lanca F1466-5.
Primer 9: Procena varijante (1)
[0238] Šesnaest vrsta varijanti (IgG antitela) koje su dobijene ekspresijom u COS-1 ćelijama u Primeru 8 je prečišćeno i procenjena je reaktivnost sa presepsinom, specifičnost i afinitet (KD vrednost) svakog antitela.
9-(1) Prečišćavanje antitela
[0239] Supernatant kulture COS-1 ćelija dobijenih iz 8- (4) je sakupljen i profiltriran kroz filter od 0,22 μm (Sterivac, Merck Millipore). Dobijeni supernatant kulture je prečišćen korišćenjem Prosep vA (Merck Millipore). Eluat koji sadrži prečišćeni proizvod je koncentrovan i potom dijalizovan sa D-PBS (pH 7,4). Koncentrat proteina je dobijen Lowry -jevim postupkom koristeći IgG (BioRad Laboratories, Inc.) kao standard. Dobijeno antitelo je analizirano sa SDS-PAGE. Kao rezultat, utvrđeno je rekombinantno antitelo koje pokazuje jednu traku od oko 150 kDa.
9-(2) Dobijanje rsCD14ST-Fc u sistemu prolazne ekspresije
[0240] Prvo, koristeći kao temlat pTK356H (TB64) (plazmid koji ima sekvencu koja kodira rsCD14 koja je opisana u primeru 13 u WO 2005/108429), par prajmera (hCD14- a, hCD14-d) i Taq polimeraza (TAKARA BIO INC), izvedena je PCR reakcija.
Dobijeni amplifikovani fragment (koji sadrži sekvencu koja prepoznaje trombin nishodno od sekvence položaja 1 do položaja 64 humanog sCD14 koji uključuje signalnu sekvencu i mesto restrikcionog enzima na oba kraja) korišćen je za kloniranje TA u vektoru pT7Blue (Merck Millipore). Nakon potvrđivanja sekvence, korišćen je kao pTK-3047. Zatim je fragment dobijen digestijom pTK-3047 sa restrikcijskim enzimima EcoRI i BamHI je insertovan u vektorski fragment koji je prethodno pripremljen
4
restrikcijom pTK-2233 (plazmid za ekspresiju ćelija sisara koji sadrži sekvencu koja kodira Fc region teškog lanca IgGl antitela, teški lanac izveden od čoveka) sa EcoRI i BamHI, a dobijeni klon korišćen je kao pTK-3053.
Sekvenca hCD14-a 5-GGGAATTCGCCGCCACCATGGAGCGCGCGTCCTGC-3' (SEQ ID NO:89)
Sekvenca hCD14-d 5’-GGGATCCACGCGGAACCAGAGCATACTGCCGCGGG-3' (SEQ ID NO:90)
[0241] Ćelije COS-1 (ATCC: CRL-1650) su transfektovane plazmidom pTK-3053 za prolaznu ekspresiju za eksprimovanje rsCD14ST-Fc. Konkretno, reagens za transfekciju i plazmid pomešani su jedan sa drugim kao 2 μl/ml i 4 μg/ml, respektivno. Nakon mešanja i dodavanja medijum, dodate su u ćelije COS-1, koje su zatim kultivisane na 37°C. Posle kultivacije tokom 72 h, supernatant kulture je sakupljen i dodat je sveži medijum. Nakon kultivacije 96 h, supernatant kulture je sakupljen i frakcije dobijene iz dve kolekcije su ispomešane i profiltrirane kroz filter od 0,22 μm (Sterivac, Merck Millipore). Dobijeni supernatant kulture je prečišćen korišćenjem Prosep vA (Merck Millipore). Eluat koji sadrži prečišćeni proizvod je koncentrovan i potom dijalizovan sa D-PBS (pH 7,4). Koncentrat proteina je dobijena Lowry metodom koristeći BSA (BioRad Laboratories, Inc.) kao standard. Dobijeni rsCD14ST-Fc je analiziran pomoću SDS-PAGE. Kao rezultat, određena je jedna traka molekulske težine od oko 75 kDa. Aktivnost vezivanja pripremljenog rsCD14ST-Fc za antitelo na presepsin je određena ELISA testom u kojoj je antigen imobilizovan u čvrstoj fazi.
9- (3) Utvrđivanje sendvič ELISA
[0242] Korišćenjem varijante koja je pročišćena u 9- (1), utvrđena je sendvič ELISA.
Konkretno, svaka varijanta je imobilisana na IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) proizvođača Nunc, a potom blokirana. Zatim je dodavanjem standardnog proizvoda presepsina (0 do 300 pg / ml) ploča reagovala jedan sat na 25 ° C. Nakon toga, ploča je isprana pet puta fiziološkom fiziološkom otopinom koja sadrži 0,05% Tween 20. Zatim je u svako ležište dodat rastvor koji sadrži razblaženi F1106-13-3 F (ab') 2-HRP i reakcija je ostavljena da se odvija 2 h na 25°C. Slično, nakon ispiranja ploče pet puta, dodat je rastvor TMB i reakcija je ostavljena da se odvija tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, reakcija je prekinuta dodatkom 1 M rastvora sumporne kiseline. Izmerena je apsorbanca na 450/650 nm pomoću čitača ploča.
9- (4) Procena specifičnosti (1)
[0243] Da bi se procenila specifičnost varijante koja je prečišćena u 9- (1), izvedena je ELISA korišćenjem ploče na koju je imobilizovan P03 peptid (SEQ ID NO: 1, pripremljen u Primeru 6). Za poređenje, takođe je izvršena evaluacija F1466-26.
[0244] Specifično, BSA ili P03 peptid-BSA je imobilizovan na IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) od strane Nunc, a potom je blokiran.
[0245] Na osnovu rezultata koncentracije proteina dobijenog 9- (1), napravljeno je razblaženje dodatkom D-PBS-a i pripremljen je rastvor u koncentraciji od 500 ng/ml. Svaki razblaženi rastvor dodat je u količini od 50 μl po ležištu i reakcija je ostavljena da se odvija na ploči tokom jednog sata. Nakon toga, ploča je isprana pet puta fiziološkom rastvorom soli koji sadrži 0,05% Tween 20. Zatim je u svako ležište dodat rastvor u kojem je razblažen anti zečji Igs-HRP (DAKO, P448) i reakcija je ostavljena tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Slično, nakon ispiranja ploče, dodat je rastvor TMB i reakcija je ostavljena da se odvija 3 do 5 min na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, reakcija je prekinuta dodatkom 1 M rastvora sumporne kiseline. Apsorbanca na 450/650 nm je merena korišćenjem čitača ploča (Molecular Devices ). Zajedno sa modifikovanom CDR sekvencom varijante, rezultati su prikazani u tabelama 7 do tabele 13.
Kao rezultat, utvrđeno je da se 87% varijanti vezuje na P03 peptid, i na taj način je pokazano da je P03 mesto prepoznato kao epitop. Konkretno, pokazano je da su 5795, 5803, 5811, 5810, 5784, 5793, 5858, 5878, 5875, 5876, 5844, 5874 i 5684 prepoznali P03 mesto kao epitop među dobijenim modifikovanim proizvodima.
9- (5) Procena afiniteta
[0246] Analizirana je afinitet (KD) varijante za presepsin (korišćen je rsCD14ST-FC pripremljen u 9- (2)), P03 peptid i peptid S68. Procena je takođe izvršena za S68 antitelo, monoklonsko antitelo dobijeno od pacova (F1146-17-2) i F1466-26.
[0247] Merenje afiniteta izvršeno je korišćenjem BIACORE3000 (GE Healthcare). Na čipu CM5 (GE Healthcare), svaki od rsCD14ST-Fc, P03-BSA i S68-BSA je imobilisan u skladu sa uobičajenom metodom i dodata je serija razblaživanja svakog antitela (1,6 do 1000 nM) i određen je način vezivanja za svaki antigen. Izrađen je senzorgram, a dobijanjem konstante brzine asocijacije (Ka) i konstante brzine disocijacije (Kd), izračunata je ravnotežna konstanta disocijacije (KD).
[0248] Rezultati merenja afiniteta (KD) antitela S68, monoklonskog antitela dobijenog od pacova (F1146-17-2) i F1466-26 za rsCD14ST-FC prikazani su u Tabeli 15.
[0249] Kao rezultat, utvrđeno je da F1466-26 (KD vrednost 1,48Е-09) ima afinitet za presepsin koji je oko deset puta veći od onog za S68 antitelo (KD vrednost 1,08E-08) za vrednosti KD. Takođe je utvrđeno da F1466-26 ima afinitet za presepsin (KD vrednost) koji je oko deset hiljada puta veći od onog monoklonskog antitela dobijenog od pacova (F1146-17-2: KD vrednost 1,08Е-05).
[0250] Rezultat merenja afiniteta (KD) svake varijante za rsCD14ST-FC prikazan je u tabelama 7 do tabele 13, zajedno sa modifikovanom sekvencom CDR. Kao rezultat, otkriveno je da 80% varijante ima afinitet koji je veći ili jednak onom antitela S68. Prema modifikaciji CDR sekvence F1466-26, dobijena je varijanta (5810) koja ima afinitet za presepsin (KD vrednost) koja je oko hiljadu puta veća od vrednosti za F1466- 26.
[0251] Jedna poželjna realizacija predmetnog pronalaska je antitelo koje ima veći afinitet antitela za presepsin u poređenju sa afinitetom S68 antitela za presepsin. Kada se uporede vrednosti KD, primeri poželjnih antitela uključuju F1466-26 i 5795, 5803,
5810, 5784, 5793, 5858, 5844 i 5684 kao varijantu. Pored toga, antitelo koje ima vrednost KD antitela manju od 10<-8>je takođe povoljno i primećene su i F1466-26, 5795, 5803, 5810, 5784, 5793, 5858, 5844, i 5684. Dalje, antitelo koje ima odličan afinitet za presepsin pomoću presepsina koji pokazuje KD vrednost koja je 1/2 ili manja od KD vrednosti za S68 antitelo je takođe poželjna, a primećene su i F1466-26, 5795, 5803, 5810, 5784 i 5793. Oni koji pokazuju posebno odličnu vrednost KD su 5793 (7,3E-10) i 5810 (6,52E-12).
[0252] Utvrđeno je da varijanta 5684 u kojoj su kombinovane cela dužina teškog lanca F1466-26 i cela dužina lakog lanca F1466-5, održavaju specifičnost P03 i aktivnost vezivanja za presepsin. Kako su F1466-26 i F1466-5 antitela koja prepoznaju isto mesto P03 kao mesto epitopa, pokazano je da aktivnost antitela može da se održi čak i kada se vrši supstitucija sekvence između antitela koja imaju istu specifičnost.
[0253] Kao što je prikazano u Primeru 2, bilo koja CDR3 sekvenca teškog lanca F1466- 5 i F1466-26 koja prepoznaje P03 kao epitop je GDF i sastavljena je od relativno kratke sekvence, odnosno tri aminokiseline. Smatra se da je to karakteristika ovog antitela.
[0254] Pored toga, budući da je primećen porast afiniteta u varijanti 5793 prema modifikaciji trećeg od teškog lanca CDR3, pokazano je da treća CDR3 sekvenca teškog lanca može imati uticaj na aktivnost antitela.
9- (6) Procena specifičnosti (2) - reakcija kompetitivne inhibicije peptida
[0255] Prema Primeru 6, izvršeno je ispitivanje reakcije kompetitivne inhibicije peptida sa Р01 do P08 za reakciju između svake varijante i presepsina.
[0256] Test je izveden sa ELISA u kojoj je varijanta imobilisana u čvrstom stanju.
Konkretno, varijanta je imobilisana na IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) od strane Nunc-a, a potom blokirana. Zatim je standardni presepsin (300 pg / ml) dodat u svako ležište u količini od 25 μl po ležištu. Zatim je dodat svaki razblažen peptid (0,01 do 10 pg/ml) u količini od 25 μl. Ostavljeno je da se reakcija odvija na ploči tokom jednog sata, na 25°C. Nakon toga, ploča je isprana pet puta fiziološkim rastvorom koja je sadržavala 0,05% Tween 20. Zatim je u svako ležište dodat rastvor u kojem je razblažen F1106-13-3 F (ab ') 2-HRP u količini od 50 μl po ležištu, i reakcija je ostavljena da se odvija tokom 2 sata na 25°C. Slično, nakon ispiranja ploče pet puta, dodat je rastvor TMB i reakcija je ostavljena da se odvija 30 do 40 min na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, reakcija je prekinuta dodatkom 1 M rastvora sumporne kiseline. Apsorbanca na 450/650 nm je merena pomoću čitača ploča. Kao negativna kontrola korišćen je uzorak bez dodavanja peptida (opisanog kao PBS). Kao pozitivna kontrola korišćen je S68 peptid. Budući da je apsorbanca PBS-a označena sa 100%, izračunat je odnos inhibicije svakog peptida. Kao rezultat, potvrđeno je da sve testirane varijante posebno prepoznaju sekvencu P03 kao što je prikazano u Tabeli 14.
Primer 10: Procena varijante (2)
[0257] Među varijantama dobijenim u Primeru 8, aktivnost vezivanja za presepsin i specifičnost je procenjena za varijantu koja nije procenjena u Primeru 9.
10-(1) Merenje koncentracije antitela pomoću ELISA
[0258] Da bi se odredila koncentracija IgG u supernatantu kulture dobijenom iz primera 8-(4), koncentracija IgG je merena primenom sendvič ELISA. Konkretno, antitelo na zeca (DAKO, Z196) je imobilisano na IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) od strane Nunc-a, a potom blokirano. Korišćenjem prečišćenog zečjeg monoklonskog antitela kao standarda, pripremljen je standardni rastvor od 100 do 1,56 ng/ml u skladu sa razblaživanjem puferom za razblaživanje (0,1 % BSA / D-PBS). Zatim je sakupljeni supernatant kulture razblažen puferom za razblaživanje (0,1% BSA / D-PBS). Razblaženi rastvor supernatanta kulture ili serija razblaženja standarda su dodate u ležišta, i reakcija je ostavljena da se tokom jednog sata odvija na ploči. Nakon toga, ploča je isprana pet puta fiziološkim rastvorom soli koji sadrži 0,05% Tween 20. Zatim je u svako ležište dodat rastvor u kojem je razblažen anti zečji Igs-HRP (DAKO, P399) i reakcija je ostavljena da se odvija 1 sat na sobnoj temperaturi. Slično, nakon ispiranja
ploče pet puta, dodat je rastvor tetrametil benzidina (TMB, BioFix) i reakcija je ostavljena da se odvija 10 minuta na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, reakcija je prekinuta dodatkom 1 M rastvora sumporne kiseline. Apsorbanca na 450/650 nm je merena pomoću čitača ploča (Molecular Devices). Koncentracija antitela u svakom supernatantu kulture merena je korišćenjem standardne krive koja je dobijena serijskim razblaživanjem koncentracije standarda.
10-(2) Procena aktivnosti vezivanja i speciflčnosti za presepsin
[0259] Da bi se procenila aktivnost vezivanja i specifičnost za predepsin varijante, ELISA je izvedena korišćenjem ploče u kojoj je antigen imobilizovan u čvrstom stanju.
[0260] Specifično, BSA, rsCD14ST-Fc, ili P03 peptid-BSA je imobilisan na IMMUNO PLATE (MAKSISORP, C96, 430341) od strane Nunc, a potom blokiran.
[0261] Na osnovu rezultata koncentracije IgG u supernatantu kulture, razblaženje supernatanta sa D-PBS je napravljeno do koncentracije od 500 ng / ml (za uzorak sa niskom koncentracijom antitela, korišćen je originalni supernatant). Svaki razblaženi rastvor supernatanta je dodat u količini od 50 pl po ležištu i reakcija je ostavljena da se odvija na ploči tokom jednog sata. Nakon toga, ploča je isprana pet puta fiziološkim rastvorom soli koji sadrži 0,05% Tween20. Zatim je u svako ležište dodat rastvor u kome je razblažen anti zečji Igs-HRP (DAKO, P448) i reakcija je ostavljena da se odvija tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Slično, nakon ispiranja ploče, dodat je rastvor TMB i reakcija je ostavljena da se odvija 3 do 5 min na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, reakcija je prekinuta dodatkom 1 M rastvora sumporne kiseline. Apsorbanca na 450/650 nm je merena pomoću čitača ploča (Molecular Devices).
[0262] Poređenja radi, evaluacija S68 antitela je takođe izvedena sa procenom aktivnosti vezivanja za presepsin. Aktivnost vezivanja za presepsin prikazana je kao odnos apsorbance u vreme reakcije između svakog antitela i rsCD14ST-Fc, kada je apsorbanca u trenutku reakcije između antitela S68 i sCD14ST-Fc podešena na 1. Zajedno sa modifikovanom sekvencom svake varijante, rezultati su prikazani u tabeli 15 do tabele 20<.>
[0263] Kao rezultat, otkriveno je da se većina antitela vezuje za peptide P03, i na taj način je pokazano da P03 mesto prepoznaje 76% antitela kao epitop.
[0264] Nadalje, otkriveno je da F1466-26 i većina varijanti pokazuju odnos apsorbance koji je veći za oko 4 do 5 puta u odnosu na antitelo S68, i stoga imaju odličnu aktivnost vezivanja za presepsin. U poređenju sa KD vrednostima i odnosom apsorpcije F1466-26 za presepsin, pretpostavlja se da će vrednost KD ovih antitela biti na istom nivou kao i povoljna KD vrednost antitela izmerena u primeru 9.
1
[0265] Jedna poželjna realizacija ovog pronalaska je antitelo koje ima vezujuću aktivnost za presepsin veću od one za antitelo S68. Na primer, u pogledu apsorpcije kao što je opisano u primerima, pretpostavlja se da je poželjno antitelo koje pokazuje apsorpciju veću od one za S68 antitelo, a bolje antitelo koje pokazuje apsorbanciju veću od najmanje 2 puta od one za antitelo S68.
[0266] Antitelo koje pokazuje, kao vezujuću aktivnost za presepsin, apsorbancu 5 puta ili veću od one kod antitela S68 i ima posebno odlično svojstvo vezivanja bilo je 5934, 5935, 5939, 5944, 5808, 5809, 5824, 5979, 5980, 5983, 5984, 5987, 5988, 5860, 5864, i 5863 među dobijenim antitelima su 5979, 5983, 5988 i 5864 koji su pokazali apsorbancu 5,5 puta veću ili veću od one za antitelo S68 i među njima su imali posebno odličnu aktivnost vezivanja za presepsin.
2
�
Primer 11: Priprema monoklonskog antitela korišćenjem postupka ekspozicije na fazima koji koristi sintetički peptid kao antigen
[0267] U vezi sa primerom 1- (1), korišćenjem limfocita koji su prikupljeni od zeca imunizovanog S68 peptid-KLH kao antigena za aplikovanje, monoklonsko antitelo je pripremljeno u skladu sa postupkom ekspozicije na fazima.
11- (1) Uspostavljanje biblioteke imuno F (ab) faga
[0268] Prema metodi koju su opisali CARLOS F. BARBAS III, et. al, Phage Display A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press), ukupna RNK je ekstrahovana iz limfocita dobijenih iz slezine koji su prikupljeni iz primera 1- (1) korišćenjem TRIZOL reagensa (Life Technologies). Zatim je upotrebom SuperScript III First-Strand Synthesis System za RT-PCR (Life Technologies) sintetisana jednolančana cDNK. Iz ove cDNK, upotrebom prajmera specifičnog za gene zečjeg antitela o kome su izvestili BARBAS III, et al., pripremljen je fragment koji sadrži varijabilni region teškog
lanca i fragment koji sadrži varijabilni region lakog lanca. Korišćenjem amplifikovanih fragmenata dobijenog teškog lanca varijabilnog regiona zeca i teškog lanca СШ čoveka kao templat, teški lanac zečje / humanog himernog fragmenta se amplikuje PCR-om. Dalje, korišćenjem amplifikovanih fragmenata lakog lanca varijabilnog regiona zeca (tip kapa ili lambda) i konstantnog regiona ljudskog lakog lanca kao templat, fragment himernog lakog lancazec / čovek je amplifikovan. Korišćenjem ovih fragmenata dobijenih himernog teškog lanca zec/ čovek i himernog lakog lanca zec/ čovek kao templata, konačno je pripremljen himerni fragment Fab zec/ čovek. Zatim, digestijom pCDisplay-4 (Creative Biogene), koji je fagemid za eksprimovanje antitela, sa restrikcijskim enzimima Sacl i Spel, dobijen je fagemid. Slično tome, digestijom hibridnog Fab fragmenta zec / čovek sa Sacl i Spel i ubacivanja fragmenta cDNK u tako pripremljen fragment fagemida, pripremljen je plazmid za ekspresiju biblioteke faga.
11-(2) Dobiianje rastvora fage za ekspoziciju na fazima
[0269] Sledeći uobičajeni postupak, soj E. Coli TGl (Alient Technologies) je transformisan plazmidom koji je pripremljen u 11- (1), i rastvor koji sadrži E. Coli je inokuliran na ploču sa LB medijumom dodat sa ampicilinom. Posle uzgajanja kulture na 37°C, formirane kolonije su sakupljene da bi se pripremila biblioteka E. Coli. Deo biblioteke je uzgojen i, nakon dodavanja ampicilina i glukoze suspenziji E. Coli, uzgajano je uz mućkanje tokom jednog sata na 37 ° C. Nakon toga je transfektovano sa pomoćničkom fagom M13K07 (Life Technologies) i uz mućkanje nastavljeno je sa uzgajanjem još jednan sat. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a nakon uklanjanja rastvora za kulturu, suspendovane su u 10 ml 2 х YT rastvora kulture nakon čega je kultura mućkana na 37 ° C. Sledećeg dana, supernatant kulture je odvojen centrifugiranjem, a 8 ml supernatanta je prebačeno u drugu epruvetu. Nakon dodavanja 2 ml rastvora PEG / NaCl, posle čega sledi mešanje, ostavljena je na ledu tokom jednog sata. Zatim se staloženi fag sakupljen centrifugiranjem i korišćen kao rastvor faga za ekspoziciju na fazima.
11-(3) Odabir ciljanog antitela postupkom afinitetne selekcije
[0270] Iz rastvor faga pripremljenog u 11 - (2), antitelo je odabrano postupkom afinitetne selekcije. Afinitetna selekcija se izvodi prema dve vrste postupaka. Prvi postupak se izvodi po metodi BARBAS et. al. Konkretno, S68-BSA je imobilisan u čvrstom stanju na IMMUNO PLATE (MAXISORP„ C96, 430341) proizvođača Nunc, nakon čega je blokiran. Nakon dodavanja, u količini od 50 μl po ležištu, D-PBS koji sadrži 4% obranog mleka i 0,2% TritonX-100, dodaje se 50 μl f rastvora faga dobijenog u 11- (2). Ostavi se da se reakcija odvija na ploči tokom jednog sata. Zatim se ispere sa D-PBS koji sadrži 0,1% TritonX-100. Zatim je eluiranje izvedeno tokom 10 minuta korišćenjem 100 mM glicin-HCl (pH 2,2), a regenerisani rastvor je neutralisan sa 1 M Tris-HCl (pH 7,4). Eluat i E. Coli TGl soj su pomešani jedan sa drugim i reaguju na 37<0>C. TGl soj je ponovo transfektiran fagom vezanim za antigen S68 peptid. U rastvor kulture dodati su ampicilin i pomoćnički fag M13K07. Posle reagovanja na 37 ° C. E. Coli je sakupljen da bi mu se dodao medijum i kanamicin, i kultivisao preko noći. Iz rastvora za kulturu, supernatant je sakupljen centrifugiranjem, a rastvor faga je pripremljen PEG tretmanom. Ponavljanjem istog postupka tri puta koncentruje se fag koji se specifično vezuje za S68 peptid.
[0271] Kao drugi postupak, afinitetna selekcija se takođe izvodi tri puta koristeći postupak opisan u Primeru 12- (2) da bi se koncentrovao fag specifičan za presepsin.
11- (4) Merenje aktivnosti vezivanja antitela i interpretacija sekvence CDR
[0272] Rastvor kulture TGl iz 11- (3), koji je transfektovan fagom, inokuliran je na LB ploču koja sadrži ampicilin da bi se formirala kolonija. Iz svake kolonije ponovo se priprema rastvor faga i reaktivnost se određuje sa ELISA. Konkretno, svaki od BSA, S68-BSA, P03-BSA i sCD14ST-Fc je lmobilisan na IMMUNO PLATE (MAXlSORP, C96, 430341) proizvođača Nunc, a potom su blokirani. Posle dodavanja D-PBS koji sadrži 4% obranog mleka i 0,2% TritonX -100, u ovo se dodaje sakupljeni rastvor faga. Pusti se da se reakcija odvija na ploči tokom jednog sata. Nakon toga, ploča je isprana pet puta fiziološkim rastvorom soli koji sadrži 0,05% Tween20. Zatim je u svako ležište dodat rastvor u kojem se razblaži monoklonalni konjugat HRP / Anti-M13 (GE Healthcare) i ostavi da se reakcija odvija tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Slično, nakon ispiranja ploče pet puta, dodaje se TMB rastvor i dozvoli se da reakcija traje 10 do 20 min na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, reakcija se prekida dodatkom 1 M rastvora sumporne kiseline. Apsorbanca na 450/650 nm meri se pomoću čitača ploča (ThermoMax, Molecular Devices). Kao rezultat toga, vezivanje je potvrđeno iz više vrsta faga. Iz tih kolonija je izolovan fagemid i određena je sekvenca.
[0273] Prema metodi za ekponiranje faga, dobijeno je antitelo na presepsin koje se specifično vezuje za P03 i presepsin i predstavlja sekvencu različitu od CDR sekvence dobijene metodom hibridoma.
Primer 12: Priprema varijante teškog lanca CDR3 sekvence upotrebom postupka ekspozicije na fazima
[0274] Budući da se očekuje da će CDR3 sekvenca teškog lanca uticati na aktivnost enzima, varijanta teškog lanca CDR3 sekvence pripremljena primenom metode ekspozicije na fazima i procenjena.
12-(1) Priprema varijante modifikovanog VH lanca CDR3 sekvence primenom metode ekspozicije na fazima
[0275] Za pripremu biblioteke slučajnih mutacija VH CDR3, PCR je izvršen korišćenjem plazmida pTK-5956 koji sadrži teški i laki lanac F1466-26 kao templat, par prajmera (pnnk3-2s; 5 'fosforilirani- GGT NNK NNK NNK TGG GGC CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC T-3'(SEQ ID:91), p-nnk3-2a; 5' fosforilirani- GCC ACA AAA ATA AGT GGC CGT GTC CTC GGT TGT CGG ACT G-3'(SEQ ID:92) (N predstavlja bilo koji od G, A, T i C, i K predstavlja G ili T)) i DNK polimerazu otpornu na toplotu (TAKARA BIO INC.). Amplifikovani fragment dobijen od njega je samo- ligaliran korišćenjem DN ligaze. Dobijeni rezultat je transformisan u E. Coli XL1-Blue (Agilent Technologies) i uzgojen na agar ploči koja sadrži LB / Ampicilin / tetraciklin. Sledećeg dana, sakupljene kolonije su sakupljene korišćenjem 2 х YT rastvora kulture. Suspenziji E. Coli dodati su ampicilin, tetraciklin i glukoza i uzgajano je tokom jednog sata na 37°C uz mućkanje. Nakon toga, transfektovano je pomoćničkim fagom М13K07 (Life Technologies) i nastavljeno je uzgajanje uz mućkanje, za jedan sat.
Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a nakon uklanjanja rastvora za kulturu, suspendovane su u 10 ml 2 х YT rastvora kulture, a zatim ponovo uzgajano uz mućkanje na 32 ° C.
Sledećeg dana, supernatant kulture razdvojen je centrifugiranjem, a 8 ml supernatanta je prebačeno u drugu epruvetu. Posle dodavanja 2 ml rastvora PEG / NaCl, posle čega je mešano, čuvan je na ledu tokom jednog sata. Zatim je istaloženi fag sakupljen centrifugiranjem i korišćen kao rastvor faga VH CDR3 biblioteke slučajnih mutacija.
12-(2) Odabir ciljnog antitela postupkom afinitetne selekciie
[0276] Sa bibliotekom pripremljenom u 12- (1), izvršena je afinitetna selekcija radi odabira antitela. Specifično, rastvor (2 ml) faga dobijen iz 12- (1) i 6 μg sCD14ST-Fc reagovalo je na 37 ° C. Dva sata kasnije, dodato je 200 μl smole proteina A (Prosep-vA, Merck Millipore), a zatim sledi reakcija u trajanju od 20 minuta. Posle ispiranja pet puta sa PBS koji sadrži 0,05% Tween20, smola je dodata sa eluentom (Tris-HCl, glicin (pH 2,2)) i održavana 8 min. Zatim je sakupljen eluirani rastvor faga i rastvor je neutralizovan. Sakupljeni rastvor i rastvor E. Coli kulture XL-1 Blue su pomešani jedan sa dmgim i reagovali na 37°C. Sat vremena kasnije, dodati su L-glutamin, ampicilin i pomoćnički fag М13K07 (Invitrogen) i reakcija je ostavljena da se odvija na 37 ° C. Opet, sat vremena kasnije, medijum je zamenjen sa 2 х YT medijum praćen uzgajanjem preko noći. Tako su sakupljene fage koje su specifično vezane za rsCD14ST-Fc. Ponavljanjem istog postupka tri puta, koncentrovano je ciljno antitelo.
12- (3) Priprema faga која sadrži presepsno-specifičnu sekvencu i određivanje CDR sekvence
[0277] XL-1 Blue je ponovo transfektiran rastvorom faga koji je konačno dobijen u 12- (2), a supernatant kulture inokuliran je u mediju 2 х YT za pripremu kolonija. Dobijena kolonija ponovo je gajena sa XL-1 Blue i dodavanjem pomoćničkog faga pripremljen je rastvor faga koji sadrži jedan fag. Zatim, korišćenjem dobijenog rastvora faga, reaktivnost je potvrđena na osnovu ELISA. Konkretno, sCD14ST-Fc je imobilizovan na ploči, odnosno IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) od kompanije Nunc, a potom je blokiran. Rastvor faga je razblažen (x 2) korišćenjem D-PBS koji sadrži 4% obranog mleka i 0,2% TritonX -100 i reakcija je ostavljena da se odvija na ploči tokom jednog sata. Nakon toga, ploča je isprana pet puta fiziološkim rastvorom soli koja je sadržavala 0,05% Tween 20. Zatim je dodat rastvor u kojem je razblažen HRP / Anti- M13 monoklonski konjugat (GE Healthcare) u količini od 50 μl po ležištu i reakcija je ostavljena da se odvija tokom sata na sobnoj temperaturi. Slično, nakon ispiranja ploče pet puta, dodat je rastvor TMB i reakcija je ostavljena da se odvija na sobnoj temperaturi. Kada je reakcija završena, reakcija je prekinuta dodatkom 1 M rastvora sumporne kiseline. Apsorbancija na 450/650 nm je merena pomoću čitača ploča (ТhermoМах, Molecular Devices). Zatim je E. Coli transfektovana sa rastvorom faga sa potvrđenom aktivnošću vezivanja, a nakon sakupljanja plazmida prema uobičajenoj metodi, određena je sekvenca gena.
12- (4) Dobijanje IgG antitela
[0278] Fagemid je sakupljen od dobijenih faga kandidata i pripremljen je fragment koji kodira varijabilni region teškog lanca. Prema metodi opisanoj u Primeru 8, pripremljen je plazmid za pripremu varijante teškog lanca. Zatim je korišćen za transfekciju ćelija COS-1, zajedno sa plazmidom (pTK-5608) za prolaznu ekspresiju lakog lanca koji sadrži laki lanca F1466-26 pune dužine. Ćelije COS-1 su kultivisane na 37 ° C. Sedamdeset i dva sata kasnije, sakupljen je supernatant kulture.
12- (5) Procena varijante teškog lanca CDR3 sekvence
[0279] Dobijena varijanta je podvrgnuta istom testu kao u Primeru 10- (2), kako bi se procenila aktivnost vezivanja za presepsina (rsCD14ST-Fc) i specifičnost P03. Rezultati su prikazani u Tabeli 21, zajedno sa CDR sekvencom modifikovanog teškog lanca CDR3.
[0280] Kao rezultat, varijanta 6027 u kojoj su supstituisane 3 aminokiseline teškog lanca CDR3 pokazala je nešto nižu reaktivnost presepsina u poređenju s drugim varijantama. Međutim, u poređenju sa antitelom S68, pokazalo je gotovo istu reaktivnost. Varijante 6026, 6028 i 6029 su pokazale odličnu reaktivnost za presepsin iako su supstituisane dve aminokiseline. Na osnovu ovih rezultata pokazano je da se aktivnost antitela može održati čak i kada je teški lanac CDR3 sastavljen od tri aminokiseline i supstituisane su njegove dve aminokiseline. Varijanta 6028 pokazala je posebno odličnu aktivnost vezivanja za presepsin.
Primer 13: Test interferencije triglicerida (TG)
[0281] Prema Primeru 5 i Primeru 6, pokazano je da merenje presepsina upotrebom antitela koje P04-05 prepoznaje kao epitop, lako ometeno sa TG u uzorku, ali merenje presepsina upotrebom antitela koje prepoznaje P03 kao epitop, teško ometeno sa TG.
13-(1) Test interferencije TG (1) upotrebom krvnog seruma normalnog čoveka
[0282] Za dalju potvrdu utvrđen je uticaj TG na normalan uzorak za testiranje. Test interferencije TG je izveden za F1466-26 (specifičnost: P03), F1466-5 (P03) i F1466-19 (P04-05) korišćenjem krvnog seruma normalnog čoveka.
[0283] Testiranom uzorku iz normalne krvi čoveka (8 uzoraka) (EDTA krvna plazma, TENECEE BLOOD SERVICIES), dodat je TG do krajnje koncentracije od 10 mg/ml i upoređena je vrednost merenja presepsina pre i posle dodavanja. S obzirom na koncentraciju TG u tom trenutku, TG prvobitno uključen u testni uzorak nije uzet u obzir. Procena je izvršena upotrebom ploče u kojoj je svako antitelo imobilisano u čvrstom stanju i sendvič ELISA sistemom opisanim u Primeru 9- (3). Rezultati su prikazani na slici 1.
[0284] Kao rezultat toga, antitela F1466-26 i F1466-5 koja prepoznaju P03 kao epitop pokazuju skoro nikakvu promenu vrednosti merenja pre i posle dodavanja TG.
Međutim, na vrednost merenja iz antitela F1466-19 koja prepoznaje P04-05 kao epitop, značajno je uticalo dodavanje TG. Očekuje se da, kao i kod F1466-19, merenje upotrebom antitela kod kojih na mernu vrednost pesepsina značajno utiče TG prisutan u test uzorku pokazuje veliku mernu vrednost za zdravu osobu koja obično pokazuje nisku vrednost. U tom je slučaju teško imati razliku između normalne i abnormalne vrednosti. Dakle, može se reći da takvo antitelo nije pogodno za merenje presepsina u test uzorku. U međuvremenu, potvrđeno je da na antitelo koje prepoznaje P03 kao epitop ozbiljno utiče TG prisutan u test uzorku, pa je to antitelo pogodno za merenje presepsina prisutnog u test uzorku.
[0285] Pored toga, test koji koristi ovaj humani serum normalne osobe podržava da je unakrsna reakcija sa sCD14 velike molekulske mase zanemarljiva u sistemu ispitivanja koristeći antitelo koje prepoznaje P03 kao epitop.
[0286] U humanom serumu normalnog čoveka, presepsin je nekoliko stotina pg / mL, dok je sCD14 velike molekulske težine prisutan oko 5,6 do 11,2 μg / ml (WO 2005/108429, primer 12), i ako antitelo reaguje sa sCD14 velike molekulske težine, nemoguće je izmeriti manju količinu presepsina.
[0287] Prema predstavljenom primeru, potvrđeno je da, u sistemu ispitivanja koji koristi antitelo koje prepoznaje P03 kao epitop, ne dolazi do unakrsne reakcija sa sCD14 velike molekulske težine, pa je moguće merenje presepsina u manjoj količini od oko nekoliko stotina pg / ml.
13-(2) Test (2) interferencije TG upotrebom varijante
[0288] TG interferencijski test je izveden na isti način kao u primeru 5 za novo dobijene varijante i utvrđen je uticaj TG prisutan u test uzorku. Varijanta je korišćena posle prečišćavanja.
[0289] Specifično, varijanta je imobilisana na IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) proizvođača Nunc, a potom je blokirana. Razblaživanje standarda presepsina izvršeno je upotrebom pufera za razređivanje za pripremu serija koncentracija presepsina (15,6 do 500 pg/ml). U tri vrste humanog uzorka za testiranje dodat je triglicerid (Intralipid, proizvođača Fresenius Kabi Japan), čija je konačna koncentracija 6,7, 13,3 ili 20 mg/ml. Sto se tiče humanih uzorka za testiranje, korišćen je jedan test uzorak seruma u krvi dobijen od pacijenta sa sepsom i dva test uzorka seruma dobijena od normalne osobe, u koji su dodatno dodate određene količine presepsina. Dalje, TG koji je prvobitno sadržan u uzorku nije razmatran za koncentraciju TG. Test uzorak je razblažen (х 20) korišćenjem pufera za razblaživanje, i uzorak u koji nije dodat TG ili u koji je dodat TG pri svakoj koncentraciji ili seriji razblaženja standarda su dodati u svako ležište. Merenje je izvršeno primenom sendvič ELISA kao u primeru 9- (3). Odnos (%) ispitnog uzorka koji pokazuje stepen disocijacije od ± 20% ili manji za merenje presepsina kada je koncentracija TG 20 mg/mL u test uzorku prikazan je u Tabeli 22
1
[0290] Kао rezultat toga, potvrđeno je da trigliceridi teško utiču na antitelo koje prepoznaje P03 kao epitop.
Primer 14: Lista modifikovanih proizvoda sa poželjnim osobinama
[0291] CDR sekvenca antitela sa poželjnim osobinama, koja su dobijena iz primera 8 i 12 predmetnog pronalaska, prikazana je na slici 2 do slike 2-2 (SEQ ID NO:93 do SEQ ID NO: 156). Ukupan broj antitela pripremljenih u primerima 8 i 12 bio je 109, a broj antitela kojima se daje prednost bio je 65.
[0292] Antitela koja imaju afinitet za presepsin (KD vrednost) manju od 10<-8>M ocenjena su kao o i antitela koja imaju afinitet manji od 10<-9>M ocenjena su kao ʘ. Antitela koja imaju KD vrednost manju od 10<-7>M ali koja pokazuju afinitet gotovo ekvivalentan afinitetu za S68 antitela presepsina ocenjena su sa Д. Prema proceni vrednosti KD, antitela za koja je utvrđeno da imaju naročito odličnu aktivnost vezivanja za presepsin bile su varijante 5793 i 5810.
[0293] Aktivnost vezivanja presepsina procenjena je odnosom apsorbance dobijene reakcijom između svakog antitela i rsCD14ST-Fc u odnosu na apsorbancu dobijenu u reakciji između antitela S68 i rsCD14ST-Fc, kada je apsorbanca dobijena u reakciji između S68 antitela a rsCD14ST-Fc je podešena na 1. Antitelo sa odnosom apsorbanci od 4 ili više je ocenjeno kao o, a antitelo sa odnosom apsorbanci od 5,5 ili više je ocenjeno kao ʘ. Prema proceni zasnovanoj na poređenju apsorbance, pronađeno je da antitelo ima posebno odličnu aktivnost vezivanja za presepsin je varijanta 5864, 5979, 5983, 5988 i 6028.
2
�
�
�
�
�
�
�
�
11
��
�
��
�
�
�
�
�
11
11
11

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Antitelo na presepsin, ili njegov fragment koji vezuje antigen, naznačen time, što antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži:
(a) VH koji sadrži VH CDRI koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:7, VH CDR2 koga čim aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:97, i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:9, i VL koji sadrži VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:22, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:23, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca Sequence NO:24;
(b) VH koji sadrži VH CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:7, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:8 i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:94, i VL koji sadrži VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:22, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:23, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca Sequence NO:24;
(c) VH koji sadrži VH CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:4, VH CDR2 koga čini ammokiselmska sekvenca SEQ ID NO:5 i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:6, i VL koji sadrži VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:19, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:20, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca Sequence NO:21;
(d) VH koji sadrži VH CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:7, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:8 i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:9, i VL koji sadrži VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:22, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:23, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca Sequence NO:24; ili
(e) VH koji sadrži VH CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:10, VH CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:11 i VH CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:12, i VL koji sadrži VL CDRl koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:25, VL CDR2 koga čini aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:26, i VL CDR3 koga čini aminokiselinska sekvenca Sequence NO:27.
2. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, prema zahtevu 1, naznačen time, što se antitelo ili fragment vezuju za presepsin sa afinitetom manjim od 10<- 8>M (KD).
3. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što se vezivanje antitela i presepsina kompetitivno inhibira za 50% ili više u reakcionom sistemu u kome je aminokiselinska sekvenca koju čini SEQ ID NO:1 izložena kompetitivnoj reakciji (apsorbanciji), tako da je vezivanje između antitela ili fragmenta i presepsina, inhibirano.
4. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva od 1 do 3, naznačen time, što je kompetitivna inhibicija vezivanja antitela i presepsina nekom aminokiselinskom sekvencom manja od 20% u reakcionom sistemu u kome je aminokiselinska sekvenca izložena kompetitivnoj reakciji (apsorbanciji), tako da je vezivanje antitela ili fragmenta i presepsina inhibirano i gde aminokiselinsku sekvencu čini sekvenca u kojoj je asparaginska kiselina na položaju 8 u SEQ ID NO:1 zamenjena alaninom.
5. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva od 1 to 4, naznačen time, što
(i) se antitelo ne vezuje specifično za solubilni CD14 velike molekulske mase; i/ili
(ii) odnos uzorka koji ispoljava stepen razdvajanja vrednosti merenja presepsina ±20% ili manji, kada je koncentracija triglicerida (TG) u uzorku 20 mg/mL, ukazuje na 50% ili više u TG interferencionoj probi na mnogo uzoraka urađeno korišćenjem navedenog antitela; i/ili
(iii) vrednost merenja presepsina u uzorku, dobijena upotrebom navedenog antitela ima koeficijent korelacije 0,9, ili veći, sa vrednošću merenja dobijenom upotrebom S68 u uzorku; i/ili
(iv) fragment antitela koje vezuje antigen je fragment antitela koje vezuje antigen odabran iz grupe koju čine Fab, Fab', F (ab')2, jednolančano antitelo (scFv), dimerizovan V region (dijatelo), V region stabilizovan disulfidnim vezama (dsFv), sc (Fv)2, polipeptid koji ima CDR, polipeptid koji ima varijabilni region teškog lanca i polipeptid koji ima varijabilni region lakog lanca.
11
6. Polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov fragment naznačen time, što vezuje antigen prema bilo kom od zahteva od 1 do 5.
7. Rekombinantni vektor naznačen time, što ima polinukleotid prema zahtevu 6.
8. Transformisani soj naznačen time, što je dobijen uvođenjem rekombinantnog vektora prema zahtevu 7, u ćeliju-domaćina.
9. Transformisani soj prema zahtevu 8, naznačen time, što je ćelija- domaćin CHO ćelija
10. Postupak za dobijanje antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, naznačen time, što uključuje stupanj kultivisanja soja, transformisanog prema zahtevu 8 ili 9.
11. Komplet za merenje presepsina, naznačen time, što ima bar antitelo ili fragment antitela koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva od 1 do 5.
12. Komplet za detekciju sepse ili pomoć u detekciji/dijagnozi sepse, naznačen time, što ima bar antitelo ili fragment antitela koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva od 1 do 5
13. Postupak za merenje presepsina, naznačen time, što postupak uključuje stupanj kontakta bar sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva od 1 do 5 i uzorka koji ima presepsin.
14. Postupak za detekciju sepse ili pomoć u detekciji/dijagnozi sepse, naznačen time, što ima bar niže opisane stupnjeve:
1) stupanj merenja koncentracije presepsina u uzorku subjekta koji koristi antitelo na presepsin ili fragment antitela koji vezuje antigen, prema bilo kom od zahteva od 1 do 5, i
2) stupanj u kome se određuje da li je dobijena koncentracija presepsina u 1) visoka vrednost u poređenju sa graničnom vrednošću, ili nije.
11
15. Postupak za skrinovanje antitela na presepsin ili fragmenta koji vezuje antigen, naznačen time, što obuhvata bar niže opisane stupnjeve:
1) stupanj dobijanja kandidata za antitelo na presepsin ili kandidata za fragment antitela koji vezuje antigen, i
2) stupanj odbira antitela ili fragmenta antitela koji vezuje antigen, u kome je vezivanje između antitela i presepsina kompetitivno inhibirano 50% ili više u reakcionom sistemu u kome je aminokiselinska sekvenca koju čini SEQ ID NO:1 izložena kompetitivnoj reakciji, tako da je vezivanje između datog antitela i presepsina inhibirano.
11
RS20191464A 2014-02-26 2015-02-25 Novo antitelo na presepsin RS59549B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461944674P 2014-02-26 2014-02-26
EP15755779.4A EP3112463B1 (en) 2014-02-26 2015-02-25 Novel anti-presepsin antibody
PCT/JP2015/055488 WO2015129774A1 (ja) 2014-02-26 2015-02-25 新規抗プレセプシン抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59549B1 true RS59549B1 (sr) 2019-12-31

Family

ID=53881586

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210737A RS62033B1 (sr) 2014-02-26 2015-02-25 Novo antitelo na presepsin
RS20191464A RS59549B1 (sr) 2014-02-26 2015-02-25 Novo antitelo na presepsin

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210737A RS62033B1 (sr) 2014-02-26 2015-02-25 Novo antitelo na presepsin

Country Status (18)

Country Link
US (3) US9951142B2 (sr)
EP (2) EP3628731B1 (sr)
JP (4) JP6567496B2 (sr)
KR (1) KR102360851B1 (sr)
CN (1) CN106255751B (sr)
AU (1) AU2015223840B2 (sr)
BR (1) BR112016019739B1 (sr)
CA (1) CA2938956C (sr)
ES (2) ES2753400T3 (sr)
LT (1) LT3628731T (sr)
MX (1) MX375897B (sr)
NZ (1) NZ722440A (sr)
PH (1) PH12016501579A1 (sr)
PL (2) PL3112463T3 (sr)
RS (2) RS62033B1 (sr)
RU (1) RU2710439C2 (sr)
SI (1) SI3628731T1 (sr)
WO (1) WO2015129774A1 (sr)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6567496B2 (ja) 2014-02-26 2019-08-28 持田製薬株式会社 新規抗プレセプシン抗体
WO2017033281A1 (ja) * 2015-08-25 2017-03-02 持田製薬株式会社 特異的に精製された抗プレセプシン抗体
CN108680634B (zh) * 2018-08-28 2023-09-08 长沙理工大学 一种基于谷胱甘肽修饰栅极金电极的l-胱氨酸的检测方法及传感器
EP4059517A4 (en) * 2019-11-19 2023-04-05 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd NEW SOLUBLE CD14 ANTI-SUBTYPE ANTIBODY AND ITS USE
WO2021253335A1 (zh) * 2020-06-18 2021-12-23 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 抗可溶性cd14亚型抗体、试剂盒及其应用
CN113555118B (zh) * 2021-07-26 2023-03-31 内蒙古自治区人民医院 一种病症程度的预测方法、装置、电子设备及存储介质

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7608684B2 (en) * 2002-11-12 2009-10-27 Mochida Pharmaceuticals Co., Ltd. Soluble CD14 antigen
EP1571160B1 (en) * 2002-11-12 2010-03-10 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Kit for assaying human low-molecular weight cd14 and antibody
JP2005106694A (ja) * 2003-09-30 2005-04-21 Mochida Pharmaceut Co Ltd 敗血症早期検出及び重篤度評価
ES2406266T3 (es) * 2004-05-11 2013-06-06 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Antígeno CD14 soluble novedoso
JP4891125B2 (ja) 2005-06-03 2012-03-07 持田製薬株式会社 抗ｃｄ１４抗体融合蛋白質
US7429487B2 (en) 2005-07-05 2008-09-30 Epitomics, Inc. Fusion partner for production of monoclonal rabbit antibodies
JP5435587B2 (ja) 2008-05-23 2014-03-05 持田製薬株式会社 食細胞の機能評価方法
KR101904497B1 (ko) * 2010-01-29 2018-10-04 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 인간 ｓＣＤ１４―ＳＴ의 분석 방법
US20130337476A1 (en) * 2012-06-13 2013-12-19 Min-Yi Lee URINARY sCD14 AS A BIOMARKER FOR CORONARY ARTERY DISEASE
JP6567496B2 (ja) * 2014-02-26 2019-08-28 持田製薬株式会社 新規抗プレセプシン抗体
WO2017033281A1 (ja) 2015-08-25 2017-03-02 持田製薬株式会社 特異的に精製された抗プレセプシン抗体

Also Published As

Publication number Publication date
JP6567496B2 (ja) 2019-08-28
WO2015129774A1 (ja) 2015-09-03
CN106255751B (zh) 2020-04-10
PL3112463T3 (pl) 2020-03-31
PL3628731T3 (pl) 2021-11-15
RS62033B1 (sr) 2021-07-30
US9951142B2 (en) 2018-04-24
KR20170002367A (ko) 2017-01-06
RU2710439C2 (ru) 2019-12-26
LT3628731T (lt) 2021-08-10
JP6759429B2 (ja) 2020-09-23
AU2015223840A2 (en) 2016-09-15
CA2938956C (en) 2022-04-26
CA2938956A1 (en) 2015-09-03
US10676532B2 (en) 2020-06-09
BR112016019739A2 (pt) 2017-10-24
NZ722440A (en) 2023-04-28
EP3112463A4 (en) 2017-12-13
EP3112463A1 (en) 2017-01-04
JP2019205458A (ja) 2019-12-05
JP2023025047A (ja) 2023-02-21
CN106255751A (zh) 2016-12-21
JPWO2015129774A1 (ja) 2017-03-30
PH12016501579B1 (en) 2016-10-03
US11685788B2 (en) 2023-06-27
RU2016137807A3 (sr) 2018-09-06
RU2016137807A (ru) 2018-04-02
AU2015223840B2 (en) 2020-08-13
ES2880225T3 (es) 2021-11-24
PH12016501579A1 (en) 2016-10-03
JP2021003115A (ja) 2021-01-14
US20210107990A1 (en) 2021-04-15
AU2015223840A1 (en) 2016-09-08
EP3112463B1 (en) 2019-09-04
ES2753400T3 (es) 2020-04-08
EP3628731A1 (en) 2020-04-01
MX2016010995A (es) 2017-02-27
KR102360851B1 (ko) 2022-02-09
EP3628731B1 (en) 2021-04-21
US20150239982A1 (en) 2015-08-27
SI3628731T1 (sl) 2021-08-31
MX375897B (es) 2025-03-07
US20180201688A1 (en) 2018-07-19
BR112016019739B1 (pt) 2023-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11685788B2 (en) Anti-presepsin antibody
JPWO2004044005A1 (ja) ヒト低分子量ｃｄ１４測定キットおよび抗体
WO2020204977A1 (en) Anti-nmda receptor antibodies and methods of use
CN116925230A (zh) 一种抗人pla2r的抗体及其抗原结合片段及其应用
KR20210068408A (ko) 가용성 bcma에 대한 항체
MX2011004923A (es) Anticuerpos para peptidos de igf-1/e humanos modificados.
EP4444424A1 (en) Camelid antibodies for use in therapy and diagnosis
KR20230018478A (ko) 인간 면역글로불린 g에 대한 토끼 항체
CN118725112B (zh) 抗人sCD14-ST蛋白的单克隆抗体及其应用
CN119874904B (zh) 抗NT-proBNP抗体及其用途
RU2859564C2 (ru) Антитела кролика к иммуноглобулинам g человека
CN121319191B (zh) Pla2r的ctld7结构域特异性抗体及其应用
CN118255883A (zh) 针对人视锥蛋白样蛋白1的单克隆抗体、抗体对和试剂盒及其应用
CN116003592A (zh) 针对人血小板生成素的抗体
JP2018080167A (ja) 肝性リパーゼに対する抗体及びその利用