RS59628B1 - Autonomni postupak za proizvodnju hidrolizata biomase sa smanjenim sadržajem soli - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak je usmeren na autonomni postupak za proizvodnju hidrolizata biomase sa smanjenim sadržajem soli. Hidrolizat koji se dobija nakon inventivnog postupka i upotreba hidrolizata kao medijuma za fermentaciju su takođe opisani.

[0002] Biomasa koja potiče od ostataka iz poljoprivredne proizvodnje, kao što su bagasa šećerne trske, pšenična slama, ječmena slama, i drugi materijal koji sadrže saharide ili polisaharide i proteine, dragoceni su izvori ne samo prerađenih saharida, poput monomernih ili dimernih šećera, već i drugih komponenti poput aminokiselina, proteina i minerala.

[0003] U stanju tehnike poznati su različiti postupci za izdvajanje komponenata, posebno šećera iz šećerne repe i šećerne trske ili žitarica. Rastvori nastali iz ovih takozvanih supstrata „prve generacije“ su skoro čisti rastvori šećera i mogu se koristiti u standardnim npr. fermentacionim postupcima bez dalje obrade i bez većeg uticaja na efikasnost postupka. Međutim, nedostatak upotrebe ovih supstanci je taj što su šećerna repa, šećerna trska i žitarice vredni prehrambeni proizvodi i njihova upotreba u postupcima kao što je proizvodnja biogoriva i hemijskih proizvoda je veoma diskutabilna.

[0004] Nasuprot tome, rastvori nastali hidrolizom supstrata „druge generacije“ na bazi ostataka poreklom iz poljoprivredne proizvodnje, kao što su bagasa šećerne trske, pšenična slama ili ječmena slama, predstavljaju složene mešavine proteina, minerala i polimernih šećera. Takođe sadrže organske kiseline, obojene čestice, proizvode razgradnje lignina i drugih nečistoća. Zbog toga su ovi hidrolizati druge generacije neprikladni za dalju obradu, kao što je na primer priprema poli-mlečne kiseline iz mlečne kiseline usled inhibicije fermentacije i neželjenog bojenja. Nedostatak postojećih postupaka koji uključuju ovu vrstu hidrolizata takođe je pojava jakog zaprljanja u crevima, cevima i na membranama, što vodi učestalom čišćenju i zameni procesnih jedinica.

[0005] Dalje, ovi supstrati druge generacije obično sadrže velike količine lignina, a polimerni šećeri su visoko polimerizovani, što ove supstrate čini nepogodnim i teškim za obradu. Stoga ovi supstrati zahtevaju korake prethodne obrade, kako bi bili dostupni za enzimsku hidrolizu. U stanju tehnike, obično se koriste neorganske kiseline poput sumporne kiseline što povećava troškove postupka, jer ne samo da je neophodno nabaviti kiselinu, već i prečišćavanje otpadnih voda postaje skuplje.

[0006] Huyskens C et al.: Membrane capacitive deionization for biomass hydrolysate desalination, SEPARATION AND PURIFICATION TECHNOLOGY (2013), 118:33-39, Huyskens C et al: Cost evaluation of largescale membrane capacitive deionization for biomass hydrolysate desalination, SEPARATION AND PURIFICATION TECHNOLOGY (2015), 146:294-300, WO 2006/007691, WO 2011/027360, Nilvebrant N-O et al.: Detoxification of lignocellulose hydrolysates with ion-exchange resins, APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY (2001), 91-93:35-49 i Mussatto S I et al.: Alternatives for detoxification of diluted-acid lignocellulosic hydrolyzates for use in fermentative processes: a review, BIORESOURCE TECHNOLOGY, ELSEVIER BV, GB (2004), 93:1-10 opisuju hidrolizate koji su odsoljeni elektrodijalizom, ili membranskom kapacitivnom dejonizacijom ili jonoizmenjivačkom hromatografijom.

[0007] Što se tiče proizvodnje hidrolizata u industrijskim razmerama, ključna prepreka nije samo proizvodnja krajnjeg proizvoda visokog kvaliteta, već i troškovi. Stoga je efikasan postupak sa niskom potrošnjom energije i materijala i malim uticajem na životnu sredinu, kao i visokim kapacitetom prerade biomase od velikog značaja.

[0008] Zbog toga je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi postupak koji ispunjava ove ključne kriterijume.

[0009] Sada su pronalazači predmetnog pronalaska iznenađujuće našli da ovaj cilj može da se ostvari postupkom koji obuhvata korake

a) obezbeđivanja biomase;

b) prethodne obrade biomase kiselinom;

c) hidrolize biomase za dobijanje hidrolizata biomase;

d) razdvajanja čvrste supstance od tečnosti hidrolizata biomase, da bi se dobila čvrsta faza i tečna faza;

e) dejonizacije tečne faze elektrodijalizom upotrebom najmanje jedne bipolarne membrane;

f) izdvajanja kisele i/ili bazne frakcije iz dejonizovane tečne faze;

g) dodavanja bar dela izdvojene kisele frakcije koraku b)

pri čemu se koraci a) do g) ponavljaju bar jednom.

[0010] Ovaj postupak neće obezbediti samo odsoljeni hidrolizat visokog kvaliteta pogodan za rafinirane primene, već će garantovati i efikasnu razgradnju biomase uz mala materijalna ulaganja koja vode ekonomski vrlo izvodljivom postupku.

[0011] Pojam "biomasa", kako se koristi u ovom pronalasku, odnosi se na bilo koju vrstu biomase koja je stručnjaku u ovoj oblasti poznata kao pogodna za postupak. Posebno je poželjna biomasa biljnog porekla. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, početni sadržaj suve materije biomase odabran je od 10 do 100 tež.%, poželjnije od 35 do 95 tež.% i posebno poželjno od 40 do 80 tež.%. Pojam "suva materija" (d.m.) odnosi se na odnos mase prema biomasi utvrđen posle uklanjanja vode i drugih isparljivih jedinjenja iz svežeg tkiva pomoću IR-vage. Prema tome, posebno je poželjno odabrati biomasu kod koje suva materija sadrži najmanje 25 tež.% saharida kao što su monomerni šećeri, dimerni šećeri i oligosaharidi i/ili polisaharidi, poželjnije najmanje 40 tež.%, posebno poželjno najmanje 60 tež.%, dalje poželjno najmanje 80 tež.% saharida kao što su monomerni šećeri, dimerni šećeri i oligosaharidi i/ili polisaharidi. Dalje, bilo kakve mešavine pogodnih biomasa uključene su u pojam "biomasa".

[0012] Posebno poželjna biomasa je "lignocelulozna biomasa".

[0013] Pojam "lignocelulozna biomasa" odnosi se na rezidualne, otpadne i/ili sporedne proizvode šumarstva i poljoprivrede, prerade hrane i industrije papira i komunalni otpad. Naročito, pojam "lignocelulozna biomasa", kako se koristi u ovom pronalasku, uključuje slamu i/ili plevu žitarica (kao što su pšenica, raž, ječam, zob), kukuruznu slamu, stabljike i/ili klipove, trave kao što su Sericea lespedeza, proso (Panicum virgatum), slonovska trava (Miscanthus, kineska trska), sudanska trava (Sorghum sudananse, Sorghum drummondi), Arundo donax, koru, drvo, ostatke od drveta, drvnu strugotinu i/ili opiljke, voćnu pulpu, pirinčanu slamu, lišće banane, prazne grozdove voća i ostatke agave.

[0014] Ostala biomasa koja je pogodna za postupak je stajsko đubrivo iz štala, biljni materijali, talog kafe i otpaci iz mlinova za dobijanje ulja kao što je presovani kolač uljane repice i otpad iz mlinova, materijal za proizvodnju papira i otpadne vode iz postrojenja za proizvodnju papira, otpadni papir, ostaci povrća i voća.

[0015] U okviru poželjnog primera izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, biomasa je odabrana od celuloze, hemiceluloze i/ili biomase koja sadrži lignin.

[0016] U okviru posebno poželjnog primera izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku biomasa je odabrana od pulpe šećerne repe, bagase šećerne trske, slame šećerne trske, pšenične slame, drveta i njihovih mešavina.

[0017] U okviru još jednog posebno poželjnog primera izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku biomasa je lignocelulozna biomasa od poljoprivrednih ostataka kao što je pšenična slama, ječmena slama, sojina slama, bagasa šećerne trske, listovi i stabljike šećerne trske, slama šećerne trske, kukuruzna slama, ječmena slama, stabljike kukuruza i njihove mešavine.

[0018] Izraz "prethodna obrada kiselinom", kako se koristi u ovom pronalasku, treba razumeti tako da predstavlja bilo kakvu obradu poznatu stručnjaku u ovoj oblasti koja uključuje upotrebu kiseline ili kombinacije kiselina. U okviru obima ovog pronalaska je dodavanje bilo koje vrste kiseline kao što je sumporna kiselina, sirćetna kiselina, mravlja kiselina, mlečna kiselina, fosforna kiselina, azotna kiselina, limunska kiselina, vinska kiselina, jantarna kiselina, hlorovodonik ili njihove mešavine, međutim, poželjno je dodavati samo kiseline stvorene tokom dejonizacije prema koraku e) postupka. Posebnu pogodnost postupka prema predmetnom pronalasku predstavlja to da nikakva spoljna kiselina/kiseline ne mora da se dodaje postupku, postupak je autonoman kada je u pitanju upotreba kiselina. U slučaju kontinuiranog postupka – ponavljanja koraka a) do g) najmanje jednom – nije potrebno dodavanje nikakve spoljne kiseline u prvom koraku b) prethodne obrade, budući da su organske kiseline koje su već prisutne u biomasi dovoljne za početak postupka. Prema tome, izraz "prethodna obrada kiselinom", kako se koristi u ovom pronalasku, takođe obuhvata obradu upotrebom kiseline/kiselina koje su već prisutne u biomasi.

[0019] Prethodna obrada kiselinom se poželjno izvodi u kombinaciji sa mehaničkom obradom. Takođe je moguće da je biomasa obezbeđena u koraku a) postupka već bila podvrgnuta mehaničkoj obradi.

[0020] Izraz "mehanička obrada" odnosi se na bilo koju mehaničku obradu koja vodi usitnjavanju biomase. Mehaničko usitnjavanje je poželjno odabrano iz grupe koja se sastoji od mehaničke obrade, brušenja, seckanja, drobljenja, rezanja, zračenja, mlevenja kao što je suvo mlevenje, vlažno mlevenje i mlevenje u mlinu sa vibrirajućim kuglama, i kombinacija navedenog.

[0021] Posebno poželjna mehanička obrada prema predmetnom pronalasku je eksplozija pare. "Eksplozija pare" prema predmetnom pronalasku poželjno obuhvata hidrotermalnu obradu pod pritiskom na temperaturi od 60 do 350 °C, poželjno od 80 do 300 °C, posebno poželjno od 100 do 250 °C i najpoželjnije od 110 do 220 °C materijala biomase. U poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska pritisak je poželjno odabran od 1 do 100 bara, poželjno od 2 do 50 bara, takođe poželjno od 3 do 25 bara i najpoželjnije od 5 do 15 bara. Reakciona vremena tokom eksplozije pare treba da se odaberu od 10s do 2h, poželjno od 1 minuta do 1.5 časa, i najpoželjnije od 5 minuta do 1 časa da bi se obezbedila efikasna transformacija komponenata biomase pri pripremi za naredne korake hidrolize. U poželjnom primeru izvođenja, postupku eksplozije pare dodaje se kiselina. Količina dodate kiseline je poželjno u opsegu od 0.07 do 6.5 molova H+ jona, poželjnije 0.13 do 3.3 mola H<+>jona, najpoželjnije 0.33 do 1.3 mola H<+>jona po kg suve materije biomase.

[0022] Pojam "hidroliza biomase", kako se koristi u ovom pronalasku, treba razumeti tako da obuhvata bilo koju vrstu hidrolize koja je stručnjaku u ovoj oblasti poznata kao pogodna za inventivni postupak. Prema posebno poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, hidroliza biomase sprovodi se enzimskom hidrolizom.

[0023] Prema poželjnom primeru izvođenja postupka predmetnog pronalaska, enzimska hidroliza se sprovodi dovođenjem u kontakt prethodno obrađene biomase sa enzimskom kompozicijom koja sadrži najmanje jedan enzim odabran iz klase hidrolaza.

[0024] Pojam "dovođenje u kontakt" (ili "doveden u kontakt") obuhvata bilo koji tip dovođenja u kontakt biomase sa enzimskom kompozicijom, koji je stručnjaku u ovoj oblasti poznat kao pogodan za inventivni postupak. U poželjnom primeru izvođenja, "dovođenje u kontakt" biomase sa enzimskom kompozicijom sprovodi se dodavanjem enzimske kompozicije biomasi. Dodatno, posebno je poželjno da dodavanje enzimske kompozicije bude praćeno, ili sprovedeno istovremeno sa mešanjem enzimske kompozicije i biomase.

[0025] Pojam "enzimska kompozicija" odnosi se na bilo koju kompoziciju koja sadrži najmanje jedan enzim odabran iz klase hidrolaza. Najmanje jedan enzim odabran iz klase hidrolaza iznosi poželjno od 1 do 99.99 tež.% (u odnosu na težinu enzimske kompozicije), dalje poželjno od 5 do 99 tež.%, posebno poželjno od 10 do 95 tež.% i najpoželjnije od 20 do 90 tež.% i može dodatno da sadrži najmanje jedan enzim odabran iz klase lijaza. U primerima izvođenja, kada enzimska kompozicija sadrži najmanje jedan enzim odabran iz klase lijaza, najmanje jedan enzim odabran iz klase hidrolaza poželjno iznosi od 0.01 do 50 tež.% (u odnosu na težinu enzimske kompozicije), poželjno od 0.05 do 20 tež.%, poželjnije od 0.08 do 5 tež.% i najpoželjnije od 0.1 do 1 tež.%.

[0026] U poželjnom primeru izvođenja, enzimska kompozicija sadrži celulaze, hemicelulaze i/ili pektinaze.

[0027] U posebno poželjnom primeru izvođenja enzimska kompozicija sadrži najmanje jednu celobiohidrolazu (EC 3.2.1.-) i najmanje jednu endo-,4-β-glukanazu (EC 3.2.1.4).

[0028] U posebno poželjnom primeru izvođenja, enzimska kompozicija sadrži najmanje jednu celobiohidrolazu (EC 3.2.1.-), najmanje jednu endo-,4-β-glukanazu (EC 3.2.1.4), najmanje jednu β-glukozidazu (EC 3.2.1.4), najmanje jednu glikozid hidrolazu 61 (GH61 i CBM33), najmanje jednu endo-ksilanazu (EC 3.2.1.8) i najmanje jednu β-ksilozidazu (EC 3.2.1.37).

[0029] U posebno poželjnom primeru izvođenja gore definisana enzimska kompozicija dalje sadrži jedan ili više enzima odabranih od β-glukanaze (EC 3.2.1.-), acetilksilan esteraze (EC 3.1.1.72), acetilgalaktan esteraze (3.1.1.6)), α-arabinopiranozidaze (3.2.1.-), α-galaktozidaze (EC 3.2.1.22), β-galaktozidaze (EC 3.2.1.23), α-glukuronidaza (EC 3.2.1.139), β-manaze (EC 3.2.1.78), pektin metil esteraze (EC 3.1.1.11), pektin acetil esteraze (EC 3.1.1.-), ramnogalakturonaze (EC 3.2.1.-; GH28), ramnogalakturonan acetilesteraze (EC 3.1.1.86), ramnogalakturonan endolijze (EC 4.2.2.23), ramnogalakturonan lijaze (EC 4.2.2.-) i βmanozidaza (EC 3.2.1.25), poligalakturonaza (EC 3.2.1.15, 67, 82: GH28) i pektin/pektat lijaza (EC 4.2.2.2, 6, 9, 10).

[0030] Pojmovi "celulaze", "hemicelulaze" i "pektinaze" odnose se na bilo koju mešavinu enzima koja je uključena u hidrolitičku razgradnju (depolimerizaciju) polimerne celuloze, hemiceluloze i/ili pektina do monomernih šećera. Kako se ovde koriste, pojmovi "celulaze", "hemicelulaze" i "pektinaze" odnose se i na prirodne i na mešavine koje nisu prirodne koje uključuju nekoliko enzima, kao što su oni koje proizvodi organizam, na primer filamentozna gljiva. "Celulaze", "hemicelulaze" i "pektinaze" poželjno potiču iz gljiva kao što su članovi podrazdela Eumycota i Oomycota, uključujući, ali bez ograničenja sledeće rodove: Aspergillus, Acremonium, Aureobasidium, Beauveria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Cryptococcus, Cyathus, Endothia, Endothia mucor, Fusarium, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Myceliophthora, Myrothecium, Mucor, Neurospora, Phanerochaete, Podospora, Paecilomyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophylum, Stagonospora, Talaromyces, Trichoderma, Thermomyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichophyton i Trametes. U poželjnoj realizaciji, filamentozna gljiva je Trichoderma species.

[0031] U poželjnom primeru izvođenja enzimske kompozicije, celulaze i/ili pektinaze potiču od gljive. U posebno poželjno primeru izvođenja enzimske kompozicije, izvor je gljiva Trichoderma reesei.

[0032] Izraz "mešavina enzima" se poželjno odnosi na mešavinu enzima izlučenih iz jednog ili više mikrobijalnih izvora. U nekim primerima izvođenja, enzimi za upotrebu u ovoj mešavini/mešavinama enzima mogu da budu pripremljeni iz jednog ili više prirodnih ili konstruisanih sojeva filamentoznih gljiva. Poželjni sojevi su gore navedeni. Željeni odnos enzimskih komponenti u finalnoj mešavini/mešavinama može da se postigne menjanjem relativne količine enzima u finalnoj mešavini npr. obogaćivanjem prečišćenim ili delimično prečišćenim enzimom/enzimima. U nekim primerima izvođenja, finalna mešavina/mešavine može da bude obogaćena jednom ili većim brojem enzimskih aktivnosti koje se ne eksprimiraju endogeno, ili se eksprimiraju na relativno niskom nivou u filamentoznim gljivama, da bi se poboljšala razgradnja celuloznog supstrata do šećera koji mogu da fermentišu. Dodatni enzim(i) mogu da se dodaju kao suplement finalnoj mešavini/mešavinama i enzimi mogu da budu komponenta posebnog kompletnog fermentacionog bujona, ili mogu da budu prečišćeni, ili minimalno ponovno izdvojeni i/ili prečišćeni.

[0033] Pojam "celulaza" odnosi se na bilo koji enzim koji može da hidrolizuje celulozne polimere do kraćih oligomera i/ili glukoze. Celulaze poželjne u enzimskoj kompoziciji uključuju celobiohidrolaze (CBH) (EC 3.2.1.-), endo-1,4-β-glukanaze (EG) (EC 3.2.1.4).), β-glukozidazu (EC 3.2.1.4), hidrolazu celobioze (EC 3.2.1.21), glikozid hidrolazu 61 (GH61 i CBM33), ekspansin, svolenin, luzinin i CIP proteine (EC 3.1.1.-; CE15).

[0034] Pojam "hemicelulaza" odnosi se na bilo koji enzim koji može da razgradi ili podrži razgradnju hemiceluloze. Hemicelulaze poželjne u enzimskoj kompoziciji uključuju β-glukanaze (EC 3.2.1.-), endo-ksilanaze (EC 3.2.1.8), β-ksilozidaze (EC 3.2.1.37), acetilksilan esterazu (EC 3.1.1.72), acetilgalaktan esterazu (3.1.1.6), acetil manan esterazu, feruloil esterazu (EC 3.1.1.73), glukuronoil esterazu (EC 3.1.1.-), α-L-arabinofuranozidazu (EC 3.2.1.55), α-arabinopiranozidazu (3.2.1.-), α-galaktozidazu (EC 3.2.1.22), β-galaktozidazu (EC 3.2.1.23), α-glukuronidaze (EC 3.2.1.139), β-manazu (EC 3.2.1.78), β-manozidaze (EC 3.2.1.25), manan 1,4-manobiozidazu (EC 3.2.1.100), arabinogalaktan endo-beta-1,4-galaktanazu (EC 3.2.1.89), endo-beta-1,3-galaktanazu (EC 3.2.1.90), galaktan endo-beta-1,3-galaktanazu (EC 3.2.1.181, glukuronoarabinoksilan endo-1,4-beta-ksilanazu (EC 3.2.1.136), alfa-L-fukozidazu (EC 3.2.1.51), koniferin beta-glukozidazu (EC 3.2.1.126), ksiloglukan hidrolaze (EC 3.2.1.150, 151, 155), ksilan α-1,2-glukuronozidazu (EC 3.2.1.131), endoksilogalakturonan hidrolazu (EC 3.2.1.-; GH28), α-amilazu (EC 3.2.1.1), glukan 1,4-α-glukozidazu (EC 3.2.1.3), galaktan 1,3-galaktozidazu (GH43), -1,4,-endogalaktanazu (EC 3.5.1.89; GH53), α-ramnozidazu (EC 3.2.1.40), β-ramnozidazu (EC 3.2.1.43), lignin peroksidazu (EC 1.11.1.14), Mn peroksidazu (EC 1.11.1.13), aril-alkohol oksidazu (EC 1.1.3.7), glioksal oksidazu (EC 1.1.3.), karbohidrat oksidaze (EC 1.1.3.4, 9, 10), lakazu (EC 1.10.3.2) i celobioza dehidrogenazu (EC 1.1.99.18).

[0035] Pojam "pektinaza" odnosi se na bilo koji enzim koji može da razgradi ili podrži razgradnju pektina. Pektinaze poželjne u enzimskoj kompoziciji uključuju poligalakturonaze (EC 3.2.1.15, 67, 82; GH28), pektin/pektat lijaze (EC 4.2.2.2, 6, 9, 10), pektin metil esterazu (EC 3.1.1.11), pektin acetil esterazu (EC 3.1.1.-), ramnogalakturonazu (EC 3.2.1.-; GH28), ramnogalakturonan acetilesterazu (EC 3.1.1.86), ramnogalakturonan endolijzu (EC 4.2.2.23), ramnogalakturonan lijazu (EC 4.2.2.-), ramnogalakturonan galakturonohidrolazu (EC 3.2.1.-), ksilogalakturonan hidrolazu (EC 3.2.1.-), pektin metilesterazu (EC 3.1.1.11), beta-arabinofuranozidazu (EC 3.2.1.55), beta-1,4-galaktanazu (EC 3.2.1.89), beta-1,3-galaktanazu (EC 3.2.1.90), betagalaktozidazu (EC 3.2.1.23), alfa-galaktozidazu (EC 3.2.1.22), feruloil acetil esterazu (EC 3.1.1.-), alfa-fukozidazu (EC 3.2.1.51), (beta-fukozidazu) (EC 3.2.1.38), beta-apiozidazu (EC 3.2.1.-), alfa-ramnozidazu (EC 3.2.1.40), beta-ramnozidazu (EC 3.2.1.43), alfa-arabinopiranozidazu (EC 3.2.1.-), beta-glukuronidazu (EC 3.2.1.31), alfa-glukuronidazu (EC 3.2.1.139), beta-ksilozidazu (EC 3.2.1.37) i alfa-ksilozidazu (EC 3.2.1.x).

[0036] Enzimi su klasifikovani prema nomenklaturama koje su zasnovane ili na nomenklaturi i klasifikaciji enzima Međunarodne unije za biohemiju i molekularnu biologiju (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/) ili na bazi podataka Carbohydrate-Active EnZYmes (http://www.cazy.org/).

[0037] Pojam "aktivnost" enzima odnosi se na katalitičku aktivnost enzima pod odgovarajućim uslovima pod kojima enzim služi kao proteinski katalizator, koji pretvara specifične polimerne ili veštačke supstrate u specifične oligomerne ili monomerne proizvode. U ovom kontekstu pojam "odgovarajući uslovi" je dobro poznat i primenjivan od strane stručnjaka u ovoj oblasti.

[0038] U poželjnom primeru izvođenja hidroliza biomase se sprovodi tokom vremena koje je dovoljno da hidrolizuje najmanje 20 tež.%, poželjno najmanje 30 tež.%, poželjnije najmanje 50 tež.% i najpoželjnije najmanje 60 tež.% biomase. U sledećem poželjnom primeru izvođenja hidroliza biomase se sprovodi tokom vremena koje je dovoljno da hidrolizuje od 10 do 100 tež.%, poželjno od 20 do 90 tež.% čak poželjnije od 30 do 85.0 tež.% i najpoželjnije od 40 do 75 tež.% celulozne biomase. Pojam "hidrolizuje" treba razumeti kao hidrolitičko pretvaranje nerastvorljivih polimernih komponenata biomase u rastvorljiva monomerna, dimerna i/ili oligomerna jedinjenja, hemijskim, fizičkim i/ili enzimskim postupcima kao što je hidroliza.

[0039] U posebno poželjnom primeru izvođenja, hidroliza biomase sprovodi se 1 minut do 136 časova, poželjnije 30 minuta do 112 časova, posebno poželjno 1 čas do 100 časova, čak poželjnije 4 časa do 96 časova, takođe posebno poželjno od 12 časova do 85 časova.

[0040] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, hidroliza biomase sprovodi se dok sadržaj preostalih nerastvorljivih čvrstih supstanci ne bude manji od 40 tež.%, poželjno manji od 30 tež.%, čak poželjnije manji od 20 tež.% i najpoželjnije manji od 15 tež.%. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, hidroliza biomase sprovodi se dok sadržaj preostalih nerastvorljivih čvrstih supstanci ne bude od 5 do 40 tež.%, poželjno od 8 do 30 tež.% i najpoželjnije od 10 do 25 tež.%.

[0041] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, hidroliza biomase sprovodi se dok biomasa ne postane tečna do najmanje 50%, poželjno najmanje 60% i najpoželjnije najmanje 80%, pri čemu je prevođenje u tečno stanje koje iznosi od 60 do 90% posebno poželjno.

[0042] Reakciona temperatura tokom hidrolize poželjno je odabrana od 25 do 80 °C, poželjnije odabrana od 30 do 75 °C i posebno poželjno od 35 do 65 °C. U još jednom poželjnom primeru izvođenja hidroliza biomase sprovodi se tokom 1 do 120 časova, poželjno 2 do 110 časova, poželjnije 3 do 100 časova, pri čemu je temperatura odabrana od 35 do 75 °C ili od 45 do 65 °C.

[0043] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pH vrednost tokom hidrolize je poželjno odabrana od 4 do 6.5, posebno poželjno od 4.5 do 5.5.

[0044] Optimalni dozni nivoi će značajno varirati u zavisnosti od supstrata i korišćenih tehnologija prethodne obrade. Enzimska kompozicija se poželjno dodaje biomasi u količini od 0.01 do 24 tež.% suve materije biomase, poželjnije 0.025 do 12 tež.% suve materije biomase, posebno poželjno 0.05 do 6 tež.% suve materije biomase i najpoželjnije od 0.1 do 3 tež.% suve materije biomase. Ukupna koncentracija enzima (proteina) određena je metodom po Bradfordu sa goveđim serumskim albuminom kao referentnim standardom (Bradford, M., 1976).

[0045] Hidroliza biomase sprovodi se u bilo kakvoj posudi koja je stručnjaku u ovoj oblasti poznata kao pogodna za inventivni postupak, poželjno u reaktoru. Odgovarajući reaktori su u okviru znanja stručnjaka u ovoj oblasti. Poželjne posude/reaktori uključuju, ali nisu ograničene na posude/reaktore koje sadrže sredstvo za mešanje i/ili sredstvo za prepumpavanje ili recirkulaciju sadržaja biomase u reaktoru. Dodatna poželjna sredstva poželjnih reaktora uključuju, ali nisu ograničena na sredstva za kontrolu temperature i/ili pH i regulaciju temperature i/ili pH.

[0046] Pojam "hidrolizat biomase", kako se koristi u ovom pronalasku, treba razumeti kao depolimerizovani biopolimer koji je depolimerizovan reakcijom hidrolize. Reakciju hidrolize treba razumeti kao cepanje hemijskih veza dodavanjem vode. Jedan način da se hidroliza tehnički sprovede predstavlja dodavanje enzima hidrolaze biomasi.

[0047] U poželjnom primeru izvođenja, hidrolizat biomase sadrži najmanje 50 tež.% saharida u obliku monomernih i dimernih šećera, poželjno najmanje 65 tež.%, poželjnije najmanje 75 tež.%, takođe poželjno najmanje 85 tež.% i najpoželjnije 99 tež.%, sve u odnosu na suvu materiju (d.m.) biomase. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, hidrolizat biomase sadrži aminokiseline, oligopeptide, minerale, oligosaharide i/ili proteine, kao i organske kiseline. Sadržaj minerala je poželjno najmanje 0.5 tež.% soli, poželjno najmanje 1 tež.%, poželjnije najmanje 2 tež.% i najpoželjnije 3 tež.%, sve u odnosu na suvu materiju (d.m.) biomase. Hidrolizat biomase može da sadrži organske kiseline kao što su mravlja kiselina, sirćetna kiselina, galaktoronska kiselina i mlečna kiselina. On može da sadrži i sledeće proizvode razgradnje: fenolna jedinjenja kao što su 4-hidroksi-3-metoksifenil i 4-hidroksi-3,5-dimetoksifenil, ferulinsku kiselinu, 4-hidroksibenzojevu kiselinu, levulinsku kiselinu, furfurale, 5-hidroksimetilfurfural, tanine i terpene.

[0048] Prema koraku (d) postupka čvrsta i tečna faza se razdvajaju iz hidrolizata biomase. Razdvajanje čvrste i tečne faze hidrolizata biomase (u nastavku "tečna faza" ili "čvrsta faza") može da se sprovede na bilo koji način koji je stručnjaku u ovoj oblasti poznat kao pogodan za inventivnu svrhu i poželjno se sprovodi filtracijom, centrifugiranjem, odlivanjem ili presovanjem npr. pomoću pužne prese. Poželjna je filter presa, najpoželjnije membranska filter presa. U poželjnom primeru izvođenja, filtersko platno filter prese ima propustljivost za vazduh od 2 do 10 L/dm2/min. Pomoćna sredstva za filtraciju kao što je dijatomejska zemlja ili kizelgur ili perlit mogu takođe da se dodaju tokom filtracije, poželjno u koncentracijama od 0.1 tež.% do 10 tež.%, poželjnije između 0.5 tež.% do 5 tež.%, i najpoželjnije između 1 tež.% i 3 tež.%.

[0049] Posle razdvajanja čvrste i tečne faze, dejonizacija tečne faze prema koraku (e) sprovodi se elektrodijalizom upotrebom najmanje jedne bipolarne membrane. U predmetnom pronalasku "elektrodijalizu upotrebom najmanje jedne bipolarne membrane" treba razumeti kao bilo koju tehniku koja obuhvata upotrebu tri različita tipa membrana pogodnih za uklanjanje soli uklanjanjem jona kao što su npr. Na<+>, K<+>, Mg<2+>, Ca<2+>, SO 2-4, PO 3-3, Cl- i podeljena H2O, prisutnih u tečnoj fazi. Elektrodijaliza upotrebom najmanje jedne bipolarne membrane poželjno obuhvata upotrebu katjonske izmenjivačke membrane, anjonske izmenjivačke membrane i katalitičkog međusloja, takozvane "bipolarne membrane", da bi se omogućilo cepanje vode u tečnoj fazi na protone i hudroksidne jone. Kroz kombinaciju selektivnog uklanjanja soli pomoću katjonske i anjonske izmenjivačke membrane uz istovremenu disocijaciju vode na katalitičkom međusloju, obrazuju se odgovarajuće neorganske ili organske kisele i bazne frakcije.

[0050] Pri upotrebi elektrodijalize koja koristi najmanje jednu bipolarnu membranu za dejonizaciju, joni uklonjeni iz rastvora se poželjno ponovo izdvajaju u tečnosti nazvanoj "koncentrat". U tom pogledu, posebno je poželjno dodati tečnost u odeljak jedinice za elektrodijalizu pre početka dejonizacije. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, ova tečnost se ne zamenjuje posle zaustavljanja dejonizacije date zapremine, već se koncentrat ponovo koristi u ponovljenim dejonizacijama tokom najmanje 2 ciklusa, poželjnije najmanje 4 ciklusa, posebno poželjno 6 ciklusa i najpoželjnije 10 ciklusa.

[0051] U poželjnom primeru izvođenja, koriste se najmanje jedna katjonska izmenjivačka membrana, najmanje jedna anjonska izmenjivačka membrana i najmanje jedan katalitički međusloj ili bipolarna membrana. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, najmanje dva seta ovih membrana su raspoređena u serijama, poželjno najmanje 4 seta, još poželjnije najmanje 6 setova i najpoželjnije najmanje 10 setova. U posebno poželjnom primeru izvođenja, sve tri membrane ili svi setovi membrana, kao što je prethodno definisano, raspoređeni su u jednom uređaju.

[0052] Dejonizacija se poželjno sprovodi na temperaturi u opsegu od 5 °C do 80 °C, poželjnije u opsegu od 10 °C do 75 °C, najpoželjnije u opsegu od 15 °C do 70 °C. Pad pritiska kroz ćeliju za elektrodijalizu poželjno je ispod 1 bara, poželjnije ispod 0.5 bara. U sledećem posebno poželjnom primeru izvođenja, dejonizacija se sprovodi dok se provodljivost rastvora ne smanji do najmanje 10 mS/cm, poželjnije do najmanje 6 mS/cm, posebno poželjno do najmanje 4 mS/cm i najpoželjnije do najmanje 2 mS/cm.

[0053] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, dejonizacija pomoću elektrodijalize upotrebom najmanje jedne bipolarne membrane praćena je kapacitivnom dejonizacijom. Kapacitivna dejonizacija se poželjno primenjuje kao takozvana "membranska kapacitivna dejonizacija", tj.

ubacivanjem katjonske izmenjivačke membrane i anjonske izmenjivačke membrane u jedinicu za kapacitivnu dejonizaciju. Ako je elektrodijaliza koja koristi najmanje jednu bipolarnu membranu praćena membranskom kapacitivnom dejonizacijom, elektrodijaliza se poželjno sprovodi dok se provodljivost rastvora ne smanji do najmanje 10 mS/cm, poželjnije do najmanje 6 mS/cm, posebno poželjno do najmanje 4 mS/cm i najpoželjnije do najmanje 2 mS/cm pre prelaska na membransku kapacitivnu dejonizaciju. Membranska kapacitivna dejonizacija nakon elektrodijalize se zatim koristi za dalje smanjenje provodljivosti rastvora poželjno do najmanje 8 mS/cm, poželjnije do najmanje 6 mS/cm, posebno poželjno do najmanje 4 mS/cm i najpoželjnije do najmanje 2 mS/cm.

[0054] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, dejonizacija pomoću elektrodijalize upotrebom najmanje jedne bipolarne membrane praćena je jonoizmenjivačkom hromatografijom. Ako je elektrodijaliza koja koristi najmanje jednu bipolarnu membranu praćena jonoizmenjivačkom hromatografijom, elektrodijaliza se poželjno sprovodi dok se provodljivost rastvora ne smanji do najmanje 10 mS/cm, poželjnije do najmanje 6 mS/cm, posebno poželjno do najmanje 4 mS/cm i najpoželjnije do najmanje 2 mS/cm pre prelaska na membransku kapacitivnu dejonizaciju. Jonoizmenjivačka hromatografija koja prati elektrodijalizu se zatim koristi da dodatno snizi provodljivost rastvora poželjno do najmanje 8 mS/cm, poželjnije do najmanje 6 mS/cm, posebno poželjno do najmanje 4 mS/cm i najpoželjnije do najmanje 2 mS/cm.

[0055] U okviru predmetnog pronalaska, "izmena jona" se definiše kao izmena jona između rastvora koji sadrži najmanje jedan jon i čvrstog polimernog ili mineralnog jonoizmenjivačkog materijala, pri čemu se jon rastvoren u rastvoru izmenjuje i zamenjuje jonom istog naelektrisanja kroz kontakt sa jonoizmenjivačkim materijalom.

[0056] Prema koraku f) postupka, kisela i bazna frakcija se izdvajaju iz dejonizovane tečne faze. Korak e) dejonizacije prema tome stvara kiselu frakciju, baznu frakciju i odsoljenu tečnu fazu. Razdvajanje prema predmetnom pronalasku može da se sprovede bilo kojim postupkom ili sredstvom koje je stručnjaku u ovoj oblasti poznato kao pogodno za inventivni postupak i poželjno se sprovodi na kontinuirani način tokom koraka dejonizacije.

[0057] U zavisnosti od sadržaja soli u tečnoj fazi, kisela frakcija može da sadrži jednu ili više kiselina kao što su npr. HCl, mravlja kiselina, sirćetna kiselina, mlečna kiselina, sumporna kiselina, fosforna kiselina, azotna kiselina, limunska kiselina i jantarna kiselina. Bazna frakcija može da sadrži jednu ili više alkalija kao što su npr. NaOH, KOH, Mg(OH)2i Ca(OH)2. U poželjnom primeru izvođenja, bazna frakcija ima pH od 9 do 14, poželjnije od 12 do 13. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, kisela frakcija ima pH od 1 do 5, poželjnije od 2 do 4.

[0058] Prema koraku g) postupka, najmanje deo izdvojene kisele frakcije dodaje se koraku b) postupka. Stoga je poželjno dodati od 5 do 99 tež.% izdvojene kiseline koraku b) postupka, poželjno od 10 do 98 tež.%, još poželjnije od 15 do 97 tež.% i najpoželjnije od 30 do 96 tež.%. U posebno poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, celokupna izdvojena kisela frakcija dodaje se koraku b) postupka.

[0059] Dodavanjem najmanje dela kisele frakcije koraku b) postupka, prethodna obrada biomase kiselinom može da se sprovede bez potrebe za upotrebom i kupovinom dodatne sirovine. Ovo vodi ne samo smanjenju troškova nabavke i logistike, već i smanjenju troškova odlaganja otpada. Sumporna kiselina, koja se obično koristi u ovakvim postupcima zbog svoje raspoloživosti u velikim količinama uz niske troškove nabavke, zahteva opsežno i skupo upravljanje otpadom.

[0060] U sledećem poželjnom primeru izvođenja postupka predmetnog pronalaska, najmanje deo izdvojene bazne frakcija dodaje se koraku c) postupka. U posebno poželjnom primeru izvođenja izdvojena bazna frakcija dodaje se koraku c) dok biomasa ne dostigne pH u opsegu od 4.5 do 5.5, najpoželjnije pH iznosi 5. Upotreba izdvojene bazne frakcije u koraku c) inventivnog postupka vodi daljem smanjenju troškova.

[0061] Još jedna primena izdvojene bazne frakcije je upotreba za čišćenje na mestu proizvodnje („cleaning in place“ - cip) jednog ili više uređaja korišćenih u postupku.

[0062] U poželjnom primeru izvođenja postupka, temperatura hidrolizata biomase podešava se pre podvrgavanja hidrolizata biomase razdvajanju čvrste i tečne faze prema koraku d). Temperatura je na taj način poželjno odabrana iz opsega od 50 do 95 °C, poželjno od 60 do 90 °C, još poželjnije od 65 do 85 °C. Podešavanje temperature se sprovodi bilo kojim sredstvom koje je stručnjaku u ovoj oblasti poznato kao pogodno za postupak. U posebno poželjnom primeru izvođenja, najmanje jedna kiselina se dodaje hidrolizatu biomase kome je podešena temperatura. U okviru obima predmetnog pronalaska je dodavanje najmanje jedne organske i/ili najmanje jedne neorganske kiseline, pri čemu je najmanje jedna kiselina poželjno odabrana iz grupe koja se sastoji od sirćetne kiseline, mravlje kiseline, mlečne kiseline, galakturonske kiseline, limunske kiseline, sumporne kiseline, fosforne kiseline, hlorovodonične kiseline, azotne kiseline i njihovih mešavina. U sledećem poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska deo kisele frakcije izdvojene prema koraku f) postupka, dodaje se u hidrolizat biomase. U poželjnom primeru izvođenja, najmanje jedna kiselina je odabrana od kiselina sa vrednošću pKa ispod 5.0, poželjno od kiselina sa vrednošću pKa ispod 3.5. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, najmanje jedna kiselina se dodaje u hidrolizat biomase dok se ne postigne pH od 1.5 do 4.5, poželjno od 2.0 do 4.0 i najpoželjnije od 2.5 do 3.5.

[0063] Koraci a) do g) kao što je gore definisano treba da se ponove najmanje jednom. Prema tome, poželjno je ponavljati korake a) do g) od 2 do 100000 puta, poželjno od 10 do 70000 puta, poželjnije od 15 do 50000 puta i najpoželjnije od 17 do 10000 puta. U posebno poželjnom primeru izvođenja postupka predmetnog pronalaska, postupak se sprovodi kao kontinuirani postupak. U okviru obima predmetnog pronalaska je da se korak čišćenja posude i/ili bilo kog drugog dela sistema sprovodi u bilo koje vreme između ili posle koraka a) do g). Čišćenje može da se sprovede na bilo koji način koji je stručnjaku u ovoj oblasti poznat kao pogodan za inventivnu svrhu i može takođe da uključuje zamenu jednog ili više delova sistema. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, koraci a) do g) se bar delimično sprovode istovremeno.

[0064] Sprovođenje koraka a) do g) postupka vodiće kompoziciji koja je označena kao "odsoljeni hidrolizat" ili "prečišćeni hidrolizat" u okviru obima predmetne prijave.

[0065] Opisan je odsoljeni hidrolizat pripremljen prema postupku kao što je ovde definisano. Sadržaj soli u odsoljenom hidrolizatu poželjno je najviše 80 %, poželjno najviše 60 %, poželjnije najviše 40 %, poželjnije najviše 20 %, i najpoželjnije najviše 10 %, sve u odnosu na sadržaj soli posle hidrolize supstrata.

[0066] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu odsoljenog hidrolizata pripremljenog prema inventivnom postupku kao medijuma za fermentaciju.

[0067] Vredna organska jedinjenja koja nastaju bakterijskom fermentacijom odsoljenog hidrolizata sadrže, ali nisu ograničena na organske kiseline (kao što su sirćetna kiselina, mlečna kiselina, jantarna kiselina, itakonska kiselina, fumarna kiselina, propionska kiselina i glukuronska kiselina), aminokiseline (kao što su glutaminska kiselina, leucin, lizin, treonin, asparaginska kiselina, fenilalanin, cistein), kaprolaktame (kao što je alfa-amino-kaprolaktam), antibiotike (kao što su bleomicin, virginiamicin, linkomicin, monensin, blasticidin, tetraciklin), vitamine (kao što su vitamin B2, B12 i C), enzime, nukleotide/nukleozide (kao što su NADH, ATP, cAMP, FAD, koenzim A), biogas, biopolimere (kao što su polihidroksibutirat, poliamidi/fibroini), proteine, polisaharide (kao što su ksantan, dekstran), amino glukane (kao što je hijaluronska kiselina), kao i organske rastvarače i biogoriva (kao što su aceton, etanol, butanol, propandiol).

[0068] Vredna organska jedinjenja koja nastaju fermentacijom odsoljenog hidrolizata pomoću kvasaca sadrže, ali nisu ograničena na organske rastvarače (npr. etanol, propanol), nukleotide (npr. RNK), biosurfaktante (npr. soforozni lipidi), enzime i biopolimere (npr. spidroine).

[0069] Vredna organska jedinjenja koja nastaju fermentacijom odsoljenog hidrolizata pomoću gljiva sadrže organske kiseline (kao što su limunska kiselina, fumarna kiselina, itakonska kiselina), antibiotike (kao što su penicilin, cefalosporin), enzime i polisaharide (kao što je hitin).

[0070] U sledećem poželjnom primeru izvođenja ovog postupka organsko jedinjenje je odabrano od alkohola, organskih kiselina, biopolimera, antibiotika, aminokiselina, kaprolaktama, polisaharida, organskih rastvarača, biogoriva, aminoglukana, nukleotida/nukleozida, vitamina, biosurfaktanata, enzima i njihovih smeša.

Primer i slika

[0071] Predmetni pronalazak je sada opisan sledećim primerom i slikom. Primer i slika su dati samo u ilustrativnu svrhu, ne treba ih razumeti kao ograničavajuće za pronalazak.

Sl. 1 prikazuje relativnu količinu glukoze izdvojene tokom enzimske hidrolize biomase kada je biomasa prethodno obrađena bez dodavanja kiseline (levi stubić) i kada je biomasa prethodno obrađena uz dodavanje kiseline (inventivni postupak) (desni stubić) pri sprovođenju postupka u skladu sa predmetnim pronalaskom prema primeru 1.

[0072] Slama žitarica sa sadržajem suve materije od 45 tež.% prethodno je obrađena eksplozijom pare (220 °C). Nakon eksplozije pare, tako prethodno obrađena slama žitarica ("supstrat") uvedena je u tank koji se meša (Labfors, Infors AG, Switzerland). Enzimska kompozicija koja sadrži 91.3 tež.% Celluclast<®>(celulaza iz Trichoderma reesei ATCC 26921, C2730 Sigma) i 8.7 tež.% glukozidaze (49291 Sigma) dodata je supstratu pri odnosu enzima i čvrste supstance od 0.5 tež.% kako bi supstrat hidrolizovao da bi se dobila suspenzija. Hidroliza je sprovedena na 50 °C, pH 5.0 tokom 72 časa uz mešanje na 50 rpm. Posle hidrolize, suspenzija je zagrevana do 70 °C tokom 1 h uz mešanje na 200 rpm, a zatim je pH podešen do 2.5 upotrebom 1 M H2SO4. Tako obrađena suspenzija je zatim filtrirana upotrebom filter prese sa filterskim platnom koje ima propustljivost za vazduh od 5 L/dm2/min pri konstantnom pritisku od 3 bara da bi se dobila tečna i čvrsta faza. Tečna faza je zatim dejonizovana upotrebom elektrodijalize sa bipolarnim membranama (ED64004, PCCell) sa membranskim nizom sastavljenim od 10 bipolarnih membrana (PCCell), 10 anjonskih izmenjivačkih membrana (PC 200D, PCCell) i 9 katjonskih izmenjivačkih membrana (PC SK, PCCell). Elektrodijaliza je sprovedena na 32 °C tokom 2 h i pri brzinama pumpe od 50 L/h za diluat i koncentrat. Posle 2 h, provodljivost je smanjena za 83% dajući odsoljeni hidrolizat. Istovremeno, tokom elektrodijalize proizvedeno je 7.1 g/l kisele frakcije sa pH vrednošću od 2. Ova frakcija može da se koristi za prethodnu obradu biomase kiselinom, smanjujući tako značajno materijalne troškove i otpad. To podmiruje količinu od 160% kiseline potrebne za prethodnu obradu kiselinom iste količine biomase koja je polazno korišćena.

[0073] Upotreba kiseline u prethodnoj obradi biomase predstavlja veliku prednost, jer omogućava izdvajanje 13% više glukoze iz biomase tokom enzimske hidrolize u poređenju sa prethodnom obradom bez dodavanja kiseline. Rezultati su prikazani na slici 1.

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Postupak za proizvodnju odsoljenog hidrolizata biomase koji obuhvata korake

a) obezbeđivanja biomase;

b) prethodne obrade biomase kiselinom;

c) hidrolize biomase za dobijanje hidrolizata biomase;

d) razdvajanja čvrste supstance od tečnosti hidrolizata biomase, da bi se dobila čvrsta faza i tečna faza;

e) dejonizacije tečne faze elektrodijalizom upotrebom najmanje jedne bipolarne membrane;

f) izdvajanja kisele i bazne frakcije iz dejonizovane tečne faze;

g) dodavanja bar dela izdvojene kisele frakcije koraku b)

pri čemu se koraci a) do g) ponavljaju bar jednom.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se prethodna obrada sprovodi eksplozijom pare.

3. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što se celokupna izdvojena kisela frakcija dodaje koraku b).

4. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što se hidroliza biomase sprovodi enzimskom hidrolizom.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, naznačen time, što se najmanje deo izdvojene bazne frakcije dodaje koraku c).

6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time, što se najmanje deo izdvojene bazne frakcije dodaje koraku c) dok biomasa ne dostigne pH u opsegu od 4.5 do 5.5.

7. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je temperatura hidrolizata biomase podešena na temperaturu odabranu iz opsega od 50 do 95 °C.

8. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što se najmanje deo izdvojene kisele frakcije dodaje u hidrolizat biomase dok se pH izdvojene tečne faze ne podesi na pH odabran iz opsega od pH 1.5 do 4.5.

9. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je biomasa lignocelulozna biomasa.

10. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je elektrodijaliza u kojoj se upotrebljava najmanje jedna bipolarna membrana praćena membranskom kapacitivnom dejonizacijom ili jonoimenjivačkom hromatografijom.