RS59676B1 - Antagonisti kalijumovog kanala kv1.3 - Google Patents

Antagonisti kalijumovog kanala kv1.3

Info

Publication number
RS59676B1
RS59676B1 RS20191608A RSP20191608A RS59676B1 RS 59676 B1 RS59676 B1 RS 59676B1 RS 20191608 A RS20191608 A RS 20191608A RS P20191608 A RSP20191608 A RS P20191608A RS 59676 B1 RS59676 B1 RS 59676B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cgtx
compound
treatment
group
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20191608A
Other languages
English (en)
Inventor
Andreas Klostermann
Jörg Stockhaus
Original Assignee
SelectION Therapeutics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SelectION Therapeutics GmbH filed Critical SelectION Therapeutics GmbH
Publication of RS59676B1 publication Critical patent/RS59676B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/40—Mineralocorticosteroids, e.g. aldosterone; Drugs increasing or potentiating the activity of mineralocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Description

Opis
PODRUČJE PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na jedinjenja koja mogu da se selektivno vezuju za i da inhibiraju aktivnost kalijumovog kanala Kv1.3. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije koje obuhvataju takva jedinjenja i na upotrebu navedenih jedinjenja i navedenih farmaceutskih kompozicija za lečenje ili prevenciju autoimunih bolesti, gojaznosti, parodontitisa i/ili odbijanja transplanta tkiva.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Autoimune bolesti predstavljaju grupu od više od 80 različitih bolesti koje se javljaju kada imuni sistem domaćina ne razlikuje strane antigene od samostalnih molekula (autoantigeni), čime se izaziva nepravilan imuni odgovor. Uzroci autoimunih bolesti su i dalje nejasni, međutim smatra se da ih prouzrokuje kombinacija genetskih i sredinskih faktora.
[0003] Imuno-zapaljenski poremećaji poput multiple skleroze, psorijaze i reumatoidnog artritisa dele zajednički patogeni princip. Njihova patogeneza je karakterisana time što autoreaktivne memorijske T ćelije posreduju u hroničnim zapaljenskim procesima nakon stimulacije. Određenije, ponovljeni antigenski izazov, koji se obično javlja kod autoimunih bolesti, dovodi do toga da se dugovečne centralne memorijske ćelije (TCM), koje poput naivnih ćelija skladište limfne čvorove kako bi se susrele sa njima srodnim antigenom, diferenciraju u kratkovečne efektorske memorijske ćelije (TEM) koje ne treba da skladište limfne čvorove za aktivaciju indukovanu antigenom. Aktivirane TEMćelije se menjaju u TEMefektore, koji rapidno migriraju ka mestima zapaljenja na kojima proizvode velike količine prozapaljenskih citokina. CD8<+>TEMćelije dalje proizvode velike količine perforina i stoga su izrazito destruktivne.
[0004] Trenutna lečenja autoimunih bolesti uključuju sistemsku upotrebu antizapaljenskih lekova i potentnih imunosupresivnih i imunomodulatornih agenasa. Međutim, ovi lekovi izazivaju brojna neželjena dejstva, uključujući npr. supresiju imunog sistema kao celine, uz rizik od infekcije i neoplazije. Dalje, kod nekih pacijenata navedeni lekovi ne mogu da indukuju klinički značajne remisije.
[0005] Jonski kanali su prisutni u membranama svih ćelija, a time i imunih ćelija. Poznato je da su određeni peptidi toksina usmereni na jonske kanale. US 2009/0318341 A1 opisuje sastav materije koja obuhvata analog OSK1 peptida.
[0006] Naponski kontrolisani Kv1.3 K<+>kanal je jedan od 76 kalijumovih kanala u ljudskom genomu i utvrđeno je da je prisutan u ljudskim T limfocitima. Sve ljudske T ćelije ekspresuju Kv1.3 kanal, kao i kalcijumski aktiviran KCa3.1, koji zajedno obezbeđuju efluks kalijuma kao protivtežu influksu kalcijuma koji je neophodan za aktivaciju i proliferaciju T ćelija. Broj kanala koje ekspresuje data ćelija zavisi od njenog stanja aktivacije i diferencijacije. Antigenom ili mitogenom stimulisane CD4<+>i CD8<+>TEMćelije iskazuju otprilike 4- do 5- struko povećanu ekspresiju Kv1.3, dok ljudske naivne ili TCMćelije pozitivno regulišu kalcijumom aktiviran KCa3.1 kanal za regulaciju membranskog potencijala i Ca2<+>signalizaciju u aktiviranom stanju.
[0007] Zbog ove diferencijalne preterane ekspresije u TEMćelijama, Kv1.3 kanal predstavlja obećavajući novi terapeutski cilj specifičan za TEM-ćeliju za lečenje autoimunih bolesti, čija patogeneza uključuje autoreaktivne TEMćelije poput npr. multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, psorijaze i dijabetesa tip-1, ali takođe i za druge hronične zapaljenske bolesti, poput npr. parodontitisa.
[0008] Dalje, postoji indikacija da Kv1.3 kanali imaju ulogu u regulaciji telesne mase. Miševi kojima nedostaje Kv1.3 imaju značajno manju masu od srodnika u kontrolnoj grupi. Dalje, nokaut miševi su zaštićeni od ishranom indukovane gojaznosti i dobijaju značajno manju masu od srodnika u kontrolnoj grupi kada im se daje hrana sa visokim procentom masti (Xu, Human Molecular Genetics, 2003, vol.12, pp 551). Kv1.3 kanal stoga takođe predstavlja obećavajući cilj za lečenje gojaznosti.
[0009] Stoga, prisutna je potreba za terapeutskim jedinjenjima specifičnim za Kv1.3 kanal koja iskazuju snažnu i specifičnu interakciju sa Kv1.3 kanalom i koja mogu da blokiraju ili smanje njegovu aktivnost.
Cilj i sažetak pronalaska
[0010] Jedan cilj ovog pronalaska jeste obezbeđenje jedinjenja koja mogu da se specifično vezuju za i inhibiraju ili smanje aktivnost kalijumovog kanala Kv1.3. Dodatni cilj ovog pronalaska je obezbeđivanje takvih inhibitornih jedinjenja i farmaceutskih kompozicija koje obuhvataju takva inhibitorna jedinjenja za upotrebu u lečenju autoimunih bolesti, poput npr. multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, psorijaze i/ili dijabetesa tip-1, gojaznosti i/ili parodontitisa.
[0011] Ovi i drugi ciljevi kao što će postati očigledno iz sledećeg opisa i patentnih zahteva se ostvaruju pomoću predmeta nezavisnih patentnih zahteva. Neki od poželjnih načina ostvarivanja su definisani zavisnim patentnim zahtevima.
[0012] U prvom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline od SEQ ID No.:25.
[0013] U drugom aspektu ovaj pronalazak se odnosi na kodiranje sekvence nukleinske kiseline za sekvencu amino kiseline u skladu sa pronalaskom.
[0014] U još jednom aspektu ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata jedinjenje u skladu sa pronalaskom.
[0015] Ovaj pronalazak se u još jednom aspektu takođe odnosi na jedinjenje u skladu sa pronalaskom ili farmaceutsku kompoziciju u skladu sa pronalaskom za upotrebu u lečenju ili prevenciji autoimune bolesti, gojaznosti, parodontitisa i/ili odbijanja transplanta tkiva.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0016]
Fig.1 Merenje inhibicije Kv1.3, Kv1.5 i Kv1.1 kanala lokalnom fiksacijom potencijala.
Fig.2 Lista sekvenci cgtx 538-548.
Fig.3 Dejstvo Jedinjenja 1-8 (C1-8).
Jedinjenje 1: cgtx 538
Jedinjenje 2: cgtx 539
Jedinjenje 3: cgtx 540
Jedinjenje 4: cgtx 541
Jedinjenje 5: cgtx 542
Jedinjenje 6: cgtx 543
Jedinjenje 7: cgtx-544
Jedinjenje 8: cgtx 547
Levo, primerne putanje hERG struja nakon primene spoljašnjeg rastvora (crno), primene jedinjenja (plavo) i hinidina (sivo). Desni panel prikazuje izmene vršne amplitude struje tokom vremena. Tačkaste linije označavaju primenu jedinjenja. Dejstvo koncentracije svakog jedinjenja je procenjeno za 10 ili 20 brisanja. Izgleda da su sva jedinjenja imala nikakvo ili tek malo dejstvo na hERG. Za razliku od njih, hinidin je u potpunosti blokirao struju. Treba napomenuti da je nastupio prekid rada od početka primene jedinjenja do kraja zabeleženog brisanja.
Fig.4 Reprezentativna aktivacija Kv1.3 kanala zavisna od napona ekspresovana u Sf21 ćelijama (A) i endogeno ekspresovana u TEMćelijama (B). (C) Protokol pulsa za Kv1.3 aktivaciju zavisnu od napona.
Fig.5 Karakteristična normalizovana korelacija između napona i struje Kv1.3 kanala ekspresovana u Sf21 (srednje i gornje linije) i TEMćelijama (donja linija); n= 41, n= 12 i n=29, respektivno. Pomoću sistema ekspresije Sf21 Baculovirusa moguće je ekspresovati velike količine Kv1.3 kalijumovih kanala.
Fig.6 Poređenje TEMćelija i Sf21 ćelija. Blok Kv1.3 kanala ekspresovanih u Sf21 (A) i TEM(B) ćelijama pomoću cgtx-544. Prikazane su reprezentativne sirove putanje struje i odgovori vremenske doze u prisustvu povećanih koncentracija Kv1.3 antagonističkog peptida.
Fig.7 Šematski prikaz lokalnog indukovanja artritisa u kolenu pacova
Fig.8 Otok zgloba kolena nakon indukovanja lokalnog artritisa
Fig.9 Imuni status eksperimentalnih životinja na osnovu brojeva WBC u perifernoj krvi; AI: indukovanje artritisa, životinje sa naivnim ćelijama = NaCl „imunizovane životinje“, imunizovane životinje = životinje tretirane Frojndovim adjuvansom uklj. mBSA
Fig.10 Razlika otoka zgloba kolena između životinja tretiranih pomoću cgtx-544 i netretiranih kontrolnih životinja (svaka grupa: n=14; puna linija sa rombovima: netretirane kontrolne životinje; isprekidana linija sa kvadratima: životinje tretirane pomoću cgtx-544)
Fig.11 Vremenski tok razlike apsolutnog povećanja otoka kolena kod pacova obolelih od artritisa sa standardnom terapijom Metotreksatom (MTX). Nakon dve imunizacije dana -21 i dana -14 antigenom indukovani artritis (AIA) je indukovan intra-artikularnim ubrizgavanjem metilisanog BSA dana 0. Grupa koja prima terapiju velikom dozom MTX je primila primenu od 1 mg/kg telesne mase MTX 1 x nedeljno s.c. počev od dana -21 do dana 0. Grupa koja prima terapiju malom dozom MTX primila je dnevnu primenu od 100 µg/kg telesne mase MTX i.v. počev od dana -3 do dana 6, a kontrolna grupa nosača je primila dnevnu primenu od 0,9 % NaCl i.v. počev od dana 0 do dana 6. Apsolutno povećanje otoka kolena je razlika između vrednosti za koleno u kojem nije indukovan artritis i vrednosti za koleno u kojem je indukovan artritis zasebno za svaku grupu. Vrednosti su srednje ± SD. Tačkasta linija sa popunjenim krugovima: grupa koja prima terapiju MTX s.c.1 x nedeljno (grupa J, n=7); Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima: grupa koja prima terapiju MTX i.v.1 x dnevno (grupa L, n=7); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) (grupa H, n=14).
Fig.12 Vremenski tok razlike apsolutnog povećanja otoka kolena kod pacova obolelih od artritisa sa standardnom terapijom Metotreksatom (MTX) u poređenju sa terapijom peptidom cgtx-544. Nakon dve imunizacije dana -21 i dana -14 antigenom indukovani artritis (AIA) je indukovan intra-artikularnim ubrizgavanjem metilisanog BSA dana 0. Grupa koja prima terapiju malom dozom MTX je primila dnevnu primenu od 100 µg/kg telesne mase MTX i.v. počev od dana -3 do dana 6. Poređenja radi, grupa koja prima terapiju cgtx-544 je primila dnevnu primenu od 1 mg/kg telesne mase cgtx-544 i.v. počev od dana -3 do dana 6, a kontrolna grupa nosača je takođe primila dnevnu primenu od 0,9 % NaCl i.v. počev od dana 0. Apsolutno povećanje otoka kolena je razlika između vrednosti za koleno u kojem nije indukovan artritis i vrednosti za koleno u kojem je indukovan artritis zasebno za svaku grupu. Vrednosti su srednje ± SD. Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima: grupa koja prima terapiju MTX i.v.1x dnevno (grupa L, n=7); Isprekidana linija sa kvadratima: grupa koja prima terapiju cgtx-544 (grupa I; n=14); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) (grupa H, n=14).
Fig.13 Vremenski tok razlike relativnog povećanja otoka kolena kod pacova obolelih od artritisa sa standardnom terapijom Metotreksatom (MTX). Nakon dve imunizacije dana -21 i dana -14 antigenom indukovani artritis (AIA) je indukovan intra-artikularnim ubrizgavanjem metilisanog BSA dana 0. Grupa koja prima terapiju velikom dozom MTX je primila primenu od 1 mg/kg telesne mase MTX 1 x nedeljno s.c. počev od dana -21 do dana 0. Grupa koja prima terapiju malom dozom MTX je primila dnevnu primenu od 100 µg/kg telesne mase MTX i.v. počev od dana -3 do dana 6, a kontrolna grupa nosača je primila dnevnu primenu od 0,9 % NaCl i.v. počev od dana 0 do dana 6. Relativno povećanje otoka kolena je razlika između vrednosti za koleno u kojem nije indukovan artritis i vrednosti za koleno u kojem je indukovan artritis zasebno za svaku grupu nakon normalizacije vrednosti. Normalizovane vrednosti (dan -21=1) su srednje ± SD. Tačkasta linija sa popunjenim krugovima: grupa koja prima terapiju MTX s.c.1 x nedeljno (grupa J, n=7); Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima: grupa koja prima terapiju MTX i.v.1 x dnevno (grupa L, n=7); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) (grupa H, n=14).
Fig.14 Vremenski tok razlike relativnog povećanja otoka kolena kod pacova obolelih od artritisa sa standardnom terapijom Metotreksatom (MTX) u poređenju sa terapijom cgtx-544. Nakon dve imunizacije dana -21 i dana -14 antigenom indukovani artritis (AIA) je indukovan intra-artikularnim ubrizgavanjem metilisanog BSA dana 0. Grupa koja prima terapiju malom dozom MTX je primila dnevnu primenu od 100 µg/kg telesne mase MTX i.v. počev od dana -3 do dana 6. Poređenja radi, grupa koja prima terapiju cgtx-544 je primila dnevnu primenu od 1 mg/kg telesne mase cgtx-544 i.v. počev od dana -3 do dana 6, a kontrolna grupa nosača je takođe primila dnevnu primenu od 0,9 % NaCl i.v. počev od dana 0. Relativno povećanje otoka kolena je razlika između vrednosti za koleno u kojem nije indukovan artritis i vrednosti za koleno u kojem je indukovan artritis zasebno za svaku grupu nakon normalizacije vrednosti. Normalizovane vrednosti (dan -21=1) su srednje ± SD. Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima: grupa koja prima terapiju MTX i.v.1x dnevno (grupa L, n=7); Isprekidana linija sa kvadratima: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-544 (grupa I; n=14); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) (grupa H, n=14).
Fig.15 Imuni status pacova obolelih od artritisa sa standardnom terapijom Metotreksatom (MTX) u poređenju sa terapijom cgtx-544. Apsolutni broj belih krvnih ćelija (WBC); vrednosti su srednje ± SD (n=7). Tačkasta linija sa popunjenim krugovima: grupa koja prima terapiju MTX s.c.1 x nedeljno (grupa J, n=7); Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima: grupa koja prima terapiju MTX i.v.1 x dnevno (grupa L, n=7); Isprekidana linija sa kvadratima: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-544 i.v.1 x dnevno (grupa I, n=7); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) i.v.1 x dnevno (grupa H, n=7). Crne strelice: vreme imunizacije sa M. tuberculosis (750 µg) i mBSA. EDTA celokupna krv je izmerena pomoću Sysmex XT-2000i.V.
Fig.16 Neutrofilni granulociti kod pacova obolelih od artritisa sa standardnom terapijom Metotreksatom (MTX) u poređenju sa terapijom cgtx-544. A. Apsolutne vrednosti su srednje ± SD (n=7). Tačkasta linija sa popunjenim krugovima: grupa koja prima terapiju MTX s.c.1 x nedeljno (grupa J, n=7); Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima: grupa koja prima terapiju MTX i.v.1 x dnevno (grupa L, n=7); Isprekidana linija sa kvadratima: grupa koja prima terapiju cgtx-544 i.v.1 x dnevno (grupa I, n=7); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) i.v.1 x dnevno (grupa H, n=7). Crne strelice: vreme imunizacije sa M. tuberculosis (750 µg) i mBSA. B. Relativni neutrofili (u %) navedeni kao celokupan iznos WBC. Vrednosti su srednje ± SD (n=7). Tačkasta linija sa popunjenim krugovima: grupa koja prima terapiju MTX s.c.1 x nedeljno (grupa J, n=7); Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima: grupa koja prima terapiju MTX i.v.1 x dnevno (grupa L, n=7); Isprekidana linija sa kvadratima: grupa koja prima terapiju cgtx-544 i.v.1 x dnevno (grupa I, n=7); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) i.v.1 x dnevno (grupa H, n=7). Crne strelice (predviđeno za dane -21 i -14): vreme imunizacije sa M. tuberculosis (750 µg) i mBSA. EDTA celokupna krv je izmerena pomoću Sysmex XT-2000i.V.
Fig.17 Vremenski tok limfocita kod pacova obolelih od artritisa sa standardnom terapijom Metotreksatom (MTX) u poređenju sa terapijom cgtx-544. A. Apsolutne vrednosti su srednje ± SD (n=7). Tačkasta linija sa popunjenim krugovima: grupa koja prima terapiju MTX s.c.1 x nedeljno (grupa J, n=7); Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima: grupa koja prima terapiju MTX i.v.1 x dnevno (grupa L, n=7); Isprekidana linija sa kvadratima: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-544 i.v.1 x dnevno (grupa I, n=7); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) i.v.1 x dnevno (grupa H, n=7). Crne strelice: vreme imunizacije sa M. tuberculosis (750 µg) i mBSA. B. Procenat limfocita kod pacova obolelih od artritisa sa standardnom terapijom Metotreksatom (MTX) u poređenju sa terapijom cgtx-544 - Relativni limfociti (u %) se navode kao celokupan broj WBC-ova. Vrednosti su srednje ± SD (n=7). Tačkasta linija sa popunjenim krugovima: grupa koja prima terapiju MTX s.c.1 x nedeljno (grupa J, n=7); Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima: grupa koja prima terapiju MTX i.v.1 x dnevno (grupa L, n=7); Isprekidana linija sa kvadratima: grupa koja prima terapiju cgtx-544 i.v.1 x dnevno (grupa I, n=7); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) i.v.1 x dnevno (grupa H, n=7). Crne strelice: vreme imunizacije sa M. tuberculosis (750 µg) i mBSA. EDTA celokupna krv je izmerena pomoću Sysmex XT-2000i.V.
Fig.18 Preventivni tretman i dozna zavisnost – Vremenski tok relativnog povećanja prečnika kolena (velika/srednja/mala doza). Vrednosti su srednje ± SD. Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima: grupa koja prima terapiju peptodom cgtx-5445 mg/kg telesne mase (grupa N, n=5);
Isprekidana linija sa crnim kvadratima: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-5441 mg/kg telesne mase (grupa I, n=14); Tačkasta linija sa popunjenim krugovima: grupa koja prima terapiju cgtx-5440,1 mg/kg telesne mase (grupa M, n=5); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) (grupa H #15-19, n=5). Pune linije sa belim kvadratima: bez povećanja prečnika kolena u kojima nije indukovan artritis (grupe I, N, M i H; leva kolena u kojima nije indukovan artritis).
Fig.19 Statistička analiza rezultata efikasnosti cgtx-544: Razlika relativnog otoka kolena sa i bez terapije peptidom cgtx-544 (velika/srednja/mala doza) dana 1(A) i dana 3(B) nakon indukovanja artritisa. Sva polja prikazuju medijanu, međukvartilni opseg, minumum i maksimum uzoraka. Za analizu važnosti, kontrolna grupa nosača je upoređena sa terapijskim grupama. *P < 0, 05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
Fig.20 Kurativni tretman – Početak tretmana na d=0 ili d=1 – Vremenski tok razlike prečnika kolena (intra-individualni, oduzimanje ind./neind.) kod pacova obolelih od artritisa sa i bez terapije peptidom cgtx-544 (početak tretmana na d0 i d1). Vrednosti su srednje ± SD. Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima – početak tretmana na d1: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-5441 mg/kg telesne mase (grupa Q, n=7); Tačkasta linija sa popunjenim krugovima – početak tretmana na d0: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-5441 mg/kg telesne mase (grupa P, n=6); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) (grupa H). Pune linije sa belim kvadratima: bez povećanja prečnika kolena u kojem nije indukovan artritis (grupe Q, P i H; leva kolena u kojima nije indukovan artritis).
Fig.21 Statistička analiza rezultata efikasnosti cgtx-544 dana 1(A), dana 2(B) i dana 3(C) nakon indukovanja artritisa: Razlika relativnog otoka kolena sa i bez terapije peptidom cgtx-544 - kurativni tretman (počev od d0/d1). Sva polja prikazuju medijanu, međukvartilni opseg, minimum i maksimum uzoraka. Za analizu važnosti, kontrolna grupa nosača je upoređena sa terapijskim grupama. *P < 0, 05, **P < 0,01, ***P<0,001.
Fig.22 Kurativni tretman – Početak tretmana na d=0 ili d=1 – Vremenski tok broja WBC kod pacova obolelih od artritisa sa i bez terapije peptidom cgtx-544 (početak tretmana na d0 i d1). Apsolutni broj belih krvnih ćelija (WBC); vrednosti su srednje ± SD. Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima – početak tretmana na d1: grupa koji primaju terapiju peptidom cgtx-544(Mix) 1 mg/kg telesne mase (grupa Q, n=7); Tačkasta linija sa popunjenim krugovima – početak tretmana na d0: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-5441 mg/kg telesne mase (grupa P, n=6); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) (grupa H, n=5). Crne strelice: vreme imunizacije sa M. tuberculosis (750 µg) i mBSA.
Fig.23 Kurativni tretman – Početak tretmana na d=0 ili d=1 – Vremenski tok relativne količine neutrofilnih granulocita u procentu WBC kod pacova obolelih od artritisa sa i bez terapije peptidom cgtx-544 (početak tretmana na d0 i d1). Neutrofili (u %) se odnose na celokupan broj WBC. Vrednosti su srednje ± SD. Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima – početak tretmana na d1: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-5441 mg/kg telesne mase (grupa Q, n=7); Tačkasta linija sa popunjenim krugovima – početak tretmana na d0: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-5441 mg/kg telesne mase (grupa P, n=6); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) (grupa H, n=5). Crne strelice: vreme imunizacije sa M. tuberculosis (750 µg) i mBSA.
Fig.24 Kurativni tretman – Početak tretmana na d=0 ili d=1 – Vremenski tok relativne količine limfocita u procentu WBC kod pacova obolelih od artritisa sa i bez terapije peptidom cgtx-544 (početak tretmana na d0 i d1). Limfociti (u %) se odnose na ukupan broj WBC-ova. Vrednosti su srednje ± SD. Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima – početak tretmana na d1: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-5441 mg/kg telesne mase (grupa Q, n=7); Tačkasta linija sa popunjenim krugovima – početak tretmana na d0: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-5441 mg/kg telesne mase (grupa P, n=6); Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) (grupa H, n=5). Crne strelice: vreme imunizacije sa M. tuberculosis (750 µg) i mBSA.
Fig.25 Kurativni tretman (jednom nedeljno ili dva puta nedeljno) – Vremenski tok relativnog povećanja prečnika zgloba kolena. Vrednosti su srednje ± SD. Dugačka isprekidana tačkasta linija sa trouglovima -jedan tretman na d1: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-5441 mg/kg telesne mase (grupa R6-10, n=5); Tačkasta linija sa popunjenim krugovima – jedan tretman na d1 i d4: grupa koja prima terapiju peptidom cgtx-5441 mg/kg telesne mase (grupa R1-5, n=5); obe grupe su bile kombinovane do dana 4. Puna linija sa rombovima: kontrolna grupa nosača (NaCl) (grupa H, n=5).
Fig.26 Kurativni tretman (jednom nedeljno ili dva puta nedeljno) – Statistička analiza efikasnosti cgtx-544: Razlika relativnog otoka kolena sa i bez terapije peptidom cgtx-544 dana 2(A) i dana 5(B) nakon indukovanja artritisa. Sva polja prikazuju medijanu, međukvartilni opseg, minimum i maksimum uzorka. Za analizu važnosti, kontrolna grupa nosača je upoređena sa terapijskim grupama. *p < 0, 05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
Fig.27 Analiza mBSA specifičnih antitela. U eksperimentalnim grupama H i I sve životinje su proizvele antitela protiv antigena mBSA tokom imunizacije i perioda indukovanja AIA. U kontrolnoj grupi F (životinje sa naivnim ćelijama) specifična mBSA antitela nisu mogla biti detektovana.
Fig.28 Statistička analiza rezultata efikasnosti MTX: Razlika relativnog otoka kolena sa i bez terapije MTX (velika/mala doza) dana 1(A) i dana 3(B) nakon indukovanja artritisa. Sva polja prikazuju medijanu, međukvartilni opseg, minimum i maksimum uzorka. Za analizu važnosti, kontrolna grupa nosača je upoređena sa terapijskim grupama. *P < 0, 05, **P < 0,01, ***P < 0,001, n.s. bez značaja.
Fig.29 Šema sinteze peptida
Fig.30 UPLC profil peptida cgtx-544 nakon savijanja
Fig.31 IC50 od cgtx-544(Sing). A. cgtx-544(Sing) je prikazao IC50 vrednost od 6,9 nM kada su rezultati prilagođeni Hilovoj krivi. B. Smanjenje struje po fazama sa povećanim koncentracijama cgtx-544(Sing). C. Putanje struje tokom merenja pri različitim koncentracijama cgtx-544(Sing).
Fig.32 Selektivnost cgtx-544(Sing). A. cgtx-544(Sing) je prikazao IC50 vrednost od oko 6 µM na Kv1.1 kada su rezultati prilagođeni Hilovoj krivi. B. Smanjenje struje po fazama sa povećanim koncentracijama cgtx-544(Sing) na Kv1.1. C. Tragovi struje tokom merenja pri različitim koncentracijama cgtx-544(Sing) na Kv1.1. D. A 10 µM rastvor od cgtx-544(Sing) nije indukovao značajnije smanjenje struja Kv1.5, dok su struje iskazale osetljivost na hinidin. E. Rastvor od 100nM od cgtx-544(Sing) nije promenio struje Kv1.2 u stabilno transfektovanim CHO ćelijama. Koncentracije > 1µM su rezultirale tek blago smanjenim strujama. IC50 je utvrđen na 2,5µM.
Fig.33 Raspadanje cgtx-544(Sing) u ljudskom serumu na 37°C. Poznata količina cgtx-544(Sing) je dodata ljudskom krvnom serumu od 3 donora krvi i inkubirana na 37°C u periodu od 57 dana.
Blokirajuća aktivnost peptida je izmerena na Kv1.3 kanalima tokom ovog perioda. Peptid ostaje stabilan tokom 16h, i može se i dalje detektovati nakon 45 dana. Nakon 57 dana dejstvo blokiranja se više ne vidi. Raspadanje se opisuje kao smanjenje koncentracije cgtx-544 (Sing) kako je utvrđeno pomoću: C(t) = IC50 (t0)/IC50(t).C0. Raspadanje je prilagođeno jednostavnoj krivi raspadanja: C (t) = C0.2(-t/t<1/2>), gde C0predstavlja početnu koncentraciju peptida u rastvoru, t0predstavlja inkubaciju od 0 min u tački od 37°C, a t1/2predstavlja vreme poluraspada.
Fig.34 Smanjenje cgtx-544(Sing) u serumu tretiranih pacova nakon i.v. ubrizgavanja. Koncentracija nevezanog cirkulišućeg cgtx-544(Sing) je izračunata na osnovu standardne krive. Standardna greška srednje vrednosti je opisana u trakama sa greškama (n=6).
Fig.35 A. Produžena inkubacija cgtx-544 rezultira pikomolarnom IC50 vrednošću. Kv1.3 struje su normalizovane do početnih vršnih struja i punog bloka od strane nespecifičnog blokatora kalijumovog kanala hinidina (podaci nisu prikazani). Dok su u kontrolnim uslovima (gornja kriva, n=11) struje stabilne tokom najmanje 10 minuta, jedna primena (strelica) cgtx-544 (donja kriva, n=13) prouzrokuje blokiranje koje se povećava sa vremenom. B. Kriva doznog odgovora cgtx-544 u produženim vremenima inkubacije. Na crnoj isprekidanoj liniji prikazana je kriva doznog odgovora za cgtx-544 sa kratkim periodima inkubacije. Crna puna kriva se javlja kada je cgtx-544 inkubiran sa Kv1.3 kanalima u produženom vremenskom periodu, tj.15 min. Primećeno blokiranje od 20% sa kratkim periodima inkubacije (bela tačka) u poređenju sa blokiranjem od 60% sa dugačkim periodima inkubacije (crna tačka) rezultira levom promenom krive doznog odgovora, i stoga je IC50 (horizontalna tačkasta linija) manji. C. IC50 vrednosti cgtx-544 na Kv1.3 i Kv1.1 sa dugačkim i kratkim periodima inkubacije.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0017] Pre detaljnog opisa ovog pronalaska u nastavku, treba shvatiti da ovaj pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole i reagense koji su ovde opisani, pošto se mogu razlikovati. Takođe treba shvatiti da ovde upotrebljena terminologija samo ima svrhu opisa određenih načina ostvarivanja, i nije predviđena da ograničava područje ovog pronalaska, koje će biti ograničeno samo priloženim patentnim zahtevima. Osim ako je drugačije definisano, svi ovde upotrebljeni tehnički i naučni pojmovi imaju isto značenje kao i ono koje je opšte shvaćeno među stručnjacima u ovoj oblasti. Ovde upotrebljene skraćenice amino kiselina od jednog i tri slova odgovaraju IUPAC nomenklaturi (pogledati npr. European Journal of Biochemistry, 138:9-37, 1984).
[0018] Uvode se sledeće definicije:
Kako se koriste u ovoj specifikaciji i u predviđenim patentnim zahtevima, oblici jednine određenog i neodređenog člana ("a" i "an") takođe uključuju respektivne množine, osim ako kontekst jasno nalaže drugačije.
[0019] Treba shvatiti da pojam „obuhvatati“ i varijacije poput „obuhvata“ i „koji obuhvata“ nisu ograničavajući. U svrhu ovog pronalaska pojam „koji se sastoji od“ se smatra poželjnim načinom ostvarivanja pojma „koji obuhvata“. Ako je u daljem tekstu grupa definisana tako da obuhvata najmanje određeni broj načina ostvarivanja, ovim takođe treba da bude obuhvaćena grupa koja se poželjno sastoji samo od ovih načina ostvarivanja.
1
[0020] Pojmovi „oko“ i „otprilike“ u kontekstu ovog pronalaska označavaju interval tačnosti koji će stručnjak iz ove oblasti shvatiti kako bi se i dalje obezbedilo tehničko dejstvo predmetne karakteristike. Ovaj pojam obično obuhvata odstupanje od naznačene numeričke vrednosti od ±10 % i poželjno od ±5 %.
[0021] Pojam "peptid" kako se ovde koristi se odnosi na molekularni lanac amino kiselina i ne odnosi se na specifičnu dužinu proizvoda; stoga, polipeptidi, oligopeptidi i proteini su uključeni u definiciju peptida. Peptidi prema definiciji mogu biti prirodni peptidi i sintetički peptidi koji mogu uključivati prirodne ili neprirodne amino kiseline. U definiciju su dalje uključeni funkcionalni derivati peptida, tj. peptidi koji su hemijski modifikovani, npr. modifikacijom bočnog lanca, slobodnog amino i/ili karboksiterminusa prirodne ili neprirodne amino kiseline, poželjno bez promene identiteta respektivne amino kiseline. Na primer, bočni lanac ili slobodan amino ili karboksi-terminus amino kiseline peptida može se modifikovati npr. glikozilacijom, amidacijom, fosforilacijom, ubikvinacijom, karboksilacijom itd. U poželjnom načinu ostvarivanja peptid u skladu sa pronalaskom može biti modifikovan PEGilacijom, HESilacijom ili PASilacijom.
[0022] Za ovde opisana jedinjenja pronalazači ovog pronalaska su iznenađujuće otkrili da se mogu selektivno vezivati za kalijumov kanal Kv1.3 preko drugih kalijumovih kanala, poput npr. Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG ili Ca2+-akvitiranih K+ kanala velike provodnosti (BK kanali). Imajući u vidu prevalenciju Kv1.3 kod TEMćelija, jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom stoga predstavljaju moćne terapijske agense za bolesti posredovane TEM-ćelijama, poput npr. autoimunih bolesti. Dalje, opisana jedinjenja obezbeđuju prednost smanjenih neželjenih dejstava, pošto suštinski ne moduliraju aktivnost drugih kalijumovih kanala distribuiranih drugim tipovima ćelija ili tkiva.
[0023] Ovaj opis se stoga generalno odnosi na jedinjenja koja mogu da se selektivno vezuju za Kv1.3 kalijumov kanal preko drugih kalijumovih kanala, poput npr. Kv1.1. Takva jedinjenja se razmatraju za upotrebu u lečenju ili prevenciji autoimunih bolesti. Takva jedinjenja mogu se odabrati iz grupe koju čine peptid, antitelo ili mali molekul. U naročito poželjnom načinu ostvarivanja navedeno jedinjenje je peptid kako je opisano za prvi, drugi i treći aspekt opisa i njegove varijante.
[0024] Antitelo koje može selektivno da se vezuje za kalijumov kanal Kv1.3 može biti monoklonsko ili poliklonsko antitelo. U nekim načinima ostvarivanja antitelo takođe može biti odabrano od varijanti ili fragmenata antitela poput npr. antitela jednog lanca, diatela, minitela, fragmenata jednog lanca Fv (sc(Fv)), sc(Fv)2antitela, Fab fragmenata ili F(ab')2fragmenata, pod uslovom da varijante ili fragmenti navedenog antitela mogu da se selektivno vezuju za kalijumov kanal Kv1.3.
[0025] Pojam „mali molekul“ kako se ovde koristi odnosi se na mala organska jedinjenja sa malom molekularnom masom.
[0026] Mali molekul može biti sintetičko jedinjenje za koje nije poznato da se javlja u prirodi ili prirodno jedinjenje izolovano od ili za koje se zna da se javlja u prirodnim izvorima, poput npr. ćelija, biljaka, gljivica, životinja i slično. Mali molekul u kontekstu ovog opisa poželjno ima molekularnu masu manju od 5000 Daltona, poželjnije manju od 4000 Daltona, poželjnije manju od 3000 Daltona, poželjnije manju od 2000 Daltona ili još poželjnije manju od 1000 Daltona. U naročito poželjnom načinu ostvarivanja mali molekul u kontekstu ovog opisa ima molekularnu masu manju od 800 Daltona.
[0027] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja mali molekul u kontekstu ovog opisa ima molekularnu masu od 50 do 3000 Daltona, poželjno od 100 do 2000 Daltona, poželjnije od 100 do 1500 Daltona i još poželjnije od 100 do 1000 Daltona. Najpoželjnije, mali molekul u kontekstu ovog opisa ima molekularnu masu od 100 do 800 Daltona.
[0028] Mali molekuli koji mogu da se selektivno vezuju za kalijumov kanal Kv1.3 mogu se npr. identifikovati skriningom biblioteka malih jedinjenja.
[0029] Ovaj opis u prvom, drugom i trećem aspektu i njegovim varijacijama se stoga odnosi na jedinjenja peptida koja mogu da se selektivno vezuju za kalijumov kanal Kv1.3. Poželjno, navedena jedinjenja mogu da se selektivno vezuju za kalijumov kanal Kv1.3 preko drugih kalijumovih kanala, poput npr. Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG ili Ca2+-aktiviranih K+ kanala velike provodnosti (BK kanali). U naročito poželjnom načinu ostvarivanja, jedinjenja u skladu sa opisom mogu da se selektivno vezuju za kalijumov kanal Kv1.3 preko kalijumovog kanala Kv1.1.
[0030] U prvom aspektu, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (SEQ ID No.:23),
pri čemu je X1=T,Q,S,Y,N; X2=I,F,V,A,L,W; X3=I,T,Y,S,V,A,L; X4=K,S,T,Y,R; X5= R,T,K,S,Y;
X6=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X7=P,S,T; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X11=D,R,P,K,E,S,T,Y; X12=P,H,V,I,L,A; X13=R,K,Q,N; X14=K,D,A,R,E,V,L,I; X15=E,Q,A,L,D,N,V,I; X16=Y,N,S,T,Q; X17=A,G,V,I,L; X18=K,R, X19=Y,N,Q,T,S i X20=G,R,K.
[0031] U varijaciji prvog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 23,
pri čemu je X1=T,Q,S,Y,N; X2=I,F,V,A,L,W; X3=I,T,Y,S,V,A,L; X4=K,S,T,Y,R; X5= R,T,K,S,Y;
X6=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X7=P,S,T; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X11=D,R,P,K,E,S,T,Y; X12=P,H,V,I,L,A; X13=R,K,Q,N; X14=K,D,A,R,E,V,L,I; X15=E,Q,A,L,D,N,V,I; X16=Y,N,S,T,Q; X17=A,G,V,I,L; X18=K,R, X19=Y,N,Q,T,S i X20=G,R,K; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0032] U poželjnom načinu ostvarivanja prvog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (SEQ ID No.: 24);
pri čemu je X1=T,Q; X2=I,F; X3=I,T; X4=K,S; X5=R,T,K; X6=T,G,S,N,I; X7=P,S; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W; X11=D,R,P,K,E,S; X12=P,H,V; X13=R,K,Q; X14=K,D,A,R; X15=E,Q,A,L; X16=Y,N; X17=A,G; X18=K,R, X19=Y,N i X20=G,R.
[0033] U poželjnom načinu ostvarivanja varijacije prvog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 24,
pri čemu je X1=T,Q; X2=I,F; X3=I,T; X4=K,S; X5=R,T,K; X6=T,G,S,N,I; X7=P,S; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E;
X10=A,Y,I,L,W; X11=D,R,P,K,E,S; X12=P,H,V; X13=R,K,Q; X14=K,D,A,R; X15=E,Q,A,L; X16=Y,N; X17=A,G; X18=K,R, X19=Y,N i X20=G,R; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0034] U poželjnijem načinu ostvarivanja prvog aspekta i njegove varijacije, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline od SEQ ID No.25 (cgtx-544) ili SEQ ID No.26 (cgtx 547). U ovom kontekstu, još jedan poželjniji način ostvarivanja prvog aspekta i njegovih varijacija, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline koja ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identičnosti sa SEQ ID No.25 (cgtx-544). Utvrđivanje procenta identičnosti između dve sekvence se poželjno ostvaruje pomoću matematičkog algoritma koji su razvili Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877. Takav algoritam je npr. inkorporiran u BLASTn i BLASTp programe koje su razvili Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215: 403-410 dostupne na NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge). Utvrđivanje procenta identičnosti se poželjno sprovodi pomoću standardnih parametara BLASTn i BLASTp programa. Pretrage BLAST polinukleotida se poželjno sprovode pomoću BLASTn programa. Za generalne parametre, polje „Maksimalne ciljne sekvence“ može biti podešeno na 100, polje „Kratke pretrage“ može biti štiklirano, polje „Očekivani prag“ može biti podešeno na 10 i polje „Veličina reči“ može biti podešeno na 28. Za parametre rezultata polje „Rezultati spajanja/nespajanja“ može biti podešeno na 1,-2 i polje „Troškovi praznina“ može biti podešeno na linearno. Za parametre filtera i maskiranja, polje „Područja niske kompleksnosti“ ne mora biti štiklirano, polje „Ponavljanja specifična za vrste“ ne mora biti štiklirano, polje „Maska samo za tabelu provere“ može biti štiklirano, polje „Maskiranje malih slova“ ne mora biti štiklirano. Pretrage BLAST proteina se poželjno sprovode pomoću BLASTp programa. Za generalne parametre, polje „Maksimalne ciljne sekvence“ može biti podešeno na 100, polje „Kratke pretrage“ može biti štiklirano, polje „Očekivani prag“ može biti podešeno na 10 i polje „Veličina reči“ može biti podešeno na „3“. Za parametre rezultata polje „Matrica“ može biti podešeno na „BLOSUM62“, polje „Troškovi praznina“ može biti podešeno na „Egzistencija: 11 Produženje:1“, polje „Podešavanja kompozicije“ može biti podešeno na „Uslovno podešavanje matrice rezultata kompozicije“. Za parametre filtera i maskiranja polje „Područja niske kompleksnosti“ ne mora biti štiklirano, polje „Maska samo za tabelu provere“ ne mora biti štiklirano i polje „Maskiranje malih slova“ ne mora biti štiklirano.
1
[0035] Jedinjenje u skladu sa pronalaskom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline od SEQ ID No.25 (cgtx-544).
[0036] U nastavku opisani načini ostvarivanja odnose se poželjno na jedinjenja prvog aspekta ovog opisa i njegove varijacije. Međutim, treba shvatiti da ovi načini ostvarivanja, npr. dužina peptida kako se navodi u nastavku, selektivnost za Kv1.3 naspram Kv1.1 itd. takođe važe i za jedinjenja drugog i trećeg aspekta ovog opisa i njihovu varijaciju, kao i njihove poželjne načine ostvarivanja kako je opisano u nastavku.
[0037] Jedinjenje u skladu sa pronalaskom je peptid.
[0038] Jedinjenje u skladu sa pronalaskom poželjno ima dužinu manju od 1000 amino kiselina, manju od 500 amino kiselina, manju od 200 amino kiselina, poželjno manju od 150 amino kiselina, manju od 100 amino kiselina, manju od 90 amino kiselina, manju od 80 amino kiselina, manju od 70 amino kiselina, manju od 60 amino kiselina, manju od 50 amino kiselina ili manju od 40 amino kiselina.
[0039] U daljem poželjnom načinu ostvarivanja jedinjenje u skladu sa pronalaskom ima dužinu od između najmanje 20 i 1000 amino kiselina, poželjno između najmanje 25 i 500 amino kiselina, poželjnije između najmanje 30 i 200 amino kiselina, poželjnije između najmanje 34 i 150 amino kiselina, poželjnije između najmanje 34 i 100 amino kiselina, poželjnije između najmanje 34 i 90 amino kiselina, i još poželjnije između najmanje 34 i 80 amino kiselina, između najmanje 34 i 70 amino kiselina, između 34 i 60 amino kiselina, između 34 i 50 amino kiselina ili između 34 i 40 amino kiselina.
[0040] U poželjnijem načinu ostvarivanja jedinjenje u skladu sa pronalaskom se suštinski sastoji od sekvence amino kiseline kako je naznačeno.
[0041] Amino kiseline obuhvaćene u jedinjenjima u skladu sa pronalaskom mogu biti L- ili D-amino kiseline. Poželjno, amino kiseline obuhvaćene u jedinjenjima u skladu sa pronalaskom su L-amino kiseline. U nekim načinima ostvarivanja, određenije u slučajevima kada je poželjna visoka otpornost na proteolizu, mogu biti poželjne D-amino kiseline.
[0042] Jedinjenja koja inhibiraju aktivnost različitih kalijumovih kanala u isto vreme mogu imati značajna neželjena dejstva ako se primene na živi organizam zbog diferencijalne distribucije različitih kalijumovih kanala u različite tipove ćelija. Ovaj pronalazak stoga obezbeđuje jedinjenja, koja mogu da se selektivno vezuju za kalijumov kanal Kv1.3 u poređenju sa drugim kalijumovim kanalima, određenije u poređenju sa kalijumovim kanalom Kv1.1.
[0043] Pojam „selektivno vezivanje“ kako se ovde koristi odnosi se na poželjno vezivanje jedinjenja u skladu sa pronalaskom za Kv1.3 kanal preko drugih jonskih kanala i određenije preko drugih kalijumovih kanala poput npr. Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG ili Ca2+-aktiviranih K+ kanala velike provodnosti (BK kanali).
[0044] Poželjno, jedinjenje u skladu sa pronalaskom može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3 preko kalijumovog kanala Kv1.1. U ovom slučaju, jedinjenje u skladu sa pronalaskom se vezuje za Kv1.3 kanal sa značajno većim afinitetom u odnosu na Kv1.1 kanal.
[0045] U kontekstu ovog pronalaska toksin HsTx 1 se ne smatra jedinjenjem koje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3, pošto se takođe vezuje za i potentno inhibira Kv1.1 kanale.
[0046] U poželjnom načinu ostvarivanja jedinjenje koje se u skladu sa pronalaskom selektivno vezuje za Kv1.3 vezuje se za kalijumov kanal Kv1.3 sa Kdvrednošću koja je najmanje 2-struko, 5-struko, 10-struko, 100-struko, 1000-struko, 2000-struko, poželjno najmanje 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 ili 10000-struko manja u poređenju sa Kdvrednošću sa kojom se navedeno jedinjenje vezuje za Kv1.1 kanal. U daljem poželjnom načinu ostvarivanja jedinjenje koje se u skladu sa pronalaskom selektivno vezuje za Kv1.3 vezuje se za kalijumov kanal Kv1.3 sa Kdvrednošću koja je najmanje 4000, 5000 ili 10000-struko manja u poređenju sa Kdvrednošću sa kojom se navedeno jedinjenje vezuje za druge kalijumove kanale poput npr. Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG ili Ca2+-aktiviranih K+ kanala velike provodnosti (BK kanali).
[0047] U naročito poželjnom načinu ostvarivanja jedinjenje koje se u skladu sa pronalaskom selektivno vezuje za Kv1.3 vezuje se za kalijumov kanal Kv1.3 sa Kdvrednošću koja je najmanje 4000, 5000 ili 10000-struko manja u poređenju sa Kdvrednošću sa kojom se navedeno jedinjenje vezuje za Kv1.1 kanal.
[0048] U poželjnom načinu ostvarivanja, jedinjenje u skladu sa pronalaskom se vezuje za kalijumov kanal Kv1.3 obično sa Kdvrednošću između oko 0,1 nM i oko 250 nM, između oko 0,5 nM i oko 250 nM, između oko 1 nM i oko 225 nM, između oko 1 nM i oko 200 nM, još poželjnije između oko 1 nM i oko 100 nM, a najpoželjnije između oko 1 nM i oko 50 nM.
[0049] Jedinjenje u skladu sa pronalaskom se vezuje za druge kalijumove kanale, poput npr. Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG ili Ca2+-aktiviranih K+ kanala velike provodnosti (BK kanali) poželjno sa Kdvrednošću većom od 0,1 mM, većom od 0,2 mM, većom od 0,3 mM, većom od 0,4 mM ili većom od 0,5 mM. U naročito poželjnom načinu ostvarivanja jedinjenje u skladu sa pronalaskom se vezuje za Kv1.1 kanal sa Kdvrednošću većom od 0,1 mM, većom od 0,2 mM, većom od 0,3 mM, većom od 0,4 mM ili većom od 0,5 mM.
[0050] Jedinjenje u skladu sa pronalaskom se stoga poželjno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3 sa Kdvrednošću između oko 0,5 i oko 200 nM poput oko 1 ili 2 nM i oko 200 nM i za Kv1.1 kanal sa Kdvrednošću većom od 0,1 mM, većom od 0,2 mM, većom od 0,3 mM, većom od 0,4 mM ili većom od 0,5 mM. Poželjnije, jedinjenje u skladu sa pronalaskom se vezuje za kalijumov kanal Kv1.3 sa Kdvrednošću između oko 0,5 i oko 100 nM poput oko 1 ili 2 nM i oko 100 nM i za Kv1.1 kanal sa Kdvrednošću većom od 0,1 mM, većom od 0,2 mM, većom od 0,3 mM, većom od 0,4 mM ili većom od 0,5 mM. Još poželjnije, jedinjenje u skladu sa pronalaskom se vezuje za kalijumov kanal Kv1.3 sa Kdvrednošću između oko 0,5 i oko 50 nM poput oko 1 ili 2 nM i oko 50 nM i za Kv1.1 kanal sa Kdvrednošću većom od 0,5 mM.
[0051] Jedinjenje u skladu sa pronalaskom poželjno može da se selektivno vezuje za i blokira ili smanjuje aktivnost kalijumovog kanala Kv1.3. Jedinjenje u skladu sa pronalaskom može smanjiti aktivnost
1
kalijumovog kanala Kv1.3 za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% u poređenju sa kontrolnom grupom. U nekim poželjnim načinima ostvarivanja jedinjenje u skladu sa pronalaskom može blokirati aktivnost kalijumovog kanala Kv1.3 za 100%.
[0052] Mogućnost jedinjenja u skladu sa pronalaskom da se selektivno vezuje za i blokira ili smanjuje aktivnost Kv1.3 kanala može se testirati analizama poznatim u ovoj oblasti. Na primer, u jednom pristupu sisarske ćelijske linije koje ekspresuju Kv1.3 ili drugi kalijumov kanal, poput npr. Kv1.1, Kv1.2, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG ili large-conductance Ca2+-aktiviranih K+ kanala velike provodnosti (BK kanali), mogu doći u kontakt sa jedinjenjima ovog pronalaska, a struje kanala mogu se izmeriti postupkom lokalne fiksacije potencijala, kako je npr. opisano u Grissmer et al. (Mol Pharmacol 45; 1227-34 (1994)) ili u nastavku ovog dokumenta u odseku sa primerima. Svako jedinjenje može npr. biti testirano u različitim koncentracijama. Kdvrednost jedinjenja u skladu sa pronalaskom se može zatim npr. utvrditi prilagođavanjem Hilove jednačine izmerenom smanjenju vršne struje.
[0053] Treba shvatiti da postupci za utvrđivanje Kdkako je opisano npr. u Primeru 2 ne uzimaju u obzir broj kanala koji se mere, zbog čega u svrhu ovog opisa Kdodgovara IC50 vrednosti, tako da se pojmovi Kdi IC50 ovde koriste kao sinonimi. Treba shvatiti da se manje Kd vrednosti mogu posmatrati kada se koriste potpuno savijeni i prečišćeni peptidi naspram kompozicija koje obuhvataju nepotpuno savijene peptide (pogledati Primer 2).
[0054] U nekim načinima ostvarivanja jedinjenje u skladu sa pronalaskom može imati spojeno sa svojom N-terminus amino grupom ili svojom C-terminus karboksi grupom antitelo ili drugi molekul koji može da prepoznaje i cilja TEMćeliju.
[0055] Jedinjenja ovog pronalaska mogu se pripremiti upotrebom tehnika poznatih u ovoj oblasti. Na primer, peptid se može sintetizovati pomoću hemije čvrste faze Fmoc, npr. u skladu sa principima koje su početno opisali Merrifield (J. Am. Chem. Soc.85; 7129 (1963)) kako su kasnije modifikovali Meienhofer et al. (J. Peptid Prot. Res.13; 35 (1979)) i Fields, et al., Peptid Res.4; 95 (1991)). Takva sinteza se npr. može sprovesti na automatskim sintetizatorima peptida. Kada se sintetizuju, sekvence se mogu proveriti pomoću automatskog sekvencera peptida.
[0056] Kalijumovi kanali pomenuti u kontekstu ovog pronalaska, poput npr. kalijumovih kanala Kv1.1, Kv 1.2, Kv1.3, Kv1.5, Kv1.6, IKCa1, hERG ili Ca2+-aktiviranih K+ kanala velike provodnosti (BK kanali), su dobro poznati u ovoj oblasti. Stoga, stručnjak iz ove oblasti može jednostavno zadržati sekvence polinukleotida i amino kiseline ovih kanala i njihove ortologne i splajsovane izoforme iz bilo koje odgovarajuće javne baze podataka poput npr. NCBI baze podataka (npr. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/).
[0057] U drugom aspektu, ovaj opis se odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
1
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No:1);
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I;
X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S i X18=G,R,K.
[0058] U poželjnom načinu ostvarivanja, navedeno jedinjenje nije HsTx 1 (SEQ ID NO: 32).
[0059] U varijaciji drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 1,
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N;X12=K,D,A,R,E,V,L,I;
X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S i X18=G,R,K; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0060] U poželjnom načinu ostvarivanja, navedeno jedinjenje nije HsTx 1.
[0061] U poželjnom načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No:2);
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N i X18=G,R.; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0062] U poželjnom načinu ostvarivanja, navedeno jedinjenje nije HsTx 1.
[0063] U poželjnom načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 2,
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N i X18=G,R; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0064] U poželjnom načinu ostvarivanja, navedeno jedinjenje nije HsTx 1.
[0065] U poželjnom načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (SEQ ID No.:3); pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I;
X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=K,R, X15=Y,N,Q,T,S i X16=G,R,K.
1
[0066] U poželjnom načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 3,
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I;
X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=K,R, X15=Y,N,Q,T,S and X16=G,R,K; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3..
[0067] U poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (SEQ ID No.:4); pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=K,R, X15=Y,N i X16=G,R.
[0068] U poželjnijem načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 4,
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=K,R, X15=Y,N i X16=G,R; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3..
[0069] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T -G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (SEQ ID No.:5); pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I;
X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L i X16=K,R.
[0070] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 5,
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I;
X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L i X16=K,R; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0071] U poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (SEQ ID No.:6); pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G i X16=K,R.
[0072] U poželjnijem načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 6,
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
1
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G i X16=K,R; i pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0073] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (SEQ ID No.:7); pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I;
X13=E,Q,A,L,D,N,V,I i X14=K,R.
[0074] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se odnosi na sekvencu amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 7,
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I;
X13=E,Q,A,L,D,N,V,I i X14=K,R; i pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0075] U poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (SEQ ID No.:8); pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L i X14=K,R.
[0076] U poželjnijem načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 8,
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L i X14=K,R; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0077] U još poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No.: 9 (cgtx 538).
[0078] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.:10); pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P;
X7=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N i X10=K,D,A,R,E,V,L,I.
[0079] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 10,
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P;
X7=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N i X10=K,D,A,R,E,V,L,I; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
1
[0080] U poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.:11); pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=A,Y,I,L,W; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N i X10=K,D,A,R,E,V,L,I.
[0081] U poželjnijem načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 11,
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=A,Y,I,L,W; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N i X10=K,D,A,R,E,V,L,I; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0082] U još poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No.12 (cgtx 539).
[0083] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No:13);
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q,N;
X7=K,D,A,R,E,V,L,I i X8=E,Q,A,L,D,N,V,I.
[0084] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 13,
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q,N;
X7=K,D,A,R,E,V,L,I i X8=E,Q,A,L,D,N,V,I; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0085] U poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 14); pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=T,G,S,N,I; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q; X7=K,D,A,R i X8=E,Q,A,L.; i pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0086] U poželjnijem načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 14,
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=T,G,S,N,I; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q; X7=K,D,A,R i X8=E,Q,A,L; i pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0087] U još poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata sekvencu amino kiseline u skladu sa SEQ ID No.15 (cgtx 540).
[0088] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C (SEQ ID No.: 16);
2
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I;
X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,Q,T,S i X15=G,R,K.
[0089] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 16,
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I;
X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,Q,T,S i X15=G,R,K; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0090] U poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C (SEQ ID No.:17); pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N i X15=G,R.
[0091] U poželjnijem načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 17,
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N i X15=G,R; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0092] U još poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa pronalaskom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No.18 (cgtx 541) ili SEQ ID No.19 (cgtx 542).
[0093] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 20); pri čemu je X1= R,T,K,S,Y; X2=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X3=P,S,T; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E; X6=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X7=D,R,P,K,E,S,T,Y; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N; X10=K,D,A,R,E,V,L,I i X11=E,Q,A,L,D,N,V,I.
[0094] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 20,
pri čemu je X1= R,T,K,S,Y; X2=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X3=P,S,T; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E; X6=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X7=D,R,P,K,E,S,T,Y; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N; X10=K,D,A,R,E,V,L,I i X11=E,Q,A,L,D,N,V,I; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0095] U poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 21); pri čemu je X1=R,T,K; X2=T,G,S,N,I; X3=P,S; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E; X6=A,Y,I,L,W; X7=D,R,P,K,E,S; X8=P,H,V; X9=R,K,Q; X10=K,D,A,R i X11=E,Q,A,L.
[0096] U poželjnijem načinu ostvarivanja varijacije drugog aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 21, pri čemu je X1=R,T,K; X2=T,G,S,N,I; X3=P,S; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E; X6=A,Y,I,L,W; X7=D,R,P,K,E,S; X8=P,H,V; X9=R,K,Q; X10=K,D,A,R i X11=E,Q,A,L; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0097] U još poželjnijem načinu ostvarivanja drugog aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No.22 (cgtx 545).
[0098] U trećem aspektu, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No.:27);
pri čemu je X1=P,I,F,V,A,L,W; X2=K,S,T,Y,R; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S i X18=G,R,K.
[0099] U varijaciji trećeg aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 27,
pri čemu je X1=P,I,F,V,A,L,W; X2=K,S,T,Y,R; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S i X18=G,R,K; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0100] U poželjnom načinu ostvarivanja trećeg aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No.: 28);
pri čemu je X1=P,I,F; X2=K,S; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N i X18=G,R.
[0101] U poželjnom načinu ostvarivanja varijacije trećeg aspekta, ovaj opis se takođe odnosi na jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No: 28, pri čemu je X1=P,I,F; X2=K,S; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W;
X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N i X18=G,R; i
pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
[0102] U naročito poželjnom načinu ostvarivanja trećeg aspekta, jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID No.29 (cgtx 543), SEQ ID No.30 (cgtx 546) ili SEQ ID No.31 (cgtx 548).
[0103] Stoga, naročito je poželjno da jedinjenje u skladu sa opisom obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID NO.9, 12, 15, 18, 19, 22, 25, 26, 29, 30 ili 31.
[0104] U nekim načinima ostvarivanja, gore navedena jedinjenja koja obuhvataju ili se sastoje od sekvence amino kiseline u skladu sa SEQ ID NO.9, 12, 15, 18, 19, 22, 25, 26, 29, 30 ili 31 može obuhvatati između 0 i 5, tj.0,1,2,3,4 ili 5 supstitucija, brisanja ili umetanja amino kiseline, pod uslovom da jedinjenja i dalje mogu da se selektivno vezuju za i/ili blokiraju ili smanjuju aktivnost kalijumovog kanala Kv1.3. Jedinjenja sa takvim mutacijama amino kiseline se nazivaju varijante i takođe formiraju deo opisa.
[0105] Supstitucija može biti konzervativna ili nekonzervativna supstitucija, poželjno supstitucija je konzervativna supstitucija. Konzervativna supstitucija obuhvata supstituciju amino kiseline sa drugom amino kiselinom koja poseduje hemijsku karakteristiku sličnu amino kiselini koja je supstituisana. U nekim načinima ostvarivanja, supstitucija može takođe biti razmena prirodne amino kiseline sa neprirodnom amino kiselinom.
[0106] Pojmovi „brisanje amino kiseline“ i „umetanje amino kiseline“ se ovde koriste u skladu sa njihovim konvencionalnim i dobro poznatim značenjem u ovoj oblasti.
[0107] Ovaj pronalazak u drugom aspektu takođe obezbeđuje kodiranje nukleinske kiseline za sekvencu amino kiseline u skladu sa pronalaskom.
[0108] U kontekstu ovog pronalaska pojmovi „nukleinska kiselina“ ili „sekvenca nukleinske kiseline“ odnose se na prirodne ili sintetičke polimere deoksiribonukleotida ili ribonukleotida u jednolančanom ili dvolančanom obliku koji može da kodira datu sekvencu amino kiseline. Ovaj pojam takođe obuhvata derivate datog polimera deoksiribonukleotida ili ribonukleotida koji se mogu razlikovati od prvobitnog polimera deoksiribonukleotida ili ribonukleotida u tome što su jedan ili više nukleotida prvobitne sekvence supstituisani drugim nukleotidima i/ili (hemijski) modifikovani postupcima poznatim stručnjaku iz ove oblasti, pod uslovom da polimer deoksiribonukleotida ili ribonukleotida i dalje može da kodira svoju respektivnu sekvencu amino kiseline.
[0109] Stručnjaku iz ove oblasti će biti očigledno da se zbog degeneracije genetskog koda data sekvenca amino kiseline u skladu sa pronalaskom može kodirati pomoću različitih sekvenci nukleotida.
[0110] Ovaj opis u daljem aspektu takođe obezbeđuje vektor koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline u skladu sa pronalaskom.
[0111] Vektor može biti bilo koji molekularni nosač poput npr. plazmidnog vektora, virusnog vektora, vektora bakteriofaga ili bilo koji drugi nosač, koji sadrži jednu ili više sekvenci nukleotida u skladu sa pronalaskom i poželjno je projektovan za prenos između različitih ćelija domaćina. U poželjnom načinu ostvarivanja, vektor je prokariotski ili eukariotski ekspresioni vektor.
2
[0112] Pojam „ekspresioni vektor“ kako se ovde koristi odnosi se na vektor koji sadrži željenu sekvencu kodiranja i odgovarajuće DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane sekvence kodiranja i može da indukuje ekspresiju proteina u određenom organizmu domaćina (npr., bakterije, kvasac, biljka, insekt ili sisar) ili u in vitro ekspresionim sistemima. Ekspresioni vektori mogu obuhvatati funkcionalne elemente poput npr., promotora koji je operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koju treba transkribovati, sekvence završetka koja omogućava pravilan završetak transkripcije i selektabilnog markera. Stručnjak iz ove oblasti će shvatiti da će priroda promotora zavisiti od toga da li će se vektor koristiti u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćina. Za dobijanje stabilne ekspresije u produženom vremenskom periodu ekspresioni vektor može dalje obuhvatati poreklo replikacije (ORI). Odgovorajući ekspresioni vektori su poznati stručnjaku iz ove oblasti. U zavisnosti od toga da li će se ekspresija ostvariti u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćina ili u in vitro ekspresionim sistemima, vektori mogu biti prokariotski i/ili eukariotski ekspresioni vektori poput plazmida, kozmida, minihromozoma, bakterijskih faga, retrovirusnih vektora itd. Stručnjak iz ove oblasti će biti upoznat sa načinom odabira odgovarajućeg vektora u skladu sa konkretnim potrebama.
[0113] Ovaj opis se u drugom aspektu odnosi na ćeliju domaćina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline ili vektor u skladu sa pronalaskom.
[0114] U zavisnosti od područja primene, ćelija domaćina može biti prokariotska ili eukariotska ćelija domaćina. Tipične prokariotske ćelije domaćina uključuju bakterijske ćelije poput npr. Escherichia coli (E. coli). Tipične eukariotske ćelije domaćina uključuju npr. ćelije kvasca poput npr. Saccharomyces cerevisiae, ćelije insekata poput npr. Sf9 / Sf21 ćelija, biljne ćelije i sisarske ćelije poput npr. COS, CHO i HeLa ćelija.
[0115] Ovaj pronalazak u daljem aspektu se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata jedinjenje u skladu sa pronalaskom.
[0116] U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija u skladu sa pronalaskom može obuhvatati više od jednog jedinjenja u skladu sa pronalaskom. Na primer, farmaceutska kompozicija u skladu sa pronalaskom može obuhvatati 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 jedinjenja u skladu sa pronalaskom. U nekim poželjnim načinima ostvarivanja farmaceutska kompozicija pronalaska može obuhvatati jedno ili više jedinjenja u skladu sa pronalaskom, pri čemu su jedinjenja odabrana od grupe jedinjenja koja obuhvataju ili se sastoje od sekvence amino kiseline od SEQ ID NO.9, 12, 15, 18, 19, 22, 25, 26, 29, 30 ili 31.
[0117] Peptidi za koje se smatra da su naročito poželjni u ovom opisu za terapijsku upotrebu su peptidi od SEQ ID No.: 25 (cgtx-544), SEQ ID No.: 29 (cgtx 543), i SEQ ID No.: 9 (cgtx 538). Napominjemo da je većina eksperimenata navedenih u nastavku sprovedena upotrebom peptida SEQ ID No.: 25 (cgtx-544). Međutim, peptidi od SEQ ID No.: 29 (cgtx 543) i SEQ ID No.: 9 (cgtx 538) su takođe testirani za njihovu selektivnost naspram hERG i, na osnovu sličnosti njihove sekvence, stoga se čini razumnim zaključiti da se slični efekti kao i za ctgx 544 mogu primetiti i za ove peptide.
[0118] Ovi peptidi, kao i drugi ovde opisani peptidi, mogu se proizvesti postupcima poznatim u ovoj oblasti poput sinteze čvrste faze. Napominjemo da ovi peptidi obuhvataju ostatke cisteina i stoga mogu zahtevati aktivno savijanje u matično stanje radi ostvarivanja optimalne aktivnosti. Aktivnost se može dalje poboljšati prečišćavanjem potpuno savijenih peptida. Savijanje se može ostvariti podvrgavanjem sintetizovanih peptida oksidaciji radi stvaranja disulfidnih mostova između ostataka cisteina. Ovo se može ostvariti inkubacijom peptida u npr. fosfatnom puferu na pH od ∼8,0 u prisustvu atmosferskog kiseonika kako je opisano u Primeru 8. Nakon savijanja može uslediti masena spektrometrija, pošto će savijeni peptid iskazati blago smanjenu masu, što odgovara gubitku atoma vodonika tokom formiranja disulfidnog mosta. U slučaju ctgx 544 razlika u masi će biti 4212 naspram 4220.2 Da.
[0119] Prečišćavanje potpuno savijenih peptida može se ostvariti pomoću postupaka poznatih u ovoj oblasti poput HPLC prečišćavanja. Odgovarajući pristup je opisan u Primeru 8.
[0120] Farmaceutska kompozicija u skladu sa pronalaskom može se dati oralno, na primer u obliku inhalabilnih praškastih pilula, tableta, prevučenih tableta, šećerom obloženih tableta, granula, tvrdih i mekih želatinskih kapsula, vodenih, alkoholnih ili uljanih rastvora, sirupa, emulzija ili suspenzija, ili rektalno, na primer u obliku supozitorija.
[0121] Davanje se takođe može sprovesti intranazalno ili sublingvalno.
[0122] Davanje se dalje može sprovesti parenteralno, na primer subkutano, intramuskularno ili intravenski u obliku rastvora za ubrizgavanje ili infuziju. Drugi odgovarajući oblici davanja su, na primer, perkutano ili topikalno davanje, na primer u obliku masti, tinktura, sprejova ili transdermalnih terapijskih sistema, ili inhalativno davanje u obliku nazalnih sprejova ili kompozicija aerosoli.
[0123] Oblici davanja za koje se smatra da su naročito poželjni u ovom opisu su intravensko, intramuskularno ili subkutano davanje.
[0124] Za proizvodnju pilula, tableta, šećerom obloženih tableta i tvrdih želatinskih kapsula moguće je koristiti, na primer, laktozu, skrob, na primer kukuruzni skrob, ili derivate skroba, talk, stearinsku kiselinu ili njene soli, itd. Nosači za meke želatinske kapsule i supozitorije su, na primer, masti, voskovi, polučvrsti i tečni poliosoli, prirodna ili tvrda ulja, itd. Odgovarajući nosači za pripremu rastvora, na primer rastvora za ubrizgavanje ili emulzija ili sirupa su, na primer, voda, fiziološki rastvor natrijum hlorida, alkoholi poput etanola, glicerol, polioli, saharoza, invertovani šećer, glukoza, manitol, bilja ulja itd. Farmaceutske kompozicije takođe mogu sadržati aditive, na primer punioce, dezintegranse, vezivna sredstva, lubrikante, agense vlaženja, stabilizatore, emulzifikatore, disperzante, konzervanse, zaslađivače, kolorante, agense za dodavanje ukusa, aromatizere, agense zgušnjavanja, razređivače, puferske supstance, rastvarače, solubilizatore, agense za dostizanje depo efekta, soli za izmenu osmotskog pritiska, agense oblaganja ili antioksidanse.
[0125] Primeri odgovarajućih ekscipijenasa za ovde opisane različite oblike farmaceutskih kompozicija mogu se pronaći u "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller.
2
[0126] U nekim načinima ostvarivanja farmaceutske kompozicije mogu biti formulacije zadržanog oslobađanja.
[0127] U nekim načinima ostvarivanja farmaceutska kompozicija u skladu sa pronalaskom pored najmanje jednog jedinjenja u skladu sa pronalaskom može dalje obuhvatati druge imunosupresivne agense koji su pogodni za lečenje autoimunih bolesti. Primeri takvih imunosupresivnih agenasa uključuju npr. kortizol, hidrokortizol, deksametazon, ciklofosfamid, nitrozoureje, metotreksat, merkaptopurin, mitomicin C, bleomicin, mitramicin, ciklosporin, rapamicin, azatioprin, prednizon i deoksispergvalin i interferone.
[0128] U drugim poželjnim načinima ostvarivanja zasebne kompozicije koje obuhvataju gore navedene dodatne imunosupresivne agense mogu se davati sisaru kojem je to potrebno u kombinaciji sa farmaceutskom kompozicijom koja obuhvata jedno ili više jedinjenja u skladu sa pronalaskom.
[0129] U daljem aspektu ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje u skladu sa pronalaskom ili farmaceutsku kompoziciju u skladu sa pronalaskom za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koja uključuje efektorske memorijske ćelije (TEM-ćelije).
[0130] Ovaj pronalazak se poželjno odnosi na jedinjenje u skladu sa pronalaskom ili farmaceutsku kompoziciju u skladu sa pronalaskom za upotrebu u lečenju bolesti odabrane iz grupe koju čine autoimuna bolest, gojaznost, parodontitis i/ili odbijanje transplanta tkiva.
[0131] U svrhu ovog opisa pojam „lečenje“ se odnosi na kurativno ublažavanje bolesti, dok se pojam „prevencija“ odnosi na preventivnu profilaksu. Treba shvatiti da oba pojma ne podrazumevaju potpunu remisiju ili prevenciju respektivne bolesti, već da je prisutno poboljšanje u poređenju sa situacijom kada se nikakav farmaceutski aktivan agens ne daje iz kurativnih ili preventivnih razloga.
[0132] U naročito poželjnom načinu ostvarivanja ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenja u skladu sa pronalaskom ili farmaceutske kompozicije u skladu sa pronalaskom za upotrebu u lečenju ili prevenciji autoimune bolesti.
[0133] U kontekstu ovog pronalaska pojam „autoimuna bolest“ ili „autoimune bolesti“ odnosi se na stanje bolesti prouzrokovano neodgovarajućim imunim odgovorom koji je usmeren na samokodirani entitet, tj. autoantigen. Ovom definicijom je obuhvaćeno više poremećaja prouzrokovanih poremećajem imunog sistema koji omogućava telu da napadne sopstvena tkiva. U poželjnom načinu ostvarivanja, autoimuna bolest je autoimuni poremećaj posredovan T ćelijom.
[0134] Primeri autoimunih bolesti koje se mogu lečiti ili prevenirati pomoću jedinjenja i farmaceutskih kompozicija ovog pronalaska uključuju npr. multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, psorijazu, dijabetes tip-1, vaskulitis, Hašimotovu bolest, astmu, atopijski dermatitis, autoimune bolesti očiju, Sjogrenov sindrom, akutni diseminirani encefalomijelitis (ADEM), Adisonovu bolest, ankilozantni spondilitis, sindrom antifosfolipidnih antitela (APS), aplastičku anemiju, autoimuni hepatitis, autoimuni ooforitis, celijakiju, Kronovu bolest, gestacioni pemfigoid, Gudpasterov sindrom, Grejvsovu bolest, Gilen-Bareov sindrom, idiopatsku trombocitopenijsku purpuru, Kavasakijevu bolest, eritemski lupus, mijasteniju
2
gravis, opsoklonus mioklonus sindrom, optički neuritis, Ordov tiroiditis, pemfigus, pernicioznu anemiju, poliartritis (kod pasa), primarnu bilijarnu cirozu, Reiterov sindrom, Takajasuov arteritis, temporalni arteritis, toplu autoimunu hemolitičku anemiju, Vegenerovu granulomatozu, sistemski vaskulitis povezan sa ANCA, Čurg-Štrausov sindrom, mikroskopski poliangiitis, kolitis, zapaljenske bolesti creva, uveitis i psorijazni artritis.
[0135] Neke od ovih autoimunih bolesti su povezane sa TEM-ćelijama, na primer sistemski vaskulitis povezan sa ANCA (Abdulahad, Nephrology, 2009 vol.14 pp 26), Čurg-Štrausov sindrom, Vegenerova granulomatoza, mikroskopski poliangiitis (Berden, Artritis & Rheumatism, 2009, vol.60, pp 1578), ankilozantni spondilitis, Behčetova bolest, kolitis, Kronova bolest, zapaljenske bolesti creva, multipla skleroza, psorijaza, reumatoidni artritis, Sjogrenov sindrom, dijabetes melitus tip 1 (Ulivieri, Expert Rev. Vaccines, 2013 vol.12 pp 297), sistemski eritemski lupus (Devarajan, Immunol. Res, 2013 vol.57 pp 12), uveitis (Amadi-Obi, Nephrology, 2009, vol 14 pp 26) i psorijazni artritis (De Vlam, Acta Derm. Venereol, 2014, vol.94, pp 627).
[0136] Isto važi za gojaznost (Xu, Human Molecular Genetics, 2003, vol.12, pp 551).
[0137] S obzirom na to da je utvrđeno da ctgx544 selektivno deluje na TEM-ćelije i da ima dejstvo na reumatoidni artritis, čini se razumnom pretpostavka da se cgtx544 i drugi ovde opisani peptidi mogu koristiti za lečenje ili prevenciju takvih bolesti.
[0138] U poželjnom načinu ostvarivanja autoimuna bolest koja se leči ili prevenira pomoću jedinjenja i farmaceutskih kompozicija ovog pronalaska je odabrana iz grupe koju čine multipla skleroza, reumatoidni artritis, psorijaza, dijabetes tip-1 i vaskulitis.
[0139] Transplantacija organa ili tkiva u novog domaćina često može dovesti do odbijanja transplantovanog organa ili tkiva zbog imunog odgovora posredovanog T ćelijom u odnosu na novi organ ili tkivo (na primer srce, jetra, bubreg, pankreas ili koža). Ovaj pronalazak se stoga takođe odnosi na jedinjenje u skladu sa pronalaskom ili farmaceutsku kompoziciju u skladu sa pronalaskom za upotrebu u lečenju ili prevenciji odbijanja transplanta organa ili tkiva. Takođe se pokazalo da odbijanje transplanta organa uključuje TEM-ćelije (pogledati npr. Macedo, Transplantation, 2012 vol 93 pp 813). S obzirom na visoku selektivnost cgtx544 i drugih ovde opisanih peptida, čini se razumnom pretpostavka da se cgtx544 i drugi ovde opisani peptidi mogu koristiti za lečenje ili prevenciju takvih bolesti.
[0140] U drugom aspektu ovaj opis se odnosi na postupak lečenja ili prevencije autoimune bolesti, gojaznosti, parodontitisa i/ili odbijanja transplanta tkiva kod sisara davanjem jedinjenja u skladu sa pronalaskom ili farmaceutske kompozicije u skladu sa pronalaskom sisaru kojem je to potrebno.
[0141] Poželjno, autoimuna bolest je odabrana iz grupe koju čine multipla skleroza, reumatoidni artritis, psorijaza, dijabetes tip-1 i vaskulitis.
[0142] Pojam „sisar“ kako se ovde koristi uključuje npr. ljude, ne-ljudske primate, miševe, pacove, zečeve, zamorčiće, pse, mačke, goveda, konje, ovce, svinje, koze i slično. Poželjan sisar je čovek.
2
[0143] Jedinični dozni oblik farmaceutske kompozicije u skladu sa pronalaskom može sadržati bilo koju odgovarajuću efektivnu količinu jedinjenja u skladu sa pronalaskom srazmernu sa predviđenim dnevnim doznim opsegom koji će se koristiti.
[0144] Sisar kojem je potrebno davanje jedinjenja u skladu sa pronalaskom ili farmaceutske kompozicije u skladu sa pronalaskom je npr. sisar oboleo od ili pod rizikom od razvoja bolesti posredovane T ćelijama, poželjno autoimune bolesti posredovane T ćelijom. U poželjnom načinu ostvarivanja navedena autoimuna bolest je odabrana iz grupe koju čine multipla skleroza, reumatoidni artritis, psorijaza, dijabetes tip-1 i vaskulitis.
[0145] Ovaj opis u daljem aspektu se takođe odnosi na postupak proizvodnje jedinjenja u skladu sa pronalaskom, sekvence nukleinske kiseline u skladu sa pronalaskom, vektora u skladu sa pronalaskom ili farmaceutske kompozicije u skladu sa pronalaskom.
[0146] Ovaj opis se takođe odnosi na:
(1) Jedinjenje koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C
(SEQ ID No.: 1);
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P;
X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N;
X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S i X18=G,R,K.
U poželjnom načinu ostvarivanja, navedeno jedinjenje nije HsTx 1 (SEQ ID No.: 32)
(2) Jedinjenje u skladu sa (1) koje obuhvata sekvencu amino kiseline: X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No.: 2);
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N i X18=G,R.
U poželjnom načinu ostvarivanja, navedeno jedinjenje nije HsTx 1.
(3) Jedinjenje u skladu sa (1) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (SEQ ID No.: 3);
Pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P;
X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N;
X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=K,R, X15=Y,N,Q,T,S i X16=G,R,K.
2
(4) Jedinjenje u skladu sa (3) koje obuhvata amino sekvencu:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C (SEQ ID No.: 4);
pri čemu je X1=A,V,I X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=K,R, X15=Y,N i X16=G,R.
(5) Jedinjenje u skladu sa (1) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (SEQ ID No.: 5);
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3= R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N;
X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L i X16=K,R.
(6) Jedinjenje u skladu sa (5) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C (SEQ ID No.: 6);
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G i X16=K,R.
(7) Jedinjenje u skladu sa (1) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (SEQ ID No.: 7);
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N;
X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I i X14=K,R.
(8) Jedinjenje u skladu sa (7) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C (SEQ ID No.: 8);
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3= R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L i X14=K,R.
(9) Jedinjenje u skladu sa (8) koje obuhvata amino sekvencu od SEQ ID No.9.
(10) Jedinjenje u skladu sa (1) koje obuhvata sekvencu amino kiseline: X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 10);
2
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N i X10=K,D,A,R,E,V,L,I.
(11) Jedinjenje u skladu sa (10) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 11);
pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3= R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=A,Y,I,L,W;
X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N i X10=K,D,A,R,E,V,L,I.
(12) Jedinjenje u skladu sa (11) koje obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID No.12.
(13) Jedinjenje u skladu sa (1) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 13); pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q,N; X7=K,D,A,R,E,V,L,I i X8=E,Q,A,L,D,N,V,I.
(14) Jedinjenje u skladu sa (13) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 14); pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3=T,G,S,N,I; X4=P,S,T; X5=R,K,P; X6=R,K,Q; X7=K,D,A,R i X8=E,Q,A,L.
(15) Jedinjenje u skladu sa (14) koje obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID No.15.
(16) Jedinjenje u skladu sa (1) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C (SEQ ID No.: 16);
pri čemu je X1=A,V,I,L; X2=S,R,K,T,Y; X3= R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N;
X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,Q,T,S i X15=G,R,K.
(17) Jedinjenje u skladu sa (16) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-XI5-C (SEQ ID No.: 17);
Pri čemu je X1=A,V,I; X2=S,R,K; X3= R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E;
X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N i X15=G,R.
(18) Jedinjenje u skladu sa (17) koje obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID No.18 ili SEQ ID No.19.
(19) Jedinjenje u skladu sa (1) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 20);
pri čemu je X1=R,T,K,S,Y; X2=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X3=P,S,T; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E;
X6=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X7=D,R,P,K,E,S,T,Y; X8=P,H,V,I,L,A; X9=R,K,Q,N; X10=K,D,A,R,E,V,L,I i X11=E,Q,A,L,D,N,V,I.
(20) Jedinjenje u skladu sa (19) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C (SEQ ID No.: 21);
pri čemu je X1=R,T,K; X2=T,G,S,N,I; X3=P,S; X4=R,K,P; X5=D,Q,N,E; X6=A,Y,I,L,W; X7=D,R,P,K,E,S; X8=P,H,V; X9=R,K,Q; X10=K,D,A,R i X11=E,Q,A,L.
(21) Jedinjenje u skladu sa (20) koje obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID No.22.
(22) Jedinjenje koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (SEQ ID No.: 23),
pri čemu je X1=T,Q,S,Y,N; X2=I,F,V,A,L,W; X3=I,T,Y,S,V,A,L; X4=K,S,T,Y,R; X5= R,T,K,S,Y;
X6=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X7=P,S,T; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F;
X11=D,R,P,K,E,S,T,Y; X12=P,H,V,I,L,A; X13=R,K,Q,N; X14=K,D,A,R,E,V,L,I; X15=E,Q,A,L,D,N,V,I;
X16=Y,N,S,T,Q; X17=A,G,V,I,L; X18=K,R, X19=Y,N,Q,T,S i X20=G,R,K.
(23) Jedinjenje u skladu sa (22) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C (SEQ ID No.: 24);
pri čemu je X1=T,Q; X2=I,F; X3=I,T; X4=K,S; X5=R,T,K; X6=T,G,S,N,I; X7=P,S; X8=R,K,P; X9=D,Q,N,E; X10=A,Y,I,L,W; X11=D,R,P,K,E,S; X12=P,H,V; X13=R,K,Q; X14=K,D,A,R; X15=E,Q,A,L; X16=Y,N; X17=A,G; X18=K,R, X19=Y,N i X20=G,R.
(24) Jedinjenje u skladu sa (23) koje obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID No.25 ili SEQ ID No.26.
1
(25) Jedinjenje koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No.: 27);
pri čemu je X1=P,I,F,V,A,L,W; X2=K,S,T,Y,R; X3= R,T,K,S,Y; X4=T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y; X5=P,S,T; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F; X9=D,R,P,K,E,S,T,Y; X10=P,H,V,I,L,A; X11=R,K,Q,N; X12=K,D,A,R,E,V,L,I; X13=E,Q,A,L,D,N,V,I; X14=Y,N,S,T,Q; X15=A,G,V,I,L; X16=K,R, X17=Y,N,Q,T,S i X18=G,R,K.
(26) Jedinjenje u skladu sa (25) koje obuhvata sekvencu amino kiseline:
G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C (SEQ ID No.: 28);
pri čemu je X1=P,I,F; X2=K,S; X3=R,T,K; X4=T,G,S,N,I; X5=P,S; X6=R,K,P; X7=D,Q,N,E; X8=A,Y,I,L,W; X9=D,R,P,K,E,S; X10=P,H,V; X11=R,K,Q; X12=K,D,A,R; X13=E,Q,A,L; X14=Y,N; X15=A,G; X16=K,R, X17=Y,N i X18=G,R.
(27) Jedinjenje u skladu sa (26) koje obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID No.: 29, SEQ ID No.: 30 ili SEQ ID No.: 31.
(28) Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (13), (14), (17), (19), (20), (22), (23), (25) ili (26), pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3.
(29) Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (13), (14), (17), (19), (20), (22), (23), (25) ili (26), pri čemu jedinjenje može da se selektivno vezuje za kalijumov kanal Kv1.3 u poređenju sa kalijumovim kanalom Kv1.1.
(30) Kodiranje sekvence nukleinske kiseline za sekvencu amino kiseline kako je pomenuto u bilo kojem od (1) do (27).
(31) Vektor koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline u skladu sa (30).
(32) Ćelija domaćina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline u skladu sa (30) ili vektor u skladu sa (31).
(33) Farmaceutska kompozicija koja obuhvata jedinjenje u skladu sa bilo kojim od (1) do (29).
2
(34) Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od (1) do (29) ili farmaceutska kompozicija u skladu sa (33) za upotrebu u lečenju autoimune bolesti, gojaznosti, parodontitisa i/ili odbijanja transplanta tkiva.
(35) Upotreba jedinjenja u skladu sa bilo kojim od (1) do (29) ili farmaceutske kompozicije u skladu sa (33) u proizvodnji leka za lečenje ili prevenciju autoimune bolesti, gojaznosti, parodontitisa i/ili odbijanja transplanta tkiva.
(36) Postupak lečenja ili prevencije autoimune bolesti, gojaznosti, parodontitisa i/ili odbijanja transplanta tkiva kod sisara davanjem jedinjenja u skladu sa bilo kojim od (1) do (29) ili farmaceutske kompozicije u skladu sa (33) sisaru kojem je to potrebno.
(37) Postupak proizvodnje jedinjenja u skladu sa bilo kojim od (1) do (29) pomoću sekvence nukleinske kiseline u skladu sa (30), vektora u skladu sa (31) ili ćelije domaćina u skladu sa (32).
Primeri
Primer 1 – Elektrofiziološka merenja
[0147] Kalijumove struje su izmerene upotrebom Spodoptera frugiperda (Sf 21) ćelija, koje ekspresuju ljudski Kv1.3 (hKv1.3) kanal. Aktivnost kanala je indukovana nakon depolarizacije membrane sa naponima pozitivnijim od -40mV. Kinetika aktivacije je brza i izrazito zavisna od napona, dok je inaktivacija mnogo sporija i ne prikazuje značajniju zavisnost od napona. Kod Sf 21 ćelija hKv1.3 ima prosečnu amplitudu struje između 250 pA - 5 nA na 40mV.
[0148] 1 - 3 dana nakon infekcije kalijumove struje su zabeležene pomoću planarne tehnike lokalne fiksacije potencijala, upotrebom Port-A-Patch (Nanion Technologies GmbH). Jonske struje su aktivirane naponskim fazama do potencijala depolarizacije od 40mV za 200ms.
[0149] Sf 21 ćelije su kultivisane u Grejsovom medijumu ćelija insekata dopunjenim sa 10 % FBS (fetalni goveđi serum), 2 mM glutamina, 1x Yeastolate (iz 50x štok rastvora) i 0,1% Pluronic® F68 (BASF) do gustine ćelija od 2 - 3 x 10<6>ćelija/ml.
[0150] Elektrofiziološki puferi su bili sledeći:
Spoljašnji pufer: 160mM NaCl
4,5mM KCl
1mM MgCl2
2mM CaCl2
5mM D-glukoza monohidrat
10mM HEPES / NaoH pH7,4
Unutrašnji pufer: 75mM KCl
10mM NaCl
70mM K-fluorid
2mM MgCl2
10mM EGTA
10mM HEPES / KOH pH 7,2
[0151] Za demonstriranje selektivnosti ovde opisanih peptida (SEQ ID Nos.: 1 do 31 i određenije cgtx-544 (SEQ ID No.: 25), IC50-ovi su utvrđeni za vezivanje cgtx-544 za Kv1.3, Kv1.1 i Kv1.5. HsTx 1 (SEQ ID No.: 32) je testiran kao kontrola.
[0152] Peptidi su rastvoreni u 1 µg/µl u 20 mM NaPO4pufera pH 8,2 (1 mg u 1 ml savijenog pufera) i dijalizovani u odnosu na isti pufer 3x 1L, Float-a-Lyzer je odrezan 500 Da (Spectrapor) na sobnoj temperaturi.
[0153] HsTx 1 vezivanje je testirano pri različitim koncentracijama od npr.100 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, i 1 µM – u zavisnosti od testiranog kanala. Reprezentativna merenja za Kv 1.1, Kv1.3 i Kv1.5 su opisana na Fig.1 a), 1b), i 1 c) respektivno.
[0154] IC50 za HsTx 1 vezivanje za Kv1.3 je iznosilo 25 2,1 nM. IC50 za HsTx 1 vezivanje za Kv1.1 je iznosilo 11,3 µM. Nikakvo vezivanje nije detektovano za Kv1.5. Stoga HsTx 1 poseduje ∼450-struko veću selektivnost za Kv1.3 naspram Kv1.1.
[0155] Vezivanje cgtx-544 je testirano pri različitim koncentracijama od npr.1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 1µM, i 5µM – u zavisnosti od testiranog kanala. Reprezentativna merenja za Kv1.1, Kv1.3 i Kv1.5 su opisana na Fig.1 d), 1e), i 1) f, respektivno.
[0156] IC50 za vezivanje cgtx-544 za Kv1.3 je iznosilo 6,9 nM. Do koncentracije od 10 µM nikakvo vezivanje za Kv1.5 nije detektovano. Kv1.1 je blokiran na oko 22% na 10µM. Stoga cgtx-544 poseduje veću selektivnost za Kv1.3 naspram Kv1.1 u poređenju sa HsTx 1.
Primer 2 – Upoređivanje vezivanja za Kv1.3 i hERG
4
[0157] U sledećem primeru vezivanje odabranih peptida za Kv1.3 i hERG je upoređeno pomoću elektrofizioloških merenja.
Ćelijski sistemi
[0158] Radi utvrđivanja vezivanja za Kv1.3, upotrebljene su Jurkatove ćelije koje endogeno ekspresuju Kv1.3. Radi vezivanja za hERG, upotrebljene su HEK ćelije koje stabilno ekspresuju hERG.
Kultivisanje ćelija
[0159] Kultivisanje ćelija je sprovedeno pomoću standardnih tehnika kultivisanja ćelija. Ukratko, ćelije su uzgajane u posudama za kulturu od 10 cm ili T75 flaskovima za kulturu u medijumima na bazi DMEM. Sa konfluencijom od oko 60 - 80 %, ćelije su deljene svaka 2 - 3 dana. Za beleženje na Patchliner (Nanion), Jurkatove ćelije su resuspendovane, a zatim okrenute centrifugiranjem. Pre okretanja, HEK ćelije su tretirane pomoću tripsina, kako bi se odvojile od površine posude. Nakon okretanja, ćelije su resuspendovane u spoljašnjem puferu beleženja do gustine od otprilike 1 - 2 miliona ćelija po ml.
Unutrašnji rastvor za beleženje: 50 mM KCl
10 mM NaCl
60 mM KF
20 mM EGTA
10 mM HEPES/KOH, pH 7,2, (Osm: ∼290 mOsm)
[0160] 5 mM Mg-ATP i 0,3 mM Na-GTP je sveže dodato unutrašnjem rastvoru, a pH vrednost je podešena na 7,2.
Spoljašnji pufer za beleženje: 140 mM NaCl
4 mM KCl
1 mM MgCl2
2 mM CaCl2
5 mM D-glukoza monohidrat
10 mM HEPES/NaOH pH 7,4, (Osm: ∼298 mOsm)
Jedinjenja
[0161] Testirana su sledeća jedinjenja:
Jedinjenje 1: cgtx 538 Jedinjenje 2: cgtx 539 Jedinjenje 3: cgtx 540 Jedinjenje 4: cgtx 541 Jedinjenje 5: cgtx 542 Jedinjenje 6: cgtx 543 Jedinjenje 7: cgtx-544 Jedinjenje 8: cgtx 547
Elektrofiziološka merenja
[0162] Elektrofiziološka beleženja su sprovedena pomoću Patchliner, uz istovremeno beleženje do 8 kanala. Patchliner je automatski sistem lokalne fiksacije potencijala koji koristi komadiće borosilikatnog stakla (NPC-16) za planarnu lokalnu fiksaciju potencijala i koji radi preko PatchControlHT softvera. NPC-16 komadići sa otpornošću od 3-5 MΩ za Jurkatove ćelije i 2-3 MΩ za HEK ćelije su korišćeni za beleženje. Tokom beleženja, ćelije su sačuvane u „ćelijskom hotelu“ gde su periodično pipetirane goredole radi održavanja vijabilnosti. Ćelije su bile vijabilne tokom otprilike 2 - 3 sata.
PatchControlHT softver
[0163] Za upravljanje Patchliner-om na kompjuteru rade dva programa u isto vreme – Nanion-ov PatchControlHT i PatchMaster od HEKA.
[0164] PatchMaster upravlja HEKA EPC10 pojačivačima i sprovodi beleženja. Protokoli pulsa i onlajn analize mogu se generisati u ovom programu. PatchControlHT se koristi za definisanje potpune eksperimentalne rutine od hvatanja i zaptivanja ćelija do prelaska celokupne ćelije i dobijanja željenih beleženja. Dvosmerna komunikacija između PatchControlHT i PatchMaster omogućava PatchControlHT radi prilagođavanja radnji statusu ćelije (giga zaptivanje, konfiguracija celokupne ćelije).
[0165] Program u potpunosti usmerava robotičke funkcije Patchliner-a, uključujući pipetu za razmenu rastvora. Istovremeno, PatchControlHT takođe kontroliše pojačivač i iščitava sve važne parametre fiksacije iz PatchMaster-a. PatchControlHT je grafički korisnički interfejs, u kojem su definisani svi parametri i kriterijumi uspešnosti eksperimenta. Ako se kriterijumi uspešnosti ne ostvare za beleženje u bazenčiću, dostupna je mogućnost da PatchControlHT prekine beleženje iz tog određenog bazenčića.
Eksperimentalna rutina
[0166] Radi utvrđivanja odgovarajućih uslova beleženja, popunjavanje komadića, hvatanje ćelija, zaptivanje i prodiranje u celokupnu ćeliju su ostvareni standardnim funkcijama postupka Patchliner-a. Na kraju ove rutine, podešavanja pojačivača (npr. potencijal zadržavanja, spor kapacitet kompenzacije i dobijanja) su odgovarajuće postavljena za željena beleženja, a zatim je beleženje počelo.
[0167] U svakom eksperimentu, ćelije su tri puta isprane spoljašnjim rastvorom kako bi se obezbedila stabilna beleženja. Jedinjenja 1-8 su dalje testirana na ćelijama koje ekspresuju hERG. Vreme izloženosti svakog jedinjenja je bilo 4 minuta, a ukupno je svaki eksperiment trajao 24 minuta.
Naponski protokol
[0168] Za hERG: hERG struje su prouzrokovane pomoću protokola naponske faze iz potencijala zadržavanja od -80 mV do -40 mV za 500 ms nakon čega sledi faza od 40 mV za 500 ms, -40 mV test puls za 500 ms kako bi se dobila završna struja, a zatim vraćanje na potencijal zadržavanja. Ova faza je ponavljana svakih 10 sekundi.
[0169] Protokolima je kontinuirano upravljano i onlajn rezultati su kontinuirano očitavani. Ovo je sprovedeno kako bi se promene nastale usled ispiranja i/ili primene jedinjenja mogle pratiti i kako bi se procenilo dostizanje stanja mirovanja.
Analiza podataka
[0170] Beleženje i analiza podataka su sprovedeni sa 2x EPC10 Quadro pojačivačima, PatchMaster softverskim paketom (HEKA Electronics, Lambreht/Pfalc, Nemačka), Excel i Igor (WaveMetrics, SAD).
[0171] Za farmakologiju na hERG, vršna amplituda u drugoj -40 mV fazi (vršna struja) je izračunata pomoću funkcija onlajn analize u PatchMaster-u. Curenje (izračunato iz prve faze na -40 mV) je oduzeto od ovog vrha kako bi se izračunao stvarni vrh, a ovo se može obeležiti kao funkcija vremena.
[0172] Vrednosti su eksportovane u Excel kako bi se izračunale krive odgovora koncentracije u Igor-u. Fig. su nacrtane i eksportovane pomoću Igor-a (WaveMetrics, SAD). Krive odgovora koncentracije su napravljene u Igor-u. Hilova jednačina je prilagođena za procenu IC50 za svako jedinjenje, a IC50 je izračunato u odnosu na maksimalan blok. Vrednosti su predstavljene kao prosek ± S.E.M kada je to moguće.
Rezultati
Jedinjenja 1-8 testirana na hERG struji
[0173] Elektrofiziološka merenja jedinjenja 1-8 na Kv1.3 strujama su pokazala da su ovi peptidi aktivni. Stoga, jedinjenja 1-8 su testirana na hERG koja ekspresuje HEK ćelije. Radi ispitivanja dejstva ovih jedinjenja, sproveden je skrining postupak od dve tačke. Obično, 3 do 5 ćelija je testirano kako bi se obezbedila tačnost. Svaki eksperiment je počeo sa tri ispiranja kako bi se obezbedile stabilne struje. hERG struje su se blago povećavale, ali su postale stabilne nakon drugog ispiranja. Čini se da jedinjenje 1, 2, 4, 5, 7, i 8 imaju mala dejstva na hERG struju. Obično, dejstva jedinjenja 1-8 se takođe mogu objasniti dejstvima prekida rada hERG struja. Rezultati su prikazani na Fig.3. Sažetak srednje vrednosti strujnog bloka ± SEM svih jedinjenja je opisan u Tabeli 1.
Tabela 1
Dalja analiza
[0174] Gore navedena analiza je sprovedena nakon podvrgavanja respektivnih peptida protokolu savijanja kako je opisano u Primeru 8 bez prečišćavanja potpuno savijenih peptida.
[0175] Pored toga, cgtx-544 je savijen i prečišćen kako je gore opisano. Analiza je zatim ponovljena sa ovim cgtx-544 (Sing). Dalje, cgtx-544 (Sing) je zatim testiran na Kv1.3 inkubiranjem tokom dužih vremenskih perioda, konkretno oko 20 min – vreme koje više odgovara dužem vezivanju peptida. U ovim uslovima cgtx-544(Sing) prikazuje IC50 od oko 900pM nakon savijanja i prečišćavanja u poređenju sa 6,9nM neprečišćenog cgtx-544 (pogledati Primer 1). Rezultati su prikazani na Fig.35.
Primer 3 - Stabilnost cgtx-544 (SEQ ID No.: 25) u plazmi čoveka i pacova
1. Utvrđivanje stabilnosti ex vivo u uzorcima seruma čoveka i pacova
[0176] Cilj je bio testiranje stabilnosti peptida cgtx-544 u krvnoj plazmi sisara nakon različitih perioda inkubacije na sobnoj temperaturi (RT) i 37°C. Stabilnost je definisana kao IC50 vrednost cgtx-544 nakon različitih perioda inkubacije na RT i 37°C. Krvna plazma je pripremljena iz uzoraka sveže krvi zdravih pacova ili ljudi. Heparin je dodat uzorcima sveže krvi kako bi se sprečilo začepljenje. Priprema plazme je sprovedena centrifugiranjem tokom 2 min na 2000xg na RT.
[0177] IC50 od cgtx-544 je definisan pre početka eksperimenta – elektrofiziološka analiza je iznedrila IC50 vrednost od 46,1 nM ± 3,9 nM (za n= 5 ćelije). Pošto je peptid cgtx-544 upotrebljen u ovim eksperimentima nepotpuno savijen, utvrđen je IC50 veći od uobičajenog. Negativna kontrola pripremljene plazme čoveka i pacova nije prikazala nespecifično vezivanje komponenata plazme za Kv1.3 kanale ekspresovane u Sf21 ćelijama insekata.
[0178] Radi ispitivanja stabilnosti i aktivnosti u plazmi, peptid je dodat sveže pripremljenoj krvnoj plazmi čoveka i pacova u krajnjoj koncentraciji od 20 µM. Uzorci su podeljeni u dva alikvota i inkubirani na 37°C i na sobnoj temperaturi (RT, 20°C). Za elektrofiziološku analizu pripremljena su serijska razblaživanja uzoraka.
Vremenska Odmah nakon dodavanja peptida u plazmu, uzorci su analizirani i iskazali su izraziti tačka 0 h: afinitet za Kv1.3 kanale. Vrednost IC50 se poboljšala na 20,9 nM za cgtx-544 u plazmi čoveka i 15,0 nM u plazmi pacova (podaci nisu prikazani).
Vremenska Tokom naredna 24 sata nije mogla biti detektovana značajnija promena aktivnosti tačka 24 h: sondi peptida skladištenih na 37°C i RT.
Vremenska Nakon 48 sati aktivnost peptida inkubiranog na 37°C se smanjila i vrednosti IC50 od tačka 48 h: cgtx-544 inkubiranog u plazmi čoveka ili pacova je bila dva puta veća u odnosu na t= 0h (37,3 nM i 57,8 nM respektivno). Aktivnost cgtx-544 skladištenog na RT ostala je nepromenjena.
Vremenska Nakon 14 dana od inkubacije na 37°C nije detektovana nikakva aktivnost. cgtx-544 tačka 14 dana: sonde inkubirane u RT su iskazale neizmenjenu aktivnost.
Primer 4 - cgtx-544 (SEQ ID No.: 25) efikasnost na izolovanim ljudskim TEMćelijama
1. Analiza Kv1.3 struja u izolovanim ljudskim TEM
[0179] Ćelijska linija insekata Spodoptera frugiperda (Sf21) je upotrebljena u kombinaciji sa Baculovirus infekcionim sistemom za heterolognu ekspresiju rekombinantnih jonskih kanala. Sf21 ćelije nude izrazito specifičnu ekspresiju proteina i pravilne posttranslacione modifikacije koje za posledicu imaju funkcionalne kanale sa predloženom uporedivošću elektrofizioloških parametara jonskih kanala in vivo. Stoga, bilo je neophodno uporediti elektrofiziološke karakteristike kalijumovog selektivnog jonskog kanala Kv1.3 ekspresovanog u Sf21 ćelijama i endogeno ekspresovanih Kv1.3 kanala u TEMćelijama.
[0180] Za upoređivanje karakteristične aktivacije Kv1.3 kanala zavisne od napona upotrebljen je uobičajeni naponski protokol od -60 mV do 60 mV u fazama od 20 mV (puls aktivacije 200 ms). Ćelije su lokalizovane na potencijalu zadržavanja od -100 mV. Fig.4 prikazuje odgovor struje za dve pojedinačne Sf21 i TEMćelije (Fig.4A i 4B, respektivno) i protokol pulsa za aktivaciju Kv1.3 zavisnu od napona (Fig.4C).
[0181] Fig.5 prikazuje odgovarajuću normalizovanu korelaciju napona i struje. Kv1.3 počinje da se otvara pri depolarizaciji membrane iz potencijala zadržavanja (-100 mV) do -20 mV i dostiže svoje maksimalno otvoreno stanje na 60 mV. Iako je ekspresija Kv1.3 mnogo veća u Sf21 ćelijama, karakteristilčna aktivacija zavisna od napona ostaje nepromenjena.
[0182] Maksimalna primećena struja, koja jasno potiče od aktivnosti Kv1.3, i primenjeni napon omogućavaju procenu ukupne provodljivosti svih Kv1.3 kanala. U skladu sa tim, broj kanala se može izvući upotrebom poznate provodljivosti jednog Kv1.3 kanala. Maksimalna K+ izlazna struja se definiše kao razlika između aktiviranih neblokiranih i maksimalno blokiranih (pun blok) struja tokom prvih 20 % putanje struje. Izmenom uslova infekcije, moguće je kontrolisati nivo ekspresije Kv1.3 u Sf21 ćelijama, u
4
skladu sa potrebama ispitivanja. U našim standardnim uslovima maksimalna struja od 2 - 5 nA, provodnost od 33 - 50 nS i broj od 2500 - 3800 kanala po ćeliji se mogu proceniti.
[0183] Heterologni sistem ekspresije u Sf21 ćelijama prikazuje odgovarajući postupak za elektrofiziološku analizu farmakološki interesantnih jonskih kanala in vitro. Na osnovu ovih zapažanja, može se pretpostaviti da je savijanje i umetanje Kv1.3 jonskih kanala u membranu plazme Sf21 ćelija uporedivo sa matičnim Kv1.3 proteinima u TEMćelijama.
[0184] Može se jasno demonstrirati da heterologno ekspresovani Kv1.3 kanali mogu poslužiti kao model sistema za izučavanje usmeravanja leka procenom elektrofizioloških parametara. Specifični Kv1.3 blok je sproveden sa jedinjenjem peptida cgtx-544. Peptid iskazuje veliki afinitet na Kv1.3 kanalima kako je ranije prikazano i takođe je testiran na izolovanim ljudskim TEMćelijama (Fig.6). Napominjemo da je cgtx-544 upotrebljen u ovim eksperimentima nepotpuno savijen i iskazuje veći IC50 od uobičajenog. Ipak, jedinjenje je iskazalo iste vrednosti na Kv1.3 transfektovanim Sf21 ćelijama kao na ljudskim TEMćelijama (Fig.6).
Primer 5 - Terapija antigenom indukovanog artritisa sa peptidom cgtx-544 (SEQ ID No.: 25)
1. Eksperimentalni model
1. AIA - Antigenom indukovani artritis
[0185] Model bolesti antigenom indukovanog artritisa (AIA) kod pacova predstavlja autoimuni artritis zavisan od T ćelije koji podseća na mnoge karakteristike reumatoidnog artritisa kod ljudi. Stoga, ovaj sistem može poslužiti kao model bolesti za procenu terapijske uspešnosti ovde opisanih supresivnih peptida T ćelije. Jedna velika prednost ovog terapijskog pristupa u odnosu na trenutne terapije (npr. upotreba generalnih citostatika) jeste činjenica da je supresovan tek mali podskup imunog sistema oji je kauzalno uključen u generisanje bolesti, dok su druge važne komponente imune odbrane poput, na primer, urođenog imunog sistema i dalje netaknute. Pored toga, ovaj model bolesti omogućava testiranje efikasnosti i tolerancije cgtx-peptida in vivo.
2. Indukovanje artritisa
[0186] Celokupan eksperiment se odvija u vremenskom periodu od 4 nedelje. Predimunizacija se odvija dana -21 (početak eksperimenta) i dana -14 subkutanim ubrizgavanjem kompozicije mBSA i M. tuberculosis preparata u nekompletnom Frojndovom adjuvansu (IFA). Lokalno indukovanje zapaljenje u zglobu jednog kolena je indukovano jednim intra-artikularnim ubrizgavanjem antigena mBSA u desno koleno dana 0. U ovom eksperimentalnom sistemu drugi (levi) netretirani zglob kolena služi kao intraindividualna kontrola.
[0187] Tretirani zglobovi kolena razvijaju ozbiljnu reakciju otoka u prvim satima nakon indukovanja, koja obično dostiže maksimalan otok u danima 1 i 2 nakon indukovanja. Ovaj fenotip je stabilan tokom preostala 2 do 3 dana, a nakon toga otok se ponovo smanjuje.
[0188] Ova šema omogućava indukovanje lokalnog reproducibilnog artritisa kod >95% eksperimentalnih životinja. U negativnim kontrolnim eksperimentima ista količina (kao za mBSA indukovanje rastvora) od 0,9% NaCl je data u koleno kontrolnih životinja (pogledati Fig.7 i 8).
2. Materijal i postupci
2.1 Životinje
[0189] Ženke Luisovih pacova, telesne mase (BW) od 180-200g, oko 8 nedelja starosti, Janvier, Francuska Životinje su držane u konvencionalnim kućnim uslovima - 5 životinja po kavezu od makrolona tip IV, sa hranom i vodom ad libitum po ritmu od 12 sati danju/noću, na sobnoj temperaturi od 22 /-2°C sa vlažnošću vazduha od 55 /- 5%.
2.2. Proizvodnja emulzije za imunizaciju, imunizaciju životinja i indukovanje lokalnog artritisa
2.2.1. Emulzija za imunizaciju i postupak imunizacije
[0190]
2.2.1.1. Materijal: Mycobacterium tuberculosis H37 Ra (BD 231141)
Nekompletni Frojndov adjuvans (Sigma F5506)
mBSA (Sigma A1009-1G)
0,9% NaCl (Braun)
Izofluran (Abbott)
2.2.1.2. Emulzija u predimunizaciji:
[0191]
Rastvor mBSA štok rastvor (50mg/ml): Dodavanje 20 ml vode ubrizgane u 1 ampulu mBSA (1g) u A: aseptičkim uslovima. Sterilni rastvor se može skladištiti na 4°C tokom nekoliko meseci.
Rastvor Štok rastvor (10mg/ml) za kompletan Frojndov adjuvans (CFA): Dodavanje 10ml (1 ampula) B: nekompletnog Frojndovog adjuvansa u 1 ampulu M. tuberculosis koja sadrži 100 mg bakterija.
Rastvor se može skladištiti na 4°C tokom 1 meseca.
Priprema kompozicije
[0192] Obe komponente su pomešane u jednakim količinama, što za rezultat ima emulziju (mešanje u aseptičkim uslovima na čistom probnom stolu). Komponente su pipetovane u Falcon cev od 15 ml ili 50 ml kako je opisano u nastavku:
1. Rastvor A - mBSA štok rastvor
2. Rastvor B - M. tuberculosis rastvor.
[0193] Neposredno nakon dodavanja komponenata, cev je vorteksovana tokom 20 sekundi. U poslednjoj fazi rastvor je emulzifikovan pomoću ultrazvučnog procesora (0,5 ciklusa sa amplitudom od 60%) do formiranja guste emulzije.
2.2.1.3. Predimunizacija
[0194] Životinje su predimunizovane dva puta pre finalnog indukovanja artritisa. Predimunizacije su se odvijale dana -21 i dana -14. U ovim vremenskim tačkama imunizacioni rastvor je ubrizgan subkutano. Nakon indukovanja narkoze sa 5% izoflurana, anestezija je zadržana sa 2% izoflurana. Ukupno 500 µl emulzifikovanog rastvora je primenjeno upotrebom braunile od 25 G.125 µl predimunizacione emulzije je ubrizgano subkutano sa 2 strane (desno i levo) korena repa, kao i sa 2 strane iznad leve i desne lopatice.
2.2.1.4. Indukovanje lokalnog artritisa
[0195] Dana 0 artritis je indukovan intra-artikularnim davanjem antigena (500 µg mBSA u 50 µl 0,9% NaCl) u zglobu desnog kolena. Levo koleno je ostavljeno netaknuto kao intra-individualna kontrola. Životinje su narkotizovane, a mesto ubrizgavanja je dezinfikovano. Primena je sprovedena pomoću kratke i fine braunile (30 G, 1/2) kako bi se minimizovalo oštećenje tkiva. Nakon davanja antigena i povlačenja braunile, zglob je lagano savijan i izduživan nekoliko puta.
2.2.2. Merenje otoka zgloba kolena
4
[0196] Sagitalni prečnik zgloba kolena je utvrđen pomoću merila. Eksperimentalne životinje su narkotizovane tokom kratkog vremenskog perioda i postavljene na leđa. Noga je podešena na ugao od 90 stepeni, a merenje sagitalnog prečnika kolena je sprovedeno tri puta.
2.2.3. Povlačenje krvi
[0197] Za povlačenje krvi životinje su nakratko narkotizovane, rep je dezinfikovan i vena repa je probijena braunilom, 50 µl krvi je povučeno pomoću pipete obložene heparinom i pomešano sa 5 µl agensa stabilizacije (CPD) i 1 µl heparina (1,5 U/µl razblaženo 1:4 u 0,9% NaCl).
2.2.3. Hematologija
[0198] Bele krvne ćelije (WBC) su izbrojane pomoću Coulter Counter-a u automatskom režimu.
2.2.4. Merenje telesne mase
[0199] Telesna masa eksperimentalnih životinja je merena jednom dnevno između 8:00 i 9:00.
2.2.5. Kliničko ispitivanje i merenje otoka zglobova kolena
[0200] Nakon indukovanja lokalnog artritisa eksperimentalne životinje su ispitivane na dnevnoj bazi. Otok zglobova kolena je izmeren i zabeleženo je opšte zdravstveno stanje.
2.3. Lečenje eksperimentalnih životinja
[0201] Lečenje žiVotinja je započeto dana -3 primenom peptida cgtx-544 (SEQ ID No.25) sa doziranjem 1 mg/kg telesne mase (BW) u količini od 0,6 ml 0,9% NaCl ili alternativno za kontrolne životinje sa istom količinom od 0,9% NaCl (ekscipijens). Peptid ili ekscipijens, respektivno, je dat i.v. u venu repa narkotizovanih životinja. Lečene životinje su posmatrane tokom otprilike jednog sata nakon lečenja.
3. Rezultati
[0202] Tokom faze predimunizacije eksperimentalne životinje su intenzivno praćene i u danima -21, -14, -7, 0 i 7 uzorci krvi su povučeni za praćenje imunog statusa životinja. Bila je prisutna veoma dobra korelacija između razvoja zapaljenja i brojeva belih krvnih ćelija (WBC, leukociti) u perifernoj krvi u odgovarajućim vremenskim tačkama analize.
[0203] Broj WBC-ova u perifernoj krvi nedavno imunizovanih životinja (dan - 21 i dan - 14) se drastično povećava u poređenju sa netretiranim životinjama (pogledati Fig.9). Broj WBC-ova dostiže maksimum između dana -14 i -7 i kasnije se smanjuje. Povećanje WBC-ova je u korelaciji sa ozbiljnošću zapaljenja indukovanog imunizacijom.
[0204] Odmah nakon indukovanja lokalnog artritisa WBC-ovi pokazuju kratkoročno povećanje (pogledati Fig.9). Međutim, ovo kratkoročno povećanje je manje pošto je zapaljenski odgovor lokalizovan.
Kontrolne životinje koje su imunizovane sa 0,9% NaCl nisu pokazale bilo kakvu razliku u broju WBC.
[0205] Predimunizovane životinje razvijaju ozbiljnu reakciju otoka desnog zgloba kolena samo nekoliko sati nakon indukovanja lokalnog artritisa putem mBSA-ubrizgavanja (pogledati Fig.8). Sa druge strane, netretirano levo koleno koje služi kao intra-individualno kontrolno koleno ne pokazuje nikakve znake reakcije otoka.
[0206] Upoređivanje životinja tretiranih peptidom cgtx-544 sa netretiranim (ekscipijens) kontrolnim životinjama otkriva nam da tretman pomoću cgtx-544 dovodi do jasnog smanjenja otoka zgloba kolena u poređenju sa netretiranim kontrolnim životinjama (pogledati Fig.10). Može se zaključiti da životinje tretirane pomoću cgtx-544 pokazuju očigledno smanjenje otoka zgloba kolena i brže povlačenje otoka u poređenju sa netretiranim kontrolnim životinjama.
Primer 5a – Preventivna efikasnost peptida cgtx-544 u AIA modelu pacova od RA
1. Materijal i postupci
[0207] Nakon dve imunizacije dana -21 i dana -14 sa emulzijom antigena mBSA u kompletnom Frojndovom adjuvansu i 750 µg toplotom inaktivirane Mycobacterium (M.) tuberculosis, AIA je indukovan intra-artikularnim ubrizgavanjem metilisanog BSA dana 0 u desnom kolenu kako je opisano u Primeru 5. Za ispitivanje efikasnosti peptida cgtx-544, pacovi su primili dnevna intravenska ubrizgavanja od 0,1, 1 ili 5 mg/kg peptida cgtx-544 (mali, srednji i veliki dozni nivo) počev od dana -3 ili nosača (0,9 % NaCl) za period od 10 dana (dan -3 do dana 6).
[0208] Ozbiljnost artritisa je praćena merenjem prečnika zgloba kolena u triplikatima pomoću merila. Vrednosti su normalizovane do dana -21. Razlika vrednosti otoka kolena je izračunata oduzimanjem prečnika levog (neindukovanog) od desnog (indukovanog) kolena.
[0209] Uzorci krvi su redovno uzimani za praćenje hematoloških parametara. Hematološki parametri su procenjeni kod svih životinja na nedeljnom nivou pre indukovanja, na dan indukovanja i 10 dana nakon indukovanja (dani -21, -14, -7, 0 i 10). Hematološki podaci za netretirane životinje (day -21) su uporedivi sa onim zabeleženim u literaturi (Waynforth & Flecknell, 1992). Između ostalog, apsolutni brojevi belih
4
krvnih ćelija (WBC), neutrofilnih granulocita i limfocita su analizirani, pri čemu su poslednja dva takođe navedena u procentima ukupnog broja WBC. EDTA celokupna krv sedam pojedinaca iz nosača i grupe koja prima terapiju peptidom cgtx-544 je izmerena pomoću Sysmex XT-2000i.
2. Rezultati
[0210] Svi testirani dozni nivoi cgtx-544 (0,1, 1, i 5mg/kg BW) su pokazali jasno smanjenje, dozno zavisno i statistički značajno dejstvo na otok kolena kod tretiranih životinja (Fig.18).
[0211] Za statističku analizu rezultata upotrebljen je Velšov t-test dva uzorka. U nastavku, statističke analize svih testiranih doznih nivoa cgtx-544 (0,1, 1, i 5mg/kg BW) su prikazani za dan 1 i 3. Svi testirani dozni nivoi su pokazali statistički značajno smanjenje otoka kolena u poređenju sa kontrolnom grupom nosača (Fig.19).
[0212] Ukratko, terapija peptidom cgtx-544 u AIA modelu je imala snažno dejstvo na zapaljenske simptome artritisa, naročito na otok kolena sa maksimalnim smanjenjem od 70 %. Nakon sedam dana lečenja, prečnici kolena u terapijskoj grupi su se dalje smanjili na prečnik koji je skoro uporediv sa neindukovanim intra-individualnim kontrolnim kolenom. Dalje, WBC, neutrofilni granulociti i limfociti (podaci nisu prikazani) pojedinaca lečenih peptidom cgtx-544 su pokazali apsolutne i relativne brojeve ćelija u poređenju sa pojedincima tretiranim nosačem.
Primer 5B – Kurativna efikasnost cgtx-544 kod AIA modela pacova od RA
1. Materijali i postupci
[0213] Nakon dve imunizacije dana -21 i dana -14 sa emulzijom antigenskog mBSA u kompletnom Frojndovom adjuvansu i 750 µg toplotom inaktivirane Mycobacterium (M.) tuberculosis, AIA je indukovana intra-artikularnim ubrizgavanjem metilisanog BSA dana 0 u desnom kolenu kako je opisano gore u Primeru 5. Za ispitivanja efikasnosti peptida cgtx-544, pacovi su primili dnevna intravenska ubrizgavanja od 1 mg/kg peptida cgtx-544 počev od dana 0 odmah nakon indukovanja artritisa ili počev od dana 1. Kontrolne životinje su primile dnevne injekcije nosača (0,9 % NaCl).
[0214] Ozbiljnost artritisa je praćena merenjem prečnika zgloba kolena u triplikatima pomoću merila. Vrednosti su normalizovane do dana -21. Razlike u vrednostima otoka kolena su izračunate oduzimanjem prečnika levog (neindukovanog) od desnog (indukovanog) kolena.
2. Rezultati
4
[0215] Obe testirane vremenske tačke lečenja počinju sa cgtx-544(Mix) (1 mg/kg BW) iskazalo je jasno smanjenje i statistički značajno dejstvo na otok kolena kod tretiranih životinja (Fig.20).
[0216] Za statističku analizu rezultata, upotrebljen je Velšov t-test dva uzorka. U nastavku, statistička analiza oba režima lečenja pomoću cgtx-544 (d0 i d1) je prikazana za dan 1, 2 i 3. Oba režima lečenja su iskazala statistički značajno smanjenje otoka kolena u poređenju sa kontrolnom grupom nosača (Fig. 21).
[0217] Vremenski tok broja belih krvnih ćelija (WBC) je prikazan na Fig.22. Vremenski tok neutrofila je prikazan na Fig.23. Vremenski tok limfocita je prikazan na Fig.24.
[0218] Lečenje pomoću cgtx-544(Mix) pokazuje značajno smanjenje otoka zgloba kolena.
Pretpostavljeno je da je preostali otok kod tretiranih životinja uzrok reakcije antitela/antigena. Stoga, imunizovane životinje, kao i životinje sa naivnim ćelijama, testirane su za prisustvo mBSA specifičnih antitela. Antitela protiv mBSA mogu se detektovati kod svih imunizovanih životinja grupa H i I sedam dana nakon indukovanja artritisa (Fig.27). Životinje sa naivnim ćelijama (eksperimentalna grupa F) nisu iskazale reaktivnost na mBSA. Čini se da terapija pomoću cgtx-544 ne sprečava formiranje B-limfocita i antitela. Pored toga, imunizovane životinje nakon 10 dana pod terapijom peptidom cgtx-544 nisu iskazale nikakvu reaktivnost na cgtx-544(Mix) (fuzioni protein L544-2a sa trx-tag, podaci nisu prikazani).
[0219] Ukratko, terapija peptidom cgtx-544 u AIA modelu imala je snažno dejstvo na simptome zapaljenskog artritisa, naročito na otok kolena sa maksimalnim smanjenjem od 40 % ako je terapija počela dana 0 odmah nakon indukovanja artritisa ili 58 % ako je terapija počela dana 1. Nakon sedam dana lečenja, prečnici kolena u terapijskim grupama su se smanjivali do prečnika koji je skoro uporediv sa neindukovanim intra-individualnim kontrolnim kolenom. Dalje, WBC, neutrofilni granulociti i limfociti pojedinaca tretiranih peptidom cgtx-544 su iskazali apsolutne i relativne brojeve ćelija u poređenju sa pojedincima tretiranim nosačem.
Primer 5C – Zadržana efikasnost cgtx-544(Mix) u AIA modelu pacova od RA
[0220] Prethodni eksperimenti (pogledati Primere 5A i 5B) su pokazali da cgtx-544 poseduje izuzetnu efikasnost u AIA modelu pacova u različitim režimima tretmana – kurativnom i preventivnom – kada se primenjuje na dnevnom nivou. Pokušali smo da pojasnimo koliko se dugo aktivnost cgtx-544 zadržava u AIA modelu kako bismo imali nagoveštaj koliko će dugo trajati intervali tretmana pomoću cgtx-544. Stoga je ustanovljen režim kurativnog tretmana sa šemom primene jednom nedeljno.
1. Materijali i postupci
[0221] Nakon dve imunizacije dana -21 i dana -14 sa emulzijom antigenskog mBSA u kompletnom Frojndovom adjuvansu i 750 µg toplotom inaktivirane Mycobacterium (M.) tuberculosis, AIA je
4
indukovana intra-artikularnim ubrizgavanjem metilisanog BSA dana 0 u desnom kolenu kako je opisano gore u Primeru 5. Za efikasnost peptida cgtx-544 i ispitivanja dejstva zadržane terapije, pacovi (10 pojedinaca) su primili jedno intravensko ubrizgavanje 1 mg/kg peptida cgtx-544 dana 1 (d1) nakon indukovanja artritisa. Dana 4 (d4) grupa koja prima terapiju cgtx-544 je podeljena u dve podgrupe od 5 pojedinaca. Prva podgrupa je primila drugo ubrizgavanje cgtx-544 kako bi se procenilo da li će drugo ubrizgavanje voditi daljem smanjenju otoka. Druga podgrupa nije primila dodatnu dozu. Kontrolne životinje su primile jedno ubrizgavanje nosača (0,9 % NaCl) dana 1.
[0222] Ozbiljnost artritisa je praćena merenjem prečnika zgloba kolena u triplikatima pomoću merila. Vrednosti su normalizovane do dana -21. Razlike u vrednostima otoka kolena su izračunate oduzimanjem prečnika levog (neindukovanog) od desnog (indukovanog) kolena.
2. Rezultati
[0223] Jedno ubrizgavanje (1 x d1) sa cgtx-544 (1 mg/kg BW) pokazalo je jasno i statistički značajno smanjenje otoka kolena kod tretiranih životinja 24 h nakon primene (Fig.25). Otok se ponovo mogao smanjiti na značajnu vrednost nakon drugog ubrizgavanja dana 4 (1 x d1 i 1 x d4). Otoci kolena su ostali na istom nivou i nisu se povećavali nakon prvog i drugog ubrizgavanja.
[0224] Za statističku analizu rezultata upotrebljen je Velšov t-test sa dva uzorka. U nastavku, statistička analiza oba režima tretmana cgtx-544 (1 x d1 ili 1 x d1 i 1 x d4) je prikazana za dan 2 (pre nego što je grupa podeljena) i dan 5 (podeljene grupe). Oba režima tretmana su pokazala statistički značajno smanjenje otoka kolena 24 h nakon svakog ubrizgavanja u poređenju sa kontrolnom grupom nosača (Fig.26).
[0225] Ukratko, terapija peptidom cgtx-544 u AIA modelu je imala snažno i zadržano dejstvo na simptome zapaljenskog artritisa, naročito na otok kolena sa početkom smanjenja otoka 24 h nakon jednog ubrizgavanja. Čak i tri dana nakon jednog ubrizgavanja, peptid cgtx-544 je pokazao zadržanu aktivnost i kliničko dejstvo, pri čemu je nivo otoka kolena ostao konstantan. Stoga, peptid ne mora da se daje na dnevnom nivou za zadržano terapijsko dejstvo u AIA modelu pacova. Stoga se mogu dostići intervali tretmana od 3-4 dana za i.v. davanje (ili duže za potencijalan s.c. put davanja).
Primer 6 – Upoređivanje terapije Metotreksatom (MTX) sa terapijom peptidom cgtx-544 (SEQ ID No.: 25) u AIA modelu pacova
1. Upoređivanje terapije Metotreksatom (MTX) sa terapijom cgtx-544 (SEQ ID No.: 25) u AIA modelu pacova
4
[0226] U zavisnosti od oblika i ozbiljnosti bolesti, terapija metotreksatom (MTX) se razlikuje u dozi i režimu. U poređenju sa standardnim terapijama, ispitali smo terapiju velikom dozom MTX sa 1mg/kg telesne mase 1 x nedeljno s.c. (grupa J, n=7) i terapiju malom dozom MTX sa 100 µg/kg telesne mase 1 x dnevno i.v. (grupa L, n=7) u AIA modelu pacova. Terapija velikom dozom MTX počela je prvog dana eksperimenta (dan -21) i davana je još tri puta (dan -14, - 7, 0). Terapija malom dozom MTX je počela tri dana pre indukovanja artritisa (dana -3) i potrajala je još sedam dana nakon indukovanja artritisa. Rezultati su upoređivani sa grupom koja prima terapiju cgtx-544 I (1 mg/kg telesne mase cgtx-544, isti režim kao grupa L) i kontrolnom grupom nosača H (0,9 % NaCl 1 x dnevno i.v. počev od dana indukovanja, dan 0). Ozbiljnost artritisa je praćena merenjem prečnika zgloba kolena u triplikatima pomoću merila. Uzorci celokupne krvi EDTA su uzimani redovno radi praćenja imunog statusa.
1.1 Svođenje otoka kolena na manju meru terapijom MTX u poređenju sa terapijom cgtx-544
[0227] Prvo, parametri kolena terapijskih grupa velike doze (J) i male doze (L) MTX se upoređuju sa kontrolnom grupom nosača (H), kako bi se pokazale moguće razlike u efikasnosti u zavisnosti od doze i režima. Drugo, tri grupe sa istim režimom (dnevna i.v. primena) su upoređene, terapijska grupa male doze (L) MTX, terapijska grupa cgtx-544 (I) i kontrolna grupa nosača (H). Razlika apsolutnog povećanja otoka je izračunata oduzimanjem prečnika levog (neindukovanog) od desnog (indukovanog) kolena. Izračunata razlika na početku eksperimenta obe terapijske grupe velike doze i male doze MTX je bila blizu nule (0,01 ± 0,06 mm i 0,0 ± 0,03 mm respektivno), pošto je veličina oba kolena uporediva. Jedan dan nakon indukovanja artritisa, razlika se povećava do 3,17 ± 1,26 mm i 3,45 ± 0,87 mm, respektivno (Fig.11).
[0228] Za razliku od grupe koja prima terapiju cgtx-544, smanjenje otoka nije sasvim brzo u poređenju sa kontrolnom grupom nosača koja ima apsolutnu razliku od 3,79 ± 1,10 mm (Fig.12).
[0229] Za normalizaciju vrednosti sa preračunavanjem između 0 i 1, relativno povećanje otoka je podešeno na 0 na početku eksperimenta (dan -21), a razlika relativnog povećanja otoka je izračunata kao i ranije. Relativna razlika terapijske grupe velike doze i male doze MTX je svedena na 0,39 ± 0,16 i 0,43 ± 0,11, respektivno (Fig.13).
[0230] Poređenja radi, kontrolna grupa nosača i grupa koja prima terapiju cgtx-544 su svedene na 0,46 ± 0,14 i 0,18 ± 0,05, respektivno (Fig.14). Na kraju, u odnosu na kontrolnu grupu nosača primetili smo prosečno smanjenje otoka kolena od 15 % kod pacova koji primaju terapiju velike doze MTX i 7 % kod pacova koji primaju terapiju male doze MTX, u poređenju sa 60 % kod pacova koji primaju terapiju cgtx-544 24 h nakon indukovanja artritisa.
1.2 Citostatičko dejstvo MTX na proliferacione ćelije
4
[0231] Za skrining zdravstvenog stanja svih pojedinaca, ponovo su upotrebljeni kompletni hemogrami. EDTA celokupna krv sedam pojedinaca iz terapijske grupe velikom dozom i malom dozom MTX je izmerena pomoću Sysmex XT-2000i.V jednom nedeljno pre indukovanja, na dan indukovanja i 4 i 7 dana nakon indukovanja (dan -21, -14, -7, 0, 4 i 7; terapijska grupa malom dozom MTX dodatno na dan -3, kada je i.v. započeta). Hematološki podaci netretiranih životinja (dan -21) su uporedivi sa podacima obezbeđenim u literaturi.
1.2.1 Bele krvne ćelije
[0232] Na početku eksperimenta (dan -21), broj belih krvnih ćelija terapijske grupe velikom dozom i malom dozom MTX je sveden na 9,41 ± 1,42 x 10<3>/µl i 11,66 ± 2,81 x 10<3>/µl, respektivno. Zbog zapaljenskih reakcija imunog sistema, broj WBC je porastao nakon prve i druge imunizacije na 20,79 ± 5,96 x 10<3>/µl i 24,01 ± 3,81 x 10<3>/µl, respektivno (dan -7). Vrednosti su uporedive sa kontrolnom grupom nosača i grupom koja prima terapiju cgtx-544. U roku od sedam dana, broj WBC je blago opao. Četiri dana nakon indukovanja artritisa, broj WBC terapijske grupe velikom dozom MTX je ponovo porastao, verovatno zbog akutnih zapaljenskih procesa povezanih sa indukovanjem. Ne može se reći da li se ovo dejstvo takođe javlja u grupi koja prima terapiju cgtx-544 i kontrolnoj grupi nosača, pošto za ove dve grupe nikakva EDTA celokupna krv nije analizirana ovog dana. Takođe, za terapijsku grupu malom dozom MTX broj WBC ne mora poslužiti kao odgovarajuće poređenje, pošto citotoksično dejstvo MTX može uticati na kompoziciju krvi četiri dana nakon indukovanja artritisa. Još sedam dana nakon indukovanja artritisa broj WBC se dalje smanjio u terapijskoj grupi velikom dozom i malom dozom MTX na 14,68 ± 2,15 x 10<3>/µl i 6,63 ± 1,37 x 10<3>/µl, respektivno (dan 7) (Fig.15), čime je iskazano citostatičko dejstvo terapije malom dozom MTX. Brojevi WBC su se smanjili za skoro 50 % u odnosu na početak eksperimenta. Nasuprot tome, broj WBC terapijske grupe velikom dozom MTX je uporediv sa onim od grupe koja prima terapiju cgtx-544 i kontrolne grupe nosača.
1.2.2 Neutrofilni granulociti
[0233] Na početku eksperimenta (dan -21), apsolutni broj neutrofilnih granulocita terapijske grupe velikom dozom i malom dozom MTX je sveden na 1,55 ± 0,52 x 10<3>/µl i 1,93 ± 0,6 x 10<3>/µl respektivno (Fig.16A) (jednako 16,39 ± 4,85 % relativnih neutrofila od ukupnog broja WBC i 16,64 ± 4,07 % relativnih neutrofila od ukupnog broja WBC, respektivno (Fig.16B)). Kao broj WBC, broj neutrofilnih granulocita je takođe porastao nakon prve i druge imunizacije do 7,54 ± 3,19 x 10<3>/µl i 10,77 ± 2,7 x 10<3>/µl respektivno (dan -7, jednako 35,46 ± 7,08 % od WBC i 44,33 ± 5,4 % od WBC, respektivno). U roku od sedam dana, broj neutrofilnih granulocita je opao, a sedam dana nakon indukovanja brojevi terapijske grupe velikom dozom MTX su bili uporedivi sa onima na početku eksperimenta (1,94 ± 1,1 x 103/µl, jednako 12,63 ± 6,1 % od WBC). Ovo dejstvo je takođe primećeno u grupi koja prima terapiju cgtx-544 i kontrolnoj grupi nosača. Terapijska grupa malom dozom MTX je iskazala mnogo veće smanjenje sa 0,33 ± 0,36 x 103/µl neutrofilnim granulocitima (dan 7, jednako 4,41 ± 4,63 % od WBC).
1.2.3 Limfociti
[0234] Na početku eksperimenta (dan -21), apsolutni broj limfocita terapijske grupe velikom dozom i malom dozom MTX je sveden na 7,39 ± 1,05 x 10<3>/µl i 9,21 ± 2,4 x 10<3>/µl, respektivno (Fig.17A) (jednako 78,77 ± 4,76 % od WBC i 78,97 ± 3,94 % od WBC, respektivno (Fig.17B)). Broj limfocita u terapijskoj grupi velikom dozom i malom dozom MTX, za razliku od brojeva WBC i neutrofilnih granulocita, nije značajnije porastao nakon prve i druge imunizacije, iznoseći 11,68 ± 2,8 x 10<3>/µl i 11,83 ± 1,35 x 10<3>/µl, respektivno (dan -7). Ovo je jednako 57,01 ± 6,45 % od WBC i 49,83 ± 5,45 % od WBC, respektivno (dan -7), pokazujući smanjene procente pošto je ukupan broj WBC izrazito porastao. U roku od sedam dana, procenat limfocita u WBC je ponovo porastao i sedam dana nakon indukovanja, u terapijskoj grupi velikom dozom MTX, bio je uporediv sa procentom na početku eksperimenta (78,16 ± 7,20 % od WBC, dan 7) za razliku od terapijske grupe malom dozom MTX , gde se i povećao (93,13 ± 4,66 % od WBC, dan 7). Apsolutni brojevi terapijske grupe velikom dozom MTX su porasli, a za terapijsku grupu malom dozom MTX su opali, u poređenju sa početkom eksperimenta: 11,38 ± 1,15 x 10<3>/µl i 6,14 ± 1,11 x 10<3>/µl, respektivno (dan 7). Iako je apsolutni broj limfocita u terapijskoj grupi malom dozom MTX smanjen sedam dana nakon indukovanja artritisa u poređenju sa početkom eksperimenta, on i dalje predstavlja 93 % svih belih krvnih ćelija. Ovo dovodi do pretpostavke da citotoksično dejstvo više utiče na druge podpopulacije leukocita nego na populaciju limfocita.
[0235] Tretman sa MTX dovodi do inhibicije dihidrofolat reduktaze i rezultira citostatičkim dejstvom na proliferacione ćelije. Za razliku od pojedinaca koji primaju terapiju cgtx-544, koji nisu pokazali generalizovanu imunosupresiju, pojedinci tretirani pomoću MTX su iskazali različita dejstva u hemogramima u poređenju sa kontrolnom grupom nosača. Sedam dana nakon indukovanja artritisa, pojedinci tretirani malom dozom su imali smanjenje broja WBC, broja neutrofilnih granulocita i broja limfocita. Dalje, ovo rezultira različitom kompozicijom procenata svih belih krvnih ćelija. Dalje, primetili smo mnogo manje smanjenje otoka kolena u poređenju sa 60 % kod pacova koji primaju terapiju cgtx-544 24 h nakon indukovanja artritisa u oba MTX režima (7 % i 15 %).
[0236] Za statističku analizu rezultata efikasnosti MTX upotrebljen je Velšov t-test sa dva uzorka. U nastavku, statistička analiza svih testiranih MTX doznih nivoa (0,1 mg/kg BW i.v. i 1mg/kg BW s.c.) su prikazani za dan 1 i 3 (Fig.28).
[0237] Ukratko, tretman sa MTX dovodi do inhibicije dihidrofolat reduktaze i rezultira citostatičkim dejstvom na proliferacione ćelije. Za razliku od pojedinaca pod terapijom peptidom cgtx-544, pojedinci tretirani pomoću MTX su iskazali različita dejstva na hemogram u poređenju sa kontrolnom grupom
1
nosača. Sedam dana nakon indukovanja artritisa, pojedinci tretirani malom dozom su imali smanjenje broja WBC, broja neutrofilnih granulocita i broja limfocita. Pored toga, ovo rezultira različitom kompozicijom procenata svih belih krvnih ćelija. Dalje, primetili smo mnogo manje smanjenje otoka kolena u poređenju sa maksimalnih 70 % kod pacova koji primaju terapiju peptidom cgtx-54424 h nakon indukovanja artritisa u oba MTX režima (7 % i 15 %).
Primer 7 - Dalja karakterizacija cgtx-544
[0238] Peptid cgtx-544 se sastoji od 38 prirodnih amino kiselina bez modifikacija i poseduje molekularnu masu od otprilike 4220 Da. Deli određene sličnosti funkcionalnog domena sa α-KTx6 podporodicom perptida škorpiona. cgtx-544 zadržavaju 4 disulfidna mosta, a 3D struktura obuhvata konformaciju αhelix/β-sloja.
Proizvodnja cgtx-544
[0239] Fig.29 obezbeđuje šematski prikaz proizvodnih faza peptida cgtx-544. Sinteza peptida se sprovodi na nerastvorljivoj polistirolnoj smoli pomoću F-moc strategije. Slobodni amin N-terminusa spojenog peptida čvrste faze je spojen sa jednom jedinicom N-zaštićene amino kiseline. Ova jedinica se zatim oslobađa zaštite (F-moc grupe se cepaju na osnovnoj pH vrednosti od strane piperidina), otkrivajući novi amin N-terminusa sa kojim dalja amino kiselina može biti spojena. Tert.-Butiloksikarbonil (Boc) grupe služe kao trajne zaštitne grupe bočnog lanca i cepaju se nakon što se sinteza peptida završi tretmanom pomoću TFA (trifluorosirćetna kiselina).
[0240] Nakon završetka sinteze peptida, peptid se oslobađa zaštite i cepa od polistirolne smole. U ovoj tački, sirovi proizvod peptida iskazuje čistoću od oko 50% nakon čega sledi analitička UPLC i LC-MS. U kasnojoj fazi sirovi peptid se prečišćava pomoću preparativne HPLC, što rezultira linearnim proizvodom peptida sa čistoćom od ≥ 90%.
Savijanje peptida cgtx-544
[0241] Ovaj rastvor peptida se savija oksidacijom (formiranjem disulfidnih veza). Postupak savijanja se zasniva na formiranju veze u fosfatnom puferu na pH 8,3 u prisustvu atmosferskog kiseonika. HPLC analiza cgtx-544 savijenog prema ovom protokolu je pokazala da ovaj peptid postoji kao kompozicija savijenih i delimično savijenih varijanti. Ovaj intermedijarni proizvod savijanja se navodi kao cgtx-544(Mix). Na osnovu elektrofizioloških podataka generisanih sa materijalom različitih izolovanih UPLC-vrhova zaključeno je da jedan vrh (vreme zadržavanja 12,77min) u savijajućoj kompoziciji korelira sa matičnim aktivnim peptidom, dok svi ostali vrhovi nisu korelirali sa elektrofiziološkom aktivnošću (Fig.
2
30). Stoga, nakon reakcije savijanja aktivni peptid (vreme zadržavanja 12,77min) je prečišćen iz cgtx-544 kompozicije savijenih i delimično savijenih peptida pomoću pripremne HPLC. Nakon ove faze prečišćavanja, aktivni peptid – koji se navodi kao cgtx-544(Sing) – obično poseduje procenjenu čistoću veću od 95%. Prečišćeni peptid cgtx-544(Sing) je visoko rastvorljiv i stabilan u 0,9% NaCl rastvoru na RT i 4°C do nekoliko nedelja.
[0242] Zbog razvoja postupka, prečišćeni peptid cgtx-544(Sing) je proizveden samo u malom formatu. Stoga, materijal je ograničen i upotrebljen je u eksperimentima predviđenim za identifikaciju IC50vrednosti od cgtx-544(Sing) na Kv1.3, Kv1.1, Kv1.2 i Kv1.5 (pogledati Primer 8). Neprečišćena savijajuća kompozicija od cgtx-544 (cgtx-544(Mix)) je upotrebljena u svim drugim ovde opisanim eksperimentima (Primeri 1 do 6), osim ako je drugačije naznačeno pojmom cgtx-544 (sing).. Izračunato je da sadržaj aktivnog materijala u kompoziciji iznosi 15%.
[0243] Ukratko, peptid cgtx-544 iskazuje sledeće biohemijske karakteristike koje postaju važne za biohemijsku analizu:
• cgtx-544 je izrazito osnovni peptid, koji sadrži 6 amino kiselina lizina i 2 amino kiseline arginina i može da se lepi za površine staklenih ampula na niskim koncentracijama (< 100ng/ml).
• Sadrži 8 amino kiselina cisteina, koje su povezane pomoću 4 disulfidna mosta.
• Izoelektrična tačka: 9,29.
• MW: 4212 Da kada su disulfidni mostovi vezani, MW: 4220.2 Da u smanjenom obliku • Zbog prisustva 4 disulfidna mosta struktura cgtx-544 je kompaktna.
Primer 8 - Dalja karakterizacija selektivnosti jonskog kanala cgtx-544 (sing) na osnovu elektrofiziološke analize
1. Materijali i postupci
[0244] Jonski kanali su ekspresovani preko Baculovirusa (Kv1.1-, Kv1.3- i Kv1.5-konstrukti) zaraženih Sf21 ćelija ili stabilno transfektovanih CHO ćelija (Kv1.2) kako je opisano u Primerima 1, 2, i 4.
Elektrofiziološka analiza je sprovedena na automatskom uređaju za lokalnu fiksaciju potencijala "Patchliner" (Nanion Technologies, Minhen, Nemačka). Patchliner je zasnovan na postupku planarne lokalne fiksacije komadića borosilikatnog stakla (NPC-16) umesto staklenih pipeta. Patchliner može da beleži četiri ćelije u isto vreme. Sva beleženja kanala su sprovedena u režimu celih ćelija. Beleženja podataka su sprovedena pomoću PatchMaster softvera (HEKA Electronics, Lambreht/Pfalc, Nemačka). Vizualizacija eksperimentalnih rezultata je ostvarena pomoću IGOR softvera (Wavemetrics, SAD).
Prosečni podaci su predstavljeni kao standardna greška srednje ± vrednosti (SEM).
[0245] Test jedinjenja su upotrebljena kao koncentrovani štok rastvori (uglavnom 1,5 µg/µl). Štok rastvori su razblaženi u puferu do neophodnih krajnjih koncentracija.
2. Rezultati
2.1 IC50– Analiza ciljnog kanala Kv1.3
[0246] Nakon hemijske sinteze (pogledati Primer 7) peptid je savijen oksidacijom sa atmosferskim kiseonikom, a frakcija pravilno savijenog (biološki aktivnog) peptida je prečišćena preparativnom HPLC. Ovaj prečišćeni peptid cgtx-544 je označen kao cgtx-544(Sing) za jedan vrh.
[0247] Elektrofiziološka analiza cgtx-544(Sing) rezultirala je izuzetnom IC50vrednošću od 6,9 nM (Fig. 31).
2.2 Elektrofiziološka analiza cgtx-544(Sing) na Kv1.1, Kv1.2 i Kv1.5
[0248] Elektrofiziološka analiza cgtx-544(Sing) na Kv1.1, Kv1.2 i Kv1.5 je pokazala da je cgtx-544 visoko selektivan. Rezultati elektrofiziološke karakterizacije cgtx-544(Sing) na Kv1.1, Kv1.2 i Kv1.5 su sažeti na Fig.32.
Primer 9 – Otpor proteaze cgtx-544(Sing)
[0249] Nakon eksperimenata opisanih u Primeru 3, stabilnost peptida cgtx-544 je testirana u uzorcima krvnog seruma u in vitro uslovima. Stoga, stabilnost cgtx-544(Sing) u ljudskom krvnom serumu je utvrđena dodavanjem poznate količine cgtx-544(Sing) ljudskom krvnom serumu i kasnijom inkubacijom na 37°C. Blokirajuća aktivnost ctx-544(Sing) je izmerena na Kv1.3 kanalima tokom perioda od 57 dana. cgtx-544(Sing) je izuzetno stabilan u ljudskom krvnom serumu. Njegova aktivnost ostaje konstantna tokom najmanje 16 sati, i polako se raspada dok nijedno dejstvo blokiranja peptida ne bude detektabilno nakon 57 dana. Ovo pokazuje da je cgtx-544 veoma otporan na akciju krvnih proteaza (Fig. 33).
[0250] Nikakvo smanjenje potentnosti blokiranja nije primećeno u odnosu na merenja sprovedena u odsustvu seruma, sa IC50 preostalim u 7nM opsegu. Kontrolni uzorci seruma bez peptida nisu pokazali nikakav nespecifičan blok Kv1.3. Stoga, zaključeno je da je uzrok primećenog dejstva blokiranja isključivo dejstvo cgtx-544(Sing). Predstavljanjem koncentracije cgtx-544(Sing) izmerene u inkubiranom rastvoru tokom 57 dana, 50% aktivnosti cgtx-544(Sing) je zadržano za period od 5 dana u ljudskom serumu na 37°C.
4
[0251] Ukratko, postojanost cgtx-544 u ljudskom serumu na 37°C je veoma visoka. cgtx-544 se ne vezuje za komponente seruma – ako se uopšte i vezuje, to čini samo sa veoma niskim afinitetima – i izuzetno je otporan na raspadanje od strane proteaza prisutnih u ljudskom serumu.
Primer 10 - In vivo vreme poluraspada cgtx-544 (Sing)
[0252] Cilj ovog ispitivanja jeste primena bioanalize radi procene in vivo vremena poluraspada cgtx-544(Sing) kod pacova. Prethodni eksperimenti (Primer 3) su pokazali da se cgtx-544 ne raspada brzo kada prodre u serum i inkubira se na 37°C.
1. Materijali i postupci
[0253] Pacovi su primili i.v. ubrizgavanja cgtx-544(Sing) (750 µg/kg BW). Krv je povučena u vremenskim tačkama 0, 1, 10 i 60 minuta. Kasnije, serum je pripremljen od uzoraka krvi. Sadržaj cgtx-544 u ovim uzorcima je elektrofiziološki analiziran merenjem dejstva blokiranja na Kv1.3 kanale ekspresovane u CHO ćelijama. Kontrolni uzorak seruma bez peptida (0 minuta) nije pokazao nespecifičan blok Kv1.3, a cgtx-544(Sing) aktivnost uzorka od 1 minuta je procenjena na 100%. Uzorak prikupljen u trećoj vremenskoj tački (60 minuta) je iskazao 10% prvobitne aktivnosti blokiranja. U cilju ispitivanja količine nevezanog cgtx-544(Sing) kod pacova, količina cgtx-544(Sing) prisutnog u cirkulišućoj krvi u gore navedenim vremenskim tačkama je izračunata preko kalibracione krive. Ova kalibraciona kriva je dobijena dodavanjem poznatih količina cgtx-544(Sing) krvnom serumu i kasnijim elektrofiziološkim merenjima na Kv1.3 kanalima. Blok Kv1.3 struja ovih uzoraka koji su prodrli je bio sličan onom dobijenom sa cgtx-544(Sing) u odsustvu seruma (podaci nisu prikazani).
2. Rezultati
[0254] Raspadanje cgtx-544(Sing) u krvi tretiranih pacova prati uobičajenu krivu raspadanja, uz prinos vremena poluraspada od otprilike t1/2=26 min (Fig.34), sa približnom koncentracijom od 62 nM cgtx-544(Sing) u cirkulišućoj krvi. Ova koncentracija je dovoljna za dostizanje punog bloka Kv1.3 kanala. Ovo vreme poluraspada je u opsegu viđenom za druge blokatore kanala peptida - varijante ShK toksina prikazuju vreme poluraspada između 20 do 50 min.
[0255] Ukratko, in vivo vreme poluraspada cgtx-544 nakon i.v. primene kod pacova je u opsegu kompetitivnog peptida ShK. In vivo vreme poluraspada iznosi otprilike 26 minuta. Zbog male veličine i kompaktne strukture cgtx-544, pretpostavlja se da je peptid očišćen od krvi najverovatnije preko renalne filtracije. Razumno je pretpostaviti da je vreme poluraspada cgtx-544 kod ljudi duže nego kod pacova, pošto pacovi imaju mnogo bržu metaboličku stopu od ljudi. In vivo vreme poluraspadanja ne odgovara trajanju dejstva leka pošto se peptid čvrsto vezuje za jonski kanal i blokira ga u dužim vremenskim periodima.
Primer 11 – Klinički podaci
[0256] Do danas nisu sprovedena nikakva klinička ispitivanja.
Prvo ispitivanje na ljudima
[0257] Ispitivanje u fazi 1 može biti randomizovano, dvostruko slepo, placebo kontrolisano jednocentrično ispitivanje kod zdravih subjekata.
[0258] Prvi deo ovog ispitivanja može biti ispitivanje jedne doze i dozne eskalacije u kohortama od 4 subjekta (3 1) za grupe sa manjom dozom i 8 subjekata (2 6) za grupe sa većom dozom. Početna doza će biti procenjena od NOAEL u ispitivanjima toksičnosti kako je utvrđeno u FDA smernicama za industriju „utvrđivanjem maksimalne bezbedne početne doze u početnim kliničkim ispitivanjima za terapiju kod odraslih zdravih dobrovoljaca“.
[0259] Drugi deo faze 1a može biti projektovan kao ispitivanje više doza. Jedna kohorta od 8 subjekata (6 2) biće izložena jednom doznom nivou ispod MTD za 7 uzastopnih dnevnih primena.
[0260] Primarni cilj ove standardne faze 1a ispitivanja može biti procena bezbednosti, tolerabilnosti i farmakokinetike cgtx-544 kod zdravih subjekata.
Ispitivanje dokaza izvodljivosti koncepta
[0261] Ova faza 2a ispitivanja može biti randomizovano, dvostruko slepo, placebo kontrolisano, više centrično ispitivanje dokaza izvodljivosti koncepta i utvrđivanja doze kod pacijenata sa umerenom-doozbiljnom psorijazom plaka.
[0262] Planirana faza 2a ispitivanja dokaza izvodljivosti koncepta će uključivati 80 odraslih pacijenata (20 60) i 3 dozna nivoa. Svaki dozni nivo će biti testiran sa 20 pacijenata tokom perioda od 12 nedelja.
[0263] Primarna krajnja tačka: Razmera subjekata koji ostvare PASI 75 (pacijenti koji ostvare poboljšanje od osnovne linije PASI od najmanje 75%) u nedelji 12.
[0264] Sekundarne krajnje tačke: Procena bezbednosti cgtx-544 za period do 12 nedelja procenom negativnih događaja, vitalnih znakova, laboratorijskih parametara, fizičkog pregleda i EEG-a.
[0265] Farmakokinetika cgtx-544 u različitim vremenskim tačkama tokom 12 nedelja nakon prvog tretmana. Razmera subjekata koji ostvare IGA rezultat „čisto“ ili „skoro čisto“ u nedelji 12.
[0266] Razmera subjekata koji ostvare PASI 50 (pacijenti koji ostvare poboljšanje od osnovne linije PASI od najmanje 50%) u nedelji 12.
[0267] Razmera subjekata koji ostvare PASI 90 (pacijenti koji ostvare poboljšanje od osnovne linije PASI od najmanje 90%) u nedelji 12.
[0268] Slična ispitivanja se mogu sprovesti za vaskulitis. Krajnje tačke će morati da budu procenjene na odgovarajući način.
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12

Claims (9)

Patentni zahtevi
1. Jedinjenje koje obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline od SEQ ID No.: 25.
2. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu jedinjenje može selektivno da se vezuje za kalijumov kanal Kvl.3.
3. Jedinjenje prema zahtevima 1 ili 2, pri čemu jedinjenje može selektivno da se vezuje za kalijumov kanal Kvl.3 u poređenju sa kalijumovim kanalom Kv1.1
4. Kodiranje sekvence nukleinske kiseline za sekvencu amino kiseline kao što je pomenuto u bilo kom od zahteva 1, 2, ili 3.
5. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1, 2, ili 3.
6. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1, 2, ili 3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 5, pri čemu je navedeno jedinjenje ili farmaceutska kompozicija pogodno za oralno, nazalno, sublingvalno, perkutano, intravensko ili intramuskularno davanje
7. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1, 2, ili 3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 5 ili 6 za upotrebu u lečenju ili prevenciji autoimune bolesti, gojaznosti, parodontitisa i/ili odbijanja transplanta tkiva.
8. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1, 2, ili 3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 5 ili 6 za upotrebu u lečenju ili prevenciji autoimune bolesti, odabrane iz grupe koja obuhvata multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, psorijazu, dijabetes tip-1, vaskulitis, Hašimotovu bolest, Sjogrenov sindrom, akutni diseminovani encefalomijelitis (ADEM), Adisonovu bolest, ankilozantni spondilitis, sindrom antifosfolipidnih antitela (APS), aplastičku anemiju, autoimuni hepatitis, autoimuni ooforitis, celijakiju, Kronovu bolest, gestacioni pemfigoid, giht, Behčetovu bolest, Gudpasterov sindrom, Grejvsovu bolest, Gilen-Bareov sindrom, idiopatsku trombocitopenijsku purpuru, Kavasakijevu bolest, eritemski lupus, mijasteniju gravis, opsoklonus mioklonus sindrom, optički neuritis, Ordov tiroiditis, pemfigus, pernicioznu anemiju, poliartritis (kod pasa), primarnu bilijarnu cirozu, Reiterov sindrom, Takajasuov arteritis, temporalni arteritis, toplu autoimunu hemolitičku anemiju i Vegenerovu granulomatozu.
9. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1, 2, ili 3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 5 ili 6 za upotrebu u lečenju ili prevenciji reumatoidnog artritisa.
RS20191608A 2014-05-08 2015-05-07 Antagonisti kalijumovog kanala kv1.3 RS59676B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1408135.0A GB201408135D0 (en) 2014-05-08 2014-05-08 Kv1.3 potassium channel antagonists
EP15721694.6A EP3140318B1 (en) 2014-05-08 2015-05-07 Kv1.3 potassium channel antagonists
PCT/EP2015/060073 WO2015169901A1 (en) 2014-05-08 2015-05-07 Kv1.3 potassium channel antagonists

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59676B1 true RS59676B1 (sr) 2020-01-31

Family

ID=51032421

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191608A RS59676B1 (sr) 2014-05-08 2015-05-07 Antagonisti kalijumovog kanala kv1.3

Country Status (21)

Country Link
US (2) US10370413B2 (sr)
EP (2) EP3660038A1 (sr)
JP (1) JP6989377B2 (sr)
KR (1) KR102449653B1 (sr)
CN (2) CN113150078A (sr)
AU (2) AU2015257694B2 (sr)
CA (1) CA2954076C (sr)
CY (1) CY1122445T1 (sr)
DK (1) DK3140318T3 (sr)
ES (1) ES2763315T3 (sr)
GB (1) GB201408135D0 (sr)
HR (1) HRP20192307T1 (sr)
HU (1) HUE046915T2 (sr)
IL (1) IL248807B (sr)
LT (1) LT3140318T (sr)
PL (1) PL3140318T3 (sr)
PT (1) PT3140318T (sr)
RS (1) RS59676B1 (sr)
SI (1) SI3140318T1 (sr)
SM (1) SMT201900742T1 (sr)
WO (1) WO2015169901A1 (sr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110540585B (zh) * 2019-09-03 2022-07-01 昆明医科大学 一种具有改善脑缺血缺氧的蝎子毒素活性多肽HsTx1及其制备方法与应用
CN118139896A (zh) * 2021-10-15 2024-06-04 南通壹宸生物医药科技有限公司 一种双特异性结合分子
WO2025133134A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 SelectION Therapeutics GmbH Peptide for treating atopic dermatitis
WO2025133137A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 SelectION Therapeutics GmbH Peptide for treating psoriasis vulgaris or psoriatic arthritis

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5185433A (en) * 1990-04-09 1993-02-09 Centocor, Inc. Cross-linking protein compositions having two or more identical binding sites
US20090175821A1 (en) * 1999-05-17 2009-07-09 Bridon Dominique P Modified therapeutic peptides with extended half-lives in vivo
EP2474316B1 (en) * 2004-10-07 2016-04-06 The Regents of The University of California Analogs of shk toxin and their uses in selective inhibition of kv1.3 potassium channels
US7833979B2 (en) * 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
PE20081140A1 (es) * 2006-10-25 2008-09-22 Amgen Inc Agentes terapeuticos a base de peptidos derivados de toxinas
WO2008119353A1 (en) * 2007-03-29 2008-10-09 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
CN101796069B (zh) * 2007-05-14 2014-02-19 墨西哥国立自治大学 Vm23和Vm24，两种以高选择性阻断人类T淋巴细胞钾通道(Kv1.3亚型)并降低大鼠的体内DTH反应的蝎子肽
WO2018013483A1 (en) * 2016-07-11 2018-01-18 The California Institute For Biomedical Research Kv1.3 channel blocking peptides and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US10800815B2 (en) 2020-10-13
DK3140318T3 (da) 2020-01-02
AU2019240693A1 (en) 2019-10-24
IL248807A0 (en) 2017-01-31
JP2017515502A (ja) 2017-06-15
JP6989377B2 (ja) 2022-01-05
PT3140318T (pt) 2020-01-07
CN106661093A (zh) 2017-05-10
GB201408135D0 (en) 2014-06-25
KR20170013898A (ko) 2017-02-07
CA2954076A1 (en) 2015-11-12
SMT201900742T1 (it) 2020-03-13
EP3140318A1 (en) 2017-03-15
EP3660038A1 (en) 2020-06-03
CY1122445T1 (el) 2021-01-27
HUE046915T2 (hu) 2020-04-28
KR102449653B1 (ko) 2022-09-29
SI3140318T1 (sl) 2020-02-28
AU2015257694A1 (en) 2017-01-05
US10370413B2 (en) 2019-08-06
CA2954076C (en) 2023-07-11
CN113150078A (zh) 2021-07-23
LT3140318T (lt) 2020-01-10
EP3140318B1 (en) 2019-10-30
US20170137470A1 (en) 2017-05-18
IL248807B (en) 2020-03-31
CN106661093B (zh) 2021-04-20
AU2019240693B2 (en) 2020-10-15
PL3140318T3 (pl) 2020-05-18
HRP20192307T1 (hr) 2020-03-20
ES2763315T3 (es) 2020-05-28
AU2015257694B2 (en) 2019-07-04
US20190375795A1 (en) 2019-12-12
WO2015169901A1 (en) 2015-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5801197B2 (ja) 痛みの治療に関する薬剤及び方法
CN101072577B (zh) ShK毒素类似物及其在选择性抑制Kv1.3钾通道中的应用
EP2313432B1 (en) Use of cd31 peptides in the treatment of thrombotic and autoimmune disorders
AU2019240693B2 (en) Kv1.3 potassium channel antagonists
WO2010070047A1 (en) Soluble polypeptides for use in treating autoimmune and inflammatory disorders
KR20210009197A (ko) 자가면역질환 및 염증성질환 펩타이드 치료제
KR20180003538A (ko) 듀얼 신호전달 단백질 (dsp) 융합 단백질 및 질환 치료에서의 그것의 이용 방법
US20080269137A1 (en) Compositions and methods for modulating the immune system
EP4431108A1 (en) Use of polypeptide in resistance to addiction and relapse thereof, and complex and polypeptide
CN107454846B (zh) 修饰的肽及其治疗慢性炎性疾病的用途
KR101645015B1 (ko) Fpr2를 활성화하는 물질을 포함하는, 인슐린 저항성 관련 질환 치료용 조성물
HK1235416A1 (en) Kv1.3 potassium channel antagonists
HK1235416B (en) Kv1.3 potassium channel antagonists
CN107896494B (zh) 多肽组合物
CN112979764B (zh) 特异结合人cd47分子的多肽及其用途
HK40012892A (en) Antibodies and polypeptides directed against cd127
HK40012892B (en) Antibodies and polypeptides directed against cd127