RS59677B1 - Marker za poremećaje povezane sa sfingomijelinazom kiselom i njegove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ova patentna prijava zahteva korist prioriteta pod 35 U.S.C. § 119 provizorne patentne prijave SAD br.61/832,302, podnete 7. Juna 2013.

[0002] Predmetno obelodanjivanje se odnosi na metode skrininga, dijagnostikovanja, praćenja i/ili tretiranja deficijencije kisele sfingomijelinaze (ASMD) kao što je Niemann-Pick bolest tipa A ili tipa B.

[0003] Kisela sfingomijelinaza (ASM) je lipozomalni enzim fosfodiesteraza koji vrši hidrolizu sfingomijelina, (SPM), supstance za skladištenje fosfolipida koja se nalazi u mozgu, jetri, plućima, slezini i limfnim čvorovima, u keramid i fosforilholin. Gubitak ASM aktivnosti za rezultat može dati nemogućnost tela da razgradi SPM. Kod pacijenata sa ASM poremećajima, SPM se prevashodno akumulira u makrofagima, ali takođe i u hepatocitima i drugim tipovima ćelija, što se za rezultat ispoljava markiranom hepatosplenomegalijom, trombocitopenijom, intersticijskom bolesti pluća i bolesti koronarnih arterija. SPM nije značajno povećan u plazmi, punoj krvi ili urinu, što ga ograničava na upotrebu kao neinvazivni biomarker.

[0004] Dijagnoza ASM poremećaja trenutno zahteva invazivno testiranje i/ili vremenski zahtevno medicinsko ispitivanje, kao što je procenjivanje pretpostavljenih kliničkih znakova i simptoma, biopsiju jetre ili pluća, testiranje ASM aktivnosti u uzorku krvi (gde su zabeleženi lažni i negativni i pozitivni slučajevi) i/ili genetsko testiranje (npr., analiza mutacije SMPD1 gena). Tretiranje ASM poremećaja može obuhvatati davanje enzima za zamenu. Pri visokim dozama, terapija zamene enzima za rezultat može dati proizvodnju toksičnih ili štetnih metabolita. Prema tome, postoji potreba da se razviju poboljšane metode za skrining, dijagnostikovanje i/ili praćenje toka tretiranja ASM poremećaja. Ovde su obelodanjene metode za neinvazivni skrining, dijagnostikovanje i praćenje terapije i/ili podešavanje doze terapeutskog sredstva za tretiranje ASM poremećaja, koje obuhvataju merenje nivoa lizo-SPM (sfingosilfosforilholin ili lizo-sfingomijelin) u biološkom uzorku. Povišeni nivoi lizo-SPM se mogu koristiti za skrining ili dijagnostikovanje ASM bolesti. Povišeni nivoi lizo-SPM se takođe mogu koristiti kao signal ili indikacija proizvodnje jednog ili više toksičnih metabolita koji su povezani sa prekomerno visokom dozom pri terapiji zamene enzima, što time omogućava kalibraciju enzimske terapije kako bi se smanjilo taloženje SPM dok se izbegavaju neželjena dejstva terapije. Povišeni nivoi lizo-SPM se takođe mogu koristiti za praćenje dugoročne efikasnosti toka tretiranja kod ASM bolesti (npr., ukoliko se nivoi lizo-SPM ne smanje u toku tretiranja, to može ukazati da tretiranje nije delotvorno).

[0005] Niemann-Pick bolest (NPD) je nasledna, autosomalna recesivna bolest skladištenja lipida okarakterisana prekomernom akumulacijom SPM u lizozomima ćelija kao što su makrofagi i neuroni, što ometa normalne ćelijske funkcije. Niemann-Pick Tip A („NPD-A“) je rapidno progresivna neurodegenerativna bolest kod male dece i obično se ispoljava smrću u prve dve li tri godine života. Niemann-Pick Tip B („NPD-B“) se ispoljava u povećanju jetre i slezine i u respiratornom distresu gde smrt obično sledi u ranom odraslom doba. Drugi tipovi Niemann-Pick bolesti, npr., Tip C („NPD-C“) takođe mogu biti povezani sa akumulacijom SPM i/ili lizo SPM. Ovde se takođe nazivaju ASM bolestima. Ovi oblici Niemann-Pick bolesti se ovde kolektivno nazivaju kao Niemann-Pick bolest (NPD).

[0006] NPD se javlja češće kod pojedinaca koji imaju poreklo od Aškenazi Jevreja nego kod opšte populacije. Procenjuje se da je incidencija NPD-A kod Aškenazi Jevreja 1 u 40.000, gde je učestalost gena (q) oko 1 u 200 a učestalost nosilaca heterozigota (2pq) 1 u 100 (Goodman, 1979, u „Genetic Disorders Among The Jewish People“, John Hopkins Univ. Press, Baltimore, str.96-100). Incidencija nosilaca heterozigota NPD-B u populaciji Aškenazi Jevreja je manje učestala. Id. Učestalost kombinovanih nosilaca heterozigota za NPD A i B je procenjena da je oko 1 u 70 kod pojedinaca koji imaju poreklo od Aškenazi Jevreja. Id. U epidemiološkim ispitivanjima sprovedenim u različitim državama, kombinovana incidencija NPD A i B bolesti je u nekoliko država na svetu procenjena da je u opsegu od 1 u 167.000 do 1 u 250.000 novorođenih beba (Miekle i dr., 1999 JAMA 281 (3):249-254; Poorthuis i dr., 1999 Hum. Genet. 105:151-156; Pinto i dr., 2004 Euro. J. Hum. Gene.12:87-92). Stopa nosilaca heterozigota se veruje da je u opsegu od 1 u 200 do 1 u 250 pojedinaca.

[0007] ASMD pacijenti koji imaju ili NPD-A ili NPD-B imaju rezidualnu ASM aktivnost (oko 1 do 10% uobičajeno), ali to nije dovoljno kako bi se sprečila prekomerna akumulacija sfingomijelina u lizozomima. Pored toga, klinički tok NPD-B je visoko varijabilan (videti, npr., Wasserstein i dr., Journal of pediatrics, 149(4): 554-559 (2006)), i trenutno nije moguće napraviti korelaciju između ozbiljnosti bolesti i nivoa rezidualne ASM aktivnosti. Iako se enzimska dijagnoza pogođenih pacijenata ili sa NPD-A ili NPD-B može učiniti u uzorcima krvi, ovoj dijagnozi obično prethodne invazivne procedure kao što je biopsija jetre ili pluća. Dodatno, enzimska detekcija obaveznih heterozigota je dokazana da je problematična, naročito kada se koriste periferni leukociti kao izvor enzima. Jedna mogućnost je da je javljanje neutralnih sfingomijelinaza u nekim izvorima i/ili prisustvo rezidualne ASM aktivnosti koje je rezultat mutiranih alela doprinelo nemogućnosti da se pouzdano diskriminišu nosači za svaki pod tip bolesti. Čak i upotreba kultivisanih fibroblasta iz kože, koji ne ispoljavaju neutralnu sfingomijelinazu, nije pružila nedvosmislene rezultate sa heterozigotima. Prema tome, alternativne metode za precizno detektovanje, skrining, dijagnostikovanje i tretiranje ASM poremećaja, kao što je NPD, je potrebno.

[0008] Terapija zamene enzima (ERT) je korišćena za tretiranje različitih bolesti skladištenja lipozoma. Videti, npr., patent SAD 7,001,994 i patentnu prijavu SAD br.2011/0052559, koje razmatraju ERT za Tay-Sachs, Pompe, i Niemann-Pick bolest, između ostalih. ERT pokušava da dopuni deficijentni i/ili defektivni enzim sa egzogeno dopunjenim enzimom. U slučaju ERT za Niemann-Pick bolest, cilj bi bio da se omogući da pogođeni pojedinac procesira sfingomijelin i da izbegne njegovo taloženje u lizozomima. Kako bi bila efikasna, takva terapija može inicijalno zahtevati dovoljno veliku količinu enzima za zamenu kako bi se razgradio akumulisani sfingomijelin, kao i nastavljeno davanje enzima za zemnu kako bi se izbegla sledeća ponovna akumulacija sfingomijelina. Metabolizam akumuliranog sfingomijelina može, međutim, za rezultat dati proizvodnju toksičnih štetnih metabolita. Pažljiva koordinacija ERT je potrebna, prema tome, kako bi se efikasno uklonio akumulirani sfingomijelin kod pacijenta bez izazivanja povišenih nivoa metabolita što se može ispoljiti u štetnim neželjenim dejstvima.

[0009] Kao što je prethodno zabeleženo, SPM nije značajno povećan u plazmi, punoj krvi ili urinu, što ga ograničava na upotrebu kao neinvazivni biomarker za skrining, dijagnostikovanje ili praćenje tretiranja ASM bolesti. Kao što je ovde obelodanjeno, lizo-SPM (sfingosilfosforilholin ili lizo-sfingomijelin), deacilisani oblik SPM, je značajno povećan u tkivu, uključujući periferno tkivo, kod pacijenata koji boluju od i/ili koji primaju terapiju za ASM poremećaje, što ga čini potencijalnim markerom za skrining, dijagnostikovanje i/ili praćenje tretiranja ASM poremećaja. Ova dihotomija je u suprotnosti sa mnogim drugim poremećajima skladištenja lizozoma, gde se izmenjeni nivoi i acilisanih i deacilisanih glikosfingolipida mogu detektovati u plazmi. Kako se izmenjeni nivoi SPM ne mogu detektovati u plazmi pacijenata koji boluju od ili koji primaju terapiju za ASM bolesti, očekivalo se da lizo-SPM bio slično tako ne bi bio pogodan za skrining, dijagnostikovanje ili praćenje tretiranja. Međutim, kako je ovde obelodanjeno, pronađeno je da se lizo-SPM može detektovati pri izmenjenim nivoima u biološkim uzorcima različitog tkiva, uključujući periferno tkivo kao što je krvna plazma.

[0010] Lizo-sfingolipidi (lizo-SL), koji obuhvataju lizo-SPM su deacilisani oblici sfingolipida; za nekoliko je pokazano da su povišeni u određenim bolestima skladištenja lipozoma. Galbiati i dr., „Combined hematopoietic and lentiviral gene-transfer therapies in newborn Twitcher mice reveal contemporaneous neurodegeneration and demyelination in Krabbe disease,“ J. Neurosci. Res.87: 1748-1759 (2009). Mehanizam kojim se lizo-SPM i drugi lizo-SL proizvode nisu u potpunosti rasvetljeni. Nedostatak istovremenog povećanja sfingozina predlaže da je deacilacija odgovarajućeg sfingolipida verovatno put stvaranja. Međutim, jedina sfingomijelin deacilaza koja je do danas identifikovana je iz stratum corneum ispitanika sa atopijskim dermatitisom. Murata i dr., „Abnormal expression of sphingomyelin acylase in atopic dermatitis: an etiologic factor for ceramide deficiency?“, J. Invest. Dermatol. 106: 1242-1249 (1996). Ispoljavanje ove deacilaze deluje da je ograničeno na izabrane tipove ćelija pod određenim fiziološkim uslovima. Pokazano je da prečišćeni ASM iz placente, mozga i urina ne vrši hidrolizu lizo-SPM. Pentchev i dr., „The isolation and characterization of sphingomyelinase from human placental tissue,“ Biochim. Biophys. Acta.

488: 312-321 (1977); Yamanaka i Suzuki, „Acid sphingomyelinase of human brain: purification to homogeneity,“ J. Neurochem. 38: 1753-1764 (1982); Quintern i dr., „Acid sphingomyelinase from human urine: purification and characterization,“ Biochim. Biophys. Acta. 922: 323-336 (1987). Nedostatak razumevanja u vezi sa biosintetičkim putem lizo-SPM dalje naglašava poteškoće pri predviđanju nivoa ispoljavanja apriori kod pacijenata koji boluju od ASM poremećaja.

[0011] Lizo-SPM ima kratko vreme polu života u krvi i in vitro zbog svog brzog metabolizma na sfingozin-1-fosfat preko autotaksina, egzoenzima sa aktivnošću lizofosfolipaze D.

Tokumura i dr., „Identification of human plasma lysophospholipase D, a lysophosphatidic acid-producing enzyme, as autotaxin, a multifunctional phosphodiesterase,“ J. Biol. Chem. 277: 39436-39442 (2002); Clair i dr., „Autotaxin hydrolyzes sphingosylphosphorylcholine to produce the regulator of migration, sphingosine-1-phosphate,“ Cancer Res.63: 5446-5453 (2003). Osim kod pacijenata sa NPD-B u slezini i jetri, i ispitanika sa NPD-A u mozgu koji nemaju ili imaju malo ASM aktivnosti i manifestuju ozbiljnu neuropatsku bolest, nije zabeležen nivo lizo-SPM u drugim organima.

[0012] Kako je ovde obelodanjeno, lizo-SPM se može detektovati pri izmenjenim koncentracijama u biološkim uzorcima (npr., uzorci uzeti iz perifernog tkiva) kod pacijenata koji boluju od i/ili koji primaju terapiju za ASM poremećaje. Izmenjeni nivo može reflektovati tranzitni efekat tretiranja (npr., izmenjeni nivoi lizo-SPM mogu služiti kao marker za proizvodnju akutnih toksičnih metabolita kao odgovor na ERT). Izmenjeni nivoi se takođe mogu dijagnostički koristiti (npr., izmenjeni nivoi lizo-SPM mogu služiti kao dijagnostički ili marker za skrining kako bi se identifikovao simptomatički ili pre-simptomatički ispitanik koji boluje od ASM poremećaja). Izmenjeni nivoi lizo-SPM se takođe mogu koristiti za praćenje dugoročne efikasnosti toka tretiranja kod ASM bolesti (npr., ukoliko se nivoi lizo-SPM ne smanje u toku tretiranja, to može ukazati da tretiranje nije delotvorno). Prema tome, ovde su obelodanjene nove metode za skrining, dijagnostikovanje, praćenje napredovanja tretiranja i/ili za podešavanje doze terapeutskog sredstva za tretiranje ASM poremećaja kao što je NPD upotrebom novih biomarkera koji obuhvataju lizo-SPM (sfingosilfosforilholin ili lizosfingomijelin). Praćenje toka tretiranja može obuhvatati detektovanje smanjenja nivoa jednog ili više markera toksičnosti (npr., lizo-SPM) u toku tretiranja, time, ukazujući efikasni režim tretiranja, ili određivanje nedovoljne izmene nivoa markera u vremenu, time ukazujući neefikasan režim. Pronalazak je definisan patentnim zahtevima.

[0013] Ovde obelodanjene metode takođe obuhvataju metode za tretiranje ispitanika koji je čovek koji ima poremećaj povezan sa kiselom sfingomijelinazom (ASM). U određenim apsektima, metode mogu obuhvatati davanje ispitaniku prve doze terapeutskog sredstva za tretiranje ASM poremećaja koja ima prvu koncentraciju; i davanje ispitaniku druge doze terapeutskog sredstva koja ima drugu koncentraciju koja je jednaka ili veća od prve koncentracije ukoliko je određeno da ispitanik ima nivo lizo-SPM koji je manji ili jednak referentnom nivou nakon davanja prve doze. Metode mogu obuhvatati merenje lizo-SPM u biološkim uzorcima iz perifernog tkiva i identifikovanje pacijenta da boluje od ASM poremećaja detektovanjem izmenjenih nivoa lizo-SPM. Metode takođe obuhvataju praćenje ili podešavanje tretiranja ASM poremećaja kod pacijenta detektovanjem nivoa jednog ili više markera toksičnosti, uključujući lizo-SPM, koji su izmenjeni kao rezultat tretiranja pacijenta terapeutskim sredstvom, npr., sredstvom koje smanjuje nivo SPM u tkivu pacijenta. Metode omogućuju neinvazivnu procenu kod takvih pacijenata.

[0014] Ovde obelodanjene metode se takođe mogu koristiti za skrining, dijagnostikovanje, praćenje napredovanja tretiranja i/ili za prilagođavanje tretiranja za ASM poremećaj, kao što je NPD. Na primer, metode obuhvataju podešavanje doze terapeutskog sredstva koje se daje pacijentu za tretiranje ASM poremećaja merenjem markera toksičnosti (npr., lizo-SPM) kako bi se održavali nivoi toksičnih metabolita kao rezultat tretiranja. Ovde obelodanjene metode se mogu koristiti za praćenje dugoročne efikasnosti toka tretiranja kod ASM bolesti (npr., ukoliko se nivoi lizo-SPM ne smanje u toku tretiranja, to može ukazati da tretiranje nije delotvorno). Metode se takođe mogu koristiti za skrining ispitanika (npr., pacijenata koji su pre-simptomatički) za povećani lizo-SPM kao početna indikacija ASM poremećaja.

Ispitanicima za koje je identifikovano da imaju povišeni lizo-SPM u skriningu se može dati dodatno procenjivanje (npr., ASM testiranje krvi, genetsko testiranje, itd.) kako bi se dijagnostikivala/potvrdila dijagnoza ASM poremećaja, dok ispitanici koji nisu pokazali povišeni lizo-SPM ne bi dobili dodatnu procenu. Takva metoda skrininga bi potencijalno smanjila troškove testiranja.

[0015] Ovde obelodanjene metode mogu obuhvatati merenje lizo-SPM u biološkom uzorku od ispitanika koji je čovek i davanje terapeutskog sredstva za tretiranje ASM poremećaja (npr., terapija ERT, šaperonom, i/ili terapija redukovanja supstrata) pri optimizovanim koncentracijama na osnovu izmerenog nivoa lizo-SPM. U različitim otelotvorenjima, biološki uzorak je uzorak perifernog tkiva. U određenim otelotvorenjima, biološki uzorak može biti uzorak plazme, pune krvi (npr., kap osušene krvi), serum i/ili urin. Upotreba uzorka perifernog tkiva za merenje nivoa lizo-SPM može izbeći potrebu za invazivnim procedurama kao što je biopsija jetre.

OPIS SLIKA

[0016] SL. 1A je dijagram koji prikazuje odnos SPM koncentracije na kapima osušene krvi (DBS) kod NPD-A i NPD-B pacijenata i vrednosti srednje koncentracije za DBS kod normalnih kontrolnih uzoraka. SL.1B je dijagram koji prikazuje odnos lizo-SPM koncentracija za DBS kod NPD-A i NPD-B pacijenata i vrednosti srednje koncentracije za DBS kod normalnih kontrolnih uzoraka.

SL. 2 je histogram koji prikazuje koliko je puta povećana koncentracija lizo-SPM (vertikalna osa) za DBS kod ASM „knockout“ miševa pri ukazanim vremenskim tačkama (1, 2, 4, 6, 24, 48 i 72 sati nakon davanja doze), u poređenju sa koncentracijom 5 minuta nakon davanja jedne doze od 0, 3 ili 20 mg/kg rhASM.

SL. 3 prikazuje koncentraciju lizo-SPM (ng/ml) za DBS dobijenu za miševe divljeg tipa (C57BL/6) ili ASM „knockout“ (ASMKO) miševe nakon davanja jedne doze (10 mg/kg) ili nakon smanjenja režima doziranja (3 mg/kg) koje je praćeno dozom od 20 mg/kg rhASM. Uzeti su uzorci krvi pri sledećim vremenskim tačkama: 5 minuta, 4 sata, 6 sati, 24 sata i 72 sata nakon davanja doze. Životinje u grupi doziranja od 10 mg/kg su bile eutanazirane 24 sata nakon vremenske tačke.

SL. 4 je histogram koji prikazuje koncentraciju lizo-SPM (ng/ml) za DBS kod ljudskog Niemann-Pick pacijenta koja je uzeta pre davanja doze, 24, 48 i 72 sata nakon davanja doze rhASM u periodu od 26 nedelja. Doze (0,1, 0.3, 0.6, 1, 2 ili 3 mg/kg) i datum davanja (dan 1, nedelja 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 i 26) su ukazani na horizontalnoj osi. Nakon 26 nedelja, uzorci su uzeti samo pre davanja doze i pri 24 i 48 sati nakon davanja doze.

DETALJNI OPIS

[0017] Sada će biti data detaljna referenca na određene primerne aspekte prema predmetnom obelodanjivanju, određene primere koji su prikazani u priloženim slikama. Gde god je moguće, isti referentni brojevi će se koristiti na slikama kako bi predstavili iste ili slične delove.

[0018] U ovoj patentnoj prijavi, upotreba jednine obuhvata množinu koliko nije naročito navedeno suprotno. U ovoj prijavi upotreba „ili“ označava „i/ili“ ukoliko nije drugačije navedeno. U nastavku, upotreba termina „obuhvatati“ kao i drugih oblika, kao što su „obuhvata“ i „obuhvaćeno“ nisu ograničavajuća. Prihvatiće se da bilo koji ovde opisani opseg obuhvata krajnje tačke i sve vrednosti između krajnjih tačaka.

[0019] Naslovi odeljaka koji su ovde upotrebljeni za organizacione svrhe samo i nisu konstruisani da ograničavaju opisanu tematiku.

[0020] Ovde su obelodanjene nove metode za skrining, dijagnostikovanje, praćenje napredovanja tretiranja i/ili za podešavanje doze terapeutskog sredstva za tretiranje ASM poremećaja, kao što je NPD. „ASM poremećaj“ može obuhvatati bilo koji poremećaj koji je povezan sa smanjenim ispoljavanjem ili oslabljenom funkcijom kisele sfingomijelinaze (ASM deficijencija ili ASMD). ASM poremećaj takođe može obuhvatati bilo koji poremećaj koji je povezan sa akumulacijom sfingomijelina u tkivu. Prema pronalasku, ASM poremećaj je deficijencija kisele sfingomijelinaze (ASMD).

[0021] U nekim apsektima, metode mogu obuhvatati davanje ispitaniku prve doze terapeutskog sredstva za tretiranje ASM poremećaja koja ima prvu koncentraciju; i zatim davanje ispitaniku druge doze terapeutskog sredstva koja ima drugu koncentraciju koja je jednaka ili veća od prve koncentracije ukoliko je određeno da ispitanik ima nivo lizo-SPM koji je manji ili jednak referentnom nivou (npr., nivo u uzorku od kontrolnog ispitanika koji nema ASM poremećaj, ili početni nivo izmeren za pacijenta pre tretiranja) nakon davanja prve doze.

[0022] U određenim aspektima, metode obuhvataju uzimanje i merenje lizo-sfingomijelina (lizo-SPM) biološkom uzorku od ljudskog ispitanika. Merenje nivoa lizo-SPM se može koristiti za skrining, dijagnostikovanje, praćenje napredovanja tretiranja i/ili za podešavanje doze terapeutskog sredstva za tretiranje ASM poremećaja. Metode su zasnovane na otkriću da je lizo-SPM značajno povećan u biološkim uzorcima iz perifernog tkiva pacijenata sa ASM poremećajima kao što je NPD, što omogućava neinvazivnu procenu takvih pacijenata, uključujući skrining i dijagnostikovanje ASM poremećaja i praćenje/kalibrisanje/upravljanje terapijom za ASM poremećaj. Metode su takođe zasnovane na otkriću da razgradnja akumuliranog ASM za vreme tretiranja može dovesti do povećanih nivoa markera (npr., lizo-SPM) što daje signal proizvodnji toksičnih i štetnih metabolita, i ovi štetni nivoi metabolita se mogu izbeći metodom davanja terapeutskog sredstva koje je osmišljeno da smanji nivoe SPM (npr., terapija ERT, šaperonom, i/ili terapija redukovanja supstrata) pri dozama koje sprečavaju prekomernu proizvodnju metabolita. Merenje povećane koncentracije lizo-SPM se može koristiti za detektovanje proizvodnje takvih metabolita i može se koristiti za kalibrisanje terapije kako bi se izbegla proizvodnja prekomerno povećanih nivoa metabolita (npr., toksični nivoi). U određenim aspektima, nivo lizo-SPM kod pacijenta koji prima terapiju za ASM poremećaj određuje to da li će se doza povećati, smanjiti, ponoviti, odložiti ili prekinuti.

[0023] Detekcija povišenih nivoa lizo-SPM kod ispitanika koji ima ASM poremećaj (npr., NPD pacijenti) se može koristiti kao deo metode za praćenje štetnih neželjenih dejstava za vreme tretiranja. Na primer, metoda može obuhvatati uzimanje biološkog uzorka od ispitanika, merenje nivoa lizo-sfingomijelina (lizo-SPM) meri u uzorku, poređenje izmerenog nivoa lizo-SPM iz uzorka sa referentnim nivoom kako bi se detektovalo štetno neželjeno dejstvo ukoliko je nivo lizo-SPM u uzorku bio povećan. U nekim aspektima, ukoliko je nivo lizo-SPM povećan za prethodno određenu količinu u poređenju sa referentnim uzorkom (npr., referentni nivou u uzorku od kontrolnog ispitanika koji nema ASM poremećaj), ili je nivo lizo-SPM povećan za prethodno određenu količinu kod ispitanika vremenom za vreme trajanja tretiranja (tj., povećanje u odnosu na početni nivo kod pacijenta pre tretiranja, ovde se takođe naziva referentnim nivoom), onda se izmereni nivo lizo-SPM može koristiti kao indikacija o štetnom neželjenom dejstvu tretiranja. U nekim otelotvorenjima, tretiranje je terapiji zamene enzima (ERT) i doziranjem ERT se upravlja uzimanjem jednog ili više bioloških uzoraka od pacijenta, testiranjem svakog uzorka za povećanje lizo-SPM, i podešavanje doze ERT nivoa koja ne izaziva povišene nivoe lizo-SPM preko prethodno postavljene vrednosti. Upravljanje dozom terapeutskog sredstva može obuhvatati povećavanje, smanjivanje, održavanje koncentracije terapeutskog sredstva i/ili diskontinualno tretiranje. U određenim otelotvorenjima, uzet je jedan ili više bioloških uzoraka nakon što je data doza terapeutskog sredstva i/ili neposredno pre nego što je data sledeća doza terapeutskog sredstva. u nekim otelotvorenjima, štetno neželjeno dejstvo se može detektovati ukoliko je nivo lizo-SPM u biološkom uzorku (npr., uzorak krvi kao što je plazma, serum ili kap osušene krvi) veći nego referentni nivo za oko 100-700 ng/ml (npr., veći za oko 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600 ili 700 ng/ml, ili bilo koja koncentracija između), ili ukoliko se nivo lizo-SPM u biološkom uzorku poveća za bar oko 1.1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, ili 10 puta ili više (ili bilo koja vrednost između) u odnosu na referentni nivo. Na primer, povećanje može biti bar oko 3 puta. Referentni nivo može biti, npr., nivo u uzorku od kontrolnog ispitanika koji nema ASM poremećaj ili početni nivo izmeren za pacijenta pre tretiranja dozom terapeutskog sredstva.

[0024] Takođe su ovde obelodanjene metode za tretiranje ispitanika koji ima ASM poremećaj (npr., NPD). U različitim aspektima, metoda obuhvata davanje terapeutskog sredstva za tretiranje ASM poremećaja (npr. ERT, terapija šaperonom, i/ili terapija redukovanja supstrata) u uzastopnim dozama koncentracije koja se povećava i praćenje ispitanika za povećane nivoe

1

lizo-SPM u biološkom uzorku nakon svake doze (npr., 1 minut, 5 minuta, 10 minuta, 30 minuta ili 45 minuta ili 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15 ili 20 sati ili 1 dan, 2 dana, 5 dana, 1 nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje ili 4 nedelje nakon doziranja ili bilo koji period između), ili samo pre naredne doze. Praćenje ispitanika može obuhvatati uzimanje biološkog uzorka od ispitanika, merenje nivoa lizo-SPM u uzorku, poređenje nivoa lizo-SPM u uzorku sa referentnim nivoom (npr., nivo u uzorku od donora koji nema ASM poremećaj ili nivoa kod ASM pacijenta pre tretiranja) i detektovanje povećanog nivoa lizo-SPM u uzorku u poređenju sa referentnim nivoom. U nekim otelotvorenjima, referentni nivo je nivo lizo-SPM koji je izmeren u biološkom uzorku od kontrolnog ispitanika koji nema ASM poremećaj. U nekim otelotvorenjima, referentni nivo je nivo lizo-SPM koji je izmeren u uzorku od ispitanika nakon davanja prethodno, manje doze ERT ili pre davanja ERT uopšte. U nekim otelotvorenjima, povećani nivo lizo-SPM u biološkom uzorku (npr., uzorak krvi kao što je uzorak seruma, uzorak plazme ili kap osušene krvi) je nivo veći od referentnog nivoa za, npr., oko 100-700 ng/ml. U nekim otelotvorenjima, povećani nivo lizo-SPM u biološkom uzorku (npr., uzorku krvi) je nivo veći od referentnog nivoa bar 1,1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ili 10 puta, ili više (ili bilo koja vrednost između). Na primer, nivo može biti veći bar oko 3 puta. U nekim otelotvorenjima, doza ERT sa većom koncentracijom se ne daje ukoliko je povećani nivo lizo-SPM detektovan nakon davanja prethodne doze.

[0025] Pored praćenja terapije i terapeutskih metoda, ovde su obelodanjene metode za skrining i/ili dijagnostikovanje ASM poremećaja (npr., NPD) kod ispitanika. U različitim aspektima, metoda obuhvata uzimanje biološkog uzorka od ispitanika, merenje nivoa lizo-SPM u uzorku, poređenje nivoa lizo-SPM u uzorku sa referentnim nivoom i detektovanje/dijagnostikovanje ASM poremećaja ukoliko je nivo lizo-SPM u uzorku povećan relativno u odnosu na referentni uzorak. U nekim aspektima, referentni uzorak je uzorak od kontrolnog ispitanika koji nema ASM poremećaj. U nekim aspektima, može se izvršiti skrining za ASM poremećaj i/ili izvršiti dijagnoza ukoliko je nivo lizo-SPM u biološkom uzorku (npr., uzorak krvi kao što je uzorak plazme, uzorak seruma ili kap osušene krvi) veći od referentnog nivoa bar 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ili 10 puta, ili više (ili bilo koja vrednost između) ili veći od referentnog nivoa za bar oko 200-2000 ng/ml, kao što je bar oko 200 ng/ml, bar oko 250 ng/ml, bar oko 300 ng/ml, bar oko 400 ng/ml, bar oko 500 ng/ml, bar oko 525 ng/ml, bar oko 575 ng/ml, bar oko 700 ng/ml, i/ili bar oko 900 ng/ml (npr., veće od oko 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 ili 2000 ng/ml, ili bilo koja koncentracija između). U nekim aspektima, biološki uzorak od normalnog ispitanika može imati nivo lizo-SPM u opsegu od oko 25-200 ng/ml (npr., oko 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, ili 200 ng/ml, ili bilo koja koncentracija između).

Merenje nivoa lizo-SPM

[0026] Za razmatranje hemijske strukture lizo-SPM, videti, npr., Ito i dr., J. Biol. Chem.270: 24370-4 (1995); takođe videti Caymen Chemical Co. stavku broj 10007947, koja je data u njihovom katalogu na adresi: https://www.caymanchem.com/app/template/Product.vm/catalog/10007947.

[0027] Ovde obelodanjene metode mogu obuhvatati merenje lizo-SPM iz različitih bioloških uzoraka, uključujući uzorke iz perifernog tkiva. Bilo koja metoda za uzimanje, pripremanje i kvantifikovanje nivoa lizo-SPM iz biološkog uzorka se može primeniti. Nivo lizo-SPM u biološkom uzorku se može kvantifikovati upotrebom spektrometra, kao što je maseni spektrometar, npr., LC/MS/MS, ili elektromagnetni spektrometar, npr., UV-VIS, IR ili NMR. U nekim otelotvorenjima, metoda za kvantifikovanje nivoa lizo-SPM može obuhvatati uzimanje biološkog uzorka (npr., aterijskom ili venskom punkturom, biopsijom tkiva, bukalnim otiskom, uzorkom urina, itd.), detektovanje i/ili odvajanje lizo-SPM od drugih komponenti uzorka (npr., upotrebom antitela, hemijske supstance za indikaciju, masenog spektrometra kao što je LC/MS/MS, ili elektromagnetnog spektrometra kao što je UV-VIS, IR ili NMR) i poređenje nivoa lizo-SPM sa nivoom referentnog uzorka.

[0028] Nivoi lizo-SPM se mogu izmeriti u biološkim uzorcima različitog tkiva ovde opisanim metodama. Na primer, biološki uzorci iz perifernog tkiva, kao što su plazma, puna krv (npr. kap osušene krvi), serum, koža i/ili urin se mogu uzeti za upotrebu kod detektovanja povišenih nivoa lizo-SPM. Biološki uzorci drugog tkiva se takođe mogu koristiti, npr., tkivo slezine, pluća, srca, jetre, bubrega i/ili mozga. Uzorci kombinacije dva ili više tkiva se mogu koristiti (npr., 2, 3, 4, 5 ili više tkiva). U nekim otelotvorenjima, upotreba biološkog uzorka iz perifernog tkiva može izbeći potrebu za invazivnim procedurama kao što je biopsija jetre.

[0029] U nekim otelotvorenjima, biološki uzorak je izložen jednom ili više koraka prethodnog tretiranja pre detekcije i/ili merenja u uzorku lizo-SPM. U određenim otelotvorenjima, uzorak se prethodno tretira centrifugiranjem, filtriranjem, taloženjem, dijalizom ili hromatografijom, ili kombinacijom takvih koraka prethodnog tretiranja. U drugim otelotvorenjima, uzorak se prethodno tretira zamrzavanjem, hemijskom fiksacijom, postavljanjem u parafin, dehidracijom, permeabilizacijom, i/ili homogenizacijom, što je praćeno centrifugiranjem, filtriranjem, taloženjem, dijalizom i/ili hromatografijom. U određenim otelotvorenjima, uzorak se prethodno tretira uklanjanjem ćelija određenog tipa iz uzorka ili uklanjanjem taloga iz uzorka pre procenjivanja lizo-SPM.

[0030] U različitim otelotvorenjima, biološki uzorak se procenjuje upotrebom uređaja za kvantifikovanje ili semi-kvantifikovanje nivoa jednog ili više markera u uzorku. Na primer, nivo lizo-SPM i/ili drugih markera u uzorku se može proceniti kvantitativno ili semikvantitativno. U nekim otelotvorenjima, uređaj za kvantifikovanje nivoa lizo-SPM i/ili drugih markera u biološkom uzorku, kao što je tečna hromatografija-masena spektrometrija (npr., LC/MS/MS) se može koristiti. U nekim otelotvorenjima, jedno ili više antitela ili drugih detekcionih sredstava se može koristiti za vezivanje lizo-SPM i/ili drugih markera u biološkom uzorku. Može se primeniti jedno ili više sredstava (npr., kolorimetrijsko sredstvo) koje reaguje sa detekcionim sredstvom kako bi se emitovao signal koji se može detektovati čija se snaga, intenzitet, boja, itd., može koristiti za semi-kvantitativno ili kvantitativno određivanje nivoa lizo-SPM i/ili drugih markera u uzorku (npr., poređenjem sa signalom od jednog ili više referentnih uzoraka). Dodatne metode za kvantifikovanje lizo-SPM i/ili drugih markera u biološkom uzorku se takođe mogu primeniti, npr., imunološke probe kao što su ELISA, imunoprecipitacija, i Western blot analiza, kao i sortiranje fluorescentno aktiviranih ćelija (FACS, transfer rezonantne energije fluorescencije (FRET), RT-PCR, i/ili Northern blot analiza.

Upravljanje tretiranjem ASM poremećaja

[0031] U različitim aspektima, nivoi lizo-SPM se mogu izmeriti kao deo terapije ASM poremećaja. Na primer, ASM poremećaj može biti Niemann-Pick bolest (NPD), npr., NPD-A, NPD-B ili NPD-C. Terapija za ASM poremećaj može obuhvatati davanje jednog ili više terapeutskih sredstava koja smanjuju nivoe SPM u tkivima pacijenta (npr., ERT, terapija šaperonom i/ili terapija redukovanja supstrata). Na primer, metoda terapije zamene enzima (ERT) sa eskalacijom doze kod pacijenta se može primeniti, kao što su ASM metode sa eskalacijom doze koje su opisane u patentnoj prijavi SAD br.2011/0052559 (videti, na

1

primer, paragrafe [0063]-[0075], koji opisuju protokole sa eskalacijom doze).

[0032] U različitim aspektima, ovde je obelodanjena metoda za praćenje štetnih neželjenih dejstava kod ispitanika (npr., proizvodnja toksičnih ili štetnih nivoa metabolita) praćenjem markera kao što je lizo-SPM za vreme terapije sa eskalacijom doze za ASM poremećaj. Metoda može obuhvatati uzimanje biološkog uzorka od ispitanika, merenje nivoa lizo-SPM u uzorku, poređenje nivoa lizo-SPM u uzorku sa referentnim nivoom i detektovanje štetnog neželjenog dejstva ukoliko je nivo lizo-SPM u uzorku bio povećan u poređenju sa referentnim nivoom. Može se uzeti jedan ili više uzoraka i proceniti nakon davanja doze terapeutskog sredstva ili pre davanja sledeće doze. Na primer, uzorci se mogu uzeti i proceniti 1 minut, 5 minuta, 10 minuta, 30 minuta ili 45 minuta ili 1, 2, 3, 5, 10, 12, 15 ili 20 sati ili 1, 2, 3, 4, 5 dana ili 1, 2, 3 ili 4 nedelje nakon davanja terapeutske doze ili u bilo kom periodu između ili pre davanja sledeće doze. U nekim aspektima, referentni uzorak je uzorak od kontrolnog ispitanika koji nema ASM poremećaj. U nekim aspektima, referentni uzorak je raniji biološki uzorak od ispitanika pre davanja doze sa većom koncentracijom terapeutskog sredstva (ili pre davanja bilo kog terapeutskog sredstva). U nekim aspektima, ukoliko se nivo lizo-SPM poveća za prethodno određenu količinu ili iznad prethodno određene početne vrednosti nakon davanja početne doze ili nakon davanja povećane (tj., sa većom koncentracijom) doze terapeutskog sredstva (npr., veća koncentracija ERT) u poređenju sa nivoom u referentom uzorku, onda se to može koristiti kao indikacija o štetnom neželjenom dejstvu tretiranja. U određenim aspektima, ukoliko se nivo lizo-SPM ne poveća ili se ne poveća preko početnog nivoa onda se to može koristiti kao indikacija da nije došlo do neželjenog štetnog dejstva.

[0033] U različitim aspektima, data je terapija za ASM poremećaj. Terapija može obuhvatati davanje jednog ili više terapeutskih sredstava koja smanjuju nivoe SPM u tkivima pacijenta (npr., ERT, terapija šaperonom i/ili terapija redukovanja supstrata). Prema pronalasku, terapija obuhvata ERT (tj., terapiju zamene ASM sa rekombinantnom ljudskom ASM (rhASM)). Terapija može obuhvatati praćenje povišenih nivoa lizo-ASM kod ispitanika za vreme terapije i podešavanje koncentracije terapeutskog sredstva (npr., koncentracije doze ERT) kako bi se smanjili nivoi lizo-SPM ispod prethodno određenog početnog nivoa. U nekim otelotvorenjima, praćenje obuhvata procenjivanje uzorka za povećane nivoe lizo-SPM nakon svake doze terapeutskog sredstva ili pre davanja svake sledeće doze terapeutskog sredstva. U određenim otelotvorenjima, praćenje nakon svake doze je opciono, i sprovodi se periodično nakon određenih doza terapeutskog sredstva ili pre davanja određene sledeće doze terapeutskog sredstva.

[0034] U nekim aspektima, terapija može obuhvatati davanje ERT (npr., terapija zamene ASM) u uzastopnim dozama sa koncentracijama koje se povećavaju, uzimanje bioloških uzoraka od pacijenta nakon određenih doza (npr., nakon svake doze ili pre svake sledeće doze), detektovanje nivoa lizo-SPM u uzorku (npr., upotrebom LC/MS/MS) i praćenje ispitanika za povećane nivoe lizo-SPM nakon svake doze ili pre davanja sledeće doze. Na primer, biološki uzorci se mogu uzeti i pratiti za povišene nivoe lizo-SPM 1 minut, 5 minuta, 10 minuta, 30 minuta ili 45 minuta ili 1, 2, 3, 5, 10, 12, 15 ili 20 sati ili 1, 2, 3, 4, 5 dana ili 1, 2, 3 ili 4 nedelje nakon davanja ERT doze u bilo kom periodu između ili pre davanja sledeće doze. Praćenje ispitanika može obuhvatati uzimanje biološkog uzorka od ispitanika, merenje a lizo-SPM u uzorku, poređenje nivoa lizo-SPM u uzorku sa referentnim nivoom i podešavanje doze ERT ukoliko je nivo-SPM u povećan za prethodno određenu količinu u odnosu na referentni uzorak. U nekim otelotvorenjima, referentni uzorak je uzorak od kontrolnog ispitanika koji nema ASM poremećaj. U nekim otelotvorenjima, referentni uzorak je raniji biološki uzorak od ispitanika pre davanja doze sa većom koncentracijom ERT (ili pre davanja bilo kog ERT). U nekim otelotvorenjima, ukoliko se nivo lizo-SPM poveća za prethodno određenu količinu u uzorku od ispitanika i/ili je veći od referentne početne vrednosti, onda se to može koristiti kao indikacija o tome bi trebalo ERT dozu smanjiti, prolongirati ili okončati kako bi se izbegla proizvodnja toksičnih ili štetnih nivoa metabolita. U nekim otelotvorenjima, ukoliko je nivo lizo-SPM jednak ili ispod prethodno određene vrednosti onda se sledeća doza sa jednakom ili većom koncentracijom može dati.

[0035] U različitim aspektima, data je terapija sa eskalacijom doze koja obuhvata davanje ERT ispitaniku sa dozama koje se vremenom povećavaju kako bi se uklonio akumulirani SPM bez proizvodnje toksičnih ili štetnih nivoa metabolita kao rezultat nagle hidrolize akumuliranog SPM. U nekim otelotvorenjima, biološki uzorci od pacijenta se prate za povećane nivoe lizo-SPM za vreme terapije sa eskalacijom doze, kako bi povećani nivoi lizo-SPM ukazali na proizvodnju toksičnih ili štetnih nivoa metabolita. U nekim otelotvorenjima, ukoliko su detektovani nivoi lizo-SPM iznad prethodno određene početne koncentracije, ili ukoliko je detektovano veliko povećanje nivoa lizo-SPM u poređenju sa nivoima u prethodnom uzorku, onda se povećana doza ERT prolongira ili se ne daje. ERT se može dati na bilo koji način koji je pogodan za postizanje terapeutskog dejstva, uključujući intravenski, intradermalni, subkutani, intraperitonealni, intrapulmonalni, topikalni, intranazalni, intrakranijalni ili intramuskularni način.

1

[0036] U nekim aspektima, ERT može obuhvatati davanje kisele sfingomijelinaze (ASM), kao što je rekombinantna ljudska ASM (rhASM), ili ERT može obuhvatati davanje modifikovane ASM (npr., modifikovana rhASM). Modifikovana ASM može obuhvatati bilo koju modifikaciju enzima koji ne menja značajno svoju sposobnost da vrši hidrolizu lipozomalnog sfingomijelina u keramid i fosforilholin (npr., modifikovana ASM pokazuje bar 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99, 99,5 ili 99.9% enzimske aktivnosti nemodifikovane ASM, ili bilo koji procenat između). Hidrolitička sposobnost modifikovane ASM se može proceniti tehnikama koje su poznate stručnjaku u ovoj oblasti, kao što su one opisane u pat. SAD br.4,039,388, 4,082,781, 5,686,240, i ,563,591, i međunarodnim patentnim objavama br. WO 2007/078806 i WO 2006/058385. Terapija zamene enzima sa eskalacijom doze upotrebom kisele sfingomijelinaze (ASM) za tretiranje ljudskih ispitanika koji imaju deficijenciju kisele sfingomijelinaze (ASMD) je opisana u WO 2011/025996. Faza jedan probnog rhASM tretiranja u kontekstu ERT kod ASM bolesti je izvršena na odraslim ljudima (videti Mc Govern i dr., „A phase 1 trial of recombinant human acid sphingomyelinase (rhASM) enzyme replacement therapy in adults with ASM deficiency (ASMD), 2012 retrieve on http://www.nnpdf.org/documents/“).

[0037] U nekim aspektima, ERT može obuhvatati davanje rekombinantne ljudske ASM (rhASM) ili modifikovane rhASM. Postoje različite izoforme ljudske ASM koje su poznate u struci, koje se sve mogu koristiti u ovde obelodanjenim metodama. Videti, npr., patentnu prijavi SAD.2011/0052559 (videti, npr., razmatranje izoformi ljudske ASM i njenih enzimskih konjugata i njihovu upotrebu u ERT u paragrafima [108]-[0117] i [0124]-[0127]).

[0038] U nekim otelotvorenjima, terapiji zamene enzima se daje ispitaniku pri početno niskoj, netoksičnoj dozi koja se zatim povećava pri sledećim davanjima. Najveća doza enzima koji ispitanik može tolerisati bez izazivanja toksičnih ili štetnih nivoa metabolita (kao što je detektovano, npr., praćenjem nivoa markera toksičnosti kao što je lizo-SPM) se zatim može koristiti kao doza za održavanje. Alternativno, terapeutski delotvorna doza koja je manja od najveće tolerisane doze se može koristiti kao doza za održavanje. Terapeutski delotvorna doza može obuhvatati bilo koju dozu koja je dovoljna da se smanji koncentracija akumuliranog sfingomijelina kod ASM ispitanika za bar oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 99% (ili bilo koji procenat između) nakon jednog ili više ciklusa davanja.

1

[0039] Tretiranje ASM poremećaja, kao što je NPD, zahteva dovoljno visoke doze terapeutskog sredstva (npr., ERT, terapija šaperonom i/ili terapija redukcije supstrata) kako bi se postigla adekvatna distribucija terapeutskog sredstva u organima patologije (npr., slezina, pluća, jetra, srce, bubrezi i mozak). Prikazano je da se, nakon intravenskog davanja rekombinantne ljudske ASM kod ASM „knockout“ miševa, većina ASM aktivnosti prenosi na jetru, dok se male količine ASM enzimske aktivnosti detektuje u drugim organima, kao što su slezina, srce, jetra, bubrezi i pluća. Videti, npr., He i dr., Biochimia et Biophsyica Acta 1432: 251-264 (1999), Miranda i dr., FASEB Journal, 14(13): 1988-1995 (2000). Prema tome, doze koje imaju povećane koncentracije terapeutskog sredstva (npr., visoke koncentracije enzima za zamenu) mogu biti potrebne kako bi se postigla adekvatna distribucija i isporuka u, npr., pluća, jetru, srce i bubrege kod ispitanika koji imaju ASM poremećaj, kao što je NPD.

[0040] Ispitivanja na ASM „knockout“ miševima su takođe pokazala da terapiji zamene enzima može, pri dovoljno visokim dozama, za rezultat dati proizvodnju toksičnih ili na drugi način štetnih metabolita sfingomijelina. Videti, npr., C. Nickerson, i dr., American Society of Human Genetics (2005); i J. Murray i dr., Society of Toxicology (2006). Bez vezivanja za teoriju, davanje visokih doza ASM NPD ispitanicima može za rezultat dati hidrolizu velikih količina akumuliranog sfingomijelina u keramid ili fosfatidilholin. Poznato je da keramid ima ulogu u ćelijskoj smrti i može biti pro-apoptičko sredstvo. Videti, npr., Smith i Schuchman, FASEB 22: 3419-3431 (2008). Zbog toga, keramid može doprineti toksičnim neželjenim dejstvima koja se primećuju kod ASM „knockout“ miševa i kod NPD ispitanika.

[0041] Zbog toga, kalibracija i koordinacija terapije (npr., ERT, terapija šaperonom i/ili terapija redukcije supstrata) su potrebne kako bi se pružila dovoljna koncentracija terapeutskog sredstva kako bi se smanjila ili sprečila buduća akumulacija lipozomalnog sfingomijelina u organima patologije, dok se takođe izbegava proizvodnja prekomernih koncentracija toksičnih metabolita. U nekim aspektima, ova koordinacija se ostvaruje pružanjem protokola sa eskalacijom doze procenjivanjem nivoa toksičnog markera, kao što je lizo-SPM u uzorku od pacijenta nakon određenih doza ili nakon svake doze i, ukoliko je neophodno, podešavanjem režima doziranja kao što je ovde opisano. Upravljanje dozom terapeutskog sredstva može obuhvatati povećavanje, smanjivanje, održavanje koncentracije terapeutskog sredstva i/ili diskontinualno tretiranje.

1

[0042] U različitim otelotvorenjima, metoda tretiranja sa eskalacijom doze obuhvata davanje jedne ili više početnih niskih doza terapeutskog sredstva (npr., enzim za zamenu) ispitaniku kako bi se smanjila količina sfingomijelina koja se akumulirala u ispitaniku. Doza terapeutskog sredstva se zatim može dati pri sistematski većim koncentracijama dok se najveća doza koja se toleriše od strane pacijenta i koja je terapeutski delotvorna dostigne. U nekim otelotvorenjima, terapeutsko sredstvo je enzim za zamenu (rhASM) i daje se tako da enzimska aktivnost u jednom ili više organa patologije (npr., organ koji pokazuje povećane lipozomalne nivoe SPM kod pacijenta koji boluje od ASM poremećaja) bude bar oko 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% (ili bilo koji procenat između) nivoa aktivnosti u odgovarajućem organu kod ispitanika koji ne boluje od ASM poremećaja (npr., zdrav ispitanik).

[0043] U nekim aspektima, metoda za tretiranje ASM poremećaja obuhvata: (a) davanje režima zamene enzima za smanjenje akumuliranja sfingomijelin supstrata u ispitaniku koje obuhvata: (i) davanje početne niske doze rhASM ili modifikovane rhASM ispitaniku; i (ii) davanje uzastopnih većih doza rhASM ili modifikovane rhASM ispitaniku (eskalacija doze); (b) praćenje ispitanika za povećane nivoe lizo-SPM i/ili za jedan ili više dodatnih markera štetnih neželjenih dejstava nakon određenih doza, ili nakon svake doze, koje su date u koracima (a)(i) i (a)(ii) (npr., upotrebom LC/MS/MS kako bi se kvantifikovala lizo-SPM koncentracija); (c) ponavljanje, smanjenje i/ili određivanje protokola za eskalaciju doze nakon što su povećani nivoi lizo-SPM detektovani i/ili nakon što je jedno ili više dodatnih štetnih neželjenih dejstava detektovano. U određenim aspektima, metode dalje obuhvataju davanje režima za održavanje koji obuhvata davanje doze koja je jednaka ili manja od najveće doze tolerisane od strane ispitanika kao doza za održavanje, i opciono dalje praćenje povišenih nivoa lizo-SPM za vreme davanja režima održavanja. U određenim otelotvorenjima, početna doza rhASM ili modifikovane rhASM može biti u opsegu od oko 0,03 mg/kg do oko 1,0 mg/kg ili oko 0,1 mg/kg do oko 0,5 mg/kg (koncentracija doze se meri kao mg enzima po kg telesne mase). U nekim otelotvorenjima, svaka uzastopna doza sa povećanom enzimskom koncentracijom se daje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana ili 1, 2, 3, 4 ili 5 nedelja nakon prethodne doze. U nekim otelotvorenjima, uzastopna doza sa povećanom enzimskom koncentracijom može biti pri koncentraciji od između oko 0,1 i 5 mg/kg (npr., oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 ili 5 mg/kg ili bilo koja koncentracija između).

[0044] U nekim otelotvorenjima, doza enzima za zamenu pri datoj koncentraciji se daje bar

1

dva puta (npr., bar 2, 3, 4 ili 5 puta) pre nego što se da sledeća doza sa većom koncentracijom. U određenim otelotvorenjima, sukcesivno veća doza bože biti približno 0,03 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,75 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg ili 5 mg/kg veća od prethodne doze (ili bilo koja vrednost između). U nekim otelotvorenjima, sukcesivno veća doza može biti od oko 0,03 do oko 0,1 mg/kg, od oko 0,1 mg/kg do oko 0,5 mg/kg, od oko 0,5 mg/kg do oko 1 mg/kg, od oko 0,5 mg/kg do oko 2 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 2 mg/kg, od oko 2 mg/kg do oko 4 mg/kg ili od oko 2 mg/kg do oko 5 mg/kg veća od prethodne doze (ili bilo koja vrednost između). U određenim otelotvorenjima, najveća doza tolerisana od strane ispitanika bez izazivanja toksičnih ili štetnih metabolita može biti oko od 1,0 mg/kg do oko 3,0 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, najveća tolerisana doza se uzastopno daje ispitaniku koji je čovek kao doza za održavanje. U nekim otelotvorenjima, doza za održavanje se daje oko svakih od 1 do 8 nedelja (npr., svakih 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 nedelja, ili bilo koji period između).

[0045] Kada se identifikuje maksimalna tolerisana doza (npr., doza koja ne izaziva toksične ili druge štetne nivoe metabolita), može se koristiti kao doza za održavanje za tretiranje ispitanika. Doza za održavanje se može davati dnevno, nedeljno, dvonedeljno, mesečno, dvomesečno ili tromesečno (ili bilo koji interval između). Praćenje povećanih nivoa lizo-SPM se može sprovesti za vreme davanja režima za održavanje, npr., 1, 2, 3, 5, 10, 12, 15 ili 20 sati ili 1, 2, 3, 4, 5 dana ili 1, 2, 3 ili 4 nedelje nakon davanja doze za održavanje, ili u bilo kom periodu između. Ukoliko su povećani nivoi lizo-SPM detektovani (npr., nivoi veći od referentnog nivoa za bar oko 100-700 ng/ml, ili nivoi bar oko 1,1-10 puta veći od referentnog nivoa), onda se doza za održavanje može smanjiti ili prekinuti.

[0046] Određeni drugi parametri se mogu izmeriti u kombinaciji sa lizo-SPM kako bi se pratio ispitanik za vreme terapije (npr., za vreme ERT) i/ili kao deo terapije za određivanje maksimalne doze koja se može tolerisati od strane ispitanika. Na primer, ispitanik može biti dalje praćen merenjem nivoa SPM, nivoa keramida u plazmi i/ili bilirubin koncentracija. Ispitanik se takođe može pratiti za proizvodnju „reaktanata akutne faze“ i inflamatornih posrednika koji su mera inflamatornih odgovora i/ili drugih biohemijskih markera. Ovi biohemijski markeri mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, CRP/hs-CRP, citokine (npr., IL-8, II-6), kalcitonin i feritin. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više parametara koji su navedeni iznad se mogu pratiti kako bi se osigurao stabilan odgovor na terapiju pre povećanja

1

doze na veću koncentraciju. U nekim otelotvorenjima, ispitanik takođe može biti praćen za jednu ili više povezanih štetnih pojava, koje mogu obuhvatati konstitucione simptome (npr., groznica, mučnina, bol, mijalgija i ikterus). Kombinacije markera takođe mogu biti praćene (npr., nivoi lizo-SPM u kombinaciji sa bilirubin i/ili keramid nivoima se mogu pratiti).

Pogodne početni nivoi za markere koji se mogu pratiti u kombinaciji sa lizo-SPM su obelodanjeni, na primer, u patentnoj prijavi SAD br.2011/0052559 (videti, na primer, paragrafe [0067]-[0086]).

[0047] U nekim otelotvorenjima, ispitanik koji prolazi kroz protokol sa eskalacijom doze (npr., ERT protokol sa eskalacijom doze) se prati za toksična i štetna neželjena dejstva (npr., praćenjem nivoa jednog ili više markera toksičnosti, kao što je lizo-SPM) nakon svakog ciklusa terapeutskog davanja (npr., oko 1 minut, 5 minuta, 10 minuta, 30 minuta ili 45 minuta ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 ili 24 sata ili 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana ili 1, 2, 3 ili 4 nedelje ili više nakon davanja, ili bilo koji period između) ili pre davanja terapeutskog sredstva pri većoj koncentraciji. U nekim otelotvorenjima, ispitanik se prati nakon svakog davanja doze za održavanje (npr., oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 ili 24 časova ili 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana ili 1, 2, 3 ili 4 nedelje ili više nakon davanja, ili bilo koji period između) ili pre davanja uzastopne doze za održavanje terapeutskog sredstva. U nekim otelotvorenjima, ispitanik prima dozu za održavanje jednu, dve, tri ili više godina i periodično se prati za toksična i štetna neželjena dejstva. Praćenje može obuhvatati praćenje markera toksičnosti koji su spomenuti iznad, kao i praćenje povezanih štetnih pojava. Ukoliko ispitanik iskušava štetnu pojavu ili ukoliko jedan ili više praćenih markera ukazuje na štetno neželjeno dejstvo (npr., ukoliko je povećani nivo lizo-SPM detektovan), onda se davanje doze za održavanje može prekinuti ili prilagoditi (npr., smanjena koncentracija ERT se može dati) kako bi se smanjilo ili minimizovalo neželjeno dejstvo.

[0048] U različitim otelotvorenjima, ispitanik može biti praćen za toksičnu i/ili na drugačiji način štetnu dozu ERT merenjem nivoa lizo-SPM u biološkom uzorku koji je dobijen nakon davanja doze ERT (npr., nakon davanja rhASM ili modifikovanog rhASM). U nekim otelotvorenjima, metoda može obuhvatati uzimanje biološkog uzorka od ispitanika, merenje nivoa lizo-SPM u uzorku, poređenje nivoa lizo-SPM u uzorku sa referentnim nivoom i detektovanje štetnog neželjenog dejstva ukoliko je nivo lizo-SPM u uzorku povećan u poređenju sa referentnim uzorkom ili je povećan za naročitu vrednost u poređenju sa referentnim uzorkom. U nekim otelotvorenjima, sledeća doza ERT pri većim koncentracijama

2

se daje samo ukoliko nivo lizo-SPM u biološkom uzorku nije preko definisane početne vrednosti nakon davanja prethodne doze. Primeri pogodnih početnih nivoa su ovde opisani. U nekim otelotvorenjima nivoi lizo-SPM su takođe praćeni za vreme davanja doze za održavanje. U nekim otelotvorenjima, ukoliko nivo lizo-SPM prevazilazi definisanu početnu vrednost za vreme davanja doze za održavanje, onda se davanje doze za održavanje prekida ili se manja doza daje koja se ne ispoljava u nivou lizo-SPM preko definisane početne vrednosti.

[0049] U nekim otelotvorenjima, štetno neželjeno dejstvo ERT se može detektovati ukoliko je nivo lizo-SPM u biološkom uzorku veći od prethodno određenog referentnog nivoa. U nekim otelotvorenjima, štetno neželjeno dejstvo se može detektovati ukoliko je nivo lizo-SPM u biološkom uzorku (npr., uzorku krvi) veći od referentnog nivoa za oko 100-700 ng/ml (npr., veći za oko 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600 ili 700 ng/ml ili bilo koja koncentracija između). U nekim otelotvorenjima, štetno neželjeno dejstvo se može detektovati ukoliko je nivo lizo-SPM u biološkom uzorku (npr., uzorku krvi) veći od referentnog nivoa za bar oko 1,1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ili 10 puta ili više (ili bilo koja vrednost između). Na primer, povećanje može biti bar oko 3 puta.

[0050] U nekim otelotvorenjima, ovde date metode za tretiranje ASM poremećaja smanjuju zapreminu slezine kako je procenjeno tehnikama koje su poznate u struci, npr., MRI. U određenim otelotvorenjima, metode smanjuju nivoe sfingomijelina u jetri kako je procenjeno tehnikama koje su poznate u struci, npr., biohemijska analiza i/ili histomorfometrijska analiza uzoraka iz jetre. U nekim otelotvorenjima, metode povećavaju kapacitet vežbanja kako je procenjeno tehnikama koje su poznate u struci, npr., maksimalno opterećenje od strane ergometrije ciklusa, uključujući procenat predviđenog maksimalnog opterećenja, maksimalni unos kiseonika i/ili proizvodnja ugljen dioksida. U nekim otelotvorenjima, metode povećavaju plućne funkcije i/ili poboljšavaju klirens pluća, kako je procenjeno tehnikama koje su poznate u struci, npr., DLco, FVC, FEV i/ili TLC. U određenim otelotvorenjima, metode smanjuju sfingomijelin bronhoalveolnog lavaža (BAL). U određenim otelotvorenjima, metode poboljšavaju izgled pluća kako je procenjeno tehnikama koje su poznate u struci, npr., CT skeniranje visoke rezolucije i/ili rendgenski snimak grudi.

[0051] U različitim otelotvorenjima, ovde date metode za tretiranje ASM poremećaja smanjuju koncentraciju sfingomijelina u jetri, koži i/ili plazmi, i/ili smanjuju hitotriosidazu u serumu, nivoe CCL18, lizo-SPM, keramid i/ili bilirubin. U nekim otelotvorenjima, metode poboljšavaju lipidni profil ispitanika (npr., smanjeni holesterol). U nekim otelotvorenjima, metode poboljšavaju jednu ili više neuroloških funkcija ispitanika (npr., psihomotorne funkcije, socijalnu responzivnost, itd.). U nekim otelotvorenjima, metode smanjuju ili poboljšavaju ozbiljnost i/ili trajanje ASM poremećaja i/ili jednog ili više simptoma koji su povezani sa poremećajem. U nekim otelotvorenjima, metode sprečavaju ponovno javljanje simptoma koji su povezani sa ASM poremećajem. U nekim otelotvorenjima, metode povećavaju stopu preživljavanja ispitanika nakon tretiranja.

Skrining i/ili dijagnostikovanje ASM poremećaja

[0052] U različitim aspektima, ovde su obelodanjene metode za skrining i/ili dijagnostikovanje ASM poremećaja. U nekim aspektima, ASM poremećaj je Niemann-Pick bolest (NPD). U nekim aspektima, ASM poremećaj je NPD tipa A, tipa B i/ili tipa C. U nekim aspektima, može se izvršiti skrining ili dijagnostikovanje ASM poremećaja (npr., NPD) merenjem nivoa lizo-SPM u biološkom uzorku koji je uzet od ispitanika.

[0053] U nekim aspektima, metoda za vršenje skrininga i/ili dijagnostikovanja ASM poremećaja kod ispitanika može obuhvatati uzimanje biološkog uzorka od ispitanika, merenje nivoa lizo-SPM u uzorku, poređenje nivoa lizo-SPM u uzorku sa referentnim nivoom i detektovanje/dijagnostikovanje ASM poremećaja ukoliko je nivo lizo-SPM u uzorku bio povećan u poređenju sa referentnim nivoom. U nekim aspektima, referentni nivo je nivo lizo-SPM koji je izmeren u biološkom uzorku od kontrolnog ispitanika koji nema ASM poremećaj. U nekim otelotvorenjima, ASM poremećaj se može detektovati/dijagnostikovati ukoliko je nivo lizo-SPM u biološkom uzorku od kontrolnog ispitanika veći od prethodno određenog referentnog nivoa. U nekim otelotvorenjima, ASM poremećaj se može detektovati/dijagnostikovati ukoliko je nivo lizo-SPM u biološkom uzorku (npr., uzorak krvi) veći od referentnog nivoa za bar oko 200-2000 ng/ml, kao što je veći za bar oko 200 ng/ml, veći od oko 300 ng/ml, veći od oko 400 ng/ml, veći od oko 500 ng/ml, veći od oko 525 ng/ml, veći od oko 575 ng/ml, i/ili veći od oko 700 ng/ml (npr., veći od oko 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 ili 2000 ng/ml, ili bilo koja koncentracija između). U nekim otelotvorenjima, ASM poremećaj se može detektovati/dijagnostikovati ukoliko je nivo lizo-SPM u biološkom uzorku (npr., uzorak krvi) veći od referentnog nivoa 1-10 puta.

[0054] Biološki uzorci od različitog tkiva se mogu koristiti za ovde opisane metode za skrining i dijagnostikovanje. Na primer, biološki uzorci iz perifernog tkiva, kao što su plazma, puna krv (npr., kap osušene krvi), serum, koža i/ili urin se mogu koristiti za praćenje povišenih nivoa lizo-SPM. Biološki uzorci drugog tkiva se takođe mogu koristiti, npr., tkivo slezine, pluća, jetre, srca, bubrega i/ili mozga. Uzorci kombinacije dva ili više tkiva se mogu koristiti (npr., 2, 3, 4, 5 ili više tkiva). U nekim aspektima, ASM poremećaj (npr., NPD) se može detektovati/dijagnostikovati merenjem nivoa lizo-SPM u biološkom uzorku koji je uzet od perifernog tkiva. U određenim aspektima, periferno tkivo može biti uzorak plazme, pune krvi (npr., kap osušene krvi), serum i/ili urin. Upotreba uzorka perifernog tkiva može izbeći potrebu za invazivnim procedurama kao što je biopsija jetre.

[0055] U različitim aspektima, ovde obelodanjene metode za skrining i/ili dijagnostikovanje mogu dalje obuhvatati davanje terapeutskog sredstva (npr., terapija zamene enzima) ispitaniku ukoliko je detektovan/dijagnostikovan ASM poremećaj. U nekim aspektima, terapija zamene enzima obuhvata davanje rhASM ili modifikovanog rhASM ispitaniku.

Komplet

[0056] U različitim aspektima, ovde je obelodanjen komplet, koji obuhvata uređaj za uzimanje biološkog uzorka koji sadrži lizo-SPM i/ili druge markere za ASM poremećaj, i uputstvo za upotrebu kompleta za merenje nivoa lizo-SPM i/ili drugih markera u biološkom uzorku. U nekim aspektima, uređaj za uzimanje biološkog uzorka može obuhvatati, epruvetu, špric i/ili drugo sredstvo za držanje tečnog uzorka, i/ili traku za uzimanje uzorka, ili šipku. Bilo koji drugi uređaj koji je poznat u struci za uzimanje biološkog uzorka se takođe može koristiti. U nekim aspektima, biološki uzorak je uzorak iz perifernog tkiva, kao što je plazma, puna krv (npr., kap osušene krvi), serum, koža i/ili urin. Biološki uzorci drugog tkiva se takođe mogu uzeti, npr., iz tkiva slezine, pluća, srca, jetre, bubrega i/ili mozga i komplet obuhvata uređaj za uzimanje uzorka iz navedenih tkiva. Mogu se koristiti uzorci kombinacije dva ili više tkiva.

[0057] U nekim aspektima, komplet može dalje obuhvatati uređaj za merenje nivoa lizo-SPM i/ili drugih markera u biološkom uzorku. Na primer, komplet može obuhvatati antitelo i/ili druga detekcionih sredstava koja se mogu koristiti za detektovanje lizo-SPM ili druge markere u biološkom uzorku. U nekim aspektima, detekciono sredstvo je obuhvaćeno u ili na uređaju za uzimanje tkiva (npr., antitelo ili hemijsko sredstvo koje je postavljeno na traci za

2

testiranje), dok je u drugim otelotvorenjima detekciono sredstvo dato odvojeno od uređaja za uzimanje.

[0058] U nekim aspektima, komplet može dalje obuhvatati uređaj za kvantifikovanje ili semikvantifikovanje nivoa lizo-SPM i/ili drugih markera u uzorku. Na primer, može biti dato sredstvo (npr., kolorimetrijsko sredstvo) koje reaguje sa detekcionim sredstvom kako bi se emitovao signal koji se može detektovati čija se snaga, intenzitet, boja, itd., može koristiti za semi-kvantitativno ili kvantitativno određivanje nivoa lizo-SPM i/ili drugih markera u uzorku (npr., poređenjem sa signalom od jednog ili više referentnih uzoraka). U nekim aspektima, uređaj može obuhvatati uređaj za odvajanje lizo-SPM od drugih komponenti uzorka, npr., upotrebom tečne hromatografije i/ili masene spektrometrije. U nekim aspektima, uređaj za kvantifikovanje nivoa lizo-SPM i/ili drugih markera u uzorku je spektrometar, kao što je maseni spektrometar, npr., LC/MS/MS ili elektromagnetni spektrometar, npr., UV-VIS, IR ili NMR.

[0059] U nekim aspektima, komplet može dalje obuhvatati uputstvo za poređenje nivoa lizo-SPM i/ili drugih markera u biološkom sa referentnim nivoom kako bi se detektovalo prisustvo toksičnih nivoa jednog ili više metabolita i/ili štetno neželjeno dejstvo za vreme tretiranja ASM poremećaja ukoliko je nivo lizo-SPM i/ili drugih markera u biološkom uzorku povećan u poređenju sa jednim ili više referentnih uzoraka. U nekim aspektima, komplet može dalje obuhvatati uputstvo za poređenje nivoa lizo-SPM u uzorku sa nivoom u referentnom uzorku i za skrining i/ili dijagnostikovanje ASM poremećaja ukoliko je nivo lizo-SPM i/ili povećan u poređenju sa jednim ili više referentnih uzoraka.

[0060] U nekim aspektima, komplet se može koristiti kao deo terapije i/ili za dijagnostikovanje ASM poremećaja. U nekim aspektima, ASM poremećaj je NPD-A, NPD-B ili NPD-C.

Populacija ispitanika

[0061] U različitim aspektima, ispitanik kako se ovde koristi je čovek za kog se vrši skrining za ASM poremećaj. U različitim aspektima, ispitanik kako se ovde koristi je ispitanik dijagnostikovan ili koji prima terapiju za ASM poremećaj u skladu sa ovde datim metodama je čovek koji ima ili je dijagnostikovan da ima poremećaj koji se ispoljava u prekomernoj akumulaciji lipozomalnog SPM u jednom ili više organa patologije. U nekim otelotvorenjima, ispitanik ima jednu ili više mutacija u genu koje kodiraju kiselu sfingomijelinazu, npr., brisanje, pomeranje, misens mutaciju i/ili nonsens mutaciju. U jednom otelotvorenju, ispitanik ima NPD-A ili NPD-B.

[0062] U nekim otelotvorenjima, ispitanik ima jednu ili više mutacija na SMPD1 genu. U određenim otelotvorenjima, mutacija je ΔR608 (brisanje arginina 608). U nekim otelotvorenjima, mutacija je misens mutacija. U određenim otelotvorenjima, misens mutacija je L302P, H421Y ili R496L. U drugim otelotvorenjima, mutacija je brisanje koje se ispoljava u brisanju jednog, dva, tri ili više aminokiselinskih ostataka. U specifičnim otelotvorenjima, ispitanik koji prima terapiju za ASM poremećaj u skladu sa ovde datim metodama ima jednu ili više mutacija koje su prikazane u Tabeli 1 u patentnoj prijavi SAD br.2011/0052559. Takođe videti Simonaro i dr., Am. J. Hum. Genet.71: 1413-1419 (2002) za mutacije u geni kisele sfingomijelinaze (označen SMPD1).

[0063] U određenim otelotvorenjima, ispitanik kod kog se vrši skrining vrši skrining ili koji se dijagnostikuje ili prima terapiju za ASM poremećaj u skladu sa ovde datim metodama može endogeno ispoljavati ASM ali sa oko 2 do 5%, 5 do 10%, 5 do 15%, 5 do 20%, 5 do 30%, 20% do 30% ili 5 do 35% aktivnosti za normalni (npr., koji nije mutiran) ljudski ASM, npr., ASM-1. U nekim otelotvorenjima, ispitanik endogeno ispoljava ASM sa manje od 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ili 1% aktivnosti za normalni (npr., koji nije mutiran) ljudski ASM, npr., ASM-1. Videti npr., pat. SAD br.4.039,388, 4,082,781, 5,686,240, i 7,563,591, i međunarodne objave patenata br. WO 2007/078806 i WO 2006/058385, za tehnike koje se mogu koristiti za merenje aktivnosti ASM; takođe videti tečnu hromatografiju visokih performansi zasnovanu na fluorescenciji koja je opisana u He i dr., Analytical Biochemistry 314: 116-120 (2003).

[0064] U određenim otelotvorenjima, ispitanik kod kog se vrši skrining vrši skrining ili koji se dijagnostikuje ili prima terapiju za ASM poremećaj u skladu sa ovde datim metodama može pokazivati jedan ili više simptoma NPD. Simptomi NPD mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, naduvenost abdomena, hepatomegaliju, splenomegaliju, hepatosplenomegaliju, neutropeniju, bolest pluća, limfoadenopatiju, prisustvo histohemijski karakterističnih NPD penastih ćelija, anemiju (npr., mikrocitna anemija), trombocitopeniju, povraćanje koje se ponavlja, hroničnu konstipaciju, problemi sa rastom (npr., smanjeni linijski rast i telesna masa), okasneli pubertet, podlivi koji se ponavljaju, krvarenje koje se ponavlja, aterogeni

2

lipidni profil (visok holesterol, trigliceridi ili LDL i/ili nizak HDL), bol (glavobolja, u leđima, ekstremitetima, abdomenu), umor, brzu zasićenost, nisku izdržljivost, osteopeniju, neurološke manifestacije i respiratorne poteškoće (npr., intersticijska bolest pluća i/ili kratak dah).

Neurološke manifestacije NPD obuhvataju pojavu crvene tačke u mrežnjači oka, hipotoniju, slabost mišića, psihomotornu retardaciju, spasticitet, socijalnu neresponzivnost, iritabilnost i/ili napade.

[0065] U određenim otelotvorenjima, ispitanik kod kog se vrši skrining ili koji se dijagnostikuje ili prima terapiju za ASM poremećaj u skladu sa ovde datim metodama je ljudsko novorođenče. U drugim otelotvorenjima, ispitanik je ljudsko dete. U određenim otelotvorenjima, ispitanik je odrasla osoba (18 godina starosti ili više). Određenim otelotvorenjima, ispitanik je osoba ženskog pola. U određenim otelotvorenjima, ispitanik je osoba muškog pola. U određenim otelotvorenjima, ispitanik je osoba ženskog pola koja nije trudna ili ne doji.

Primeri

[0066] Sledeći primeri su namenjeni da prikažu i ni na koji način nisu namenjeni da ograniče predmetno obelodanjivanje.

Primer 1: Materijali i postupci

[0067] Puna krv korišćena u ispitivanju je dobijena od 20 prethodno dijagnostikovanih NPD-B ispitanika nakon pisane informisane saglasnosti i od 20 zdravih odraslih osoba (kupljeno od ProMedDx, LLC, Norton, MA). Krv iz vene je stavljena u Vacutainer® tube (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) koje su sadržale EDTA, i poslate su na hladnim pakovanjima preko noći, i držane na 4°C.48 sati nakon uzimanja, krv je pomešana obrtanjem tubi nekoliko puta i 75 µL krvi po kapi je stavljeno na Whatman 903® papir za uzimanje uzorka i osušeno na sobnoj temperaturi u trajanju od bar 4 sata.

[0068] Kako bi se kvantifikovao lizo-SPM, 1-O-heksadecil-(7,7,8,8-d4)-2-O-acetil-sngliceril-3-fosforilholin (Faktor aktiviranja krvnih pločica C16-d4; PAF C16-D4, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan) je korišćen kao interni standard. 3,2 mm iz kapi osušene krvi (DBS) je ekstrahovano u 200 µL metanol/acetonitril/vodu (80/15/5) što je

2

sadržalo 0,8 ng internog standarda, mešano je u trajanju od 30 minuta i sonifikovano u trajanju od 10 minuta. Eluent je uklonjen centrifugiranjem u trajanju od 5 minuta pri 16,200 g i zatim 30 µL je injektirano u API Qtrap 4000 LC/MS/MS (AB Sciex, Toronto, Kanada) sistem zajedno sa Agilent 1100 sistemom za tečnu hromatografiju sa visokim pritiskom (HPLC) (Agilent, Palo Alto, CA). HPLC je izvršena na koloni sa silika gelom sa normalnom fazom u izokratskom režimu upotrebom smeše metanol/acetonitril/voda kao mobilna faza. Masena spektrometrija (MS) je izvršena u više režima praćenja reakcije (MRM) sa sledećim prelazima: m/z 465,4>184,1 za lizo-SPM i 528,5>184,1 za PAF C16-D4. Kako bi se kvantifikovao SPM, C12-SPM (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) je korišćen kao interni standard. Ekstrakcija i LC/MS/MS procedure su slične onima koje su korišćene za lizo-SPM uz razliku da je eluent razblažen 320 puta pre injektiranja i dvanaest izoformi SPM su praćene i sumirane.

Primer 2: Dijagnostikovanje NPD

[0069] Iako je poznato da su nivoi SPM povećani više od 10 puta u jetrama i slezini NPD-B ispitanika, nivoi SPM u plazmi NPD-B ispitanika nisu znatno povećani i preklapaju se sa onim za normalnu kontrolu. Kao što je prikazano na SL.1A, nivo SPM kod NPD-A i NPD-B pacijenata nije značajno povećan, kao što je pokazano odnosom SPM koncentracije u kapima osušene krvi (DBS) kod NPD-A i NPD-B pacijenata i vrednosti srednje koncentracije za DBS kod normalnih kontrolnih uzoraka. SPM je glavna komponenta ćelijskih membrana i lipoproteina, i najmanje povećanje SPM u DBS kod NPD ispitanika može biti povezano sa svojim već visokim nivoima i brzim preokretima u cirkulaciji.

[0070] Za razliku od SPM, nivoi lizo-SPM su jadno povećani za DBS kod NPD-A i NPD-B ispitanika. Kao što je prikazano na SL.1B, nivo lizo-SPM kod NPD-A i NPD-B pacijenata je povećan, kao što je pokazano odnosom lizo-SPM koncentracije u kapima osušene krvi (DBS) kod NPD-A i NPD-B pacijenata i vrednosti srednje koncentracije za DBS kod normalnih kontrolnih uzoraka. Nivo lizo-SPM nije bio u korelaciji sa količinom rezidualne ASM aktivnosti za DBS ili starosti ispitanika pri uzimanju. Kao zaključak, lizo-SPM je povećan u perifernom tkivu (DBS) kod NPD ispitanika pri nivoima koji se mogu razlikovati od normalne kontrole.

Primer 3: Efekat eskalacije doze kod miševa

2

[0071] Prethodna ispitivanja kod ASM „knockout“ miševa (Niemann-Pick model za miševe, videti npr., Horinouchi i dr., Nature Genetics, 10: 288-293 (1995)) su demonstrirala da klinički simptomi toksičnosti nisu primećeni dok korišćena pojedinačna doza nije bila veća ili jednaka 10 mg/kg. Nickerson i dr., „Dose Responsive Toxicological Findings Following Intravenous Administration of Recombinant Human Acid Sphingomyelinase (rhASM) to Acid Sphingomyelinase Knock-out (ASMKO) Mice,“ American Society of Human Genetics 2005; i Murray i dr., „Elevations of Pro-Inflammatory Cytokines and Decreases in Cardiovascular Hemodynamics Following Intravenous Administration of Recombinant Human Acid Sphingomyelinase (rhASM) to Acid Sphingomyelinase Knock-out (ASMKO) Mice,“ Society of Toxicology 2006.

[0072] U trenutnom ispitivanju, ASM „knockout“ miševima je data jedna intravenska doza rhASM pri jednoj od tri različite koncentracije: 0 mg/kg, 3 mg/kg (netoksična doza, nisu primećeni klinički očigledni štetni efekti) ili 20 mg/kg (toksična doza).3 mužjaka i 3 ženke miševa su dodeljene svakoj grupi za doziranje (ukupno 18 životinja) i uzorci krvi su uzeti pri vremenskim tačkama koje su ukazane na Tabeli 1.

Tabela 1

[0073] Nivoi lizo-SPM za DBS uzorke su kvantifikovani i pokazali su da su se nivoi povećali sa povećanjem koncentracije rhASM doze, sa maksimumom kod grupa sa tretiranjem 3 mg/kg i 20 mg/kg oko 6 sati nakon davanja doze. Videti SL.2, histogram koji prikazuje koliko je puta povećana koncentracija lizo-SPM za DBS za tri doze za uzorke uzete u vremenskim tačkama nakon davanja doze, u poređenju sa koncentracijom 5 minuta nakon doziranja.

Iznenađujuće, broj koliko je puta povećana koncentracija lizo-SPM u plazmi kao odgovor na

2

toksičnu dozu (20 mg/kg) rhASM je značajno veći od broja koliko puta je povećana koncentracija lizo-SPM u plazmi kao odgovor na netoksičnu dozu (3 mg/kg) rhASM. Ovaj rezultat predlaže da je lizo-SPM koristan kao marker za merenje toksičnog dejstva terapeutskog sredstva koji smanjuje nivo akumulisanog SPM kod pacijenta sa ASM poremećajem.

Primer 4: Poređenje režima davanja doze i režima smanjenja.

[0074] Kapi osušene krvi su dobijene od miševa divljeg tipa (C57BL/6) ili ASM „knockout“ (ASMKO) miševa nakon davanja jedne doze ili režima smanjenja doze rhASM. Pet ASMKO miševa je dobilo jednu dozu od 10 mg/kg rhASM. Pet C57BL/6 i šest ASMKO miševa je tretirano primenom režima smanjenja od 3 mg/kg rhASM i zatim su dobili dozu od 20 mg/kg. Uzeti su uzorci krvi pri sledećim vremenskim tačkama: 5 minuta, 4 sata, 6 sati, 24 sata i 72 sata nakon davanja doze. Životinje u grupi doziranja od 10mg/kg su bile eutanazirane 24 sata nakon vremenske tačke.

[0075] Svih 70 uzoraka kapi krvi je pripremljeno primenom postupka lipidne multipleks ekstrakcije i analizirani su sa LC/MS/MS. Ukratko, pojedinačne DBS kapi su uzete iz svakog uzorka i postavljene u pojedinačne Eppendorf tube. Dve stotine mikrolitara 80:15:5 rastvora (MeOH:ACN:H2O) je zatim dodato u svaku tubu pre nego što su mešane u trajanju od 30 minuta, sonifikovane u trajanju od 10 minuta i centrifugirane kako bi se pomešale sve čestice. Kalibraciona kriva za lizo-SPM (bez internog standarda) je korišćena za određivanje koncentracije lizo-SPM za svaki uzorak.

[0076] Podaci na SL.3 prikazuju da su se nivoi lizo-SPM povećali samo kod ASMKO grupe koja je tretirana sa jednom (visokom) dozom rhASM pri 10 mg/kg, u poređenju sa ASMKO grupom izloženom režimu smanjenja. Pri tako visokoj dozi, očekivano je bilo da će bar 50% miševa umreti između 24 i 72 sata, i da će svi miševi preživeti režim smanjenja. Ovi rezultati predlažu da lizo-SPM može biti od koristi kao marker za merenje toksičnog dejstva terapeutskog sredstva.

Primer 5: Testiranje kod ljudi

[0077] Uzeti su uzorci krvi od Niemann-Pick pacijenata koji su tretirani sa rhASM.

2

Reprezentativni primer je prikazan na SL.4. Uzorci su uzeti pre davanja doze i 24, 48 i 72 sata nakon davanja ukazane doze (0,1, 0.3, 0.6, 1, 2 ili 3 mg/kg) rhASM u periodu od 26 nedelja (dan 1, nedelja 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 i 26). Nakon 26 nedelja, uzorci su uzeti samo pre davanja doze i pri 24 i 48 sati nakon davanja doze. Nivoi lizo-SPM su izmereni u ng/ml. Podaci pokazuju opšti trend opadanja nivoa lizo-SPM nakon ponovljenih doza pri višim koncentracijama, sa fluktuacijama nivoa lizo-SPM između vremenskih tačaka pre davanja doze i 72 sata nakon davanja doze nakon svake pojedinačne doze. Najraniji uzorak nakon davanja doze je uzet nakon 24 sata, nakon čega se maksimum lizo-SPM koncentracije nakon davanja nije mogao primetiti. Date doze su takođe možda bile ispod koncentracije koja je potrebna kako bi se primetili značajni maksimumi nivoa lizo-SPM nakon davanja.

[0078] Prethodni primeri su namenjeni da prikažu i ni na koji način nisu namenjeni da ograniče predmetno obelodanjivanje. Druga otelotvorenja obelodanjenih uređaja i metoda će biti očigledna stručnima u ovoj oblasti na osnovu razmatranja specifikacije i upotrebe ovde obelodanjenih uređaja i metoda.

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Terapeutsko sredstvo za upotrebu u metodi za tretiranje ispitanika koji je čovek koji ima deficijenciju kisele sfingomijelinaze (ASMD), gde se:

(a) prva doza terapeutskog sredstva koja ima prvu koncentraciju za tretiranje ASMD daje ispitaniku; i

(b) druga doza terapeutskog sredstva koja ima drugu koncentraciju koja je jednaka ili veća od prve koncentracije daje ispitaniku ukoliko je određeno da ispitanik ima nivo lizosfingomijelina (lizo-SPM) koji je manji ili jednak referentnom nivou nakon davanja prve doze,

gde terapeutsko sredstvo sadrži rekombinantnu ljudsku kiselu sfingomijelinazu (rhASM), gde prva doza terapeutskog sredstva sadrži od 0,03 do 1,0 mg/kg rhASM.

2. Terapeutsko sredstvo za upotrebu u metodi za tretiranje ispitanika koji je čovek koji ima deficijenciju kisele sfingomijelinaze (ASMD), gde se:

(a) terapeutsko sredstvo daje ispitaniku više puta; i

(b) periodično meri nivo lizo-sfingomijelina (lizo-SPM) u biološkom uzorku koji je dobijen nakon davanja doze terapeutskog sredstva ispitaniku, gde smanjenje nivoa lizo-SPM u odnosu na referentni nivo ukazuje na efikasnost terapeutskog sredstva,

gde terapeutsko sredstvo sadrži rekombinantnu ljudsku kiselu sfingomijelinazu (rhASM), gde prva doza terapeutskog sredstva sadrži od 0,03 do 1,0 mg/kg rhASM.

3. Terapeutsko sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, gde se nivo lizosfingomijelina (lizo-SPM) meri u biološkom uzorku koji je dobijen od ispitanika tri dana do 4 nedelje nakon poslednje doze i gde se povećava koncentracija doze terapeutskog sredstva.

4. Terapeutsko sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, gde je referentni nivo početni nivo lizo-SPM ispitanika pre bilo kakvog tretiranja terapeutskim sredstvom.

5. Terapeutsko sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, gde se svaka doza terapeutskog sredstva daje dva puta nedeljno nakon prethodne doze i ima koncentraciju koja se povećava.

6. Terapeutsko sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde se svaka doza terapeutskog sredstva pri datoj koncentraciji daje bar dva puta.

7. Terapeutsko sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, gde je biološki uzorak uzet pre davanja sledeće doze.

8. Terapeutsko sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, gde je biološki uzorak puna krv, kap osušene krvi, plazma ili serum.

9. Terapeutsko sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, gde se terapeutsko sredstvo daje intravenski.

10. Terapeutsko sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, gde se dalje daje doza za održavanje terapeutskog sredstva, gde je doza za održavanje jednaka ili manja od najveće doze terapeutskog sredstva koju pacijent može tolerisati.

11. Terapeutsko sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, gde je ASMD Niemann-Pick bolest (NPD) tipa A ili NPD tipa B.

12. Terapeutsko sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde se daje doza za održavanje terapeutskog sredstva koja sadrži rhASM pri 1, 2 ili 3 mg/kg.