RS59736B1 - 3.alfa.-etinil, 3.beta.-hidroksi-5.alfa.-pregnan-20-oksim za upotrebu u lečenju poremećaja cns - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na novo steroidno jedinjenje i na ovo jedinjenje za upotrebu u terapiji, kao što je lečenje hepatične encefalopatije, Daunovog sindroma, Alzhajemerove bolesti i generalno kognitivnog oštećenja, kao i na farmaceutske kompozicije koje sadrže takvo jedinjenje.

Stanje tehnike pronalaska

[0002] Metaboliti endogenih steroidnih hormona, kao što su pregnanoloni (uključujući pregnenolon, progesteron, deoksikortikosteron, kortizon i kortizol), testosteron, androstendion i dehidroepiandrosteron, su bili predmet različitih isptivanja.

[0003] Poznato je da mnogi primeri 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-steroida deluju na kompleks receptora gama-aminobuterne kiseline-hloridne jonofore (GABAA-R) i prema tome nazivaju se steroidima koji moduliraju GABAAreceptor (GAMS). Mehanizmi interakcije na receptorskom mestu nisu još uvek rasvetljeni, usled strukturne kompleksnosti kompleksa GABAA-R. Međutim, familija GABA receptora uključuje nekoliko komponenti subjedinica, za koje se zna da su povezani sa specifičnim funkcijama i poremećima CNS.

[0004] 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-steroidi se proizvode u visokim količinama tokom nekoliko dana/nedelja, i direktno mogu da uzrokuju inhibiciju funkcija CNS. Primeri poremećaja i simptoma uzrokovanih direktnim delovanjem 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-steroida uključuju premenstrualni disforični poremećaj, premenstrualni sindrom, demenciju, Alzhajmerova bolest, Daunov sindrom, sedaciju, umor, sindrom hroničnog umora, poremećaj pamćenja, poremećaj učenja, poremećaj motorne funkcije, frakture, nespretnost, povećan apetit i potreba za hranom, gojaznost, relaps u zloupotrebi alkohola ili supstance, negativno raspoloženje kao što je napetost, razdražljivost, depresija, smanjen sluh i vid, pogoršanje Petit Mal epilepsije i sindroma sagorevanja.

[0005] Kontinuirano i/ili dugotrajno izlaganje 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-steroidima uzrokuje razvijanje tolerancije u GABAAreceptorskom sistemu. Ova tolerancija je prvi korak u postupku koji na kraju može da dovede do osetljivosti na stres, poteškoća u vezi sa koncentracijom, i gubitkom kontrole impulsa i depresijom. Dalje, otkriveno je da je delovanje 3-alfa-hidroksi-5-alfa/betasteroida faktor koji pojačava zavisnost od lekova.

[0006] Kontinuirano ali kratkotrajno izlaganje sa druge strane dovodi do efekta odvikavanja kada se izlaganje privede kraju. Ovaj fenomen se dešava npr. tokom menstruacije, kada je prekinuta proizvodnja 3-alfa-hidroksi-5-alfa/betasteroida od strane žutog tela (corpus luteum) ovarijuma. Ovaj fenomen odvikavanja se takođe događa odmah nakon rođenja kada je prekinuta njegova proizvodnja od strane placente, ili na kraju perioda stresa (nadbubrežne žlezde, tokom stresa proizvode 3-alfahidroksi-5-alfa/beta-steroide).

[0007] Primeri stanja koja se nalaze pod uticajem takvog odvikavanja odn. povlačenja i/ili odsustva uključuju parcijalnu epilepsiju, "katamenijalna epilepsiju", migrenu, promene u raspoloženju i "vikend" glavobolju.

[0008] GABAAreceptor je hloridni kanal i ispoljava svoje delovanje promenom influksa hlorida kroz kanal. U oblasti tehnike je poznato da je aktivnost neurona u mozgu smanjena kada je receptor GABAAotvoren i velike količine hloridnog jona prolaze u ćeliju. Takođe je poznato da postoji veza između količine hlorida koji ulazi u, i kliničkog efekta aktivnog leka GABAAreceptora.

[0009] Benzodiazepini, barbiturati i, u izvesnoj meri, alkohol ispoljava njihovo dejstvo preko ovog mehanizma. Ovo, međutim, takođe predstavlja negativne efekte ovih lekova.

[0010] Problem sa GABAAreceptorom je taj što ispoljava svoje delovanje u većini delova u mozgu. U pogledu toga, potpuni blokatori delovanja GABA su opasni i mogu da uzrokuju psihotične simptome i poremećaje. Takoreći, kada delovanje 3-alfa hidroksi-5-alfa/beta-pregnan-steroida treba antagonizovati poželjno je da se koriste jedinjenja koja specifično antagonizuju 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-pregnan-steroidne efekte, dok ne antagonizuju sam efekat GABA.

[0011] Prema tome, predmetni pronalazak teži da reši problem obezbeđenja specifičnih sredstava koji su sposobni da blokiraju GABA receptore, gde jedinjenja mogu prema tome mogu da budu korisna u lečenju anomalija u pobuđivanju receptora GABA ili drugih neurotransmitera koji su povezani sa GABA receptorima.

[0012] Međunarodna prijava patenta WO 2008/063128 prikazuje 3-alfa-hidroksi steroide i 3-betahidroksi steroide. Međunarodna prijava patenta WO 99/45931 prikazuje antagonističke efekte steroida 3-beta-OH-5alfa-pregnan-20-ona. Međunarodna prijava patenta WO 03/059357 prikazuje 3-beta-hidroksi steroide i njihov antagonistički efekat na GABAAreceptor.

[0013] US patenti US 5,232,917, US 5,925,630, US 5,939,545, US 6,143,736 i US 6,277,838 prikazuju 3-alfahidroksi steroide i 3-beta-hidroksi steroide kao agoniste modulatore GABAAreceptora sa specifičnim fokusom na 3-alfa-hidroksi steroide i njihov efekat sličan benzodiazepinu. U US prijavi patenta US 2004/0242549, prikazani su brojni steroidi.

[0014] Antagonistički efekat 3-beta-OH-5-alfa-pregnan-20-ona i drugih 3-beta-OH-5-alfa/beta pregnansteroida je razmatran od strane Wang et al (Acta Physiol. Scand., 169, 334 (2000) and J. Neurosci., 22, 3366 (2002)).

[0015] Jedinjenja prethodnog stanja tehnike uključujući ona koja se pominju gore u tekstu nisu specifična prema određenim podtipovima GABAA-R. Prema tome, postoji potreba za jedinjenjima koja su selektivnija prema receptorskim podtipovima.

[0016] Dodatno steroidi iz stanja tehnike i koji se pojavljuju u prirodi su podložni metabolizmu, i često nisu pogodni za oralnu primenu, i obično imaju slabu permeabilnost.

[0017] To značajno otežava primenu takvih jedinjenja. Takođe, takođe postoji potreba za jedinjenjima koja se manje lako metabolišu/degradiraju u telu, i/ili imaju unapređenu permeabilnost/biodostupnost.

Opis pronalaska

[0018] Pronašli smo da jedinjenje 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim mogu da deluju kao antagonisti GABAAreceptora, i to se može učiniti putem modulacije steroidnog pojačanja GABAA-R kompleksa, na primer modulacijom GAMS signalnog efekta kao antagonista podjedinice alfa 5 GABA receptora.

[0019] Prema prolanasku, obezbeđeno je jedinjenje 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim, ili njegova farmaceutski prihvaljiva so, gde su jedinjenja i soli ovde zajedno naznačeni sa "jedinjenja iz pronalaska".

[0020] Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli.

[0021] Takve kisele adicione soli i bazne adicione soli mogu da se dobiju kovencionalnim postupcima, na primer reagovanjem slobodnog kiselinskog ili baznog oblika jedinjenja formule I sa jednim ili više ekvivalenata odgovarajuće kiseline ili baze, opciono u rastvaraču, ili medijumu u kome je so nerastvorljiva, nakon čega sledi uklanjanje pomenutog rastvarača, ili pomenutog medijuma, upotrebom standardnih postupaka (npr. in vacuo, sušenje zamrzavanjem ili ceđenje). Soli mogu takođe da se dobiju izmenom kontra jona jedinjenja iz pronalaska u obliku soli sa drugim kontra-jonom, na primer upotrebom pogodne jonoizmenjivačke smole.

[0022] Primeri kiselih adicionih soli koje mogu da budu pomenute uključuju karboksilatne soli (npr. format, acetat, trifluoroacetat, propionat, izobutirat, heptanoat, dekanoat, kaprat, kaprilat, stearat, akrilat, kaproat, propiolat, askorbat, citrat, glukuronat, glutamat, glikolat, α-hidroksibutirat, laktat, tartrat, fenilacetat, mandelat, fenilpropionat, fenilbutirat, benzoat, hlorobenzoat, metilbenzoat, hidroksibenzoat, metoksibenzoat, dinitrobenzoat, o-acetoksibenzoat, salicilat, nikotinat, izonikotinat, cinamat, oksalat, malonat, sukcinat, suberat, sebakat, fumarat, malat, maleat, hidroksimaleat, hipurat, ftalat ili tereftalatne soli), halogene soli (npr. hlorid, bromid ili jodidne soli), hlorovodonične soli (npr. hlorovodonične, bromovodonične ili jodovodonične soli), sulfonatne soli (npr. benzensulfonat, metil-, bromo- ili hloro-benzensulfonat, ksilensulfonat, metansulfonat, etansulfonat, propansulfonat, hidroksietansulfonat, 1- ili 2-naftalen-sulfonat ili 1,5-naftalendisulfonatne soli) ili sulfat, pirosulfat, bisulfat, sulfit, bisulfit, fosfat, monohidrogenfosfat, dihidrogenfosfat, metafosfat, pirofosfat ili nitratne soli, i slično.

[0023] Primeri bazni adicionih soli koje mogu da budu pomenute uključuju soli koje se obrazuju sa alkalnim metalima (kao što su Na i K soli), zemnoalkalnim metalima (kao što su Mg i Ca soli), organske baze (kao što su etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, trometamin i lizin) i neorganske baze (kao što su amonijum i aluminijum hidroksid). Određenije, bazne adicione soli koje mogu da budu pomenute uključuju Mg, Ca i, određenije, K, i, najodređenije, Na soli.

[0024] U skladu sa aspektom iz pronalaska, obezbeđena je 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim hidrohloridna so. U skladu sa daljim aspektom pronalaska, obezbeđena je 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5αpregnan-20-oksim natrijumova so.

[0025] Jedinjenja iz pronalaska mogu da se dobiju na primer kao što je ovde opisano.

Medicinske i farmaceutske upotrebe

[0026] Jedinjenja iz pronalaska su naznačena kao farmaceutska sredstva. Prema tome, u skladu sa daljim aspektom pronalaska obezbeđeno je jedinjenje kao što je ovde gore u tekstu definisano, za upotrebu kao farmaceutsko sredstvo i/ili za upotrebu u terapiji, kao što je u medicini.

[0027] Kao što je ovde posle opisano, iznenađujuće je pokazano da jedinjenja iz pronalaska mogu da pojačaju efekat GABA u GABAAreceptorima koji sadrže kompoziciju podjedinica α1,β2,γ2, dok same nemaju direktan efekat na fluks hlorida kada se primenjuje samo na GABAAreceptor koji sadrži α1,β2,γ2.

[0028] Posebno, pronađeno je da jedinjenja iz pronalaska mogu da pojačaju efekat GABA on α1,β2,γ2 receptorima dok su istovremeno antagonisti α5,β3,γ2 receptora. Iznenađujuće, istovremeni tretman sa 3-alfa-hidroksi-pregnan-steroidima i jedinjenjima iz pronalaska inhibira fluks hlorida kroz humani GABAAreceptor alfa 5 tipa kada je rekombinovano eksprimiran u HEK-ćelijama (Humani embrionalni bubreg, HEK) indukovan 3-alfa-hidroksi-pregnan-steroidom, ali ima nizak efekat na hloridni fluks koji se indukuje samo sa GABA.

[0029] Dalje je pronađeno sa ovo delovanje može da se postigne na farmakološkim i fiziološki pogodnim koncentracijama.

[0030] Prema tome, zbog toga što jedinjenja iz pronalaska mogu da blokiraju delovanje 3-alfa-hidroksipregnan-steroida na humanom GABAAreceptoru, potencijalno su korisna u lečenju poremećaja CNS povezanih sa steroidom, obično kod humanih subjekata.

[0031] "Steroidni-povezani CNS poremećaji" uključuju epilepsiju, epilepsiju koja je povezana sa menstrualnim ciklusom, depresiju, depresiju povezanu sa stresom, migenu, umor i posebno umor koji je povezan za stresom, premenstrualni sindrom, premenstrualni disforični poremećaj, promene raspoloženja povezane sa menstrualnim ciklusom, kognitivno oštećenje (uključujući minimalno kognitivno oštećenje), promene memorije povezane sa menstrualnim ciklusom, promene memorije povezane sa stresom, poteškoće u učenju povezane sa stresom, hepatična encefalopatija, Daunov sindrom, Alzhajmerova bolest, poteškoće u koncentraciji povezane sa menstrualnim ciklusom, poremećaji spavanja povezani sa menstrulanim ciklusom i umor. Takođe postoje jake indikacije da takođe gojaznost i povećan apetit, kao i relapsi u alkoholu i/ili zloupotreba supstanci, neki oblici smetnji/poremećaja ravnoteže, ’moment’ poremećaji i poteškoće u koordinaciji su povezani sa steroidom ili su indukovani steroidom, i "steroidni-vezani poremećaji CNS-a" prema tome takođe uključuju povećani apetit, prejedanje i gojaznost, relaps u alkoholu i zloupotrebi supstanci. Predmetni pronalazak prema tome nudi jedinjenja i postupke za lečenje, ublažavanje ili prevenciju ovih stanja.

[0032] Poremećaji koji se mogu pomenuti specifično uključuju Daunov sindrom i Alchajmerovu bolest i, posebno, hepatičnu encefalopatiju.

[0033] Poremećaji hepatične encefalopatije mogu da se manifestuju i/ili karakterišu simptomima uključujući narušavanje jedinog ili više od ciklusa spavanja i budnosti, kognicije, memorije, učenja, motorne koordinacije i/ili svesti, kao i umanjenih energetskih nivoa, promene ličnosti, kognitivnog narušavanja, dezorijentacije i/ili kome i uključuje Tip A hepatične encefalopatije, Tip B hepatične encefalopatije, Tip C hepatične encefalopatije, minimalna hepatična encefalopatija, i otvorena hepatična encefalopatija.

"Tip A hepatična encefalopatija" se obično odnosi na hepatičnu encefalopatiju koja je povezana sa akutnom inuficijencijom jetre, obično vezanom sa cerebralnim edemom.

"Tip B hepatične encefalopatije" se obično odnosi na hepatičnu encefalopatiju (bajpas) uzrokovanu portalno-sistemskim šantovanjem bez pridružene unutrašnje bolesti jetre.

"Tip C hepatične encefalopatije" se obično odnosi na hepatičnu encefalopatiju koja se pojavljuje kod pacijenata sa cirozom. Ovaj tip se često deli na "epizodnu", "trajnu" i "minimalnu" hepatičnu encefalopatiju.

[0034] "Minimalna hepatična encefalopatija" se obično odnosi na hepatičnu encefalopatiju koja ne vodi do klinički otvorene kognitivne disfunkcije, ali se može pokazati neuropsihološkim studijama.

[0035] "Otvorena hepatična encefalopatija" se obično odnosi na klinički očiglednu hepatičnu encefalopatiju koja se manifestuje kao neuropsihijatrijski sindrom sa velikim spektrom mentalnih i motornih poremećaja. Otvorena hepatična encefalopatija može epizodno da nastane, u periodu sati ili dana u pacijentima koji su prethodno stabilni ili pacijenti mogu biti predstavljeni sa trajnim neuropsihijatrijskim abnormalitetima.

[0036] Pored gore navedenog, iako većina operacija transplantata jetre koristi jetre iz inače zdravih umrlih davalaca, jetre takođe mogu da se dobiju od živog donora (ili kao porcija jetre zdrave osobe). Pacijenti sa npr. cirozom obično prolaze kroz hepatičnu enceflopatiju i pre-operativnu hepatičnu encefalopatiju, što značajno predviđa post-transplantne neurološke komplikacije. Jedinjenje za koje se traži zaštita ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za tretman hepatične encefalopatije kod pacijenata koji treba da se podvrgnu transplantaciji jetre su obuhvaćeni obimom pronalaska.

[0037] Termin "hiperamonemija" se obično odnosi na metabolički poremećaj koji se karakteriše viškom amonijaka u krvi.

[0038] Termin "akutna ka hroničnoj insuficijenciji jetre" se obično odnosi na akutnu dekompenzaciju ciroze, prestankom rada bar jednog organa, ili pripada pod grupi sa visokom kratkoročnom stopom smrtnosti.

[0039] Termin "dekompenzovana ciroza" je obično namenjena da uključi uznapredovalu cirozu jetre sa opsegom kliničkih dokaza kao što je žutica, asciti, edem, hepatična encefalopatija, gastrointestinalno krvarenje, portalna hipertenzija, bakterijske infekcije, ili bilo koja njihova kombinacija. Treba da bude u kontrastu sa "kompenzovanom cirozom", koja se obično odnosi na cirozu jetre bez bilo kog kliničkog dokaza ali može da uključi asimptotske varikoze jednjaka ili želuca i rane simptome kao što je umor i gubitak energije, gubitak apetita i težine, mučnina ili abdominalni bol.

[0040] Termin "portalna hipertenzija" se obično odnosi na hepatični venozni gradijent pritiska koji prati cirozu jetre, sa ili bez pridruženog transjugularnog intrahepatičnog portsistemskog šanta (TIPS).

[0041] Jedinjenja iz pronalaska su indikovana i u terapeutskom i/ili profilaktičkom tretmanu svih od gore pomenutih stanja.

[0042] Prema daljem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđena su jedinjenja iz pronalaska za upotrebu u lečenju steroidnog-povezanog poremećaja CNS kao što je ovde pomenuto, gde postuak obuhvata ordiniranje farmaceutski efikasne količine jedinjenja iz pronalaska pacijentu kome je potreban takav tretman.

[0043] Dalje su obezbeđena jedinjenja iz pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje i/ili prevenciju povezanih sa steroidom ili indukovanih sa steroidom poremećaja memorije i učenja, kognitivnog narušavanja, demencije i/ili poremećaja raspoloženja, kao što su oni koji se gore opisuju ordiniranjem jedinjenja iz pronalaska pacijentu kome je potrebno.

[0044] Jedinjenja iz pronalaska mogu da imaju prednost u tome što ona mogu da spreče razvijanje tolerancije i/ili smanjenje regulacije GABAAreceptora. Jedinjenja iz pronalaska mogu da imaju prednost u tome što ona mogu da ometaju efekte povlačenja jednom kada se steroid povuče. Na ovaj način, jedinjenja iz pronalaska mogu da imaju prednost u tome što mogu da sačuvaju osetljivost GABAAsistema i inhibiraju razvijanje manje osetljivog stanja tokom lutealne faze, na primer, menstrualnog ciklusa, sprečavajući simptome kao što je migrena i/ili epileptički napadi.

[0045] Drugo izvođenje predmetnog pronalaska je prema tome jedinjenja iz pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije razvijanja stanja ili simptoma steroidne tolerancije i/ili stanja ili simptoma povlačenja steroida, ordiniranjem jedinjenja iz pronalaska pacijentu kome je potrebno.

[0046] Primeri takvi simptoma i/ili stanja koja mogu da budu pomenuta uključuju sedaciju, umor, narušavanje pamćenja, poteškoće u učenju, narušavanje motorne funkcije, nespretnost, npr. simptomi u hepatičnoj encefalopatiji, povećan apetit i želja za hranom, relapsi u alkoholu i zloupotrebi supstanci, negativno raspoloženje kao što je napetost, razdražljivost i depresija koji u kardijalni simptomi u premenstrualnom simptomu i pogoršanje Petit Mal epilepsije.

[0047] Stanja i simptomi uzrokovani razvojem tolerancije nakon dugih vremenskih perioda (npr. nekoliko dana) izlaganja 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-steroidima su npr. osetljivost na stres, poteškoće u koncentraciji, poteškoće u koncentraciji povezane sa stresom ili menstrualnim ciklusom, poremećajima spavanja, umorom, gubitkom kontrole impulsa i depresijom, poteškoće u pamćenju i učenju. 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-steroidi takođe pojačavaju zavisnost od lekova. Prema predmetnom pronalasku, ova stanja ili simptomi mogu da se spreče, ublaže ili leče ordiniranjem jedinjenja iz pronalaska pacijentu kome je to i potrebno.

[0048] Kontinuirano ali kraće izlaganje 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-steroidima daje efekat odvikavanja kada je izlaganje završeno. Ovaj fenomen se događa tokom menstruacije kada proizvodnja 3-alfahidroksi-5-alfa/beta-steroida od strane žutog tela ovarijuma je narušena. Ovaj fenomen odvikavanja se takođe pojavljuje posle porođaja (post partum) kada je prekinuta proizvodnja 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-steroida od strane placente. Isti fenomen je takođe uočen kada je period stresa završen i 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-steroidi proizvedeni od strane nadbubrežne žlezde tokom stresa su narušeni. Primeri stanja koja se nalaze pod uticajem ovog fenomena odvikavanja/apstinacije su parcijala epilepsija gde pacijent ima epileptički fokus u cerebralnom kortekstu gde se pogoršanje dešava u periodu povlačenja tokom menstruacije. Ovaj fenomen je poznat pod imenom "katamenijalna epilepsija". Drugi primeri su migrena koja je povezana sa menstrualnim ciklusom i stresom i promenama raspoloženja post partum. Fenomen povlačenja je znak prethodno razvijene tolerancije.

[0049] Jedno izvođenje iz pronalaska, koje se tiče problema koji pogađa brojne žene, se sastoji iz jedinjenja pronalaska za upotrebu u postupku lečenja i/ili prevencije nepoželjnih sporednih efekata anti-inflamatorne steroidne i postmenopauzalne terapije kod humanih pacijenata. Ova stanja ili simptomi mogu da budu sprečeni, ublaženi ili tretirani ordiniranjem jedinjenja iz pronalaska pacijentu kome je potrebno.

[0050] Drugo izvođenje iz pronalaska se sastoji iz jedinjenja iz pronalaska koja su za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji nepoželjih sporednih efekata oralnih kontraceptiva kod humanih pacijenata. Ova stanja ili simptomi mogu da se spreče, ublaže ili leče ordiniranjem jedinjenja iz pronalaska paijentu kome je potrebno. U ovom kontekstu, jedinjenja iz pronalaska mogu da se ordiniraju zajedno sa oralnim kontraceptivnom, koji je već uzet od strane pacijenta. Nazalna i perkutanozna ordiniranja su takođe pogodni načini za ordiniranje.

[0051] Drugim rečima, jedinjenja iz pronalaska mogu da deluju za lečenje stanja povezanih sa stresom i/ili indukovanih stresom uzrokovanih jednim ili više od tri moguća mehanizma pomoću kojih steroidi deluju na centralni nervni sistem:

odnosno putem:

(a) direktnog delovanja,

(b) indukovanja tolerancije, i/ili

(c) efekta odvikavanja.

[0052] Dalje, u okviru obima gore navedenog izvođenja, doza jedinjenja iz pronalaska mogu da budu podešene do nivoa endogenih steroida tokom stresa ili menstrualnog perioda.

[0053] "Pacijenti" uključuju sisarske (i posebno humane) pacijente.

[0054] Termin "efektivna količina" se odnosi na količinu jedinjenja, koja potvrđuje terapeutski efekat na pacijentu koji se leči. Efekat može da bude objektivan (tj. može da se izmeri nekim testom ili markerom) ili subjektivan (tj. subjekat daje indikaciju ili osećaj efekta).

[0055] Jedinjenja iz pronalaska će se normalno ordinirati oralno, intravenozno, subkutano, bukalno, rektalno, dermalno (npr. perkutano), nazalno, trahealno, bronhijalno, sublingvalno, bilo kojim parentalnim načinom davanja ili preko udisanja, u farmaceutski prihvatljivom doznom obliku.

[0056] Jedinjenja iz pronalaska mogu da se ordiniranju u obliku tableta, kapsula ili eliksira za oralno davanje, supozitorije za rektalno davanje, sterilni rastvori ili suspenzije za parenteralno, uključujući intravenozno ili intramišićno ordiniranje i, slično.

[0057] Formulacija kompozicija koje obuhvataju jedinjenja iz pronalaska može da se podesi ili prilagodi prema normalnim farmakološkim postupcima, u hemijskom obliku koji odgovara izabranom načinu ordiniranja, zajedno sa odgovarajućim adjuvansima, nosačima, rastvaračima i nosačima, konvencionalno korišćenim i dobro poznatim stručnjaku iz oblasti tehnike. Takve formulacije, prema tome mogu da se pripreme u skladu sa standardnom i/ili prihvaćenom farmaceutskom praksom.

[0058] Prema daljem aspektu pronalaska na taj način je obezbeđena farmaceutska formulacija uključujući jedinjenje iz pronalaska, kao što je ovde prethodno definisano, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, rastvaračem ili nosačem.

[0059] U zavisnosti od npr. potencije i fizičkih karakteristika jedinjenja iz pronalaska (tj. aktivnog sastojka), farmaceutske formulacije koje mogu da se pomenu uključuju one u kojima je aktivni sastojak prisutan bar 1% (ili bar 10%, bar 30% ili bar 50%) u odnosu na težinu. To jest, odnos aktivnog sastojka prema drugim komponentama (tj. dodavanje adjuvansa, rastvarača ili nosača) farmaceutske kompozicije je bar 1:99 (ili bar 10:90, bar 30:70 ili bar 50:50) u odnosu na težinu.

[0060] Jedinjenje dalje obezbeđuje postupak za dobijanje farmaceutske formulacije, kao što je ovde prethodno definisano, gde postupak obuhvata dovođenje u vezu jedinjenja iz pronalasa, kao što je ovde prethodno definisano sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, rastvaračem ili nosačem.

[0061] Jedinjenja iz pronalaska mogu takođe da se kombinuju sa drugim terapeutskim sredstvima koja su korisna u jednom ili više od:

(a) tretmana poremećaja CNS koji je povezan sa steroidom;

(b) tretmana uzrokovanih razvijanjem tolerancije posle izlaganja 3-alfa-hidroksi-5-alfa/betasteroidima;

(c) tretmana stanja koje je pogođeno sa odvikavanjem/odsustvom izlaganja 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-steroidima;

(d) tretmana jednog ili više nepoželjnih sporednih efekata anti-inflamatornim steroidom;

(e) tretmana jednog ili više nepoželjnih sporednih efekata postmenopauzalne terapije; i/ili (f) tretmana jednog ili više nepoželjnih sporednih efekata oralnog kontraceptiva, ili sa oralnim kontraceptivom per se. Takva terapeutska sredstva, ili oralni kontraceptivi, su ovde zajedno naznačeni zajedno kao druga ili druga "terapeutska sredstvo(a) kao što je ovde gore u tekstu definisano".

[0062] Na primer, jedinjenja iz pronalaska mogu da budu uključena u formulaciju ili režim tretmana zajedno sa oralnim kontraceptivom da se ublaže i/ili uklone:

(i) nepoželjni sporedni efekti oralnih kontraceptiva; i/ili

(ii) bilo koji neželjeni efekat periodičnih promena u endogenim steroidima.

[0063] Dalji aspekti iz pronalaska obezbeđuju za farmaceutske kompozicije i komplete delova koji obuhvataju terapeutski pogodne doze drugih terapeutskih sredstava kao što je ovde gore u tekstu definisano, kombinovano sa terapeutski pogodnom dozom jedinjenja iz pronalaska.

[0064] Prema daljem aspektu iz pronalaska, obezbeđen je kombinovani proizvod koji obuhvata: (A) jedinjenje iz pronalaska, kao što je ovde gore u tekstu definisano; i

(B) bar jedno drugo terapeutsko sredstvo kao što je ovde gore u tekstu definisano,

gde svaka od komponenti (A) i (B) je formulisana u smeši sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, rastvaračem ili nosačem.

[0065] Takvi kombinovani proizvodi obezbeđuju za ordiniranje jedinjenje iz pronalaska zajedno sa drugim terapeutskim sredstvom, i mogu prema tome da budu prikazani ili kao odvojene formulacije, gde bar jedna od tih formulacija obuhvata jedinjenje iz pronalaska, i bar jedna obuhvata drugo terapeutsko sredstvo, ili može da bude predstavljena (tj. formulisana) kao kombinovani preparat (tj. prezentovan u jednoj formulaciji uključujući jedinjenje iz pronalaska i drugo terapeutsko sredstvo).

[0066] Prema tome, dodatno je obezbeđena:

(1) farmaceutska formulacija uključujući jedinjenje iz pronalaska, kao što je ovde prethodno navedeno, bar jedno drugo terapeutsko sredstvo kao što je ovde prethodno gore navedeno, i farmaceutski privatljiv adjuvans, rastvarač ili nosač; i

(2) komplet delova koji obuhvataju komponente:

(a) farmaceutske formulacije uključujući jedinjenje iz pronalaska, kao što je obvde prethodno definisano, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, rastvaračem ili nosačem; i (b) farmaceutske formulacije uključujući bar jedno drugo terapeutsko sredstvo kao što je ovde prethodno definisano u smeši sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, rastvaračem ili nosačem,

gde su komponente (a) i (b) svaka obezbeđene u obliku koji je pogodan za ordiniranje zajedno sa drugim.

[0067] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za dobijanje kombinovanog proizvoda kao što je ovde prethodno definisano, gde postupak obuhvata dovođenje u vezu jedinjenja iz pronalaska, kao što je ovde prethodno definisano, sa bar jednim drugim terapeutskim sredstvom kao što je ovde gore u tekstu definisano, i bar jedan farmaceutski prihvatljivi adjuvans, rastvarač ili nosač.

[0068] Pod "dovođenje u vezu", smatramo da se dve komponente učine pogodnim za ordiniranje zajedno jedna sa drugom. Jedinjenja iz pronalaska mogu da se koriste kao deo "dodatka na terapiju" u lečenju koje uključuje bar jedno drugo terapeutsko sredstvo kao što je ovde prethodno navedeno.

[0069] Prema tome, u vezi sa postupkom za dobijanje kompleta u delovima kao što je ovde gore u tekstu definisano, povezivanjem dve komponente "u vezi sa" jedna sa drugom, uključujemo da mogu biti dve komponente delova kita:

(i) obezbeđene kao odvojene formulacije (tj. nezavisno jedna od druge), koje se nakon toga zajedno jedna sa drugom dovode za upotrebu u kombinovanoj terapiji; ili

(ii) spakovane ili predstavljene zajedno kao odvojene komponente "kombinovanog pakovanja" za upotrebu zajedno jedna sa drugom u kombinovanoj terapiji.

[0070] Jedinjenja iz pronalaska mogu da se ordiniraju u različitim dozama. Na primer, parenteralne (npr intravenozne) doze, pogodni interval je oko 0.2 do 200 mg po kg telesne težine, kao što je oko 20 do 100 mg po kg telesne težine. Doze mogu da se daju kontinuirano ili u podeljenim dozama jednom, dva puta, tri ili četiri puta ili više puta tokom dana.

[0071] U svakom slučaju, lekar, ili stručna osoba, će biti sposobna da odredi stvarnu dozu koja će najviše biti pogodna za individualnog pacijenta, koja će se verovatno razlikovati od načina davanja, tipa i težine stanja koje se leči, kao i vrsta, starosti, težine, pola, funkcije bubrega, funkcije jetre i odgovora određenog pacijenta koji se tretira. Gore pomenute doze su primeri srednjeg slučaja; može da, naravno, budu pojedinačni slučajevi gde su potrebni viši ili niži dozni opsezi, i takvi su obuhvaćeni obimom ovog pronalaska.

[0072] Jedinjenja iz pronalaska imaju prednost da su sposobna da blokiraju aktivnost 3-alfahidroksipregnan-steroida na humanom GABAAreceptoru.

[0073] Termin "blokiranje" je korišćen u ovom kontekstu da se definiše efekat u kome su 3-alfahidroksi-5-alfa/betasteroidi sprečeni od strane jedinjenja iz pronalaska da deluju na GABA-R receptor. "Blokiranje" je prema tome različit termin od onoga što se obično podrazumeva pod "modulacijom" ili "represijom" ili slični termini, što ukazuje da se farmakološko dejstvo i dalje odvija, ali u manjem obimu ili sporijom brzinom. Na ovaj način, "antagonist" označava supstancu koja ometa drugu supstancu, npr. agonist, da indukuje njegov efekat. U ovoj prijavi termin "antagonist" i "blokator" mogu da se koriste naizmenično.

[0074] Kao što je ovde prethodno razmatrano, jedinjenja iz pronalaska takođe imaju prednost u tome što oni selektivno blokiraju delovanje 3-alfa-hidroksi-5alfa/beta-pregnan-steroida na GABAAreceptor istovremenim ordiniranjem, sa samo ograničenim efektima na (u većini parcijalnim antagonistima) GABA efekta.

[0075] Pored prednosti koje se ovde prethodno pominju, jedinjenja iz pronalaska mogu dalje da imaju prednost u tome što mogu da budu efikasnija od, ili mogu da budu manje toksična od, ili duže da deluju od, mogu da budu potentnija od, proizvode manje neželjnih sporednih dejstava od, mogu lakše da se apsorbuju od, i/ili imaju bolji farmakokinetički profil od (npr. višu biodostupnost, koja nastaje na primer od povećane rastvorljivosti u vodenim rastvaračima, i/ili niže uklanjanje) od, i/ili ima druga korisna

1

farmakološka, fizička, ili hemijska svojstva, u odnosu na jedinjenja koja su poznata u prethodnom stanju tehnike, bilo da se koristi u gore navedenim indikacijama ili na bilo koji drugačiji način.

[0076] Kad god termin "oko" je ovde korišćen, na primer u kontekstu količina (npr. doza aktivnih sastojaka), ili vremenskih perioda, treba razumeti da su takve promenljive približne vrednosti i kao takve mogu da se razlikuju za ± 10%, na primer ± 5% i poželjno ± 2% (npr. ± 1%) od ovde naznačenih brojeva.

[0077] Pronalazak je ilustrovan, ali nije ograničen na bilo koji način, primeirma koji slede.

Primer 1 Sinteza 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksima

[0078] Identifikovano je da reakcija etinil Grinjarovog reagensa sa 3, 20/17 diketon steroidima je u većini slučajeva selektivna za položaj 3 i nema potrebe za zaštitu/uklanjanje zaštite drugog ketona čija je funkcija potrebna. Obrazovani su i alfa i beta izomeri, koji mogu da se razdvoje postupcima hromatografije i ponovo kristalizuju.

[0079] Polazni materijali za sintezu 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksima su odgovarajći steroidi sa 3-hidroksilnim substituentom i keto grupom na položajima 20. Oni mogu da se konvertuju u odgovarajuće dione oksidacijom sa IBX reagensom. Reakcija se odvija neometano i sa potpunom konverzijom. Drugi pogodni steroidi mogu da se koriste kao polazni materijali kada je to potrebno. Reakcije se izvode u pogodnim rastvaračima kao što je metanol, etanol, voda, THF, dietil etar, dihlorometan ili drugim rastvaračima koje stručnjak iz oblasti tehnike može da prepozna kao pogodne. Reaktanti su izabrani da bi se izbeglo kada je moguće, upotreba reaktanata, kao što su teški metali, koji su toksični čak kada se nalaze u tragovima ili je teško da se u potpunosti uklone u postupku obrade.

[0080] Reakcije koje uključuju reagense ili proizvode koji su osetljivi na vazduh ili vlagu izvode se u inertnoj atmosferi, kao što je gasoviti azot ili argon, u prisustvu suvih rastvarača. Dietil etar i tetrahidrofuran su osušeni preko Na u prisustvu benzofenona. Špricevi koji su napunjeni sa inertnim gasom su korišćeni za transfer reagenasa i suvih rastvarača. Optimizovano vreme i temperatura reakcija su određeni praćenjem obrazovanja proizvoda i gubitkom polaznog materijala korišćenjem odgovarajućeg hromatografskog postupka kao što je TLC ili GC/MS.

[0081] Prečišćavanja su izvedena upotrebom hromatografskih postupaka kao što je fleš hromatografija na gelu od silike, tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) korišćenjem HPLC aparata. Stručnjak iz oblasti tehnike će prepoznati da mogu da se koriste alternativi postupci prečišćavanja, i laboratorijski postupci hromatografije mogu da budu prilagođeni industrijskoj skali korišćenjem kolona hromatografije za dobijanja na veliko. Identifikovanje proizvoda se izvodi korišćenjem pogodnih analitičkih postupaka kao što su 1H-NMR, 13C-NMR, masena spektrometrija, IR spektroskopija, spektroskopija X-zračenja i bilo koji drugi test koji stručnjak iz oblasti tehnike može da prepozna kao mogući za strukturnu identifikaciju i određivanje čistoće 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksima. Stručnjak iz oblasti tehnike će prepoznati da slični reagensi, rastvarači, stanja i parametri mogu da se koriste u reakcijama, u zavisnosti od supstrata. NMR podaci su zabeleženi upotrebom Bruker 400 MHz spektrometra.

3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-on

[0082] 3,20-5α-pregnandion (1.580 g, 5.0 mmol) je razblažen u 50 mL suvog THF na sobnoj temperaturi (st) pod azotom. Etinil magnezijum bromid (1.1 ekviv) je dodat u kapima na st uz mešanje i rastvor je ostavljen da se meša preko noći na st u protoku azota.

[0083] Rastvor žućkaste boje je nakon toga ugašen sa zasićenim NH4Cl(vod) i vodena faza je ekstrahovana sa dihlorometanom (3 x 30 mL). Sakupljene organske faze su isparene pod redukovanim pritiskom, dobijeno žuto ulje je rastvoreno u dihlorometanu, isprano sa slanim rastvorom i osušeno preko MgSO4. Rastvor je redukovan pod vakuumom, i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni od silika gela (1:4 dietiletar:dihlorometan). Tipični prinosi su 72%. Eventualni tragovi proizvoda mogu da budu eliminisani daljom rekristalizacijom iz dietiletra.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3-d6): δ 2.51 (t, 1H); 2.47 (s, 3H); 2.14 (m, 1H); 2.11 (s, 3H); 0.81 (s, 1H); 0.60 (s, 3H).

3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α -pregnan-20-on

[0084] Ovo jedinjenje je dobijeno kao proizvod iz gore opisane reakcije i razdvojeno je fleš hromatografijom na koloni od silika gela. Uobičajen prinos je bio 13%.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3-d6): δ 2.52 (t, 1H); 2.43 (s, 1H); 2.11 (s, 3H); 0.80 (s, 3H), 0.60 (s, 3H).

3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α -pregnan-20-oksim

[0085] 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-on (10 mmol) je rastvoren u 5 mL dihlorometana i 50 mL etanola na st i atmosferi vazduha, u balonu zapremine 250 mL sa okruglim dnom. 4 ekviv. NH2OH hlorhidrata i 4 ekv. natrijum acetata su rastvoreni u 5 mL H2O i nakon toga se dodaju u rastvor steroida. Dodaje se 20 mL etanola i smeša je stavljena na refluks preko noći. Smeša je nakon toga ohlađena i rastvarač je uklonjen pod redukovanim pritiskom. Ostatak bele boje je tretiran sa 50 mL H2O i 50 mL dihlorometana, vodena faza je ekstrahovana sa 3 x 30 mL dihlorometana. Sakupljene organske faze su zatim osušene preko MgSO4, proceđene i rastvarač je uklonjen pod redukovanim pritiskom. Konačni ostatak je pročišćen fleš hromatografijom na koloni od silika gela dihlorometan:dietil etar 4:1, uobičajeni prinosi 95-100 %.

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3-d6): δ 2.47 (s, 1H); 2.22 (t, 1H); 2.05 (m, 1H); 1.88 (s, 3H); 1.86 (m, 1H); 0.81 (s, 3H), 0.62 (s, 3H).

Primer 2

Efekti 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksima na GABAAreceptor podtip alfa 5 i alfa 1

[0086] Korišćene su HEK-293 ćelije, koje su trajano transfektovane sa humanim α1β2γ2 GABAA i α5β3γ2 GABAAreceptorom koje eksprimiraju funkcionalne α1β2γ2L i α5β3γ2L GABAAreceptore. Ćelijske linije koje trajno eksprimiraju funkcionalni GABAAreceptor su dobijene u koracima koji slede. Podjedinice α1 (308-1727 NM_000806), β2 (214-1679 NM_000813), i y2L (290-1785 NM_198904) GABAAreceptora uključujući introdukovne Kozac sekvence neposredno pre start kodona su subklonirane u sisarskim ekspresionim vektorima koji su redom otporni na Geneticin, Higromocin B, i Zeocin. HEK-293 ćelijska linija stabilno eksprimira sve tri podjedinice GABAAreceptora je proizvedena transfekcijom podjedinicama jednom po jednom u vremenu. Nakon transfekcije sledi selekcija sa odgovarajućim antibioticima, ćelijsko razdvajanje korišćenjem antitela specifičnih za podjedinice (β2 i γ2), i proizvodnjom jednoćelijskih kolonija. Proizvedene ćelijske linije su imunohistohemijski analizirane za sve tri podjedinice GABAAreceptora, nakon čega sledi selekcija odgovarajuće ćelijske linije koja pokazuje normalnu i dobru reaktivnost receptora GABAAi analiza nametanja voltaže na delić membrane (engl. patch-clamp) (videti u tekstu ispod) prema GABA i GAMS tetrahidrodeoksikortikosteronu (THDOC).

Postupci za ispitivanje efekata GABAAreceptora 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksima [0087] Eksperimeni su sprovedeni da se ispita efekat 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksima na funkciju GABAAreceptora u odsustvu i u prisustvu GAMS Tetrahidrodeoksikortikosterona (THDOC) sa Dynaflow™ sistemom na HEK-293 ćelijama. U ovim testovima protokol je prilagođen da bude sličan sa fiziološkim uslovima u sinaptičkom procepu.

[0088] Ćelijska kultura: HEK-293 ćelije, trajno transfektovane sa α1β2γ2 GABAA i α5β3γ2 GABAApodtipovima receptora, u zasejani u gustini 3 x 10<4>/25 cm<2>u posudi za kulturu koja vezuje ćelije. Transfekovane ćelije su korišćene za eksperimente koji koriste tehniku nametanja voltaže na deliću membrane 3 dana posle zasejavanja. Kada se ćelije koriste za eksperimente nametanja voltaže na deliću membrane ćelije su dva puta isprane sa EC-rastorom sa mehurićima O2(videti ispod). Oko 5 mL EC je nakon toga dodato i ćelije su držane u inkubatoru 15 minuta. Posle 15 minuta ćelije se oslobađaju sa dna balona i pažljivo su razdvojene usisavanjem nekoliko puta Pasterovom pipetom.

[0089] Dynaflow™ sistem: Dynaflow™ sistem sa čipovima za razdvajanje je korišćen za sve eksperimente nametanja voltaže na deliću membrane. Čipovi za razdvajanje su napravljeni od nelepljivih materijala. Širina kanala je 150 µm i visina je 50 µm. Zapremina bunarića je 280 µL. Vreme protoka na brzini protoka 26 µL/min. je 180 min. Podešavanja pumpe su bila prema sledećim: Omnifix korišćen 2 mL špric sa unutrašnjim prečnikom 9.65 mm. Brzina protoka pumpe šprica na čipu je 26 µL/min.

[0090] Steroidi i GABA: GABA je rastvoren ultrazvukom u EC-rastvoru za oko 40 minuta do koncentracije 10 mM na sobnoj temperaturi. Svi steroidi su rastvoreni do koncentracije 6 mM u etanolu. Koncentracija etanola je 0.1% u svim krajnjim studijama, uključujući rastvor za ispiranje (EC) i rastvor sa samom GABA. Krajnji rastvori su rastvori koji se dodaju u bunarićima na čipu.

[0091] Elektrofiziologija: Patch elektrode su izvučene iz 1.5 mm O.D., 0.86 mm I.D. borosilikatnog kapilarnog stakla bez filamenta. Uobičajene elektrode imaju otpor 2-5 MΩ kada se napune sa intraćelijskim rastvorima. Intraćelijski rastvor se sastoji iz (u mM): 140 Cs-glukonata, 3.0 NaCl, 1.2 MgCl<2>, 1.0 EGTA, 10 HEPES. pH je podešen do 7.2 sa CsOH. Vanćelijski (EC) rastvor korišćen za snimanja koja sadrže (u mM): 137 NaCl, 5.0 KCI, 1.0 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukozu. pH je podešen sa NaOH do 7.4. Nakon kompenzacije za potencijal tečnosti veza mirujući potencijal održavanja -17 mV je korišćen u svim eksperimentima. U fiziološkim uslovima HEK-293 ima potencijal mirovanja -40 mV i nisku koncentraciju hloridnih jona unutar ćelije. Korišćenjem nametnutog potencijala od -17 mV i intraćelijskog rastvora sa niskom koncentracijom hloridnih jona, hloridni joni ulaze u ćeliju kada su receptori aktivirani. Svi eksperimenti su izvedeni sa sobnoj temperaturi (21 do 23°C). Standardni protokol je korišćen za sve eksperimente.

Protokol

[0092] GABA primene: Korišćenjem Dynaflow opreme je moguće ispitivati transfekciju HEK-293 u skoro fiziološkim uslovima. Dynaflow sistem omogućava primenu rastvora za kratko 40 ms do minuta u vremenu. Fiziološki, u sinaptičkom procepu, GABA je oslobođena u mM opsegu za oko 2 ms ovo je validno za alfa 1 receptore. Na dodatnim sinaptičkim mestima nivoi GABA su niži ali ostaju u dužem periodu ovo je validno za alfa5 receptore. U eksperimentima sa α1β2γ2L primenili smo GABA ± steroid tokom 40 ms; u eksperimentima sa α5β3γ2L, GABA ± steroid je primenjen 6 s. Pronađeno je da u skoro svim ćelijama, prva primena GABA je dala manji odgovor od druge primene GABA. Ne postoji razlika u odgovoru između druge i treće primene GABA. Prema tome prva GABA primena se uvek ponavlja dva puta i drugi odgovor je korišćen u analizi. Ispiranje: GABA je dosta rastvorljiva u vodi i lako se ispira sa receptora. Vreme ispiranja je podešeno do 1 minuta nakon primene samo sa GABA. Steroidi se sa druge strane teže rastvaraju vodi i takođe se teško ispiraju sa receptora. U našim eksperimentima, koristili smo THDOC kao agonist GABA. Sa vremenom ispiranja 2 minuta, 200 nM THDOC je u potpunosti ispran što nije pokazano ni akumulativni niti senzibilizacioni efekat.

1

[0093] Inkubacija: Da bi se uočio efekat steroida i da bi se postigli stabilni rezultati mi smo pronašli da steroidi moraju da se inkubiraju na receptoru pre primene GABA. Ovo otkriće je podržano predlogom da mesto vezivanja za THDOC je locirano unutarćelijski na receptoru (Hosie et al 2006). Ispitana su različita vremena inkubacije da bi se postiglo optimalno vreme za postizanje stabilnih rezultata i minimalizovalo vreme ispiranja. Inkubaciono vreme od 20 sekundi se pokazalo kao optimalno vreme za vreme ispiranja od 2 minuta.

[0094] Zaključak optimizacije: Optimizovani protokol je sledeći: 20 sekundi inkubacije steroida, 40 ms ili 6 s. GABA ± steroidi primena, ispiranje 2 minuta. Prva primena GABA je ponovljena dva puta sa vremenom ispiranja 1 min. Između prve i druge primene.

Rezultati ispitivanja 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksima na receptor GABAAa1β2γ2L i α5β3γ2

[0095] Rezultati ispitivanja tehnikom nametanja voltaže na deliću membrane 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5αpregnan-20-oksima u dva različita GABAAreceptora podtipova α1β2γ2L i α5β3γ2L su dali neočekivani i iznenađujući rezultat. Kao što je prikazano u Tabeli 2, 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim u, α1β2γ2L receptoru, nije imao efekat antagonista u odnosu na pojačavajući efekat THDOC, GAMS korišćen u eksperimentima. 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim sami nisu imali efekat pojačavanja ili efekat antagonizacije na fluks hlorida. 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim je imao efekat blagog agonista na GABA otvaranje α1β2γ2L GABAA receptora. Ovaj efekat agonista je tako mali da nije od značaja i u opsegu je nosača.

[0096] Neočekivano, na podtip α5β3γ2L receptora 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim je antagonist u svim ispitanim situacijama sa GAMS i GABA (Tabela 2).3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim, prema tome pokazuje specifičnost koja zavisi od podtipa receptora. 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim je prema tome pokazao selektivnost i njegovom delovanju i prema tome je pogodan kao lek. Kao što je 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim specifičan i nije aktivan na α1β2γ2L receptoru, 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim će imati manje nepoželjnih sporednih efekata zbog opštijeg alfa1 receptora. Inhibicija efekta kao antagonista daje veći uticaj od slične pozitivne promene kao agonist.

Tabela 2. Ispitivanja na trenutnom odgovoru koji je posredovan fluksom hloridnog jona kroz GABAAreceptore koji eksprimiraju α1 i α5 podjedinicu. U ovom ispitivanju je korišćen postupak nametanja voltaže na deliću membrane kombinovan sa Dynaflow™ sistemom primene, koji obezbeđuje brze primene i uklanjanje supstanci. "Jedinjenje" se odnosi na 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim.

"GAMS" se odnosi na "steroide modulatore GABAAreceptora" u ovom slučaju tetrahidrodeoksikortikosteron (THDOC).

α1β2γ2-GABAAreceptori

[0097] 1 µM 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksima povećava strujni odgovor α1β2γ2L- GABAAreceptora za približno 10% (Tabela 2).1 µM 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim nije direktno aktivirao receptor GABAA, u odsustvu GABA. Rezultati iz ovog ispitivanja su pokazali da 3α-etinil, 3βhidroksi, 5α-pregnan-20-oksim nije negativno modulirao struje pobuđene GABA na α1β2γ2- GABAAreceptorima. Osim toga, uočeno 10% povećanje GABA pobuđenih struja na tipu α1-podjedinice mora se smatrati neznatnim efektom. Ukratko, 3α-etinil, 3β-hidroki, 5α-pregnan-20-oksim nema bilo koji veći efekat na GABA pobuđenim strujama na α1β2γ2L- GABAAreceptorima.

α5β3y2-GABAAreceptori

[0098] Očigledan efekat antagonizacije koji zavisi od koncentracije je uočen za 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim na 200 nM GAMS (THDOC) i 0.3 µM GABA pobuđenim strujama (Tabela3).3αetinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim je takođe imao efekat antagonizacije na 200 nM THDOC pobuđenu struju, tj. direktnu aktivaciju GABAAreceptora sa GAMS. Ovaj antagonizam je bio iste veličine kao onaj na 200 nM THDOC i 0.3 µM GABA pobuđenoj struji.

Tabela 3.0.1-3 µM 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim ("Jedinjenje") u prisustvu 200 nM THDOC 0.3 µM GABA. Relativni efekat u odnosu na kontrolu 200 nM THDOC 0.3 µM GABA, podešen na 0.

Primer 3

Komparativni efekti 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksima i njegovog epimera na GABAAreceptor podtip alfa 5

[0099] Korišćenjem postupaka koji se opisuju u Primeru 2 u tekstu iznad, 3α-etinil, 3β-hidroksi,5αpregnan-20-oksim i njegov epimer, 3β-etinil, 3α-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim su ispitani za efekte na GABAAreceptor podtip alfa 5.

[0100] Jedina metodološka razlika u postupcima koji se koriste u poređenju sa Primerom 2 je da su steroidi rastvoreni u etanolu do koncentracije 2 µM u rastvoru štoka, sa finalnom koncentracijom etanola 0.1% u svim rastvorima. Rezultati su predstavljeni tabelom u Tabeli 4 u tekstu ispod.

Tabela 4. Efekti ispitanih UC-steroida 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksima ("Jedinjenja") i 3βetinil, 3α-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksima ("Komparator") u koncentracijama od 1 µM ispitanim u odgovoru na GABA-steroid THDOC mereno kao promena u protoku hlorida kroz α5β3γ2L GABAArece tor.

1

[0101] Rezultati pokazuju da jedinjenje iz pronalaska deluje kao antagonist GABA receptora podjedinice alfa 5, gde epimer deluje kao agonist.

1

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-oksim ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Farmaceutska formulacija koja obuhvata jedinjenje kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, rastvaračem ili nosačem.

3. Jedinjenje kako je definisano u patentnom zahtevu 1, za upotrebu u terapiji.

4. Jedinjenje kako je definisano u patentnom zahtevu 1, za upotrebu u postupku lečenja:

(a) poremećaja CNS povezanog sa steroidom;

(b) stanja ili simptoma uzrokovanih razvijanjem tolerancije nakon izlaganja 3-alfa-hidroksi-5-alfa/beta-steroidima;

(c) stanja koje je pod uticajem odvikavanja/apstinencije izlaganja 3-alfa-hidroksi-5-alfa/betasteroidima;

(d) jednog ili više nepoželjnog efekta anti-inflamatornog steroida;

(e) jednog ili više nepoželjnog efekta postmenopauzalne terapije; i/ili

(f) jednog ili više nepoželjnog efekta oralnog kontraceptiva.

5. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, gde poremećaj CNS povezan sa steroidom je izabran iz grupe koju čine epilepsija, epilepsija zavisna od menstrualnog ciklusa, depresija, depresija povezana sa stresom, migrena, umor i posebno umor koji je povezan sa stresom, premenstrualni sindrom, premenstrualni disforični poremećaj, promene raspoloženja povezane sa menstrualnim ciklusom, minimalno kognitivno oštećenje, kognitivno oštećenje, promene u memoriji povezane sa menstrualnim ciklusom, promene u memoriji povezane sa stresom, poteškoće u učenju povezane sa stresom, hepatična encefalopatija, Daunov sindrom, Alzhajmerova bolest, poteškoće u koncentraciji povezane sa menstrualnim ciklusom, poremećaji spavanja povezan sa menstrualnim ciklusom i umor, povećan apetit, prejedanje i gojaznost, relaps zloupotrebe alkohola i supstanci, poremećaji ravnoteže, ’moment’ poremećaji i poteškoće u koordinaciji.

6. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, gde poremećaj je hepatična encefalopatija.

7. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde hepatična encefalopatija je Tip A hepatične encefalopatije, Tip B hepatične encefalopatije, Tip C hepatične encefalopatije, minimalna hepatična encefalopatija, ili otvorena hepatična encefalopatija.

8. Jedinjenje za upotrebu kao što je navedeno u patentnom zahtevu 5, gde je poremećaj Daunov sindrom ili Alchajmerova bolest.

9. Kombinovani proizvod koji obuhvata:

(A) jedinjenje kao što je definisano u patentnom zahtevu 1; i

(B) bar jedno drugo terapeutsko sredstvo koje je korisno u lečenju poremećaja CNS povezanog sa steroidom,

pri čemu svaka od komponenti (A) i (B) je formulisana u smeši sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, rastvaračem ili nosačem.

10. Kombinovani proizvod kao što je navedeno u patentnom zahtevu 9 koji obuhvata farmaceutsku formulaciju ukjučujući jedinjenje kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, bar jedno drugo farmaceutsko sredstvo koje je korisno u lečenju poremećaja CNS povezanog sa steroidom, i farmaceutski prihvatljivi adjuvans, rastvarač ili nosač.

11. Kombinovani proizvod kao što je definisano u patentnom zahtevu 9, koji obuhvata komplet delova koji sadrže komponente:

(a) farmaceutska formulacija koja obuhvata jedinjenje formule I kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, rastvaračem ili nosačem; i

(b) farmaceutska formulacija koja obuhvata bar jedno drugo terapeutsko sredstvo koje je korisno u lečenju poremećaja CNS povezanog sa steroidom u smeši sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, nosačem ili rastvaračem,

gde komponente (a) i (b) su svaka obezbeđene u obliku koji je pogodan za ordiniranje zajedno sa drugim.

12. Postupak za dobijanje jedinjenja formule I kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, gde proces obuhvata reakciju 3α-etinil, 3β-hidroksi, 5α-pregnan-20-ona sa hidroksilaminom.

13. Postupak za dobijanje farmaceutske formulacije kao što je definisano u patentnom zahtevu 2, gde postupak obuhvata dovođenje u vezu jedinjenja kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, rastvaračem ili nosačem.

14. Postupak za dobijanje kombinovanog proizvoda kako je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 9 do 11, gde postupak obuhvata dovođenje u vezu jedinjenja kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 sa drugim terapeutskim sredstvom koje je korisno u lečenju poremećaja CNS povezanog sa steroidom, i bar jednim farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, rastvaračem ili nosačem.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5

1