RS59802B1 - Terapeutski agens ili profilaktički agens za demenciju - Google Patents

Description

Opis

[Tehnička oblast]

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje. Određenije, ovaj pronalazak odnosi se inovativno antitelo protiv fosforilisanog proteina ili peptida, sa odličnim efektom za poboljšavanje kognitivne funkcije, i na terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje koji obuhvataju anti-fosforilisano tau antitelo, ili antigen koji izaziva antifosforilisano tau antitelo.

[Stanje tehnike]

[0002] Kognitivni poremećaj je stanje u kojem se razvijena inteligencija pogoršava zbog nekog stečenog uzroka, što predstavlja prepreku socijalnom prilagođavanju. Kognitivni poremećaji klasifikuju se kao neurodegenerativne bolesti, vaskularni kognitivni poremećaji, prionske bolesti, infektivne bolesti, metabolični/endokrini poremećaji, trauma i cerebralni poremećaji, i toksični poremećaji (NPL 1). Od 2010, u Japanu postoji trenutno oko 2.1 miliona pacijenata obolelih od kognitivnih poremećaja, sa stopom javljanja morbiditeta od oko 8-10%, ili čak više od 10%, među starijim preko 65 godina, i to je prepoznato kao ozbiljan problem kod starih ljudi širom sveta (NPL 2). Podaci fundamentalnih bolesti kognitivnih poremećaja ukazuju da su u pitanju u većini slučajeva neurodegenerativne bolesti kao što su AD i FTLD, sa približno 35% Alchajmerove bolesti (AD), približno 15% kombinacije AD i cerebrovaskularne bolesti, i 5% neurodegenerativnih bolesti kao što su Frontotemporalna lobarna degeneracija (FTLD) (NPL 2). Kognitivni poremećaj zbog neurodegenerativne bolesti okarakterisan je podmuklim početkom slabljenja pamćenja i/ili promenama lilčnosti koji napreduju tokom perioda od najmanje 6 meseci ili više. Konzistentan faktor u neurodegenerativnim postupcima koji ispoljavaju visok stepen korelacije sa stepenom pogoršanja kognitivne funkcije je prisustvo neurofibrilarne petlje (NFT) (NPL 3).

[0003] Tau (protein) je protein enkodiran MAPT genom smeštenim na hromozomu 17 (17q21) kod ljudi, i predstavlja jedan od mikrotubula-vezujućih proteina u velikoj meri izražen u centralnom nervnom sistemu. Pronađeno je da je Tau glavni konstituentni protein u uparenim spiralnim filamentima i ravnim filamentima koja formiraju NFT u AD, jedna od the najistaknutijih neurodegenerativnih bolesti, a njegovo intraceluralno nagomilavanje pokazano je u različitim varijantama neuropatoloških stanja. Bolesti izazvane intraceluralnim nagomilavanjem tau zajedno se nazivaju "tauopatije" (NPL 4).

Neurodegenerativne bolesti koje se uključuju među tauopatijama su Alchajmerova bolest (AD), degeneracija kortikalno-bazalnih ganglija (CBD ili CBS), progresivna supranuklearna paraliza, Pikova bolest, (demencija argirofilnog zrna (bolest argirofilnog zrna), Multiple sistemska tauopatija sa demencijom (MSTD), frontotemporalna demencija povezana sa hromozomom 17 sa Parkinsonizmom (FTDP-17), demencija neurofibrilarnih petlji, difuzne neurofibrilarne petlje sa kalcifikacijom (DNTC), tauopatija bele mase sa globularnim glialnim inkluzijama (WMT-GGI) i frontotemporalna lobarna degeneracija sa tau-pozitivnim inkluzijama (FTLD-tau), ali i ne-neurodegenerativne bolesti, koje uključuju infektivne bolesti kao što su von Economo-va postencefalitična Parkinsonova bolest i subakutni sklerozni panencefalitis, i traumom indukovanaq stanja kao što su bokserska encefalopatija, takođe su uključene među tauopatijama (NPL 4).

[0004] Struktura MAPT gena na genomu pronađeno je daje protein koji se sastoji od 13 eksona, sa višestrukim izoformama zbog alternativnog splajsovanja (NPL 4). Osobine strukture tau je da ona obuhvata N-terminalni kiselinski domen koji sadrži 0-2 ponavljajuće sekvence (N) 29 aminokiselina zavisno od alternativog splajsovanja eksona 2 i eksona 3 (N0-N2), intermedijernog domena bogarog prolinom, i C-terminalni mikrotubula-vezujući domen (enkodiran eksonima 9 do 12) koji sadrži 3 (3R) ili 4 (4R) ponavljajuće sekvence (R) koje doprinose mikrotubularnom vezivanju (NPL 3 i 4). Prema tome, tau ima 6 reprezentativnih izoformi, 3R0N (352 aminokiseline) ·3R1N (381 aminokiselina) ·3R2N (410 aminokiselina) ·4R0N (383 aminokiseline) ·4R1N (412 aminokiselina) i 4R2N (441 aminokiselina), zavisno od broja 29 aminokiselinskih ponavljajućih sekvenci (N) i mikrotubula-vezujućih ponavljajućih sekvenci (R) koje sadrži. Od ovih izotipova, samo 3R0N je prisutan u mozgu embriona, dok je svih 6 izotipova prisutno u mozgu odrasle osobe, pri čemu je tip 4R najzastupljeniji (NPL 3). Razlika između 3R i 4R izotipova je da li je ekson 10 uklonjen alternativnim splajsovanjem (3R) ili je prisutan (4R). Prema tome, postoji nekoliko izoformi tau, ali su aminokiselinski brojevi (1-441) najduže izoforme 4R2N (SEQ ID NO: 1) predstavljeni za identifikaciju aminokiselinskih brojeva na odgovarajućim položajima. Na primer, oznaka"Ser413" ukazuje na serin koji je 413-ti aminokiselinski ostatak u 4R2N (SEQ ID NO: 1), ako je ova serin 384-i aminokiselinski ostatak u 4R1N (SEQ ID NO: 2), 355-i u 4R0N (SEQ ID NO: 3), 382-i u 3R2N (SEQ ID NO: 4), 353-i u 3R1N (SEQ ID NO: 5), i 324-i u 3R0N (SEQ ID NO: 6).

[0005] U pogledu uloge tau u neurodegenerativnim bolestima, prvo je otkriveno da postoji odnos između mutacije MAPT gena i nagomilavanja tau u frontotemporalnoj demenciji povezanom sa hromozomom 17 sa Parkinsonizmom (FTDP-17), pri čemu je više od 40 različitih genskih mutacija u MAPT genu prijavljeno u FTDP-17 (NPL 4). Predloženo je da takve genske mutacije mogu da dovedu do izmena u proporciji tau izoforma i promene interakciju mutant tau sa mikrotubulama, čime se doprinosi utvrđivanju patologije. Međutim, za razliku od naslednih neurodegenerativnih bolesti, mutacije u MAPT obično nisu prisutne kod sporadičnih neurodegenerativnih bolesti kao što je AD. Pored toga, jedna od karakteristika nagomilavanja tau kod neurodegenerativnih bolesti je visok stepen modifikacije fosforilacijom. Šta više, kod pacijenata koji ispoljavaju blago pogoršanje kognitivne funkcije (MCI), primećene su korelacije između nivoa fosforilisanog tau u spinalnoj tečnosti i atrofije hipofize, što sugeriše da je fosforilisan tau veoma pouzdan biomarker za neurodegeneraciju kod pacijenata sa tauopatijama (NPL 5). Iz ovog razloga, izvedeni su napori da se primene enzimski inhibitori protiv kinaza, a određenije GSK-3 beta, kao enzimi koji su uključeni u fosforilaciju, da bi se inhibirala prekomerna fosforilacija tau, a taj razvoj nastavio se u ovu oblast (NPL 5). Međutim, kako su kinaze kao što su GSK-3 beta enzimi koji su umešani ne samo u bolest već i u kontrolu funkcije kod normalnih fizioloških postupaka, sporedni efekti predstavljali su izvor zabrinutosti. Zapravo, kako se neka od mesta na kojima je tau fosforilisan putem GSK-3 beta poklapaju sa mestima tau fosforilacije primećene kod normalnih ljudskih mozgova (NPL 3), postoji mogućnost da ona utiče na normalnu tau funkciju.

[0006] Uobičajeno znanje je da ekstracelularni tau curi iz ćelije kao posledica ćelijske smrti degenerisanih neurona, ali nedavna ispitivanja sugerišu da nakon prekomerne intraceluralne fosforilacije, tau se prerađuje i aktivno luči iz ćelije. Fosforilisan tau izlučen iz ćelija smatra se da je defosforilisan na određenim mestima fosforilacije, naknadno dejstvujući na muskarinske receptore M1 i M3 okolnih ćelija, i tako promovišući intraceluralnu tau fosforilaciju i doprinoseći izazivanju ćelijske smrti (NPL 6, NPL 7). Kako se stvara konsenzus tako da tau funkcioniše kao faktor ekstracelularne aktivnosti, povećava se fokus na njegovim mogućnostima u terapeutskim agensima, primenom komponenti leka koje su makromolekuli kao što su antitela koja se ne mogu lako izazvati da ispoljavaju intraceluralnu aktivnost. Međutim, kako je prethodno navedeno, ekstracelularno izlučen tau može biti delimično obrađen i može postati defosforilisan, potencijalno prolazeći kroz dalje modifikacije izvan strukturalne informacije o prekomerno fosforilisanom tau koji je ciljan u prošlosti. Takođe je predloženo da lekovi koji deluju na delove defosforilisanog tau mogu da utiču na funkciju normalnog tau. Kada se cilja tau povezan sa patologijom nekim antitelima ili slično, još važnije je da se odabere entitet koji će delovati na dato patološki specifično mesto, tj. tau fosforilacioni epitop, i odabir epitopa postaje još teži zbog kompleksnosti ove informacije.

[0007] Prijavljeni su pronalasci koji se odnose na imunološku terapiju za tauopatije sa tau proteinom kao metom, koji se cilja na izvršnoj specifičnoj aktivnosti protiv tau (NPL 5, PTL 1, PTL 2, PTL 3). Imunološka terapija sprovodi se sa ciljem izazivanja proizvodnje specifičnih antitela davanjem peptidnih vakcina i slično, i očekuje se da imaju smanjene sporedne efekte zbog visoke specifičnosti prema ciljanim proteinima ili peptidima. Prijavljeno je da motorna funkcija poboljšava u životinjskim modelima koji ispoljavaju mutant tau, imunizacijom životinja iz tog modela vakcinisanjem primenom delimičnih peptida fosforilisanog tau (sa aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju Ser396 i Ser404 fosforilisanom, i sa aminokiselinskim ostatkom koji odgovara Ser262 fosforilisanom). Međutim, ovi izveštaji su ispitivanja koja koriste transgene miševe (Tg miševi) sa indukovanim genskim mutacijama kao što su P301L (mutacija iz prolina u leucin na 301-om aminokiselinskom ostatku tau), i iako takvi Tg miševi služe kao modeli genske mutacije za FTDP-17, vrsta nasledne neurodegenerativne bolesti, oni ne predstavljaju većinu neurodegenerativnih bolesti među tauopatijama koje nisu praćene tau genskim mutacijama, a određenije sporadične neurodegenerativne bolesti. Pored toga, kako su P301Ltg miševi modeli za pogoršanje motornih funkcija, a nisu modeli koji predstavljaju pogoršanje kognitivne funkcije, što predstavlja problem sa kognitivnim poremećajima kod ljudi (NPL 8), teško je razaznati da se rezultati kod ovih životinja mogu primeniti na lečenje kognitivnih poremećaja kod ljudi. Kod PTL 4, ispituje se efekat tretmana tauopatija, davanjem antitela koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo sa tau peptidom kod kojeg je Ser409 fosforilisan. Međutim, peptidne vakcine su skupe, zahtevaju visoke ukupne doze i zahtevaju duge periode da ispolje njihove efekte. Pored toga, efekti peptidnih vakcina i reaktivnosti imunološkog odgovora vakcinisanih ljudi i životinja se razlikuje u skladu sa genetskom pozadinom, a efektivna proizvodnja antitela ne može uvek biti izavana kod svakog pojedinca. Prema tome, dok imunološka terapija pasivnom imunizacijom antitelima ima potencijal, veoma veliki broj mesta je fosforilisan u tau, a virtuelno ne postoji informacija u pogledu koja antitela za koja mesta fosforilacije je efektivno primeniti. Pored toga, ne može se smatrati da trenutno dostupna antitela imaju dovoljnu funkciju za upotrebu u terapiji, na osnovu njihovih efekata u životinjskim modelima.

[0008] Pored toga, Kada se antitelo koristi kao bazno jedinjenje za terapeutski agens ili profilaktički agens, potrebno je takođe uzeti u obzir količinu antitela koje se koristi za lečenje, kako bi se izbegli sporedni efekti i minimizirali problemi medicinskih troškova, a to je naročito značajno u vezi sa dozama kod hroničnih bolesti ili genetskih bolesti. Na primer, doza za lečenje sa Actemra<R>(tocilizumab), koji je humano anti-IL-6R antitelo, je 8 mg po 1 kg telesne mase tokom 1 do 4 nedelje, a doza za lečenje sa Soliris<R>(ekulizumab), koji je humanizovano anti-komplement C5 antitelo, iznosi 600-900 mg po odrasloj osobi po davanju, tokom 2 do 4 nedelje. Ovo su superiorna antitela razvijena odabirom između velikog broja antitela, ali su njihove doze realitvno velike u odnosu na lekove na bazi antiela koji su trenutno u upotrebi. Zbog toga, efekat se mora postići dozama jednakim ili manjim od ovih, za lekove na bazi antitela koji će se raviti u budućnosti. Pored toga, dok je mozak organ koji se tretira kod kognitivniv poremećaja kao što su AD, sistemsko davanje intravenoznim ili subkutanima putem generalno se smatra da daje malu brzinu migracije antitela iz krvi u mozak, zbog prisustva krvno-moždane barijere, i prema tome antitela koja se koriste za lečenje kognitivnih poremećaja i očekuje se da imaju niže farmakološke efekti u poređenju sa lečenjem za bolesti koje uključuju druge organe, i to predstavlja glavni problem.

[0009] Glavni simptomi kod humanih kognitivnih poremećaja su pogoršanje pamćenja i pogoršanje kognitivne funkcije, a kako je kognitivna funkcija naročito značajna za ispoljavanje procene na bazi pamćenja, komunikacije i izvedbe, simptomi kognitivnih poremećaja su od glavnog značaja. Motorna funkcija, sa druge strane, iako je simptom koji se javlja kod frontotemporalne demencije povezane sa hromozomom 17 sa Parkinsonizmom (FTDP-17) i Alchajmerove bolesti krajnjeg stadijuma, nije nužno glavni simptom koji se ispoljava kod kognitivnih poremećaja. Zbog toga, glavni razlog zbog kog se razmatra tretiranje kognitivnih poremećaja je poboljšanje kognitivnih funkcija. Međutim, trenutno ne postoji način za dobijanje terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa za kognitivne poremećaje koji ispoljavaju superiorno poboljšanje na kognitivnu funkciju, primenom pogodnih životinjskih modela za taupatija-povezano pogoršanje kognitivne funkcije koji su neophodni za rešavanje ovde navedenih problema, niti postoji bilo kakav terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje koji ispoljava spcifičan i superioran efekat protiv kognitivnih poremećaja.

[0010] WO2010/144711 opisuje peptid koji odgovara ostacima 398-416 tau pri čemu je Ser na položajima 412 i 413 fosforilisan. Ovde su takođe opisana antitela koja se vezuju za peptid.

[0011] US2002/0086009 opisuje broj peptida koji se delimično preklapa sa regionom 410-421 tau. Ovi peptidi su fosforilisani na položajima 412 i/ili 413 i koriste se za generisanje antitela za detektovanj Alchajmerove bolesti.

[0012] Boutanjagout et al 2011 opisuju upotrebu PHF1 antitela, koje cilja tau koji je fosforilisan na serinskim aminokiselinama 396 i/ili 404, za pasivnu imunizaciju na mišjem modelu Alchajmerove bolesti.

[0013] Prema tome, u svetlu gore navedenog, postoji zahtev za terapeutskim agensom ili profilaktičkim agensom sa snažnim efektom za poboljšavanje kognitivnih funkcija.

Citatna lista

Patentna literatura

[0014]

[PTL 1] US8012936

[PTL 2] WO2010/142423

[PTL 3] WO2010/144711

[Ne-patentna literatura]

[0015]

[NPL 1] Kishimoto, T., Takahashi, S., STEP Series Seishinka, 2th Edition, P.103-104, Kaibashobo, 2008 [NPL 2] Asada, T., Igaku no Ayumi, supplementary volume, "Cognitive disorders", p.5-10, Ishiyaku Publishing, 2011

[NPL 3] Alistair Burns, John O’Brien and David Ames, Dementia.3rd Edition, P.408-464, 2005

[NPL 4] Arai, T., Shinkei Naika, Vol.72, special number, (Suppl.6), P.46-51, 2010

[NPL 5] Wendy Noble et al., Expert Opin. Drug Discov., Vol.6, No.8, P.797-810, 2011

[NPL 6] Miguel Diaz-Hernandes et al., Journal of Biological Chemistry Vol.285, p.32539-32548, 2010 [NPL 7] Venessa Plouffe et al., PLoS ONE Vol.7, p36873, 2012

[NPL 8] Alistair Burns, John O’Brien and David Ames, Dementia.3rd Edition, P.459, 2005

OPIS PRONALASKA

Problemi koji se rešavaju ovim pronalaskom

[0016] Predmet ovog pronalaska je da obezbedi terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje, fokusirajući se na tau fosforilaciju u tauopatijama.

[0017] Još jedan predmet ovog pronalaska je da obezbedi terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje koji obuhvataju kao aktivni sastojak antitelo koje učestvuje u specifičnoj reakciji antigen-antitelo za tau fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji odgovara blizini Ser413, ili peptid sa aminokiselinskom sekvencom u blizini Ser413 i fosforilisan na najmanje jednom aminokiselinskom ostatku.

[0018] U još jednom predmetu ovog pronalaska je da obezbedi monoklonalno antitelo sa visokim efektom poboljšavanja kognitivne funkcije, postupak pripremanja antitela koji je još pogodniji za lečenje kognitivnog poremećaja, kao što je humanizovano antitelo, na osnovu analize strukture monoklonalnog antitela.

Sredstva za rešavanje problema

[0019] Ovaj pronalazak je kako sledi. Tau protein ovog pronalaska uključuje ne samo 4R2N, već svih 6 vrsta izoforma. Praktičnosti radi, položaji aminokiselinskih ostataka u skladu sa ovim pronalaskom identifikovani su na osnovu SEQ ID NO: 1, i na primer, ako se pominje aminokiselinski ostatak koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1, to se odnosi na 413-i serin iz SEQ ID NO: 1 (4R2N), ili serin koji je 384-i aminokiselinski ostatak iz SEQ ID NO: 2 (4R1N), 355-i iz SEQ ID NO: 3 (4R0N), 382-i iz SEQ ID NO: 4 (3R2N), 353-i iz SEQ ID NO: 5 (3R1N) ili 324-i iz SEQ ID NO: 6 (3R0N).

[0020] U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije tauopatije, pri čemu terapeutski agens ili profilaktički agens obuhvata, kao aktivni sastojak, monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za tau protein fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1, pri čemu je vezivanje definisano afinitetom predstavljeno ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od najviše 1 x 10<-6>M, i pri čemu je pomenuto vezivanje za fosforilisan tau protein najmanje 10 puta jače od vezivanja za tau protein koji nije fosforilisan na pomenutom Ser413.

[0021] U jednom načinu ostvarivanja, antitelo obuhvata: varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata CDR-H1 sa sekvencom odabranom od SEQ ID NO: 7 ili 8; CDR-H2 sa sekvencom odabranom od SEQ ID NO: 9, 10, 11 ili 12; i CDR-H3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 13; i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDR-L1 sa sekvencom odabranom od SEQ ID NO: 14 ili 15; CDR-L2 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 16; i CDR-L3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 17.

[0022] U još jednom načinu ostvarivanja, antitelo obuhvata: VH koji obuhvata CDR-H1 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 8; CDR-H2 sa sekvencom koja je najmanje 85% identična sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 9; i CDR-H3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 13; i VL koji obuhvata CDR-L1 sa sekvencom koja je najmanje 85% identična sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 14; CDR-L2 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 16; i CDR-L3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 17.

[0023] U još jednom načinu ostvarivanja, antitelo obuhvata: VH koji obuhvata CDR-H1 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 8; CDR-H2 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 9; i CDR-H3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 13; i VL koji obuhvata CDR-L1 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 14; CDR-L2 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 16; i CDR-L3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 17.

[0024] U još jednom načinu ostvarivanja, antitelo obuhvata: VH sa sekvencom koja je najmanje 85% identična sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 20; i VL sa sekvencom koja je najmanje 85% identična sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 26. U daljem načinu ostvarivanja, antitelo obuhvata: VH sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 20; i VL sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 26.

[0025] U još jednom načinu ostvarivanja, antitelo predstavlja humanizovano antitelo ili himerno antitelo.

[0026] U još jednom načinu ostvarivanja, vezivanje antitela za tau protein fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1 je najmanje 30 puta, ili najmanje 100 puta jače od vezivanja za tau protein koji nije fosforilisan na pomenutom Ser413. U još jednom načinu ostvarivanja, antitelo se vezuje za tau protein fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1 sa afinitetom predstavljenim ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od najviše 1x10<-7>M ili najviše 1x10<-8>M. U još jednom načinu ostvarivanja, afinitet vezivanja antitela određuje se merenjem vezivanja primenom rezonancije površinskog plazmona.

[0027] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije tauopatije koji sadrži, kao aktivni sastojak, peptid koji obuhvata deo tau proteina, pri čemu pomenuti peptid obuhvata aminokiseline 410-421 iz SEQ ID NO: 1, gde je aminokiselinski ostatak koji odgovara Ser413 fosforilisan.

[0028] U jednom načinu ostvarivanja, tauopatija je Alchajmerova bolest, degeneracija kortikalnobazalnih ganglija, progresivna supranuklearna paraliza, Pikova bolest, demencija argirofilnog zrna (bolest argirofilnog zrna), Multiple sistemska tauopatija sa demencijom (MSTD), frontotemporalna demencija povezana sa hromozomom 17 sa Parkinsonizmom (FTDP-17), demencija neurofibrilarnih petlji, difuzne neurofibrilarne petlje sa kalcifikacijom (DNTC), tauopatija bele mase sa globularnim glialnim inkluzijama (WMT-GGI) ili frontotemporalna lobarna degeneracija sa tau-pozitivnim inkluzijama (FTLD-tau).

[0029] Ovde su opisane sledeće tačke:

(1) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje koji obuhvataju, kao aktivni sastojak, antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo sa tau proteinom koji je fosforilisan na najmanje jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara položajima 410 do 421 tau proteina predstavljenom sa SEQ ID NO: 1.

(2) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa (1), u kojem antitelo predstavlja antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo sa fosforilisanim tau proteinom karakterističnim za kognitivne poremećaje.

(3) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa (1) ili (2), u kojem antitelo učestvuje u reakciji antigen-antitelo sa tau proteinom koji je fosforilisan na jednom ili više mesta koja se biraju među Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416.

(4) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa bilo kojim od (1) do (3), u kojem antitelo predstavlja antitelo koje se, u vezivanju sa tau proteinom, vezuje u kompeticiji sa antitelom koje uključuje VH koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 20 i VL koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 26.

(5) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa bilo kojim od (1) do (3), u kojem antitelo predstavlja antitelo koje uključuje VH koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 20 i VL koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 26.

(6) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa bilo kojim od (1) do (4), u kojem antitelo predstavlja antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo sa tau proteinom koji je fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser413 mestu.

(7) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa bilo kojim od (1) do (6), u kojem antitelo predstavlja antitelo koje obuhvata CDR sekvencu na H lancu predstavljenu sa SEQ ID NO: 7 do 13, CDR sekvencu na H lancu predstavljenu najmanje jednom iz SEQ ID NO: 7 do 13 ili CDR sekvencu na H lancu sa najmanje 85% homologije sa najmanje jednom CDR sekvencom na H lancu predstavljenom sa SEQ ID NO: 7 do 13, i/ili CDR sekvencu na L lancu predstavljenu sa SEQ ID NO: 14 do 17, CDR sekvencu na L lancu predstavljenu najmanje jednom iz SEQ ID NO: 14 do 17 ili CDR sekvencu na L lancu sa najmanje 85% homologije sa najmanje jednom CDR sekvencom na L lancu predstavljenom sa SEQ ID NO: 14 do 17.

(8) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa bilo kojim od (1) do (7), u kojem antitelo predstavlja antitelo koje obuhvata varijabilni region H lanca predstavljen bilo kojom iz SEQ ID NO: 18 do 24 ili varijabilni region H lanca koji sadrži sekvencu sa najmanje 85% homologije sa bilo kojom iz SEQ ID NO: 18 do 24, i/ili varijabilni region L lanca predstavljen bilo kojom iz SEQ ID NO: 25 do 30 ili varijabilni region L lanca koji sadrži sekvencu sa najmanje 85% homologije sa bilo kojom iz SEQ ID NO: 25 do 30.

(9) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa bilo kojim od (1) do (8), pri čemu je to antitelo humanizovano antitelo ili himerno antitelo.

(10) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje koji sadrži, kao aktivni sastojak, peptid koji uključuje sekvencu od najmanje 8 neprekidnih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju aminokiselinskim brojevima 410-421 iz SEQ ID NO: 1, pri čemu je najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka u peptidu fosforilisan.

(11) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa (10), pri čemu najmanje jedan od fosforilisanih aminokiselinskih ostataka u peptidu odgovara aminokiselinskom ostatku Ser412, Ser413, Thr414 ili Ser416 iz SEQ ID NO: 1.

(12) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa (10) ili (11), pri čemu fosforilisani aminokiselinski ostaci u peptidu uključuju najmanje aminokiselinski ostatak koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1.

(13) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa bilo kojim od (1) do (12), pri čemu je kognitivni poremećaj tauopatija.

(14) Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa (13), pri čemu je tauopatija Alchajmerova bolest, degeneracija kortikalno-bazalnih ganglija, progresivna supranuklearna paraliza, Pikova bolest, demencija argirofilnog zrna (bolest argirofilnog zrna), Multiple sistemska tauopatija sa demencijom (MSTD), frontotemporalna demencija povezana sa hromozomom 17 sa Parkinsonizmom (FTDP-17), demencija neurofibrilarnih petlji, difuzne neurofibrilarne petlje sa kalcifikacijom (DNTC), tauopatija bele mase sa globularnim glialnim inkluzijama (WMT-GGI) ili frontotemporalna lobarna degeneracija sa tau-pozitivnim inkluzijama (FTLD-tau).

(15) Monoklonalno antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo sa peptidom koji obuhvata sekvencu od najmanje 8 neprekidnih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih brojeva 410-421 iz SEQ ID NO: 1, pri čemu je aminokiselinski ostatak koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1 u peptidu fosforilisan.

(16) antitelo za fosforilisan tau protein, pri čemu je to antitelo ono čije vezivanje za antigen je u kompeticiji protiv antitela koje uključuje VH koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 20 i VL koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 26. (17) antitelo za fosforilisan tau protein, pri čemu je to antitelo ono koje uključuje VH koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 20 i VL koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 26.

(18) Monoklonalno antitelo koje ima CDR sekvencu na H lancu predstavljenu sa SEQ ID NO: 7 do 13, CDR sekvencu na H lancu predstavljenu najmanje jednom iz SEQ ID NO: 7 do 13, ili H lanac koji

1

uključuje CDR sekvencu sa najmanje 85% homologije sa najmanje jednom CDR sekvencom na H lancu predstavljenom sa SEQ ID NO: 7 do 13, i/ili CDR sekvencu na L lancu predstavljenu sa SEQ ID NO: 14 do 17, CDR sekvencu na L lancu predstavljenu najmanje jednom iz SEQ ID NO: 14 do 17, ili L lanac koji uključuje CDR sekvencu sa najmanje 85% homologije sa najmanje jednom CDR sekvencom na L lancu predstavljenom sa SEQ ID NO: 14 do 17.

(19) Monoklonalno antitelo koje obuhvata varijabilni region H lanca predstavljen bilo kojom iz SEQ ID NO: 18 do 24 ili varijabilni region H lanca sa najmanje 85% homologije sa bilo kojom iz SEQ ID NO: 18 do 24, i/ili varijabilni region L lanca predstavljen bilo kojom iz SEQ ID NO: 25 do 30 ili varijabilni region L lanca sa najmanje 85% homologije sa bilo kojom iz SEQ ID NO: 25 do 30.

(20) Monoklonalno antitelo u skladu sa bilo kojim od (15) do (19), pri čemu je to antitelo humanizovano antitelo ili himerno antitelo.

(21) Peptid koji se sastoji od sekvence od najmanje 8 neprekidnih aminokiselina iz reda aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju aminokiselinskim brojevima 410-421 iz SEQ ID NO: 1, pri čemu je najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka u peptidu fosforilisan.

(22) Peptid u skladu sa (21), pri čemu najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju aminokiselinama Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1 je fosforilisan.

(23) Peptid u skladu sa (21) ili (22), pri čemu je taj fosforilisaminokiselinski ostatak aminokiselinski ostatak koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1.

Efekat ovog pronalaska

[0030] Ovaj pronalazak obezbeđuje terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje, koji sadrži kao aktivni sastojak, antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo specifično sa fosforilisanim tau na aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1 pri čemu je vezivanje definisano afinitetom predstavljenim pomoću KD od najviše 1 x 10<-6>M, i pri čemu je pomenuto vezivanje za fosforilisan tau protein najmanje 10 puta jače od vezivanja za tau protein koji nije fosforilisan na pomenutom Ser413; ili peptid koji uključuje aminokiseline 410-421 iz SEQ ID NO: 1, sa aminokiselinskim ostatkom Ser413 koji je fosforilisan. Ovde je takođe obezbeđeno monoklonalno antitelo koje ima visoki efekat poboljšavanja kognitivne funkcije, i postupak pripremanja antitela koje je još pogodnije za lečenje kognitivnog poremećaja, kao što je humanizovano antitelo, na osnovu analize strukture monoklonalnog antitela.

Kratak opis crteža

[0031]

Fig.1 je spisak početnih delova aminokiselinskih sekvenci izoformi humanog tau proteina, poravnati primenom ClustalW.

Fig.2 je spisak krajnjih delova aminokiselinskih sekvenci izoformi humanog tau proteina, poravnati primenom ClustalW.

Fig.3 je grafikon koji prikazuje specifičnost zečijeg poliklonalnog antitela za pSer413 peptid.

Fig.4 je grafikon koji prikazuje rezultate probnog testa u mišjem modelu u kojem je davano pSer413-prepoznavajuće zečje poliklonalno antitelo.

Fig.5 je grafikon koji prikazuje rezultate ispitnog testa u mišjem modelu u kojem je davano pSer413-prepoznavajuće zečje poliklonalno antitelo.

Fig.6 je linijski grafikon koji prikazuje rezultate testa otvorenog polja u mišjem modelu u kojem je davano pSer413-prepoznavajuće zečje poliklonalno antitelo.

Fig.7 je grafikon sa stubićima koji prikazuje rezultate testa otvorenog polja u mišjem modelu u kojem je davano pSer413-prepoznavajuće zečje poliklonalno antitelo.

Fig.8 je grafikon koji prikazuje rezultate probnog testa u mišjem modelu u kojem je davano pSer413-prepoznavajuće mišje monoklonalno antitelo (Ta1505).

Fig.9 je grafikon koji prikazuje rezultate ispitnog testa u mišjem modelu u kojem je davano pSer413-prepoznavajuće mišje monoklonalno antitelo (Ta1505).

Fig.10 je linijski grafikon koji prikazuje rezultate testa otvorenog polja u mišjem modelu u kojem je davano pSer413-prepoznavajuće mišje monoklonalno antitelo (Ta1505).

Fig.11 je grafikon sa stubićima koji prikazuje rezultate testa otvorenog polja u mišjem modelu u kojem je davano pSer413-prepoznavajuće mišje monoklonalno antitelo (Ta1505).

Fig.12 je grafikon koji prikazuje rezultate probnog testa u mišjem modelu u kojem je davano pSer396-prepoznavajuće mišje monoklonalno antitelo (Ta9).

Fig.13 je grafikon koji prikazuje rezultate ispitnog testa u mišjem modelu u kojem je davano pSer396-prepoznavajuće mišje monoklonalno antitelo (Ta9).

Fig.14 je linijski grafikon koji prikazuje rezultate testa otvorenog polja u mišjem modelu u kojem je davano pSer396-prepoznavajuće mišje monoklonalno antitelo (Ta9).

Fig.15 je grafikon sa stubićima koji prikazuje rezultate testa otvorenog polja u mišjem modelu u kojem je davano pSer396-prepoznavajuće mišje monoklonalno antitelo (Ta9).

Fig.16 je grafikon sa stubićima koji prikazuje nivoe sinaptofisina u hipokampusu u mišjem modelu u kojem je davano Ta1505 antitelo.

Fig.17 je dijagram koji predstavlja fragment gena koji sadrži tau gen.

Fig.18 je grafikon koji prikazuje rezultate probnog testa vodenog lavirinta kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato Ta1505 antitelo.

Fig.19 je grafikon koji prikazuje rezultate ispitnog testa vodenog lavirinta kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato Ta1505 antitelo.

Fig.20 je grafikon koji prikazuje rezultate probnog testa vodenog lavirinta kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato Ta9 antitelo.

Fig.21 je grafikon koji prikazuje rezultate ispitnog testa vodenog lavirinta kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato Ta9 antitelo.

Fig.22 je fotografija koja prikazuje imunohistološko bojenje CA3 regiona i CA23 regiona hipokampusa Ta1505 antitelom kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato kontrolno IgG (1mg/glava) ili Ta1505 antitelo (1mg/glava).

Fig.23 je fotografija koja prikazuje imunohistološko bojenje regiona parahipokampalnog girusa sa Ta1505 kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato kontrolno IgG (1mg/glava).

Fig.24 je fotografija koja prikazuje imunohistološko bojenje regiona parahipokampalnog girusa Ta1505 antitelom kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato Ta1505 antitelo (1mg/glava).

Fig.25 je fotografija koja prikazuje imunohistološko bojenje CA3 regiona i CA23 regiona hipokampusa sa AT8 kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato kontrolno IgG (1mg/glava) ili Ta1505 antitelo (1mg/glava).

Fig.26 je fotografija koja prikazuje imunohistološko bojenje regiona parahipokampalnog girusa sa AT8 kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato kontrolno IgG (1mg/glava).

Fig.27 je fotografija koja prikazuje imunohistološko bojenje regiona parahipokampalnog girusa sa AT8 kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato Ta1505 (1mg/glava).

Fig.28 je grafikon koji prikazuje količinu G2, AT8, PHF1, i Ta1505 reaktivnog tau u TBS rastvorivoj frakciji mozga kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato Ta1505 (1mg/glava). Fig.29 je grafikon koji prikazuje količinu G2, AT8, PHF1, i Ta1505 reaktivnog tau u sarkozil rastvorivoj frakciji mozga kod miševa sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg) kojima je dato Ta1505 (1mg/glava).

Najbolji način za izvođenje ovog pronalaska

[0032] Pronalazači ovog predmeta pripremili su antitela koja učestvuju u reakciji antigen-antitelo specifično sa tau koji je fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1, koji je fosforilisan na specifičnom mestu kod AD, dali ih Tg miševima koji ispoljavaju sa sazrevanjmpovezano pogoršanje kognitivne funkcije, i otkrili da se kognitivna funkcija može povratiti na približno isti nivo kao kontrolna grupa. Sa druge strane, adekvatno poboljšavanje kognitivne funkcije nije primećeno kod primene, poređenja radi, uporedive koncentracije antitela za tau koji je fosforilisan na

1

aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser396 iz SEQ ID NO: 1, koji ima viši afinitet za ekvivalentni antigen u odnosu na antitelo ovog pronalaska. Deo u blizini aminokiselinskog ostatka koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1 je region za koji nije poznata ni jedna određena informacija u pogledu odnosa između tau strukture i funkcije, i neočekivano je rezultovalo u tome da je pronađeno da antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo specifično sa ovim delom ima tako snažan poboljšavajući efekat na kognitivnu funkciju. Na taj način, mesto u blizini aminokiselinskog ostatka koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1, koji do sada nije bio fokus interesa, ovim pronalaskom je prvo razjašnjeno kao značajno mesto za početak pogoršanja kognitivne funkcije u tauopatijama, a ovaj pronalazak je samim tim upotpunjen.

[Anti-fosforilisano tau antitelo]

[0033] Tau (protein), u svrhe ovog pronalaska, uključuje ne samo humani tau protein kakav je predstavljen pomoću SEQ ID NO: 1-6, već i njegove genetske mutacije. Kako je prethodno objašnjeno u Stanju tehnike, više od 40 mutacija poznato je kod FTDP-17, nasledna neurodegenerativna bolest povezana sa kognitivnim poremećajem, ali mesta mutacije nisu nužno ograničena na njih. Pored toga, proteini sa mutacijama na aminokiselinama na 1 do 50 mesta, poželjno 1 do 30 mesta i poželjnije 1 do 10 mesta, kao broj mutacija u SEQ ID NO: 1-6, takođe su tretirani kao tau u svrhe ovog pronalaska. Pored toga, proteini koji ispoljavaju najmanje 80% homologije (Identiteta) sa humanim tau proteinom naveden kao SEQ ID NO: 1 u skladu sa BLAST postupkom (podrazumevani uslovi za NCBI PBLAST), i njihove izoforme, takođe su uključeni. Takvi proteini takođe uključuju tau vrsta koje se razlikuju od ljudi, kao što su šimpanze, makaki majmuni, konji, svinje, psi, miševi, zečevi i pacovi, i mogu se upotrebiti za pripremu terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa koji ciljaju te tau proteine, u cilju poboljšavanja kognitivne funkcije kod ovih životinja.

[0034] Aminokiselinski brojevi u skladu sa ovim pronalaskom, tj. položaji aminokiselinskih ostataka, označeni su na osnovu sekvence navedene kao SEQ ID NO: 1, praktičnosti radi. Tako, na primer, ako se aminokiselinski ostatak koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1 pominje, to se odnosi na serin koji je 413-i aminokiselinski ostatak iz SEQ ID NO: 1 (4R2N), 384-i iz SEQ ID NO: 2 (4R1N), 355-i iz SEQ ID NO: 3 (4R0N), 382-i iz SEQ ID NO: 4 (3R2N), 353-i iz SEQ ID NO: 5 (3R1N) ili 324-i iz SEQ ID NO: 6 (3R0N). Tabela 1 prikazuje položaje aminokiselinskih ostataka koji su u istom zajedničkim položajima, za svaku izoformu. U Tabeli 1, prikazani su položaji aminokiselinskih ostataka za svaku izoformu koji odgovaraju 410-421 iz SEQ ID NO: 1, i uzajamni položajni odnosi aminokiselinskih ostataka na drugim položajima lako će se shvatiti na osnovu Fig.1 i Fig.2, na primer.

[Tabela 1]

[0035] Pojam "anti-fosforilisano tau antitelo" odnosi se na antitelo koje učestvuje u reakciji antigenantitelo sa tau koji je fosforilisan na aminokiselinskom ostatku na jednom ili više mesta aminokiselinske sekvence prethodno pomenutog tau. Fosforilisani aminokiselinski ostaci mogu biti serin (Ser), treonin (Thr), tirozin (Tyr), ili slično. Takođe, mesto na fosforilisanom tau u kojem anti-fosforilisano tau antitelo ovog pronalaska učestvuje u reakciji antigen-antitelo je mesto koje je specifično fosforilisano kod neurodegenerativnih bolesti kao što su AD. Pored toga, mesto fosforilisanog tau u kojem antifosforilisano tau antitelo učestvuje u reakciji antigen-antitelo može biti odabrano iz reda aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1. U određenim slučajevima, antitelo može da učestvuje u reakciji antigen-antitelo sa tau koji je fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser412 ili Ser413 iz SEQ ID NO: 1, ili na oba mesta. Antitelo ovog pronalaska učestvuje u reakciji antigen-antitelo sa tau koji je fosforilisan na mestu aminokiselinskog ostatka koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1. Ovde, aminokiselinski ostatak koji

1

odgovara Ser412, Ser413, Thr414 ili Ser416 iz SEQ ID NO: 1 odnosi se na mesto koji odgovara aminokiselinskom broju kod humanog 4R2N tau (SEQ ID NO: 1), i kako je objašnjeno u Stanju tehnike, odgovarajuće mesto u izoformama, ili odgovarajuće mesto u ne-humanim homolozima, tretira se na isti način bez obzira od aminokiselinskog broja dodeljenog iz te aminokiselinske sekvence. Odgovarajuća mesta u izoformama ili homolozima može da odredi stručnjak putem odgovarajućih analiza postupkom Parnog poravnavanja sekvenci kao što su Needleman-Wunsch postupak ili Smith-Waterman postupak, ili Višestrukim poravnavanjem sekvenci kao što su ClustalW postupak ili PRRP postupak. Primer postupka analize odgovarajućeg mesta prikazan je na Fig.1 i Fig.2, sa aminokiselinskim sekvencama (prikazane pojedinačnim slovima) 6 različitih izoformi kod ljudi poravnatih primenom ClustalW. Kako se ovde može zapaziti, struktura u blizini aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1 sačuvana je u 6 izoformi, i lako se može raspoznati koje su odgovarajuće aminokiseline.

[0036] Anti-fosforilisano tau antitelo koje se može upotrebiti u terapeutskom agensu ili profilaktičkom agensu kakvi su ovde obezbeđeni, predstavlja antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo specifično sa tau proteinom koji je fosforilisan na najmanje jednom aminokiselinskom ostatku prisutnom od položaja 410 do položaja 421 tau proteina iz SEQ ID NO: 1, poželjno ono je antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo specifično sa tau proteinom koji je fosforilisan na jednom ili više mesta koja se biraju među aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1, poželjnije ono je antitelo koje se vezuje kompetitivno protiv antitela čija VH aminokiselinska sekvenca predstavlja SEQ ID NO: 20 i čija VL aminokiselinska sekvenca predstavlja SEQ ID NO: 26 (u nastavku označeno kao "1505 antitelo"). Antitelo ovog pronalaska učestvuje u reakciji antigen-antitelo specifično sa tau proteinom koji je fosforilisan na Ser413 mestu. Tau protein koji je fosforilisan na najmanje jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara položajima 410 do 421 iz SEQ ID NO: 1, tau protein koji je fosforilisan na jednom ili više mesta koja se biraju među aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1, ili tau protein koji je fosforilisan na mestu aminokiselinskog ostatka koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1, je tau protein koji je fosforilisan na odgovarajućem mestu koje uključuje izotipove humanih ili drugih vrsta, kako je prethodno navedeno, ali poželjnije je to humani tau protein, a još poželjnije on je bilo koja od 6 izoforma kod ljudi.

[0037] Kada se govori o Tau proteinu koji je fosforilisan na najmanje jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara položajima 410 do 421 iz SEQ ID NO: 1, tau proteinu koji je fosforilisan na jednom ili više mesta koja se biraju među aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1, ili tau proteinu koji je fosforilisan na mestu aminokiselinskog ostatka koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1, ovi fosforilisan tau proteini uključuju peptide koji imaju potpunu homologiju sa delovima aminokiselinskih sekvenci aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju položajima 410 do 421 tau proteina, ili homologiju sa najmanje 80% sekvenci, i fosforilisani su na ovim aminokiselinskim

1

ostacima, a antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo specifično sa takvim peptidom, takođe je anti-fosforilisano tau antitelo.

[0038] Kako je ovde opisano "učestvuje u reakciji antigen-antitelo" označava vezivanje sa tau proteinom koji je fosforilisan na najmanje jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara položajima 410 do 421 iz SEQ ID NO: 1, tau protein koji je fosforilisan na jednom ili više mesta koja se biraju među aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1. U skladu sa ovim pronalaskom, "učestvuje u reakciji antigen-antitelo" označava vezivanje sa tau proteinom koji je fosforilisan na mestu aminokiselinskog ostatka koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1, sa afinitetom predstavljenim ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od najviše 1 × 10<-6>M, poželjno vezivanje sa afinitetom predstavljenim ravnotežnom konstantom disocijacije od najviše 1 × 10<-7>M, i još poželjnije vezivanjem sa afinitetom predstavljenim ravnotežnom konstantom disocijacije od najviše 1 × 10<-8>M.

[0039] Pojam "specifično" označava da je vezivanje sa tau proteinom koji je fosforilisan na najmanje jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara položajima 410 do 421 iz SEQ ID NO: 1, tau proteinom koji je fosforilisan na jednom ili više mesta koja se biraju među aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1, i/ili tau proteinom koji je fosforilisan na mestu aminokiselinskog ostatka koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1, je u stanju koje je najmanje 10 puta jače, poželjnije najmanje 30 puta jače i još poželjnije najmanje 100 puta jače, od vezivanja sa tau proteinom koji nije fosforilisan na tom mestu (koje uključuje peptide sa potpunom homologijom sa delo, aminokiselinske sekvence tau proteina, ili sa homologijom sa najmanje 80% sekvence).

[0040] Pored toga, "kompetitivno se vezuje" sa antitelom čija VH aminokiselinska sekvenca predstavlja SEQ ID NO: 20 i čija VL aminokiselinska sekvenca predstavlja SEQ ID NO: 26 (1505 antitelo) označava fenomen u kojem, kada je drugo antitelo prisutbo zajedno sa monoklonalnim antitelom tokom vezivanja za antigen, vezivanje monoklonalnog antitela je inhibirano, i opšre govoreći, to se može izmeriti merenjem količine dodavanja (koncentracija) na kojoj je količina vezivanja monoklonalnog antitela za antigen redukovana kada se različito antitelo dodaje u različitoj količini (koncentracija) u odnosu na fiksnu količinu (koncentracija) monoklonalnog antitela, pri čemu je stepen inhibicije izražen kao vrednost IC50ili Ki. Antitelo koje se vezuje kompetitivno sa antitelom čija VH aminokiselinska sekvenca predstavlja SEQ ID NO: 20 i čija VL sekvenca is SEQ ID NO: 26 (1505 antitelo) je ona koja ima

IC50vrednost nižu od 1 µM, poželjnije nižu od 100 nM i još poželjnije nižu od 10 nM, kada je vezivanje antigen-antitelo detektovano primenom 10 nM monoklonalnog antitela.

[0041] Vezivanje antitelo-antigen takvog antitela sa fosforilisanim tau proteinom može se odrediti pogodnim merenjem vezivanja od strane stručnjaka iz ove oblasti primenom sistema čvrste faze ili tečne faze, postupkom kao što je ELISA, EIA, rezonancija površinskog plazmona, FRET, LRET ili slično, iako ne postoji ograničenje u vezi sa tim. Prilikom merenja takvog vezivanja antigen-antitelo, antitelo i/ili antigen (fosforilisan tau protein ili tau protein) obeležen je enzimom, fluorescentnom supstancom,

1

luminescentnom supstancom, radioaktivnim izotopom ili slično, postupak merenja pogodan za fizičke i/ili hemijske osobine obeležene supstance koristi se za zapažanje antigen-antitelo reakcije.

[0042] Anti-fosforilisano tau antitelo ovog pronalaska takođe uključuje antitelo u kojem varijabilni region H lanca sadrži aminokiselinske sekvence CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3, koje se sastoje od kombinacija iz SEQ ID NO: 7 ili 8 kao CDR-H1 aminokiselinska sekvenca, bilo koje odabrane iz reda SEQ ID NO: 9, 10, 11 i 12 kao CDRH-H2 aminokiselinska sekvenca i SEQ ID NO: 13 kao CDRH-H3 aminokiselinska sekvenca, a varijabilni region L lanca sadrži aminokiselinske sekvence CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3, koje se sastoje od kombinacija iz SEQ ID NO: 14 ili 15 kao CDR-L1 aminokiselinska sekvenca, SEQ ID NO: 16 kao CDR-L2 aminokiselinska sekvenca i SEQ ID NO: 17 kao CDR-L3 aminokiselinska sekvenca. Poželjno, ono je antitelo u kojem je skup CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 u varijabilnom regionu H lanca bilo koje odabrane iz reda kombinacija: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13; i SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 13, skup CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 u varijabilnom regionu L lanca je SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 17; ili SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 17, i poželjnije ono je antitelo u kojem kombinacija skupa CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 u varijabilnom regionu H lanca i skupa CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 u varijabilnom regionu L lanca je odabrana iz reda kombinacija: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 17; i SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 17. Antitelo ovog pronalaska takođe uključuje ono u kojem najmanje jedna od odgovarajućih CDR sekvenci među aminokiselinskim sekvencama CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 je sekvenca koji ispoljava najmanje 85% homologije (identiteta), a poželjno najmanje 90% homologije, sa bilo kojom iz SEQ ID NO: 7 do 17, u skladu sa BLAST postupkom (podrazumevani uslovi za NCBI PBLAST).

[0043] Postupak za identifikovanje sekvence iz CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 ili CDR-L3 u antitelu može biti, na primer, postupak prema Kabat-u ili postupak prema Chothia-i, a stručnjak iz ove oblasti može identifikovati sekvencu dela koji odgovara svakom CDR, pri čemu su postupci prema Kabatu (Kabat, E.A. i Wu, T.T., J. Immunol., 147, 1709-1719, 1991) i Chothia-i (Al-Lazikani, B., Lesk, A.M. i Chothia, C., J. Mol. Biol., 273,927-948, 1997) uobičajeno tehnično znanje za stručnjake u ovoj oblasti, i njihovi kratki pregledi mogu se naći na web sajtu Dr. Andrew C.R. Martin's Group (http://www.bioinf.org.uk/abs/), na primer.

[0044] Različit oblik antitela ovog pronalaska može biti antitelo u kojem aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona H lanca (VH) predstavlja neku izabranu među SEQ ID NO: 18 do 24, a aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona L lanca (VL) predstavlja neku izabranu među SEQ ID NO:

1

25 do 30, a poželjno antitelo u kojem je kombinacija aminokiselinskih sekvenci VH i VL neka izabrana među kombinacijama: SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 19 i SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 20 i SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 21 i SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 29, i SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 30. Antitelo ovog pronalaska uključuje ono u kojem najmanje jedna od VH i VL aminokiselinskih sekvenci je bilo koja VH aminokiselinska sekvenca navedena kao SEQ ID NO: 18 do 24 ili bilo koja VL aminokiselinska sekvenca navedena kao SEQ ID NO: 25 do 30, i sekvence koje ispoljavaju najmanje 85% homologije (identiteta), a poželjno najmanje 90% homologije sa SEQ ID NO: 18 do 30 na osnovu BLAST postupka (podrazumevani uslovi za NCBI PBLAST).

[0045] Aminokiselinske sekvence konstantnih regiona kod takvih antitela biraju se iz reda sisarskih podtipova IgG, IgA, IgM, IgE i IgD, ili njihovih varijanti.

[0046] Stručnjak iz ove oblasti može da dizajnira rekombinanta antitela pogodna za davanje u cilju lečenja vrste od interesa, kao što su humanizovana antitela, na osnovu informacije za aminokiselinske sekvence za CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i/ili nukleotidne sekvence gena koji se za njih kodiraju, ili aminokiselinske sekvence za CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 i/ili nukleotidne sekvence gena koji se za njih kodiraju, a stručnjak iz ove oblasti takođe može da dizajnira himerno antitela u skladu sa svrhom, na osnovu informacije za aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona H lanca i/ili nukleotidnu sekvencu gena koji se kodira za nju, ili aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona L lanca i/ili nukleotidnu sekvencu gena koji se kodira za nju. Pored toga, stručnjak iz ove oblasti može pogodno da primeni poznatu tehnologiju da bi pripremio nisko-molekularna antitela ili skafold antitela, na osnovu informacije za aminokiselinske sekvence za CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i/ili nukleotidne sekvence gena koji se za njih kodiraju, ili aminokiselinske sekvence za CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 i/ili nukleotidne sekvence gena koji se za njih kodiraju, ili na osnovu informacije za aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona H lanca i/ili nukleotidnu sekvencu gena koji se kodira za nju, ili aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona L lanca i/ili nukleotidnu sekvencu gena koji se kodira za nju.

[0047] Antitelo ovog pronalaska može biti antitelo sastavljeno od dva H lanca i dva L lanca, ili može biti antitelo sastavljeno samo od dva H lanca. Takođe, antitelo ovog pronalaska može biti fragment antitela, pri čemu primeri fragmenata antitela uključuju F(ab')2, Fab i Fv strukture.

[0048] Antitelo ovog pronalaska može se dobiti primenom tehnika poznatih stručnjacima iz ove oblasti. Antitelo ovog pronalaska je monoklonalno antitelo. Dalje opsiana antitela mogu biti monoklonalna ili poliklonalna antitela (Milstein et al., Nature (England), October 6, 1983, Vol.305, No.55934, p.537-540). Na primer, poliklonalno antitelo može se dobiti primenom kao antigena, tau proteina koji je fosforilisan na najmanje jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara položajima 410 do 421 iz SEQ ID NO: 1, tau proteina koji je fosforilisan na jednom ili više mesta koja se biraju među Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1, tau proteina koji je fosforilisan na Ser413 mestu iz SEQ ID NO: 1, ili peptida sa potpunom homologijom sa najmanje delom aminokiselinske sekvence sa položaja 410 do 421 tau

1

proteina iz SEQ ID NO: 1, ili homologiju sa najmanje 80% sekvence, i koji je fosforilisan na ovim aminokiselinskim ostacima, i senzibilisanja sisara, i izdvajanja antitela iz seruma te životinje. Kada se peptid primenjuje kao antigen, antigen se može primeniti u obliku konjugovanom sa nosećim proteinom kao što je BSA ili KLH, ili polilizinom. Specifični primeri peptida koji se koriste kao antigeni uključuju peptide iz SEQ ID NO: 31 ili 32 koji su fosforilisani na mestu koje odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1, kako je opisano u Primerima 1 i 2, ali ne postoji ograničenje u vezi sa tim. Za monoklonalno antitelo u skladu sa ovim pronalaskom, hibridom utvrđen primenom imunocita izolovanih iz sisara senzitivisanog antigenom i njihovim fuzionisanjem sa ćelijama mijeloma ili slično, može biti kloniran, a antitelo izdvojeno iz kulture. Postupak za dobijanje takvih monoklonalnih antitela opisan je u Primeru 2, i tpri čemu monoklonalna antitela dobijena na taj način mogu biti monoklonalna antitela koja sadrže VH aminokiselinske sekvence za SEQ ID NO: 18 do 24 i VL sekvence iz SEQ ID NO: 25 do 30 (Ta1501, 1502, 1505-1509), ali bez njihovog ograničenja.

[0049] Za dobijeno monoklonalno antitelo, moguće je dobiti molekul nukleinske kiseline sa genskom sekvencom koja se kodira za aminokiseline proteina antitela, i moguće je pripremiti antitelo tehnikom genetskog inženjeringa primenom takvog molekula nukleinske kiseline. Uvođenje modifikacija radi povećanja mogućnost vezivanja ili specifičnost antitela, primena genetskih informacija antitela, kao što su informacija za H lanac, L lanac ili njihove variajbilne regione ili CDR sekvence, i pripremanje antitela sa strukturom pogodnom za upotrebu u lečenju modifikovanjem antitela nek životinje kao što je mišje u antitelo humanog tipa, predstavljaju tehnike koje su dobro poznate stručnjacima iz ove oblasti. Pored toga, primenom ne-humanih transgenih životinja u koje se transferuje gen humanog antitela, kao životinje za senzitivisanje antigenom, moguće je obezbediti humanog tipa monoklonalna antitela. Pored toga, tehnika u kojoj biblioteka faga eksprimira antigen-vezujući region humanog antitela ili njegovog dela (prika fage humanog antitela) koristi se da bi se dobilo antitelo koje se specifično vezuje sa odgovarajućim antigenom, ili klon faga koji obuhvata specifičnu aminokiselinsku sekvencu, humana antitela pripremaju se iz tih informacija, mogu se pogodno izvesti out od strane stručnjaka iz ove oblasti, kao postupak koji ne zahteva senzitivisanje životinja.(See Taketo Tanaka et al., Keio J. Med., Vol.60, p.37-46, na primer).

[0050] Šta više, kao prethodno pomenuti postupak proizvodnje monoklonalnih antitela, hibridom koji proizvodi traženo antitelo, može biti uzgajan, a antitelo prečišćeno i dobijen uobičajenim postupcima iz dobijnog supernatanta kulture. Kao različiti postupak proizvodnje, gen koji kodira antitelo, a specifičnije gene koji kodira imunoglobulinski težak lanac i/ili laki lanac, može biti dobijen iz hibridoma koji proizvodi antitelo od interesa, ili iz klona faga ili se slično dobija prikazom faga humanog antitela, i vektorom za eksprimiranje gena pripremljenog i transferovanog u ćelije domaćina (sisarske ćelije, ćelije insekata, mikrobi ili slično) radi proizvodnje antitelo. Tokom ove procedure, stručnjak iz ove oblasti može izvesti javno poznatu tehniku za gensku modifikaciju gena koji kodira imunoglobulinski teški lanac i/ili laki

2

lanac, radi uvođenja poželjnih osobina, ili se može pripremiti humanog tipa antitelo, himera protein antitela, nisko-molekularno antitelo ili skafold antitelo, primenom strukturalne informacije za varijabilni region ili CDR imunoglobulinskog teškog lanca i/ili lakog lanca. Pored toga, kako bi se poboljšala performansa antitela ili zaobišli sporedni efekti, može se primeniti tehnika dobro poznata stručnjacima iz ove oblasti za uvođenje modifikacija u strukturu konstantnog regiona antitela, ili modifikovanje svojih šećernih delova lanca.

[Fosforilisan peptid sa tau-izvedenom aminokiselinskom sekvencom]

[0051] Ovaj pronalazak obezbeđuje peptide koji sadrže delove aminokiselinskih sekvenci za tau između aminokiseline 410 i 421 i koji su fosforilisani na aminokiselinskom ostatku Ser413. "Fosforilisani" aminokiselinski ostatak je onaj koji je vezan estarskom vezom za fosfatnu grupu na bočnom lancu aminokiselinskog ostatka, pri čemu su tipični fosforilisani aminokiselinski ostaci serin, treonin i tirozin. Fosforilisani peptidi mogu biti peptidi sa dužinom od najmanje 8 aminokiselina koje sadrže najmanje 3 neprekidne aminokiseline među aminokiselinskim sekvencama koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju aminokiselinskim brojevima 410-421 iz SEQ ID NO: 1, poželjno peptid dužine od najmanje 8 aminokiselina koje sadrže najmanje 5 neprekidnih aminokiselina, i poželjnije peptid dužine od najmanje 8 aminokiselina koje sadrže najmanje 8 neprekidnih aminokiselina. Fosforilisani aminokiselinski ostaci u fosforilisanim peptidima mogu biti bilo koji od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju aminokiselinskim brojevima 410-421 iz SEQ ID NO: 1, poželjno bilo koji od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju aminokiselinama Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1.

Fosforilisaminokiselinski ostatak u fosforilisanim peptidima ovog pronalaska je aminokiselinski ostatak koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1. Tipičan primer takvog fosforilisanog peptida je fosforilisan peptid koji se koristi za pripremanje antitela u Primeru 1 (SEQ ID NO: 31), ali bez njegovog ograničavanja.

[0052] Fosforilisan peptid sa tau-izvedenom aminokiselinskom sekvencom u skladu sa ovim pronalaskom može se primeniti u terapeutskom agensu ili profilaktičkom agensu za kognitivne poremećaje, koji obuhvata antigen za pripremanje anti-fosforilisanog tau antitela u skladu sa ovim pronalaskom, ili samog peptida. Fosforilisan peptid takođe može biti modifikovan supstancama koje pružaju druge funkcije, u skladu sa svrhom, na N-terminus i/ili C terminus sekvencama. Na primer, on može da ima metioninski ostatak, acetil ili piroglutaminsku kiselinu dodatu N-terminusu fosforilisanog peptida, ili može biti modifikovan fluorescentnom supstancom ili slično. Supstance koje se primenjuju za modifikovanje N-terminusa i/ili C-terminusa fosforilisanog peptida takođe mogu biti peptidi ili proteini, čiji primeri uključuju peptide sa aminokiselinskim sekvencama za pogodno tagovanje sekvence (obično histidinski tag ili FLAG tag), sekvencu za prepoznavanje T-ćelijskih receptora (TCR) ili glavni histokompatibilni antigeni (MHC), i virusni ili bakterijski proteini, ili peptidi sa sekvencama izvedenim iz njih, dodati N-terminusu ili C-terminusu. Fosforilisan peptid ovog pronalaska takođe uključuje one modifikovane jedinjenjima ili peptidima na jednom ili više aminokiselinskih ostataka koji se razlikuju od onih na N-terminusu ili C-terminusu. Takva modifikacija fosforilisanog peptida može se izvesti primenom postupaka poznatih stručnjacima iz ove oblasti, kao što su postupak opisan od strane Hermanson et al. (Biokonjugat tehnika, USA, 1996, Academic Press).

[0053] Fosforilisan peptid ovog pronalaska može se proizvesti od strane stručnjaka iz ove oblasti primenom odgovarajućih postupaka sinteze ili genetskog inženjeringa. Primeri postupaka za proizvodnju fosforilisanih peptida sintezom uključuju Boc postupke (Wakamiya T. et al., Chemistry Letters, Vol.22 P.1401, 1993), Fmoc postupke (PERICH, J. W., International Journal of Peptide and Protein Research, vol.40, P.134-140, 1992), i postupak opisan u japanskom patentnu br.3587390, iako se drugi pogodni postupci mogu implementirati od strane stručnjaka iz ove oblasti. Takođe, postupci proizvodnje genetskim inženjeringom mogu da uključe pripremanje genetskog materijala (DNK, RNK) sa nukleotidnom sekvencom koja kodira peptid koji se proizvodi ili njegov prekursor, i uvodi u odgovarajući ekspresioni vektor sa dodavanjem promoter sekvence i slično, radi uvođenja u pogodnog domaćina radi esksprimiranja, ili proizvodnja primenom sistema za proizvodnju proteina bez ćelija. U ovom slučaju, fosforilisan peptid koji je fosforilisan na mestu od interesa može se proizvesti pogodnom reakcijom fosforilacije u domaćinu kinazom koja je u domaćinu ili idnukovana genetski konstruisanom ekspresijom, ili peptid od interesa može biti sakupljen prvo, a zatim reagovan sa kinazom ili slično in vitro radi reakcije fosforilacije. Za takvu in vitro reakciju fosforilacije, upotrebljeni enzim može biti onaj čija je funkcija u tau reakciji fosforilacije za peptide od interesa poznata, kao što su GSK3 ili CDK5. Kako bi se dobili peptidi sa aminokiselinskim ostacima od interesa koji su fosforilisani, među fosforilisanim peptidima koji su fosforilisani na ovaj način u domaćinu ili in vitro, mogu se primeniti postupci za izdvajanje fosforilisanih peptida koji su specifično vezani za antitelo u reakciji antitelo-antigen primenom anti-fosforilisanih tau antitela koja su prethodno pomenuta.

[Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje koji obuhvataju anti-fosforilisano tau antitelo ili fosforilisan tau peptid]

[0054] Pojam "kognitivni poremećaji" za ljude označava stanje pogoršanja funkcije intelekta koji je razvijen ili stečen, i smatra se vrstom poremećaja intelekta (Kamijima, K., Niwa, S., Nankodo's Essential Well - Advanced Series, New Seishin Igaku, p.69-70, 2008), a u širem smislu smatraju se bolestima koje ispoljavaju poremećaj intelekta i/ili pogoršanje pamćenja. Kod neurodegenerativnih bolesti kao što su AD, "neurodegeneracija" može biti utvrđena potvrđivanjem prisustva neurofibrilarne petlje (NFT) histološkom analizom posle smrti, ali lekari mogu sprovesti dijagnozu neurodegenerativne bolesti pomoću Hasegawa skalom za merenje demencije - revidirana (HDS-R) ili Mini-pregledom mentalnog stanja (MMSE), na osnovu ispitivanja kao dela neuropsihološkog pregleda, Ocenjivanjem kliničke demencije (CDR) ili Određivanjem funkcionalnih faza (FAST) na osnovu posmatranja, povećanom zastupljenošću tau ili fosforilisanog tau ili povećanom zastupljenošću Aβ u cerebrospinalnoj tečnosti, kao biohmeijski pregled, ili na osnovu informacije dobijene iz kranijalnog CT, kranijalnog MRI, SPECT ili PET, kao ispitivanje snimanjem, kako bi se dijagnostikovao kognitivni poremećaj i specifična neurodegenerativna bolest. Tako, terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje ovog pronalaska je onaj koji se daje pacijentu kome je lekar dijagnostikovao kognitivni poremećaj, a son ima poboljšavajući efekat u poređenju sa prethodnim tretiranjem, za najmanje jednu stavku dijagnoze neurodegenerativne bolesti, ili efekat inhibiranja napredovanja simptoma ili održavanja ili oporavka stanja pre tretiranja.

[0055] Pacijenti kojima se daje terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje ovog pronalaska su pacijenti sa kognitivnim poremećajima, a naročito pacijenti sa tauopatijama, koji uključuju pacijente obolele od bolesti kao što su Alchajmerova bolest (AD), degeneracija kortikalno-bazalnih ganglija (CBD ili CBS), progresivna supranuklearna paraliza, Pikova bolest, demencija argirofilnog zrna (bolest argirofilnog zrna), Multiple sistemska tauopatija sa demencijom (MSTD), frontotemporalna demencija povezana sa hromozomom 17 sa Parkinsonizmom (FTDP-17), demencija neurofibrilarnih petlji, difuzne neurofibrilarne petlje sa kalcifikacijom (DNTC), tauopatija bele mase sa globularnim glialnim inkluzijama (WMT-GGI), frontotemporalna lobarna degeneracija sa tau-pozitivnim inkluzijama (FTLD-tau), Economo-va postencefalitična Parkinsonova bolest, subakutni sklerozni panencefalitis ili bokserska encefalopatija. Prema tome, terapeutski agens za kognitivne poremećaje ovog pronalaska je terapeutski agens ili profilaktički agens za tauopatije, a sa drugačijeg stanovišta, može se smatrati da je terapeutski agens ili profilaktički agens za bolesti kao što je Alchajmerova bolest (AD), degeneracija kortikalno-bazalnih ganglija (CBD ili CBS), progresivna supranuklearna paraliza, Pikova bolest, demencija argirofilnog zrna (bolest argirofilnog zrna), Multiple sistemska tauopatija sa demencijom (MSTD), frontotemporalna demencija povezana sa hromozomom 17 sa Parkinsonizmom (FTDP-17), demencija neurofibrilarnih petlji, difuzne neurofibrilarne petlje sa kalcifikacijom (DNTC), tauopatija bele mase sa globularnim glialnim inkluzijama (WMT-GGI), frontotemporalna lobarna degeneracija sa tau-pozitivnim inkluzijama (FTLD-tau), Economo-va postencefalitična Parkinsonova bolest, subakutni sklerozni panencefalitis ili bokserska encefalopatija.

[0056] Takođe se može smatrati da terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje ovog pronalaska imaju efekat poboljšavanja kognitivnih funkcija ili inhibiranja gubitka ili održavanje kognitivne funkcije kod ne-humanih životinja. Takve ne-humane životinje uključuju životinje kao što su šimpanze, makaki majmuni, konji, svinje, psi, miševi, zečevi, pacovi, mačke i slično kod kojih je ispoljen tau sa visokom homologijom za humani tau, bez ograničavanja istog.

[Životinjski modeli za kognitivni poremećaj]

2

[0057] Životinje za ispitivanje terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa za kognitivne poremećaje ovog pronalaska uključuju životinjske modele za kognitivne poremećaje, među kojima životinjski modeli za tauopatije mogu biti posebno napomenuti. Životinjski modeli za tauopatije su životinje koje eksprimiraju normalan-tip ili genski mutant tau u mozgu, a određenije životinjski modeli koji ispoljavaju pogoršanje u kognitivnoj funkciji. Takve životinje koje eksprimiraju normalan-tip ili genski mutant tau u mozgu mogu se proizvesti genetskim inženjeringom, pri čemu su tipičan primer transgeni miševi (Tg miševi). Životinjski modeli kao što su Tg miševi koji eksprimiraju genski mutant tau korisni su kao modeli genetskih naslednih tauopatija, ali za ispitivanje efekta terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa za sporadične tauopatije koje čine većinu slučajeva među ljudima, poželjno efekat je eksprimiran u Tg miševima koji eksprimiraju normalan-tip tau. Najpogodniji kao Tg miševi koji eksprimiraju normalan-tip tau su miševi proizvedeni u primerima proizvodnje ovog pronalaska, ali se takođe mogu primeniti Tg miševi prijavljeni od strane Kambe et al. (Neurobiology of Disease, Vol.42, P.404-414, 2011) i Kimura et al. (The EMBO J. vol.26. P.5143-5152, 2007). Međutim, iako je pogoršanje kognitivne funkcije primećeno kod miševa od Kambe et al. i Kimura et al., čini se da nakon 14 meseci starosti i 20 meseci starosti, respektivno, pa prema tome početak starenja i efekri starenja takođe mogu biti doprinoseći efekti, dok efekti i rađanje dugoročne vrste takođe predstavljaju probleme. Nausprot tome, miševi proizvedeni u primerima proizvodnje ovog pronalaska ispoljavaju humani normalan-tip tau i ispoljavaju početak pogoršanj kognitivne funkcije u relativno ranom stadijumu od oko 6 meseci starosti, i prema tome su najpogodniji kao modeli za kognitivni poremećaj jer se faktori kao što su starenje mogu isključiti, a primenom takvih modela, omogućena je preciznija procena terapeutskih agenasa ili profilaktičkih agenasa za kognitivne poremećaje koji poboljšavaju efekte na kognitivnu funkciju.

[0058] Poželjan postupak spitivanja efekta terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa za kognitivne poremećaje u skladu sa ovim pronalaskom u životinjskom modelu je postupak testiranja kognitivne funkcije, kao što je ispitivanje učećeg pamćenja. Takav postupak može biti test Morris-ovog vodenog lavirinta, test učenja po fazama ili test prepoznavanja novih objekata, ali je poželjno kombinacija testova bihevioralnog merenja kao što su Test otvorenog polja, kako bi se uzela u obzir stanja bihevioralne količine i anksioznosti životinje.

[0059] Kao postupci za ispitivanje efekta terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa za kognitivne poremećaje u skladu sa ovim pronalaskom, moguće je primeniti postupke ispitivanja nivoa tau proteina ili fosforilisanog tau u moždanom tkivu, tokom izazivanja na životinjskom modelu kognitivnog poremećaja. Kod AD i drugih neurodegenerativnih bolesti, ekspresija nivoa tau proteina ili povećano abnormalan fosforilisan tau povezani su sa patologijom (Khalid Iqbal et al., Curr. Alzheimer Res., Vol.7, p.654-664, 2010). Takođe j dobro poznato da redukovanje tau ekspresije i nivoa abnormalnog fosforilisanog tau kod nekih životinjskih modela patologija, proizvodi poboljšanje u kognitivnoj funkciji i motornoj funkciji (K. Santa Cruz et al., Science, 30, Vol.9, p.476-481, 2005; Sylvie Le Corre et al., Proc.

Nat. Acad. Sci. USA, 10, Vol.3, p.9673-9678, 2006). Kao postupak ispitivanja promena u tau proteinu ili fosforilisanom tau, to se može postići postupkom kao što su Western blot primenom homogenata moždanog tkiva, kako je opisano u primerima, a stručnjak iz ove oblasti može da odabere neki drugi pogodan postupak kao što su ELISA (Xiyun Chai et al., J. Biol. Chem., Vol.286, p.34457-34467, 2011) ili imunohistohemijski postupak (David J. Irwin et al., BRAIN, Vol.135, p.807-818, 2012).

[0060] Efekat terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa za kognitivne poremećaje ovog pronalaska u životinjskom modelu može se primeniti kao podaci farmakološkog efekta za razvoj terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa kod ljudi.

[Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje]

[0061] Jedan oblik terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa za kognitivne poremećaje koji su ovde obezbeđeni, predstavlja onaj koji obuhvata anti-fosforilisano tau antitelo, i poželjno antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo specifično sa tau proteinom koji je fosforilisan na najmanje jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara položajima 410 do 421 iz SEQ ID NO: 1 u tau proteinu, poželjnije antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo sa tau proteinom koji je fosforilisan na jednom ili više mesta koja se biraju među aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1, poželjnije antitelo koje se vezuje kompetitivno protiv antitela čija VH aminokiselinska sekvenca predstavlja SEQ ID NO: 20 i čija VL aminokiselinska sekvenca predstavlja SEQ ID NO: 26 (1505). Jedan oblik terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa za kognitivne poremećaje ovog pronalaska je onaj koji obuhvata anti fosforilisano tau antitelo koje učestvuje u reakciji antigenantitelo sa tau proteinom koji je fosforilisan na mestu aminokiselinskog ostatka koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1. Takva antitela su prethodno objašnjena u odeljku [Anti-fosforilisano tau antitelo].

[0062] Još jedan oblik terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa za kognitivne poremećaje ovog pronalaska j onaj koji sadrži peptid koji uključuje deo tau sekvence između aminokiselinskih ostataka 410 i 421 i koji je fosforilisan na aminokiselinskim ostacima Ser413. Fosforilisan peptid može biti peptid dužine od najmanje 8 aminokiselina koje sadrže najmanje 3 neprekidnih aminokiselina među aminokiselinskim sekvencama koji se sastoji od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju aminokiselinskim brojevima 410-421 iz SEQ ID NO: 1, poželjno peptid dužine od najmanje 8 aminokiselina koje sadrže najmanje 5 neprekidnih aminokiselina, i poželjnije peptid dužine od najmanje 8 aminokiselina koje sadrže najmanje 8 neprekidnih aminokiselina. Takođe, fosforilisani aminokiselinski ostaci u fosforilisanim peptidima mogu biti bilo koji od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju aminokiselinskim brojevima 410-421 iz SEQ ID NO: 1, poželjno bilo koji od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju aminokiselinama Ser412, Ser413, Thr414 i Ser416 iz SEQ ID NO: 1. Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje ovog pronalaska je onaj koji sadrži peptid koji uključuje deo tau sekvence između aminokiselina 410 i 421 i koji je fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji

2

odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1. Takvi peptidi su prethodno objašnjeni u odeljku [Fosforilisan peptid sa tau-izvedenom aminokiselinskom sekvencom].

[0063] Terapeutski agens ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje ovog pronalaska takođe može da sadrži farmaceutski prihvatljive aditive. Formulacije koje koriste farmaceutski prihvatljive aditive mogu se proizvesti postupkom opisanim u "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, University of the Sciences in Philadelphia, Williams & Wilkins, December 15, 2000". Jedan oblik za takav terapeutski agens ili profilaktički agens je tečni lek pripremljen rastvaranjem, suspendovanjem ili emulzifikacijom u aseptičnom vodemom rastvoru ili uljastom rastvoru. Rastvarači za ovo uključuju destilovanu voda za injektovanje i fiziološki slani rastvor, za vodene rastvori, uz dodavanje agensa za regulisanje osmolarnosti (na primer, D-glukoza, D-sorbitol, D-manitol, natrijumhlorid i slično), koji se često primenjuje u kombinaciji sa pogodnim sredstvom za potpomaganje rastvaranja kao što je alkohol (na primer, etanol), polialkohol (na primer, propilenglikol ili polietilenglikol), ili nejonski surfaktant (na primer, polisorbat 80 ili polioksietilen hidrogenovano riciniusovo ulje 50). Uljasti rastvori takođe se ponekad primenjuju kao rastvarači, a kao primeri uljastih rastvora uključueno je susamovo ulje i sojino ulje, koja se često koriste u kombinaciji sa benzilbenzoatom, benzil alkoholom ili slično kao sredstva za potpomaganje rastvaranja. Kod takvih tečnih lekova, često se primenjuju pogodni aditivi kao što su puferujući agensi (na primer, fosfatni puferujući agensi i acetatni puferujući agensi), agensi za ublaživanje (na primer, benzalkonjiumhlorid i prokain hidrohlorid), stabilizatori (na primer, humani serumski albumin i polietilenglikol), prezervativi (na primer, askorbinska kiselina, eritrobinska kiselina, i njihove soli), agensi za bojenje (na primer, bakar hlorofil β-karoten, Crveno #2 i Plavo #1), antiseptični agensi (na primer, estri paraoksibenzojeve kiseline, fenol, benzetonijumhlorid i benzalkonjiumhlorid), zgušnjivači (na primer, hidroksipropil celuloza, karboksimetil celuloza, i njihove soli), stabilizatori (na primer, humani serumski albumin manitol i sorbitol), i popravljači mirisa (na primer, mentol i citrusne arome). Različiti oblici terapeutskih agenasa ili profilaktičkih agenasa uključuju čvrste formulacije kao što su praškovi, tablete, granule, kapsule, pilule, supozitorije, lozenge i slično. Za čvrstu formulaciju koja se daje u oralnom obliku, mogu se primeniti aditivi kao što su ekscipijensi (na primer, kristalna celuloza, laktoza i skrob), lubrikanti (na primer, magnezijum stearat i talk), veziva (hidroksipropil celuloza, hidroksipropil metil celuloza, makrogol i slično), i dezintegratori (na primer, skrob i karboksimetil celuloza kalcijum). Ukoliko je potrebno, aditivi kao što su antiseptični agensi (na primer, benzil alkohol, hlorobutanol, metil paraoksibenzoat i propil paraoksibenzoat), antioksidanti, agensi za bojenje, zaslađivači i slično, mogu se primeniti. Drugi alternativni oblici uključuju terapeutske agense ili profilaktičke agense za nanošenje na mukozne membrane, pri čemu takve formulacije često sadrže aditive kao što adhezivi osetljivi na pritisak, pojačivače osetljive na pritisak, regulatore viskoziteta, zgušnjivače i slično (na primer, mucin, agar, želatin, pektin, karagenan, natrijumalginat, rogač guma, ksantan guma, tragakant guma, guma arabika, hitosan, pululan, voskasti skrob, sukralfat, celulozu i

2

njhovi derivati (kao što su hidroksipropil metil celuloza), estri poliglicerol masnih kiselina, kopolimeri akrilnih kiselina-alkil (met)akrilata, ili njihove soli i estri poliglicerol masnih kiselina), primarno u cilju saopštavanja osobina mukozalne adsorpcije ili zadržavanja. Međutim, oblik, rastvarač i aditivi za terapeutski agens ili profilaktički agens koji se unosi u telo nisu ovim ograničeni, a stručnjak iz ove oblasti može napraviti odgovarajući odabir.

[0064] Terapeutski ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa ovim pronalaskom takođe encompasses the concept terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa koji obuhvataju existing supstance with efekti inhibiranja razvoja kognitivnog poremećaja, pored toga do prethodno pomenuti anti-fosforilisano tau antitelo ili fosforilisan peptid. Takođe, terapeutski ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa ovim pronalaskom može biti deo kompleta za kombinovanu primenu terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa koji sadrži anti-fosforilaciono antitelo ili fosforilisan peptid i terapeutski agens ili profilaktički agens koji sadrži postojeću supstancu sa efektima inhibiranja razvijanja kognitivnog poremećaja. Primeri supstanci koji inhibiraju razvoj kognitivnog poremećaja uključuju, ali se ne ograničavaju na, donepezil, galantamin, memantin i rivastigmin. Doza supstance sa efektom inhibiranja razvoja kognitivnog poremećaja, koja se dodaje, ili terapeutskog agensa ili profilaktičkog agensa koji sadrži supstancu sa efektom inhibiranja razvoja kognitivnog poremećaja, mogu biti uobičajeno upotrebljene doze za lečenje, koje mogu varirati u skladu sa stanjem.

[0065] Takođe, dok rezultati primera pokazuju da antitelo koje se koristi za izvođenje ovog pronalaska ispoljava efekat leka delovanjem na mozak kroz krvno-moždanu barijeru čak kada se daje periferno intraperitonealnim davanjem, ono je moguće za pripremu formulacije koja efikasno obezbeđuje antifosforilisano tau antitelo, koje se takođe može primeniti kao terapeutski ili profilaktički agens ovog pronalaska protiv kognitivnog poremećaja, na moždano tkivo, a takve formulacije su takođe obuhvaćene terapeutskim ili profilaktičkim agensom za kognitivne poremećaje u skladu sa ovim pronalaskom. Postupci za efikasno obezbeđivanje antitela ili peptida do moždanog tkiva putem krvnomoždane barijere su poznati, kao što su postupci dodavanja ciljajuće supstance ili postupci enkapsuliranja u lipozome ili nanočestice. Supstance koje se koriste ca ciljanje uključuju one koje prolaze potpunu ili delimičnu promenu karakteristikama naelektrisanja vezivanjem sa antitelom, ili peptidima, proteinima ili drugim jedinjenjima sa svojstvom vezivanja sa specifičnim receptorom ili transporterom. Primeri peptida, proteina ili drugih jedinjenja sa svojstvom vezivanja sa specifičnim receptorom ili membranskim proteinom uključuju ligande koji se vezuju za receptorski ligande ili membranske proteine, i njihove analoge, i antitela, agonist jedinjenja/antagonist jedinjenja/alosterne modulatore koji se vezuju za receptorski ligande ili membranske proteine, i njihova analogna jedinjenja. Primeri of receptorskih liganda ili membrannskih proteinia kao tagovi za peptid, protein ili drugo jedinjenje sa svojstvom vezivanja za specifični receptor ili transporter uključuju transferinski receptor (TfR), insulinski receptor (IR), insulinski receptor faktora rasta (IGFR), LDL receptor-povezan protein (LRP) i difterija

2

toksinski receptor (HB-EGF), bez posebnog ograničavanja samo na njih (Angela R. Jones et al., Pharm. Res., Vol.24, p.1759-1771, 2007). Supstanca za ciljaje može biti hemijski dodata antitelu koje se koristi za terapeutski ili profilaktički agens za kognitivne poremećaje u skladu sa ovim pronalaskom, pri čemu je to postupak koji se može pogodno izvesti od strane stručnjaka iz ove oblasti sa pozivanjem na poznati postupak kao što je opisano u, na primer, Hermanson et al., Biokonjugat techniques, USA 1996, Academic Press. Ta supstanca za ciljanje takođe može biti vezana za lipozome ili nanočestice koje enkapsuliraju antitelo ili peptid (Sonu Bhaskar et al., Particle and Fibre Toxicology, Vol.7, No.3, 2010). Pored toga, kada je ta supstanca za ciljanje peptid ili protein, ona se može proizvesti kao pogodan fuzioni protein od strane stručnjaka iz ove oblasti primenom tehnika genetskog inženjeringa, bilo proizvodnjom fuzionog peptida hemijskom sintezom peptida, ili kombinovanjem nukleinske kiseline koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida ili proteina sa nukleinskom kiselinom koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu za antitelo ili peptid koji se koriste.

[0066] Agens za lečenje ili prevenciju u skladu sa ovim pronalaskom može se davati oralno ili patenteralno, u cilju poboljšavanja simptoma. Za oralno davanje, mogu se odabrati dozni oblici kao što su granule, praškovi, tablete, kapsule, tečni lekovi, sirupi, emulzije, suspenzioni agensi ili eliksir. Za parenteralno davanje, transnazalni agens se može pripremiti, a tečni lek, suspenzija ili čvrsta formulacija mogu biti odabrani. Injektovanje se može pripremiti kao različit oblik za parenteralno davanje, pri čemu se injekcija bira kao hipodermna injekcija, intravenozna injekcija, kapajuća injekcija, intramuskularna injekcija, intracerebroventrikularna injekcija ili intraperitonealna injekcija. Druge formulacije koje se koriste za parenteralno davanje uključuju supozitorije, podjezične agense, perkutane agense i transmukosalne agense koji se razlikuju od transnazalnih agenasa. Pored toga, intravaskularno lokalno davanje moguće je putem dodavanja ili oblaganja na stent ili intravaskularni obturator.

[0067] Doza za agens za lečenje ili prevenciju u skladu sa ovim pronalaskom razlikovaće se zavisno od starosti pacijenta, pola, telesne mase i simptoma, terapeutskog efekta, postupka davanja, vremena tretiranja, ili tipova aktivnih sastojaka u medicinskoj kompoziciji, ali uobičajeno se daju u opsegu od 0.1 mg do 1 g, a poželjno u opsegu od 0.5 mg do 200 mg aktivnog jedinjenja po davanju u slučaju odrasle osobe. Međutim, kako doza varira zavisno od varijeteta stanja, mogu biti dovoljne niže doze od pomenutih, ili mogu biti potrebne doze koje prevazilaze ove opsege.

[0068] Agens za lečenje ili prevenciju u skladu sa ovim pronalaskom može da ispoljava efekat unutar kratkog perioda davanja.

[Primeri]

2

[0069] Ovaj pronalazak sada će biti objašnjen detaljnije pomoću primera, podrazumevajući da ti primeri ne ograničavaju ovaj pronalazak ni na koji način. Eksperimenti su izvedeni uz dopuštenje the Animal Experiment Committee na Osaka City University, Abeno Campus.

[Primer 1] Pripremanje zečijeg poliklonalnog antitela za pSer413 peptid

[0070] Antigen upotrebljen za pripremu antitela za pSer413 peptid bio je sintetički peptid (SEQ ID NO: 31, sintetizovan od strane Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. [MBL]) sa Cys pričvršćenim na C-terminalnom mestu aminokiselinske sekvence koji odgovara regionu od 410th Asn do 416th Ser aminokiselinske sekvence za SEQ ID NO: 1 za humani tau protein, fosforilisan na Ser koji odgovara položaju 413 (u nastavku ovaj peptid je označen kao pSer413(S) peptid).

pSer413(S) peptid: N-AsnValSer(pSer)ThrGlySerCys-C (SEQ ID NO: 31)

[0071] Nakon sinteze, pSer413(S) peptid je prečišćen pomoću HPLC i kovalentno vezan sa KLH (Hemocijanin prilepka). Dobijeni konjugat upotrebljen je za imunizaciju sa 0.1 mg po dozi po zecu. Za prvu imunizaciju, 0.2 mL rastvora konjugata (koncentracija konjugata: 0.5 mg/mL) umešano je sa jednakom količinom Freund-ovog potpunog adjuvansa, i intradermalno ubrizgano u leđna oblast obrijanih japanskih belih zečeva na 8 mesta sa po 50 µL. Za drugu i naknadne imunizacije, Freund-ov nepotpun adjuvans upotrebljen je za još dve slične imunizacije svake 2 nedelje.2 nedelje nakon konačne imunizacije, krvni uzorak je izvađen i titar antitela seruma potvrđen je sa ELISA primenom imunizovaniog peptidnog konjugata, a životinja je žrtvovana nakon 1 nedelje i izvađena je sva krv. Serum je pripremljen iz dobijene krvi, a antitela su prečišćena iz seruma primenom afinitetne kolone pSer413(Af) peptida (SEQ ID NO: 32).

[0072] Serumski titar potvrđen je sledećim postupkom. pSer413(S) peptid razblažen je do 5 µg/mL primenom PBS, i zatim dispergovan u ploču sa 100 µL/bazenčić i ostavljen da odstoji preko noći na 4°C. Nakon uklanjanja rastvora, blokirajući pufer (MBL Co.) dispergovan je pri 250µL/bazenčić, a ploča ostavljena da odstoji preko noći na 4°C. Serije razblaženja za pred-imunizacioni zečji serum i postimunizacioni zečji serum bila je 100, 500, 2,500, 12,500 i 62,500 struka, sa PBS-razblaženim uzorkom dodat pri 100 µL/bazenčić, i reakcija je sprovedena na 25°C tokom 60 minuta. Nakon ispiranja, anti-zečje IgG-peroksidaza oznaka (proizvod od MBL) razblažena 8,000-puta puferom (MBL) dodata je pri 100 µL/bazenčić, i reakcija je sprovedena na 25°C tokom 60 minuta. Nakon ispiranja, rastvor za bojenje (MBL) dodat je pri 100 µL/bazenčić radi bojenja tokom 3 do 10 minuta, a zatim 2N sumporna kiselina dodata je pri 100 µL/bazenčić kako bi se prekinula reakcije. Posle prekidana reakcije, apsorbanca je izmerena pri talasnoj dužini merenja od 450 nm i referentnoj talasnoj dužini od 620 nm.

[0073] Reaktivnost antitela prečišćenog antitela potvrđena je sledećim postupkom. pSer413(L) peptid [pSer413(S) peptid (podvučen) koji se daljepruža u N-terminalnim i C-terminalnim pravcima (SEQ ID NO:

2

33, sintetizovan je od strane Biosinteza Co.): N-ProArgHisLeuSerAsnValSer(pSer)ThrGlySerIleAspMetValAsp-C] ili NonP(L) peptid sa istom aminokiselinskom sekvencom ali koji nije fosforilisan na mestu koje odgovara Ser413 (SEQ ID NO: 34, sintetizovan od strane Biosinteza Co.) razblažen je do 1 µg/mL primenom PBS i zatim dispergovan u ploču pri 50 µL/bazenčić, i ostavljen da odstoji preko noći na 4°C. Nakon uklanjanja rastvora, blokirajući pufer (3% BSA-PBS) dispergovan je pri 250 µL/bazenčić, i mešavina je ostavljena da dalje odstoji na 37°C tokom 1 sata ili duže. Prečišćeno antitelo razblaženo primenom PBS i podeljeno u serije dodato je pri 50 µL/bazenčić, i reakcija je sprovedena na 25°C tokom 90 minuta. Nakon ispiranja, kozje anti-zečje IgG-alkalinska fosfataza oznaka (Bioscience) razblažena je 2,000-puta puferom za razblaživanje (3% BSA-PBS) i dodato pri 50 µL/bazenčić, i reakcija je sprovedena na 25°C tokom 60 minuta. Nakon ispiranja, rastvor za bojenje (2.5 mM MgCl2-koji sadrži 0.1 M dietanolaminski puferski rastvor, sa 1 mg/mL PNPP [paranitrofenil fosfat] dodat do pH 9.8) dodat je pri 100 µL/bazenčić radi bojenja tokom 30 minuta, i apsorbanca je izmerena pri talasnoj dužini merenja od 405 nm i referentnoj talasnoj dužini od 550 nm.

<Rezultati>

[0074] Kako je prikazano na Fig.3, prečišćeno antitelo imalo je visoku specifičnost za pSer413(L) peptid, dok virtuelno nije zapažena nikakva reakcija sa nonP(L) peptidom. Prema tome, antitelo je antitelo koje učestvuje u reakciji antigen-antitelo specifično sa pSer413(L) (kroz ovu specifikaciju, ovo takođe može biti označeno kao "pSer413-obeleženo zečje poliklonalno antitelo" ili "pS413AB").

[Primer 2] Pripremanje monoklonalnog antitela za pSer413 peptid (Ta15 Serije)

[0075] Antigen koji je upotrebljen bio je sintetički peptid pSer413(Im) (SEQ ID NO: 35), sa GlyCysSerGly pričvršćenim na N-terminusu sekvence, koji odgovara regionu od 403rd Thr do 423rd Pro, fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser na položaju 413 aminokiselinske sekvence humanog tau proteina predstavljenog pomoću SEQ ID NO: 1. Nakon sinteze, pSer413(Im) peptid je prečišćen pomoću HPLC i kovalentno vezan sa KLH (Hemocijanin prilepka). Dobijeni konjugat upotrebljen je za imunizaciju sa 0.04 mg po dozi po mišu. Imunizacija je sprovedena intraperitonealnom injekcijom na 10 miševa pri 200 µL svaki mešavine 0.4 ml rastvora konjugata (1.1 mg/ml u pogledu peptida), 0.7 mL slanog rastvora i 1.1 mL Freund-ovog potpunog adjuvansa. Još tri slične imunizacije (sa istim mestom imunizacije i dozom antigena, primenom Freund-ovog nepotpunug adjuvansa) sproveden su svake 2 nedelja. Jedan mesec nakon konačne imunizacije, 100 µL 0.5 mg/mL antigen rastvora (rastvoren u slanom rastvoru) u pogledu peptida injektovano je u kaudalnu venu jednog miša od deset koji su imali povećan titar antitela u serumu za antigen, a trećeg dana životinje su žrtvovane i izolovane su slezine. Dve 18G injekcione igle upotrebljene su za komadanje slezina, a zatim su komadi slezina nežno ugnječeni gumenom površinom čepa. Ugnječeni splenociti suspendovani su u približno 10 mL hladne RPMI 1640 podloge, supernatant je filtriran pomoću 40 µm ćelijskog sita, i filtrat je sakupljen u 50 mL epruvetu. Ostaci ćelija slezine dalje su ugnječeni gumenom površinom čepa, i slično suspendovani u hladnoj RPMI 1640 podlozi, filtriran, a filtrat sakupljen. Hladna RPMI 1640 podloga (ili hladni PBS) dodata je u konačnoj zapremini od 40 mL za suspenziju ćelija slezine. Koncentracija limfocita u suspenziji je izmerena hemacitometrom, a limfociti u finalnoj količini koja odgovara 2 × 10<7>ćelijama, transferovani su u 50 mL epruvetu. U to je dodat ekvivalent 4 × 10<7>ćelija mišje mijeloma ćelijske linije P3X63Ag8 ·U1 (P3·U1) u logaritmičkoj fazi rasta, koje su uzgajane u rastvoru za uzgajanje B (RPMI 1640 10% fetalni goveđi serum 2 mM glutamin 100 µg/mL streptomicin 100 jedinica/mL penicillin), i nakon centrifugiranja pri 1500 o/min tokom 5 minuta, supernatant je odbačen. Ćelijski pelet temeljno je dispergovan tapkanjem epruvete. Tome je dodato 0.5 mL polietilen glikol rastvora (sastavljen od RPMI 1640 (2.3 mL) polietilen glikol 2000 (1.4 mL) dimetil sulfoksid (0.3 mL), u nastavku označeno skraćeno kao "PEG rastvor"), a ćelije su nežno suspendovane. Nakon 1 minuta, 0.5 mL PEG rastvora polako je dodato ukapavanjem tokom perioda od 1 minuta, 1.0 mL RPMI 1640 polako je dodato ukapavanjem tokom perioda od 1 minuta, a zatim 2 mL RPMI 1640 polako je dodato ukapavanjem tokom perioda od 2 minuta. Zatim, 4 mL HAT/GIT rastvora za uzgajanje (GIT podloga [Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.] 5% fetalni goveđi serum 100 µg/mL streptomicin 100 jedinica/mL penicillin 95 µM hipoksantin 0.4 µM aminopterin 16 µM timidin) dodato je ukapavanjem tokom perioda od 2 minuta, a zatim 4 mL HAT/GIT rastvora za uzgajanje dodato je ukapavanjem tokom perioda od 2 minuta. Konačno, HAT/GIT rastvor za uzgajanje dodat je do dobijanja 40 do 50 mL ćelijske suspenzije. Nakon inkubacije u termostatičkom kupatilu na 37°C tokom 30 minuta, suspenzija je zasejana u 7 ploča za uzgajanje (96 bazenćića). Ploče za uzgajanje koje su upotrebljene bile su ploče sa 96 bazenčića (hranljive ploče) na koje su mišje (ICR) makrofage abdominalne šupljine (ćelije hranilice) uzgajane tokom nekoliko dana (> 1 × 10<5>/bazenčić). Ploče su zatim uzgajane tokom 7 do 10 dana na 37°C, 5% CO2.

[0076] Polovina rastvora za uzgajanje zamenjena je svežim HT rastvorom za uzgajanje (HAT/GIT rastvor za uzgajanje bez aminopterina) jednom svake nedelje, i dobijeni su hibridomi.

[0077] Skrining antitela izveden je sledećim postupkom. pSer413(L) peptid razblažen je do 1 µg/mL primenom PBS, i zatim dispergovan u ploču sa 96 bazenčića pri 50 µL/bazenčić i ostavljen da odstoji preko noći na 4°C. Nakon uklanjanja rastvora, blokirajući pufer (3% BSA-PBS) dispergovan je pri 250 µL/bazenčić, a mešavina ostavljena da odstoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sata ili duže. Blokirajući pufer (3% BSA-PBS) aspiriran je, supernatant hibridoma je dodat pri 30-50 µL/bazenčić, a reakcija je sprovedena na 25°C tokom 60 minuta. Nakon ispiranja fosfatom-puferovanim slanim rastvorom koji sadrži 0.05% Tween20 (PBS-Tween), drugo antitelo (rastvor koji sadrži alkalinska fosfataza-obeleženo kozje anti-miš IgG-Fc antitelo [SouthernBiotech], razblažen 2000-puta blokirajućim puferom) dodat je pri 100 µL/bazenčić, a reakcija je sprovedena na 25°C tokom 60 minuta. Nakon ispiranja, rastvor supstrata (2.5 mM MgCl2-koji sadrži 0.1 M dietanolaminski pufer, sa 0.7 do 1.2 mg/mL PNPP [para-

1

nitrofenil fosfat] dodat je pri pH 9.8) dodat je pri 100 µL/bazenčić radi bojenja na 25°C tokom 60 minuta, nakon čega je izmerena apsorbanca pri talasnoj dužini merenja od 405 nm.

[0078] U ovom skriningu, ćelije su izdvojene iz pozitivnih bazenćića i izbrojane hemacitometrom, a zatim zasejane na ploči sa 96 bazenčića (prethodna ploča hranilica) pri 1-3 ćelije/bazenčić, radi kloniranja postupkom ograničenog razblaženja (Ta1501, Ta1502, Ta1505-1509). Za naknadnu analizu, klonovi su masovno uzgajane , a antitelo je prečišćeno kolonom proteina G. Ta1505 je isto što i Ta1505-2. Izotipovi su određeni primenom kompleta od AbD Serotec.

[0079] Prečišćeno antitelo reagovano je sa ELISA pločom obloženom delimičnim peptidom koji odgovara različitim mestima fosforilacije tau, radi određivanja specifičnosti fosfatne grupe. Postupak je bio kako sledi.

[0080] 10% DMSO rastvor svakog tau peptida (pS46 [SEQ ID NO: 36], pS199 [SEQ ID NO: 37], pS202 [SEQ ID NO: 38], pT212 [SEQ ID NO: 39], pS214 [SEQ ID NO: 40], pT212/pS214 [SEQ ID NO: 41], pT217 [SEQ ID NO: 42], pS413 [SEQ ID NO: 33], ne pS413 [SEQ ID NO: 34]), ili PBS rastvor BSA-konjugovanog peptida (pS400 [SEQ ID NO: 43]-BSA, pS412 [SEQ ID NO: 44]-BSA) razblažen je do 1 µg/mL primenom PBS (pH 7) i dodat u ploču sa 96 bazenčića (MaxiSorp: Nunc) pri 50 µL/bazenčić, a zatim inkubisan preko noći na 4°C tokom imobilizacije. Zatim, rastvor peptida je uklonjen i ispran 3 puta sa TBS koji sadrži 0.05% Tween20, nakon čega 3% BSA/PBS dodat je pri 280 µL/bazenčić, a blokiranje je izvedeno na 37°C tokom 1 sata.

[0081] Blokirajući rastvor je aspiriran, ispiranje je izvedeno 3 puta sa TBS koji sadrži 0.05% Tween20, a zatim je 1 µg/mL svake od Ta15 Serija rastvora monoklonalnog antitela u 3% BSA-PBS dodat pri 50 µL/bazenčić, a reakcija je sprovedena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Nakon ispiranja 3 puta sa TBS koji sadrži 0.05% Tween 20, dodato je 50 µL alkalinska fosfataza-obeleženog kozjeg anti-mišjeg IgG antitela (ThermoScience) razblaženo 2000-puta primenom PBS koji sadrži 3% BSA, a reakcija je sprovedena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Nakon ispiranja 3 puta sa TBS koji sadrži 0.05% Tween 20, dodato je 100 µL 1 mg/mL PNPP (para-nitrofenil fosfat) rastvora rastvorenog u 0.1 M dietanolamina (pH 10), reakcija je sprovedena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i izmerena je apsorbanca na 405 nm. Rezultati procene reaktivnosti svakog antitelo za svaki peptid prikazani su u Tabeli 2. Rreaktivnost je procenjena na skali od 3-nivoa.

+: Reaktivnost, -: Bez reaktivnosti, ±: Prisutna ali i dalje veoma slaba reaktivnost

[Tabela 2]

Reakciona specifičnost respektivnih fosfatnih grupa tau prema dobijenom antitelu

2

[0082] Ova antitela (u nastavku označena kao "Ta15 Serije") reagovana su samo sa pSer413 među ispitanim peptidima, a specifičnost fosfatne grupe bila je izizetno visoka.

[Primer 3] Merenje afiniteta vezivanja antitela Ta15 Serija

[0083] Kako bi se procenio afinitet vezivanja između antitela Ta15 Serija i antigen peptida (pSer413 peptid (Im): videti Primer 2), sistem Biacore rezonancije površinskog plazmona (SPR) (BIACORE3000, kod# BR-1100-45, od GE Healthcare, Japan) i svaki Biacore proizvod upotrebljeni su za merenje u skladu sa uputstvom proizvođača. Jedan postupak merenja koji je upotrebljen bio je postupak imobilizovanja (kod# BR-1006-33) anti-mišjeg antitela (kod# BR-1008-38) na CM5 čip (karboksimetildekstran slojformiran čip, kod# BR-1100-14) kovalentnim vezivanjem putem reakcije kuplovanja amina, vezujući antitelo Ta15 Serije sa imobilizovanim anti-mišjim antitelom, i merenje ponašanja vezivanja antigen peptida za vezano antitelo Ta15 Serije.

[0084] Specifično-vezujuća reakciona mešavina upotrebljena je sa HBS-EP puferom (kod# BR-T-1001-88), a CM5 čip je aktiviran pomešanim rastvorom N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS). Rastvor anti-mišjeg antitela razblažena u 0.001 mg/mL sa 10 mM natrijum acetatnim puferom na pH 5.0 reagovano je sa 4 protočnih ćelija na čipu, a nakon kovalentnog vezivanja anti-mišjeg antitela sa CM5 čipom, podvrgnut je blokiranju sa etanolaminom. Od 4 protočne ćelije imobilizovanja anti-mišjeg antitela, jedna je zarobila negativno antitelo (mišje IgG2a izotip kontrola, kod# MAB003, od R&D Systems) dok su ostale od protočnih ćelija zarobile antitelo Ta15 Serije, pri gustini od oko 1000 RU svaka. HBS-EP pufer (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v Surfaktant P20) sa dodatim 1 M NaCl reagovano je tokom 3 minuta i nespecifično adsorbovano antitelo je uklonjeno, a zatim je HBS-EP pufer reagovan tokom 10 minuta pri brzini protoka od 50 µL/min da bi se tabilizovala osnovna linija. Peptid je serijski razblažen HBS-EP puferom od koncentracije od 100 pM do 5 mM (blizu pocenjene konstante disocijacije vezivanja [KD]), dobijeni rastvori peptida (5 koncentracija) reagovani su tokom između 4 minuta i 6 minuta (uniformno) ri intervalima od 6 minuta svaki kontinulano sa kraja niske koncetracije, a ponašanja vezivanja su izmerena.

[0085] Kao podaci specifičnog ponašanje vezivanja za antigen peptid, podaci ponašanja vezivanja dobijeni su za ne-fosforilisan peptid (ne pSer413 peptid) kao negativan peptid, a to je oduzeto od podataka ponašanja vezivanja za antigen peptid, kako bi se eliminisali efekti buke proizvedene ovim postupkom. Nije primećen vezivanje ne-fosforilisanog peptida za antitelo pri merenju koncentracija. Specifični podaci ponašanja vezivanja ukopljeni su sa kinetikom jednog ciklusa 1:1, vezivanje sa modelom zanošenja, primenom Biacore softvera za analizu (BIA procena: Analiza kinetika jednog ciklusa, kod# AP-4000-01), a brzine kinetičke asocijacije (Ka) i brzine disocijacije (Kd) simultano su dobijene (Karlsson, R., Katsamba, P. S., Nordin, H., Pol, E. i Myszka, D. G. (2006). "Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors." Anal.Biochem.349(1): 136-47). Vrednost ravnotežne konstante disocijacije (KD), kao afinitet merenje za antitela Ta15 Serija, izračunata je kao Kd/Ka.

<Rezultati>

[0086]

[Tabela 3]

[0087] Od antitela Ta15 Serija, Ta1505 antitelo sa najjačim afinitetom za antigen peptid upotrebljen u testu ponašanja primenom miševa sa oslabljenim pamćenjem.

4

[Referentni Primer 4] Pripremanje monoklonalnog antitela koje prepoznaje pSer396 i/ili pSer404 peptid

[0088] Kao antigen upotrebljen je sintetički peptid (SEQ ID NO: 47, sintetizovan od strane Biosinteza Co.) sa GlyCys vezanim na N-terminalnom mestu sekvence od 379-i Arg do 408-i Leu i fosforilisan na aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju Ser na položajima 396 i 404 aminokiselinske sekvence humanog tau proteina predstavljenim pomoću SEQ ID NO: 1 (u nastavku, ovaj peptid biće označen da ima "pSer396/pSer404 peptid").

pSer396/pSer404 peptid: N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLys(pSer)ProV alValSerGlyAspThr(pSer)ProArgHisLeu-C (SEQ ID NO: 47)

[0089] Nakon sinteze pSer396/pSer404 peptida, prečišćen je HPLC i kovalentno vezan za maleimidom aktiviranim KLH (Hemocijanin prilepka)(Thermo Scientific). Dobijeni konjugat upotrebljen je za imunizaciju Balb/c miševa sa približno 0.04 mg po dozi po mišu. Imunizacija je sprovedena intraperitonealnom injekcijom svakog od 4 miša sa 100 µL mešavine 0.3 ml rastvora konjugata (0.77 mg/ml u pogledu peptida) i 0.3 mL Freund-ovog potpunog adjuvansa. Dva od miševa imunizovana su intraperitonealnom imunizacijom (istom količinom antigena, primenom Freund-ov nepotpunog adjuvansa) i imunizacijom u predelu tabana (antigen Titer Max adjuvans), dok su ostala dva imunizovana samo intraperitonealnom imunizacijom, a to je ponovljeno dva puta na 2 nedeljnim intervalima. Miševima imunizovani intraperitonealnom imunizacijom i imunizacijom u predelu tabana, koji su imali povećane serumske titre antitela za antigen, ubrizgan je antigen rastvor (rastvoren u slanom rastvoru) putem kaudalne vene 15 dana nakon konačne imunizacije, i nakon 3 dana životinje su žrtvovane, a slezine ekstraktovane. Dve 18G injekcone igle upotrebljeni su za komadanje slezina, a zatim a zatim su komadi slezina nežno ugnječeni gumenom površinom čepa. Ugnječeni splenociti suspendovani su u približno 10 mL hladne RPMI 1640 podloga, supernatant je filtriran pomoću 40 µm ćelijskog sita, a filtrat je sakupljen u 50 mL epruvetu. Ostaci ćelija slezine dalje su ugnječeni gumenom površinom čepa, i slično suspendovani u hladnoj RPMI 1640 podlozi, filtrirani, a filtrat sakupljen. Hladna RPMI 1640 podloga (ili hladni PBS) dodata je u konačnoj zapremini od 40 mL za suspenziju ćelija slezine. Koncentracija limfocita u suspenziji je izmerena hemacitometrom, a limfociti u finalnoj količini koja odgovara 2 × 10<7>ćelijama, transferovani su u 50 mL epruvetu. U to je dodat ekvivalent 4 × 10<7>ćelija mišje mijeloma ćelijske linije P3 ·U1 u logaritmičkoj fazi rasta, koje su uzgajane u rastvoru za uzgajanje B (RPMI 1640 10% fetalni goveđi serum 2 mM glutamin 100 µg/mL streptomicin 100 jedinica/mL penicillin), i nakon centrifugiranja pri 1500 o/min tokom 5 minuta, supernatant je odbačen. Ćelijski pelet temeljno je dispergovan tapkanjem test epruvete.0.5 mL PEG rastvora u to je dodato, a ćelije su nežno suspendovane. Nakon 1 minuta, 0.5 mL PEG rastvora polako je dodato ukapavanjem tokom perioda od 1 minuta, 1.0 mL RPMI 1640 polako je dodato ukapavanjem tokom perioda od 1 minuta, a zatim 2 mL RPMI 1640 polako je dodato ukapavanjem tokom perioda od 2 minuta. Zatim, 4 mL HAT/GIT rastvora za uzgajanje (GIT podloga [Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.] 5% fetalni goveđi serum 100 µg/mL streptomicin 100 jedinica/mL penicillin 95 µM hipoksantin 0.4 µM aminopterin 16 µM timidin) dodato je ukapavanjem tokom perioda od 2 minuta, a zatim 4 mL HAT/GIT rastvora za uzgajanje dodato je ukapavanjem tokom perioda od 2 minuta. Konačno, HAT/GIT rastvor za uzgajanje dodat je do dobijanja 40 do 50 mL ćelijske suspenzije. Nakon inkubacije u termostatičkom kupatilu na 37°C tokom 30 minuta, suspenzija je zasejana u 7 ploča za uzgajanje (sa 96 bazenčića). Ploče za uzgajanje koje su upotrebljene bile su ploče sa 96 bazenčića (hranljive ploče) na koje su mišje (ICR) makrofage abdominalne šupljine (ćelije hranilice) uzgajane tokom nekoliko dana (> 1 × 10<5>/bazenčić). Ploče su zatim uzgajane tokom 7 do 10 dana na 37°C, 5% CO2.

[0090] Polovina rastvora za uzgajanje zamenjena je svežim HT rastvorom za uzgajanje (HAT/GIT rastvor za uzgajanje bez aminopterina) jednom svake nedelje, i dobijeni su hibridomi.

[0091] Skrining monoklonalnog antitela izveden je na sledeći način. Skkrining antigeni koji su upotrebljeni bili su pSer396/pSer404 peptid-BSA, sa BSA konjugovanim na N-terminalnom Cys iz pSer396/pSer404 peptid (N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLys(pSer)ProV alValSerGlyAspThr(pSer)ProArgHisLeu-C) (SEQ ID NO: 47), i ne-fosforilisan peptid-BSA, sa BSA konjugovanim na N-terminalnom Cys ne-fosforilisanog peptida (N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLysSerProValV alSerGlyAspThrSerProArgHisLeu-C) (SEQ ID NO: 48). Ne-fosforilisan peptid-BSA ili pSer396/pSer404 peptid-BSA razblažen je do 1 µg/mL primenom PBS, a zatim dispergovan u ploču sa 96 bazenčića pri 50 µL/bazenčić i ostavljen da odstoji preko noći na 4°C. Nakon uklanjanja rastvora, blokirajući pufer (3% BSA-PBS) dispergovan je pri 250 µL/bazenčić, a mešavina ostavljena da odstoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sata ili duže. Blokirajući pufer (3% BSA-PBS) aspiriran je, supernatant hibridoma je dodat pri 30-50 µL/bazenčić, a reakcija je sprovedena na 25°C tokom 60 minuta. Nakon ispiranja fosfatom-puferovanim slanim rastvorom koji sadrži 0.05% Tween20 (PBS-Tween), reagens za detekciju (rastvor koji sadrži dodati alkalinska fosfatazaobeležen Protein A, razblažen 2000-puta blokirajućim puferom) dodat je pri 100 µL/bazenčić, i reakcija je sprovedena na 25°C tokom 60 minuta. Nakon ispiranja, rastvor supstrata (2.5 mM MgCl2-koji sadrži 0.1 M dietanolaminski pufer, sa 0.7 do 1.2 mg/mL PNPP [para-nitrofenil fosfat] dodat pri pH 9.8) dodat je pri 100 µL/bazenčić radi bojenja na 25°C tokom 60 minuta, nakon čega je izmerena apsorbanca pri talasnoj dužini merenja od 405 nm.

[0092] Ćelije su izdvojene iz bazenćića koji su imali nisku reaktivnost sa ne-fosforilisanim peptid-BSA i visoku reaktivnost sa pSer396/pSer404 peptid-BSA, i koje su zasejane u ploči sa 96 bazenčića (prethodna ploča hranilica) pri 1-3 ćelije/bazenčić, radi kloniranja postupkom ograničenog razblaženja. Klonovi koji proizvode Ta9 antitelo (IgG3/κ) odabrani su od pomenutih. Za naknadnu analizu, klonovi su masovno uzgajani, a antitelo je prečišćeno kolonom proteina G.

[0093] Nakon merenja KD vrednosti za Ta9 antitelo za pSer396/pSer404 peptid postupkom opisanim u Primeru 3, pronađeno je da iznosi 1.08 × 10<-10>, sa afinitetom prema peptidu koji je viši od Antitela Ta15 Serija.

[Primer 5] Bihevioralni test: Efekat dobijenih antitela na miševe sa oslabljenim učećim pamćenjem [0094] Ispitani su efekti davanja sledeća tri antitela na miševe sa oslabljenim učećim pamćenjem (Tau-Tg).

(1) pSer413-prepoznavajuće zečje poliklonalno antitelo: Tau-Tg (linija 609) miševi ili non-Tg miševi (normalna kontrola), 9-11 meseci starosti, n = 9-10/grupa

(2) Ta1505 (pSer413-prepoznavajuće monoklonalno antitelo): Tau-Tg (linija 784) miševi ili non-Tg miševi, 14 meseci starosti, n = 9-10/grupa

(3) Ta9 (pSer396-prepoznavajuće monoklonalno antitelo): Tau-Tg (linija 609) miševi ili non-Tg miševi, 14 meseci starosti, n = 9-10/grupa

[0095] Za ovaj eksperiment upotrebljeni su mužijaci hetero mutant Tau-Tg miševa (linija 609 ili linija 784), i non-Tg jedinke istog legla, 9-14 meseci starosti. Grupe su podeljene tako da ne postoje razlike u prosečnoj masi između grupa. Hetero mutant Tau-Tg miševi su oni kojima je dato antitelo razblaženo primenom PBS ili citratnog pufera (pH 5), jednom nedeljno, ukupno 5 puta, u abdominalnu šupljinu pri 1 mg po mišu po davanju. Kao negativna kontrolna grupa, pufer upotrebljen za pripremu antitela, ili mišje IgG monoklonalno antitelo bez reaktivnosti za tau, je ono što je dato u abdominalnu šupljinu pri istoj dozi. Kao pozitivna kontrola, non-Tg jedinke istog legla su one kojima je dat pufer upotrebljen za pripremu antitela, u abdominalnu šupljinu pri istoj dozi.

[0096] Strukture za grupe (1) do (3) prikazane su u nastavku.

(1) <Upotrebljeni miševi>: Mutant Tau-Tg (linija 609), 9 do 11 meseci starosti.

<Struktura grupe>

[0097]

Grupa antitela koje se ocenjuje: 1.6 mg/mL anti-tau pSer413 zečjeg poliklonalnog antitela u PBS (n = 10) Grupa kontrolnog antitela: PBS (n = 9)

Non-Tg grupa: PBS (n = 9)

(2) <Upotrebljeni miševi>: Mutant Tau-Tg (linija 784), 14 meseci starosti.

<Struktura grupe>

Grupa antitela koje se ocenjuje: 3.84 mg/ml anti-tau pSer413 mišjeg monoklonalnog antitela Ta1505 u 0.1 M citratnom puferu (pH 5) (n = 10)

Grupa kontrolnog antitela: 4.28 mg/ml anti-Pseudomonas aeruginosa mišjeg monoklonalnog antitela 4C10F4 u 0.1 M citratnom puferu (pH 5) (n = 9)

Non-Tg grupa: 0.1 M citratni pufer (pH 5) (n = 9)

(3) <Upotrebljeni miševi>: Mutant Tau-Tg (linija 609), 14 meseci starosti.

<Struktura grupe>

[0099]

Grupa antitela koje se ocenjuje: 2.66 mg/ml anti-tau pSer396 mišjeg monoklonalnog antitela Ta9 u 0.02 M citratnom puferu (pH 6) (n = 10)

Grupa kontrolnog antitela: 4.50 mg/ml anti-Pseudomonas aeruginosa monoklonalnog antitela 6F11 u 0.02 M citratnom puferu (pH 6) (n = 9)

Non-Tg grupa: 0.02 M citratni pufer (pH 6) (n = 9)

[0100] Od Ponedeljka nedelje nakon konačnog davanja, sproveden je test prostorne referentne memorije primenom Morris-ov vodenog lavirinta (test vodenog lavirinta). Dana nakon završetka testa vodenog lavirinta, uređaj otvorenog polja upotrebljen je za merenje količine aktivnog pomeranja miševa (Test otvorenog polja) .

<Test vodenog lavirinta: Isti za grupe (1) do (3)>

[0101] Pripremanje: Crni bazen unurtašnjeg prečnika od 100 cm i visine od 45 cm napunjen je vodom do dubine od 16 cm. Temperatura vode podešena je na 21-23 stepena, uz održavanje bezbojne providnosti bez obojenja titanijum oksidom ili slično. Nije dodat hlor, a nakon svakog ispitnog dana, fekalij su uklanjanje i približno 10 L vode zamenjeno.

[0102] Probni (akvizicioni) test: 15 cm-visoka transparenta platforma potopljena je na položaj 20 cm od zida (30 cm od centra). Deljenjem na 4 kvadranta koji uključuju lokaciju u kojoj je platform potopljena, miševi su nasumično uvedeni iz jednog od 3 kvadranta bez platforme. Ograničenje za svaki test bilo je 60 sekundi, sa 5 testova sprovođenih dnevno. Interval između testova bio je približno 5 minuta. "vreme oslobađanja" do dostizanja platforme, beleženo je kao podatak. Miševi koji se nisu oslobodili u roku od 60 sekundi usmereni su do platforme rukom rukovaoca, a vreme oslobađanja je tretirano kao 60 sekundi. Miš na platformi je uklonjen iz bazena nakon 10 sekundi i pušren da se slobodno ponaša do sledećeg testa, sušeći telo. Rezultati za svakog miša svaki dan beleženi su kao prosečan broj sekundi za broj oslobađanja za 5 testova.

[0103] Akvizicioni test završen je kada su rezultati za kontrolnu grupu (nonTg) stabilizovani, a ispitni test je sproveden sledećeg dana.

[0104] Ispitni test: Dana nakon poslednje dana, platforma je uklonjen bazena, a slobodno plivanje je zabeleženo video kamerom tokom 60 sekundi. Zabeleženi video je posmatran, a vreme tokom kojeg su miševi koji su slobodno plivali, otplivali u kvadrant koji je sadržavao platformu (target kvadrant) između 4 kvadranta, je izmereno i izraženo kao procenat od 60 sekundi. Tokom ovog vremena, plivanje od do 30 sekundi nakon uvođenja u bazen takođe je analizirano.

[0105] Značajan test za probni (akvizicioni) test izvedene je ponovljenom merom i Fisher-ovim PLSD, a značajan test za ispitni test izveden je Fisher-ovim PLSD.

<Test otvorenog polja: Isti za grupe (1) do (3)>

[0106] Uređaj: 5 mm-debela transparentna akrilna ploča upotrebljena za pravljenje 30 × 30 × 30 cm kvadratne kutije, a ona je odložena u zvučno izolovano okruženje.40W žarulja sa žarnom niti smeštena je iznad okruženja odlaganja, a stranica poda osvetljena je osvetljenjem od 110 lux.

[0107] Količina ponašanja: (i) Infracrveni zraci podešeni su na spoljne strane akrilne kutije na mstima 1.5 cm od površine poda, na razmaku od 10 cm. Kada je miš kontinulano blokirao 2 zraka detektovano je kretanje, i izbrojano.

(ii) Površine infracrvenih zraka obezbeđene su na mestima dve suprotne strane, 3.5 cm od površine poda. Kada je miš blokirao deo površine zraka, detektovano je podizanje i izbrojano.

[0108] Test: Svaki miš was podvrgnut je pojedinačnoj 20-minutnoj sesiji. Miš je uveden u centralnu sekciju akrilne kutije i, nakon brzog zatvaranja vrata da bi se proizvelo zvučno izolovano okruženje, započeta je sesija.

[0109] Prvih 10 minuta sesije bili su slobodne aktivnosti pod uslovima svetlosti, dok je poslednjih 10 minuta, osvetljenje ukinuto radi slobodne aktivnosti pod uslovima mraka.

[0110] Analiza: Količina ponašanja svakog miša svakog minuta pokazana je na grafikonu, za kretanje i podizanje.

[0111] Normalna vizuelna percepcija definisana je kao reakcija da se promeni u okruženju u stanje mraka 10 minuta nakon početka sesije, čime miš pokazuje promenu u količini ponašanja.

[0112] Svaka količina ponašanja pod uslovima svetla i mraka, i ukupna količina ponašanja tokom 20 minuta, prikazani su u grafikonu sa stubićima.

[0113] Značajan test je sproveden između grupa, za ukupnu količinu ponašanja kretanja i podizanja.

[0114] Kretanje je glavna spontana količina ponašanja dok je podizanje glavno istraživačko ponašanje, ali zapravo oba pokazatelja su zajednički uticajni (primer: čak i kada se učini da je kretanje redukovano, ako je podizanje povećano tokom tog vremena, ta količina ponašanja ne može se smatrati

redukovanom).

<Imunohistohemijski test: samo za grupu (2)>

[0115] Nakon završetka bihevioralnog testa, 5 miševi su odabrani iz svake grupe i perfusiono-fiksirani formalinom. Nakon ugrađivanjau parafin, tanak isečak je pripremljen iz mozga primenom mikrotoma i tretiran 4 puta ksilenom i etanolom svakih 10 minuta, kao deparafinizciono tretiranje. Zatim je kuvan tokom 30 minuta u puferu limunske kiseline (pH 6) (antigen aktivirajuće tretiranje) i vraćen na sobnu temperaturu, nakon čega je ispran dva puta sa Tris pufer-fiziološkim slanim rasvorom (TS) tokom 10 minuta. Nakon blokiranja tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi sa TS koji sadrži 20% goveđi serum, mišje antihumano sinaptofisin antitelo (SVP-38 razblažena 200-puta sa TS koji sadrži 10% goveđi serum, od Sigma) je montirano, a lečenje je sprovedeno preko noći na 4°C. Nakon ispiranja dva puta sa TS tokom 10 minuta, FITC-obeleženo anti-mišje IgG antitelo (antitelo razblaženo 20-puta sa TS koji sadrži 10% goveđi serum, od Vector) je montirano, a lečenje je sprovedeno na sobnoj temperaturi tokom 60 minuta. Nakon ispiranja dva puta sa TS tokom 10 minuta, VECTASHIELD (Vector) je montiran, i izvedeno je posmatranje mikroskopom. Intenzitet fluorescencije je kvantifikovan i izražen brojevima sa NIH imageJ, i izražen u arbitrarnim jedinicama.

<Rezultati>

1. Efekti svake primene antitela na pogoršanje u pamćenju

(1) pSer413 zečje poliklonalno antitelo

[0116] Rezultati za (1-1) do (1-3) pokazani su na Fig.4 do Fig.7. Ukratko, pasivna imunizacija sa antipSer413 poliklonalnim antitelom značajno je poboljšala pogoršanje pamćenja u mišjem modelu (Tau-Tg) do istog nivoa kao i non-Tg. Na (1-3), bez primećene značajne razlike u aktivnom kretanju i vizuelnoj percepciji između tih grupa.

(2) pSer413 mišje monoklonalno antitelo (1505 antitelo)

[0117] Rezultati za (2-1) do (2-3) pokazani su na Fig.8 do Fig.11. Ukratko, pasivna imunizacija antipSer413 monoklonalnim antitelom značajno je poboljšala pogoršanje pamćenja u mišjem modelu do istog nivoa kao non-Tg. U (2-3), bez primećene značajne razlike u aktivnom kretanju i vizuelnoj percepciji između ovih grupa.

[0118] Na osnovu rezultata (2-1) i (2-2), zaključeno je da je pSer413 epitop zadovoljavajući epitop kao meta terapije pasivne imunizacije, i za poliklonalna antitela i monoklonalna antitela.

(3) pSer396 mišje monoklonalno antitelo (Ta9 antitelo)

4

[0119] Rezultati za (3-1) do (3-3) pokazani su na Fig.12 do Fig.15. Ukratko, Ta9 davanje značajno je poboljšalo pogoršanje pamćenja do istog niva kao non-Tg. In (3-3), bez primećene značajne razlike u aktivnom kretanju i vizuelnoj percepciji između ovih grupa.

[0120] Kada je Ta9 poređeno sa Ta1505, sa druge strane, pronađeno je da je njegov efekat leka slabiji. Iako je antigenski afinitet bio Ta9 > Ta1505 (videti Primere 2 i 3), efekat leka bio je Ta9 < Ta1505 (Primer 5), što sugeriše na značajnu razliku u efektu leka zbog razlika u fosforilacionom epitopu.

[Primer 6] Efekti primene Ta1505 antitela na neuronsku funkciju

[0121] Efekat primene Ta1505 antitela na nivoe sinaptofisina, poznatog kao markera koji reflektuje neuronsku funkciju, ispitan je imunobojenjem anti-sinaptofisin antitela u CA3 regionu hipokampusa, koji je centra memorije. Intenzitet fluorecencije kvantifikovan je putem NIH-Image J.

[0122] Rezultate su pokazani na Fig.16. Sa davanjem Ta1505 antitela, zapažen je oporavak nivoa sinaptofisina u hipokampusu, iako ne u značajnom stepenu.

[Primer 7] Nukleotidno sekvencionisanje cDNK monoklonalnog antitela Ta15 Serije

(1) Prečišćavanje hibridom ukupne RNK

[0123] Uzgajani su hibridomi koji proizvode različita monoklonalna antitela, a 1 mL ISOGEN-a upotrebljeni po bazenčiću ploče sa 6 bazenčića radi liziranja ćelija. Nakon dodavanja 0.2 mL hloroforma lizatu i mešanja u vorteksu, ostavljena je da odstoji na sobnoj temperaturi tokom 2 do 3 minuta.

Centrifugacija je izvedena pri 12,000 o/min, 4°C tokom 10 minuta, i gornji sloj je transferovan u novu epruvetu. Nakon dodavanja 0.5 mL izopropil alkohola i mešanja, mešavina je ostavljena da odstoji na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Zatim je centrifugirana pri 15,000 o/min, 4°C tokom 15 minuta da bi se istaložila ukupna RNK. Nakon dodavanja 1 mL 75% etanola peletu i temeljnog mešanja, centrifugirana je pri 10,000 o/min, 4°C tokom 5 minuta. Pelet je osušen na vazduhu, rastvoren u DNaza/RNaza-slobodnoj vodi, i odložen na -80°C.

(2) Dobijanje cDNK H lanca i L lanca 5'-RACE i 3'-RACE i nukleotidno sekvencionisanje ovih cDNK [0124] Prajmeri su sintetizovani za 5'-RACE (Brza aplifikacija cDNK krajeva) i 3'-RACE, na osnovu poznatih cDNK sekvenci konstantnih regiona mišjih IgG2a i IgG2b H lanaca. Prajmeri su slično sintetizovani za 5'-RACE (Brza aplifikacija cDNK krajeva) i 3'-RACE, na osnovu cDNK sekvence konstantnog regiona mišjeg L lanca.

[0125] Odvojeno, 1 µg ukupne RNK dobijene iz hibridoma upotrebljeno je za sintezu cDNK za 5'-RACE i 3'-RACE primenom SMART-RACE Kopleta (proizvod od Clontech), i 5'-RACE i 3'-RACE su izvedene. PCR reakcija je sprovedena primenom Advantage 2 Polimerase Mix (Clontech), u skladu sa protokolom proizvođača. PCR proizvodi dobijeni sa 5'-RACE i 3'-RACE elektroforezirani su na agaroza gelu, a glavni amplifikovani DNK fragment isečen je iz agaroza gela, umetnut u TA klonirajući vektor (Invitrogen) i upotrebljen za transformisanje E. coli, dobijajući nekoliko klonova. Plazmidi su pripremljeni iz transformanta utvrđenenim postupkom, i određena je nukleotidna sekvenca umetnutog DNK fragmenta.

(3) Dobijanje cDNK pune dužine H lanca i L lanca i nukleotidno sekvencionisanje ovih cDNK [0126] cDNK sekvence koje kodiraju N-terminus i C-terminus H lanca i L lanca su određene na osnovu informacije o nukleotidnoj sekvenci, a napredni i nazadni prajmeri konstruisani su za amplifikaciju sekvence pune dužine. Ovi prajmeri upotrebljeni su za amplifikaciju H lanca i L lanca punih dužina primenom Prime STAR MaxPCR (TaKaRa), a PCR fragmenti su klonirani u pEF4 vektoru. To je primenjeno za konačno određivanje cDNK sekvenci pune dužine.

[0127] Translacija u aminokiselinske sekvence izvedena je na osnovu dobijenih informacija o nukleotidnoj sekvenci, a IgBLAST (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) upotrebljen je za identifikovanje CDR regiona postupkom prema Kabat-u (Kabat, E.A. i Wu, T.T., J. Immunol., 147, 1709-1719, 1991).

[0128] Sekvence dobijenih CDR regiona, navedene su od SEQ ID NO: 14 pa nadalje.

[0129] Informacije koje se tiču CDR sekvenci antitela koje specifično prepoznaje pSer413 dobijene su homologije sa ovim sekvencama (Tabele 4 do 6).

[Tabela 4]

[Tabela 5]

[Primer 8] Bihevioralni test: Efekat dobijenih antitela na miševe sa oslabljenim učećim pamćenjem [0130] Ispitan je efekat davanja sledeća dva antitela na miševe sa oslabljenim učećim pamćenjem, sa doziranjem od 0.1 mg.

(4) Ta1505 (pSer413-prepoznavajuće monoklonalno antitelo): Tau-Tg (linija 784) miševi ili non-Tg miševi, 10 meseci starosti, n = 9-10/grupa

(5) Ta9 (pSer396-prepoznavajuće monoklonalno antitelo): Tau-Tg (linija 784) miševi ili non-Tg miševi, 11 meseci starosti, n = 8-10/grupa

4

[0131] Za ovaj eksperiment upotrebljeni su mužijaci hetero mutant Tau-Tg miševa (linija 784), i njihove non-Tg jedinke istog legla, 10-11 meseci starosti. Grupe su podeljene tako da ne postoje razlike u prosečnoj masi između grupa. Hetero mutant Tau-Tg miševi su oni kojima je dato antitelo razblaženo primenom PBS, jednom nedeljno, ukupno 5 puta, u abdominalnu šupljinu pri 0.1 mg po mišu po davanju. Kao negativna kontrolna grupa, PBS upotrebljen za pripremu antitela, ili mišje IgG monoklonalno antitelo bez reaktivnosti za tau, je ono što je dato u abdominalnu šupljinu pri istoj dozi. Kao pozitivna kontrola, non-Tg jedinke istog legla su one kojima je dat PBS upotrebljen za pripremu antitela, u abdominalnu šupljinu pri istoj dozi.

[0132] Strukture za grupe (4) do (5) prikazane su u nastavku.

(4) <Upotrebljeni miševi>: Mutant Tau-Tg (linija 784), 10 meseci starosti.

<Struktura grupe>

[0133]

Grupa antitela koje se ocenjuje: 0.25 mg/ml anti-tau pSer413 mišjeg monoklonalnog antitela Ta1505 u PBS (n = 10)

Grupa kontrolnog antitela: 0.25 mg/ml anti-Pseudomonas aeruginosa mišjeg monoklonalnog antitela 4C10F4 u PBS (n = 10)

Non-Tg grupa: PBS (n = 9)

(5) <Upotrebljeni miševi>: Mutant Tau-Tg (linija 784), 11 meseci starosti.

<Struktura grupe>

[0134]

Grupa antitela koje se ocenjuje: 0.25 mg/ml anti-tau pSer396 mišjeg monoklonalnog antitela Ta9 u PBS (n = 10)

Grupa kontrolnog antitela: 0.25 mg/ml anti-Pseudomonas aeruginosa monoklonalnog antitela 6F11 u PBS (n = 8)

Non-Tg grupa: PBS (n = 8)

[0135] Od Ponedeljka nedelje nakon konačnog davanja, sproveden je test prostorne referentne memorije primenom Morris-ov vodenog lavirinta (test vodenog lavirinta). Test vodenog lavirinta je sproveden na isti način kao Primer 5.

<Rezultati>

1. Efekti svake primene antitela na pogoršanje u pamćenju

(4) pSer413 mišje monoklonalno antitelo (1505 antitelo)

[0136] Rezultati za Probni test (4-1) i Ispitni test (4-2) pokazani su na Fig.18 i Fig.19. Ukratko, pasivna imunizacija anti-pSer413 monoklonalnim antitelom poboljšala je pogoršanje pamćenja u mišjem modelu do nivoa od 50% ili vše u poređenju sa non-Tg.

[0137] Rezultati (4-1) i (4-2) potvrđuju efekat leka za pSer413 epitop monoklonalno antitelo čak i pri dozi od 0.1 mg.

(5) pSer396 mišje monoklonalno antitelo (Ta9 antitelo)

[0138] Rezultati za Probni test (5-1) i Ispitni test (5-2) pokazani su na Fig.20 i Fig.21. Ukratko, pogoršanje pamćenja nije poboljšano sa Ta9 davanja pri dozi od 0.1 mg.

[0139] Ovi testovi još jasnije sugerišu razliku u efektu leka pri dozi od 0.1 mg, zbog razlika u fosforilacionom epitopu.

[0140] Davanje antitela pri 0.1 mg po mišu odgovara davanju pri dozi od približno 2.5 mg/kg.

[Primer 9] Promena u nivou fosforilisanog Tau u mozgu primenom Ta1505 antitela

[0141] Efekat primene Ta1505 antitela na nivoe fosforilisanog Tau u mozgovima Tau-Tg miševi, ispitan je imunohistološkim bojenjem sa pSer413-prepoznavajućim Ta1505 antitelom i AT8 antitelom (PHF-prepoznavajući pSer202/pThr205 epitop), u regionu hipokampusa, koji su centri memorije.

[0142] Nakon završetka bihevioralnog testa, 5 miševa je odabrano iz svake grupe i perfusiono-fiksirano sa 4% paraformaldehida/PBS. Mozgovi su uklonjeni i učvršćeni u parafinu, a 5 µm tanki isečci pripremljeni su mikrotomom. Nakon tretiranja 4 puta ksilenom i etanolom tokom 10 minuta svaki put, deparafinizaciono tretiranje je izvedeno, a isečci su kuvani (antigen aktivirajuće tretiranje) tokom 10 minuta pri pH 2, sobna temperatura. Nakon restoracije na sobnoj temperaturi, isprani su dva puta Tris-HCl fiziološkimslanim rastvorom (TS) tokom 10 minuta. Zatim je izvedeno blokiranje tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi primenom 20% goveđi serum-sadržavajućeg TS.

[0143] Anti-tau antitela (Ta1505, AT8) razblažena na 1 µg/mL sa 10% goveđi serum- sadržavajućim TS su montirana, radi tretiranja preko noći na 4°C. Nakon ispiranja dva puta sa TS tokom 10 minuta, biotinobeleženo anti-mišje antitelo (Vector Co.) razblaženo 500-puta sa TS koji sadrži 10% goveđi serum je montirano, radi tretiranja na sobnoj temperaturi tokom 60 minuta.

[0144] Nakon ispiranja dva puta sa TS tokom 10 minuta, HRP-obeležen ABC rastvor (Vector Co.) je montiran radi reakcije na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, a nakon dodatnih ispiranja, izvedeno je bojenje diaminobenzidinom (DAB). To je enkapsulirano sa Entellan (Merck) i zapaženo i fotografisano.

[0145] Rezultati imunohistološkog bojenja sa Ta1505 pokazani su na Fig.22 do Fig.24.

[0146] Kao što se može videti na Fig.22, Ta1505-pozitivno Tau bojenje zapaženo je u CA3 regionu hipokapmusa (prva kolona s leva) i CA23 regionu hipokapmusa (druga kolona s leva) kod 5 pojedinaca kontrolno IgG-tretirane grupe, ali su nivoi bojenja u CA3 regionu hipokapmusa (treća kolona s leva) i

4

CA23 regionu hipokapmusa (četvrta kolona s leva) kod 5 pojedinaca Ta1505-tretirane grupe bili jasno niži od kontrolno IgG-tretirane grupe. Ovo potvrđuje da Ta1505 davanje redukuje Ta1505-pozitivan Tau, tj. Ser413-fosforilisan Tau, u CA3 regionu hipokapmusa i CA23 regionu hipokapmusa. Određenije, kontrolno IgG grupa pokazuje akumulirane fine braon tačke, bojenje u debeloj liniji sa leva na desno u CA3. Sa CA23, debela kriva obojena je od gore desno prema levoj strani. Ta1505-tretirana grupa had veoma fine tanke braon tačke, sa debelom linijom bojenja od gore levo prema the dole desno u CA3. With CA23, a debela kriva obojena je od gore desno prema levoj strani. Virtuelno no bojenje primećeno je u četiri CA3 regiona i tri CA23 regiona.

[0147] Na Fig.23 i Fig.24, AT8-pozitivno Tau bojenje primećeno je u regioni korteksa (Perirhinalni korteks (prva kolona s leva na Fig.23), Bočni Entorhinalni Korteks (druga kolona s leva na Fig.23), i Srednji Entorhinalni Korteks (treća kolona s leva na Fig.23)), za pet pojedinaca u kontrolno IgG-tretiranoj grupi.(Bojenje kao braon tačke na Fig.23.)

[0148] Nivoi bojenja u regionima korteksa (Perirhinalni korteks (prva kolona s leva na Fig.24), Bočni Entorhinalni Korteks (druga kolona s leva na Fig.24) i Srednji Entorhinalni Korteks (treća kolona s leva na Fig.24)), jasno su redukovani ispod kontrolno IgG-tretirane grupe, za pet pojedinaca u Ta1505-tretiranoj grupi, do nivoa koji ne pokazuje bojenje.

[0149] Ovo potvrđuje da Ta1505 davanje redukuje Ta1505-pozitivan Tau, tj. Ser413 fosforilisan Tau, u regionima korteksa (Perirhinalni korteks, Bočni Entorhinalni Korteks, Srednji Enotrhinal Korteks).

[0150] Braon tačkasto bojenje je prisutno na Fig.23, ali se virtuelno ne može videti braon tačkasto bojenje na Fig.24.

[0151] Potvrđeno je da primena Ta1505 antitela redukuje Ser413 fosforilisane Tau nivoe u mozgu (= CA3 region hipokapmusa, CA23 region hipokapmusa, PRh, Ent (Bočni, Srednji)).

PRh = Perirhinalni korteks

Ent = Entorhinalni Korteks

[0152] Rezultati imunohistološkog bojenja sa AT8 pokazani su na Fig.25 do Fig.27.

[0153] Kao što se može videti na Fig.25, AT8-pozitivno Tau bojenje zapaženo je u CA3 regionu hipokapmusa (prva kolona s leva) i CA23 regionu hipokapmusa (druga kolona s leva) kod 5 pojedinaca kontrolno IgG-tretirane grupe, ali su nivoi bojenja u CA3 regionu hipokapmusa (treća kolona s leva) i CA23 regionu hipokapmusa (četvrta kolona s leva) kod 5 pojedinaca Ta1505-tretirane grupe bili jasno niži od kontrolno IgG-tretirane grupe. Ovo potvrđuje da Ta1505 davanje redukuje AT8-pozitivan Tau, tj. Ser202/Thr205-fosforilisan Tau, u CA3 regionu hipokapmusa i CA23 regionu hipokapmusa. Određenije, na Fig.25, kontrolno IgG grupa prikazuje akumulirane fine braon tačke, bojenje u debeloj liniji od gore levo ka dole desno, sa CA3. Sa CA23, debela kriva obojena je od gore desno prema levoj strani. Ta1505-tretirana grupa ima veoma fine tanke braon tačke, sa debelom linijom bojenja od gore levo prema dole desno sa CA3. Sa CA23, a debela kriva obojena je od gore desno prema levoj strani.

4

[0154] Na Fig.26, AT8-pozitivan Tau bojenje primećeno je u regionima korteksa (Perirhinalni korteks (prva kolona s leva na Fig.26), Bočni Entorhinalni Korteks (druga kolona s leva na Fig.26), i Srednji Entorhinalni Korteks (treća kolona s leva na Fig.26)), za pet pojedinaca u kontrolno IgG-tretiranoj grupi.(Bojenje kao braon tačke na Fig.26.)

[0155] Na Fig.27, nivoi bojenja u regionima korteksa (Perirhinalni korteks (prva kolona s leva na Fig.27), Bočni Entorhinalni Korteks (druga kolona s leva na Fig.27) i Srednji Entorhinalni Korteks (treća kolona s leva na Fig.27)) jasno su redukovani ispod kontrolno IgG-tretirane grupe, za pet pojedinaca u Ta1505-tretiranoj grupi.(Bojenje kao tanke braon tačke na Fig.27.)

[0156] Ovo potvrđuje da Ta1505 davanje redukuje AT8-pozitivan Tau, tj. Ser202/Thr205 fosforilisan Tau, u regionima korteksa (Perirhinalni korteks, Bočni Entorhinalni Korteks, Srednji Entorhinalni Korteks).

[0157] Potvrđeno je da primena Ta1505 antitela teži da redukuje AT8-prepoznavajuće Ser202/Thr205 fosforilisan Tau nivoe u mozgu (= CA3 region hipokapmusa, CA23 region hipokapmusa, PRh, Ent (Bočni, Srednji)).

[0158] Ovaj rezultat pruža podršku da primena antitela ublažava patologiju u mozgu i poseduje poboljšavajući efekat na pogoršanje pamćenja. Rezultati ukazuju da intraperitonealno dato antitelo dejstvuje u mozgu.

[Primer 10] Efekat primene Ta1505 antitela na Tau nivoe u mozgu

[0159] Primenom AT8 antitela, za koje se smatra da prepoznaje hiperfosforilisan Tau prisutan u PHF (pSer202/pThr205-prepoznavajuće mišje monoklonalno antitelo, Innax Co.), G2 (antihumano specifično N-terminalni region-prepoznavajuće antitelo: zečje poliklonalno antitelo), PHF1 (pSer396/pSer404-prepoznavajuće mišje monoklonalno antitelo, za koj se smatra da prepoznaje hiperfosforilisan Tau prisutan u PHF) i Ta1505, ispitan je efekat primene 1505 antitela na nivoe Tau i hiperfosforilisanog Tau u u homogenatima mozga pomoću Western blot-a primenom antitelo-tretiranih Tau-Tg mišjih homogenaza mozga.

[0160] Sonikacija je izvedena na 100 do 200 mg mišje cerebralne hemisfere u 5-strukoj količini TBS (koji sadrži koktel proteaza inhibitora i koktel fosfataza inhibitora). To je centrifugisano pri 100,000 g tokom 15 minuta na 4°C, a supernatant je sakupljen kao TBS rastvoriva frakcija.

[0161] Talog je sakupljen u 1% sarkozil/TBS (koji sadrži koktel proteaza inhibitora i koktel fosfataza inhibitora), i inkubisan tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. To je centrifugirano na 100,000 g tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi, a supernatant je upotrebljen kao sarkozil rastvoriva frakcija.

[0162] TBS rastvoriva frakcija i sarkozil rastvoriva frakcija elektroforezirane su sa 7% Tris-Acetatnim Gelom i razdvojene, transferovane u PVDF membranu, i podvrgnute blokirajnju preko noći na sobnoj temperaturi sa 1% BSA/3% SkimMilk/0.05% Tween20/TBS. Zatim, rastvor antiteloa reagovan je

4

primenom HRP konjugat antitela kao drugo antitelo, reakcija je sprovedena ECL postupkom, a analiza je izvedena sa LAS3000 analizatorom slike radi kvantifikacije.

[0163] Rezultati su pokazani na Fig.28 i Fig.29.

[0164] For the TBS rastvoriva frakcija, it potvrđen je that Primena Ta1505 antitela značajno je redukuje human Tau (recognized by G2 antitelo), hiperfosforilisan Tau (recognized by AT8 (pS202/pT205 epitope) i PHF1 (pS396/pS404 epitope)) i pS413Tau (recognized by Ta1505) in Tau-Tg miševi brain.

[0165] For the sarkozil rastvoriva frakcija, it potvrđen je that Primena Ta1505 antitela značajno je redukuje hiperfosforilisan Tau (recognized by AT8) in Tau-Tg miševi brain.

[0166] This result obezbeđuje support that primena antitela ameliorates patologija u mozgu i has an poboljšavanje efekat for pogoršanje pamćenja. Rezultate takođe indicate that intraperitoneally kojima je dato antitelo acts u mozgu.

[Primer proizvodnje 1] Tg miševi koji eksprimiraju human normal tip tau (Tau-Tg miševi), as pogoršanje kognitivne funkcije model

[0167] Farmakološki efekat antitela ovog pronalaska na poboljšavanje kognitivne funkcije ispitan je primenom Tg miševa sa karakteristikom koja eksprimira humani normalni tip tau, a određenije isti ekspresioni obrazac kao u ontogenezi ljudi, što je ekspresija samo tipa 3R tau tokom embrionske faze i oba tipa 3R i 4R tau sa kontinulanim rastom, a koji ispoljavavaju početak pogoršanja kognitivne funkcije na oko 6 meseci nakon rođenja. Tg miševi su pripremljeni sledećim postupkom.

[0168] Genska struktura koja je primenjena za pripremanje Tg miševa bila je gen-dodeljujuća nukleinska kiselina sa strukturom prikazanom na Fig.17, koja obuhvata Simian virus 40 (SV40) 5'-intron (0.3 kb), tau gen (Tau; 7.3 kb), SV403'-intron (0.8 kb) i SV40 poliA signal (0.3 kb) u tom redosledur, nadole od αkalmodulin kinaza IIα (CaMKII) promotera (8.5 kb). Tau gen koji je upotrebljen bio je dobijen istim postupkom opisanim od strane Yamashita T. et al. (FEBS Letters, Vol.579, P.241-244, 2005), kao 7.3 kbdug gen koji obuhvata nukleotidnu sekvencu dela koji odgovara eksonima 1 do 9 iz cDNK koja kodira humani tau, nukleotidnu sekvencu koja uključuje deo prvih 18 nukleotida i poslednja 3 kb introna 9, nukleotidnu sekvencu eksona 10, deo prva 3 kb i zadnjih 38 nukleotida introna 10(sa citozinom koji se supstituiše za timin na osnovu broja 16 od 5'-kraja introna 10) i nukleotidnom sekvencom od cDNK koja odgovara eksonima 11 do 13. Tau gen je kloniran na restrikcionom enzimskom EcoRV mestu za pNN265, vektor koji uključuje SV405'-intron i 3'-intron i poli(A) signalnu sekvencu (Choi T et al., Mol. Cell. Biol. vol.11, pp.3070-3074, 1991). DNK fragment koji sadrži SV405'-intron, tau gen, SV403'-intron i poli(A) signalnu sekvencu, isečen je iz dobijenih plazmida sa restrikcionim enzimima XhoI i NotI, a DNK fragment je kloniran u pMM403 vektoru koji uključuje CaMKII promoter (Mayford M et al., Cell vol.81 pp.891-904, 1995). Takođe, fragment gena sa strukturom prikazanom na Fig.17, koji sadrži tau gen, isečen je iz dobijenih plazmida sa restrikcionim enzimom SfiI (17.2 kb), izolovan elektroforezom agaroze,

4

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

Claims (12)

1. Patentni zahtevi 1. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije tauopatije, pri čemu taj terapeutski agens ili profilaktički agens obuhvata, kao aktivni sastojak, monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za tau protein fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1, pri čemu je to vezivanje definisano afinitetom predstavljenim ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od najviše 1 x 10<-6>M, i pri čemu je pomenuto vezivanje za fosforilisan tau protein najmanje 10 puta jače od vezivanja za tau protein koji nije fosforilisan na pomenutom Ser413.
2. 2. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu prema zahtevu 1, u kojem antitelo obuhvata: varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata CDR-H1 sa sekvencom odabranom od SEQ ID NO: 7 ili 8; CDR-H2 sa sekvencom odabranom od SEQ ID NO: 9, 10, 11 ili 12; i CDR-H3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 13; i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDR-L1 sa sekvencom odabranom od SEQ ID NO: 14 ili 15; CDR-L2 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 16; i CDR-L3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 17.
3. 3. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu prema zahtevu 1, u kojem antitelo obuhvata: VH koji obuhvata CDR-H1 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 8; CDR-H2 sa sekvencom koja je najmanje 85% identična sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 9; i CDR-H3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 13; i VL koji obuhvata CDR-L1 sa sekvencom koja je najmanje 85% identična sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 14; CDR-L2 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 16; i CDR-L3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 17.
4. 4. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, u kojem antitelo obuhvata: VH koji obuhvata CDR-H1 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 8; CDR-H2 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 9; i CDR-H3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 13; i VL koji obuhvata CDR-L1 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 14; CDR-L2 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 16; i CDR-L3 sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 17.
5. 5. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 do 4, u kojem antitelo obuhvata: VH sa sekvencom koja je najmanje 85% identična sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 20; i VL sa sekvencom koja je najmanje 85% identična sekvenci predstavljenoj pomoću SEQ ID NO: 26.
6. 6. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, u kojem antitelo obuhvata: VH sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 20; i VL sa sekvencom predstavljenom pomoću SEQ ID NO: 26.
7. 7. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 6, u kojem antitelo predstavlja humanizovano antitelo ili himerno antitelo.
8. 8. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, u kojem je vezivanje antitela za tau protein fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1, najmanje 30 puta, ili najmanje 100 puta jače od vezivanja za tau protein koji nije fosforilisan na pomenutom Ser413.
9. 9. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, u kojem se antitelo vezuje za tau protein fosforilisan na aminokiselinskom ostatku koji odgovara Ser413 iz SEQ ID NO: 1 sa afinitetom predstavljenim pomoću KD od najviše 1x10<-7>M ili najviše 1x10<-8>M.
10. 10. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu se afinitet vezivanja antitela određuje merenjem vezivanja primenom rezonancije površinskog plazmona.
11. 11. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije tauopatije, koji sadrži, kao aktivni sastojak, peptid koji obuhvata deo tau proteina, pri čemu pomenuti peptid obuhvata aminokiseline 410-421 iz SEQ ID NO: 1, gde je aminokiselinski ostatak koji odgovara Ser413 fosforilisan.
12. 12. Terapeutski agens ili profilaktički agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu je tauopatija Alchajmerova bolest, degeneracija kortikalno-bazalnih ganglija, progresivna supranuklearna paraliza, Pikova bolest, demencija argirofilnog zrna (bolest argirofilnog zrna), Multiple sistemska tauopatija sa demencijom (MSTD), frontotemporalna demencija povezana sa hromozomom 17 sa Parkinsonizmom (FTDP-17), demencija neurofibrilarnih petlji, difuzne neurofibrilarne petlje sa kalcifikacijom (DNTC), tauopatija bele mase sa globularnim glialnim inkluzijama (WMT-GGI) ili frontotemporalna lobarna degeneracija sa tau-pozitivnim inkluzijama (FTLD-tau).