RS59827B1 - Metoda za aktiviranje i konjugovanje biomolekula - Google Patents

Metoda za aktiviranje i konjugovanje biomolekula

Info

Publication number
RS59827B1
RS59827B1 RS20191568A RSP20191568A RS59827B1 RS 59827 B1 RS59827 B1 RS 59827B1 RS 20191568 A RS20191568 A RS 20191568A RS P20191568 A RSP20191568 A RS P20191568A RS 59827 B1 RS59827 B1 RS 59827B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
coagulation factor
rfviii
pegylation
peg
conjugation
Prior art date
Application number
RS20191568A
Other languages
English (en)
Inventor
Jens H Vogel
Chi Shung Brian To
Carolina Lucia Bianco
Original Assignee
Bayer Healthcare Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Healthcare Llc filed Critical Bayer Healthcare Llc
Publication of RS59827B1 publication Critical patent/RS59827B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/02—Reverse osmosis; Hyperfiltration ; Nanofiltration
    • B01D61/025—Reverse osmosis; Hyperfiltration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2315/00—Details relating to the membrane module operation
    • B01D2315/10—Cross-flow filtration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2315/00—Details relating to the membrane module operation
    • B01D2315/16—Diafiltration

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na metodu za proizvodnju PEGilisanog konjugata faktora koagulacije u integrisanom sistemu sa tangencijalnim protokom.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Sa napredovanjem biotehnologije, razvijena su biofarmaceutska sredstva kako bi se zadovoljile nezadovoljene medicinske potrebe. Međutim, njihovo poluvreme života in vivo zahteva da pacijenti uzimaju doze češće i/ili veće doze ovih biofarmaceutskih sredstava kako bi se postigao terapeutski ili profilaktički željeni efekat. Dugotrajna intravenska terapija ili učestale injekcije mogu uticati na kvalitet života pacijenta. Različiti polimeri, kao što je polietilen glikol (PEG) se mogu konjugovati u biomolekul (npr. protein) kako bi se poboljšalo poluvreme života i biološka aktivnost velikog broja molekula (Reddy, Ann. Pharmacother. 34:915-923, 2000). Druge koristi konjugovanja polimera obuhvataju (a) poboljšanu stabilnost proizvoda za vreme trajanja procesa proizvodnje; (b) smanjeni renalni klirens (Fung, i dr., Polym. Prepr.38:565-566, 1997); poboljšano ciljanje tumora (Yowell, i dr., Cancer Treat. Rev. 28 Dop. A:3-6, 2002); smanjenu antigenost i imunogenost (Muller, i dr., Br. J.
Haematol. 110:379-384, 2000; Abshire i dr., Blood 96:1709-1715, 2000); i veću toleranciju (Safra i dr., Ann. Oncol. 11:1029-1033, 2000; Judson i dr., Eur. J. Cancer 37:870-877, 2001). PEGilacija je bila primenjena na ljudske faktore rasta (Kim i dr., Biomaterials 23:2311-2317, 2002; Wu i dr., Protein Expr. Purif.48:24-27, 2006), faktor oslobađanja hormona rasta (Piquet i dr., J. Chromatogr.944:141-148, 2002), adenovirusni vektor (Eto i dr., Int. J. Pharm.
354:3-8, 2008) i plazmidnu DNK (Hosseinkhani i dr., J. Control Release, 97:157-171, 2004). Zbog koristi PEGilacije razvijeno je mnogo hemijskih reakcija konjugacije (Roberts, i dr., Adv. Drug Deliv. Rev.54:459-476, 2002) i polimernih derivata (evropski patent br.
1578841). Kako se primena konjugata biomolekul-polimer povećava, neophodno je da se razvije jednostavna jedinična operacija koja se može ponavljati i povećati u razmeri kako bi se zadovoljile potrebe proizvodnje.
REZIME PRONALASKA
[0003] Predmetni pronalazak se odnosi na metodu za proizvodnju konjugata faktora koagulacije koja obuhvata korake aktiviranja faktora koagulacije dovođenjem u kontakt sa sredstvom za aktivaciju; uklanjanja sredstva za aktivaciju; i konjugovanja faktora koagulacije reagovanjem faktora koagulacije sa aktiviranim polimerom; gde su koraci metode obuhvaćeni u integrisanom sistemu za filtraciju sa tangencijalnim protokom i gde je polimer polietilen glikol a sredstvo za aktivaciju je redukciono sredstvo. Metoda može dalje obuhvatati korak separacije konjugata faktora koagulacije od faktora koagulacije koji nije konjugovan. U jednom otelotvorenju, konjugat faktora koagulacije se odvaja od faktora koagulacije koji nije konjugovan ekskluzionom hromatografijom ili jonoizmenjivačkom hromatografijom.
[0004] U sledećem otelotvorenju, redukciono sredstvo je ditiotreitol ili tris 2-karboksietil fosfin.
OPIS SLIKA
[0005]
Slika 1. Elucioni profil hromatografije sa izmenom katjona za kontrolnu PEGilaciju.
Slika 2. SDS-PAGE elucionih maksimuma hromatografije sa izmenom katjona za kontrolnu PEGilaciju.
Slika 3. Ekskluziona hromatografija elucionih maksimuma hromatografije sa izmenom katjona za kontrolnu PEGilaciju.
Slika 4. Elucioni profil hromatografije sa izmenom katjona za PEGilaciju izvršenu u TFF režimu.
Slika 5. Elucioni profili hromatografije sa izmenom katjona za TFF u laboratorijskim uslovima
Slika 6. SEC profili PEGilisanog rFVIII proizvedenog sa TFF u laboratorijskim uslovima.
Slika 7. Elucioni profili hromatografije sa izmenom katjona za TFF u probnoj razmeri.
OPIS PRONALASKA
[0006] Potrebno je napomenuti da se ovde kao i u priloženim patentnim zahtevima koriste oblici jednine „a“, „an“ i „the“ [članovi u engleskom jeziku] koji obuhvataju referencu na množinu, ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Prema tome, na primer, referenca na „sredstvo“ je referenca na jedno ili više sredstava. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je uobičajeno prihvaćeno od strane stručnjaka u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada.
[0007] PEGilacija faktora koagulacije može biti nasumična konjugacija ili konjugacija specifična za mesto. U oba slučaja, faktor koagulacije se obično aktivira kako bi se omogućilo efikasno spajanje PEG. Kod nasumične PEGilacije, PEG može biti kovalentno konjugovan za nasumično aktivirane aminokiselinske ostatke. To obično za rezultat daje smešu mono-PEGilisanih i više puta PEGilisanih biomolekula. Kod PEGilacije specifične za mesto, faktor koagulacije može biti genetski modifikovan tako da se PEG molekul može konjugovati na specifičnom mestu na površini faktora koagulacije. Ovaj pristup minimizira formiranje nus proizvoda i olakšava opterećenje na sledeći korak prečišćavanja koji odvaja proizvod od nus proizvoda.
[0008] Ostaci na faktoru koagulacije izloženi rastvaraču su aktivirani upotrebom redukcionih sredstava kao što su ditiotreitol (DTT) ili tris 2-karboksietil fosfin (TCEP). Nakon redukovanja, PEG molekul može biti povezan za aktivirani ostatak preko kovalentne veze. Može biti neophodno da se ukloni zadržani materijal pre reakcije konjugovanja. Ekskluziona hromatografija (SEC) je uobičajena tehnika za uklanjanje zadržanog materijala u laboratorijskim uslovima.
[0009] Efikasna najsavremenija konjugacija faktora koagulacije u opštem slučaju zahteva više jediničnih operacija, na primer,
• aktiviranje preko inkubiranja/kontrolisanog mešanja sa redukcionim sredstvom, koje se obično vrši u pomešanom sudu kao što je rezervoar za aktiviranje sa mešanjem; • uklanjanje sredstva za aktivaciju, obično ekskluzionom hromatografijom ili drugom hromatografskom metodom;
• konjugovanje preko inkubiranja/kontrolisanog mešanja sa aktiviranim polimerom (kao što je PEG), koje se obično vrši u pomešanom sudu kao što je rezervoar za konjugaciju sa mešanjem; i
• separacija konjugovanog biomolekula od nereagovanih molekula i nus proizvoda hromatografijom, kao što je jonoizmenjivačka hromatografija.
[0010] Takav proces zahteva više sistema, a pri komercijalnoj razmeri, značajan prostor i ručno rukovanje/prenošenje između jediničnih operacija. Dodatno, SEC se teško implementira pri proizvodnji u komercijalnoj razmeri i zahteva podešavanje kao samostalna jedinična operacija.
[0011] Metoda predmetnog pronalaska integriše korake aktiviranja, uklanjanja sredstva za aktivaciju i konjugovanja u jednu jediničnu operaciju upotrebom integrisane filtracije sa tangencijalnim protokom za reagovanje/mešanje i, posle toga, uklanjanje reaktanata. Dok se ciljani faktor koagulacije zadržava primenom membrana od prekida odgovarajuće molekulske mase, fizikohemijski uslovi kao što su koncentracija, pH, provodljivost i vrste pufera se mogu izmeniti pre, tokom ili nakon aktiviranja/konjugovanja. Podešavanje hidrodinamike sistema omogućava podešavanje optimalnih koncentracija i opciono podešavanje koncentracije lokalizovanog većeg reagovanja na površini membrane kako bi se dalje optimizovali procesi aktiviranja i konjugovanja. Metodom se lako upravlja, može se ponavljati, povećati u razmeri i koristiti za farmaceutsku proizvodnju u komercijalnoj razmeri.
[0012] Primeri PEG koji se mogu koristiti u metodi predmetnog pronalaska obuhvataju metoksipolietilen glikol (mPEG), PEG-glicidil etre (Epox-PEG), PEG-oksikarbonilimidazol (COl-PEG), razgranate polietilen glikole, linearne polietilen glikole, račvaste polietilen glikole i super razgranate ili polietilen glikole sa više krakova (star-PEG).
[0013] Polietilen glikol (PEG) obuhvata bilo koji poli(etilen oksid) koji se može rastvarati u vodi. Obično, PEG sadrže sledeću strukturu „--(OCH2CH2)--“ gde je (n) od 2 do 4000. Kako se ovde koristi, PEG takođe obuhvata „--CH2CH2--O(CH2CH2O)--CH2CH2--“ i „(OCH2CH2)O--,“ zavisi od toga da li su krajnji kiseonici pomereni ili ne.
[0014] Polietilen glikol takođe obuhvata strukture koje imaju različite terminalne ili kapa grupe, kao što su, bez ograničenja, hidroksil ili C120 alkoksi grupa. Polietilen glikol takođe predstavlja polimer koji sadrži većinski, odnosno, više od 50% --OCH2CH2-ponavljajućih pod jedinica. U vezi sa specifičnim oblicima, PEG može imati bilo koji broj različitih molekulskih masa, kao i strukture ili geometrije kao što su razgranata, linijska, račvasta i višefunkcionalna.
PRIMERI
[0015] U cilju boljeg razumevanja ovog pronalaska, dati su sledeći primeri.
Primer 1: PEGilacija
[0016] Kod kontrole, tris 2-karboksietil fosfin (TCEP) koncentrovani rastvor je stavljen u 7,2 mL prečišćenog rFVIII rastvora (0,4 µM). Nakon redukovanja, TCEP u rFVIII rastvoru je uklonjen sa SEC upotrebom Superdex-75 kolone. Čvrsti PEG je stavljen u rFVIII rastvor do krajnje koncentracije PEG od 30 µM. rFVIII je inkubiran sa PEG u trajanju od 13 sati pri 2-8°C. Na kraju PEGilacione inkubacije, serija je razblažena 3 puta i stavljena u kolonu od 4 mL za hromatografiju sa izmenjivanjem katjona. rFVIII vezan za kolonu je odvojen i eluiran sa gradijentom.
[0017] U drugoj probi, 695 mL prečišćenog rFVIII rastvora (0,49 µM) je stavljeno u sud za zadržavanje postavke za tangencijalni protok opremljene sa 50 cm<2>filtracione membrane za tangencijalni protok (TFF) od 30 kDa regenerisane celuloze. rFVIII rastvor je prvo koncentrovan do 1,78 µM propuštanjem 500 mL materijala kroz TFF membranu. Nakon koncentrovanja, TCEP št koncentrovani ok rastvor je stavljen u koncentrovani rFVIII rastvor. Redukciono inkubiranje je trajalo 30 minuta. Zadržani unakrsni protok je održavan pri 4 L/min/m<2>dok je propušteni materijal recikliran nazad do suda za zadržavanje pri 0,7 L/min/m<2>. Nakon redukovanja, TCEP u zadržanom materijalu je uklonjen diafiltracijom kroz 5 zapremina PEGilacionog pufera. Za vreme trajanja diafiltracije, uzorci zadržanog i propuštenog materijala su uzeti nakon svake diafilterske zapremine kako bi se analizirali za TCEP koncentraciju. Na kraju diafiltracije za uklanjanje TCEP, čvrsti PEG je stavljen u sud za zadržavanje kako bi se dobila krajnja koncentracija PEG od 39 µM. rFVIII je inkubiran sa PEG u trajanju od približno 2 sata. Za vreme trajanja inkubiranja, izvršeno je mešanje ponovnim cirkulisanjem zadržanog materijala kroz TFF sistem pri 4 L/min/m<2>. Na kraju PEGilacione inkubacije, zadržani materijal je sakupljen i razblažen 4 puta. Deo razblaženog zadržanog materijala je stavljen u kolonu od 5 mL za hromatografiju sa izmenom katjona. rFVIII vezan za kolonu je odvojen i eluiran gradijentnim eluiranjem.
[0018] Frakcije koje su dobijene gradijentnim eluiranjem su analizirane sa SDS-PAGE i analitičkom HPLC-SEC dok su uzorci zadržanog i propuštenog materijala analizirani za TCEP analitičkom HPLC.
[0019] Elucioni profil hromatografije sa izmenom katjona za kontrolni eksperiment je prikazan na Slici 1. Sastoji se od tri eluciona maksimuma gde su Maksimumi 1, 2 i 3 eluirani pri 49,5%, 58% i 63,7% pufera B, respektivno.
[0020] SDS-PAGE je primenjena kako bi se okarakterisali elucioni maksimumi. Kako obeležavanje sa barijum jodom formira kompleks sa polietilen glikolom, SDS-PAGE gel je prvo obeležen sa barijum jodom kako bi se potvrdilo konjugovanje polietilen glikola sa rFVIII. Nakon što je napravljena slika, gel je ponovo obeležen i zatim ponovo obeležen sa Kumasi plavom bojom. SDS-PAGE obeležen sa Kumasi plavom bojom što je prikazano na Slici 2 ukazuje da rFVIII pre PEGilacije sadrži teški lanac (HC) i laki lanac (LC) koji imaju molekulske mase između 82 kDa i 116 kDa. Nakon PEGilacije, laki lanac u rFVIII pri Maksimumu 1 se povećava do više od 182 kDa. Povećanje molekulske mase je zbog konjugovanja polietilen glikola sa lakim lancem za vreme trajanja PEGilacije što je potvrđeno obeležavanjem sa barijum jodom. Maksimum 2 sadrži različite vrste proteina koje nisu PEGilisane. Vrste sakupljene u Maksimumu 3 sadrže teški lanac i laki lanac koji nije PEGilisan.
[0021] Uzorak iz svakog elucionog maksimuma je takođe analiziran sa SEC. Slika 3 prikazuje da su analitička SEC vremena zadržavanja za Maksimum 1 (PEGilisani rFVIII), Maksimum 2 i Maksimum 3 (ne-PEGilisani rFVIII) 16,6 minuta, 17,8 minuta i 19,4 minuta, respektivno. Kako je vreme zadržavanje ne-PEGilisanog rFVIII 2,8 minuta duže nego za PEGilisani rFVIII, analitička SEC se može koristiti kao ortogonalna metoda za potvrđivanje konjugovanja PEG sa rFVIII molekulom.
[0022] Dodatni korak u procesu PEGilacije je uklanjanje reduktanta pre koraka konjugovanja. Tabela 1 prikazuje da zadržani i propušteni materijal sakupljeni u TFF režimu PEGilacije imaju slične koncentracije TCEP na kraju svake diafilterske zapremine. TCEP i kod zadržanog i kod propuštenog materijala je redukovan ispod granice koju analiza može detektovati nakon 4 diafilterske zapremine. Ovo ukazuje da je diafiltracija efikasna za uklanjanje reduktanta.
TABELA 1
[0023] Elucioni profil hromatografije sa izmenom katjona materijala dobijen za PEGilaciju u TFF režimu je prikazan na Slici 4. Slično Slici 1, takođe se sastoji se od tri eluciona maksimuma gde su Maksimumi 1, 2 i 3 eluirani pri 48,3%, 56,1% i 62,8% pufera B, respektivno. Vreme zadržavanja analitičke HPLC-SEC za Maksimum 1 je 15,6 minuta u poređenju sa 18,5 minuta za Maksimum 3. Razlika između vremena zadržavanja (2,9 minuta) između ova dva eluciona maksimuma hromatografije sa izmenom katjona je u skladu sa kontrolom. Ovo pokazuje da proces PEGilacije u TFF režimu može integrisati korake obuhvaćene u konjugaciji biomolekul-polimer u jednom TFF koraku.
Primer 2. Ispitivanje konzistencije
[0024] Izvršeno je nekoliko probi u laboratorijskim uslovima kako bi se procenila konzistentnost procesa PEGilacije u TFF režimu. Zapremine od 700-900 mL prečišćenog rFVIII rastvora su stavljene u Uniflux™ TFF sistem (GE Healthcare, Piscataway, NJ) koji je opremljen sa 50-100 cm<2>30 kDa membrane od regenerisane celuloze (Millipore Corporation, Billerica, MA). rFVIII rastvori su koncentrovani do ciljane koncentracije. TCEP je stavljen u sud za zadržavanje kako bi se dostigla efikasna koncentracija od 250-450 µM i inkubiran je u trajanju od 30 minuta. Nakon redukovanja, TCEP u sistemu je uklonjen diafiltracijom. PEG je stavljen u redukovani rFVIII kako bi se dostigla efikasna koncentracija od 13-26 µM i inkubiran je u trajanju od 10-15 sati. Unakrsni protoci zadržanog i propuštenog materijala koji su korišćeni za vreme koncentrovanja i diafiltracije su bili 6-15 L/min/m<2>i 0,5-2 L/min/m<2>, respektivno. Nakon PEGilacije, zadržani materijali su dobijeni iz TFF sistema, razblaženi i stavljeni u kolonu od 56 mL za hromatografiju sa izmenjivanjem katjona. rFVIII vezan za kolonu je odvojen i eluiran gradijentom. Koncentracija proteina je određena analitičkom SEC-HPLC. Potentnost uzoraka je određena hromogenom analizom.
[0025] Površina membrane koja je korišćena za probe u laboratorijskim uslovima je prikazana u Tabeli. Početne koncentracije rFVIII rastvora koje su korišćene za TFF probe su u opsegu od 35 µg/mL do 55 µg/mL. Rastvori su zatim koncentrovani do 10 puta pre redukovanja i PEGilacije.
TABELA 2
[0026] Elucioni profil hromatografije sa izmenom katjona za TFF probe u laboratorijskim uslovima su prikazani na Slici 5. Ovi profili su slični onima koji su prikazani na Slici 4 koji sadrže PEGilisani rFVIII, rFVIII koji nije pegilisan i druge rFVIII povezane vrste.
[0027] Elucioni profili analitičke HPLC-SEC koji su prikazani na Slici 6 ukazuju da je PEGilisani rFVIII mono-PEGilisan. Vreme zadržavanja HPLC-SEC sažeto u Tabeli 3 prikazuje da je PEGilisani rFVIII eluiran 2,5-2,6 minuta pre nego rFVIII koji nije PEGilisan. Ovo je u skladu sa onim što je uočeno u Primeru 1.
TABELA 3
[0028] Efikasnost PEGilacije TFF proba je izračunata upotrebom potentnosti međuproizvoda procesa. U opsegu je od 48-72% (TABELA) što je uporedivo sa PEGilacijom drugih proteina (Brocchini i dr., Adv. Drug Deliv. Rev.60:3-12, 2008; Schiavon i dr., Farmoco 55:264-269, 2000; Lee i dr., Bioconjug. Chem. 18:1728-1734; 2007). Ovaj primer demonstrira da se PEGilacija u TFF režimu može ponoviti sa efikasnošću PEGilacije koja je uporediva sa onom zabeleženom u literaturi.
Primer 3. PEGilacija u TFF režimu u probnoj razmeri
[0029] Probe PEGilacije u TFF režimu u probnoj razmeri su izvršene kako bi se demonstrirala stabilnost procesa. U ovim probama, približno 25 L rFVIII rastvora je preneto u TFF sistem koji je opremljen sa 0,5 m<2>30 kDa membrane regenerisane celuloze. rFVIII rastvor je koncentrovan i redukovan sa TCEP sa efikasnom koncentracijom od 600 µM. Nakon redukovanja, TCEP je uklonjen diafiltracijom kroz PEGilacioni pufer. PEG je stavljen u redukovani rFVIII kako bi se dostigla efikasna koncentracija od 40 µM. Unakrsni protoci zadržanog i propuštenog materijala koji su korišćeni za vreme koncentrovanja i diafiltracije su bili 7 L/min/m<2>i 1 L/min/m<2>, respektivno. Na kraju PEGilacione inkubacije, serija je razblažena i stavljena u kolonu od 4 L za hromatografiju sa izmenjivanjem katjona. Proteini vezani kolonu su odvojeni i eluirani gradijentom.
[0030] PEGilisani rFVIII je analiziran analitičkom HPLC-SEC dok je efikasnost PEGilacije izračunata na osnovu potentnosti određene hromogenom analizom.
[0031] Elucioni profil hromatografije sa izmenom katjona materijala dobijen za PEGilaciju u TFF režimu u probnoj razmeri je prikazan na Slici 7. Slično onima koji su prikazani u prethodnim primerima, elucioni profili sadrže PEGilisani rFVIII maksimum i druge rFVIII povezane vrste. PEGilisani rFVIII se može odvojiti od drugih vrsta hromatografijom sa izmenom katjona sa odgovarajućim gradijentom.
[0032] Vremena zadržavanja za PEGilisani i ne-PEGilisani rFVIII su sažeta u Tabeli 4.
Razlika između vremena zadržavanja za ove dve rFVIII vrste je 3 minuta. Efikasnost PEGilacije je bila u opsegu 40-55%. Ovo je takođe u skladu sa onim što je prikazano u prethodnim primerima. Ovaj primer demonstrira da se PEGilacija u TFF režimu može povećati u razmeri i da je konzistentna.
TABELA 4

Claims (5)

Patentni zahtevi
1. Metoda za proizvodnju konjugata faktora koagulacije koja obuhvata korake aktiviranja faktora koagulacije dovođenjem u kontakt sa sredstvom za aktivaciju; uklanjanja sredstva za aktivaciju; i
konjugovanja faktora koagulacije reagovanjem faktora koagulacije sa aktiviranim polimerom; gde su koraci metode obuhvaćeni u integrisanom sistemu za filtraciju sa tangencijalnim protokom i,
gde je polimer polietilen glikol, i
gde je sredstvo za aktivaciju redukciono sredstvo.
2. Metoda prema patentnom zahtevu 1, koja dalje obuhvata korak separacije konjugata faktora koagulacije od faktora koagulacije koji nije konjugovan.
3. Metoda prema patentnom zahtevu 2, gde se konjugat faktora koagulacije odvaja od faktora koagulacije koji nije konjugovan ekskluzionom hromatografijom ili jonoizmenjivačkom hromatografijom.
4. Metoda prema jednom ili više patentnih zahteva od 1 do 3, gde je faktor koagulacije rFVIII.
5. Metoda prema jednom ili više patentnih zahteva od 1 do 4, gde je redukciono sredstvo ditiotreitol ili tris 2-karboksietil fosfin.
RS20191568A 2010-02-21 2011-02-21 Metoda za aktiviranje i konjugovanje biomolekula RS59827B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30651310P 2010-02-21 2010-02-21
EP11745404.1A EP2536399B1 (en) 2010-02-21 2011-02-21 Method for activation and conjugation of biomolecules
PCT/US2011/025592 WO2011103531A1 (en) 2010-02-21 2011-02-21 Method for Activation and Conjugation of Biomolecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59827B1 true RS59827B1 (sr) 2020-02-28

Family

ID=44483343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191568A RS59827B1 (sr) 2010-02-21 2011-02-21 Metoda za aktiviranje i konjugovanje biomolekula

Country Status (34)

Country Link
US (1) US9254336B2 (sr)
EP (1) EP2536399B1 (sr)
JP (1) JP5726915B2 (sr)
KR (1) KR101776976B1 (sr)
CN (2) CN105664175B (sr)
AU (1) AU2011217794B2 (sr)
BR (1) BR112012020855B8 (sr)
CA (1) CA2790401C (sr)
CL (1) CL2012002306A1 (sr)
CO (1) CO6592111A2 (sr)
CR (1) CR20120437A (sr)
CU (1) CU20120121A7 (sr)
CY (1) CY1122711T1 (sr)
DK (1) DK2536399T3 (sr)
EA (1) EA201290804A1 (sr)
EC (1) ECSP12012112A (sr)
ES (1) ES2769629T3 (sr)
GT (1) GT201200244A (sr)
HR (1) HRP20192164T1 (sr)
HU (1) HUE047661T2 (sr)
IL (1) IL221447A (sr)
LT (1) LT2536399T (sr)
MX (1) MX2012009674A (sr)
NZ (1) NZ601905A (sr)
PE (1) PE20130003A1 (sr)
PH (2) PH12012501664A1 (sr)
PL (1) PL2536399T3 (sr)
PT (1) PT2536399T (sr)
RS (1) RS59827B1 (sr)
SG (1) SG183309A1 (sr)
SI (1) SI2536399T1 (sr)
UA (1) UA115221C2 (sr)
WO (1) WO2011103531A1 (sr)
ZA (2) ZA201206215B (sr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE481323A (sr) * 1947-04-10
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
AU2014312215B2 (en) 2013-08-28 2020-02-27 Abbvie Stemcentrx Llc Site-specific antibody conjugation methods and compositions
PE20160870A1 (es) 2013-11-06 2016-09-09 Abbvie Stemcentrx Llc Anticuerpos anti-claudina novedosos y metodos de uso
PE20160993A1 (es) 2013-12-12 2016-10-14 Abbvie Stemcentrx Llc Nuevos anticuerpos anti-dpep3 y metodos de uso
PE20161209A1 (es) 2014-02-21 2016-11-10 Abbvie Stemcentrx Llc Conjugados de anticuerpos anti-drosophila similar a delta 3 (anti-dll3) y medicamentos para usarse en el tratamiento contra melanoma
TW201617368A (zh) 2014-09-05 2016-05-16 史坦森特瑞斯公司 新穎抗ｍｆｉ２抗體及使用方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2357009A1 (en) * 2002-07-15 2011-08-17 Board of Regents, The University of Texas System Duramycin peptide binding to anionic phospholipids and aminophospholipids conjugates and their use in treating viral infections
US7384909B2 (en) * 2002-07-15 2008-06-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-viral treatment methods using phosphatidylethanolamine-binding peptides linked to anti-viral agents
EP1578841B2 (en) 2002-12-31 2016-10-12 Nektar Therapeutics AL, Corporation Maleamic acid polymer derivatives and their bioconjugates
US20050175619A1 (en) * 2004-02-05 2005-08-11 Robert Duffy Methods of producing antibody conjugates
KR101468345B1 (ko) * 2004-11-12 2014-12-03 바이엘 헬스케어 엘엘씨 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
US20070173634A1 (en) 2006-01-24 2007-07-26 Olsson Nils U Methods for one-step purification of organic polymers using tangential flow filtration
US20080220448A1 (en) * 2006-09-01 2008-09-11 Blincko Stuart J Antigenic protein conjugates and process for preparing same
US8207298B2 (en) 2008-05-01 2012-06-26 Archemix Corp. Methods of separating biopolymer conjugated molecules from unconjugated molecules
CN102497884A (zh) * 2009-07-27 2012-06-13 巴克斯特国际公司 凝血蛋白缀合物
US20130034573A1 (en) * 2009-12-22 2013-02-07 Celldex Therapeutics, Inc. Vaccine compositions

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012020855A2 (pt) 2017-08-29
CN102970988B (zh) 2016-03-16
WO2011103531A1 (en) 2011-08-25
CL2012002306A1 (es) 2013-01-18
EP2536399B1 (en) 2019-11-20
IL221447A (en) 2015-09-24
US20130040362A1 (en) 2013-02-14
CN102970988A (zh) 2013-03-13
CR20120437A (es) 2012-12-07
PL2536399T3 (pl) 2020-06-29
LT2536399T (lt) 2020-03-10
SG183309A1 (en) 2012-09-27
IL221447A0 (en) 2012-10-31
ZA201405941B (en) 2018-05-31
BR112012020855B1 (pt) 2021-05-04
AU2011217794B2 (en) 2015-01-29
ES2769629T3 (es) 2020-06-26
BR112012020855B8 (pt) 2021-05-25
CN105664175B (zh) 2019-07-23
PH12016501602A1 (en) 2017-06-05
JP2013520441A (ja) 2013-06-06
CY1122711T1 (el) 2021-03-12
EA201290804A1 (ru) 2013-03-29
HK1182330A1 (zh) 2013-11-29
HRP20192164T1 (hr) 2020-03-06
CO6592111A2 (es) 2013-01-02
US9254336B2 (en) 2016-02-09
CU20120121A7 (es) 2013-01-30
DK2536399T3 (da) 2020-02-10
CN105664175A (zh) 2016-06-15
HUE047661T2 (hu) 2020-05-28
JP5726915B2 (ja) 2015-06-03
EP2536399A1 (en) 2012-12-26
MX2012009674A (es) 2012-09-07
ZA201206215B (en) 2014-10-29
NZ601905A (en) 2014-09-26
ECSP12012112A (es) 2012-10-30
AU2011217794A1 (en) 2012-09-20
SI2536399T1 (sl) 2020-02-28
KR20120120966A (ko) 2012-11-02
CA2790401C (en) 2018-05-29
PH12012501664A1 (en) 2012-10-22
HK1225652A1 (zh) 2017-09-15
PE20130003A1 (es) 2013-01-19
KR101776976B1 (ko) 2017-09-08
CA2790401A1 (en) 2011-08-25
UA115221C2 (uk) 2017-10-10
EP2536399A4 (en) 2016-02-24
GT201200244A (es) 2014-09-02
PT2536399T (pt) 2020-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS59827B1 (sr) Metoda za aktiviranje i konjugovanje biomolekula
EP2412744B1 (en) Method for preparing branched functionalised polymers using branched polyol cores
BRPI0720619B1 (pt) Composto de fator ix-poli(etileno glicol) com uma ligação liberável, método para preparar o mesmo e composição
EP2563403A1 (en) Conjugated blood coagulation factor viia
KR102572453B1 (ko) 단백질 가공 처리를 위한 부형제 화합물
TWI281864B (en) N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates and process for their preparation
EP2293818B1 (en) Conjugates of butyrylcholinesterase and a polymer
US20110003741A1 (en) Novel neurturin conjugates for pharmaceutical use
AU2007281998B2 (en) Long half-life recombinant butyrylcholinesterase
CN106632588A (zh) 一种聚乙二醇修饰蛋白的纯化工艺
AU2013202750A1 (en) Method for activation and conjugation of biomolecules
HK1225652B (zh) 用於活化和綴合生物分子的方法
HK1182330B (en) Method for activation and conjugation of biomolecules
EP3487538A1 (en) Conjugates of a factor viii moiety having an oxime-containing linkage
Fee et al. Production of PEGylated proteins
EP1885404A2 (en) Bioconjugation reactions for acylating polyethlene glycol reagents
EP2551263A1 (en) Thiosulfonate compound, reversibly cationizing agent for proteins and/or peptides, and method for solubilization
Shang Purification and synthesis of PEGylated protein
CN103374559A (zh) 一种异型双功能连接剂辅助蛋白质的peg修饰方法
HK1230072A1 (en) Conjugate comprising erythropoietin and a branched polymer structure