RS59834B1

RS59834B1 - Hidrolizati kvasca sa niskim glutenom

Info

Publication number: RS59834B1
Application number: RS20200082A
Authority: RS
Inventors: Van Petrus Norbertus Beelen
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2014-07-01
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2020-02-28
Also published as: CA2951350A1; PL3164500T3; US10604780B2; CN106659217A; EP3164500B1; EP3164500A1; JP2017520244A; CA2951350C; JP6244601B2; CN106659217B; DK3164500T3; WO2016001072A1; US20170152542A1

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na hidrolizate kvasca sa niskim glutenom i proces za njihovo dobijanje koristeći prolin-specifičnu endoproteazu.

Stanje tehnike

[0002] Za proizvodnju ekstrakta kvasca, tipične ćelije pekarskog i torula kvasca mogu se podvrgnuti autolizi. Neki izvori kvasca (npr. potrošeni pivarski kvasac) sadrže ostatke glutena (gliadini). Kao posledica toga, ekstrakti i suspenzije izvedeni iz izvora kvasca koji sadrže gliadine imaju ograničenu upotrebu kao prehrambene namirnice zbog netolerancije na gliadine kod dela stanovništva (celijakija). Primećeno je da tipični ekstrakti kvasca ili autolizati dobijeni iz izvora koji sadrže gliadine (npr. ekstrakti pivarskog kvasca) sadrže gliadine u koncentraciji koja prelazi prihvatljivi prag od 20 ppm po težini.

[0003] Redukcija gliadina iz izvora kvasca koji sadrže gliadine omogućava upotrebu ovih kvasaca i njihovih ekstrakata kao prehrambenih namirnica koje zahtevaju odsustvo niskih koncentracija glutena.

[0004] Problem sa smanjenjem gliadina u kvascu je konkretno smanjenje sadržaja gliadina bez neželjenih nuspojava tretmana. Na primer, nepoželjno je da tretman koji ima za cilj da smanji sadržaj gliadina takođe degradira RNK kvasca.

[0005] US5286630 obelodanjuje ekstrakte kvasca od Candida utilis koji se mogu koristiti kao pojačivači ukusa i emulgatori. Ekstrakt je izolovan zagrevanjem Candida utilis ćelije, prekidanjem ćelija, razdvajanjem prekinutih i izvlačenjem rastvorljivog ekstrakta kvasca.

[0006] WO2005/027953 obelodanjuje upotrebu prolin specifičnih endoproteaza za hidrolizu peptida i proteina koji sadrže 4 do 40 aminokiselinskih ostataka.

[0007] WO2005/067734 obelodanjuje pruža proizvodnje sastava koji sadrži 5'-ribonukleotide u kojima je mikroorganizam podvrgnut autolizi pod uslovima kada značajan deo RNK ostaje u obliku razgradivom na 5'-ribonukleotide, i gde značajan deo RNK ostaje povezan sa fragmentom ćelijskog zida.

[0008] WO2012/110534 obelodanjuje proces za proizvodnju ekstrakta kvasca koji sadrži: a) podvrgavanje kvasca autolizi i b) podvrgavanje autolizata razdvajanju čvrstih materija/tečnosti i oporavak rastvorljivog fragmenta, gde se razdvajanje čvrste tečnosti u koraku b) vrši pri pH manjem od 5,1.

[0009] JP2007049988 obelodanjuje pružanje ekstrakta kvasca upotrebom proteaze, 5'-fosfodiesteraze i 5'-adelidatoeaminaze, što rezultuje povećanjem sadržaja peptida i nukleinske kiseline u hidrolizatima.

[0010] EP2256184 opisuje Saccharomyces cerevisiae mutantni soj koji ima sadržaj RNK od 14% težine ili više na osnovu težine suve ćelije i postupka za proizvodnju kvasca visokog sadržaja RNK korišćenjem tog soja.

[0011] Sada je iznenađujuće otkriveno da gliadini mogu biti uklonjeni iz izvora kvasca koji sadrže gliadine inkubacijom sa prolin-specifičnom endoproteazom tokom procesa hidrolize i/ili autolize. Iznenađujuće je utvrđeno da gliadini mogu efikasno da se hidrolizuju do nivoa ispod 20 ppm po sadržaju suve materije autolizata i ekstrakata kvasca. Dalje, otkriveno je da inkubacija sa prolin-specifičnom endoproteazom tokom procesa hidrolize i/ili autolize ne degradira RNK prisutnu u kvascima.

Definicije

[0012] „Kvasac“ je ovde definisan kao čvrst, kao pasta ili tečni sastav koja sadrži ćelije kvasca. Poželjno ćelije kvasca su iz roda Saccharomyces. Kvasac se može proizvesti postupkom fermentacije, kao što je proces za proizvodnju uobičajenog pekarskog kvasca. Kvasac je poželjno pivarski kvasac, kao što je potrošeni pivarski kvasac koji se može dobiti kao sporedni proizvod procesa proizvodnje piva.

[0013] „Autoliza“ je ovde definisana kao enzimski raspad ćelija kvasca korišćenjem endogenih enzima kvasca i opciono dodatnih egzogenih enzima. Autoliza može rezultovati i autolizom kvasca i ekstraktom kvasca (pogledati definicije u nastavku).

[0014] „Hidroliza“ je ovde definisana kao enzimski raspad ćelija kvasca koristeći samo egzogene enzime. Endogeni enzimi kvasca najpre se inaktiviraju, na primer, toplotnim šokom. Hidroliza može takođe da rezultuje i autolizom kvasca i ekstraktom kvasca (pogledati definicije u nastavku).

[0015] „Hidrolizat kvasca“ je ovde definisan kao varenje kvasca, kao što je potrošeni pivarski kvasac, dobijen autolizom ili hidrolizom kako je ovde ranije definisano, i što rezultuje autolizom kvasca ili ekstraktom kvasca kako je ovde definisano u nastavku.

[0016] „Autolizat kvasca“ je koncentrovani, ne ekstrahovani, delimično rastvorljivi proizvod varenja dobijen iz ćelija pivarskog kvasca, poželjno potrošenih ćelija pivarskog kvasca. Varenje se vrši hidrolizom ili autolizom ćelija kvasca kako je ranije definisano.

Autolizat pivarskog kvasca sadrži i rastvorljive i nerastvorljive komponente dobijene iz cele ćelije kvasca (npr. Food Chemical Codex).

[0017] „Ekstrakt kvasca“ sadrži samo komponente ćelije pivarskog kvasca rastvorljive u vodi, čiji sastav čine prevashodno aminokiseline, peptidi, ugljeni hidrati i soli. Ekstrakt kvasca proizvodi se hidrolizom peptidnih veza pomoću enzima koji se javljaju u jestivom kvascu i/ili dodavanjem enzima hrane (Food Chemical Codex), tj. autolizom i/ili hidrolizom kao što je prethodno definisano.

[0018] „Proteaza“ je ovde definisana kao hidrolaza koja deluje na peptidne veze na proteinskom supstratu na endo-način, tj. razdvajanjem peptidnih veza bilo gde u polipeptidnom lancu za razliku od (egzo) peptidaze koja je ovde definisana kao hidrolaza koja deluje na peptidne veze u proteinskom supstratu na egzo način, tj. deluje blizu krajeva polipeptidnog lanca: aminopeptidaze razdvajaju aminokiseline, id- tri ili viših oligopeptida sa N-terminalne strane polipeptidnog lanca i karboksipeptidaze razdvajajući aminokiseline, ditri ili viših oligopeptida koji formiraju C-terminalnu stranu polipeptidnog lanca.

Endoproteaze su podeljene u podklase na osnovu svog katalitičkog mehanizma: serinske endoproteaze (EC 3.4.21.xx), cisteinske endoproteaze (EC 3.4.22.xx), aspartanske endoproteaze (EC 3.4.23.xx) i metalo-endoproteaze (EC 3.4.24.xx).

[0019] „Prolin-specifična endoproteaza“ je ovde definisana kao proteinski ili oligopeptidni supstrat koji cepa proteine endoproteaze na C-terminalnoj strani prolinskog ostatka u proteinskom ili oligopeptidnom supstratu. prolin-specifična endoproteaza klasifikovana je kao EC 3.4.21.26. Enzim se može dobiti iz različitih izvora, kao što su izvori sisara, bakterije (npr. Flavobacterium) i gljiva (Aspergillus, naročito Aspergillus niger). Enzim od Aspergillus niger je detaljno opisan u WO02/45524, WO02/46381, WO03/104382. Pogodan gljivični enzim od Penicillium chrysogenum obelodanjen je u WO2009/144269. Odgovarajući bakterijski enzim iz Flavobacterium meningosepticum obelodanjen je u WO03068170.

[0020] „Gluten“ je ovde definisan kao proteinski kompozit koji se nalazi u zrnu i podeljen je na gliadin i glutenin proteine.

Detaljan opis pronalaska

[0021] U prvom aspektu, pronalazak pruža proces za dobijanje hidrolizata kvasca, gde proces obuhvata korak dovođenja u dodir hidrolizata kvasca koji sadrži gluten sa prolin-specifičnom endoproteazom klasifikovanom kao EC 3.4.21.26 od Aspergillus niger i fosfodiesterazom za proizvodnju 5'-ribonukleotida što rezultuje stvaranjem hidrolizata kvasca koji sadrži manje od 100 ppm glutena i najmanje 1 ppm glutena, ili gliadin, na bazi suve materije kvasca, bez soli, i koji dalje sadrži 5'-ribonukleotide 5'-GMP i/ili 5'-IMP, gde je ukupna količina 5'-GMP i 5'-IMP najmanje 1,5% na osnovu suve materije, bez NaCl, hidrolizata kvasca. Poželjno, dobijeni hidrolizat kvasca sadrži manje od 50 ppm glutena, poželjnije manje od 40 ppm, poželjnije manje od 30 ppm i poželjnije manje od 20 ppm glutena, ili gliadin, na bazi suve materije kvasca, bez soli. Hidrolizat kvasaca poželjno sadrži najmanje 5 ppm glutena ili gliadina, poželjnije najmanje 4 ppm glutena, ili gliadina, poželjnije najmanje 3 ppm glutena ili gliadina, poželjnije najmanje 2 ppm glutena ili gliadina. Hidrolizat kvasaca sadrži najmanje 1 ppm glutena na bazi suve materije kvasca, bez soli. Pronalazači predmetnog pronalaska iznenađujuće su otkrili da ova prolin-specifična endoproteaza pruža hidrolizat kvasca niskog glutena gde RNK kvasca ili izvedeni 5'ribonukleotidi nisu, ili nisu u značajnoj meri, degradirani i na taj način su dostupni za konverziju u 5'-ribonukleotide za poboljšanje ukusa.

[0022] Proces predmetnog pronalaska je korišćenje prolin-specifične endoproteaze od Aspergillus niger. Ovaj enzim je komercijalno dostupan kao Brewer's Clarex i može se nabaviti od DSM Food Specialties, Delft, The Netherlands.

[0023] Uslovi za korak u kom se koristi prolin-specifična endoproteaza za smanjenje sadržaja glutena u hidrolizatu kvasca, kao što su pH i temperatura, mogu varirati od prolin-specifične endoproteaze do prolin-specifične endoproteaze, ali ih može odabrati stručnjak bez većih problema, na osnovu na enzimskim svojstava koja su poznata u struci za različite prolinspecifične endoproteaze.

[0024] Poželjno, količina prolin-specifične endoproteaze koja je u dodiru sa prisutnim glutenom koji sadrži hidrolizat kvasca je u rasponu većem od nula do 0,5% w/w na suvoj materiji kvasca, bez soli. Još poželjnije, količina prolin-specifične endoproteaze koja je u dodiru sa prisutnim glutenom koji sadrži hidrolizat kvasca je u rasponu od 0,01 do 0,5, poželjnije u rasponu od 0,02 do 0,1 ili 0,01 w/w na suvoj materiji kvasca, bez soli.

[0025] Hidrolizat kvasaca može biti ekstrakt kvasca ili autolizat kvasca kako je prethodno definisano. Kvasac može biti bilo koji pogodan kvasac, i poželjnije je izabran iz rodova Saccharomyces, Brettanomyces, Kluyveromyces, Candida ili Torula, po mogućnosti rod Saccharomyces, još poželjnije Saccharomyces cerevisiae koji se koristi kao pekarski kvasac ili pivarski kvasac Saccharomyces carlsbergensis ili njegov sinonim Saccharomyces pastorianus kao što se koristi u pivarskoj industriji, na primer, za proizvodnju lager piva. U poželjnom otelotvorenju kvasci su pivarski kvasci, i poželjnije potrošeni pivarski kvasci koji su sporedni proizvod procesa proizvodnje piva.

[0026] Hidrolizat kvasaca može se proizvesti iz ćelija kvasca postupcima dobro poznatim u struci, poput autolize ili hidrolize, kao što je prethodno definisano. Ćelije kvasca mogu da sadrže gluten, na primer, jer se u procesu proizvodnje kvasca koristi sirovina koja sadrži gluten. Konkretno pivarski kvasci, poželjnije potrošeni pivarski kvasac, mogu da sadrže zaostali gluten iz ječma ili pšenice koja se koristi u postupku proizvodnje piva.

[0027] U postupku pronalaska se priprema hidrolizat kvasca koji sadrži manje od 100 ppm glutena i najmanje 1 ppm, ili gliadina, na bazi suve materije kvasca, bez soli. Poželjno, dobijeni hidrolizat kvasca sadrži manje od 50 ppm glutena, ili gliadina, poželjnije manje od 40 ppm, poželjnije manje od 30 ppm i poželjnije manje od 20 ppm glutena, ili gliadina, na bazi suve materije kvasca, bez soli. Prolin-specifična endoproteaza koja se koristi u postupku je smanjenje količine glutena koji je prisutan u hidrolizi kvasca razdvajanjem glutena sa specifičnošću opisanom ranije za prolin-specifičnu endoproteazu. Stručnjak će lako razumeti da, kako bi se dobio hidrolizat kvasa sa glutenom nižim od 100 ppm, hidrolizat kvasca podvrgnut koraku sa prolin-specifičnom endoproteazom mora da sadrži više od 100, u suprotnom prolin-specifična endoproteaza nije u mogućnosti da smanji sadržaj glutena. Isto tako, kako bi se dobio hidrolizat kvasa sa glutenom nižim od 50 ppm, hidrolizat kvasca podvrgnut koraku sa prolin-specifičnom endoproteazom mora da sadrži više od 50 ppm i takođe kako bi se dobio hidrolizat kvasa sa glutenom nižim od 40 ppm, hidrolizat kvasca podvrgnut koraku sa prolin-specifičnom endoproteazom mora da sadrži više od 40 ppm i takođe kako bi se dobio hidrolizat kvasa sa glutenom nižim od 30 ppm, hidrolizat kvasca podvrgnut koraku sa prolin-specifičnom endoproteazom mora da sadrži više od 30 ppm i takođe kako bi se dobio hidrolizat kvasa sa glutenom nižim od 20 ppm, hidrolizat kvasca podvrgnut koraku sa prolin-specifičnom endoproteazom mora da sadrži više od 20 ppm. Generalno, hidrolizat kvasaca podvrgnut koraku sa prolin-specifičnom endoproteazom mora da sadrži više glutena nego hidrolizat kvasa dobijen posle koraka u kom prolin-specifična endoproteaza smanjuje sadržaj glutena.

[0028] U predmetnom koraku je uključeno dovođenje u dodir hidrolizata kvasca koji sadrži gluten i prolin-specifične endoproteaze, što rezultuje hidrolizatom kvasca koji sadrži manje od 100 ppm glutena i najmanje 1 ppm glutena na bazi suve materije kvasca, bez soli, i fosfodiesteraze za proizvodnju 5'-ribonukleotida i opciono enzimskog tretmana za pretvaranje 5'-AMP u 5'-IMP. Prednost upotrebe kombinacije fosfodiesteraze sa ovom prolinspecifičnom endoproteazom je u tome što se dobija hidrolizat kvasca sa niskim glutenom sa povećanim količinama 5'-ribonukleotida.

[0029] U drugom aspektu, pronalazak pruža hidrolizat kvasca koji sadrži manje od 100 ppm glutena i najmanje 1 ppm, ili gliadina, na bazi suve materije kvasca, bez soli. Poželjno, dobijeni hidrolizat kvasca sadrži manje od 50 ppm glutena ili gliadina, poželjnije manje od 40 ppm, poželjnije manje od 30 ppm i poželjnije manje od 20 ppm glutena, ili gliadina, na bazi suve materije kvasca, bez soli. Hidrolizat kvasca poželjno može da sadrži najmanje 5 ppm glutena, poželjnije najmanje 4 ppm glutena ili gliadina, poželjnije najmanje 3 ppm glutena ili gliadina, poželjnije najmanje 2 ppm glutena ili gliadina. Hidrolizat kvasaca sadrži najmanje 1 ppm glutena, ili gliadina, na bazi suve materije kvasca, bez soli. Hidrolizat kvasca može se dobiti bilo kojim pogodnim postupkom, ali ga je poželjno ili moguće dobiti postupkom prvog aspekta predmetnog pronalaska.

[0030] Predmetni hidrolizat kvasca dalje sadrži 5'-ribonukleotide. Izraz „5'-ribonukleotidi“ se ovde odnosi na slobodne 5'-ribonukleotide ili njihove soli.5'-IMP, 5'-GMP poznati su po svojstvima poboljšanja ukusa. Oni mogu poboljšati ukus kod određenih vrsta hrane. Stoga je prednost predmetnog hidrolizata kvasca u tome što on pruža svojstva za poboljšanje ukusa u kombinaciji sa malom količinom gliadina i/ili glutena.

[0031] Težinski procenat 5'-ribonukleotida u hidrolizatu kvasca predmetnog pronalaska (% w/w) zasnovan je na težini suve materije hidrolizata kvasa, bez NaCl, i izračunava se kao heptahidrata dinatrijum soli (2Na.7H2O) 5'-ribonucelotida.

[0032] U narednom poželjnom otelotvorenju prvog ili drugog aspekta, predmetni hidrolizat kvasca dalje sadrži 5'-GMP (5'-gvanin monofosfat) i/ili 5'-IMP (5'-inozin monofosfat).

Poželjno, ovaj hidrolizat kvasca sadrži više od 60%, poželjno više od 70%, poželjnije više od 80%, poželjnije više od 90%, poželjnije više od 95% 5'-GMP i/ili 5'-IMP od količine 5'-GMP i/ili 5'-IMP koja bi se maksimalno mogla dobiti uzimajući u obzir količinu RNK koja je prisutna u ćeliji kvasca, od čega je dobijen hidrolizat kvasca.

[0033] Poželjno, ukupna količina 5'-GMP i 5'-IMP u ovom hidrolizatu kvasca je najmanje 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5, 4%, 5% ili najmanje 6% na bazi suve materije, bez NaCl, hidrolizata kvasca. Ako je hidrolizat kvasca autolizat kvasca, ukupna količina 5'-GMP i 5'-IMP je najmanje 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5, 4%, 5% ili najmanje 6% na bazi suve materije, bez NaCl, autolizata kvasca. Ako je predmetni hidrolizat kvasca ekstrakt kvasca, ukupna količina 5'-GMP i 5'-IMP je najmanje 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5, 4%, 5% ili na najmanje 6% na bazi suve materije, bez NaCl, ekstrakta kvasca. Poželjno, ukupna količina 5'-GMP i 5'-IMP u ovom autolizatu kvasca ili ekstraktu kvasca je manja od 10%, poželjno manje od 6%, poželjnije manje od 5% ili manje od 4% na bazi suve materije autolizata kvasaca ili ekstrakta kvasca, bez NaCl.

[0034] Hidrolizat kvasca drugog aspekta predmetnog pronalaska može biti ekstrakt kvasca ili autolizat kvasca kao što je prethodno definisano. Kvasac može biti bilo koji pogodan kvasac i poželjnio je izabran iz rodova Saccharomyces, Brettanomyces, Kluyveromyces, Candida ili Torula, po mogućnosti rod Saccharomyces, još poželjnije Saccharomyces cerevisiae koji se koristi kao pekarski kvasac ili pivarski kvasac Saccharomyces carlsbergensis ili njegov sinonim Saccharomyces pastorianus kao što se koristi u pivarskoj industriji, na primer, za proizvodnju lager piva. U poželjnom otelotvorenju kvasci su pivarski kvasci, i poželjnije potrošeni pivarski kvasci koji su sporedni proizvod procesa proizvodnje piva.

[0035] U trećem aspektu, predmetni pronalazak pruža upotrebu hidrolizata kvasaca ili upotrebu ekstrakta kvasca ili autolizata kvasca drugog aspekta predmetnog pronalaska u reakciji obrade ukusa, u mesnim primenama, ili kao pojačivač ukusa, ili kao poboljšivač ukusa, ili kao nosač prvog ukusa ili za kuhinjske primene.

[0036] U četvrtom aspektu, pronalazak pruža pojačivač ukusa, mesni proizvod, poboljšivač ukusa, nosača prvog ukusa ili kuhinjsku primenu, koji sadrže hidrolizat kvasca ili ekstrakt kvasca ili autolizat kvasca drugog aspekta pronalaska.

MATERIJALI I POSTUPCI

Određivanje glutena

[0037] Količina glutena u hidrolizatu kvasca određena je UPEX ekstrakcijom (univerzalni rastvor za ekstrakciju prolamina i glutelina) glutena/gliadina i kvantifikovanjem ELISA testom u suštini kako je opisano kod M.C. Mena et al. Talanta 91 (2012) pp 33-40 „Comprehensive analysis of gluten in processed foods using a new extraction method and a competitive ELISA based on the R5 antibody“.

[0038] Procedura ekstrakcije glutena zasnovana je na redukciji Tris(2-karboksietil)-fosfin (TCEP) (Sigma-Aldrich art nr.: C4706,The Netherlands) i anjonski surfaktant N-lauroilsarkozin (Sarkosyl) (Sigma-Aldrich art nr.: 61745, The Netherlands) reagenasa u PBS (Sigma-Aldrich art nr.: P3813, The Netherlands).

1. 250 mg hidrolizata suvog kvasca je izmereno i preneseno u 10-ml polipropilensku epruvetu.

2. 2,5 ml UPEX rastvora (5 mM TCEP, 2% N-lauroilsarkozin u PBS, pH 7) je dodati u epruvetu koja sadrži hidrolizat kvasca. kako bi se sprečila inaktivacija redukcionog agensa, UPEX rastvor je pripremljen neposredno pre upotrebe.

3. Epruvete su bile dobro zatvorene, i poklopci su prekriveni filmom kako bi se izbeglo isparavanje.

4. Sadržaj epruveta temeljno je pomešan vrtloženjem u trajanju od 5 do 10 sekundi i epruvete su stavljene na stalak.

5. Epruvete su inkubirane u GL vodenoj kadi: 1003 na 50°C tokom 40 minuta.

6. Epruvete su ostavljene da se hlade 5 minuta na sobnoj temperaturi.

7. 7,5 ml 80% etanola/vode (v/v) je dodato i uzorci su temeljno raspršeni vrtloženjem tokom 10-60 sekundi dok nije postignuta potpuna raspršenost uzorka, i zatim su inkubirani tokom 1 sata na sobnoj temperaturi u rotacionom (glava-preko glave) mikseru (Stuart Scientific Rollermixer tip: SRT2) pri 45 obrtaja/min.

8. Epruvete su centrifugirane u stonoj centrifugi (Eppendorf model 5810R) tokom 10 min na 2500 g na sobnoj temperaturi.

9. Koristeći sveže Pasterove pipete, supernatant iz svake epruvete je prebačen u čistu 10ml polipropilensku cev.

10. Rastvor je analiziran ELISA testom u roku od 24 sata nakon ekstrakcije.

[0039] Za ELISA test korišćen je Ridascreen® Gliadin Competitive komplet isporučen od strane R-Biopharm) (R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany).

PRIMERI

Primer 1

Redukcija gliadina

[0040] Potrošeni pivarski kremni kvasac piva nabavljen je iz pivare u Holandiji. Dobijeni kvasac je zagrejan na 55°C i pH je podešen na 5,3. Alcalase® (Alcalase® sadrži subtilisin endoproteaze Carlsberg od Bacillus licheniformis i proizvodi ga Novozymes, Danska, i kupljen je od Sigma, kataloški broj P4860) je dodat u suspenziju u dozi od 1% w/w na suvoj materiji kvasca. Bez soli. Suspenzija je inkubirana preko noći. Posle inkubacije Alcalase® suspenzija je postavljena na pH 5,3 i podeljena na 4 različita fragmenta. Prolin-specifična endoproteaza dozirana je u rasponu od 0 do 0,5% w/w na suvoj materiji, bez soli, prema Tabeli 1. Suspenzije su održavane na 61°C i inkubirane tokom 15 sati. Posle inkubacije suspenzije su zagrejane kako bi se zaustavila rezidualna aktivnost enzima. Uzorci suspenzija i ekstrakata (nakon što su suspenzije razbistrene) su uzeti i koncentrovani isparavanjem.

Koncentrati su analizirani na sadržaj gliadina pomoću UPEX ekstrakcije i ELISA testa kako je opisano u Materijalima i postupcima.

1

Tabela 1: Efekat doze prolin-specifične endoproteaze

Primer 2

Redukcija gliadina

[0041] Ekstrakt pivarskog kvasca (EKSPRESA 2200S, DSM FOOD SPECIALTIES, Delft, Holandija) u obliku praška je rastvoren u vodi do 10% w/w. PH rastvora je postavljen na 5,3, i temperatura je održavana na 61°C. Uzorak je podeljen u dva fragmenta.

[0042] Prolin-specifična endoproteaza dodata je u jednu od dve bočice koja sadrži ekstrakt kvasca i dozirana je na 0,5% w/w na suvoj materiji kvasca, bez soli. Rastvor je inkubiran tokom 15 sati. Posle inkubacije rastvor je zagrejan do 90°C kako bi se zaustavila rezidualna aktivnost enzima. Dobijeni rastvor je koncentrovan isparavanjem vode. Korišćen koncentrovani uzorak je analiziran ua sadržaj gliadina pomoću UPEX ekstrakcije i ELISA testa kako je opisano u Materijalima i postupcima.

Tabela 2: Dejstvo prolin-specifične endoproteaze

Primer 3

Redukcija RNK od prolin-specifične endoproteaze u poređenju sa proteazama

[0043] U ovom primeru, neželjena degradacija RNK nakon smanjenja sadržaja gliadina sa prolin-specifičnom endoproteazom upoređuje se sa tretmanom komercijalno dostupnim proteazama, koje su takođe pogodne za smanjenje sadržaja gliadina. Pivarski kvasac dobijen iz holandske pivare korišćen je za proizvodnju nukleotida koji sadrži autolizat kvasca sa visokim prinosom solubilitizacije kvasca. Izmerena je RNK kvasca i iznosila je 3,4% na suvoj materiji. Najpre, kvasac je bio podvrgnut toploti tokom 5 minuta na 95°C. Zatim je suva materija rastvorena u dva koraka proteaze. Najpre, Alcalase® (Alcalase® sadrži subtilisin endoproteaze Carlsberg od Bacillus licheniformis i proizvodi ga Novozymes, Danska, i kupljen je od Sigma, kataloški broj P4860) se inkubira na pH 8 i temperaturi od 62°C tokom 6 sati (doza: 0,8% na suvoj materiji). Za drugi tretman proteazom testirano je nekoliko različitih enzima:

• Proteax (dostupan od Amano Enzyme)

• Peptidase R (dostupno od Amano Enzyme)

• Accelerzyme (dostupno od DSM)

• Sumizyme FP (dostupno od Shin Nihon)

• prolin-specifična endoproteaza (Brewers Clarex, iz DSM)

[0044] Te proteaze su odvojeno primenjene u različitim eksperimentima (1% na suvoj materiji) i inkubirane pri pH od 5,2, sa temperaturom od 51,5°C tokom 15 sati. Posle ova dva koraka proteaze, enzimi su bili inaktivirani 85°C toplotnim šokom. RNK je konvertovana inkubacijom sa 5'-fosfodiesterazom (DSM) i deaminazom (Amano) kako bi se dobio 5'GMP i 5'IMP. Inkubacija je bila na pH 5,3 i na 60°C tokom 15 sati. Nakon ovih različitih procesa, količina 5'-GMP i 5'-IMP u uzorcima (izražena kao težinski procenat natrijum-heptahidrata na bazi suve materije bez natrijum-hlorida) je naknadno određena pomoću HPLC prema narednom postupku. 5'-GMP i 5'-IMP su kvantifikovani pomoću HPLC upotrebom Whatman Partisil 10-SAX kolone, fosfatnog pufera pH 3,35 kao eluenta i UV detektovanja.

Koncentracije su izračunate na osnovu 5'-GMP i 5'-IMP standarda. Natrijum-hlorid se određuje merenjem hloridnih jona u uzorku pomoću Jenway merača hlorida PCLM 3 (Jenway, Essex, England) i izračunavanjem odgovarajuće količine natrijum-hlorida.

[0045] Delotvornost proteaza je merena određivanjem prinosa solubilizacije i stepena hidrolize proteina. Rezultati su sumirani u tabeli 3:

Tabela 3:

[0046] Tabela 3 pokazuje da upotreba prolin-specifične endoproteaze daje najmanje 90% 5'-GMP i 5'-IMP očekivane količine 5'-GMP i 5'-IMP, s obzirom na sadržaj RNK u početnom kvascu (3,4%). Prema tome, prolin-specifična endoproteaza može da smanji gluten kao što je prikazano u primerima 1 i 2, dok RNK prisutna u kvascu nije razgrađena i na taj način je dostupna da se pretvori u 5'-ribonukleotide poput 5'-GMP i 5'-IMP. To je iznenađujuće, uzimajući u obzir količinu 5'-GMP i 5'-IMP za ostale proteaze, koje su očigledno takođe degradirale RNK kvasca.

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Proces za pripremu hidrolizata kvasca naznačen time što proces obuhvata korak dovođenja u dodir hidrolizata kvasca koji sadrži gluten sa prolin-specifičnom endoproteazom klasifikovanom kao EC 3.4.21.26 od Aspergillus niger i fosfodiesterazom za proizvodnju 5'-ribonukleotida, što rezultuje stvaranjem hidrolizata kvasca koji sadrži manje od 100 ppm glutena i najmanje 1 ppm glutena na bazi suve materije kvasca, bez soli, i dalje sadrži 5'-ribonukleotide 5'-GMP i/ili 5 ' -IMP, gde je ukupna količina 5'-GMP i 5'-IMP najmanje 1,5% na osnovu suve materije hidrolizata kvasca, bez NaCl.

2. Proces prema patentnom zahtevu 1, gde rezultujući hidrolizat kvasca sadrži manje od 50 ppm glutena, poželjnije manje od 40 ppm, poželjnije manje od 30 ppm i poželjnije manje od 20 ppm glutena na bazi suve materije kvasca, bez soli.

3. Proces prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je hidrolizat kvasca ekstrakt kvasca ili autolizat kvasca.

4. Proces prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je hidrolizat kvasca hidrolizat potrošenog pivarskog kvasca.

5. Proces prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je kvasac vrsta iz rodova Saccharomyces, Brettanomyces, Kluyveromyces, Candida ili Torula, poželjno rod Saccharomyces.

6. Hidrolizat kvasaca koji sadrži manje od 100 ppm glutena i najmanje 1 ppm glutena na bazi suve materije kvasca, bez soli, i dalje sadrži 5'-ribonukleotide.

7. Hidrolizat kvasaca prema patentnom zahtevu 6, koji sadrži manje od 50 ppm glutena i najmanje 1 ppm glutena na bazi suve materije kvasca, bez soli, i dalje sadrži 5'-ribonukleotide.

8. Hidrolizat kvasca prema patentnom zahtevu 6, koji sadrži manje od 40 ppm glutena i najmanje 1 ppm glutena na bazi suve materije kvasca, bez soli, i dalje sadrži 5'-ribonukleotide.

9. Hidrolizat kvasaca prema patentnom zahtevu 6, koji sadrži manje od 30 ppm glutena i najmanje 1 ppm glutena na bazi suve materije kvasca, bez soli, i dalje sadrži 5'-ribonukleotide.

10. Hidrolizat kvasca prema patentnom zahtevu 6, koji sadrži manje od 20 ppm glutena i najmanje 1 ppm glutena na bazi suve materije kvasca, bez soli, i dalje sadrži 5'-ribonukleotide.

11. Hidrolizat kvasaca prema bilo kom patentnom zahtevu 6 do 10, koji dalje sadrži 5'-GMP i 5'-IMP, poželjno je da ukupna količina 5'-GMP i 5'-IMP iznosi najmanje 2% na osnovu suve materije hidrolizata kvasca, bez NaCl.

12. Hidrolizat kvasa kvasaca prema bilo kom patentnom zahtevu 6 do 11, gde je hidrolizat kvasca ekstrakt kvasca ili autolizat kvasca.

13. Upotreba hidrolizata kvasaca prema bilo kom patentnom zahtevu 6 do 11 ili ekstrakta kvasca ili autolizata kvasca prema patentnom zahtevu 12, u reakciji obrade ukusa, u mesnim primenama, ili kao pojačivač ukusa, ili kao poboljšivač ukusa, ili kao nosač prvog ukusa ili za kuhinjske primene.

14. Pojačivač ukusa, mesni proizvod, poboljšivač ukusa, nosač prvog ukusa ili kuhinjska primena, koji sadrži hidrolizat kvasca prema bilo kom patentnom zahtevu 6 do 11, ili ekstrakt kvasca ili autolizat kvasca prema patentnom zahtevu 12.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5

1