RS59923B1 - Ekspresioni kertridž za transformaciju eukariotske ćelije, postupak za transformaciju eukariotske ćelije, genetički modifikovani organizam i postupak za proizvodnju biogoriva i/ili biohemikalija i biogoriva koja su proizvedena na taj način - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na biogoriva, biohemikalije i postupke za njihovo dobijanje. Konkretnije, predmetni pronalazak obezbeđuje tehnička rešenja za proizvodnju goriva druge generacije na bazi konverzije biljne biomase, poželjno od polimera biljnog ćelijskog zida. Osim drugih ciljeva, predmetna tehnologija opisuje ekspresionu kasetu za transformaciju eukariotskih ćelija i genetički modifikovanih mikroorganizama, sa efikasnim učinkom pri konverziji šećera prisutnih u biljnoj biomasi u biohemikalije i/ili biogoriva. Mikroorganizam prema predmetnom pronalasku prošao je kroz postupak poboljšanja putem evolucionog inženjeringa kako bi mu se povećala potrošnja ksiloze, čime se poboljšava njegov učinak na industrijskoj skali. Takođe su opisani postupak za dobijanje biogoriva i/ili biohemikalija i na taj način dobijeni proizvodi.

Osnov pronalaska

[0002] Potreba da se svetska matrica goriva zasnovana na fosilnim izvorima zameni obnovljivim alternativama, učinila je proizvodnju goriva druge generacije, na primer, etanola, jednom od najperspektivnijih tehnologija u fazi razvoja. Postupak se sastoji od konverzije polimera koji obrazuju biljnu biomasu, uglavnom onih koji su prisutni u ćelijskom zidu, kao što su celuloza, hemiceluloza i lignin, u biogoriva i/ili biohemikalije.

[0003] Biljna biomasa je složena mešavina hemijski različitih jedinjenja, koja može da se razdvoji na frakcije, dajući tako komponente sa specifičnim aplikacijama. Dakle, na isti način na koji petrohemijska rafinerija proizvodi niz veoma raznovrsnih proizvoda koji se dobijaju iz sirove nafte, tako se isti principi mogu primeniti i na biorafinerije, odnosno, na rafinerije koje se zasnivaju na biomasi (Santos, L. V.; Pereira, G. A. G. Petroquimica verde - Anais do Simpósio Microrganismos em Agroenergia: da Prospecção aos Bioprocessos. Editora Embrapa. ISSN 2177-4439, 2013).

[0004] Premda upotreba biljne biomase kao izvora šećera sa sposobnošću fermentacije predstavlja perspektivnu i održivu alternativu, neophodno je da budu prevaziđeni neki izazovi, kao što je dostupnost šećera iz biljnog ćelijskog zida. Ovaj postupak može da se odvija kroz delovanje hidrolitičkih enzima (celulaza i hemicelulaza), čime se obezbeđuju monomeri šećera (heksoze i pentoze), koje naknadno metabolišu mikroorganizmi kako bi obrazovali biohemikalije i biogoriva.

[0005] Međutim, mikroorganizmi koji su prirodno sposobni da troše šećere prisutne u lancima celuloze ili hemiceluloze, u principu nemaju efikasnu iskoristljivost na industrijskoj skali. Dakle, neophodno je da se razviju mikroorganizmi sa sposobnošću da na industrijskoj skali efikasno koriste ove šećere iz biljnog ćelijskog zida, kako je opisano u predmetnom pronalasku.

[0006] Opisi upotrebe mikroorganizama kao efikasnih platformi za konverziju šećera iz biomase u proizvode velike dodate vrednosti, široko su prisutni. U tom smisli, kvasac Saccharomyces cerevisiae dobio je istaknutu ulogu zahvaljujući svojoj robusnosti i tolerantnosti u uslovima industrijske fermentacije. Lakoća genetičke manipulacije ovim organizmom i upotreba metaboličkih oruđa za inženjering, u sadejstvu sa biologijom sistema i sintetičkom biologijom, omogućilo je uključivanje novih metaboličkih puteva za proizvodnju goriva i hemikalija kao što su etanol, biobutanol, biodizel, 1,2-propandiol, ćilibarna kiselina, pirogrožđana kiselina, između ostalih [Cellular and Molecular Life Sciences, 69(16):2671-90, 2012].

[0007] Divlji sojevi S. cerevisae prirodno nisu u stanju da fermentišu pentoze, kao što je na primer ksiloza, koje su prisutne u biomasi. Međutim, u nekoliko studija već su obavljeni postupci metaboličkog inženjeringa u S. cerevisiae putem uvođenja metaboličkih puteva za potrošnju ksiloze, sa fokusom na dva glavna puta: put ksiloza reduktaze – ksilitol dehidrogenaze (XR-XDH) i put ksiloza izomeraze (XI).

[0008] Među sprovedenim studijama, uvođenje gena koji kodira enzim ksiloza izomerazu (XI) omogućava soju da prezentuje viši prinos prilikom proizvodnje alkohola i/ili kiselina nego kada je modifikovan drugim genom, kao na primer, genom koji kodira ksiloza reduktazu ili ksilitol dehidrogenazu, pošto je prisutna manja akumulacija neželjenih sporednih proizvoda, kao što su ksilitol i glicerol [2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664].

[0009] Put XR-XDH, prisutan u eukariotskim mikroorganizmima, sastoji se od dve redoks reakcije u kojima se ksiloza redukuje u ksilitol delovanjem enzima ksiloza reduktaze (XR), u reakciji koja je posredovana pomoću NADPH/NADH, a zatim se ksilitol oksiduje do ksiluloze pomoću enzima ksilitol dehidrogenaze, (XDH), što je isključivo posredovano pomoću NAD<+>. Kofaktor NADPH uglavnom se regeneriše u oksidativnoj fazi puta petozofosfata, uz proizvodnju CO

2. Osim toga, NAD se uglavnom regeneriše u respiratornom lancu, gde je O2krajnji akceptor elektrona. U uslovima ograničenih koncentracija kiseonika, ne dolazi do reoksidacije celokupnog NAD+ , što dovodi do redoks neravnoteže i akumulacije ksilitola, a što direktno utiče na krajnji prinos etanola [Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v.12, n.1, p.49-59, 2002]. Pored ksilitola, drugi obrazovani sporedni proizvod je glicerol, usled reoksidacije viška NADH pomoću XDH [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004].

[0010] Put ksiloza izomeraze (XI), koji je češći kod prokariota, odvija se u samo jednom koraku, čime se izbegava redoks neravnoteža i obrazovanje sporednih proizvoda koji smanjuju prinos etanola. Tokom nekoliko decenija, pokušaji da se dobije heterologa ekspresija bakterijskog XI u S. cerevisiae nisu bili uspešni [Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v.32, n.2, p.252-259, 2003]. Godine 2003., funkcionalnom ekspresijom ksiloza izomeraze anaerobne gljive Piromyces sp. u S. cerevisiae [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.1, p.69-78, 2003], a u 2009., gljive Orpinomyces sp. [Applied Microbiology and Biotechnology, Heidelberg, v.82, n.6, p.

1067-1078, 2009], dobijeni su mutanti koji su bili u stanju da rastu u ksilozi kao jedinom izvoru ugljenika, sa visokim aktivnostima ovih enzima, višim prinosom u proizvodnji etanola, nižom proizvodnjom i nagomilavanjem intermedijernih metabolita i sa manje kataboličke represije u medijumu koji sadrži glukozu i ksilozu [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004; FEMS Yeast Research, Delft, v.5, n.4, p.399-409, 2005a; FEMS Yeast Research, Delft, v.5, n.10, p.925-934, 2005b]. Put XR-XDH ima inicijalno višu produktivnost, proizvodeći etanol brže, samo zahvaljujući inserciji gena odgovornih za konverziju ksiloze, međutim, put XI ima viši prinos jer ne nagomilava sporedne proizvode [Microbial Cell Factories, Londres, v.6, n.5, p.1-10, 2007].

[0011] Mnogi dokumenti, kao na primer, WO2006/009434, WO2011/153516, US8399215, EP2679686 i WO2014018552 opisuju mikroorganizme koji su u stanju da koriste pentoze, konkretnije, ksilozu, kao izvor ugljenika. Da bi mogli da troše ksilozu, neophodno je da mikroorganizmi budu genetički modifikovani najmanje dodavanjem gena koji kodira ksiloza izomerazu. Strategija za povećanje produktivnosti može da bude preterana ekspresija gena koji kodiraju ksilulokinazu i gena u putu pentozofosfata: transketolaze, riboza 5-fosfat izomeraze, riboza 5-fosfat epimeraze i transaldolaze. Osim toga, može da se sprovede inaktivacija gena koji kodira aldoza reduktazu (GRE3), što za cilj ima manje nagomilavanje ksilitola i viši prinos etanola.

[0012] Dokument WO2009/109633 opisuje ćeliju koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira ksiloza izomerazu, pri čemu je ta nukleotidna sekvenca heterologa za domaćina. Ćelija može da se koristi u postupku za proizvodnju fermentacionog proizvoda, kao što je etanol. Ovaj postupak može da obuhvata fermentaciju medijuma koji sadrži izvor ksiloze pomoću ćelije prema pronalasku, tako da ćelija fermentiše ksilozu do proizvoda fermentacije. Sa druge strane, dokument WO2009/109633 ne opisuje ekspresionu kasetu ili genetički modifikovan mikroorganizam, koji su opisani u predmetnom pronalasku.

[0013] Dokument WO99/54477 opisuje vektore dobijene genetičkim inženjeringom, i rekombinantne ćelije koje sadrže ove vektore ili delove ovih vektora . Vektori sadrže mutirani oblik gena koji kodira enzim aldoza reduktazu (AR), gde je na vektoru prisutan samo deo gena. Mutirana sekvenca aldoza reduktaze služi kao mesto homologog krosing-overa sa vektorskim sekvencama i genomom ćelije domaćina. Rekombinantnim ćelijama koje su napravljene upotrebom vektora nedostaje gen za aldoza reduktazu i sposobne su da u velikim količinama fermentišu hidrolizate lignoceluloze do etanola. Ovaj dokument takođe obezbeđuje rekombinantne vektore i ćelije sa višestrukim kopijama gena koji kodiraju enzime uključene u konverziju lignoceluloze ili hidrolizata lignoceluloze do etanola. Dokument takođe obezbeđuje postupke za pravljenje rekombinantnih ćelija i postupke za efikasnu proizvodnju etanola od kompozicija koje sadrže lignocelulozu. Sa druge strane, dokument WO99/54477 ne opisuje ekspresionu kasetu ili genetički modifikovan mikroorganizam, koji su opisani u predmetnom pronalasku.

[0014] Dakle, literatura pokazuje da je povećana ekspresija gena koji su prethodno opisani u tekstu i koji favorizuju konverziju ksiloze u etanol, neophodna kako bi potrošnja ovog šećera bila efikasna. Dakle, mikroorganizmi prethodno opisani u oblasti, koji su genetički modifikovani radi potrošnje ksiloze mogu da imaju (ali ne nužno) genetičke modifikacije prethodno opisane u tekstu. Ono što u osnovi razlikuje efikasnost i produktivnost anaerobne konverzije ksiloze u biogoriva i/ili biohemikalije, koju svaka od njih prezentuje, je to u kakvom se obliku i na kom mestu ovi geni inkorporiraju u genom mikroorganizma, uzimajući u obzir najbolju moguću kombinaciju između ovih gena i respektivnih promotora koji ih regulišu, kao i odgovarajući izbor nukleotidne sekvence koja kodira ksiloza izomerazu, budući da je to glavni gen koji, kada je eksprimiran, omogućava potrošnju ksiloze za svaki modifikovani mikroorganizam, uz adaptaciju mikroorganizma kroz evoluciju. Dakle, predmetni pronalazak pokazuje prednost zbog boljeg prinosa i bolje produktivnosti od mikroorganizama koji su prethodno opisani u stanju tehnike.

[0015] Predmetni pronalazak osim drugih objekata opisuje i genetički modifikovan mikroorganizam za uključivanje gena pentozofosfatnog puta, kao i gena u putu ksilulokinaze, i inaktivaciju gena za aldoza reduktazu, kao što je opisano u dokumentima WO2006/009434, WO2011/153516, US8399215, EP2679686 i WO2014018552. Genetički modifikovan mikroorganizam prema predmetnom pronalasku ima prednost po kojoj se razlikuje od prethodnog, a to je činjenica da su geni efikasnije kombinovani sa svojim promotorima, kao i da su inserirani u pogodnije lokacije u genomu mikroorganizma, u poređenju sa prethodno pominjanim dokumentima. Dodatno, pronalazači su optimizovali ovde inserirani gen koji kodira ksiloza izomerazu, preferencijalnim kodonima mikroorganizma u koji je prvobitno inseriran, što je u ovom slučaju mikroorganizam vrste Saccharomyces cerevisiae. U predmetnom dokumentu, geni se inseriraju u mikroorganizam putem homologe rekombinacije, a zatim interaguju sa njegovim genomom.

[0016] Konkretno, dobijanje nekih linija koje su u stanju da deluju na industrijskoj skali, bilo je uspešno, kad je u pitanju proizvodnja etanola. Međutim, ovi sojevi su i dalje podložni tome da njihov učinak prilikom fermentacije bude ugrožen ili čak zamenjen divljim linijama, kada su izloženi stresnim uslovima brazilskog postupka proizvodnje etanola.

[0017] U brazilskom postupku fermentacije za proizvodnju etanola, uobičajeno je da biljke sprovode intenzivnu ponovljenu upotrebu ćelija kvasca koje se koriste za fermentaciju, što je proces poznat kao recikliranje. U ovom procesu i do 90% kvasaca iz jedne fermentacije može ponovo da se koristi u drugoj, čime se u fermentoru dobijaju velike gustine ćelija, i čime se vreme fermentisanja jako skraćuje [FEMS yeast research, 8(7): 1155-63, 2008].

[0018] U nekim industrijskim postrojenjima, recikliranje može da se odvija tokom celog perioda sakupljanja, sa trajanjem i do devet meseci. Tako produženi period recikliranja, uz kontinuirano uvođenje mikrobijalnog zagađenja u sistem, čini okruženje u kome se fermentacija odvija veoma kompetitivnim, namećući sojevima kvasca koji se koriste u postupku ozbiljne biotičke i abiotičke tenzije [International Sugar Journal, Londres, v.112, p.86-89, 2010]. Ovo kompetitivno okruženje dovodi do zamene kvasaca koji su otpočeli proces, divljim kvascima. Do ovoga dolazi zato što se divlji kvasci nalaze u šećernoj trski i, ubacuju se, dakle, zajedno sa njom u proces fermentacije, što se završava kontaminacijom celokupnog idustrijskog postupka [FEMS yeast research, 8(7):1155-63, 2008].

[0019] Pored toga, neke studije su pokazale da kvasci koji su otpočeli proces fermentacije i koji su na kraju zamenjeni divljim kvascima, takođe nisu u stanju da prežive stresne situacije industrijskog procesa fermentacije, kao što su visoka koncentracija etanola, visoka temperatura, osmotski stres usled prisustva soli i šećera, kiselost, sulfiti i bakterijska kontaminacija [FEMS yeast research, 8(7):1155-63, 2008]. Dakle, dobijanje linije koja ima efikasan kapacitet rezistentnosti na agresivne industrijske procese fermentacije, i koja je podložna genetičkim modifikacijama kojima stiče osobine od interesa, kao što je trošenje pentoza, konkretnije ksiloze, nije trivijalan postupak.

[0020] Mikroorganizam opisan u predmetnom pronalasku ima, stoga, tu prednost da je prilagođen za Brazilski postupak industrijske fermentacije, a pokazano je i da je različito efikasan pri konverziji šećera od biljne biomase, uglavnom lignoceluloznog materijala, do biogoriva i/ili biohemikalija, odnosno, da daje prinos dovoljan za primenu na industrijskoj skali, čak i u stresnim uslovima Brazilskog postupka fermentacije. Dodatno, mikroorganizam opisan u predmetnom pronalasku pokazuje svojstva interesantna za industriju, kao što su: predstavlja soj kod koga nema flokulacije, pokazuje visok prinos etanola, nisko obrazovanje glicerola i ksilitola, visoku vijabilnost, visoku stopu rasta, odsustvo stvaranja pene, između ostalog.

Kratak opis pronalaska

[0021] Predmetni pronalazak obezbeđuje ekspresionu kasetu za transformaciju eukariotske ćelije, koja se odlikuje time što sadrži kombinaciju sledećih ekspresionih kaseta: strana 7a [0022] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za transformaciju eukariotske ćelije koji obuhvata uvođenje najmanje ekspresione kasete koja je definisana predmetnim pronalaskom, u ćeliju koja se transformiše.

[0023] Predmetni pronalazak obezbeđuje genetički modifikovan organizam koji sadrži najmanje ekspresionu kasetu definisanu predmetnim pronalaskom.

a) ekspresionu kasetu koja sadrži gen koji kodira ksiloza izomerazu sekvence SEQ ID NO: 1, TDH1 promotor nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 2, i TDH1 terminator nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 3;

b) ekspresionu kasetu koja sadrži promotor ADH1 predstavljen sekvencom SEQ ID NO: 8, XKS1 gen predstavljen sekvencom SEQ ID NO: 9 i terminator ADH1 predstavljen sekvencom SEQ ID NO: 10;

c) ekspresionu kasetu koja sadrži promotor TDH1 nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 2, TAL1 gen sekvence SEQ ID NO: 5, terminator gen TDH1 sekvence SEQ ID NO: 3, nakon koga sledi promotor PGK1 sekvence SEQ ID NO: 6, RKI1 gen (SEQ ID NO: 7) i terminator nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 13; i

d) ekspresionu kasetu koja sadrži promotor TDH1 sekvence SEQ ID NO: 02, TKL1 gen sekvence SEQ ID NO: 11, kodirajući gen riboza 5-fosfat epimeraze (SEQ ID NO: 12), terminator TDH1 sekvence SEQ ID NO: 3, nakon koga sledi promotor PGK1 sekvence SEQ ID NO: 6, gen RPE1 sekvence SEQ ID NO: 12 i terminator PGK1 sekvence SEQ ID NO: 13;

pri čemu je pomenuta ekspresiona kaseta funkcionalna u eukariotskoj ćeliji.

[0024] Predmetni pronalazak obezbeđuje genetički modifikovan mikroorganizam Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

[0025] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju biogoriva i/ili biohemikalija, koji obuhvata korak kultivacije mikroorganizma, kao što je definisan predmetnim pronalaskom.

[0026] Predmetni pronalazak obezbeđuje genetički modifikovan organizam sa efikasnim učinkom pri fermentaciji, u konverziji šećera sadržanih u biljnoj biomasi u biogoriva i/ili biohemikalije, u poređenju sa istim mikroorganizmom bez genetičkih modifikacija opisanih u predmetnom dokumentu. Konkretnije, genetički modifikovan mikroorganizam opisan u predmetnom pronalasku odnosi se na bilo koju eukariotsku ćeliju koja je podložna genetičkoj transformaciji, a koja može da se sastoji od kvasaca ili filamentoznih gljiva, poželjno kvasca iz roda Saccharomyces.

[0027] Mikroorganizam prema pronalasku obezbeđuje efikasan učinak pri konverziji šećera prisutnih u biljnoj biomasi, poželjno u lignoceluloznom materijalu, u biohemikalije i/ili biogoriva. Tako, u jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak opisuje mikroorganizam vrste Saccharomyces cerevisiae koji je efikasniji od svog pandana bez genetičkih modifikacija, kada je u pitanju konverzija pentoza prisutnih u lignoceluloznom materijalu u alkohole i/ili biohemikalije, kao što je, na primer, ćilibarna kiselina, jabučna kiselina, 1,3-propandiol, 1,2-propandiol, butanol, izobutanol, biodizel, 1,4-butandiol, 2,3-butandiol, PHB - poli(butirat hidroksid), međutim, bez ograničenja na njih, a da međutim nisu ograničeni na njih.

[0028] Mikroorganizam prema predmetnom pronalasku je genetički modifikovan uvođenjem sekvence nukleotida koja kodira peptid sa funkcijom ksiloza izomeraze. Ova sekvenca je originalno opisana u Orpinomyces sp. [Appl Microbiol Biotechnol, 82:1067-1078, 2009] (XI, EC 5.3.1.5), a ovi pronalazači su je manuelno optimizovali kodonima koji se preferencijalno koriste za Saccharomyces cerevisiae. Optimizacija obuhvata poređenje između kodona koji su prisutni u sekvenci za Orpinomyces sa kodonima koji se preferencijalno koriste za Saccharomyces sa ciljem da se isti zamene, a da se ipak zadrži udeo kodona prisutan u Saccharomyces. Optimizovana sekvenca ksiloza izomeraze opisana u predmetnom pronalasku (predstavljena u SEQ ID NO: 1) nije, međutim, prirodna, i različita je od već opisanih prirodnih sekvenci ksiloza izomeraze. SEQ ID NO: 1 može takođe da bude korisna za inserciju u eukariotsku ćeliju i eksprimirana u aktivnom obliku. Nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 1 može da bude prisutna u genomu kao jedna kopija ili u vidu višestrukih kopija.

[0029] Genetički modifikovana eukariotska ćelija domaćina (ciljna ćelija) može dodatno da sadrži gene pentozofosfatnog puta, sa ciljem da se poveća brzina konverzije ksiloze. Međutim, uz inserciju SEQ ID NO: 1 u ćeliju domaćina, predmetni pronalazak opisuje genetičke modifikacije u istoj ćeliji koje za cilj imaju favorizovanje metaboličkog protoka kroz pentozofosfatni put, pri čemu ove modifikacije ipak nisu restriktivni faktor za transformaciju ćelije domaćina sa sekvencom nukleotida predstavljenom u SEQ ID NO: 1.

[0030] Kako bi se povećao protok puta pentozofosfata u ćeliji domaćina, inseriraju se nove kopije gena koji kodiraju ksilulokinazne enzime (XKS1, EC 2.7.1.17), čija je nukleotidna sekvenca u ovom dokumentu predstavljena prema SEQ ID NO: 9, transaldolazu (TAL1, EC 2.2.1.2), predstavljenu sekvencom SEQ NO ID:5, transketolazu (TKL1, EC 2.2.1.1), predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 11, riboza 5-fosfat izomerazu (RKI1, EC 5.3.1.6), predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 7; i riboza 5-fosfat epimerazu (RPE1, EC 5.1.3.1), predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 12.

[0031] Među predstavljenim enzimima koji obrazuju put pentozofosfata, najmanje jedan od gena koji ih kodiraju mora da bude preterano eksprimiran, i poželjno povezan sa konstitutivnim promotorima, to jest, promotorima koji su konstantno eksprimirani bez obzira na uslove kojima je ćelija izložena ili prirodno inducibilnim promotorima. U predmetnom dokumentu, promotori su definisani kao regulatorni region, smešten u 5’ regionu gena koji je pod njihovom regulacijom i odgovoran za početak transkripcije, dok su terminatori definisani kao sekvenca koja određuje kraj gena tokom procesa transkripcije.

[0032] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje ekspresione kasete koje sadrže jedan ili više gena endogenih enzima iz neoksidativne faze pentozofosfatnog puta, za transformaciju eukariotskih ćelija. Ove ekspresione kasete ili genski konstrukti poželjno obuhvataju jake i konstitutivne promotore ćelije u koju će biti inserirani. Konkretno, u predmetnoj specifikaciji su opisana četiri primera izvođenja integrativnih ekspresionih kaseta, konstruisanih upotrebom jakih i konstitutivnih promotora Saccharomyces cerevisiae i stabilno integrisanih u genom ćelije domaćina.

[0033] Jedna od kaseta sadrži gen koji kodira ksiloza izomerazu, SEQ ID NO: 1 i inserira se u ćeliju domaćina koja je funkcionalno povezana i/ili omeđena, poželjno putem promotorskog i terminatorskog regiona gena za gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu, izoenzim 1 (TDH1). Druga prikazana kaseta sadrži gen koji kodira enzim ksilulokinazu (SEQ ID NO: 9) i poželjno se konstruiše upotrebom promotora i terminatora gena koji kodira enzim alkoholnu dehidrogenazu (ADH1). Treća kaseta prema predmetnom pronalasku sadrži gene koji kodiraju transaldolazu (SEQ NO ID:5) i riboza 5-fosfat izomerazu (SEQ ID NO: 7) i konstruisana je, poželjno, tako što su promotor i terminator gena koji kodira enzim gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu, izoenzim 1 (TDH1), upotrebljeni da omeđe gen za transaldolazu, a promotori i terminatori enzima 3-fosfoglicerat kinaza (PGK1) da omeđe gen za riboza 5-fosfat izomerazu. Poslednja kaseta prema predmetnom pronalasku sadrži gene koji kodiraju transketolazu (SEQ ID NO: 11) i riboza 5-fosfat epimerazu (SEQ ID NO: 7). Ona se konstruiše, poželjno, pod delovanjem promotora i terminatora gena za gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu, izoenzim 1 (TDH1), kojima je omeđen gen za transketolazu i promotor i terminator gena koji kodira enzim 3-fosfoglicerat kinazu (PGK1).

[0034] Pomenute ekspresione kasete sa genima metaboličkog puta pentozofosfata koji favorizuju potrošnju ksiloze uvode se u eukariotsku ćeliju, i odgovarajući geni se inseriraju u ciljni hromozom u delu između centromere i prvog susednog gena, poželjno u regionu 5 hiljada prvih baznih parova, brojanih od centromere i ushodno i nishodno, a što može da bude čak samo ushodno, samo nishodno, ili u oba smera istovremeno.

[0035] Osim insercije ekspresionih kaseta, predmetni pronalazak obezbeđuje deleciju gena GRE3 eukariotske ćelije domaćina, koji kodira aldoza reduktazu i predstavljen je sa SEQ ID NO: 14.

[0036] Dalje, predmetni pronalazak obezbeđuje stabilnu integraciju i to visokog broja kopija kasete koja eksprimira XI (SEQ ID NO:1) u genom ćelije domaćina. U predmetnom dokumentu, pod visokim brojem kopija se podrazumeva insercija najmanje 5 kopija datog gena, pri čemu je poželjna insercija najmanje 20 kopija.

[0037] Predmetni dokument opisuje, dakle, eukariotsku ćeliju, poželjno mikroorganizam vrste Saccharomyces cerevisiae, genetički modifikovan tako da u svom genomu sadrži najmanje jedan od gena za enzime koji su potrebni kako bi se favorizovao neoksidativni deo puteva pentozofosfata, koji je poželjno inseriran u visokom broju kopija i u region između centromere i prvog susednog gena do nje.

[0038] Dodatno, opisan je mikroorganizam, koji je, osim što je podvrgnut genetičkoj manipulaciji predstavljenoj prethodno u tekstu, izložen i postupku evolucionog inženjeringa kako bi se obrazovale nasumične mutacije koje favorizuju potrošnju lignoceluloznog dela biljne biomase, poželjno ksiloze, u anaerobnom medijumu i, u skladu s tim, višu stopa rasta i obimniju proizvodnju biohemijskih jedinjenja i/ili biogoriva, poželjno etanola, po vremenskom okviru, kada se poredi sa mikroorganizmom pre postupka evolucije. Genetički modifikovan mikroorganizam prema predmetnom pronalasku različito pokazuje svojstva kao što je to da predstavlja soj kod koga nema flokulacije, da ima visok prinos etanola, nisko obrazovanje glicerola i ksilitola, visoku vijabilnost, visoku stopu rasta, odsustvo stvaranja pene, uz efikasnu sposobnost rezistencije na agresivni proces fermentacije. Ovaj evoluirani mikroorganizam, pronalazači su deponovali kod Nemačke kolekcije mikroorganizama i ćelijskih kultura - Leibniz-Institut DSMZ, gde je dobio broj DSM28739.

[0039] Mikroorganizam DSM28739 prema predmetnom pronalasku pokazuje svojstva interesantna za industriju, kao što su: predstavlja soj kod koga nema flokulacije, pokazuje visok prinos etanola, nisko obrazovanje glicerola i ksilitola, visoku vijabilnost, visoku stopu rasta, odsustvo stvaranja pene, između ostalog.

[0040] Osim toga, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju biogoriva i biohemikalija od biljne biomase. Konkretnije, postupak za proizvodnju biogoriva i biohemikalija poželjno koristi lignocelulozni deo biljne biomase. Postupak prema predmetnom pronalasku koristi mikroorganizam prema pronalasku, poželjno DSM28739, za proizvodnju biogoriva i/ili biohemikalija.

1

Kratak opis crteža

[0041] Na slici 1, zabeležena je potrošnja ksiloze i proizvodnja etanola u anaerobnim uslovima, od strane mikroorganizma opisanog u predmetnom pronalasku, nakon postupka genetičke manipulacije u cilju insercije gena pentozofosfatnog puta i genetički modifikovanog gena za ksiloza izomerazu, SEQ ID NO: 1, i pre procesa evolucije. Na vertikalnoj osi data je koncentracija u gramima po litru (g/L), a na horizontalnoj osi vreme u časovima . Koncentracija ksiloze je označena sa (♦), dok je koncentracija etanola u vremenu predstavljena sa (■).

[0042] Na slici 2, zabeležena je potrošnja ksiloze i proizvodnja etanola u anaerobnim uslovima, od strane mikroorganizma opisanog u predmetnom pronalasku, nakon postupka genetičke manipulacije u cilju insercije gena pentozofosfatnog puta i genetički modifikovanog gena za ksiloza izomerazu, SEQ ID NO: 1, i pre procesa evolucije. Na vertikalnoj osi data je koncentracija u g/L, a na horizontalnoj osi vreme u časovima. Koncentracija ksiloze je označena sa (♦), dok je koncentracija etanola u vremenu predstavljena sa (■).

[0043] Na slici 3 je moguće posmatrati kinetiku fermentacije mikroorganizma DSM28739 u sintetskom medijumu koji sadrži ksilozu kao jedan od svojih izvora ugljenika, kao što je medijum YEPX (20 g/L ksiloze, 10 g/L ekstrakta kvasca i 20 g/L bakteriološkog peptona). Na slici, simbol (■) predstavlja ksilozu, (♦) predstavlja ćelijski rast izražen u vidu optičke gustine (OD), (▲) predstavlja etanol i (●) predstavlja glicerol. Na prikazanoj slici, vertikalna osa sa leve strane predstavlja koncentraciju (g/L) svakog pojedinog analiziranog jedinjenja. Vertikalna osa sa desne strane predstavlja optičku gustinu (OD) merenu apsorbancijom na 600 nm. Horizontalna osa, sa svoje strane, predstavlja vreme fermentacije izraženo u časovima.

[0044] Na slici 4, uočava se kinetika fermentacije mikroorganizma DSM28739 u hidrolizatu šećerne trske, gde je koncentracija predstavljena na vertikalnoj osi (g/L), a vreme u časovima na horizontalnoj osi. Koncentracija ksiloze u vremenu je predstavljena sa (■), glukoze sa (♦), koncentracija etanola je predstavljena sa (▲), glicerola sa (●) i sirćetne kiseline.

[0045] Na slici 5, je prikazana nukleotidna sekvenca predstavljena kao SEQ ID NO: 17, pri čemu je naznačen region koji kodira LEU2 (podvučeno), zajedno sa svojim promotorom i terminatorom (nije podvučeno).

[0046] Na slici 6 je prikazan gel za elektroforezu dobijen iz amplifikacije regiona spoljašnjih u odnosu na inseriranu kasetu, čime se potvrđuje integracija u kvasce. Na ovoj slici, M predstavlja lestvicu markera od 1 kb; 1a, kasetu gena XKS1 inseriranu pored centromere 2; 1b, negativnu kontrolu reakcije 1; 2a je kaseta gena XKS1 inserirana pored centromere 8; 2b je negativna kontrola reakcije 2; 3a je kaseta gena TAL1 i RKI1 inserirana pored centromere 12; 3b je negativna kontrola reakcije 3; 4a je kaseta gena TKL1 i RPE1 inserirana pored centromere 13; 4b je negativna kontrola reakcije 4; 5a je kaseta gena XI inserirana pored centromere 5; a 5b je negativna kontrola reakcije 5.

[0047] Na slici, prenetoj iz publikacije Matsushika et al., [Applied Microbiology and Biotechnology, 84:37-53, 2009], modifikacija učinjena na S. cerevisiae može da se posmatra kroz metabolički inženjering za fermentaciju ksiloze. Geni obeleženi pomoću asteriska bili su preterano eksprimirani; precrtani geni su bili deletirani.

Detaljan opis pronalaska

[0048] Predmetni pronalazak obezbeđuje ekspresionu kasetu za transformaciju eukariotske ćelije koja sadrži kombinaciju sledećih ekspresionih kaseta: strana 14a

a) ekspresione kasete koja sadrži gen koji kodira ksiloza izomerazu sekvence SEQ ID NO: 1, promotor TDH1 nukletidne sekvence SEQ ID NO: 2, i terminator TDH1 nukletidne sekvence SEQ ID NO: 3;

b) ekspresione kasete koja sadrži promotor ADH1 predstavljen sekvencom SEQ ID NO: 8, gen XKS1 predstavljen sekvencom SEQ ID NO: 9 i terminator ADH1 predstavljen sekvencom SEQ ID NO: 10;

c) ekspresione kasete koja sadrži promotor TDH1 nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 2, gen TAL1 sekvence SEQ ID NO: 5, terminator gen TDH1 sekvence SEQ ID NO: 3, nakon koga sledi promotor PGK1 sekvence SEQ ID NO: 6, gen RKI1 (SEQ ID NO: 7) i terminator nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 13; i

d) ekspresione kasete koja sadrži promotor TDH1 sekvence SEQ ID NO: 02, TKL1 gen sekvence SEQ ID NO: 11, kodirajući gen riboza 5-fosfat epimeraze (SEQ ID NO: 7), TDH1 terminator sekvence SEQ ID NO: 3, nakon koga sledi promotor PGK1 sekvence SEQ ID NO: 6, RPE1 gen sekvence SEQ ID NO: 12 i terminator PGK1 sekvence SEQ ID NO: 13;

pri čemu je navedena ekspresiona kaseta funkcionalna u eukariotskoj ćeliji.

[0049] U jednom primeru izvođenja, pomenuti promotor(i) je/su konstitutivni ili prirodno inducibilni.

[0050] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje postupak za transformaciju eukariotske ćelije, koji obuhvata uvođenje najmanje jedne ekspresione kasete otkrivene predmetnim pronalaskom, u ćeliju koja se transformiše. U jednom primeru izvođenja, uvođenje se vrši u genom ćelije koja se transformiše.

[0051] U jednom primeru izvođenja, ekspresiona kaseta dodatno sadrži inaktivaciju ili deleciju gena GRE3 (SEQ ID NO: 14) u genomu pomenute eukariotske ćelije.

[0052] Predmetni pronalazak obezbeđuje genetički modifikovan mikroorganizam koji sadrži najmanje jednu ekspresionu kasetu opisanu u ovoj patentnoj prijavi.

[0053] U jednom primeru izvođenja, jedna ili više navedenih ekspresionih kaseta, prisutno je u regionu prvih 5 hiljada baznih parova, kada se broji od centromere i ushodno i nishodno, a što može čak da bude samo ushodno, samo nishodno ili u oba smera istovremeno.

[0054] U jednom primeru izvođenja, promotorske sekvence, kodirajuće sekvence i terminatorske sekvence ekspresionih kaseta su stabilne u genomu mikroorganizma i/ili su prisutne u najmanje 5 kopija u genomu mikroorganizma.

[0055] U jednom primeru izvođenja, gen GRE3 (SEQ ID NO: 14) je inaktiviran ili deletiran u/iz svog genoma.

[0056] U jednom primeru izvođenja, mikroorganizam je kvasac iz roda odabranog iz grupe koja se sastoji od rodova: Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula i Yarrowia.

[0057] U jednom primeru izvođenja, mikroorganizam je Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

[0058] Predmetni pronalazak obezbeđuje genetički modifikovan mikroorganizam Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

[0059] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak proizvodnje biogoriva i/ili biohemikalija koji obuhvata korak kultivacije mikroorganizma, kako je definisano u predmetnom pronalasku.

[0060] U jednom primeru izvođenja, prinos postupka iznosi najmanje 0.45 grama etanola proizvedenog po gramu ksiloze koju mikroorganizam potroši u sintetskom medijumu koji sadrži ksilozu kao izvor ugljenika.

[0061] U jednom primeru izvođenja, volumetrijska produktivnost iznosi najmanje 0.67 grama etanola proizvedenog po litru, tokom svakog časa, u sintetskom medijumu koji sadrži ksilozu kao izvor ugljenika.

[0062] U jednom primeru izvođenja, mikroorganizam je mikroorganizam Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

[0063] Predmetni pronalazak obezbeđuje genetički modifikovan organizam sa efikasnim učinkom pri fermentaciji u konverziji šećera sadržanih u biljnoj biomasi u biogoriva i/ili biohemikalije, kada se poredi sa verzijom istog mikroorganizma bez genetičkih modifikacija opisanih u ovom dokumentu.

[0064] Konkretnije, genetički modifikovan mikroorganizam prema predmetnom pronalasku odnosi se na genetički transformisanu eukariotsku ćeliju, poželjno kvasca ili filamentoznih gljiva.

[0065] U ovom pronalasku, pod kvascima se podrazumeva bilo koji subjekt iz grupe Eumycotina, odnosno, prave gljive koje rastu kao jednoćelijski organizmi i koje preferencijalno

1

obavljaju anaerobnu fermentaciju, kao što su, na primer, Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula i Yarrowia.

[0066] Filamentozne gljive, sa svoje strane, su gljive kojima je svojstveno da, osim toga što obavljaju aerobnu respiraciju, imaju vegetativni micelijum i rastu usled elongacije hifa, kao što su, na primer, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Moniliophthora i Acremonium.

[0067] Još konkretnije, predmetni pronalazak obezbeđuje genetički modifikovan organizam, poželjno kvasac iz roda Saccharomyces.

[0068] Opisani mikroorganizam prezentuje efikasan učinak pri konverziji šećera prisutnih u biljnoj biomasi, poželjno lignoceluloznom materijalu, u biohemikalije ili biogoriva. Jedan primer izvođenja pronalaska opisuje mikroorganizam vrste Saccharomyces cerevisiae koji je efikasniji pri konverziji pentoza prisutnih u lignoceluloznom materijalu, u alkohole i/ili biohemikalije, kao što su, na primer, ćilibarna kiselina, jabučna kiselina, 1,3-propandiol, 1,2- propandiol, butanol, izobutanol, biodizel, 1,4-butandiol, 2,3-butandiol, PHB - poli(butirat hidroksid), međutim, ne i ograničeno na ova jedinjenja, ako se poredi sa verzijom istog mikroorganizma bez genetičkih modifikacija, koju predmetni dokument sadrži.

[0069] Pentoza koju mikroorganizam preferencijalno koristi za konverziju u prethodno u tekstu naznačene alkohole i/ili biohemikalije, je ksiloza, premda bez ograničenja na nju.

[0070] U predmetnom pronalasku se pominje nekoliko genskih sekvenci, koje su sve navedene u odeljku Spisak sekvenci. Da bi navođenje bilo brzo i razumevanje lako, njihove respektivne funkcije ili geni su naznačeni u sledećoj tabeli 1.

Tabela 1 –Sekvence koje se pominju u predmetnom pronalasku i odgovarajući

geni/funkcije.

[0071] Nukleotidna sekvenca predstavljena prema SEQ ID NO: 1, koja kada se inserira u eukariotsku ćeliju kodira peptid sa svojstvom ksiloza izomeraze, obezbeđuje ekspresiju enzima koji favorizuje izomerizaciju ksiloze u ksilulozu.

[0072] Mikroorganizam opisan u predmetnom pronalasku, genetički je modifikovan uvođenjem nukleotidne sekvence koja kodira peptid sa funkcijom ksiloza izomeraze. Ovi nukleotidi, originalno opisani u Orpinomyces sp. (XI, EC 5.3.1.5), pronalazači su manuelno optimizovali kodonima koje preferencijalno koristi Saccharomyces cerevisiae. Optimizovana sekvenca ksiloza izomeraze koja se koristi u predmetnom pronalasku, nije, međutim, prirodna, i razlikuje se od prirodnih sekvenci ksiloza izomeraze koje su već opisane u javnim bankama podataka, i predstavljena je u SEQ ID NO: 1.

[0073] Nakon optimizacije sekvence predstavljene u SEQ ID NO: 1, CAI (Indeks adaptacije kodona), indeks koji određuje mogućnost visokih nivoa ekspresije proteina, bio je 0.79 do 0.91, što ukazuje na dobijanje efikasne ekspresije ovog proteina u S. cerevisiae. CAI indeks je geometrijska sredina relativnih vrednosti adaptacije i za njeno izračunavanje isključuju se nesinonimni kodoni, a u nekim slučajevima i kodoni terminacije. Vrednosti variraju između 0 i 1, a veće vrednosti ukazuju na veći udeo najobilnije zastupljenih kodona [Nucleic Acids Research 15: 1281-1295].

[0074] Dakle, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ekspresionu kasetu koja sadrži nukleotidnu sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 1, koja kodira peptid tipa ksiloza izomeraze i koji, izborno, može da se inserira u eukariotsku ćeliju u cilju ekspresije navedene izomeraze u aktivnom obliku. U ovom dokumentu, geni se inseriraju u mikroorganizam putem homologe rekombinacije, čime počinju integraciju u njegov genom. Ekspresiona kaseta prema pronalasku odlikuje se time što sadrži: - nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 1) koja kodira peptid sa funkcijom ksiloza izomeraze; - najmanje jedan promotor za navedenu kodirajuću nukleotidnu sekvencu; i – jednu nukleotidnu sekvencu odabranu od: jedne terminatorske nukleotidne sekvence transkripcije; jednog markera za selekciju; jedne ili više kodirajuće nukleotidne sekvence (sekvenci) drugih enzima; njihovih kombinacija ili jednog plazmida koji sadrži takve sekvence, pri čemu je najmanje jedna od upravo definisanih nukleotidnih sekvenci heterologa. U

1

transformaciji eukariotskih ćelija u skladu sa pronalaskom, može da se koristi jedna ili više ekspresionih kaseta.

[0075] Izborno, ekspresiona kaseta prema pronalasku takođe sadrži sekvence odabrane od grupe koja sadrži kodirajuće sekvence enzima ksilulokinaze (SEQ ID NO: 9), transaldolaze (SEQ NO ID:5), transketolaze (SEQ ID NO: 11), riboza 5-fosfat izomeraze (SEQ ID NO: 7) i/ili riboza 5-fosfat epimeraze (SEQ ID NO: 12).

[0076] U jednom primeru izvođenja, eukariotska ćelija domaćina/ćelija mikroorganizma domaćina je kvasac vrste Saccharomyces cerevisiae, međutim, potrebno je napomenuti da bilo koja eukariotska ćelija može da bude transformisana pomoću jedne ili više ekspresionih kaseta prema pronalasku, što obuhvata i nukleotidne sekvence opisane u SEQ ID NO: 1.

[0077] Dakle, predmetni pronalazak obezbeđuje eukariotsku ćeliju, kvasce ili filamentozne gljive, poželjno kvasac vrste Saccharomyces cerevisiae, transformisane pomoću nukleotidne sekvence opisane u SEQ ID NO: 1, koja može da bude prisutna u jednoj kopiji, ili, poželjno, u genom može da se inserira više kopija ove nukletidne sekvence.

[0078] U jednom primeru izvođenja, genetički modifikovana ćelija domaćina dodatno sadrži gene pentozofosfatnog puta, tako da insercija SEQ ID NO: 1, koja kodira ksiloza izomerazu, favorizuje izomerizaciju ksiloze u ksilulozu. Međutim, osim insercije SEQ ID NO: 1 u ćeliju domaćina, predmetni pronalazak opisuje genetičke modifikacije u istoj ćeliji koje imaju za cilj favorizovanje metaboličkog protoka kroz puteve pentozofosfata, pri čemu te modifikacije nisu, međutim, restriktivni faktor za transformaciju ćelije domaćina nukleotidnom sekvencom predstavljenom u SEQ ID NO: 1.

[0079] U cilju povećanja protoka pentozofosfatnog puta u ćeliji domaćina, inserirani su geni koji kodiraju enzime ksilulokinazu (XKS1, EC 2.7.1.17), čija je nukleotidna sekvenca predstavljena u ovom dokumentu prema SEQ ID NO: 9, transaldolazu (TAL1, EC 2.2.1.2), predstavljenu sekvencom SEQ NO ID:5, transketolazu (TKL1, EC 2.2.1.1), čija je nukleotidna sekvenca predstavljena prema SEQ ID NO: 11, riboza 5-fosfat izomerazu (RK/1, EC 5.3.1.6), čija je nukleotidna sekvenca predstavljena prema SEQ ID NO: 7; i riboza 5-fosfat epimerazu (RPE1, EC 5.1.3.1), čija je nukleotidna sekvenca predstavljena prema SEQ ID NO: 12.

[0080] Među predstavljenim enzimima koji sačinjavaju pentozofosfatni put, uz ksiloza izomerazu predstavljenu prema SEQ ID NO: 1, najmanje jedan od gena koji ih kodiraju mora da bude preterano eksprimiran ili, poželjno, da bude povezan sa konstitutivnim promotorima, odnosno da bude konstantno eksprimiran, bez obzira na uslove kojima je ćelija izložena, ili sa prirodno inducibilnim promotorima. U predmetnom dokumentu, promotori su definisani kao regulatorni region, smešten u 5’ regionu pod čijim su delovanjem i odgovorni za otpočinjanje

1

transkripcije, dok su terminatori definisani kao sekvenca koja određuje završetak gena tokom procesa transkripcije.

[0081] Preterana ekspresija gena koji kodiraju ove enzime može da bude posledica povećanog broja kopija nukleotidne sekvence koja ih kodira, ekspresije epizomalnih gena prisutnih u vektoru koji može da se inserira u eukariotsku ćeliju domaćina, putem upotrebe promotora heterologih u odnosu na sekvencu u kojoj je operabilno vezan, ili čak homologih u odnosu na ćeliju gde su inserirani, ili kao endogeni u ćeliji domaćina, sve dotle dok su u stanju da proizvedu stabilno stanje transkripcije, višeg nivoa nego što bi se postiglo u verziji ćelije koja nema ove genetičke modifikacije, u situacijama kada su izvori ugljenika kao što su glukoza i ksiloza dostupni u okolini. Ovi promotori mogu da budu konstitutivni ili prirodno inducibilni.

[0082] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži ekspresionu kasetu u kojoj se nalaze endogeni geni enzima neoksidativne faze pentozofosfatnog puta, koji su poželjno konstruisani upotrebom jakih i konstitutivnih promotora ćelije u koju će biti inserirani. Konkretno, predmetni pronalazak opisuje četiri primera izvođenja integrativne ekspresione kaseta, koje su konstruisane upotrebom promotora visoke ekspresije ili konstitutivnih promotora Saccharomyces cerevisiae, i stabilno integrisane u genom ćelije domaćina.

[0083] Jedna od opisanih kaseta sadrži gen koji kodira ksiloza izomerazu, SEQ ID NO: 1. U ovoj kaseti, kopija SEQ ID NO: 1 je inserirana u ćeliju domaćina, sa graničnim regionima u vidu, poželjno, promotorskog i terminatorskog regiona gena za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu, izoenzim 1 (TDH1). Tako je, ukratko, kaseta koja sadrži gen koji kodira ksiloza izomerazu i koja je inserirana u genom ćelije domaćina, obrazovana od promotora TDH1, čija je nukleotidna sekvenca predstavljena prema SEQ ID NO: 2, gena XI (SEQ ID NO: 1) i terminatora TDH1, čija je nukleotidna sekvenca predstavljena prema SEQ ID NO: 3.

[0084] Druga kaseta opisana u predmetnom pronalasku, sadrži gen koji kodira enzim ksilulokinazu (SEQ ID NO: 9). Predmetni opis ukazuje da se kaseta poželjno konstruiše upotrebom genskog promotora i terminatora, gena koji kodira enzim alkoholnu dehidrogenazu (ADH1). Stoga je opisano da je kaseta koja sadrži kodirajući gen ksilulokinaze konstruisana pomoću promotora ADH1, predstavljenog prema SEQ ID NO: 8, gena XKS (SEQ ID NO: 9) i terminatora ADH1, predstavljenog prema SEQ ID NO: 10.

[0085] Još jedna kaseta prema predmetnom pronalasku sadrži gene koji kodiraju transaldolazu (SEQ NO ID:5) i riboza 5-fosfat izomerazu (SEQ ID NO: 7). Ova kaseta se konstruiše poželjnom upotrebom promotora i terminatora gena koji kodira enzim gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu, izoenzim 1 (TDH1) da bi se omeđio gen za transaldolazu i upotrebom promotora i terminatora enzima 3-fosfoglicerat kinaze (PGK1) da bi se omeđio gen riboza 5-fosfat

1

izomeraze. Tako je, ukratko, ekspresiona kaseta poželjno konstruisana od promotora TDH1 (SEQ ID NO: 2), gena TAL1 (SEQ ID NO: 5) i terminatora TDH1 (SEQ ID NO: 3), iza koga sledi promotor PGK1, čija je nukleotidna sekvenca predstavljena prema SEQ ID NO: 6, gen RKI1 (SEQ ID NO: 7) i terminator, čija je nukleotidna sekvenca SEQ ID NO: 13.

[0086] Poslednja kaseta prema predmetnom pronalasku sadrži kodirajuće gene transketolaze (SEQ ID NO: 11) i riboza 5-fosfat epimeraze (SEQ ID NO: 12), poželjno, u vezi sa funkcijom promotora i terminatora gena za gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu, izoenzim 1 (TDH1), koji omeđuje gen transketolaze i promotor i terminator gena koji kodira enzim 3-fosfoglicerat kinazu (PGK1). Tako je, ukratko, ekspresiona kaseta koja je inserirana u genom ćelije domaćina i koja sadrži gene za transketolazu i riboza 5-fosfat epimerazu, poželjno konstruisana od promotora TDH1 (SEQ ID NO: 2), gena TKL1 (SEQ ID NO: 11) i terminatora TDH1 (SEQ ID NO: 3), nakon kojih sledi promotor PGK1 (SEQ ID NO: 6), gen RPE1 (SEQ ID NO: 12) i terminator PGK1 (SEQ ID NO: 13).

[0087] Sve ekspresione kasete sa genima metaboličkog puta pentozofosfata koji favorizuju potrošnju ksiloze, inserirane su u region ciljnog hromozoma smešten između centromere i prvog gena do nje, poželjno u regionu od 5 hiljada baznih parova, kada se broji od centromere i ushodno i nishodno, a što može čak da bude samo ushodno, samo nishodno ili u oba smera istovremeno.

[0088] Uzvodnim smerom se smatra ono što je smešteno pre početne tačke transkripcione jedinice neke DNK sekvence, koja počinje promotorom i završava se terminatorom. Sa svoje strane, nizvodnim se smatra region smešten posle početne tačke transkripcione jedinice DNK sekvence.

[0089] Osim na inserciju ekspresione kasete, predmetni pronalazak se takođe odnosi na deleciju ili inaktivaciju gena GRE3, koji kodira aldoza reduktazu i predstavljen je u SEQ ID NO: 14.

Proizvodnja ksilitola smanjuje ukupan prinos etanola koji može da se dobije. Osim toga, ksilitol je inhibitor delovanja enzima ksiloza izomeraze.

[0090] Kada se sprovode u Saccharomyces cerevisiae, genetičke modifikacije koje su prethodno pomenute u tekstu, favorizuju tok neoksidativnog dela pentozofosfatnog puta.

[0091] Zatim, primer 4 pokazuje da prosta insercija gena koji favorizuje metabolički protok pentozofosfatnim putem, kao i gena koji kodira peptid tipa ksiloza izomeraze, u ćeliju domaćina, ne garantuje efikasnu potrošnju pentoza prisutnih u medijumu.

[0092] Dakle, predmetni pronalazak obezbeđuje stabilnu integraciju i veliki broj kopija kasete koja eksprimira XI (SEQ ID N:1) u genomu ćelije domaćina. U predmetnom dokumentu, velikim brojem kopija se smatra insercija od naimanje 5 kopija datog gena, pri čemu je poželjna insercija od najmanje 20 kopija.

1

[0093] Predmetni dokument opisuje, međutim, i eukariotsku ćeliju, poželjno mikroorganizam vrste Saccharomyces cerevisiae, genetički modifikovan tako da u svom genomu sadrži najmanje jedan od gena enzima koji su potrebni da bi se favorizovao neoksidativni deo pentozofosfatnog puta, inseriran poželjno u velikom broju kopija i u region između centromere i prvog gena do nje. Pošto ima sve metaboličke puteve potrebne za konverziju ksiloze u aerobnim uslovima, ova linija je u stanju da troši ksilozu prisutnu u medijumu za kultivaciju, ali je u anaerobnim uslovima potrošnja veoma spora.

[0094] Dalje je opisan postupak usmerene evolucije iz koga se dobija mikroorganizam sa većim kapacitetom za potrošnju ksiloze u anaerobnim uslovima, i usled toga, višom stopom rasta i obimnijom proizvodnjom biohemijskih jedinjenja i biogoriva po vremenskom okviru, ako se poredi sa mikroorganizmom koji nije bio podvrgnut pomenutom postupku. U pomenutom postupku, mikroorganizam vrste Saccharomyces cerevisiae izložen je evolutivnim pritiscima koji su se sastojali od progresivnih povećanja koncentracije ksiloze kao jedinog izvora ugljenika, kako bi se odabrali mikroorganizmi sa nasumičnim mutacijama koje favorizuju obimniju potrošnju ksiloze u anaerobnim uslovima, i shodno tome, višu stopu rasta i obimniju proizvodnju biohemijskih jedinjenja i biogoriva, poželjno etanola. Primer 4 prikazuje komparativne rezultate između mikroorganizma koji nastaje ovim postupkom i mikroorganizma pre postupka usmerene evolucije. Genetički modifikovan mikroorganizam opisan u predmetnom pronalasku, različito prezentuje svojstva ne-flokulentnosti, davanja visokog prinosa etanola, niskog obrazovanja glicerol i ksilitola, visoke vijabilnosti, visoke stope rasta, odsustva proizvodnje pene, uz efikasan kapacitet rezistentnosti na stresan postupak industrijske fermentacije. Ovaj mikroorganizam je deponovan kod Nemačke kolekcije mikroorganizama i ćelijskih kultura - Leibniz-Institut DSMZ, pod brojem DSM28739.

[0095] Mikroorganizam DSM28739 prema predmetnom pronalasku pokazuje svojstva interesantna za industriju, kao što su: predstavlja soj kod koga nema flokulacije, pokazuje visok prinos etanola, nisko obrazovanje glicerola i ksilitola, visoku vijabilnost, visoku stopu rasta, odsustvo stvaranja pene, između ostalog.

[0096] Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak proizvodnje biogoriva i biohemikalija od biljne biomase, poželjno od lignoceluloznog dela biljne biomase. Postupak opisan u predmetnom pronalasku koristi mikroorganizam prema pronalasku za proizvodnju biogoriva i/ili biohemikalija.

[0097] U jednom primeru izvođenja, postupak se sastoji od sledećih koraka:

- dovođenje mikroorganizma DSM28739 u kontakt sa lignoceluloznim materijalom; i

- izborno, naknadno sakupljanje obrazovanog jedinjenja.

1

[0098] U drugom primeru izvođenja prema pronalasku, pomenuti lignocelulozni materijal se dobija prethodnom obradom lignocelulozne biljne biomase, nakon koje sledi hidroliza.

[0099] Postupak prema pronalasku obezbeđuje proizvodnju biogoriva koja predominantno obuhvataju alkohole, posebno etanol. Postupak prema pronalasku obezbeđuje proizvodnju biohemikalija odabranih iz grupe koja sadrži, ali nije ograničena na: ćilibarnu kiselinu, jabučnu kiselinu, 1,3-propandiol, 1,2-propandiol, butanol, izobutanol, biodizel, 1,4-butandiol, 2,3-butandiol i/ili PHB - poli(butirat hidroksid).

[0100] Dodatno su prikazana biogoriva, poželjno etanol, i biohemikalije proizvedene postupkom koji koristi mikroorganizam prema pronalasku, kao što je DSM28739.

PRIMERI

Primer 1 - KONSTRUISANJE KASETE ZA EKSPRESIJU I NJENA INSERCIJA U GENOM

[0101] Za konstruisanje svake pojedinačne kasete koja sadrži gene neoksidativne faze pentozofosfatnog puta, uključujući gen za ksiloza izomerazu, svaki od gena je amplifikovan putem PCR genoma S. cerevisiae i kloniran u integrativnu ekspresionu kasetu.

[0102] Pored terminatora svake kasete, kloniran je URA3 gen omeđen sa dva loxP regiona u istoj orijentaciji, što omogućava uklanjanje ovog regiona ekspresijom Cre rekombinaze, kao i korišćenje URA3 auksotrofnog markera u svim ekspresionim kasetama sa opisanim genima.

[0103] Kad je u pitanju konstruisanje ekspresiona kasete koja sadrži gen koji kodira ksiloza izomerazu, osim prethodno pomenutog konstruisanja, takođe je u krajeve kasete, sa svake strane klonirano po 126 pb koji pokazuju homologiju sa regionom blizu hromozoma pet Saccharomyces cerevisiae, čime se omogućava integracija u ovaj region putem homologe rekombinacije.

[0104] U cilju konstrukcije ekspresione kasete sa genom koji kodira ksilulokinazu, na primer, ovaj gen je amplifikovan pomoću PCR genoma S. cerevisiae i kloniran je neposredno uz promotor i terminator gena koji kodira alkoholnu dehidrogenazu (ADH1). Posle terminatora, omeđujući gen URA3 inseriran je pomoću dva loxP regiona u istoj orijentaciji. U krajeve kasete su klonirani regioni homologije blizu centromere dva i osam S. cerevisiae. Sprovedene su dve transformacije da bi se inserirala kaseta koja eksprimira gen XKS1 na rastojanju od 288 pb od centromere dva i 228 pb od centromere osam. Na ovaj način, pored endogene kopije, transformant ima još dve kopije gena XKS1 pod delovanjem promotora za konstitutivnu ekspresiju.

[0105] Što se tiče ekspresione kasete koja sadrži kodirajuće gene transaldolaze (TAL1) i riboza 5-fosfat izomeraze (RKI1), na primer, ovi geni su klonirani pod delovanjem promotora i

2

terminatora gena za gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu, izoenzim 1 (TDH1) i 3-fosfoglicerat kinazu (PGK1), redom, koji su razdvojeni markerom URA3, omeđenim loxP mestima, i pravilno inserirani u hromozom ćelije domaćina.

[0106] Što se tiče ekspresione kasete koja sadrži kodirajuće gene transcetolaze (TKL1) i riboza 5-fosfat epimeraze (RPE1), na primer, ovi geni su klonirani pod delovanjem promotora i terminatora gena za gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu, izoenzim 1 (TDH1) i 3-fosfoglicerat kinazu (PGK1), redom, koji su razdvojeni markerom URA3, omeđenim loxP mestima, i pravilno inserirani u hromozom ćelije domaćina.

[0107] Transformacija ćelije domaćina svakom od kaseta koje sadrže gene neoksidativne faze pentozofosfatnog puta pratila je protokol po Gietz-u i Schiestl-u [Nature Protocols 2, 31 - 34; 2007], pomoću litijum acetata, i svaki od gena, omeđenih jakim i konstitutivnim promotorima i terminatorima iz Saccharomyces cerevisiae, stabilno je integrisan u hromozom ćelije domaćina. Pravilna integracija je potvrđena putem PCR. Nakon potvrde, URA3 region je isečen iz genoma privremenom ekspresijom Cre rekombinaze, koja je zadržala samo jedno loxP mesto na poziciji, posle terminatora inseriranog gena.

[0108] Na krajevima kasete sa ksiloza izomerazom, sa svake strane je klonirano po 126 pb koji pokazuju homologiju sa regionom uz hromozom pet Saccharomyces cerevisiae, čime se omogućava integracija u ovaj region putem homologe rekombinacije.

Primer 2 - INSERCIJA KASETE SA IZOMERAZOM KSILOZE U GENOM, U VELIKOM BROJU KOPIJA

[0109] Da bi se osigurala stabilna integracija i veliki broj kopija u ćeliji domaćina, kaseta koja eksprimira ksiloza izomerazu predstavljena prema SEQ ID NO: 1 modifikovana je uključivanjem delta elemenata retrotranspozona Ty1 (element prisutan u velikom broju kopija u genomu S. cerevisiae), u krajeve kasete.

[0110] Marker URA3, omeđen loxP regionima, u ovom plazmidu je zamenjen markerom LEU2. Prethodno je LEU2 gen deletiran u koraku genetičke manipulacije. U ovom koraku se integriše gen URA3, omeđen loxP regionima koji se nalaze uz regione homologije promotora i terminatora LEU2, što dovodi do delecije ovog gena. Zatim se inserira XI kaseta omeđena Ty1 elementima, i uz upotrebu auksotrofnog markera LEU2 u cilju odabira transformanata.

Primer 3 – DELECIJA GENA GRE3

[0111] Delecija gena GRE3, koji kodira aldoza reduktazu i predstavljen je u SEQ ID NO: 14, izvedena je u dva koraka, putem genetičke manipulacije, sa ciljem da se smanji proizvodnja ksilitola od ksiloze. U prvom koraku je integrisan gen URA3, omeđen loxP regionima koji se nalaze uz regione homologije promotora i terminatora gena GRE3, što je dovelo do delecije ovog regiona. U drugom koraku, nakon što je potvrđena delecija, marker URA3 je uklonjen privremenom ekspresijom Cre rekombinaze.

Primer 4 – ADAPTIVNA EVOLUCIJA I POTROŠNJA KSILOZE

[0112] Nakon što je podvrgnut genetičkoj manipulaciji sa insercijom svih gena metaboličkog puta koji su neophodni za konverziju ksiloze i pre podvrgavanja adaptivnoj evoluciji, genetički modifikovan mikroorganizam je, kada se nalazio u anaerobnim uslovima, trošio ksilozu prisutnu u medijumu za kultivaciju polako i uz nizak nivo obrazovanja biogoriva, u ovom slučaju etanola, kao što može da se vidi na slici 1.

[0113] Pomenuti mikroorganizam je podvrgnut postupku evolucionog inženjeringa koji se sastojao od sukcesivnih ponavljanja u medijumu koji sadrži 50 g/L ksiloze u polovično anaerobnim uslovima. Inokulum je započet sa optičkom gustinom (OD) od ∼1.0. Usled niskog nivoa inicijalnog rasta, mala količina glukoze (0.5%) je dodavana u medijum u prvim eksperimentima, sa ciljem da se postigne brži rast kulture. Posle 48 časova kultivacije, alikvot je prebačen u novu bocu sa medijumom za kulturu i eksperiment je ponovljen. Prilikom trećeg prebacivanja dodavanje glukoze u medijum za kultivaciju nije bilo neophodno zato što se brzina rasta mikroorganizma u ksilozi kao jedinom izvoru ugljenika, povećala. 20 kolonija iz smeše evoluiranih ćelija je izolovano i analizirano. Mikroorganizam DSM28739 je odabran na osnovu svog superiornog učinka u smislu kapaciteta za konverziju ksiloze u etanol, kao što može da se vidi na slici 2.

Primer 5 - RAST MIKROORGANIZMA DSM28739 KADA SE KSILOZA KORISTI KAO IZVOR UGLJENIKA

Priprema inokuluma

[0114] Alikvot kulture mikroorganizma DSM28739 koji je prethodno čuvan zamrznut na -85°C (u rastvoru glicerola 20% tež./zap.) reaktiviran u YEPD medijumu (20 g/L glukoze, 10 g ekstrakta kvasca i 20 g/l peptona), tokom 6 časova, u elenmajeru od 100 mL koji je sadržao 50 mL YEPD medijuma, 20 g/L glukoze, u orbitalnom šejkeru na 200 rpm i 30 °C. Alikvot ove kulture je naknadno prebačen u erlemajer od 500 ml koji je sadržao 200 ml YEPD medijuma sa 40 g/l glukoze.

[0115] Kultura je inicirana sa optičkom gustinom (OD) jednakom 0.1, mereno na talasnoj dužini od 600 nm, inkubirana na 200 rpm i 30 °C tokom 16 časova. Izvesna zapremina ove kulture je prebačena u epruvetu sa konusnim dnom od 50 ml i centrifugirana na 4000 rpm tokom 10 min.

Istaložene ćelije su 3 puta oprane u destilovanoj vodi centrifugiranjem i resuspendovane u odgovarajućem medijumu za kulturu, da bi se prebacile u bioreaktor (opisano u tekstu koji sledi).

Kultivacija u bioreaktoru

[0116] 600 mL sintetskog medijuma za kulturu pripremljeno je u boci od 1 L, i sadržalo je ksilozu kao jedan od izvora ugljenika, kao YEPX medijum (20 g/L ksiloze, 10 g/L ekstrakta kvasca i 20 g/bakteriološkog peptona). Pripremljen je bioreaktor radne zapremine od 1L sa 500 mL ovog medijuma za kulturu.

[0117] Bioreaktor je zatim sterilisan u autoklavu na 121 °C i pri pritisku od 1 atm tokom 20 minuta. Preostala zapremina od 100 mL prebačena je u bocu od 250 mL i takođe je autoklavirana. Izvor ugljenika je rastvoren u 100 mL destilovane i autoklavirane vode u boci od 250 mL. Posle autoklaviranja, zapremina od 100 mL koja je sadržala izvor ugljenika, prebačena je u bioreaktor.

[0118] Inokulum je pripremljen od ćelija dobijenih centrifugiranjem inokuluma prethodno pripremljenog pomoću kulture mikroorganizma DSM28739. Ćelije su zatim resuspendovane u 100 mL medijuma bez izvora ugljenika i odmah su zasejane u bioreaktoru. Kultura je inicirana sa OD=3.

[0119] Tokom rasta ćelija, pH vrednost je održavana u opsegu pH između 3 i 7, putem dodavanja kiselina i/ili baza. Temperatura i brzina mešanja su takođe održavane na konstantnim vrednostima od 30 °C i 200 rpm, redom.

[0120] Da bi se osiguralo anaerobno stanje, medijum za kultivaciju i atmosfera u bioreaktoru su pre inokulacije bili sa protokom gasovitog azota od 2 LN/min (normalnih litara po minuti) tokom 10 minuta. Sakupljana su dva uzorka od po 1.5 mL približno na svaka tri časa. Jedan uzorak je korišćen za merenje OD, dok je drugi analiziran pomoću tečne hromatografije visokog učinka (HPLC).

Kvantitativno određivanje proizvoda fermentacije

[0121] Kvantitativno određivanje ksiloze, etanola i glicerola izvedeno je pomoću tečne hromatografije visokog učinka HPLC i koristeći hromatograf Alliance HT (kompanije Waters) sa detektorom indeksa prelamanja (sistem Waters 2414). Merenja su izvedena upotrebom kolone HPX-87H (kompanije BioRad) koja je držana na 35 °C, sa 4 mM sumpornom kiselinom kao mobilnom fazom i protokom od 0.6 mL/min.

[0122] Posmatranjem slike 3, može da se proveri da je mikroorganizam DSM28739 potrošio 20 g/L ksiloze za približno 18 časova. Glavni proizvod fermentacije je bio etanol koji je dostigao

2

približno 9 g/L. Uočen je i glicerol, ali u niskoj koncentraciji. Proizvodnja glicerola je uočena u niskoj koncentraciji.

[0123] Tabela 2 prikazuje prinos etanola i volumetrijsku produktivnost mikroorganizma DSM28739.

Tabela 2: Prinos i volumetrijska produktivnost mikroorganizma DSM28739 u sintetskom medijumu koji sadrži ksilozu kao jedan od izvora ugljenika, kao što je YEPX medijum (20 g/L ksiloze, 10 g/L ekstrakta kvasca i 20 g/L bakteriološkog peptona).

Volumetrijska produktivnost Prinos u g/g (grami

etanola u g/Lh (grami Linija proizvedenog etanola po gramu

proizvedenog etanola po litru i potrošene ksiloze)

po času)

DSM28739 0.46 ± 0.01 0.69 ± 0.02

Primer 6 - FERMENTACIJA MIKROORGANIZMA DSM28739 KORIŠĆENJEM HIDROLIZATA ŠEĆERNE TRSKE.

Medijum za kultivaciju

[0124] Medijum za kultivaciju je pripremljen korišćenjem hidrolizata šećerne trske koji je sadržao između 20 do 60 g/L ksiloze i/ili 20 to 60 g/L glukoze. U hidrolizat je dodavana urea, kako bi se podržao rast.

Priprema inokuluma

[0125] Alikvot kulture mikroorganizma DSM28739 koji je prethodno čuvan zamrznut na -85°C (u rastvoru glicerola 20% tež./zap.) reaktiviran je tokom 6 časova u elenmajeru od 100 mL koji je sadržao 50 mL YEPD medijuma 20 g/L glukoze u orbitalnom šejkeru na 200 rpm i 30 °C. Alikvot ove kulture je naknadno prebačen u erlemajer od 500 ml koji je sadržao 200 ml YEPD medijuma sa 40 g/l glukoze. Kultura je inicirana pri OD= 0.1 (optička gustina na talasnoj dužini od 600 nm), inkubirana na 200 rpm i 30 °C tokom 16 časova. Izvesna zapremina ove kulture je prebačena u epruvetu sa konusnim dnom od 50 ml i centrifugirana na 4000 rpm tokom 10 min. Istaložene ćelije su 3 puta oprane u destilovanoj vodi centrifugiranjem i resuspendovane su u medijumu za kultivaciju (hidrolizovanom).

Kultivacija u bioreaktoru

[0126] 700 mL hidrolizata šećerne trske je autoklavirano u boci od 1 L. U bioreaktor radne zapremine od 1 L (prethodno autoklaviran), prebačeno je 600 mL hidrolizata, a preostalih 100 mL je prebačeno u bocu od 250 mL (prethodno autoklavirana) za naknadno resuspendovanje inokuluma. Inokulum je pripremljen od ćelija dobijenih prethodnim centrifugiranjem. Ćelije za inokulum su resuspendovane u 100 mL hidrolizata i odmah su zasejane u bioreaktor. Kultura je inicirana pri OD=1. Tokom rasta ćelija, pH vrednost je održavana između 3 i 7 automatskim dodavanjem vodenog rastvora kiselina ili baza, kao na primer, KOH koncentracije 3 mol/L ili H2SO4koncentracije 1mol/L. Temperatura i brzina mešanja su održavane na konstantnim vrednostima od 30 °C i 200 rpm, redom. Da bi se osiguralo anaerobno stanje, medijum za kultivaciju i atmosfera u bioreaktoru su pre inokulacije bili zasićeni protokom gasovitog azota od 2 LN/min (normalnih litara po minuti) tokom 10 minuta. Uzorci su sakupljani u pogodnim intervalima, trenutno smrzavani u tečnom azotu i čuvani zamrznuti na -20 °C za naknadnu analizu pomoću tečne hromatografije visokog učinka (HPLC).

Kvantitativno određivanje prozvoda fermentacije

[0127] Kvantitativno određivanje ksiloze, etanola i glicerola izvedeno je pomoću tečne hromatografije visokog učinka HPLC i koristeći hromatograf Alliance HT (kompanije Waters) sa detektorom indeksa prelamanja (sistem Waters 2414). Merenja su izvedena upotrebom kolone HPX-87H (kompanije BioRad) koja je držana na 35 °C, sa 4 mM sumpornom kiselinom kao mobilnom fazom i protokom od 0.6 mL/min. Kinetika fermentacije mikroorganizma DSM28739 u hidrolizatu šećerne trske, može da se vidi na slici 4.

[0128] Mikroorganizam DSM28739 je trošio glukozu veoma brzo, u približno 30 časova. Posle 70 časova najveći deo ksiloze je takođe bio potrošen. Glavni proizvod fermentacije je bio etanol, koji je dostizao približno 37 g/L. Takođe je uočena proizvodnja glicerola u niskoj koncentraciji. Glavni inhibitor u hidrolizatu, sirćetna kiselina, održavana je na konstantnom nivou tokom svih fermentacija (oko 5 g/L).

[0129] Tabela 3 prikazuje prinos etanola i volumetrijsku produktivnost DSM28739 u hidrolizatu šećerne trske.

Tabela 3: Prinos i volumetrijska produktivnost mikroorganizma DSM28739 u hidrolizatu šećerne trske

Prinos u g/g (grami Volumetrijska produktivnost Linija

proizvedenog etanola po gramu etanola u g/Lh (grami potrošenih šećera) proizvedenog etanola po litru i

2

po času)

DSM28739 0.44 ± 0.009 0.64 0.005

Primer 7 – DOKAZ ZA INSERCIJU KASETA U GENETIČKI MODIFIKOVAN MIKROORGANIZAM DSM28739

[0130] DNK linije DSM28739 korišćena je kao model za lančanu reakciju polimeraze koristeći oligonukleotide u spoljašnjem regionu u odnosu na inserciju ekspresione kasete gena. Za svaku reakciju je korišćen par specifičnih nukleotida za spoljašnji region svake inserirane kasete.

[0131] Nakon eksperimenta sa lančanom reakcijom polimeraze (PCR), na agarozni gel od 0.8% obojen bojom GelRed primenjen je alikvot, i gel je podvrgnut elektroforezi kako bi se razdvojili amplifikovani fragmenti.

[0132] Slika 6 pokazuje gel dobijen elektroforezom reakcija na spoljašnje delove inseriranih kaseta, koja potvrđuje integraciju kvasaca. Na ovoj slici, M predstavlja lestvicu markera od 1 kb; 1a, je kaseta gena XKS1 inserirana pored centromere 2; 1b, negativna kontrola reakcije 1; 2a je kaseta gena XKS1 inserirana pored centromere 8; 2b je negativna kontrola reakcije 2; 3a je kaseta gena TAL1 i RKI1 inserirana pored centromere 12; 3b je negativna kontrola reakcije 3; 4a je kaseta gena TKL1 i RPE1 inserirana pored centromere 13; 4b je negativna kontrola reakcije 4; 5a je kaseta gena XI inserirana pored centromere 5; a 5b je negativna kontrola reakcije 5.

[0133] Dakle, na slici 6 može da se uoči da su kasete korektno inserirane u ciljanu lokaciju. Ovaj rezultat se uočava usled amplifikacije traka koje su slične veličine kao i konstruisana kaseta.

2

2

2

2

1

2

4

4

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Ekspresiona kaseta za transformaciju eukariotske ćelije naznačena time što sadrži kombinaciju sledećih ekspresionih kaseta:

a) ekspresionu kasetu koja sadrži gen koji kodira ksiloza izomerazu sekvence SEQ ID NO: 1, promotor TDH1 nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 2 i terminator TDH1 nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 3;

b) ekspresionu kasetu koja sadrži promotor ADH1 predstavljen sekvencom SEQ ID NO: 8, gen XKS1 predstavljen sekvencom SEQ ID NO: 9 i terminator ADH1 predstavljen sekvencom SEQ ID NO: 10;

c) ekspresionu kasetu koja sadrži promotor TDH1 nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 2, gen TAL1 sekvence SEQ ID NO: 5, gen terminator TDH1 sekvence SEQ ID NO: 3, nakon koga sledi promotor PGK1 sekvence SEQ ID NO: 6, gen RKI1 (SEQ ID NO: 7) i terminator nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 13; i

d) ekspresionu kasetu koja sadrži promotor TDH1 sekvence SEQ ID NO: 02, gen TKL1 sekvence SEQ ID NO: 11, gen koji kodira riboza 5-fosfat epimerazu (SEQ ID NO: 7), terminator TDH1 sekvence SEQ ID NO: 3, nakon koga sledi promotor PGK1 sekvence SEQ ID NO: 6, gen RPE1 sekvence SEQ ID NO: 12 i terminator PGK1 sekvence SEQ ID NO: 13;

pri čemu je navedena ekspresiona kaseta funkcionalna u eukariotskoj ćeliji.

2. Ekspresiona kaseta, prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što navedeni promotor(i) je/su konstitutivni ili prirodno inducibilni.

3. Postupak za transformaciju eukariotske ćelije, naznačen uvođenjem, u ćeliju koja se transformiše, najmanje ekspresione kasete kao što je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1-2.

4. Postupak, prema patentnom zahtevu 3, dodatno naznačen time što sadrži inaktivaciju ili deleciju GRE3 gena (SEQ ID NO: 14) u genomu navedene eukariotske ćelije.

5. Genetički modifikovani mikroorganizam, naznačen time što sadrži najmanje ekspresionu kasetu kao što je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1-2.

6. Mikroorganizam, prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što su jedna ili više navedenih ekspresionih kaseta prisutne u regionu od 5 hiljada prvih baznih parova brojanih od centromere kako u ushodnom tako i u nishodnom pravcu, i može biti čak samo ushodnom, samo nishodnom ili oba istovremeno.

7. Mikroorganizam, prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što promotorske sekvence, kodirajuće sekvence i terminatorske sekvence ekspresionih kaseta su stabilne u genomu mikroorganizma i/ili su prisutne u najmanje 5 kopija u genomu mikroorganizma.

8. Mikroorganizam, prema bilo kom od patentnih zahteva 6-7, naznačen time što gen GRE3 (SEQ ID NO: 14) je inaktiviran ili deletiran u/iz njegovog genoma.

9. Mikroorganizam, prema bilo kom od patentnih zahteva 6-8, naznačen time što je to kvasac iz roda izabranog iz grupe koja se sastoji od: Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula i Yarrowia.

10. Mikroorganizam, prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što mikroorganizam je Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

11. Genetički modifikovani mikroorganizam, naznačen time što je to Saccharomyces cerevisiae DSM28739.

12. Postupak za proizvodnju biogoriva i/ili biohemikalija, naznačen time što sadrži korak kultivacije mikroorganizma kao što je definisan u bilo kom od patentnih zahteva 5-11.

13. Postupak, prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što je prinos postupka najmanje 0.45 grama etanola proizvedenog po gramu ksiloze potrošene od strane mikroorganizma u sintetičkom medijumu koji sadrži ksilozu kao izvor ugljenika.

14. Postupak, prema patentnom zahtevu 12 ili 13, naznačen time što volumetrijska produktivnost je najmanje 0.67 grama etanola proizvedenog po litru svakog časa, kada je u sintetičkom medijumu koji sadrži ksilozu kao izvor ugljenika.

15. Postupak, prema bilo kom od patentnih zahteva 12-14, naznačen time što mikroorganizam je mikroorganizam Saccharomyces cerevisiae DSM28739.