RS60003B1 - Formulacije polipeptida faktora viii - Google Patents

Description

STANJE TEHNIKE

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se uglavnom odnosi na oblast lekova za hemostatske poremećaje.

Stanje tehnike

[0002] Hemofilija A je X-povezan poremećaj krvarenja izazvan mutacijama i/ili brisanjima gena Faktora VIII (FVIII), što dovodi do nedostatka FVIII aktivnosti (Peyvandi, F. i dr. Haemophilia 12:82-89 (2006). Bolest karakteriše spontano krvarenje i prekomerno krvarenje nakon traume. Vremenom, ponovljeno krvarenje u mišićima i zglobovima, koje često počinje u ranom detinjstvu, rezultuje hemofilnom artropatijom i nepovratnim oštećenjima zglobova. Ovo oštećenje je progresivno i može dovesti do ozbiljno ograničene pokretljivosti zglobova, atrofije mišića i hroničnog bola (Rodriguez-Merchan, E.C., Semin. Thromb. Hemost. 29:87-96 (2003)).

[0003] A2 domen je neophodan za prokoagulantnu aktivnost molekula Faktora VIII. Studije pokazuju da svinjski Faktor VIII ima šest puta veću prokoagulantnu aktivnost od ljudskog Faktora VIII (Lollar, P., i E. T. Parker, J. Biol. Chem.266:12481-12486 (1991)), i da se čini da se razlika u aktivnosti koagulacije između ljudskog i svinjskog Faktora VIII zasniva na razlici u aminokiselinskoj sekvenci između jednog ili više ostataka u ljudskom i svinjskom A2 domenu (Lollar, P., i dr., J. Biol. Chem.267:23652-23657 (1992)).

[0004] Tretman hemofilije A je terapija zamene usmerena na obnavljanje FVIII aktivnosti na 1 do 5% normalnog nivoa radi sprečavanja spontanog krvarenja (Mannucci, P.M., i dr., N. Engl. J. Med.344:1773-1779 (2001)). Na raspolaganju su FVIII proizvodi izvedeni iz plazme i rekombinantni FVIII proizvodi za tretman epizoda krvarenja na zahtev ili za sprečavanje nastanka epizoda krvarenja profilaktičkim tretmanom.

[0005] Smanjeni mortalitet, sprečavanje oštećenja zglobova i poboljšan kvalitet života su važna dostignuća usled razvoja FVIII izvedenih iz plazme i rekombinantnih FVIII. Produžena zaštita od krvarenja predstavljala bi još jedan ključni napredak u tretmanu pacijenata sa hemofilijom A.

KRATAK SAŽETAK PRONALASKA

[0006] Na osnovu obelodanjenja koje je ovde sadržano, predmetni pronalazak pruža farmaceutski sastav koji sadrži: (a) 50 IU/ml do 2500 IU/ml od rFVIIIFc polipeptida; (b) 10 mg/ml do 25 mg/ml saharoze; (c) 8,8 mg/ml do 14,6 mg/ml natrijum hlorida (NaCl); (d) 0,75 mg/ml do 2,25 mg/ml L-histidina; (e) 0,75 mg/ml do 1,5 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (f) 0,08 mg/ml do 0,25 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80. manitol, glicin, alanin ili hidroksietil skrob nisu uključeni u farmaceutski sastav. U drugom otelotvorenju, NaCl je jedini agens za povećanje mase.

[0007] U drugim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži oko 13 mg/ml do oko 20 mg/ml saharoze, oko 13,3 mg/ml saharoze, ili oko 20,0 mg/ml saharoze. U još nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži oko 10 mg/ml do oko 13 mg/ml NaCl, oko 12,0 mg/ml NaCl.

[0008] U drugim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži oko 1,03 mg/ml L-histidina do oko 1,55 mg/ml L-histidina. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži 0,75 mg/ml do 1,5 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata, ili oko 0,8 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata do oko 1,18 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata.

[0009] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži oko 0,13% mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80 ili oko 0,20 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0010] U drugim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži rFVIIIFc polipeptid, koji sadrži prvu podjedinicu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% ili 95% identičnosti sa aminokiselinama 20 do 1684 od SEQ ID NO: 2 ili 20 do 2578 od SEQ ID NO : 6, i drugu podjedinicu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% do 95% identičnosti sa aminokiselinama 21 do 247 od SEQ ID NO: 4. U određenim otelotvorenjima, gde rFVIIIFc polipeptid sadrži prvu podjedinicu koja sadrži aminokiseline 20 do 1684 od SEQ ID NO: 2 ili 20 do 2578 od SEQ ID NO: 6, i drugu podjedinicu koja sadrži aminokiseline 21 do 247 od SEQ ID NO: 4.

[0011] U nekim otelotvorenjima, rFVIIIFc polipeptid je prisutan u farmaceutskom sastavu u koncentraciji od oko 50 IU/ml do oko 2500 IU/ml, npr., 83 IU/ml, 167 IU/ml, 250 IU/ml, 333 IU/ml, 500 IU/ml, 667 IU/ml, 1000 IU/ml, 1333 IU/ml, 1667 IU/ml, ili 2000 IU/ml rFVIIIFc polipeptida. U nekim otelotvorenjima, rFVIIIFc polipeptid je prisutan u farmaceutskom sastavu u koncentraciji od 150 IU/ml, 287,5 IU/ml, 431,25 IU/ml, 575 IU/ml, 862,5 IU/ml, 1150 IU/ml, 1725 IU/ml, ml, 2300 IU/ml, rFVIIIFc polipeptida.

[0012] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži: (a) oko 83 IU/ml, oko 167 IU/ml, oko 250 IU/ml, oko 333 IU/ml, oko 500 IU/ml, oko 667 IU/ml, oko 1000 IU/ml, oko 1333 IU/ml, oko 1667 IU/ml, ili oko 2000 IU/ml rFVIIIFc polipeptida; (b) oko 13,3 mg/ml saharoze; (c) oko 12,0 mg/ml NaCl; (d) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (e) oko 0,8 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (f) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0013] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak uključuje farmaceutski komplet koji sadrži: (a) prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži (i) oko 250 IU, oko 500 IU, oko 750 IU, oko 1000 IU, oko 1500 IU, oko 2000 IU, oko 3000 IU, oko 4000 IU, oko 5000 IU ili oko 6000 IU rFVIIIFc polipeptida, (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg natrijum hlorida; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,40 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (v) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i (b) drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, kada se kombinuje sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 83 IU/ml, oko 167 IU/ml, oko 250 IU/ml, oko 333 IU/ml, oko 500 IU/ml, oko 667 IU/ml, oko 1000 IU/ml, oko 1333 IU/ml, oko 1667 IU/ml, ili oko 2000 IU/ml rFVIIIFc polipeptid, respektivno; (ii) oko 13,3 mg/ml saharoze; (iii) oko 12,0 mg/ml NaCl; (iv) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (v) oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorida; i (vi) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0014] Obelodanjenje takođe uključuje postupak za smanjenje ili ublažavanje epizode krvarenja ili tretman ili sprečavanje stanja krvarenja, koji sadrži primenu farmaceutskog sastava koji sadrži FVIII polipeptid.

Predmetni pronalazak i poželjna otelotvorenja su izloženi u priloženim patentnim zahtevima

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1 prikazuje detalje dizajna sekvencijalne PK podgrupe (Krak 1) doziranja i PK uzorkovanja.

Slika 2 prikazuje srednju posmatranu FVIII aktivnost sa rFVIIIFc i rFVIII tokom vremena: test u jednoj fazi koagulacije (logaritamska skala) u sekvencijalnoj farmakokinetičkoj podgrupi. rFVIIIFc je pokazao približno 50% duži poluživot eliminacije i srednje vreme zadržavanja u poređenju sa faktorom VIII divljeg tipa (kratko delujući FVIII polipeptid) (P <0,001).

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0016] Predmetni pronalazak pruža formulaciju za FVIII-Fc.

I. Definicije

[0017] Mora se primetiti da, kako se koristi u ovom opisu i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju i oblike množine, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije.

Oblici jednine, kao i izrazi „jedan ili više“ i „najmanje jedan“, ovde se mogu koristiti naizmenično.

[0018] Izraz „otprilike“ se ovde koristi da označi približno, otprilike, okolo ili unutar oblasti. Kada se izraz „otprilike“ koristi u kombinaciji sa numeričkim rasponom, on menja taj raspon širenjem granica iznad i ispod numeričkih vrednosti koje su iznete. Uglavnom, izraz „otprilike“ se ovde koristi za izmenu numeričke vrednosti iznad i ispod navedene vrednosti sa varijansom od 10 posto, gore ili dole (više ili niže).

[0019] Dalje, „i/ili“, kako se ovde koristi, treba da se uzima kao specifično otkrivanje svake od dve navedene karakteristike ili komponente, sa ili bez druge. Prema tome, izraz „i/ili“, kako se ovde koristi, u frazi kao što je „A i/ili B“ podrazumeva da uključuje „A i B“, „A ili B“, „A“ (sam) i „B“ (sam). Slično tome, izraz „i/ili“ kako se koristi u frazama kao što je „A, B i/ili C“ treba da obuhvati svako od narednih otelotvorenja: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (sam); B (sam); i C (sam).

[0020] Podrazumeva se da gde god su ovde opisane otelotvorenja sa izrazom „sadrži“, takođe su pružena analogna otelotvorenja opisana izrazima „sastoji se od“ i/ili „uglavnom se sastoji od".

[0021] Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ih uobičajeno razume stručnjak u oblasti na koju se ovo obelodanjenje odnosi. Na primer, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, pruža stručnjaku opšti rečnik mnogih izraza koji se koriste u ovom obelodanjenju.

[0022] Jedinice, prefiksi i simboli označeni su u svom Système International de Unites (SI) prihvaćenom obliku. Numerički rasponi uključuju brojeve koji definišu raspon. Ako nije drugačije naznačeno, aminokiselinske sekvence se pišu sa leva na desno, u amino-karboksi orijentaciji. Ovde navedeni naslovi nisu ograničenja različitih aspekata ili otelotvorenja obelodanjenja, već se mogu odnositi na opis u celini. Shodno tome, pojmovi definisani neposredno u nastavku su potpunije definisani pozivanjem na opis u celosti. Aminokiseline se ovde označavaju svojim opšte poznatim troslovnim simbolima jednoslovnim simbolima koje preporučuje IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nukleotidi se takođe označavaju svojim uobičajenim jednoslovnim kodovima.

[0023] Izraz „polipeptid“, „peptid“ i „protein“ se upotrebljavaju naizmenično i odnose se na polimerno jedinjenje koje se sastoji od kovalentno povezanih aminokiselinskih ostataka.

[0024] Izrazi „polinukleotid“ i „nukleinska kiselina“ koriste se naizmenično i odnose se na polimerno jedinjenje koje se sastoji od kovalentno povezanih nukleotidnih ostataka.

Polinukleotidi mogu biti DNK, cDNK, RNK, jednolančani ili dvolančani, vektori, plazmidi, fagi ili virusi. Polinukleotidi uključuju one u Tabeli 10, koji kodiraju polipeptide iz Tabele 11 (pogledati Tabelu 10). Polinukleotidi takođe uključuju fragmente polinukleotida iz Tabele 10, npr., oni koji kodiraju fragmente polipeptida iz Tabele 11, kao što je Faktor VIII, Fc, signalna sekvenca, propeptid i drugi fragmenti polipeptida iz Tabele 11.

[0025] „Primena“, kako se ovde koristi, označava propisivanje ili primenu farmaceutskog sastava koji sadrži polipeptid Faktora VIII predmetnog pronalaska pacijentu farmaceutski prihvatljivim putem. Primeri načina primene uključuju, ali nisu ograničeni na, intravensku, npr., intravenska injekcija i intravenska infuzija, npr., putem centralnog venskog pristupa.

Dodatni putevi primene uključuju potkožnu, intramuskularnu, oralnu, nazalnu i plućnu primenu. Prednosti predmetnog pronalaska su: poboljšana usaglašenost sa režimom; smanjeno prekidanje usled krvarenja; pojačana zaštita zglobova od krvarenja; sprečavanje oštećenja zglobova; smanjeni morbiditet; smanjena smrtnost; dugo delujuća zaštita od krvarenja; smanjeni trombotski događaji; i poboljšan kvalitet života.

[0026] Izrazi „dugotrajno“ i „dugo delujuće“ su ovde korišćeni naizmenično. U jednom otelotvorenju, izraz „dugotrajno“ ili „dugo delujuće“ ukazuje da je FVIII aktivnost kao rezultat primene „dugo delujućeg“ FVIII polipeptida duža od FVIII aktivnosti divljeg tipa FVIII (npr., ADVATE® ili FVIII izveden iz plazme („pdFVIII“). „Duža“ FVIII aktivnost može se meriti bilo kojim poznatim postupcima u oblasti, npr., aPTT test, hromogeni test, ROTEM®, TGA, itd. U jednom otelotvorenju, „duža“ FVIII aktivnost može se pokazati pomoću T1/2beta(aktivnost). U drugom otelotvorenju, „duža“ FVIII aktivnost može se pokazati nivoom FVIII antigena prisutnog u plazmi, npr., Pomoću T1/2beta(antigen). U drugim otelotvorenjima, dugo delujući ili dugo delujući FVIII polipeptid deluje duže u kaskadi koagulacije, npr., deluje duže vreme, u poređenju sa divljim tipom FVIII polipeptida, tj., polipeptidom koji se sastoji od aminokiselina 20 do 1457 od SEQ ID NO: 2, tj., SQ BDD FVIII (REFACTO®) ili polipeptidom koji se sastoji od aminokiselina 20 do 2351 do SEQ ID NO: 6 (ADVATE®).

[0027] Izrazi „kratkotrajno“ i „kratko delujući“ su ovde korišćeni naizmenično. Izraz „kratkotrajno“ ili „kratko delujući“ ukazuje da je FVIII aktivnost kao rezultat primene „kratko delujućeg“ FVIII polipeptida slična ili ista kao FVIII aktivnost divljeg tipa FVIII (npr., ADVATE® (aminokiseline 20 do 2351 od SEQ ID NO: 6), REFACTO® (aminokiseline 20 do 1457 od SEQ ID NO: 2) ili FVIII izveden iz plazme („pdFVIII“) ili kraći od FVIII aktivnost dugo delujućeg FVIII polipeptida. „Kraća“ FVIII aktivnost može se meriti bilo kojim poznatim postupcima, na primer, aPTT testom, hromogenim testom, ROTEM®, TGA, itd. Primeri kratko delujućih FVIII polipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, zreli FVIII polipeptid divljeg tipa (ADVATE®, RECOMBINATE® ili HELIXATE®) ili FVIII polipeptide sa izbrisanim B domenom kao što su SQ BDD FVIII (REFACTO® i XYNTHA®) ili FVIII polipeptidi koji sadrže 21 aminokiselinu iz B domena (tj., SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR, SEQ ID NO: 17) (npr., NOVOEIGHT®).

[0028] Izraz „himerni polipeptid“, kako se ovde koristi, označava polipeptid koji unutar sebe sadrži najmanje dva polipeptida (ili njihove delove, kao što su pod-sekvence ili peptidi) iz različitih izvora. Himerni polipeptidi mogu da uključuju dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili više polipeptida ili njihove delove iz različitih izvora, kao što su različiti geni, različite cDNK, ili različite životinje ili druge vrste. Himerni polipeptidi mogu obuhvatati jedan ili više veznika koji spajaju različite polipeptide ili njihove delove. Prema tome, polipeptidi ili njihovi delovi mogu biti direktno spojeni ili mogu biti indirektno spojeni, preko veznika ili oboje, u okviru jednog himernog polipeptida. Himerni polipeptidi mogu da uključuju dodatne peptide kao što su signalne sekvence i sekvence kao što su 6His i FLAG koji pomažu u prečišćavanju ili detektovanju proteina. Pored toga, himerni polipeptidi mogu imati aminokiseline ili peptidne dodatke N- i/ili C-terminusima. U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid je dugo delujući FVIII polipeptid. Primeri himernih polipeptida predmetnog pronalaska su Faktor VIII-FcRn BP himerni polipeptidi, npr., polipeptidi Faktora VIII-Fc, poput FVIIIFc, SEQ ID NO: 2 ili 6 (Tabela 11), sa ili bez njene signalne sekvence i propeptida.

[0029] „Hibridni“ polipeptidi i proteini, kako se ovde koristi, označava kombinaciju himernog polipeptida sa drugim polipeptidom. Himerni polipeptid i drugi polipeptid u hibridu mogu biti povezani jedni sa drugima preko protein-protein interakcija, kao što su naelektrisanje-naelektrisanje ili hidrofobne interakcije. Himerni polipeptid i drugi polipeptid u hibridu mogu se međusobno povezati disulfidom ili drugim kovalentnim vezama. Hibridi su opisani u WO 2004/101740 i WO 2006/074199. Takođe pogledati U.S. Patent Nos.

7,404,956 i 7,348,004. Drugi polipeptid može biti druga kopija istog himernog polipeptida ili može biti ne-identičan himerni polipeptid. Pogledati, npr., Tabelu 11. U jednom otelotvorenju, drugi polipeptid je polipeptid koji sadrži FcRn vezujući partner. FcRn vezujući partneri vezuju se za FcRn i štite FcRn vezujući partner koji sadrži molekul od katabolizma i tako produžavaju poluživot u plazmi. U drugom otelotvorenju, himerni polipeptid je himerni polipeptid Faktora VIII-Fc, i drugi polipeptid se uglavnom sastoji od Fc, npr., rFVIIIFc rekombinantni fuzioni protein koji se sastoji od jednog molekula rekombinantnog ljudskog FVIII sa izbrisanim B-domenom (BDD-rFVIII), spojenog sa dimernim Fc domenom ljudskog IgG1, bez intervenišućih veznih sekvenci. Ovaj hibridni polipeptid se ovde naziva FVIIIFc monomerni Fc fuzioni protein, FVIIIFc monomerni hibrid, monomerni FVIIIFc hibrid i FVIIIFc monomer-dimer. Pogledati Tabelu 11A. Primeri daju pretkliničke i kliničke podatke za ovaj hibridni polipeptid.

[0030] Drugi polipeptid u hibridu može da sadrži ili se suštinski sastoji od najmanje 90% ili 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 11A (ii) bez signalne sekvence (aminokiseline 21 do 247 od SEQ ID NO: 4) ili najmanje 90% ili 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 11A (ii) sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 247 od SEQ ID NO: 4). Drugi polipeptid može da sadrži ili se suštinski sastoji od sekvence identične aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u Tabeli 11A (ii) bez signalne sekvence (aminokiseline 21 do 247 od SEQ ID NO: 4) ili identične aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u Tabeli 11A (ii) sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 247 od SEQ ID NO: 4).

[0031] Koagulantna aktivnost Faktora VIII izražena je kao Međunarodna jedinica(e) (International Unit - IU). Jedna IU aktivnost Faktora VIII približno odgovara količini Faktora VIII u mililitru normalne ljudske plazme. Dostupno je nekoliko testova za merenje aktivnosti Faktora VIII, uključujući test u jednoj fazi koagulacije (aktivirano delimično tromboplastinsko vreme; aPTT), vreme stvaranja trombina (TGA) i rotacionu tromboelastometriju (ROTEM®).

[0032] Izraz „liofilizat“, kako se ovde koristi, u vezi sa formulacijom prema pronalasku označava formulaciju koja se proizvodi postupcima sušenja smrzavanjem poznatim u struci. Rastvarač (npr. voda) uklanja se zamrzavanjem nakon sublimacije pod vakuumom i desorpcije zaostale vode na povišenoj temperaturi. U farmaceutskoj oblasti, liofilizat obično ima zaostalu vlagu od oko 0,1 do 5% (w/w) i prisutan je u obliku praška ili fizički stabilnog kolača. Za liofilizat je karakteristično brzo rastvaranje nakon dodavanja agensa za rekonstituciju.

[0033] Izraz „rekonstituisana formulacija“, kako se ovde koristi, označava formulaciju koja se liofilizuje i ponovo rastvara dodavanjem razblaživača. Razblaživač može da sadrži, bez ograničenja, vodu za injekcije (WFI), bakteriostatsku vodu za injekcije (BWFI), rastvor natrijum hlorida (npr.0,9% (W/v) NaCl), rastvor glukoze (npr. 5% glukoze), rastvor koji sadrži sufraktant (npr.0,01% polisorbat 20 ili polisorbat 80), pH-puferisan rastvor (npr. rastvori puferisani fosfatima) i njihove kombinacije.

[0034] „Interval doziranja“, kako se ovde koristi, označava vreme koje protekne između više doza koje se primenjuju pacijentu. Interval doziranja se tako može označiti kao raspon.

Interval doziranja u postupcima detektovanja upotrebom himernog FVIII-FcRn BP, npr., himernog FVIII -Fc, može biti najmanje oko jedan i po do osam puta duži od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu količinu (u IU/kg) Faktora VIII bez FcRn BP, npr., Fc deo (tj., polipeptid koji se sastoji od pomenutog FVIII). Interval doziranja prilikom primene, npr., himerni polipeptid Faktora VIII-Fc (ili hibrid) predmetnog pronalaska može biti najmanje oko jedan i po put duži od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu količinu Faktora VIII, bez FcRn BP, npr., Fc deo (tj., polipeptid koji se sastoji od Faktora VIII). Interval doziranja može biti najmanje oko jedan i po do osam puta duži od intervala doziranja potrebnog za ekvivalentnu količinu Faktora VIII bez, npr., Fc deo (ili polipeptid koji se sastoji od Faktora VIII).

[0035] Izraz „učestalost doziranja“, kako se ovde koristi, odnosi se na učestalost primene doza FVIII polipeptida u datom vremenu. Učestalost doziranja može se naznačiti kao broj doza u određenom vremenu, npr., jednom nedeljno ili jednom u dve nedelje.

[0036] Izraz „profilaksa jedne ili više epizoda krvarenja“ ili „profilaktički tretman“, kako se ovde koristi, označava primenu FVIII polipeptida u više doza pacijentu tokom određenog vremena kako bi se povećao nivo FVIII aktivnosti u plazmi pacijenta. U jednom aspektu, „profilaksa jedne ili više epizoda krvarenja“ ukazuje na upotrebu FVIII polipeptida za sprečavanje ili inhibiciju pojave jednog ili više spontanih ili nekontrolisanih krvarenja ili epizoda krvarenja, ili za smanjenje učestalosti jednog ili više spontanih ili nekontrolisanih krvarenja ili epizoda krvarenja. U drugom otelotvorenju, povećani nivo FVIII aktivnosti je dovoljan da smanji učestalost spontanih krvarenja ili da spreči krvarenje u slučaju nepredviđenih povreda. Profilaktički tretman smanjuje ili sprečava epizode krvarenja, na primer, one opisane pod tretmanom na zahtev. Profilaktički tretman može biti individualizovan, o čemu se govori u „intervalu doziranja“, npr., kako bi se nadomestila varijabilnost među pacijentima.

[0037] Izraz „oko dva puta nedeljno“, kako se ovde koristi, označava približan broj, i „oko dva puta nedeljno“ može da sadrži dva puta u jednoj nedelji, npr., prva doza za tri dana i druga doza za tri dana, prva doza za tri dana i druga doza za četiri dana, prva doza za četiri dana i druga doza za tri dana, prva doza za četiri dana i druga doza za četiri dana. Izraz „oko dva puta nedeljno“ može takođe da obuhvata svaka tri dana, svaka četiri dana ili svakih pet dana.

1

[0038] Izraz „oko jednom nedeljno“, kako se ovde koristi, označava približan broj, i „oko jednom nedeljno“ može obuhvatati svakih sedam dana ± dva dana, tj., svakih pet dana do svakih devet dana. Učestalost doziranja „jednom nedeljno“ može biti svakih pet dana, svakih šest dana, svakih sedam dana, svakih osam dana ili svakih devet dana.

[0039] Izraz „individualizovana profilaksa“ ili „profilaktički i individualizovano“, kako se ovde koristi, označava upotrebu FVIII polipeptida za individualizovano doziranje i/ili interval doziranja za sprečavanje ili inhibiciju pojave jednog ili više spontanih i/ili nekontrolisanih krvarenja ili epizoda krvarenja ili za smanje učestalost jednog ili više spontanih i/ili nekontrolisanih krvarenja ili epizoda krvarenja. „Individualizovano“ u kontekstu profilakse u ovoj prijavi koristi se kao sinonim za „prilagođeno“. Na primer, „individualizovana profilaksa“ takođe znači „prilagođena profilaksa“, i „profilaktičko i

individualizovano“ takođe znači „profilaktičko i prilagođeno“. U jednom otelotvorenju, „individualizovani interval“ uključuje svaka 3 dana ± 2 dana, tj., svaki dan do svakih pet dana. Učestalost doziranja „individualizovanih intervala profilakse“ tako može biti svaki dan, svaka dva dana, svaka tri dana, svaka četiri dana ili svakih pet dana.

[0040] Izraz „tretman na zahtev“, kako se ovde koristi, označava tretman koje treba da se odvija tokom kratkog vremenskog perioda i reaguje na postojeće stanje, kao što je epizoda krvarenja ili uočena kratkoročna potreba kao što je planirana operacija. „Tretman na zahtev“ koristi se naizmenično sa „epizodnim“ tretmanom. Uslovi koji mogu zahtevati tretman na zahtev uključuju epizodu krvarenja, hemartrozu, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, hemoragiju, hemoragiju u mišićima, oralnu hemoragiju, traumu, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intraturacikalno krvarenje, prelom kosti, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru ili krvarenje u omotaču iliopsoasa. Uključene su i epizode krvarenja koje nisu navedene. Pacijentu takođe može potrebna hirurška profilaksa, perioperativno upravljanje ili tretman za operaciju. Takve operacije uključuju malu operaciju, veliku operaciju, vađenje zuba, tonzilektomiju, druge stomatološke/torako-facijalne operacije, ingvinalnu herniotomiju, sinovektomiju, totalnu zamenu kolena, drugu zamenu zglobova, kraniotomiju, osteosintezu, traumu, intrakranijalnu operaciju, intra-abdominalnu operaciju, ili intratorakalnu operaciju. Uključene su i hirurške operacije koje nisu navedene.

[0041] Dodatna stanja koji mogu zahtevati tretman na zahtev uključuju manje krvarenja, hematroze, površno krvarenje mišića, krvarenje mekog tkiva, umereno krvarenje, intramuskularno ili krvarenje mekog tkiva sa disekcijom, krvarenje sluzokože, hematurija, veliko krvarenje, krvarenje grkljana, krvarenje retrofarinksa, krvarenja retroperitonijuma, krvarenja centralnog nervnog sistema, modrice, posekotine, ogrebotine, krvarenje u zglobovima, krvarenje iz nosa, krvarenje iz usta, krvarenje iz desni, intrakranijalno krvarenje, intraperitonealno krvarenje, manje spontano krvarenje, krvarenje nakon velike traume, umerene modrice na koži ili spontano krvarenje u zglobovima, mišićima, unutrašnjim organima ili mozgu. Dodatni razlozi za tretman na zahtev uključuju potrebu za operativnim upravljanjem za operaciju ili vađenje zuba, veliku operaciju, opsežnu oralnu operaciju, urološku operaciju, operaciju hernije, ortopedsku operaciju kao što je zamena kolena, kuka ili drugog velikog zgloba.

[0042] Izraz „tretman“ ili „tretiranje“, kako se ovde koristi, označavanja poboljšanje ili smanjenje jednog ili više simptoma bolesti ili poremećaja krvarenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hemofiliju B. U jednom otelotvorenju, „tretman“ ili „tretiranje“ bolesti ili poremećaja krvarenja uključuje sprečavanje jednog ili više simptoma ili poremećaja krvarenja. Kod bolesti ili poremećaja krvarenja izazvanih nedostatkom FVIII (npr., niska početna FVIII aktivnost), izraz „tretman“ ili „tretiranje“ označava terapiju zamene FVIII. Primenom farmaceutskog sastava koji sadrži FVIII polipeptid pacijentu, pacijent može postići i/ili održati nivo nivoa FVIII u plazmi na oko 1 IU/dl ili iznad 1 IU/dl. U drugim otelotvorenjima, „tretman“ ili „tretiranje“ znači smanjenje učestalosti jednog ili više simptoma bolesti ili poremećaja krvarenja, npr., spontane ili nekontrolisane epizode krvarenja. „Tretman“, međutim, ne mora da bude izlečenje.

[0043] Izraz „perioperativno upravljanje“, kako se ovde koristi, označava upotrebu farmaceutskog sastava koji sadrži FVIII polipeptid pre, istovremeno sa ili posle operativnog postupka, npr., hirurške operacije. Upotreba za „perioperativno upravljanje“ jedne ili više epizoda krvarenja uključuje hiruršku profilaksu pre (tj., preoperativno), tokom (tj., intraoperativno) ili posle (tj., postoperativno) operacije za sprečavanje jednog ili više krvarenja ili epizoda krvarenja, ili smanjivanje ili inhibiranje spontanih i/ili nekontrolisanih epizoda krvarenja pre, tokom i nakon operacije.

[0044] „Osnovica“, kako se ovde koristi, je najniži izmereni nivo Faktora VIII u plazmi kod pacijenta pre primene doze. Nivoi FVIII u plazmi mogu se meriti u dve vremenske tačke pre doziranja: prilikom pregleda i neposredno pre doziranja. Alternativno, (a) početna vrednost kod pacijenata čija je FVIII aktivnost pre tretmana iznosila <1%, koji nemaju detektovani FVIII antigen i imaju nonsens genotipove, može se definisati kao 0%, (b) početna vrednost za pacijente čija je FVIII aktivnost pre tretmana iznosila <1% i koji imaju detektovani FVIII antigen može se postaviti na 0,5%, (c) osnovna vrednost za pacijente čija je FVIII aktivnost pre tretmana iznosila između 1 - 2% je Cmin (najniža aktivnost tokom PK studije) i (d) osnovna vrednost za pacijente čija je FVIII aktivnost pre tretmana iznosila ≥2% može se postaviti na 2%. Aktivnost koja je iznad osnovne vrednosti pre doziranja može se smatrati ostatkom leka iz prethodnog tretmana, i može se raspasti do osnovne vrednosti i oduzeti od PK podataka nakon doziranja rFVIIIFc.

[0045] „T1/2β“ ili „T1/2 beta“ ili „Beta HL“, kako se ovde koristi, je poluživot povezan sa fazom eliminacije, t1/2β=(ln2)/konstanta stope eliminacije koja je povezana sa terminalnom fazom. T1/2 betamože se meriti FVIII aktivnošću ili nivoom FVIII antigena u plazmi. T1/2betana osnovu aktivnosti prikazan je kao T1/2 beta(aktivnost) i T1/2 betana osnovu nivoa antigena FVIII može se prikazati kao T1/2 beta(antigen). I T1/2 beta(aktivnost) i T1/2 beta(antigen) mogu se prikazati kao rasponi ili geometrijske sredine.

[0046] „Najniži“, kako se ovde koristi, je najniži nivo FVIII u plazmi koji je dostignut nakon primene doze himernog polipeptida prema ovom pronalasku ili drugog molekula FVIII i pre primene naredne doze, ako postoji. Najniži se ovde upotrebljava naizmenično sa „pragom“. Osnovni nivoi FVIII oduzimaju se od izmerenih nivoa FVIII kako bi se izračunao najniži nivo.

[0047] Izraz „godišnja stopa krvarenja“ („ABR“), kako se ovde koristi, odnosi se na broj epizoda krvarenja (uključujući spontana i krvarenja usled trauma) koje je pacijent doživeo tokom određenog vremenskog perioda, ekstrapolirano na 1 godinu. Na primer, dva krvarenja u šest meseci ukazuju na ABR od četiri. Medijana ABR pruža srednju vrednost među svim posmatranim ABR, što ukazuje da je polovina pacijenata imala pojedinačne ABR manje ili jednake medijani, dok je polovina imala ABR veće ili jednake medijani.

[0048] Izraz „inter kvartilni raspon“ („IQR“), kako se ovde koristi, odnosi se na meru

1

statističke disperzije, jednaku razlici između gornjeg i donjeg kvartila. Za razliku od (ukupnog) raspona, inter kvartilni raspon je robusna statistika, koja ima tačku proboja od 25%, pa se često preferira više od ukupnog raspona. Za simetričnu raspodelu (gde je srednja vrednost jednaka srednjoj liniji, prosek prvog i trećeg kvartila), polovina IQR jednaka je medijani apsolutnog odstupanja (MAD). Medijana je odgovarajuća mera centralne tendencije.

[0049] „Pacijent“, kako se ovde koristi, označava čoveka. Pacijent, kako se ovde koristi, uključuje osobu za koju se zna da ima najmanje jedan događaj epizoda nekontrolisanog krvarenja, kojoj je dijagnostikovana bolest ili poremećaj povezan sa epizodama nekontrolisanog krvarenja, npr., bolest ili poremećaj krvarenja, npr., hemofilija A, koja je podložna epizodama nekontrolisanog krvarenja, npr., hemofilija, ili bilo koja njihova kombinacija. Pacijenti takođe mogu da uključe pojedinca kom preti jedna ili više epizoda nekontrolisanog krvarenja pre određene aktivnosti, npr., operacije, sportske aktivnosti ili bilo kakve naporne aktivnosti. Pacijent može imati baznu FVIII aktivnost manju od 1%, manju od 0,5%, manju od 2%, manju od 2,5%, manju od 3%, ili manju od 4%. Ispitanici takođe uključuju pedijatrijske pacijente. Pedijatrijski ljudski pacijenti su od rođenja do 20 godina života, poželjno od rođenja do 18 godina, od rođenja do 16 godina, od rođenja do 15 godina, od rođenja do 12 godina, od rođenja do 11 godina, od rođenja do 6 godina, od rođenja do 5 godina, od rođenja do 2 godine, ili od 2 do 11 godina.

[0050] „Terapeutska doza“, „doza“, „efektivna doza“ ili „količina doziranja“ kako se ovde koristi, označava dozu koja postiže najniži nivo u plazmi od FVIII aktivnosti najmanje oko 1 IU/dl ili iznad 1 IU/dl kod pacijenta kom se primenjuje farmaceutski sastav koji sadrži FVIII polipeptid. U svrhu predmetnog pronalaska, u jednom aspektu, „doza“ se odnosi na količinu doza koja održava najniži nivo u plazmi FVIII aktivnosti najmanje oko 1 IU/dl ili iznad 1 IU/dl, najmanje oko 2 IU/dl ili iznad 2 IU/dl, najmanje oko 3 IU/dl ili više od 3 IU/dl, najmanje oko 4 IU/dl ili više od 4 IU/dl, ili najmanje oko 5 IU/dl ili više od 5 IU/dl tokom primene farmaceutskog sastava koji sadrži FVIII polipeptid. U drugom otelotvorenju, „doza“ smanjuje ili ublažava učestalost krvarenja ili poremećaja krvarenja. U drugim otelotvorenjima, „doza“ zaustavlja neprekidno, nekontrolisano krvarenja ili epizode krvarenja. U još nekim otelotvorenjima, „doza“ sprečava spontano krvarenje ili epizode krvarenja kod pacijenta podložnog takvom spontanom krvarenju ili epizodama krvarenja. „Doza“ ili „terapijska doza“ ne moraju da izleče hemofiliju.

[0051] Izraz „ciljani zglob“ definisan je kao značajni zglob (npr., kuk, lakat, ručni zglob, rame, koljeno i gležanj) u kom se javi ponovljeno krvarenje (učestalost ≥3 epizode krvarenja u istom zglobu u uzastopnom 6-mesečnom periodu).

[0052] Izraz „epizoda krvarenja“, kako se ovde koristi, prihvata standardizovanu definiciju epizode krvarenja. Epizoda krvarenja započela je od prvog znaka krvarenja i završila se 72 sata nakon poslednjeg tretmana krvarenja, u okviru kog su bilo koji simptom krvarenja na istom mestu ili injekcija udaljena manje od 72 sata, smatrani istom epizodom krvarenja. Svaka injekcija za tretman epizode krvarenja, primenjena više od 72 sata nakon prethodne, smatra se prvom injekcijom za tretman nove epizode krvarenja na istom mestu. Svako krvarenje na drugom mestu smatralo se zasebnom epizodom krvarenja, bez obzira na vreme od poslednje injekcije. Ovu definiciju je predložio Subcommittee on Standards and Criteria, FVIII/FIX pododbor od International Society of Thrombosis and Hemostasis, i koristilo ga je PedNet multicentrično ispitivanje hemofilije.

[0053] Izraz „godišnja stopa krvarenja (ABR), kako se ovde koristi, odnosi se na broj epizoda krvarenja koji se godišnje dodaju svakom pacijentu koristeći narednu formulu:

ABR=Brojepizoda krvarenjatokom periodadelovanja ×365,25 Ukupanbroj danatokom periodadelovanja

[0054] „Varijanta“, kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotid ili polipeptid koji se razlikuje od originalnog polinukleotida ili polipeptida, ali zadržava njegova osnovna svojstva, npr., koagulacionu aktivnost Faktora VIII ili Fc (vezivanje FcRn) aktivnost. Uglavnom, varijante su u celini blisko slične i u mnogim regionima identične originalnom polinukleotidu ili polipeptidu. Varijante uključuju polipeptidne i polinukleotidne fragmente, brisanja, umetanja i modifikovane verzije originalnih polipeptida.

II. Farmaceutski sastav

[0055] Predmetni pronalazak je usmeren na rFVIIIFc polipeptid formulisan kao farmaceutski sastav. Farmaceutski sastav može biti formulisan za primenu na ljudima. Farmaceutski sastavi sadrže farmaceutski prihvatljive nosače, uključujući, na primer, izmenjivače jona, glinicu, aluminijum stearat, lecitin, serumske proteine, kao što je albumin iz ljudskog seruma, puferske materije kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, delimične

1

smeše glicerida zasićenih biljnih masnih kiselina, vodu, soli ili elektrolite, poput protamin sulfata, dinatrijum hidrogen fosfata, kalijum hidrogen fosfata, natrijum hlorida, cinkovih soli, koloidnog silicijuma, magnezijum trisilikata, polivinil pirolidona, supstanci na bazi celuloze, polietilen glikola, natrijum karboksimetilcelulozae, poliakrilata, voskova, polietilenpolioksipropilen-blok polimera, polietilen glikola i vunene masti. Različiti postupci formulisanja predmetnog pronalaska su dobro poznati u struci.

[0056] U određenim formulacijama koje su ovde date, FVIII polipeptid je formulisan kao sterilan, bez konzervansa, nepirogeni, liofilizovani, beli do sivi prašak za kolače, za intravenoznu (IV) primenu. Formulacija se može pruženi u bočici za jednokratnu upotrebu.

[0057] U određenim otelotvorenjima, pružen je formulacija rFVIIIFc u bočici za jednokratnu upotrebu koja je proizvedena tako da sadrži, nakon rekonstitucije sa odgovarajućom količinom razblaživača, oko 83 IU/ml, 167 IU/ml, 250 IU/ml, 333 IU/ml, 500 IU/ml, 667 IU/ml, 1000 IU/ml, 1333 IU/ml, 1667 IU/ml ili 2000 IU/ml dugo delujućeg FVIII polipeptida. U određenim otelotvorenjima u kojima se rastvarač dodaje u krajnju zapreminu od oko 3 ml, bočica za jednokratnu upotrebu može nominalno da sadrži oko 250, oko 500, oko 750, oko 1000, oko 1500, oko 2000, Međunarodnih jedinica (IU) rFVIIIFc.

[0058] U određenim otelotvorenjima, formulacija uključuje, pored aktivnog rFVIIIFc: saharozu (koja može delovati kao stabilizator), natrijum hlorid (koji može delovati kao agens za povećanje mase), L-histidin (koji može delovati kao pufer), kalcijum hlorid i polisorbat 20 ili polisorbat 80 (koji može delovati kao stabilizator). Formulacija je pružena sa razblaživačem koji sadrži sterilni rastvor natrijum hlorida. U nekim otelotvorenjima, razblaživač je dostupan u unapred napunjenom špricu.

[0059] Shodno tome, ovde je pružen farmaceutski sastav koji sadrži određenu količinu rFVIIIFc (u IU), zajedno sa ekscipijensima saharozom, NaCl, L-histidinom, kalcijum hloridom i polisorbatom 20 ili polisorbatom 80. Sastavi koji su ovde pruženi sadrže različite koncentracije različitih ekscipijenasa i koncentracije se mogu izraziti na različite načine. Na primer, koncentracija datog ekscipijensa može se izraziti molarnom koncentracijom (npr., M ili mM), kao težinski/zapreminski procenat, (npr., grama na 100 ml razblaživača), ili kao miligram po mililitru (mg/ml). Ovde prikazane formulacije mogu sadržati određene količine različitih ekscipijenasa sa tačnošću koja varira od približne, npr., koncentracije izražene do

1

samo jedne značajne cifre (npr., oko 0,1% (w/v)), ili sa više preciznosti, npr., od 2, 3, 4, 5 ili 6 značajnih cifri (npr., oko 3,88 mg/ml, sa preciznošću do tri značajne cifre). Potrebni nivo preciznosti može varirati u zavisnosti od, npr., zahteva date regulatorne agencije ili proizvodnog procesa. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži rekonstituisanu formulaciju, koja može biti pružena kao liofilizat, opciono praćena razblaživačem.

[0060] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži oko 50 IU/ml do oko 2500 IU/ml rFVIIIFc, npr., 83 IU/ml, 167 IU/ml, 250 IU/ml, 333 IU/ml, 500 IU/ml, 667 IU/ml, 1000 IU/ml, 1333 IU/ml, 1667 IU/ml, ili 2000 IU/ml rFVIIIFc. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži 83 IU/ml, 167 IU/ml, 250 IU/ml, 333 IU/ml, 500 IU/ml, 667 IU/ml, 1000 IU/ml, 1333 IU/ml, 1667 IU/ml, ili 2000 IU/ml rFVIIIFc u formulaciji koja sadrži oko 13,3 mg/ml ili oko 1,33% (w/v) saharoze, oko 12,0 mg/ml ili oko 205 mM NaCl, oko 1,03 mg/ml ili oko 6,64 mM L-histidina, oko 0,80 mg/ml ili oko 5,4 mM kalcijum hlorid dihidrata, i oko 0,13 mg/ml ili oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0061] U određenim slučajevima, farmaceutski sastav pre liofilizacije sadrži oko 100 IU/ml do oko 4000 IU/ml rFVIIIFc, npr., 150 IU/ml, 287,5 IU/ml, 431,25 IU/ml, 575 IU/ml, 862,5 IU/ml, 1150 IU/ml, 1725 IU/ml, 2300 IU/ml, 2875 IU/ml, ili 3450 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc). U određenim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži 150 IU/ml, 287,5 IU/ml, 431,25 IU/ml, 575 IU/ml, 862,5 IU/ml, 1150 IU/ml, 1725 IU/ml, 2300 IU/ml, 2875 IU/ml, ili 3450 IU/mlo FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc) u formulaciji koja sadrži oko 20,0 mg/ml ili oko 2,0% (w/v) saharoze, oko 18,0 mg/ml ili oko 308 mM NaCl, oko 1,55 mg/ml ili oko 9,8 mM L-histidina, oko 1,18 mg/ml ili oko 8,0 mM kalcijum hlorid dihidrata, i oko 0,2 mg/ml ili oko 0,02% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0062] U određenim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži farmaceutski prihvatljivu količinu saharoze. U određenim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži oko 1% (w/v) do oko 2,5% (w/v) saharoze, poželjno oko 1,3% (w/v) do oko 2% saharoze (w/v) npr., oko 1,33% (w/v) saharoze ili oko 2,0% (w/v) saharoze. U određenim povezanim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži oko 10 mg/ml do oko 25 mg/ml saharoze, poželjno oko 13 mg/ml do oko 20 mg/ml saharoze, npr., oko 13,3 mg/ml saharoze ili oko 20,0 mg/ml saharoze. U

1

drugim otelotvorenjima, stabilizujući agensi poput trehaloze, rafinoze i/ili arginina mogu se koristiti u ovim koncentracijama u kombinaciji sa saharozom.

[0063] U određenim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži oko 150 mM do oko 250 mM NaCl, oko 175 mM do oko 225 mM NaCl, i oko 200 mM do oko 210 mM NaCl, npr., oko 205 mM NaCl. U nekim povezanim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži oko 8,8 mg/ml do oko 14,6 mg/ml NaCl, oko 10 mg/ml NaCl do oko 13 mg/ml, npr., oko 12,0 mg/ml NaCl. U određenim otelotvorenjima, NaCl je povezanim u željenoj koncentraciji u rastvoru razblaživača u kom je rekonstituisan liofilizat koji sadrži rFVIIIFc.

[0064] U drugom otelotvorenju, sastavi predmetnog pronalaska ne uključuju agense za povećanje mase kao što su manitol, glicin, alanin i/ili hidroksietil skrob. U drugim otelotvorenjima, NaCl je jedini agens za povećanje mase.

[0065] U određenim slučajevima, farmaceutski sastav pre liofilizacije sadrži oko 250 mM do oko 350 mM NaCl, oko 275 mM do oko 325 mM NaCl, npr., oko 308 mM NaCl. U određenim povezanim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži oko 14,6 mg/ml do oko 20,5 mg/ml NaCl, oko 16 mg/ml do oko 19 mg/ml, npr., oko 18,0 mg/ml NaCl.

[0066] U određenim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži farmaceutski prihvatljivu količinu L-histidina. U određenim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži oko 5 mM do oko 15 mM L-histidina, npr., oko 6,64 mM L-histidina ili oko 9,8 mM L-histidina. U određenim povezanim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži oko 0,75 mg/ml do oko 2,25 mg/ml L-histidina, npr., oko 1,03 mg/ml L-histidina ili oko 1,55 mg/ml L-histidina. U određenim otelotvorenjima, L-histidin je pružen kao deo liofilizata, koji nakon rekonstitucije odgovarajućom količinom razblaživača pruža L-histidin u željenoj koncentraciji.

[0067] U određenim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži farmaceutski prihvatljivu količinu kalcijum hlorida. U određenim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži oko 5 mM do oko 10 mM kalcijum hlorida, npr., oko 5,4 mM kalcijum hlorida ili oko 8 mM kalcijum hlorida. U određenim povezanim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži oko 0,75 mg/ml do oko 1,5 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata, npr., oko 0.8 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata ili oko 1,18 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata. U određenim otelotvorenjima, kalcijum hlorid je pružen kao deo liofilizata, koji nakon rekonstitucije odgovarajućom količinom razblaživača

1

pruža kalcijum hlorid u željenoj koncentraciji.

[0068] U određenim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži farmaceutski prihvatljivu količinu polisorbata 20 ili polisorbata 80. U određenim povezanim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži oko 0,008% (w/v) do oko 0,025% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80, npr., oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80 ili oko 0,02% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80. U određenim povezanim otelotvorenjima farmaceutski sastav sadrži oko 0,08 mg/ml do oko 0,25 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80, npr., oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80 ili oko 0,20 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80. U određenim otelotvorenjima, polisorbat 20 ili polisorbat 80 su pruženi kao deo liofilizata, koji nakon restitucije sa odgovarajućom količinom razblaživača pruža polisorbat 20 ili polisorbat 80 u željenoj koncentraciji.

[0069] U određenim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži: oko 50 IU/ml do oko 2500 IU/ml rFVIIIFc; oko 1% (w/v) do oko 2,5% (w/v) saharoze; oko 150 mM do oko 250 mM NaCl; oko 5 mM do oko 15 mM L-histidina; oko 5 mM do oko 10 mM kalcijum hlorida; i oko 0,008% (w/v) do oko 0.025% polisorbata 20 ili polisorbata 80. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski sastav je pružen kao liofilizat i razblaživač. U određenim otelotvorenjima, količina liofilizata pruža oko 3 ml farmaceutskog sastava sa željenim sastojcima u željenim koncentracijama.

[0070] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži: oko 50 IU/ml do oko 2500 IU/ml rFVIIIFc; oko 10 mg/ml do oko 25 mg/ml saharoze; oko 8,8 mg/ml do oko 14,6 mg/ml NaCl; oko 0,75 mg/ml do oko 2,25 mg/ml L-histidina; oko 0,75 mg/ml do oko 1,5 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i oko 0,08 mg/ml do oko 0,25 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski sastav je pružen kao liofilizat i razblaživač. U određenim otelotvorenjima, količina liofilizata pruža oko 3 ml farmaceutskog sastava sa željenim sastojcima u željenim koncentracijama.

[0071] Primeri sastava pruženi su u Tabeli 1 i Tabeli 2 u Primerima.

[0072] Na primer, obelodanjenje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 83 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 1,33% (w/v) saharoze; oko 205 mM NaCl; oko 6,64 mM L-histidina; oko 5,4 mM kalcijum

1

hlorid dihidrata i oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 167 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 1,33% (w/v) saharoze; oko 205 mM NaCl; oko 6,64 mM L-histidina; oko 5,4 mM kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 250 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 1,33% (w/v) saharoze; oko 205 mM NaCl; oko 6,64 mM L-histidina; oko 5,4 mM kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 333 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 1,33% (w/v) saharoze; oko 205 mM NaCl; oko 6,64 mM L-histidina; oko 5,4 mM kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 500 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 1,33% (w/v) saharoze; oko 205 mM NaCl; oko 6,64 mM L-histidina; oko 5,4 mM kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 667 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 1,33% (w/v) saharoze; oko 205 mM NaCl; oko 6,64 mM L-histidina; oko 5,4 mM kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 1000 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 1,33% (w/v) saharoze; oko 205 mM NaCl; oko 6,64 mM L-histidina; oko 5,4 mM kalcijum hlorida i oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje takođe pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 1333 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 1,33% (w/v) saharoze; oko 205 mM NaCl; oko 6,64 mM L-histidina; oko 5,4 mM kalcijum hlorida i oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 1667 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 1,33% (w/v) saharoze; oko 205 mM NaCl; oko 6,64 mM L-histidina; oko 5,4 mM kalcijum hlorida i oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80. U drugim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 2000 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 1,33% (w/v) saharoze; oko 205 mM NaCl; oko 6,64 mM L-histidina; oko 5,4 mM kalcijum hlorida i oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

2

[0073] Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 83 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 13,3 mg/ml saharoze; oko 12,0 mg/ml NaCl; oko 1,03 mg/ml L-histidina; oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,10 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 1673 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 13,3 mg/ml saharoze; oko 12,0 mg/ml NaCl; oko 1,03 mg/ml L-histidina; oko 0,80 mg/ml kalcijum-hlorid-dihidrata i oko 0,10 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 250 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 13,3 mg/ml saharoze; oko 12,0 mg/ml NaCl; oko 1,03 mg/ml L-histidina; oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,10 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80, obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 333 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 13,3 mg/ml saharoze; oko 12,0 mg/ml NaCl; oko 1,03 mg/ml L-histidina; oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,10 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 500 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 13,3 mg/ml saharoze; oko 12,0 mg/ml NaCl; oko 1,03 mg/ml L-histidina; oko 0,80 mg/ml kalcijumhlorid-dihidrata i oko 0,10 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 667 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 13,3 mg/ml saharoze; oko 12,0 mg/ml NaCl; oko 1,03 mg/ml L-histidina; oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,10 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 1000 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 13,3 mg/ml saharoze; oko 12,0 mg/ml NaCl; oko 1,03 mg/ml L-histidina; oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,10 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80. Obelodanjenje takođe pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 1333 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 13,3 mg/ml saharoze; oko 12,0 mg/ml NaCl; oko 1,03 mg/ml L-histidina; oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,10 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 1667 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 13,3 mg/ml saharoze; oko 12,0 mg/ml NaCl; oko 1,03 mg/ml L-histidina; oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,10 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80. U drugim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža farmaceutski sastav koji sadrži: oko 2000 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); oko 13,3 mg/ml saharoze; oko 12,0 mg/ml NaCl; oko 1,03 mg/ml L-histidina; oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata i oko 0,10 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0074] Ovo obelodanjenje takođe pruža komponente farmaceutskog kompleta. Takav komplet uključuje jedan ili više kontejnera i opcione dodatke. Ovde je opisan komplet koji olakšava primenu efektivne količine rFVIIIFc pacijentu kom je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, komplet olakšava primenu rFVIIIFc intravenskom infuzijom. U nekim otelotvorenjima, komplet olakšava primenu samom sebi rFVIIIFc intravenskom infuzijom.

[0075] U određenim slučajevima, obelodanjenje pruža farmaceutski komplet koji sadrži: prvi kontejner koji sadrži liofilizirani prašak ili kolač, gde prašak ili kolač sadrže: (i) FVIII polipeptid (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc), (ii) saharozu (i/ili trehaloza, rafinoza ili arginin); (iii) NaCl; (iv) L-histidin; (v) kalcijum hlorid dihidrat; i (vi) polisorbat 20 ili polisorbat 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije koju treba kombinovati sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera. U određenim slučajevima je pruženo dovoljno razblaživača za proizvodnju oko 3 ml FVIII polipeptid (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc) formulacije sa željenim svojstvima kako je ovde obelodanjeno. U nekim otelotvorenjima, drugi kontejner je unapred napunjen špric povezan sa klipom, kako bi se omogućilo dodavanje razblaživača prvom kontejneru, rekonstitucija sadržaja prvog kontejnera i prebacivanje natrag u špric. U nekim otelotvorenjima, komplet dalje pruža adapter za pričvršćivanje špriceva na prvi kontejner. U nekim otelotvorenjima, komplet dalje pruža iglu i infuzionu cev, koja treba da se pričvrsti na špric sa rekonstituisanim FVIII polipeptid (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc) formulacijom koja omogućava IV infuziju formulacije.

[0076] U nekim otelotvorenjima rFVIIIFc je pružen u ukupnoj količini od oko 200 IU do oko 6000 IU, npr., oko 250 IU, oko 500 IU, oko 750 IU, oko 1000 IU, oko 1500 IU, oko 2000 IU, oko 3000 IU, oko 4000 IU, oko 5000 IU ili oko 6000 IU.

[0077] U jednom slučaju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži (i) oko 250 IU FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 83 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); (ii) oko 1,33% (w/v) saharoze; (iii) oko 205 mM NaCl; (iv) oko 6,64 mM L-histidina; (v) oko 5,4 mM kalcijum hlorida; i (vi) oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0078] U narednom slučaju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 500 IU FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc, (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 167 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); (ii) oko 1,33% (w/v) saharoze; (iii) oko 205 mM NaCl; (iv) oko 6,64 mM L-histidina; (v) oko 5,4 mM kalcijum hlorida; i (vi) oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0079] U narednom slučaju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 750 IU FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 250 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); (ii) oko 1,33% (w/v) saharoze; (iii) oko 205 mM NaCl; (iv) oko 6,64 mM L-histidina; (v) oko 5,4 mM kalcijum hlorida; i (vi) oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0080] U narednom slučaju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 1000 IU FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii)

2

oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 333 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); (ii) oko 1,33% (w/v) saharoze; (iii) oko 205 mM NaCl; (iv) oko 6,64 mM L-histidina; (v) oko 5,4 mM kalcijum hlorida; i (vi) oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0081] U narednom slučaju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 1500 IU FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 500 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); (ii) oko 1,33% (w/v) saharoze; (iii) oko 205 mM NaCl; (iv) oko 6,64 mM L-histidina; (v) oko 5,4 mM kalcijum hlorida; i (vi) oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0082] U narednom slučaju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 2000 IU FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 667 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); (ii) oko 1,33% (w/v) saharoze; (iii) oko 205 mM NaCl; (iv) oko 6,64 mM L-histidina; (v) oko 5,4 mM kalcijum hlorida; i (vi) oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0083] U narednom slučaju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 3000 IU FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 1000 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); (ii) oko 1,33% (w/v) saharoze; (iii) oko 205 mM NaCl; (iv) oko 6,64 mM L-histidina; (v) oko 5,4 mM kalcijum hlorida; i (vi) oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0084] U narednom slučaju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 4000 IU FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 1333 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); (ii) oko 1,33% (w/v) saharoze; (iii) oko 205 mM NaCl; (iv) oko 6,64 mM L-histidina; (v) oko 5,4 mM kalcijum hlorida; i (vi) oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0085] U narednom slučaju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 5000 IU FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, kada se kombinuje sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 1667 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); (ii) oko 1,33% (w/v) saharoze; (iii) oko 205 mM NaCl; (iv) oko 6,64 mM L-histidina; (v) oko 5,4 mM kalcijum hlorida; i (vi) oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0086] U narednom slučaju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 6000 IU FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za

2

injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 2000 IU/ml FVIII polipeptida (npr., dugo delujući ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., rFVIIIFc); (ii) oko 1,33% (w/v) saharoze; (iii) oko 205 mM NaCl; (iv) oko 6,64 mM L-histidina; (v) oko 5,4 mM kalcijum hlorida; i (vi) oko 0,013% (w/v) polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0087] U narednom otelotvorenju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 250 IU rFVIIIFc, (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 83 IU/ml rFVIIIFc; (ii) oko 13,3 mg/ml saharoze; (iii) oko 12,0 mg/ml NaCl; (iv) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (v) oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0088] U narednom otelotvorenju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 500 IU rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, kada se kombinuje sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 167 IU/ml rFVIIIFc; (ii) oko 13,3 mg/ml saharoze; (iii) oko 12,0 mg/ml NaCl; (iv) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (v) oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0089] U narednom otelotvorenju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 750 IU rFVIIIFc, (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 250 IU/ml rFVIIIFc; (ii) oko 13,3 mg/ml saharoze; (iii) oko 12,0 mg/ml NaCl; (iv) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (v) oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata

2

[0090] U narednom otelotvorenju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 1000 IU rFVIIIFc, (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, kada se kombinuje sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 333 IU/ml rFVIIIFc; (ii) oko 13,3 mg/ml saharoze; (iii) oko 12,0 mg/ml NaCl; (iv) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (v) oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0091] U narednom otelotvorenju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 1500 IU rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 500 IU/ml rFVIIIFc; (ii) oko 13,3 mg/ml saharoze; (iii) oko 12,0 mg/ml NaCl; (iv) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (v) oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0092] U narednom otelotvorenju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 2000 IU rFVIIIFc, (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 667 IU/ml rFVIIIFc); (ii) oko 13,3 mg/ml saharoze; (iii) oko 12,0 mg/ml NaCl; (iv) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (v) oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0093] U narednom otelotvorenju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 3000 IU rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg

2

saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 1000 IU/ml rFVIIIFc); (ii) oko 13,3 mg/ml saharoze; (iii) oko 12,0 mg/ml NaCl; (iv) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (v) oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0094] U narednom otelotvorenju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 4000 IU rFVIIIFc, (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 1333 IU/ml rFVIIIFc; (ii) oko 13,3 mg/ml saharoze; (iii) oko 12,0 mg/ml NaCl; (iv) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (v) oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0095] U narednom otelotvorenju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 5000 IU rFVIIIFc), (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, kada se kombinuje sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 1667 IU/ml rFVIIIFc; (ii) oko 13,3 mg/ml saharoze; (iii) oko 12,0 mg/ml NaCl; (iv) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (v) oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0096] U narednom otelotvorenju, pružen je farmaceutski komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži: (i) oko 6000 IU rFVIIIFc, (ii) oko 40 mg saharoze; (iii) oko 36 mg NaCl; (iv) oko 3,1 mg L-histidina; (v) oko 2,4 mg kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži: (i) oko 2000 IU/ml rFVIIIFc;

2

(ii) oko 13,3 mg/ml saharoze; (iii) oko 12,0 mg/ml NaCl; (iv) oko 1,03 mg/ml L-histidina; (v) oko 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i (vi) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

[0097] U određenim otelotvorenjima, prva ovde pružen kontejner farmaceutskog kompleta je staklena bočica koja sadrži gumeni čep. U nekim otelotvorenjima, drugi ovde pružen kontejner farmaceutskog kompleta je telo šprica, povezano sa klipom. U određenim otelotvorenjima, špric je unapred napunjena špric koji sadrži razblaživač. U određenim otelotvorenjima, ovde navedeni farmaceutski komplet dalje sadrži adapter koji povezuje staklenu bočicu sa telom šprica. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski komplet koji je ovde pružen dalje sadrži infuzionu cev povezanu sa iglom za spajanje na špric, pogodnu za intravensku infuziju.

[0098] U određenim otelotvorenjima, željena doza rFVIIIFc) se može postići korišćenjem jednog farmaceutskog kompleta kao što je ovde dato. U nekim otelotvorenjima, više od jednog farmaceutskog kompleta može se koristiti za postizanje željene doze. Ovde je pružen postupak kombinovanja ili udruživanja formulacija sadržanih u dva ili više farmaceutskih kompleta kako je ovde dato kako bi se postigla željena doza.

[0099] U nekim slučajevima, FVIII polipeptid za farmaceutski sastav je kratko delujući FVIII polipeptid. U drugim slučajevima, FVIII polipeptid za farmaceutski sastav je FVIII polipeptid dugog delovanja.

[0100] U nekim slučajevima, dugo delujući FVIII polipeptid u farmaceutskom sastavu sadrži Faktor VIII deo i deo koji nije Faktor VIII, npr., heterologni deo. U jednom slučaju, heterologna se može in vivo ili in vitro produžiti poluživot FVIII polipeptida. Primeri delova koji nisu Faktor VIII uključuju, ali nisu ograničeni na, Fc, albumin, PAS sekvencu, transferin, CTP (28 aminokiselinski C-terminalni peptid (CTP) ljudskog horionskog gonadotropina (hCG) sa svoja 4 O-glikana), polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), polipeptid koji vezuje albumin, mali molekuli koji vezuju albumin ili bilo koja njihova kombinacija. Primeri dugo delujućih polipeptida predmetnog pronalaska uključuju, npr., polipeptide Faktora VIII-Fc, polipeptide Faktor VIII-albumina, polipeptide Faktora VIII-PAS, polipeptide Faktor VIII-transferina, polipeptide Faktora VIII-CTP, polipeptide Faktora VIII-PEG, polipeptide Faktora VIII-HES, polipeptide koji vezuju Faktor VIII-albumin ili

2

polipeptide malih molekula koji vezuju Faktor VIII-albumin.

[0101] Faktor VIII (Faktora deo VIII dugo delujućeg FVIII polipeptida ili FVIII kratko delujućeg FVIII polipeptida) može imati najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom Faktora VIII prikazanom u Tabeli 11 bez signalne sekvence (aminokiseline 20 do 1457 od SEQ ID NO: 2; i aminokiseline 20 do 2351 od SEQ ID NO: 6), gde Faktor VIII deo ima aktivnost Faktora VIII. Faktor VIII (Faktor VIII deo himernog polipeptida) može biti identičan aminokiselinskoj sekvenci Faktora VIII prikazanoj u Tabeli 11 bez signalne sekvence (aminokiseline 20 do 1457 od SEQ ID NO: 2; i aminokiseline 20 do 2351 od SEQ ID NO: 6).

[0102] Faktor VIII (Faktor VIII deo dugo delujućeg FVIII polipeptida ili FVIII kratko delujućeg FVIII polipeptida) može imati najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom Faktora VIII prikazanom u Tabeli 11 sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 1457 od SEQ ID NO: 2 i aminokiseline 1 do 2351 od SEQ ID NO: 6), gde Faktor VIII deo ima aktivnost Faktora VIII. Faktor VIII (Faktor VIII deo dugo delujućeg FVIII polipeptida ili kratko delujućeg FVIII polipeptid) može biti identičan aminokiselinskoj sekvenci Faktora VIII prikazanoj u Tabeli 11 sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 1457 od SEQ ID NO: 2 i aminokiseline 1 do 2351 od SEQ ID NO: 6).

[0103] dugo delujući polipeptid može da sadrži sekvencu koja ima najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom Faktora VIII i Fc prikazanom u Tabeli 11A (i) bez signalne sekvence (aminokiseline 20 do 1684 od SEQ ID NO: 2) ili najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ili 100% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom Faktora VIII i Fc prikazanom u Tabeli 11A (i) sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 1684 od SEQ ID NO: 2), gde sekvenca ima aktivnost Faktora VIII. Aktivnost Faktora VIII može se meriti pomoću aktiviranja parcijalnog vremena tromboplastina (aPTT), hromogenog ispitivanja ili drugih poznatih postupaka. dugo delujući FVIII polipeptid može da sadrži sekvencu identičnu aminokiselinskoj sekvenci Faktora VIII i Fc prikazanoj u Tabeli 11A (i), bez signalne sekvence (aminokiseline 20 do 1684 od SEQ ID NO: 2) ili sekvencu identičnu aminokiselinskoj sekvenci Faktora VIII i Fc prikazanoj u Tabeli 11A (i) sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1 do 1684 od SEQ ID NO: 2).

[0104] Kao što je razmatrano iznad, primeri dugo delujućih polipeptida takođe uključuju Faktor VIII spojen za jedan ili više albumin polipeptida, polipeptide koji vezuju albumin ili male molekule koji vezuju albumin. U jednom slučaju, albumin je ljudski albumin. Albumin ili protein koji se vezuje za albumin mogu se spojiti na N-terminalni kraj od FVIII ili na C-terminalni kraj od FVIII, ili umetnuti između dve aminokiseline u FVIII. Poznati su primeri albumina, npr., njegovi fragmenti, koji se mogu koristiti u ovom pronalasku. npr., U.S. Patent No. 7,592,010; U.S. Patent No.6,686,179; i Schulte, Thrombosis Res.124 Suppl. 2:S6-S8 (2009).

[0105] Polipeptidi koji vezuju albumin mogu sadržati, bez ograničenja, domene koji vezuju bakterijske albumine, peptide koji vezuju albumin ili fragmente antitela koji vežu albumin koji se mogu vezati za albumin. Domen 3 iz streptokoknog proteina G, kao što je obelodanjeno od strane Kraulis i dr., FEBS Lett.378:190-194 (1996) and Linhult i dr., Protein Sci.11:206-213 (2002) je primer domena koji vezuje bakterijski albumin. Primeri peptida koji vezuju albumin uključuju seriju peptida koji imaju jezgarenu sekvencu DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 7). Pogledati, npr., Dennis i dr., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002). Primeri fragmenata antitela koji vezuju albumin obelodanjeni su u Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther.9:319-326 (2007); Rooverset i dr., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), i Holt i dr., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008).

[0106] U određenim aspektima, dugo delujući FVIII polipeptid predmetnog pronalaska sadrži najmanje jedno mesto vezivanja za ne-polipeptidni mali molekul, varijantu ili derivat koji se može vezati na njegov albumin. Primer takvih delova koji vezuju albumin je 2-(3-maleimidopropanamido)-6-(4-(4-jodfenil)butanamido)heksanoat („Albu“ oznaka) kako je obelodanjeno kod Trusselet i dr., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009).

[0107] Kao što je razmatrano iznad, primeri dugo delujućih polipeptida takođe uključuju Faktor VIII spojen za bar jedan C-terminalni peptid (CTP) β podjedinice ljudskog horionskog gonadotropina ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata. CTP se može spojiti za Faktor VIII ili na N-terminalnom kraju FVIII ili na C-terminalnom kraju FVIII ili umetnuti između dve aminokiseline u FVIII. Poznato je da jedan ili više CTP peptida spojenih ili umetnutih u rekombinantni protein povećavaju in vivo poluživot tog proteina. Pogledati npr. U.S. Patent

1

No. 5,712,122. Primeri CTP peptida uključuju DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO: 8 ili SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ. Pogledati npr. U.S. objava prijave patenta br. US 2009/0087411 A1.

[0108] Kao što je razmatrano iznad, primeri dugo delujućih FVIII polipeptida takođe uključuju Faktor VII spojen sa najmanje jednom PAS sekvencom ili njenim fragmentom, varijantom ili derivatom. PAS sekvenca se može spojiti za N-terminalni kraj od FVIII ili na C-terminalni kraj od FVIII ili umetnuti između dve aminokiseline u FVIII. PAS peptid ili PAS sekvenca, kako se ovde koristi, označava aminokiselinsku sekvencu koja sadrži uglavnom ostatke alanina i serina ili sadrži uglavnom ostatke alanina, serina i prolina, gde aminokiselinska sekvenca formira nasumičnu konformaciju zavojnice pod fiziološkim uslovima. Prema tome, PAS sekvenca je gradivni blok, aminokiselinski polimer, ili kaseta sekvence koja sadrži, sastoji se u osnovi od alanina, serina i prolina koji se mogu koristiti kao deo heterologne grupe u himernom proteinu. Aminokiselinski polimer takođe može da formira nasumičnu konformaciju zavojnice kada se ostaci koji nisu alanin, serin i prolin dodaju kao manji sastavni deo u PAS sekvenci. Pod „manjim sastavnim delom“ se podrazumeva da se aminokiseline koje nisu alanin, serin i prolin mogu dodati u određenom stepenu u PAS sekvenci, npr., do oko 12%, tj. oko 12 od 100 aminokiselina PAS sekvence, do oko 10%, do oko 9%, do oko 8%, oko 6%, oko 5%, oko 4%, oko 3%, tj. oko 2%, ili oko 1%, aminokiselina. Aminokiseline koje nisu alanin, serin i prolin mogu se izabrati iz grupe koju čine Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, i Val. U fiziološkim uslovima, PAS peptid formira nasumičnu konformaciju zavojnice i na taj način može posredovati povećanu in vivo i/ili in vitro stabilnost na rekombinantni protein predmetnog pronalaska i ima prokoagulantno delovanje.

[0109] Neograničavajući primeri PAS peptida uključuju ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 10), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 11), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 12), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 13), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 14), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 15), ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 16) ili bilo koje njihove varijante, derivate, fragmente ili kombinacije. Dodatni primeri PAS sekvence su poznati iz, npr., US objava patenta br.2010/0292130 A1 i PCT objava prijave br.. WO 2008/155134 A1. Evropski izdat patent EP2173890.

2

[0110] Kao što je razmatrano iznad, primeri dugo delujućih FVIII polipeptida takođe uključuju Faktor VIII spojen sa bar jednim peptidom ili fragmentom transferina, njegovom varijantom ili derivatom. Najmanje jedan transferin peptid se može spojiti na N-terminalni kraj od FVIII ili na C-terminalni kraj od FVIII ili umetnuti između dve aminokiseline u FVIII. Bilo koji transferin može biti spojen ili ubačen u rekombinantni FVIII protein predmetnog pronalaska. Kao primer, divlji tip ljudskog Tf (Tf) je 679 aminokiselinski protein, od oko 75 KDa (ne računajući glikozilaciju), sa dva glavna domena, N (oko 330 aminokiselina) i C (oko 340 aminokiselina), za koje se čini da potiču iz umnožavanja gena. Pogledati GenBank pristupni brojevi NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 i S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[0111] Transferin transportuje gvožđe putem endocitoze posredovane receptorima (TfR). Nakon puštanja gvožđa u endozomski odeljak i nakon što se Tf-TfR kompleks reciklira na površinu ćelije, Tf se oslobađa nazad u vanćelijski prostor za naredni ciklus transporta gvožđa. Tf poseduje dugi poluživot koji prelazi 14-17 dana (Li i dr., Trends Pharmacol. Sci.

23:206-209 (2002)). Transferin fuzioni proteini su proučavani za produženje perioda poluživota, ciljane isporuke za terapiju raka, oralnu primenu i stalne aktivacije proinsulina (Brandsma i dr., Biotechnol. Adv., 29: 230-238 (2011); Bai i dr., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 102:7292-7296 (2005); Kim i dr., J. Pharmacol. Exp. Ther., 334:682-692 (2010); Wang i dr., J. Controlled Release 155:386-392 (2011)).

[0112] Kao što je razmatrano iznad, primeri dugo delujućih FVIII polipeptida takođe uključuju Faktor VIII spojen sa najmanje jednim delom polietilen glikola (PEG).

[0113] PEGilirani FVIII može se odnositi na konjugat formiran između FVIII i najmanje jednog molekula polietilen glikola (PEG). PEG je komercijalno dostupan u velikom broju molekularnih težina i rasponu prosečne molekularne mase. Tipični primeri raspona prosečne molekularne mase PEG uključuju, ali nisu ograničeni na, oko 200, oko 300, oko 400, oko 600, oko 1000, oko 1300-1600, oko 1450, oko 2000, oko 3000, oko 3000-3750, oko 3350, oko 3000-7000, oko 3500-4500, oko 5000-7000, oko 7000-9000, oko 8000, oko 10000, oko 8500-11500, oko 16000-24000, oko 35000, oko 40000, oko 60000, i oko 80000 daltona. Ove prosečne molekularne težine date su samo kao primeri i nisu predviđene ni na koji način da ograničavaju.

[0114] dugo delujući FVIII polipeptid koristan za pronalazak može se PEGilirati tako da uključuje mono- ili poli-(npr., 2-4) PEG delove. PEGilacija se može izvesti bilo kojom od reakcija PEGilacije poznatih u struci. Postupci za dobijanje proizvoda PEGiliranog proteina će uglavnom uključivati (i) reakciju polipeptida sa polietilen glikolom (kao što je reaktivni ester ili aldehidni derivat PEG) pod uslovima kada se peptid predmetnog pronalaska vezuje za jednu ili više PEG grupa; i (ii) dobijanje proizvoda reakcije. Uglavnom, optimalni reakcioni uslovi za reakcije odrediće se za svaki slučaj na osnovu poznatih parametara i željenog rezultata.

[0115] Na primer, veliki broj postupaka PEG vezivanja je dostupan stručnjacima u ovoj oblasti, na primer Malik F i dr., Exp. Hematol.20:1028-35 (1992); Francis, Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992); Evropske objave patenata br. EP0401384, EP0154316, i EP0401384; i Međunarodna prijave patenta br. WO92/16221 i WO95/34326. Kao neograničavajući primer, varijante FVIII mogu sadržati supstitucije cisteina na jednom ili više mesta umetanja u FVIII, i cisteini mogu biti dalje konjugovani sa PEG polimerom.

Pogledati Mei i dr., Blood 116:270-279 (2010) i U.S. Patent No.7,632,921.

[0116] Kao što je razmatrano iznad, primeri dugo delujućih FVIII polipeptida takođe uključuju Faktor VIII spojen na bar jedan hidroksietil skrob (HES) polimer. HES je derivat amilopektina koji se prirodno javlja i razgrađuje se alfa-amilazom u organizmu. HES pokazuje povoljna biološka svojstva i koristi se kao agens za nadoknadu zapremine krvi i u terapiji hemodilukcijom u klinikama. Pogledati, npr., Sommermeyer i dr., Krankenhauspharmazie 8:271-278 (1987); i Weidler i dr., Arzneim.-Forschung/Drug Res. 41: 494-498 (1991).

[0117] HES uglavnom karakteriše raspodela molekularne težine i stepen supstitucije. HES ima srednju molekularnu masu (srednja težina) od 1 do 300 kD, od 2 do 200kD, od 3 do 100 kD, ili od 4 do 70kD. Hidroksietil skrob dalje može da pokaže molarni stepen supstitucije od 0,1 do 3, od 0,1 do 2, od 0,1 do 0,9, ili od 0,1 do 0,8, i odnos između C2:C6 supstitucije u rasponu od 2 do 20 u odnosu na hidroksietil grupe. HES sa srednjom molekularnom težinom od oko 130 kD je VOLUVEN® kompanije Fresenius. VOLUVEN® je veštački koloid, koji se koristi, npr., za zamenu zapremine koja se koristi u terapijskoj indikaciji za terapiju i profilaksu hipovolemije. Postoje brojni postupci za HES vezivanje dostupni stručnjacima u

4

ovoj oblasti, npr., iste postupci kao oni gore opisani za PEG vezivanje.

[0118] U nekim slučajevima, dugo delujući FVIII polipeptid koji sadrži FVIII deo ima produžen poluživot (t1/2) preko polipeptida koji se sastoji od istog FVIII dela, bez dela koji nije FVIII. dugo delujući FVIII polipeptid sa povećanim t1/2može se ovde navesti kao dugo delujući FVIII. Dugo delujući himerni polipeptidi Faktora VIII uključuju, npr., Faktor VIII spojen sa Fc (uključujući, npr., himerne polipeptidi Faktora VIII u obliku hibrida, kao što je FVIIIFc monomerni dimerni hibrid; pogledati primer, Tabelu 11A; i US Patent Nos.

7,404,956 i 7,348,004) i Faktor VIII spojen za albumin.

[0119] Ovde korišćen polipeptid Faktora VIII je funkcionalni polipeptid Faktora VIII u svojoj normalnoj ulozi u koagulaciji, osim ako nije drugačije navedeno. Prema tome, izraz Faktor VIII uključuje varijantne polipeptide koji su funkcionalni. Proteini Faktora VIII mogu biti ljudski, svinjski, pseći i mišji proteini Faktora VIII. Poznate su polipeptidne i polinukleotidne sekvence pune dužine, kao i mnogi funkcionalni fragmenti, mutanti i modifikovane verzije. Primeri sekvenci ljudskog Faktora VIII prikazani su kao sekvence u SEQ ID NO: 2 ili 6 (Tabela 11). Polipeptidi Faktora VIII uključuju, npr., Faktor VIII pune dužine, faktor VIII pune dužine minus Met na N-terminusu, zreli Faktor VIII (minus signalna sekvenca), zreli Faktor VIII sa dodatnim Met na N-terminusu, i/ili Faktor VIII sa potpunim ili delimičnim brisanjem B domena. Varijante Faktora VIII uključuju brisanje B domena, bilo delimično ili potpuno brisanje.

[0120] Poznato je mnogo varijanti funkcionalnog Faktora VIII, kao što je razmatrano iznad i u nastavku. Pored toga, stotine nefunkcionalnih mutacija Faktora VIII identifikovane su kod pacijenata sa hemofilijom, i utvrđeno je da efekat ovih mutacija na funkciju Faktora VIII više odgovara mestu gde leže unutar trodimenzionalne strukture Faktora VIII, nego na prirodu0 supstitucija (Cutler i dr., Hum. Mutat.19:274-8 (2002)). Pored toga, poređenjem Faktora VIII od ljudi i drugih vrsta utvrđeni su sačuvani ostaci, koji su verovatno potrebni za funkcionisanje (Cameron i dr., Thromb. Haemost.79:317-22 (1998); US 6,251,632).

[0121] Gen ljudskog Faktora VIII je izolovan i eksprimiran u ćelijama sisara (Toole, J. J., i dr., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., i dr., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., i dr., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., i dr., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; U.S. Pat. No.4,757,006), i aminokiselinska sekvenca je izvedena iz cDNK. Capon i dr., U.S. Pat. No.4,965,199, obelodanjuje postupak rekombinantne DNK za proizvodnju Faktora VIII u ćelijama domaćina sisara i prečišćavanje ljudskog Faktora VIII. Prijavljeno je eksprimiranje ljudskog Faktora VIII u CHO ćelijama (jajnika kineskog hrčka) i BHK (ćelije bubrega beba hrčaka). Ljudski Faktor VIII je modifikovan tako da briše deo ili čitav B domen (U.S. Pat. Nos. 4,994,371 i 4,868,112,) i izvršena je zamena ljudskog B domena Faktora VIII sa ljudskim B domenom Faktora V (U.S. Pat. br.5,004,803). cDNK sekvenca koja kodira ljudski Faktor VIII i predviđena aminokiselinska sekvenca prikazane su u SEQ ID NO: 1 i 2, respektivno, u US objava prijave br. 2005/0100990.

[0122] U.S. Pat. No.5,859,204, Lollar, J. S., izveštava o funkcionalnim mutantima Faktora VIII koji imaju smanjenu antigenost i smanjenu imunoreaktivnost. U.S. Pat. No.6,376,463, Lollar, J. S., takođe izveštava o mutantima Faktora VIII koji imaju smanjenu imunoreaktivnost. US Objava prijave br.2005/0100990, Saenko i dr., izveštava o funkcionalnim mutacijama u A2 domenu Faktora VIII.

[0123] Brojni funkcionalni molekuli Faktora VIII, uključujući brisanja B domene, obelodanjeni su u narednim patentima US 6,316,226 i US 6,346,513, oba dodeljena Baxter; US 7,041,635 dodeljen In2Gen; US 5,789,203, US 6,060,447, US 5,595,886, i US 6,228,620 dodeljen Chiron; US 5,972,885 i US 6,048,720 dodeljen Biovitrum, US 5,543,502 i US 5,610,278 dodeljen Novo Nordisk; US 5,171,844 dodeljen Immuno Ag; US 5,112,950 dodeljen Transgene S.A.; US 4,868,112 dodeljen Genetics Institute.

[0124] Objavljena je sekvenca svinjskog Faktora VIII, (Toole, J. J., i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986)), i zabeležena je kompletna svinjska cDNK sekvenca dobijena PCR amplifikacijom sekvenci Faktora VIII iz biblioteke cDNK svinjske slezine (Healey, J. F. i dr., Blood 88:4209-4214 (1996)). Hibridni ljudski/svinjski Faktor VIII sa supstitucijama svih domena, svih podjedinica i specifičnih aminokiselinskoj sekvenci su obelodanjeni u U.S. Pat. No.5,364,771 odstrane Lollar and Runge, i u WO 93/20093. U novije vreme, nukleotidne i odgovarajuće aminokiselinske sekvence A1 i A2 domena svinjskog Faktora VIII i himernog Faktor VIII sa svinjskim A1 i/ili A2 domenima supstituisanim za odgovarajuće ljudske domene prijavljeni su u WO 94/11503. U.S. Pat. No.

5,859,204, Lollar, J. S., takođe obelodanjuje svinjsku sDNK i izvedene aminokiselinske sekvence. US Pat. No.6,458,563, obelodanjuje svinjski Faktor VIII sa izbrisanim B domenom.

[0125] „B domen“ Faktora VIII, kako se ovde koristi, je isti kao B domen poznat u struci, koji je definisan internom identičnošću aminokiselinske sekvence i mesta proteolitičkog cepanja trombinom, npr., ostaci Ser741-Arg1648 zrelog ljudskog Faktora VIII pune dužine. Ostali domeni ljudskog Faktora VIII su definisani narednim aminokiselinskim ostacima: A1, ostaci Ala1-Arg372; A2, ostaci Ser373-Arg740; A3, ostaci Ser1690-Ile2032; C1, ostaci Arg2033-Asn2172; C2, ostaci Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 sekvenca uključuje ostatke Ser1690-Tyr2332. Preostala sekvenca, ostaci Glu1649-Arg1689, obično se nazivaju peptid aktiviranja lakog lanca Faktora VIII. Lokacije granica za sve domene, uključujući B domene, za svinjski, mišji i pseći Faktor VIII takođe su poznate u struci. U jednom aspektu, B domen Faktora VIII se briše („Faktor VIII sa izbrisanim B domenom“ ili „BDD FVIII“). Primer BDD FVIII je REFACTO® (rekombinantni BDD FVIII), koji ima sekvencu kao Faktor VIII deo sekvence u Tabeli 11A (i) (aminokiseline 1 do 1457 ili 20 do 1457 od SEQ ID NO: 2). U drugom otelotvorenju, Faktor VIII sa izbrisanim B domenom sadrži netaknuto intracelularno mesto obrade, koje odgovara argininu u ostatku 754 od Faktora VIII sa izbrisanim B domenom, što odgovara ostatku arginina 773 od SEQ ID NO: 2, ili ostatku 1648 od Faktora VIII pune dužine, što odgovara ostatku arginina 1667 od SEQ ID NO: 6. Brojevi ostataka sekvencu koji su ovde korišćeni bez pozivanja na bilo koje SEQ ID brojeve odgovaraju sekvenci Faktora VIII bez signalne peptidne sekvence (19 aminokiselina), osim ako nije drugačije naznačeno. Na primer, S743/Q1638 Faktora VIII pune dužine odgovara S762/Q1657 od SEQ ID NO: 6 zbog 19 aminokiselinske signalne peptidne sekvence. U drugim otelotvorenjima, FVIII sa izbrisanim B domenom sadrži supstituciju ili mutaciju na položaju aminokiseline koji odgovara Argininu 1645, supstituciju ili mutaciju na položaju aminokiseline koji odgovara Argininu 1648, ili supstituciju ili mutaciju na položajima aminokiselina koji odgovaraju Argininu 1645 i Argininu 1648 u Faktoru VIII pune dužine. U nekim otelotvorenjima, aminokiselina supstituisana na položaju aminokiseline koji odgovara Argininu 1645 je različita aminokiselina od aminokiseline supstituisane na položaju aminokiseline koji odgovara Argininu 1648. U nekim otelotvorenjima, supstitucija ili mutacija je aminokiselina koja nije arginin, npr., alanin.

[0126] „Faktor VIII sa izbrisanim B domenom“ može imati potpuna ili delimična brisanja kako je obelodanjeno u U.S. Patentima br.6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, i 6,458,563. U nekim otelotvorenjima, sekvenca Faktora VIII sa izbrisanim B domenom predmetnog pronalaska sadrži bilo koje od brisanja obelodanjenih u kol. 4, red 4 do kol.5, red 28 i primeri 1-5 od U.S. Patent No.6,316,226 (takođe u US 6,346,513). U nekim otelotvorenjima, Faktor VIII sa izbrisanim B domenom predmetnog pronalaska ima brisanje obelodanjeno u kol.2, redovi 26-51 i primeri 5-8 od U.S. Patent No.

5,789,203 (takođe US 6,060,447, US 5,595,886, i US 6,228,620). U nekim otelotvorenjima, Faktor VIII sa izbrisanim B domenom ima brisanje opisano u kol.1, red 25 do kol.2, red 40 od US Patent No.5,972,885; kol.6, redovi 1-22 i primer 1 od U.S. Patent no.6,048,720; kol.

2, redovi 17-46 od U.S. Patent No.5,543,502; kol.4, red 22 do kol.5, red 36 od U.S. Patent no. 5,171,844; kol.2, redovi 55-68, slika 2 i primer 1 od U.S. Patent No.5,112,950; kol.2, red 2 do kol.19, red 21 i tabela 2 od U.S. Patent No.4,868,112; kol.2, red 1 do kol.3, red 19, kol.3, red 40 do kol.4, red 67, kol.7, red 43 do kol.8, red 26 i kol.11, red 5 do kol.13, red 39 od U.S. Patent no.7,041,635; ili kol.4, redovi 25-53, od U.S. Patent No.6,458,563. U nekim otelotvorenjima, Faktor VIII sa izbrisanim B domenom ima brisanje većeg dela B domena, ali još uvek sadrži amino-terminalne sekvence B domena koje su neophodni za in vivo proteolitičku obradu primarnog proizvoda za prevođenje u dva polipeptidna lanca (tj., intracelularno mesto za obradu), kao što je obelodanjeno u WO 91/09122. U nekim otelotvorenjima, Faktor VIII sa izbrisanim B domenom konstruisan je sa brisanjem aminokiselina 747-1638, tj., praktično potpunim brisanjem B domena. Hoeben R.C., i dr. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Faktor VIII sa izbrisanim B domenom takođe može da sadrži brisanje aminokiselina 771-1666 ili aminokiselina 868-1562 Faktora VIII. Meulien P., i dr. Protein Eng.2(4): 301-6 (1988). Dodatna brisanja B domena koja su deo pronalaska uključuju, npr.,: brisanje aminokiselina 982 do 1562 ili 760 do 1639 (Toole i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.83:5939-5942 (1986)), 797 do 1562 (Eaton i dr., Biochemistry 25:8343-8347 (1986)), 741 do 1646 (Kaufman (PCT objavljena prijava No. WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver i dr., DNA 6:553-564 (1987)), 741 do 1648 (Pasek (PCT prijava br.88/00831)), 816 do 1598 ili 741 do 1689 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597)), od kojih je svaki. U nekim otelotvorenjima, izbrisani domen B domena FVIII sadrži delimično brisanje u B domenu, tj. ima 21 aminokiselinu iz B domena (tj.

SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR, koji je SEQ ID NO: 17) obelodanjen u US Prijava br. 20100286067 i US Prijava br. US 20120093840. Svako od prethodnih brisanja može se izvršiti u bilo kojoj sekvenci Faktora VIII.

[0127] U jednom otelotvorenju, Faktor VIII sa izbrisanim B domenom deo iz FVIII polipeptida se obrađuje u dva lanca povezana (ili spojena) metalnom vezom, gde prvi lanac sadrži teški lanac (A1-A2-delimični B) i drugi lanac sadrži laki lanac (A3-C1-C2). U drugom otelotvorenju, Faktor VIII sa izbrisanim B domenom deo je jednolančani Faktor VIII.

Jednolančani Faktor VIII može da sadrži intracelularno mesto za obradu, koje odgovara Argininu u ostatku 754 od Faktora VIII sa izbrisanim domenom B (ostatak 773 od SEQ ID NO: 2) ili u ostatku 1648 Faktora VIII pune dužine (ostatak 1657 od SEQ ID NO: 6).

[0128] Metalna veza između teškog i lakog lanca može biti bilo koji metal poznat u struci. Na primer, metali korisni za pronalazak mogu biti dvovalentni metalni joni. Metali koji se mogu koristiti za povezivanje teškog i lakog lanca uključuju, ali nisu ograničeni na, Ca<2+>, Mn<2+>, ili Cu<2+>. Fatouros i dr., Intern. J Pharm.155(1): 121-131 (1997); Wakabayashi i dr., JBC.

279(13): 12677-12684 (2004).

[0129] Ovde korišćeni FVIII polipeptid može da sadrži obrađeni Faktor VIII ili jednolančani Faktor VIII ili njihovu kombinaciju. „Obrađeni Faktor VIII“, kako se ovde koristi, označava Faktor VIII koji je razdvojen kod Arginina 1648 (za Faktor VIII pune dužine) ili Arginina 754 (za Faktor VIII sa izbrisanim B domenom), tj., mesto za intracelularnu obradu. Zbog razdvajanja na mestu intracelularne obrade, obrađeni Faktor VIII sadrži dva polipeptidna lanca, od kojih je prvi teški lanac, a drugi je laki lanac. Na primer, obrađeni fuzioni protein Faktora VIII-Fc (tj., teški i laki lanac spojeni na Fc) je podvrgnut na približno 90 kDa i 130 kDa na ne-redukcionom SDS-PAGE, respektivno, odnosno 90 kDa i 105 kDa na redukcionom SDS-PAGE, respektivno. Zbog toga je, u jednom otelotvorenju, najmanje oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98 %, oko 99%, ili oko 100% Faktor VIII dela u dugo delujućem polipeptidu ili kratko delujućem FVIII polipeptidu obrađen Faktor VIII. U drugom otelotvorenju, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99 %, ili oko 100% Faktor VIII dela u dugo delujućem polipeptidu ili kratko delujućem FVIII polipeptidu je obrađen Faktor VIII. U posebnom otelotvorenju, FVIII polipeptid koji sadrži obrađeni Faktor VIII je prečišćen (ili izolovan) od polipeptida koji sadrži jednolančani Faktor VIII, i najmanje oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili oko 100% Faktor VIII dela u dugo delujućem polipeptidu ili kratko delujućem FVIII polipeptidu je prerađen Faktor VIII. U nekim otelotvorenjima, FVIII polipeptid sadrži oko 15% do 25% jednolančanog FVIII polipeptida i oko 75% do oko 85% prerađenog FVIII polipeptida.

[0130] Jednolančani Faktor VIII, „SC Faktor VIII“ ili „SCFVIII“, kako se ovde koristi, označava Faktor VIII koji nije razdvojen na mestu Arginina (ostatak 1648 za Faktor VIII pune dužine (tj. ostatak 1667 od SEQ ID NO: 6) ili ostatak 754 za Faktor VIII sa izbrisanim B domenom (tj. ostatak 773 SEQ ID NO: 2). Prema tome, jednolančani Faktor VIII u FVIII polipeptidu koji se ovde koristi sastoji se od jednog lanca. U jednom otelotvorenju, jednolančani Faktor VIII sadrži netaknuto mesto za intracelularnu obradu. U još jednom otelotvorenju, jednolančani Faktor VIII predmetnog pronalaska sadrži supstituciju ili mutaciju na položaju aminokiseline koji odgovara Argininu 1645, supstituciju ili mutaciju na položaju aminokiseline koji odgovara Argininu 1648, ili supstituciju ili mutaciju na položajima aminokiselina koji odgovaraju Argininu 1645 i Argininu 1648 u Faktoru VIII pune dužine. U drugim otelotvorenjima, aminokiselina supstituisana na položaju aminokiseline koji odgovara Argininu 1645 je različita aminokiselina od aminokiseline supstituisane na položaju aminokiseline koji odgovara Argininu 1648. U nekim otelotvorenjima, supstitucija ili mutacija je aminokiselina koja nije arginin, npr., izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan, valin, alanin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, prolin, selenocistein, serin, tirozin, histidin, tarotinin, ornitin, pirolizin ili taurin. Fuzioni protein jednolančanog Faktora VIII-Fc može da se podvrgne na približno 220 kDa na ne-redukcionom SDS-PAGE i približno na 195 kDa na redukcionom SDS-PAGE.

[0131] Faktor VIII deo u FVIII polipeptidu korišćenom ovde ima aktivnost Faktora VIII. Aktivnost Faktora VIII može se meriti bilo kojim postupcima poznatim u struci. Na primer, jedan od tih postupaka može biti hromogeni test. Mehanizam hromogenog testa zasnovan je na principima kaskade koagulacije krvi, gde aktivirani Faktor VIII ubrzava konverziju faktora X u faktor Xa u prisustvu aktiviranog faktora IX, fosfolipida i jona kalcijuma. Aktivnost Faktora Xa procenjuje se hidrolizom supstrata p-nitroanilida (pNA) specifičnog za Faktor Xa. Početna brzina oslobađanja p-nitroanilina izmerena na 405 nM direktno je proporcionalna aktivnosti faktora Xa, i samim tim i aktivnosti Faktora VIII u uzorku. Hromogeni test je preporučen od strane Factor VIII and Factor IX Subcommittee of the Scientific and Standardization Committee (SSC) of the International Society on Thrombosis and Hemostasis (ISTH). Od 1994. godine, hromogeni test je takođe referentan postupak od European Pharmacopoeia za dodelu potencijala koncentrata FVIII. Prema tome, u jednom aspektu, FVIII polipeptid koji sadrži jednolančani Faktor VIII ima aktivnost Faktora VIII

4

uporedivu sa FVIII polipeptidom koji sadrži obrađeni Faktor VIII, kada se aktivnost Faktora VIII meri in vitro hromogenom analizom.

[0132] U određenom otelotvorenju, dugo delujući FVIII polipeptid je FVIII monomer-dimer hibrid. Kako bi se dobio FVIII monomer-dimer hibrid, kodirana sekvenca ljudskog rekombinantnog FVIII sa izbrisanim B domenom dobijena je reverznom transkripcijapolimeraza lančanom reakcijom iz ljudske jetrene poli A RNK (Clontech) koristeći FVIII-specifične prajmere. FVIII sekvenca uključuje nativnu signalnu sekvencu za FVIII. Brisanje B-domena bilo je od serina 743 (S743; 2287 bp) do glutamina 1638 (Q1638; 4969 bp), i ukupna brisanje iznosi 2682 bp. Zatim je kodirajuća sekvenca za ljudski rekombinantni Fc dobijena RT-PCR iz biblioteke cDNK ljudskih leukocita (Clontech) koristeći Fc specifične prajmere. Prajmeri su dizajnirani tako da je sekvenca FVIII sa izbrisanim B domenom spojena direktno na N-terminus Fc sekvence bez posrednika u vidu veznika. FVIIIFc DNK sekvenca je klonirana u sisarski dualni vektor eksprimiranja pBUDCE4.1 (Invitrogen) pod kontrolom CMV promotera. Druga identična Fc sekvenca koja uključuje mišju Igk signalnu sekvencu dobijena je pomoću RT-PCR i klonirana nizvodno od drugog promotera, EF1α, u vektoru eksprimiranja pBUDCE4.1.

[0133] U jednom otelotvorenju, FcRn vezujući partner može biti Fc region. FcRn vezujući partner je svaki molekul koji FcRn receptor može specifično da veže sa posledičnim aktivnim transportom FcRn receptora od strane FcRn vezujućeg partnera. Prema tome, izraz Fc uključuje bilo koje varijante IgG Fc koje su funkcionalne. Područje Fc dela od IgG koji se vezuje za FcRn receptor opisano je na osnovu rendgenske kristalografije (Burmeister i dr., Nature 372:379 (1994) ). Glavno područje dodira Fc sa FcRn je blizu spoja CH2 i CH3 domena. Svi Fc-FcRn dodiri su unutar jednog teškog lanca Ig. FcRn vezujući partneri uključuju, npr., čitav IgG, Fc fragment od IgG i druge fragmente IgG koji uključuju kompletni vezujući region od FcRn. Glavna mesta dodira uključuju aminokiselinske ostatke 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 od CH2 domena i aminokiselinske ostatke 385-387, 428 i 433-436 od CH3 domena. Pozivanja na numerisanje aminokiselina imunoglobulina ili fragmenata imunoglobulina, ili regiona, zasnivaju se na Kabat i dr.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD. (FcRn receptor je izolovan od više vrsta sisara, uključujući ljude. Poznate su sekvence ljudskog FcRn, pacovskog FcRn i mišjeg FcRn (Story i dr., J. Exp. Med.180: 2377 (1994) ). Fc može da sadrži CH2 i CH3 domene imunoglobulina sa ili bez zglobnog regiona imunoglobulina. Primerne su varijante Fc WO 2004/101740 i WO 2006/074199.

[0134] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može sadržati jednu ili više mutacija i kombinacija mutacija.

[0135] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može da sadrži mutacije koje daju povećani poluživot kao M252Y, S254T, T256E i njihove kombinacije, kako je obelodanjeno u Oganesyan i dr., Mol. Immunol.46:1750 (2009); H433K, N434F, i njihove kombinacije, kako je obelodanjeno u Vaccaro i dr., Nat. Biotechnol.23:1283 (2005); mutanti obelodanjeni na stranicama 1-2, paragrafu i primerima 9 i 10 od US 2009/0264627 A1; i mutanti obelodanjeni na stranici 2, paragrafima od [0014] do [0021] od US 20090163699 A1.

[0136] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) takođe može da uključuje, npr., naredne mutacije: Fc region IgG može da se modifikuje u skladu sa dobro prepoznatim postupcima kao što je mutageneza usmerena na mesto i slično, dajući modifikovane fragmente IgG ili Fc ili njihove delove koji će biti vezani od strane FcRn. Takve modifikacije uključuju, npr., modifikacije udaljene od FcRn mesta dodira kao i modifikacije unutar mesta dodira koje očuvaju ili čak poboljšavaju vezivanje za FcRn. Na primer, naredni pojedinačni aminokiselinski ostaci u ljudskom IgG1 Fc (Fci1) mogu da se zamene bez značajnog gubitka afiniteta vezivanja Fc za FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, A330S, P331A, P331S, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, i K447A, gde na primer P238A predstavlja prolin divljeg tipa supstituisan sa alaninom na položaju 238. Pored alanina druge aminokiseline mogu da budu supstituisane za divlji tip aminokiselina na gore navedenim položajima. Mutacije se mogu uvesti pojedinačno u Fc čime se dobija više od sto FcRn vezujućih partnera različitih od matičnog Fc. Pored toga, kombinacije dve, tri ili više ovih pojedinačnih mutacija mogu se uvesti zajedno, što stvara stotine dodatnih FcRn vezujućih partnera. Neke od ovih mutacija mogu dodeliti novu funkcionalnost FcRn vezujućem partneru. Na primer, jedno otelotvorenje sadrži N297A, uklanjajući visoko očuvano mesto N-glikozilacije. Efekat ove mutacije je da smanji imunogenost, poboljšavajući na taj način poluživot FcRn vezujućeg partnera u cirkulaciji, i učini da FcRn vezujući partner nije sposoban da se vezuje za FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB i FcyRIIIA, a da ne ugrozi afinitet za FcRn (Routledge i dr.1995, Transplantation 60:847; Friend i dr.1999, Transplantation 68:1632, koji je; Shields i dr.1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Pored toga, čini se da najmanje tri ljudska Fc gama receptora prepoznaju mesto vezivanja za IgG unutar nižeg zglobnog regiona, uglavnom aminokiseline 234-237. Zbog toga, drugi primer nove funkcionalnosti i potencijalno smanjene imunogenosti može nastati iz mutacija ovog regiona, na primer zamenom aminokiselina 233-236 ljudskog IgG1 „ELLG“ odgovarajućom sekvencom iz IgG2 „PVA“ (sa jednim brisanjem aminokiseline). Pokazalo se da se FcyRI, FcyRII i FcyRIII, koji posreduju različite efektorske funkcije, neće vezati za IgG1 kada su takve mutacije uvedene (Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77 (1995); and Armour i dr., Eur. J Immunol.

29:2613 (1999) ). Kao dodatni primer nove funkcionalnosti koja proizilazi iz gore opisanih mutacija, afinitet za FcRn u nekim slučajevima može biti veći od divljeg tipa. Ovaj povećani afinitet može odražavati povećanu „on“ stopu, smanjenu „off“ stopu ili i povećanu „on“ stopu i smanjenu „off“ stopu. Mutacije za koje se veruje da daju povećan afinitet za FcRn uključuju, npr., T256A, T307A, E380A i N434A (Shields i dr., J. Biol. Chem.276:6591 (2001) ).

[0137] Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može imati najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa Fc aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u Tabeli 11 (aminokiseline 1458 do 1684 od SEQ ID NO: 2 ili aminokiseline 2352 do 2578 od SEQ ID NO: 6). Fc (ili Fc deo himernog polipeptida) može biti identičan aminokiselinskoj sekvenci Fc prikazanoj u Tabeli 11 (aminokiseline 1458 do 1684 od SEQ ID NO: 2 i aminokiseline 2352 do 2578 od SEQ ID NO: 6).

[0138] Kao praktično pitanje, može li se utvrditi da li je neki određeni molekul nukleinske kiseline ili polipeptid najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan nukleotidnoj sekvenci ili polipeptidu predmetnog pronalaska konvencionalnim korišćenjem poznatih računarskih programa. U jednom aspektu, postupak za određivanje najboljeg ukupnog podudaranja između sekvence upita (referentne ili originalne sekvence) i predmetne sekvence, koji se takođe naziva i globalno poravnavanje sekvenci, može se odrediti

4

korišćenjem računarskog programa FASTDB na osnovu algoritma od Brutlag i dr., Comp. App. Biosci.6:237-245 (1990), u poravnavanju sekvenci, sekvenca upita i predmetna sekvenca su obe DNK sekvence. RNK sekvenca se može uporediti pretvaranjem U u T.

Rezultat navedenog usklađivanja globalnih sekvenci je procenat identičnosti. U još jednom otelotvorenju, parametri koji se koriste u FASTDB poravnavanju nizova DNK za izračunavanje procenta identičnosti su: Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size=500 ili dužina predmetne nukleotidne sekvence, šta je kraće,

[0139] Ako je predmetna sekvenca kraći od sekvence upita usled 5' ili 3' brisanja, a ne zbog unutrašnjih brisanja, na rezultate se mora primeniti ručna korekcija. To je zato što program FASTDB ne računa 5' i 3' skraćenja predmetne sekvence prilikom izračuna procenta identičnosti Za predmetne sekvence skraćene na 5' ili 3' krajevima, u odnosu na sekvencu upita, procenat identičnosti se ispravlja izračunavanjem broja baza u nizu upita koji su 5' i 3' od predmetne sekvence, i koji se ne podudaraju/poravnavaju, kao procenat od ukupnih baza sekvence upita. Da li se nukleotid podudara/poravnava određuje se rezultatima FASTDB poravnanja sekvence. Ovaj procenat se zatim oduzima od procenta identičnosti, izračunatog gore navedenim FASTDB programom koristeći navedene parametre, kako bi se dostigao konačni procenat identičnosti. Ovaj ispravljeni rezultat koristi se u svrhu predmetnog pronalaska. Za ručno podešavanje procenta identičnosti procenjuju se samo baze izvan 5' i 3' baza predmetne sekvence, prikazane FASTDB poravnanjem, koje nisu podudarne/poravnate sa sekvencom upita.

[0140] Na primer, predmetna sekvenca od 90 baza je poravnat sa sekvencom upita od 100 baza kako bi se odredio procenat identičnosti. Brisanja se dešavaju na 5' kraju predmetne sekvence i stoga FASTDB poravnanje ne pokazuje podudarnost/poravnavanje prvih 10 baza na 5' kraju.10 neuparenih baza predstavljaju 10% sekvence (broj baza na 5' i 3' krajevima koji nisu podudarni/ukupan broj baza u sekvenci upita), tako da se 10% oduzima od procenta rezultata identičnosti izračunatog programom FASTDB. Ako bi se preostalih 90 baza savršeno podudaralo, krajnji procenat identičnosti bio bi 90%. U drugom primeru, predmetna sekvenca od 90 baza upoređuje se sa sekvencom upita od 100 baza. Ovog puta su brisanja unutrašnje brisanje tako da nema baza na 5' ili 3' od predmetne sekvence koje nisu podudarne/poravnate sa upitom. U ovom slučaju procenat identičnosti izračunat FASTDB nije ručno ispravljen. Još jednom, ručno se ispravljaju samo baze 5' i 3' predmetne sekvence koje nisu podudarne/poravnate sa sekvencom upita. Druge ručne korekcije se ne vrše u svrhu predmetnog pronalaska.

[0141] Pod polipeptidom koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje, na primer, 95% „identičnu“ aminokiselinskoj sekvenci upita predmetnog pronalaska, podrazumeva se da je aminokiselinska sekvenca predmetnog polipeptida identična sekvenci upita osim toga što predmetna polipeptidna sekvenca može obuhvatati do pet izmena aminokiselina na svakih 100 aminokiselina aminokiselinske sekvence upita. Drugim rečima, kako bi se dobio polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu aminokiselinskoj sekvenci upita, do 5% aminokiselinskih ostataka u predmetnoj sekvenci može biti umetnuto, izbrisano (indel) ili zamenjeno sa drugom aminokiselinom. Ove promene referentne sekvence mogu se dogoditi na amino ili karboksi terminalnim položajima referentne aminokiselinske sekvence ili bilo gde između tih terminalnih položaja, isprekidano bilo pojedinačno među ostacima u referentnoj sekvenci, ili u jednoj ili više međusobnih grupa unutar referentne sekvence.

[0142] Kao praktično pitanje, da li je neki određeni polipeptid bar 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, na primer, aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 2 (Faktor VIII deo, Fc deo, pojedinačno ili zajedno) ili 4, ili poznatoj sekvenci Faktor VIII ili Fc polipeptida, može se odrediti konvencionalno korišćenjem poznatih računarskih programa. U jednom aspektu, postupak za određivanje najboljeg ukupnog podudaranja između sekvence upita (referentne ili originalne sekvence) i predmetne sekvence, koja se takođe naziva i globalno poravnavanje sekvenci, može se odrediti korišćenjem računarskog programa FASTDB na osnovu algoritma od Brutlag i dr., Comp. App. Biosci.6:237-245(1990). Kod poravnavanja sekvenci, sekvenca upita i predmetna sekvenca su obe nukleotidne sekvence ili su obe aminokiselinske sekvence. Rezultat navedenog globalnog poravnanja sekvenci je u procentu identčnosti. U drugom otelotvorenju, parametri koji se koriste u FASTDB poravnanju aminokiselina su: Matrix=PAM 0, k-tuple=2, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Window Size=sequence length, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, Window Size=500 ili dužina predmetne aminokiselinske sekvence, šta je kraće.

[0143] Ako je predmetna sekvenca kraća od sekvence upita zbog brisanja N- ili C-terminala, a ne zbog internih brisanja, na rezultatima se mora izvršiti ručna korekcija. To je zato što

4

program FASTDB ne računa N-i C-terminalna skraćenja predmetne sekvence prilikom izračunavanja globalnog procenta identičnosti. Za predmetne sekvence skraćene na N- i C-terminusima, u odnosu na sekvencu upita, procenat identičnosti se ispravlja izračunavanjem broja ostataka sekvence upita koji su N- i C-terminus predmetne sekvence, i koji nisu podudarni/poravnati sa odgovarajućim predmetnim ostatkom, kao procenat ukupnih baza sekvence upita. Da li se ostatak podudara/poravnava određuje se rezultatima poravnanja FASTDB sekvence. Ovaj procenat se oduzima od procenta identičnosti, izračunatog gore navedenim FASTDB programom koristeći određene parametre, kako bi se dostigao konačni procenat identičnosti. Ovaj konačni procenat identičnosti koristi se u svrhu predmetnog pronalaska. Za ručno podešavanje procenta identičnosti procenjuju se samo ostaci N-i C-terminusa predmetne sekvence, koji nisu podudarni/poravnati sa sekvencom upita. Odnosno, položaji ostataka upita van najudaljenijih N- i C-terminalnih ostataka predmetne sekvence.

[0144] Na primer, predmetna sekvenca od 90 aminokiselinskih ostataka je poravnata sa sekvencom upita od 100 ostataka kako bi se odredio procenat identičnosti. Brisanje se dešava na N-terminusu predmetne sekvence i stoga FASTDB poravnanje ne pokazuje podudaranje/poravnavanje prvih 10 ostataka na N-terminusu. 10 neuparenih ostataka predstavljaju 10% sekvence (broj ostataka na N- i C-terminusu nisu podudarni sa ukupnim brojem ostataka u sekvenci upita), tako da se 10% oduzima od rezultata procenta identičnosti izračunatog FASTDB programom. Ako bi se preostalih 90 ostataka savršeno podudaralo, krajnji procenat identičnosti bio bi 90%. U drugom primeru, predmetna sekvenca od 90 ostataka je poravnata sa sekvencom upita od 100 ostataka. Ovog puta su brisanja unutrašnja brisanje, tako da na N- ili C-terminusima predmetne sekvence nema ostataka koji nisu podudarni/poravnati sa upitom. U ovom slučaju procenat identičnosti izračunat pomoću FASTDB nije ručno ispravljen. Još jednom, ručno se ispravljaju samo položaji ostataka izvan N- i C-terminusa predmetne sekvence, kao što je prikazano u FASTDB poravnanju, i koji nisu podudarni/poravnati sa sekvencom upita. Druge ručne korekcije se ne vrše u svrhu predmetnog pronalaska.

[0145] Polinukleotidne varijante mogu sadržati izmene u kodirajućim regionima, nekodirajućim regionima ili oboje. U jednom aspektu, polinukleotidne varijante sadrže izmene koje proizvode tihe supstitucije, dodatke ili brisanja, ali ne menjaju svojstva ili aktivnosti kodiranog polipeptida. U drugom otelotvorenju, nukleotidne varijante se proizvode tihom supstitucijom usled degeneracije genetskog koda. U drugim otelotvorenjima, to su

4

varijante u kojima je 5-10, 1-5 ili 1-2 aminokiselina supstituisano, izbrisano ili dodato u bilo kojoj kombinaciji. Polinukleotidne varijante se mogu proizvesti iz različitih razloga, npr., za optimizaciju eksprimiranja kodona za određenog domaćina (promena kodona u ljudskoj mRNK u druge, npr., bakterijski domaćin kao što je E. coli).

[0146] Varijante koje se javljaju u prirodi nazivaju se „alelne varijante“ i odnose se na jedan od nekoliko alternativnih oblika gena koji zauzimaju određeni lokus na hromozomu organizma (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Ove alelne varijante mogu varirati na nivou polinukleotida i/ili polipeptida i uključene su u predmetni pronalazak. Alternativno, varijante koje se ne javljaju u prirodi mogu se proizvesti tehnikama mutageneze ili direktnom sintezom.

[0147] Koristeći poznate postupke dizajniranja proteina i rekombinantnu DNK tehnologiju, mogu se stvoriti varijante za poboljšanje ili promenu karakteristika polipeptida. Na primer, jedna ili više aminokiselina mogu biti izbrisane sa N-terminusa ili C-terminusa izlučenog proteina bez značajnog gubitka biološke funkcije. Ron i dr., J. Biol. Chem.268: 2984-2988 (1993), su prijavili varijantu KGF proteina koja ima aktivnost vezivanja heparina čak i nakon brisanja 3, 8 ili 27 amino-terminalnih aminokiselinskih ostataka. Slično tome, Interferon gama je pokazao i do deset puta veću aktivnost nakon što je izbrisao 8-10 aminokiselinskih ostataka sa karboksi kraja ovog proteina. (Dobeli i dr., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)

[0148] Štaviše, dovoljno dokaza pokazuje da varijante često zadržavaju biološku aktivnost sličnu onoj od proteina koji se javlja u prirodi. Na primer, Gayle i saradnici (J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993) su obavili opsežnu mutacionu analizu ljudskog citokina IL-1a. Oni su koristili slučajnu mutagenezu kako bi generisali preko 3.500 pojedinačnih IL-1a mutanata koji su prosečno menjali 2,5 aminokiseline po varijanti po celoj dužini molekula. Ispitane su višestruke mutacije na svakom mogućem položaju aminokiselina. istraživači su otkrili dase „[većina molekula može izmeniti uz mali efekat, bilo na [vezivanje ili na biološku aktivnost].“ (pogledati Apstrakt.) U stvari, samo su 23 jedinstvene aminokiselinske sekvence od više od 3.500 ispitivanih nukleotidnih sekvenci proizvele protein koji se značajno razlikovao po aktivnosti od divljeg tipa.

[0149] Kao što je gore navedeno, polipeptidne varijante uključuju, npr., modifikovane polipeptide. Izmene uključuju, npr., acetilaciju, acilaciju, ADP-ribozilaciju, amidaciju,

4

kovalentno vezivanje flavina, kovalentno vezivanje hemskog dela, kovalentno vezivanje nukleotida ili derivata nukleotida, kovalentno vezivanje lipidna ili derivata lipidna, kovalentno vezivanje fosfotidilinozitola, unakrsno povezivanje, ciklizaciju, formiranje disulfidnih veza, demetilaciju, formiranje kovalentnog unakrsnog povezivanjea, formiranje cisteina, formiranje piroglutamata, formilaciju, gama-karboksilaciju, glikozilaciju, formiranje GPI sidra, hidroksilaciju; jodiranje, metilaciju, mistoilaciju, oksidaciju, pegilaciju (Mei i dr., Blood 116:270-79 (2010), proteolitičku obradu, fosforilaciju, prenilaciju, racemizaciju, selenoilaciju, sulfaciju, transfer-RNK-posredovano dodavanje aminokiselina proteinima kao što su arginilacija i ubikvitacija. U nekim otelotvorenjima, Faktor VIII je modifikovan, npr., pegiliran, na bilo kom pogodnom mestu. U nekim otelotvorenjima, Faktor VIII je pegiliran na površini izloženoj aminokiselini Faktora VIII, npr., površinski izloženi cistein, koji može biti konstruisan cistein. Id. U nekim otelotvorenjima, modifikovani Faktor VIII, npr., pegilirani Faktor VIII, je dugo delujući Faktor VIII.

III. Postupak primene

[0150] Tretman hemofilije A je terapije zamena koja ima za cilj obnavljanje FVIII aktivnosti na 1 do 5% od normalnog nivoa kako bi se sprečilo spontano krvarenje (Mannucci, P.M. i dr., N. Engl. J. Med.344:1773-9 (2001)).

[0151] Predmetno obelodanjenje takođe uključuje postupke primene farmaceutskog sastava predmetnog pronalaska. Ovo obelodanjenje pruža postupak primene farmaceutskih sastava ljudskom pacijentu koji ima potrebu za tim (npr., ljudski pacijent), obuhvatajući primenu pacijentu terapeutske doze farmaceutskog sastava koji sadrži polipeptid Faktora VIII, npr., dugo delujući FVIII polipeptid ili kratko delujući FVIII polipeptid, npr., polipeptid Faktora VIII-Fc, ili hibrid takvog polipeptida, u intervalu doziranja.

[0152] U nekim slučajevima, farmaceutski sastav predmetnog pronalaska se koristi da ublaži ili smanji jednu ili više epizoda krvarenja ili učestalost (npr. stanje krvarenja) kod pacijenta koji ima potrebu za tim. U drugim slučajevima, farmaceutski sastav predmetnog pronalaska se koristi za tretman ili sprečavanje stanja krvarenja kod pacijenta koji ima potrebu za tim.

[0153] Stanje krvarenja može biti uzrokovano poremećajem koagulacije krvi. Poremećaj koagulacije krvi takođe se može nazvati koagulopatijom. U jednom primeru, poremećaj koagulacije krvi koji se može tretirati farmaceutskim sastavom predmetnog obelodanjenja je

4

hemofilija. U drugom primeru, poremećaj koagulacije krvi koji se može tretirati farmaceutskim sastavom predmetnog obelodanjenja je hemofilija A.

[0154] U nekim slučajevima se vrsta krvarenja koja je povezana sa stanjem krvarenja iz grupe koja uključuje hemartrozu, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, hemoragiju, hemoragiju u mišićima, oralnu hemoragiju, traumu, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intraturacikalno krvarenje, prelom kosti, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru ili krvarenje u omotaču iliopsoasa.

[0155] U drugim slučajevima, pacijentu kom pati od krvarenja potreban je tretman za operaciju, kao što su: npr., hirurška profilaksa ili perioperativno upravljanje. U jednom primeru je operacija izabrana od manje operacije i velike operacije. Primeri hirurških zahvata uključuju vađenje zuba, tonzilektomiju, ingvinalnu herniotomiju, sinovektomiju, kraniotomiju, osteosintezu, traumu, intrakranijalnu operaciju, intra-abdominalnu operaciju, intratorakalnu operaciju, zamenu zgloba (npr., totalna zamena kolena, zamena kuka i slično), operaciju

[0156] Predmetno obelodanjenje takođe pruža postupak za poboljšanje ili smanjenje godišnje stope krvarenja (ABR) pacijenta koji ima hemofiliju, i koji uključuje primenu pacijentu efektivne doze FVIII polipeptida. U jednom slučaju, dugo delujući FVIII polipeptid se pruža u intervalu doziranja svaka tri dana ili duže. U drugom slučaju, efektivna doza je između oko 20 IU/kg i oko 90 IU/kg. U ostalim slučajevima, efektivna doza je 20-30 IU/kg, 30-40 IU/kg, 40-50 IU/kg, 50-60 IU/kg, 60-70 IU/kg, 70-80 IU/kg, ili 80-90 IU/kg. U drugim slučajevima, efektivna doza je 20 IU/kg, 25 IU/kg, 30 IU/kg, 35 IU/kg, 40 IU/kg, 45 IU/kg, 50 IU/kg, 55 IU/kg, 60 IU/kg, 65 IU/kg, 70 IU/kg, 75 IU/kg, 80 IU/kg, 85 IU/kg, ili 90 IU/kg.

[0157] U određenim slučajevima, primena FVIII polipeptida je za individualizovanu (prilagođenu) profilaksu i rezultuje sa ABR nižim od oko 5,5, nižim od oko 5,4, nižim od oko 5,3, nižim od oko 5,2, nižim od oko 5,1, nižim od oko 5,0, nižim od oko 4,9, nižim od oko 4,8, nižim od oko 4,7, nižim od oko 4,6, ili nižim od oko 4,5. U drugim slučajevima, primena rezultuje sa ABR od oko 4,7 do 0. U nekim slučajevima, ABR medijana iznosi oko 1,6. U drugim otelotvorenjima, srednja vrednost ABR iznosi oko 2,9. U jednom aspektu individualizovanog režima profilakse, efektivna doza je od oko 25 IU/kg do oko 65 IU/kg,

4

data na svakih tri do pet dana. Na primer, efektivna doza iznosi oko 25 IU/kg do oko 65IU/kg, primenjeno na svaka tri dana. U drugom slučaju, efektivna doza iznosi oko 50 IU/kg do oko 65IU/kg na svaka četiri dana ili svakih pet dana. U drugim slučajevima, efektivna doza je do 65 IU/kg na svaka tri dana. U drugim slučajevima, efektivna doza FVIII polipeptida je modifikovana na osnovu pacijentovog farmakokinetičkog profila. U jednom primeru, patent se primenjuje najpre sa dve doze, prvom dozom od 25 IU/kg prvog dana i drugom dozom od 50 IU/kg na dan 4. Ako farmakokinetički podaci pokazuju niži nivo od normalne FVIII aktivnosti ispod 1% nakon početne dve doze, pacijentu se zatim pruža oko 25 IU/kg do oko 65IU/kg na svaka tri dana. U drugom primeru, ako farmakokinetički podaci pokazuju više od 1% najnižeg nivoa normalne FVIII aktivnosti tokom pet dana od doziranja, pacijentu se zatim pruža oko 50 IU/kg do oko 65IU/kg na svakih pet dana. Ako pacijent doživi više od dva spontana krvarenja tokom perioda od osam nedelja nakon primene oko 50 IU/kg do oko 65IU/kg na svakih pet dana, pacijentu se primenjuje jedan od narednih postupaka: (1) do oko 65 IU/kg na svaka tri dana (za ciljani najniži nivo do 5% od normalnog), (2) oko 50 IU/kg do oko 65 IU/kg na svaka četiri dana (za ciljani najniži do 5% od normalnog), ili (3) oko 25IU/kg do oko 65IU/kg na svaka tri dana (za ciljani najniži nivo od 1% do 3% od normalnog). Ako pacijent koji prima oko 50 IU/kg do oko 65IU/kg na svaka četiri dana i dalje ima više od dva spontana krvarenja, maksimalna doza se može povećati do oko 65IU/kg na svaka tri dana. U nekim primerima, interkvartilni raspon (IQR) ABR za individualizovani režim profilakse je 0 do 4,7.

[0158] U nekim slučajevima, primena FVIII polipeptida je za nedeljnu profilaksu i rezultuje sa ABR nižim od oko 9,0, nižim od oko 8,9, nižim od oko 8,8, nižim od oko 8,7, nižim od oko 8,6, nižim od oko 8,5 ili nižim od oko 8.4. U jednom primeru, primena rezultuje sa ABR između oko 8,4 i 0. U drugom primeru, ABR medijana za nedeljnu profilaksu iznosi oko 3,6. U drugim primerima, srednja vrednost ABR za nedeljnu profilaksu iznosi oko 8.8. U drugim otelotvorenjima, efikasna doza za nedeljnu profilaksu iznosi oko 65 IU/kg jednom nedeljno, npr., svakih pet dana, svakih šest dana, svakih sedam dana, svakih osam dana ili svakih devet dana. U nekim primerima, IQR id ABR za nedeljni režim profilakse je 1,9 do 8,4.

[0159] U ostalim slučajevima, primena FVIII polipeptida je za epizodni tretman ili na tretman na zahtev i rezultuje sa ABR nižim od oko 55, nižim od oko 54, nižim od oko 53, nižim od oko 52, nižim od oko 51, nižim od oko 50, nižim od oko 49, nižim od oko 48, ili nižim od oko 47. U jednom primeru, primena rezultuje sa ABR između oko 49 i 0, npr., između 48,7 i 0. U drugom primeru, ABR medijana za epizodni (na zahtev) tretman iznosi oko 33,5. U drugim primerima, srednja vrednost ABR za epizodni (na zahtev) tretman iznosi oko 37,23. U drugim otelotvorenjima, efikasna doza za tretman na zahtev iznosi oko 10 IU/kg do 75IU/kg na svakih 12 do 24 sata. U nekim primerima, IQR od ABR za tretman na zahtev je 21,1 do 48,7.

[0160] U nekim slučajevima, efektivna doza za individualizovanu profilaksu, nedeljnu profilaksu ili epizodni tretman je fiksna doza ili stratifikovana doza. U jednom aspektu, fiksna doza iznosi oko 2.000 IU po dozi, oko 2.500 IU po dozi, oko 3.000 IU po dozi, oko 3.500 IU po dozi, ili oko 4.000 IU po dozi.

[0161] Interval doziranja za dugo delujući FVIII polipeptid može biti najmanje oko jedan i po do šest puta duži, jedan i po do pet puta duži, jedan i po do četiri puta duži, jedan i po do tri puta duži, ili jedan i po do dva puta duži, nego što je interval doziranja potreban za ekvivalentnu dozu Faktora VIII, bez dela koji nije Faktor VIII (polipeptid koji se sastoji od Faktor VIII dela), npr., bez Fc dela. Interval doziranja može biti najmanje oko jedan i po, dva, dva i po, tri, tri i po, četiri, četiri i po, pet, pet i po ili šest puta duži od interval doziranja koji potreban za ekvivalentnu dozu Faktora VIII bez dela koji nije Faktor VIII (polipeptid koji se sastoji od Faktor VIII dela), npr., bez Fc dela. Interval doziranja može biti otprilike svaka tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest ili četrnaest dana, ili duže.

[0162] Postupci obelodanjenja mogu primeniti pacijentu kom su potrebni profilaktički tretman ili tretman na zahtev.

[0163] Za tretman na zahtev, interval doziranja farmaceutskog sastava koji sadrži FVIII polipeptid je otprilike jednom u 24-36, 24-48, 24-72, 24-96, 24-120, 24-144, 24-168, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, ili 72 sata ili duže.

[0164] U jednom slučaju, pacijentu je potreban tretman na zahtev (epizodni). U drugom slučaju, tretman na zahtev (epizodni) rešava više od 80% (više od 80%, više od 81%, više od 82%, više od 83%, više od 84%, više od 85%, više od 86%, više od 87%, više od 88%, više

1

od 89%, više od 90%, više od 91%, više od 92%, više od 93%, više od 94%, više od 95%, više od 96%, više od 97%, više od 98%, više od 99%, ili 100%) ili 80-100%, 80-90%, 85-90%, 90-100%, 90-95%, ili 95-100% krvarenja (npr. spontana krvarenja) u jednoj dozi. U drugom slučaju, više od 80% (više od 81%, više od 82%, više od 83%, više od 84%, više od 85%, više od 86%, više od 87%, više od 88%, više od 89%, više od 90%, više od 91%, više od 92%, više od 93%, više od 94%, više od 95%, više od 96%, više od 97%, više od 98%, ili 100%) ili 80-100%, 80-90%, 85-90%, 90-100%, 90-95%, ili 95-100% epizoda krvarenja lekari ocenjuju odličnim ili dobrim nakon tretmana na zahtev (epizodni). U ostalim slučajevima, više od 5%, (više od 6%, više od 7%, više od 8%, više od 9%, više od 10%, više od 11%, više od 12%, više od 13%, više od 14%, više od 15%, više od 16%, više od 17%, više od 18%, više od 19%, više od 20%), ili 5-20%, 5-15%, 5-10%, 10-20%, ili 10-15% epizoda krvarenja lekari ocenjuju solidnim nakon tretmana na zahtev (epizodni)

[0165] U drugim slučajevima, farmaceutski sastav koji sadrži FVIII polipeptid koristi se za profilaksu. Profilaksa se može pokazati boljim Cmax, boljim Tmax i/ili većom srednjom vrednosti u odnosu na kratko delujući FVIII. U nekim slučajevima, rezultat profilaksa je da nema spontanih epizoda krvarenja u roku od oko 24, 36, 48, 72 ili 96 sati (npr., 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, ili 96 sati), posle injekcije (npr., poslednja injekcija). U određenim slučajevima, profilaksa rezultuje više od 30% (npr., više od 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89, ili 90%, na primer, više od 50%), smanjenje srednje vrednosti godišnjih epizoda krvarenja sa doziranjem jednom nedeljno (npr., pri 65 IU/kg).

[0166] U drugom primeru, pacijent se istovremeno tretira sa FIX. Pošto su jedinjenja predmetnog pronalaska sposobna da aktiviraju FIXa, mogu se koristiti za pre-aktivaciju FIXa polipeptida pre primene FIXa pacijentu.

IV. Postupak izrade

[0167] FVIII polipeptid se može proizvesti u ćeliji domaćinu koja sadrži vektor koji kodira FVIII polipeptid. U jednom slučaju, ćelija domaćin transformiše se sa jednim ili više vektora koji sadrže prvu nukleotidnu sekvencu koji kodira FVIII polipeptid i prvi FcRn polipeptid,

2

drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira drugi FcRn polipeptid i, po izboru, treću nukleotidnu sekvencu koja kodira protein konvertazu, npr., PC5. Kako se ovde koristi, vektor eksprimiranja odnosi se na bilo koji konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži neophodne elemente za transkripciju i translaciju ubačene kodirajuće sekvence, ili u slučaju RNK virusnog vektora, neophodne elemente za replikaciju i translaciju, kada se uvede u odgovarajuću ćeliju domaćina. Vektori eksprimiranja mogu uključivati plazmide, fagemide, viruse i njihove derivate.

[0168] Ovde korišćena sekvenca kontrole eksprimiranja gena je bilo koja regulatorna nukleotidna sekvenca, poput promoterske sekvence ili kombinacije pojačivača i promotera, koja olakšava efikasnu transkripciju i translaciju kodirajuće nukleinske kiseline za koju je operativno povezana. Sekvenca za kontrolu eksprimiranja gena može, na primer, biti sisarski ili virusni promoter, poput konstitutivnog ili inducibilnog promotera. Sisarski onstitutivni promoteri uključuju, ali nisu ograničeni na, promotere za naredne gene: hipoksantin fosforibosil-transferaza (HPRT), adenozin deaminaza, piruvat kinaza, beta-aktinski promoter i drugi konstitutivni promoteri. Primeri virusnih promotera koji konstitutivno deluju u eukariotskim ćelijama uključuju, na primer, promotere iz citomegalovirusa (CMV), simijan virusa (npr., SV40), papiloma virusa, adenovirusa, virusa ljudske imunodeficijencije (HIV), Rous sarkoma virus, citomegalovirusa, dugačka terminalna ponavljanja (LTR) virusa Moloney leukemije, i druge retroviruse, i promoter timidin kinaze herpes simpleks virusa. Ostali konstitutivni promoteri poznati su stručnjacima u oblasti. Promoteri korisni kao sekvence eksprimiranja gena predmetnog pronalaska takođe uključuju inducibilne promotere. Inducibilni promoteri su eksprimirani u prisustvu agensa za indukciju. Na primer, promoter metalotioneina indukuje se da promoviše transkripciju i translaciju u prisustvu određenih jona metala. Stručnjacima su poznati i drugi inducibilni promoteri.

[0169] Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na virusne vektore ili plazmidne vektore. Plazmidni vektori su opsežno opisani u struci i dobro su poznati onima koji poznaju ovu oblasti. Pogledati, npr., Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. U poslednjih nekoliko godina otkriveno je da su plazmidni vektori naročito povoljni za isporuku gena ćelijama in vivo zbog svoje nemogućnosti da se repliciraju unutar i integrišu u genom domaćina. Ovi plazmidi, međutim, koji imaju promoter kompatibilan sa ćelijom domaćinom, mogu eksprimirati peptid iz gena koji je operativno kodiran unutar plazmida. Neki najčešće korišćeni plazmidi dostupni od komercijalnih dobavljača uključuju pBR322, pUC18, pUC19, različite pcDNA plazmide, pRC/CMV, različite pCMV plazmide, pSV40 i pBlueScript. Dodatni primeri specifičnih plazmida uključuju pcDNA3.1, kataloški broj V79020; pcDNA3.1/hygro, kataloški broj V87020; pcDNA4/myc-His, kataloški broj V86320; i pBudCE4.1, kataloški broj V53220, svi od kompanije Invitrogen (Carlsbad, CA.). Ostali plazmidi su dobro poznati stručnjacima. Pored toga, plazmidi mogu da se dizajniraju korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije za uklanjanje i/ili dodavanje određenih fragmenata DNK.

[0170] Vektor ili vektori eksprimiranja se zatim transficiraju ili ko-transficiraju u pogodnu ciljanu ćeliju, koja će eksprimirati polipeptide. Tehnike transfekcije poznate u struci uključuju, ali nisu ograničene na, taloženje kalcijum-fosfata (Wigler i dr. (1978) Cell 14:725), electroporation (Neumann i dr. (1982) EMBO J 1:841), i reagense na bazi lipozoma. Različiti sistemi vektora eksprimiranja domaćina mogu se koristiti za eksprimiranje ovde opisanih proteina, uključujući prokariotske i eukariotske ćelije. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, mikroorganizme, poput bakterija (npr. E. coli) transformisanih sa vektorima eksprimiranja rekombinantne bakteriofagne DNK ili plazmidne DNK koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; kvasne ili vlaknaste gljive transformisane rekombinantnim vektorima eksprimiranja kvasca ili gljiva koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; ćelijski sistemi insekata zaraženi vektorima eksprimiranja rekombinantnih virusa (npr., bakulovirus) koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; sistem biljnih ćelija zaražen vektorima eksprimiranja rekombinantnih virusa (npr., mozaični virus karfiola ili mozaični virus duvana) ili transformisan rekombinantnim vektorima eksprimiranja plazmida (npr., Ti plazmid) koji sadrži odgovarajuću kodirajuću sekvencu; ili životinjske sisteme ćelija, uključujući ćelije sisara (npr., Ćelije HEK 293, CHO, Cos, HeLa, HKB11 i BHK).

[0171] U jednom slučaju, ćelija domaćin je eukariotska ćelija. Kako se ovde koristi, eukariotska ćelija se odnosi na bilo koju životinjsku ili biljnu ćeliju koja ima definitivno jezgro. Eukariotske ćelije životinja uključuju ćelije kičmenjaka, npr., sisari i ćelije beskičmenjaka, npr., insekti. Eukariotske ćelije biljaka posebno mogu da uključuju, bez ograničenja, ćelije kvasca. Eukariotska ćelija se razlikuje od prokariotske ćelije, npr., bakterije.

[0172] U određenim slučajevima, eukariotska ćelija je ćelija sisara. Ćelija sisara je svaka ćelija dobijena od sisara. Ćelije sisara specifično uključuju, ali nisu ograničene na, ćelijske

4

linije sisara. U jednom aspektu, ćelija sisara je ljudska ćelija. U drugom slučaju, ćelija sisara je HEK 293 ćelija, koja je ljudska embrionska bubrežna ćelijska linija. HEK 293 ćelije su dostupne kao CRL-1533 od strane American Type Culture Collection, Manassas, VA, and as 293-H cells, Catalog No.11631-017 ili 293-F ćelije, kataloški broj 11625-019 od kompanije Invitrogen (Carlsbad, Calif.). U nekim slučajevima ćelija sisara je PER.C6® ćelija, koja je ljudska ćelijska linija izvedena iz mrežnjače. PER.C6® ćelije su dostupne od kompanije Crucell (Leiden, The Netherlands) U drugim otelotvorenjima, ćelija sisara je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO). CHO ćelije su dostupne od strane American Type Culture Collection, Manassas, VA. (npr., CHO-K1; CCL-61). U drugim slučajevima, sisarska je ćelija bubrega beba hrčaka (BHK). BHK ćelije su dostupne od strane American Type Culture Collection, Manassas, Va. (npr., CRL-1632). U nekim slučajevima ćelija sisara je HKB11 ćelija, koja je hibridna ćelijska linija HEK293 ćelije i ljudske B ćelijske linije. Mei i dr., Mol. Biotechnol.

34(2): 165-78 (2006).

[0173] Postupak može dalje da obuhvata korake prečišćavanja. Različiti poznati koraci prečišćavanja su dobro poznati u struci.

Primeri

Primer 1. Opis proizvoda

[0174] rFVIIIFc je dugo delujući, potpuno rekombinantni fuzioni protein koji se sastoji od ljudskog faktora koagulacije VIII (FVIII) kovalentno vezanog za Fc domen ljudskog imunoglobulina G1 (IgG1). Faktor VIII deo od rFVIIIFc ima primarnu aminokiselinsku sekvencu i post-translacione modifikacije koje su uporedive sa 90 80 kDa oblikom Faktora VIII (tj. B domena je izbrisana). Fc domen rFVIIIFc sadrži zglobni, CH2 i CH3 region IgG1. rFVIIIFc sadrži 1882 aminokiselina sa očiglednom molekularnom masom od oko 220 kilodaltona.

[0175] rFVIIIFc se proizvodi rekombinantnom DNK tehnologijom u ljudskoj embrionskoj ćelijskoj liniji bubrega (HEK), koja je opsežno okarakterisana. Ćelijska linija eksprimira rFVIIIFc u definisanom medijumu ćelijske kulture koji ne sadrži proteine koji potiču iz životinjskih ili ljudskih izvora. rFVIIIFc se prečišćava nizom koraka hromatografije koji ne zahtevaju upotrebu monoklonskog antitela. Proces uključuje korak inaktivacije virusa i više koraka uklanjanja virusa, uključujući afinitetnu hromatografiju i korak nanofiltracije zadržavanja virusa od 15 nm. Nijedan ljudski ili životinjski aditiv se ne koristi u ćelijskoj kulturi, prečišćavanju i formulaciji.

[0176] rFVIIIFc je u farmakoterapijskoj grupi: antihemoragici, faktor koagulacije krvi VIII. Pruža se u obliku belog do sivkastog praška za kolače koji je sterilan, bez konzervansa, nepirogen, liofiliziran, za intravensku (IV) primenu u bočici za jednokratno upotrebu, praćeno tečnim razblaživačem u unapred napunjenom špricu. Pored rFVIIIFc, farmaceutski sastav sadrži liofilizat saharozu, natrijum hlorid, L-Histidin, kalcijum hlorid i polisorbat 20 ili polisorbat 80, i nalazi se u sterilisanoj vodi za injekcije. Svaka bočica za jednokratnu upotrebu sadrži nominalno 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 ili 6000 međunarodnih jedinica (IU) rFVIIIFc. Kada je rekonstituisan sa pruženim rastvaračem, proizvod sadrži naredne pomoćne sastojke: saharozu, natrijum hlorid, L-histidin, kalcijum hlorid i polisorbat 20 ili polisorbat 80, u koncentracijama prikazanim u Tabeli 1 ili Tabeli 2 u nastavku. Farmaceutski sastav je formulisana za intravensku primenu tek nakon rekonstitucije.

[0177] Svako pakovanje sadrži bočicu sa praškom (staklena bočica tipa 1) sa čepom (butil) i zatvaračem koji se okreće (aluminijum), 3 ml rastvarača u unapred napunjenom špricu (staklena bočica tipa 1) sa klipnim čepom (butil), i čepom sa vrhom (butil), i uređaj za rekonstituciju sterilne ambalaže.

TABELA 1: rFVIIIFc formulacije nakon rekonstitucije sa tečnim razblaživačem

TABELA 2: rFVIIIFc formulacije nakon rekonstitucije sa tečnim razblaživačem

Primer 2. Postupak formulisanja

[0178] rFVIIIFc lek je sterilni liofilizovani prašak za injekcije namenjen intravenskoj primeni. Dostavlja se u aseptički napunjenim bočicama za jednokratnu upotrebu koje sadrže nominalno 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 i 6000 IU po bočici. Bočice su 10 ml USP/Ph. Eur. Staklene bočice tipa 1 zapečaćene su 20 mm teflonskim čepom za liofilizaciju od butilne gume i aluminijumskim zatvaračem koji se okreće. Pre liofilizacije, nominalna zapremina punjenja za 250 do 6000 IU bočica je 3 ml. Sastav ekscipijenata formulacije pre liofilizacije je isti za sve snage doziranja. Prašak za injekcije je rekonstituisan sa 3 ml razblaživača koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije koja se pruža u sterilno napunjenom špricu.

[0179] Sastavi rastvora lekova pre liofilizacije prikazani su u Tabeli 3. Sastavi lekova posle rekonstitucije prikazani su u Tabeli 1 ili Tabeli 2. (Primer 1).

TABELA 3: Koncentracije pre-liofilizacije komponenti rFVIIIFc formulacije

Primer 3. Doziranje i način primene/postupak izračunavanja početne procenjene doze [0180] rFVIIIFc je dugo delujući anti-hemofilni faktor (rekombinantni) koji je indikovan kod odraslih i dece (≥12 godina) sa hemofilijom A (nedostatak urođenog faktora FVIII) za, npr., kontrolu i prevenciju epizoda krvarenja, rutinska profilaksa radi sprečavanja ili smanjenja učestalosti epizoda krvarenja i perioperativno upravljanje (hirurška profilaksa).

[0181] Doziranje rFVIIIFc može se proceniti kao što je opisano u ovom primeru, ali takođe se može odrediti standardnim testovima, kao što su testovi FVIII aktivnosti opisani na drugim mestima ovde.

[0182] Očekuje se da 1 IU rFVIIIFc po kg telesne težine poveća nivo Faktora VIII u cirkulaciji za 2 [IU/dL]. Pokazalo se da rFVIIIFc ima produžen poluživot u cirkulaciji.

[0183] Budući da pacijenti mogu da variraju po svojoj farmakokinetici (npr., poluživot, in vivo oporavak) i kliničkim odgovorim na rFVIIIFc, očekivano in vivo maksimalno povećanje nivoa Faktora VIII izraženo kao IU/dL (ili % od normale) ili potrebne doze mogu se proceniti koristeći naredne formule:

IU/dL (ili % od normale) = [ukupna doza (IU)/telesna težina (kg)] x 2(IU/dL po IU/kg) ILI

Doza (IU) – telesna težine (kg) x porast željenog Faktora VIII (IU/dL ili % od normale) x 0,5(IU/kg) po IU/dL)

[0184] Naredna tabela (Tabela 4) može se koristiti kao vodič za doziranje u epizodama krvarenja:

Tabela 4: Vodič za rFVIIIFc doziranje za tretman krvarenja

[0185] Naknadna doza i trajanje tretmana zavise od pojedinačnog kliničkog odgovora, težine nedostatka Faktora VIII, lokacije i obima krvarenja.

[0186] Naredna tabela (Tabela 5) se može koristiti za usmeravanje doziranja za perioperativno upravljanje (hirurška profilaksa):

Tabela 5: Vodič za rFVIIIFc doziranje za perioperativno upravljanje (hirurška profilaksa)

[0187] Za rutinsku profilaksu preporučeni režim je 50 IU/kg na svakih 3-5 dana. Doza se može prilagoditi na osnovu reakcije pacijenta u rasponu od 25-65 IU/kg.

[0188] Za nedeljnu profilaksu preporučena doza je 65 IU/kg.

[0189] rFVIIIFc je kontraindikovan kod pacijenata koji su ispoljavali ozbiljne reakcije preosetljivosti, uključujući anafilaksiju, na proizvod ili njegove komponente. Teške reakcije preosetljivosti nisu primećene u kliničkim ispitivanjima; međutim, za njih se zna da se dešavaju upotrebom drugih faktora zamene Faktora VIII.

[0190] Klinički odgovor na rFVIIIFc može varirati. Ako krvarenje nije kontrolisano preporučenom dozom, može se utvrditi nivo Faktora VIII u plazmi, i može se primeniti dovoljna rFVIIIFc doza kako bi se postigao zadovoljavajući klinički odgovor. Ako pacijentov nivo Faktora VIII u plazmi ne poraste kako se očekuje ili ako krvarenje nije kontrolisano nakon primene rFVIIIFc, treba posumnjati na prisustvo inhibitora (neutrališućih antitela) i obaviti odgovarajuće testiranje. Pacijentima koji koriste rFVIIIFc se može pratiti razvoj inhibitora Faktora VIII odgovarajućim kliničkim opservacijama i laboratorijskim testovima poznatim stručnjacima.

[0191] Pacijentova plazma može se pratiti za nivo aktivnosti Faktora VIII, npr., postignuta je i održavana jednostepena analiza koagulacije koja potvrđuje odgovarajuće nivoe Faktora VIII, kada je to klinički indikovano. Pacijentova plazma može se dalje pratiti zbog razvoja inhibitora Faktora VIII.

1

Primer 4. 3 Kliničko ispitivanje Faze 3 produženog poluživota rekombinantnog Fc fuzionog Faktora VIII („A-LONG“ studija)

Sažetak A-LONG studije

[0192] U A-LONG studiju uključeno je 165 pacijenata muškog pola starosti 12 i više godina. A-LONG studija je imala tri kraka tretmana: individualizovanu profilaksu, nedeljnu profilaksu i epizodni (na zahtev) tretman (Kraci 1, 2 i 3, respektivno). U podgrupi pacijenata svih krakova tretmana, rFVIIIFc je procenjen u perioperativnom tretmanu pacijenata kojima je potreban veliki hirurški postupak tokom studije.

[0193] Sveukupno, 92,7 odsto pacijenata je završilo studiju. Rekombinantni FVIIIFc se generalno dobro podnosi. Nisu detektovani inhibitori rFVIIIFc i nisu zabeleženi slučajevi anafilaksije ni kod jednog pacijenta, od kojih su svi prešli iz komercijalno dostupnih Faktor VIII proizvoda. Ispitivači nisu primetili ozbiljne štetne događaje povezane sa lekom.

[0194] Najčešći neželjeni događaji (incidencija ≥5 procenata) koji su se javljali van perioperativnog perioda tretmana bili su nazofaringitis, artralgija, glavobolja i infekcija gornjih disajnih puteva.

[0195] Medijana (srednja vrednost) godišnje stopa krvarenja (ABR), uključujući spontana i krvarenja usled traume, bila je 1,6 (2,9) u kraku individualizovane profilakse, 3,6 (8,8) u kraku nedeljne profilakse i 33,6 (37,2) u kraku epizodnog tretmana. U kraku individualizovane profilakse medijana intervala doziranja iznosila je 3,5 dana. Tokom poslednja 3 meseca na ispitivanju, 30 procenata pacijenata u kraku individualizovane profilakse postiglo je srednji interval doziranja koji iznosi najmanje 5 dana.

[0196] Kontrola krvarenja je procenjena kod svih pacijenata koji su tokom ispitivanja doživeli epizodu krvarenja. Sveukupno, 98 procenata epizoda krvarenja kontrolisano je sa jednom ili dve injekcije rFVIIIFc.

[0197] Pored toga, rFVIIIFc je procenjen u perioperativnom tretmanu 9 pacijenata koji su podvrgnuti 9 većih hirurških zahvata. Lekari koji su sprovodili tretman ocenili su hemostatsku efikasnost rFVIIIFc kao odličnu ili dobru u 100 procenata ovih operacija.

2

[0198] A-LONG je uključivao farmakokinetičku (PK) analizu rFVIIIFc kod svih pacijenata u studiji. U podgrupi pacijenta sa obimnim PK uzorkovanjem, približni terminalni poluživot rFVIIIFc bio je 19,0 sati u poređenju sa 12,4 sata za ADVATE® [antihemofilični faktor (rekombinantni), postupak bez plazme/albumina], u skladu sa rezultatima dobijenim u Fazi 1/2 ispitivanja rFVIIIFc.

O A-LONG studiji i rFVIIIFc programu

[0199] A-LONG je globalna, otvorena, višecentrična studija Faze 3 koja je procenjivala efikasnost, sigurnost i farmakokinetiku intravenski injektiranog rFVIIIFc. Studija je osmišljena za procenu rFVIIIFc u kontroli i prevenciji krvarenja, rutinskoj profilaksi i perioperativnom tretmanu kod pacijenata sa hemofilijom A. A-LONG je uključivao 60 centara za tretman hemofilije u 19 zemalja na 6 kontinenata.

[0200] A-LONG studija imala je tri kraja za tretman. U Kraku 1 (individualizovana profilaksa; n=117), pacijenti su tretirani sa 25-65 IU/kg rFVIIIFc, u razmaku od svaka tri do pet dana, koji je individualizovan za održavanje nivoa faktora preko nivoa dovoljnog za sprečavanje krvarenja. U Kraku 2 (nedeljna profilaksa; n=24), pacijenti su tretirani nedeljnom dozom od 65 IU/kg. U Kraku 3 (epizodni tretman; n=23), pacijenti su primili rFVIIIFc epizodni tretman prema potrebi za krvarenje. U podgrupi pacijenata u svim kracima tretmana, rFVIIIFc je procenjen u hirurškim uslovima.

[0201] Primarne mere efikasnosti bile su godišnja stopa krvarenja po pacijentu u Kraku 1 u odnosu na Krak 3 i farmakokinetika rFVIIIFc u odnosu na rFVIII (jednofazni test koagulacije [aktivirano parcijalno vreme tromboplastina] i hromogeni testovi kalibrisani u normalnu ljudsku referentnu plazmu sa potencijom koja se može osloniti na standarde Word Health Organization). Sigurnosn krajnje tačke uključuju učestalost neželjenih događaja i razvoj inhibitora (Nijmegen-modifikovani Bethesda test) kod pacijenata ispitivanih do 54 nedelje. Krajnje krajnje tačke efikasnosti uključuju ABR u Kraku 2 u odnosu na Krak 3, godišnji broj epizoda spontanog krvarenja i krvarenja u zglobovima po pacijentu, broj injekcija i doza po injekciji potreban da bi se razrešilo krvarenje i procene reakcija pacijenata na operaciju sa rFVIIIFc koristeći skalu odgovora na krvarenje (samo hirurška podgrupa), odgovor na tretman epizoda krvarenja i farmakokinetiku rFVIIIFc u odnosu na ADVATE®. Neneutralizirajuća antitela (NNA) procenjena su testom anti-rFVIIIFc na vezivanje antitela zasnovanom na elektrohemiluminiscenciji.

[0202] U toku su klinička ispitivanja rFVIIIFc i uključuju Kids A-LONG i ASPIRE studije. Kids A-LONG je otvorena studija Faze 3, kod dece mlađe od 12 godina, prethodno tretirane sa hemofilijom A. Ova studija aktivno regrutuje pacijente. ASPIRE je dugoročna otvorena studija za pacijente koji su završili A-LONG studiju ili koji su završili Kids A-LONG studiju.

A-LONG Studijski dizajn

[0203] Dizajn: Globalna, otvorena, višecentrična studija Faze 3. Protokol studije odobrili su lokalni institucionalni revizorski odbori za svaku od institucija koje su učestvovale, i studija je sprovedena u skladu sa International Conference on Harmonisation guidelines for Good Clinical Practice.

[0204] Ciljevi: Proceniti efikasnost i sigurnost intravenski ubrizgavanog fuzionog proteina Faktora VIII Fc (rFVIIIFc) u kontroli i prevenciji epizoda krvarenja, rutinskoj profilaksi i perioperativnom tretmanu kod osoba sa ozbiljnom hemofilijom A.

Ključni kriterijumi za uključivanje:

Muškarci

[0205] ≥ 12 godina i najmanje 40 kg

[0206] Dijagnoza teške hemofilije A definisana kao <1% (<1 IU/dL) aktivnosti endogenog Faktora VIII (FVIII)

[0207] Prethodno tretirani pacijenti (PTP): istorija ≥150 prethodnih dokumentovanih dana izloženosti (ED) sa bilo kojim trenutno plasiranim FVIII proizvodom, bili su na profilaksi ≥ 2 puta nedeljno sa FVIII proizvodom (samo za Krak 1), ili su imali 12 krvarenja u proteklih 12 meseci u epizodnom režimu.

[0208] Nema trenutnih/prethodnih FVIII inhibitora merljive aktivnosti.

[0209] Ne postoji istorija inhibitora ili istorija preosetljivosti ili anafilaksije koja je povezana sa bilo kojim FVIII ili intravenskom primenom imunoglobulina

[0210] Svi ispitanici (ili njihovi staratelji u slučaju maloletnika) dali su obaveštenu pismenu

4

saglasnost pre učešća u ispitivanju.

[0211] Kraci tretmana: Detalji dizajna A-LONG studije opisani su u nastavku.

Krak 1 (individualizovana profilaksa) je primenjen 25-65 IU/kg na svakih 3-5 dana (maksimalni 5-odnevni interval doziranja). Pacijenti su tretirani početnom dozom od 25 IU/kg prvog dana i 50 IU/kg četvrtog dana, koja je naknadno prilagođena za održavanje nivoa faktora dovoljnog za sprečavanje krvarenja. Dalja prilagođavanja doze za ciljane nivoe od 3 do 5 IU/dL dozvoljena su nakon sedme nedelje ako je osoba doživela ≥ 2 umerena/jaka krvarenja tokom perioda od 8 nedelja; 10 do 20 IU/kg rFVIIIFc (cilj 20-40 IU/dL FVIII) za manje epizode krvarenja; 15 do 30 IU/kg rFVIIIFc (ciljana vrednost 30-60 IU/dl FVIII) za umerene do velike epizode krvarenja; 40 do 50 IU/kg rFVIIIFc (ciljani 80-100 IU/dL FVIII) za velike epizode krvarenja opasne po život.

Krak 2 (nedeljna profilaksa) je primenjen u dozi od 65 IU/kg. Ispitanici su tretirani sa 65 IU/kg jednom nedeljno, bez prilagođavanja doze ili intervala.

Krak 3 (epizodni [na zahtev] tretman) primenjeno je 10-50 IU/kg. Pacijenti su primili rFVIIIFc epizodni tretman prema potrebi za krvarenje.

Osnovana je podgrupa za perioperativno upravljanje. U ovoj podgrupi, rFVIIIFc je primenjen pre i posle operacije kod podgrupe pacijenata kojima je potreban veliki hirurški postupak tokom ispitivanja. Ispitanici iz bilo koje grupe za tretman mogli bi da budu upisani u hiruršku podgrupu. Podobnost: potrebna veća operacija; ≥12 dana izlaganja rFVIIIFc sa negativnim titrom inhibitora posle ovog perioda i u roku od 4 nedelje pre operacije; i, završeno, u najmanju ruku skraćeno PK uzorkovanje.

[0212] Svi pacijenti (isključujući sekvencijalnu podgrupu PK) podvrgnuti su uzorkovanju PK od pre injekcije rFVIIIFc do 96 sati nakon injekcije, prema rasporedu: pre injekcije, 30 (±3) minuta, 3 sata (±15 minuta), 72 (±2) sata (Dan 3) i 96 (±2) sati (Dan 4) od početka injekcija.

[0213] Izvršeno je ocenjivanje farmakokinetike (PK). Svi ispitanici u svim kracima imali su početnu PK procenu nakon prve rFVIIIFc doze. Podgrupa pacijenata iz Kraka 1 dodeljena je protokolarno određenoj PK podgrupi da uporedi stabilnost PK svojstava rFVIIIFc tokom vremena sa onom od rekombinantnog Faktora VIII (rFVIII, ADVATE® [anti-hemofilni faktor (rekombinantni) plazma/postupak bez albumina], oktogon alfa) na sledeći način:

Pre tretmana u oružju 1, PK je procenjen nakon jednokratne doze ADVATE® 50 IU/kg. Potom je PK procenjen kod istih pacijenata nakon jedne doze rFVIIIFc 50 IU/kg.

PK rFVIIIFc se ponovio na 12 do 24 nedelje.

[0214] Detalji o dizajnu sekvencijalne PK podgrupe (Krak 1) doziranja i PK uzorkovanja opisani su na Slici 1

[0215] Ključne mere efikasnosti (uključene u početno očitavanje):

a. Godišnja stopa krvarenja (ABR) u Kraku 1 u odnosu na Krak 3

b. Krak individualizovane profilakse u poređenju sa epizodnim krakom.

c. Broj injekcija potrebnih da se razreši epizoda krvarenja

d. Broj injekcija potrebnih da se razreše epizode krvarenja

e. Medijana doze potrebna da se razreše epizoda krvarenja

f. Tretiranje lekarskih procena reakcija pacijenata na operaciju sa rFVIIIFc korišćenjem skale sa 4-tačke

[0216] Mere ishoda PK uključuju:

a. Primarna procena PK zasnovana je na nivoima FVIII aktivnosti utvrđenim u centralnoj laboratoriji jednostepenim testom koagulacije i hromogenim testom prema komercijalno dostupnim standardima plazme.

b. PK od rFVIIIFc i ADVATE®

c. PK svojstva rFVIIIFc su upoređena sa rFVIII (ADVATE®; sekvencijalna PK podgrupa). Ukupno trajanje studije bilo je ≤75 nedelja za sve ispitanike. Primarna krajnja tačka efikasnosti bila je godišnja stopa krvarenja (ABR; Kraci 1 i 2 u odnosu na Krak 3). Procenjeni su doza i intervali profilakse, broj injekcija potrebnih za tretman epizoda krvarenja i perioperativna hemostaza.

[0217] Ključne mere sigurnosnog ishoda uključuju:

a. Učestalost razvoja inhibitora. Ispitivanje je korišćeno da detektuje pojavu inhibitora sa dvostranim intervalom pouzdanosti od 95% koristeći Clopper-Pearson tačni postupak ako se primete 2 slučaja stvaranja inhibitora.

b. Učestalost neželjenih događaja (AE) koji se dešavaju izvan perioperativnog perioda upravljanja

[0218] Pridržavanje tretmana (mere pridržavanja) procenjeno je korišćenjem elektroničkih dnevnika pacijenata.

A-LONG rezultati

Pacijenti

[0219] Ukupno 165 pacijenata je bilo uključeno u ispitivanje. Medijana starosti iznosila je 30 godina (raspon, 12-65), i 8% je bilo <18 godina. Broj pacijenata u svakoj grupi ispitivanja bio je: Krak 1 (individualizovana profilaksa), n=118; Krak 2 (nedeljna profilaksa), n=24; Krak 3 (epizodni tretman), n=23; i podgrupe perioperativnog upravljanja, n=9, 9 operacija (8 pacijenta iz Kraka 1 i 1 iz Kraka 2). Ispitanici iz svake grupe tretmana mogli su ući u hiruršku podgrupu ako im je bila potrebna veća operacija, imali su ≥12 ED do rFVIIIFc i negativan titar inhibitora posle ovog perioda, i u roku od 4 nedelje pre operacije. Pacijenti su na prethodnom epizodnom tretmanu imali veći srednji broj epizoda krvarenja unutar 12 meseci pre ispitivanja, i veći procenat pacijenata u Kracima 2 i 3 imao je ciljane zglobove. Za pacijente koji su prethodno bili na profilaksi, 87% ih je prijavilo injekcije najmanje tri puta nedeljno.

[0220] 92,7% pacijenata je završilo ispitivanje. Ukupno je 153 (otprilike 93%) pacijenata završilo ispitivanje; 112/118 (95%) u Kraku 1, 19/24 (795) u Kraku 2, i 22/23 (96%) u Kraku 3. Razlozi prevremenog prekida bili su: Krak 1 - povlačenje pacijenta (n=2), odluka lekara (n=2), ostalo (n=1), smrt (n=1); Krak 2 - povlačenje pacijenta (n=2; neželjeni događaji (AE) koji se odnose na ispitivani lek su mogli da doprinesu), AE (n=2), ostalo (n=1); Krak 3 -ostalo (n=1).

[0221] Starost, rasa i geografska lokacija pacijenata bili su reprezentativni za globalnu populaciju hemofilije A koja ima pristup tretmanu, rezimirano u Tabeli 6.

TABELA 6. Demografija A-LONG pacijenata

[0222] Pacijenti su primili rFVIIFc za srednju vrednost (min-max) od 30,5 (<1-54) nedelja sa medijanom (minimum do maksimuma) u kracima 1, 2 i 3 od 32,1 (9, 54), 28,0 (<1, 38), i 28,9 (15, 32) nedelje, respektivno. Ukupno je 111 pacijenata (67,7%) imalo> 50 ED za ispitivan lek. Tokom studije je primenjeno ukupno 9356 injekcija, što odgovara 9170 ED (100,2 pacijent-godina izlaganja). Sveukupno, 93,6% pacijenata bilo je u skladu sa propisanom dozom i intervalom u kracima profilakse.

[0223] Sveukupno, 93,6% pacijenata bilo je privrženo i propisanoj dozi i propisanom intervalu doziranja u kracima profilakse.

Efikasnost

[0224] U analizu efikasnosti uključeno je 163 pacijenata. Jedan pacijent je isključen zbog toga što je primio samo ADVATE® (Krak 1); drugi pacijent se povukao pre procene efikasnosti (Krak 2). Medijane ABR sa 25. i 75. percentilima (interkvartilni raspon [IQR]) su sledeći: Krak 1 - individualizovana profilaksa: 1,6 (0,0, 4,7); Krak 2 - nedeljna profilaksa: 3,6 (1,9, 8,4); i Krak 3 - epizodni tretman: 33,6 (21,1, 48,7). Većina epizoda krvarenja bila je spontana. U Kracima 1, 2 i 3, respektivno, 45,3%, 17,4% i 0% nije imalo epizoda krvarenja, i 13,7%, 34,8%, i 0% imalo je 1 epizodu krvarenja.

[0225] Medijana intervala doziranja:

a. U kraku individualizovane profilakse srednji interval doziranja iznosio je 3,5 dana, tokom poslednja 3 meseca tokom ispitivanja.

b. 30 procenata pacijenata u kraku individualizovane profilakse postiglo je srednji interval doziranja od najmanje 5 dana.

c. Sveukupno, medijana (IQR) intervala doziranja sa individualizovanom profilaksom, koja je imala za cilj da se postigne najniži FVIII od najmanje 1 do 3 IU/dL (sa dozvoljenim maksimalnim 5-dnevnim intervalom u protokolu), iznosila je 3,5 (3,2-4,4) dana (Tabela 7) na osnovu medijane nedeljne doze od 78 (72-91) IU/kg. d. Otprilike 30% pacijenata postiglo je srednji interval doziranja od 5 dana tokom poslednja 3 meseca tokom ispitivanja. 100% pacijenata imalo je prosečne intervale doziranja ≥2 dana tokom čitavog ispitivanja.

[0226] Medijana doze po injekciji za Krak 3 epizodnog režima iznosila je 26,5 IU/kg (n=23), i srednja ukupna doza po epizodi krvarenja iznosila je 27,4 IU/kg (n=23).

TABELA 7. Uporedna farmakokinetika za rFVIIIFc u odnosu na rFVIII (n=28)<1>

[0227] Kontrola krvarenja: približno 98% (97,7%) epizoda krvarenja je kontrolisano sa jednom ili dve injekcije rFVIIIFc.87,3% krvarenja je kontrolisano jednom injekcijom. 1,7% su bile potrebne tri injekcije.

[0228] Perioperativno upravljanje: Ukupno je obavljeno 9 glavnih operacija kod 9 pacijenata (8 pacijenata iz Kraka 1; 1 pacijent iz Kraka 2), uključujući artroplastiku kolena (n=5), laparoskopsku popravku ingvinalne kile (n=2), apendektomiju (n=1) i artroskopiju (n=1). Lekari koji su obavljali tretman ocenili su hemostatsku efikasnost rFVIIIFc odličnom (8/9) ili dobrom (1/9) u 100% operacija. Medijana (min, max.) procenjenog gubitka krvi dostupna za 7/9 operacija iznosila je 15,0 (0, 600) mL tokom operacije i 0,0 (0, 1100) mL postoperativno; posthirurška drenaža).

PK

[0229] Uporedni PK podaci za rFVIIIFc i ADVATE® dostupni od 28 pacijenata u sekvencijalnoj PK podgrupi Kraka 1 sažeti su u Tabeli 7.

a. rFVIIIFc je pokazao približno 50% duži poluživot eliminacije (Slika 2) i srednje vreme zadržavanja u poređenju sa ADVATE® (P <0,001) zbog smanjenja klirensa rFVIIIFc za 35% u odnosu na ADVATE®.

b. Srednje geometrijsko vreme do 1 IU/dl FVIII aktivnosti nakon doze od 50 IU/kg bilo je otprilike 5 dana za rFVIIIFc u odnosu na približno 3 dana za ADVATE® (P<0,001; Tabela 7, Slika 2).

c. Postepeni oporavak za rFVIIIFc je bio klinički uporediv sa ADVATE®.

d. Nije došlo do pomeranja PK svojstava rFVIIIFc, što dokazuju uporediva PK svojstva između osnovice i ponavljanja rFVIIIFc PK profila.

e. Analogni PK rezultati dobijeni su kada se analiza zasnivala na hromogenom FVIII testu.

f. Jednostepene i hromogene koagulacije određuju tačno i precizno i rFVIIIFc i ADVATE® koristeći komercijalno dostupne standarde FVIII u plazmi.

[0230] Geometrijska sredina (95% interval pouzdanosti) terminalnog poluživota rFVIIIFc iznosila je otprilike 19,0 sati (17,0, 21,1) sati, što je 1,53 puta duže od ADVATE® vremena (približno 12,4 (11,1, 13,9) sati).

[0231] Srednje geometrijsko vreme (IQR) za 1% FVIII aktivnosti posle 50 IU/kg rFVIIIFc je bilo otprilike 5 dana (4,92 (4,43, 5,46) dana). Uporedni PK profili rFVIIIFc primećeni su u

1

Nedelji 14. Medijana intervala doziranja sa individualizovanom profilaksom iznosila je 3,5 dana, i srednja doza nedeljno je iznosila 78 IU/kg; približno 30% pacijenata postiglo je srednji interval doziranja od ≥ 5 dana tokom poslednja 3 meseca ispitivanja (ispitanici sa ≥6 meseci ispitivanja) kao što je prikazano u Tabeli 8.98% epizoda krvarenja je kontrolisano sa 1-2 injekcije.

TABELA 8. Sažetak profilaktičkog doziranja

Sigurnost

[0232] Nisu otkriveni inhibitori rFVIIIFc i nisu zabeleženi slučajevi anafilaksije, alergije ili ozbiljnih trombičnih događaja.

[0233] rFVIIIFc se generalno dobro podnosi i nije ocenjeno da su ozbiljni štetni događaji povezani sa rFVIIIFc.

2

[0234] Najčešći AE, bez obzira na uzročno-posljedičnu pojavu (incidencija ≥5%) koji se javljaju izvan perioda perioperativnog upravljanja, bili su nazofaringitis, artralgija (bol u zglobovima), glavobolja i infekcija gornjih disajnih puteva, sažeto u Tabeli 9.

[0235] 12 ispitanici (7,3%) su imali najmanje jedan ozbiljan AE (SAE) izvan perioperativnog perioda upravljanja.

[0236] Istraživači nije procenio da SAE imaju veze sa lekom.

[0237] Sa NNA testom, koji je približno 20 puta osetljivija od Bethesda testa, primećena je beznačajna učestalost ne-neutralizujućeg antitela (NNA). U početku je pet pacijenata bilo pozitivno na NNA, ali svi su imali najmanje jednu negativnu ocenu tokom studije. Šest pacijenata, četiri u Kraku 1 studije i dva u Kraku 2 studije, postali su pozitivni tokom studije. U skoro svim slučajevima, međutim, antitela su prolazna i niskog titra, i u svim slučajevima antitela su usmerena protiv FVIII.

[0238] Sveukupno, 14 (8,5%) pacijenata je prijavilo SAE. Istraživači su utvrdili da ni jedan SAE nije povezan sa ispitivanim lekom, i nijedan prijavljen SAE nije se desio kod više od jednog pacijenta. Tokom studije dogodio se 1 smrtni događaj, koji je pripisan predoziranju pol supstancom, i istraživač ga je ocenio kao nepovezan sa rFVIIIFc.

TABELA 9. Sažetak neželjenih događaja (AE)

Sažetak

[0239] Pojedinačni i nedeljni profilaktički režimi kao rezultat imali su niske jednocifrene medijane godišnjih stopa krvarenja

[0240] U kraku individualizovane profilakse medijana intervala doziranja iznosila je 3,5 dana. Tokom poslednja 3 meseca na ispitivanju, 30 procenata pacijenata u individualizovanom kraku profilaksa postiglo je srednji interval doziranja od najmanje 5 dana.

[0241] 98% epizoda krvarenja je kontrolisano jednom ili dve injekcije rFVIIIFc. Ukupno, 757 epizoda krvarenja (Krak 1 = 209; Krak 2 = 92; Krak 3 = 456) tretirano je kod 106 od 164 pacijenta. 87,3% je zahtevalo jednu injekciju rFVIIIFc za razrešenje, i 97,8% je imalo potrebu za ≤2 injekcije. Ukupno 85,6%, 80,4% i 89,5% epizoda krvarenja je razrešeno jednom injekcijom rFVIIIFc u Kracima 1, 2 i 3, respektivno.

[0242] Hemostatičku efikasnost rFVIIIFc tokom hirurške intervencije lekari su ocenili kao odličnu ili dobru u 100% operacija.

[0243] Poluživot rFVIIIFc iznosio je približno 19,0 sati u poređenju sa 12,4 sata za ADVATE®.

[0244] Nijedan pacijent nije razvio inhibitor ili doživeo anafilaktičku reakciju na rFVIIIFc.

[0245] Rekombinantni FVIIIFc se generalno dobro podnosi.

[0246] A-LONG je najveća do danas sprovedena registraciona globalna bitna studija faze 3 dugo delujućeg rFVIII kod teške hemofilije A. Studija je pokazala da rFVIIIFc nudi potencijal za značajno smanjenu učestalost injekcija, smanjeno opterećenje tretmana, poboljšanje kliničkih ishoda za sprečavanje krvarenja kod pacijenata sa teškom hemofilijom A.

[0247] Cilj dizajna studije: Studija je osmišljena za procenu efikasnosti i sigurnosti rFVIIIFc u kontroli i prevenciji epizoda krvarenja, rutinskoj profilaksi i perioperativnom tretmanu kod osoba sa ozbiljnom hemofilijom A. Pored toga, studija je dizajnirana za procenu efektivne doze i intervala rFVIIIFc za profilaksu, kao i izvodljivost nedeljnog tretmana u dozi od 65 IU/kg.

4

[0248] Epizodni tretman je primena zamenskog faktora samo ako je potreban za tretman epizoda krvarenja nakon što su započete. Profilaktički tretman je redovna primena supstitucionog faktora radi sprečavanja epizoda krvarenja.

[0249] Početni režim iznosio je 25 IU/kg na Dan 1 i 50 IU/kg na Dan 4. Doza i učestalost tretmana mogli su da se podese na osnovu pacijentovog PK profila, i cilj je bio da se održi nivo faktora koji je dovoljan da se spreče epizode krvarenja korišćenjem doza između 25 IU/kg i 65 IU/kg, i intervali tretmana od 3 do 5 dana.

[0250] Više od polovine pacijenta sa teškom hemofilijom A u SAD još uvek ne poštuje režim profilakse, delom i zbog opterećenja tretmana. Stoga smo uključili nedeljni režim doziranja u A-LONG studiju kako bismo procenili da li će ovaj režim rezultovati nižim ABR u poređenju sa epizodnim režimom. ABR medijana u nedeljnom režimu iznosila je 3,59 (IQR 1,9, 8,4) u poređenju sa 33,6 (IQR 21,1, 48,7) za epizodni tretman.

[0251] Svi ispitanici imali su početnu PK procenu kako bi karakterisali PK rFVIIIFc u reprezentativnoj populaciji pacijenata sa Hemofilijom A.

[0252] Obimnije uzorkovanje PK izvršeno je kod podgrupe pacijenata u kraku individualizovane profilakse (Krak 1) na osnovici nakon pojedinačne doze ADVATE® (50 IU/kg) i nakon ispiranja od 4 dana, nakon čega je usledila jedna doza rFVIIIFc (50 IU/kg). Uzorci krvi uzimani su za ADVATE® u periodu od 72 sata. Zatim su uzeti uzorci krvi za rFVIIIFc u periodu od 120 sati. PK procena rFVIIIFc u ovom podskupu je ponovljena 12 do 24 nedelje sa istim PK uzorkom.

[0253] U perioperativnom tretmanu, jedna injekcija rFVIIIFc bila je dovoljna za održavanje hemostaze do krajnjeg datuma/vremena svih glavnih operacija sa srednjom dozom od 51,4 IU/kg. Medijana potrošnje rFVIIIFc (sumirana tokom svih injekcija tokom svakog referentnog vremenskog perioda) iznosila je 80,6 IU/kg na dan veće operacije, 161,3 IU/kg na Dane 1-3 dana nakon operacije, i 387,1 IU/kg na Dane 4-14 nakon operacija.

Perioperativna hemostaza sa rFVIIIFc ocenjena je kao odlična ili dobra za svih 9 glavnih operacija. Nijedan ispitanik nije prijavio epizodu krvarenja tokom postoperativnog ili rehabilitacionog perioda. Ukupno je zabeleženo 7 neželjenih događaja (AE) kod 4 (44,4%) pacijenata u hirurškoj podgrupi, od kojih je 6 AE bilo blage ili umerene ozbiljnosti, i 1 AE je smatran teškim. Dva ozbiljna AE (ingvinalna kila i upala slepog crijeva) prijavljena su kod 2 pacijenta. Istraživači su ocenili sve AE tokom perioperativnog perioda kao nepovezane sa rFVIIIFc tretmanom.

[0254] Lekari koji su obavljali tretman ocijenili su hemostatsku efikasnost rFVIIIFc odličnom ili dobrom u 100% operacija na skali od 4 tačke, koje podrazumevaju odličan, dobar, solidan i loš/nijedan.

[0255] rFVIIIFc rezultujeo je niskim ABR medijanama od 3,59 u kraku nedeljne profilakse i 1,60 u kraku individualizovanog intervala profilakse. Suprotno tome, krak epizodnog tretmana imao je ABR medijanu od 33,57.

[0256] U kraku individualizovane profilakse, srednji interval doziranja iznosio je 3,5 dana, medijana doze od 77,7 IU/kg tokom poslednja 3 meseca ispitivanja.

[0257] Terminalni poluživot iznosio je oko 18,97 sati za rFVIIIFc i približno 12,3 sati za ADVATE®.

[0258] 97,8% epizode krvarenja kontrolisane su jednom ili dve injekcije.

[0259] Hemostatsku efikasnost rFVIIIFc za perioperativan tretman lekari su ocenili kao odličnu ili dobru u 100% operacija.

[0260] Krak 2 je bio nedeljni režim doziranja. Dizajniran je da istraži koristi za pacijente na profilaktičkoj terapiji i da uporedi te rezultate sa pacijentima koji koriste režim epizodnog tretmana. ABR medijana u Kraku 2 iznosila je 3,59 u poređenju sa 33,57 za režim epizodnog tretmana (Krak 3).

[0261] Medijana doze po injekciji potrebna za razrešenje krvarenja bila je 27,4 IU/kg, i medijana ukupne potrebne doze iznosila je 28,2 IU/kg.

[0262] Medijana injekcija potrebnih za razrešenje epizode krvarenja iznosila je konstantno 1,0 kada se tretman primenjivano u roku od 8 sati od početka krvarenja, bez obzira na vrstu ili lokaciju krvarenja. Sveukupno, za 78,8% od rFVIIIFc injekcija u Kraku 1, 64,8% u Kraku 2, i 79,7% injekcija u Kraku 3, ispitanici su ocenili da daju odličan ili dobar odgovor.

Medijana intervala doziranja od 3,5 dana od Kraka 1 predstavlja interval doziranja koji može postići većina pacijenata: 30% pacijenata bilo je u mogućnosti da postigne interval doziranja od najmanje 5 dana. Neki pacijenti su uspeli da postignu nedeljni režim profilakse (Krak 2) sa srednjim ABR od 3,59 epizoda krvarenja.

[0263] Pacijenti u kraku individualizovane profilakse dobili su početnu dozu od 25 IU/kg prvog dana i 50 IU/kg četvrtog dana. Dizajn studije omogućio je prilagođavanje intervala doziranja i doze radi održavanja ciljanih nivoa faktora i radi sprečavanja krvarenja. Verujemo da su srednji interval i doza zasnovani na poslednjih 6 meseci ispitivanja najviše reprezentativni za individualizovani režim profilakse.

[0264] 87,3% epizoda krvarenja razrešeno je jednom injekcijom rFVIIIFc i 97,8% je razrešeno sa jednom ili dve injekcije. Za 96 (12,7%) epizoda krvarenja kojima je za razrešenje bilo potrebno više od jedne injekcije, medijana intervala između prve i druge injekcije iznosila je 30,9 sati.

[0265] Globalna procena odgovora pacijenata na dodeljeni režim rFVIIIFc je od strane istraživača ocenjena kao odlična ili efikasna za 99,4%, 100% i 98,1% ispitanih poseta u Kracima 1, 2 i 3, respektivno.

[0266] U A-LONG, aktivnost faktora koagulacije je merena korišćenjem jednostepenog (aPTT) testa koagulacije i hromogenog testa. Prijavljeni poluživot zasnovan je na rezultatima jednostepenog testa koagulacije. Dok su poluživoti rFVIIIFc i ADVATE® bili nešto duži sa hromogenim testom, odnosi između proizvoda bili su konzistentni između dva testa.

TABELA 10: Polinukleotidne sekvence

�

TABELA 11: Polipeptidne sekvence

2

4

�

�

11

��

�

��

�

�

�

�

�

11

11

Claims (20)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutski sastav koji sadrži:

(a) 50 IU/ml do 2500 IU/ml rFVIIIFc polipeptida;

(b) 10 mg/ml do 25 mg/ml saharoze;

(c) 8,8 mg/ml do 14,6 mg/ml natrijum hlorida (NaCl);

(d) 0,75 mg/ml do 2,25 mg/ml L-histidina;

(e) 0,75 mg/ml do 1,5 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i

(f) 0,08 mg/ml do 0,25 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

2. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži:

(a) 13 mg/ml do oko 20 mg/ml saharoze, ili

(b) 13,3 mg/ml saharoze ili oko 20,0 mg/ml saharoze.

3. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji sadrži:

(a) 10 mg/ml do 13 mg/ml NaCl, ili

(b) 12,0 mg/ml NaCl.

4. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koji sadrži:

(a) 1,03 mg/ml L-histidina, ili

(b) 1,55 mg/ml L-histidina.

5. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koji sadrži:

(a) 0,8 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata, ili

(b) 1,18 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata.

6. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, koji sadrži:

(a) 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80, ili

(b) 0,20 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

7. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, koja sadrži 83 IU/ml, 167 IU/ml, 250 IU/ml, 333 IU/ml, 500 IU/ml, 667 IU/ml, 1000 IU/ml, 1333 IU/ml, 1667 IU/ml, ili 2000 IU/ml rFVIIIFc polipeptida.

8. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, koji sadrži:

(a) oko 83 IU/ml, oko 167 IU/ml, oko 250 IU/ml, oko 333 IU/ml, oko 500 IU/ml, oko 667 IU/ml, oko 1000 IU/ml, oko 1333 IU/ml oko 1667 IU/ml ili oko 2000 IU/ml rFVIIIFc polipeptida;

(b) oko 13,3 mg/ml saharoze;

(c) oko 12,0 mg/ml NaCl;

(d) oko 1,03 mg/ml L-histidina;

(e) oko 0,8 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i

(f) oko 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

9. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 8, koji sadrži oko 83 IU/ml, oko 167 IU/ml, oko 250 IU/ml, oko 333 IU/ml, oko 500 IU/ml, oko 667 IU/ml, oko 1000 IU/ml, ili oko 2000 IU/ml rFVIIIFc polipeptida.

10. Farmaceutski komplet koji sadrži:

(a) prvi kontejner koji sadrži liofilizovani prašak, gde prašak sadrži

(i) 250 IU, 500 IU, 750 IU, 1000 IU, 1500 IU, 2000 IU, 3000 IU, 4000 IU, 5000 IU ili 6000 IU rFVIIIFc polipeptida;

(ii) 40 mg saharoze;

(iii) 36 mg natrijum hlorida;

(iv) 3,1 mg L-histidina;

(v) 2,40 mg kalcijum hlorid dihidrata; i

(vi) 0,40 mg polisorbata 20 ili polisorbata 80; i

(b) drugi kontejner koji sadrži sterilisanu vodu za injekcije u zapremini dovoljnoj da se dobije, u kombinaciji sa liofilizovanim praškom prvog kontejnera, rastvor koji sadrži:

(i) 83 IU/ml, 167 IU/ml, 250 IU/ml, 333 IU/ml, 500 IU/ml, 667 IU/ml, 1000 IU/ml, 1333 IU/ml, 1667 IU/ml, ili 2000 IU/ml rFVIIIFc polipeptida, respektivno;

(ii) 13,3 mg/ml saharoze;

(iii) 12,0 mg/ml NaCl;

(iv) 1,03 mg/ml L-histidina;

(v) 0,80 mg/ml kalcijum hlorid dihidrata; i

(vi) 0,13 mg/ml polisorbata 20 ili polisorbata 80.

11

11. Farmaceutski komplet prema patentnom zahtevu 10, gde liofilizovani prašak sadrži 250 IU, 500 IU, 750 IU, 1000 IU, 1500 IU, 2000 IU ili 3000 IU rFVIIIFc polipeptida, i gde rastvor sadrži 83 IU/ml, 167 IU/ml, 250 IU/ml, 333 IU/ml, 500 IU/ml, 667 IU/ml, odnosno 1000 IU/ml rFVIIIFc polipeptida, respektivno.

12. Farmaceutski komplet prema patentnom zahtevu 10 ili 11, gde je prvi kontejner staklena bočica koja sadrži gumeni čep.

13. Farmaceutski komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 12, gde je drugi kontejner telo šprica, i gde je telo šprica povezano sa klipom.

14. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, koji se koristi kao lek.

15. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, koji se koristi za poboljšanje ili smanjenje jedne ili više epizoda krvarenja ili učestalosti epizoda krvarenja, ili se koristi u tretmanu ili prevenciji stanja krvarenja, kod pacijenta koji ima potrebu za tim.

16. Farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevom 15, gde poboljšanje ili smanjenje učestalosti epizoda krvarenja smanjuje godišnju stopu krvarenja, kod pacijenta koji ima potrebu za tim.

17. Farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 15 ili patentnom zahtevu 16, gde pacijent ima hemofiliju koja ima stanje krvarenja.

18. Farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 17, gde je farmaceutski sastav pogodan za intravensku ili subkutanu upotrebu.

19. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, farmaceutski komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 13, ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 18, gde rFVIIIFc polipeptid sadrži prvu podjedinicu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% ili 95% identičnosti sa aminokiselinama 20 do 1684 od SEQ ID NO: 2, i drugu podjedinicu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% do 95% identičnosti sa aminokiselinama 21 do 247 od SEQ ID NO : 4.

11

20. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, farmaceutski komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 13, ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 18, gde rFVIIIFc polipeptid sadrži prvu podjedinicu koja sadrži aminokiseline 20 do 1684 od SEQ ID NO: 2, i drugu podjedinicu koja sadrži aminokiseline 21 do 247 od SEQ ID NO: 4.

11