RS60146B1 - Rekombinantna mycobacterium kao vakcina za upotrebu kod ljudi - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na novu rekombinantnu vakcinu koja obezbeđuje zaštitni imunitet naročito protiv tuberkuloze kod humanih subjekata.

[0002] Tokom 1993 tuberkuloza (TB) je proglašena za globalnu opsanost od strane Svetske zdravstvene organizacije (WHO). Širom sveta, približno 2 mlijarde ljudi<1,2>inficirano je sa Mycobacterium tuberculosis, mikroozganizmom koji izaziva TB. Svi oni su pod rizikom od razvijanja kliničkih simptoma ove bolesti. Kod većine pojedinaca infekcija sa Mycobacterium tuberculosis prvenstveno je zadržana odbranama domaćina, a infekcija ostaje latentna. Međutim, latentna TB infekcija poseduje potencijal da se razvije u aktivnu TB bolest u bilo kom trenutku, a pojedinci sa aktivnom TB postaju izvori novih infekcija. U 2007 broj novih slučajeva ove bolesti prijavljen u WHO izveštaju (2009) iznosio je 9.3 miliona<1>i u stalnom je porastu. Približno 1.8 miliona ljudi umre od ove bolesti svake godine. Zbog toga, TB nastavlja da bude vodeći uzročnik umiranja zbog ove infektivne bolesti širom sveta.

[0003] BCG (Bacillus Calmette-Guérin), oslabljeni soj Mycobacterium bovis, primenjuje se u upotrebi kao TB vakcina od 1921. Do danas, dato je približno 4 milijarde doza.<3>Međutim, vakcinacija sa BCG nedovoljno je efektivna da zaustavi širenje TB. BCG može da zaštiti od, ili najmanje ublaži, teške oblike sistemske TB kod dece, naročito meningitis. BCG ne štiti od plućnih i infektivnih oblika ove bolesti.4 Međutim, to bi bilo neophodno u cilju prekida prenosa ove bolesti.

[0004] Samo nekoliko antibiotskih lečenja je dostupno. Njihov broj stalno opada, budući da sve veći broj pacijenata biva inficiran TB sojevima rezistentnim na više lekova.<1,5>Ono što situaciju čini još gorom je to da se šire novi veoma patogeni sojevi, poput Mycobacterium tuberculosis Beijing/W.<6>

[0005] Predmet ovog pronalaska je razvoj bezbedne, dobro tolerišuće i efikasne vakcine protiv TB, naročito za stanovnike u endemskim područjima i osobe koje su pod rizikom u ne-endemskim područjima. Ova vakcina bi zamenila BCG vakcinu koja se trenutno koristi. Nova vakcina mora biti najmanje potentna poput trenutnog soja, a mora biti bezbednija od BCG.<5,7>

[0006] Mycobacterium tuberculosis i BCG su fagocitozirani makrofagama domaćina. Intrafagozomalna lokacija izaziva prenos bakterijskog antigena kroz glavni put kompleksa II histokompatibilnosti (MHC). To rezultuje u preferencijalnoj stimulaciji CD4 T ćelija. Međutim, pokazano je da su MHC I ograničene CD8 citotoksične T ćelije krucijalne u imunitetu prema Mycobacterium tuberculosis.<8,9>Nasuprot Mycobacterium tuberculosis, BCG idukuje samo slabu stimulaciju CD8 citotoksičnih T ćelija.<2,3,10>S tim u vezi, generisan je rekombinantni BCG soj koji eksprimira domen fagolizozomalnog izlaska, koji bi usmeravao mikobakterijske antigene na MHC I put.<2,7>Ovaj soj luči listeriolizin (Hly) L. monocitogena.<7,11>On omogućava soju da izađe iz fagozoma inficiranih ćelija domaćina perforiranjem membrane tog fagozoma. Inaktivacija gena ureaze C neophodna je kako bi se obezbedila kisela fagozomalna pH za optimalnu Hly aktivnost. Perforiranje promoviše antigensku translokaciju u citomplazmu i olakšava unakrsni prajming povećanom aptoptozom.<7,9>Ovaj proces imitira imunološku indukciju Mycobacterium tuberculosis veoma efikasno. Očekivano je da način delovanja rezultuje kao efikasna i veoma dobro tolerišuća vakcina protiv TB.

[0007] Ovaj koncept je opisan u WO 99/10496 i u WO 2004/094469, čiji su sadržaji ovde uključeni kao referenca.

[0008] U ovom ispitivanju, rekombinantna ureaza-deficijentna BCG vakcina prvi put se primenjuje na humanim subjektima. Ovo ispitivanje procenjuje bezbednost, lokalnu i sistemsku toleranciju kao i imunogenost te vakcine. Ono je praćeno dozno-povećavajućim sekvencijalnim dizajnom u poređenju sa komercijalno dostupnom BCG. Osamdeset (80) subjekata u Nemačkoj nasumično su raspoređeni u 4 grupe koje se sastoje od 20 subjekata od kojih je svaki odabran i raspoređen zbog svoje istorije BCG-vakcinacije.

[0009] Intenzivno bezbedosno praćenje koje uključuje laboratorijske parametre, procene fizičke bezbednosti i detaljnu ECG-analizu, izvedeno je pored standardnog bezbednosnog praćenja.

[0010] Glavni predmet ovog pronalaska je vakcina za upotrebu kod ljudi koja obuhvata kao aktivni sastojak rekombinantnu Mycobacterium koja je ureaza-deficijentna i koja obuhvata rekombinantni molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni polipeptid koji obuhvata (a) Mycobacterium antigen ili njegov imunogeni fragment i (b) domen fagolizozomalnog izlaska.

[0011] Dalji glavni predmet ovog pronalaska je postupak za vakcinisanje humanog subjekta, koji obuhvata davanje farmaceutski efektivne doze rekombinantne Mycobacterium koja je ureazadeficijentna i koja obuhvata rekombinantni molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni polipeptid koji obuhvata (a) Mycobacterium antigen ili njegov imunogeni fragment i (b) domen fagolizozomalnog izlaska.

[0012] U naročito poželjnom primeru izvođenja, ureC sekvenca je inaktivirana (ΔUrec), npr. konstruisanjem samoubilačkog vektora koji sadrži ureC gen prekinut odabirom marker gena, čime se ciljana ćelija transformiše tim vektorom i posmatra na postojanje selekcionih marker-pozitivnih ćelija sa ureaza negativnom fenovrstom<12>.

[0013] Ova ćelija je poželjno M. bovis ćelija, M. tuberculosis ćelija, određenije oslabljenja M. tuberculosis ćelija ili druga mikobakterija, npr. M. microti, M. smegmatis, M. canettii, M. marinum ili M. fortuitum. Poželjnije, ova ćelija je rekombinantna M.bovis (BCG) ćelija, određenije rekombinantna M. bovis ćelija soja Danish podvrste Prague<13>. Najpoželjnije, ova ćelija je rekombinantna BCG soja Danish podvrste Prague, okarakterisana kao rBCG ΔUrec :: Hly<+>:: Hyg<+>(VPM1002).

[0014] Mycobacterium ćelija ovog pronalaska obuhvata rekombinantni molekul nukleinske kiseline, npr. molekul nukleinske kiseline iz SEQ ID No.1. Ovaj molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu koja kodira signalni peptid (nukleotid 1 - 120), sekvencu koja kodira imunogeni domen (nukleotid 121 -153), sekvencu koja kodira peptidni linker (nukleotid 154 - 210), sekvencu koja kodira fagolizozomalni domen (nukleotid 211 - 1722), dodatnu sekvencu koja kodira peptidni linker (nukleotid 1723 - 1800) i sekvencu koja kodira nasumični peptid (nukleotid 1801 - 1870). Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca prikazana je u SEQ ID No.2.

[0015] Domen koji može da izazove imuni odgovor bira se od imunogenih peptida ili polipeptida iz M.bovis ili M.tuberculosis ili iz njihovih imunogenih fragmenata koji imaju dužinu od najmanje 6, poželjno najmanje 8 aminokiselina. Specifični primeri za pogodne antigene su Ag85B (p30) iz M.tuberculosis (Harth et al., 1996), Ag85B (α-antigen) iz M.bovis BCG (Matsuo et al., 1988), Ag85A iz M.tuberculosis (Huygen et al., 1996) i ESAT-6 iz M.tuberculosis (Sorensen et al., 1996, Harboe et al., 1996 and Andersen et al., 1995). Poželjnije, imunogeni domen dobija se iz antigena Ag85B.

Najpoželjnije, imunogeni domen obuhvata sekvencu od aa.41 do aa.51 u SEQ ID No.2.

[0016] Rekombinantni molekul nukleinske kiseline dalje obuhvata domen fagolizozomalnog izlaska, tj. polipeptidni domen koji obezbeđuje izlazak fuzionog polipeptida iz fagolizozoma u citozol ćelija sisara. Poželjno, domen fagolizozomalnog izlaska je Listeria domen fagolizozomalnog izlaska, koji je opisan u US 5,733,151, ovde uključen kao referenca. Poželjnije, domen fagolizozomalnog izlaska izveden je iz listeriolizin gena (Hly) L.monocitogena. Najpoželjnije, domen fagolizozomalnog izlaska je kodiran molekulom nukleinske kiseline koji se bira od: (a) nukleotidne sekvence koja obuhvata nukleotide 211 -1722 kakvi su prikazani u SEQ ID No.1, (b) nukleotidne sekvence koja kodira istu aminokiselinsku sekvencu kao sekvenca iz (a), i (c) nukleotidne sekvence koja hibridizuje pod strogim uslovima sa sekvencom iz (a) ili (b).

[0017] Pored nukleotidne sekvence prikazane u SEQ ID No.1, ovaj pronalazak takođe obuhvata sekvence nukleinske kiseline koje sa njom hibridizuju. U ovom pronalasku, izraz "hibridizacija" koristi se kako je definisana od strane Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104). U skladu sa ovim pronalaskom, izraz "hibridizacija" koristi se ako pozitivni signal hibridizacije i dalje može da se zapazi posle pranja tokom jednog sata sa 1 X SSC i 0.1 % SDS na 55°C, poželjno na 62° C, a poželjnije na 68°C, određenije tokom 1 sata u 0.2 X SSC i 0.1 % SDS na 55°C, poželjno na 62°C, a poželjnije na 68°C. Sekvenca koja hibridizuje sa nukleotidnom sekvencom kao iz SEQ ID No.1 pod ovakvim uslovima pranja, predstavlja domen fagolizozomalnog izlaska koji kodira nukleotidnu sekvencu koja je poželjna u skladu sa ovim pronalaskom.

[0018] Nukleotidna sekvenca koja kodira domen fagolizozomalnog izlaska kakav je prethodno opisan može se direktno dobiti iz Listeria organizma ili iz bilo kog rekombinantnog izvora npr. rekombinantna E.coli ćelija koja sadrži odgovarajući Listeria molekul nukleinske kiseline ili njegovu varijantu kakva je prethodno opisana.

[0019] Poželjno, rekombinantni molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni polipeptid sadrži sekvencu koja kodira signalni peptid. Poželjnije, ta signalna sekvenca je signalna sekvenca aktivna u mikobakteriji, poželjno u M.bovis, npr. nativna M.bovis signalna sekvenca. Poželjan primer pogodne signalne sekvence je nukleotidna sekvenca koja kodira Ag85B signalni peptid koji je prikazan u SEQ ID No.1 od nukleotida 1 do 120.

[0020] Dalje, poželjno je da je peptidni linker obezbeđen između imunogenog domena i domena fagolizozomalnog izlaska. Poželjno, pomenuti peptidni linker ima dužinu od 5 do 50 aminokiselina. Poželjnije, sekvenca koja kodira linker kakav je prikazan u SEQ ID No.1 od nukleotida 154 do 210 ili sekvenca koja joj odgovara u pogledu degeneracije genetskog koda.

[0021] Nukleinska kiselina može biti smeštena na rekombinantnom vektoru. Poželjno, rekombinantni vektor je prokariotski vektor, tj. vektor koji sadrži elemente za replikaciju i/ili genomsku integraciju u prokariotske ćelije. Poželjno, rekombinantni vektor nosi molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska koji je radno povezan sa sekvencom za kontrolu ekspresije. Sekvenca za kontrolu ekspresije poželjno je sekvenca za kontrolu ekspresije aktivna u mikobakteriji, naročito u M.bovis. Taj vektor može biti ekstrahromozomalni vektor ili vektor pogodan za integraciju u hromozom. Primeri takvih vektora poznati su stručnjacima iz ove oblasti i, primera radi, dati su u Sambrook et al. supra.

[0022] U nekim primerima izvođenja, rekombinantna Mycobacterium ćelija može da nosi gen rezistencije na antibiotike, npr. gen rezistencije na higromicin (Hyg). U drugim primerima izvođenja, rekombinantna Mycobacterium ćelija ne nosi gen rezistencije na antibiotike.

[0023] Poželjno, ova vakcina je živa-vakcina za upotrebu kod ljudi, npr. za upotrebu na stanovnicima područja endemiskih za mikobakterijske infekcije, kao što je tuberkuloza ili za upotrebu kod osoba koje su pod rizikom od oboljevanja, a u ne-endemskim područjima. Ova vakcina može biti za davanje Mycobacterium-, npr. BCG-naivnom subjektu, npr. čoveku koji prethodno nije izložen imunogenom Mycobacterium čelendžu ili čovek koji prethodno nije imunizovan sa BCG. Primeri takvih subjekata su npr. novorođenčad ili deca, npr. do 8 godina, npr. u područjima endemskim za mikobakterijski infekcije, kao što je tuberkuloza, ili osobe koje su pod rizikom od oboljevanja, a u ne-endemskim područjima. Ova vakcina naročito je pogodna za davanje subjektima sa HIV-pozitivnim roditeljima, npr. majkama. Ova vakcina može se dati Mycobacterium-, npr. BCG-, naivnim subjektima u populaciji endemskoj za HIV-infekcije. U drugim primerima izvođenja, ova vakcina može se davati Mycobacterium, npr. BCG, prethodno izloženom subjektu, npr. deci od 9 godina na gore ili odraslima, npr. koji žive u područjima sa endemskom tuberkulozom ili subjektima koji su prethodno imunizovani sa BCG. Kod ovakvih subjekata, ova inventivna vakcina ima efekat bustovanja već postojećeg BCG indukovanog imunog statusa.

[0024] U dalje poželjnom primeru izvođenja, davanje ove vakcine rezultuje kao povećan IFN-γ odgovor kod naivnih ili prethodno imunizovanih subjekata i kao ushodna regulacija CD4<+>T ćelija, naročito multifunkcionalnih CD4<+>T ćelija.

[0025] U poželjnom primeru izvođenja, ova vakcina je liofilizat koji obuhvata Mycobacterium ćeliju i opciono agense, npr. glukozu i/ili dekstran. Opciono, ova vakcina dodatno obuhvata rekonstrukcionu tečnost, vodu za injekcije ili slani rastvor. U nekim primerima izvođenja, ova vakcina obuhvata dozu od oko 10<3>-10<4>CFU (jedinice za formiranje kolonija), oko 10<4>-10<5>CFU ili oko 10<5>-10<6>CFU.

[0026] Može se birati davanje putem mukozalne površine (npr. očno, intranazalno, oralno, gastrično, crevno, rektalno, vaginalno ili kroz urinarni trakt) ili parenteralnim putem (npr. subkutano, intradermalno, intramuskularno, intravenozno ili intraperitonealno). Naročito je poželjno intradermalno davanje.

[0027] U nekim primerima izvođenja, ova vakcina je za davanje u jednoj dozi koja uključuje imunizaciju Mycobacterium-naivnih subjekata ili buster vakcinaciju Mycobacterium-prethodno-izloženih subjekata, npr. subjekata koji su prethodno vakcinisani vakcinom na bazi Mycobacterium, npr. nativna BCG vakcina za subjekte koji su bili u kontaktu sa mikobakterijom, npr. patogenom mikobakterijom pre davanja ove inventivne vakcine. Alternativno, vakcina ovog pronalaska može se davati u dve ili više doza. Određene doze mogu se davati između intervala od oko 1 nedelje do oko 6 meseci ili duže.

[0028] Vakcina ovog pronalaska je za upotrebu protiv Mikobakterijskih infekcija, određenije za upotrebu protiv tuberkuloze.

[0029] Ovaj pronalazak dalje će biti ilustrovan pomoću crteža, liste sekvenci i primera koji slede.

Fig.1: Korelacija prosečne veličine eritema po tretmanskoj grupi i ispitnom danu

Fig.2: Prosečna veličina zadebljanja po tretmanskoj grupi i ispitnom danu

Fig.3: Prosečne promene od osnovne linije za IFN-γ-Odgovor posle stimulisanja sa Ag 85B kod naivnih subjekata.

A. PBMC ELISA za IFN-γ,

B. ELISpot,

C. ELISA Pune krvi za IFN-γ.

Svi ogledi stimulisani su sa Ag85B 2 µg/mL. VPM1002 (5x10<5>) prikazan je crvenim stubićima, BCG grupa plavim stubićima.

Stimulisanje: Ag 85B 2 µg/mL. VPM1002 povećava IFN-γ odgovor.

Fig.4: Prosečne promene od osnovne linije za IFN-γOdgovor posle stimulisanja sa Ag 85B kod prethodno imunizovanih subjekata

A. PBMC ELISA za IFN-γ,

B. ELISA Pune krvi za IFN-γ.

Svi ogledi stimulisani su sa Ag85B 2 µg/mL.

VPM1002 (5x10<5>) prikazan je crvenim stubićima, BCG grupa plavim stubićima.

Stimulisanje: Ag 85B 2 µg/mL. VPM1002 povećava IFN-γ

odgovor.

Fig.5: Promena od osnovne linije pojedinačnih i multifunkcionalnih CD4<+>T ćelija kod naivnih subjekata

A. Frekvencija pojedinačnih pozitivnih CD4+ T ćelija (ekspresija IFN-γ) ponovo stimulisanih sa PPD

B. Frekvencija multifunkcionalnih CD4 T ćelija (ekspresija IFN-γ i IL-2) ponovo stimulisanih sa Ag85B.

C. Frekvencija multifunkcionalnih CD4 T ćelija (koje eksprimiraju IFN-γ, IL-2 i TNF-α) ponovo stimulisanih sa PPD ili

D. Ponovo stimulisane sa Ag85B, određena je pomoću FACS ICS od PBMC za odrasle imunizovane sa VPM1002 (crveno) ili BCG kontrolom (plavo).

SEQ ID No.1: pokazuje nukleotidnu sekvencu molekula nukleinske kiseline koji kodira Mycobaterium 85B antigen i listeria domen faga-lizomalnog izlaska.

SEQ ID No.2: pokazuje odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu iz molekula nukleinske kiseline iz SEQ ID No.1.

Primer

[0030] Faza 1 kliničkog ispitivanja za procenjivanje bezbednosti i imunogenosti inventivne vakcine (VPM1002) u poređenju sa BCG na zdravim muškim dobrovoljcima koji su odabrani i raspoređeni zbog svoje istorije BCG vakcinacije.

1. Identitet vakcine VPM 1002

[0031] VPM1002 je genetski modifikovana BCG vakcina izvedena iz Mycobacterium bovis BCG soja Danish podvrste Prague, okarakterisana kao rBCG AureC :: Hly<+>:: Hyg<+>. VPM1002 je bila dostupna kao liofilizovani kolač žive Mycobacterium bovis BCGΔureC::Hly<+>::Hyg<+>. Jedna bočica sadržavala je 5x10<6>CFU (opseg 2-8x10<6>CFU) VPM1002.

[0032] Gen za listeriolizin (Hly) inkorporiran je u ureaza C gen (ureC) što rezultuje brisanjem ureaza C aktivnosti i uvođenjem listeriolizin aktivnosti.

[0033] VPM1002 je otporna na higromicin (Hyg). Otpornost na higromicin služi kao selekcioni marker tokom genetskog inženjeringa soja i služiće kao specifičan marker u genetski modifikovan organizam (GMO)-praćenju i GMO-planu za hitne slučajeve. VPM1002 je osetljiva na antibiotike koji se uobičajeno koriste u lečenju mikobakterijskih infekcija, tj. izoniazid, rifampicin i etambutol.

[0034] VPM1002 obezbeđena je kao zamrzavanjem osušen (liofilizovan) kolač koji je rekonstituisan sa 1 mL H2O (aqua ad injectabilia). Koncentracija nakon rekonstituisanja iznosila je oko 5 x 10<6>CFU. Za davanje doza od 5 x 10<3>i 5 x 10<4>CFU, rekonstituisana VPM1002 suspenzija razblažena je 1:100 ili 1:10, respektivno, upotrebom odmah upotrebljivog sterilnog natrijum hloridnog 0.9% rastvora.

2. Ciljevi

[0035] Primarni cilj ovog ispitivanja bio je da se ispita bezbednost pojedinačnih doza VPM1002.

[0036] Sekundarni cilj ovog ispitivanja bio je da se ispita imunogenost pojedinačnih doza VPM1002 za vakcinaciju protiv tuberkuloze.

3. Metodologija (dizajn ispitivanja):

[0037] Ovo je prva primena VPM1002 na ljudima. Ispitivanje je praćeno otvorenim, nasumičnim, kontrolisanim, dozno-povećavajućim dizajnom kako bi se odredila bezbednost i imunogenost pojedinačne doze VPM1002.

[0038] Pojedinačna vakcinacija sa VPM1002 data je intradermalno subjektima koji su ili Bacille Calmette-Guérin (BCG) naivni ili koji su prethodno imunizovani sa BCG (zabeležena BCG-vakcinacija u dokumentima o vakcinisanju ili BCG-ožiljak i u oba slučaja uz ne više od slabo pozitivnog kožnog testa na prečišćeni proteinski derivat (PPD)). Ispitane su tri povećavajuće doze VPM1002. Referentna grupa subjekata primila je jednu dozu BCG vakcine.

[0039] Nakon vakcinacije, bezbednosni parametri pažljivo su praćeni do 4 sata nakon doziranja. Nakon toga, subjekti su otpušteni iz klinike, osim prva 3 subjekta unutar svake dozne grupe, koji su ostali u klinici do 24 sata nakon vakcinacije.

[0040] Bezbednosne i farmakodinamičke procene izvođene su do Dana 57 i ponovo 6 meseci posle vakcinacije.

[0041] Privremena bezbednosna analiza izvedena pošto su rezultati na Dan 57 dobijeni od prva 3 subjekta svake kohorte. Na osnovu ovih podataka, davanje VPM1002 u dozama do 5x10<5>CFU procenjeno je kao bezbedno i dobro tolerišuće. Na osnovu krajnjih tačaka drugog ispitivanja imunogenosti, izvedeno je ponovno statističko procenjivanje veličine uzoraka. Rezultati ove analize (p1 = 0.0119) pokazuju da je planirana veličina uzoraka od 80 subjekata uključenih u ispitivanje bila dovoljna. Proširenje veličine uzorka nije bilo potrebno.

4. Broj subjekata

[0042] U ovo ispitivanje, planirano je uključivanje četrdeset (40) BCG naivnih i 40 subjekata sa prethodnom BCG vakcinacijom (ili PPD pozitivni). Svih 80 subjekata, osim 1 subjekta, koji nije uspeo da ih prati, završili su ispitivanje kako je planirano.

5. Dijagnoza i glavni kriterijumi za uključivanje:

[0043] Zdravi muški subjekti, 18-55 starosti (uključene obe granice), bez bilo kakvih simptoma, fizičkih znakova ili laboratorijskih vrednosti koje sugerišu sistemske poremećaje ili trenutnu bolest i bez bilo kakvih znakova aktivne ili latentne tuberkulozne infekcije (LTBI). Tuberculin-PPD test morao je biti < 10 mm za subjekte sa prethodnom BCG vakcinacijom, a < 1 mm za naivne subjekte na osnovnoj liniji.

6. Ispitni proizvod, doza i način davanja, broj serija:

[0044] Aktivni sastojak VPM1002 je Mycobacterium bovis rBCGΔ ureC::Hly<+>::Hyg<+>, zamrzavanjem osušena i standardizovana do nekog broja vijabilnih (jedinice za formiranje kolonija (CFU)) mikobakterija po davanju.

Dozni nivoi:

5 x 10<3>CFU VPM1002 (opseg 2-8 x 10<3>CFU)

5 x 10<4>CFU VPM1002 (opseg 2-8 x 10<4>CFU)

5 x 10<5>CFU VPM1002 (opseg 2-8 x 10<5>CFU)

[0045] Približno 0.1 mL rekonstituisane i razblažene VPM1002 suspenzije dato je putem intradermalne injekcije upotrebom šprica od 1 mL podeljen na stotine mL (1/100 mL) sa kratkom zakošenom iglom (25G/0.50 mm ili 26G/0.45 mm, 10 mm po dužini). Nisu bili dozvoljeni niti vazdušni ubrizgivači, niti uređaj koji pravi višestruke ubode.

7. Trajanje tretiranja:

[0046] Jedno vakcinisanje

8. Referentna terapija, doza i način davanja, broj serija:

[0047] BCG Vakcina SSI, prah i rastvarač za suspenziju za ubrizgavanje, Statens Serum Institut Denmark.

[0048] Nakon rekonstituisanja, 1 doza (0.1 mL) sadržala je:

Mycobacterium bovis BCG (Bacillus Calmette-Guérin), danski soj 1331, živ oslabljen, 2-8 x 10<5>CFU.

[0049] Davanje je izvedeno kao što je opisano za VPM1002.

9. Kriterijumi ocenjivanja:

Bezbednosni parametri:

[0050]

● Javljanje sporednih efekata, vremenski profil sporednih efekata, drugi profil sporednih efekata ● Određivanje lokalne reakcije na mestu vakcinacije i fotodokumentovanje lokalne reakcije na mestu vakcinacije (Dani 1, 5, 11, 29, 57, nakon 6 meseci)

● Standardni bezbednosni laboratorijski parametri (hematologija, koagulacija, klinička hemijska slika koja uključuje enzime jetre, urinoliziju)

● QuantiFeron gold test na osnovnoj liniji, Dan 57 i Mesec 6

● Fizikalni pregled uključujući elektrokardiogram (ECG), vitalne znake i telesnu masu

● Radiografija grudnog koša

● Sonografno snimanje jetre na osnovnoj liniji, Dan 57 i Mesec 6

● Opšte ocenjivanje tolerancije subjekta.

1

Parametri imunogenosti:

[0051]

● Test limfocitnog stimulisanja (LST): količina interferona (IFN)-γ po ćeliji

● Enzimska imunospot tehnika (ELIspot): broj IFN-γ sekretujućih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) u odnosu na ukupan broj PBMC

● Ogledi pune krvi (WBA): količina IFN-γ u odnosu na broj limfocita

● Intraćelijsko bojenje citokina (ICS) (fluorescencijom aktivirano sortiranje ćelija (FACS)-analiza):

broj CD)4+ i CD8+ limfocita; koji su xxx-svetli, xxx-svetli i xxxsvetli ("trostruko-pozitivne-ćelije"); u odnosu na ukupan broj limfocita.

10. Ispitne krajnje tačke:

Primarna krajnja tačka:

[0052] Kako bi se odredila bezbednost pojedinačne doze VPM1002 ocenjeni su fizikalni pregled, vitalni znaci, ECG, sonografija jetre, radiografija grudnog koša, laboratorijski bezbednosti parametri (koji uključuju hematologiju, koagulaciju, kliničku hemijsku sliku i urinoliziju), tolerancija, beleženje uporednih lekova i praćenje sporednih efekata.

Sekundarne krajnje tačke: Imunogenost, određena upotrebom

[0053]

● LST za tuberkulin (PPD) sa naknadnim IFN-γ specifičnim enzimskim imunosorbentnim ogledom (ELISA) na supernatantima PBMC.

● ELIspot specifičan za broj IFN-γ sekretujućih PBMC posle stimulisanja sa PPD.

● WBA stimulisanje ćelija tokom 3 dana sa PPD i merenje IFN-γ u plazmi pomoću ELISA.

Istraživačke krajnje tačke: Imunogenost, određena upotrebom

[0054]

● FACS-analize ICS za IFN-γ, faktor nekroze tumora (TNF)-α i interleukina (IL)-2 u CD4+ i CD8+ limfocitima nakon celonoćnog stimulisanja sa PPD.

● FACS-analize intraćelijskog bojenja sa karboksifluorescein diacetat sukcinimidil estrima (CFSE) u CD4+ i CD8+ limfocitima nakon celonoćnog stimulisanja sa PPD

● LST, ELIspot, ICS i WBA za stimulisanje sa peptidnim koktelom antigena tuberkuloze (TB-Ag) 85b. ● Koncentrovanja sermunskih antitela protiv PPD ili TB-Ag85B peptidnog koktela; kvantifikacije imunoglobulinskih (Ig)G-podvrsta ovih serumskih antitela.

11. Statističke metode:

[0055] Opisne statistike korišćene su za procenu bezbednosnih parametara. Sledeće statističke ispitne procedure korišćene su za pribavljanje imunogenih podataka:

● Jonckheere Terpstra test (a =0.05) za detektovanje odnosa doza-odgovor u prilagođenim promenama od osnovne linije u ponovljenim uslovima merenja u poređenju sa BCG-grupom ● Model linearne regresije za podešavanje promena od osnovne do pojedinačnih vizita posle osnovne linije u odnosu na odgovarajući parametar sa prospektivno definisanim potentnim kovarijetima i kofaktorima faktora tretiranja (Backward-ova selekcija)

● Ocenjivanje efekata tretiranja (promene od osnovne linije) primenom 95% intervala poverenja, i unutar grupe i u poređenju VPM1002-grupe sa BCG-grupom

● Eliminacija unazad za statistički irelevantne kovarijete/kofaktore u modelima podešavanja regresije

● X 2-test, t-test, U-test za istraživačka poređenja između dve tretmanske grupe

● višestruka linearna regresija umesto Jonckheere-Terpstra-testa, koja procenjuje osetljivost neparametričkih analiza

12. Kratak pregled ispitne polulacije:

[0056] Svih 80 subjekata uključeno je u bezbednosnu populaciju i populaciju namenjenu za lečenje (ITT). Za svih 80 subjekata obezbeđene su validne i interpretirajuće procene koje se tiču imunogenih parametara i nisu primećena važnija odstupanja od protokola; na taj način, svi subjekti bili su validni za populaciju imunogenosti (IM) i pred-protokolnu polulaciju (PP).

[0057] Ukupno prosečno doba bilo je 33.1 godina (prosečne vrednosti za različite kohorte između 25.2 i 38.7 godina). Prosečna visina iznosila je 179.7 cm (između 177.2 i 181.8 cm), prosečna masa iznosila je 78.8 kg (između 73.0 i 82.5 kg), a prosečni BMI iznosio je 24.38 kg/m<2>(između 22.98 i 25.78 kg/m<2>). Razlike među tretmanskim grupama nisu smatrane klinički relevantnim.

13. Kratak pregled farmakodinamika:

[0058] Sekundarni cilj ovog ispitivanja bio je da pokaže imunogenost VPM1002. Ovaj sekundarni cilj je postignut. Ovo ispitivanje pokazuje da VPM1002 indukuje kvantitativno i kvalitativno veoma dobre ćelijske imune odgovore u oba nivoa "naivnih" i BCG "prethodno imunizovanih" subjekata.

[0059] Svi zapaženi podaci pokazuju jasan Th1 tip imunog odgovora izazvan sa VPM1002. Inicijalni cilj razvijanja ovakve vakcine soja VPM1002 bio je da se poveća ćelijama posredovan imuni odgovor i da se indukuje kvalitativno bolji imuni odgovori u odnosu na BCG. Ovi ciljevi bi mogli da se postignu. Pored toga, takođe je pokazan potencijal buster vakcinacije na već postojeći imuni odgovor indukovan od strane BCG.

[0060] Za određenu količinu IFN-γ u odnosu na određeni broj limfocita (sekundarne krajnje tačke LST i WBA) neparametrijskim i parametrijskim statistikama zapažena je veza doza-odgovor između grupa koje su primile VPM1002. Unutar svakog nivoa, prosečne promene od osnovne linije bile su najviše u 5 x 10<5>CFU VPM1002 grupi, a najniže u 5 x 10<3>CFU VPM1002 tokom svih ispitnih dana. Ovo dokazuje efekat VPM1002 na primaoca.

[0061] Analiza linearne regresije promena od osnovne linije u sekundarnim krajnjim tačkama pokazuje da starost, masa, ukupne PBMC na osnovnoj liniji i ukupni limfociti na osnovnoj liniji nisu imali statistički značajan efekat na rezultate.

[0062] U istraživačkim krajnjim tačkama, u oba nivoa primećen je značajan efekat na indukciju multifunkcionalnih CD4+ T ćelija.

[0063] Zaključuje se da VPM1002 izaziva Th1 imuni odgovor indukovanjem IFN-γ, ne samo kvantitativno različito od BCG, već i kvalitativno različito sa multifunkcionalnim T ćelijama. Ovi rezultati ohrabruju dalji razvoj ove vakcine.

14. Kratak pregled bezbednosti:

[0064] Primarna krajnja tačka faze I ovog ispitivanja bilo je ocenjivanje bezbednosti VPM1002. Zaista, ispitivanje nije otkrilo bilo kakve bezbednostne probleme za VPM1002.

[0065] Detaljnije, jedna vakcinacija sa do 5x10<5>CFU VPM1002 dobro je tolerisana. Nije primećen ni jedan ozbiljan sporedan efekat (AE).

[0066] Ispitivač je ocenio da je ukupno 80.7% svih AE-a povezano sa ispitnim lekom (sporedne reakcije na lek (ADR-e): odnos određen kao "izvestan", "verovatan" ili "moguć").

[0067] Svi subjekti su prijavili ADR-e. Skoro svi ADR bili su poremećaji na mestu ubrizgavanja (98.0% svih ADR-a).

[0068] Broj ADR-a povećavao se sa povećavanjem doze. Međutim, frekvencija i intenzitet ADR-a uvek su bili medicinski prihvatljivi, čak i pri najvišoj dozi VPM1002 (5x10<5>CFU). Takođe je postojala tendencija ka većoj incidenci ADR-a kod subjekata sa prethodnom BCG vakcinacijom u poređenju sa respektivnim tretmanskim grupama bez prethodne BCG imunizacije (239 vs.204 ADR-e, respektivno).

[0069] Svi subjekti su iskusili AE. Broj AE-a bio je sličan u BCG i 5x10<5>CFU VPM1002 grupama kod subjekata koji nisu prethodno imunizovani BCG vakcinacijom (76 i 82 AE-a, respektivno), a niži u 2 druge grupe (47 AE-a nakon 5x10<3>CFU VPM1002 i 53 AE-a nakon 5x10<4>CFU VPM1002). U grupi subjekata sa prethodnom BCG vakcinacijom, broj AE-a bio je najviši u 5x10<5>CFU VPM1002 grupi (97 AE-i), u poređenju sa 72 AE-i u BCG grupi i 61 AE-i i u 5x10<3>CFU i u 5x10<4>CFU VPM1002 grupama.

[0070] Unutar nivoa BCG-naivnih subjekata, ADR-e zapažene u tretmanskim grupama koje su primile BCG i VPM1002 u istom doznom ospegu (5x10<5>CFU) imale su uporedivu incidencu i težinu (64 versus 72 nakon BCG i VPM1002, respektivno). Unutar nivoa BCG prethodno imunizovanih subjekata, incidenca

1

ADR-a bila je nešto viša kod subjekata koji su primili 5x10<5>CFU VPM1002 u poređenju sa 5x10<5>CFU BCG (78 ADR-a nakon VPM1002 versus 60 ADR-a nakon BCG). Međutim, intenzitet ADR-a mogao se porediti između obe kohorte, a nakon bližeg ispitivanja glavni razlog za ovaj disbalans smatra se nešto veća incidenca ulceracije na mestu ubrizgavanja nakon VPM1002 (4 i 8 efekta nakon BCG i VPM1002, respektivno; 1 do 8 mm prečnika) povezana sa povezanim pratećim efektima kao što je pojava krasti, i perutanje na mestu ubrizgavanja (6 versus 9 i 4 versus 7 ADR-a, respektivno, nakon BCG i VPM1002), svi ocenjeni kao blagi u intenzitetu što je još jedan pokazatelj indukcije imunogenosti.

[0071] Većina AE-a bila je blagog intenziteta (95.3% svih AE), 25 AE-a (4.6% svih AE) bila je umerenog intenziteta, a 1 AE (0.1 % svih AE, prijavljeno nakon BCG) bio je ozbiljnog intenziteta.

[0072] Ni jedan subjekat nije isključen zbog AE.

Kratak pregled ukupnog broja AE-a i poremećaja na mestu ubrizgavanja

[0073] Sveukupno, broj subjekata sa lokalnim reakcijama i intenzitet lokalne reakcije povećavao se sa povećavanjem doze i bili su uporedivi za 5x10<5>CFU BCG i VPM1002 grupe. Rezultai kod BCG naivnih subjekata i subjekata prethodno imunizovanih sa BCG generalno su bili slični, nije primećena jasna tedencija ka razvoju drugih lokalnih reakcija. Najistaknutije lokalne reakcije bile su eritem i zadebljanje. Eritem je primećen kod svih subjekata. Prosečna veličina eritema povećavala se sa dozom. Prosečna veličina eritema bila je slična nakon vakcinacije sa 5x10<5>CFU BCG i VPM1002. Kod subjekata koji su primili 5x10<5>CFU VPM1002 prosečna veličina eritema bila je konzistentno veća kod prethodno

1

imunizovanih subjekata, dok je u BCG grupi prosečna veličina bila manja u grupi subjekata bez prethodne BCG-imunizacije.

[0074] Kod brojnih subjekata sa zadebljanjem nije primećena jasna dozna veza. Prosečna veličina zadebljanja bila je najveća u tretmanskim grupama, koje su primile 5x10<5>CFU BCG ili VPM1002.

Maksimalno zadebljanje javilo se u grupama vakcinisanim sa 5 x 10<5>CFU BCG oko dana 3 do 5 što je ranije od grupa vakcinisanih sa 5 x 10<5>CFU VPM1002 koje su pokazale maksimalnu veličinu na Dane 11 do 29. Veličina lokalnog zadebljanja predstavlja meru lokalnog ćelijskog imunog odgovora.

Karakterističan vremenski profil u VPM1002-grupama razlikovao se od vremenskog profila u BCG-grupama koji je u skladu sa farmakodinamičkim imunogenim rezultatima.

[0075] Korelacija prosečne veličine eritema po tretmanskoj grupi i ispitnom danu prikazana je na Fig.1.

[0076] Korelacija prosečne veličine zadebljanja po tretmanskoj grupi i ispitnom danu prikazana je na Fig.2.

[0077] Opšta tolerantnost gotovo uvek je procenjena kao dobra (42%) ili veoma dobra (57%) od strane subjekata. Samo 1 subjekat (BCG, bez prethodne vakcinacije) ocenio je opštu tolerantnost kao lošu na Dan 57, ali ne duže od 6 meseci nakon vakcinacija.

[0078] Laboratorijski podaci nisu pokazali klinički relevantne vremenske- ili dozno- povezane razlike. Neki subjekti imali su vrednosti iznad normalnog opsega već na osnovnoj liniji. Parametar funkionisanja jetre, naročito ALT, bio je povišen iznad normalnog opsega kod nekih subjekata (19 subjekata, 13 BCG naivnih subjekata i 6 subjekata sa prethodnom BCG vakcinacijom). Broj subjekata sa abnormalnim ALT vrednostima bio je najviši u grupi subjekata koji su bili BCG naivni i primili 5x10<5>CFU VPM1002, ali naglašenija povećanja zapažena su u grupama koje su primile niže doze, a nikad nisu prešle 6-struki normalni opseg i smanjile su se do kraja ispitivanja.

[0079] Vitalni znaci i ECG parametri nisu pokazali vremenski- ili dozno-povezane razlike.

[0080] Nisu zapaženi nikakvi klinički relevantni nalazi u fizikalnom pregledu, sonografiji jetre i radiografiji grudnog koša nakon vakcinacije. Svi QuantiFeron gold testovi bili su negativni.

15. Zaključci

Farmakodinamike (sekundarni ispitni ciljevi)

[0081]

- Postignut je sekundarni ispitni cilj.

- VPM1002 pokazuje imunogenost kako je detektovano dozno-zavisnim IFN-γ stimulisanjem.

Rezultati su prikazani na Fig.3 i 4.

- VPM1002 indukuje kvantitativno i kvalitativno različit imuni odgovor od BCG.

- VPM1002 ima buster efekat na već postojeći, BCG indukovan, imuni status.

1

- Multifunkcionalne CD4<+>T ćelije ushodno su regulisane u svim kohortama VPM1002 (5x10<5>CFU). Rezultati su prikazani na Fig.5.

Bezbednost (primarni ispitni cilj)

[0082]

- Postignut je primarni ispitni cilj: Jedna vakcinacija sa VPM1002 do 5x10<5>CFU bila je bezbedna i dobro tolerisana.

- Sporedni efekti koji su smatrani povezanim sa lekom bili su gotovo uvek poremećaji na mestu ubrizgavanja. Broj AE-a povećavao se sa dozom i bio je sličan nakon 5x10<5>CFU VPM1002 i referentne vakcine od 5x10<5>CFU BCG.

- Broj i intenzitet lokalnih reakcija povećavao se sa dozom VPM1002, a pri najvišoj dozi incidenca lokalnih reakcija bila je slična onoj primećenoj nakon vakcinacije sa BCG.

- Opšte tolerisanje VPM1002 uvek je procenjeno kao dobro ili veoma dobro od strane subjekata. - Laboratorijski podaci, vitalni znaci i ECG podaci pokazali su da nisu postojale klinički relevantne vremenski- ili dozno zavisne razlike.

16. Ukupan zaključak

[0083] Bezbednosni profil VPM1002 bio je dobar. VPM1002 je pokazala imunogenost. Imunogeni profil za VPM1002 razlikuje se od onog za BCG. Odnos rizik-korist omogućava nastavak kliničkog razvoja ovog kandidata za vakcinu.

Spisak referenci

[0084]

1. World Health Organization (WHO) (2009). WHO Report 2009 - Global tuberculosis controlepidemiology, strategy, financing. WHO, Geneva.

2. Andersen P. (2007). Tuberculosis vaccines - an update. Nat. Rev. Microbiol.5 , 484-487.

3. Mittrucker HW, Steinhoff U, Kohler A, Krause M, Lazar D, Mex P, Miekley D, Kaufmann SH. (2007). Poor correlation between BCG vaccination-induced T cell responses and protection against tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.104 , 12434-12439.

4. Young D, Dye C. (2006). The development and impact of tuberculosis vaccines. Cell.124, 683-687.

5. Kaufmann SH. (2007). The contribution of immunology to the rational design of novel antibacterial vaccines. Nat. Rev. Microbiol.5 , 491-504.

6. Gagneux S, DeRiemer K, Van T, Kato-Maeda M, de Jong BC, Narayanan S, Nicol M, Niemann S, Kremer K, Gutierrez MC, Hilty M, Hopewell PC, Small PM. (2005). Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.103 , 2869-2873.

1

7. Grode L, Seiler P, Baumann S, Hess J, Brinkmann V, Nasser Eddine A, Mann P, Goosmann C, Bandermann S, Smith D, Bancroft GJ, Reyrat JM, van Soolongen D, Raupach B, Kaufmann SH. (2005). Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin mutants that secrete listeriolysin. The Journal of Clinical Investigation 115 , 2472-2479.

8. Cho S, Mehra V, Thoma-Uszynski S, Stenger S, Serbina N, Mazzaccaro RJ, Flynn JL, Barnes PF, Southwood S, Celis E, Bloom BR, Modlin RL, Sette A. (2000). Antimicrobial activity of MHC class I-restricted CD8+ T cells in human tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.97 , 12210-12215.

9. Winau F, Weber S, Sad S, deDiego J, Locatelli Hoops S, Breiden B, Sandhoff K, Brinkmann V, Kaufmann SHE, Schaible UE. (2006). Apoptotic vesicles crossprime CD8 T cells and protect against tuberculosis. Immunity.24, 105-117.

10. Schaible UE, Winau F, Sieling PA, Fischer K, Collins HL, Hagens K, Modlin RL, Brinkmann V, Kaufmann SH. (2003). Apoptosis facilitates antigen presentation to T lymphocytes through MHC-I and CD1 in tuberculosis. Nat. Med.9, 1039-1046.

11. Hess J, Miko D, Catic A, Lehmensiek V, Russel D, Kaufmann SH. (1998). Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin strains secreting listeriolysin of Listeria monocytogenes. Proc Natl Acad Sci 95 , 5299-5304.

12. Reyrat JM, Berthet FX, Gicquel B., (1995) The urease locus of Mycobacterium tuberculosis and its utilization for the demonstration of allelic exchange in Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin. Proc Natl Acad Sci USA.92(19):8768-72

13. Brosch R, Gordon SV, Garnier T, Eiglmeier K, Frigui W, Valenti P, Dos Santos S, Duthoy S, Lacroix C, Garcia-Pelayo C, Inwald JK, Golby P, Garcia JN, Hewinson RG, Behr MA, Quail MA, Churcher C, Barrell BG, Parkhill J, Cole ST, Proc Natl Acad Sci USA.2007 Mar 27;104(13):5596-601. Epub 2007 Mar 19.

1

1

2

Claims (7)

1. Patentni zahtevi 1. Rekombinantna Mycobacterium bovis ćelija soja Danish podvrste Prague, koja je ureaza-deficijentna i koja obuhvata rekombinantni molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni polipeptid kakav je prikazan u SEQ ID NO:1 koji obuhvata: (a) Mycobacterium antigen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu kodiranu nukleotidima 121-153 iz SEQ ID NO: 1 i (b) domen fagolizozomalnog izlaska koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu kodiranu nukleotidima 211-1722 iz SEQ ID NO: 1.
2. 2. Rekombinantna Mycobacterium bovis ćelija prema zahtevu 1, gde ta rekombinantna Mycobacterium bovis ćelija nosi gen rezistencije na antibiotike, npr. gen rezistencije na higromicin.
3. 3. Rekombinantna Mycobacterium bovis ćelija prema zahtevu 1, gde ta rekombinantna Mycobacterium bovis ćelija ne nosi gen rezistencije na antibiotike.
4. 4. Rekombinantna Mycobacterium bovis ćelija prema zahtevu 1 ili 2, koja je okarakterisana kao rBCG ΔUrec :: Hly+ :: Hyg+.
5. 5. Rekombinantna Mycobacterium bovis ćelija prema bilo kom od zahteva 1-4, za upotrebu kao vakcina kod humanih subjekata.
6. 6. Rekombinantna Mycobacterium bovis ćelija prema zahtevu 5, gde je humani subjekat Mycobacterium-naivni subjekat, npr. novorođenče.
7. 7. Rekombinantna Mycobacterium bovis ćelija za upotrebu prema zahtevu 5, gde je humani subjekat Mycobacterium-prethodno izložen subjekat.