RS60156B1

RS60156B1 - Himerni protein sačinjen od ngf antagonist domena i tnfa antagonist domena

Info

Publication number: RS60156B1
Application number: RS20200396A
Authority: RS
Inventors: Darren Schofield; Matthew Alexander Sleeman; Iain Patrick Chessell; Jonathan Hatcher; David Lowe
Original assignee: Medimmune Ltd
Priority date: 2014-02-02
Filing date: 2015-02-02
Publication date: 2020-05-29
Also published as: BR112016017698A2; US10457728B2; JP2024133644A; EP3696193A1; JP2017509323A; MX2016010030A; CN106459190A; US9884911B2; PT3099713T; SMT202000182T1; PL3099713T3; US20200123241A1; US11897949B2; EP3099713A1; CA2938066C; HUE048478T2; RU2678810C2; JP2020120666A; AU2015212787B2; CA2938066A1

Description

Opis

POZADINA

[0001] Bol je jedan od najčešćih simptoma zbog kojih se traži lekarska pomoć i primarna je žalba polovine svih pacijenata koji posećuju lekara. Uprkos postojanju i širokoj upotrebi brojnih lekova protiv bolova, eliminacija bola, posebno hroničnog bola, nije uspela. Dakle, teret za društvo ostaje visok. Različita ispitivanja procenjuju da bolovi rezultiraju gubitkom 50 miliona radnih dana svake godine i 61.2 milijarde dolara izgubljenom produktivnošću. Kod hroničnih bolova samo je oko polovina sposobna da kontroliše bol pomoću dostupnih propisanih opcija lečenja. A, ukupno tržište lekova protiv bolova na recept iznosi oko 25 milijardi dolara godišnje. Kao što sugerišu ovi podaci, ostaje velika potreba za sigurnim i efikasnim novim analgeticima.

[0002] Terapeutska sredstva koja smanjuju nivo tkiva ili inhibiraju efekte izlučenog faktora rasta nerva (NGF ili beta-NGF) mogu biti takvi novi analgetici. NGF igra dobro poznatu glavnu ulogu u razvoju nervnog sistema; međutim, NGF je takođe dobro potvrđena meta za bol jer izaziva bol kod životinja i ljudi. Kod odraslih, NGF naročito pospešuje zdravlje i opstanak podskupova centralnih i perifernih neurona (Huang & Reichardt, Ann). Rev.

Neurosci. 24:677-736 (2001)). NGF takođe doprinosi modulaciji funkcionalnih karakteristika ovih neurona i vrši toničnu kontrolu nad osetljivošću ili razdražljivošću u senzornih receptora bola zvanih nocireceptori (Priestley i dr., Can. J. Physiol. Pharmacol.80:495-505 (2002); Bennett, Neuroscientist 7:13-17 (2001)). Nocireceptori osećaju i prenose u centralni nervni sistem različite štetne nadražaje koji izazivaju percepciju bola (nocicepciju). NGF receptori se nalaze na nocireceptorima. Ekspresija NGF je povećana u povređenom i upaljenom tkivu i pojačano se reguliše kod bolova u ljudima. Zbog toga, zbog uloge NGF u nocicepciji, sredstva koja vezuju NGF koji smanjuju nivo NGF imaju korisnost kao analgetski terapeutici.

[0003] Subkutane injekcije NGF-a same stvaraju bol kod ljudi i životinja. Injektirani NGF uzrokuje brzu toplotnu hiperalgeziju, praćenu kasnom termalnom hiperalgezijom i mehaničkom alodinijom (Petty i dr., Ann. Neurol.36:244-46 (1994); McArthur i dr., Neurology 54:1080-88 (2000)). Endogeno izlučeni NGF je sličan pro-nociceptivnom.

Oslobađanje tkiva izazvano povredom NGF-a i njegovo posledično delovanje na periferiji igraju glavnu ulogu u indukciji toplotne hiperalgezije kroz proces "periferne senzibilizacije" (Mendell & Arvanian, Brain Res. Rev.40:230-39 (2002)). Oštećenje tkiva promoviše oslobađanje pro-nociceptivnih i pro-inflamatornih citokina, koji zauzvrat, indukuju oslobađanje NGF-a iz keratinocita i fibroblasta. Ovaj oslobođeni NGF deluje direktno na nocireceptore da izazove bolna ili nociceptivna stanja u roku od nekoliko minuta od pojave bola koji škodi. Prema tome, NGF takođe deluje posredno kako bi indukovao i održavao nociceptivna/bolna stanja u oslobađanju. Pokreće degranulaciju mastocita, oslobađajući pronociceptivna sredstva poput histamina i serotonina i, što je još važnije, više NGF-a, a takođe može podstaći simpatičke nervne terminale da oslobode pro-nociceptivne neurotransmitere, poput noradrenalina (Ma & Woolf, Neuroreport.8:807-10 (1997)).

[0004] Nivoi NGF u tkivu povišeni su kod kompletnog Freundov adjuvans (CFA) - i životinja koje ubrizgavaju karagenan (Ma & Woolf, Neuroreport.8:807-10 (1997); Amann & Schuligoi, Neurosci. Lett.278:173-78 (2000)). NGF potencira reakciju kapsaicina na DRG (dorzalna ganglija) kod pacova. Zabeleženi su povećani nivoi NGF-a kod pacijenata koji pate od reumatoidnog artritisa (Aloe & Tuveri, Clin. Exp. Rheumatol. 15:433-38 (1997)) ili cistitis (Lowe i dr., Br. J. Urol.79:572-77 (1997)). Kod glodara, povreda perifernog nerva povećava ekspresiju NGF mRNK u makrofagama, fibroblastima i Švanovim ćelijama (Heumann i dr., J. Cell Biol.104:1623-31 (1987)). Prekomerna ekspresija NGF kod transgenskih miševa rezultira pojačanim neuropatskim ponašanjem bola usled povrede nerva iznad onih divljih vrsta miševa (Ramer i dr., Pain, Supp.6:S111-20 (1998)). Tokom sati i 15 dana, povišeni nivoi NGF igraju ulogu u pospešivanju „centralne senzibilizacije“ - pojačavanju neurotransmisije u sinapsama u nociceptivnim putevima kičmene moždine. Centralna senzibilizacija rezultira upornom i hroničnom hiperalgezijom i alodinijom. Smatra se da ovaj postupak uključuje internalizaciju kompleksa NGF i njegovog receptora visokog afiniteta, tirozin receptor kinaze A (trkA). Retrogradni transport ovih kompleksa do ćelija nocireceptorskih ćelija u DRG potencira izlučivanje nocireceptivnih neuropeptida, npr., supstancije P ili peptida povezanih s genom kalcitonina (CGRP), aktiviranja protein kinaze C (PKC) i N-metil-D-aspartata (NMDA) aktivacija receptora u dorzalnom rogu kičmene moždine (Sah i dr., Nat. Rev. Drug Disc.2:460-72 (2003)) - svi procesi koji promovišu senzibilizaciju nociceptivnih puteva. NGF takođe igra ulogu u povećanju regulacije i distribucije naponskih i ligandskih jonskih kanala, uključujući podtipove natrijumskih kanala i receptor kapsaicina, katjonski kanal sa potencijalom prolaznog receptora, podfamilija V član 1 (TRPV1) (Mamet i dr., J. Biol. Chem.278:48907-13 (1999); Fjell i dr., J. Neurosci. Res. 57:39-47 (1999); Priestley i dr., Can. J. Physiol. Pharmacol.80:495-505 (2002)).

Izmenjene aktivnosti i/ili ekspresija transmitera, receptora i jonskih kanala podležu povećanoj osetljivosti i ekscitabilnosti nocireceptora povezanih sa neuropatskim bolnim stanjima.

[0005] NGF-indukovana nocicepcija/bol posreduje NGF-receptor visokog afiniteta, trkA (tirozin-receptorska kinaza A) (Sah, i dr., Nat. Rev. Drug Disc.2:460-72 (2003)). Oko 40-45% ćelija nocireceptora u DRG-ima izražava trkA. Ovo su ćelijska tela vlakana malog prečnika, ili C-vlakna, koja takođe eksprimiraju izlučene pro-nociceptivne peptide, supstancu P i CGRP. Ta vlakna završavaju se u laminama I i II dorzalnog roga, gde prenose u centralni nervni sistem štetne podražaje koje osećaju periferni nocireceptori. Mutacije ili delecije u trkA genu stvaraju fenotip za koji je karakterističan gubitak osećaja boli i kod ljudi (Indo, Clin. Auton. Res.12 (Supp 1):I20-I32 (2002)) i u trkA nokaut miševima (de Castro i dr., Eur. J. Neurosci.10:146-52 (1998)). Značajno je da je ekspresija trkA regulisana kod životinja koje su podvrgnute modelima artritisa (Pozza i dr., J. Rheumatol. 27:1121-27 (2000)) ili cističnom bolu (Qiao & Vizzard, J. Comp. Neurol.454:200-11 (2002)), ili inflamatorni bol izazvan ubrizgavanjem CFA ili karagenana u šapu (Cho i dr., Brain Res. 716:197-201 (1996)).

[0006] NGF se takođe vezuje za p75 neurotrofinski receptor (p75NTR). Uloga p75NTR zavisi od ćelijskog okruženja i prisustva drugih receptora za koje se veruje da igraju dodatnu funkciju ili funkciju ko-receptora. Interakcija između trkA i p75NTR rezultira formiranjem mesta za vezivanje visokog afiniteta za NGF. Važnost takvih interakcija receptora u signalizaciji boli posredovane s NGF nije jasna, ali nedavna ispitivanja ukazuju p75NTR u ćelijskim procesima koji mogu biti relevantni (Zhang & Nicol, Neurosci. Lett.366:187-92 (2004)). Međutim, dok nokaut miševi s p75NTR pokazuju povišene pragove na štetne nadražaje, oni i dalje reaguju na hiperalgetičke NGF efekte, sugerirajući da su samo trkA receptori dovoljni za posredovanje ovih efekata (Bergmann i dr., Neurosci. Lett.255:87-90 (1998)).

[0007] Blokada NGF stvara efikasnost promene stepena u odnosu na NSAID kod hroničnog nociceptivnog bola, npr., kod osteoartritisa (OA) i kod hroničnog bola u donjem delu leđa. Brojni kandidati za terapijska antitela koja ciljaju NGF nalaze se u različitim fazama pretkliničkog i kliničkog razvoja. Takva antitela uključuju, npr., Tanezumab (PF-4383119; Pfizer), koji je humanizovano antitelo u IgG2 formatu SAR164877/REGN475 (Sanofi-Aventis/Regeneron Pharmaceuticals), koje je humano antitelo u IgG4 formatu; AMG 403 (Amgen/Johnson & Johnson), koje je humano antitelo u IgG2 formatu; PG110 (PanGenetics/Abbott), koji je humanizovano antitelo u IgG4 formatu. Još jedan kandidat za terapijsko antitelo je obelodanjen u WO 2006/077441, koji se odnosi na NGF antitela i na postupke lečenja bolesti ili poremećaja u kojima NGF igra ulogu sa obelodanjenim antitelima. MEDI-578 je humano antitelo u IgG4 formatu. Uprkos razvoju ovih kandidata, ostaje potreba da se obezbedi analgetsko olakšanje za širi spektar stanja bola kroz sredstvo koje vezuje NGF koje ima robusnu efikasnost i poboljšane sigurnosne profile.

[0008] Faktor nekroze tumora-alfa (TNFα), takođe nazvan kahektin, je plejotropni citokin širokog spektra bioloških aktivnosti uključujući citotoksičnost, imunološku proliferaciju ćelija, upalu, tumorigenezu i replikaciju virusa. Kim i dr., J. Mol. Biol.374, 1374 (2007). TNFα se najpre proizvodi kao transmembranski protein (tm TNFα), koji se zatim deli metaloproteinazom do rastvorljivog oblika (sTNFα). Wallis, Lancet Infect. Dis.8(10): 601 (2008). TNFα (∼17 kDa) postoji kao kruti homotrimerni molekul, koji se vezuje za TNF receptor 1 ili TNF receptor 2, indukujući oligomerizaciju receptora i transdukciju signala.

[0009] Poznato je da inflamatorni citokini, a naročito TNFα, imaju ulogu u stvaranju hiperalgezije. Leung, L., i Cahill, CM., J. Neuroinflammation 7:27 (2010). Neki preliminarni podaci pokazuju da TNFα inhibitori mogu biti korisni u kontroli neuropatskog bola. Videti, npr., Sommer C, i dr., J. Peripher. Nerv. Syst.6:67-72 (2001), Cohen i dr., A&A Feb 2013, 116, 2, 455-462, Genevay i dr., Ann Rheum Dis 2004, 63, 1120-1123. Rezultati kliničkih ispitivanja koja su ispitivala TNFα inhibitore kao jedinstvene terapije u lečenju neuropatskog bola ostaju neuporedive. Videti Leung i Cahill (2010).

[0010] Uprkos razvoju kandidata za ciljanje NGF i TNFα za lečenje bola, i dalje postoji potreba da se analgetskim olakšanjem za različita stanja bola obezbedi sredstvima koja imaju bolju efikasnost od postojećeg standarda nege. Ovo obelodanjivanje pruža kombinovane tretmane koji ciljaju i NGF i TNFα, koji mogu povećati efikasnost i imaju potencijal da smanje i količinu i učestalost primene za osobe koje pate od boli.

[0011] WO 2010/006060 odnosi se na proteine dvostrukog varijabilnog domena koji se mogu vezati za dva ili više različitih mogućih antigena, kao što su NGF ili TNFα. US 2011/250130 odnosi se na upotrebu antitela koja se vezuju za TNFα i koja se mogu davati u kombinaciji sa antitelom koje se vezuje za niz drugih ciljeva, kao što je NGF. WO 2007/146968 se odnosi na bispecifična, jednolančana antitela koja sadrže prvi i drugi vezujući domen koji prepoznaju mete kao što su TNFalpha i NGF. WO 2011/047262 se odnosi na projektovana bispecifična antitela ili anti-NGF fragmente i TNFα.

KRATAK REZIME OBELODANJIVANJA

[0012] Pronalazak je opisan u priloženim patentnim zahtevima. U patentnom zahtevu 1, obezbeđen je vezujući molekul koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα, gde domen antagonista NGF predstavlja fragment anti-NGF scFv, a domen antagonista TNFα sadrži rastvorljiv fragment koji vezuje TNFα TNFR-2; gde domen antagonista TNFα sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinama 1 do 235 SEQ ID NO:13; gde anti-NGF scFv fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:94 i VL domen antitela koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:95, gde je anti-NGF scFv fragment stabilizovan SS-om. Takođe je obezbeđen izolovan polinukleotid kao što je prikazan u patentnom zahtevu 15 i vektor kao što je obelodanjeno u patentnom zahtevu 16. Nadalje je obezbeđena ćelija domaćin kao što je prikazano u patentnom zahtevu 17, i sastav koji sadrži vezni molekul, kako je obelodanjeno u patentnom zahtevu 18. Sledeće pogodne karakteristike obelodanjene su u preostalim zavisnim patentnim zahtevima.

[0013] Ovo obelodanjivanje pruža sastave za upotrebu u kontroli bola kod ispitanika, koji sadrže efektivnu količinu antagonista faktora rasta nerva (NGF) i antagonista faktora nekroze tumora-alfa (TNFα), ili vezujući molekul koji sadrži domen antagonista NGF i TNFα domen antagonista, za davanje ispitaniku kome je potreban. U nekim otelotvorenjima, davanje kontroliše bol kod ispitanika efikasnije od ekvivalentne količine NGF antagonista ili TNFα antagonista koji se daje sam. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži TNFα antagonist za zajedničko davanje sa antagonistom NGF. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži NGF antagonist za zajedničko davanje sa antagonistom TNFα. U nekim otelotvorenjima, antagonist TNFα i antagonist NGF se daju sekvencijalno ili istovremeno.

[0014] U nekim otelotvorenjima, sastav za upotrebu je dovoljan da spreči, smanji, poboljša ili eliminiše bol kod ispitanika. U nekim otelotvorenjima, bol je akutna bol, kratkotrajna bol, uporni ili hronični nociceptivni bol ili uporni ili hronični neuropatski bol. U nekim otelotvorenjima, sastav za upotrebu je najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90% ili 100% efikasniji u kontroli bola u ispitanika nego ekvivalentne količine NGF antagonista ili TNFα antagonista koji se daje sam.

[0015] U nekim otelotvorenjima, deo antagonista TNFα vezivnog molekula vezuje polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2. U nekim otelotvorenjima, antagonist NGF vezuje polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1.

[0016] U nekim otelotvorenjima, deo antagonista NGF vezivnog molekula je anti-NGF antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može inhibirati vezivanje NGF za TrkA, p75NTR, ili oba TrkA i p75NTR. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo preferirano blokira vezanje NGF na TrkA preko vezivanja NGF na p75NTR. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment vezuje humani NGF sa afinitetom od oko 0.25-0.44 nM. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment se vezuje na isti epitop kao i MEDI-578. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment konkurentno inhibira vezivanje MEDI-578 za humani NGF.

[0017] U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži skup CDR-ova HCDR1, HCDR2, HCDR3 i VL domen antitela koji sadrži skup CDR-ova LCDR1, LCDR2 i LCDR3, gde HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:4 sa do dve supstitucije aminokiselina, HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:5 sa do dve supstitucije aminokiselina, HCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:6 sa do dve aminokiselinske supstitucije, SSRIYDFNSALISYYDMDV (SEQ ID NO:11), ili SSRIYDMISSLQPYYDMDV (SEQ ID NO:12), LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8 ili SEQ ID NO:8 sa do dve supstitucije aminokiselina, LCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9 ili SEQ ID NO:9 sa do dve supstitucije aminokiselina, i LCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10 ili SEQ ID NO:10 sa do dve aminokiselinske supstitucije. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:3. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:7. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH koji ima sekvencu aminokiselina koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:3. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL koji ima sekvencu aminokiselina koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:7. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:94. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:95. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH koji ima sekvencu aminokiselina koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:94. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL koji ima sekvencu aminokiselina koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:95.

[0018] U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment je potpuno HH2L2antitelo, Fab, fragment, Fab' fragment, F(ab)2fragment ili samo lančani Fv (scFv) fragment. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment je humanizovano, himerno, primitizovano ili potpuno humano. U nekim otelotvorenjima, NGF antagonist je anti-NGF scFv fragment. U nekim otelotvorenjima, scFv je SS-stabilizovan. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF scFv fragment sadrži, od N-kraja do C-kraja, VH koji sadrži niz aminokiselina SEQ ID NO:3, veznička 15-sekvenca aminokiselina (GGGGS)3(SEQ ID NO:15), i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF scFv fragment sadrži, od N-kraja do C-kraja, VH koji sadrži niz aminokiselina SEQ ID NO:94, 20-aminokiselinska veznička sekvenca (GGGGS)4(SEQ ID NO:19), i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95.

[0019] U nekim aspektima, sastav za upotrebu sadrži TNFα antagonist koji inhibira vezivanje TNFα na TNF receptor (TNFR) i na taj način blokira aktivnost TNFα. U nekim otelotvorenjima, TNFα antagonist sadrži anti-TNFα antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim otelotvorenjima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži skup CDRs HCDR1, HCDR2, i HCDR3 i domen VL antitela koji sadrži skup CDRs LCDR1, LCDR2 i LCDR3, gde su CDRs identični sa HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 infliksimaba ili HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 adalimumaba.

[0020] U nekim otelotvorenjima, vezujući molekul sadrži kompletno antitelo anti-TNFα i anti-NGF scFv spojeno na C-kraju teškog lanca antitela anti-TNFα. Taj vezujući molekul može da sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20 i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22.

[0021] U nekim otelotvorenjima, TNFα antagonist sadrži rastvorljivi vezujući fragment TNFα. U nekim otelotvorenjima, TNFR je TNFR-2 ili njegov rastvorljivi fragment. U drugim otelotvorenjima, TNFR je TNFR-1 ili njegov rastvorljivi fragment. U nekim otelotvorenjima, rastvorljivi fragment TNFR-1 je 55kD fragment. U drugim otelotvorenjima, rastvorljivi fragment TNFR-2 fragmenta je 75kD fragment. U nekim otelotvorenjima, TNFR fragment je spojen sa imunoglobulinskim Fc domenom. U nekim otelotvorenjima, imunoglobulin Fc domen je humani IgG1 Fc domen. U nekim otelotvorenjima, antagonist TNFα ima sekvencu aminokiselina koja je navedena u SEQ ID NO:13, ili njegov funkcionalni fragment.

[0022] U nekim otelotvorenjima, vezujući molekul sadrži fuzioni protein koji sadrži antagonist NGF spojen na TNFα antagonist preko veznika. U nekim otelotvorenjima, vezujući molekul je homodimer fuzionog proteina.

[0023] U nekim otelotvorenjima, NGF antagonist je anti-NGF scFv domen, a antagonist TNFα je rastvorljivi, TNFα-vezujući fragment TNFR-2 spojen na njegovom karboksi-kraju na imunoglobulinski Fc domen. U nekim otelotvorenjima, scFv se spaja na karboksi-kraj imunoglobulinskog Fc domena preko veznika.

[0024] U nekim otelotvorenjima, vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži, od N-kraja do C-kraja, TNKα-vezujući 75kD fragment TNFR-2, humani IgG1Fc domen, 10-aminokiselinski veznik (GGGGS )2, VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO 3, vezujuću sekvencu od 15 aminokiselina (GGGGS)3(SEQ ID NO:15), i VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7. U nekim otelotvorenjima, vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14. U nekim otelotvorenjima, vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži sekvencu aminokiselina koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:14.

[0025] U nekim otelotvorenjima, vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži, od N-kraja do C-kraja, TNKα-vezujući 75kD fragment TNFR-2, humani IgG1Fc domen, 10-aminokiselinski veznik (GGGGS )2, VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO:94, 20-aminokiselinska veznička sekvenca (GGGGS)4(SEQ ID NO:19), i VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95. U nekim otelotvorenjima, vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17. U nekim otelotvorenjima, vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži sekvencu aminokiselina koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:17.

[0026] U nekim otelotvorenjima, vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži, od N-kraja do C-kraja, TNKα-vezujući 75kD fragment TNFR-2, humani IgG1Fc domen, vezničku sekvencu i anti-NGF scFv domen.

[0027] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje sastav za inhibiranje p38 fosforilacije u ćeliji, gde smeša kontaktira ćeliju sa bilo kojim od ovde opisanih polipeptida (npr., bilo koji od molekula za vezivanje koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα koji je ovde opisan). Obelodanjivanje takođe obezbeđuje sastav za inhibiranje ERK fosforilacije u ćeliji, gde smeša kontaktira ćeliju sa bilo kojim od ovde opisanih polipeptida (npr., bilo koji od molekula za vezivanje koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα koji je ovde opisan). U nekim otelotvorenjima, ćelija je nervna ćelija. U drugim otelotvorenjima, ćelija je periferna nervna ćelija. U još nekim otelotvorenjima, ćelija je centralna nervna ćelija. U nekim otelotvorenjima, ćelija je u sisaru. U nekim otelotvorenjima, sisar je čovek. U nekim otelotvorenjima, ćelija je u kulturi ćelija.

[0028] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje polinukleotidne sekvence koje kodiraju ovde vezane molekule, vektore koji sadrže te polinukleotidne sekvence i ćelije domaćine koji sadrže te polinukleotide ili vektore.

1

[0029] Obelodanjivanje takođe pruža postupke proizvodnje vezujućih molekula opisanih ovde.

[0030] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje sastave, farmaceutske sastave i komplete koji sadrže ovde povezane molekule.

KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA

[0031]

Slika 1: Šematski prikaz TNFR2-Fc fuzionog proteina (Panel A) i primernog multispecifičnog vezujućeg molekula, TNFR2-Fc_VH#4, koji sadrži domen TNFR2-Fc spojen na anti-NGF scFv domen (panel B).

Slika 2A prikazuje rezultate SEC-HPLC analize nivoa fragmentacije agregata, monomera i proteina u seriji prečišćenog TNFR2-Fc_VH#4.

Slika 2B prikazuje SDS-PAGE analizu prečišćenog TNFR2-Fc_VH#4 i pročišćenog proteina TNFR2-Fc pod redukovanim i neredukovanim uslovima. Redosled punjenja gela: 1. TNFR2-Fc_VH#4, 2. TNFR2-Fc_VL-VH (TNFR2-Fc kondenzovan sa anti-NGF scFv sa reverznom promenljivim genskim domenom), 3. TNFR2-Fc beznačajan scFv 1, 4. TNFR2-Fc, 5.

TNFR2-Fc beznačajan scFv 2.

Slika 3A prikazuje čistoću TNFR2-Fc_VH#4 nakon prečišćavanja kolonom proteina A. Slika 3B prikazuje čistoću TNFR2-Fc_VH#4 sledeći drugi korak prečišćavanja na koloni SP sefaroze.

Slika 4 prikazuje stabilnost analize TNFR2-Fc_VH#4 koristeći diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju.

Slika 5 prikazuje vezivanje TNFR2-Fc_VH#4 za TNFα i NGF, pojedinačno i zajedno, kako određuje ELISA. Slika 5A prikazuje vezivanje za NGF, Slika 5B prikazuje vezivanje za TNFα, i Slika 5C prikazuje simultano vezivanje za TNFα i NGF.

Slika 6 prikazuje senzorgram testa vezivanja površinske plazmonske rezonance za TNFR2-Fc_VH#4. Istovremeno vezivanje antigena za TNFR2-Fc_VH#4 korišćenjem multispecifičnog antitela BIAcore 2000. Istovremeno vezivanje antigena procenjeno je serijskim vezivanjem TNFα i NGF preko TNFR2-Fc_VH#4 vezan za površinu senzora. Prvi deo senzorgrama prikazuje vezivanje zasićenih količina TNFα na multispecifično antitelo, drugi deo senzorgrama pokazuje vezivanje kada se primenjuje drugi antigen, bilo ponovo TNFα, koji pokazuje da je površina zasićena, ili ekvimolarna smeša TNFα i NGF. Povećanje rezonantnih jedinica izjednačava se sa vezivanjem NGF na multispecifični molekul, a samim tim i istovremenim angažmanom antigena. Test je takođe izveden sa dodatkom antigena u obrnutom redosledu koji potvrđuje ove podatke.

Slika 7 prikazuje inhibiciju NGF-posredovane proliferacije TF-1 ćelija. A. Proliferacija posredovana NGF u odsustvu dodatih NGF antagonista. B. Inhibicija ljudskog NGF odgovora TNFR2-Fc_VH#4. C. Inhibicija mišijeg NGF odgovora TNFR2-Fc_VH#4.

Aktivnost NGF se obično predstavlja kao RLU-relativna jedinica za luminescenciju, a % NGF posredovane proliferacije izračunat je kao % reakcije na NGF ligand, koristeći sledeću formulu: 100 ∗ (dobro RLU - pozadinska RLU)/(ukupno RLU - pozadinska RLU), gde je pozadina RLU = prosek kontrola medija, a ukupna RLU = prosek kontrola samo liganda. D. Inhibicija ljudskog NGF odgovora TNFR2-Fc_VarB i ndimab VarB. E. Inhibicija mišijeg NGF odgovora TNFR2-Fc_VarB i ndimab VarB.

Slika 8 prikazuje inhibiciju aktivnosti kaspaze 3 izazvane TNFα u ćelijama U937. A. TNFα je inducirala aktivnost kaspaze 3 u ćelijama U937 u odsustvu dodatih antagonista TNFα. B. Inhibicija TNFα indukovane aktivnosti kaspaze 3 u U937 ćelijama prikazana kao procenat odgovora u odsustvu dodatnog antagonista. Aktivnost TNF je obično predstavljena kao RFU-relativna fluorescentna jedinica, a % oslobađanja kaspaze 3 posredovanog TNF-om izračunat je kao % odgovora na ligand TNF, koristeći primenu formule kao što je iznad opisano na Sl.

7C: C. Slični rezultati prikazani su za srodni molekul TNFR2-Fc_varB i ndimab VarB.

Slika 9 prikazuje efekat kombinovanog lečenja etanerceptom i MEDI-578 na mehaničku hiperalgeziju izazvanu delimičnom ligacijom išijasa. Rezultati su prikazani kao ipsilateralni/kontralateralni odnos. N=9-10 po grupi. Podaci su analizirani korišćenjem dvosmerne ANOVA analize sa vremenom i lečenjem kao zavisnim faktorima. Naknadna statistička značajnost dobijena je Boniferronijevim post-hoc testom. ***p<0.001 za Op CAT-251 kontrola.

Slika 10A prikazuje efekat TNFR2-Fc_VH#4 na mehaničku hiperalgeziju izazvanu delimičnom ligacijom išijasa. Rezultati su prikazani kao ipsilateralni/kontralateralni odnos. N=10 po grupi. Podaci su analizirani korišćenjem dvosmerne ANOVA analize sa vremenom i lečenjem kao zavisnim faktorima. Naknadna statistička značajnost dobijena je Boniferronijevim post-hoc testom. ***p<0.001 u odnosu na kontrolu bispecifične izotipe. Slika 10B prikazuje slične rezultate sa srodnim molekulom TNFR2-Fc_varB.

Slika 11 prikazuje efekat istodobne primene MEDI-578 i etanercepta na smanjenje bola u modelu bola u zglobu mehaničke preosetljivosti. N=9-10 po grupi. Podaci su analizirani korišćenjem dvosmerne ANOVA analize. Naknadna statistička značajnost dobijena je Boniferronijevim post-hoc testom. *P>0.05; ***P<0.001 u odnosu na CAT-251.

Slika 12 prikazuje uticaj TNFR2-Fc_VH#4 na smanjenje bola u modelu boli u zglobovima mehaničke preosetljivosti. N=9-10 po grupi. Podaci su analizirani korišćenjem dvosmerne ANOVA analize. Naknadna statistička značajnost dobijena je Boniferronijevim post-hoc testom. ***P<0.001 u odnosu na kontrolu bispecifične izotipe.

Slika 13 prikazuje efekte pet različitih doza TNFR2-Fc_varB na hiperalgeziju izazvanu CFA u modelu štakora.

Slika 14: Toplotna karta koja pokazuje odnose HTRF iz reakcija fosfo-p38.

Slika 15: Krive doziranja pokazuju efekat TNFα, NGF ili kombinacije TNFα i NGF na p38 fosforilaciju.

Slika 16: Toplotna karta koja pokazuje odnose HTRF iz reakcija fosfo-ERK.

Slika 17: Krive doziranja pokazuju efekat TNFα, NGF ili kombinacije TNFα i NGF na ERK fosforilaciju.

DETALJNI OPIS

Definicije

[0032] Treba napomenuti da se izraz "a" ili "an" entitet odnosi na jedan ili više entiteta. Kao takvi, termini "a" (ili "an"), "jedan ili više" i "najmanje jedan" se ovde mogu koristiti naizmenično.

[0033] Dalje, "i/ili" gde se ovde koristi treba uzeti kao specifično obelodanjivanje svake od dve specifične karakteristike ili komponente sa ili bez druge. Prema tome, termin "i/ili" kako se koristi u frazi kao što su "A i/ili B" ovde treba da uključi "A i B", "A ili B", "A" (samo), i "B" "(samo). Isto tako, termin "i/ili" kako se koristi u izrazu kao što su "A, B i/ili C" treba da obuhvati svaki od sledećih aspekata: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (samo); B (samo); i C (samo).

[0034] Podrazumeva se da gde god su aspekti ovde opisani sa jezikom "koji sadrži", inače su obezbeđeni analogni aspekti opisani u terminima "koji se sastoje iz" i/ili "koji se suštinski sastoje iz".

[0035] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što se uobičajeno shvata onaj koji je uobičajeno upoznat sa stanjem tehnike koje je povezano sa ovim obelodanjivanjem. Na primer, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The

1

Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; i Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, pružiti stručnjaku sa opštim rečnikom mnogih termina koji se koriste u ovom obelodanjivanju.

[0036] Jedinice, prefiksi i simboli su označeni u prihvaćenom obliku njihovog međunarodnog sistema jedinica (SI). Numerički opsezi obuhvataju brojeve koji definišu opseg. Ako nije drugačije naznačeno, aminokiselinske sekvence se pišu sa leva na desno, u amino-karboksi orijentaciji. Ovde navedeni naslovi nisu ograničenja različitih aspekata obelodanjivanja, koja se mogu odnositi na specifikaciju u celini. U skladu sa time, pojmovi definisani odmah ispod su u potpunosti definisani s obzirom na specifikaciju u celosti.

[0037] Kako se ovde koristi, pojam "vezujući molekul" odnosi se u svom najširem smislu na molekul koji specifično vezuje antigenu determinantu, npr., antigen. Neograničavajući primer vezujućeg molekula uključuje antitela ili njihov fragment, rastvorljive proteine fuzije rastvorljivih receptora ili njihov fragment, ne-imunoglobulinske skele ili njihove fragmente, a svaki zadržava specifično vezanje antigena. Primeri neimunoglobulinskih skela uključuju Tn3 (Koide i dr., J Mol Biol 2012 Jan 13;415(2):393-405), DARPin (Boersma & Pluckthun, Curr Opin Biotechnol. 201122(6):849-57), antikalin (Gebauer & Skerra, Methods Enzymol.

2012; 503:157-88). Ispod su navedeni primeri rastvorljivih proteina i antitela rastvorljivih receptora. U određenim otelotvorenjima, vezujući molekul može biti konstruisan da sadrži kombinacije takvih antitela ili njihovih fragmenata, rastvorljivih proteina fuzije rastvorljivih fragmenata ili njihovih fragmenata i skela zasnovanih na ne-imunoglobulinu ili njihovih fragmenata.

[0038] Vezni molekul, ili bilo koji deo vezujućeg molekula koji prepoznaje antigen, ovde se naziva "vezujući domen." Osim ako se posebno ne odnosi na molekule veziva pune veličine, kao što su antitela koja se javljaju u prirodi, termin „vezujući molekul“ obuhvata, bez ograničenja, antitela pune veličine ili druge molekule koji se vezuju za antitela, kao i fragmente koji vezuju antigen, varijante, analoge ili derivati takvih veznih molekula, npr., antitelo ili imunoglobulinski molekuli koji se javljaju u prirodi ili konstruisani vezivni molekuli ili fragmenti koji vezuju antigen na način sličan veznom molekulu pune veličine.

[0039] U određenim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje određene multi-specifične vezivne molekule, npr., bispecifične, trispecifične, tetraspecifične, itd. vezujuće molekule, ili fragmente, varijante ili njihove derivate koji vezuju antigen. Kao što se ovde koristi, multispecifični vezujući molekul može da obuhvata jedan ili više domena koji se vežu za antitelo, jedan ili više domena koji se vežu za antitela ili kombinaciju istih.

[0040] Termin "faktor rasta nerva" ("NGF") takođe se u literaturi naziva faktor rasta betanerva, kao što se ovde koristi, odnosi se na izlučeni protein koji deluje u rastu i preživljavanju različitih neurona. Humani NGF predstavljen je kao GenBank pristupni broj NP_002497.2, a ovde je predstavljen kao SEQ ID NO:1. Termin NGF kako se ovde koristi nije ograničen na humani NGF i uključuje sve vrste ortologa humanog NGF. Termin "NGF" obuhvata prooblik NGF, pro-NGF, NGF u punoj dužini, kao i bilo koji oblik NGF koji je rezultat procesiranja unutar ćelije. Termin takođe obuhvata varijante NGF koje se javljaju u prirodi, npr., varijante spajanja, alelne varijante i izoformu. NGF se može vezati za dva receptora: p75 neurotrofinski receptor (p75(NTR)) i TrkA, transmembranska tirozin kinaza. NGF je dobro potvrđena meta za bol za koju se zna da posreduje senzibilizaciju nocireceptora.

[0041] Različita sredstva se testiraju kao antagonisti aktivnosti NGF. Jedno takvo anti-NGF sredstvo je trkA-Fc, koji deluje kao lepilo ili sredstvo za čišćenje na koji se vezuje i time inaktivira endogeni NGF. TrkA-Fc je fuzioni protein koji se sastoji iz NGF vezivnog područja trkA povezanog sa fragmentom konstantnog domena (Fc) IgG antitela. TrkA-Fc proizvodi hipoalgeziju kod naivnih životinja, smanjuje reakciju nocireceptora i smanjuje klijanje nemeliniranih neurona koji osećaju bol (Bennett, D. L. i dr. (1998) Eur J Neurosci, 10:1282-91).

[0042] NGF-posredovani bol je posebno pogodan za sigurno i efikasno lečenje vezanjem molekula kao što je ovde navedeno, jer se nivoi NGF povećavaju na periferiji kao odgovor na štetne podražaje i antitela imaju malu propusnost krvno-moždane barijere. Brojni anti-NGF antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen koji se mogu koristiti u ovde opisanim terapijama i sastavima mogu se naći u literaturi, videti, na primer, PCT publikacije br.

WO02/096458 i WO04/032870.

[0043] Termin "MEDI-578" odnosi se na antitelo koje se specifično veže za NGF, što je predmet međunarodne prijave br. PCT/GB2006/000238 i patentne SAD obj. br.

1

2008/0107658 A1. MEDI-578 sekvence teških i lakih lanaca prikazane su u SEQ ID NO:3 i 7, respektivno.

[0044] Termin NGF-NG odnosi se na antitelo koje se specifično veže na NGF. NGF-NG sekvence teških i lakih lanaca prikazane su u SEQ ID NO:24 i 26, respektivno.

[0045] Termin "faktor nekroze tumora alfa" ("TNFα"), koji se u literaturi naziva i kahektin, APC1 protein; faktor tumorske nekroze; TNF; ili ligand faktora nekroze tumora nekroze, član 2, kako se ovde koristi, odnosi se na specifični protein TNFα, a ne na super-porodicu TNF liganda. Humani TNFα predstavljen je kao GenBank pristupni broj NP_000585.2, a ovde je predstavljen kao SEQ ID NO:2. Termin TNFα kako se ovde koristi nije ograničen na humani TNF i uključuje sve vrste ortologa humanog TNFα. Termin "TNFα" obuhvata pro-oblik TNFα, pro-TNFα, TNFα u punoj dužini, kao i bilo koji oblik TNFα koji je rezultat procesiranja unutar ćelije. Termin takođe obuhvata varijante TNFα koje se javljaju u prirodi i koje nisu u prirodi, npr., spojne varijante, alelne varijante i izoformu. TNFα može da vezuje dva receptora, TNFR1 (TNF receptor tip 1; CD120a; p55/60) i TNFR2 (TNF receptor tipa 2; CD120b; p75/80). TNFα deluje kao pro-inflamatorni citokin, npr., koji deluje u neuroinflamacijama. Na primer, smatra se da je TNFα funkcionalno uključen u stvaranje neuropatskog bola (Leung, L., i Cahill, CM., J. Neuroinflammation 7:27 (2010)).

[0046] Veliki broj TNFα antagonista je poznat u stanju tehnike, a mnogi su komercijalno dostupni kao terapeutici. Primeri komercijalno dostupnih antagonista TNF-alfa koji se mogu koristiti u ovde terapiji i sastavima uključuje etanercept (ENBREL®, Amgen/Pfizer), infliksimab (npr., REMICADE®, Centocor), certolizumab pegol (npr., CIMZIA®, UCB), golimumab (npr., SIMPONI™, Centocor), i adalimumab (npr., HUMIRA®/TRUDEXA®, Abbott).

[0047] "Izolovani" vezujući molekul, polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija domaćin ili kompozicija odnosi se na molekul koji se vezuje, polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćeliju domaćina ili sastav koji je u obliku koji se ne pojavljuje u prirodi. Izolovani vezujući molekuli, polipeptidi, antitela, polinukleotidi, vektori, ćelije domaćini ili sastavi uključuju one koji su izmenjeni, prilagođeni, kombinovani, preuređeni, projektovani ili na drugi način manipulisani do te mere da više nisu u obliku u kojem su

1

pronađeni u prirodi. U nekim aspektima, vezujući molekul, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija domaćin ili sastav koji je izolovan je "rekombinantan".

[0048] Kao što je ovde korišćeno, termini "multifunkcionalni polipeptid" i "bifunkcionalni polipeptid" odnose se na vezujući molekul koji se ne javlja prirodno i dizajniran je da cilja dva ili više antigena. Multifunkcionalni polipeptid kao što je ovde opisano, tipično je genetski inženjerski fuzioni protein dizajniran da spoji dve različite željene biološke funkcije u jedan vezujući molekul. Na primer, multifunkcionalni polipeptid može biti višenamenski vezujući molekul. Ovde je opisan multifunkcionalni polipeptid multifunkcionalni vezujući molekul koji sadrži domen antagonista NGF, npr., peptidni domen koji blokira, smanjuje ili inhibira jednu ili više prirodnih NGF funkcija i domen antagonista TNFα, npr., domen peptida koji blokira, smanjuje ili inhibira jednu ili više prirodnih funkcija TNFα.

[0049] Jedna grupa multifunkcionalnih polipeptida koji su ovde obezbeđeni su multispecifični vezujući molekuli, npr., vezujući molekuli koji uključuju jednu ili više domena koja se vezuju za antitela, npr., „multispecifično antitelo“, jedno ili više domena koji se vezuju za ne antitela, npr., lažni receptor ili njihove kombinacije. Multispecifični vezujući molekuli, npr., uključujući jedan ili više domena koji vezuju antitela, jedan ili više domena koji se vezuju za antitela ili njihovu kombinaciju, su molekuli sa domenima koji se vezuju i koji mogu specifično da prepoznaju i vezuju se za najmanje dva različita epitopa. Različiti epitopi mogu biti unutar iste molekule (npr., isti NGF) ili na različitim molekulima, na primer, multispecifični vezujući molekuli koji mogu specifično prepoznati i vezati NGF, kao i drugi molekul koji sadrži epitope, npr., TNFα, tako da multispecifični vezujući molekul specifično prepoznaje NGF i TNFα.

[0050] Tehnike za pravljenje multispecifičnih vezujućih molekula, npr., uključujući jednu ili više vezujućih domena antitela, jedan ili više domena koji se vezuju za antitela ili kombinaciju njih, dostupni su u tehnici (Dimasi, N., i dr., 2009, J Mol Biol.393:672-92; Milstein i dr., 1983, Nature 305:537-539; Brennan i dr., 1985, Science 229:81; Suresh i dr., 1986, Methods in Enzymol.121:120; Traunecker i dr., 1991, EMBO J.10:3655-3659;

Shalaby i dr., 1992, J. Exp. Med.175:217-225; Kostelny i dr., 1992, J. Immunol.148:1547-1553; Gruber i dr., 1994, J. Immunol. 152:5368; i patent SAD 5,731,168). Takođe se razmatraju antitela sa više od dve valencije. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela (Tutt i dr., J. Immunol. 147:60 (1991)).

1

[0051] Termin "antitelo" znači molekul imunoglobulina koji prepoznaje i specifično se veže za cilj, kao što je protein, polipeptid, peptid, ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid ili kombinacije iznad pomenutog, kroz najmanje jedno mesto za prepoznavanje antigena u promenljivom regionu molekula imunoglobulina. Kao što je ovde korišćen, termin "antitelo" obuhvata netaknuta poliklonalna antitela, netaknuta monoklonska antitela, fragmente antitela (kao što su Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente), jednolančane Fv (scFv) mutante, multispecifična antitela. kao što su bispecifična, trispecifična, tetraspecifična, itd. antitela koja su dobijena iz najmanje dva netaknuta antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzionih proteina koji sadrže deo antitela za određivanje antigena, i bilo kojeg drugog modifikovanog molekula imunoglobulina koji sadrži mesto prepoznavanja antigena tako sve dok antitela pokazuju željenu biološku aktivnost. Antitelo može biti bilo koje od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, ili njihove podklase (izotipovi) (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), na osnovu identiteta njihovih konstantnih domena teških lanaca koji se nazivaju alfa, delta, epsilon, gama i mu, respektivno. Različite klase imunoglobulina imaju različite i dobro poznate strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije.

[0052] U nekim otelotvorenjima, "blokirajući" vezujući molekul, npr., blokirajuće antitelo ili vezujući molekul "antagonista", kao što je na primer, antagonist antitelo ili fuzioni protein je onaj koji inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena za koji se vezuje, kao što su NGF ili TNFα. U određenim aspektima, blokirajuća antitela ili molekuli koji vezuju antagoniste značajno ili potpuno inhibiraju biološku aktivnost antigena. Na primer, biološka aktivnost može da se smanji za 0,01%, 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ili čak 100%. "Antagonisti" i "domeni antagonista" kao što se ovde koristi uključuju polipeptide ili druge molekule koji se vezuju za njihov cilj (npr., TNFα ili NGF), blokirajući ili inhibiravši cilj u interakciji sa receptorom. NGF i/ili TNFα antagonisti tako uključuju molekule koje blokiraju ili inhibiraju interakciju NGF sa trkA ili p75 neurotrofinom, ili TNFα interakciju sa TNFR-1 ili TNFR-2. NGF i/ili TNFα antagonisti takođe uključuju molekule koji smanjuju p38 fosforilaciju i/ili ERK fosforilaciju. Primeri antagonista uključuju, ali nisu ograničeni na antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen, i ciljno specifične, rastvorljive, ne-signalizirajuće peptide receptora ("lažnih receptora", ili njihove fragmente koji vezuju ligande).

1

[0053] Termin "fragment antigena" odnosi se na deo netaknutog antitela i se odnosi na antigena koja određuje varijabilne regione netaknutog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente, linearna antitela, jednolančana antitela i multispecifična antitela koja su formirana iz fragmenata antitela. Fragmenti koji se vezuje za antigen molekula koji se ne vezuju za antitela, ovde opisani, takođe su obezbeđeni ovim obelodanjivanjem.

[0054] "Monoklonsko antitelo" odnosi se na homogenu populaciju antitela koja je uključena u visoko specifično prepoznavanje i vezivanje jedne antigenske determinante ili epitopa. Ovo je za razliku od poliklonalnih antitela koja obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih antigenskih determinanti. Termin "monoklonalno antitelo" obuhvata netaknuta i celovita monoklonska antitela, kao i fragmente antitela (kao što su Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jednolančane (scFv) mutante, fuzione proteine koji sadrže antitelo porcija i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji sadrži mesto za prepoznavanje antigena. Dalje, "monoklonsko antitelo" se odnosi na takva antitela načinjena na bilo koji način, uključujući hibridomom, selekcijom faga, rekombinantnom ekspresijom i transgenskim životinjama.

[0055] Termin "humanizovano antitelo" odnosi se na oblike ne-humanih (npr., mišjih) antitela koja su specifični imunoglobulinski lanci, himerni imunoglobulini ili njihovi fragmenti koji sadrže minimalne ne-humane (npr., mišje) sekvence. Uobičajeno, humanizovana antitela su humani imunoglobulini u kojima su ostaci iz komplementarne determinantnog regiona (CDR) zamenjeni ostacima iz CDR ne-humane vrste (npr., miš, pacov, zec ili hrčak) koji imaju željenu specifičnost, afinitet i sposobnost (Jones i dr., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann i dr., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen i dr., 1988, Science, 239:1534-1536). U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirne regije (FR ili FW) humanog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim ostacima u antitelu ne-humane vrste koja ima željenu specifičnost, afinitet i sposobnost. Humanizovano antitelo može se dalje modifikovati supstitucijom dodatnih ostataka bilo u Fv okvirnom regionu i/ili unutar zamenjenih nehumanih ostataka da bi se pročistio i optimizirao specifičnost, afinitet i/ili sposobnost antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo će sadržati uglavnom sve najmanje jednu, i tipično dve ili tri varijabilne domene koje sadrže sve ili suštinski svi CDR regioni koji odgovaraju ne-humanom imunoglobulinu dok su svi ili u suštini svi regioni FR one iz humanog imunoglobulinskog konsenzusnog niza. Humanizovano antitelo takođe može da sadrži bar deo konstantnog regiona ili domena imunoglobulina (Fc), obično onog humanog

1

imunoglobulina. Primeri postupaka koji se koriste za stvaranje humanizovanih antitela su opisani u patentu SAD br.5.225.539 ili 5.639.641.

[0056] "Varijabilni region" antitela odnosi se na varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, bilo pojedinačno ili u kombinaciji. Svaki varijabilni region teškog i lakog lanca sastoje se od četiri okvira (FR ili FW) povezanih sa tri regiona koja određuju komplementarnost (CDR) takođe poznat kao hipervarijabilni region. CDR-ovi u svakom lancu drže se zajedno u neposrednoj blizini FR-a i, s CDR-ovima iz drugog lanca, doprinose formiranju mesta za vezanje antigena za antitela. Postoje najmanje dve tehnike za određivanje CDR: (1) pristup zasnovan na varijabilnosti sekvenci među vrstama (tj., Kabat i dr. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); i (2) pristup zasnovan na kristalografskim ispitivanjima kompleksa antigen-antitela (Al-lazikani i dr. (1997) J. Molec. Biol.273:927-948)). Pored toga, kombinacije ova dva pristupa se ponekad koriste u oblasti tehnike za određivanje CDR-ova.

[0057] Kabat sistem numerisanja se obično koristi kada se odnosi na ostatak u varijabilnom domenu (približno ostaci 1-107 lakog lanca i ostaci 1-113 teškog lanca) (npr., Kabat i dr., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

[0058] Numeracija položaja aminokiselina kao u Kabatu, odnosi se na sistem numerisanja koji se koristi za varijabilne domene teških lanaca ili promenljive domene lakog lanca kompilacije antitela u Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Koristeći ovaj sistem numerisanja, stvarna linearna sekvenca aminokiselina može da sadrži manje ili dodatnih aminokiselina koje odgovaraju skraćenju ili ubacivanju u FR ili CDR promenljivog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da sadrži jedan umetak aminokiselina (ostatak 52a prema Kabatu) posle ostatka 52 H2 i ubačene ostatke (npr., ostatke 82a, 82b i 82c, itd prema Kabatu) posle teškog lanca FR ostatak 82. Kabat numerisanje ostataka može se odrediti za dato antitelo podešavanjem u oblastima homologije sekvence antitela sa "standardnom" Kabat numerisanom sekvencom. Chothia se umesto toga odnosi na lokaciju strukturalnih petlji (Chothia i Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). Kraj petlje Chothia CDR-H1 kada se broji pomoću kabatove konvencije o numerisanju varira između H32 i H34, ovisno o dužini petlje (to je zbog toga što shema numerisanja Kabata

2

umetanja postavlja na H35A i H35B; ako nema ni 35A ni 35B, petlja se završava na 32; ako je prisutno samo 35A, petlja se završava na 33; ako su prisutni i 35A i 35B, petlja se završava na 34). AbM hipervarijabilni regioni predstavljaju kompromis između Kabat CDR-a i Chothia strukturnih petlji, a koristi ih softver za modelovanje AbM antitela Oxford Molecular. Poređenje je dato u Tabeli 1 ispod.

Tabela 1: Poređenje sistema numerisanja antitela

[0059] Termin "humano antitelo" označava izvorno humano antitelo ili antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara matičnom humanom antitelu, načinjeno korišćenjem bilo koje tehnike poznate u oblasti tehnike. Ova definicija humanog antitela uključuje netaknuta ili celovita antitela, njihove fragmente i/ili antitela koja sadrže najmanje jedan polipeptid teškog i/ili lakog lanca kao što je, na primer, antitelo koje sadrži mišji laki lanac i humani polipeptid teškog lanca.

[0060] Termin "himerna antitela" odnosi se na antitela gde je aminokiselinska sekvenca imunoglobulinskog molekula izvedena od dve ili više vrsta. Tipično, varijabilni region lakih i teških lanaca odgovara promenljivom regionu antitela dobijenih od jedne vrste sisara (npr., miš, pacov, zec itd.) sa željenom specifičnošću, afinitetom i sposobnošću dok su konstantni regioni homologni sekvencama antitela dobijenih iz druge (obično humane) da se izbegne imunološki odgovor u toj vrsti. Multispecifični molekuli vezivanja, npr., uključujući jedan ili više domena koji vežu antitela, jedan ili više domena koji se vežu za antitela ili njihovu kombinaciju, npr., antagonisti TNFα i/ili NGF antagonisti navedeni ovde mogu sadržavati konstantna područja antitela (npr. Fc regioni ) u kojoj je najmanje deo jednog ili više domena sa konstantnim regionom izbrisan ili izmenjen na drugi način da se dobiju željene biohemijske karakteristike, poput povećane lokalizacije tumora ili smanjenog poluživota u serumu u poređenju sa antitelom približno iste imunogenosti koji sadrži izvorni ili nepromenjeni konstantni region. Ovde modifikovane konstantne oblasti mogu sadržavati izmene ili modifikacije jednog ili više od tri konstantna domena teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) i/ili konstantnog domena lakog lanca (CL). U nekim aspektima, jedna ili više konstantnih domena mogu se delimično ili u potpunosti izbrisati. U nekim aspektima, ceo CH2 domen može biti izbrisan (ΔCH2 konstrukti). Videti, npr., Oganesyan V, i dr., 2008 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.64:700-4; Oganesyan V, i dr., Mol Immunol.46:1750-5; Dall'Acqua, W.F., i dr., 2006. J. Biol. Chem.281:23514-23524; i Dall'Acqua, i dr., 2002. J. Immunol. 169:5171-5180.

[0061] Termin "epitop" ili "antigenska determinanta" ovde se koristi naizmenično i odnosi se na onaj deo antigena koji može da bude prepoznat i specifično vezan za određeno antitelo. Kad je antigen polipeptid, epitopi se mogu formirati kako iz susednih aminokiselina, tako i iz nepovezanih aminokiselina koje su međusobno izložene tercijarnim savijanjem proteina. Epitopi nastali iz susednih aminokiselina obično se zadržavaju nakon denaturisanja proteina, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem obično gube nakon denaturisanja proteina. Epitop obično uključuje najmanje 3, i češće, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Ovde opisani epitop ne mora biti definisan do specifičnih aminokiselina koje formiraju epitop. U nekim aspektima, epitop se može identifikovati ispitivanjem vezivanja na peptidne podjedinice polipeptidnog antigena ili ispitivanjem konkurencije vezanja na antigen grupom antitela specifičnih za antigen.

[0062] Pod "ispitanik" ili "pojedinac" ili "životinja", "pacijent" ili "sisar", podrazumeva se svaki ispitanik, posebno sisar, za koji je poželjna dijagnoza, prognoza ili terapija. Ispitanici sisara uključuju ljude, domaće životinje, domaće životinje, sportske životinje i životinje iz zoološkog vrta, uključujući npr., ljude, primate koji nisu čoveka, pse, mačke, zamorce, zečeve, pacove, miševe, konje, goveda, medveda i tako dalje.

[0063] Termini "sastav" i " farmaceutski sastav" se odnose na preparat koji je u takvom obliku da dozvoljava biološku aktivnost aktivnog sastojka da bude efektivan i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanike kojima će se dati sastav. Takvi sastavi mogu biti sterilni.

[0064] Kao što je ovde korišćeno, termini "efikasna količina" i "terapeutski efikasna količina" odnose se na količinu jedne ili više terapijskih sastava koji su efikasni za kontrolu bola kod ispitanika. Termin "kontrolni bol" i gramatički ekvivalenti su ovde korišćeni za opisivanje bilo kojeg korisnog ili poželjnog dejstva kod ispitanika kome je potrebna kontrola bola. Na primer, efektivna količina jedne ili više ovde opisanih terapijskih sastava može, na primer, sprečiti bol, održati podnošljiv nivo bola, ublažiti bol, smanjiti bol, minimizirati bol ili eliminisati bol kod ispitanika.

[0065] Termin "davanje", kao što je ovde korišćen, odnosi se na davanje ispitaniku jednog ili više ovde opisanih terapeutskih sastava, npr., bifunkcionalni polipeptid koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα, terapeutski sastav koji sadrži kombinaciju antagonista NGF i a TNFα antagonist, ili zasebne terapeutske sastave, od kojih jedan sadrži NGF antagonist i jedan sadrži TNFα antagonist. Termin "zajedničko davanje" odnosi se na davanje ispitaniku dve ili više terapeutskih sastava, npr., koja sadrži NGF antagonist i jedna koja sadrži antagonist TNFα. Kao što se ovde koristi, zajedničko davanje uključuje, ali ne zahteva, da se dva ili više terapijskih sastava daju ispitaniku istovremeno. Dva ili više terapijskih sastava mogu se ispitaniku davati uzastopno, na primer, sa trideset minuta razmaka, jedan sat razmaka, dva sata razmaka, tri sata razmaka, četiri sata razmaka, ili pet ili više sati razmaka. Redosled i vreme zajedničkog davanja, kako je ovde opisano, mogu se utvrditi, ili se mogu menjati na osnovu procene zdravstvenog radnika.

[0066] Termini "polinukleotid" i "nukleinska kiselina" odnose se na polimerno jedinjenje koje se sastoji od kovalentno povezanih nukleotidnih ostataka. Polinukleotidi mogu biti DNK, cDNK, RNK, jednolančani ili dvolančani, vektori, plazmidi, fage ili virusi.

[0067] Termin "vektor" označava konstrukt koji je sposoban da isporuči i eksprimira jedan ili više gena ili sekvenci koji su od interesa u ćeliji domaćinu. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore, gole vektori ekspresije DNK ili RNK, plazmidni, kosmidni ili fagni vektori, vektori ekspresije DNK ili RNK povezani sa katjonskim kondenzacionim sredstvima, vektori ekspresije DNK ili RNK kapsulirani u lipozome i određene eukariotske ćelije, kao što su ćelije proizvođača.

2

[0068] Termini "polipeptid", "peptid" i "protein" ovde su korišćeni naizmenično za označavanje polimera aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili razgranat, može da sadrži modifikovane aminokiseline, a ne-aminokiseline mogu da ga prekinu. Termini obuhvataju i aminokiselinski polimer koji je prirodno modifikovan ili je modifikovan intervencijom; na primer, formiranje disulfidne veze, glikozilacija, lipidizacija, acetilacija, fosforilacija ili bilo koje druge manipulacije ili modifikacije, poput konjugacije sa komponentom za obeležavanje. U definiciju su takođe uključeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiseline (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline, itd.), kao i druge modifikacije poznate u tehnici.

[0069] "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka sa sličnim bočnim lancima su definisane u struci, uključujući osnovne bočne lance (npr., lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr., asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarni bočni lanci (npr., glicin, alanin, valin, leucin, izoleukin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranati bočni lanci (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatični bočni lanci (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Na primer, supstitucija fenilalanina tirozinom je konzervativna supstitucija. U određenim aspektima, konzervativne supstitucije u sekvencama polipeptida i antitela koje su ovde date ne ukidaju vezivanje ili drugu funkcionalnu aktivnost polipeptida koji sadrži sekvencu aminokiselina. Postupci identifikacije supstitucija nukleotida i aminokiselina koje ne utiču na funkciju dobro su poznate u struci (videti, npr., Brummell i dr., Biochem.32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi i dr. Protein Eng.12:879-884 (1999); i Burks i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).

Vezujući molekul koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα [0070] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje bifunkcionalni polipeptid koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα. U određenim aspektima, davanje efektivne količine bifunkcionalnog polipeptida ovde obezbeđenog može da kontroliše bol kod ispitanika koji ima potrebu za time, efikasnije od ekvivalentne količine NGF antagonista ili TNFα antagonista koji se daje sam. Bifunkcionalni polipeptidi koji su ovde dati mogu da uključuju domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα u bilo kom redosledu, strukturi ili konformaciji. Bilo koji pogodni NGF antagonisti ili TNFα antagonisti mogu biti deo bifunkcionalnog polipeptida koji je ovde obezbeđen. Primeri antagonista NGF i antagonista TNFα opisani su na drugom mestu u ovom obelodanjivanju.

[0071] U određenim aspektima, antagonist NGF je molekul koji nije antitelo, ili njegov vezujući domen, sposoban da inhibira aktivnost NGF, na primer, rastvorljivi fragment TrkA koji vezuje NGF. U određenim aspektima, NGF antagonist je anti-NGF antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment. Pogodni anti-NGF antagonisti, npr., antagonist antitela mogu inhibirati vezanje NGF na TrkA, p75NRT ili oba TrkA i p75NRT. U određenim aspektima, anti-NGF antagonist, na primer, antagonisti antagonista ili njegov fragment za upotrebu u bifunkcionalnom molekulu koji je ovde obezbeđen, npr., multispecifični vezujući molekul, može povoljno da blokira vezivanje NGF za TrkA nad vezanjem NGF na p75NRT.

[0072] Primerna antitela ili njihovi fragmenti za upotrebu u bifunkcionalnim polipeptidima, npr., multispecifični vezivni molekuli koji su ovde obelodanjeni su dostupni u patentnoj prijavi SAD br.2008/0107658. U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment se vezuje na isti epitop koji može konkurentno inhibirati ili se može vezati za NGF sa većim afinitetom od anti-NGF antitela MEDI-578. U nekim otelotvorenjima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment veže humani NGF i/ili pacov NGF sa afinitetom ili manjim od 1, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3 ili 0.2 nM. Na primer, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da vezuje humani NGF sa afinitetom od oko 0.2-0.8, 0.2-0.7, 0.2-06, 0.2-0.5, i/ili 0.25-0.44 nM i pacov NGF sa afinitetom od oko 0.2-0.9, 0.2-0.8, i/ili 0.25-0.70 nM.

[0073] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment je MEDI-578. MEDI-578 je obelodanjen u patentnoj prijavi SAD br.2008/0107658 kao klon 1252A5. U drugim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment je Tanezumab (RN-624), humanizovani anti-NGF mAb (Pfizer; opisan u Kivitz i dr., (2013) PAIN, 154, 9, 1603-161), fulranumab, potpuno humani anti-NGF mAb (Amgen; opisan u Sanga i dr., PAIN, Volume 154, Issue 10, oktobar 2013, stranice 1910-1919); REGN475/SAR164877, potpuno humani anti-NGF mAb (Regeneron/Sanafi-Aventis); ABT-110 (PG110), humanizovani anti-NGF mAb (Abbott Laboratories). Anti-NGF antitelo ili njegov fragment uključen u bifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezivni molekul koji je ovde obezbeđen, može biti, na primer, humanizovani, himerni, primatizovani ili potpuno humani.

2

[0074] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 domene MEDI-578, varijante CDR-a teškog lanca MEDI-578 sa do jednog, dva, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina, npr., konzervativne supstitucije aminokiselina. Na primer, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži HCDRl sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:4 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:4 sa jednom ili više, npr. jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina. Slično, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži HCDR2 sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:5 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:5 sa jednom ili više, npr. jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina. Isto tako, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži HCDR3 sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:6 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:6 sa jednom ili više, npr. jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina. U određenim aspektima, HCDR3 može sadržati aminokiselinsku sekvencu SSRIYDFNSALISYYDMDV (SEQ ID NO:11), ili SSRIYDMISSLQPYYDMDV (SEQ ID NO:12).

[0075] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 domene MEDI-578, varijante CDR-a lakog lanca MEDI-578 sa do jednog, dva, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina, npr., konzervativne supstitucije aminokiselina. U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži LCDR1 sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:8 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:8 sa jednom ili više, npr. jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina. Slično, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži LCDR2 sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:9 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:9 sa jednom ili više, npr. jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina. Isto tako, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži LCDR3 sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:10 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:10 sa jednom ili više, npr. jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina.

[0076] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:3. U nekim

2

aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3.

[0077] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:7. U nekim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7.

[0078] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:94. U nekim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:94.

[0079] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:95. U nekim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95.

[0080] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 domene bilo kojeg od SEQ ID NO:30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 i 96, ili njegove varijante sa do jedne, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina, npr., konzervativne supstitucije aminokiselina.

[0081] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 domene bilo kojeg od SEQ ID NO:31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 i 97, ili njegove varijante sa do jedne, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina, npr., konzervativne supstitucije aminokiselina.

2

[0082] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom bilo kojom od SEQ ID NO:30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 i 96. U nekim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 i 96.

[0083] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom bilo kojom od SEQ ID NO:31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 i 97. U nekim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 i 97.

[0084] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 domene NGF-NG, varijante CDR-a teškog lanca NGF-NG sa do jednog, dva, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina, npr., konzervativne supstitucije aminokiselina. Na primer, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži HCDRl sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:88 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:88 sa jednom ili više, npr. jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina. Slično, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži HCDR2 sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:89 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:89 sa jednom ili više, npr. jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina. Isto tako, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži HCDR3 sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:90 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:90 sa jednom ili više, npr., jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina.

[0085] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 domene NGF-NG, varijante CDR-a teškog

2

lanca NGF-NG sa do jednog, dva, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina, npr., konzervativne supstitucije aminokiselina. U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži LCDR1 sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:91 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:91 sa jednom ili više, npr. jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina. Slično, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži LCDR2 sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:92 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:92 sa jednom ili više, npr. jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina. Isto tako, anti-NGF antitelo ili njegov fragment može da sadrži LCDR3 sa tačnim sekvencama aminokiselina SEQ ID NO:93 ili sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:93 sa jednom ili više, npr., jednom, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina.

[0086] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:24. U nekim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24.

[0087] U određenim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:26. U nekim aspektima, anti-NGF antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26.

[0088] Multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezujući molekul koji je obezbeđen ovim obelodanjivanjem, može da sadrži kompletno anti-NGF antitelo, tj., antitelo koje sadrži dva kompletna teška lanca i dva kompletna lana lanca u H2L2formatu. Ako je anti-NGF antitelo kompletno antitelo, jedan ili više domena antagonista TNFα mogu se spojiti na N-kraj ili C-kraj jednog ili više teških lanaca anti-NGF antitela ili na N-kraju ili C-kraju jednog ili više lakih lanaca anti-NGF antitela. Alternativno, multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezivni molekul koji je obezbeđen ovim obelodanjivanjem, može sadržati antigenski fragment koji vezuje anti-NGF antitela. U određenim aspektima, fragment anti-NGF antitela može da sadrži bilo koji deo konstantnih domena antitela ili može da sadrži samo promenljive domene. Primeri fragmenata anti-NGF antitela za uključivanje u

2

bifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezujući molekul, uključuju, ali nisu ograničeni na Fab fragmente, Fab' fragmente, F(ab)2fragmente ili fragmente jednog lanca Fv (scFv).

[0089] U određenim ovde navedenim primernim sastavima, anti-NGF antitelo je scFv fragment, npr. scFv fragment MEDI-578, ili njegove varijante koja veže NGF. U određenim ovde navedenim primernim sastavima, anti-NGF antitelo je scFv fragment, npr. scFv fragment NGF-NG, ili njegove varijante koja veže NGF. Anti-NGF scFv polipeptid može da sadrži VH i VL domene u bilo kom redosledu, bilo N-VH-VL-C, ili N-VL-VH-C. ScFv molekule su obično konstruisane tako da su VH i VL domeni povezani preko fleksibilnog povezivača. Primerne scFv strukture, uključujući razne veze, mogu se naći u Dimasi, N., i dr., J Mol Biol.393:672-92 (2009), i u PCT objavi br. WO 2013/070565. Kao što razumeju ljudi sa uobičajenom strukom, fragmenti scFv antitela mogu imati smanjenu stabilnost u odnosu na promenljive domene koji postoje u standardnoj Fab konformaciji. U nekim aspektima scFv se može strukturno stabilizovati uvođenjem stabilizirajućih mutacija ili uvođenjem međuljudskih disulfidnih veza (npr., SS-stabilizovanih). Međutim, stabilizirajuće mutacije i/ili uvedena međulančana disulfidna veza nisu potrebne i, u određenim aspektima, nisu prisutne. Za stabilizaciju scFv polipeptida dostupno je nekoliko poznatih postupaka.

[0090] Veznici se mogu koristiti za pridruživanje domena/regiona bifunkcionalnih polipeptida koji su ovde navedeni. Veziva se mogu koristiti za povezivanje domena antagonista NGF i domena antagonista TNFα bifunkcionalnog molekula, a mogu se koristiti i za povezivanje promenljivih teških i lakih lanaca scFv. Primer, veznik koji ograničava, je polipeptidni lanac koji sadrži najmanje 4 ostatka. Delovi takvih povezivača mogu biti fleksibilni, hidrofilni i imaju malu ili nikakvu sekundarnu strukturu (delovi koji vezuju ili fleksibilni delovi veze). Veznici sa najmanje 4 aminokiseline mogu se koristiti za spajanje domena i/ili regiona koji su postavljeni blizu jedan drugom nakon što se sastavi bifunkcionalni polipeptidni molekul. Duži veznici se takođe mogu upotrebiti. Stoga, veznici mogu biti oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ostataka. Veznici takođe mogu biti, na primer, od oko 100-175 ostataka. Kada se koristi više veznika za povezivanje delova bifunkcionalnog polipeptidnog molekula, veznici mogu biti isti ili različiti (npr., jednaka ili različita dužina i/ili sekvenca aminokiselina).

[0091] Veznici u bifunkcionalnom polipeptidnom molekulu olakšavaju stvaranje željene strukture. Veznici mogu da sadrže (Gly-Ser)nostatke (gde je n ceo broj od najmanje jednog, dva i do, na primer, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100 ili više), sa nekim Glu ili Lys ostacima raspršenim tokom povećanja rastvorljivosti. Alternativno, određeni veznici ne sadrže nikakve serinske ostatke, npr. gde je taj veznik podvrgnut O-vezanoj glikolizi. U nekim aspektima, veznici mogu da sadrže ostatke cisteina, na primer, ako se upotrebljava dimerizacija veznika za dovođenje domena bifunkcionalnog polipeptida u njihovu ispravno presavijenu konfiguraciju. U nekim aspektima, bifunkcionalni polipeptid može da sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri ili više polipeptidnih veznika koji se pridružuju domenima polipeptida.

[0092] U nekim aspektima, polipeptidni veznik može da sadrži 1-50 ostataka, 1-25 ostataka, 25-50 ostataka ili 30-50 ostataka. U nekim aspektima, polipeptidni veznik može da sadrži deo Fc grupe. Na primer, u nekim aspektima, polipeptidni veznik može da sadrži deo imunoglobulinskog zglobnog domena od IgG1, IgG2, IgG3 i/ili IgG4 antitela ili njegove varijante.

[0093] U nekim aspektima, polipeptidni veznik može da sadrži ili se sastoji od gly-ser veznika. Kao što je ovde korišćen, termin "gly-ser veznik" odnosi se na peptid koji se sastoji iz glicinskih i serinskih ostataka. Primer gly-ser veznika sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (Gli4Ser)n, gde je n ceo broj od najmanje jednog, dva i do, na primer, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100 ili više. U nekim aspektima, polipeptidni veznik može da sadrži bar deo zglobnog regiona (npr., izveden iz molekula IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) i niz gly-ser aminokiselinskih ostataka (npr., gly-ser veznik kao što je (Gly4Ser)n).

[0094] Kada multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezni molekul, sadrži scFv, fleksibilni veznik može povezati teške i lagane lance scFv. Ovaj fleksibilni veznik obično ne uključuje zglobni deo, već je gly-ser veznik ili drugi fleksibilan veznik. Dužina i niz aminokiselinskog fleksibilnog veznika koji povezuje domene scFv mogu se lako odabrati i optimizovati.

[0095] U određenim aspektima, multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezivni molekul, može da sadrži anti-NGF scFv fragment koji sadrži, od N-kraja do C-kraja, VH, 15-aminokiselinsku vezujuću sekvencu (GGGGS)3, i VL. U određenim otelotvorenjima, veznik koji spaja VH i VL scFv je 20 aminokiselinskih vezničkih sekvenci (GGGGS)4. U određenim

1

aspektima, VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO 3. U određenim aspektima, VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7. U određenim otelotvorenjima, VH sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO:24, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 94 i 96. U određenim otelotvorenjima, VL sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO:26, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 95 i 97. U određenim aspektima, VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 3, 24, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 94 i 96. U određenim aspektima, VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 7, 26, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 95 i 97.

[0096] U drugim aspektima, stabilnost polipeptida može biti poboljšana dodavanjem međulančane disulfidne veze između VH domena i VL domena modifikacijom određenih ostataka unutar VH i VL domena u ostatke cisteina. Videti na primer, Michaelson, J. S., i dr. (2009) MAbs 1, 128-41; Brinkmann, U., i dr., (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90, 7538-42; Young, N. M., i dr., (1995) FEBS Lett 377, 135-9. Na primer, ostatak glicina na pozicijama 100, 101 ili 102 od VL može da se modifikuje u ostatak cisteina, a ostatak glicina u položaju 44 VH može da se modifikuje u cisteinski ostatak.

[0097] Multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezivni molekul koji je ovde dat može da obuhvata domen antagonista TNFα. U određenim aspektima, domen antagonista TNFα može inhibirati vezivanje TNFα na TNF receptor (TNFR) na površini ćelija, blokirajući tako aktivnost TNF.

[0098] U određenim aspektima, domen antagonista TNFα multifunkcionalnog polipeptida kao što je ovde dato, je anti-TNFα antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U nekim aspektima, anti-TNFα antitelo je infliksimab, adalimumab, certolizumab pegol, golimumab ili fragment koji vezuje antigen bilo kojeg od ovih antitela.

[0099] U određenim aspektima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za isti epitop koji može konkurentno inhibirati ili se može vezati za TNFα s većim afinitetom od

2

bilo kojeg anti-TNFα antitela infliksimab, adalimumab, certolizumab pegol ili golimumab, ili fragment koji vezuje antigen bilo kojeg od ovih antitela. U nekim aspektima, anti-TNFα antitelo je infliksimab, adalimumab, certolizumab pegol, ili golimumab ili fragment koji vezuje antigen bilo kojeg od ovih antitela. Struktura i sekvence ovih anti-TNFα antitela su lako dostupne stručnjacima i mogu se uključiti u multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezujući molekul, kao što je ovde opisano, bez nepotrebnog eksperimentiranja. Anti-TNFα antitelo ili njegov fragment uključen u multifunkcionalni polipeptid može biti, na primer, humanizovano, himerno, primitizovano ili potpuno humano.

[0100] U određenim aspektima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 domene infliksimaba, adalimumaba, certolizumaba pegola ili golimumaba, ili varijante infliksimaba, adalimumaba, certolizumab pegola, ili golimumaba CDR-ovi teškog lanca sa do jedne, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina, npr. konzervativne supstitucije aminokiselina.

[0101] U određenim aspektima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži LCDRl, LCDR2 i LCDR3 domene infliksimaba, adalimumaba, certolizumaba pegola ili golimumaba, ili varijante infliksimaba, adalimumaba, certolizumab pegola, ili golimumaba CDR-ovi teškog lanca sa do jedne, dve, tri, četiri, pet ili više supstitucija aminokiselina, npr., konzervativne supstitucije aminokiselina.

[0102] U određenim aspektima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična na VH aminokiselinsku sekvencu infliksimaba, adalimumaba, certolizumab pegola ili golimumaba. U nekim aspektima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu infliksimaba, adalimumaba, certolizumab pegola ili golimumaba.

[0103] U određenim aspektima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična na VL aminokiselinsku sekvencu infliksimaba, adalimumaba, certolizumab pegola ili golimumaba. U nekim aspektima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu infliksimaba, adalimumaba, certolizumab pegola ili golimumaba.

[0104] U određenim aspektima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:28. U nekim aspektima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28.

[0105] U određenim aspektima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:29. U nekim aspektima, anti-TNFα antitelo ili njegov fragment sadrži VL domen antitela koji sadrži VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29.

[0106] Multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezujući molekul koji je obezbeđen ovim obelodanjivanjem, može da sadrži kompletno anti-TNFα antitelo, tj., antitelo koje sadrži dva kompletna teška lanca i dva kompletna lana lanca u H2L2formatu. Ako je anti-TNFα antitelo kompletno antitelo, jedan ili više domena antagonista TNFα mogu se spojiti na N-kraj ili C-kraj jednog ili više teških lanaca anti-TNFα antitela ili na N-kraj ili C-kraj jednog ili više lakih lanaca anti-TNFα antitela. Alternativno, multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezivni molekul koji je obezbeđen ovim obelodanjivanjem, može sadržati antigenski fragment koji vezuje anti-TNFα antitela. U određenim aspektima, fragment anti-TNFα antitela može da sadrži bilo koji deo konstantnih domena antitela ili može da sadrži samo promenljive domene. Primeri fragmenata anti-TNFα antitela za uključivanje u multifunkcionalni polipeptid uključuju, ali nisu ograničeni na Fab fragmente, Fab 'fragmente, F(ab)2fragmente ili fragmente jednolančanog Fv (scFv).

[0107] U nekim aspektima, multifunkcionalni molekul je ndimab varB, koji je molekul koji sadrži kompletno antitelo na TNFα, tj., antitelo koje sadrži dva kompletna teška lanca i dva kompletna laka lanca u H2L2formatu, gde je MEDI-578 scFv spojen C-krajem teškog lanca antitela anti-TNFα. Ndimab varB sadrži laki lanac aminokiselinsku sekvence SEQ ID NO:20, i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22. U nekim aspektima, bifunkcionalni molekul sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična SEQ ID NO:20 i teški

4

lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO:22.

[0108] U određenim aspektima, anti-TNFα antitelo je scFv fragment, npr. scFv fragment izveden iz infliksimaba, adalimumaba, certolizumab pegola, ili golimumaba, ili njihovih varijanti koje vezuju TNFα. Anti-TNFα scFv polipeptid može da sadrži VH i VL domene u bilo kom redosledu, bilo N-VH-VL-C, ili N-VL-VH-C. ScFv molekuli su obično napravljeni tako da su VH i VL domeni povezani preko fleksibilnog veznika i mogu da pretpostave brojne različite strukture, kao što je iznad opisano. Anti-TNFα scFv polipeptid se može stabilizovati, takođe kao što je iznad opisano.

[0109] U određenim aspektima, antagonist TNFα je rastvorljivi fragment TNFα-vezivnog fragmenta, npr., TNFR-1 ili TNFR-2, ili njegova varijanta ili rastvorljivi fragment. U određenim aspektima, rastvorljivi fragment TNFR-1 je 55kD fragment. U određenim aspektima, rastvorljivi fragment TNFR-2 je 75kD fragment. U određenim aspektima, fragment TNF receptora je spojen sa heterolognim polipeptidom, npr., fragmentom imunoglobulina Fc, npr., IgG1 Fc domenom. U određenim aspektima, TNFα antagonist sadrži aminokiselinu datu u SEQ ID NO:13, ili TNFα-vezujući fragment navedenog. TNFR-2 deo sadrži aminokiseline 1 do 235 SEQ ID NO:13. U određenim aspektima, varijanta rastvorljivog fragmenta TNFR-2 koji vezuje TNFα sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100 % identičnih aminokiselinama 1 do 235 SEQ ID NO:13. U nekim aspektima, varijanta rastvorljivog fragmenta TNFR-2 koji vezuje TNFα sadrži aminokiseline 1 do 235 SEQ ID NO:13, izuzev, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40 ili 50 umetanja, supstitucija ili brisanja aminokiselina. IgG1 Fc deo sadrži aminokiseline 236 do 467 SEQ ID NO:13. U određenim aspektima, rastvorljivi fragment rastvorljivog u TNFa može se spojiti u Fc deo bilo kog humanog ili ne-humanog antitela ili bilo koje druge proteinske ili ne-proteinske supstance koje bi obezbedile stabilnost, na primer, albumin ili polietilen glikol. U određenim aspektima, varijanta rastvorljivog fragmenta TNFR-2 koji vezuje TNFα sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100 % identičnih aminokiselinama 236 do 467 SEQ ID NO:13. U nekim aspektima, varijanta rastvorljivog fragmenta TNFR-2 koji vezuje TNFα sadrži aminokiseline 236 do 467 SEQ ID NO:13, izuzev, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40 ili 50 umetanja, supstitucija ili brisanja aminokiselina. U određenim aspektima, varijanta rastvorljivog fragmenta TNFR-2 koji vezuje TNFα sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100 % identičnosti sa SEQ ID NO:13. U određenim aspektima, varijanta rastvorljivog fragmenta TNFR-vezujućeg TNF-α sadrži SEQ ID NO:13, izuzev, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40 ili 50 umetanja, supstitucija ili brisanja aminokiselina.

[0110] U nekim aspektima, rastvorljivi fragment rastvorljivog u TNFα TNFR-2 je fuzioni protein sa jednim lancem. U određenim aspektima, rastvorljivi fragment rastvorljivog u TNFα je dimer od dva fuziona proteina, koji su povezani, npr., disulfidnim vezama između dva Fc domena.

[0111] Multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezni molekul, kao što je ovde dato, može imati mnoštvo različitih struktura i konformacija. U jednom aspektu, multifunkcionalni polipeptid kao što je ovde dato, sadrži fuzioni protein gde se domen antagonista NGF, kao što je iznad opisano, spaja sa domenom antagonista TNFα, kao što je iznad opisano, kroz fleksibilni veznik. Primeri veznika su ovde opisani na drugom mestu. U određenim aspektima, multifunkcionalni polipeptid sadrži homodimer fuzionog proteina.

[0112] U oglednom aspektu, obezbeđen je multifunkcionalni polipeptid u kome je NGF antagonist anti-NGF scFv domen, npr., iz MEDI-578, a TNFα antagonist je rastvorljiv, TNFα-vezujući fragment TNFR-2 spojen u karboksi-kraju imunoglobulinskog Fc domena. Anti-NGF scFv se u nekim aspektima može spojiti sa karboksi-krajem imunoglobulinskog Fc domena preko veznika. U određenim aspektima, monomeri ovog multifunkcionalnog polipeptida formiraju homodimer sa svakom podjedinicom koja sadrži, od N-kraja do C-kraja, fragment TNFα-75KD-vezujućeg 75KD domena, humani IgG1Fc domen, 10-aminokiselinski veznik (GGGGS)2(SEQ ID NO:98), anti-NGF VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO 3, vezujuću sekvencu od 15 aminokiselina (GGGGS)3(SEQ ID NO:15), i anti-NGF VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7. U jednom aspektu, multifunkcionalni polipeptid je TNFR2-Fc_VH#4, koji sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14. U nekim aspektima, multifunkcionalni polipeptid sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identična SEQ ID NO:14.

[0113] U sledećem oglednom aspektu, multifunkcionalni polipeptid sadrži, od N-kraja do C-kraja, fragment od 75kD TNFR-2 koji vezuje TNFα, humani IgG1Fc domen, 10-aminokiselinski veznik (GGGGS)2(SEQ ID NO:98), anti-NGF VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO 94, vezujuću sekvencu od 20 aminokiselina (GGGGS)4(SEQ ID NO:19), i anti-NGF VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95. U nekom aspektu, multifunkcionalni polipeptid je TNFR2-Fc_varB, koji sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17. U nekim aspektima, multifunkcionalni polipeptid sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identična SEQ ID NO:17.

Polipeptidi

[0114] Polipeptidi kako su ovde navedeni, npr., multifunkcionalni polipeptidi koji sadrže domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα, ili pojedinačni polipeptidi koji sadrže domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα, mogu biti rekombinantni polipeptidi, izvedeni iz prirodnih polipeptida ili sintetičkih polipeptida. U tehnici će biti prepoznato da neke sekvence aminokiselina mogu varirati bez značajnog uticaja na strukturu ili funkciju proteina. Prema tome, obelodanjivanje dalje daje varijacije ovde obezbeđenih polipeptida koji imaju značajnu aktivnost ili koji uključuju domene NGF antagonista i domene antagonista TNFα. Takvi mutanti uključuju brisanja, umetanja, inverzije, ponavljanja i supstitucije tipa.

[0115] Polipeptidi i analozi mogu se dalje modifikovati tako da sadrže dodatne hemijske grupe koje obično nisu deo proteina. One derivatizovane grupe mogu poboljšati rastvorljivost, biološki polu-raspad ili apsorpciju proteina. Ovi delovi takođe mogu da smanje ili eliminišu sve poželjne neželjene efekte proteina. Pregled tih delova možete pronaći u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

[0116] U određenim aspektima, multifunkcionalni polipeptid koji je ovde obezbeđen može da obuhvata NGF ili TNFα vezujući domen koji nije antitelo. U struci su poznati razni postupci za identifikovanje i proizvodnju polipeptida koji nisu antitela i koji se vezuju sa visokim afinitetom. Videti, npr., Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse i dr., Protein Science, 15:14-27 (2006), Gill i dr., Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J., 275:2668-76 (2008), i Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008). U određenim aspektima, tehnologija fagnog prikaza može se koristiti za identifikaciju/proizvodnju odgovarajućih multifunkcionalnih polipeptida. U određenim aspektima, multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezivni molekul ovde obezbeđen može da sadrži proteinski skelet tipa izabran iz grupe koja se sastoji iz proteina A, lipokalina, domena fibronektina, ankirinog konsenzusnog ponovljenog domena i tioredoksina.

Polinukleotidi, vektori i ćelije domaćina

[0117] Predmetno obelodanjivanje pruža molekule nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotide koji kodiraju multifunkcionalni polipeptid koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα. Predmetno obelodanjivanje dalje daje molekule nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotide koji kodiraju pojedinačne polipeptide koji sadrže, respektivno, antagonist NGF i antagonist TNFα. U određenim aspektima, takvi polinukleotidi kodiraju peptidni domen koji specifično veže NGF ili njegov fragment, a takođe veže TNFα ili njegov fragment. Na primer, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje polinukleotid koji kodira polipeptidni domen koji sadrži anti-NGF antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen i polipeptidni domen koji sadrži antagonist TNFα, kao što je anti-TNFα antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, ili rastvorljivi deo TNFα-vezujućeg dela TNF receptora, npr., TNFR2. Polinukleotidi mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK. DNK uključuje cDNK, genomsku DNK i sintetičku DNK; i mogu biti dvolančani ili jednolančani, a ako jednolančani mogu biti kodirajući ili nekodirajući (anti-sense) struk.

[0118] U nekim obelodanjivanjima, izolovani polinukleotid koji kodira multifunkcionalni polipeptid koji je ovde opisan sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:16, 18 ili 99, ili njihovi fragmenti, ili sekvenca od najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO:16, 18 ili 99, ili njihovi fragmenti.

[0119] Ovde opisani izolovani polipeptidi mogu se proizvesti bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u stanju tehnike. Takvi postupci kreću se od direktnih postupaka sintetisanja proteina do konstruisanja DNK sekvence koja kodira izolovane polipeptidne sekvence i ekspresije tih sekvenci u odgovarajućem transformisanom domaćinu. U nekim aspektima, DNK sekvenca je konstruisana korišćenjem rekombinantne tehnologije izolovanjem ili sintetizacijom DNK sekvence koja kodira multifunkcionalni polipeptid koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα, ili pojedinačne polipeptide koji sadrže domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα. Shodno tome, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje izolovan polinukleotid koji kodira bifunkcionalni polipeptid koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα, kao što je detaljno opisano iznad. Dalje su obezbeđeni izolovani polinukleotidi koji kodiraju pojedine polipeptide koji sadrže domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα.

[0120] U nekim aspektima, DNK sekvenca koja kodira multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezujući molekul od interesa ili pojedinačni polipeptidi koji sadrže domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα, može se konstruisati hemijskom sintezom koristeći oligonukleotidni sintetizator. Takvi oligonukleotidi mogu biti dizajnirani na osnovu aminokiselinskog niza željenog multifunkcionalnog polipeptida i odabirom onih kodona koji su favorizovani u ćeliji domaćinu u kojoj će se proizvesti rekombinantni polipeptid od interesa. Standardni postupci se mogu primeniti za sintezu izolovane polinukleotidne sekvence koja kodira multifunkcionalni polipeptid od interesa. Na primer, kompletna sekvenca aminokiselina može da se koristi za konstrukciju gena koji je preveden nazad. Dalje, DNK oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira određeni multifunkcionalni polipeptid ili pojedinačne polipeptide može se sintetizovati. Na primer, nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida može se sintetizovati i zatim lizirati. Pojedinačni oligonukleotidi obično sadrže 5' ili 3' preklopa za komplementarno sklapanje.

[0121] U određenim aspektima, ovde navedeni polinukleotidi mogu da sadrže kodirajuću sekvencu za zreli polipeptid kondenzovan u istom okviru za čitanje u marker sekvencu koja omogućava, na primer, prečišćavanje kodiranog polipeptida. Na primer, marker sekvenca može biti heksa-histidinska oznaka snabdevena pQE-9 vektorom kako bi se obezbedilo prečišćavanje zrelog polipeptida spojenog sa markerom u slučaju bakterijskog domaćina, ili sekvenca markera može biti hemaglutinin (HA) oznaka dobijena iz proteina hemaglutinina protiv gripa kada se koristi domaćin sisar (npr., ćelije COS-7).

[0122] Ovde navedeni polinukleotidi mogu dalje sadržati promene u kodirajućim regionima, nekodirajućim regionima ili oboje. U nekim aspektima, polinukleotidne varijante sadrže izmene koje proizvode tihe supstitucije, dodavanja ili brisanja, ali ne menjaju svojstva ili aktivnosti kodiranog polipeptida. U nekim aspektima, nukleotidne varijante se proizvode tihom supstitucijom zbog degeneracije genetskog koda. Varijante polinukleotida mogu se proizvesti iz različitih razloga, npr., za optimizaciju ekspresije kodona za određenog domaćina (promena kodona u humanoj mRNK u ona koja preferira bakterijski domaćin kao što je E. coli).

[0123] Takođe su obezbeđeni vektori i ćelije koje sadrže polinukleotide ovde opisane.

Jednom kada se sastave (sintezom, mutagenezom usmerenom na mesto ili drugim postupkom), polinukleotidne sekvence koje kodiraju određeni izolovani polipeptid od interesa mogu biti ubačeni u ekspresioni vektor i operativno povezani sa kontrolnom sekvencom ekspresije pogodnom za ekspresiju proteina u željenom domaćinu. Predmetno obelodanjivanje pruža takve vektore. Nukleotidno sekvenciranje, mapiranje restrikcije i ekspresija biološki aktivnog polipeptida u pogodnom domaćinu mogu potvrditi pravilno sklapanje. Kao što je dobro poznato u tehnici, da bi se postigli visoki nivoi ekspresije transfektovanog gena kod domaćina, gen mora biti operativno povezan sa transkripcijskim i translacijskim kontrolnim sekvencijama ekspresije koje su funkcionalne u izabranom domaćinu ekspresije.

[0124] U određenim aspektima, rekombinantni ekspresioni vektori se mogu koristiti za amplifikaciju i ekspresiju DNK koji kodira multifunkcionalne polipeptide, npr., multispecifične vezujuće molekule, koji sadrže domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα, ili pojedinačne polipeptide koji sadrže domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα, respektivno. Rekombinantni ekspresioni vektori su replicirani DNK konstrukti koji imaju sintetičke DNK fragmente dobijene iz cDNK ili kodiraju multifunkcionalni polipeptid ili pojedinačne polipeptide koji sadrže domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα, koji su operativno povezani sa odgovarajućim transkripcionim ili translacionim regulatornim elementima dobijenim od sisara, mikrobioma, virusa ili gena insekata. Transkripciona jedinica obično sadrži sklop (1) genetskog elementa ili elemenata koji imaju regulatornu ulogu u ekspresiji gena, na primer, transkripcionih promotora ili pojačivača, (2) strukturalne ili kodirajuće sekvence koja se prepisuje u mRNK i pretvara u protein, i (3) odgovarajuće sekvence inicijacije i prestanka transkripcije i prevođenja, kao što je detaljno opisano u nastavku. Takvi regulatorni elementi mogu da obuhvataju sekvencu operatora za kontrolu transkripcije. Dodatno se može ugraditi sposobnost repliciranja u domaćina, obično dodeljena poreklom replikacije, i selekcijski gena koji olakšava prepoznavanje transformatora. DNK regioni su operativno povezani kada su funkcionalno povezani jedni sa drugima. Na primer, DNK za signalni peptid (sekretorni vođa) operativno je povezan sa DNK za polipeptid ako je eksprimiran kao prekursor koji učestvuje u izlučivanju polipeptida; promotor je operativno

4

povezan sa kodirajućom sekvencom ako kontroliše transkripciju sekvence; ili je mesto vezanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da dozvoljava prevođenje. Strukturni elementi namenjeni upotrebi u sistemima za ekspresiju kvasca uključuju vodeću sekvencu koja omogućava ekstracelularnu sekreciju prevedenog proteina od strane ćelije domaćina. Alternativno, gde se rekombinantni protein eksprimira bez vođe ili transportne sekvence, može da sadrži N-kraj metioninskog ostatka. Ovaj ostatak može eventualno da se odvoji od izraženog rekombinantnog proteina da bi se dobio konačni proizvod.

[0125] Izbor sekvence kontrole ekspresije i vektora ekspresije zavisiće od izbora domaćina. Može se koristiti širok izbor kombinacija domaćin/vektor ekspresije. Korisni vektori ekspresije za eukariotske domaćine uključuju, na primer, vektore koji sadrže sekvence kontrolisanja ekspresije iz SV40, goveđeg papiloma virusa, adenovirusa i citomegalovirusa. Korisni ekspresijski vektori za bakterijske domaćine uključuju poznate bakterijske plazmide, poput plazmida E. coli, uključujući pCR 1, pBR322, pMB9 i njihove derivate, plazmide šireg područja domaćina, kao što su M13 i jednolančane filamentne DNK fage.

[0126] Predmetno obelodanjivanje dalje obezbeđuje ćelije domaćina koje sadrže polinukleotide koji kodiraju ovde prikazane polipeptide. Pogodne ćelije domaćina za ekspresiju ovde prikazanih polipeptida uključuju prokariote, kvasce, insekte ili više eukariotske ćelije pod kontrolom odgovarajućih promotora. Prokarioti uključuju gram negativne ili gram-pozitivne organizme, na primer E. coli ili bacile. Više eukariotske ćelije uključuju uspostavljene ćelijske linije sisara, kako je ispod opisano. Takođe se mogu koristiti sistemi za prevođenje bez ćelija. Odgovarajući vektori za kloniranje i ekspresiju za upotrebu sa bakterijskim, gljivičnim, kvascima i ćelijskim domaćinima sisara opisali su Pouvels i dr. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985). Dodatne informacije o postupcima proizvodnje proteina, uključujući proizvodnju antitela, mogu se naći, npr., u patentnoj objavi SAD br.2008/0187954, patentu SAD br.6,413,746 i 6,660,501, i međunarodnoj patentnoj objavi SAD br. WO 04009823.

[0127] Različiti sistemi kultura ćelija sisara ili insekata mogu takođe biti korisni za ekspresiju rekombinantnog proteina. Ekspresija rekombinantnih proteina u ćelijama sisara može se izvesti jer su takvi proteini uglavnom pravilno preklopljeni, odgovarajuće modifikovani i potpuno funkcionalni. Primeri pogodnih ćelijskih linija domaćina sisara uključuju HEK-293 i HEK-293T, COS-7 linije majmunskih ćelija bubrega, koje je opisao Gluzman (Ćelija 23:175, 1981), i druge ćelijske linije, uključujući, na primer, L ćelije, C127, 3T3, jajnici kineskog hrčka (CHO), HeLa i BHK ćelijske linije. Ekspresioni vektori sisavaca mogu sadržavati elemente koji nisu prepisani kao što je poreklo replikacije, pogodni promotor i pojačivač vezan za gen koji treba eksprimirati, i drugih 5' ili 3' bočnih ne prepisanih sekvenci, i 5' ili 3' neprevedene sekvence, kao što je potrebno mesta vezivanja ribozoma, mesta poliadenilacije, splajs donora i akceptora za spajanje i sekvencije transkripcije terminala. Bakulovirusni sistemi za proizvodnju heterolognih proteina u ćelijama insekata pregledavaju Luckow i Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

[0128] Ovo obelodanjivanje dalje daje postupak proizvodnje multifunkcionalnog polipeptida kao što je ovde opisano, ili za proizvodnju pojedinačnih polipeptida koji sadrže, odnosno NGF antagonist, i antagonist TNFα. Postupak uključuje kultivaciju ćelije domaćina kako je iznad opisano pod uslovima koji promovišu ekspresiju multifunkcionalnog polipeptida ili pojedinih polipeptida i povraćaj multifunkcionalnog polipeptida ili pojedinih polipeptida.

[0129] Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina visokog prinosa pogodna je stabilna ekspresija. Na primer, ćelijske linije koje stabilno izražavaju multifunkcionalni polipeptid mogu biti konstruisane. Umesto da koriste ekspresione vektore koji sadrže virusno poreklo replikacije, ćelije domaćini se mogu transformisati DNK kontrolisanim odgovarajućim elementima za kontrolu ekspresije (npr., promoter, pojačivač, sekvence, transkripcioni terminator, mesta poliadenilacije itd.) i marker koji se može odabrati. Nakon uvođenja strane DNK, inženjerskim ćelijama može se pustiti da rastu 1-2 dana u obogaćenoj podlozi, a zatim će se prebaciti na selektivnu podlogu. Selektivni marker u rekombinantnom plazmidu daje otpornost na selekciju i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u svoje hromozome i rastu u obliku žarišta koje zauzvrat mogu biti klonirane i proširene u ćelijske linije. Ovaj postupak se može koristiti za projektovanje ćelijskih linija koje izražavaju multifunkcionalni polipeptid.

[0130] U nekim otelotvorenjima, multifunkcionalni polipeptidi prikazani ovde su eksprimirani u ćelijskoj liniji sa prolaznom ekspresijom multifunkcionalnog polipeptida. Prolazna transfekcija je proces u kome se nukleinska kiselina koja se uvodi u ćeliju ne integriše u genom ili hromosomsku DNK te ćelije, već se održava kao ekstrahromozomski element, npr. kao epizoda, u ćeliji. Na procese transkripcije nukleinske kiseline epizoda ne utiče i stvara se protein kodiran nukleinskom kiselinom epizoma.

[0131] Ćelijska linija, ili stabilna ili prolazna transfekcija, održava se u podlozi ćelijske kulture i uslovima poznatim u struci, što rezultira ekspresijom i proizvodnjom polipeptida. U nekim otelotvorenjima, podloga ćelijske kulture sisara zasnovana je na komercijalno dostupnim formulacijama podloga, uključujući, na primer, DMEM ili Ham-ov F12. U nekim otelotvorenjima, podloga za kultivisanje ćelija je modifikovana da podrži porast i rasta ćelije i ekspresije biološkog proteina. Kao što je ovde korišćeno, termini "podloge za kultivisanje ćelija", "podloge za kultivisanje" i "formulacija podloge" odnose se na hranljivo rešenje za održavanje, rast, širenje ili ekspanziju ćelija u veštačkom in vitro okruženju izvan višećelijskog organizma ili tkiva. Podloga za kultivisanje ćelija može biti optimizovana za specifičnu upotrebu ćelijske kulture, uključujući, na primer, podlogu za rast ćelijske kulture koji je formulisana za podsticanje ćelijskog rasta, ili podlogu za proizvodnju ćelijske kulture koji je formulisana da promoviše rekombinantnu proizvodnju proteina. Termini hranljivi sastojak, sastojak i komponenta mogu se naizmenično koristiti za označavanje sastojaka koji čine podlogu za kultivisanje ćelija.

[0132] U različitim otelotvorenjima ćelijske linije se održavaju korišćenjem hranjenog serijskog postupka. Kao što se ovde koristi, „postupak hranjene serije“ odnosi se na postupak kojim se hranjena ćelijska kultura snabdeva dodatnim hranjivim sastojcima nakon što se prvo inkubira bazalnom podlogom. Na primer, način nahranjene serije može da sadrži dodavanje dodatnih podloga prema utvrđenom rasporedu hranjenja u datom vremenskom periodu.

Prema tome, „hranjena ćelijska kultura“ odnosi se na ćelijsku kulturu gde se ćelije, obično sisari, i podloge za kultivisanje u početku isporučuju u posudu za uzgoj, a dodatni hranjivi nutrijenti se neprekidno ili u diskretnim koracima dovode u kulturu tokom kultivisanja, sa ili bez periodične berbe ćelija i/ili proizvoda pre završetka kultivisanja.

[0133] U nekim otelotvorenjima, podloga za ćelijsko kultivisanje sadrži bazalnu podlogu i najmanje jedan hidrolizat, npr., na bazi soje, hidrolizat, hidrolat na bazi kvasca ili kombinaciju dve vrste hidrolizata što rezultira modifikovanom bazalnom podlogom. Dodatni hranljivi sastojci mogu ponekad da sadrže samo bazalnu podlogu, kao što je koncentrovana bazalna podloga, ili mogu da sadrže samo hidrolate ili koncentrovane hidrolate. Pogodne bazalne podloge uključuju, ali nisu ograničeni na njih Dulbecco's Modified Eagle's Medium

4

(DMEM), DME/F12, Minimal Essential Medium (MEM), Basal Medium Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, .alpha.-Minimal Essential Medium (.alpha.-MEM), Glasgow's Minimal Essential Medium (G-MEM), PF CHO (videti, npr., CHO podloga bez proteina (Sigma) ili EX-CELL.TM. 325 PF CHO Serum-Free Medium za CHO Cells Protein-Free (SAFC Bioscience), i Iscove's Modified Dulbecco's Medium. Ostali primeri bazalnih podloga koje se mogu koristiti u ovoj tehnologiji uključuju BME Basal Medium (Gibco-Invitrogen; Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, powder) (Gibco-Invitrogen (#31600)).

[0134] U nekim otelotvorenjima, bazalna podloga može biti bez seruma, što znači da ta podloga ne sadrži serum (npr., fetalni goveđi serum (FBS), konjski serum, kozji serum ili bilo koji drugi serum koji potiče od životinja poznatog stručnjaku) ili podloga bez životinjskog proteina ili hemijski definisana podloga.

[0135] Bazalna podloga se može modifikovati tako da ukloni određene hranjive komponente koje se nalaze u standardnom bazalnoj podlozi, kao što su razni neorganski i organski puferi, surfaktanti i natrijum hlorid. Uklanjanje takvih komponenti iz bazalne ćelijske podloge omogućava povećanu koncentraciju preostalih hranljivih sastojaka i može poboljšati ukupni rast ćelije i ekspresiju proteina. Pored toga, izostavljene komponente mogu se dodati u podlogu za ćelijsku kulturu koja sadrži modifikovanu podlogu bazalnih ćelija u skladu sa zahtevima uslova ćelijske kulture. U nekim otelotvorenjima, podloga za kultivisanje ćelija sadrži modifikovanu bazalnu podloge za kultivisanje, i bar jedno od sledećih hranljivih materija, izvor gvožđa, rekombinantni faktor rasta; pufer; surfaktant; regulator osmolarnosti; izvor energije; i ne životinjske hidrolize. Pored toga, modifikovana podloga bazalnih ćelija može po izboru da sadrži aminokiseline, vitamine ili kombinaciju i aminokiselina i vitamina. U nekim otelotvorenjima, modifikovani bazalna podloga dalje sadrži glutamin, npr. L-glutamin, i/ili metotreksat.

[0136] U nekim otelotvorenjima, proizvodnja proteina se vrši u većoj količini bioreaktornim postupkom, koristeći bioreaktorske hranjive serije, serije, perfuziju ili kontinuirano hranjenje. Bioreaktori velike veličine imaju kapacitet od najmanje 50 L, ponekad oko 500 litara ili 1,000 do 100,000 litara. Ovi bioreaktori mogu koristiti rotore sa mešalicama za distribuciju kiseonika i hranljivih materija. Bioreaktori malih razmera se uglavnom odnose na kultivisanje ćelija u zapreminskom kapacitetu ne većem od oko 100 litara, a može biti od oko 1 litre do oko 100 litara. Alternativno, bioreaktori za jednokratnu upotrebu (SUB) mogu se koristiti za kultivisanje velikih ili malih dimenzija.

[0137] Temperatura, pH, agitacija, aeracija i gustina inokulacije mogu varirati u zavisnosti od korišćenih ćelija domaćina i rekombinantnog proteina koji treba da se eksprimira. Na primer, kultura rekombinantnih proteinskih ćelija može se održavati na temperaturi između 30 i 45 stepeni Celzijusa. PH podloge za kultivisanje može se nadgledati tokom procesa kultivisanja tako da pH ostane na optimalnom nivou, koji može biti za određene ćelije domaćina, unutar raspona pH od 6.0 do 8.0. Za mešanje sa takvim kulturama za agitaciju može se koristiti mešanje sa pogonom. Brzina rotacije radnog kola može biti približno 50 do 200 cm/sek vršna brzina, ali mogu se koristiti i drugi podizači vazduha ili drugi sistemi za mešanje/aeraciju poznati u tehnici, u zavisnosti od vrste ćelije domaćina koja se uzgaja. Obezbeđena je dovoljna aeracija za održavanje koncentracije rastvorenog kiseonika od približno 20% do 80% zasićenja vazduhom u kulturi, opet, u zavisnosti od odabrane ćelije domaćina koja se uzgaja. Alternativno, bioreaktor može prosipati vazduh ili kiseonik direktno u podlogu za kultivisanje. Postoje i drugi postupci snabdevanja kiseonikom, uključujući sisteme za aeraciju bez mehurića koji koriste aeratore sa šupljim vlaknima.

Prečišćavanje proteina

[0138] Proteini proizvedeni od transformisanog domaćina kako je iznad opisano mogu se prečistiti prema bilo kojem pogodnom postupku. Takvi standardni postupci uključuju hromatografiju (npr., jonoizmenjivačku, afinitetnu i hromatografiju za isključivanje veličine), centrifugiranje, diferencijalnu rastvorljivost ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Oznake afiniteta kao što su heksahistidin, domen vezivanja maltoze, sekvenca obloga gripa i glutation-S-transferaza mogu se povezati sa proteinom kako bi se omogućilo lako prečišćavanje prolaskom preko odgovarajućeg afinitetne kolone. Izolovani proteini se takođe mogu fizički okarakterisati korišćenjem tehnika kao što su proteoliza, nuklearna magnetna rezonanca i rendgenska kristalografija.

[0139] Na primer, supernatanti iz sistema koji izlučuju rekombinantni protein u podlogu za kultivisanje mogu se prvo koncentrisati pomoću komercijalno dostupnog filtera za koncentraciju proteina, na primer, jedinice za ultrafiltraciju Amicon ili Millipore Pellicon. Nakon koraka koncentracije koncentrat se može naneti na pogodnu matricu za pročišćavanje. Alternativno, može se koristiti anjonska izmenljiva smola, na primer, matrica ili supstrat koji

4

ima pandan dietilaminoetilne (DEAE) grupe. Matrice mogu biti akrilamid, agaroza, dekstran, celuloza ili druge vrste koje se obično koriste u prečišćavanju proteina. Alternativno, može se primeniti korak katjonske razmene. Pogodni katjonski izmenjivači uključuju razne nerastvorene matrice koje sadrže sulfopropil ili karboksimetil grupe. Konačno, jedan ili više faza tečne hromatografije reverzne faze (RP-HPLC) koji koriste hidrofobne RP-HPLC podloge, npr., silika gel koji ima pandanske metilne ili druge alifatske grupe, može se koristiti za dalje prečišćavanje vezujućih NGF sredstava. Neki ili svi prethodni koraci prečišćavanja, u raznim kombinacijama, takođe se mogu koristiti da se dobije homogeni rekombinantni protein.

[0140] Rekombinantni protein proizveden u bakterijskoj kulturi može se izolovati, na primer, početnom ekstrakcijom iz ćelijskih peleta, a zatim jednim ili više koraka koncentracije, usoljavanjem, vodenom jonoizmenjivačkom ili hromatografijom za isključivanje veličine. Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) može se koristiti za završne korake prečišćavanja. Mikrobne ćelije koje se koriste u ekspresiji rekombinantnog proteina mogu se uništiti bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući ciklično zamrzavanje-odmrzavanje, sonikaciju, mehanički poremećaj ili upotrebu sredstava za liziranje ćelija.

[0141] Postupci poznati u struci za pročišćavanje rekombinantnih polipeptida takođe uključuju, na primer, one opisane u patentnoj publikaciji SAD br.2008/0312425, 2008/0177048 i 2009/0187005.

Farmaceutski sastavi i sastavi za upotrebu

[0142] Predmetno obelodanjivanje pruža sastave za kontrolu ili lečenje bola kod ispitanika, koji sadrže terapeutski efikasnu količinu multifunkcionalnog polipeptida antagonista TNFα i NGF, npr., multispecifični vezujući molekul, kao što je ovde dato za davanje ispitaniku, ili sadrži TNFα antagonist i NGF antagonist za zajedničko davanje ispitaniku. U određenim aspektima, ispitanik je čovek.

[0143] Predmetno obelodanjivanje dalje daje farmaceutske sastave koji sadrže multifunkcionalni polipeptid antagonista TNFα i NGF, npr., multispecifični vezujući molekul, kao što je ovde dato ili sadrži kombinaciju antagonista TNFα i antagonista NGF kao što je ovde dato. U određenim aspektima, farmaceutski sastavi dalje sadrže farmaceutski

4

prihvatljiv nosač. Ovi farmaceutski sastavi su korisni u lečenju bola, npr., neuropatskog i inflamatornog (npr., osteo ili reumatoidno-artritičnog) bola.

[0144] Multifunkcionalni polipeptidi i sastavi koji sadrže antagonist NGF i antagonist TNFα koji su ovde obezbeđeni mogu biti korisni u raznim primenama uključujući kontrolu ili lečenje bola, npr., neuropatskog bola. Sastavi se mogu koristiti in vitro, ex vivo, ili in vivo.

[0145] U određenim aspektima, bolest, poremećaj ili stanje lečeno sredstvom za vezivanje NGF (npr., antitelom ili polipeptidom) povezano je sa bolom. U određenim aspektima, bol je povezan sa hroničnom nocireceptivnom boli, hroničnom boli u donjem delu leđa, neuropatskom boli, boli zbog karcinoma, postherpetičkom neuralgijom (PHN) ili sa visceralnim bolovima.

[0146] Predmetno obelodanjivanje daje sastav za kontrolu bola kod ispitanika, koji sadrži efikasnu količinu antagonista faktora rasta živca (NGF) i antagonista faktora nekroze tumora (TNFα) za davanje ispitaniku kome je potrebna kontrola bola, gde davanje može da kontroliše bol kod ispitanika efikasnije od ekvivalentne količine antagonista NGF ili antagonista TNFα koji se daje sam.

[0147] U određenim aspektima, davanje je zajedničko davanje NGF antagonista i TNFα antagonista kao kombinovana terapija. Kao što je ovde razmatrano, pojedinačne komponente se mogu davati istovremeno ili sekvencijalno. Pojedinačni NGF antagonist ili TNFα antagonist može biti bilo koji NGF ili TNFα antagonist ovde obezbeđen, npr., rastvorljivi fragment TrkA receptora koji vezuje NGF, anti-NGF antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, rastvorljivi fragment koji vezuje TNFα TNF. receptor, npr., TNFR-2, ili anti-TNFα antitelo ili njegov fragment, npr., infliksimab, adalimumab, certolizumab pegol, golimumab, ili fragment koji vezuje antigen bilo kojeg od ovih antitela.

[0148] Zajedničko davanje može da sadrži različite doze svakog od antagonista prema potrebi za kontrolu bola. U nekim aspektima, zajedničko davanje može da sadrži niže doze ili manje česte doze svake komponente nego što bi se uobičajeno davalo kao pojedinačna terapija, pružajući tako dodatnu bezbednost, praktičnost i ekonomičnost.

4

[0149] U određenim aspektima, sastavi za upotrebu u kontrolisanju bola kao što je ovde dato, sadrže multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezujući molekul, koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα. Ovde su detaljno opisani primerni multifunkcionalni polipeptidi za upotrebu u ovom sastavu. Na osnovu obelodanjivanja, dodatni multifunkcionalni polipeptidi korisni u ovim sastavima biće očiti osobama sa uobičajenom strukom.

[0150] Pod kontrolom bola „efikasnije“ od komponenti koje se primenjuju samostalno podrazumeva se da je kombinovani tretman efikasniji u kontroli bola od ekvivalentnih količina bilo antagonista NGF ili antagonista TNFα koji se daje pojedinačno. U određenim aspektima, kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu, sastavi za upotrebu u kontrolisanju bola koji su ovde dati mogu da daju sinergističku efikasnost, npr., efekat davanja i antagonista NGF i antagonista TNFα može da pruži više od aditivnog efekta, ili mogu biti efikasni tamo gde ni NGF antagonist, ni TNFα antagonist nisu efikasni pojedinačno. U određenim aspektima, kombinacija može dozvoliti štednju doze, npr., efektivne doze pojedinih komponenti kada se istovremeno primenjuju mogu biti manje od efektivnih doza svake komponente pojedinačno.

[0151] U određenim aspektima, sastav za upotrebu u kontrolisanju bola koji je ovde dat je najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90%, ili 100% efikasniji u kontroli bola kod ispitanika nego ekvivalentna količina NGF antagonista ili TNFα antagonista koji se daje sam. U određenim aspektima, doze pojedinačnog NGF antagonista ili TNFα antagonista koji se zajedno daju ispitaniku ili doza relativne doze NGF antagonista ili TNFα antagonista obezbeđena nakon davanja ovde bifunkcionalnog polipeptida može biti manja, npr., 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80% ili 90% niže od doze potrebne za komponente koje se daju sami.

[0152] Efikasnost kontrole bola može se meriti tako što se od pacijenta traži da oceni kvalitet i intenzitet osećaja boli prema većem broju različitih skala. Verbalna skala boli koristi reči da opiše raspon bez boli, blage boli, umerene i jake boli sa ocenom od 0 do 3 dodeljene svakoj. Alternativno, od pacijenta se može tražiti da oceni njihov bol prema numeričkoj lestvici bola od 0 (bez bola) do 10 (najgori mogući bol). Na vizuelnoj analognoj skali (VAS) vertikalna ili horizontalna linija sadrži reči kojima se opisuje bol od neobične do najgore moguće boli i od pacijenta se traži da markira liniju u tački koja predstavlja njihov trenutni nivo bola. McGill

4

indeks boli omogućava pacijentima da opišu kvalitet i intenzitet bola tako što odaberu reči koje najbolje opisuju njihovu bol iz niza kratkih lista, npr., lupanje, žarenje, stezanje. Ostale vage za bol mogu se koristiti za odrasle osobe koje imaju poteškoće sa korišćenjem VAS ili numeričkih vaga, npr. FACES ili za neverbalne pacijente, npr. lestvica za ocenu ponašanja. Rezultat funkcionalne aktivnosti odnosi se na to koliko pacijent ometa njihov bol tražeći od njega da izvrši zadatak vezan za bolno područje. Poboljšanje ocene bola korišćenjem ove vrste skale potencijalno bi ukazivalo na poboljšanje efikasnosti analgetika.

[0153] Prema sastavu koji se koristi u kontrolisanju bola koji je ovde dat, davanje sastava je dovoljna da kontroliše bol kod subjekta kome je potrebna kontrola bola, npr., istodobna primena NGF antagonista i TNFα antagonista, ili primena a multifunkcionalni polipeptid, npr., multispecifični vezujući molekul koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα može da spreči, smanji, poboljša ili eliminiše bol kod ispitanika. U određenim aspektima, bol može biti akutna bol, kratkotrajna bol, uporni ili hronični nocireceptivni bol ili uporni ili hronični neuropatski bol.

[0154] U određenim aspektima, formulacije se pripremaju za čuvanje i upotrebu kombinujući multifunkcionalni polipeptid antagonista TNFα i NGF, npr., multispecifični vezujući molekul koji je ovde dat ili kombinaciju TNFα antagonista i NGF antagonista kao što je ovde dato, sa farmaceutski prihvatljivim nosačem (npr. nosač, ekscipijens) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, netoksične pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; soli kao što je natrijum hlorid; antioksidanti uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (npr. oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil paraben, poput metila ili propil parabena; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptidi niske molekularne težine (npr., manje od oko 10 aminokiselinskih ostataka); proteini kao što su albumin u serumu, želatina ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, poput polivinilpirolidona; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; ugljeni hidrati kao monosaharidi, disaharidi, glukoza, manoza ili dekstrini; helirajuća sredstva kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-joni koji stvaraju sol kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr., Zn-protein kompleksi); i nejonske površinski aktivne materije kao što su TWEEN ili polietilen glikol (PEG).

4

[0155] Multifunkcionalni polipeptidi predmetnog obelodanjivanja mogu se formulisati u tečnim, polučvrstim ili čvrstim oblicima, zavisno od fizičko-hemijskih svojstava molekula i putanje isporuke. Formulacije mogu da sadrže pomoćne sastojke ili kombinacije pomoćnih sastojaka, na primer: šećera, aminokiselina i površinski aktivnih materija. Tečne formulacije mogu da uključuju širok spektar koncentracija polipeptida i pH. Čvrste formulacije se mogu dobiti, na primer, liofilizacijom, sušenjem sprejom ili sušenjem pomoću superkritične tečne tehnologije. U nekim otelotvorenjima, bilo koja od ovde opisanih formulacija je liofilizovana formulacija.

[0156] U specifičnom otelotvorenju, multifunkcionalni polipeptid ovog obelodanjivanja je formulisan u 20 mM natrijum-fosfata, 50 mM L-arginin-HCL, 150 mM saharoze, 0.03% (w/v) polisorbata 80, pH 6.5.

[0157] Ovde dat farmaceutski sastav može se primeniti na bilo koji broj načina ili za lokalni ili za sistemski tretman. Davanje može biti lokalno (na primer na sluznici, uključujući vaginalno i rektalno) kao što su transdermalni flasteri, masti, losioni, kreme, gelovi, kapi, supozitoriji, sprejevi, tečnosti i praškovi; plućno (npr., inhalacijom ili insuflacijom praha ili aerosola, uključujući nebulizatorom; intratrahealno, intranazalno, epidermalno i transdermalno); oralno; ili parenteralno uključujući intravensko, intraarterijsko, potkožno, intraperitonealno ili intramuskularnu injekciju ili infuziju; ili intrakranijalno (npr., intratekalno ili intraventrikularno) davanje.

[0158] Multifunkcionalni polipeptid antagonista TNFα i NGF kao što je ovde dato ili kombinacija antagonista TNFα i antagonista NGF kao što je ovde dato, mogu se dalje kombinovati u farmaceutskoj kombinovanoj formulaciji ili režimu doziranja kao kombinovana terapija, sa drugim (ili trećim) jedinjenjem koje ima anti-nocireceptivna svojstva.

[0159] Za lečenje bola, odgovarajuća doza multifunkcionalnog polipeptida antagonista TNFα i NGF, npr., multispecifični vezujući molekul koji je ovde dat ili kombinacija antagonista TNFα i antagonista NGF kao što je ovde dato, zavisi od vrste bola koji se tretira , ozbiljnost i tok bola, reaktivnost bola, bilo da se multifunkcionalna kombinacija polipeptida ili polipeptida daje u terapeutske ili profilaktičke svrhe, prethodna terapija, klinička anamneza pacijenta i tako dalje, sve po nahođenju lekara koji leči. Multifunkcionalna kombinacija polipeptida ili polipeptida može se primenjivati jedanput ili tokom niza tretmana koji traju od nekoliko dana do nekoliko meseci kako bi se održala efikasna kontrola bola. Optimalan raspored doziranja može se izračunati na osnovu merenja nakupljanja lekova u telu pacijenta i varirati će u zavisnosti od relativne potencijale pojedinačnog antitela ili polipeptida. Lekar koji upravlja lekovima može lako da odredi optimalne doze, metodologije doziranja i brzine ponavljanja.

[0160] Primena multifunkcionalnog polipeptida, npr., multispecifičnog vezujućeg molekula ili kombinacije polipeptidnih kombinacija kako je ovde obezbeđeno, može da pruži „sinergiju“ i da se pokaže „sinergističkom“, tj. efekat postignut kada su aktivni sastojci koji se koriste zajedno veći od zbira efekata koji rezultat je upotrebe jedinjenja odvojeno.

Sinergistički efekat se može postići kada su aktivni sastojci: (1) daje se kao jedan, multifunkcionalni fuzioni polipeptid; (2) zajednički formulisan i administriran ili dostavljen istovremeno u kombinovanoj formulaciji jedinične doze; (3) isporučuje se naizmenično ili paralelno kao odvojene formulacije; ili (4) nekim drugim režimom. Kada se dostavljaju u alternativnoj terapiji, sinergistički efekat se može postići kada se jedinjenja primenjuju ili isporučuju sekvencijalno, npr., različitim injekcijama u odvojenim špricevima. Generalno, tokom alternativne terapije, efektivna doza svakog aktivnog sastojka se daje sekvencijalno, dok se u kombinovanoj terapiji efektivne doze dva ili više aktivna sastojaka daju zajedno.

Bol

[0161] U svojoj širokoj upotrebi, „bol“ se odnosi na iskustveni fenomen koji je visoko subjektivan pojedincu koji ga doživljava i na koji utiče mentalno stanje pojedinca, uključujući okruženje i kulturnu pozadinu. "Fizički" bol obično se može povezati sa stimulusom koji se može primetiti trećem licu koji je uzročnik stvarnog ili potencijalnog oštećenja tkiva. U tom smislu, bol se može posmatrati kao „senzorno i emocionalno iskustvo povezano sa stvarnim ili potencijalnim oštećenjima tkiva, ili opisano u smislu takvog oštećenja“, prema Međunarodnom udruženju za proučavanje boli (IASP). Međutim, neki slučajevi boli nemaju vidljiv uzrok. Na primer, psihogena bol, uključujući pogoršanje već postojeće fizičke boli pomoću psihogenih faktora ili sindroma ponekad trajne, opažane boli kod osoba sa psihološkim poremećajima, bez ikakvih dokaza o vidljivom uzroku boli.

Tipovi boli

1

[0162] Bol uključuje nocireceptivni bol, neuropatsku/neurogenu bol, probojni bol, alodiniju, hiperalgeziju, hiperesteziju, disteziju, paresteziju, hiperpatiju, fantomske bolove u udovima, psihogenu bol, anesteziju doloroza, neuralgiju, neuritis. Ostale kategorizacije uključuju maligni bol, anginalnu bol i/ili idiopatsku bol, kompleksni regionalni sindrom boli I, složni regionalni sindrom boli II. Vrste i simptomi bola ne moraju se međusobno isključivati. Ovi uslovi su zamišljeni kako je definisano u IASP.

[0163] Nocireceptivni bol pokreću specijalizovani senzorni nocireceptori u perifernim nervima kao odgovor na štetne podražaje, kodirajući štetne podražaje u akcione potencijale. Nocireceptori, uglavnom na Ad vlaknima i (polimodalnim) C vlaknima, su slobodni nervni završeci koji završavaju odmah ispod kože, u tetivama, zglobovima i telesnim organima. Neuroni dorzalnog gangliona (DRG) pružaju mesto komunikacije između periferije i kičmene moždine. Signal se obrađuje kroz kičmenu moždinu do moždanog i talamičnog mesta i na kraju do moždane kore, gde obično (ali ne uvek) izaziva osećaj boli. Nocireceptivni bol može biti rezultat širokog spektra hemijskih, termičkih, bioloških (npr., inflamatornih) ili mehaničkih događaja koji mogu nadražiti ili oštetiti telesno tkivo, a koji su uglavnom iznad određenog minimalnog praga intenziteta potrebnog da izazovu nociceptivnu aktivnost u nocireceptorima.

[0164] Neuropatski bol je generalno rezultat nenormalnog funkcionisanja perifernog ili centralnog nervnog sistema, što izaziva periferni ili centralni neuropatski bol, respektivno. Neuropatski bol je definisan od strane IASP kao bol iniciran ili uzrokovan primarnom lezijom ili disfunkcijom nervnog sistema. Neuropatski bol često uključuje stvarno oštećenje nervnog sistema, posebno u hroničnim slučajevima. Inflamatorni nocireceptivni bol općenito je rezultat oštećenja tkiva i rezultirajući inflamatorni proces. Neuropatski bol može dugo trajati (npr., mesecima ili godinama) nakon očiglednog zarastanja bilo kojih vidljivih oštećenja tkiva.

[0165] U slučajevima neuropatskog bola, senzorna obrada iz pogođenog regiona može postati abnormalni i bezopasni podražaji (npr., termički, dodir/pritisak) koji obično ne bi prouzrokovali bol (tj., alodinija) ili štetni podražaji mogu izazvati preteranu percepciju boli (tj., hiperalgezija) kao odgovor na normalno bolan stimulans. Pored toga, osećaji slični električnom golicanju ili udarcima ili "žmarcima" (tj., parestezije) i/ili osećaji koji imaju neugodne kvalitete (tj., dizestezije) mogu se javiti normalnim stimulansima. Probojni bol je

2

pogoršanje već postojećeg hroničnog bola. Hiperpatija je bolan sindrom nastao kao rezultat nenormalno bolne reakcije na stimulans. Stimulacija se u većini slučajeva ponavlja sa povećanim pragom boli, što se može smatrati najmanje iskustvom bola koje pacijent može prepoznati kao bol.

[0166] Primeri neuropatskog bola uključuju taktilnu alodiniju (npr., indukovanu nakon povrede živaca) neuralgiju (npr., post herpetičku (ili post-zoster) neuralgiju, trigeminalnu neuralgiju), refleksnu simpatičku distrofiju/kauzalgiju (nervna trauma), komponente bola kancera (npr., bol zbog samog karcinoma ili povezanih stanja kao što je inflamacija ili zbog lečenja kao što su hemoterapija, operacija ili radioterapija), fantomska bol u udovima, neuropatija udubljenja (npr., sindrom karpalnog tunela) i neuropatije poput periferne neuropatije (npr., zbog dijabetesu, HIV-a, hronične upotrebe alkohola, izloženosti drugim toksinima (uključujući mnoge hemoterapije), nedostatak vitamina i velikom broju drugih medicinskih stanja). Neuropatska bol uključuje bol izazvan ekspresijom patološkog delovanja nervnog sistema nakon povrede nerva usled različitih uzroka, na primer, hirurške operacije, rane, ožiljaka, dijabetičke neuropatije, amputacije nogu ili ruku ili kancera. Medicinska stanja povezana sa neuropatskim bolom uključuju traumatske povrede živaca, moždani udar, multiplu sklerozu, siringomijeliju, povredu kičmene moždine i kancer.

[0167] Stimulator koji izaziva bol često izaziva inflamatorni odgovor koji sam po sebi može doprineti iskustvu bola. Čini se da u nekim uslovima bol nastaje složenom mešavinom nocireceptivnih i neuropatskih faktora. Na primer, hronični bol često sadrži inflamatorni nocireceptivni bol ili neuropatski bol, ili smešu oboje. Inicijalna disfunkcija ili povreda nervnog sistema može pokrenuti neuronsko oslobađanje inflamatornih medijatora i posledičnu neuropatsku inflamaciju. Na primer, migrenska glavobolja može predstavljati mešavinu neuropatskog i nocireceptivnog bola. Takođe, miofascijalni bol verovatno je sekundarni unosu nocireceptivnog mišića, ali nenormalna mišićna aktivnost može biti rezultat neuropatskih stanja.

Kompleti koji sadrže antagoniste TNFα i NGF

[0168] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje setove koji sadrže multifunkcionalni polipeptid antagonista TNFα i NGF, npr., multispecifični vezujući molekul, kao što je ovde dato, ili kombinaciju TNFα antagonista i NGF antagonista kao što je ovde dato, koji se mogu koristiti za sastave za ovde opisane primene. U određenim aspektima, kit sadrži najmanje multifunkcionalni fuzioni polipeptid koji sadrži antagonist TNFα i antagonist NGF, npr., polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:14 ili 17, u jednom ili više kontejnera, ili kombinaciji NGF antagonista, npr. MEDI-578, i antagonista TNFα, npr., antitelo TNFα kao što je infliksimab ili adalimumab, ili rastvorljivi fragment rastvorljiv u TNFα TNF receptor, npr., TNFR2-Fc. Stručnjak u oblasti će lako prepoznati da ovde otkriveni antagonisti TNFα i NGF mogu biti lako uklopljeni u jedan od utvrđenih formata kita, koji su dobro poznati u tehnici.

PRIMERI

[0169] Obelodanjivanje koje je sada uopšteno opisano, biće lakše razumljivo pozivanjem na sledeće primere, koji su uključeni samo u svrhu ilustracije određenih aspekata i otelotvorenja ovog obelodanjivanja, i nisu namenjeni ograničavanju obelodanjivanja.

Primer 1 - Konstrukcija i karakterizacija multispecifičnog vezujućeg molekula Anti NGF scFv/TNFR2-Fc

[0170] Multifunkcionalni molekul, specifično, multispecifični vezni molekul koji sadrži domen anti-NGF antitela i domen TNFR2-Fc proizveden je na sledeći način. ScFv fragment anti-NGF antitela je stopljen na C-kraj TNFR2-Fc fuzionog proteina (SEQ ID NO:13) preko CH3 domena teškog lanca, prema Bs3Ab formatu opisanom u Dimasi, N., i dr., J Mol Biol.

393:672-92 (2009), i u PCT objavi br. WO 2013/070565. Dijagram konstrukcije prikazan je na Sl.1. GeneArt (Invitrogen) sintetizovao je DNK konstrukcije koje kodiraju TNFR2-Fc polipeptid i multispecifični vezujući molekul. Za multispecifični vezujući molekul, anti-NGF scFv koji sadrži VH (SEQ ID NO:3) i VL (SEQ ID NO:7) domeni MEDI-578 spojeni preko 15 aminokiselinskih veza u sekvenci (GGGGS) 3 (SEQ ID NO:15) su konstruisani. N-kraj scFv je spojen, preko 10-aminokiselinske vezničke sekvence (GGGGS) 2, na C-kraj SEQ ID NO:13. Ovaj multispecifični vezujući molekul ovde se naziva TNFR2-Fc_VH#4.

Konstrukcija DNK koja kodira multispecifični vezujući molekul konstruisana je tako da sadrži stop-kodon i EcoRI restrikcijsko mesto na 3' terminalu za kloniranje u ekspresijski vektor Bs3Ab. DNK sekvenca koja kodira TNFR2-Fc_VH#4 predstavljena je kao SEQ ID NO:16 i njena aminokiselinska sekvenca kao SEQ ID NO:14.

[0171] Termostabilnost multispecifičnog vezivnog molekula TNF-NGF poboljšana je dodavanjem međulančane disulfidne veze između VH i VL domena MEDI-578 scFv dela multispecifičnog vezujućeg molekula. Ovo je urađeno uvođenjem G-> C mutacije u

4

aminokiselini 44 VH domena (SEQ ID NO:94) i na aminokiselini 102 domena VL (SEQ ID NO:95). Ovaj klon je označen sa TNFR2-Fc_varB. Sekvenca aminokiselina TNFR2-Fc_varB predstavljena je kao SEQ ID NO:17. DNK sekvenca koja kodira TNFR2-Fc_varB predstavljena je kao SEQ ID NO:18. Kodon optimizovana DNK sekvenca koja kodira TNFR2-Fc_varB predstavljena je u SEQ ID NO:99. TNFR2-Fc_varB se dalje razlikuje od TNFR2-Fc_VH#4 po tome što je 15 aminokiselinskih vezničkih sekvenci (GGGGS)3koji spajaju VH i VL scFv dela zamenjen sa 20 aminokiselinskih veznika (GGGGS)4(SEK ID NO:19). Diferencijalna fluorimetrija za skeniranje (DSF) je korišćena za merenje Tm TNFR2-Fc_VH#4 i TNFR2-Fc_varB. Ovaj postupak meri ugradnju fluorescentnog bojila, Sipro Orange (Invitrogen), koji se vezuje za hidrofobne površine otkrivene tokom rastanka domena nakon izloženosti povišenim temperaturama. U DSF testu, Tm TNFR2-Fc_VH#4 je bio 62°C, dok je Tm TNFR2-Fc_varB bio 66°C. Zbog toga, dodavanje međulančane disulfidne veze u MEDI-578 scFv delu multispecifičnog molekula poboljšalo je termostabilnost molekula za 4°C.

[0172] TNFR2-Fc protein i TNFR2-Fc_VH#4 su bili prolazno eksprimirani u suspenzionim CHO ćelijama koristeći polietilenimin (PEI) (Polysciences) kao reagens za transfekciju. Ćelije su održavane u CD-CHO podlozi (Life Technologies). Sakupljači kultura od malih transfekcija su prečišćeni korišćenjem afinitetne hromatografije 1 ml HiTrap MabSelect SuRe™ u skladu sa protokolom proizvođača (GE Healthcare) i naknadno izmenjeni pufer u 1% saharoze, 100 mM NaCl, 25 mM L-arginin hidrohlorida i 25 mM natrijum-fosfat (pH 6.3). Čistoća rekombinantnih proteina analizirana je korišćenjem SDS-PAGE pod redukcionim uslovima i korišćenjem analitičke hromatografije za isključivanje veličine (videti postupak ispod), a koncentracije su određene očitavanjem apsorbancije na 280 nm koristeći teoretski utvrđene koeficijente izumiranja.

[0173] Prolazna ekspresija malog obima i protein Pročišćavanje na koloni TNFR2-Fc fuzionog proteina i multispecifičnog konstrukta TNF-NGF, TNFR2-Fc_VH#4, daje prinose od 36.6 i 79.9 mg L-1.

[0174] Veća serija TNFR2-Fc_VH#4 je dobijena na sledeći način. Sirova serija kulture iz velike transfekcije (do 6L) filtrirana je dubinskom filtracijom i stavljena u kolonu agarozine proteina A od 1.6 k 20cm (GE Healthcare), koja je prethodno bila uravnotežena sa puferom A (fiziološka otopina pufera sa fosfatom pH 7.2). Kolona je zatim isprana puferom A i proizvod je eluiran u stepenom gradijenta pufera B (50 mM natrijum acetat pH <4.0). Proizvod je dalje prečišćen punjenjem u kolonu Poros HS 50 veličine 1.6 x 20 cm (primenjeni biosistemi), prethodno uravnoteženoj u puferu C (50 mM natrijum acetatni pufer pH <5.5), ispran u puferu C, a zatim je proizvod eluiran u linearni gradijent od 0 do 1 M NaCl u 50 mM Natrijum acetatni pufer pH <5.5. Dobijeni eluati analizirani su pomoću HPLC za isključivanje veličine. Koncentracija proteina određena je A280 spektroskopijom Beckmanovim DU520 spektrofotometrom koristeći izračunati koeficijent izumiranja 1.36.

Postupci karakterizacija TNFR2-Fc_VH#4

[0175] Analiza zapadnog blotovanja izvedena je korišćenjem standardnih protokola. Proteini su preneti na membranu poliviniliden fluorida (Life Technologies) korišćenjem Xcell SureLock™ sistema (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Membrana je blokirana sa 3% (w/v) obranog mleka u prahu u fiziološkom rastvoru sa fosfatom (PBS) 1 h na sobnoj temperaturi. Vestern blotovi razvijeni su korišćenjem standardnih protokola sa HRP-konjugovanim antitelom IgG Fc specifičnim antitelom (Sigma).

[0176] HPLC za isključivanje veličine izvedena je korišćenjem Gilson HPLC sistema (Izokratska pumpa-307, UV/Vis-151 detektor, Tekući uređaj-215 i Injekcioni modul-819) sa Phenomenex BioSep-SEC-S3000 (300 x 7.8 mm) kolonom pokretna faza D-PBS (životne tehnologije) pri protoku od 1 ml/min. Dvadeset i pet uzoraka ubrizgano je na kolonu i odvajanje proteinskih vrsta je praćeno na A280 nm

[0177] Enzimska deglikosilacija malih pročišćenog TNFR2-Fc_VH#4 izvedena je korišćenjem EDGLI kompleta (Sigma Aldrich) u skladu sa protokolima proizvođača. Proteini su deglikozilisani i u denaturisanim i u prirodnim uslovima. Za denaturirane proteine, 30 µg proteina je deglikozilisano PNGase F, O-glikozidazom i α- (2→3, 6, 8, 9) -neuraminidaza, β-N-acetilglukozaminidaza i P-(1→4) -galaktozidaza tokom 3 sata na 37°C. U prirodnim uslovima, 35 µg proteina je deglikozilisano istim setom enzima kao gore tokom 3 dana na 37°C. Deglikozilisani proteini su analizirani pomoću SDS-PAGE obojenih kumasi i zapadnim blotovanjem koristeći standardne protokole ispitivanja.

[0178] Sekvencioniranje N-kraja aminokiseline TNFR2-Fc_VH#4 izvršeno je na sledeći način. Otprilike 2 µg TNFR2-Fc_VH#4 je pokrenuto na SDS-PAGE gelu koristeći standardne protokole. Proteini su preneseni na PVDF membranu korišćenjem Xcell SureLock™ sistema (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Membrana je obojena sa 0.1% (w/v) amido crnom približno 15 minuta na orbitalnoj mućkanoj platformi, a zatim je isprana dH2O da bi se smanjilo pozadinsko bojenje PVDF membrane. Membrana je osušena na vazduhu pre sekvenciranja N-kraja. Grupe od interesa su prekinute i određivanje sekvenci N-kraja multispecifičnog vezujućeg molekula izvršeno je na apliciranom sekvenceru Applied Biosystems 494 HT (Applied Biosystems, San Francisco, CA, SAD) pomoću onlajn analize feniltiohidantoina pomoću Applied Biosystems 140A mikro HPLC.

Rezultati karakterizacije

[0179] Prečišćeni TNFR2-Fc_VH#4 i TNFR2-Fc proteini su profilisani pomoću SEC-HPLC za nivoe fragmentacije agregata, monomera i proteina (Sl.2A i 2B). Glavni vrh koji sadrži monomer sačinjavao je otprilike 90% ukupnog prisutnog proteina, a preostalih oko 10% proteinske mase sa nižim vremenom zadržavanja na koloni što ukazuje na prisustvo vrsta ili agregata višeg reda. Međutim, monomerni vrh iz SEC-HPLC imao je dva naglašena ramena što ukazuje da protein unutar ovog vrha nije jedna vrsta. SDS-PAGE analiza obojenjem kumasi pokazala je dva različita opsega za TNFR2-Fc_VH#4 (pribl.100 i 75 kD) i slično dve različite trake za TNFR2-Fc fuzioni protein takođe (pribl.70 i 45 kD) uz redukciju uslovi (Sl.

2B). Pod neredukcionim uslovima, tri glavna opsega su bila prisutna za TNFR2-Fc_VH#4 (između 150 i 250 kD) i jedan glavni opseg i jedan manji opseg za TNFR2-Fc fuzioni protein približno. 150 i 120 kD. Pošto je razlika u molekularnoj masi između dve opsega pod redukcionim uslovima bila približno ekvivalentna veličini scFv fragmenta (∼26.5 kD), izvršena je dalja analiza kako bi se razumelo u kojim oblicima se stvara multispecifični vezni molekul. Masena spektroskopska analiza u nativnim uslovima potvrdila je SDS-PAGE podatke da su za dva odvojena prečišćena preparata proteina bile tri molekularne mase prisutne u prečišćenom sastavu TNFR2-Fc_VH # 4 u približno 125, 152 i 176 kD (Sl.2C).

[0180] Ako je obrazac vezivanja, primećen SDS-PAGE gelom, bio posledica diferencijalne glikozilacije TNFR2-Fc_VH#4, tada bi se nakon deglikosilacije to rešilo sve do jednog opsega. Međutim, obrazac vezivanja održavan je i u redukcionim i neredukcionim uslovima kada je TNFR2-Fc_VH#4 deglikozilisan ili kao izvorni protein ili kao denaturirani protein (podaci nisu prikazani). Bojenje zapadnog blota i glikozilisanog i deglikozilisanog TNFR2-Fc_VH#4 sa poliklonskim antitelom specifičnim za humani IgG Fc pokazalo je da i očekivana traka pune dužine i opseg niže molekularne mase reagiraju sa antitelima specifičnim za anti-Fc (podaci nisu prikazani).

[0181] Konačna identifikacija skraćenog proizvoda izvršena je sekvenciranjem N-kraja aminokiselinskog proteina. Ovo otkriva da prvih 8 aminokiselina N-kraja odsečenog proteina treba da bude SMAPGAVH što odgovara aminokiselinama 176 do 183 TNFR2-Fc_VH#4 sekvence (SEQ ID NO:14). Ovo je predstavljalo skraćenje od 175 aminokiselina na N-kraju TNFR2-Fc_VH#4, što je ostavilo samo 42 aminokiseline iz domena TNFR2. Ovo nam omogućava precizno tumačenje podataka o masi iz SDS-PAGE, masene spektroskopije i SEC-HPLC analize. Postoje tri moguće kombinacije dimera TNFR2-Fc_VH#4 i svi su bili prisutni u prečišćenim proteinskim preparatima: (1) homodimera pune dužine, (2) heterodimera pune dužine i skraćene vrste, i (3) homodimera skraćene vrste. Da bi se tačno izmerilo biološku aktivnost i in vitro i in vivo, preparat homodimera pune dužine generisan je postupkom dvostepene hromatografije na koloni. U prvom koraku, posle prečišćavanja Proteinom A, proizvod je sadržavao 80.5% monomera (Sl.3A), a nakon drugog koraka prečišćavanja kolone (SP sefaroza) procenat monomera je bio 97.8% (Sl.3B). Prinos tokom celog postupka bio je 7.3%.

Primer 2 - Analiza termičke stabilnosti diferencijalnom kalorimetrijom skeniranja (DSC)

[0182] Za kalorimetrijska merenja korišćen je automatizovani MicroCal VP-kapilarni DSC (GE Healthcare, SAD). Uzorci proteina su testirani na 1 mg/mL u 25 mM Histidin/Histidin-HCl puferu pH 6.0. Uzorci proteina i pufer su podvrgnuti linearnoj toplotnoj rampi od 25°C do 100°C brzinom 95°C na sat. Pufer se oduzme kao referenca iz uzorka proteina korišćenjem programa Origin 7 i odredi se termički prelazi.

[0183] Termogram za TNFR2-Fc _VH#4 (Sl.4) pokazuje tri različita prelaza koji se razviju sa temperaturama denaturacije (Tm) od 64, 67 i 84°C. Zaključili smo da je Tm od 64°C odgovarao denaturaciji i domena TNFR2 i anti-NGF scFv domena, gde su Tms od 67°C i 84°C tipični za denaturaciju Tms za IgG1 CH2 i CH3 domene respektivno (npr. Dimasi, N., i dr., J Mol Biol.393:672-92 (2009), i objava PCT br. WO 2013/070565). Iako ne žele da se vezuju teorijom, scFv uglavnom ima niže temperature denaturacije od ostalih domena antitela, a njihovo odvijanje se karakteriše jednim prelaznim događajem (Roberge i dr., 2006, Jung i dr., 1999, Tischenko i dr., 1998).

Primer 3 - Potvrda vezivanja antigena za TNFR2-Fc_VH#4

A. Jednostruko i dvostruko vezivanje antigena pomoću ELISA

[0184] Udubljenja Nunc Maxisorp su obložene preko noći na 4°C sa 50 µl TNFα (R&D sistemi) razblažen do 5 µg ml<-1>u PBS (pH 7.4). Sledećeg dana rastvor za oblaganje je uklonjen i udubljenja su blokirana sa 150 µl blokirajućeg pufera [3% obranog mleka-PBS] 1 h na sobnoj temperaturi. Udubljenja su isprana tri puta u PBS-u pre dodavanja 50 µl serije razblaženja TNFR2-Fc_VH#4 načinjene u blokirajućem puferu. Posle 1 sata na sobnoj temperaturi, udubljenja su isprana tri puta u PBS-Tween 20 (0.1% v/v; PBS-T). Pedeset mikrolitara biotiniliranog NGF-a zatim je dodato u udubljenja i inkubirano tokom sledećeg sata na sobnoj temperaturi, pre ispiranja kao i iznad i dodavanja 50 µl streptavidin-HRP (1:100). Posle 1 sata na sobnoj temperaturi, udubljenja su isprana sa PBS-T, dodato je 50 µl 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidin supstrata i boja je ostavljena da se razvije. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 1M H2SO4i merenje apsorbancije na 450 nm pomoću čitača mikrotiterskih ploča. Dobijeni podaci analizirani su pomoću softvera Prism 5 (GraphPad, San Diego, CA). Za ELISA vezanje pojedinačnog antigena, udubljenja su obložena ili TNFα ili NGF-biotinom kao iznad, a vezivanje antitela detektirano je antitelom konjugovanim za humani IgG Fc specifičan HRP (1:5000) i boja razvijena iznad.

[0185] ELISA rezultati su prikazani na Sl.5. TNFR2-Fc_VH#4 dizajniran je da se veže i za TNFα i NGF antigene. Pojedinačno vezanje antigena izvršeno je prvo imobilizacijom jednog antigena na mikrotitarsku ploču sa 96 udubljenja, a zatim dodatkom serijskog razblaženja TNFR2-Fc_VH#4. Specifično vezivanje detektirano je korišćenjem antitela specifičnog za ren peroksidazu (HRP) povezano sa anti-IgG Fc specifičnim antitelom. Za ELISA dvostruko vezivanje antigena, prvi antigen, TNFα je imobilizovan na ELISA ploči, a zatim je dodato serijsko razblaženje TNFR2-Fc_VH#4, posle čega je dodato drugi biotinilirani antigen, NGF u fiksnoj koncentraciji. Specifično vezivanje je zatim otkriveno korišćenjem streptavidina povezanog sa HRP. TNFR2-Fc_VH#4 vezan za TNFα i NGF u ELISA vezivanju pojedinačnog antigena (Sl.5A i B). U dvostrukom vezivanju antigena ELISA, TNFR2-Fc_VH#4 se istovremeno veže i za TNFα i NGF (Sl.5C).

B. Istovremeno vezanje antigena površinskom rezonancom plazmona

[0186] Istovremeni eksperimenti za vezivanje antigena izvedeni su u osnovi kako je opisano u Dimasi, N. i dr., J Mol Biol.393:672-92 (2009) koristeći BIAcore 2000 instrument (GE Healthcare). Ukratko, CM5 senzorski čip korišćen je za imobilizaciju oko 1500 rezonantnih jedinica TNFR2-Fc_VH#4 na 100 nM. Površine senzorskih čipova su zatim korišćene za istovremeno vezivanje za TNFα i NGF. Antigeni su pripremljeni u HBS-EP puferu [10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA), 0.005% P20]. Za sva merenja vezivanja korišćena je brzina protoka od 30 µl/min. Za određivanje istovremenog vezivanja multispecifičnog antitela na TNFα i NGF, 1 µM TNFα (molekularna masa, 17.5 kD) ubrizgava se preko površine senzorskog čipa, a po završetku ubrizgavanja, smeša TNFα i NGF (molekularna masa, 13.5 kD), oba na 1 µM, tada je ubrizgana. TNFα je uključen u smešu sa NGF radi sprečavanja gubitka signala usled disocijacije TNFα tokom faze vezivanja NGF. Kao kontrola izvedena je slična procedura vezivanja, a na zadnjoj injekciji dodan je samo TNFα, nije dalja povećanje rezonantnih jedinica za ovu injekciju ukazala da je TNFα vezan na zasićenim nivoima. Izvršeni su slični eksperimenti vezivanja i kontrole u kojima je redosled ubrizgavanja TNFα i NGF obrnut.

[0187] Istovremeno vezanje antigena TNFR2-Fc_VH#4 karakteriše površinska rezonanca plazmona. Događaji vezivanja su kvalitativno analizirani na sekvencijalni način. TNFR2-Fc_VH#4 kovalentno je imobilizovan na površini senzorskog čipa korišćenjem hemije vezivanja amina. Nakon toga, prvi antigen je ubrizgan da bi se dobio zasićeni nivo vezivanja za TNFR2-Fc_VH#4, a zatim je drugi antigen ubrizgan kao ekvimolarna smeša sa antigenom 1. Senzorgram vezivanja jasno je pokazao da se TNFR2-Fc_VH#4 istovremeno vezuje za TNFα i NGF (slika 6). Istovremeno vezivanje dva antigena dogodilo se bez obzira na redosled ubrizgavanja antigena.

Primer 4 - Inhibicija TF-1 ćelijske proliferacije indukovana sa NGF

[0188] TF-1 ćelije (ECACC kataloški broj 93022307) posejane su u 1.5 x10<4>ćelije/udubljenju u 50 µl seruma bez seruma u medijumu sa kulturom od 96 udubljenja (Corning Costar) i inkubirane 18 sati na 37°C, sa 5% CO2. Rekombinantni humani (Sigma) ili mišji NGF (R&D sistemi) prethodno su inkubirani razblaženjima TNFR2-Fc_VH#4, MEDI-578 IgG1 TM ITE, nevezujućim IgG1 TM ITE izotipom za MEDI-578 ili nevezujuće bispecifične izotipske kontrole R347 Bs3Ab u trajanju od 30 minuta na 37°C u ploči sa okruglim dnom sa 96 udubljenja (Greiner). Pedeset mikrolitara svakog uzorka je zatim dodato ćelijskoj ploči i inkubirano tokom 48 sati na 37°C. Nakon perioda inkubacije, dodato je 100 µl ćelijskog TITRE GLO® pufera (Promega) i ploča je inkubirana 10 minuta na 37°C sa 5% CO2. Potom je merena luminescencija korišćenjem standardnog protokola luminiscencije. Standardna NGF-indukovana proliferacija TF-1 u odsustvu antitela prikazana je na Sl.7A.

[0189] Funkcionalna aktivnost TNFR2-Fc_VH#4 određena je korišćenjem proliferacije izazvane NGF TF-1. TNFR2-Fc_VH#4 bio je u stanju da potpuno inhibira proliferaciju izazvanu humanim i mišijim NGF (Sl.7B i 7C, respektivno). Sl.7B: TF-1 ćelije su stimulisane rekombinantnim humanim NGF-om koji odgovara koncentraciji EC80. Ćelije su inkubirane ligandom sa serijom razblaženja antitela tokom 48 sati, nakon čega je ćelijska proliferacija kvantifikovana kulturom u toku 10 minuta sa ćelijskim puferom za ispitivanje TITRE GLO® (Promega). Sl.7C: TF-1 ćelije su stimulisane rekombinantnim mišijim NGF-om koji odgovara koncentraciji EC80. Ćelije su inkubirane ligandom sa serijom razblaženja antitela tokom 48 sati, nakon čega je ćelijska proliferacija kvantifikovana kulturom u toku 10 minuta sa ćelijskim puferom za ispitivanje TITRE GLO® (Promega). Ovi podaci pokazuju da je NGF inhibitorni deo TNFR2-Fc_VH#4 biološki aktivan i inhibira proliferaciju izazvanu NGF sličnom potencijom kao MEDI-578 kao IgG1TM. Slični podaci su takođe primećeni za TNFR2-Fc_varB i drugi TNF-NGF multispecifični vezujući molekul ndimab var B (Sl.7D & 7E). Ndimab varB sadrži kompletno anti-TNFα antitelo, tj. antitelo koje sadrži dva kompletna teška lanca i dva kompletna laka lanca u H2L2formatu, sa MEDI-578 scFv spojenim sa C-krajem teškog lanca antitela anti-TNFα. Laki lanac ndimab varB je prikazan u SEQ ID NO:20 i teški lanac ndimab varB je prikazan u SEQ ID NO:22.

Primer 5 - Inhibicija U937 ćelijske apoptoze indukovane TNFα

[0190] U937 ćelije (ECACC Cat. br.85011440) postavljeni su u crnu zidanu pločicu sa kulturom od 96 udubljenja (Corning Costar) u koncentraciji 8x10<5>ćelija/udubljenju u 50 µl podloge za kultivisanje. U937 ćelije su stimulisane rekombinantnim humanim TNFα koji odgovara koncentraciji EC80. Ćelije su inkubirane ligandom sa serijom razblaženja antitela tokom 2 sata, nakon čega je aktivnost kaspaze 3 kvantifikovana kulturom tokom 2 sata reakcionim puferom kaspaze 3. TNFR2-Fc_VH#4, nevezujuća bispecifična izotipska kontrola, R347 Bs3Ab i etanercept prethodno su inkubirani sa ćelijama 30 minuta na 37°C. Sledilo je dodavanje 50 µl rekombinantnog humanog TNFα (R&D sistemi) da bi se dobila konačna koncentracija ispitivanja od 20 ng/ml i naredna 2 h inkubacija na 37°C. Nakon perioda inkubacije, dodato je 50 µl reakcionog pufera kaspaze 3 (0.2% v/v CHAPS, 0.5% v/v Igepal CA-630, 200 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 uM DEVD-R110 supstrata (Invitrogen)) i ćelije se inkubiraju 2.5 h na 37°C. Fluorescencija je merena ekscitacijom na 475nm i emisijom 512nm. Aktivnost kaspaze u odsustvu TNFα antagonista prikazana je na Slici 8A.

1

[0191] Funkcionalna aktivnost TNFR2-Fc_VH#4 određena je korišćenjem testa induciranog TNFα Caspase 3 u ćelijama U937. TNFR2-Fc_VH#4 potpuno je inhibirao aktivnost kaspaze 3, indukovanu TNFα, kao i etanercept (Sl.8B). Ovo jasno pokazuje da je TNFα inhibitorni deo TNFR2-Fc_VH#4 biološki aktivan i da ima sličnu moć kao etanercept. Slični podaci su takođe primećeni za TNFR2-Fc_varB i ndimab varB (videti Sl.8C).

Primer 6 - In vivo testovi

[0192] Svi in vivo postupci sprovedeni su u skladu sa Zakonom o kućnim uredima za životinje u Velikoj Britaniji (1986) i odobrenim od lokalne komisije za etiku. Ženke C57B1/6 miševi (Charles River, Velika Britanija) korišćeni su u svuda. Miševi su smešteni u grupama od 5/6 po kavezu, u individualno ventiliranim kavezima (IVC) sa slobodnim pristupom hrani i vodi pod 12-satnim svetlosnim/tamnim ciklusom (svetla u 07:00-19:00). Prostorije za smeštaj i postupak održavanja su održavane na 24°C, a stalna pozadinska buka održavana je pomoću uobičajene radio stanice. Svi su miševi podvrgnuti ubacivanju transpondera pod anesteziju (3% izofluran u kiseoniku) radi identifikacije najmanje 5 dana pre početka svakog ispitivanja.

A. Seltzerov model neuropatskog bola

[0193] Mehanička hiperalgezija određena je korišćenjem analgisemetra (Randall LO, Selitto JJ, Arch Int Pharmacodyn Ther.111:409-19 (1957)) (Ugo Basile). Sve veća sila bila je primenjena na dorzalnu površinu svake zadnje šape, sve dok nije primećen odgovor povlačenja. Primena sile je zaustavljena u ovom trenutku i zabeležena je masa u gramima. Podaci su izraženi kao prag povlačenja u gramima za ipsilateralne i kontralateralne šape. Nakon uspostavljanja osnovnog čitanja, miševi su podeljeni u dve grupe sa približno jednakim odnosima ipsilateralne kontralateralne korekcije i podvrgnuti operaciji. Miševi su anestezirani sa 3% izofluranom. Nakon toga, otprilike 1 cm levog išijasnog nerva izložen je tupom disekcijom kroz rez na nivou srednje butine. Šav (10/0 Virgin Virgin: Ethicon) je zatim prošao kroz dorzalnu trećinu živca i čvrsto ga vezao. Rez je zatvoren lepkom i miševima je ostavljeno da se oporave najmanje sedam dana pre početka ispitivanja. Lažno operisani miševi podvrgnuti su se istom protokolu, ali nakon izlaganja nerva rana je zalepljena i ostavljeno joj je da se oporavi. Na miševima su testirani hiperalgezija 7. i 10. dana posle operacije. Posle testiranja 10. dana, operirani miševi su dalje podeljeni u grupe koje su primile izotipsku CAT251 IgG1 kontrolu (0.03 mg/kg sc), etanercept (0.01 mg/kg sc), MEDI-578 (0.03 mg/kg s.c.) ili kombinacija etanercepta (0.01 mg/kg s.c.) i MEDI-578 (0.03

2

mg/kg s.c.). Svi lažno operisani miševi su primili CAT251 (0.03 mg/kg s.c.). Mehanička hiperalgezija merena je 4 h, 1, 2, 3, 4 i 7 dana nakon doze.

[0194] Istodobna primena etanercepta i MEDI-578 u modelu mehaničke hiperalgezije pokazala se kao značajno smanjenje odnosa ipsilateralne/kontralateralne terapije na dan 10 nakon operacije u poređenju sa lakom kontrolisanom kontrolom (Sl.9). Primena jednostruke doze etanercepta (0.01 mg/kg s.c.) ili MEDI-578 (0.03 mg/kg s.c.) nije uspela značajno poništiti ovu hiperalgeziju. Istodobna primena etanercepta (0.01 mg/kg s.c.) zajedno sa MEDI-578 (0.03 mg/kg s.c.) značajno je poništila mehaničku hiperalgeziju u 4 h posle doze i efekat je zadržan do 7 dana posle doze.

[0195] U drugom ispitivanju procenjen je efekat TNFR2-Fc_VH#4. Nakon uspostavljanja mehaničke hiperalgezije, miševi su dozirani 13. dana posle operacije uz R347 Bs3Ab kontrolu izotipa (0.03 mg/kg s.c.), etanercept (0.01 mg/kg s.c.), MEDI-578 (0.03 mg/kg s.c.) ili TNFR2- Fc_VH#4 (0.01 mg/kg ili 0.03 mg/kg s.c.). Lako pripremljene životinje primile su R347 Bs3Ab kontrolu izotipa (0.03 mg/kg s.c.). Miševi su testirani na mehaničku hiperalgeziju u 4 h nakon doze i prvog, drugog, četvrtog i sedmog dana nakon doze kako je iznad opisano.

[0196] Davanje TNFR2-Fc_VH#4 dovela je do značajnog smanjenja ipsilateralnog/kontralateralnog odnosa na 10. dana nakon operacije, u poređenju sa lažno rukovođenim kontrolama (Slika 10A). Davanje ili etanercepta (0.01 mg/kg s.c.) ili MEDI-578 (0.03 mg/kg s.c.) nije uspela značajno poništiti mehaničku hiperalgeziju. Međutim, davanje TNFR2-Fc_VH#4 (0.01 i 0.03 mg/kg s.c.) dovela je do značajnog preokretanja mehaničke hiperalgezije u 4 h posle doze, efekat koji se zadržavao do 6 dana nakon doze. Nije primećen efekat posle primene R347 kontrolnog Bs3Ab. Slični podaci primećeni su kada je davan TNFR2-Fc_varB (videti Sliku 10B). Ovi podaci sugeriraju da TNFR2-Fc_VH#4 može značajno preokrenuti bol pri vrlo malim dozama gde se pokazalo da su ekvivalentne doze neefikasne ili minimalno efikasne ili sa MEDI-578 ili sam etanerceptom.

B. Model hronične boli u zglobovima

[0197] Mehanička preosetljivost je određena pomoću testera za onesposobljenost miša (Linton Instrumentation). Miševi su smešteni u uređaj sa njihovim zadnjim šapama na odvojenim senzorima, a raspodela telesne mase izračunata je u periodu od 4 s. Podaci su izraženi kao odnos ipsilateralnog i kontralateralnog opterećenja u gramima.

[0198] Nakon uspostavljanja osnovnog čitanja, miševi su podeljeni u dve grupe sa približno jednakim odnosima ipsilateralne kontralateralne korekcije. Intraartikularne injekcije su izvedene sledećom tehnikom: životinje su anestezirane korišćenjem 3% izoflurana u kiseoniku, a levo koleno je obrijano i očišćeno. U zglob kolena svakog miša ubrizgan je 10 µl Freund-ovog kompletnog pomoćnog sredstva (FCA) (10 mg/ml) ili nosač (lagano mineralno ulje) pomoću igle od 25 kalibra montirane na Hamilton špricu od 100 µl. Injekcije su rađene direktno u sinovijalni prostor zgloba kolena. Miševima je dozvoljeno da se oporave i ponovo su testirani na promene mehaničke preosetljivosti 7. i 10. dana nakon injekcije, kao što je iznad opisano. Nakon testiranja 10. dana, FCA tretirani miševi su dodatno nasumično postavljeni u grupe, a 13. dana miševima su dozirani etanercept (0.01 mg/kg i.p.) ili nosač nakon čega su primili dozu MEDI-578 (0.03 mg/kg i.v.) ili kontrola izotipa CAT251 (0.03 mg/kg i.v.). Miševi su testirani na mehaničku hipersenzitivnost u 4 h nakon doze i prvog, drugog, četvrtog i sedmog dana nakon doze kako je iznad opisano.

[0199] Efekat zajedničkog davanja etanercepta i MEDI-578 procenjen je korišćenjem intraartikularnog FCA modela inflamatornog bola. Intraartikularna primena FCA izazvala je mehaničku preosetljivost koja se manifestovala kao značajno smanjenje odnosa ipsilateralne/kontralateralne u danima 7 i 10 u poređenju sa kontrolnim nosačem (Sl.11). Nije opaženo smanjenje ipsilateralnog/kontralateralnog odnosa u lažno lečenim grupama u poređenju sa početnim nivoima pre tretmana. Davanje etanercepta (0.01 mg/kg i.p.) CAT251 (0.03 mg/kg i.v.) ili PBS (10 ml/kg i.p.) MEDI-578 (0.03 mg/kg i.v.) uzrokovalo je blago preokretanje mehaničke preosetljivosti izazvane FCA u 4 h, a dana 1, 2, 4 i 7 nakon doze, ali to nije uspelo dostići statističku značajnost. Međutim, davanje etanercepta (0.01 mg/kg i.p.) MEDI-578 (0.03 mg/kg i.v.) uzrokovalo je značajnu preokret mehaničke preosetljivosti izazvane FCA u svako vreme ispitivanja nakon doze.

[0200] U drugom ispitivanju procenjen je efekat TNFR2-Fc_VH#4. Posle uspostavljanja mehaničke preosetljivosti izazvane FCA, miševima su dozirani 13. dana posle FCA sa: R347 Bs3Ab izotipska kontrola (0.01 mg/kg s.c.), etanercept (0.01 mg/kg s.c.), MEDI-578 (0.01 mg/kg s.c.) ili TNFR2-Fc_VH#4 (0.003 mg/kg ili 0.01 mg/kg s.c.). Ponovo, miševi su

4

testirani na mehaničku hipersenzitivnost u 4 h nakon doze i prvog, drugog, četvrtog i sedmog dana nakon doze kako je iznad opisano.

[0201] Učinak TNFR2-Fc_VH#4 ("bispecifičan") u poređenju sa efektima etanercepta i MEDI-578 pojedinačno, prikazan je na Sl.12. Ni etanercept (0.01 mg/kg s.c.) niti MEDI-578 (0.01 mg/kg s.c.) nisu značajno poništili mehaničku preosetljivost izazvanu FCA u bilo kojem trenutku nakon doze. Međutim, primena TNFR2-Fc_VH#4 izazvala je značajnu preokret mehaničke preosetljivosti izazvane FCA. Viša doza TNFR2-Fc_VH#4 (0.01 mg/kg sc) pokazala je značajnu aktivnost tokom trajanja studije dok je niža doza (0.003 mg/kg sc) dostigla značaj prvog dana posle doze i ostala na nivou sličnom veće doze tokom trajanja ispitivanja.

C. Uspostavljen FCA indukovani model mehaničke preosetljivosti kod pacova

[0202] Intraplantarna injekcija Freundov kompletan adjuvans (FCA) izaziva inflamatornu reakciju, koja indukuje preosetljivost i edeme i oponaša neke aspekte kliničke inflamatorne boli. Ovi efekti se mogu istražiti upotrebom opreme za merenje težine nošenja. Procena potencijalnih antihiperalgetičkih svojstava TNFR2-Fc_VH#4 FCA indukovane preosetljivosti primenom postupka nosivosti. Naivni pacovi ravnomerno raspoređuju svoju telesnu masu između dveju zadnjih šapa. Međutim, kada je injektirana (leva) zadnja šapa upaljena i/ili boli, težina se distribuira tako da se na pogođenu šapu stavi manja težina (smanjenje težine na povređenoj šapi). Težina nosi kroz svaki zadnji ud, meri se korišćenjem testera za onesposobljenost pacova (Linton Instruments, Velika Britanija). Pacovi se postavljaju u uređaj za ispitivanje nesposobnosti zadnjim šapama na posebnim senzorima, a prosečna sila koju obe oba zadnja udova beleže tokom 4 sekunde.

[0203] Za ovo ispitivanje, naivni štakori (mužjak, Sprague-Dawley miševi (Harlan, Velika Britanija), 198-258 g) bili su prilagođeni proceduralnoj sobi u svojim kućnim kavezima, sa hranom i vodom na raspolaganju ad libitum. Navikavanje ispitivaču nesposobnosti obavljano je nekoliko dana. Snimci sa osnovnom težinom snimljene su pre nego što su izazvale povredu. Inflamatorna preosetljivost je indukovana intraplanarnom injekcijom FCA (dostupno od Sigma, 100µl 1 mg/ml rastvora) u levu zadnju šapu. Merenje težine pred lečenjem preuzet je da bi se procenila preosetljivost 23 sata nakon FCA.

[0204] Životinje su zatim rangirane i postavljene nasumično u grupe za tretiranje prema FCA prozoru težine u latino kvadratnom dizajnu.24 sata nakon injekcije FCA, životinje su tretirane ili TNFR2-Fc_VH#4 ("bispecifik") danim i.v. na 0.003, 0.01, 0.03, 0.3 i 3 mg/kg, negativno kontrolno antitelo, NIP228 (antitelo podignuto da se vezuje na hapten nitrofenol) dato i.v. pri 3 mg/kg, nosač (1% metilceluloza) dat p.o.2 ml/kg ili indometacin koji se daje 10 mg/kg p.o.

[0205] Ležanje težine procenjeno je 4 i 24 sata posle tretmana antitelo/lek. Podaci su analizirani upoređivanjem grupa za tretiranje sa kontrolnom grupom nosača u svakom trenutku. Statistička analiza uključuje ponovljene mere ANOVA praćene testom planiranog upoređivanja korišćenjem InVivoStat (invivostat.co.uk), (p <0.05 smatra se značajnim). Rezultati su prikazani na SL.13. Primećena je značajan preokret preosetljivosti kod Indomethacina (10 mg/kg) za 4 i 24 sata. TNFR2-Fc_VH#4 dozirani na 0.3 i 3 mg/kg pokazali su značajnu preokret hipersenzibilnosti tokom 4 i 24 sata, TNFR2-Fc_VH#4 dozirani na 0.003 i 0.03 mg/kg takođe su pokazali značajnu preokretu preosetljivosti, ali samo nakon 24 sata. Kontrola izotipa, NIP228 nije bilo značajnog uticaja na FCA odgovor ni u jednom trenutku.

Primer 7 - p38 fosforilacija TNFα i NGF

[0206] Literatura sugeriše da p38 fosforilacija igra važnu ulogu u razvoju neuropatske boli. Na primer, pokazalo se da lečenje p38 inhibitorima sprečava razvoj neuropatskih simptoma boli u modelu poštede oštećenja živaca (Wen YR i dr., Anesthesiology 2007, 107:312-321) i u išijatičnom modelu inflamatorne neuropatije (Milligan ED i dr., J Neurosci 2003, 23:1026-1040). U ovom eksperimentu, uloga TNFα, NGF i kombinacije TNFα i NGF u fosforilaciji p38 je ispitivana u testu ćelijske kulture. Ukratko, ćelije Neuroscreen-1 (subklona PC-12 neuroendokrinih ćelija pacova) su inkubirane sa sve većim količinama TNFα, NGF ili kombinacije TNFα i NGF. Nakon 20-minutnog perioda inkubacije, fosfo-p38 je kvantifikovan korišćenjem homogenog testa rastvorenog fluorescencije (HTRF) (Cisbio).

[0207] HTRF test: Posle stimulacije TNFα, NGF ili kombinacije TNFα i NGF, ćelijski supernatanti su brzo uklonjeni i ćelije lizirane u puferu za lizu. Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) detektovan je u lizatima u formatu sendvič analize koristeći dva različita specifična antitela; antitelo protiv fosfo-p38 konjugovano na europijum kriptat (donor fluorofor) i antitelo protiv p38 (ukupno) konjugovano na d2 (akceptor fluorofor). Antitela se inkubiraju sa ćelijskim lizatima i HTRF odnosima izračunatim iz merenja fluorescencije na 665 nm i 620 nm, načinjenih korišćenjem EnVision Multilabel Reader ploča (Perkin Elmer).

[0208] Podaci su predstavljeni kao HTRF odnosi, koji se izračunavaju kao odnos između emisije na 665 nm i emisije na 620 nm. Toplotna karta koja pokazuje odnose HTRF iz reakcija fosfo-p38 je prikazana na SL.14. Krive reakcije doze koje pokazuju efekat TNFα, NGF ili kombinacije TNFα i NGF prikazane su na Sl.15. Kao što se može videti sa SL.15, kombinovani efekat većih koncentracija TNFα i NGF na fosfo-p38 je veći od predviđene sume fosfo-p38 signala indukovanog bilo kojim faktorom. Ovi podaci sugeriraju da TNFα i NGF mogu delovati zajedno da induciraju p38 fosforilaciju i da dva puta mogu biti uključena u molekularnu signalizaciju koja vodi do bola.

Primer 8 - ERK fosforilacija TNFα i NGF

[0209] Poput p38, i ERK se aktivira tokom razvoja neuropatske boli (Zhuang ZY i dr., Pain 2005, 114:149-159). U ovom eksperimentu, uloga TNFα, NGF i kombinacije TNFα i NGF u fosforilaciji ERK je ispitivana u testu ćelijske kulture. Ukratko, ćelije Neuroscreen-1 (subklona PC-12 neuroendokrinih ćelija pacova) su inkubirane sa sve većim količinama TNFα, NGF ili kombinacije TNFα i NGF. Posle 20-minutnog perioda inkubacije, fosfo-ERK je kvantifikovan korišćenjem HTRF testa (Cisbio).

[0210] HTRF test: Posle stimulacije, ćelije supernatanta su brzo uklonjene i ćelije lizirane u puferu za liziranje. Phospho-p38 MAPK (Thr202/Tyr204) detektovan je u lizatima u formatu sendvič analize koristeći dva različita specifična antitela; antitelo protiv fosfo-ERK konjugovano na europijum kriptat (donor fluorofor) i antitelo protiv ERK (ukupno) konjugovano na d2 (akceptor fluorofor). Antitela se inkubiraju sa ćelijskim lizatima i HTRF odnosima izračunatim iz merenja fluorescencije na 665 nm i 620 nm, načinjenih korišćenjem EnVision Multilabel Reader ploča (Perkin Elmer).

[0211] Podaci su predstavljeni kao HTRF odnosi, koji se izračunavaju kao odnos između emisije na 665 nm i emisije na 620 nm. Toplotna karta koja pokazuje odnose HTRF iz reakcija fosfo-ERK je prikazana na SL.16. Krive reakcije doze koje pokazuju efekat TNFα, NGF ili kombinacije TNFα i NGF prikazane su na Sl.17. Kao što se može videti sa SL.17, male količine TNFα same nisu indukovale fosfo-ERK, ali veće količine, pojačale NGF-indukovane fosfo-ERK. Ovi podaci sugeriraju da TNFα i NGF mogu delovati zajedno da induciraju p38 fosforilaciju i da dva puta mogu biti uključena u molekularnu signalizaciju koja vodi do bola.

1

2

4

[0213] Obelodanjivanje ne treba da bude ograničeno opsegom opisanih specifičnih aspekata koji su zamišljeni kao pojedinačne ilustracije pojedinih aspekata obelodanjivanja, a bilo koji sastavi ili postupci koji su funkcionalno ekvivalentni spadaju u obim predmetnog obelodanjivanja. Zaista, različite modifikacije obelodanjivanja pored onih koje su ovde prikazane i opisane, stručnjacima će postati jasne iz prethodnog opisa i pratećih crteža. Takve modifikacije treba da spadaju u domet dodatih zahteva.

1

2

�

4

1

11

12

1

14

1

11

12

1

11

12

1

14

1

14

��

Claims

Patentni zahtevi

1. Vezujući molekul koji sadrži domen antagonista NGF i domen antagonista TNFα, gde domen antagonista NGF predstavlja fragment anti-NGF scFv, a domen antagonista TNFα sadrži rastvorljiv TNFR-2 fragment koji vezuje TNFα; gde domen antagonista TNFα sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinama 1 do 235 SEQ ID NO:13; gde anti-NGF scFv fragment sadrži VH domen antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:94 i VL domen antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95, i gde je anti-NGF scFv fragment stabilizovan uvođenjem međulančane disulfidne veze (SS-stabilizovane).

2. Vezujući molekul prema patentnom zahtevu 1, gde anti-NGF scFv fragment sadrži, od N-kraja do C-kraja, VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:94, 20-aminokiselinsku vezničku sekvencu (GGGGS)4(SEQ ID NO:19), i VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95.

3. Vezujući molekul u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-2, gde antagonist TNFα sadrži rastvorljivi fragment TNFR-vezujućeg TNFR-2 spojenog u imunoglobulin Fc domen.

4. Vezujući molekul iz patentnog zahteva 3, gde je imunoglobulin Fc domen humani IgG1 Fc domen.

5. Vezujući molekul prema patentnom zahtevu 4, gde imunoglobulin Fc domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinama 236 do 467 SEQ ID NO:13.

6. Vezujući molekul prema patentnom zahtevu 1, gde antagonist TNFα sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična SEQ ID NO:13.

7. Vezujući molekul prema patentnom zahtevu 1, gde vezujući molekul sadrži fuzioni protein koji sadrži antagonist NGF spojen na antagonist TNFα preko veznika.

8. Vezujući molekul prema patentnom zahtevu 7, gde vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog proteina.

9. Vezujući molekul prema patentnom zahtevu 8, gde je antagonist NGF anti-NGF scFv domen i antagonist TNFα je rastvorljivi fragment TNFR-vezujućeg TNFR-2 kondenzovanog na njegovom karboksi-kraju u Fc domen imunoglobulina preko veznika.

10. Vezujući molekul prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-9, gde vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži, od N-kraja do C-kraja, fragment koji vezuje TNFα TNFR-2, sadrži aminokiselinsku sekvencu identičnu sekvenca koja odgovara aminokiselinama 1-235 od SEQ ID NO:13, humani IgG1Fc domen, veznička sekvenca od 10 aminokiselina (GGGGS)2(SEQ ID NO:98), VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:94, 20-aminokiselinska veznička sekvenca (GGGGS)4(SEQ ID NO:19), i VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95.

11. Vezujući molekul prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-9, gde vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži, od N-kraja do C-kraja, fragment koji vezuje TNFα TNFR-2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:13, humani IgG1Fc domen, veznička sekvenca od 10 aminokiselina (GGGGS)2(SEQ ID NO:98), VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:94, 20-aminokiselinsku vezničku sekvencu (GGGGS)4(SEQ ID NO:19), i VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95.

12. Vezujući molekul u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-11, gde vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17.

13. Vezujući molekul u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-11, gde vezujući molekul sadrži homodimer fuzionog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:17.

14. Izolovani polinukleotid koji kodira vezujući molekul bilo kog od 1-13.

1

15. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 14, operativno povezan sa promoterom.

16. Ćelija domaćina koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 15.

17. Sastav koji sadrži vezujući molekul prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-13 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

18. Sastav prema patentnom zahtevu 17, za upotrebu u lečenju bola kod ispitanika.

1 1