RS60219B1 - Proces za propagaciju kvasca sposobnog da fermentiše glukozu i ksilozu - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Fermentacija monomernih šećera u alkohol pomoću kvasca je vrlo poznata već hiljadama godina. Naime, pivo su proizvodile gotovo sve kulture i populacije u istoriji ljudske vrste. U oblasti biogoriva, sirovine prve generacije koje imaju visok sadržaj skroba, kao što je kukuruz, se uspešno koriste na industrijskom nivou za proizvodnju etanola. Fermentativni procesi tehnologije prve generacije imaju koristi od mogućnosti hidrolize sirovine da se proizvede hidrolizovana kaša koja ima veoma visoku koncentraciju monomernih C6 šećera, pretežno glukoze, i vrlo malo ili uopšte ne inhibitora kvasca, kao što je sirćetna kiselina. Štaviše, šećeri izvedeni od hemiceluloze kao što je ksiloza nisu prisutni u sirovini prve generacije.

[0002] Primena hidrolizata lignocelulozne sirovine predstavlja niz zahtevnih problema, od kojih se većina pojavljuje u vođenju procesa na industrijskom nivou. Većina problema je povezana sa tim da učine proces ekonomski izvodljivim; drugi su povezani sa specifičnim karakteristikama hidrolizata lignocelulozne sirovine koji čine primenu hidrolizata lignocelulozne sirovine težom nego u slučaju hidrolizata prve generacije.

[0003] Prvi nedostatak u konvertovanju hidrolizata lignocelulozne sirovine pomoću kvasca je prisustvo C5 monomernih šećera, uglavnom ksiloze. Za ksilozu je poznato da se teško ili je nemoguće da se konvertuje prirodnim enzimima i kvasacima, a specijalni genetski modifikovani enzimski kokteli i kvasaci su dizajnirani za konvertovanje hemiceluloznog dela. Čak sa kvasacem koji je genetski modifikovan da bude sposoban da fermentuje i glukozu i ksilozu, konverzija ksiloze je spora.

[0004] Drugi nedostatak u konvertovanju hidrolizata lignocelulozne sirovine pomoću kvasca je niska koncentracija šećera hidrolizata lignocelulozne sirovine, koja je obično manja od 100g ukupnih šećeri po kg hidrolizata na vlažnoj osnovi. Pri niskoj koncentraciji šećera, brzina unosa šećera od strane kvasca je spora i time se olakšava propagacija bioloških kontaminanata, kao što su bakterije, koje troše relevantan deo raspoloživih šećera da proizvedu neželjene bioproizvode, kao što su mlečne kiseline. Problem je dodatno pojačan sporom brzinom konverzije ksiloze od strane kvasca. Time, sterilizacija hidrolizata lignocelulozne sirovine pomoću hemijskih ili biohemijskih agenasa, kao što su antibiotici, ili pomoću fizičkih agenasa, kao što su toplota ili svetlosti, se često praktikuje, povećavajući celokupne troškove.

[0005] Treći nedostatak u konvertovanju hidrolizata lignocelulozne sirovine pomoću kvasca je prisustvo inhibitornih jedinjenja u hidrolizatu. Jedinjenja kao što su sirćetna kiselina, mravlja kiselina, furfural, koja se obično proizvode u pretretmanu ili hidrolizi lignocelulozne sirovine, smanjuju sposobnost kvasca da preuzme šećere, ili bar brzinu unosa. Uklanjanje inhibitornih jedinjenja u različitim fazama uzvodno do konverzije kvasca često se praktikuje, opet povećavajući celokupne troškove.

[0006] Četvrti nedostatak u konvertovanju hidrolizata lignocelulozne sirovine pomoću kvasca, koji obično zahteva agitaciju hidrolizata, je da se hidrolizat lignocelulozne sirovine često proizvodi u obliku kaše, stoga teško je i skupo da bude agitovan. Kaša hidrolizata lignocelulozne sirovine može se odvojiti u tečnu komponentu koja sadrži vodu i šećere rastvorljive u vodi, i čvrstu komponentu koja sadrži prethodno tretiranu lignoceluloznu sirovinu nerastvorljivu u vodi, ponovo povećavajući troškove procesa.

[0007] Jedan glavni problem procesa fermentacije hidrolizata lignoceluloznih sirovina je da se smanji količina kvasca koja je ukupno potrebna, što ima veliki uticaj na troškove krajnjeg proizvoda. Da bi se rešio problem, korak propagacije se obično primenjuje, pri čemu se kvasac ubacuje u medijum za propagaciju pod uslovima koji promovišu rast kvasca, na taj način omogućavajući proizvodnju više ćelija kvasca koje će se koristiti u sledećem procesu fermentacije. Propagacija se može obavljati u šaržnom, polušaržnom i kontinualnom režimu. Dok se pokazalo da je propagacija kvasca na medijumu za propagaciju koji sadrži sintetičke šećere -i ksilozu i glukozu- efikasna na laboratorijskom nivou, različiti pristupi su predloženi za propagaciju kvasca na hidrolizatu lignocelulozne sirovine da se smanje troškovi medijuma za propagaciju.

[0008] WO2009155633A1 stavlja na uvid javnosti primenu supstrata koji sadrži materijal koji sadrži C5 jedinjenje, u rastu Saccharomyces kvasca ili proizvodnju proizvoda Saccharomyces kvasca, pri čemu materijal koji sadrži C5 jedinjenje je: (a) materijal koji sadrži C5 jedinjenje dobijen iz lignoceluloznog hidrolizata; (b) materijal koji sadrži C5 jedinjenje dobijen fermentacijom lignoceluloznog hidrolizata; ili (c) smeša (a) i (b). Prijava patenta takođe stavlja na uvid javnosti metodu proizvodnje biomase Saccharomyces kvasca ili proizvoda Saccharomyces kvasca korišćenjem supstrata, metoda obuhvata inkubaciju supstrata koji sadrži materijal koji sadrži C5 jedinjenje sa Saccharomyces kvascem u uslovima koji izazivaju rast Saccharomyces kvasca ili proizvodnju proizvoda. Prema tome, prijava patenta ne govori o specifičnim problemima i srodnim rešenjima koja su uključena u propagaciju kvasca na lignoceluloznom hidrolizatu.

[0009] WO2014072232A1 stavlja na uvid javnosti proces za aerobnu propagacija kvasca pri čemu se kvasac uzgaja u reaktoru, koji obuhvata korake : a) punjenje reaktora izvorom ugljenika i početnom populacijom kvasca, b) opciono uzgajanje početne populacije kvasca u reaktoru u šaržnom režimu, c) merenje pH u reaktoru, d) dodavanje lignoceluloznog hidrolizata u reaktor u polušaržnom režimu pri stopi za podešavanje pH u reaktoru na unapred određenu vrednost, i e) nakon dovoljne propagacije, izolacija kvasca iz reaktora. Izvor ugljenika iz koraka a) može biti razblažen lignocelulozni hidrolizat, pri čemu je razblaženje lignoceluloznog hidrolizata obezbeđeno za smanjenja efekata inhibitornih jedinjenja lignoceluloznog hidrolizata. Kontrolisanje uzgajanja u polušaržnom režimu je teško na industrijskom nivou, i povećava troškove, kao i održavanje aerobnih uslova u procesu propagacije na lignoceluloznom hidrolizatu, što zahteva snažnu agitaciju i velik protok vazduha. Štaviše, prijava patenta ne prepoznaje prisustvo bioloških kontaminanata kao kritično u koraku propagacije. Naime, navedeno je da je zagađenje bakterijama ili divljim kvascima retko problem tokom propagacije jer su rezervoari za propagaciju kvasca manji i mogu se lakše očistiti od rezervoara za fermentaciju. Osim čišćenja, antibakterijski proizvodi može se dodati da spreči rast neželjenih mikroba.

[0010] US8450094 stavlja na uvid javnosti metodu propagacije kvasca na medijumu za propagaciju, pri čemu se ksiloza daje medijumu kao izvoru ugljenika za rast ćelijske mase. Prva ćelijska masa se propagira pod aerobnim uslovima sa protokom vazduha od najmanje 1.0 zapremine vazduha po zapremini medijuma po minuti u drugoj ćelijskoj masi, koja se po izboru propagira u sledećem koraku u trećoj ćelijskoj masi. Sekvencijalna metoda stavljena na uvid javnosti u patentu da se proizvede razumna količina kvasca zahteva dugo vreme propagacije u uslovima povoljnim za biološke kontaminante, time zahtevajući sterilizaciju izvora ugljenika.

[0011] Elia Tomás-Pejó i Lisbeth Olsson "Influence of the propagation strategy for obtaining robust Saccharomyces cerevisiae cells that efficiently co-ferment xylose and glucose in lignocellulosic biomass hydrolysates" Microbial Biotechnology tom. 8 2015 strane 999-1005 stavlja na uvid javnosti da je dodavanje lignoceluloznog hidrolizata tokom propagacije ćelija prilagodilo ih inhibitorima, što rezultuje tolerantnijim ćelijama sa kraćim fazama zaostajanja i većim specifičnim brzinama rasta u minimalnom medijumu koji sadrži sirćetnu kiselinu i vanilin u odnosu na neprilagođene ćelije.

[0012] Zbog toga postoji potreba za procesom propagacije kvasca na hidrolizatu lignocelulozne sirovine koji se može koristiti na industrijskom nivou. Veruje se da proces stavljen na uvid javnosti prevazilazi gore pomenute nedostatke u primeni hidrolizata lignocelulozne sirovine, obezbeđujući rešenje za propagaciju kvasca na hidrolizatu lignocelulozne sirovine na industrijskom nivou.

REZIME

[0013] Proces za propagaciju kvasca sposobnog da fermentiše glukozu i ksilozu hidrolizata lignocelulozne sirovine stavljen je na uvid javnosti, pri čemu navedeni proces obuhvata propagaciju kvasca tokom najmanje prvog i drugog ciklusa propagacije. Prvi ciklus propagacije (Pn, gde je n=1) obuhvata korake: kontaktiranje kvasca pri početnoj gustini kvasca sa prvim kultivacionim medijumom koji sadrži prvi deo hidrolizata lignoceluloze sirovine; i omogućavanje kvascu da se propagira da bi se stvorio prvi naseljeni bujon koji sadrži vodu i prvi propagirani kvasac, pri čemu se najmanje 50% glukoze i manje od 20% ksiloze u prvom kultivacionom medijumu troši u prvom propagacionom ciklusu. Drugi ciklus (P2, n=2) obuhvata korake: razdvajanje prvog naseljenog bujona na najmanje prvi uklonjeni deo i prvi preostali deo, pri čemu i prvi preostali deo i prvi uklonjeni deo sadrže nešto prvog propagiranog kvasca; kontaktiranje prvog zaostalog dela sa drugim kultivacionim medijumom koji sadrži drugi deo hidrolizata lignocelulozne sirovine; i omogućavanje kvascu da se propagira da bi se stvorio drugi naseljeni bujon koji sadrži vodu i drugi propagirani kvasac, pri čemu se najmanje 50% glukoze i manje od 20% ksiloze u drugom kultivacionom medijumu troši u drugom ciklusu propagacije.

[0014] Proces stavljen na uvid javnosti može dalje da sadrži sledeće cikluse Pnpropagacije, gde n je ceo broj veći od 2 i jedan je (1) veći od broja ciklusa neposrednog prethodnog ciklusa (n-1), svaki ciklus Pnpropagacije sadrži korake: razdvajanje Pn-1naseljenih bujona u najmanje Pn-1uklonjenom delu i Pn-1preostalom delu, pri čemu i Pn-1preostali deo i Pn-1uklonjeni deo sadrže nešto Pn-1propagiranog kvasca; kontaktiranje preostalog dela naseljenog bujota najmanje jednog od prethodnih ciklusa i Pnkultivacionog medijuma koji sadrži Pndeo hidrolizata lignocelulozne sirovine; i omogućavanje kvascu da se propagira da se stvori Pnnaseljeni bujon, pri čemu se najmanje 50% glukoze i manje od 20% ksiloze u Pnkultivacionom medijumu troši u Pnciklusu propagacije.

[0015] Takođe je stavljeno na uvid javnosti da korak omogućavanja kvascu da se propagira u ciklusima Pnpropagacije može da se izvede u šaržnom režimu, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1.

[0016] Dalje je stavljeno na uvid javnosti da početna gustina kvasca u prvom ciklusu propagacije može biti u opsegu od 1 x 10<6>do 1x 10<8>ćelija kvasca po miligramu prvog kultivacionog medijuma na vlažnoj osnovi.

[0017] Takođe je stavljeno na uvid javnosti da se količina Pn-1uklonjenog dela i količina Pndela hidrolizata lignocelulozne sirovine može odabrati da ima početnu gustinu kvasca u Pnciklusu propagacije u opsegu od 1 x 10<6>do 1x 10<8>ćelija kvasca po miligramu Pnkultivacionog medijuma na vlažnoj osnovi, pri čemu n je ceo broj veći od 1.

[0018] Dalje je stavljeno na uvid javnosti da početna gustina kvasca u Pnciklusu propagacije, gde n je ceo broj veći od 1, može biti veća od početne gustine u prvom ciklusu propagacije.

[0019] Takođe je stavljeno na uvid javnosti da konačna gustina kvasca u Pnciklusu propagacije može biti u opsegu od 1 x 10<7>do 1x 10<9>ćelija kvasca po miligramu Pnnaseljenog bujona na vlažnoj osnovi, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1.

[0020] Dalje je stavljeno na uvid javnosti da vreme propagacije prvog ciklusa propagacije može biti manje od vrednosti odabrane iz grupe koja se sastoji od 30 sati, 25 sati i 20 sati.

[0021] Takođe je stavljeno na uvid javnosti da vreme propagacije Pnciklusa propagacije može biti manje od procentualne vrednosti odabrane iz grupe koja se sastoji od 70%, 50%, i 40% prvog vremena propagacije, pri čemu n je ceo broj veći od 1.

[0022] Dalje je stavljeno na uvid javnosti da kultivacioni medijum može dalje da sadrži izvor azota.

[0023] Takođe je stavljeno na uvid javnosti da se vitamini i/ili elementi u tragovima ne moraju da se dodaju u proces.

[0024] Dalje je stavljeno na uvid javnosti da hidrolizat lignocelulozne sirovine može da sadrži biološke kontaminante, a gustina bioloških kontaminanti u početnom Pnkultivacionom medijumu može biti u opsegu odabranom iz grupe koja se sastoji od 10<0>CFU/ml do 10<6>CFU/ml, od 10<1>CFU/ml do 10<5>CFU/ml, i 10<2>CFU/ml do 10<3>CFU/ml početnog Pnkultivacionog medijuma, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1.

[0025] Takođe je stavljeno na uvid javnosti da hidrolizat lignocelulozne sirovine ne mora da bude podvrgnut bilo kakvoj sterilizaciji.

[0026] Dalje je stavljeno na uvid javnosti da antibakterijski agensi ne moraju da se dodaju u proces.

[0027] Takođe je stavljeno na uvid javnosti da hidrolizat lignocelulozne sirovine može biti kaša koja sadrži prethodno tretiranu lignoceluloznu sirovinu nerastvorljivu u vodi.

[0028] Dalje je stavljeno na uvid javnosti da suva materija Pnkultivacionog medijuma može biti manje od 30% i više od procentualne vrednosti odabrane iz grupe koja se sastoji od 5%, 10%, 15%, i 20%, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1.

[0029] Takođe je stavljeno na uvid javnosti da svi ciklus propagacijei mogu biti izvedeni u jednoj posudi za propagaciju.

[0030] Dalje je stavljeno na uvid javnosti da posuda za propagaciju ne mora biti izložena bilo kakvoj sterilizaciji i/ili čišćenju između i/ili tokom ciklusa propagacije.

[0031] Takođe je stavljeno na uvid javnosti da proces stavljen na uvid može dalje da obuhvata korake: uvođenje jednog ili više Pnuklonjenih delova i fermentacionog medijuma koji sadrži dalji deo hidrolizata lignocelulozne sirovine u barem posudu za fermentaciju; omogućavanje kvascu da fermentiše glukozu i ksilozu da se stvori fermentacioni bujon, koji sadrži fermentacioni proizvod, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1.

DETALJAN OPIS

[0032] Stavljen je na uvid javnosti višestepeni proces za sekvencijalnu propagaciju kvasca u dva ili više ciklusa propagacije na odgovarajućem kultivacionom medijumu koji svaki sadrži deo hidrolizata lignocelulozne sirovine, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Kvasac je sposoban da fermentiše i glukoza i ksiloza monomerne šećere, koji su dve glavne komponente hidrolizata lignocelulozne sirovine.

[0033] U skladu sa jednim aspektom, proces stavljen na uvid javnosti obezbeđuje rešenje koje se može uvesti na industrijskom nivou, prevazilazeći probleme koji se javljaju u stvarnom postrojenju za konverzaciju.

[0034] U skladu sa sledećim aspektom, proces stavljen na uvid javnosti dozvoljava da se proizvede kvasac potreban u sledećem koraku fermentacije počevši od male količine kvasca, na taj način osetljivo smanjujući troškove fermentacije. U skladu sa daljim aspektom, u procesu stavljenom na uvid javnosti propagacija kvasca se dešava na hidrolizatu lignocelulozne sirovine koji je već dostupan u postrojenju za konverziju, na taj način izbegavajući ili značajno smanjujući troškove povezane sa skupim izvorima ugljenika.

[0035] U skladu sa dodatnim aspektom, proces stavljen na uvid javnosti omogućava primenu hidrolizata lignocelulozne sirovine koji može da sadrži biološke kontaminante na zanemarljivom nivou, bez primene bilo kojeg agensa za sterilizaciju ili postupka.

[0036] U skladu sa daljim aspektom, u procesu stavljenom na uvid javnosti propagacija kvasca može se desiti bez dodavanja vitamina i drugih skupih nutrijenata.

[0037] U skladu sa daljim aspektom, u procesu stavljenom na uvid javnosti propagacija kvasca se izvodi za vreme propagacije koje je kraće od onog u procesu stavljenom na uvid u stanju tehnike.

[0038] U kontekstu predmetne objave, "propagacija kvasca", ili "rast kvasca", ili "proizvodnja kvasca" označava proces povećanja količine kvasca, ili biomase kvasca, dobijene hranjenjem početne količine kvasca sa izvorom ugljenika i opciono drugim nutrijentima u pogodnim uslovima. Povećanje biomase kvasca ili količine kvasca dešava se povećanjem broja ćelija kvasca ukupno proizvedenih, a može se verifikovati određivanjem gustine ćelija na početku i na kraju propagacionog(ih) koraka, ili tokom propagacionog(ih) koraka. Gustina ćelije može se odrediti brojenjem ćelija kvasca prisutnih u reprezentativnim uzorcima kultivacionog medijuma u različitim vremenima propagacionog(ih) koraka.

[0039] Kvasac procesa stavljenog na uvid javnosti je sposoban da fermentiše ne samo glukozu, ali takođe ksilozu. Kako kvasac koji se pojavljuje u prirodi obično nije sposoban da preuzme ksilozu, kvasac koji se koristi u procesu stavljenom na uvid javnosti je poželjno kvasac koji se ne pojavljuje u prirodi ili je izveden iz kvasca koji se ne pojavljuje u prirodi.

[0040] Termin kvasac "koji se ne pojavljuje u prirodi" znači da mikrobni organizam ima najmanje jednu genetsku alteraciju koja se obično ne nalazi u soju koji se pojavljuje u prirodi referentne vrste, uključujući sojeve referentne vrste koji se pojavljuje u prirodi, kako bi se stvorio kvasac koji se pojavljuje u prirodi sposoban da fermentiše i glukozu i ksilozu. Genetske alteracije mogu da uključuju, na primer, modifikacije koje uvode ekspresivne nukleinske kiseline koje kodiraju metaboličke polipeptide, druge adicije nukleinskih kiselina, delecije nukleinske kiseline i/ili druge funkcionalne poremećaje genetskog materijala kvasca. Takve modifikacije mogu da uključuju, na primer, kodirajuće regione i njihove funkcionalne fragmente, za heterologne, homologne ili i heterologne i homologne polipeptide za referentne vrste. Dodatne modifikacije mogu da uključuju, na primer, nekodirajuće regulatorne regione u kojima modifikacije menjaju ekspresiju gena ili operona.

[0041] Kvasac koji se ne pojavljuje u prirodi predmetne objave može da sadrži stabilne genetske alteracije, što se odnosi na kvasac koji se može propagirati više od pet generacija bez gubitka alteracije. Generalno, stabilne genetske alteracije uključuju modifikacije koje traju duže od 10 generacija, posebno stabilne modifikacije će trajati više od oko 25 generacija, tačnije, stabilne genetske modifikacije će biti više od 50 generacija, uključujući neograničeno.

[0042] Kvasac predmetne objave može biti odabran od bilo kojeg poznatog roda i vrste kvasca. Kvasci su opisani na primer u N. J. W. Kreger-van Rij, "The Yeasts," tom.1 Biology of Yeasts, poglavlje 2, A. H. Rose i J. S. Harrison, Izd. Academic Press, London, 1987. U jednom tehičkom rešenju kvasac je odabran iz grupe koja se sastoji od Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Debaromyces, Nadsonia, Lipomyces, Torulopsis, Kloeckera, Pichia, Schizosaccharomyces, Trigonopsis, Brettanomyces, Cryptococcus, Trichosporon, Aureobasidium, Lipomyces, Phaffia, Rhodotorula, Yarrowia, i Schwanniomyces. Poželjno kvasac je odabran od Saccharomyces cerevisiae sojeva.

[0043] U procesu stavljenom na uvid javnosti, glavni izvor ugljenika korišćen za propagaciju kvasca je hidrolizat izveden iz lignocelulozne sirovine. Detaljan opis lignocelulozne sirovine može se pronaći u WO2015028156A1, str. 11-14,. Poželjna lignocelulozna sirovina je odabrana iz grupe poljoprivrednih ostataka, naročito slame kao što je pšenična slama, pirinčana slama ili bagasa, kao što je bagasa od šećerne trske (ostaci nakon prerade šećerne trske). Tvrdo drvo i meko drvo takođe imaju koristi od ovog procesa. Po izboru, drugi izvori ugljenika kao što je melasa ili sintetičkih šećera se mogu takođe koristiti, ali monomerni šećeri hidrolizata lignoceluloznih sirovina su poželjno najmanje 80% masenih, poželjnije najmanje 90%, a najpoželjnije najmanje 95% ukupnih izvora ugljenika korišćeni u procesu. U još najpoželjnijem tehničkom rešenju, hidrolizat lignocelulozne sirovine je jedinstven izvor ugljenika korišćen u procesu propagacije kvasca.

[0044] Hidrolizat lignocelulozne sirovine je poželjno izveden iz lignocelulozne sirovine pomoću višestepenog procesa koji sadrži predtretman lignocelulozne sirovine da se proizvede predhodno tretirana lignocelulozna sirovina i podvrgavanje prethodno tretirane lignocelulozne sirovine enzimskoj hidrolizi. Predtretman povećava dostupnost ugljenih hidrata u tome sadržanih u delovanju enzima. Poželjni predtretman obuhvata hidrotermalnu obradu lignocelulozne sirovine vodom u parnoj fazi u reaktoru pod pritiskom, i vodenom parom koja eksplodira hidrotermalno tretiranu sirovinu brzo oslobađajući pritisak primenjen na sirovinu. Hidrotermalni tretman se poželjno izvodi na temperaturi u opsegu od 130°C do 230°C u vremenu od 1 minuta do 180 minuta. Reaktor je poželjno pod pritiskom pare pri pritisku od najmanje 10 bara da se dobije efikasno razlaganje sirovine.

[0045] U jednom tehničkom rešenju, lignocelulozna sirovina je podvrgnuta procesu natapanja ili koraku za uklanjanje dela nelignoceluloznih jedinjenja sadržanih u sirovoj lignoceluloznoj sirovini, kao što su neorganske soli, voskovi, i organske kiseline pre nego što se hidrotermalno tretirana u reaktoru pod pritiskom. U koraku ili procesu natapanja, spoljni kontaminanti, kao što su zemlja, kamenje, i ostaci žetve, mogu se takođe odvojiti. Proces natapanja poželjno uključuje uvođenje lignocelulozne sirovine u tečnost za natapanje koja sadrži vodu na temperaturi od 20°C do 100°C, poželjnije od 40°C i 70°C i tokom vremena natapanja od 30 sekundi do 30 minuta, poželjnije od 3 minuta do 15 minuta.

[0046] Po izboru, lignocelulozna sirovina je podvrgnuta preliminarnom hidrotermalnom tretmanu u vodi ili tečnosti koja sadrži vodu da bi se rastvorio deo ugljenih hidrata nerastvorljivih u vodi sadržanih u lignoceluloznoj sirovini pre nego što se uvede u reaktorsku posudu pod pritiskom. Preliminarni hidrotermalni tretman se izvodi u uslovima pod pritiskom u prisustvu vode u parnoj ili tečnoj fazi, ili njihovoj smeši, na temperaturi od 100°C do 190°C, poželjno od 130°C do 180°C, i najpoželjnije od 140°C do 170°C. Preliminarni hidrotermalni tretman se izvodi tokom vremena u opsegu od 10 minuta do 3 sata, poželjno od 15 minuta do 3 sata, a najpoželjnije od 20 minuta do 60 minuta. Preliminarni hidrotermalni tretman uglavnom rastvori hemicelulozne komponente lignocelulozne sirovine, koje mogu biti podvrgnute termičkoj degradaciji na višim temperaturama, a tečnost koja sadrži vodu i u vodi rastvorljive polimere i oligomere ksiloze i opciono druge hemicelulozno-izvedene šećere se na taj način odvaja od čvrste lignocelulozne sirovine.

[0047] Prethodno tretirana lignocelulozna sirovina je podvrgnuta enzimskoj hidrolizi radi hidrolize polimernih i oligomernih šećera u monomerne šećere, koji sadrže glukozu i ksilozu. Enzimska hidroliza obuhvata kontaktiranje prethodno tretirane lignocelulozne sirovine u obliku kaše sa enzimom ili enzimskom kompozicijom pod uslovima koji promovišu enzimsku aktivnost. Pri tome, kaša prethodno tretirane lignocelulozne sirovine je obezbeđena mešanjem prethodno tretirane lignocelulozne sirovine sa tečnošću koja sadrži vodu da bi imala suvu materiju, poželjno između 10% i 25%; po izboru, kada se primenjuje preliminarni hidrotermalni tretman, bar deo tečnosti koji sadrži vodu i rastvorene polimere i oligomere ksiloze tu proizvedene, može se takođe koristiti. Enzimatska hidroliza se obično izvodi na pH između 4.5 i 5.0 na temperaturi između 45°C i 55°C, i tokom vremena hidrolize od 24 sata do 72 sata, uz brzo mešanje.

[0048] Enzimska hidroliza može se izvesti u jednom ili više koraka. Poželjno, enzimatska hidroliza se izvodi u dva koraka u odvojenim posudama za hidrolizu. U prvim koracima hidrolize, koji se izvode u periodu od 12sati do 30sati u prvoj posudi, delimična hidroliza prethodno tretirane lignocelulozne sirovine se dobija, da bi se dobila likvefakcija prethodno tretirane lignocelulozne sirovine, na taj način dobijajuči delimično hidrolizovanu smešu koja ima viskozitet niži od početne kaše. Delimično hidrolizovana smeša se zatim premešta u drugu posudu za hidrolizu, pri čemu se drugi korak hidrolize nastavlja tokom vremena između 12 sati i 60 sati da se dobije hidrolizat lignocelulozne sirovine, koji sadrži vodu, zaostalu prethodno tretiranu lignoceluloznu sirovinu nerastvorljivu u vodi i šećere rastvorljive u vodi koji sadrže glukozu i ksilozu. Hidrolizat lignocelulozne sirovine može dalje da sadrži druge C6 i C5 monomerne šećere rastvorljive u vodi, obično u koncentraciji nižoj od glukoze i ksiloze, redom.

[0049] Još poželjnije, enzimska hidroliza se izvodi u skladu sa učenjem iz WO2010113130,

[0050] Najmanje deo zaostale prethodno tretirane lignocelulozne sirovine nerastorljive u vodi može se ukloniti iz hidrolizata lignocelulozne sirovine. Razdvajanje preostalih prethodno tretiranih lignoceluloznih sirovina nerastvorljivih u vodi može se dobiti na primer dekantovanjem, centrifugiranjem, ili presovanjem hidrolizata lignocelulozne sirovine, ili njihovim kombinacijama. Ipak, čak i ako prisustvo preostalih prethodno tretiranih lignoceluloznih sirovina nerastvorljivih u vodi u opisanom propagacionom procesu može dovesti do problema mešanja, neki monomerni šećeri rastvorljivi u vodi potopljeni u preostalim čvrstim supstancama mogu se povući iz hidrolizata lignocelulozne sirovine u koraku razdvajanja i izgubiti, tako da se u poželjnom tehničkom rešenju ne vrši uklanjanje čvrstih supstanci a hidrolizat lignocelulozne sirovine je kaša koja sadrži prethodno tretiranu lignoceluloznu sirovinu nerastvorljivu u vodi.

[0051] Gore opisan proces ili procesi za izvođenje hidrolizata lignocelulozne sirovine iz lignocelulozne sirovine su primeri i poželjna tehnička rešenja za obezbeđivanje hidrolizata lignocelulozne sirovine koji se koristi kao glavni izvor ugljenika za propagaciju kvasca prema procesu stavljenom na uvid javnosti, i to podrazumeva se da oni nisu predviđeni da na bilo koji način ograniče obim pronalaska.

[0052] Hidrolizat lignocelulozne sirovine može imati suvu materiju između 5% i 30%, poželjno između 10% i 20%.

[0053] Hidrolizat lignocelulozne sirovine ima koncentraciju glukoze koja može biti u opsegu od 20 g/kg do 100 g/kg hidrolizata lignocelulozne sirovine na vlažnoj osnovi, poželjno od 30 g/kg do 70 g/ kg i najpoželjnije od 40 g/kg do 50 g/kg.

[0054] Hidrolizat lignocelulozne sirovine ima koncentraciju ksiloze koja može biti u opsegu od 10 g/ kg do 40 g/kg hidrolizata lignocelulozne sirovine na vlažnoj osnovi, poželjno od 15 g/kg do 30 g/ kg, i najpoželjne od 20 g/kg do 25 g/kg.

[0055] Hidrolizat lignocelulozne sirovine može dalje da sadrži inhibitorna jedinjenja odabrana sa liste od sirćetne kiseline, mravlje kiseline, furfurala i hidroksimetil furfurala (5-HMF), koji se formiraju u prethodnom tretmanu i koracima ili procesima hidrolize, i inhibiraju rast kvasca, uzrokujući bar odlaganje brzine rasta.

[0056] Naročito, sirćetna kiselina može imati koncentraciju koja je u opsegu od 2 g/kg do 7 g/kg hidrolizata lignocelulozne sirovine na vlažnoj osnovi.

[0057] Hidrolizat lignocelulozne sirovine može dalje da sadrži biološke kontaminante, što se obično dešava pri radu na industrijskom nivou. Biološki kontaminanti su mikrobni organizmi različiti od kvasca koji se propagira prema procesu stavljenom na uvid javnosti, i čije prisustvo je uopšte štetno za prinos procesa stavljenog na uvid javnosti, trošeći deo monomernih šećera koji su potpuno dostupni za rast željenih kvasac. Biološki kontaminanti mogu da sadrže bakterije i gljivice, kao i kvasce različite od željenog kvasca koji se propagira, kao što su kvasci divljih vrsta. Bakterije mlečne kiseline bakterije, posebno Lactobacillus vrste, su primarni bakterijski kontaminanti. Koncentracije mlečne kiseline fermentacionih smeša obično se uzimaju kao mera stepena kontaminacije. Biološka kontaminacija je kontrolisana sterilizacijom hidrolizata lignocelulozne sirovine, kultivacionog i fermentacionog medijuma, i opreme uključene u proces, koja se može dobiti dodavanjem antibakterijskih agenasa, kao što su antibiotici ili drugi aseptički agensi, ili postupcima sterilizacije, kao što je pasterizacija, primenom fizičkih agenasa, uključujući, između ostalih, toplotu, svetlost i zračenje, pre, između ili tokom trajanja fermentacije/propagacije. Pod "sterilizacijom" se ovde smatra smanjenje gustine bioloških kontaminanata za faktor od najmanje 100. Primena antibakterijskih agenasa i postupaka sterilizacije, koji uvode dodatne troškove, se poželjno izbegava u procesu stavljenom na uvid javnosti, istovremeno održavajući rast bioloških kontaminanata na razumno niskom nivou.

[0058] Poželjno, hidrolizat lignocelulozne sirovine se ne podvrgava bilo kakvom koraku ili postupku sterilizacije, što bi bilo teško i skupo da se izvede na industrijskom nivou.

[0059] Poželjno, antibakterijski agensi se ne koriste u procesu stavljenom na uvid javnosti, niti se dodaju u hidrolizat lignocelulozne sirovine pre procesa stavljenog na uvid javnosti.

[0060] U procesu stavljenom na uvid javnosti, kvasac se propagira u sekvencijalnim propagacionim ciklusima koji su ovde označeni sa Pn, pri čemu n je veće ili jednako 1, na određenom kultivacionom medijumu koji sadrži različite alikvote hidrolizata lignocelulozne sirovine. Propagacioni proces stavljen na uvid javnosti sadrži najmanje dva ciklusa propagacija. Da bi se smanjio trošak početnog kvasca u celom procesu, poželjno je da ciklusa propagacije bude najmanje tri, poželjnije najmanje pet, a najpoželjnije najmanje sedam. Čak i ako ne postoji teoretska granica, veruje se da se ciklus propagacijei mogu ponoviti do dvadeset puta bez menjanja sposobnosti kvasca da fermentiše i glukozu i ksilozu.

[0061] Poželjno, svaki ciklus propagacije se izvodi u šaržnom režimu, pri čemu hidrolizat lignocelulozne sirovine se dodaje pre početka ciklusa propagacije, ili na početku ciklusa propagacije.

[0062] U prvom propagacionom ciklusu, prva količina kvasca je u kontaktu sa prvim kultivacionim medijum i održava se pod uslovima koji promovišu propagaciju kvasca da proizvede prvi propagirani kvasac. U svakom sledećem ciklusu Pnpropagacije, deo kvasca propagiranog u prethodnom propagacionom ciklusu, koji je poželjno neposredno prethodni ciklus Pn-1propagacije, se koristi kao inokulum za tekući ciklus Pnpropagacije. Na taj način, pogodna količina prethodno propagiranog kvasca je u kontaktu sa Pnkultivacionim medijum i omogućava da se propagira da se proizvede Pnpropagirani kvasac. U svim ciklusima Pnpropagacije, deo ugljenika šećera može da se pretvori u proizvod fermentacije od strane ćelija kvasca, u zavisnosti od propagacionih uslova razmnožavanja. Etanol je poželjan proizvod fermentacije.

[0063] Prvi ciklus propagacije ima prepoznatljive karakteristike u odnosu na sve sledeće cikluse propagacije. Naime, u prvom ciklusu propagacije, početni kvasac se koristi. Kada je početni kvasac u kontaktu sa prvim kultivacionim medijumom, unos šećera kvascem se u početku ne dešava značajno. Ovaj period se naziva lag faza i može se smatrati periodom prilagođavanja kvasaca hidrolizatu lignocelulozne sirovine, pri čemu je rast kvasca zanemarljiv. Kvasac koji se koristi u sledećim ciklusima Pnpropagacije, gde je n veći od 1, je kvasac propagiran na hidrognozatu lignocelulozne sirovine, čime se odgovarajuća lag faza Pnznačajno smanjuje u odnosu na lag fazu prvog ciklusa propagacije.

[0064] Brzina unosa šećera je važan parametar procesa stavljenog na uvid javnosti, posebno u slučaju da hidrolizat lignocelulozne sirovine sadrži nešto bioloških kontaminanta i nije korišćena sterilizacija i antibakterijski agensi, jer se u tim uslovima povećava konkurentski rast bioloških kontaminanti. Unos glukoze kvascem omiljen je u odnosu na unos ksiloze, pa će koncentracija glukoze u medijumu za propagaciju početi da opada, dok se unos ksiloze neće znatno nastaviti dok se koncentracija glukoze ne smanji ispod određene kritične vrednosti. Kako se afinitet kvasca prema preostalim šećerima u kultivacionom medijumu smanjuje, ukupna stopa unosa šećera kvascem vremenom će se smanjivati, čineći konkurentan rast bioloških kontaminanata povoljnim. Time, u procesu stavljenom na uvid javnosti, svi ciklusi Pnpropagacije, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1, se prolongiraju tokom vremena dovoljno da se konzumira najmanje 50% glukoze sadržane u početnom medijumu za propagaciju, i manje od 20% ksiloze sadržane u početnom medijumu za propagaciju. Nameravano je da je potrošnja glukoze i ksiloze ukupna potrošnja tokom propagacionog koraka, a može se verifikovati merenjem odgovarajuće koncentracije šećera u medijumu za propagaciju. Pri tome, ukupna potrošnja šećera koja se javlja u ciklusu Pnpropagacije uključuje i unos šećera biološkim kontaminantima, koji je nameravan da se minimizuje u procesu stavljenom na uvid javnosti, i šećer eventualno konvertovan u proizvod fermentacije. Da bi se poboljšao prinos procesa u pogledu proizvedene biomase kvasca, poželjno ciklusi propagacije se izvode za vreme propagacije dovoljno da se potroši najmanje 70% glukoze početnog medijuma za propagaciju, a najpoželjnije najmanje 80%. u isto vreme, da bi se izbeglo da ukupni unos šećera dostigne kritičnu vrednost za kompetativni rast bioloških kontaminanta, poželjno ciklus propagacije Pn se prolongira za vreme propagacije dovoljno da se konzumira manje od 10% ksiloze u početnom kultivacionom medijumu, najpoželjnije manje od 5%. Primećeno je da svaki ciklus propagacije procesa stavljenog na uvid javnosti može biti karakterisan specifičnom potrošnjom glukoze i ksiloze i vremom propagacije, pod uslovom da su ovi parametri unutar opsega stavljenih na uvid javnosti. Takođe je primećeno da, dok je ukupna količina ksiloze konzumirana u propagacionom koraku poželjno veća od 0, u nekim slučajevima ksiloza se neće značajno konzumirati barem u prvom propagacionom ciklusu. Naime, prvi ciklus propagacije tipično zahteva vreme propagacije koje je više od vremena propagacije u sledećim ciklusima propagacije, usled duže lag faze istih. Prvi ciklus propagacije može se izvesti za vreme propagacije koje je manje od 30 sati, ali poželjno manje od 25 sati, poželjnije manje od 20 sati, i najpoželjnije manje od 16 sati. Vreme propagacije sledećih Pnciklusa propagacije pri čemu n je ceo broj veći od 1, je poželjno manje od 70%, poželjnije manje od 50%, i još poželjnije manje od 40% prvog vremena propagacije.

[0065] Čak ako više od jedne posude za propagaciju se može koristiti, poželjno svi ciklus propagacijei izvode u jednoj posudi za propagaciju. Da bi se minimizovali troškovi, posuda ili posude za propagaciju po mogućnosti nisu podvrgnute nikakvoj sterilizaciji i/ili čišćenju između i/ili tokom ciklusa propagacije.

[0066] Da bi se ograničio efekat konkurentskog rasta bioloških kontaminanata, hidrolizat lignocelulozne sirovine je poželjno održavati na temperaturi od 45°C do 55°C pre upotrebe u procesu stavljenom na uvid javnosti, a najpoželjnije na temperaturi enzimske hidrolize ili završnog koraka enzimske hidrolize. Na ovoj temperaturi, aktivnost bioloških kontaminanata se značajno smanjuje.

[0067] U svakom ciklusu Pnpropagacije, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1, deo Pnhidrolizata lignocelulozne sirovine se koristi da se formira kultivacioni medijum. Temperatura dela Pnhidrolizata lignocelulozne sirovine se redukuje do temperature propagacije ciklusa Pnpropagacije, koja je poželjno u opsegu od 28°C do 35°C. Razmenjivači toplote mogu se koristiti da se ohladi deo Pnhidrolizata lignocelulozne sirovine do temperature propagacije u posudi za propagaciju ili pre ulaska u posudu za propagaciju.

[0068] Voda ili tečnost koja sadrži vodu, i opciono ograničene količine dodatnih izvora ugljenika različitih od hidrolizata lignocelulozne sirovine mogu se koristiti da se dostigne željena suva materija. Jedna od prednosti koju nudi proces stavljen na uvid javnosti je mogućnost da se izvodi u suvoj materiji koja je veća od ostalih poznatih procesa koji koriste lignocelulozni hidrolizat kao glavni izvor ugljenika. Suva materija kultivacionog medijuma je poželjno manja od 30%, jer bi je bilo teško mešati, i poželjno je veća od 5%, poželjnije veća od 10%, još poželjnije veća od 15%, najpoželjnije veća da 20%. Voda ili tečnost koja sadrži vodu mogu se dodati na temperaturi koja je niža od temperature propagacije da se ohladi deo Pnhidrolizata lignocelulozne sirovine.

[0069] Prema tome, gustina bioloških kontaminanata u početnom Pnkultivacionom medijumu može se držati na razumnom nivou, koji može biti u opsegu 10<0>CFU/ml do 10<6>CFU/ml, poželjno od 10<1>CFU/ml do 10<5>CFU/ml, i najpoželjnije od 10<2>CFU/ml do 10<3>CFU/ml početnog Pnkultivacionog medijuma, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1, a CFU = jedinica(e) koje formiraju koloniju (colony forming unit).

[0070] Kultivacioni medijum Pn, pri čemu je n ceo broj jednak ili veći od 1, može dalje da sadrži izvor azota, obično ureeu, koja je jeftin hranljivi izvor kvasca, ali je poželjno bez dodatih vitamina i/ili elemenata u tragovima, koji se obično koriste u laboratorijskim razmerama kao suplementi za rast ali su izuzetno skupi. Drugim rečima, poželjno u hidrolizat lignocelulozne sirovine i kultivacioni medijum ne dodaju se vitamini i/ili elementi u tragovima tokom procesa ili u koracima pre procesa.

[0071] Poželjno, pH kultivacionog medijuma Pnse podešava na vrednost od 5.0 do 5.5, na primer dodavanjem na primer pogodne količine baze (NaOH rastvora). Ukoliko je potrebno da se održi pH u željenom opsegu, dodatni alikvoti baze mogu se dodati tokom koraka propagacije.

[0072] U prvom propagacionom ciklusu, kvasac se može dodati u prvi kultivacioni medijum, ili u komponenete korišćene da se formira prvi kultivacioni medijum. U jednom tehničkom rešenju, kvasac se dodaje u prvi deo hidrolizata lignocelulozne sirovine korišćene da se formira prvi medijum za propagaciju. Količina kvasca koja je u kontaktu sa prvim kultivacionim medijumom će varirati u skladu sa ukupnom zapreminom prvog medijuma za propagaciju. Poželjno, u prvom propagacionom ciklusu dodata je količina kvasca da se dobije početna gustina kvasca koja je između 1 x 10<6>i 1x 10<8>ćelija kvasca po miligramu prvog kultivacionog medijuma na vlažnoj osnovi.

[0073] U svim propagacionim ciklusima Pn, pri čemu je n ceo broj jednak ili veći od 1, propagacija se poželjno dešava u aerobnim uslovima kako bi se poboljšala količina proizvedenog propagiranog kvasca. Aerobni uslovi su karakterisani srednjom saturacijom kiselonikom u medijumu za propagacija koja je veća od 10%. Saturacija kiseonikom je odnos koncentracije rastvorenog kiseonika (O2) odnos koncentracije rastvorenog kiseonika u kultivacionom medijumu i maksimalne količine kiseonika koji će se rastvoriti u kultivacionom medijumu na toj temperaturi pod suvim pritiskom pod stabilnom ravnotežom. Pri tome, protok kiseonika, vazduha ili druge gasne smeše koja sadrži kiseonik se ubacuje u medijum za propagaciju, poželjno pri srednjoj brzini protoka između 50 vvm i 200 vvm. Da bi se pospešila difuzija kiseonika u medijumu za propagaciju, agitacija ili mešanje mogu se takođe obezbediti medijumu za propagaciju. Aerobni uslovi se mogu održavati tokom najmanje dela koraka propagacije. U nekim slučajevima, specifični ciklički intervali aerobnih/anaerobnih uslova mogu se postići uticajem na mešanje kultivacionog medijuma.

[0074] Na kraju Pnciklusa propagacije, pri čemu je n ceo broj jednak ili veći od 1, dobija se Pnnaseljeni bujon koji sadrži vodu i prvi propagirani kvasac. Naseljeni bujon može dalje da sadrži proizvode fermentacije, tj. etanol, koji su dobijeni fermentacijskom aktivnošću kvasca, šećerima rastvorljivim u vodi koje nije konzumirao kvasac i preostalom prethodno tretiranom lignoceluloznom sirovinom nerastvorljivom u vodi. U poželjnom tehničkom rešenju, hidrolizat lignocelulozne sirovine dalje sadrži preostale enzime iz koraka hidrolize, čiji je deo još uvek aktivan. Čak i ako uslovi propagacije nisu optimalni za aktivnost enzima, deo ugljenih hidrata nerastvorljivih u vodi u preostaloj prethodno tretiranoj lignoceluloznoj sirovini nerastvorljivoj u vodi može se hidrolizovati u dodatne šećere rastvorljive u vodi koji su stoga dostupni kvascu. U tom slučaju, ukupna količina glukoze i ksiloze koju će kvasac konzumirati uzeće u obzir dodatne šećere rastvorljive u vodi.

[0075] U svim propagacionim ciklusima Pn, biće proizvedena količina propagiranog kvasca koja može biti od 5 do 15 puta odgovarajuće početne količine kvasca. Isti poželjni opseg važi i na gustinu ćelija kvasca.

[0076] Poželjno, u Pnciklusu propagacije konačna gustina kvasca je između 1 x 10<7>i 1x 10<9>ćelija kvasca po miligramu prvog kultivacionog medijuma na vlažnoj osnovi.

[0077] U sledećim ciklusima Pn propagacije, pri čemu je n ceo broj veći od 1, Pn-1naseljeni bujon se zatim razdvaja u najmanje dva dela, naime uklonjeni deo i preostali deo Pn-1naseljenog bujona, pri čemu svaki deo sadrži nešto dela prethodno propagiranog kvasca Pn-1. Poželjno razdvajanje sadrži podelu Pn-1naseljenog bujona na Pn-1preostali deo i Pn-1uklonjeni deo, pri čemu dva dela imaju isti sastav. U najpoželjnijem tehničkom rešenju, uklonjeni deo Pn-1naseljenog bujona se uklanja iz posude za propagaciju, a Pn-1preostali deo ostaje u posudi za propagaciju za Pnciklus propagacije. U nekim tehničkim rešenjeima, razdvajanje može da obuhvata selektivno razdvajanje specifičnih komponeni naseljenog bujona, na primer pomoću filtracije ili centrifugiranja, da se proizvedu dva dela koja imaju različit sastav. Na taj način, u nekim slučajevima dva dela mogu biti karakterisana da imaju različitu gustinu naseljenog kvasca. U nekim tehničkim rešenjeima, dva dela mogu da imaju različit sadržaj zaostale prethodno tretirane lignocelulozne sirovine nerastvorljive u vodi.

[0078] Nakon prvog ciklusa propagacije (Pn=1), proces podleže drugom ciklusu propagacije (Pn=2) kao što je opisano iznad za cikluse propagacije gde je n ceo broj veći od 1.

[0079] Količina preostalog dela Pn-1je poželjno manja od 50% Pn-1naseljenog bujona po masi na vlažnoj osnovi, poželjnije manje od 40%, i najpoželjnije manje od 25%.

[0080] U svakom ciklusu Pnpropagacije nakon prve propagacije P1, preostali deo iz predhodnog ciklusa propagacije se koristi kao inokulum kvasca. Poželjno, u ciklusu Pn propagacije preostali deo neposrednog prethodnog ciklusa propagacije Pn-1se koristi. Time, preostali deo iz prethodnog ciklusa propagacije se kontaktira kultivacionim medijumom koji sadrži odgovarajući deo Pnhidrolizata lignocelulozne sirovine. U poželjnom tehničkom rešenju, Pnalikvot hidrolizata lignocelulozne sirovine se dodaje u posudu za propagaciju koja sadrži preostali deo iz Pn-

1ciklusa propagacije da se formira Pnkultivacioni medijum. Gustina bioloških kontaminanata u zaostalom delu koji je korišćen u Pnciklusu propagacije može biti veća od gustine bioloških kontaminanata u hidrolizatu lignocelulozne sirovine, usled propagacije kompetetivnih kontaminanata. Dodavanje pogodnog dela Pnhidrolizata lignocelulozne sirovine će u ovom slučaju razblažiti gustinu bioloških kontaminanata u početnom Pn medijumu za propagaciju do željene vrednosti.

[0081] Poželjno, količina zaostalog dela iz prethodnog ciklusa propagacije i količina Pndela hidrolizata lignocelulozne sirovine korišćeni da se formira Pnkultivacioni medijum se biraju da imaju početnu gustinu kvasca u Pnciklusu propagacije koja je veća od početne gustine kvasca u prvom ciklusu propagacije.

[0082] Još poželjnije, količina preostalog dela iz prethodnog ciklusa propagacije i količina Pn dela hidrolizata lignocelulozne sirovine korišćeni da se formira Pnkultivacioni medijum se biraju da imaju početnu gustinu kvasca u Pnciklusu propagacije koja je veća od između 1 x 10<6>i 1x 10<8>ćelija kvasca po miligramu Pnkultivacionog medijuma na vlažnoj osnovi, pri čemu je n ceo broj veći od 1.

[0083] Uklonjeni delovi naseljenih bujona, koji sadrže kvasac propagiran u različitim ciklusima propagacije mogu se zatim koristiti da fermentišu fermentacioni medijum koji sadrži šećere rastvorljive u vodi da se proizvede proizvod fermentacija. Poželjno, proizvod fermentacije je etanol.

[0084] U poželjnom tehničkom rešenju, jedan ili više uklonjenih delova naseljenih bujona se kotaktira sa fermentacionim medijumom koji sadrži dalji deo hidrolizata lignocelulozne sirovine u posudi za fermentaciju. Hidrolizat lignocelulozne sirovine se koristi kao izvor ugljenika da se formira fermentacioni medijum, na takav način da je propagirani kvasac već prilagođen fermentacionom medijumu. Ostatak suve ksiloze opciono glukoze sadržani u uklonjenom delu ili delovima naseljenih bujona se takođe fermentišu u procesu, da se poveća ukupni prinos fermentacije. Fermentacija proizvodi fermentacioni bujon, koji sadrži proizvod fermentacije, koji se može odvojiti i ponovo dobiti.

Eksperimentalni deo

Pripremanje hidrolizata lignocelulozne sirovine

[0085] Pšenična slama je izabrana za dokazivanje procesa stavljenog na uvid javnosti.

[0086] Prvo, sirovina je podvrgnuta predtretmanskom procesu, primenjivanjem hidrotermalne obrade na temperaturi od 158°C tokom 65 minuta, sa prvom solubizacijom sirovog materijala. Proces je stvorio prethodno tretiranu sirovinsku kaša, koja je razdvojena na tečni deo, koji uglavnom sadrži ksilooligomere, i čvrsti deo pomoću prese. Čvrsti deo je podvrgnut hidrotermalnoj obradi vodenom parom na 204°C tokom 4 minuta, praćeno eksplozijom u vodenoj pari, da bi se dobila čvrsta prethodno tretirana lignocelulozna sirovina.

[0087] Čvrsta prethodno tretirana lignocelulozna sirovina i tečni deo koji sadrži ksilooligomere su pomešani u bioreaktoru, i voda je dodata da se dobije prethodno tretirana lignocelulozna sirovinska kaša koja ima sadržaj suve materije od 15% po masi, pH je podešen do 5,0±0,2 sa dodavanjem NaOH, zatim je prethodno tretirana lignocelulozna sirovinska kaša podvrgnuta enzimskoj hidrolizi.

[0088] Komercijalni enzimski koktel CTec3 od Novozymes, sposoban da hidrolizuje i C6 i C5 šećere, je dodat, koji odgovara dozi od 7% proteina mg po gramu glukana u prethodno tretiranoj lignoceluloznoj sirovini i kaša je hidrolizovana na 50°C pod neprekidnim mešanjem tokom 72 sata.

[0089] Rezultujući hidrolizat lignocelulozne sirovine je kaša, koja ima suvu materiju od 15% po masi, koja sadrži tečnu frakciju i prostalu prethodno tretiranu lignoceluloznu sirovinu nerastvorljivu u vodi. Sastav hidrolizata je prikazan u Tabeli 1. U tabeli, preostala prethodno tretirana lignocelulozna sirovina nerastvorljiva u vodi se odvaja na svoje komponente (nerastvorljive glukane, nerastvorljive ksilane i lignin i druge nerastvorljive materije). Sirćetna kiselina, mravlja kiselina, furfural, hidroksimetil furfural su inhibitorna jedinjenja propagacije kvasca.

[0090] Mlečna kiselina je proizvedena bakterijskom kontaminacijom i zato se smatra markerom prisustva bakterija. Time, određena biološka kontaminacija je prisutna u hidrolizatu lignocelulozne sirovine. Hidrolizat lignocelulozne sirovine je održavan na temperaturi od 50°C do upotrebe u sledećim eksperimentima propagacije. Nije uveden antibiotik.

Tabela 1. Kompozicija hidolizata lignocelulozne sirovine na vlažnoj osnovi

Eksperimenti propagacije

[0091] Proces stavljen na uvid javnosti je dokazan izvođenjem tri uzastopna ciklus propagacije, u skladu postupkom koji se može implementirati na industrijskom nivou. Nije izvršena sterilizacija između ciklusa.

[0092] Sastav kultivacionog medijuma i naseljenog bujona su prikazani u tabeli 2. Samo jedinjenja rastvorljiva u vodi relevantna za proces su navedena u tabeli. Druga jedinjenja rastvorljiva u vodi i čvrsta jedinjenja nisu navedena.

[0093] U prvom ciklusu propagacije, prvi kultivacioni medijum je formiran uvođenjem zapremine od 1.21 vruće kaše hidrolizata lignocelulozne sirovine u bioreaktor i dopunjavanjem sa rastvorom uree sa 1.5 g/l. pH je podešena na 5,2±0,1 sa NaOH kontrolom. Nisu korišćeni vitamini i drugi nutrijenti. Kultivacioni medijum je ohlađen na 32°C pre ubacivanja kvasca.

[0094] Propagacija u svakom ciklusu je izvedena pod agitacijom pri 300 ob/min u šaržnoj konfiguraciji, u aerobnim uslovima protoka vazduha od 1 VVh. VVh odgovara zapremini gasa koja teče po zapremini kultivacionog medijuma na sat.

[0095] Gustina ćelija kvasca je određena ćelijskim brojem (Neubauerova komora za brojanje ćelija) i sastav kultivacionog medijuma je analiziran sa HPLC da se odredi koncentracija za zaostalu glukozu i ksilozu i kritična jedinjenja za propagaciju kvasca. Oba merenja su izvedena na početku i na kraju svakog ciklusa propagacije.

[0096] U prvom ciklusu propagacije, komercijalni genetski modifikovan kvasac CelluX™2 koji distribuira Leaf Technologies, sposoban da fermentiše glukozu i ksilozu, je ubačen u kultivacioni medijum pri početnoj gustini kvasca od 1,3 x 10<7>ćelija kvasca po miligramu kultivacionog medijuma.

[0097] Prvi ciklus propagacije je izveden za vreme propagacije od 14 sati uzimajući u obzir početnu lag fazu. Koncentracija ćelije kvasca od 1,5 x 10<8>ćelija kvasca po miligramima je postignuta u prvom naseljenom bujonu. Performanse rasta su procenjene izračunavanjem faktora rasta, koji je odnos između koncentracije ćelije kvasca na kraju i na početku propagacije. Faktor rasta od oko 10 je dobijen u prvom ciklusu propagacije.

[0098] Oko 76% početne glukoze i manje od 10% početne ksiloze u početnom prvom medijumu za propagaciju je konzumirano. Koncentracija mlečne kiseline se nije značajno povećala, ukazujući da je propagacija bakterijskih kontaminanata bila na razumnim nivoima. Određena količina etanola je takođe proizvedena.

[0099] Na kraju prvog ciklusa propagacije, deo prvog naseljenog bujona je uklonjen iz bioreaktora, a preostali deo od oko 240 ml prvog naseljenog bujona je ostavljen za drugi ciklus propagacije.

[0100] U drugom ciklusu propagacije, bioreaktor je ponovo napunjen sa drugim delom hidrolizata lignocelulozne sirovine, koji je ohlađen na oko 32°C pre nego što je uveden, i dopunjen sa ureeom. Drugi kultivacioni medijum je imao zapreminu od 1.21 kao i u prvom toku propagacije. Na taj način, drugi deo hidrolizata lignocelulozne sirovine predstavlja oko 80% drugog kultivacionog medijuma a preostali deo prvog naseljenog bujona predstavlja oko 20% drugog kultivacionog medijuma (odnos svežeg hidrolizata prema zaostalom hidrolizatu 4:1).

[0101] Sadržaj glukoze u početnom drugom kultivacionom medijumu je bio nešto manji nego u prvom kultivacionom medijumu, jer je preostali deo prvog naseljenog bujona bio osiromašen glukozom. Štaviše, nešto etanola je bilo prisutno u drugom kultivacionom medijumu, čak i ako ne postoji problematični nivo za propagaciju. Pri tome se druga propagacija dogodila u prisustvu početne koncentracija etanola u drugom medijumu za propagaciju. Početna koncentracija kvasca u drugom ciklusu propagacije je bila 5,3 x 10<7>. Mlečna kiselina je bila prisutna u niskoj koncentraciji, slično prvom kultivacionom medijumu.

[0102] Druga propagacija je izvedena tokom 6 sati. Koncentracija ćelija kvasca od 1,7 x 10<8>ćelija kvasca po miligramima je postignuta u drugom naseljenom kultivacionom medijumu odgovarajući faktoru rasta od oko 3.2.

[0103] Oko 66% početne glukoze i manje od 10% početne ksiloze u početnom drugom medijumu za propagaciju je konzumirano. Ponovo, koncentracija mlečne kiseline nije se značajno povećala, ukazujući da je propagacija bakterijskih kontaminanata bila na prihvatljivim nivoima, a određena količina etanol je takođe proizvedena.

[0104] Nakon što je ciklus 2 propagacije završen, treći ciklus je izveden u skladu sa istim postupkom kao ciklus 2 propagacije (treće vreme propagacije 6 sati).

[0105] Početna koncentracija ćelija kvasca je bila 4.2 x 10<7>a koncentracija ćelija kvasca od 1.3 x 10<8>ćelija kvasca po miligramima je postignuta u trećem naseljenom kultivacionom medijumu odgovarajući faktoru rasta od oko 3.

[0106] Oko 63% početne glukoze i manje od 10% početne ksiloze u početnom trećem medijumu za propagacija je konzumirano, sa malo mlečne kiseline proizvedene.

Eksperimenti fermentacije

[0107] Uklonjeni delovi naseljenih bujona su korišćeni kao inokulum za fermentaciju različitih alikvota hidrolizata lignocelulozne sirovine.

[0108] U svakom fermentacionom koraku, alikvot od 960 ml hidrolizata lignocelulozne sirovine je uveden u posudu za fermentaciju, ohlađen na oko 32°C, a zatim zapremina od 240 ml svakog uklonjenog dela naseljenog bujona je dodata da se formira odgovarajući fermentacioni medijum. pH je podešena na 5±0,1 sa rastvorom NaOH i dopunjena sa rastvorom uree od 1.0 g/l. Na taj način, u svakom fermentacionom koraku, zapremina odgovarajućeg uklonjenog dela korišćenog kao inokulum je bila oko 1:5 ukupne zapremine fermentacionog medijuma. Fermentacija je izvođena tokom 48 sati u odsustvu protoka vazduha, u šaržnoj konfiguraciji, održavanjem temperature od 32°C pod agitacijom pri 300 ob/min. U fermentaciji, enzimska hidroliza zaostale prethodno tretirane lignocelulozne sirovine nerastvorljive u vodi je nastavljena sa enzimima sadržanim u hidrolizatu lignocelulozne sirovine i nešto dodatnih šećera je omogućeno kvascu.

[0109] Sastavi fermentacionog medijuma i fermentacionih bujona su mereni na početku (t0, fermentacioni medijum) i na kraju (t48, fermentacioni bujon) fermentacionih koraka i, navedeni su u Tabeli 3. Primećeno je da svi fermentacioni medijumi imali nešto etanola iz odgovarajućeg propagacionog bujona razblaženog sa svežim hidrolizatom lignocelulozne sirovine; koncentracija etanola bila je dovoljno niska da ne bi stvorila probleme fermentacionim koracima. U svim fermentacionim koracima, bakterijska kontaminacija je bila vrlo mala ili zanemarljiva, o čemu svedoči koncentracija mlečne kiseline koja je bila stabilna.

[0110] Gotovo svi monomerni šećeri u fermentacionom medijumu konzumirali su propagirani kvasac, pokazujući da je genetski modifikovani kvasac zadržao svoju sposobnost fermentacije i glukoze i ksiloze tokom više ciklusa propagacije/fermentacije.

Tabela 3. Sastav početnog fermentacionog medijuma (t0) i fermentacionih bujona (t48) ciklusa propagacije.

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Proces za propagaciju kvasca sposobnog da fermentiše glukozu i ksilozu hidrolizata lignocelulozne sirovine, pri čemu navedeni proces oduhvata:

propagaciju kvasca tokom najmanje prvog ciklusa propagacije i drugog ciklusa propagacije,

pri čemu prvi ciklus propagacije (Pn, gde n=1) obuhvata korake:

a. kontaktiranje kvasca pri početnoj gustini kvasca sa prvim kultivacionim medijumom koji sadrži prvi deo hidrolizata lignocelulozne sirovine,

b. omogućavanje kvascu da se propagira da se stvori prvi naseljeni bujon koji sadrži vodu i prvi propagirani kvasac, pri čemu najmanje 50% glukoze i manje od 20% ksiloze u prvom kultivacionom medijumu se konzumira u prvom ciklusu propagacije,

drugi ciklus propagacije (P2, n=2) obuhvata korake:

a. razdvajanje prvog naseljenog bujona na barem prvi uklonjeni deo i prvi preostali deo, pri čemu i prvi preostali deo i prvi uklonjeni deo sadrže nešto prvog propagiranog kvasca, b. kontaktiranje prvog preostalog dela sa drugim kultivacionim medijumom koji sadrži drugi deo hidrolizata lignocelulozne sirovine, i

c. omogućavanje kvascu da se propagira da se stvori drugi naseljeni bujon koji sadrži vodu i drugi propagirani kvasac, pri čemu najmanje 50% glukoze i manje od 20% ksiloze u drugom kultivacionom medijumu se konzumira u drugom ciklusu propagacije.

2. Proces prema patentnom zahtevu 1, koji dalje obuhvata sledeće cikluse Pnpropagacije, gde n je ceo broj veći od 2 i jedan je (1) veći od broja ciklusa neposrednog prethodnog ciklusa (n-1), pri čemu svaki ciklus Pnpropagacije sadrži korake:

a. razdvajanje Pn-1naseljenog bujona u barem Pn-1uklonjeni deo i Pn-1preostali deo, pri čemu i Pn-1preostali deo i Pn-1uklonjeni deo sadrže nešto Pn-1propagiranog kvasca, b. kontaktiranje preostalog dela naseljenog bujona najmanje jednog od prethodnih ciklusa propagacije i Pnkultivacionog medijuma koji sadrži Pndeo hidrolizata lignocelulozne sirovine, i

c. omogućavanje kvascu da se propagira da se stvori Pnnaseljeni bujon, pri čemu najmanje 50% glukoze i manje od 20% ksiloze u Pnkultivacionim medijumu se konzumira u Pnciklusu propagacije.

3. Proces prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu korak omogućavanja kvasca da se propagira u ciklusima Pnpropagacije se izvodi u šaržnom režimu, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1.

4. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu početna gustina kvasca u prvom ciklusu propagacije je između 1 x 10<6>i 1x 10<8>ćelija kvasca po miligramu prvog kultivacionog medijum na vlažnoj osnovi.

5. Proces prema patentnom zahtevu 4, pri čemu količina Pn-1uklonjenog dela i količina Pndela hidrolizata lignocelulozne sirovine su odabrane da imaju početnu gustinu kvasca u Pnciklusu propagacije između 1 x 10<6>i 1x 10<8>ćelija kvasca po miligramu Pnkultivacionog medijuma na vlažnoj osnovi, pri čemu n je ceo broj veći od 1.

6. Proces prema patentnom zahtevu 5, pri čemu početna gustina kvasca u Pnciklusu propagacije, gde n je ceo broj veći od 1, je veća od početne gustina kvasca u prvom ciklusu propagacije.

7. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva 4 do 6, pri čemu konačna gustina kvasca u Pnciklusu propagacije je u opsegu od 1 x 10<7>do 1x 10<9>ćelija kvasca po miligramu Pnnaseljenog bujona na vlažnoj osnovi, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1.

8. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva 4 do 7, pri čemu vreme propagacije prvog ciklusa propagacije je manje od 30 sati.

9. Proces prema patentnom zahtevu 8, pri čemu vreme propagacije Pnciklusa propagacije je manje od procentualne vrednosti od 70% od prvog vremena propagacije, pri čemu n je ceo broj veći od 1.

10. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu kultivacioni medijum dalje sadrži izvor azota.

11. Proces prema patentnom zahtevu 10, pri čemu vitamini i/ili elementi u tragovima se ne dodaju u proces.

12. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11, pri čemu hidrolizat lignocelulozne sirovine sadrži biološke kontaminante, a gustina bioloških kontaminanta u početnom Pnkultivacionom medijumu je u opsegu od 10<0>CFU/ml do 10<6>CFU/ml, početnog Pnkultivacionog medijuma, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1, a CFU = jedinica(e) koje formiraju koloniju.

13. Proces prema patentnom zahtevu 12, pri čemu hidrolizat lignocelulozne sirovine nije izložen bilo kojoj sterilizaciji.

14. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva 12 do 13, pri čemu antibakterijski agensi se ne dodaju u proces.

15. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 14, pri čemu hidrolizat lignocelulozne sirovine je kaša koja sadrži prethodno tretiranu lignoceluloznu sirovinu nerastvorljivu u vodi.

16. Proces prema patentnom zahtevu 15, pri čemu suva materija Pnkultivacionog medijuma je manja od 30% i veća od procentualne vrednosti od 5%,, pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1.

17. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 16, pri čemu svi ciklusi propagacije se izvode u jednoj posudi za propagaciju.

18. Proces prema patentnom zahtevu 17, pri čemu posuda za propagaciju nije izložena bilo kojoj sterilizaciji i/ili čišćenju između i/ili tokom ciklusa propagacije.

19. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 18, koji dalje obuhvata korake:

a. uvođenje jednog ili više Pnuklonjenih delova i fermentacionog medijuma koji sadrži dalji deo hidrolizata lignoceluloze sirovine u barem posudu za fermentaciju, i

b. omogućavanje kvascu da fermentiše glukozu i ksilozu da se stvori fermentacioni bujon, koji sadrži proizvod fermentacije,

pri čemu n je ceo broj jednak ili veći od 1.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5