RS60220B1 - Postupak za proizvodnju koktela enzima od gljivica iz komine - Google Patents

Postupak za proizvodnju koktela enzima od gljivica iz komine

Info

Publication number
RS60220B1
RS60220B1 RS20200521A RSP20200521A RS60220B1 RS 60220 B1 RS60220 B1 RS 60220B1 RS 20200521 A RS20200521 A RS 20200521A RS P20200521 A RSP20200521 A RS P20200521A RS 60220 B1 RS60220 B1 RS 60220B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
phase
pomace
separated
enzyme
cooling phase
Prior art date
Application number
RS20200521A
Other languages
English (en)
Inventor
Chaabane Fadhel Ben
Etienne Jourdier
Celine Cohen
Bernard Chaussepied
Original Assignee
Ifp Energies Now
Institut National De Recherche Pour Lagriculture Lalimentation Et Lenvironnement
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ifp Energies Now, Institut National De Recherche Pour Lagriculture Lalimentation Et Lenvironnement filed Critical Ifp Energies Now
Publication of RS60220B1 publication Critical patent/RS60220B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01037—Xylan 1,4-beta-xylosidase (3.2.1.37)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na poboljšanje proizvodnje celulolitičkih i/ili hemicelulolitičkih enzima, posebno u okviru proizvodnje etanola polazeći od celuloznih ili lignoceluloznih materijala.
[0002] Ovi poslednji se proizvode od lignocelulozne biomase i, u pogledu korišćenja poljoprivrednog zemljišta za proizvodnju biogoriva, predstavljaju manji problem kao konkurencija namirnicama nego takozvani procesi prve generacije proizvodnje iz šećerne trske, kukuruza, pšenice, repe,...
[0003] Razne tehnoekonomske studije pokazuju da je sniženje cene celulaza jedna od ključnih tačaka procesa za biološku proizvodnju etanola polazeći od lignoceluloznih sirovina.
Trenutno se industrijske celulaze proizvode uglavnom pomoću filamentozne gljivice Trichoderma reesei, zbog njene velike moći izlučivanja. U klasičnim procesima za proizvodnju celulaza, one se izoluju u supernatantu kulture u više faza separacije.
Komina od gljivica (čvrsti deo izolovan nakon filtracije) nije bila cenjena. Ona se smatrala otpadom.
Pored toga, koktel enzima koji proizvode hiperproduktivni sojevi Trichoderma reesei ima slabu aktivnost β-glukozidaze.
[0004] Patenti su predlagali procese za poboljšanje proizvodnog soja na više načina: prekomernom ekspresijom gena (kao patentna prijava EP2082054 vezana za prekomernu ekspresiju β-glukozidaze), ili kloniranjem najefikasnijih β-glukozidaza drugih mikroorganizama (kao patentna prijava WO2013115305 koja opisuje kloniranje gena βglukozidaze aspergilusa kod Trichoderma reesei) ili stvaranje novih efikasnijih gena polazeći od različitih gena β-glukozidaze (kao patentna prijava WO 2010029259 koja opisuje proizvodnju varijanti β-glukozidaze poboljšane aktivnosti putem L-mešanja).
[0005] Takođe, iz patentne prijave WO 11079048 je poznato da u procesu simultane saharifikacije i fermentacije (SSF), povećanje aktivnosti β-ksilozidaze ima povoljan efekat na enzimsku hidrolizu, jer omogućava da se smanji doza upotrebljenih enzima. Ona takođe omogućava hidrolizu alkil ksilozida. Pronalazak predlaže proces za proizvodnju koktela enzima i instalaciju pogodnu za primenu procesa prema pronalasku, gde koktel na značajan, čak i drastičan način omogućava poboljšanje aktivnosti β-glukozidaze i β-ksilozidaze.
[0006] Zapravo, neočekivano je utvrđeno da primena procesa prema pronalasku dovodi do velikog poboljšanja specifične aktivnosti β-glukozidaze, FPaze i β-ksilozidaze. Aktivnost βglukozidaze može biti između 3 i deset puta veća od one izmerene na kraju proizvodnje enzima u normalnim uslovima; a aktivnost β-ksilozidaze 3 puta veća.
Zbog toga je procenjena komina od gljivica razdvojena od enzima tokom klasične faze proizvodnje enzima, i ova komina predstavlja 10-20% mase u odnosu na ukupnu masu kulture.
[0007] Preciznije, pronalazak se odnosi na proces za povećanje udela β-glukozidaze i/ili βksilozidaze u koktelu enzima polazeći od celulolitičkog mikroorganizma koji proizvodi celulaze i/ili hemicelulaze, koji obuhvata:
fazu proizvodnje enzima uz dobijanje medijuma koji sadrži enzime i kominu mikroorganizma, i pomenuta komina se razdvaja ili se ne razdvaja od tečnosti koja sadrži pomenute enzime,
fazu hlađenja pomenute komine na temperaturu od 4 do 20°C, što je temperatura niža od temperature faze proizvodnje enzima i u periodu od 12 do 90 h tako da:
koncentracija β-glukozidaze ili β-ksilozidaze u tečnosti iz faze hlađenja je veća nego u tečnosti iz faze proizvodnje enzima,
i/ili
odnos zapremine čvrste faze/ukupne zapremine je manji od pomenutog odnosa za fazu proizvodnje enzima,
i na kraju faze hlađenja se dobija koktel enzima, mikroorganizma koji pripada rodu Trichoderma.
[0008] Pogodno, temperatura u fazi hlađenja je od 4 do 20°C, i poželjno od 4°C do 18°C. Poželjno, faza hlađenja se izvodi na pH od 3,5 do 5,5, i poželjno iznad 4.
Na poželjan način, faza hlađenja se izvodi u atmosferi siromašnoj kiseonikom, poželjno u anaerobnoj atmosferi.
Generalno, injektuje se neutralni gas, na primer azot ili ugljen dioksid.
Mikroorganizam pripada rodu Trichoderma, konkretno Trichoderma reesei, i poželjno se radi o soju CL847.
[0009] Nakon faze hlađenja, koktel enzima dobijen iz komine je razdvojen i dobijena je preostala komina.
Generalno, separacija je izvršena pomoću najmanje jednog centrifugiranja ili filtracije/presovanja ili mikrofiltracije, kome eventualno prethodi dekantovanje. Enzimi iz izdvojene tečnosti mogu da se koncentruju, na primer ultrafiltracijom.
[0010] Korišćeni mikroorganizam je odabran od celulolitičkih gljivica ili drugih modifikovanih mikroorganizama. Na poželjan način, celulolitički mikroorganizam pripada rodu Trichoderma koji posebno proizvodi celulaze i hemicelulaze prilagođene za totalnu hidrolizu celuloze i hemiceluloze.
[0011] Upotrebljeni industrijski sojevi poželjno pripadaju vrsti Trichoderma reesei, gljivica je generalno modifikovana radi poboljšanja proizvodnje celulolitičkih i/ili hemicelulolitičkih enzima procesom selekcije mutacije (nasumična mutageneza), kao, na primer, soj IFP CL847 (francuski patent FR-B-2555 803). Ti sojevi su dobro poznati stručnjacima.
[0012] Postupak prema pronalasku uključuje fazu proizvodnje enzima uz dobijanje medijuma koji sadrži enzime i kominu mikroorganizma, i eventualno separaciju pomenute komine od tečnosti koja sadrži enzime.
[0013] Sojevi se uzgajaju u fermentoru koji se meša i provetrava u uslovima koji odgovaraju njihovom rastu i proizvodnji enzima, i ti uslovi su poznati stručnjacima. Uvodi se izvor ugljenika za rast i indukujući izvor za proizvodnju enzima. Izvor ugljenika može biti rastvorljivi industrijski šećer, na primer glukoza, laktoza ili ksiloza, ili ekstrakt hemicelulozne frakcije u obliku monomera iz prethodno obrađene biomase. Indukujući izvor ugljenika može biti odabran od laktoze, celobioze, soforoze, celuloze. Ostatak od hidrolize ili prethodno obrađena lignocelulozna supstanca takođe može da se koristi kao izvor ugljenika za rast mikroorganizama i indukciju sistema za ekspresiju. Ovaj poslednji izvor ugljenika takođe mogu da koriste genetski poboljšani sojevi i posebno rekombinantni sojevi.
[0014] Na kraju faze proizvodnje enzima, komina se razdvaja od tečnosti ili se ne razdvaja od tečnosti ili se još može razdvojiti samo jedan deo komine. Komina odgovara gljivici, čvrstom delu. Tečnost sadrži enzime. Razdvojena (potpuno ili delimično) komina može da se razblaži. Poželjno, razdvojena komina se razblažuje vodom.
[0015] Separacija posebno može da se prilagodi u zavisnosti od željenih aktivnosti.
Separacija može da se vrši svakim sredstvom poznatim stručnjaku. Kao poželjno se navodi centrifugiranje, filtracija/presovanje (filter presa) ili mikrofiltracija. Centrifugiranju eventualno prethodi dekantovanje. Može biti predviđena faza koncentrovanja enzima, na primer, ultrafiltracijom.
[0016] Proces prema pronalasku se nastavlja fazom hlađenja pomenute komine (koja je razdvojena ili nije) na temperaturi nižoj od temperature faze proizvodnje enzima i tokom određenog vremena.
[0017] Temperatura u fazi hlađenja je pogodno od 4 do 20°C, i poželjno od 4°C do 18°C. Poželjno, faza hlađenja se izvodi na pH od 3,5 do 5,5, i poželjno iznad 4. Taj interval pH je definisan između pH 3 od početka deaktivacije β-glukozidaze i pH 6 moguće sporulacije gljivice.
Poželjno, faza hlađenja se izvodi u atmosferi siromašnoj kiseonikom, poželjno u anaerobnoj atmosferi. Generalno, injektuje se neutralni gas, na primer azot ili ugljen dioksid. Primećen je poboljšan prinos u atmosferi siromašnoj kiseonikom, a najbolji prinos je u anaerobnoj atmosferi. U prisustvu kiseonika, gljivica može ponovo da troši enzime.
Generalno, dovoljno je hlađenje poželjno u trajanju od 24 h do 72 h, i generalno oko 48 h.
[0018] Tokom ove faze hlađenja, postavlja se reakcija autolize gljivice prisutne u komini, i to je autoliza koju stvaraju enzimi. Oni su prisutni bilo u tečnosti nerazdvojene komine, ili su to oni koji su još uvek zarobljeni u razdvojenoj komini, i koji ne mogu da se razdvoje.
[0019] Eksperimentalno je zapaženo da se, u uslovima procesa prema pronalasku, aktivnost βglukozidaze i β-ksilozidaze veoma značajno povećava, i da se talog biomase smanjuje.
[0020] Da bi se optimizovao prinos koktela enzima, vreme hlađenja može biti prethodno određeno laboratorijskim eksperimentom.
Pogodno, vreme hlađenja se kontroliše tokom primene procesa, a napredovanje reakcije se prati uzorkovanjem.
[0021] Vreme hlađenja je takvo da
aktivnost β-glukozidaze ili β-ksilozidaze u tečnosti iz faze hlađenja je veća od one iz faze proizvodnje enzima,
i/ili
odnos zapremine čvrste faze/ukupne zapremine (talog biomase) je manji od pomenutog odnosa za fazu proizvodnje enzima.
Supstrat korišćen za određivanje aktivnosti β-glukozidaze ili aril β-glukozidaze je pnitrofenil-β-D-glukopiranozid (PNPG). On se cepa β-glukozidazom koja oslobađa pnitrofenol.
Jedna jedinica aktivnosti aril β-glukozidaze je definisana kao količina enzima potrebna za proizvodnju 1 µmol p-nitrofenola polazeći od PNPG po minutu, i izražava se u IU/ml.
Supstrat korišćen za određivanje aktivnosti β-ksilozidaze je p-nitrofenil-β-D-ksilopiranozid po istom principu.
Ti parametri se određuju na osnovu merenja.
[0022] Primećeno je da tokom procesa koncentracija β-glukozidaze raste, dostiže maksimum, pa opada. U isto vreme, primećeno je kako se talog biomase smanjuje.
Na primer, može se konstatovati da generalno količina oslobođene tečnosti iznosi najmanje 10%, i najčešće 30-40% početne težine razdvojene komine, i da je koncentracija proteina, merena u odnosu na aktivnost β-glukozidaze i β-ksilozidaze, tri puta veća.
Stručnjak može da odredi vreme hlađenja polazeći od tih podataka.
[0023] Nakon faze hlađenja, enzimski koktel (tečni deo) može, i ne mora da se razdvoji od čvrstog ostatka, poželjno se razdvaja.
Sredstva za separaciju su prethodno opisana.
[0024] Može se zaključiti da je ta separacija teža, delikatnija, kada se komina ne razdvaja do kraja uzgajanja.
[0025] Tako, najpoželjnije se izvodi jedna separacija komine pre faze hlađenja, poželjno pomoću filter prese. Poželjno, razdvaja se najmanje 95% komine, i još poželjnije, komina se potpuno razdvaja od tečnosti. Ovde se podrazumeva da se „potpuno“ odnosi na upotrebljenu metodu separacije.
[0026] Poželjno, pomenuti koktel enzima iz faze hlađenja se meša sa enzimima iz faze proizvodnje enzima.
Pomenuti koktel se meša potpuno ili delimično.
Pomenuti koktel, pomešan ili ne, koristi se u enzimskoj hidrolizi.
[0027] Preostala komina može da se podvrgne novoj fazi hlađenja, a zatim, eventualno ali poželjno, separaciji novog koktela enzima.
Uslovi za te faze su ranije opisani.
Ovde je pomenuta jedna dodatna faza hlađenja, ali njihov broj nije ograničen.
Tako, pronalazak se takođe odnosi na proces sprovođenja prethodnih faza u kojima se pomenuta preostala komina podvrgava fazi hlađenja, i na kraju faze hlađenja se dobija koktel enzima, koji je razdvojen ili nije razdvojen od preostale komine. Poželjno, pomenuti koktel se razdvaja od preostale komine iz pomenute faze hlađenja.
[0028] Poželjno, kokteli enzima iz faza hlađenja su pomešani. Poželjno, oni su pomešani sa enzimima iz faze proizvodnje enzima.
Generalno, svi kokteli mogu da se mešaju međusobno i/ili sa enzimima iz faze proizvodnje enzima. Udeo svake od komponenata smeše se određuje prema primeni pomenute smeše. Poželjno, mešaju se svi kokteli i enzimi.
[0029] Najmanje jedan koktel, pomešan ili ne, koristi se u enzimskoj hidrolizi.
[0030] Pronalazak će se bolje razumeti na osnovu slika 1 do 6. Slike 7 do 13 se odnose na primere.
Slika 1 prikazuje poželjno otelotvorenje sa fazom separacije između faze proizvodnje enzima i faze hlađenja. Slika 2 je prikaz bez separacije komine. Na slikama 3 i 4, dodata je dodatna faza hlađenja slikama 1, odnosno 2.
Slika 5 predstavlja otelotvorenje koje je sa separacijom ili bez separacije.
Slika 6 predstavlja poželjno otelotvorenje faze separacije komine pre i/ili posle faze hlađenja.
[0031] Prema slici 1, dodati su izvor ugljenika i indukujući izvor (vod 1) u fazi proizvodnje enzima (zona 2 za proizvodnju enzima), kao i celulolitički mikroorganizam koji proizvodi celulaze i/ili hemicelulaze (vod 3) i neophodni nutrijenti (vod 4).
Dobijeni proizvod je razdvojen (zona 5 za separaciju) na tečnost koja sadrži enzime (vod 6) i sakuplja se komina (vod 7) koja sadrži gljivicu i zarobljene enzime.
Komina se podvrgava fazi hlađenja (zona 8 hlađenja).
[0032] U jednom otelotvorenju, tečnost se izvlači iz zone za proizvodnju enzima (reaktor) i komina ostaje u pomenutoj zoni gde se hladi.
U drugom otelotvorenju koje je poželjno, medijum za uzgajanje se izvlači iz zone za proizvodnju enzima i razdvaja se pomoću sredstva za separaciju (filtriranje/presovanje, centrifugiranje,...), poželjno posle dekantovanja i izvlačenja tečnosti, da se dobije komina. Ta komina se ubacuje u zonu hlađenja koja može biti reaktor zone za proizvodnju enzima (u slučaju diskontinualnog procesa) ili drugi reaktor (u slučaju kontinualnog procesa).
Ohlađena komina (vod 9) razdvaja se (zona 10) na tečnost koja sadrži koktel enzima (vod 11) i čvrstu supstancu koja je preostala komina (vod 12).
Enzimi protočnih vodova 6 i 11 se mešaju i odvode (vod 13) u zonu enzimske hidrolize (14).
[0033] Na slici 3 ponovo je prikazana ova šema, uz dodatak faze hlađenja.
Preostala komina (komina 12) se podvrgava dodatnoj fazi hlađenja (zona 15 hlađenja).
Na isti način kao pre, komina poslata u dodatnu fazu hlađenja (zona 15) možda nije razdvojena u zoni 10 posle prve faze hlađenja (zona 8).
Ohlađena komina (vod 16) razdvaja se (zona 17) na tečnost koja sadrži koktel enzima (vod 19) i čvrstu supstancu koja je preostala komina (vod 18).
Enzimi protočnog voda 19 se mešaju sa onima iz protoka faze proizvodnje enzima (vod 6) prve faze hlađenja (vod 11), i odvode se (vod 20) u zonu enzimske hidrolize (14).
[0034] Na slici 2 primetićete reference na sliku 1. Izbačena je faza separacije (zona 5) nakon faze proizvodnje enzima.
[0035] Isto je na slici 4 koja odgovara slici 2, i uključuje dodatnu fazu hlađenja, i reference na taj dodatak su uzete sa slike 3.
[0036] Takođe, na šemi se može kombinovati postojanje jedne separacije sa odsustvom druge separacije. To je, na primer, ilustrovano na sl.5. Na njoj se vidi prisustvo separacije na kraju faze proizvodnje enzima (zona 5), odsustvo separacije na kraju prve faze hlađenja (zona 8) i pre dodatne faze hlađenja, i prisustvo separacije posle dodatne faze hlađenja (zona 17).
[0037] Slika 6 predstavlja poželjno otelotvorenje faze separacije komine pre i/ili posle faze hlađenja.
Ako pogledamo sliku 1, to je otelotvorenje zone 5 i/ili zone 10.
Na kraju zone 2 proizvodnje enzima, medijum za uzgajanje je razdvojen u fazi dekantovanja (zona 30), gljivica se nalazi u dekantovanom talogu (vod 31) i dobijeni zamućeni sok (vod 32) prelazi u fazu centrifugiranja (zona za centrifugiranje 33). Odatle izlazi krem (vod 34) koji sadrži gljivicu i bistri sok (vod 35). Da bi se postigla separacija, bistri sok prelazi u fazu mikrofiltracije (zona 36), retentat (vod 37) sadrži gljivicu, a permeat (vod 38) enzime.
Različiti tokovi koji sadrže gljivicu (talog, krema, retentat) mogu da se pomešaju i da čine kominu koja će ići u fazu hlađenja, ili čine preostalu kominu, koja će biti ili neće biti podvrgnuta novoj fazi hlađenja. Da bi se enzimi koncentrovali, permeat se prevodi u fazu ultrafiltracije. Tako se dobija koncentrovani retentat enzima (vod 40), kao i permeat (vod 41) koji se može ponovo koristiti u procesu.
Treba napomenuti da skup faza dekantovanja i centrifugiranja može da se zameni filtracijom/presovanjem (filter/presa).
Primeri
Primer 1: sa slikama 7 do 9.
[0038] Slika 7 predstavlja fotografiju komine Trichoderma reesei CL847 posle separacije i pre faze hlađenja.
Slika 8 prikazuje razvoj koncentracije proteina u supernatantu kulture.
Slika 9 prikazuje aktivnost β-glukozidaze merenu na kraju faze proizvodnje i pre hlađenja gljivice tokom 72 h na 4°C.
[0039] Proizvodnja celulaze se izvodi u bioreaktoru od 20 l (korisnih 12 l) sa mehaničkim mešanjem. Mineralni medijum ima sledeći sastav: KOH 1,66 g/l, 85% H3PO42 ml/l, (NH4)2SO4 2,8 g/l, MgSO4, 7 H2O 0,6 g/l, CaCl20,6 g/l, MnSO43,2 mg/l, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mg/l, CoCl210 4,0 mg/l, FeSO4, 7 H2O 10 mg/l, Corn Steep [vodica od močenja kukuruza] 1,2 g/l, antipenušavac 0,5 ml/l.
Bioreaktor koji sadrži mineralni medijum je sterilisan na 120 °C tokom 20 minuta, glukoza kao izvor ugljenika je odvojeno sterilisana na 120 °C tokom 20 minuta, pa je sterilno dodata u bioreaktor u krajnjoj koncentraciji od 30 g/l.
Bioreaktor je zasejan sa 10% (v/v) tečne pretkulture soja Trichoderma reesei CL847.
Mineralni medijum za pretkulturu je isti kao onaj u bioreaktoru, osim što se dodaje kalijum ftalat do 5 g/l radi podešavanja pH. Rast gljivice u pretkulturi je sproveden koristeći glukozu kao ugljenični supstrat, u koncentraciji od 30 g/l. Rast inokuluma traje 2 do 3 dana i vrši se na 28 °C u inkubatoru sa mešanjem. Prenos u bioreaktor se vrši ako je preostala koncentracija glukoze manja od 15 g/l.
[0040] Proizvodno iskustvo na bioreaktoru obuhvata dve faze:
fazu rasta na izvoru ugljenika glukozi (inicijalna koncentracija = 30 g/l) na temperaturi od 27 °C i pH od 4,8 (podešava se pomoću 5,5 M amonijaka). Aeracija je 0,5 vvm, i mešanje se pojačava od 200 do 800 o/min, u zavisnosti od pO2 (pritiska rastvorenog kiseonika), koji se održava iznad 30%.
fazu proizvodnje enzima. Kada se utroši inicijalni supstrat u fermentoru, kontinualno se injektuje rastvor laktoze od 250 g/l brzinom od 35 do 45 mg po g ćelija i na sat, do 164 sata. Temperatura se spušta na 25 °C i pH na 4 do kraja uzgajanja. Da bi se regulisao pH, dodaje se
1
5,5 N amonijačni rastvor kojim se unosi azot potreban za sintezu ekskretovanih proteina. Sadržaj rastvorenog kiseonika se održava iznad 15 do 20% delovanjem na aeraciju i mešanje. Proizvodnja enzima se prati doziranjem ekstracelularnih proteina Lorijevom metodom i standardom BSA, nakon separacije micelijuma filtracijom ili formiranih ćelija). Krajnja dobijena koncentracija proteina iznosi 45 g/l.
[0041] Posle ove faze proizvodnje, prešli smo na fazu separacije komine gljivica supernatanta kulture. Komina je presovana tako da se ekstrahuje maksimalna količina supernatanta (slika 7) i izmerena. Zatim je stavljena u zatvoreni prijemni sud na 4°C tokom 72 h.
Uzorci supernatanta oslobođenog nakon autolize gljivice uzimani su svakih 24 h do 72 h. Težina tečnosti po isteku 72 h je izmerena. Ona odgovara 30% težine komine. Testovi koncentracije proteina prikazani su na slici 8. Vidi se da su koncentracije pomnožene sa 3 u odnosu na kraj proizvodnje enzima, kao i aktivnost β-glukozidaze (slika 9)
Primer 2: sa slikama 10 do 13.
[0042] Slika 10 prikazuje aktivnost β-glukozidaze merenu na kraju uzgajanja i posle 72 h autolize gljivice na 4° i 20°C.
[0043] Slika 11 prikazuje specifičnu aktivnost β-glukozidaze (IU/mg) dobijenu posle dve serije separacije.
Slika 12 prikazuje aktivnost FPaze (IU/mg) dobijenu posle dve serije separacije.
Slika 13 odgovara identifikaciji enzima u fazi separacije.
[0044] Postupak je primenjen na pilot postrojenju od 6 m<3>. Gljivica Trichoderma reesei CL847 se uzgaja pod istim uslovima opisanim u primeru 1. Na kraju faze proizvodnje, enzimi su razdvojeni u 4 faze: faza dekantovanja, faza centrifugiranja, faza mikrofiltracije i faza ultrafiltracije.
Ove četiri faze su šematski prikazane na slici 6. Tri prve faze služe da se ukloni gljivica, a poslednja faza (ultrafiltracija) služi za koncentrovanje proizvedenih enzima.
[0045] Sve sakupljene frakcije gljivica (talog od dekantovanja, krema od centrifugiranja i retentat od mikrofiltracije) stavljene su u bioreaktor ohlađen na 8°C tokom 72 h i razblažene vodom do krajnje zapremine od 4 m3. Komina je podvrgnuta drugoj seriji separacije: centrifuga, mikrofiltracija i ultrafiltracija.
[0046] Količina sakupljenih enzima na kraju druge serije separacije analogna je količini dobijenoj na kraju prve, što je oko 70 kg proteina posle prve serije separacije i 64 kg u drugoj seriji separacije. Nasuprot tome, zanimljivo je zapaziti da su specifične aktivnosti βglukozidaze (slika 11) i FPaze (slika 12) dobijenog koktela enzima 20% veće posle faze hlađenja (autoliza gljivice). Sakupljeni koktel enzima je usled toga mnogo delotvorniji.
[0047] Urađena je dvodimenzionalna elektroforeza da bi se videlo ima li vidljive modifikacije sastava koktela enzima tokom faza separacije. Polazeći od prethodno desalinizovanih uzoraka na FPLC [Fast protein liquid chromatography], sa nanošenjem 200 µg na 2D gel, i bojenjem Coomassie plavim, proteini su razdvojeni prema molekulskoj masi i izoelektričnoj tački. Snimljeni gelovi su prikazani na slici 13, slika 13a odgovara kremu a slika 13b bistrom soku. Glavni enzimi su identifikovani tokom faze centrifugiranja u bistrom soku i kremu. Uočava se jasna razlika na profilima gelova. Na kremovima od centrifugiranja se vide β-ksilozidaze. Ova aktivnost je izmerena na pnp-ksilozi radi potvrde, i nađena je specifična aktivnost oko 3 puta veća u kremovima u odnosu na enzimski koktel dobijen na kraju proizvodnje (1,2 IU/mg u kremovima i 0,4 IU/mg u finalnom uzorku iz fermentora).

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Proces za povećanje udela β-glukozidaze i/ili β-ksilozidaze u koktelu enzima polazeći od celulolitičkog mikroorganizma koji proizvodi celulaze i/ili hemicelulaze, koji obuhvata: - fazu proizvodnje enzima uz dobijanje medijuma koji sadrži enzime i kominu mikroorganizama, i pomenuta komina se razdvaja ili se ne razdvaja od tečnosti koja sadrži pomenute enzime,
- fazu hlađenja pomenute komine na temperaturu od 4 do 20°C, što je temperatura niža od temperature faze proizvodnje enzima i u periodu od 12 i 90 h tako da:
- koncentracija β-glukozidaze ili β-ksilozidaze u tečnosti iz faze hlađenja je veća od one iz faze proizvodnje enzima,
i/ili
- odnos zapremine čvrste faze/ukupne zapremine je manji od pomenutog odnosa za fazu proizvodnje enzima,
i na kraju faze hlađenja se dobija koktel enzima,
mikroorganizma koji pripada rodu Trichoderma.
2. Postupak prema zahtevu 1, okarakterisan time što je vreme faze hlađenja od 24 do 72 h.
3. Postupak prema jednom od prethodnih zahteva u kome se, na kraju faze proizvodnje enzima, komina razdvaja od tečnosti.
4. Postupak prema prethodnom zahtevu, u kome se pomenuta razdvojena komina razblažuje vodom.
5. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, u kome se, na kraju faze proizvodnje enzima, komina ne razdvaja od tečnosti.
6. Postupak prema jednom od prethodnih zahteva u kome se, nakon faze hlađenja, koktel enzima dobijen iz komine razdvaja, i dobija se preostala komina.
7. Postupak prema jednom od zahteva 3 ili 4 i 6, u kome je separacija izvršena pomoću najmanje jednog centrifugiranja ili filtracije/presovanja ili mikrofiltracije, kojima eventualno prethodi dekantovanje.
8. Postupak prema zahtevu 6, u kome enzimi iz izdvojene tečnosti mogu da se koncentruju, na primer ultrafiltracijom.
9. Postupak prema jednom od prethodnih zahteva u kome se faza hlađenja izvodi na pH od 3,5 do 5,5.
10. Postupak prema jednom od prethodnih zahteva u kome se faza hlađenja izvodi u atmosferi siromašnoj kiseonikom, poželjno u anaerobnoj atmosferi.
11. Postupak prema prethodnom zahtevu u kome se injektuje neutralni gas, na primer ugljen dioksid ili azot.
12. Postupak prema jednom od prethodnih zahteva u kome mikroorganizam pripada rodu Trichoderma reesei, i poželjno se radi o soju CL847.
13. Postupak prema jednom od prethodnih zahteva u kome se pomenuta preostala komina podvrgava fazi hlađenja, i na kraju faze hlađenja se dobija koktel enzima, koji se razdvaja ili ne razdvaja od preostale komine, i poželjno, pomenuti koktel je razdvojen od preostale komine iz pomenute faze hlađenja.
14. Postupak prema jednom od prethodnih zahteva u kome se kokteli enzima iz komine mešaju.
15. Postupak prema jednom od prethodnih zahteva u kome se najmanje jedan koktel enzima meša sa razdvojenom tečnošću koja sadrži enzime iz faze proizvodnje enzima.
RS20200521A 2014-07-30 2015-07-27 Postupak za proizvodnju koktela enzima od gljivica iz komine RS60220B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1457358A FR3024463B1 (fr) 2014-07-30 2014-07-30 Procede de production d'un cocktail enzymatique a partir de mout de champignon
EP15742261.9A EP3174979B8 (fr) 2014-07-30 2015-07-27 Procede de production d'un cocktail enzymatique a partir de moût de champignon
PCT/EP2015/067139 WO2016016182A1 (fr) 2014-07-30 2015-07-27 Procede de production d'un cocktail enzymatique a partir de moût de champignon

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60220B1 true RS60220B1 (sr) 2020-06-30

Family

ID=51787093

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200521A RS60220B1 (sr) 2014-07-30 2015-07-27 Postupak za proizvodnju koktela enzima od gljivica iz komine

Country Status (16)

Country Link
US (1) US10214734B2 (sr)
EP (1) EP3174979B8 (sr)
CN (1) CN107075448B (sr)
BR (1) BR112017001669B8 (sr)
CA (1) CA2956372C (sr)
DK (1) DK3174979T3 (sr)
ES (1) ES2784253T3 (sr)
FR (1) FR3024463B1 (sr)
HR (1) HRP20200717T1 (sr)
HU (1) HUE050216T2 (sr)
LT (1) LT3174979T (sr)
PL (1) PL3174979T3 (sr)
PT (1) PT3174979T (sr)
RS (1) RS60220B1 (sr)
SI (1) SI3174979T1 (sr)
WO (1) WO2016016182A1 (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3054141B1 (fr) * 2016-07-22 2018-07-13 Institut National De La Recherche Agronomique Separation des enzymes issues de trichoderma reesei par filtre presse et filtration tangentielle sur membrane ceramique.
FR3071852A1 (fr) * 2017-09-29 2019-04-05 IFP Energies Nouvelles Souche de trichoderma reesei hyperproductrice et presentant une activite beta-glucosidase amelioree
FR3143030A1 (fr) 2022-12-08 2024-06-14 IFP Energies Nouvelles Procédé de séparation de l’enzyme bêta-xylosidase à partir d’un mélange d’enzymes

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4628029A (en) * 1983-08-25 1986-12-09 Parsons & Whittemore, Inc. Method for the conversion of a cellulosic substrate to glucose using Microbispora bispora, strain Rutgers P&W
EP1735454B1 (en) * 2004-03-25 2017-05-10 Novozymes, Inc. Methods for degrading or converting plant cell wall polysaccharides

Also Published As

Publication number Publication date
EP3174979B1 (fr) 2020-02-19
WO2016016182A1 (fr) 2016-02-04
HUE050216T2 (hu) 2020-11-30
US10214734B2 (en) 2019-02-26
BR112017001669B8 (pt) 2024-02-06
CA2956372A1 (fr) 2016-02-04
PL3174979T3 (pl) 2020-11-02
CN107075448B (zh) 2021-06-11
BR112017001669B1 (pt) 2023-04-18
ES2784253T3 (es) 2020-09-23
BR112017001669A2 (pt) 2018-02-14
EP3174979B8 (fr) 2020-04-01
EP3174979A1 (fr) 2017-06-07
FR3024463A1 (fr) 2016-02-05
SI3174979T1 (sl) 2020-08-31
HRP20200717T1 (hr) 2020-07-24
PT3174979T (pt) 2020-04-08
CA2956372C (fr) 2023-10-03
FR3024463B1 (fr) 2018-04-06
LT3174979T (lt) 2020-05-25
CN107075448A (zh) 2017-08-18
DK3174979T3 (da) 2020-05-11
US20170211051A1 (en) 2017-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9670454B2 (en) Methods of microalgae cultivation for increased resource production
ES2773953T3 (es) Proceso para hidrólisis enzimática de material lignocelulósico usando GH61, adición de oxígeno y alto contenido de materia seca
EP2198019A1 (en) Method for cellulase production
UA105343C2 (uk) Спосіб гідролізу лігноцелюлози з одночасним виробленням ферментів
CN101868549A (zh) 在生物精炼环境中生产醇的方法
KR20160143714A (ko) 리그노셀룰로스 물질을 효소적으로 가수분해하고 당을 발효시키는 방법 및 장치
FR2957935A1 (fr) Procede de production de cellulases base sur la regulation de l&#39;oscillation de la pression en oxygene dissous dans le milieu de culture
RS60220B1 (sr) Postupak za proizvodnju koktela enzima od gljivica iz komine
Arif et al. Lignocellulolytic enzymes production by four wild filamentous fungi for olive stones valorization: comparing three fermentation regimens
CA2874574C (fr) Procede de production d&#39;un cocktail enzymatique utilisant les residus liquides d&#39;un procede de conversion biochimique de materiaux ligno-cellulosiques
CA2850609A1 (fr) Procede de production de cellulases en continu par un champignon filamenteux utilisant un substrat carbone issu d&#39;un pretraitement acide
JP2008538914A (ja) リグニン分解酵素の生産のための木材腐朽担子菌
US8753844B2 (en) Overproduction of ligninolytic enzymes
JP7400468B2 (ja) トリコデルマ属糸状菌変異株およびタンパク質の製造方法
CA2856463A1 (fr) Procede de production d&#39;un cocktail enzymatique utilisant les residus solides d&#39;un procede de conversion biochimique de materiaux ligno-cellulosiques
CA2895439A1 (fr) Procede de production d&#39;oligosaccharides a partir de biomasse lignocellulosique
WO2015091079A1 (fr) Procede d&#39;hydrolyse enzymatique avec production in situ de glycosides hydrolases par des microorganismes genetiquement modifies (mgm) et non mgm
Tanwar et al. Application of Microbial Fermentation Technique for the Synthesis of Fermentable Sugars from Different Agrobiomasses
Elisashvili et al. Overproduction of ligninolytic enzymes
Makky et al. Bioeconomy: fermented waste management and pectinases purification from Thermomyceslanuginosus
JPWO2016076282A1 (ja) セルラーゼ賦活剤及びそれを用いたリグノセルロース系バイオマス糖化方法
Epishkina et al. Fungi cellulases for crude fibre reduction in plant raw materials
Jurado et al. Biological pretreatment and ethanol production from olive cake
EP2862939A1 (en) Process for the hydrolysis of biomass