RS60225B1 - Derivat hlorina koristan u fotodinamičkoj terapiji i dijagnostici - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na hlorin e4 natrijum i postupak za njegovu pripremu. Hlorin e4 natrijum je pogodan za upotrebu u fotodinamičkoj terapiji, citoluminescentnoj terapiji i fotodinamičkoj dijagnostici, na primer za lečenje ili detekciju tumora. Predmetni pronalazak takođe se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži hlorin e4 natrijum, na upotrebu hlorin e4 natrijuma u proizvodnji fototerapeutskog ili fotodijagnostičkog sredstva i na hlorin e4 natrijum za upotrebu u fotodinamičkoj terapiji, citoluminescentnoj terapiji ili fotodinamičkoj dijagnostici, na primer za upotrebu u lečenju ili detekciji tumora.

Stanje tehnike

[0002] Porfirini i njihovi derivati su poznata fotosenzitivna hemijska jedinjenja, koja mogu da apsorbuju fotone svetlosti i da ih emituju na većim talasnim dužinama. Za ova jedinstvena svojstva postoje brojne primene, a jedna od njih je PDT (fotodinamička terapija).

[0003] Tokom aktivacije svetlosti, molekul prelazi iz osnovnog stanja (S0) u pobuđeno singletno stanje (S1), (S0→S1tranzicija), a zatim se vraća u osnovno stanje (S0), (S1→S0tranzicija), emitujući svetlost viših talasnih dužina u obliku fluorescencije. Postoji i drugo energetsko stanje poznato kao tripletno stanje (T1). Tripletno stanje (T1) ne može efikasno da se popuni direktnom ekscitacijom. Međutim, međusistemski prelaz S1→T1odvija se izoenergetski, praćen deaktivacijom do T1. S1→T1promena je formalno spinski zabranjena, ali je silazni proces i u nekim molekulima međusistemski prelaz odvija se tako efikasno da dolazi do gašenja fluorescencije. Ovakva jedinjenja su korisna za obrazovanje pobuđenih tripleta putem prenosa ekscitacije (fenomen poznat kao sensitizacija) u molekulima u kojima je međusistemski prelaz minimalan.

[0004] Slika 1 prikazuje modifikovani Jablonski dijagram za tipični fotosenzitizer, koji u kratkim crtama daje glavne fotofizičke procese od interesa.

[0005] U tripletnom stanju (T1) molekuli postaju veoma nestabilni i mogu da reaguju sa molekulskim kiseonikom (<3>O2), deleći ga na dva singletna kiseonika (<1>O2). Singletni kiseonik (<1>O2) je poznat kao “skavendžer” i može da uništi poremećene biološke ćelije i ukloni slobodne radikale.

[0006] Ova jedinstvena svojstva čine brojne fotosenzitivne molekule dobrim fotosenzitizerima za PDT.

[0007] Trenutno postoje dve generacije fotosenzitizera za PDT. Prva generacija obuhvata hem porfirine (derivate krvi), a druga su najvećim delom derivati hlorofila. Ova druga jedinjenja poznata su kao hlorini i bakteriohlorini.

[0008] Hlorini pokazuju fotofizička svojstva slična svojstvima porfirinskih sistema, ali imaju pojačanu Q traku, pomerenu ka crvenoj oblasti (670nm), što sisteme koji sadrže hlorin čini boljim kandidatima za PDT. Hlorofil a, zeleni fotosintetski pigment, je jedan prototip hlorinske klase prirodnih proizvoda. On ili njegovi derivati mogu da se ekstrahuju iz nekih vrsta Spirulina Platensis bez ikakve kontaminacije hlorofilom b, čime se izbegava zamorno hromatografsko razdvajanje.

[0009] Derivat hlorofila, rastvoran u vodi, poznat kao tri-natrijum bakar(II) hlorin e6, koristi se u lečenju različitih bolesti kod ljudi, bez dokaza o toksičnosti, senzitizaciji kože i drugim ozbiljnim sporednim efektima.

[0010] Wong et al (The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1967, vol.

155(1), strane 50-57) opisuju kardiotropna delovanja hlorina e4. Hlorin e4 je nedavno proučavan i pokazano je da ispoljava dobru fotosenzitivnu aktivnost. Naznačeno je da hlorin e4 ima zaštitni efekat protiv želudačnih lezija izazvanih indometacinom kod pacova i akutnih oštećenja jetre izazvanih putem TAA- ili CCl4, kod miševa. Zbog toga je predloženo da bi hlorin e4 mogao da bude obećavajući novi kandidat za lek protiv ulceracija želuca i za zaštitu od oštećenja jetre. WO 2009/040411 predlaže upotrebu kompleksa hlorin e4 cinka u fotodinamičkoj terapiji. Li et al (Oncology Reports, 2012, vol. 27, strane 1455-1460) opisuju hlorin e4 kao fotosenzitizer u tretmanu ćelijske linije raka bešike.

hlorin e4

[0011] Međutim, i dalje postoji potreba za boljim fotosenzitizerima. Postoji potreba za jedinjenjima koja imaju visok kvantni prinos singletnog kiseonika i za jedinjenjima koja imaju veliku sposobnost fotosensitizacije, poželjno u organskim i vodenim medijumima. Takođe postoji potereba za jedinjenjima koja imaju visok kvantni prinos fluorescencije.

Kratak opis pronalaska

[0012] Prvi aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje hlorin e4 natrijum, koji ima strukturu:

[0013] Poželjno, hlorin e4 natrijum ima strukturu:

[0014] Stručnjak u oblasti razumeće da su negativna naelektrisanja na strukturama hlorina prikazana na prethodnim slikama delokalizovana preko konjugovanog sistema.

[0015] Hlorin e4 natrijum ima dva hiralna centra. Hlorin e4 natrijum prema predmetnom pronalasku je poželjno u osnovi čist enantiomer, što znači da hlorin e4 natrijum sadrži manje od 10% drugih stereoizomera, poželjno manje od 5%, poželjno manje od 3%, poželjno manje od 2%, poželjno manje od 1%.

[0016] Drugi aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje postupak za pripremu hlorin e4 natrijuma u skladu sa prvim aspektom prema predmetnom pronalasku, koji sadrži korak reakcije hlorina e4 sa jedinjenjem natrijuma.

[0017] Poželjno, jedinjenje natrijuma je natrijum hidroksid, natrijum karbonat, natrijumova so karboksilne kiseline (kao što su natrijum stearat ili natrijum acetat), natrijum halid (kao što je natrijum fluorid) ili natrijum hidrid. Poželjno, jedinjenje natrijuma je natrijum hidroksid, natrijumova so karboksilne kiseline (kao što je natrijum stearat ili natrijum acetat), natrijum halid (kao što je natrijum fluorid) ili natrijum hidrid. Poželjno, jedinjenje natrijuma je natrijum hidroksid ili natrijum karbonat. Poželjnije, jedinjenje natrijuma je natrijum hidroksid.

[0018] Izborno, hlorin e4 reaguje sa jedinjenjem natrijuma u prisustvu baze. Poželjno, baza je aminska baza, poželjno aromatična aminska baza kao što je tiamin pirofosfat ili DMAP. Ako se koristi, baza je poželjno tiamin pirofosfat.

[0019] Poželjno, hlorin e4, jedinjenje natrijuma i izborna baza se koriste u molskom odnosu od 0.15-1 : 45-60 : 0-12.

[0020] Poželjno, hlorin e4 reaguje sa jedinjenjem natrijuma u prisustvu rastvarača. Poželjno, rastvarač je odabran od alkohola (kao što je metanol, etanol, n-propanol ili izopropanol), vode, DMF, hloroforma, DMSO, toluena ili njihove smeše. Poželjno, rastvarač je odabran od metanola, vode ili njihove smeše. Poželjno, rastvarač je smeša metanola i vode.

[0021] Poželjno se reakcija izvodi na temperaturi od 60°C ili nižoj. Poželjno, reakcija se izvodi na temperaturi u opsegu od 25-60°C.

[0022] Poželjno, reakcija se izvodi tokom 1 do 12 sati, poželjno tokom 3 do 8 sati.

[0023] Dobijeni hlorin e4 natrijum može da se prečisti filtracijom, na primer kroz filter od 45µm kompanije Millipore. Alternativno ili dodatno, dobijeni hlorin e4 natrijum može da se prečisti hromatografijom, na primer brzom hromatografijom na koloni sa silika gelom. Hlorin e4 natrijum može da se izdvoji liofilizacijom.

[0024] Četvrti aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0025] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska pogodan je za upotrebu u medicini.

[0026] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska, pogodni su za upotrebu u fotodinamičkoj terapiji ili citoluminescentnoj terapiji.

[0027] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska pogodni su za lečenje bolesti koja se karakteriše benignom ili malignom hiperproliferacijom ćelija ili oblastima neovaskularizacije; benignog ili malignog tumora; ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; Hočkinovog limfoma; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema ili kostiju.

[0028] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska pogodni su za lečenje bolesti koja se karakteriše benignom ili malignom hiperproliferacijom ćelija ili oblastima neovaskularizacije.

[0029] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska pogodni su za lečenje benignog ili malignog tumora.

[0030] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska pogodni su za lečenje ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; limfoma; Hočkinovog limfoma; kancera glave i vrata; oralnog ili kancera usta; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema, kostiju, kože ili pankreasa. Poželjno su pogodni za lečenje ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; Hočkinovog limfoma; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema ili kostiju. Poželjno su pogodni za lečenje limfoma; Hočkinovog limfoma; oralnog ili kancera usta; ili kancera prostate, grlića materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, pluća, jednjaka, bubrega, jetre, mozga, limfnog sistema, kostiju, kože ili pankreasa. Poželjno su pogodni za lečenje limfoma; oralnog ili kancera usta; ili kancera prostate, grlića materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, pluća, jednjaka, kostiju ili kože.

[0031] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska pogodni su za upotrebu u fotodinamičkoj dijagnostici.

[0032] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska pogodni su za detekciju bolesti koja se karakteriše benignom ili malignom hiperproliferacijom ćelija ili oblastima neovaskularizacije; benignog ili malignog tumora; ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; Hočkinovog limfoma; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema ili kostiju.

[0033] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska pogodni su za detekciju oblasti koja je pogođena benignom ili malignom hiperproliferacijom ćelija ili neovaskularizacijom.

[0034] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska pogodni su za detekciju benignog ili malignog tumora.

[0035] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska pogodni su za detekciju ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; limfoma; Hočkinovog limfoma; kancera glave i vrata; oralnog ili kancera usta; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema, kostiju, kože ili pankreasa. Poželjno su pogodni za detekciju ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; Hočkinovog limfoma; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema ili kostiju. Poželjno su pogodni za detekciju limfoma; Hočkinovog limfoma; oralnog ili kancera usta; ili kancera prostate, grlića materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, pluća, jednjaka, bubrega, jetre, mozga, limfnog sistema, kostiju, kože ili pankreasa. Poželjno su pogodni za detekciju limfoma; oralnog ili kancera usta; ili kancera prostate, grlića materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, pluća, jednjaka, kostiju ili kože.

[0036] Poželjno, hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska pogodni su za fluorescentnu ili fosforescentnu detekciju prethodno nabrojanih bolesti, poželjno za fluorescentnu ili fosforescentnu detekciju i kvantifikaciju navedenih bolesti.

[0037] Poželjno su hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska prilagođeni za primenu istovremeno sa primenom ili pre primene zračenja ili zvuka, poželjno za primenu pre primene zračenja.

[0038] Ukoliko su hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska namenjeni za upotrebu u fotodinamičkoj terapiji ili citoluminescentnoj terapiji, onda su oni poželjno prilagođeni za primenu 5 do 100 sati pre zračenja, poželjno 6 do 72 sata pre zračenja, poželjno 24 do 48 sati pre zračenja.

[0039] Ukoliko su hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska namenjeni za upotrebu u fotodinamičkoj dijagnostici, onda su oni poželjno prilagođeni za primenu 3 do 60 sati pre zračenja, poželjno 8 do 40 sati pre zračenja.

[0040] Poželjno, zračenje koje se koristi u fotodinamičkoj terapiji, citoluminescentnoj terapiji ili fotodinamičkoj dijagnostici je elektromagnetno zračenje sa talasnim dužinama u opsegu od 500nm do 1000nm, poželjno od 600nm do 790nm. Elektromagnetno zračenje može da se primenjuje tokom 5-60 minuta, poželjno tokom 15-20 minuta, pri oko 0.1-5W, poželjno pri oko 1W. U jednom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, koriste se dva izvora elektromagnetnog zračanja (na primer laserska svetlost i LED svetlost), jedan izvor sa talasnom dužinom u opsegu od 600nm do 690nm, poželjno oko 660nm, drugi izvor sa talasnom dužinom u opsegu od 700nm do 790nm, poželjno oko 760nm. U drugom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, koriste se dva izvora elektromagnetnog zračenja (na primer laserska svetlost i LED svetlost), gde su oba izvora prilagođena da obezbede zračenje sa talasnom dužinom u opsegu od 600nm do 690nm, poželjno oko 660nm, i zračenje sa talasnom dužinom u opsegu od 700nm do 790nm, poželjno oko 760nm. U drugom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, zračenje može da se obezbedi pomoću uređaja za ubacivanje u telesnu šupljinu, koji se ubacuje u prostatu, analno, vaginalno, u usta ili nos. U drugom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, zračenje može da se obezbedi aktivacijom svetlosti u intersticijumu, na primer, upotrebom fine igle za ubacivanje optičkog vlakna u pluća, jetru, limfne čvorove ili dojku. U drugom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, zračenje može da se obezbedi endoskopskom aktivacijom svetlosti, na primer, u cilju dostavljanja svetlosti u pluća, želudac, debelo crevo, bešiku ili vrat.

[0041] Farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku može da bude u obliku pogodnom za oralnu, parenteralnu (uključujući intravensku, potkožnu, intramuskularnu, intradermalnu, intratrahealnu, intraperitonealnu, intraartikularnu, intraabdominalnu, intrakranijalnu i epiduralnu), transdermalnu, respiratornu (aerosol), rektalnu, vaginalnu ili topikalnu (uključujući bukalnu, mukoznu i sublingvalnu) primenu. Farmaceutska kompozicija može takođe da bude u obliku pogodnom za primenu klistira ili za primenu putem injeciranja u tumor. Poželjno farmaceutska kompozicija je u obliku pogodnom za oralnu, parenteralnu ili respiratornu primenu, poželjno u obliku pogodnom za oralnu ili parenteralnu primenu, poželjno u obliku pogodnom za oralnu primenu.

[0042] U jednom poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je obliku pogodnom za oralnu primenu. Poželjno farmaceutska kompozicija je obezbeđena u obliku tablete, kapsule, tvrde ili meke želatinske kapsule, perlice, pilule ili lozenge, u vidu praška ili granula, ili u vidu vodenog rastvora, suspenzije ili disperzije. Poželjnije farmaceutska kompozicija je obezbeđena u obliku vodenog rastvora, suspenzije ili disperzije za oralnu primenu, ili alternativno u obliku praška osušenog zamrzavanjem koji može da se pomeša sa vodom pre primene kako bi obezbedio vodeni rastvor, suspenziju ili disperziju za oralnu primenu. Poželjno farmaceutska kompozicija je obliku pogodnom za obezbeđivanje 0.01 do 10 mg/kg/dan hlorin e4 natrijuma, poželjno 0.1 do 5 mg/kg/dan, poželjno oko 3 mg/kg/dan.

[0043] U drugom poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je obliku pogodnom za parenteralnu primenu. Poželjno farmaceutska kompozicija je obliku pogodnom za intravensku primenu. Poželjno farmaceutska kompozicija je obezbeđena u obliku vodenog rastvora za parenteralnu primenu, ili alternativno u obliku praška osušenog zamrzavanjem koji može da se pomeša sa vodom pre primene kako bi obezbedio vodeni rastvor za parenteralnu primenu. Poželjno farmaceutska kompozicija je vodeni rastvor ili suspenzija koja ima pH od 6 do 8.5.

[0044] U drugom poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je obliku pogodnom za respiratornu primenu. Poželjno farmaceutska kompozicija je obezbeđena obliku vodenog rastvora, suspenzije ili disperzije za respiratornu primenu, ili alternativno u obliku praška osušenog zamrzavanjem koji može da se pomeša sa vodom pre primene, kako bi obezbedio vodeni rastvor, suspenziju ili disperziju za respiratornu primenu. Poželjno farmaceutska kompozicija je obliku pogodnom za obezbeđivanje 0.01 do 10 mg/kg/dan hlorin e4 natrijuma, poželjno 0.1 do 5 mg/kg/dan, poželjno oko 3 mg/kg/dan.

[0045] Peti aspekt prema predmetnom pronalasku obezbeđuje hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti koja se karakteriše benignom ili malignom hiperproliferacijom ćelija ili oblastima neovaskularizacije; benignog ili malignog tumora; ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; Hočkinovog limfoma; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema ili kostiju.

[0046] Peti aspekt prema predmetnom pronalasku takođe obezbeđuje hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska za upotrebu u fotodinamičkoj terapiji ili citoluminescentnoj terapiji. Poželjno fototerapeutsko sredstvo je pogodno za lečenje bolesti koja se karakteriše benignom ili malignom hiperproliferacijom ćelija ili oblastima neovaskularizacije; benignog ili malignog tumora; ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; Hočkinovog limfoma; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema ili kostiju.

[0047] Poželjno hlorin e4 natrijum ili fototerapeutsko sredstvo prema petom aspektu predmetnog pronalaska pogodno je za lečenje bolesti koja se karakteriše benignom ili malignom hiperproliferacijom ćelija ili oblastima neovaskularizacije.

[0048] Poželjno hlorin e4 natrijum ili fototerapeutsko sredstvo prema petom aspektu predmetnog pronalaska pogodno je za lečenje benignog ili malignog tumora.

[0049] Poželjno hlorin e4 natrijum ili fototerapeutsko sredstvo prema petom aspektu predmetnog pronalaska pogodno je za lečenje ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; limfoma; Hočkinovog limfoma; kancera glave i vrata; oralnog ili kancera usta; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema, kostiju, kože ili pankreasa. Poželjno je pogodno za lečenje ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; Hočkinovog limfoma; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema ili kostiju. Poželjno je pogodno za lečenje limfoma; Hočkinovog limfoma; oralnog ili kancera usta; ili kancera prostate, grlića materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, pluća, jednjaka, bubrega, jetre, mozga, limfnog sistema, kostiju, kože ili pankreasa. Poželjno je pogodno za lečenje limfoma; oralnog ili kancera usta; ili kancera prostate, grlića materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, pluća, jednjaka, kostiju ili kože.

[0050] Peti aspekt prema predmetnom pronalasku takođe obezbeđuje hlorin e4 natrijum prema prvom aspektu predmetnog pronalaska za upotrebu u fotodinamičkoj dijagnostici.

1

[0051] Poželjno fotodijagnostičko sredstvo prema petom aspektu predmetnog pronalaska je pogodno za detekciju bolesti koja se karakteriše benignom ili malignom hiperproliferacijom ćelija ili oblastima neovaskularizacije; benignog ili malignog tumora; ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; Hočkinovog limfoma; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema ili kostiju.

[0052] Poželjno fotodijagnostičko sredstvo prema petom aspektu predmetnog pronalaska je pogodno za detekciju oblasti koja je pogođena benignom ili malignom hiperproliferacijom ćelija ili neovaskularizacijom.

[0053] Poželjno fotodijagnostičko sredstvo prema petom aspektu predmetnog pronalaska je pogodno za detekciju benignog ili malignog tumora.

[0054] Poželjno fotodijagnostičko sredstvo prema petom aspektu predmetnog pronalaska je pogodno za detekciju ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; limfoma; Hočkinovog limfoma; kancera glave i vrata; oralnog ili kancera usta; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema, kostiju, kože ili pankreasa. Poželjno je pogodno za detekciju ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; Hočkinovog limfoma; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema ili kostiju. Poželjno je pogodno za detekciju limfoma; Hočkinovog limfoma; oralnog ili kancera usta; ili kancera prostate, grlića materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, pluća, jednjaka, bubrega, jetre, mozga, limfnog sistema, kostiju, kože ili pankreasa. Poželjno su pogodni za detekciju limfoma; oralnog ili kancera usta; ili kancera prostate, grlića materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, pluća, jednjaka, kostiju ili kože.

[0055] Poželjno, fotodinamičko sredstvo prema petom aspektu predmetnog pronalaska je pogodno za fluorescentnu ili fosforescentnu detekciju navedenih bolesti, poželjno za fluorescentnu ili fosforescentnu detekciju i kvantifikaciju navedenih bolesti.

[0056] Poželjno, hlorin e4 natrijum, fototerapeutsko sredstvo ili fotodijagnostičko sredstvo su prilagođeni za primenu istovremeno sa primenom ili pre primene zračenja ili zvuka, poželjno za primenu pre primene zračenja.

[0057] Ako su hlorin e4 natrijum ili fototerapeutsko sredstvo za upotrebu u fotodinamičkoj terapiji ili citoluminescentnoj terapiji, onda su poželjno prilagođeni za primenu 5 do 100 sati pre ozračivanja, poželjno 6 do 72 sata pre ozračivanja, poželjno 24 do 48 sati pre ozračivanja.

[0058] Ukoliko je fotodijagnostičko sredstvo za upotrebu u fotodinamičkoj dijagnostici, onda je ono poželjno prilagođeno za primenu 3 do 60 sati pre zračenja, poželjno 8 do 40 sati pre zračenja.

[0059] Poželjno, ozračivanje koje se koristi u fotodinamičkoj terapiji, citoluminescentnoj terapiji ili fotodinamičkoj dijagnostici, predstavlja elektromagnetno zračenje sa talasnom dužinom u opsegu od 500nm do 1000nm, poželjno od 600nm do 790nm. Elektromagnetno zračenje može da se primenjuje tokom oko 5-60 minuta, poželjno tokom oko 15-20 minuta, na oko 0.1-5W, poželjno na oko 1W. U jednom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, koriste se dva izvora elektromagnetnog zračenja (na primer laserska svetlost i LED svetlost), jedan izvor sa talasnom dužinom u opsegu od 600nm do 690nm, poželjno oko 660nm, drugi izvor sa talasnom dužinom u opsegu od 700nm do 790nm, poželjno oko 760nm. U drugom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, koriste se dva izvora elektromagnetnog zračenja (na primer laserska svetlost i LED svetlost), gde su oba izvora prilagođena da obezbede zračenje sa talasnom dužinom u opsegu od 600nm do 690nm, poželjno oko 660nm, i zračenje sa talasnom dužinom u opsegu od 700nm do 790nm, poželjno oko 760nm. U drugom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, zračenje može da se obezbedi pomoću uređaja za ubacivanje u telesnu šupljinu, koji se ubacuje u prostatu, analno, vaginalno, u usta ili nos. U drugom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, zračenje može da se obezbedi aktivacijom svetlosti u intersticijumu, na primer, upotrebom fine igle za ubacivanje optičkog vlakna u pluća, jetru, limfne čvorove ili dojku. U drugom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, zračenje može da se obezbedi endoskopskom aktivacijom svetlosti, na primer, u cilju dostavljanja svetlosti u pluća, želudac, debelo crevo, bešiku ili vrat.

Kratak opis crteža

[0060]

Slika 1 prikazuje modifikovani Jablonski dijagram za tipični fotosenzitizer, koji u kratkim crtama daje principe fotofizičkih procesa od interesa.

Slika 2 šematski oslikava metalizaciju i demetalizaciju porfirinskog prstena.

Slika 3 šematski oslikava reakciju 1,3-difenilizobenzofurana (DPIBF) sa dva singletna kiseonika (<1>O2).

Slika 4 prikazuje apsorpcioni spektar rastvora hlorin e4 natrijuma (oko 10 µM) u etanolu.

Slika 5 prikazuje apsorpcioni spektar rastvora hlorin e4 natrijuma (oko 10 µM) u vodi.

Slika 6 prikazuje apsorpcioni spektar rastvora hlorin e4 natrijuma (oko 10 µM) u vodi sa 0.2 M deterdžentom natrijum dodecil sulfatom (SDS).

Slika 7 prikazuje fluorescentni spektar rastvora hlorin e4 natrijuma (oko 10 µM) u etanolu. Talasna dužina ekscitacije je iznosila 403 nm; apsorbancija na ovoj talasnoj dužini je bila 0.10; veličina kivete 1cm.

Slika 8 prikazuje fluorescentni spektar rastvora hlorin e4 natrijuma (oko 10 µM) u vodi. Talasna dužina ekscitacije je iznosila 403 nm; apsorbancija na ovoj talasnoj dužini je bila 0.13; veličina kivete 1cm.

Slika 9 prikazuje fluorescentni spektar rastvora hlorin e4 natrijuma (oko 10 µM) u vodi sa 0.2 M deterdžentom natrijum dodecil sulfatom (SDS). Talasna dužina ekscitacije je iznosila 403 nm; apsorbancija na ovoj talasnoj dužini je bila 0.13; veličina kivete 1cm.

Slika 10 prikazuje fluorescentni ekscitacioni spektar rastvora hlorin e4 natrijuma (oko 10 µM) u etanolu. Fluorescencija je merena na 710 nm; apsorbancija na 403 nm je bila 0.15 u 1 cm; optički put je iznosio 0.5 cm.

Slika 11 prikazuje apsorpcioni spektar rastvora DPIBF i hlorin e4 natrijuma u etanolu pre i 14 minuta nakon ozračivanja crvenom svetlošću (660 nm).

Slika 12 prikazuje kinetičke tragove (1) i spektar (2) fosforescencije singletnog kiseonika nakon pulsnog laserskog pobuđivanja hlorin e4 natrijuma u etanolu.

Slika 13 prikazuje kinetičke tragove (1) i spektar (2) fosforescencije singletnog kiseonika nakon pulsnog laserskog pobuđivanja hlorin e4 natrijuma u vodi.

Slika 14 prikazuje kinetičke tragove fosforescencije singletnog kiseonika nakon pulsnog laserskog pobuđivanja hlorin e4 natrijuma u vodi sa 0.2 M deterdžentom natrijum dodecil sulfatom (SDS).

Detaljan opis pronalaska

1

[0061] Insercija metala u centralni deo porfirinskog ili hlorinskog prstena poznata je kao metalizacija i taj opšti hemijski proces je prikazan na slici 2. Porfirini i hlorini mogu da obrazuju komplekse sa nizom različitih metala (M). Ovi metalni kompleksi ne samo da štite unutrašnje atome azota od elektrofilnih reagenasa i jakih baza, već imaju i naglašeni efekat na reaktivnost makrocikličnih molekula. Uobičajena geometrija ovih komplekasa je oktaedralna, gde metalni joni zauzimaju centar N4ravni porfirina i gde su ligandi metala u trans položajima (slika 2).

[0062] Hlorin e4 ima devet bočnih lanaca, od kojih dva nose neku komponentu karboksilne kiseline. Ove komponente karboksilnih kiselina mogu da obrazuju soli sa nizom različitih metala (M).

Detalji eksperimenata

Primer – detalji opšte sinteze

[0063] Postupak 1: 0.15-1mmol hlorina e4 rastvara se u 60-100ml metanola. U ovaj rastvor se dodaje 15-20ml natrijum hidroksida (3M vodeni rastvor). Smeša se meša dok se sinteza ne okonča, nakon oko 6 sati. Zatim se smeša filtrira kroz filter od 45µm kompanije Millipore. Proizvod se prečišćava brzom hromatografijom sa metanolom kao mobilnom fazom. Zatim se rastvor destiluje i liofilizira. U poželjnom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, reakcija se izvodi na temperaturi u opsegu od 25-60°C.

[0064] Postupak 2: 0.15-1mmol hlorina e4 rastvara se u 60-100ml metanola. U ovaj rastvor se dodaje 15-20ml natrijum hidroksida (3M vodeni rastvor). Odvojeno se rastvara 5-12mmol tiamin pirofosfata u 40-60ml vode, i taj rastvor se dodaje prethodnom. Smeša se meša dok se sinteza ne okonča, nakon oko 6 sati. Zatim se smeša filtrira kroz filter od 45µm kompanije Millipore. Proizvod se prečišćava brzom hromatografijom sa metanolom kao mobilnom fazom. Zatim se rastvor destiluje i liofilizira. U poželjnom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, reakcija se izvodi na temperaturi u opsegu od 25-60°C.

Primer - sinteza hlorin e4 natrijuma

[0065] Postupak 1: 0.5mmol (276mg) hlorina e4 je rastvoreno u 60ml metanola, i rastvor je polako mešan tokom 10 minuta na 40°C. 15ml natrijum hidroksida (3M vodeni rastvor) je dodato i mešanje je nastavljeno tokom dodatnih 6 sati na 60°C. Zatim je reakciona smeša filtrirana kroz filter od 45µm kompanije Millipore. Proizvod je prečišćen brzom hromatografijom na koloni sa suvim silika gelom uz upotrebu metanola kao mobilne faze. Zatim je zapremina rastvora smanjena u rotacionom uparivaču i proizvod je izolovan liofilizacijom u vidu suvog praha sa prinosom od 85%.

[0066] Proizvod hlorin e4 natrijuma okarakterisan je pomoću<1>H i<13>C NMR.

<1>H NMR (D2O) (milionitih delova): 8.82 (1H), 8.64 (1H), 6.52 (1H), 6.35 (1H), 5.25 (1H), 5.12 (1H), 4.68 (2H), 4.09 (3H), 3.52 (3H), 2.87 (1H), 2.71 (2H), 2.59 (3H), 2.44 (2H), 2.06 (1H), 1.82 (3H), 0.99 (6H).

<13>C NMR (D2O) (ppm): 185.7 (CO2H), 180.8 (CO2H), 171.6 (Ckvat=), 170.7 (Ckvat=), 148.0 (Ckvat=), 144.7 (Ckvat=), 139.0 (Ckvat=), 137.5 (Ckvat=), 136.5 (Ckvat=), 136.2 (Ckvat=), 135.3 (Ckvat=), 133.9 (Ckvat=), 133.6 (Ckvat=), 132.5 (Ckvat=), 131.2 (Ckvat=), 129.5 (CH=), 121.6 (CH2=), 121.4 (Ckvat=), 109.4 (Ckvat=), 101.2 (CH=), 97.4 (CH=), 96.2 (CH=), 56.8 (CH), 50.9 (CH), 38.0 (CH2), 34.5 (CH2), 26.1 (Me), 21.7 (Me), 20.1 (CH2), 18.7 (Me), 14.0 (Me), 12.6 (Me), 10.7 (Me).

[0067] Postupak 2: 0.5mmol (276mg) hlorina e4 je rastvoreno u 60ml metanola, i rastvor je polako mešan tokom 10 minuta na 40°C. 15ml natrijum hidroksida (3M vodeni rastvor) je dodato i mešanje je nastavljeno tokom dodatnih 20 minuta. Odvojeno je rastvoreno 6mmol (378mg) tiamin pirofosfata u 50ml vode, i rastvor je mešan na 60°C. Rastvor tiamin pirofosfata dodat je u rastvor hlorina e4, i reakciona smeša je polako mešana tokom 6 sati na 60°C. Zatim je reakciona smeša filtrirana kroz filter od 45µm kompanije Millipore. Proizvod je prečišćen brzom hromatografijom na koloni sa suvim silika gelom uz upotrebu metanola kao mobilne faze. Zatim je zapremina rastvora smanjena u rotacionom uparivaču i proizvod je izolovan liofilizacijom u vidu suvog praha sa prinosom od 85%.

[0068] Proizvod hlorin e4 natrijuma okarakterisan je pomoću<1>H i<13>C NMR. Dobijeni su isti rezultati kao i za postupak 1.

Primer - in vitro studije

[0069] Sledeći eksperimenti su izvedeni kako bi se proučavali apsorpcioni i fluorescentni spektri hlorin e4 natrijuma, kvantni prinosi fluorescencije hlorin e4 natrijuma i sposobnost fotosenzitizacije hlorin e4 natrijum u tri sistema – rastvoru u etanolu, čistoj vodi i vodi koja sadrži deterdžent natrijum dodecil sulfat (SDS).

Merenja apsorpcije i fluorescencije

[0070] Apsorpcioni spektri su snimljeni upotrebom kompjuterizovanih spektrofotometara Hitachi 3400 (Japan) i SF-2000 (Rusija). Fluorescentni spektri su mereni kompjuterizovanim spektrofluorimetrom Perkin-Elmer MPF-44B. Za merenja apsorpcije i fluorescencije korišćene su kvarcne kivete široke 10 mm. Fluorescencija je detektovana pod pravim uglom u odnosu na ekcitatorski zrak. Širina spektralne trake monohromatora je iznosila 3 nm. Da bi se izbegla reapsorpcija fluorescencije od strane pigmenta, korišćeni su razblaženi rastvori hlorin e4

1

natrijuma sa apsorbancijo na 403 nm koja nije prelazila 0.2 cm u kiveti od 1 cm. Kvantni prinosi fluorescencije (ΦF) određeni su koristeći kao referencu rastvore TPPS (m-tetrakis(psulfonatofenil)porfina) u etanolu. Prema literaturi, najverovatniji kvantni prinos fluorescencije TPPS u vazduhom zasićenoj vodi i etanolu jednak je 0.08 (K. Kalyanasundaram i M. Neumann-Spallart, Photophysical and redox properties of water soluble porphyrins in aqueous media, J. Phys. Chem., 1982, 86, 5163-5169; i A.T. Gradyushko, A.N. Sevchenko, K.N. Solovyov i M.P. Tsvirko, Energetics of photo-physical processes in chlorophyll-like molecules, Photochem. Photobiol., 1970, 11, 387-400). Fluorescencija uzoraka je pobuđivana monohromatskom svetlošću koja odgovara maksimumu Soretovih traka: 415 nm za TPPS u etanolu i 413 nm zaTPPS u vodi, i 403 nm za hlorin e4 natrijum u vodi i etanolu. Širina trake monohromatora je iznosila 3 nm. Kvantni prinosi fluorescencije (ΦF) su izračunati upotrebom sledeće jednačine:

gde je ΦTPPkvantni prinos fluorescencije TPPS, Sc je kvadrat ispod fluorescentnog spektra uzorka hlorin e4 natrijuma, STPP je kvadrat ispod fluorescentnog spektra TPPS, i Dc i DTPP su apsorbancije (optičke gustine) hlorin e4 natrijuma i TPPS redom, na ekscitacionim talasnim dužinama. Dobijeni rezultati su sumirani upotrebom relativnih jedinica za intenzitet pobuđene svetlosti na ekscitacionim talasnim dužinama. Intenziteti monohromatske svetlosti su mereni upotrebom kalibrisanog silicijumskog detektora Optical Power Meter System ThorLabs (Karlsfeld, Nemačka).

Detekcija fosforescencije singletnog kiseonika

[0071] Fosforescencija singletnog kiseonika je detektovana upotrebom merenja infracrvene fosforescencije na 1270 nm što odgovara tranziciji molekula kiseonika iz singletnog u tripletno stanje. Fosforescencija je snimana na sobnoj temperaturi laserskim fosforescentnim spektrometrom opisanim u publikacijama A.A. Krasnovsky Jr., Photodynamic action and singlet oxygen, Biofizika, 2004, 49, 305-321; i A.A. Krasnovsky Jr., Singlet oxygen and primary mechanisms of photodynamic therapy and photodynamic diseases, U: Photodynamic therapy at the cellular level, ed. A.B. Uzdensky, Research Singpost, Kerala, India, 2007, 17-62. Za pobuđivanje su korišćeni pulsevi zračenja od 511 nm, dobijeni od lasera sa parama bakra (Troitzk, Physics Institute of the Russian Academy of Science), trajanja merenog nanosekundama. Lasersko zračenje je dodatno prolazilo kroz zeleni svetlosni filter SZS-22 (4 mm), koji je propuštao lasersku svetlost i zadržavao IC lasersko zračenje izazvano zagrevanjem cevi lasera. Trajanje pulsa je iznosilo 20 ns, energija pulsa je varirala od 18 do 40 µJ, a brzina

1

ponavljanja pulsa je bila 12 kHz. Lasersko zračenje je kolimisano na površini pravougaone kvarcne kivete od 1 cm. Prečnik osvetljene tačke na površini ćelije iznosio je 5 mm. Za kinetička merenja je korišćen drugi spektrometar bez monohromatora. U ovom slučaju, fosforescencija dobijena pod pravim uglom u odnosu na ekscitacioni zrak bila je fokusirana na fotokatodi ohlađenog S-1 fotomultiplikatora (FEU-112) kroz filter za zadržavanje IR svetlosti i interferentni filter sa maksimumom transmisije na 1270 nm. Fosforescentni spektri su mereni upotrebom rešetkastog monohromatora velike propustljivosti, MS-80. U ovom slučaju, fosforescencija je bila fokusirana na ulazni prorez ovog monohromatora. Širina trake monohromatora odgovarala je spektralnom intervalu od 20 nm. Monohromatska svetlost je fokusirana na fotokatodu ohlađenog S-1 fotomultiplikatora (FEU-83). Signal fotomultiplikatora je registrovan upotrebom brojenja pojedinačnih fotona u korelaciji sa vremenom i određena je srednja vrednost za veliki broj laserskih pulseva. U većini eksperimenata, vreme rada jednog kanal je iznosilo 81 ns. Kada je izbeljivanje pigmenta dostiglo 10%, rastvor je zamenjen svežim rastvorom i merenje je nastavljeno. Pošto je hlorin e4 natrijum izbeljivao prilično brzo, rastvori su menjani posle svakog ozračivanja od 60-180 s. Dovoljno dobre fosforescentne krive dobijene su nakon 10-20 minuta sakupljanja signala, pa su, dakle, uzorci menjani mnogo puta. Kao što je ranije opisano (D.A. Butorina, A.A. Krasnovsky Jr. i A.V. Priezzev, Investigation of the kinetic parameters of singlet molecular oxygen in aqueous porphyrin solutions, Influence of detergents and the quencher sodium azide, Biofizika, 2003, 48, 189-196; A.A. Krasnovsky Jr., Luminescence and photochemical studies of singlet oxygen photonics, J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 2008, 196, 210-218; i N. Kuznetsova, D. Makarov, O. Yuzhakova, A. Strizhakov, Y. Roumbal, L. Ulanova, A. Krasnovsky i O. Kaliya, Photophysical properties and photodynamic activity of octacationic oxotitanium(IV) phthalocyanines, Photochemical Photobiological Sciences, 2009, 8, 1724-1733), za kompjutersku analizu korišćena je sledeća jednačina sa dve eksponencijalne funkcije:

I(t) = I0·[exp(-kraspada·t) – exp(-kporasta·t)] n

gde su kraspada i kporasta konstante brzine faze raspada i faze porasta krivih fosforescencije nakon laserskog pulsa, n je šum fotomultiplikatora kad je isključen, I0 je intenzitet fosforescencije za nulto vreme, i I(t) intenzitet fosforescencije za vreme t. Kako bi se smanjio doprinos luminescencije pigmenta u kvarcnoj kiveti, koji je uočen ubrzo nakon laserskih pulseva, očitavanja su vršena počevši od 400 ns nakon laserskih pulseva u etanolu i 1 µs u vodi. Osim toga, fosforescencija i kinetički tragovi su takođe mereni iz kontrolnih rastvora hlorin e4 natrijuma sa visokim koncentracijama natrijum azida, koji su potpuno ugasili singletni kiseonik. Ovaj postupak je otkrio jaku brzo raspadajuću komponentu odložene luminescencije u

1

rastvorima hlorin e4 natrijuma, koja nije bila tako lako ugašena natrijum azidom. Luminescentne krive dobijene iz kontrolnih rastvora aproksimirane su eksponencijalima i oduzete od eksperimentalnih kinetičkih tragova dobijenih za rastvore hlorin e4 natrijuma u koje nije dodavan natrijum azid.

[0072] Za merenja je korišćen softver Origin 6.0. Ovaj softver operiše upotrebom postupka aproksimacije najmanjih kvadrata. Origin je omogućio varijaciju parametara I0, kraspada, kporastai n, kako bi se dobile njihove vrednosti koje odgovaraju minimalnom koeficijentu x<2>. U rastvorima hlorin e4 natrijuma, merenja su uvek davala kraspada, koja je bila nešto kraća nego u referentnim rastvorima TPPS u istim rastvaračima. U rastvaračima koji su korišćeni u ovoj studiji, životni vek singletnog kiseonika, koji je odgovoran za kraspada, nezavisan je od pigmenata. Ovaj rezultat, dakle, ukazuje da “azidna kontrola” ne eliminiše u potpunosti brzo raspadajuću komponentu iz ukupnih krivih raspada. Moguće je da je luminescencija odgovorna za ovu komponentu delimično ugašena natrijum azidom. Da bi se eliminisala greška koju izaziva ovaj efekat, za finalna merenja fosforescentnih krivih u rastvorima hlorin e4 natrijuma, korišćena je fiksna kraspadadobijena u rastvorima TPPS. U ovom slučaju, kao što je Origin i pokazao, koeficijent korelacije R<2>nije bio manji od 98% i greška određivanja kporastabila je manja od ± 5% u svim rastvaračima. Kvantni prinosi (ΦΔ) fotogeneracije singletnog kiseonika hlorin e4 natrijumom određeni su iz poređenja ukupnih intenziteta fosforescencije singletnih kiseonika u rastvorima hlorin e4 natrijuma i referentnih rastvora TPPS u istim rastvaračima. Prema literaturi, najverovatnije vrednosti kvantnih prinosa fotogeneracije singletnog kiseonika pomoću TPPS iznose 0.6 u vodi i 0.7 u etanolu i vodi koja sadrži deterdžent (F. Wilkinson, W.P. Helman i A.B. Ross, Quantum yields of the photosensitized formation of the lowest electronically excited singlet states of molecular oxygen, J. Phys. Chem. Ref. Data, 1993, 22(2), 113-262; i C. Tanielian, C. Wolf i M. Esch, Singlet oxygen production in water: Aggregation and charge transfer effects, J. Phys. Chem., 1996, 100, 6555-6560). Ukupan intenzitet fosforescencije izračunavan je integraljenjem fosforescencije kinetičkih tragova. Apsorbancija rastvora pigmenta na 511 nm obično je iznosila oko 0.1-0.2 u kiveti od 5 mm. Ovo je odgovaralo koncentraciji pigmenta jednakoj oko 20 µM.

Detekcija singletnog kiseonika upotrebom hemijskih konjugata

[0073] Drugi postupak za detekciju singletnog kiseonika zasnivao se na fotosenzitiziranoj oksigenaciji konjugata singletnog kiseonika 1,3-difenilizobenzofurana (DPIBF) (Acros Organics, Velika Britanija). DPIBF se hemijski vezuje za dva singletna kiseonika (<1>O2) (slika 3). Ovaj postupak je bio primenjen na rastvore hlorin e4 natrijuma u etanolu. Glavna apsorpciona traka DPIBF nalazi se na 414-415 nm. Zna se da molarni apsorpcioni koeficijent na ovom

1

maksimumu, εDPIBF, iznosi 23500 M<-1>cm<-1>. Testirani rastvori su ozračeni monohromatskom svetlošću ksenonske lampe koristeći ekscitacioni sistem spektrofluorimetra Perkin-Elmer MPF-44B, gde je spektralna širina monohromatorske trake odgovarala 5 nm. Snaga zračenja je merena upotrebom kalibrisanog detektora ThorLabs PM-100 (Nemačka). Kvantni prinosi singletnog kiseonika (ΦΔ) izračunavani su prema jednačini:

gde je ΔDDPIBF smanjenje optičke gustine DPIBF na 414 nm tokom vremena ozračivanja, εDPIBFje molarni apsorpcioni koeficijent DPIBF na 414 nm, 1 je optički put jednak 1 cm, V je zapremina testiranih rastvora(obično 1.2-1.5 ml), NA je Avogadrov konstanta, Iirr snaga ozračivanja (u W) monohromatske svetlosti ekscitacionog sistema Perkin-Elmer spektrofluorimetra koji uključuje ksenonsku lampu i ekscitacioni monohromator sa širinom trake koja odgovara intervalu talasne dužine od 5 nm, hv je energija jednog fotona u J, (1-T) apsorpcioni faktor testiranih rastvora, tirr je vreme ozračivanja u sekundama, i ηP je frakcija molekula<1>O2uhvaćenih od strane DPIBF u proučavanim rastvorima. Ovaj parametar je izračunat upotrebom poznatih kinetičkih jednačina za potrošnju singletnog kiseonika od strane hemijskih konjugata i konstante brzine reakcije singletnog kiseonika sa DPIBF koja je jednaka 10<9>M<-1>s<-1>(videti A.A. Krasnovsky Jr., Y.V. Roumbal i A.A. Strizhakov, Rates of<1>O2production upon direct excitation of molecular oxygen by 1270 nm laser radiation in air-saturated alcohols and micellar aqueous dispersions, Chem. Phys. Lett., 2008, 458, 195-199; i reference sadržane u ovoj publikaciji).

Rezultati

[0074] Apsorpcioni spektri hlorin e4 natrijuma u etanolu, čistoj vodi i vodi koja sadrži deterdžent natrijum dodecil sulfat (SDS) prikazani su na slikama 4-6. Glavne apsorpcione trake navedene su u tabeli 1. Najjače su Soretova traka na 403 nm i crvena traka na 654-662 nm. Analiza apsorpcionih spektara ukazuje na to da je hlorin e4 natrijum uglavnom bio monomeran u svim rastvaračima. U vodi bez deterdženta, crveni apsorpcioni maksimum je blago pomeren ka regionu kraćih talasnih dužina (od 662 do 654 nm) i uočeno je slabo “rame” na oko 665-670 nm. Pored toga, uočena apsorbancija u zelenom regionu je bila povećana u odnosu na rastvore sa etanolom i deterdžentom. Ovi podaci pokazuju da rastvor u vodi bez deterdženta može da sadrži

1

agregirane (dimerne i oligomerne) molekule hlorin e4 natrijuma, koji se razdvajaju u prisustvu deterdženta.

Tabela 1 – Pozicije glavnih apsorpcionih i fluorescentnih traka rastvora hlorin e4 natrijuma

[0075] Merenja fluorescencije su podržala ovu pretpostavku (slike 7-9). Fluorescentni spektri su bili uglavnom slični u etanolu i vodi koja sadrži SDS. Slika 10 prikazuje ekscitacioni spektar fluorescencije hlorin e4 natrijuma u etanolu. Uočava se da se on praktično poklapa sa apsorpcionim spektrom ovog pigmenta. Ovo zapažanje pokazuje da fluorescencija potiče od hlorin e4 natrijuma. U vodi bez SDS, maksimum fluorescencije je bio pomeren ka kraćim talasnim dužinama i “rame” na oko 710 nm postalo je značajno jače nego u etanolu. Nađeno je da je kvantni prinos fluorescencije najviši u etanolu, nešto manji u vodi koja sadrži SDS i najmanji u vodi bez SDS. Ovi podaci ukazuju na to da u vodi dolazi do agregacije hlorin e4 natrijuma. Međutim, kvantni prinos fluorescencije hlorin e4 natrijuma i dalje je bio visok u vodi bez SDS, pokazujući da je znatna količina monomerinih molekula hlorin e4 natrijuma prisutna u vodenim rastvorima bez deterdženta. Ovi eksperimenti pokazuju da je hlorin e4 natrijum visoko fluorescentni pigment i da emituje velike količine fotona. Otuda hlorin e4 natrijum može efikasno da se koristi kao fluorescentni pigment za fotodinamičku dijagnostiku.

[0076] Obrazovanje singletnog kiseonika proučavano je u rastvorima etanola i upotrebom hemijskog konjugata singletnog kiseonika, DPIBF, i merenjem hlorin e4 natrijumom fotosensitizovane fosforescencije singletnog kiseonika na 1270 nm. Slika 11 ilustruje eksperiment sa DPIBF. Apsorpcioni maksimum DPIBF leži na 420 nm. Sa slike 11 vidi se da je ozračivanje rastvora etanola koji sadrži i hlorin e4 natrijum i DPIBF crvenom svetlošću (660 nm), koju apsorbuje hlorin e4 natrijum ali ne i DPIBF, izazvalo izbeljivanje DPIBF maksimuma na 420 nm. Ovaj efekat nastaje usled reakcije DPIBF sa singletnim kiseonikom, koji se obrazuje nakon ozračivanja hlorin e4 natrijuma. Pokazano je da kvantni prinos obrazovanja singleta kiseonika dobijen iz ovog eksperimenta iznosi 0.68 ± 0.05 u etanolu. Kinetički tragovi hlorin e4 natrijumom fotosensitizovane fosforescencije singletnog kiseonika nakon laserskih pulseva prikazani su na slikama 12-14. Tabela 2 daje kratak pregled kinetičkih parametara fosforescentnih krivih. Vreme porasta odražava brzinu obrazovanja singletnog kiseonika pomoću tripletnih molekula pigmenta. Ono odgovara životnom veku tripletnog stanja pigmenta u vazduhom zasićenom rastvoru pigmenta. U etanolu, vreme porasta je bilo jednako 300 ns.

2

Vreme raspada odgovara životnom veku singletnog kiseonika u etanolu (13.5 µs). Kvantni prinos singletnog kiseonika u etanolu određen upotrebom ovih kinetičkih krivih bio je jednak 0.63 ± 0.05, što je blisko vrednosti dobijenoj upotrebom DPIBF. Dakle, oba postupka su obezbedila sličan rezultat. Tabela 2 pokazuje da je hlorin e4 natrijum moćan fotosenzitizer obrazovanja singletnog kiseonika u alkoholnim kao i u vodenim sistemima, premda je u vodi SDS fotosenzitizujuća aktivnost bila niža nego u etanolu. Razlog za ovaj efekat je možda delimična agregacija molekula pigmenta, za koju se zna da dovodi do gubitka fotosenzitizujuće aktivnosti. Ovi eksperimenti pokazuju da hlorin e4 natrijum ima snažnu fotosenzitizujuću sposobnost u organskom rastvaraču (alkohol) i u vodenim medijumima, sa visokim kvantnim prinosom singletnog kiseonika. Otuda hlorin e4 natrijum može efikasno da se koristi u fotodinamičkoj terapiji.

Tabela 2 - Kinetički parametri fosforescencije fotosenzitizovanog singletnog kiseonika u vazduhom zasićenim rastvorima hlorin e4 natrijuma

Zaključak

[0077] Hlorin e4 natrijum pokazuje snažnu fluorescenciju i snažnu sposobnost fotosenzitizacije u organskom rastvaraču (alkoholu) i u vodenim medijumima. U vodi, fotosensitizujuća aktivnost hlorin e4 natrijuma opada usled agregacije molekula pigmenta, ali je i dalje visoka. Dodavanje deterdženta dovodi do razdvajanja i povećanja i fluorescencije i sposobnosti fotosenzitizacije. Ovo pokazuje da je hlorin e4 natrijum aktivan i u hidrofilnim i u vodenim medijumima. Stoga ovaj pigment obećava kada je u pitanju primena u fotodinamičkoj medicini.

Primer - in vivo studije

[0078] Sledeći onkološki pacijenti su uspešno lečeni hlorin e4 natrijumom. Većina pacijenata su bili onkološki pacijenti sa metastazama, koji su prethodno neuspešno koristili tradicionalne terapije za lečenje. Većina pacijenata je bila lošeg zdravstvenog stanja pre lečenja hlorin e4 natrijumom.

Primer 1

[0079] Žena pacijent, stara 70 godina, sa invazivnim duktalnim kancerom dojke i metastazama limfnih čvorova u desnoj pazušnoj jami, uspešno je lečena. Pre tretmana je u desnoj dojci uočena velika kancerozna masa i u desnoj pazušnoj jami mala kancerozna masa. Lečenje se sastojalo od tri ciklusa. U svakom ciklusu je oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijentkinja je tretirana laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

[0080] Nakon tretmana, analiza pomoću dopler ultrazvuka je pokazala da kod velike kancerozne mase u dojci skoro da ne postoji prokrvljenost, i nema krvnih sudova koje do nje vode. Veličina kancerozne mase nije se smanjila, međutim, njene ivice su bile čvrste i glatke, što ukazuje na neaktivan tumor koji ne raste. Manja kancerozna masa u limfnom čvoru takođe skoro da nije pokazivala prokrvljenost i veličina joj se smanjila od 1.9cm do 1cm.

[0081] Potom je pacijentkinja tretirana sa još dva dodatna ciklusa. Ponovo je za svaki ciklus oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijentkinja je tretirana laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm. Dodatno je na dojci izveden intersticijalni svetlosni tretman upotrebom fine igle sa laserom sa optičkim vlaknom, koji ima talasnu dužinu od 660nm i 760nm.

[0082] Dopler ultarzvučna analiza dobijena nakon četvrtog ciklusa tretmana, pokazala je da se veličina velike kancerozne mase u dojci smanjila za oko 25%. PET/CT snimci, dobijeni nakon petog i poslednjeg ciklusa tretmana, pokazali su ukupan odgovor u dojci i limfnim čvorovima. Posle svakog ciklusa lečenja, uočen je inflamatorni odgovor na mestu tumora u dojci, što je uobičajeno kada imunski sistem napada tumor. Pri kraju drugog ciklusa tretmana, pacijentkinja je osećala pečenje na mestu tumora u dojci. Pacijentkinja je trenutno, dve godine i tri meseca nakon početka lečenja i pet meseci nakon završetka lečenja, živa i dobro se oseća.

Primer 2

[0083] Muškarac pacijent, star 62 godine, sa karcinomom nazo-fariksa koji se protezao na limfni čvor u levoj strani vrata, uspešno je lečen. Lečenje se sastojalo od tri ciklusa. U svakom ciklusu je oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana.24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijent je tretiran laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

[0084] Neposredno nakon lečenja, biopsija tretiranog limfnog čvora u vratu pokazala je benigni ili nekancerozni limfni čvor, ćelije kancera nisu bile detektovane. Ovo je potvrđeno drugom biopsijom, deset meseci nakon lečenja. Poređenje CT snimaka, dobijenih jedan mesec pre i deset meseci nakon lečenja, pokazalo je da nema rasejanja tumora i da je veličina tumora smanjena.

[0085] Potom je pacijent tretiran dodatnim ciklusom. Ponovo je za ciklus oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijent je tretiran laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

[0086] Slike ultrazvuka i biopsije dobijene nakon poslednjeg ciklusa tretmana, pokazale su ukupan odgovor. Pacijent nije patio od sporednih efekata, ali je posle svakog tretmana uočavan inflamatorni odgovor što je uobičajeno kada imunski sistem napada tumor. Pacijent je trenutno, dve godine i šest meseci nakon početka lečenja i pet meseci nakon završetka lečenja, živ i dobro se oseća.

Primer 3

[0087] Pacijent muškarac, star 71 godinu, sa uznapredovalom metastatskom bolešću bubrega, sa metastazama u žučnoj kesi, jetri i plućima, uspešno je lečen. Lečenje se sastojalo od tri ciklusa. U svakom ciklusu je oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijent je tretiran laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

[0088] PET/CT snimci, dobijeni neposredno pre lečenja i dva meseca, tri meseca, pet meseci i 15 meseci nakon lečenja, pokazali su da su u telu pacijenta neki tumori sasvim nestali, a da se veličina preostalih tumora smanjila. Dodatne metastaze nisu uočene.

[0089] Potom je pacijent tretiran sa još dva dodatna ciklusa. Ponovo je za svaki ciklus oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijent je tretiran laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm. Dodatno je na jetri i plućima izveden intersticijalni svetlosni tretman upotrebom fine igle sa laserom sa optičkim vlaknom, koji ima talasnu dužinu od 660nm i 760nm.

[0090] PET/CT snimci ponovo su pokazali dobar odgovor na tretman. Pacijent nije patio od sporednih efekata usled tretmana. Nažalost, pacijent je nedavno preminuo. Pre pet ciklusa tretmana, on je bio onkološki pacijent u uznapredovalom stadijumu bolesti sa očekivanim preživljavanjem od samo šest meseci, ali je uspeo da živi aktivnim životom tokom dve godine i četiri meseca.

Primer 4

[0091] Žena pacijent, stara 20 godina sa Hočkinovim limfomom stadijuma IVB sa metastazama u jetri, limfnom sistemu, slezini, plućima i na kostima, uspešno je lečena. Lečenje se sastojalo od tri ciklusa. U svakom ciklusu je oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4

2

natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijentkinja je tretirana laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

[0092] CT snimci su pokazali da su u područjima tela pacijentkinje koja su do sada tretirana laserskom i LED svetlošću, neki tumori potpuno nestali, a da je veličina nekih tumora smanjena.

[0093] Potom je pacijentkinja tretirana sa još dva dodatna ciklusa. Ponovo je za svaki ciklus oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijentkinja je tretirana laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

[0094] PET/CT snimci su ponovo pokazali dobar odgovor na tretman. Pacijentkinja je nažalost, nedavno preminula. Pre pet ciklusa tretmana, ona je bila u izuzetno lošem stanju, patila je od ekstremnog gubitka težine i letargije, preslaba da hoda i uz neprekidnu potrebu za lekovima protiv bolova. Pre lečenja, njeno očekivano preživljavanje je bilo samo dve nedelje, ali je uspela da živi još dve godine i dva meseca, i to bar delom aktivno.

Primer 5

[0095] Pacijent muškarac, star 82 godine, sa kancerom pluća, uspešno je lečen. Lečenje se sastojalo od jednog ciklusa od pet oralno primenjenih doza od 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijent je tretiran laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

[0096] Tri meseca nakon lečenja, pacijent je iskašljavao krv i tumorsko tkivo. CT snimak je pokazao razgradnju tumora.

Primer 6

[0097] Pacijent muškarac, star 46 godina, sa kancerom pluća, uspešno je lečen. Lečenje se sastojalo od tri ciklusa. U svakom ciklusu je oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijent je tretiran laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

[0098] CT snimak dobijen neposredno nakon poslednjeg ciklusa tretmana pokazao je potpuni oporavak od kancera pluća.

Primer 7

[0099] Žena pacijent, stara 54 godine, sa uznapredovalim kancerom pankreasa sa metastazama u jetri, uspešno je lečena. Pre lečenja, pacijentkinja je bila lošeg opšteg zdravstvenog stanja i patila je od ekstremnog gubitka težine, bola i drugih simptoma tipičnih za uznapredovali kancer pankreasa. Lečenje se sastojalo od tri ciklusa. U svakom ciklusu je oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24 sata nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijentkinja je tretirana laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

[0100] PET/CT snimci pankreasa, dobijeni pre i posle lečenja, pokazali su poboljšanja i dobar odgovor na tretman u oblasti pankreasa. Pacijentkinja nije imala fotosenzitivnu reakciju i manje je patila od bolova. Nažalost, blokada creva i neuhranjenost doveli su do smrti pacijentkinje.

Primer 8

[0101] Žena pacijent, stara 67 godina, sa nesitnoćelijskim kancerom pluća sa metastazama u limfnim čvorovima i kostima, uspešno je lečena. Lečenje se sastojalo od dva ciklusa. U svakom ciklusu je oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. Oko 24 sata nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijentkinja je tretirana laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

[0102] PET/CT snimci pluća, dobijeni pre i posle lečenja, pokazali su izražen odgovor na tretman, pri čemu su brojni tumori nestali, a preostali tumori su pokazivali nikakvu ili nisku metaboličku aktivnost nakon tretmana. Pacijentkinja nije patila od sporednih efekata i njeno zdravstveno stanje se poboljšalo. Ona je trenutno, 10 meseci nakon otpočinjanja lečenja i sedam meseci po završetku lečenja, živa i oseća se dobro.

Primer 9

[0103] Žena pacijent, stara 54 godine, sa kancerom dojke u desnoj dojci, uspešno je lečena. Lečenje se sastojalo od tri ciklusa. U svakom ciklusu je oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijentkinja je tretirana laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

[0104] Mamografija, ultrazvuk i PET/CT snimci grudi, dobijeni pre i posle lečenja, pokazali su potpun odgovor. Pacijentkinja nije patila od sporednih efekata. Ona je trenutno, jednu godinu i sedam meseci nakon otpočinjanja lečenja i 10 meseci po završetku lečenja, živa, i oseća se dobro.

Primer 10

[0105] Muškarac pacijent, star 33 godine, sa karcinomom nazo-fariksa sa metastazama u limfnim čvorovima u levoj strani vrata i u plućima, uspešno je lečen. Lečenje se sastojalo od pet ciklusa. U svakom ciklusu je oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijent je

2

tretiran laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm. Dodatno je na levom plućnom krilu, na velikom tumoru, izveden intersticijalni svetlosni tretman upotrebom fine igle sa laserom sa optičkim vlaknom, koji ima talasnu dužinu od 660nm i 760nm.

[0106] PET/CT snimci su pokazali veoma dobar odgovor na tretman. Pacijent je trenutno, jednu godinu i pet meseci nakon početka lečenja i dva meseca nakon završetka lečenja, živ i dobro se oseća.

Primer 11

[0107] Žena pacijent, stara 44 godine, sa kancerom pluća sa metastazama u limfnim čvorovima i sakralnoj kosti, uspešno je lečena. Pacijentkinja je imala operaciju pri kojoj je odstranjen primarni tumor na plućima i završila je četiri ciklusa hemioterapije. Naknadni PET/CT snimci pokazali su tumore u limfnim čvorovima vrata, limfnim čvorovima u levoj pazušnoj jami i u sakralnoj kosti. Lečenje se sastojalo od pet ciklusa. U svakom ciklusu je oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijentkinja je tretirana laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm. Dodatno je, tokom dva ciklusa tretmana, na sakralnoj kosti izveden intersticijalni svetlosni tretman upotrebom fine igle sa laserom sa optičkim vlaknom koji ima talasnu dužinu od 660nm i 760nm. Osim toga, tokom dva poslednja ciklusa tretmana primenjena je mezotelijumska terapija rasta kostiju.

[0108] PET/CT snimci su pokazali potpuni odgovor, bez aktivnih tumora u telu pacijenta. Pacijentkinja je trenutno, 10 meseci nakon početka lečenja i četiri meseca nakon završetka lečenja, živa i dobro se oseća.

Primer 12

[0109] Muškarac pacijent, star 52 godine, sa kancerom mozga, sa metastazama u plućima i limfnim čvorovima, uspešno je lečen. MRI snimak pokazao je veliku tumorsku masu u mozgu. Pacijent je imao operaciju kojom je uklonjen pritisak koji je tumor vršio na mozak, ali nije prošao hemioterapiju ili radioterapiju. Naknadni PET/CT snimci su pokazali aktivne tumore u mozgu sa metastazama u oba plućna krila i u limfnim čvorovima u desnom cervikalnom i desnom supraklavikularnom regionu. Pacijent je imao povremene epileptične napade i teške glavobolje. Lečenje se sastojalo od dva ciklusa. U svakom ciklusu je oralno primenjeno pet doza od po 62.5-187.5mg hlorin e4 natrijuma tokom osam dana. 24-48 sati nakon svake oralne doze hlorin e4 natrijuma, pacijent je tretiran laserskom i LED svetlošću talasnih dužina od 660nm i 760nm.

2

[0110] PET/CT snimci pokazali su potpuni odgovor u plućima i odsustvo metaboličke aktivnosti u oblasti moždanog tumora. Limfni čvorovi još nisu bili čisti i pacijent će proći kroz treći ciklus tretmana.

Primer – klinička studija sa pacijentima koji pate od uznapredovalog nesitnoćelijskog kancera pluća

[0111] Putem patološke i citološke dijagnostike, 66 pacijenata sa uznapredovalim nesitnoćelijskim kancerom pluća je odabrano i nasumično podeljeno u dve grupe. U grupi A bila su 32 pacijenta koji su tretirani hlorin e4 natrijumom. U grupi B bila su 34 pacijenta koji su tretirani i hemioterapijom, i radioterapijom.

[0112] Za grupu A, hlorin e4 natrijum je primenjen u dozi od 2 mg po kilogramu telesne težine, pri čemu su dve trećine primenjene putem inhalacije, a jedna trećina je primenjena oralno. Pošto je određeno ciljno(a) mesto(a) za ozračivanje, optičko vlakno namenjeno za tretman laserom, uvedeno je u tumor(e) u plućima intersticijalnim postupkom. Intenzitet svetlosti za ozračivanje je iznosio 200 J/cm<2>, snaga ozračivanja je bila 1,000 mW, i iluminacija je trajalo od osam do deset minuta. Prodiranje laserskog zračenja u tumor iznosilo je 2 do 5 centimetara. Ozračivanje je izvođeno ili po fazama (tretman pododeljaka) na osnovu veličine tumora ili se ponavljalo.

[0113] Za grupu B, za radioterapiju, polje ozračivanja X-zracima od 15 MV za radijacionu terapiju pokrilo je primarnu tumorsku leziju(e) u plućima i oblast limfne drenaže u medijastinumu, sa dozom od 65-70 Gy, primenjenom svakog prvog dana u nedelji radioterapije. Za hemioterapiju je intravenski primenjivano 20 mg cisplatina.

[0114] Stope preživljavanja od jedne ili dve godine, za grupe A i B, iznosile su 93.75%, 70.60% i 68.75, 32.35% redom, razlika je bila statistički značajna (P<0.05). Kombinovane ukupne i parcijalne stope remisije za grupe A i B bile su 56.20% i 21.30%, stopa grupe A bila je značajno viša nego stopa grupe B, razlika je bila statistički značajna (P<0.05).

Primer – studija na miševima sa potkožnim sarkomom S180

[0115] U ovom eksperimentu su posmatrani efekti fotodinamičke terapije posredovane putem tri različita fotosenzitizera, naime, duteroporfirinom, hlorin e4 natrijumom i 5-ALA, na mišijem sarkomu S180. Duteroporfirin i 5-ALA su derivati porfirina.

[0116] 40 Kunming miševa sa solidno izraslim potkožnim sarkomima S180 nasumično je podeljeno u četiri grupe: (A) duteroporfirin grupu (10mg/kg), (B) hlorin e4 natrijum grupu (20mg/kg), (C) 5-ALA grupu (100mg/kg) i (D) kontrolnu grupu u vidu slepe probe. Miševi u grupama A i B izloženi su iluminaciji 8-10 sati nakon što su dobili injekciju fotosensitizera u repnu venu, dok su miševi u grupi C izloženi iluminaciji 3 sata nakon što su dobili injekciju

2

fotosensitizera u repnu venu. Laser talasne dužine 630nm korišćen je za grupe A i C, dok je laser sa dvostrukom frekvencijom sa talasnim dužinama od 660nm i 760nm korišćen za grupu B. Mesta lokalnih tumora su ozračena vertikalno, sa prečnikom laserskih tačaka od 1.2-1.5cm. Ceo tumor i 3-5mm normalnog tkiva oko tumora, bilo je pokriveno laserom. Laseri su primenjeni na grupe A, B i C tokom 20 minuta, sa gustinom snage 150 mW/cm<2>i gustinom energije od 180 J/cm<2>. Miševi u kontrolnoj grupi D nisu bili izloženi iluminaciji.

[0117] Nakon tretmana, uočene su promene izgleda tumora. Crni prištevi su uočeni u grupama A i B nakon tretmana, dok su prištevi uočeni u grupi C bili tanji i braonkasto crvene boje. Pošto su prištevi otpali, koža i krzno potpuno su se oporavili u sve tri tretirane grupe; oporavak kože je bio najbrži u grupi C.

[0118] Iz krivih rasta tumora moglo se videti da šest dana nakon tretmana nije bilo očigledne razlike u veličinama tumora u tretiranim grupama A, B i C i kontrolnoj grupi D. Moguće je da su razlog za to bili edemi i prištevi izazvani tretmanom, koji su se javljali na ozračenim mestima. Posmatranje veličina tumora, 21 dan nakon tretmana, pokazalo je da su razlike srednjih vrednosti između svih tretiranih grupa A, B i C i kontrolne grupe D bile statistički značajne (P<0.05), pri čemu je srednja vrednost zapremine bila statistički značajno manja u tretiranim grupama A, B i C nego u kontrolnoj grupi D. Razlika srednje zapremine za grupe B i C takođe je bila satistički značajna (P<0.05), pri čemu je srednja vrednost zapremine bila statistički značajno manja u grupi B nego u grupi C.

[0119] Osim toga, sve tretirane grupe pokazale su statistički značajnu inhibiciju tumora u poređenju sa kontrolnom grupom D, a grupa B pokazala je statistički značajno bolji terapeutski efekat nego grupa C (P<0.05). Stope inhibicije tumora u grupama A, B i C iznosile su redom 62.5%, 75.4% i 37.2%.

[0120] Na osnovu analize apoptotskih i nekrotičnih tumorskih ćelija, pomoću FCM, 24 sata nakon tretmana, udeli apoptotskih i nekrotičnih tumorskih ćelija bili su mnogo viši i živih ćelija je bilo očigledno manje, u svim tretiranim grupama A, B i C nego u kontrolnoj grupi D, što je pokazalo jasne efekte u svim tretiranim grupama, kad je ubijanje ćelija kancera u pitanju.

[0121] Patološki preseci tumorskog tkiva posmatrani su zahvaljujući HE bojenju. Patološke promene tumorskog tkiva u tretiranim grupama A, B i C, 24 sata nakon tretmana, uključile su: širok opseg tumorske nekroze, poremećaj vaskularizacije tumora i infiltraciju neutrofila.

[0122] Mehanizam ubijanja ćelija fotodinamičkom terapijom uključuje direktno ubijanje tumorskih ćelija, oštećenje krvnih sudova u tumorima i stimulaciju imunskog sistema pacijenata. Ovi faktori mogu jedan drugom da doprinose i predstavljaju dugoročne mehanizme za kontrolu tumora.

2

[0123] Ukratko, ova studija je potvrdila da fotodinamička terapija sa duteroporfirinom, hlorin e4 natrijumom i 5-ALA može da inhibira rast sarkoma S180 kod miševa. Hlorin e4 natrijum imao je sličan ili neznatno bolji terapeutski efekat nego duteroporfirin, i statistički značajno bolji terapeutski efekat nego 5-ALA.

[0124] Podrazumevaće se da je predmetni pronalazak prethodno u tekstu samo opisan putem primera.

2

Claims (17)

1. Patentni zahtevi 1. Hlorin e4 natrijum, koji ima strukturu:
2. 2. Hlorin e4 natrijum prema patentnom zahtevu 1, koji ima strukturu:
3. 3. Postupak za pripremu hlorin e4 natrijuma prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji sadrži korak reakcije hlorina e4 sa jedinjenjem natrijuma.
4. 4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, gde je jedinjenje natrijuma natrijum hidroksid.
5. 5. Postupak prema patentnom zahtevu 3 ili 4, pri čemu hlorin e4 reaguje sa jedinjenjem natrijuma u prisustvu baze, poželjno aminske baze, poželjno tiamin pirofosfata.
6. 6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 5, pri čemu se hlorin e4, jedinjenje natrijuma i izborna baza koriste u molarnom odnosu od 0.15-1 : 45-60 : 0-12.
7. 7. Hlorin e4 natrijum prema patentnom zahtevu 1 ili 2, za upotrebu u medicini.
8. 8. Hlorin e4 natrijum prema bilo kom od patentnih zahteva 1, 2 ili 7, za upotrebu u fotodinamičkoj terapiji ili citoluminescentnoj terapiji.
9. 9. Hlorin e4 natrijum prema bilo kom od patentnih zahteva 1, 2, 7 ili 8, za upotrebu u lečenju: (i) bolesti naznačene benignom ili malignom hiperproliferacijom ćelija ili oblastima neovaskularizacije; i/ili (ii) benignog ili malignog tumora; i/ili (iii) ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; limfoma; Hočkinovog limfoma; kancera glave i vrata; oralnog ili kancera usta; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema, kostiju, kože ili pankreasa.
10. 10. Hlorin e4 natrijum prema bilo kom od patentnih zahteva 1, 2 ili 7, za upotrebu u fotodinamičkoj dijagnostici.
11. 11. Hlorin e4 natrijum za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 10, gde je hlorin e4 natrijum prilagođen za primenu pre primene ozračivanja, pri čemu ozračivanje poželjno predstavlja elektromagnetno zračenje sa talasnom dužinom u opsegu od 500nm do 1000nm.
12. 12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži hlorin e4 natrijum prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2 ili 7-11 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
13. 13. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 12, za upotrebu u fotodinamičkoj terapiji ili citoluminescentnoj terapiji.
14. 14. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 12 ili 13, za upotrebu u lečenju: (i) bolesti naznačene benignom ili malignom hiperproliferacijom ćelija ili oblastima neovaskularizacije; i/ili (ii) benignog ili malignog tumora; i/ili (iii) ranog kancera; cervikalne displazije; sarkoma mekog tkiva; tumora klicinih ćelija; retinoblastoma; limfoma; Hočkinovog limfoma; kancera glave i vrata; oralnog ili kancera usta; ili kancera krvi, prostate, grlića materice, materice, vagine ili drugih ženskih 1 adneksa, dojke, nazo-farinksa, traheje, larinksa, bronhija, bronhiola, pluća, šupljih organa, jednjaka, želuca, žučnog kanala, tankog creva, debelog creva, kolorektuma, rektuma, bešike, uretera, bubrega, jetre, žučne kese, slezine, mozga, limfnog sistema, kostiju, kože ili pankreasa.
15. 15. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 12, za upotrebu u fotodinamičkoj dijagnostici.
16. 16. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 12 do 15, gde je farmaceutska kompozicija prilagođena za primenu pre primene ozračivanja, pri čemu ozračivanje poželjno predstavlja elektromagnetno zračenje sa talasnom dužinom u opsegu od 500nm do 1000nm.
17. 17. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 12 do 16, naznačena time što je farmaceutska kompozicija u obliku pogodnom za oralnu, parenteralnu (uključujući intravensku, potkožnu, intramuskularnu, intradermalnu, intratrahealnu, intraperitonealnu, intraartikularnu, intraabdominalnu, intrakranijalnu i epiduralnu), transdermalnu, respiratornu (aerosol), rektalnu, vaginalnu ili topikalnu (uključujući bukalnu, mukoznu i sublingvalnu) primenu, gde je poželjno farmaceutska kompozicija u obliku pogodnom za oralnu ili parenteralnu primenu. 2