RS60268B1 - Aminokiselinska struktura za obnovu fibroelastina u dermalnim vezujućim tkivima - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na strukture koje sadrže, kao aktivni sastojak, smešu aminokiselina koje su sposobne da stimulišu biosintezu elastina i kolagena.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Dermis je srednji deo kože koji vrši potporne i trofičke funkcije i daje koži kao celini snagu, elastičnost, čvrstinu i metaboličku održivost. Dermis sadrži ć elije nazvane fibroblasti, tj. specijalizovane ć elije mezenhimskog porekla, koje kontinuirano obnavljaju intersticijski matriks koji se uglavnom sastoji od glikozaminoglikana (GAG) i proteoglikana (PGs), hidrofilnih supstanci glikozida i glikopeptidne prirode. Navedeni makromolekuli zadržavaju velike količine vode, što čini hidrofilnu mrežu u formi gela u koju su uronjeni svi vlaknasti proteini koji koži daju snagu i tonus.

[0003] Fibroblasti su takođe odgovorni za sintezu elastina, proteina elastičnih svojstava koji daje koži i sluzokoži osnovno svojstvo prilagođavanja morfološkim i mehaničkim promenama kroz koje prolazi.

[0004] Elastin je sposoban da se proteže do 7 puta više od sopstvene dužine i da se vrati svom dimenzionom modulu bez značajnih molekularnih izmena i teoretski to može ponoviti neograničen broj puta.

[0005] Uslovi poznati kao starenje kože i fotostarenje predstavljaju objektivne dermatološke manifestacije veoma složenih biohemijskih pojava koje uključuju ć elije, površinske strukture tkiva i, pre svega, duboke strukture tkiva.

[0006] Fotostarenje uzrokuje pojavu bora različitog broja i dubina na površini kože, posebno tamo gde je izložena svetlosti (lice, dekolte i trup), elastozi i manje ili više difuzniih pigmentnih mrlja, zadebljanja epiderme i pega. Elastična komponenta kože, predstavljena mrežom elastinskih vlakana koja se nalaze u distalnom delu dermalnog tkiva (retikularni dermis), pretrpi značajne promene kao rezultat gore opisanih fenomena fotostarenja, što uzrokuje značajan gubitak ukupne elastične sposobnosti kože. Na makroskopskom nivou, navedene pojave smanjuju sposobnost vezivnog tkiva kože da se prilagođava mehaničkom istezanju, što dovodi do propadanja tkiva i elastoze.

[0007] Gen koji kodira protein tropoelastin (ELN-gen), koji je prekursor elastina, je jedinstven; ne postoji nekoliko gena (super-porodica) koji kodiraju različite oblike elastina kao što je slučaj sa kolagenom [1]. Spomenuti gen kodira različite oblike tropoelastina (stoga verovatno postoji različiti postupak kodiranja tropoelastina za zdrava i novoformirana tkiva, na primer kao odgovor na fizička ošteć enja kao što su opekotine ili fotostarenje); ve ć počinje da se izražava u fazi fetusa, ostaje aktivan prvih 5 godina života i zatim se drastično usporava, sve dok aktivnost ne prestane [1, 2]. Drugim rečima, elastična komponenta vezivnog tkiva, a posebno dermisa, sluzokože, hrskavičavog tkiva, tunica intima, pluć nog i valvularnog/miokardnog vezivnog tkiva, ve ć prestaje da se sintetiše u prvim godinama života. Navedena komponenta, prema tome, predstavlja „snabdevanje elastičnosti“ tela i nikada se ne dopunjava tokom svog životnog veka, osim u slučaju ozbiljnih ošteć enja tkiva, poput opekotina i jakog fotostarenja. U ovim slučajevima postoji prekomerna ekspresija gena LOX (lizin oksidaza), koji kodiraju 5 različitih enzima koji katalizuju oksidaciju ostataka lizina u molekulima prekursora tropoelastina, što je neophodan korak za sintezu funkcionalnog elastina i njegovu naknadnu ugradnju u mikrofibrile koji se lepe na ć elijsku površinu [3,4]. Naročito se navedeni postupak koji zavisi od enzima sastoji od oksidacije lizina i istovremenog formiranja Schiff-ove baze između amino grupe L-LYS i aldoze, da bi se dobila umrežena intramolekularna veza [5, 6]. Elastin je jedini protein vezivnog tkiva koji u suštini nije zamenjen i ostaje isti tokom 70 godina (srednji poluživot 74 godine).

[0008] U slučaju kolagena, kolagen tipa IV igra ključnu ulogu u procesu strukturiranja bazalne dermoepidermalne membrane i supramolekularne organizacije vanć elijskog matriksa (ECM), sa posebnim osvrtom na ć elijsku orijentaciju u matriksu. Manjak kolagena IV usko je povezan sa gubitkom trofizma i elastične snage ljudske kože, naročito u pojavama degeneracija kože tipičnih za starenje kože i fotostarenje [7, 8].

[0009] Poznate su specifične kombinacije aminokiselina i oligopeptida koje, ako se prikladno nose i primenjuju lokalno ili oralno, promovišu ekspresiju gena koji stvara novu sintezu proteina u dermoepidermalnom vezivnom tkivu, sluzokoži i zglobnoj hrskavici, posebno sintezu kolagena i tropoelastina [9, 10, 11, 12].

[0010] Jedna od glavnih pojava koja učestvuje u progresivnom padu elastične funkcije dermoepidermalnih tkiva tokom starenja kože i fotostarenja predstavlja progresivni gubitak aktivnosti biosinteze od strane fibroblasta, ć elija odgovornih za regeneraciju proteina kolagena i elastina i dermalnog vanć elijskog matriksa (ECM). Kao rezultat ove pojave, u slučaju nedovoljne ili slabe sinteze novih strukturnih dermalnih proteina i hidrofilnih vanć elijskih matriksa, povećava se njihova razgradnja specifičnim kataboličkim enzimima zvanim elastaza, metaloproteinaza, kolagenaza i želatinaza [13, 14, 15]. Spomenuti enzimi, koji su hipereksprimirani i sintetizovani u mitohondrijama fibroblasta za starenje i makrofaga, preokreću "sinteza-rušenje" ravnotežu u pravac rušenja, što dovodi do sporog, ali progresivnog propadanja tkiva, koje tako postaje manje kompaktno, manje elastično i manje hidratizovano (nedostatak GAG-a, PG-a i komponente fibroelastina). Da bi se inhibirao ili bar ograničio navedeni fenomen, koji je delimično fiziološki ali je pogoršan različitim okolnim i genetskim uzrocima, potrebno je promovisati ekspresiju gena koji indukuju sintezu strukturnih proteina u fibroblastima (tropoelastin i kolagen) u svim oblastima u kojima su potonji prisutni i istovremeno smanjiti ekspresiju gena odgovornih za kodiranje metaloproteinaza, posebno onih specijalizovanih za razgradnju kolagena i elastina (kolagenaza i elastaza).

[0011] Obzirom na pojačane kataboličke aktivnosti posredovane hiperekspresijom gena enzima koji razgrađuju matriks, naročito kolagenaze i elastaze, topikalne ili injektivne primene, direktno u dermoepidermalno tkivo, sluzokožu ili zglobove, supstanci sa dokazanom aktivnošć u koja inhibira ekspresiju navedenih enzima, posebno je strateški. Naročito, N-acetilcistein, N-acetilirani oblik sumporne aminokiseline L-cistein, pokazuje očigledno delovanje koje inhibira ekspresiju metaloelastaza indukovanih foto-zračenjem [16]. Njegovo istovremeno uvođenje u strukture poliamino kiselina koji obavljaju elastogenu i kolagenu aktivnost je korisno za promociju oporavka i održavanja sadržaja elastina i kolagena u vezivnom tkivu.

[0012] Hijaluronska kiselina (HA) je glavni GAG prisutan u amorfnom intersticijskom matriksu vezivnog tkiva.

[0013] GAG-ovi (glikozaminoglikani) su polisaharidni molekuli koji se sastoje od ponavljajuć ih mono- ili disaharidnih jedinica; hijaluronska kiselina je poliglukodimer koji se sastoji od N-acetil glukozamina i glukuronske kiseline. HA je jedini GAG čiji molekul ne uključuje sulfatne grupe i jedini koji ima nerazgranatu linearnu strukturu. Ostali GAG-ovi prisutni u amorfnom matriksu vezivnog tkiva i komponente drugih struktura vezivnog tkiva poput tetiva i hrskavice su hondroitin sulfat, keratan sulfat, heparan sulfat, dermatan sulfat i heparin. HA vrši presudne hidratantne funkcije u ECM-u, promovišuć i pokretljivost ć elija, razmenu hranljivih materija i rastvorljivih faktora proteina i modulaciju biohemijskih pojava regeneracije i organizacije matriksa fibro-vezivnog tkiva.

[0014] Mešavine aminokiselina za injektiranje, topikalnu ili oralnu upotrebu su opisane u EP 2 033 689, WO 2007/048522 i WO 2011/064297. Međutim, nijedna od opisanih struktura ne sadrži mešavinu glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-leucina i L-lizin hidrohlorida u odgovarajuć im odnosima, koji su u stanju da stimulišu sintezu i kolagena i elastina.

OPIS PRONALASKA

[0015] Pronalazak se odnosi na strukture koje sadrže mešavinu aminokiselina koje selektivno pokreć u ekspresiju gena koji kodiraju tropoelastin (ELN), lizin oksidazu (LOXL-1) i kolagen tipa IV (COL4A1) i inhibiraju ekspresiju gena koji kodiraju metaloelastaze.

[0016] Mešavina aminokiselina prema pronalasku se sastoji od glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-leucina i L-lizin hidrohlorida u slede ć im težinskim odnosima:

- Glicin 1;

- L-prolin: 0,7-0,8;

- L-alanin: 0,47-0,76;

- L-valin: 0,35-0,56;

- L-leucin: 0,13-0,27;

- L-lizin hidrohlorid: 0.10-0.12.

[0017] L-cistein ili N-acetil-L-cistein mogu takođe biti prisutni u težinskim srazmerama koji se kreć u između 1 i 20% ukupne smeše aminokiselina.

[0018] Poželjni težinski odnosi su:

- Glicin 1;

- L-prolin: 0,75;

- L-alanin: 0,48-0,51;

- L-valin: 0,35-0,37;

- L-leucin: 0,13-0,15;

- L-lizin hidrohlorid: 0.10-0.11, ili:

- Glicin 1;

- L-prolin: 0,75;

- L-alanin: 0,75-0,76;

- L-valin: 0,54-0,56;

- L-leucin: 0,13-0,14;

- L-lizin hidrohlorid: 0.10-0.11, ili

- Glicin 1;

- L-prolin: 0,75;

- L-alanin: 0,49-0,51;

- L-valin: 0,35-0,36;

- L-leucin: 0,26-0,27;

- L-lizin hidrohlorid: 0.10-0.11.

[0019] Pomenute strukture mogu biti u obliku pogodnom za oralnu primenu, kao što su rastvori, granule, disperzivni prah, tablete ili kapsule.

[0020] Strukture prema pronalasku takođe mogu da sadrže hijaluronsku kiselinu ili njene soli, naročito natrijum hijaluronat, čija je prosečna molekulska masa u opsegu između 500.000 i 3.000.000 Da, u procentima koji se kreć u između 0,01 i 3 % ukupne težine strukture. Navedene strukture koje sadrže mešavinu gore opisanih aminokiselina i hijaluronske kiseline su pogodne za lokalnu upotrebu ili injekciju. Primeri upotrebljivih formulacija uključuju gelove, masti, emulzije, transdermalne flastere, sterilne rastvore i sterilne praškove aminokiselina dizajnirane za rekonstituciju sa sterilnim vodenim rastvorima hijaluronata.

[0021] U slučaju oralnih formulacija, jedinične doze glicina se kreć u između 100 i 1500 mg.

[0022] U slučaju formulacija koje se mogu injektirati, jedinična doza glicina se kreć e između 10 i 50 mg, a doze hijaluronske kiseline ili njene natrijumove soli između 10 i 100 mg.

[0023] U slučaju topičkih formulacija, koncentracija glicina može biti u opsegu od 0,1 do 2% mg/ml.

[0024] Strukture prema pronalasku su korisne u lečenju elastoze i dermoepidermalne atrofije koja proizilazi iz fotostarenja, kožnih poremeć aja sa dermoatrofičnom i iatrogenom bazom [17], opekotina (uključuju ć i radijacione opekotine), kožnih lezija, dekubitusa, dermalne aplazije izazvane lekovima (antiretrovirusi, anti-HIV lekovi, kortikosteroidi ili hemoterapija), lezije tetiva i zglobova.

[0025] Upotrebom in vitro transkriptomike i proteomike, otkriveno je da smeša aminokiselina indukuje porast ekspresije gena koji kodiraju tropoelastin (ELN) i kolagen tipa IV (COLIV) posle 120 sati inkubacije humanih fibroblasta. Iznenađujuć e je što navedeni efekat više nije prisutan ako se eliminiše čak i jedna od aminokiselina ili se variraju težinski odnosi.

[0026] Isporuka aminokiselina u obliku vodenog rastvora geliranih hijaluronskom kiselinom u obliku natrijumove soli vrać a plastičnost dermalnog matriksa i garantuje zadržavanje aminokiselina u dermoepidermalnom području dovoljno vremena da se izazove željeni biološki efekat.

[0027] Formulacije za ubrizgavanje se mogu pripremiti rastvaranjem aminokiselina u obliku sterilnog praha u sterilnom rastvoru hijaluronske kiseline natrijumove soli unošenjem gela hijaluronske kiseline (natrijumove soli) direktno (npr. sa špricem za dermalni implantat) u bočicu koja sadrži prah. Kada se potpuno rastopi, dobijeni rastvor gela se ubrizgava u dermoepidermalnu oblast.

[0028] Sterilni vodeni rastvor hijaluronske kiseline natrijumove soli može da sadrži pufer agense za korekciju pH (npr. fosfatni pufer) ili korektore osmolarnosti (npr. natrijum-hlorid) i druge tehnološke dodatke koji mogu da garantuju fizikalno-hemijske i karakteristike za kompatibilnost tkiva potrebne za sterilne farmaceutske oblike za ubrizgavanje. Pronalazak je detaljno ilustrovan u sledeć im primerima.

PRIMER 1

[0029]

STERILNI RASTVOR NATRIJUM-HIJALURONA

STERILNI AMINO-KISELINSKI PRAH

PRIMER 2

[0030]

STERILNI RASTVOR NATRIJUM-HIJALURONA

STERILNI AMINO-KISELINSKI PRAH

PRIMER 3

[0031]

STERILNI RASTVOR NATRIJUM-HIJALURONA

STERILNI AMINO-KISELINSKI PRAH

PRIMER 4

[0032]

TOPIKALNI HIDROGEL BAZIRAN NA AMINOKISELINAMA I NATRIJUM-HIJALURONU

PRIMER 5

[0033]

VREĆICE (PAKOVANJA) ZA ORALNI RASTVOR

ISPITIVANJA EFIKASNOSTI

[0034] Efikasnost smeša aminokiselina prema pronalasku je procenjena poređenjem sa kontrolnim mešavinama i mešavinama hijaluronske kiseline u podsticanju proizvodnje strukturnih sastojaka ekstracelularnog matriksa, posebno neosinteze elastina, i omoguć avanju efikasnijeg taloženja elastičnih vlakana ( elastogeneza), istovremeno održavaju ć i stimulaciju kolagena.

[0035] Korišć ena je primarna kultura standardizovanih ljudskih fibroblasta. Probni dizajn je konstruisan da proceni ekspresiju gena elastina i kolagena. Ekspresija gena je procenjena pomoć u RT-qPCR u slede ć im vremenima: 24, 72 i 120 h. Proizvodnja navedenih matriks proteina je procenjena tehnikom Western Blot u 120 h.

[0036] Preliminarna procena citotoksičnosti smeša aminokiselina i hijaluronske kiseline sprovedena je da bi se identifikovala ispitivana maksimalna koncentracija koja nije citotoksična. Koncentracija od 1000 mg/ml je odabrana na osnovu dobijenih podataka.

Rezultati transkripcijske studije

[0037] Ova studija je uključivala negativnu kontrolu (NC), što odgovara neobrađenim fibroblastima (fiziološki odgovor). Smeša A, koja se sastoji samo od aminokiselina koje čine kolagen (Gli, L-Pro, L-Lis, L-Leu), nije inducirala značajnu ekspresiju gena. Suprotno tome, dve smeše koje sadrže šest testiranih aminokiselina, C i D, koje se sastoje od aminokiselina koje su najviše izražene i u kolagenu i u elastinu (Gli, L-Pro, L-Lis, L-Leu, L-Ala i L-Val) , su izazvale značajnu modulaciju gena ELN (elastin) i COLIV (kolagen IV) nakon 120 h.

[0038] Strukture ispitivanih smeša su navedene u donjoj tabeli.

Genska ekspresija elastina (ELN) i kolagena IV (COLIV) kvantifikovana u poređenju sa kontrolom.

[0039] Slika 1 prikazuje rezultate post-translacione studije

[0040] Kao što je prikazano na grafikonu, smeša A indukuje poveć anje proizvodnje samo kolagena, dok smeše C i D značajno moduliraju proizvodnju i elastina i kolagena IV.

Relativna kvantitacija proteina kolagena IV i elastina koristeć i NC kao referencu.

Diskusije

[0041] Grafikon na Slici 2 prikazuje rezultate jednoslojnih ispitivanja humanog fibroblasta, sprovedenih na osnovu transkriptomskog pristupa, pokazujuć i da samo određene smeše aminokiselina, opciono kombinovane sa hijaluronskom kiselinom, mogu modulirati biosintezu proteina vanć elijskog matriksa i posebno promovišu elastogenezu. Samo smeše aminokiselina kombinovane prema odnosima opisanim u ovom patentu poveć avaju ekspresiju elastina na genu i proteinu kao i pojačavanje stimulacije kolagena (posebno kolagena IV).

[0042] Treba napomenuti da integritet i kvalitet matriksa nije ograničen na kolagen, već na proizvodnju i fiziološku interakciju svih strukturnih proteina koje stvaraju fibroblasti, naročito elastin.

[0043] U stvari, kolagen i elastin održavaju anizotropiju u matriksu, tj. sposobnost proizvedenih vlakana da šire zatezne sile, što je karakteristika koja se s godinama gubi.

[0044] Takođe je pokazano da smeše predmetnih aminokiselina izazivaju fiziološku indukciju gena elastina sa vrlo različitom kinetikom od reakcije na UV zračenje, pri čemu je pojava elastina brza, neuredna i, induciranjem elastaze, zapravo uzrokuje razgradnju.

Zaključci

[0045] Rezultati ove studije pokazuju da samo smeše prema pronalasku promovišu značajnu proizvodnju dva proteina. Stoga je pokazano da ne samo da postoji induktivni mehanizam, već proizvedena mRNA kodira funkcionalni protein.

REFERENCE

[0046]

1. Bashir, MM et al. (1989), J Biol Chem 264, 8887-8891.

2. Chen, Z et al., (2009), Exp Dermatol 18, 378-386.

3. Indik Z et al., (1989), Am J Med Genet 34, 81-90.

4. Cenizo V et al., (2006), Exp Dermatol 15, 574-581.

5. Maki et al., (2005), Am J Pathol 167, 927-936.

6. Noblesse et al., (2004), J Invest Dermatol 122, 621-630.

7. Abreu-Velez AM et al., N Am J Med Sci.2012 Jan;4(1):1-8.

8. Vázquez F et al., Maturitas.1996 Nov;25(3):209-15.

9. Lupo MP et al., (2007). Cosmeceutical peptides. Dermatol Ther 20, 343-349.

10. Reddy B et al., Bioactive oligopeptides in dermatology: Part I. Exp Dermatol. 2012 Aug;21(8):563-8. doi: 10.1111/j.1600-0625.2012.01528.x. Epub 2012 Jun 4.

11. Proksch E et al., Skin Pharmacol Physiol.2014;27(3):113-9.

12. Dioguardi FS, (2008) Nov-Cec;26(6):636-40.

13. Fisher GJ et al., J Invest Dermatol.2001 Aug; 117(2):219-26.

14. Rijken F et al., J Investig Dermatol Symp Proc.2009 Aug;14(1):67-72. doi: 10.1038/jidsymp.2009.15.

15. Quan T et al., J Investig Dermatol Symp Proc.2009 Aug;14(1):20-4. doi: 10.1038/jidsymp.2009.8.

16. Chung JH et al., J Invest Dermatol. 2002 Aug;119(2):507-12.

17. Schoepe S et al., Exp Dermatol.2006 Jun;15(6):406-20.

Claims (11)

Patentni Zahtevi

1. Strukture koje kao aktivni sastojak sadrže smešu aminokiselina koja obuhvata glicin, L-prolin, L-alanin, L-valin, L-leucin i L-lizin hidrohlorida u slede ć im težinskim srazmerama:

- Glicin 1;

- L-prolin: 0,7-0,8;

- L-alanin: 0,47-0,76;

- L-valin: 0,35-0,56;

- L-leucin: 0,13-0,27;

- L-lizin hidrohlorid: 0.10-0.12.

2. Strukture prema patentnom zahtevu 1, koje takođe obuhvataju L-cistein N-acetil-L-cistein, u težinskim srazmarama u rasponu između 1 i 20% ukupne smeše aminokiselina.

3. Strukture prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu su težinske srazmere aminokiselina:

- Glicin 1;

- L-prolin: 0,75;

- L-alanin: 0,48-0,51;

- L-valin: 0,35-0,37;

- L-leucin: 0,13-0,15;

- L-lizin hidrohlorid: 0.10-0.11.

4. Strukture prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu su težinske srazmere aminokiselina:

- Glicin 1;

- L-prolin: 0,75;

- L-alanin: 0,75-0,76;

- L-valin: 0,54-0,56;

- L-leucin: 0,13-0,14;

- L-lizin hidrohlorid: 0.10-0.11.

5. Strukture prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu su težinske srazmere aminokiselina:

- Glicin 1;

- L-prolin: 0,75;

- L-alanin: 0,49-0,51;

- L-valin: 0,35-0,36;

- L-leucin: 0,26-0,27;

- L-lizin hidrohlorid: 0.10-0.11.

6. Strukture prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva za oralnu upotrebu.

7. Strukture prema patentnom zahtevu 6 u obliku rastvora, granula, disperzivnog praha, tableta ili kapsula.

8. Strukture prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5, koje takođe sadrže hijaluronsku kiselinu ili njene soli, naročito natrijum hijaluronat, prosečne molekulske mase u opsegu između 500.000 i 3.000.000 Da, u težinskim procentima koji se kreć u između 0,01 i 3 % , po ukupnoj težini kompozicije.

9. Strukture prema patentnom zahtevu 8, za lokalnu ili injektivnu upotrebu.

10. Strukture prema patentnom zahtevu 9, u obliku gelova, masti, emulzija, transdermalnih flastera, sterilnih rastvora ili sterilnih aminokiselinskih prahova oblikovanih za rekonstituciju sa sterilnim vodenim rastvorima hijaluronata.

11. Strukture prema patentnim zahtevima od 1 do 10, za upotrebu u lečenju elastoze i dermoepidermalne atrofije koje nastaju usled fotostarenja, kožnih poremeć aja sa dermoatrofičnim i iatrogenim uzrokom, opekotina, opekotina od radijacije, lezija kože, dekubitusa, dermalne aplazije izazvane davanjem lekova, lezija tetiva i zglobova.