RS60335B1 - Hiper-granati poli(beta-amino estar) za gensku terapiju - Google Patents

Hiper-granati poli(beta-amino estar) za gensku terapiju

Info

Publication number
RS60335B1
RS60335B1 RS20200441A RSP20200441A RS60335B1 RS 60335 B1 RS60335 B1 RS 60335B1 RS 20200441 A RS20200441 A RS 20200441A RS P20200441 A RSP20200441 A RS P20200441A RS 60335 B1 RS60335 B1 RS 60335B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
amine
group
poly
amino ester
c6alkyl
Prior art date
Application number
RS20200441A
Other languages
English (en)
Inventor
Wenxin Wang
Dezhong Zhou
Original Assignee
University College Dublin National University Of Ireland Dublin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University College Dublin National University Of Ireland Dublin filed Critical University College Dublin National University Of Ireland Dublin
Publication of RS60335B1 publication Critical patent/RS60335B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/68—Polyesters containing atoms other than carbon, hydrogen and oxygen
    • C08G63/685—Polyesters containing atoms other than carbon, hydrogen and oxygen containing nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/005—Hyperbranched macromolecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Biological Depolymerization Polymers (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Pronalazak se odnosi na granate polimere koji nalaze upotrebu u primenama kod genske terapije kao transfekcioni agensi nukleinske kiseline. Naročito, pronalazak daje biorazgradive, hiper-granate polimere koji se mogu koristiti u isporuci gena i koji obezbeđuju poboljšane efikasnosti transfekcije koji su istovremeno bezbedni i netoksični.
Osnova pronalaska
[0002] Genska terapija obećava da bude jedna od najvažnijih granica u medicini. Iako je bilo izvesnih prepreka u lečenju bolesti, mnogi novi sistemi pokazuju veliki potencijal za efikasan i bezbedan tretman bolesti vezanih za genetiku. Trenutni pristupi za isporuku gena mogu biti kategorizovani u dve grupe, virusnu i nevirusnu isporuku gena. Trenutno, većina protokola za gensku terapiju koristi virusne vektore kao nosače gena<1>, koji su povezani sa slabom kontrolom i problemima u vezi bezbednosti. Nevirusni vektori nude određeni broj prednosti u odnosu na virusne sisteme po tome što oni mogu biti fino podešeni i modifikovani da se eliminišu problemi vezani za bezbednost i kontrolu2 , međutim, mnogi od trenutnih nevirusnih sistema isporuke nemaju sposobnosti transfekcije i oslobađanja gena koje poseduju virusni vektori i mnogo su manje efikasni u isporuci gena do ćelije.
[0003] Dokaz rasta u ovoj tehnologiji se može videti iz porasta broja kompanija za gensku terapiju na bazi virusa (od 44 u 1995. do više od 190 trenutno). Nevirusni, sintetički linearni poli(β-amino estri) za isporuku gena su poznati. Međutim, ograničene krajnje grupe i linearna struktura linearnih poli(β-amino estara) teško ometaju njihovo dalje poboljšanje efikasnosti genske terapije. Iako nevirusni transfekcioni agensi prevazilaze mnoge probleme vezane sa upotrebom virusnih vektora, tu tipično postoje problemi povezani sa nižom efikasnošću transfekcije. Prednosti nevirusnih polimernih/lipozomskih transfekcionih reagenasa su te da se oni sastoje od jednostavnih komponenti, od kojih su mnoge komercijalno dostupne i ispoljavaju manje problema sa biološkom bezbednošću. Čak iako su se značajna poboljšanja javila u toku poslednje decenije, u oblasti nevirusne genske terapije, efikasnost još uvek nedostaje, tako da su mnoge nove tehnologije nesposobne da se pomere dalje od stadijuma kliničkih ispitivanja i FDA dozvole. Pored toga, prevođenje razvoja genske terapije u kliničku primenu do danas je teško ograničena problemima u vezi sa mutagenezom kod sistema isporuke na bazi virusa i problemima efikasnosti kod trenutno dostupnih reagenasa na hemijskoj bazi.
[0004] Predmetni pronalazak koristi triakrilatne monomere koji reaguju direktno preko Michaelove adicije sa monomerima amina da bi se dobio hiper-granati poli(β-amino estar) (HPAE).
Zahvaljujući hiper-granatoj strukturi, višestruke i trodimenzionalne (3-D) krajnje grupe mogu se koristiti za dalje poboljšanje osobina poli(β-amino estra) (HPAE) kao nevirusnog vektora genske isporuke. Reakciona sekvenca uključuje slučajnu polimerizaciju između amino i akrilatnih jedinica formiranih u reakcionoj sekvenci. Termin "hiper-granati" kao što je ovde korišćen označava strukturu generisanu konjugatnom adicijom primarnih i sekundarnih amina u triakrilate, među kojima svaki primarni ili sekundarni amin je konjugatno adiran u dve vinil grupe istovremeno.
[0005] Početno, rezultati kompleksacije DNK, ćelijske vijabilnosti i ćelijske transfekcije pokazuju nadu za ovaj novo-sintetisani hiper-granati poli(β-amino estar). Kompleksi (polielektrolitni kompleksi nukleinskih kiselina sa polikatjonima) su ispitivani kao obećavajući vektori isporuke za čitav asortiman terapija. Čak iako efikasnost ovih polimera u ćelijskoj transfekciji nije do nivoa vektora na bazi virusa, takođe je važno zapaziti da su optimizacija i fino podešavanje ovih polimera veoma jednostavni. Ovi polimeri u kombinaciji sa napretkom u dizajnu plazmida imaće izrazit efekat na oblast nevirusne genske terapije.
[0006] Ova prijava opisuje sintezu i karakterizaciju hiper-granatog poli(β-amino estra) za efikasnu gensku isporuku za lečenje bolesti povezanih sa genetikom. Nevirusni vektori su sintetički polimeri koji su sintetisani pomoću Michael-ove adicije sa triakrilatnim monomerima i amin monomerima da bi se proizveo hiper-granati poli(β-amino estar) (HPAE). HPAE su sastavljeni od trimetilolpropan triakrilata (TMTPA), bisfenol etoksilat diakrilata (BE), 4-amino-1-butanola (S4) i 3-morfolinopropilamina (MPA). Kondenzacija DNK je postignuta protonovanjem tercijarnog amina pod kiselom pH vrednošću. Hiper-granata struktura daje HPAE višestruke sinergističke funkcionalne grupe. Vektori genske isporuke imaju kriterijume tehničkog dizajna kao što su pakovanje velikih DNK plazmida, zaštita DNK, stabilnost seruma, specifično ćelijsko ciljno delovanje, internalizacija, endolizozomalno ispuštanje i jedarna lokalizacija sa minimalnom toksičnošću, da navedeno samo neke. Ostali kriterijumi obuhvataju ekonomske faktore i faktore povećanja obima proizvodnje: lakoću primene, lakoću pripreme, jeftinu sintezu, lako prečišćavanje i bezbednost. Dosta ispitivan poli(β-amino estar) za gensku isporuku je linearni PAE koji sadrži grupe tercijarnog amina za kompleksiranje DNK. Međutim, većina polimera na bazi katjona koji se trenutno koriste u istraživanju nemaju visoku efikasnost ispoljenu od strane virusnih vektora in-vitro i in-vivo. S obzirom na to da izgleda da katjonski polimeri funkcionišu različito sa različitim ćelijskim tipovima, naš sistem je dovoljno fleksibilan da omogući male promene polimera da bi se prilagodio traženom kliničkom ciljnom mestu. Nedavni rezultati su pokazali proteinsku ekspresiju u određenom broju ćelija upotrebom našeg novo-sintetisanog hiper-granatog poli(β-amino estra) (HPAE). Ovaj polimer je formirao komplekse sa DNK u nanometarskoj razmeri (<100nm) koji su efikasno apsorbovani od strane ćelije. Višak pozitivnog naelektrisanja nano-čestica označava da su one bile sposobne da izađu iz endozoma preko efekta "protonskog sunđera"<7>i razlaganjem u citoplazmi omogućavajući oslobađanje DNK i kasniju ekspresiju proteina. Polimeri su pokazali višu sposobnost transfekcije od trenutnih polimera zlatnog standarda (PEI, sSuperfect, lipofektamin 2000 i Xfect) sa manje citotoksičnosti i višom sposobnošću kondenzacije DNK. Pokazano je da HPAE ima nižu citotoksičnost i višu efikasnost transfekcije od hela, RDEBK i hADSC.
[0007] Patent broj: US6998115B2 opisuje biorazgradive poli(β-amino estre), koji su linearne strukture na bazi monomera 1,6-diaminoheksana, N,N-cistaminbisakrilamida i 1,2-diaminoetana. Polimeri predmetnog pronalaska se razlikuju od ovog polimera iz stanja tehnike po tome što oni poseduju granate strukture i sintetisani su od različitih gradivnih blokova. Predmetni pronalazak sa njegovom monomerskom kombinacijom omogućava promenljivu, ali kontrolisanu sintezu sa jednistvenim strukturnim osobinama koje mogu biti optimizovane tako da redukuju citotoksičnost i povećavaju efikasnost transfekcije.
[0008] US2012149630 objavljuje reakciju poli(beta-amino estra) sa amin-terminusom sa elektrofilom i reakciju poli(beta-amino estra) sa akrilat-terminusom sa nukleofilom.
[0009] US2012259084 objavljuje granati, dendritski ili hiper-granati poli (amino estar) koji ima polimerni osnovni lanac koji sadrži množinu grana, pri čemu polimerni osnovni lanac ima najmanje jednu sekundarnu i najmanje jednu tercijarnu amino vezu, pri čemu su poli (amino estri) pripremljeni preko Michael-ove adicione reakcije tris(akrilat estar) monomera sa diamin monomerom.
Cilj pronalaska
[0010] Iako su se značajna poboljšanja javila tokom poslednje decenije u oblasti nevirusne genske terapije, efikasnost još uvek nedostaje kod mnogih novih tehnologa koje su nesposobne da se pomere dalje od stadijuma kliničkih ispitivanja i FDA dozvole. Cilj predmetnog pronalaska je na taj način razvoj bezbednog i efikasnog sistema genske isporuke za lečenje bolesti, naročito bolesti povezanih sa genetikom.
Kratak opis pronalaska
[0011] Prema predmetnom pronalasku obezbeđen je poli-beta amino estar pripremljen pomoću:
(a) zajedničke reakcije, preko Michael-ove adicione reakcije, da bi se formirao polimer P1:
(i) triakrilatne komponente koja ima formulu (I)
gde je Z1 osnova koja se sastoji od:
linearnog ili granatog ugljeničnog lanca od 1 do 30 atoma ugljenika, linearnih ili granatih ugljeničnih lanaca koji sadrže heteroatom od 1 do 30 atoma, karbociklusa koji sadrži 3 do 30 atoma ugljenika ili heterociklusa koji sadrži 3 do 30 atoma;
gde je Z1 nesupstituisan ili supstituisan sa najmanje jednim od halogena, hidroksila, amino grupe, sulfonil grupe, sulfonamid grupe, tiola, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C1-C6etra, C1-C6tioetra, C1-C6sulfona, C1-C6sulfoksida, C1-C6primarnog amida, C1-C6sekundarnog amida, halo C1-C6alkila, karboksil grupe, cijano grupe, nitro grupe, nitrozo grupe, -OC(O)NR’R’, -N(R’)C(O)NR’R’, -N(R’)C(O)O-C1-C6alkila, C3-C6cikloalkila, C3-C6heterociklila, C2-C5heteroarila i C6-C10arila; gde je svaki R’ nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C6alkila; gde je svaki R’ nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C6alkila;
(ii) diakrilatne komponente koja je bisfenol etoksilat diakrilat; i
(iii) komponente amina A1 koja sadrži 3 do 20 atoma,
pri čemu je navedena komponenta amina nesupstituisana ili supstituisana sa najmanje jednim od halogena, hidroksila, amino grupe, sulfonil grupe, sulfonamid grupe, tiola, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C1-C6etra, C1-C6tioetra, C1-C6sulfona, C1-C6sulfoksida, C1-C6primarnog amida, C1-C6sekundarnog amida, halo C1-C6alkila, karboksil grupe, cijano grupe, nitro grupe, nitrozo grupe, -OC(O)NR’R’, -N(R’)C(O)NR’R’, -N(R’)C(O)O-C1-C6alkila, C3-C6cikloalkila, C3-C6heterociklila, C2-C5heteroarila i C6-C10arila; gde je svaki R’ nezavisno izabran, iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C6alkila; i
(b) reakcije polimera P1 preko Michael-ove adicione reakcije sa komponentom amina A2 koja sadrži 3 do 20 atoma, gde je navedena komponenta amina nesupstituisana ili supstituisana sa najmanje jednim od halogena, hidroksila, amino grupe, sulfonil grupe, sulfonamid grupe, tiola, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C1-C6etra, C1-C6tioetra, C1-C6sulfona, C1-C6sulfoksida, C1-C6primarnog amida, C1-C6sekundarnog amida, halo C1-C6alkila, karboksil grupe, cijano grupe, nitro grupe, -OC(O)NR’R’, -N(R’)C(O)NR’R’, -N(R’)C(O)O-C1-C6alkila, C3-C6cikloalkila, C3-C6heterociklila, C2-C5heteroarila i C6-C10arila; gde je svaki R’ nezavisno izabran, iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C6alkila.
[0012] Poželjno poli-beta amino estar ima molekulsku masu u opsegu od oko 3000 Da do oko 50,000 Da.
[0013] Poli-beta amino estar pogodno ima alfa parametar poreklom od Mark-Houwink jednačine manji od 0.5, pri čemu se određivanje parametra izvodi upotrebom uzorka poli-beta amino estra rastvorenog u dimetilformamidu (DMF). Poželjno, alfa parametar poreklom od Mark-Houwink jednačine je od oko 0.2 do oko 0.5, poželjnije, od oko 0.25 do oko 0.5, i pogodno od oko 0.3 do oko 0.5.
[0014] U jednom primeru izvođenja poli-beta amino estar pogodno ima alfa parametar poreklom od Mark-Houwink jednačine od 0.3 do 0.5.
[0015] Triakrilatna komponenta može imati formulu:
gde je R linearni ili granati ugljenični lanac od 1 do 30 atoma ugljenika, linearni ili granati ugljenični lanci koji sadrže heteroatom od 1 do 30 atoma, karbociklus koji sadrži 3 do 30 atoma ugljenika, ili heterociklus koji sadrži 3 do 30 atoma;
gde je R nesupstituisan ili supstituisan sa najmanje jednim od halogena, hidroksila, amino grupe, sulfonil grupe, sulfonamid grupe, tiola, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C1-C6etra, C1-C6tioetra, C1-C6sulfona, C1-C6sulfoksida, C1-C6primarnog amida, C1-C6sekundarnog amida, halo C1-C6alkila, karboksil grupe, cijano grupe, nitro grupe, nitrozo grupe, -OC(O)NR’R’, -N(R’)C(O)NR’R’, -N(R’)C(O)O- C1-C6alkila, C3-C6cikloalkila, C3-C6heterociklila, C2-C5heteroarila i C6-C10arila; gde je svaki R’ nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C6alkila; i
R1 je nesupstituisan ili supstituisan, linearan ili granat ugljenični lanac od 1 do 10 atoma ugljenika, linearni ili granati ugljenični lanci koji sadrže heteroatom od 1 do 10 atoma, karbociklus koji sadrži 3 do 10 atoma ugljenika, ili heterociklus koji sadrži 3 do 10 atoma.
[0016] Triakrilatna komponenta može imati formulu:
gde je R linearni ili granati ugljenični lanac od 1 do 30 atoma ugljenika; i R<1>je linearan ili granat ugljenični lanac od 1 do 10 atoma ugljenika, poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od metila, etila, propila, butila, pentila, heksila, heptila, oktila, nonila ili decila. Poželjno triakrilatna komponenta je izabrana iz grupe koja se sastoji od trimetilolpropan triakrilata, pentaeritritol triakrilata, glicerol propoksilat (1PO/OH) triakrilata, trimetilolpropan propoksilat triakrilata i pentaeritritol propoksilat triakrilata.
[0017] Poželjno komponenta amina A1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od metil amina, etil amina, propil amina, buitil amina, pentil amina, heksil amina, heptil amina, oktil amina, nonil amina, decilamina. Komponenta amina A1 može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od:
[0018] Poželjno komponenta amina A2 je C1-C20alkil amin; C2-C20cikloalkil amin; C4-C20aril amin ili C3-C20cikloalkil amin; koji može biti nesupstituisan ili supstituisan sa najmanje jednim halogenom, hidroksilom, amino grupom, sulfonil grupom, sulfonamid grupom, tiolom, C1-C6alkilom, C1-C6alkoksi, C1-C6etrom, C1-C6tioetrom, C1-C6sulfonom, C1-C6sulfoksidom, C1-C6primarnim amidom, C1-C6sekundarnim amidom, halo C1-C6alkilom, karboksil grupom, cijano grupom, nitro grupom, -OC(O)NR’R’, -N(R’)C(O)NR’R’, -N(R’)C(O)O-C1-C6alkilom, C3-C20cikloalkilom, C3-C6heterociklilom, C2-C5heteroarilom i C6-C10arilom; gde je svaki R’ nezavisno izabran, iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C6alkila.
[0019] Komponenta amina A2 može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od:
[0020] Pronalazak takođe daje poli-beta amino estar kao što je opisan u prethodnom tekstu za upotrebu kao lek. U dodatnom aspektu pronalazak daje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži poli-beta amino estar kao što je definisan u prethodnom tekstu. Farmaceutska kompozicija može da sadrži polinukleotid i poli-beta amino estar kao što je ovde definisan. Pronalazak takođe daje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži nanočestice koje sadrže polinukleotid i poli-beta amino estar kao što je definisan u prethodnom tekstu. Pronalazak takođe daje kompoziciju za upotrebu u transfekciji ćelije koja sadrži nukleinsko kiselinsku komponentu i poli-beta amino estarsku komponentu kao što je definisana ovde. U navedenoj kompozoiciji, triakrilat može biti trimetilolpropan triakrilat, amin A1 može biti
i amin A2 može biti
[0021] Pronalazak takođe daje in vitro postupak za transfekciju ćelija koji sadrži dovođenje u kontakt ćelija sa kompozicijom koja sadrži nevirusni transfekcioni agens i nukelinsku kiselinu; pri čemu, navedeni nevirusni transfekcioni agens je poli-beta amino estar pripremljen pomoću:
(a) zajedničke reakcije, preko Michael-ove adicione reakcije, tako da se formira polimer P1:
(i) triakrilatne komponente koja ima formulu:
gde je R1 linearan ili granati ugljenični lanac od 1 do 10 atoma ugljenika, izabran iz grupe koja se sastoji od metila, etila, propila, butila, pentila, heksila, heptila, oktila, nonila ili decila;
(ii) diakrilatne komponente koja je bisfenol etoksilat diakrilat; i
(iii) komponente amina A1 izabrane iz grupe koja se sastoji od metil amina, etil amina, propil amina, butil amina, pentil amina, heksil amina, heptil amina, oktil amina, nonil amina, decilamina; ili:
i
(b) reakcije polimera P1 preko Michael-ove adicione reakcije sa komponentom amina A2; gde je A2 izabran iz grupe koja se sastoji od:
1
[0022] U navedenom postupku, triakrilat može biti trimetilolpropan triakrilat, amin A1 može biti
i amin A2 može biti
Kratak opis crteža
Slika 1 GPC kriva sintetisanog HPAE.
Slika 2 NMR spektar sintetisanog HPAE
Slika 3 Merenja veličine (A) i naelektrisanja (B) kompleksa formiranih od različitih transfekcionih agenasa kao što su dobijeni iz „Zetasizer“-a (n=4).
Slika 4 Sposobnost kompleksacije HPAE u različitim težinskim odnosima polimera/DNK.
Slika 5 Studije ćelijske vijabilnosti HPAE, u Hela ćelijama, RDEBK ćelijama i hADSC ćelijama u optimalnim težinskim odnosima polimera/DNK. Kontrole (SF, LP, PEI, Xfect i NFBfect) takođe imaju optimalan tež./tež. odnos, (n=4)( ±S).
Slika 6 Ekspresija luciferaze kvantitativno određena pomoću luminiscencije posle transfekcije sa različitim transfekcionim agensima, (n=4)(±S).
Slika 7. Ekspresija pGFP u transficiranim HeLa ćelijama (A) i RDEBK ćelijama (B) vizuelizovan upotrebom fluorescentnog mikroskopa.
Slika 8. Amin, triakrilati i diakrilati su prvo kopolimerizovani tako da formiraju bazni polimer sa akrilat terminusom, a zatim agensom koji formira krajnju kapu baznih polimera da bi se proizveo HPAE.
Slika 9 Karakterizacija HPAE različitog sastava i strukture. (a)<1>HNMR spektri HPAE i LPAE. (b) tragovi GPC pokazuju da HPAE i LPAE imaju molekulske mase oko 12,000 Da; (c) Mark-Houwink (MH) grafikoni HPAE i LPAE. Sa povećanjem u odnosu punjenja TMPTA prema BE, vrednost LPAE i HPAE se uzastopno smanjuje: LPAE ima vrednost od 0.65 što potvrđuje njegovu tipičnu linearnu strukturu. Nasuprot tome, vrednost HPAE se smanjuje od 0.48 (HPAE-1) do 0.31 (HPAE-10) što potvrđuje njihove visoko granate strukture.
Slika 10. Potencija transfekcije gena HPAE-2 i HPAE-4 u poređenju sa LPAE i komercijalnim transfekcionim reagensima SuperFect i PEI u različitim ćelijskim tipovima. (a) Aktivnost gluciferaze različitih ćelija 48 časova posle transfekcije. HPAE-2 i HPAE-4 pokazuju do 8,521-struko višu aktivnost gluciferaze od LPAE, SuperFect i PEI. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD, n=4. Statistička značajnost u poređenju sa SuperFect je *p <0.05, **p < 0.01 i ***p < 0.001; (b) Reprezentativne fluorescentne slike ćelija transficiranih pomoću HPAE u tež./tež. odnosu od 15:1. Linije sa razmerom predstavljaju 200 µm; (c) „Western blotting“ se dobija za supernatant RDEBK ćelija. Jasno vidljiva traka za protein kolagen VII (C7) je zabeležena posle transfekcije sa HPAE/DNK.
Slika 11. 1HNMR spektri baznih polimera HPAE i LPAE sa akrilatnim terminusom. Spektri ilustruju da pre dodavanja krajnje-kape MPA, u približno 6.0 ppm, višestruki signalni pikovi su bili očigledni koji predstavljaju vinil grupe u baznim polimerima.
Slika 12. HPAE 1H NMR i odgovarajući<13>C NMR spektri. Funkcionalne grupe su dodeljene odgovarajućim signalnim pikovima na spektrima, respektivno:<1>HNMR: 0.8 (bs, CH3CH2-), 1.3-1.7 (m, CH3CH2-, -C(CH3)2-,-NHCH2CH2CH2N- i -NCH2(CH2)2CH2OH), 2.3-2.6 (m, -NCl-HCH2COO-,-COCH2CH2N-, -NHCH2CH2CH2N-, -COCH2CH2NH- i -NHCH2CH2CH2N(CH2)2), 2.7-2.9 (m, -NCH2(CH2)2CH2OH i -NHCH2CH2COO-), 3.2-3.9 (m, -NCH2COO-, -NCH2CH2O- i -NCH2(CH2)2CH2OH), 4.0-4.5 (m, -O(CH2)2O-, -COOCH2C- i -NCH2CH2COO-), 6.8 (d, -O-C(CH)2CH-), 7.1 (d, -O-C(CH)2CH-); 13C NMR: 7.4, 22.9, 24.7, 31.0, 31.4, 31.9, 33.6, 40.7, 41.7, 44.4, 48.8, 52.8, 53.7, 54.0, 62.4, 63.7, 65.8, 67.3, 69.2, 69.9, 70.3 113.9, 127.7, 143.6, 156.5, 172.0. Uslovi merenja: 1H NMR, CDCl 13
3, 500 MHz; C NMR, CDCl3, 150 MHz.
Slika 13. LPAE 1H NMR i odgovarajući<13>C NMR spektri. Funkcionalne grupe su dodeljene odgovarajućim signalnim pikovima na spektrima, respektivno:<1>H NMR: 1.5-1.7 (m, -C(CH3)2-, -NHCH2CH2CH2N- i -NCH2(CH2)2CH2OH), 2.3-2.6 (m, -COCH2CH2N-, -NHCH2CH2CH2N-, -COCH2CH2NH- i NHCH2CH2CH2N(CH2)2), 2.7-2.9 (m, -NCH2(CH2)2CH2OH i -NHCH2CH2COO-), 3.4-3.9 (m, -NCH2COO-, -NCH2CH2O- i -NCH2(CH2)2CH2OH), 4.0-4.5 (m, -O(CH2)2O-), 6.8 (d, -O-C(CH)2CH-), 7.1 (d, -O-C(CH)2CH-); 13C NMR: 24.8, 28.3, 31.0, 31.5, 31.8, 41.0, 41.7, 44.5, 49.3, 53.7, 53.9, 62.6, 65.8, 67.3, 69.2, 69.6, 113,9, 127.7, 143.6, 156.4, 172.3. Uslovi merenja: 1H NMR, CDCl3, 500 MHz; 13CNMR, CDCl3, 150 MHz.
Slika 14. Interakcija HPAE-2 i HPAE-4 sa DNK. (a) HPAE-2 i HPAE-4 ispoljavaju snažnu sposobnost vezivanja DNK i mogu efikasno da uspore napredovanje kroz agarozni gel; (b) HPAE-2/DNK i HPAE-4/DNK polipleksi ispoljavaju veoma male veličine u DMEM medijumu sa 10% FBS; (c) HPAE-4/DNK i HPAE-4/DNK polipleksi ispoljavaju veoma dobru stabilnost i ne ispoljavaju značajnu agregaciju posle 4 časa formiranja kompleksa u DMEM sa 10% FBS. Slika 15. Preliminarna procena efikasnosti transfekcije i citotoksičnosti HPAE različitih kompozicija i struktura u tež./tež. odnosu od 10: 1 u HeLa ćelijama upotrebom analiza gluiciferaze. (a) Svi HPAE ispoljavaju značajno višestruko povećanje (12∼2,400) u efikasnostima transfekcije u poređenju sa LPAE. Napomena, HPAE-1, HPAE-2, HPAE-3 i HPAE-4 pokazuju 5 do 20-struko povećanje u efikasnosti transfekcije u poređenju sa komercijalnim transfekcionim raegensima Superfect i PEL (b) Svi HPAE čuvaju ćelijsku vijabilnost iznad 90%.
Slika 16. GFP pozitivne ćelije posle transfekcije su kvantitativno određene pomoću protočne citometrije. HPAE-2 i HPAE-4 pokazuju značajno pojačanu efikasnost transfekcije u različitim ćelijskim tipovima u poređenju sa LPAE kao i SuperFect i PEI; Podaci su prikazani kao srednja vrednost ±SD, n=4. Statistička značajnost u poređenju sa SuperFect bila je *p < 0.05, **p < 0.01 i ***p < 0.001.
1
Slika 17. Ćelijska vijabilnost posle transfekcije sa HPAE-2, HPAE-4, LPAE i komercijalnim reagensima SuperFect i PEI, merena upotrebom Alamarblue analize. Među 12 različitih ćelijskih tipova, HPAE-2 i HPAE-4 čuvaju visoke nivoe ćelijske vijabilnosti čak u matičnim ćelijama i astrocitama.
Detaljan opis crteža
[0024] Postupak za sintezu ovih polimera je zasnovan na Michael-ovoj adicionoj reakciji1,2.
[0025] Gde su n i m bilo koji broj između 1 i 100, poželjno između 1 i 75, poželjno između 1 i 50 ili poželjno između 1 i 25.
[0026] Monomeri koji su korišćeni za sintezu HPAE su prikazani u (A) i postupak za sintezu HPAE pomoću Michael-ove adicije je prikazan pod (B).
Eksperimentalni postupak
Materijal
[0027] Za sintezu i karakterizaciju polimera, komercijalno dostupni akrilatni monomeri uključujući trimetilolpropan triakrilat (TMPTA) i bisfenol etoksilat diakrilat (BE), monomeri amina uključujući 4-amino-1-butanol (S4) i agensi koji formiraju krajnju kapu uključujući 3-morfolinopropilamin (MPA) su kupljeni iz Sigma Aldrich i korišćeni kakvi su primljeni. Litijum bromid (LiBr) za GPC merenja je kupljen iz Sigma-Aldrich. Rastvarači dimetil sulfoksid (DMSO), dimetilformamid (DMF), tetrahidrofuran (THF) i dietil etar su kupljeni iz Fisher Scientific. Deuterisani hloroform (CDCb) je kupljen iz Sigma Aldrich. Natrijum acetat (pH 5.260.1, 3 M) kupljen iz Aldrich je razblažen do 0.025 M pre upotrebe. Za karakterizaciju i učinak polipleksa, agaroza (za gel elektroforezu, Aldrich) i SYBR® Safe Gel Stain (Invitrogen) su korišćeni kakvi su primljeni prema protokolima. Za ćelijsku kulturu i gensku transfekciju, medijum ćelijske kulture, tripsin-EDTA i fetusni teleći serum (PBS) i Hank-ov ravnotežni rastvor soli (HBSS) su kupljeni iz Sigma Aldrich i Life Technologies. Komercijalni transfekcioni reagens granati polietilenimin (PEI, MM=25 KDa) je kupljen iz Sigma Aldrich. SuperFect® je kupljen iz Qiagen, Lipofectamine TM 2000 je kupljen iz Invitrogen i Xfect™ polimer je kupljen iz Clontech i korišćen prema protokolu proizvođača. Ćelije koje izlučuju plazmid luciferaze Gaussia princeps (pCMV-GLuc) i plazmid Green Fluorescent Protein (pCMV-GFP) dobijeni su iz New England Biolabs UK, i njihovo širenje, izolacija i prečišćavanje izvedeni su upotrebom Giga-Prep (Qiagen) kompleta prema protokolu. BioLux TM Gaussia Luciferase Assay Kit (New England Biolabs), AlamarBlue® (Invitrogen) korišćeni su prema protokolima. Interkalacioni agens, propidijum jodid je kupljen iz Life Technologies za protočno citometrijsku analizu. Svi reagensi su korišćeni prema protokolima proizvođača.
Sinteza polimera
[0028] Da bi se sintetisali hiper-granati PAE (HPAE) polimeri, 0.28 g TMPTA, 0.29 g BE i 0.18 g S4 rastvoreni su u 7.5 ml DMSO i reakcija se odvijala na 90°C. Pošto je molekulska masa bila u opsegu od 5000-7000 Da, 0.288 g MPA rastvorenih u 2.88 ml DMSO dodato je u krajnju-kapu baznog polimera sa akrilatnim terminusom na sobnoj temperaturi u trajanju od 24 h. Zatim je
1
polimerni proizvod istaložen u dietil etru tri puta i sušen pod vakuumom u trajanju od 24 h i zatim čuvan na -20°C za kasnija ispitivanja.
[0029] Kao što je navedeno u Tabeli S 1, da bi se sintetisali HPAE različitog sastava i granatih struktura, korišćeni su različiti odnosi punjenja monomera. Amin, triakrilat i diakrilat su rastvoreni u DMSO i reakcije su izvedene na 90°C. Završetak reakcije polimerizacije je postignut postavljanjem krajnje-kape terminalnih akrilata preko adicije amina za krajnju-kapu rastvorenog u DMSO u reakcionoj posudi na sobnoj temperaturi (RT) u trajanju od 24 časa. Finalni polimerni proizvodi su prečišćeni taloženjem u dietil etru tri puta i zatim sušeni pod vakuumom u trajanju od 24 h pre čuvanja na -20°C za kasnija ispitivanja. Da bi se sintetisao LPAE, amin i diakrilat su direktno mešani bez rastvarača i reagovali na 90°C. Reakcija je završena i finalni proizvod je prečišćen i čuvan kao što je opisano u prethodnom tekstu.
[0030] Molekulska masa (Mm i Mn) i indeks polidisperziteta (PDI) HPAE i LPAE mereni su pomoću gel permeacione hromatografije (GPC). Analiza je izvedena upotrebom 1260 Infinite GPC sistema sa detektorom refraktivnog indeksa (RI), detektorom viskometra (VS DP) i dvougaonim detektorom rasipanja svetlosti (LS 15° i LS 90°). Da bi se pripremili polimeri za analizu, 10.0 mg uzoraka rastvoreno je u 2 mL DMF i zatim filtrirano kroz 0.45 µm filter. GPC kolone (30 cm PLgel Mixed-C, dve u seriji) su eluirane sa DMF i 0.1 % LiBr na stopi protoka od 1 mL/min na 50°C. Kolone su kalibrisane sa linearnim poli(metil metakrilat) standardima (PMMA). NMR je potvrdila sastave HPAE. Uzorci polimera su rastvoreni u CDCl3, 1H-NMR spektri su dobijeni na Varian Inova 500 MHz spektrometru i prikazani u delovima na milion (ppm) u odnosu na odgovor rastvarača (7.24 ppm) ili tetrametilsilan (0.00 ppm). 13C NMR spektri su izvedeni na 150 MHz i prikazani u ppm u odnosu na odgovor rastvarača (77.2 ppm).
Određivanje molekulske mase pomoću gel permeacione hromatografije (GPC)
[0031] Molekulska masa i polidisperzitet HPAE su mereni pomoću GPC.50 µL HPAE uzorka je izvlačeno iz reakcije na specifičnim vremenskim intervalima, razblaženo sa 1mL DMF, filtrirano kroz 0.2 µm filter i zatim analizirano upotrebom Varian 920-LC GPC instrumenta opremljenog detektorom refraktornog indeksa (RI) na 60°C sa DMF kao elucionim rastvorom, stopa protoka je bila 1 ml u min. Mašina je kalibrisana sa linearnim poli(metil metakrilat) standardima.
Merenje protonske nuklearne magnetne rezonance (1H-NMR)
[0032] Hemijska struktura HPAE je potvrđena pomoću 1H-NMR. HPAE je rastvoren u deuterisanom hloroformu (CDCl3) i merenja su izvedena na 300 MHz Bruker NMR opremi. Sva hemijska pomeranja su prikazana u ppm u odnosu na tetrametilsilan (TMS).
1
Određivanje veličine polipleksa i zeta potencijala pomoću dinamičkog rasipanja svetlosti (DLS)
[0033] Za određivanje veličine i zeta potencijala, korišćen je pCMV-GLuc plazmid. Polipleksi su formirani preko elektrostatičke interakcije između DNK i HPAE. Ukratko, HPAE je prvo rastvoren u DMSO do 100 mg/ml. 2 µg DNK razblaženo je u 100 µl natrijum acetatnog pufera (pH 5.2±0.1, 0.025 M). Prema odnosu težine (tež./tež.) HPAE/DNK, traženi HPAE DMSO rastvor je razblažen do 100 ml sa natrijum acetatnim puferom i zatim je dodat u rastvor DNK, vorteksovan i održavan u mirovanju u trajanju od 10 minuta. Zatim je određivanje veličine polipleksa izvedeno na Malvern Instruments Zetasizer (Nano-2590) sa uglom rasejanja od 90°C. Za određivanje zeta potencijala, polipleksi su pripremljeni kao u prethdonom tekstu i razblaženi do 800 µl sa natrijum acetatnim puferom i zatim je zeta potencijal određen na istoj opremi. Sva određivanja su ponovljena najmanje četiri puta.
Određivanje Mark-Houwink alfa parametra
[0034] Mark-Houwink grafikon je moćan alat za ispitivanje strukture polimera u rastvoru jer on jasno otkriva vezu između strukture i molekulske mase sa visokom osetljivošću. On je generisan preko grafikona molekulske mase (MM) prema intrinzičkom viskozitetu (IV) na log-log grafikonu. Molekulska masa, naravno, pokazuje dužinu polimernih lanaca (ili stepen polimerizacije), ali sama po sebi ne može da pruži nikakvu indikaciju strukture. Intrinzički viskozitet (izražen u dL/g) je mera molekulske gustine polimernih lanaca u rastvoru. Što su lanci gušće savijeni ili namotani u rastvoru, to je veća gustina i niži intrinzički viskozitet. Ovo merenje je nezavisno od molekulske mase, tako da dve različite strukture koje imaju istu molekulsku masu mogu imati različite intrinzičke viskozitete – na primer linearni (negranati) polimer i granati polimer iste molekulske mase imaće različite intrinzičke viskozitete. Pored toga, ako polimer menja strukturu duž njegove raspodele molekulske mase (npr. postaje više supstituisan), promene intrinzičkog viskoziteta će se lako detektovati. Ovo je ono što čini Mark-Houwink grafikon tako korisnim i moćnim. Sirovi podaci za Mark-Houwink grafikon su prikladno i jednostavno dobijeni iz visoko kvalitetnih multi-detekcionih podataka GPC/SEC kombinovanjem molekulske mase iz detektora rasipanja svetlosti sa intrinzičkim viskozitetom iz detektora viskozimetra. Obe grupe podataka su merene na svakoj tački duž elucionog profila uzorka. Dobijeni grafikon može biti korišćen na mnoge načine od jednostavne procene koliko su dve strukture blizu stvaranja složenih kvantitativnih merenja grananja polimera.
[0035] Uopšteno:
α<0.5: kompaktni/sferični lanci
0.5<α<0.8: slučajno-navijeni/fleksibilni lanci
1
0.5<α<0.8: Kruti-štapićasti/kruti lanci
[0036] Određivanje Mark-Houwink alfa parametara HPAE izvedeno je na 1260 Infinite GPC sistemu sa detektorom refraktivnog indeksa (RI), detektorom viskometrom (VS DP) i dvougaonim detektorom rasipanja svetlosti (LS 15 ° i LS 90°). Da bi se polimeri pripremili za analizu, 10.0 mg uzoraka je rastvoreno i 2 mL DMF i zatim filtrirano kroz 0.45 µm filter. GPC kolone (30 cm PLgel Mixed-C, dva u seriji) su eluirane sa DMF i 0.1% LiBr na stopi protoka od 1 mL/min na 60°C. Kolone su kalibrisane sa linearnim poli(metil metakrilat) standardima (PMMA). GPC podaci su analizirani upotrebom univerzalne kalibracije.
Analize elektroforeze na agaroznom gelu
[0037] Za analize elektroforeze na agaroznom gelu, 1 µg Gluc plazmida je korišćeno za pripremu svakog uzorka. DNK je razblažen do 0.2 µg/ml sa natrijum acetatnim puferom, prema tež./tež. odnosu, traženi HP AB je razblažen do 5 µl sa natrijum acetatom i zatim dodat u rastvor 5 µl DNK, vorteksovan i održavan u mirovanju u trajanju od 10 minuta. Nakon toga, rastvori polipleksa su dodati zajedno sa 2 µl boje za punjenje u komorice sa agaroznim gelom (1 % agaroza u Tris-bornoj kiselini-EDTA (TBE) puferu sa SYBR® Safe DNA Stain, pH 8.0) i podvrgnuti istovremeno 60 mV u trajanju do 40 minuta. Zatim je agarozni gel vizualizovan i predstavljen sa Vis-BIue™ transiluminatorom.
Ćelijska kultura
[0038] Bubrežna proksimalna tubularna ćelijska linija HKC8 poreklom od čoveka, ćelijska linija slična fibroblastu COS7 bubrega američkog zelenog majmuna, ćelijska linija 3T3 tkiva embriona švajcarskog albino miša, stromalne ćelije rADSC adipoznog tkiva pacova i Neu7 astrocite, humana ćelijska linija cervikalnog kancera HeLa (Invitrogen) kultivisane su u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle medijumu (DMEM) koji sadrži 10% FBS i 1 % penicilin/streptomicin (PIS). Ćelijska linija RDEBK tip VII kolagen nula-RD EB keratinocita-RDEB-TA4 ljubazno obezbeđena od strane Dr F. Larcher (Madrid, Spain) je kultivisana u medijumu 2 za rast keratinocita (c-20011 pROMOCELL) sa 5% FBS i 1 % P/S. Mezenhimalna matična ćelijska linija poreklom iz humanog adipoznog tkiva hADSC (Invitrogen) održavana je u MesenPRO RSTM medijumu sa bazalnim medijumom, suplementom rasta i 1 % P/S. SH·SY5Y neuroblastom i primarni astrociti su kultivisani u 50% DMEM 150% F12 Ham medijumu koji sadrži 10% FBS i 1 % P/S, normalne humane keratinociti NHK i keratinociti RDEBK recesivne distrofične epidermolizis buloze kultivisani su u medijumu 2 za rast keratinocita (c-20011 pROMOCELL) sa 1 % PIS, ćelijska linija HepG2 hepatoćelijskog karcinoma kultivisana je u
1
RPMI 1640 medijumu koji sadrži 10% FBS i 1% P/S. Sve ćelije su kultivisane na 37°C, 5% CO2, u humidnom inkubatoru upotrebom standardnih tehnika ćelijske kultivacije.
In Vitro transfekcija i citotoksičnost
[0039] Za in vitro transfekcije upotrebom DNK gluciferaze, ćelije su zasejane na 96-komorne ploče u gustini od 1 x 10<4>ćelija/komorici u 100 µL medijuma i kultivisane do 70-80% konfluence. Matične ćelije rADSC, hADSC korišćene za transfekciju bile su ispod četvrtog pasaža, dok su primarne astrocite i SH-SY5Y korišćene za transfekciju bile pod petim pasažom. Pre transfekcije, polipleksi su pripremljeni shodno tome, 0.25 µg DNK po komorici je korišćeno za primarne ćelije i matične ćelije i 0.5 µg DNK po komorici je korišćeno za sve ostale ćelije. Korišćeni su odnosi težine (tež./tež.) polimera/DNK od 5:1, 10:1 i 15:1. Za komercijalne transfekcione reagense, PEI je korišćen u odnosu tež./tež. od 4:1 i SuperFect je korišćen prema protokolu proizvođača. Ukratko, LPAE i HPAE su početno rastvoreni u DMSO do 100 mg/mL stok rastvora, zatim prema tež./tež. odnosu i konačno, stok rastvori su dalje razblaženi natrijum acetatnim puferom. DNK je razblažena do 0.1 mg/mL natrijum acetatnog pufera. LPAE ili HPAE rastvori su dodati u rastvor DNK, vorteksovani u trajanju od 10-15 sekundi i ostavljeni da odstoje u trajanju od 10-15 minuta. Medijum ćelijske kulture je zatim dodat da bi se povećala zapremina rastvora polipleksa do 100 µL. Medijum u komoricama ploča ćelijske kulture je brzo uklonjen i dodat je rastvor polipleksa. Posle 4 časa, medijum je zamenjen sa 100 µL svežeg medijuma i ćelije su kultivisane još 44 časova. Kontrolne ćelije su podvrgnute istom tretmanu izuzev dodavanja polipleksa i komparativne kontrole za oba komercijalna transfekciona reagensa Superfect i PEI su takođe izvedene. Analiza aktivnosti izlučene gluciferaze izvedena je prema obezbeđenom protokolu, sa aktivnošću gluciferaze direktno detektovanom u ćelijskom supernatantu i postavljena je na grafikon prema relativnim svetlosnim jedinicama (RLU). Analiza citotoksičnosti je izvedena na svim ćelijama upotrebom Almarblue redukcionog postupka. Da bi se izvela ova analiza, ćelijski supernatanti su početno uklonjeni i zatim su ćelije isprane u Hank-ovom ravnotežnom rastvoru soli (HBSS), nakon čega je usledilo dodavanje 10% Alamarblue u HBSS. Žive, proliferišuće ćelije održavaju redukcionu sredinu unutar citosola ćelija koja deluje tako da redukuje aktivni, ne-fluorescentni sastojak (resazurin) u Alamarblue, u visoko fluorescentno jedinjenje, resorufin. Ova redukcija izaziva promenu boje iz plave u svetlo crvenu i omogućava kvantitativno merenje ćelijske vijabilnosti na bazi povećanja u ukupnoj fluorescenciji i boje medijuma. Alamarblue rastvor iz svake komorice je prebačen u sveću 96-komornu ploču sa ravnim dnom za merenja fluorescencije na 590 nm. Kontrolne ćelije netretirane polipleksima korišćene su za normalizaciju vrednosti fluorescencije, i one su prikazane na grafikonu kao 100% vijabilne. Svi eksperimenti redukcije gluciferaze i Alamarblue
1
su izvedeni u četiri ponavljanja sa granicom greške prikazanom kao ± standardna devijacija (SD). Za in vitro transfekcije upotrebom DNK GFP, ćelije su zasejane u 24-komorne ploče u gustini od 5 X 104 ćelija/komorici u 500 µL medijuma. Transfekcije su izvedene kao što je navedeno u prethodnom tekstu, ali 1 µg DNK po komorici je korišćeno za primarne ćelije i matične ćelije, dok je 2 µg DNK po komorici korišćeno za ostale ćelije. Za merenja protočne citometrije, posle transfekcije, ćelije su sakupljene prema standardnim protokolima ćelijske kulture i propidijum jodid je korišćen za isključivanje mrtvih ćelija sa najmanje uračunatih 8,000 ćelija. Da bi se vizualizovale transficirane ćelije sa fluorescentnim mikroskopom, 48 časova posle transfekcije, medijum je uklonjen i ćelije su isprane u HBSS tri puta i zatim vizualizovane pod fluorescentnim mikroskopom (Olympus IX81).
Procena HPAE/DNK polipleksa
[0040] Za analize elektroforeze na agaroznom gelu, 1 µg DNK je korišćeno za pripremu svakog uzorka. DNK je razblažena do 0.2 µg/µL u natrijum acetatnom puferu (pH 5.2±0.1, 0.025 M). HPAE su početno rastvoreni u DMSO da bi se proizveli 100 mg/mL stok rastvori. Na bazi tež./tež. odnosa, HPAE su dalje razblaženi do 5 µL u natrijum acetatnom puferu i zatim dodati u 5 µL rastvora DNK, vorteksovani i ostavljeni da odstoje u trajanju od 10 minuta. 2 µL boje za punjenje je dodato u svaki rastvor polipleksa pre punjenja u gel (1% agaroza u Tris-Acetatnom-EDTA puferu sa SYBR® Safe DNA Stain, pH 8.3) komorice. Gelovi su ispitivani 40 minuta na 60 mV. Slike agaroznih gelova su dobijene sa Vis-Blue™ transiluminatorom. Da bi se procenila veličina polipleksa, HPAE su rastvoreni u DMSO da bi se dobili 100 mg/mL stok rastvori.2 µg DNK je razblaženo u 10 µL natrijum acetatnog pufera. Prema težinskom odnosu HPAE/DNK (tež./tež.), HPAE stok rastvor je razblažen do 10 µL sa natrijum acetatnim puferom, dodat u rastvor DNK, vorteksovan u trajanju od 10 sekundi i zatim ostavljen da odstoji 10 minuta. Polipleksi su razblaženi sa DMEM koji sadrži 10% FBS i Malvern Instruments Zetasizer (Nano-2590) sa uglom rasipanja od 90 stepeni je korišćen za određivanje veličine polipleksa. Veličina je ponovo određivana posle 4 časa inkubacije. Svi eksprimenti su ponovljeni minimalno četiri puta.
„Western blot“ analiza
[0041] RDEBK ćelije su zasejane u TI 75 posudi 24 časa pre transfekcije. HPAE/DNK polipleksi (60 µg DNK) su pripremljeni kao što je prethodno navedeno i dodati su u ćelije. Posle 48 časova, supernatant je sakupljen, koncentrovan i denaturisan praćenjem standardnih protokola. Proteinski rastvor je sipan u SDS-PAGE gel (6%) i ispitivan na 130 V u trajanju od 70 minuta, zatim na 100 V u trajanju od 15 minuta. Sledeće, uzorak proteina je prebačen na
2
nitroceluloznu membranu na 80 V u trajanju od 1 časa. Blokiranje membrane je izvedeno u trajanju od 1 časa na sobnoj temperaturi upotrebom 5% BSA TBST pufera. Inkubacija uzorka proteina je izvedena preko noći na 4°C u primarnom antitelu (kolagen VII antitelo) razblaženom u 5% blokirajućem puferu. Membrana je isprana tri puta u TBST (svaki put po 5 minuta). Posle ispiranja, uzorak proteina je inkubiran sa sekundarnim antitelom (anti-zečje HRP) u 5% blokirajućem puferu u trajanju od 1 časa na sobnoj temperaturi. Konačno, membrana je ispirana tri puta u TBST. Slike su sakupljene upotrebom standardnih tehnika razvijanja u mračnoj sobi za hemiluminiscenciju.
Statistička analiza
[0042] Svi podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SD, pri čemu je SD predstavljena greškama. Statistička poređenja između kontrolne i tretiranih grupa izvedena su upotrebom Studentovog T testa. Prosečne vrednosti i standardne devijacije su izračunate za svaki ispitivani uzorak iz najmanje četiri nezavisna eksperimenta. Nivoi statističke značajnosti bili su podešeni na P < 0.05 (*), 0.01 (**) i 0.001 (***).
Rezultati
Sinteza ko-polimera:
[0043] Hiper-granati poli(β-amino estar) (HPAE) je uspešno sintetisan upotrebom Michael-ove adicione reakcije.
Karakterizacija kompleksa:
[0044] Dva od najznačajnijih faktora koji utiču na unos kompleksa od strane ćelija su njihovo katjonsko naelektrisanje i hidrodinamička veličina. Potencijal i hidrodinamička veličina nanočestica su određivani upotrebom višerežimske merne opreme koja koristi DLS i osobine naelektrisanja koloidnih ćestica da bi se odredila veličina čestica i potencijal, respektivno. (slika 3).
Kompleksacija polimera/DNK:
[0045] Sposobnost polimera da kompleksira plazmid Gaussia luciferaze (GLuc) DNK procenjivana je pomoću gel elektroforeze. Rastvori polimera/plazmida su pripremljeni u natrijum acetatnom puferu (pH=5.2, 0.025 M) u različitim masenim odnosima dodavanjem 1 µg GLuc u različite koncentracije polimera. Oni su ostavljeni u trajanju od 10 minuta da bi se formirali kompleksi pre analize. Agarozni gel (1 % agaroza u Tris-borat-EDT (TBE) puferu; sa SYBR®Safe DNK bojom) pripremljen je za sve testirane polimere. 10µL svakog rastvora polimera/plazmida (koncentracija DNK od 100 µg ml-1) dodato je zajedno sa 2µL boje za punjenje u svaku komoricu i istovremeno podvrgavano 120m V u trajanju do 40 minuta (Sl.4).
Ćelijska vijabilnost:
[0046] Ispitivanja ćelijske vijabilnosti za HPAE pokazuju nižu citotoksičnost u većini ćelijskih tipova u poređenju sa trenutnim komercijalnim polimernim vektorima.
Ćelijska transfekcija:
[0047] Analiza aktivnosti ekspresije luciferaze HPAE pokazala je sposobnost polimera da efikasno isporučuju i oslobađanju DNK u ćeliju. Rezultati ekspresije Gaussia luciferaze ukazuju na to da je HPAE sposoban za efikasnu transfekciju Bela, keratinocita (RDEBK) tip VII kolagen-nula i matičnih ćelija poreklom iz humanog adipoznog tkiva (ADSC).
Ekspresija pGFP posle transfekcije
[0048] Ekspresija pGFP u transficiranim Hela ćelijama (A) i RDEBK ćelijama (B) vizualizovana je upotrebom fluorescentnog mikroskopa.
[0049] U zaključku, razvili smo dobro-definisani multifukcionalni HPAE i koristili smo ga kao nevirusne vektore za gensku isporuku preko Michaelove adicione reakcije. Sistemsko istraživanje HPAE sintetisanog na tri različita tipa ćelija ukazuje na to da hiper-granata struktura ima kritičnu ulogu u postizanju visoke sposobnosti transfekcije i redukovane citotoksičnosti. Prilagođavanjem sastava i strukture, HPAE može da postigne ultra-visoku efikasnost transfekcije i istovremeno da pokaže veoma nisku citoksičnost, naročito u ćelijskim linijama keratinocita. HPAE predstavlja mnogo efikasnije i bezbednije vektore za isporuku gena u poređenju sa komercijalnim transfekcionim reagensima Superfect, PEI, Xfect i liopofektaminom 2000. Dokaz koncepta HPAE postavlja novo merilo u sposobnosti isporuke gena i može da obezbedi prve vodiče za razvoj nevirusnih vektora za isporuku gena visokog učinka.
Analiza hemijske strukture pomoću 1H NMR
[0050] Kao što je prikazano na slici 1,<1>H NMR spektar HPAE (u CDCl3, 300 MHz), signalni pikovi od "X" su dodeljeni rezidualnim rastvaračima DMSO (oko 2.5 ppm) i dietil etru (oko 1.2 ppm i 3.4 ppm).
Merenja molekulske mase pomoću GPC
[0051] Slika 2 prikazuje GPC tragove HPAE pre i posle postavljanja krajnje kape sa MPA, DMF kao eluentom, 50 stepeni, 1 ml/min. Prilikom izvođenja GPC testova za merenje molekulske mase HPAE, DMF je bio eluent, merenja su izvedena na 50 stepeni, stopa protoka eluenta bila je 1 ml/min. Molekulska masa HPAE pre postavljanja krajnje kape sa MPA i posle postavljanja krajnje kape sa MPA merena je respektivno.
Analiza veličine i zeta potencijala pomoću dinamičkog rasipanja svetlosti (DLS)
[0052] HPAE/DNK polipleksi imaju hidratacioni prečnik oko 75 nm i zeta potencijal oko 24 mV, prikazan na slici 3.
Kapacitet kondenzacije DNK procenjivan pomoću elektroforeze na agaroznom gelu [0053] HPAE može da kondenzuje DNK efikasno pod tež./tež. odnosom u opsegu od 10:1 do 30:1 (videti sliku 4).
Citotoksičnost HPAE kod različitih ćelijskih tipova procenjivana pomoću AlamarBlue analiza
[0054] U tri testirana ćelijska tipa, HPAE/DNK može da očuva najmanje 80% ćelijske vijabilnosti posle transfekcije u trajanju od 48 h u odnosu tež./tež. od 30:1, 96-komorne ploče, 0.5 µg DNK po komorici (videti sliku 5).
Procena efikasnosti in vitro transfekcije sa ekspresijom gluciferaze i GFP
[0055] Kao što je prikazano na slici 6 tri ćelijska tipa su ispoljila veoma visoku aktivnost gluciferaze posle transfekcije sa HPAE/DNK polipleksima u trajanju od 48 h pod uslovima seruma. Pored toga, kao što je prikazano na slici 7, tri ćelijska tipa su ispoljila veoma visoku ekspresiju zelenog fluorescentnog proteina (GFP) posle transfekcije sa HPAE/DNK polipleksima u trajanju od 48 h pod uslovima seruma.
Dizajn i sinteza HPAE
[0056] 4-amino-1-butanol (S4, A2 tip monomer), trimetilolpropan triakrilat (TMPTA, B3 tip monomer) i bisfenol etoksilat diakrilat (BE, C2 tip monomer) su kopolimerizovani preko "A2+B3+C2" tipa Michael-ove adicije u jednoj posudi (Sl.8). Da bi se sistemski procenili efekti različitih monomerskih komponenti na 30 arhitektura i funkcionalnosti HPAE, odnosi punjenja TMPT prema BE su uzastopno varirani. Zatim, funkcionalni 3-morfolinopropilamin (MPA) je uveden preko dodavanja krajnje kape da bi se dalje pojačala osobina i funkcionalnosti HPAE kao genskih vektora. Da bi se poredili efekti različitih struktura na učinak poli(β-amino estara), linearni parnjak, LPAE, je takođe sintetisan. Gel permeracija (GPC) je korišćena za praćenje rasta baznih polimera u toku polimerizacije. Ukratko, povećanje odnosa punjenja TMPTA prema BE rezultovalo je u čak bržem povećanju molekulske mase baznog polimera, što znači da je više
2
oligomera kombinovano preko granajućih jedinica. Sastav monomernih jedinica u baznim polimerima je dalje potvrđen pomoću nuklearne magnetne rezonantne spektroskopije (<1>HNMR i 13CNMR, SL. 11, 12 i 13). Odnosi punjenja pokazali su da je postojao višak vinil grupa u poređenju sa amino grupama (Tabela S1), prema tome tu su bile prisutne višestruke neodreagovale vinil grupe u baznim polimerima (oko 6.0 ppm). Kako se odnos punjenja TMPTA prema BE povećao, odgovarajuća količina rezidualnih vinil grupa u baznom polimeru se povećala (Sl.11). Postojeće višestruke vinil grupe su dalje modifikovane sa funkcionalnim MPA preko postavljanja krajnje kape. Posledično, posle prečišćavanja, sve vinil grupe u baznim polimerima su proširene i uvedene su višestruke morfolino grupe (Sl. 9a). GPC podaci su potvrdili da su svi HPAE imali sličnu molekulsku masu (Mm je približno bila 12,000, Sl. 9b) i PDI (približno 2.2), što pokazuje da se čak na visokoj koncentraciji monomera (500 mg/mL) i reakcionoj temperaturi (90°C) sa visokim odnosom punjenja granajućeg monomeroma (TMPTA), polimerizacija još uvek može biti dobro kontrolisana bez gelacije preko pristupa "A2+B3+C2" Michael-ove adicije u jednoj posudi. Alfa (α) vrednost svih HPAE Mark-Houwink (MH) grafikona bila je ispod 0.5 što ukazuje na to da su to bile tipično visoko granate strukture (Sl. 9c). Pored toga, kako se odnos punjenja TMPTA prema BE povećao, vrednost se smanjila od 0.48 za HPAE-1 do 0.31 za HPAE-10 što takođe pokazuje da se preko "A2+B3+C2" pristupa, granata struktura polimera može lako podesiti jednostavnim variranjem odnosa punjenja od B3 do C2. Detaljan odnos punjenja monomera, sastav polimera i strukturne informacije su prikazani u Tabeli 1.
[0057] Povoljno, poli-beta amino estri predmetnog pronalaska imaju alfa parametar poreklom od Mark-Houwink jednačine od manje od 0.5, na primer od 0.3 do 0.5. Ovo pokazuje da su triakrilati kopolimerizovani sa aminima i diakrilatima istovremeno, da poli-beta amino estri imaju veću gustinu funkcionalne grupe i trodimenzionalnu arhitekturu, i da su poli-beta amino estri predmetnog pronalaska visoko granati.
Tabela S1. Odnos punjenja monomera za sintezu LPAE i HPAE
1. Za sintezu HPAE, monomeri: TMPTA, BE i S4 su prethodno rastvoreni u DMSO do 500 mg/mL.
2. Zapremina DMSO korišćena za razblaživanje baznih polimera pre postavljanja krajnje kape sa MPA.
Interakcija HPAE sa DNK
[0058] Kondenzacija DNK pomoću vektora za isporuku gena u poliplekse nano-veličine je jedan od fundamentalnih uslova za efikasnu isporuku gena. Da bi se procenila kondenzacija DNK i formiranje nano polipleksa, korišćeni su elektroforeza na agaroznom gelu i analize dinamičkog rasipanja svetlosti (DLS). Rezultati gel elektroforeze su pokazali da nije bilo pomeranja DNK izvan komorica kod svih HPAE/DNK težinskih odnosa (tež./tež.) u opsegu od 3:1 do 30:1; što
2
označava formiranje HPAE/DNK polipleksa i snažno vezivanje HPAE-DNK (Sl. 14a), što je posledica odlične sposobnosti protonacije višestrukih tercijarnih amina u osnovnim lancima HPAE. Rezultati DLS su dalje pokazali sposobnost kondenzacije DNK, HPAE da bi se formirali polipleksi nano-veličine (30-120 nm, Sl. 14b). Mala veličina ovih polipleksa je visoko primenljiva; jer bi mali polipleksi mogli da prodiru kroz biološke barijere sa većom lakoćom. Kožno tkivo; krvno-moždana barijera (BBB) i limfni čvorovi su dobro poznati po tome što je teško kroz njih proći, ističući široki spektar ciljnih mesta i primena, HPAE bi se mogla koristiti u različitim tkivima. Pored toga, HPAE/DNK polipleksi su bili prilično stabilni zbog toga što nije bilo vidljive agreagacije u prisustvu seruma (Sl. 14c), što bi potencijalno moglo da poveća unos polipleksa u ćelije i višu efikasnost transfekcije sa velikim kliničkim značajem za in vivo primene.
Procena potencije transfekcije HPAE in vitro
[0059] Cilj istraživanja nevirusnog vektora za isporuku gena je pretežno maksimizacija efikasnosti transfekcije uz istovremenu minimizaciju nivoa citotoksičnosti. Međutim, u praksi, poboljšanja u efikasnosti transfekcije obično dolaze na račun bezbednosti i obrnuto. Kao takav, učinak transfekcije genskih vektora je potrebno pažljivo proceniti pre finalne primene u kliničkom okruženju. Sposobnost transfekcija genom i bezbednost deset HPAE sa različitim sastavima i strukturama je prvo procenjivana i upoređivana sa onim kod LPAE in vitro u HeLa ćelijama, i procenjivana je pomoću analize izlučenog proteina Gaussia luciferaze (gluciferaze) i analize Alamarblue. Komercijalno dostupni reagensi za transfekciju SuperFect i PEI su korišćeni kao pozitivne kontrole da bi se obezbedila mera za poređenje. Sl. 15 prikazuje aktivnost gluciferaze i vijabilnost HeLa ćelija posle transfekcije sa različitim vektorima. Podaci su jasno pokazali da su u poređenju sa LPAE, svih deset HPAE ispoljili značajno višu efikasnost transfekcije sa 12 do 2,400-strukim povećanjem u aktivnosti gluciferaze, uz održavanje ćelijske vijabilnosti preko 90%. Posle poređenja sa SuperFect i PEI, koji su dobro ustanovljeni kao vektori sa visokom efikasnošću transfekcije, aktivnost gluciferaze HeLa ćelija posle transfekcije sa HPAE-1, HPAE-2, HPAE-3 i HPAE-4 bila je i dalje uglavnom 5 do 20 puta viša. Ovi rezultati pokazuju da grananje ima kritičnu ulogu u potenciji transfekcije poli(β-amino estara) i da prilagođavanjem 3D strukture zajedno sa višestrukim funkcionalnim terminalnim grupama, efikasnost transfekcije poli(β-amino estara) može biti pojačana za nekoliko redova veličine. Da bi se dodatno potvrdila visoka potencija HPAE u isporuci gena, široki spektar 12 ćelijskih tipova sa različitim fenotipovima je testiran upotrebom HPAE-2 i HPAE-4 sistematično (Sl. 10. U epitelijalnim ćelijama (HKC8), fibroblastima (COS7 i 3T3), keratinocitima (NHK i RDEBK) i ćelijama kancera (HeLa, HepG2 i SHSY-5Y), oba - HPAE-2 i HPAE-4 su pokazali bolju
2
efikasnost transfekcije, naročito u tež./tež. odnosu 15:1. Aktivnost gluciferaze je bila čak do 8,521 puta viša u poređenju sa onom od LPAE pod istim uslovima transfekcije (Sl. 10a). Dobro je poznato da su matične ćelije i astrocite među ćelijskim tipovima koji predstavljaju najveći izazov za transfekciju upotrebom nevirusnih vektora. Zaista, na ADSC pacova (rADSC), humanim ADSC (hADSC), Neu7 astrocitama i primarnim astrocitama, LPAE su ispoljile veoma nisku efikasnost transfekcije i uopšteno aktivnost gluciferaze bila je 2 do 3 reda veličine niža nego u gore navedenim imortalizovanim ćelijama. Nasuprot tome, posle transfekcije sa HPAE-2 i HPAE-4 aktivnost gluciferaze istih matičnih ćelija i astrocita bila je mnogo viša i slična imortalizovanim ćelijama, što podržava ideju da HPAE proizvode visoku potenciju transfekcije bez obzira na ćelijske tipove. Bolja sposobnost transfekcije HPAE je dalje kvantitativno određivana upotrebom protočne citometrije preko ekspresije GFP posle transfekcije (Sl. 16). U HKC8, COS7, NHK, RDEBK, HeLa i rADSC, preko 75% ćelija bilo je GFP pozitivno 48 časova posle transfekcije – čak do 98% u HKC8. Slično, manje od 10% ćelija bilo je GFP pozitivno posle transfekcije sa LPAE osim u RDEBK (35%) u odnosu tež./tež. od 15:1. U skladu sa ekspresijom gluciferaze, čak u hADSC i primarnim astrocitama koji predstavljaju najveći izazov, HPAE-2 i HPAE-4 još uvek su pokazale visoku efikasnost transfekcije, sa preko 35% ćelija efikasno transificiranih. U oštrom kontrastu, LPAE je pokazao zanemarljivu efikasnost transfekcije (< 6%) u ovim ćelijama. Reprezentativne slike fluorescencije ćelija posle transfekcije prikazane su na Sl.10b, sa boljom efikasnošću transfekcije HPAE koja je prikazana kvantitativno jakom ekspresijom GFP. Visoka efikasnost transfekcije HPAE je dodatno potvrđena pomoću „western blotting“ analize upotrebom pcDNA3.1COL7A1 plazmid kodirajućeg tipa VII proteina kolagena (C7). Ovi rezultati pokazuju da HPAE-4 može efikasno da isporučuje pcDNA3.1COL7A1 u C7 nula RDEBK ćelije i značajan C7 protein je proizveden 48 časova posle transfekcije (Sl.10c). Uzeto zajedno, ovo ističe sposobnost HPAE da isporučuju terapeutski gen za povratak funkcionalne proteinske ekspresije. Svi rezultati iz analiza gluciferaze, protočno citometrijskih merenja i „western blotting“ analize potvrđuju ideju da uvođenje grananja može značajno da pojača sposobnost transfekcije gena poli(β-amino estara), i da je grananje veoma važno u genskoj isporuci poli(3-amino estara). Vredno je pomena da su dvanaest ćelijskih tipova transficiranih ovde bili iz različitih tkiva sa različitim fenotipovima, tako da činjenica da su HPAE pokazali bolju potenciju transfekcije na svima njima sugeriše veliki potencijal za HPAE sa implikacijama za njihovu upotrebu kod mnogih kliničkih ciljnih mesta.
[0060] U vezi sa bezbednošću transfekcije, Sl. 17 prikazuje da oba HPAE nisu pokazala značajan nivo citotoksičnosti i da oni mogu da održavaju visoku ćelijsku vijabilnost čak na visokom odnosu tež./tež. u matičnim ćelijama i astrocitama. Nasuprot tome, PEI je bio veoma
2
toksičan i vijabilnost 3T3, hADSC, SH-SY5Y i primarne astrocite posle transfekcije bila je za sve ispod 50%. Ovi rezultati ilustruju da uvođenje granate strukture može da pojača sposobnost transfekcije poli(β-amino estara), ali ne ugrožava ćelijsku vijabilnost.
Reference
[0061]
1. Green, J. J.; Langer, R.; Anderson, D. G., combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Acc Chem Res 2008, 41(6), 749-59.
2. Eltoukhy, A.A.; Chen, D.; Alabi, C. A.; Langer, R.; Anderson, D. G., Deradable terpolymers with alkil side chains demonstrate enhanced gene delivery potency and nanoparticle stability. Adv. Mater 2013, 25, 1487-93.
[0062] Reči "sadrži/koji sadrži" i reči "ima/uključujući" kada su ovde korišćene u vezi sa predmetnim pronalaskom korišćene su za označavanje prisustva navedenih karakteristika, celih brojeva, koraka ili komponenti, ali ne isključuje prisustvo ili dodavanje jedne ili više drugih karakteristika, celih brojeva, koraka, komponenti ili njihovih grupa. Jasno je da određene karakteristike pronalaska, koje su, radi jasnoće, opisane u kontekstu posebnih primera izvođenja, mogu takođe biti obezbeđene u kombinaciji u jednom primeru izvođenja. Suprotno tome, različite karakteristike pronalaska koje su, radi sažetosti, opisane u kontekstu jednog primera izvođenja, takođe mogu biti obezbeđene posebno ili u bilo kojoj pogodnoj pod-kombinaciji.
2

Claims (21)

  1. Patentni zahtevi 1. Poli-beta amino estar pripremljen pomoću: (a) zajedničke reakcije, preko Michael-ove adicione reakcije, da bi se formirao polimer P1: (i) triakrilatne komponente koja ima formulu (I)
    gde je Z1 osnova koja se sastoji od: linearnog ili granatog ugljeničnog lanca od 1 do 30 atoma ugljenika, linearnih ili granatih ugljeničnih lanaca koji sadrže heteroatom od 1 do 30 atoma, karbociklusa koji sadrži 3 do 30 atoma ugljenika ili heterociklusa koji sadrži 3 do 30 atoma; gde je Z1 nesupstituisan ili supstituisan sa najmanje jednim od halogena, hidroksila, amino grupe, sulfonil grupe, sulfonamid grupe, tiola, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C1-C6etra, C1-C6tioetra, C1-C6sulfona, C1-C6sulfoksida, C1-C6primarnog amida, C1-C6sekundarnog amida, halo C1-C6alkila, karboksil grupe, cijano grupe, nitro grupe, nitrozo grupe, -OC(O)NR’R’, -N(R’)C(O)NR’R’, -N(R’)C(O)O-C1-C6alkila, C3-C6cikloalkila, C3-C6heterociklila, C2-C5heteroarila i C6-C10arila; gde je svaki R’ nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C6alkila; (ii) diakrilatne komponente koja je bisfenol etoksilat diakrilat; i (iii) komponente amina A1 koja sadrži 3 do 20 atoma, pri čemu je navedena komponenta amina nesupstituisana ili supstituisana sa najmanje jednim od halogena, hidroksila, amino grupe, sulfonil grupe, sulfonamid grupe, tiola, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C1-C6etra, C1-C6tioetra, C1-C6sulfona, C1-C6sulfoksida, C1-C6primarnog amida, C1-C6sekunadarnog amida, halo C1-C6alkila, karboksil grupe, cijano grupe, nitro grupe, nitrozo grupe, -OC(O)NR’R’, -N(R’)C(O)NR’R’, -N(R’)C(O)O-C1-C6alkila, C3-C6cikloalkila, C3-C6heterociklila, C2-C5heteroarila i C6-C10arila; gde je svaki R’ nezavisno izabran, iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C6alkila; 2 (b) reakcije polimera P1 preko Michael-ove adicione reakcije sa komponentom amina A2 koja sadrži 3 do 20 atoma, gde je navedena komponenta amina nesupstituisana ili supstituisana sa najmanje jednim od halogena, hidroksila, amino grupe, sulfonil grupe, sulfonamid grupe, tiola, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C1-C6etra, C1-C6tioetra, C1-C6sulfona, C1-C6sulfoksida, C1-C6primarnog amida, C1-C6sekundarnog amida, halo C1-C6alkila, karboksil grupe, cijano grupe, nitro grupe, -OC(O)NR’R’, -N(R’)C(O)NR’R’, -N(R’)C(O)O-C1-C6alkila, C3-C6cikloalkila, C3-C6heterociklila, C2-C5heteroarila i C6-C10arila; gde je svaki R’ nezavisno izabran, iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C6alkila.
  2. 2. Poli-beta amino estar prema patentnom zahtevu 1, koji ima molekulsku masu u opsegu od 3000 Da do 50,000 Da.
  3. 3. Poli-beta amino estar prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što triakrilatna komponenta ima formulu:
    gde je R linearni ili granati ugljenični lanac od 1 do 30 atoma ugljenika, linearni ili granati ugljenični lanci koji sadrže heteroatom od 1 do 30 atoma, karbociklus koji sadrži 3 do 30 atoma ugljenika, ili heterociklus koji sadrži 3 do 30 atoma; gde je R nesupstituisan ili supstituisan sa najmanje jednim od halogena, hidroksila, amino grupe, sulfonil grupe, sulfonamid grupe, tiola, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C1-C6etra, C1-C6tioetra, C1-C6sulfona, C1-C6sulfoksida, C1-C6primarnog amida, C1-C6sekundarnog amida, halo C1-C6alkila, karboksil grupe, cijano grupe, nitro grupe, nitrozo grupe, -OC(O)NR’R’, -N(R’)C(O)NR’R’, -N(R’)C(O)O- C1-C6alkila, C3-C6cikloalkila, C3-C6heterociklila, C2-C5heteroarila i C6-C10arila; gde je svaki R’ nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C6alkila; i R1 je nesupstituisan ili supstituisan, linearan ili granat ugljenični lanac od 1 do 10 atoma ugljenika, linearni ili granati ugljenični lanci koji sadrže heteroatom od 1 do 10 atoma, karbociklus koji sadrži 3 do 10 atoma ugljenika, ili heterociklus koji sadrži 3 do 10 atoma.
  4. 4. Poli-beta amino estar prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što triakrilatna komponenta ima formulu:
    gde je R linearni ili granati ugljenični lanac od 1 do 30 atoma ugljenika; i R<1>je linearan ili granati ugljenični lanac od 1 do 10 atoma ugljenika.
  5. 5. Poli-beta amino estar prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što triakrilatna komponenta ima formulu:
    gde je R1 linearni ili granati ugljenični lanac od 1 do 30 atoma ugljenika, izabran iz grupe koja se sastoji od metila, etila, propila, butila, pentila, heksila, heptila, oktila, nonila ili decila.
  6. 6. Poli-beta amino estar prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što je triakrilatna komponenta izabrana iz grupe koja se sastoji od trimetilolpropan triakrilata, pentaeritritol triakrilata, glicerol propoksilat (1PO/OH) triakrilata, trimetilolpropan propoksilat triakrilata i pentaeritritol propoksilat triakrilata. 1
  7. 7. Poli-beta amino estar prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što je komponenta amina A1 izabrana iz grupe koja se sastoji od metil amina, etil amina, propil amina, butil amina, pentil amina, heksil amina, heptil amina, oktil amina, nonil amina i decilamina.
  8. 8. Poli-beta amino estar prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što je komponenta amina A1 izabrana iz grupe koja se sastoji od:
  9. 9. Poli-beta amino estar prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što je komponenta amina A2 C1-C20alkil amin; C2-C20cikloalkil amin; C4-C20aril amin ili C3-C20cikloalkil amin; gde je amin nesupstituisan ili supstituisan sa najmanje jednim od halogena, hidroksila, amino grupe, sulfonil grupe, sulfonamid grupe, tiola, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C1- 2 C6etra, C1-C6tioetra, C1-C6sulfona, C1-C6sulfoksida, C1-C6primarnog amida, C1-C6sekundarnog amida, halo C1-C6alkila, karboksil grupe, cijano grupe, nitro grupe, -OC(O)NR’R’, -N(R’)C(O)NR’R’, -N(R’)C(O)O-C1-C6alkila, C3-C6cikloalkila, C3-C6heterociklila, C2-C5heteroarila i C6-C10arila; gde je svaki R’ nezavisno izabran, iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C6alkila.
  10. 10. Poli-beta amino estar prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što je komponenta amina A2 izabrana iz grupe koja se sastoji od:
  11. 11. Poli-beta amino estar prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što ima alfa parametar poreklom od Mark-Houwink jednačine od manje od 0.5, pri čemu se određivanje parametra izvodi upotrebom uzorka polibeta amino estra rastvorenog u dimetilformamidu (DMF).
  12. 12. Poli-beta amino estar prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što ima alfa parametar poreklom od Mark-Houwink jednačine od 0.3 do 0.5, pri čemu se određivanje parametra izvodi upotrebom uzorka polibeta amino estra rastvorenog u dimetilformamidu (DMF).
  13. 13. Poli-beta amino estar prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što triakrilat je trimetilolpropan triakrilat; amin A1 je
    i amin A2 je
  14. 14. Poli-beta amino estar prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu za upotrebu kao lek.
  15. 15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži poli-beta amino estar prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13.
  16. 16. Farmaceutska kompozicija koja sadrži polinukleotid i poli-beta amino estar prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13.
  17. 17. Farmaceutska kompozicija koja sadrži nanočestice koje sadrže polinukleotid i poli-beta amino estar prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13.
  18. 18. Kompozicija za upotrebu u transfekciji ćelije koja sadrži nukleinsko kiselinsku komponentu i poli-beta amino estarsku komponentu prema patentnom zahtevu 1. 4
  19. 19. Kompozicija za upotrebu za upotrebu prema patentnom zahtevu 18, naznačena time što: triakrilat je trimetilolpropan triakrilat; amin A1 je
    i amin A2 je
  20. 20. In-vitro postupak za transfekciju ćelija koji sadrži dovođenje u kontakt ćelija sa kompozicijom koja sadrži nevirusni transfekcioni agens i nukleinsku kiselinu; pri čemu je navedeni nevirusni transfekcioni agens poli-beta amino estar pripremljen pomoću: (a) zajedničke reakcije, preko Michael-ove adicione reakcije, da bi se formirao polimer P1: (i) triakrilatne komponente koja ima formulu:
    gde je R1 linearan ili granati ugljenični lanac od 1 do 10 atoma ugljenika, izabran iz grupe koja se sastoji iz grupe koja se sastoji od metila, etila, propila, butila, pentila, heksila, heptila, oktila, nonila ili decila; (ii) diakrilatne komponente koja je bisfenol etoksilat diakrilat; i (iii) komponente amina A1 koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od metil amina, etil amina, propil amina, butil amina, pentil amina, heksil amina, heptil amina, oktil amina, nonil amina, decilamina; ili:
    (b) reakcijom polimera P1 preko Michael-ove adicione reakcije sa komponentom amina A2; pri čemu je A2 izabran iz grupe koja se sastoji od:
  21. 21. Postupak prema patentnom zahtevu 20, naznačen time što: triakrilat je trimetilolpropan triakrilat; amin A1 je
    i amin A2 je
RS20200441A 2014-08-06 2015-08-06 Hiper-granati poli(beta-amino estar) za gensku terapiju RS60335B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1413907.5A GB201413907D0 (en) 2014-08-06 2014-08-06 Hyberbranched poly(beta-amino ester) for gene therapy
PCT/EP2015/068153 WO2016020474A1 (en) 2014-08-06 2015-08-06 HYPERBRANCHED POLY( ß -AMINO ESTER) FOR GENE THERAPY
EP15745509.8A EP3177670B1 (en) 2014-08-06 2015-08-06 Hyperbranched poly( beta-amino ester) for gene therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60335B1 true RS60335B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=51587799

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200441A RS60335B1 (sr) 2014-08-06 2015-08-06 Hiper-granati poli(beta-amino estar) za gensku terapiju

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20170216455A1 (sr)
EP (2) EP3738992A1 (sr)
CY (1) CY1122850T1 (sr)
DK (1) DK3177670T3 (sr)
ES (1) ES2785248T3 (sr)
GB (1) GB201413907D0 (sr)
HR (1) HRP20200633T1 (sr)
HU (1) HUE049704T2 (sr)
LT (1) LT3177670T (sr)
PL (1) PL3177670T3 (sr)
PT (1) PT3177670T (sr)
RS (1) RS60335B1 (sr)
SI (1) SI3177670T1 (sr)
SM (1) SMT202000235T1 (sr)
WO (1) WO2016020474A1 (sr)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3700965A1 (en) 2017-10-27 2020-09-02 Massachusetts Institute of Technology Poly (beta-amino esters) and uses thereof
WO2020077347A2 (en) * 2018-10-12 2020-04-16 Amryt Genetics Ltd. Compositions and methods for transfecting cells
EP3870629A1 (en) 2018-10-26 2021-09-01 Massachusetts Institute of Technology Polymer-lipids and compositions
KR20210110791A (ko) * 2018-12-28 2021-09-09 엠리트 제네틱스 리미티드 폴리플렉스의 형성 방법
EP3798250A1 (en) * 2019-09-25 2021-03-31 University College Dublin Hyperbranched cationic polymers useful as nucleic acid delivery vectors for transfecting
CN114650811A (zh) 2019-09-25 2022-06-21 爱尔兰国立都柏林大学 用于基因疗法的纳米粒子组合物
CN110746599B (zh) 2019-09-30 2021-06-18 苏州大学 具有高效基因递送能力的UV光响应性超支化聚β-氨基酯及其制备方法与应用
CN111135306B (zh) * 2020-01-19 2023-03-10 安阳师范学院 基于叶酸靶向聚乙二醇修饰型超支化聚胺制备叶酸和磁性双靶向型非病毒基因载体的方法
US12433847B2 (en) 2021-03-09 2025-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Branched poly(-amino esters) for the delivery of nucleic acids
CN114106348B (zh) * 2021-11-12 2023-07-07 西安交通大学 苯硼酸修饰的胞内可降解超支化聚（β-氨基酯）及其制备方法和蛋白递送应用
EP4183884A1 (en) * 2021-11-19 2023-05-24 Branca Bunus Limited A method of preparing a fraction of a starting polymer vector for gene therapy
WO2023131648A1 (en) 2022-01-05 2023-07-13 Branca Bunus Limited Nanoparticulate compositions for gene therapy
EP4324485A1 (en) 2022-08-15 2024-02-21 Branca Banus Ltd A method for the production of pegylated hyperbranched poly( -amino ester)s, pegylated hyperbranched poly( -amino ester)s produced by those methods and their use in enhanced nucleic acid delivery
CN116003787B (zh) * 2023-01-15 2026-03-06 上海艾迪特基因科技有限公司 含疏水烷基链的高度支化聚（β-氨基酯）及其制备方法和mRNA递送应用
CN116178709B (zh) * 2023-02-28 2025-11-21 西安交通大学 一类主链含有硫醚的功能性高度支化聚（β-氨基酯）及其制备方法和应用
CN116396476B (zh) * 2023-04-18 2026-02-24 西安交通大学 一类末端为两性离子功能化的高度支化聚（β-氨基酯）及其制备方法和应用
CN116640301A (zh) * 2023-06-28 2023-08-25 复旦大学附属儿科医院 一类功能性高度灵活的支化聚、制备方法及mRNA递送应用
CN119101237A (zh) * 2024-08-14 2024-12-10 安徽艾迪特生物科技有限公司 支化聚(β-氨基酯)及其制备方法和用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5180424A (en) * 1991-10-07 1993-01-19 Westvaco Corporation Michael addition aminopolyester resins as dilution extenders for zinc-containing metal resinate inks
US6998115B2 (en) 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
JP5541861B2 (ja) * 2005-04-29 2014-07-09 エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ 超分岐ポリマーおよびそれらの適用
EP2046266A4 (en) * 2006-07-21 2009-11-04 Massachusetts Inst Technology ENDMODICIFIED POLY (BETA AMINO ESTER) AND ITS USE

Also Published As

Publication number Publication date
PT3177670T (pt) 2020-04-24
PL3177670T3 (pl) 2020-07-13
CY1122850T1 (el) 2021-05-05
HRP20200633T1 (hr) 2020-08-07
GB201413907D0 (en) 2014-09-17
WO2016020474A1 (en) 2016-02-11
EP3177670B1 (en) 2020-03-18
SI3177670T1 (sl) 2020-07-31
DK3177670T3 (da) 2020-04-27
EP3177670A1 (en) 2017-06-14
LT3177670T (lt) 2020-06-25
EP3738992A1 (en) 2020-11-18
HUE049704T2 (hu) 2020-10-28
US20170216455A1 (en) 2017-08-03
ES2785248T3 (es) 2020-10-06
SMT202000235T1 (it) 2020-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS60335B1 (sr) Hiper-granati poli(beta-amino estar) za gensku terapiju
Zhou et al. Highly branched poly (β-amino ester) s for skin gene therapy
Chen et al. Redox and pH-responsive degradable micelles for dually activated intracellular anticancer drug release
Li et al. PEG-sheddable polyplex micelles as smart gene carriers based on MMP-cleavable peptide-linked block copolymers
Jiang et al. Multi-arm carriers composed of an antioxidant lignin core and poly (glycidyl methacrylate-co-poly (ethylene glycol) methacrylate) derivative arms for highly efficient gene delivery
Bus et al. 3rd generation poly (ethylene imine) s for gene delivery
US20080112916A1 (en) CHEMICALLY MODIFIED POLYCATION POLYMER FOR siRNA DELIVERY
EP2340811B1 (en) Ph-sensitive block copolymer forming polyionic complex micelles and drug or protein carrier using the same
Liu et al. Inhibition of murine breast cancer growth and metastasis by survivin-targeted siRNA using disulfide cross-linked linear PEI
EP2284210B1 (en) Charge conversional ternary polyplex
Li et al. Asymmetrically functionalized β-cyclodextrin-based star copolymers for integrated gene delivery and magnetic resonance imaging contrast enhancement
EP2716689A1 (en) Polymer comprising a plurality of branches having at least one disulfide group and/or at least one vinyl group
US9254258B2 (en) Amphiphilic block copolymers for nucleic acid delivery
Plenderleith et al. Highly-branched poly (N-isopropyl acrylamide) s with core–shell morphology below the lower critical solution temperature
Gibson et al. Star polymers with acid-labile diacetal-based cores synthesized by aqueous RAFT polymerization for intracellular DNA delivery
Shi et al. Reducible HPMA-co-oligolysine copolymers for nucleic acid delivery
Samarajeewa et al. Degradable cationic shell cross-linked knedel-like nanoparticles: synthesis, degradation, nucleic acid binding, and in vitro evaluation
Liao et al. A direct comparison of linear and star-shaped poly (dimethylaminoethyl acrylate) polymers for polyplexation with DNA and cytotoxicity in cultured cell lines
Miyazaki et al. Guanidine-phosphate interactions stabilize polyion complex micelles based on flexible catiomers to improve mRNA delivery
Lin et al. Cationic micellar nanoparticles for DNA and doxorubicin co-delivery
Kizjakina et al. Cationic glycopolymers for the delivery of pDNA to human dermal fibroblasts and rat mesenchymal stem cells
Bayraktutan et al. Polysarcosine functionalised cationic polyesters efficiently deliver self-amplifying mRNA
Wang et al. Impact of molecular rigidity on the gene delivery efficiency of core–shell tecto dendrimers
Johnson et al. Poly (2‐Hydroxyethyl Methacrylate)‐b‐Poly (L‐Lysine) Cationic Hybrid Materials for Non‐Viral Gene Delivery in NIH 3T3 Mouse Embryonic Fibroblasts
Lin et al. PEGylated bioreducible poly (amido amine) s for non-viral gene delivery