RS60354B1

RS60354B1 - Kombinacija kanrenoata i eksenatida

Info

Publication number: RS60354B1
Application number: RS20200614A
Authority: RS
Inventors: George Vogiatzis
Original assignee: Genesis Pharma Sa
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2020-07-31
Also published as: CN108472333A; DK3370756T3; SMT202000290T1; JP2018537522A; HRP20200845T1; CY1123041T1; PL3370756T3; EP3370756A1; US20170333519A1; US10172914B2; CN108472333B; WO2017077378A1; JP6928611B2; ES2791301T3; EP3370756B1; US20190290721A1; HUE049732T2; PT3370756T; SI3370756T1; ME03734B

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak pruža novu kombinaciju koja sadrži najmanje: (i) modulator insulina, konkretno eksenatid ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i (ii) antagonist aldosterona, tačnije kalijum kanrenoat. Navedene kombinacije su pogodne za kardioprotekciju i/ili za tretman i/ili sprečavanje ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja.

[0002] Dalji aspekti se odnose na farmaceutske proizvode i farmaceutske sastave koji sadrže navedene kombinacije prema pronalasku i farmaceutske proizvode i farmaceutske sastave za upotrebu u tretmanu.

STANJE TEHNIKE

[0003] Akutni infarkt miokarda (AMI) je glavni uzrok smrtnosti i morbiditeta širom sveta. Svake godine procenjeno 785.000 osoba (STEMI 500,000) imaće novi AMI samo u Sjedinjenim Državama, i otprilike svakog minuta Amerikanac će podleći jednom AMI (Roger i dr., Circulation, 2012, 125: e2-e220).Svaki šesti muškarac i svaka sedma žena u Evropi umreće od infarkta miokarda (ESC Guidelines for the management of acute MI in patients presenting sa ST-elevation, Eur. Heart J., 2012, 33:2569-2619).

[0004] Trenutno su pravovremena reperfuzija miokarda korišćenjem trombolitičke terapije ili primarne perkutane koronarne intervencije (PPCI) izabrana terapija za pacijente sa akutnim infarktom miokarda sa povišenim ST (STEMI) (Worner i dr., Rev Exp Cardiol., 2013, 66: 5-11). Ove intervencije ograničavaju infarkt miokarda (MI), čuvaju sistoličnu funkciju leve komore, i smanjuju nastanak zatajenja srca.

[0005] Međutim, smrtnost ostaje značajna kod ovih bolesnika, uz smrtnost u bolnici koja se kreće između 6 i 14% (Mandelzweig i dr., Eur. Heart J., 2006, 27: 2285-2293). Pored toga, morbiditet ostaje značajan - MI je vodeći uzrok hroničnog zatajenja srca - sa oko 5 do 6% pacijenata koji su nakon 30 dana imali kardiovaskularni događaj, dok je ponovna hospitalizacija unutar jedne godine oko 2,7%. (Lagerqvist i dr., N. Engl. J. Med., 2014, 371:1111-20).

[0006] Paradoksalno, iako je reperfuzija miokarda ključna za oporavak miokarda, pružanje kiseonika i hranljivih materija ishemijskoj površini ima svoju cenu, jer samo po sebi može da izazove oštećenje miokarda i smrt kardiomiocita - fenomen nazvan „reperfuziono oštećenje miokarda“, čiji nepovratni efekti uključuju mikrovaskularnu opstrukciju i infarkt miokarda (Yellow and Hausenloy, N. Engl. J. Med., 2007, 357: 1121-1135). Procenjuje se da je ishemijsko-reperfuziono oštećenje odgovorno za otprilike 50% krajnje površine infarkta (Yetgin i dr., Neth. Heart J., 2010; 28, 389-392). Prethodni pokušaji prevođenja kardioprotektivnih terapija (tj. antioksidanasa, blokatora kalcijumskih kanala i protiv-upalnih agenasa) za smanjenje reperfuzionog oštećenja do kliničkih terapija nisu bili uspešni (Frohlich i dr., Eur. Heart J., 2013, 34:1714-1724). Trenutno ne postoji odobrena efikasna terapija za sprečavanje oštećenje miokarda k reperfuzionih STEMI pacijenata, što ga čini važnom rezidualnom metom za kardioprotekciju.

[0007] Pionirski rad devedesetih godina prošlog veka je ukazao na tranzicione pore mitohondrijske propusnosti (MPTP) kao kritični posrednik smrtonosne reperfuzionog oštećenja miokarda. Otvaranje MPTP (neselektivni kanal unutrašnje mitohondrijske membrane) u prvih nekoliko minuta reperfuzije dovodi do mitohondrijalnog Ca<2+>preopterećenja, oksidativnog stresa, obnavljanja fiziološkog pH i ATP iscrpljivanja (Heusch i dr, Basic Res Cardiol, 2010, 105: 151-154). Ovi događaji izazivaju smrt kardiomiocita razdvajanjem oksidativne fosforilacije.

[0008] Promene u membranskim proteinima slobodnih radikala su jedan od važnih faktora u evoluciji reperfuzionog oštećenja miokarda. Velike količine reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) dovode do nadimanja ćelijskih endogenih antioksidativnih odbrana. Ovo uzrokuje, između ostalog, peroksidaciju lipidnih membrana i gubitak integriteta membrane što rezultuje nekrozom i smrću ćelije (Zweier i Talukder, Cardiovasc Res, 2006, 70: 181-190). Ponovno unošenje obilnog kiseonika na početku reperfuzije izaziva usporavanje dodatnih toksičnih derivata kiseonika, uključujući superoksidni anjon, hidroksil radikal i peroksinitrit, tokom prvih nekoliko minuta ponovnog puštanja. Štaviše, oksidativni stres takođe smanjuje bioraspoloživost azotnog oksida (vazodilatacionog jedinjenja) pri reperfuziji, i primena NO donora je kardioprotektivna na životinjskim modelima.

[0009] Trenutno postoji potreba za efikasnim tretmanom reperfuzionog oštećenja, posebno oštećenja miokarda.

SUŠTINA PRONALASKA

[0010] Predmetni pronalazak pruža nove kombinacije koje su kardioprotektivne i pogodne za prevenciju i/ili tretman reperfuzionog oštećenja. Kombinacije i drugi aspekti predmetnog pronalaska pružaju tretman koji je efikasniji i omogućava superiorne kliničke rezultate u poređenju sa terapijama koje koriste jedan aktivan farmaceutski agens.

[0011] Prvi aspekt se odnosi na kombinaciju koja sadrži modulator insulina, gde je modulator insulina eksenatid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i antagonist aldosterona, gde je antagonist aldosterona kalijum kanrenoat.

[0012] Drugi aspekt se odnosi na kombinaciju prema prvom aspektu koja sadrži najmanje jedan dalji aktivni farmaceutski sastojak (API) izabran između beta blokatora, inhibitora renin-angiotenzina, statina (inhibitora HMG-CoA reduktaze), inhibitora aktiviranja ili agregacije trombocita, inhibitora fosfodiesteraze-3, senzibilizatora kalcijuma, antioksidansa i protiv-upalnog agensa.

[0013] Treći aspekt se odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži kombinaciju prema bilo kom od prethodnih aspekata i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0014] Četvrti aspekt se odnosi na farmaceutski sastav prema trećem aspektu u obliku pogodnom za parenteralnu primenu, poželjno intravenoznu primenu.

[0015] Peti aspekt se odnosi na farmaceutski proizvod koji sadrži modulator insulina, gde je modulator insulina eksenatid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i antagonist aldosterona, gde je antagonist aldosterona kalijum kanrenoat.

[0016] Šesti aspekt se odnosi na kombinaciju prema aspektu 1 ili 2, ili farmaceutski sastav prema aspektu 3 ili 4, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju jednog ili više od ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja, ishemijskog moždanog udara, zatajenja srca, akutnog infarkta miokarda, neonatalne asfiksije i kardiogenog šoka, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova.

[0017] Sedmi aspekt se odnosi na kombinaciju ili farmaceutski sastav za upotrebu prema aspektu 6, gde ishemija i/ili reperfuziono oštećenje predstavljaju ishemiju i/ili reperfuziono oštećenje mozga, srca, pluća, bubrega, poželjno ishemija miokarda, reperfuzija miokarda ili akutni infarkt miokarda.

[0018] Osmi aspekt se odnosi na kombinaciju ili farmaceutski sastav za upotrebu prema aspektu 6 ili 7, gde su komponente namenjene za intravensku primenu.

[0019] Deveti aspekt se odnosi na kombinaciju ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od aspekata 6 do 8, gde su komponente namenjene za primenu tokom reperfuzije.

[0020] Deseti aspekt odnosi se na kombinaciju ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od aspekata 6 do 8, gde su komponente namenjene za primenu pre reperfuzije.

[0021] Jedanaesti aspekt se odnosi na kombinaciju ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od aspekata 6 do 8, gde su komponente namenjene za primenu nakon reperfuzije.

[0022] Dvanaesti aspekt se odnosi na farmaceutski proizvod prema aspektu 5 za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju jednog ili više od narednog: ishemija i/ili reperfuziono oštećenje, ishemijski moždani udar, zatajenje srca, akutni infarkt miokarda, neonatalna asfiksija i kardiogeni šok, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova, gde su komponente namenjene za primenu istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno.

[0023] Trinaesti aspekt se odnosi na farmaceutski proizvod za upotrebu prema aspektu 12, gde ishemija i/ili reperfuziono oštećenje predstavljaju ishemiju i/ili reperfuziono oštećenje mozga, srca, pluća, bubrega, poželjno ishemija miokarda, reperfuzija miokarda ili akutni infarkt miokarda.

[0024] Četrnaesti aspekt odnosi se na farmaceutski proizvod za upotrebu prema aspektu 12 ili aspektu 13, gde su komponente namenjene za parenteralnu primenu, poželjno za intravensku primenu.

[0025] Petnaesti aspekt odnosi se na farmaceutski proizvod za upotrebu prema bilo kom od aspekata 12 do 14, gde su komponente namenjene za primenu tokom reperfuzije.

[0026] Šesnaesti aspekt odnosi se na farmaceutski proizvod za upotrebu prema bilo kom od aspekata 12 do 14, gde su komponente namenjene za primenu pre reperfuzije.

[0027] Sedamnaesti aspekt odnosi se na farmaceutski proizvod za upotrebu prema bilo kom od aspekata 12 do 14, gde su komponente namenjene za primenu nakon reperfuzije.

[0028] Osamnaesti aspekt odnosi se na farmaceutski proizvod za upotrebu prema bilo kom od aspekata 12 do 17, gde su komponente namenjene za istovremenu primenu.

[0029] Devetnaesti aspekt se odnosi na upotrebu kombinacije koja sadrži modulator insulina, gde je modulator insulina eksenatid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i antagonist aldosterona, gde je antagonist aldosterona kalijum kanrenoat, za tretman i/ili sprečavanje ishemije i/ili reperfuziono oštećenje u ex vivo organu pre transplantacije.

[0030] Dvadeseti aspekt odnosi se na upotrebu u skladu sa aspektom 19, gde ishemija i/ili reperfuziono oštećenje predstavljaju ishemiju miokarda, reperfuziono oštećenje miokarda ili akutni infarkt miokarda.

[0031] Dvadeset i prvi aspekt odnosi se na upotrebu prema aspektu 19 ili aspektu 20, gde su komponente primenjene pre transplantacije.

DETALJAN OPIS

[0032] Poželjna otelotvorenja koja su navedena u daljem tekstu su primenljiva na bilo koji od gore navedenih aspekata predmetnog pronalaska, kako je odgovarajuće.

Modulator insulina

[0033] Kombinacija predmetnog pronalaska sadrži modulator insulina, konkretno eksenatid ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0034] Kako se ovde koristi, izraz „modulator insulina“ odnosi se na agens koji je u stanju direktno ili indirektno da poveća ili smanji aktivnost insulina, što zauzvrat može povećati ili smanjiti fiziološki odgovor posredovan insulinom.

[0035] Kombinacija, sastavi i upotreba sadrže modulator insulina, posebno eksenatid ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kao osnovnu karakteristiku.

[0036] Kao što je ovde obelodanjeno, modulator insulina može biti izabran između GLP-1 agonista, DPP-4 inhibitora, PPAR agonista, insulina i njihovih analoga.

[0037] Primeri GLP-1 agonista uključuju eksenatid, liksisenatid, albiglutid, liraglutid, taspoglutid i dulaglutid (LY2189265) i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0038] Primeri inhibitora DPP-4 uključuju sitagliptin, vildagliptin, saksagliptin, linagliptin, anagliptin, teneligliptin, alogliptin, trelagliptin, gemigliptin, dutogliptin i omarigliptin (MK-3102) i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0039] Primeri PPAR agonista uključuju klofibrate, gemfibrozil, kiprofibrat, bezafibrat, fenofibrat, saroglitazar, aleglitazar, muraglitazar i tesaglitazar, i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0040] Primeri analoga insulina uključuju insulin lispro, insulin aspart, insulin glulisin, insulin detemir, insulin degludek, insulin glargin i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0041] Kao što je ovde obelodanjeno, modulator insulina može biti izabran između eksenatida, liksisenatida, albiglutida, liraglutida, taspoglutida, dulaglutida (LY2189265), sitagliptina, vildagliptina, saksagliptina, linagliptin anagliptina, teneligliptina, alogliptina, trelagliptina, gemigliptina, dutogliptina, omarglitpina (MK-3102), klofibrata, gemfibrozila, kiprofibrata, bezafibrata, fenofibrata, saroglitazara, aleglitazara, muraglitazar tesaglitazara, insulina lispro, insulina aspart, insulina glulisin, insulina detemir, insulina degludek, insulina glargin, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.

[0042] Kao što je ovde obelodanjeno, modulator insulina je GLP-1 agonist izabran između eksenatida, liksisenatida, albiglutida, liraglutida, taspoglutida, dulaglutida (LY2189265) i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. Poželjno, GLP-1 agonist je eksenatid.

Eksenatid

[0043] Modulator insulina je eksenatid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0044] Kako se ovde koristi, izraz „eksenatid“ odnosi se na 39-merni peptid naredne sekvence:

[0045] Eksenatid (sinonim je eksendin 4) prvobitno je izolovan iz pljuvačke Gila monstruma, Heloderma suspectum, od strane Eng 1992. godine. To je insulinski sekretagog sa glukoregulacijskim efektima sličnim ljudskom peptidu glukagonu-sličnom peptidu-1 (GLP-1).

[0046] Eksenatid oponaša ljudski glukagonima-sličan peptid 1 (GLP-1), stomačni hormon incretina koji se oslobađa kao odgovor na unos hranljivih materija (Goke i dr., J. Biol. Chem., 1993, 268: 19650-19655). On poseduje insulinotropna i insulinomimetička svojstva preko GLP-1 receptora. GLP-1 receptor se široko eksprimira u mnogim organima, uključujući srčani i vaskularni endotel (Bullock i dr., Endocrinology, 1996, 137: 2968-2978; Nystrom i dr., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2004, 287: E1209-E1215). Trenutno je eksenatid odobren kao antidijabetički lek za tretman pacijenata sa dijabetes melitus tipom 2. Preporučena doza u ovoj indikaciji je u početku 5 µg (mcg) dva puta dnevno, uz povećavanje na 10 µg dva puta dnevno nakon 1 meseca, na osnovu kliničkog odgovora.

[0047] GLP-1 je neefikasan kao terapeutski agens jer ima veoma kratak polu-život (manje od 2 minuta) zbog brze razgradnje dipeptidil peptidazom-4. Eksenatid je 50% homologan sa GLP-1, ali ima polu-život od 2,4 sata kod ljudi, jer izostaje mesto razdvajanja dipeptidil peprtidaze-4.

[0048] Eksenatid pojačava lučenje insulina zavisnog od glukoze pomoću beta-ćelija pankreasa, suzbija neprimereno povišenu sekreciju glukagona i usporava pražnjenje želuca. Eksenatid je izuzetno moćan, sa minimalnom efikasnom koncentracijom od 50µg/ mL (12pM) kod ljudi. Trenutno tretman eksenatidom uključuje injekcije dva puta dnevno (Byetta®). Takođe, formulacija sa sporim otpuštanjem (Bydureon®) je odobrena za injekciju jednom nedeljno.

[0049] Kako se ovde koristi, funkcionalni analog eksenatida može da se odnosi na jedinjenje koje ima sličnu strukturu, ali se razlikuje od njega u pogledu određenih aspekata (npr. može se razlikovati po jednom ili više atoma, funkcionalnih grupa, aminokiselinskih ostataka ili podstruktura, koje se zamenjuju se drugim). Funkcionalni analozi pokazuju slična farmakološka svojstva i mogu biti strukturno srodni.

[0050] Funkcionalni derivat ili analog eksenatida je oblik eksenatida koji je modifikovan tako da produži polu-život, na primer, konjugatima eksenatida.

[0051] Kao što je ovde obelodanjeno, funkcionalni derivat ili analog eksenatida može biti PEGilirani eksenatid. Na primer, u jednom poželjnom otelotvorenju, funkcionalni derivat ili analog je eksenatid mono-PEGiliran sa 40kDa PEG. PEGilirani eksenatid može se pripremiti postupcima poznatim u struci. Kao primer, PEGilirani oblici eksenatida opisani su u WO 2013/059323 (Prolynx LLC). Eksenatid se takođe može konjugovati sa drugim molekulima, npr. proteinima.

[0052] U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, eksenatid je oblik produženog oslobađanja, na primer, koji se prodaje pod robnom markom Bydureon®. U drugom poželjnom otelotvorenju, eksenatid je u obliku višeslojnih nanočestica za neprekidnu isporuku, na primer, kako je opisano kod Kim JY i dr, Biomaterials, 2013 Nov;34(33):8444-9.

[0053] U narednom naročito poželjnom otelotvorenju, eksenatid je u obliku za injekcije poput onog koji se prodaje pod trgovačkim imenom Byetta®.

Kako se ovde koristi, funkcionalni derivat ili analog eksenatida može se odnositi na agoniste GLP receptora. Pogodni funkcionalni derivati ili analozi eksenatida uključuju liksisenatid, albiglutid, liraglutid, taspoglutid i dulaglutid (LY2189265).

[0054] Funkcionalni analog eksenatida znači eksenatid modifikovan gde je jedan ili više aminokiselinskih ostataka razmenjen za drugi aminokiselinski ostatak, i/ili gde je jedan ili više aminokiselinskih ostataka izbrisan i/ili gde su dodati i/ili umetnuti jedan ili više aminokiselinskih ostataka.

[0055] Funkcionalni analog eksenatida može da sadrži manje od 10 modifikacija aminokiselina (supstitucije, brisanja, dodavanja (uključujući umetanje) i bilo koja njihova kombinacija) u odnosu na eksenatid, alternativno manje od 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ili 2 modifikacije u odnosu na eksenatid.

[0056] Funkcionalni analog eksenatida može da sadrži 10 modifikacija aminokiselina (supstitucije, eksenatida, dodavanja (uključujući umetanje) i bilo koja njihova kombinacija) u odnosu na eksenatid, alternativno 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 modifikaciju u odnosu na eksenatid.

[0057] Kako se ovde koristi, funkcionalni derivati eksenatida uključuju njihove soli, izomer, enantiomere, solvate, polimorfe, prolekove i njihove metabolite.

Imunosupresivni agens

[0058] Ovde obelodanjene kombinacije mogu dalje sadržati imunosupresivni agens.

[0059] Kako se ovde koristi, izraz „imunosupresivni agens“ odnosi se na agens koji može delimično ili u potpunosti da potisne imuni odgovor kod pacijenta.

1

[0060] Imunosupresivni agens može biti izabran između glukokortikoida, citostatičkog agensa, citokina (npr. interferona, interleukina, hemokina), imunosupresivnog antitela, inhibitora kalcineurina i proteina koji vezuje TNF.

[0061] Imunosupresivni agens može biti izabran između antimetabolita, inhibitora kalcineurina i proteina koji vezuje TNF.

Primeri antimetabolita uključuju metotreksat, azatioprin, merkaptopurin i fluorouracil i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0062] Primeri inhibitora kalcineurina uključuju ciklosporin, ciklosporin G, N-Metil-4-izoleucin ciklosporin (takođe poznat kao NIM811), takrolimus i pimekrolimus, i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0063] Primeri proteina koji vezuju TNF uključuju infliksimab, etanercept i adalimumab, i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0064] Imunosupresivni agens može biti izabran između metotreksata, azatioprina, merkaptopurina, fluorouracila, ciklosporina, ciklosporina G, N-Metil-4-izoleucin ciklosporina (takođe poznat kao NIM811), takrolimusa, pimekrolimusa, infliksimaba, etanercepta i adalimumaba, i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0065] Imunosupresivni agens može biti inhibitor kalcineurina. Inhibitor kalcineurina može biti izabran između ciklosporina, ciklosporina G, N-Metil-4-izoleucin ciklosporina (takođe poznat kao NIM811), takrolimusa i pimekrolimusa, i njihove farmaceutski prihvatljive soli. Poželjno, inhibitor kalcineurina je ciklosporin.

[0066] Inhibitor kalcineurina može biti izabran između ciklosporina, ciklosporina G i N-Metil-4-izoleucin ciklosporina (takođe poznat kao NIM811), i njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0067] Inhibitor kalcineurina može biti ciklosporin, ili njegov funkcionalni derivat ili analog, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0068] Predmetno obelodanjenje takođe obuhvata funkcionalne derivate i analoge gore navedenih imunosupresivnih agensa, naročito onih koji su modifikovani tako da produže polu-život agensa, na primer konjugate agensa.

Ciklosporin

[0069] Kako se ovde koristi, izraz „ciklosporin“ (takođe poznat kao ciklosporin A) odnosi se na prirodni Tolypocladium inflatum ciklični ne-ribozomski peptid sa sistematskim (IUPAC) nazivom: (3S,6S,9S,12R,15S,18S,21S,24S,30S,33S)-30-etil-33-[(1R,2R,4E)-1-hidroksi-2-metil-4-heksen-1-il]-6,9,18,24-tetraizobutil-3,21-diizopropil1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonametit-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undekaazaciklotritriakontan-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-undekon.

[0070] Ciklosporin je imunosupresivni agens koje se široko koristi da spreči odbacivanje organa nakon alogenskih transplantacija. Za ovu indikaciju, preporučena IV doza u ovoj indikaciji je u početku 5 do 6 mg/kg/dan. On ostaje važni agens za upravljanje transplantacijom organa uprkos štetnim efektima na bubrežnu strukturu i funkciju. Takođe se pokazalo da je ciklosporin efikasan u tretmanu psorijaze, atopijskog dermatitisa, pioderma gangrenosuma, hronične autoimune urtikarije i reumatoidnog artritisa. U tim indikacijama preporučena početna doza oralno je 2,5 mg/kg/dan, podeljeno u dve primene dnevno.

Međutim, zbog visokog stepena toksičnosti povezane sa lekom, ciklosporin je obično indikovan za teške slučajeve ovih stanja. Za pacijente sa transplantacijom, ciklosporin se generalno primenjuje samo povremeno ili ciklično, uz pažljivo praćenje bubrežne funkcije.

[0071] Ovde prikazane kombinacije mogu dalje sadržati funkcionalni derivat ili analog ciklosporina. Funkcionalni derivat ili analog ciklosporina je oblik ciklosporina koji je modifikovan tako da produži polu-život, na primer, konjugata ciklosporina.

[0072] Kako se ovde koristi, funkcionalni derivati ciklosporina uključuju njihove soli, izomere, enantiomere, solvate, polimorfe, prolekove i njihove metabolite.

[0073] Kako se ovde koristi, funkcionalni analog ciklosporina može se odnositi na jedinjenje koje ima sličnu strukturu, ali se razlikuje od njega u pogledu određenih aspekata (npr. može se razlikovati po jednom ili više atoma, funkcionalnih grupa, aminokiselinskih ostataka ili podstruktura, koje se zamenjuju se drugim). Funkcionalni analozi pokazuju slična farmakološka svojstva i mogu biti strukturno srodni.

[0074] Funkcionalni derivat ili analog ciklosporina može biti izabran između ciklosporina G, N-Metil-4-izoleucin ciklosporina (takođe poznat kao NIM811) takrolimusa i pimekrolimusa, i njihove farmaceutski prihvatljive soli. U drugom otelotvorenju, funkcionalni derivat ili analog ciklosporina je izabran između ciklosporina G i N-Metil-4-izoleucin ciklosporina (takođe poznat kao NIM811) i njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0075] Ciklosporin G se razlikuje od ciklosporina A u položaju aminokiseline 2, gde L-norvalin zamenjuje α-aminobuternu kiselinu. (Pogledati uopšteno, Wenger, R.M.1989, Synthesis ciklosporina and analogues: structural and conformational requirements for immunosuppressive activity. Progress in Allergy, 38: 46-64).

Antagonist aldosterona

[0076] Kombinacija pronalaska sadrži antagonist aldosterona, tačnije kalijum kanrenoat.

[0077] Kombinacija, sastavi i upotrebe predmetnog pronalaska sadrže antagonist aldosterona, tačnije kalijum kanrenoat kao osnovnu karakteristiku.

[0078] Akutni infarkt miokarda i njegove posledične hemodinamičke promene dovode do složene neurohormonalne aktivacije. Renin-angiotenzin-aldosteron put je kamen temeljac takve neurohormonalne aktivacije. Izveštava se da aldosteron, koji je na najvišem nivou nakon akutnog infarkta miokarda, promoviše širok spektar štetnih kardiovaskularnih efekata, uključujući akutnu endotelnu disfunkciju, inhibiciju NO aktivnosti, pojačani endotelni oksidativni stres, povećani vaskularni tonus, inhibiciju obnavljanja tkiva kateholamina, brzu pojavu vaskularnih ćelija glatkog mišića i nekrozu srčanog miocita, taloženje kolagena u krvnim sudovima, hipertrofiju miokarda i fibrozu (Struthers, Am Heart J, 2002, 144: S2-S7; Zannad and Radauceanu, Heart Fail Rev, 2005, 10: 71-78). Dalje, obelodanjeno je da predviđa loše ishode (Beygui i dr, Circulation, 2006, 114: 2604-2610).

[0079] Antagonist aldosterona, ili antimineralokortikoid, je diuretski lek koji antagonizuje

1

dejstvo aldosterona na mineralokortikoidne receptore. Ova grupa lekova se često koristi za tretman hroničnog zatajenja srca. Pripadnici ove klase takođe se koriste u upravljanju hiperaldosteronizmom (uključujući Conn-ov sindrom) i ženskim hirzutizmom (zbog dodatnih antiandrogenih akcija). Većina antimineralokortikoida su steroidni spirolaktoni.

[0080] Antagonizam mineralokortikoidnih receptora inhibira resorpciju natrijuma u sabirnom kanalu nefrona u bubrezima. Ovo ometa razmenu natrijuma i kalijuma, smanjuje izlučivanje kalijuma u urinu, i blago povećava izlučivanje vode (diureza). Kod kongestivnog zatajenja srca, antagonisti aldosterona koriste se pored drugih lekova za aditivno diuretsko dejstvo, što smanjuje edeme i opterećenje srca.

[0081] Postojeće smernice preporučuju upotrebu antagonista mineralokortikoidnih receptora, kod pacijenata sa zatajenjem srca posle infarkta miokarda, na osnovu rezultata EPHESUS ispitivanja.

[0082] Nekoliko ispitivanja na životinjskim modelima akutnog infarkta miokarda, kao i klinička ispitivanja, pokazala su korist blokade aldosterona u prevenciji reperfuzionog oštećenja i poboljšanju rada srca kod pacijenta sa STEMI.

[0083] Primeri antagonista aldosterona uključuju spironolakton (prvi i najčešće korišćeni član ove klase), eplerenon (mnogo selektivniji na cilju od spironolaktona, ali nešto manje moćan i efikasan), kanrenon i kalijum kanrenoat, finorenon (nesteroidni i potentniji i selektivniji od eplerenona ili spironolaktona) i prorenona.

[0084] Neki lekovi takođe imaju antimineralokortikoidne efekte koji su sekundarni u odnosu na njihov glavni mehanizam delovanja. Primeri uključuju progesteron, drospirenon, gestoden i benidipin.

[0085] Predmetno obelodanjenje takođe obuhvata funkcionalne derivate i analoge antagonista aldosterona, posebno one koji su modifikovani tako da produže polu-život agensa, na primer, konjugate antagonista aldosterona.

Kalijum kanrenoat

[0086] Kalijum kanrenoat ili kanrenoat kalijum, takođe poznat kao kalijumova so kanrenoinske kiseline, je antagonist aldosterona iz grupe spirolaktona. Kao i spironolakton, to je prolek, koji se metabolizuje do kanrenona u telu. Kalijum kanrenoat se obično primenjuje intravenski u dozama u rasponu između 200 mg/dan i 600 mg/dan za tretman hiperaldosteronizma ili hipokalijemije.

[0087] Kalijum kanrenoat ima sistematski (IUPAC) naziv kalijum 3-[(8R,9S,10R,13S,14S,17R)-17-hidroksi-10,13-dimetil-3-okso-2,8,9,11,12,14,15,16 oktahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-17-il]propanoat, formula C22H29KO4i narednu hemijsku strukturu:

[0088] Predmetno obelodanjenje takođe obuhvata funkcionalne derivate i analoge kalijum kanrenoata, naročito one koji su modifikovani tako da produže polu-život agensa, na primer, konjugate kalijum kanrenoata.

Kombinacija

[0089] Prvi aspekt se odnosi na kombinaciju koja sadrži modulator insulina, gde je modulator insulina eksenatid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i antagonist aldosterona, gde je antagonist aldosterona kalijum kanrenoat.

[0090] Poželjna otelotvorenja opisana u daljem tekstu se primenjuju mutatis mutandis na druge aspekte predmetnog pronalaska, uključujući upotrebu, proizvode i sastave.

[0091] Ovde su obelodanjene kombinacije koje sadrže najmanje dve od narednih komponenti: (i) najmanje jedan od eksenatida, liksisenatida, albiglutida, liraglutida, taspoglutida i dulaglutida (LY2189265), ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, (ii) najmanje jedan od ciklosporina A, ciklosporina G, N-Metil-4-izoleucin ciklosporina, takrolimusa i pimekrolimusa, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli i (iii) najmanje jedan od kalijum kanrenoata, kanrenona, spironolaktona, eplerenona, finerenona i prorenona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde je to primenljivo (npr. farmaceutski prihvatljive soli kanrenona, spironolaktona, eplerenona, finerenona i prorenona).

1

[0092] Ovde su obelodanjene kombinacije koje sadrže (i) najmanje jedan od eksenatida, liksisenatida, albiglutida, liraglutida, taspoglutida i dulaglutida (LY2189265), ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, i (iii) najmanje jedan od kalijum kanrenoata, kanrenona, spironolaktona, eplerenona, finerenona i prorenona ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, gde je to primenljivo.

[0093] Ovde su obelodanjene kombinacije koje sadrže najmanje dve od narednih komponenti: (i) najmanje jedan od eksenatida, liksisenatida, albiglutida, liraglutida, taspoglutida i dulaglutida (LY2189265), ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, (ii) najmanje jedan od ciklosporina A, ciklosporina G i N-Metil-4-izoleucin ciklosporina, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli i (iii) najmanje jedan od kalijum kanrenoata, kanrenona, spironolaktona, eplerenona, finrerena i prorenona ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, gde je to primenljivo.

[0094] Ovde su obelodanjene kombinacije (i) eksenatida ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i (ii) najmanje jednog od ciklosporina A, ciklosporina G, N-Metil-4-izoleucin ciklosporina, takrolimusa i pimekrolimusa, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0095] Ovde su obelodanjene kombinacije (i) eksenatida ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i (ii) najmanje jednog od ciklosporina A, ciklosporina G, N-Metil-4-izoleucin ciklosporina, takrolimusa i pimekrolimusa, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0096] Ovde su obelodanjene kombinacije (i) najmanje jednog od eksenatida, likisenatida, albiglutida, liraglutida, taspoglutida i dulaglutida (LY2189265), ili njihove farmaceutski prihvatljive soli i (ii) ciklosporina A ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0097] Ovde su obelodanjene kombinacije (i) eksenatida ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, (ii) ciklosporina A ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i (iii) kalijum kanrenoata.

[0098] U jednom aspektu, kombinacije aktivnih agenasa predmetnog pronalaska pružaju pojačan efekat u poređenju sa svakim lekom kada se primenjuje sam.

1

[0099] Dalje, u drugom otelotvorenju, kombinacije aktivnih agenasa predmetnog pronalaska proizvode neočekivane sinergetske efekte, na primer, u tretmanu i/ili sprečavanju reperfuzionog oštećenja, naročito reperfuzionog oštećenja miokarda.

[0100] Kombinacija dva ili više lekova može dovesti do različitih vrsta interakcije lekova. Kaže se da je interakcija lekova aditivna kada je kombinovani efekat dva leka jednak zbiru efekta svakog leka kada se primenjuje sam. Kaže se da je interakcija lekova sinergetska ako kombinovani efekat dva leka prevaziđe efekte svakog leka kada se primenjuje sam (Goodman and Gilmans' „The Pharmacological Basis of Therapeutics“, 12th Edition).

[0101] Kombinovana terapija je važan modalitet tretmana u mnogim postavkama bolesti, uključujući kardiovaskularne bolesti, rak i zarazne bolesti. Nedavni naučni napredak povećao je naše razumevanje patofizioloških procesa koji su u osnovi ovih i drugih složenih bolesti. Ovo povećano razumevanje omogućilo je dalji podsticaj razvoju novih terapijskih pristupa korišćenjem kombinacija lekova usmerenih na više terapijskih ciljeva kako bi se poboljšao odgovor na tretman, minimizovao razvoj rezistencije ili minimizovali neželjeni događaji. U postavkama u kojima kombinovana terapija pruža značajne terapijske prednosti, raste interesovanje za razvoj novih kombinacija dva ili više lekova.

[0102] Povoljno, sinergetska kombinacija može da omogući prisustvo nižih doza svake komponente, čime se smanjuje toksičnost terapije, istovremeno stvarajući i/ili održavajući isti terapeutski efekat ili pojačani terapeutski efekat. Prema tome, u jednom posebno poželjnom otelotvorenju, svaka komponenta je prisutna u sub-terapeutskoj količini.

[0103] Izraz „sub-terapeutska efikasna količina“ označava količinu manju od one koja je obično potrebna za postizanje terapijskog efekta u odnosu na tretman sa svakim agensom.

[0104] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na sinergetsku kombinaciju koja sadrži (i) modulator insulina, konkretno eksenatid ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i (ii) antagonist aldosterona, konkretno kalijum kanrenoat.

[0105] U jednom aspektu, modulator insulina je definisan prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja modulatora insulina.

1

[0106] U jednom otelotvorenju, antagonist aldosterona je definisan prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja antagonista aldosterona.

[0107] Ovde su obelodanjene sinergetske kombinacije (i) najmanje jednog od eksenatida, likisenatida, albiglutida, liraglutida, taspoglutida i dulaglutida (LY2189265), ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, i (iii) najmanje jednog od kalijum kanrenoata, kanrenona, spironolaktona, eplerenona, finerenona i prorenona ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, gde je to primenljivo.

[0108] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na sinergetsku kombinaciju (i) eksenatida ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i (ii) kalijum kanrenoata.

[0109] Ovde su obelodanjene sinergetske kombinacije (i) najmanje jednog eksenatida, liksisenatida, albiglutida, liraglutida, taspoglutida i dulaglutida (LY2189265), ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, i (iii) kalijum kanrenoata.

Dodatni aktivni farmaceutski sastojci

[0110] U jednom primeru, gore opisane kombinacije sadrže najmanje jedan dalji aktivni farmaceutski sastojak (API).

[0111] U jednom aspektu, gore opisane kombinacije mogu dalje sadržati najmanje jedan dalji API odabran od beta blokatora, inhibitora renin-angiotenzina, statina (HMG-CoA inhibitor reduktaze), inhibitora aktiviranja ili agregacije trombocita, inhibitor fosfodiesteraze-3, kalcijumovog senzibilizatora, antioksidansa i protiv-upalnog agensa.

[0112] Primeri beta blokatora uključuju propranolol, metoprolol, bucindolol, karteolol, karvedilol, labetalol, nadolol, okprenolol, penbutolol, pindolol, sotalol i timolol. Inhibitori renin-angiotenzina uključuju inhibitore enzima koji pretvaraju angiotenzin, inhibitore angiotenzin AT1receptora i inhibitore renina.

[0113] Primeri inhibitora enzima koji pretvaraju angiotenzin uključuju kaptopril, zofenopril, enalapril, ramipril, kinapril, perindopril, lizinopril, benazepril, imidapril, trandolapril,

1

cilazapril i fosinopril.

[0114] Primeri antagonista angiotenzin AT1receptora uključuju losartan, irbesartan, olmesartan, kandesartan, valsartan, fimasartan i telmisartan.

Primeri inhibitora renina uključuju remikiren i aliskiren.

[0115] Primeri kalcijumovog senzibilizatora uključuju levosimendan i njihove analoge.

[0116] Primeri statina uključuju atorvastatin, lovastatin, pravastatin, rosuvastatin i simvastatin.

[0117] Primeri inhibitora aktiviranja ili agregacije trombocita uključuju prostaciklin (epoprostenol) i njegove analoge i derivate (npr. Treprostinil, iloprost), nepovratne inhibitore ciklooksigenaze (npr. Aspirin, Trifusal), inhibitore receptora adenozin-difosfata (ADP) (npr. Klopidogrel, Prasugrel, Tikagrelor, Tiklopidin), inhibitore fosfodiesteraze (npr. Cilostazol), antagoniste proteazom-aktiviranog receptora-1 (PAR-1) (npr. Vorapaksar), inhibitore glikoproteina IIB/IIIA (npr. Abciksimab, Eptifibatid, Tirofiban), inhibitore ponovnog uzimanja adenozina (npr. Dipiridamol), i inhibitore tromboksana, uključujući inhibitore tromboksan sintaze i antagoniste receptora tromboksana (npr. Terutroban).

[0118] Primeri inhibitora fosfodiesteraze-3 (PDE-3) uključuju amrinon, milrinon i njihove analoge.

[0119] Primeri antioksidanasa uključuju askorbinsku kiselinu, lipoinsku kiselinu, glutation i melatonin.

[0120] Primeri protiv-upalnih agenasa uključuju COX-2 inhibitore (npr. celekoksib), glukokortikoide (npr. hidrokortizon) i nesteroidne protivupalne lekove (npr. ibuprofen).

[0121] U jednom otelotvorenju, gore navedene kombinacije sadrže najmanje jedan dalji API odabran između propranolola, metoprolola, bucindolola, karteolola, karvedilola, labetalola, nadolola, oksprenolola, penbutolola, pindolola, sotalola, timolola, kaptoprila, zofenoprila, enalaprila, rampirila, kinaprila, perindoprila, lizinoprila, benazeprila, imidaprila, trandolaprila,

1

cilazaprila, fosinoprila, losartana, irbesartana, olmesartana, kandesartana, valsartana, fimasartana, telmisartana, remikirena i aliskirena.

[0122] U drugom otelotvorenju, gore navedene kombinacije sadrže najmanje jedan dalji API odabran između karvedilola, metoprolola, losartana, irbesartana, olmesartana, kandesartana, valsartana, fimasartanaa, telmisartana, kaptoprila, zofenoprila, enalaprila, ramiprila, kinaprila, perindoprila, lizinoprila, benazeprila, imidaprila, trandolaprila, cilazaprila, fosinoprila, remikirena i aliskirena.

[0123] U drugom otelotvorenju, gore navedene kombinacije sadrže najmanje jedan dalji API odabran između karvedilola i metoprolola.

Farmaceutski prihvatljive soli

[0124] Aktivni farmaceutski agensi predmetnog pronalaska mogu biti prisutni kao farmaceutski prihvatljive soli.

[0125] Farmaceutski prihvatljive soli agenasa predmetnog pronalaska uključuju odgovarajuće adicione kiseline ili njihove bazne soli. Pregled pogodnih farmaceutskih soli može se naći kod Berge i dr., J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977). Soli se formiraju, na primer, sa jakim neorganskim kiselinama kao što su mineralne kiseline, npr. sumporna kiselina, fosforna kiselina ili hidrohalične kiseline; sa jakim organskim karboksilnim kiselinama, kao što su alkanekarboksilne kiseline sa 1 do 4 atoma ugljenika, koje su nesupstituisane ili supstituisane (npr. halogenom), kao što je sirćetna kiselina; sa zasićenim ili nezasićenim dikarboksilnim kiselinama, na primer oksalna, malonska, jantarna, maleinska, fumarna, ftalna ili tetraftalna kiselina; sa hidroksikarboksilnim kiselinama, na primer, askorbinska, glikolna, mlečna, jabučna, vinska ili limunska kiselina; sa aminokiselinama, na primer asparaginska ili glutaminska kiselina; sa benzojevom kiselinom; ili sa organskim sulfonskim kiselinama, kao što su (C1-C4)-alkil- ili aril-sulfonske kiseline koje su nesupstituisane ili supstituisane (na primer, halogenom), kao što su metan ili p-toluen sulfonska kiselina.

Enantiomeri/tautomeri

2

[0126] Pronalazak takođe obuhvata, gde je odgovarajuće, sve enantiomere i tautomere aktivnih farmaceutskih agenasa. Stručnjak će prepoznati jedinjenja koja poseduju optička svojstva (jedan ili više hiralnih atoma ugljenika) ili tautomerne karakteristike. Odgovarajući enantiomeri i/ili tautomeri se mogu izolovati/pripremiti postupcima poznatim u struci.

Stereo i geometrijski izomeri

[0127] Neki od aktivnih farmaceutskih agensa predmetnog pronalaska mogu postojati kao stereoizomeri i/ili geometrijski izomeri - npr. mogu da poseduju jedan ili više asimetričnih i/ili geometrijskih centara, i tako mogu postojati u dva ili više stereoizomernih i/ili geometrijskih oblika. Predmetni pronalazak razmatra upotrebu svih pojedinačnih stereoizomera i geometrijskih izomera tih inhibitora i njihovih smeša. Izrazi korišćeni u patentnim zahtevima obuhvataju ove oblike, pod uslovom da navedeni oblici zadržavaju odgovarajuću funkcionalnu aktivnost (mada ne nužno u istom stepenu).

[0128] Predmetni pronalazak takođe uključuje sve pogodne izotopske varijacije aktivnih farmaceutskih agenasa ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. Izotopska varijacija agensa predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutski prihvatljive soli je definisana kao ona u kojoj je najmanje jedan atom zamenjen atomom istog atomskog broja, ali sa atomskom masom različitom od atomske mase koja se obično nalazi u prirodi. Primeri izotopa koji se mogu ugraditi u agens i njegove farmaceutski prihvatljive soli uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, sumpora, fluora i hlora, kao što su 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 170, 180, 31P, 32P, 35S, 18F i 36CI, respektivno. Određene izotopske varijacije agensa i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, na primer, one u koje je ugrađen radioaktivni izotop, poput 3H ili 14C, korisne su u ispitivanjima distribucije lekova i/ili supstrata u tkivu. Tritirani, tj.3H, i ugljenik-14, tj.14C, izotopi su naročito poželjni zbog svoje lakoće pripreme i detektibilnosti. Dalje, supstitucija izotopima kao što je deuterijum, tj.2H, može pružiti određene terapijske prednosti koje rezultuju iz veće metaboličke stabilnosti, na primer, povećanog in vivo polu-života ili smanjene potrebe za doziranjem, i stoga može poželjan u nekim okolnostima. Izotopne varijacije agensa predmetnog pronalaska i njegove farmaceutski prihvatljive soli predmetnog pronalaska mogu se generalno pripremiti konvencionalnim postupcima koristeći odgovarajuće izotopske varijacije pogodnih reagensa.

Solvati

[0129] Predmetni pronalazak takođe obuhvata solvatne oblike aktivnih farmaceutskih agenasa predmetnog pronalaska. Izrazi korišćeni u patentnim zahtevima obuhvataju ove oblike.

Polimorfi

[0130] Pronalazak se dalje odnosi na aktivne farmaceutske agense predmetnog pronalaska u njihovim različitim kristalnim oblicima, polimorfnim oblicima i vodenim oblicima. U farmaceutskoj industriji je dobro utvrđeno da hemijska jedinjenja mogu biti izolovana u bilo kom od takvih oblika, blago varirajući postupak prečišćavanja ili izolaciju od rastvarača koji se koriste u sintetičkoj pripremi ovih jedinjenja.

Farmaceutski sastavi

[0131] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži kombinaciju koja sadrži: (i) modulator insulina, konkretno eksenatid ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, (ii) antagonist aldosterona, tačnije kalijum kanrenoat; i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0132] Iako se jedinjenja prema ovom pronalasku (uključujući njihove farmaceutski prihvatljive soli) mogu primenjivati sama, ona će se generalno primenjivati u mešavini sa farmaceutskim nosačem, ekscipijensom ili razblaživačem, posebno za ljudsku terapiju.

Farmaceutski sastavi mogu biti za upotrebu kod ljudi, ili u veterinarskoj medicini.

[0133] Primeri takvih pogodnih ekscipijenata za različite oblike ovde opisanih farmaceutskih sastava mogu se naći u „Handbook of Pharmaceutical Excipients“, 2nd Edition, (1994), uređen od strane A Wade i PJ Weller.

[0134] Prihvatljivi nosači ili razblaživači za terapijsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj struci, i opisani su, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit.1985).

[0135] Izbor farmaceutskog nosača, ekscipijensa ili razblaživača može biti izveden u skladu sa planiranim načinom primene i standardnom farmaceutskom praksom. Primeri načina primene uključuju parenteralno (npr. intravensko, intramuskularno, intradermalno, intraperitonealno ili potkožno), oralno, inhalaciono, transdermalno (lokalno), intraokularno, iontoforetsko i transmukozalno primenjivanje.

U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav je za parenteralnu primenu (npr., intravenska, intraarterijska, intratekalna, intramuskularna, intradermalna, intraperitonealna ili potkožna). Poželjno je da se sastavi pripremaju od sterilnih ili sterilisanih rastvora.

[0136] U narednom otelotvorenju, farmaceutski sastav je za intravensku, intramuskularnu ili potkožnu primenu.

U još jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav je za intravensku primenu.

[0137] Rastvori ili suspenzija koja se koristi za parenteralnu, intradermalnu ili potkožnu primenu mogu obuhvatati naredne komponente: sterilni razblaživač poput vode za injekcije, fiziološkog rastvora, fiksiranih ulja, polietilen glikola, glicerina, propilen glikola ili drugih sintetičkih rastvarača; antibakterijskih agenasa poput benzil-alkohola ili metil parabena; antioksidansi kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helatnih agenasa kao što su etilendiamin-tetra sirćetna kiselina; pufera poput acetata, citrata ili fosfata i agenasa za prilagođavanje toničnosti, kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može prilagoditi pomoću kiselina ili baza, poput hlorovodonične kiseline ili natrijum hidroksida.

[0138] Farmaceutski sastavi pogodni za upotrebu za injekcije mogu da uključuju sterilne vodene rastvore (kada je rastvorljiv u vodi) ili disperzije i sterilni prašak za trenutnu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Za intravensku primenu, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor soli, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL™ ili fiziološki rastvor puferisan od fosfata (PBS). U svim slučajevima, sastav za parenteralnu primenu mora biti sterilan i treba da bude tečan do te mere da postoji lak prolaz kroz špric. Treba da bude stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja, i da se čuva od kontaminirajućeg delovanja mikroorganizama, poput bakterija i gljivica.

[0139] Sterilni rastvori za injekcije mogu se pripremiti tako da se aktivno jedinjenje u potrebnoj količini ugradi u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom prethodno

2

nabrojanih sastojaka, po potrebi, praćeno filtriranom sterilizacijom. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem aktivnih jedinjenja u sterilni nosač, koji sadrži bazni disperzioni medijum i potrebne ostale gore nabrojane sastojke. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, tipični postupci pripreme uključuju sušenje vakuumom i sušenjem smrzavanjem, što može primeniti prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora. Pronalazak takođe obuhvata lipozomske formulacije i nanočestice koje sadrže aktivne agense. Takve formulacije, zajedno sa postupcima za njihovu pripremu, biće poznate stručnjacima.

Farmaceutski proizvodi

[0140] Ovde je obelodanjen farmaceutski proizvod koji sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona.

[0141] Predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski proizvod koji sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; (iii) kalijum kanrenoat.

[0142] U jednom otelotvorenju, farmaceutski proizvod je komplet delova koji sadrže svu potrebnu opremu (npr. bočice sa lekom, bočice sa razblaživačem, špriceve i igle) za tok tretmana.

[0143] U jednom otelotvorenju, komplet sadrži odvojene kontejnere za svaki aktivan agens. Navedeni kontejneri mogu biti ampule, špricevi za jednokratnu upotrebu ili bočice sa više doza.

[0144] U drugom otelotvorenju, komplet sadrži kontejner koji sadrži kombinovani sastav svakog aktivnog agensa.

[0145] Komplet dalje može da sadrži uputstva za tretman i/ili sprečavanje reperfuzionog oštećenja.

Medicinske upotrebe

[0146] Ovde je obelodanjena kombinacija koja sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju jednog ili više od ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja, ishemijskog moždanog udara, zatajenja srca, akutnog infarkta miokarda, neonatalne asfiksije i kardiogenog šoka, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova.

[0147] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na kombinaciju koja sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; (ii) kalijum kanrenoat, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju jednog ili više od ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja, ishemijskog moždanog udara, zatajenja srca, akutnog infarkta miokarda, neonatalne asfiksije i kardiogenog šoka, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova.

[0148] Ovde je obelodanjen farmaceutski sastav koji sadrži kombinaciju koja sadrži: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju jednog ili više od ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja, ishemijskog moždanog udara, zatajenja srca, akutnog infarkta miokarda, neonatalne asfiksije i kardiogenog šoka, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova.

[0149] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži kombinaciju koja sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i (ii) kalijum kanrenoat, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju jednog ili više od ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja, ishemijskog moždanog udara, zatajenja srca, akutnog infarkta miokarda, neonatalne asfiksije i kardiogenog šoka, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova.

[0150] Ovde je obelodanjen farmaceutski proizvod koji sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju jednog ili više od ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja, ishemijskog moždanog udara, zatajenja srca, akutnog infarkta miokarda, neonatalne asfiksije i kardiogenog šoka, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova.

[0151] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski proizvod koji sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i (ii) kalijum kanrenoat, za

2

upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju jednog ili više od ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja, ishemijskog moždanog udara, zatajenja srca, akutnog infarkta miokarda, neonatalne asfiksije i kardiogenog šoka, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova, gde su komponente namenjene za primenu istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno.

[0152] Ovde je obelodanjeno korišćenje najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina i (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona u proizvodnji leka za tretman i/ili sprečavanje jednog ili više od ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja, ishemijskog moždanog udara, zatajenja srca, akutnog infarkta miokarda, neonatalne asfiksije i kardiogenog šoka, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova.

[0153] Ovde je obelodanjeno korišćenje najmanje dve od narednih komponenti: (i) eksenatida, ili njegovog funkcionalnog derivata ili analoga, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; (ii) ciklosporin, ili njegov funkcionalni derivat ili analog, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i (iii) kalijum kanrenoat, ili njegov funkcionalni derivat ili analog u proizvodnji leka za tretman i/ili sprečavanje jednog ili više od ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja, ishemijskog moždanog udara, zatajenja srca, akutnog infarkta miokarda, neonatalne asfiksije i kardiogenog šoka, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova.

[0154] Ovde je obelodanjena kombinacija koja sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju reperfuzionog oštećenja.

[0155] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na kombinaciju koja sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i (ii) kalijum kanrenoat, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju reperfuzionog oštećenja.

[0156] Ovde je obelodanjen farmaceutski sastav koji sadrži kombinaciju koja sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju reperfuzionog oštećenja.

[0157] U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski sastav koji

2

sadrži kombinaciju koja sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; (ii) kalijum kanrenoat, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju reperfuzionog oštećenja.

[0158] Ovde je obelodanjen farmaceutski proizvod koji sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju reperfuzionog oštećenja, gde su komponente namenjene za primenu istovremeno, uzastopno ili odvojeno.

[0159] U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski proizvod koji sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i (ii) kalijum kanrenoat, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju reperfuzionog oštećenja, gde su komponente namenjene za primenu istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno.

[0160] Ovde je obelodanjena upotreba najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona u proizvodnji leka za tretman i/ili sprečavanje reperfuzionog oštećenja.

[0161] Ovde je obelodanjeno korišćenje najmanje dve od narednih komponenti: (i) eksenatida, ili njegovog funkcionalnog derivata ili analoga, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; (ii) ciklosporin, ili njegov funkcionalni derivat ili analog, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; i (iii) kalijum kanrenoat, ili njegov funkcionalni derivat ili analog u proizvodnji leka za tretman i/ili sprečavanje reperfuzionog oštećenja.

[0162] Ovde je obelodanjena kombinacija koja sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju ishemije.

[0163] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na kombinaciju koja sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i (ii) kalijum kanrenoat, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju ishemije.

[0164] Ovde je obelodanjen farmaceutski sastav koji sadrži kombinaciju koja sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju ishemije.

2

[0165] U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži kombinaciju koja sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i (ii) kalijum kanrenoat, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju ishemije.

[0166] Ovde je obelodanjen farmaceutski proizvod koji sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju ishemije, gde su komponente su za primenu istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno.

[0167] U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski proizvod koji sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i (ii) kalijum kanrenoat, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju ishemije, gde su komponente namenjene za primenu istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno.

[0168] Ovde je obelodanjeno korišćenje najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona u proizvodnji leka za tretman i/ili sprečavanje ishemije.

[0169] Ovde je obelodanjeno korišćenje najmanje dve od narednih komponenti: (i) eksenatida, ili njegovog funkcionalnog derivata ili analoga, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; (ii) ciklosporina, ili njegovog funkcionalnog derivata ili analoga, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (iii) kalijum kanrenoata, ili njegovog funkcionalnog derivata ili analoga, u proizvodnji leka za tretman i/ili sprečavanje ishemije.

[0170] Kako se ovde koristi, izraz „reperfuziono oštećenje“ odnosi se na oštećenje tkiva nastalo kada se dotok krvi vrati u tkivo posle perioda ishemije. Odsustvo kiseonika i hranljivih materija iz krvi stvara stanje u kome obnavljanje cirkulacije rezultuje upalom, mitohondrijskom disfunkcijom i oksidativnim oštećenjima putem indukcije oksidativnog stresa, a ne obnavljanjem normalne funkcije. Reperfuziono oštećenje može nastati nakon spontano nastalog događaja, npr., začepljenja arterija ili planiranog događaja, npr., bilo koje od niza hirurških intervencija. oštećenje miokarda može se javiti, na primer, nakon infarkta miokarda ili kao rezultat transplantacije srca.

2

[0171] U jednom otelotvorenju, ishemija i/ili reperfuziono oštećenje mogu biti ishemija i/ili reperfuziono oštećenje mozga, srca, pluća, bubrega ili drugog organa/tkiva podložnog ishemiji i/ili reperfuzionom oštećenju.

[0172] U jednom otelotvorenju, ishemija i/ili reperfuziono oštećenje su ishemija i/ili reperfuziono oštećenje srca, poželjno ishemija miokarda i/ili reperfuziono oštećenje miokarda. modulator insulina, imunosupresivni agens i antagonist aldosterona mogu se primenjivati istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno (kao deo režima doziranja).

[0173] Eksenatid ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ciklosporin ili njegovi funkcionalni derivati ili analozi ili farmaceutski prihvatljive soli i kalijum kanrenoat, mogu da se pružaju istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno (kao deo režima doziranja).

[0174] Kako se ovde koristi, „istovremeno“ se koristi da znači da se ova dva agensa pružaju istovremeno.

[0175] Kako se ovde koristi, „sekvencijalno“ se koristi da znači da se aktivna agensa ne pružaju istovremeno, već jedan za drugim. Prema tome, primena „sekvencijalno“ može dozvoliti da se jedni agens primenjuje u roku od 5 minuta, 10 minuta ili nekoliko sati posle drugog, pod uslovom da je polu-život cirkulacije prvog primenjenog agensa takav da su istovremeno prisutni u terapeutski efikasnim količinama. Vremensko odlaganje između primene komponenti variraće u zavisnosti od tačne prirode komponenti, njihove interakcije i njihovih polu-života.

[0176] Za razliku od „sekvencijalno", ovde se „odvojeno“ koristi da znači da je razmak između primene jednog agensa i drugog značajan, tj. prvi primenjeni agens više nije prisutan u krvotoku u terapeutski efikasnoj količini kada se primenjuje drugi agens.

[0177] U jednom otelotvorenju, komponente kombinacije su za istovremenu primena.

Postupci tretmana

[0178] Ovde je obelodanjen postupak tretmana i/ili sprečavanja ishemije i/ili reperfuzionog

2

oštećenja, gde navedeni postupak uključuje istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu primenu pacijentu najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona.

[0179] Ovde je obelodanjen postupak tretmana i/ili sprečavanja ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja, gde navedeni postupak uključuje istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu primenu pacijentu, koji ima potrebu za tim, najmanje dve od narednih komponenti: (i) eksenatid, ili njegov funkcionalni derivat ili analog, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; (ii) ciklosporin, ili njegov funkcionalni derivat ili analog, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; i (iii) kalijum kanrenoat, ili njegov funkcionalni derivat ili analog.

[0180] Ovde je obelodanjen postupak tretmana i/ili sprečavanja reperfuzionog oštećenja, gde navedeni postupak uključuje istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu primenu pacijentu, koji ima potrebu za tim, najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona.

[0181] Ovde je obelodanjen postupak tretmana i/ili sprečavanja reperfuzionog oštećenja, gde navedeni postupak uključuje istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu primenu pacijentu, koji ima potrebu za tim, najmanje dve od narednih komponenti: (i) eksenatid, ili njegov funkcionalni derivat ili analog, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; (ii) ciklosporin, ili njegov funkcionalni derivat ili analog, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; i (iii) kalijum kanrenoat, ili njegov funkcionalni derivat ili analog.

[0182] Ovde je obelodanjen postupak tretmana i/ili sprečavanja ishemije, gde navedeni postupak uključuje istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu primenu pacijentu, koji ima potrebu za tim, najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona.

[0183] Ovde je obelodanjen postupak tretmana i/ili sprečavanja ishemije, gde navedeni postupak uključuje istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu primenu pacijentu, koji ima potrebu za tim, najmanje dve od narednih komponenti: (i) eksenatid, ili njegov funkcionalni derivat ili analog, ili njegova farmaceutski njihova prihvatljiva so; (ii) ciklosporin, ili njegov funkcionalni derivat ili analog, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; i (iii) kalijum kanrenoat, ili njegov funkcionalni derivat ili analog.

[0184] Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može da se odnosi na tretman i/ili sprečavanje ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja mozga, srca, pluća, bubrega ili drugog organa/tkiva podložnog ishemiji i/ili reperfuzionom oštećenju.

[0185] Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može da se odnosi na tretman i/ili sprečavanje reperfuzionog oštećenja mozga, srca, pluća, bubrega ili drugog organa/tkiva podložnog reperfuzionom oštećenju.

[0186] Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može da se odnosi na tretman i/ili sprečavanje ishemije mozga, srca, pluća, bubrega ili drugog organa/tkiva podložnog ishemiji.

[0187] Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može da se odnosi na tretman i/ili sprečavanje ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja srca, poželjno ishemije miokarda i/ili reperfuzionog oštećenja miokarda.

[0188] Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može da se odnosi na tretman i/ili sprečavanje reperfuzionog oštećenja srca, poželjno reperfuzionog oštećenja miokarda.

[0189] Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može da se odnosi na tretman i/ili sprečavanje akutnog infarkta miokarda. Akutni infarkt miokarda jedna je od najčešćih kliničkih indikacija reperfuzionog oštećenja.

[0190] Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može da se odnosi na tretman i/ili sprečavanje neonatalne asfiksije.

[0191] Neonatalna asfiksija (ili perinatalna asfiksija) je zdravstveno stanje koje proizilazi iz uskraćivanja kiseonika novorođenčetu i traje dovoljno dugo tokom procesa rođenja da uzrokuje fizičku štetu, obično za mozak. Najčešći uzrok neonatalne asfiksije je pad krvnog pritiska kod majke, ili neko drugo ometanje protoka krvi u mozgu novorođenčeta tokom porođaja, na primer, zbog neadekvatne cirkulacije ili perfuzije, poremećenog respiratornog napora ili neadekvatne ventilacije.

1

[0192] Neonatalna asfiksija može prouzrokovati hipoksično oštećenje većine organa novorođenčeta (srce, pluća, jetra, creva, bubrezi), ali najvažnije je oštećenje mozga, i za njega je najmanje verovatno da će brzo ili potpuno zaceliti. U izraženijim slučajevima novorođenče će preživeti, ali sa oštećenjem mozga koji se manifestuje ili kao mentalno, kao što je zastoj u razvoju ili intelektualni invaliditet, ili fizičko, poput spastičnosti. Novorođenče koje pati od ozbiljne perinatalne asfiksije obično ima lošu boju (cijanoza), perfuziju, responsivnost, mišićni tonus i respiratorne napore. Ekstremni stepeni asfiksije mogu izazvati zatajenje srca i smrt. Neonatalna asfiksija javlja se kod 2 do 10 na 1000 novorođenčadi koji se rode unutar svog termina, dok više slučajeva ima kod onih koji su rođeni prevremeno. SZO procjenjuje da se usled neonatalne asfiksije godišnje dogodi 4 miliona smrti novorođenčadi, što predstavlja 38% smrti dece mlađe od 5 godina.

Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može da se odnosi na tretman i/ili sprečavanje ishemije srca, poželjno ishemije miokarda.

[0193] Kao što je ovde obelodanjeno, pacijent može biti sisar, poželjnije čovek.

[0194] Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može da obuhvati parenteralnu (npr., intravenski, intramuskularno, intradermalno, intraperitonealno ili potkožno) primenu komponenti pacijentu.

[0195] Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može da obuhvati intravensku, intramuskularnu ili potkožnu primena komponenti pacijentu.

Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može da obuhvati intravenozno primena (komponenti pacijentu).

[0196] Svaka komponenta može se primeniti istim ili različitim načinom na druge komponente. Poželjno je da se komponente pružaju istim putem.

[0197] U jednom otelotvorenju, navedene kombinacije su za upotrebu kod pacijenta koji je donor i/ili primaoca pre i/ili posle transplantacije srca. Na primer, u nekim otelotvorenjima kombinacija se može primeniti prvom pacijentu iz koga će biti uklonjen srčani organ radi transplantacije drugom pacijentu. Dodatno ili alternativno, u nekim otelotvorenjima kombinacija se primenjuje izvađenom srčanom organu, pre uvođenja u drugog pacijenta.

2

Dodatno ili alternativno, u nekim otelotvorenjima, kombinovana terapija se primenjuje drugom pacijentu pre transplantacije srca.

[0198] U jednom otelotvorenju, navedene kombinacije su za upotrebu u tretmanu pacijenta sa kardiogenim šokom. Kardiogeni šok je zdravstveno stanje opasno po život koje nastaje kao posledica neadekvatne cirkulacije krvi usled primarne nesposobnosti ventrikula srca da efikasno funkcionišu. Stanje se javlja kod 2-10% pacijenata hospitalizovanih zbog infarkta miokarda, i glavni je uzrok smrti među tim pacijentima (Holmes i dr, 1995, J Am Coll Cardiol, 26: 668-674). Tačnije, kardiogeni šok je rezultat složenog procesa sa neuspehom isporuke kiseonika, generalizovanim nedostatkom ATP-a i disfunkcijom više organa koja je pokrenuta usled zatajenja srčane pumpe (Okuda, 2006, Shock, 25: 557-570). Kako je ovo vrsta cirkulatornog šoka, nema dovoljno perfuzije tkiva koje bi zadovoljile potrebe za kiseonikom i hranljivim materijama. Ovo stanje uključuje sve veću ćelijsku smrt usled nedostatka kiseonikom (hipoksije) i nedostatka hranjivih materija (npr. nizak šećer u krvi). Zbog toga može dovesti do zatajenja srca (ili prekida cirkulacije), što predstavlja naglo zaustavljanje funkcije srčane pumpe (kao i zaustavljeno disanje i gubitak svesti). Kardiogeni šok je definisan održavanjem niskog krvnog pritiska hipoperfuzijom tkiva uprkos adekvatnom pritisku punjenja leve komore. Pokazatelji hipoperfuzije tkiva uključuju nisku proizvodnju urina (<30 mL/sat), hladne ekstremitete i izmenjeni nivo svesti. Nekoliko velikih ispitivanja pokazalo je da je koronarna revaskularizacija najvažnija strategija za poboljšanje preživljavanja pacijenata (Hochman i dr, 1999, N Engl J Med, 341: 625-634). Međutim, pacijenti koji razviju kardiogeni šok uprkos akutnoj revaskularizaciji imaju lošu prognozu, verovatno usled reperfuzionog oštećenja, i smatra se da je to povezano sa rezultujućom veličinom infarkta. Zaista, pokazalo se da hipotermija pruža zaštitu tkiva kod ishemije miokarda, i pretklinička ispitivanja pokazala su korisne rezultate u smanjenju veličine infarkta u eksperimentalno izazvanom infarktu miokarda (Dae i dr, 2002, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 282: H1584-H1591). Prema tome, u modelu svinja blaga terapijska hipotermija smanjuje akutni mortalitet u kardiogenom šoku i poboljšava hemodinamičke parametre (Gotberg i dr, 2010, Resuscitation, 81: 1190-1196).

[0199] U jednom otelotvorenju, navedene kombinacije su za upotrebu u tretmanu pacijenta sa zatajenjem srca. Zatajenje srca je nagli prekid efikasnog protoka krvi usled neuspeha srca da se efikasno kontrakuje. Najčešći uzrok zatajenja srca je bolest koronarnih arterija. Tretman zatajenja srca je trenutna kardiopulmonalna reanimacija (CPR) i, ako je prisutan ritam za šokiranje, defibrilacija. U Sjedinjenim Državama zatajenje srca izvan bolnice se javlja kod oko 13 na 10,000 ljudi godišnje (326.000 slučajeva). U bolnici dolazi do zatajenja srca u dodatnih 209.000 (Kronic i dr, Circulation, 2015, 132: S397-S413). Pored pružanja visokokvalitetne kardiopulmonalne reanimacije, optimizacija upravljanja sindromom nakon zatajenja srca je od presudne važnosti za poboljšanje dugoročnog ishoda za srčane bolesnike. Unutar ovog sindroma („sindrom nakon zatajenja srca“) postoje 3 glavna područja: (1) oštećenje mozga nakon zatajenja srca; (2) disfunkcije miokarda i reperfuziono oštećenje nakon zatajenja srca; i (3) sistemski ishemijsko-reperfuzioni odgovor. Sada je jasno da postreanimaciona nega može uticati na dugoročno preživljavanje i miokardni i neurološki oporavak i funkciju preživelih (Kern, 2015, Circ J, 79: 1156-1163). Inhibicija otvaranja tranzicionih pora mitohondrijske propusnosti (MPTP) tokom ishemije-reperfuzije može poboljšati oštećenja srca i drugih sistemskih organa. Zaista, na životinjskom modelu zatajenja srca, pokazano je da se post-srčana disfunkcija miokarda i preživljavanje mogu poboljšati tretmanom ciklosporinom (Huang i dr, 2011, Resuscitation, 82S: S41-S47).

[0200] U jednom otelotvorenju, navedene kombinacije su za upotrebu u tretmanu pacijenta sa ishemijskim moždanim udarom. Moždani udar je kada loš dotok krvi u mozak rezultuje smrću ćelije. Postoje dve glavne vrste moždanog udara: ishemijski, usled nedostatka protoka krvi, i hemoragijski, usled krvarenja. Rezultat je da deo mozga ne funkcioniše pravilno. Znaci i simptomi moždanog udara mogu uključivati, između ostalog, nemogućnost pomeranja ili osećanja na jednoj strani tela, probleme sa razumevanjem ili govorom, osećaj vrtoglavosti ili gubitak vida na jednoj strani. Ishemijski moždani udar obično je uzrokovan blokadom krvnih sudova. Tretman ishemijskog moždanog udara uključuje operaciju otvaranja (reperfuzije) arterija do mozga kod osoba sa problematičnim sužavanjem. Ishemijski moždani udar, ako se otkrije u roku od tri do četiri i po sata, može se tretirati lekovima koji mogu razgraditi ugrušak. U 2013. godini moždani udar je bio drugi najčešći uzrok smrti nakon koronarne bolesti, čineći 6,4 miliona smrti (12% od ukupnog broja).

[0201] Ishemijski moždani udar i akutni infarkt miokarda zahtevaju hitnu reperfuziju kako bi se poboljšao funkcionalni ishod (Patel i Saver, 2013, Stroke, 44: 94-98). Intravenozni plazminogeni aktivator tkiva dugo je bio jedina reperfuziona terapija sa dokazanom kliničkom koristi kod pacijenata sa akutnim ishemijskim moždanim udarom. Kao što se događa u

4

akutnom infarktu miokarda, endovaskularni postupci obnavljanja reperfuzije kod akutnog ishemijskog moždanog udara mogu izložiti pacijente povećanoj ishemiji/reperfuzionom oštećenju, i na taj način ugroziti korist od rekanalizacije jer promovišu hemoragijsku transformaciju i teški vazogeni edem, koji se smatraju markerima reperfuzionog oštećenja (Bai and Lyden, 2015, Int J Stroke, 10: 143-152). Eksperimentalni dokazi ukazuju da ishemijska reperfuziono oštećenje mozga (kao što se događa kod oštećenja miokarda) može biti ublažena ishemijskim pre i post-kondicioniranjem. Pored toga, eksperimentalni dokazi sugerišu da tranziciona pora mitohondrijske propusnosti (MPTP) igra kritičnu ulogu i kod ishemijske reperfuzionog oštećenja miokarda i mozga (Schinzel i dr, 2005, Proc Natl Acad Sci USA, 102: 12005-12010) i ciklosporin A (inhibitor otvaranja MPTP) može da spreči ishemijsku reperfuziono oštećenje mozga kod životinja (Leger i dr, 2011, Exp Neurol, 230: 58-66; Borlongan i dr, 2005, Life Sci, 76: 1503-1512).

[0202] U jednom otelotvorenju pacijent je pod rizikom od (ili je podložan) začepljenja krvnih sudova ili srčanog ishemijskog-reperfuzionog oštećenja.

[0203] U jednom otelotvorenju, navedene kombinacije su za upotrebu u pružanju kardioprotekcije kod pacijenta protiv kardiotoksičnih efekata lekova (npr. antraciklina). Primeri kardiotoksičnih lekova su opisani kod Bovelli i dr (Annals of Oncology 21 (Supplement 5): v277-v282, 2010).

[0204] Kako se ovde koristi, izraz „kardioprotekcija“ odnosi se na zaštitu srca, na primer, sprečavanjem, smanjenjem ili odlaganjem oštećenja miokarda. Kardiotoksični lekovi uključuju lekove povezane sa zatajenjem srca, lekove povezane sa ishemijom ili tromboembolijom, lekove povezane sa hipertenzijom, lekove povezane sa drugim toksičnim efektima kao što su tamponada i endomiokardna fibroza, hemoragični miokarditis, bradiaritmija, Raynaud-ov fenomen, autonomna neuropatija, produžavanje QT-a ili torsades de pointes ili plućna fibroza. Primeri kardiotoksičnih lekova uključuju antracikline/antrakinonole, ciklofosfamid, Trastuzumab i druge inhibitore tirozin kinaze na bazi monoklonskih antitela, antimetabolite (fluorouracil, kapecitabin), antimikrotubule (paclitaksel, docetaksel), cisplatina, talidomid, bevacizumab, sunitinib, sorafenib, busulfan, paclitaksel, vinblastin, bleomicin, vinkristin, arsenik trioksid, bleomicin, metotreksat.

[0205] U jednom otelotvorenju, komponente za upotrebu se primenjuju istovremeno.

U jednom otelotvorenju, (i) eksenatid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; i (ii) kalijum kanrenoat se primenjuje istovremeno.

[0206] U jednom otelotvorenju, komponente za upotrebu pružaju se sekvencijalno ili odvojeno.

[0207] Za tro-komponentnu kombinaciju za upotrebu, sve tri komponente mogu se primenjivati istovremeno, ili se bilo koje dve komponente mogu primenjivati istovremeno, s tim što se treća komponenta primenjuje odvojeno ili sekvencijalno. Alternativno, sve tri komponente se mogu primeniti u bilo kom redosledu, odvojeno ili sekvencijalno.

[0208] U jednom otelotvorenju, (i) se primenjuje pre sekvencijalne ili odvojene primene (ii).

[0209] U drugom otelotvorenju, (ii) se primenjuje pre sekvencijalne ili odvojene primene (i).

[0210] U jednom otelotvorenju, (i) eksenatid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; (ii) kalijum kanrenoat za upotrebu, primenjuje se sekvencijalno ili odvojeno.

[0211] U jednom otelotvorenju, komponente za upotrebu se pružaju u terapeutski efikasnoj količini u odnosu na pojedinačne komponente.

[0212] U jednom otelotvorenju, (i) eksenatid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; (ii) kalijum kanrenoat za upotrebu, se primenjuju u terapeutski efikasnoj količini u odnosu na pojedinačne komponente.

[0213] Kako se ovde koristi, izraz „terapeutski efikasna količina“ odnosi se na količinu dovoljnu za postizanje željenog terapeutskog i/ili profilaktičkog efekta, npr. Količinu koja rezultuje u sprečavanju ili smanjenju ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja ili jedan ili više simptoma povezanih sa ishemijom i/ili reperfuzionim oštećenjem.

[0214] U kontekstu terapijskih ili profilaktičkih primena, količina sastava koja se primenjuje pacijentu zavisiće od vrste i težine bolesti i od karakteristika pojedinca, kao što su opšte zdravstveno stanje, starost, pol, telo, težina i tolerancija na lekove. Takođe će zavisiti od stepena ozbiljnosti i vrste bolesti. Iskusni stručnjak će moći da odredi odgovarajuće doze u zavisnosti od ovih i drugih faktora. Sastav se takođe može primeniti u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa.

[0215] U jednom otelotvorenju, komponente za upotrebu se pružaju u sub-terapeutski efikasnoj količini u odnosu na pojedinačne komponente.

[0216] U jednom otelotvorenju, (i) eksenatid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; (ii) kalijum kanrenoat za upotrebu, se svaki primenjuje u sub-terapeutski efikasnoj količini u odnosu na pojedinačne komponente.

[0217] U jednom otelotvorenju, komponente za upotrebu su primenjene pre reperfuzije pacijenta.

[0218] U jednom otelotvorenju, (i) eksenatid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; (ii) kalijum kanrenoat za upotrebu, primenjuju se pre reperfuzije pacijenta.

[0219] U jednom aspektu, komponente za upotrebu se primenjuju tokom reperfuzije pacijenta.

[0220] U jednom otelotvorenju, (i) eksenatid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; (ii) kalijum kanrenoat za upotrebu, primenjuju se tokom reperfuzije pacijenta.

[0221] U jednom aspektu, komponente za upotrebu se primenjuju nakon reperfuzije pacijenta.

[0222] U jednom otelotvorenju, (i) eksenatid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; (ii) kalijum kanrenoat za upotrebu, primenjuje se nakon reperfuzije pacijenta.

[0223] U jednom aspektu, komponente za upotrebu primenjuju se pre i/ili tokom i/ili posle reperfuzije pacijenta.

[0224] U jednom otelotvorenju, (i) eksenatid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; (ii) kalijum kanrenoat za upotrebu, primenjuje se pre, tokom i posle reperfuzije pacijenta.

[0225] U nekim otelotvorenjima, pacijent se primenjuje (i) kontinuirano pre, tokom i posle reperfuzije pacijenta, i primenjuje se (ii) kao bolus doza pre reperfuzije.

[0226] U nekim otelotvorenjima, pacijent se primenjuje (ii) kontinuirano pre, tokom i posle reperfuzije pacijenta i primenjuje se (i) kao bolus doza pre reperfuzije.

[0227] U nekim otelotvorenjima, dodatna primena jedne ili više komponenti može se pojaviti posle reperfuzije. Poželjno, ova ponavljana primena se izvodi najmanje dva puta, poželjnije od 2 do 100 puta, ili može biti u obliku kontinuirane infuzije.

[0228] U nekim otelotvorenjima, pacijentu se pružaju komponente kao bolus doza pre reperfuzije.

[0229] U nekim otelotvorenjima, pacijentu se pružaju komponente kao bolus doza tokom reperfuzije.

[0230] U nekim otelotvorenjima, pacijentu se pružaju komponente kao bolus doza nakon reperfuzije.

[0231] Kako se ovde koristi, „reperfuzija“ je obnavljanje protoka krvi u bilo kom organu ili tkivu u kom je protok krvi smanjen ili blokiran. Na primer, protok krvi može se obnoviti u bilo kom organu ili tkivu zahvaćenom ishemijom ili hipoksijom. Obnavljanje protoka krvi (reperfuzija) može se dogoditi bilo kojim postupkom poznatim stručnjacima. Na primer, reperfuzija ishemijskog srčanog tkiva može nastati revaskularizacijom.

[0232] Reperfuzija se može postići postupkom revaskularizacije. Postupak revaskularizacije može biti izabran iz grupe koju čine: perkutana koronarna intervencija; balonska angioplastika; umetanje bajpasnog transplantata; ubacivanje stenta; usmerena koronarna ateroktomija; tretman jednim ili više trombolitičkih agenasa; i uklanjanje začepljenja.

[0233] Jedan ili više trombolitičkih agenasa mogu biti izabrani iz grupe koju čine: tkivni aktivator plazminogen; urokinaza; prourokinaza; streptokinaza; acilovani oblik plazminogena; acilovani oblik plazmina; i acilovana streptokinaza-plazminogen kompleks.

Doziranje

[0234] Stručnjak lako može da odredi odgovarajuću dozu jednog od predmetnih sastava koji će se primenjivati pacijentu bez nepotrebnog eksperimentisanja. Tipično, lekar će odrediti stvarnu dozu koja će biti najprikladnija za pojedinog pacijenta i zavisiće od različitih faktora, uključujući aktivnost određenog jedinjenja koje se koristi, metaboličku stabilnost i dužinu delovanja tog jedinjenja, starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol, ishranu, način i vreme primene, brzinu izlučivanja, kombinaciju lekova, težinu određenog stanja i pojedinca koji je podvrgnut terapiji. Ovde prikazane doze su primeri prosečnog slučaja. Naravno, mogu postojati pojedinačni slučajevi u kojima su odgovarajući viši ili niži rasponi doza, i oni su u okviru predmetnog pronalaska.

[0235] U jednom veoma poželjnom otelotvorenju predmetnog pronalaska, doza modulatora insulina (eksenatida) u kombinaciji je generalno manja od doze koja se obično koristi u monoterapiji u kontekstu trenutno odobrenih terapija, i/ili je niža od opšte doze prijavljene u literaturi o reperfuzionom oštećenju.

[0236] Ako je prisutno, doza imunosupresivnog agensa (npr. ciklosporina) u kombinaciji je generalno manja od doze koja se obično koristi u monoterapiji u kontekstu trenutno odobrenih terapija i/ili je niža od opšte doze prijavljene u literaturi o reperfuzionom oštećenju.

[0237] Kada se koristi u trenutno navedenim kombinacijama, eksenatid se poželjno primenjuje u dozi od oko 0,001 do oko 1,5 µg/kg, poželjnije od oko 0,005 do oko 0,15 µg/kg.

[0238] Kada se koristi u kombinacijama koje se nalaze u predmetnim patentnim zahtevima, kalijum kanrenoat se pogodno primenjuje u dozi od oko 0,03 do oko 10, poželjno od oko 1 do oko 10 mg/kg, poželjnije, od oko 1 do oko 5 mg/kg, čak i više poželjno, od oko 1 do oko 3 mg/kg.

[0239] Ako se koristi, ciklosporin se poželjno primenjuje u dozi od oko 0,001 do oko 10 mg/kg, poželjnije od oko 0,01 do oko 5 mg/k, još poželjnije od oko 0,01 do oko 2,5 mg/kg.

[0240] U jednom veoma poželjnom otelotvorenju, kombinacija je kombinacija sa fiksnom dozom koja sadrži unapred određene doze odgovarajućih sastojaka (npr. oko 0,005 do oko 0,05 µg/kg eksenatida i od oko 1 do oko 3 mg/kg kalijum kanrenoata, poželjnije, oko 0,05 µg/kg eksenatida i 1 mg/kg kalijum kanrenoata).

Ne-terapeutska upotreba

[0241] Ovde je obelodanjena kombinacija koja sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona za tretman i/ili sprečavanje ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja u ex vivo organu pre ili tokom transplantacije.

[0242] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu kombinacije koja sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i (ii) kalijum kanrenoat, za tretman i/ili sprečavanje ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja u ex vivo organu pre transplantacije.

[0243] Ovde je obelodanjena kombinacija koja sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona za tretman i/ili sprečavanje reperfuzionog oštećenja u ex vivo organu pre ili tokom transplantacije.

[0244] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu kombinacije koja sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i (ii) kalijum kanrenoat, za tretman i/ili sprečavanje reperfuzionog oštećenja u ex vivo organu pre ili tokom transplantacije.

[0245] Ovde je obelodanjena kombinacija koja sadrži najmanje dve od narednih komponenti: (i) modulator insulina, (ii) imunosupresivni agens i (iii) antagonist aldosterona za tretman i/ili sprečavanje ishemije u ex vivo organu pre transplantacije.

[0246] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu kombinacije koja sadrži: (i) eksenatid, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i (ii) kalijum kanrenoat, za tretman i/ili sprečavanje ishemije u ex vivo organu pre transplantacije.

[0247] Ex vivo (izvađen iz tela) organ može biti podložan reperfuzionom oštećenju usled nedostatka protoka krvi. Zbog toga se kombinacija predmetnog pronalaska može koristiti za

4

sprečavanje reperfuzionog oštećenja uklonjenog organa. Poželjno, organ je srce, jetra ili bubreg, poželjnije srce.

[0248] U nekim otelotvorenjima, uklonjeni organ je smešten u standardni puferisani rastvor, kakav se obično koristi u struci, koji sadrži kombinaciju predmetnog pronalaska. Na primer, uklonjeno srce može da se stavi u kardioplegični rastvor koji sadrži eksenatid i ciklosporin. Stručnjak može lako da odredi koncentraciju eksenatida, ciklosporina i kalijum kanrenoata korisnih u standardnom puferisanom rastvoru. Takve koncentracije mogu biti, na primer, između oko 0,1 nM do oko 10 µM, poželjno oko 1 nM do oko 10 µM.

PRIMERI

[0249] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan narednim primerima, koje ne trena tumačiti kao ograničavajuće na bilo koji način.

Uporedni primer 1. Efekti kombinovanog tretmana eksenatidom i ciklosporinom u zečjem modelu akutnog oštećenja infarkta miokarda

[0250] Studije sugerišu da tretman eksenatidom može smanjiti/ublažiti oštećenja miokarda kao rezultat ishemijo-reperfuzionog (I/R) oštećenja, što se može klinički desiti nakon akutnog infarkta miokarda (AMI) i/ili perkutane koronarne intervencije/angioplastike (PCI). Eksenatid (0,150 µg/Kg IV bolus), kada se primenjuje pre početka reperfuzije, može imati štetne efekte miokarda. Pored toga, studije sugerišu da tretman ciklosporinom-A (CsA) može smanjiti/ublažiti oštećenje miokarda usled I/R oštećenja, kao što se može klinički desiti nakon AMI i/ili PCI. CsA (2,5 mg/Kg IV bolus), kada se primenjuje pre početka reperfuzije, može imati štetne efekte miokarda. Ova studija je osmišljena za testiranje kombinovanih kardioprotektivnih efekata eksenatida i CsA u okruženju koje oponaša klinički scenario akutnog I/R oštećenja. Studija je sprovedena pod hipotezom da će kombinovani tretman eksenatidom i CsA posle početka ishemije (ali pre reperfuzije) pružiti izraženiji zaštitni efekat miokarda u poređenju sa tretmanom eksenatidom ili ciklosporinom.

[0251] Novozelandski beli zečevi su korišćeni u ovoj studiji. Zečevi su bili mužjaci, stari> 8 nedelja i težine između 2,9 i 3,8 kg. Odobrenja od Etičkih odbora i veterinarskih institucija dobijena su pre nego što je studija započeta. Kontrole okruženja u prostorijama za životinje postavljene su da održavaju temperaturu od 22°do 28°C i relativnu vlažnost vazduha između 30% i 70%. Sobna temperatura i vlaga beležili su se svaki sat i pratili svakodnevno. U prostorijama za životinje bilo je otprilike 10-15 razmena vazduha na sat. Raspored svetla bio je 12 sati svetla, i 12 sati mraka. Obavljena su svakodnevna rutinska opažanja. Zečevima je pružena sertifikovana standardna prehrana, otprilike 180 grama dnevno od dolaska u objekat.

[0252] Eksenatid peptid [Byetta®, 10µg/injektirana doza (40 µl), Eli Lilly Nederland B.V.] i ciklosporin A [CsA, Sandimmun® (50mg/ml) Novartis Pharma A.G., Switzerland] su korišćeni kao test proizvodi, bilo u monoterapiji ili u kombinovanoj terapiji. Dozirni rastvori eksenatida (0,15 µg/kg u standardnim fiziološkim rastvoru) i/ili CsA (2,5 mg/kg u standardnim fiziološkim rastvoru) pripremljeni su neposredno pre primene zečevima. Kao kontrola korišćen je standardni fiziološki rastvor (0,9% NaCl).

[0253] Test/kontrolni proizvodi primenjivani su intravenski, pod opštom anestezijom, kako bi se oponašao očekivani put primene u kliničkom okruženju akutnog infarkta miokarda, i primarne perkutane koronarne intervencije. Intravenski bolusi su primenjeni preko periferne vene (zečja aurikularna vena).

[0254] Studija je pratila unapred određeni placebo i lažno kontrolisani dizajn. Ukratko, 80 zdravih, aklimatizovanih mužjaka zečeva nasumično je dodeljeno jednom od tri kraka ispitivanja. Krak A (n = 4, LAŽNI) uključuje lažno operisane vremenske kontrole tretirane normalnim fiziološkim rastvorom (NS; IV); Krak B (n = 18, KONTROLA/PLACEBO) uključuje I/R životinje koje su tretirane normalnim fiziološkim rastvorom (NS; IV); Krak C (n = 18, EKSENATID, 0,15 µg/Kg) uključuje I/R životinje koje su tretirane eksenatidom; Krak D (n = 18, CIKLOSPORIN, 2,5 mg/kg, IV) uključuje I/R životinje koje su tretirane sa CsA; Krak E (n = 22, EKSENATID CIKLOSPORIN, IV) uključuje I/R životinje koje su tretirane eksenatidom i CsA.

[0255] U I/R grupama (kraci B, C, D i E), zečevi su podvrgnuti 40 minuta regionalnoj ishemiji srca (koronarna začepljenje), nakon čega je usledila 120 minuta (2 sata) reperfuzija. U svim slučajevima, tretmani (intravenska bolus primena NS ili eksenatida, CsA ili eksenatida plus CsA) su izvedeni 30 minuta nakon početka ishemije (10 minuta pre početka reperfuzije). U svim slučajevima, kardiovaskularna funkcija je praćena i pre i tokom ishemije, kao i tokom 120 minuta (2 sata) posle reperfuzije. Eksperimenti su završeni 2 sata posle reperfuzije (kraj studije); nepovratno oštećenje miokarda (veličina infarkta pomoću histomorfometrije) procenjeno je u ovoj vremenskoj tački, i bila je primarna krajnja tačka studije. Dizajn studije sažet je u Tabeli 1.

Tabela 1. Protokol eksperimenta

[0256] Anestezija/hirurška priprema. Opšta anestezija je indukovana intramuskularno (IM) sa smešom ketamina (∼35-50 mg/kg) i ksilazina (∼5-10 mg/kg). Kako bi sačuvala autonomna funkcija i održala anestezija tokom eksperimentalnog postupka, životinje su primale dodatnu anesteziju prema potrebi (∼10-15 mg ketamina/30 minuta ili ∼15-20 mg/kg natrijumpentobarbitala). Venski kateter je postavljen u perifernu venu (npr. ušnu ušnu venu) za primenu dodatnih anestetika i standardnih fizioloških rastvora/proizvoda za testiranje. Dejstvo anestezije ocenjuje se (i) potpunim ukidanjem životinjskog refleksa rožnjače, (ii) potpunim ukidanjem životinjskog respiratornog centra i potpunom mehaničkom ventilacijom bez

4

ikakvog otpora vazduhu izazvanog spontanim disanjem životinje i (iii) stabilnošću hemodinamičkih parametara. Trahealna cev je stavljena putem traheotomije (ventralni srednji rez) i korišćena je za mehaničku ventilaciju pluća sa 95% O2/5% CO2smešom pomoću volumenski cikličnog ventilatora za životinje (∼40 udisaja/minut sa plimskom zapreminom od ∼12,5 ml/Kg) kako bi se održale PaCO2vrednosti u fiziološkom rasponu. Tokom eksperimentalne procedure kontinuirano su praćeni elektrokardiogram, arterijski pritisak, srčani puls i kapnogram. Sonda za merenje temperature je ubačena u rektum i telesna temperatura je održavana pomoću jastuka za grejanje. Konačno, arterijski kateter je postavljen u perifernu arteriju (npr. uvo) za uzorkovanje krvi.

[0257] Posle toga, životinje su smeštene u levo-bočni ležeći položaj i grudi su hirurški otvorene levom torakotomijom. Grudi su otvorene kroz levi četvrti interkostalni prostor. Srce koje je kucalo bilo je izloženo, i perikard je zasečen. Pod atrijalnim dodatkom, prva velika anterolateralna grana cirkularne arterije i po potrebi, u zavisnosti od koronarne anatomije svake životinje, sama cirkularna arterija, zaokružena je 3-0 svilenim šavom. Začepljenje koronarnih arterija u ovom regionu obično rezultuje ishemijom velike površine anterolateralnog i apikalnog zida ventrikula. Krajevi šava provučeni su kroz mali komad polietilenske cevi, formirajući zamku. Ishemija je izazvana povlačenjem niti kroz cev koja je uz malu stezaljku čvrsto postavljena uz koronarni zid arterija. Ishemija je rezultovala porastom ST na elektrokardiogramu i promenom boje (tj. cijanotike) miokarda. Nakon 30 minuta ishemije, životinje kojima su primenjivani IV bolusi bilo nosača (standardni fiziološki rastvor) ili eksenatida ili CsA ili kombinacija eksenatida i CsA; ishemija je nastavljena dodatnih 10 minuta (tj.40 minuta ukupno vremena ishemije) nakon tretmana. Na kraju perioda ishemije, koronarne zamke su oslobođene, i prethodni ishemijski miokard je reperfuziran u trajanju do 2 sata. Treba napomenuti da su kod lažno operisanih životinja zamke u krvnim sudovima manipulisane u vreme početka ishemijsko-reperfuzione zaštite, ali nisu bile ni zategnute ni olabavljene.

[0258] Hemodinamičke promenljive i rektalna temperatura praćene su i evidentirane u 6 unapred određenih vremenskih tačaka: posle anestezija (početna vrednost), neposredno pre početka ishemije (pre začepljenja), 30 minuta (primena nosača/test proizvoda) ishemije, kao i na 30, 60 i 120 minuta nakon reperfuzije. Pored toga, kako bi se odredio/kvantifikovao stepen nepovratnog oštećenja miokarda (tj. infarkta) koje je posledica I/R oštećenja sa i bez eksenatida ili CsA ili njihove kombinacije, procenjeno je površina infarkta.

[0259] Uzorci krvi. Sakupljeni su venski (<3 mL) uzorci cele krvi za procenu oštećenja miokarda pomoću srčanih biomarker analiza u dve vremenske tačke prikupljanja podataka: osnovna vrednost i 120 minuta nakon reperfuzije. Izmeren je srčani troponin-I (cTnl), kao najvredniji i najpouzdaniji klinički korišćeni biomarker. cTnl je određen pomoću biohemijskog analizatora (Triage® Cardiac Panel, Alere San Diego, Inc. CA, USA).

[0260] Histopatologija/Histomorfometrija. Po završetku protokola procenjeno je nepovratno oštećenje miokarda (tj. infarkt) koja je posledica I/R oštećenja. Ukratko, nakon završetka reperfuzije, srca su izvađena, postavljena na aparat i perfuzirana sa standardnim fiziološkim rastvorom u trajanju od 2 minuta za uklanjanje krvi. Potom je koronarna ligatura ponovo natopljena na istom mestu i 5 ml zelenog fluorescentnog polimernog mikrosfernog rastvora (8 mg/ml; prečnik 3-8 µm; Fluoro-Max™, Thermo Scientific, CA, USA) je infuzirano za odvajanje normalno perfuzirane površine (bez ishemijske površine) i za označavanje površine pod rizikomom od miokarda (AAR, ishemijska površina) tokom ishemije. Srca su držana na -20°C tokom 24 sata i secirana su vertikalno duž svoje dugačke ose (od vrha do baze) na komade debljine 3 mm. Nakon toga, komadi su inkubirani tokom 20 minuta u 2% trifeniltetrazolijum-hrolidu (TTC, Sigma, St. Louis, MO, USA) na 37°C i fiksirani u 10% nepuferisanom rastvoru formalina.

[0261] Nakon fiksiranja, ukupna površina leve komore (LV), površina pod rizikom (AAR) i površina infarkta (IF) su ocrtani/mereni digitalno. Sa talasnom dužinom od 366 nm UV svetla, na svakom slajdu su razdvojeni ishemijska površina (AAR) od infarktirane zone (IF) i nema ishemijske površine. Sve površine su označene na acetatnoj ploči. Oznake su naknadno uvezene u program analize slike (Image J; National Institutes of Health), i kompjuterski podržana planometrija je izvršena za određivanje ukupne površine leve komore (LV), površine pod rizikomom (AAR) i infarkt (IF). Za svaki slajd, AAR je izražen kao procenat LV površine (AAR/LV), i IF je izražen kao procenat AAR (IF/AAR). U svim je slučajevima kvantitativna histomorfometrija izvršena od strane osoblja koje je bilo slepo za raspored tretmana/dizajn studije.

[0262] Analiza podataka/statistika. Dobijeni podaci iz gore navedenog postupka eksperimenta su tabelirani i izračunati pomoću Excel programa. Statistička analiza izvedena je sa SPSS

4

verzijom 21.0 (SPSS Inc., IL, USA). Vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost±standardna greška (SEM). Statističko poređenje numeričkih promenljivih između tri grupe analizirano je korišćenjem modela jednosmerne analize varijance (ANOVA) sa Bonferroni korekcionom analizom. Izračunata P-vrednost manja od 0,05 smatrala se statistički značajnom.

Opservacije životinja/rezultati.

[0263] Hemodinamičke promenljive, srednji arterijski pritisci i brzina otkucaja srca su prikazani u Tabeli 2. Bazne vrednosti su bile slične u svim grupama. Kao što obično vidimo u našem zečjem modelu, arterijski pritisci se smanjuju nakon operacije i začepljenja, i najznačajnije na kraju reperfuzije. U ovoj promenljivih pritiska nije bilo značajnih razlika među grupama. Sve grupe su tokom vremena sledile sličan obrazac.

Tabela 2: Hemodinamički parametri

4

[0264] LV veličina i AAR veličina bili su uporedivi kod svih tretiranih životinja, što ukazuje da se početni deo leve komore i ishemijska površina ne razlikuju značajno između grupa. Iako je primena eksenatida ili CsA rezultovala smanjenjem veličine infarkta u poređenju sq kontrolom, primena kombinacije eksenatida i CsA rezultovala je superiornim smanjenjem veličine infarkta. Slično tome, dok su eksenatid ili CsA smanjili cTnl oslobađanje za 48%, odnosno 36%, kombinovana terapija eksenatida i ciklosporina smanjila je cTnl oslobađanje za 61% (62,6±10,7, P<0,001).

[0265] Tabela 3 prikazuje podatke koji pokazuju nivo srčanog troponina I, odnose površine pod rizikom sa levom komorom, površine infarkta sa levom komorom i površine infarkta sa površinom pod rizikom, za svaku grupu koja se koristi u ovom ispitivanju.

[0266] Ovi rezultati pokazuju da je u standardizovanom zečjem modelu akutne miokardijalne ishemije i reperfuzionog oštećenja kombinovana terapija eksenatida i CsA primenjena kao IV bolus (0,15 µg/Kg i 2,5 mg/Kg, respektivno) 10 minuta pre započinjanja reperfuzije mogla da proizvede veće smanjenje veličine infarkta miokarda u poređenju sa grupama za monoterapiju

4

sa eksenatidom ili CsA. Shodno tome, ovi rezultati pokazuju po prvi put da je u terapiji reperfuzionog oštećenja miokarda kombinovana primena ciklosporina i eksenatida korisnija i povoljnija, i omogućava superiorne kliničke ishode u odnosu na terapije sa samim ciklosporinom ili eksenatidom. Kao takvi, kombinovani eksenatid i CsA su izuzetno korisni u postupcima za sprečavanje i tretman ishemijsko-reperfuzionog oštećenja kod sisara.

Uporedni primer 2. Dozno-zavisni efekti kombinovanog tretmana eksenatidom i ciklosporinom u pacovskom modelu akutnog oštećenja infarkta miokarda

[0267] Ova studija je osmišljena da ispita kardioprotektivne efekte eksenatida, CsA i njihovih kombinacija u različitim dozama i na modelu reperfuzionog oštećenja miokarda kod pacova. Studija je sprovedena pod hipotezom da će kombinovana terapija eksenatidom i CsA, nakon početka ishemije i pre reperfuzije, takođe rezultovati povećanim smanjenjem veličine infarkta u dodatnom životinjskom modelu.

[0268] U ovom ispitivanju korišćeni su Wistar pacovi. Pacovi su bili mužjaci, težine između 266 i 370 g. Odobrenja od Etičkih odbora i veterinarskih institucija dobijena su pre nego što je studija započeta. Životinje su smeštene u individualno ventiliranim kavezima koristeći HEPA filtrirani vazduh, koji je u skladu sa preporukama o veličini u najnovijem Guide for the Care and Use of Laboratory Animals DHEW (NIH) Direktivi 2010/63/EU o zaštiti životinja koje se koriste u naučne svrhe. Kontrola okruženja u prostorijama za životinje postavljene su da održavaju temperaturu od 22°do 28°C i relativnu vlažnost vazduha između 30% i 70%.

Materijal za otpad koji se nalazi ispod kaveza menjao se najmanje tri puta nedeljno. U prostorijama za životinje bilo je otprilike 10-15 razmena vazduha na sat. Raspored svetla bio je 12 sati svetla, i 12 sati mraka. Obavljena su svakodnevna rutinska opažanja. Životinje su kondicionirane u svojim objektima najmanje 3 dana pre testiranja. Na raspolaganju su bili standardna laboratorijska hrana za pacove i filtrirana voda iz česme, ad libitum.

[0269] Eksenatid (Byetta®, Eli Lilly Nederland B.V.) i CsA (Sandimmun®, Novartis Pharma A.G., Switzerland) koriste se kao test proizvodi, bilo u monoterapiji ili u kombinovanoj terapiji. Dozirni rastvori eksenatida i/ili CsA su pripremljeni neposredno pre primene pacovima. Kao kontrola korišćen je standardni fiziološki rastvor (0,9% NaCl).

[0270] Studija je pratila unapred određeni placebo kontrolirani dizajn. Ukratko, 130 zdravih,

4

aklimatizovanih mužjaka pacova nasumično je dodeljeno jednom od deset istraživačkih krakova. Sve životinje podvrgnute su 30 minuta regionalne ishemije srca (koronarno začepljenje), nakon čega je usledilo 120 minuta (2 sata) reperfuzija. U svim slučajevima, tretmani (intravenska bolus primena NS ili eksenatida ili CsA ili njihovih kombinacija) su izvedeni 20 minuta nakon početka ishemije (10 minuta pre početka reperfuzije). U svim slučajevima, kardiovaskularna funkcija je praćena i pre i tokom ishemije, kao i tokom 120 minuta (2 sata) posle reperfuzije. Eksperimenti su završeni 2 sata posle reperfuzije (kraj studije); nepovratno oštećenje miokarda (veličina infarkta pomoću histomorfometrije) u ovoj vremenskoj tački je procenjeno i bila je primarna krajnja tačka studije. Dizajn studije sažet je u Tabeli 4.

Tabela 4. Protokol eksperimenta

4

[0271] Anestezija/hirurška priprema. Mužjaci Wistar pacova anestezirani su intraperitonealnom (IP) injekcijom pentobarbitala (Euthazol, Produlab Pharma b.v., Raamsdonksveer, The Netherlands; bolus doza od 60 mg/kg praćena sa 15-20 mg/kg po potrebi tokom eksperimenta). Pacovi su bili izmereni, i površina stomaka i grudi im je obrijana. Održavanje telesne temperature potpomognuto je upotrebom jastuka za grejanje sa konstantnom temperaturom. Traheja je intubirana plastičnom kanilom spojenom na respirator za glodare. Životinje su ventilirane sobnim vazduhom (6,2ml/kg, 70±5 udaha/minuta). Krvni pritisak, površinski EKG i telesna temperatura jezgra praćeni su tokom eksperimenata kako bi se osigurala stabilnost sastava. Desna karotidna arterija je kanilirana za merenje krvnog pritiska, i desna jugularna vena je kanilirana za primenu test proizvoda. Torakotomija je urađena u petom interkostalnom prostoru i srce je izloženo.5-0 prolenski šav postavljen je oko leve silazne koronarne arterije. Koronarna arterija je zatim začepljena u trajanju od 30 minuta postavljanjem ligature kroz mali komad plastične cevi i čvrstim povlačenjem zamke na mesto pomoću hemostata. Nakon 30 minuta koronarnog začepljenja, reperfuzija je pokrenuta otpuštanjem zamke i nastavljena je tokom 120 minuta.

[0272] Hemodinamičke promenljive su praćene i zabeležene u 6 unapred određenih vremenskih tačaka: posle anestezije (početna linija), neposredno pre početka ishemije (pre začepljenja), 20 minuta (primena članaka/test članaka) ishemije, kao i na 30, 60 i 120 minuta posle reperfuzije. Pored toga, u cilju određivanja/kvantifikacije stepena nepovratnog oštećenja miokarda (tj. infarkta) koje je posledica I/R oštećenja sa i bez tretmana eksenatidom ili CsA ili eksenatidom i Csa, procenjeni su srčani biomarkeri, kao i površina infarkta.

[0273] Histopatologija/histomorfometrija. Na kraju perioda od 120 minuta reperfuzije, srce je izvađeno i određena je veličina infarkta. Ukratko, leva prednja silazna koronarna arterija je ponovo začepljena i srce je perfuzirano sa 4 ml 0,3% (w/v) Evans-plave boje (Sigma-Aldrich) sa konstantnim 100cmH2O pritiskom u aortu kako bi se odredila površina pod rizikom.

Područje neishemijskog perfuznog tkiva obojena je u plavo, dok je zona rizika ostala neobojena. Obojena srca su brzo zamrznuta (-20°C tokom najmanje 2 sata), isečena na komade debljine 2 mm i svaki komad je inkubirana na 37°C u 1,5 ml 1% (w/v) TTC (Merck Biosciences) rastvorenog u 50mM fosfatnog pufera (pH 7,4) tokom 10 minuta. Zatim su komadi preneseni u 10% rastvor formalina u trajanju od 5 minuta.

[0274] Nakon fiksiranja, ukupna površina leve komore (LV), površina pod rizikom (AAR) i površina infarkta (IF) su ocrtani/mereni digitalno. Komadi su stavljeni između staklenih ploča, i digitalne fotografije napravljene su sa obe strane komada srca. Različito obojene oblasti slika kvantifikovane su digitalnom planimetrijom (Infarctsize™ 2.5, Pharmahungary, Szeged, Hungary). Evaluacija svih slika je izvršena na slep način od strane iskusne osobe tokom čitave studije. Za svaki slajd, AAR je izražen kao procenat LV površine (AAR/LV), a IF je izražen kao procenat AAR (IF/AAR).

[0275] Analiza podataka/statistika. Dobijeni podaci iz postupka eksperimenta izloženog iznad su tabelirani i izračunati pomoću Excel programa. Statistička analiza izvedena je sa SPSS verzijom 21.0 (SPSS Inc., IL, USA). Vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost±standardna greška (SEM). Razlike među sredstvima merenja krajnjih tačaka (tj. veličina infarkta, AAR) analizirane su korišćenjem jednosmernog ANOVA, praćenog sa Tukey post hoc testom kako bi se napravile poređenja svake grupe sa kontrolom, kada je to potrebno. Razlike među sredstvima kontinuiranih promenljivih (tj. hemodinamički podaci) analizirane su ponovljenim merama dvosmernoim ANOVA praćenim sa Tukey post hoc testom. Izračunata P-vrednost manja od 0,05 smatrala se statistički značajnom.

1

Opservacije životinja/rezultati.

[0276] Hemodinamičke promenljive, srednji arterijski pritisci i brzina otkucaja srca su prikazani u Tabeli 5. Bazne vrednosti su bile slične u svim grupama. Kao što tipično vidimo u našem pacovskom modelu, arterijski pritisci se smanjuju nakon operacije i začepljenja, i najznačajnije na kraju reperfuzije. U ovoj promenljivoj pritiska nije bilo značajnih razlika među grupama. Sve grupe su tokom vremena sledile sličan obrazac.

Tabela 5: Hemodinamički parametri

2

[0277] LV veličina i AAR veličina bili su uporedivi kod svih tretiranih životinja, što ukazuje da se početna površina leve komore i ishemija nisu značajno razlikovala između grupa.

Primena eksenatida ili CsA pokazala je efekat zavistan od doze. Konkretno, tretman životinja sa nižim dozama eksenatida i CsA rezultovao je značajnim smanjenjem veličine infarkta u odnosu na kontrolu, dok veće doze nisu imale efekte. Zanimljivo je da je primena kombinacije niskih doza eksenatida i CsA rezultovala superiornim smanjenjem veličine infarkta. Dok je eksenatid u dozi od 0,03 µg/Kg smanjio površinu infarkta za 27% (45,9±1,4; P <0,05) i CsA za 0,5 mg/kg za 26,6% (46,2±3,7; P <0,05), kombinovana terapija eksenatida i CsA smanjili su površinu infarkta za 39,1% (38,3±2,7; P <0,05), u poređenju sa kontrolom (62,9±3,7).

[0278] Tabela 6 prikazuje podatke koji pokazuju odnose površine pod rizikom i leve komore i površine infarkta i površine pod rizikom za svaku grupu ispitivanja.

[0279] Ovi rezultati pokazuju da je u dodatnom standardizovanom modelu akutne ishemije i reperfuzionog oštećenja miokarda, kombinovana terapija eksenatida i CsA takođe mogla da proizvede veće smanjenje veličine infarkta miokarda u poređenju sa monoterapijama eksenatida ili CsA. Međutim, u ovom pacovskom modelu kardioprotektivni efekat je bio

4

očigledan u nižim dozama u poređenju sa zečjim modelom iz Uporednog primera 1, što ukazuje da različite vrste mogu različito reagovati na eksenatid ili CsA ili na njihovu kombinaciju. Činjenica da je trajanje ishemije bilo duže u zečjem modelu takođe može biti odgovorno za razliku u efektima kod dve vrste. Ipak, ovi rezultati opet pokazuju da je u terapiji reperfuzionog oštećenja miokarda kombinovana primena CsA i eksenatida korisnija i povoljnija i omogućava superiorni klinički ishod u odnosu na terapije sa samim ciklosporinom ili eksenatidom. Kao takvi, kombinovani eksenatid i CsA su izuzetno korisni u postupcima za sprečavanje i tretman ishemijsko-reperfuzionog oštećenja kod sisara.

Primer 3. Efekti kombinovanog tretmana eksenatidom i kalijumom kanrenoatom u zečjem modelu akutnog oštećenja infarkta miokarda

[0280] Ispitivanja sugerišu da tretman kalijum kanrenoatom može da smanji/ublaži oštećenje miokarda koja je posledica I/R oštećenja kao što se može klinički desiti nakon AMI i/ili PCI. Ova studija je osmišljena za testiranje kombinovanih kardioprotektivnih efekata eksenatida i kalijum kanrenoata u okruženju koje oponaša klinički scenario akutnog I/R oštećenja.

Ispitivanje je sprovedeno pod hipotezom da će kombinovani tretman eksenatidom i kalijum kanrenoatom nakon početka ishemije (ali pre reperfuzije) pružiti izraženiji zaštitni efekat za miokard u poređenju sa tretmanom samim eksenatidom ili kalijum kanrenoatom.

[0281] Novozelandski beli zečevi su korišćeni u ovoj studiji. Zečevi su bili mužjaci, stari> 8 nedelja i težine između 2,6 i 3,8 kg. Sve životinje su tretirane u skladu sa Direktivom 2010/63/UE od European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes, i u skladu sa Guide for the Care and Use of Laboratory Animals objavljenim od strane US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revidirano 1985). Odobrenja od Etičkih odbora i veterinarskih institucija dobijena su pre nego što je studija započeta. Kontrola okruženja u prostorijama za životinje postavljene su da održavaju temperaturu od 22°do 28°C i relativnu vlažnost vazduha između 30% i 70%. Sobna temperatura i vlaga beležili su se svaki sat i pratili svakodnevno. U prostorijama za životinje bilo je otprilike 10-15 razmena vazduha na sat. Raspored svetla bio je 12 sati svetla, i 12 sati mraka. Obavljena su svakodnevna rutinska opažanja. Zečevima je pružena sertifikovana standardna prehrana, otprilike 180 grama dnevno od dolaska u objekat.

[0282] Eksenatid (Byetta®; Eli Lilly Nederland BV) i kalijum kanrenoat (Sigma-Aldrich, Germany) koriste se kao test proizvodi bilo u monoterapiji ili u kombinovanoj terapiji.

Doziranje rastvora eksenatida (0,15 µg/kg u standardnim fiziološkim rastvoru) i/ili kalijum kanrenoata (1 mg/kg u standardnim fiziološkim rastvoru) je pripremljeno neposredno pre primene zečevima. Kao kontrola korišćen je standardni fiziološki rastvor (0,9% NaCl).

[0283] Test/kontrolni proizvodi primenjivani su intravenski, pod opštom anestezijom, kako bi se oponašao očekivani put primene u kliničkom okruženju akutnog infarkta miokarda i primarne perkutane koronarne intervencije. Intravenski bolusi su primenjeni preko periferne vene (zečja aurikularna vena).

[0284] Studija je pratila unapred određeni placebom kontrolisani dizajn. Ukratko, 52 zdravih, aklimatizovanih mužjaka zečeva nasumično je dodeljeno jednom od četiri kraka ispitivanja. U svim grupama zečevi su podvrgnuti 30 minuta regionalne ishemije srca (koronarno začepljenje), nakon čega je usledilo 180 minuta (3 sata) reperfuzije. U svim slučajevima, tretmani (intravenska bolus primena fiziološkog rastvora, eksenatida ili kalijum kanrenoata ili njihove kombinacije) izvedeni su 15 minuta nakon početka ishemije (15 minuta pre početka reperfuzije). Eksperimenti su završeni 3 sata posle reperfuzije (kraj studije); procenjeno je nepovratno oštećenje miokarda (veličina infarkta pomoću histomorfometrije) u ovoj vremenskoj tački, i to je bila primarna krajnja tačka studije. Dizajn studije sažet je u Tabeli 7.

Tabela 7. Protokol eksperimenta

[0285] Anestezija/hirurška priprema. Opšta anestezija je indukovana intramuskularno (IM) sa smešom ketamina (-35-50 mg/kg) i ksilazina (5-10 mg/kg). Kako bi sačuvala autonomna funkcija i održala anestezija tokom eksperimentalnog postupka, životinje su primale dodatnu anesteziju prema potrebi (∼10-15 mg ketamina/30 minuta ili ∼15-20 mg/kg natrijumpentobarbitala). Venski kateter je postavljen u perifernu venu (npr. ušnu aurikularnu venu) za primenu dodatnih anestetika i standardnih fizioloških rastvora/proizvoda za testiranje.

Trahealna cev je stavljena putem traheotomije (ventralni srednji rez) i korišćena je za mehaničku ventilaciju pluća sa 95% O2/5% CO2smešom pomoću zapreminski-cikliranog životinjskog respiratora (-40 udisaja/minut sa plimskom zapreminom od -12,5 ml/kg) kako bi se PaCO2vrednosti održale u fiziološkom rasponu.

[0286] Posle toga, životinje su smeštene u levo-bočni ležeći položaj i grudi su hirurški otvorene levom torakotomijom. Grudi su otvorene kroz levi četvrti interkostalni prostor. Srce koje je kucalo bilo je izloženo, i perikard je zasečen. Ispod atrijalnog dodatka, leva prednja silazna koronarna arterija (LAD) je okružena 3-0 svilenim šavom. Začepljenje koronarnih arterija u ovom regionu obično rezultuje ishemijom velike površine anterolateralnog i apikalnog zida ventrikula. Krajevi šava provučeni su kroz mali komad polietilenske cevi, formirajući zamku. Ishemija je izazvana povlačenjem niti kroz cev koja je uz malu stezaljku čvrsto postavljena uz koronarni zid arterija. Ishemija je rezultovala promenom boje (tj. cijanotike) miokarda. Nakon 15 minuta ishemije, životinjama je primenjen IV bolus, bilo nosača (standardni fiziološki rastvor) ili naznačenog test proizvoda; ishemija je nastavljena dodatnih 15 minuta (tj., 30 minuta ukupno vreme ishemije) nakon tretmana. Na kraju perioda ishemije, koronarne zamke su oslobođene, i prethodni ishemijski miokard reperfuziran je u roku od 3 sata. Kako bi se utvrdio/kvantifikovao stepen nepovratnog oštećenja miokarda (tj. infarkta) koji je posledica ishemije i reperfuzionog oštećenja sa i bez naznačenog tretmana, procenjena je površina infarkta.

[0287] Histopatologija/histomorfometrija. Po završetku protokola procenjeno je nepovratno oštećenje miokarda (tj. infarkt) koje je posledica I/R oštećenja. Ukratko, nakon završetka reperfuzije, srca su izvađena, postavljena na uređaj i perfuzovana sa standardnim fiziološkim rastvorom u trajanju od 2 minuta za uklanjanje krvi. Potom je koronarna ligatura povučena na istom mestu i 5 mL zelenog fluorescentnog mikrosfernog rastvora polimera (8 mg/ml; prečnik 3-8 µm; Fluoro-Max™, Thermo Scientific, CA, USA) je infuziran za razdvajanje normalno perfuzirane površine (bez ishemijske površine) i za označavanje površine miokarda pod rizikom (AAR, ishemijska površina) tokom ishemije. Srca su držana na -20°C tokom 24 sata i secirana su vertikalno duž svoje dugačke ose(od vrha do baze) na komade debljine 3 mm. Nakon toga, komadi su inkubirane tokom 20 minuta u 2% (TTC, Sigma) na 37°C i fiksirani u 10% ne-puferisanom rastvoru formalina.

[0288] Nakon fiksiranja, ukupna površina leve komore (LV), površina pod rizikom (AAR) i površina infarkta (IF) su ocrtani/mereni digitalno. Sa talasnom dužinom od 366 nm UV svetla, na svakom slajdu su razdvojeni ishemijska površina (AAR) od infarktirane zone (IF) i nema ishemijske površine. Sve površine su označene na acetatnoj ploči. Oznake su naknadno uvezene u program analize slike (Image J; National Institutes of Health), i kompjuterski podržana planometrija je izvršena za određivanje ukupne površine leve komore (LV), površine pod rizikomom (AAR) i infarkt (IF). Za svaki slajd, AAR je izražen kao procenat LV površine (AAR/LV), i IF je izražen kao procenat AAR (IF/AAR). U svim je slučajevima kvantitativna histomorfometrija izvršena od strane osoblja koje je bilo slepo za raspored tretmana/dizajn studije.

[0299] Analiza podataka/statistika. Statistička analiza izvedena je sa SPSS verzijom 21.0 (SPSS Inc., IL, USA). Vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost±standardna greška (SEM). Statističko poređenje numeričkih promenljivih između tri grupe analizirano je korišćenjem modela jednosmerne analize varijance (ANOVA) sa Bonferroni korekcionom analizom. Izračunata P-vrednost manja od 0,05 smatrala se statistički značajnom.

Opservacije životinja/rezultati.

[0290] Površina leve komore (LV) i ishemijska površina (AAR) bili su slični kod svih životinja i nisu se statistički razlikovali između ispitivanih grupa. Indukcija ishemije (30 minuta) i reperfuzija (180 minuta) u kontrolnoj grupi rezultovali su značajnim oštećenjima miokarda eksperimentalnih životinja (49,47±3,97%), što ukazuje na dovoljnu primenu modela i reproduktibilnost eksperimentalnog postupka studija. Monoterapija eksenatidom (0,150 µg/Kg) izazvala je smanjenje stepena infarkta za 36,2% (31,55±3,31%; P <0,05) u poređenju sa kontrolnom grupom. Primena monoterapije kalijum kanrenoatom (1 mg/kg) smanjila je površinu infarkta za 30,5% (34,36±2,83%); P <0,05) u poređenju sa kontrolnom grupom.

[0291] Tretman kombinacijom eksenatida i kalijum kanrenoata izazvalo je dramatično smanjenje obima infarkta za 73,1% (13,31±2,14%; P <0,001) u poređenju sa kontrolnom grupom. Zanimljivo je da je efekat kombinacije takođe bio statistički značajan (P<0,01) u poređenju sa monoterapijama eksenatida i kalijum kanrenoata.

Tabela 8 prikazuje podatke koji pokazuju odnose površine pod rizikom i leve komore i površine infarkta i površine pod rizikom za svaku od grupa korišćenih u ovom ispitivanju.

[0292] Ovi rezultati pokazuju da je u standardizovanom zečjem modelu akutne ishemije miokarda i reperfuzionog oštećenja kombinovana terapija eksenatida i kalijum kanrenoata, kada se primenjuje kao IV bolus (0,15 µg/kg i 1 mg/kg, respektivno), 15 minuta pre započinjanja reperfuzija mogla da proizvede znatno veće smanjenje veličine infarkta miokarda u poređenju sa monoterapijskim grupama eksenatida ili kalijum kanrenoata. Dalje, od velikog je interesa to što predmetni rezultati po prvi put pružaju snažne dokaze da je kombinovana terapija kalijum kanrenoata sa eksenatidom sinergetski smanjila stepen oštećenja miokarda, jer dobijena kombinacija premašuje zbir umanjenja pojedinačnih monoterapija. Shodno tome, ovi rezultati pokazuju po prvi put da je u terapiji reperfuzionog oštećenja miokarda kombinovana primena kalijum kanrenoata i eksenatida korisnija i povoljnija i omogućava vrhunski klinički ishod u odnosu na terapije samim kanrenoatom ili eksenatidom. Kao takvi, kombinovani eksenatid i kalijum kanrenoat su izuzetno korisni u postupcima za sprečavanje i tretmana ishemijsko-reperfuzionog oštećenja kod sisara.

Primer 4. Trostruka kombinovana terapija: efekti kombinovanog tretmana eksenatidom, ciklosporinom i kalijumom kanrenoatom u zečjem modelu akutnog oštećenja infarkta miokarda

[0293] Ova studija je osmišljena za testiranje kombinovanih kardioprotektivnih efekata eksenatida, ciklosporina (CsA) i kalijum kanrenoata u okruženju koje oponaša klinički scenario akutnog I/R oštećenja. Studija je sprovedena pod hipotezom da će trostruko kombinovano tretman eksenatidom, CsA i kalijum kanrenoatom nakon početka ishemije (ali pre reperfuzije) pružiti izraženiji zaštitni efekat miokarda u poređenju sa dvostrukim tretmanom eksenatidom i ciklosporinom.

[0294] Novozelandski beli zečevi su korišćeni u ovoj studiji. Zečevi su bili mužjaci, stari> 8 nedelja i težine između 2,6 i 3,8 kg. Sve životinje tretirane su u skladu sa Direktivom 2010/63/UE od European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes, i u skladu sa Guide for the Care and Use of Laboratory Animals objavljenim od strane US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revidirano 1985). Odobrenja od Etičkih odbora i veterinarskih institucija dobijena su pre nego što je studija započeta. Kontrola okruženja u prostorijama za životinje postavljene su da održavaju temperaturu od 22°do 28°C i relativnu vlažnost vazduha između 30% i 70%. Sobna temperatura i vlaga beležili su se svaki sat i pratili svakodnevno. U prostorijama za životinje bilo je otprilike 10-15 razmena vazduha na sat. Raspored svetla bio je 12 sati svetla, i 12 sati mraka. Obavljena su svakodnevna rutinska opažanja. Zečevima je pružena sertifikovana standardna prehrana, otprilike 180 grama dnevno od dolaska u objekat.

[0295] Kao test proizvodi koriste se eksenatid (Byetta®; Eli Lilly Nederland BV), CsA (Sandimmun®, Novartis Pharma AG, Switzerland) i kalijum kanrenoat (Sigma-Aldrich, Germany), bilo u dvostrukoj ili u trostrukoj kombinovanoj terapiji. Dozni rastvori eksenatida, CsA i kalijum kanrenoata su pripremljeni neposredno pre primene zečevima. Kao kontrola korišćen je standardni fiziološki rastvor (0,9% NaCl).

[0296] Test/kontrolni proizvodi primenjivani su intravenski, pod opštom anestezijom, kako bi se oponašao očekivani put primene u kliničkom okruženju akutnog infarkta miokarda i primarne perkutane koronarne intervencije. Intravenski bolusi su primenjeni preko periferne vene (zečja aurikularna vena).

[0297] Studija je pratila unapred određeni placebom kontrolisani dizajn. Ukratko, 55 zdravih, aklimatizovanih mužjaka zečeva nasumično je dodeljeno jednom od četiri kraka ispitivanja. U svim grupama zečevi su podvrgnuti 30 minuta regionalne ishemije srca (koronarno začepljenje), nakon čega je usledilo 180 minuta (3 sata) reperfuzije. U svim slučajevima, tretmani (intravenska bolus primena fiziološkog rastvora ili kombinacija test proizvoda) su vršeni 15 minuta nakon početka ishemije (15 minuta pre započinjanja reperfuzije).

Eksperimenti su završeni 3 sata posle reperfuzije (kraj studije); nepovratno oštećenje miokarda (veličina infarkta pomoću histomorfometrije) u ovoj vremenskoj tački je procenjeno i bilo je primarna krajnja tačka studije. Dizajn studije sažet je u Tabeli 9.

Tabela 9. Protokol eksperimenta

1

[0298] Anestezija/hirurška priprema. Opšta anestezija je indukovana intramuskularno (IM) sa smešom ketamina (-35-50 mg/kg) i ksilazina (∼5-10 mg/kg). Kako bi sačuvali autonomnu funkciju i održali anesteziju tokom eksperimentalnog postupka, životinje su primile dodatnu anesteziju prema potrebi (∼10-15 mg ketamina/30 minuta ili -15-20 mg/kg natrijum pentobarbitala). Venski kateter je postavljen u perifernu venu (npr. ušnu aurikularnu venu) za primenu dodatnih anestetika i standardnih fizioloških rastvora/proizvoda za testiranje.

[0299] Posle toga, životinje su smeštene u levo-bočni ležeći položaj i grudi su hirurški otvorene levom torakotomijom. Grudi su otvorene kroz levi četvrti interkostalni prostor. Srce koje je kucalo bilo je izloženo, i perikard je zasečen. Ispod atrijalnog dodatka, leva prednja

2

silazna koronarna arterija (LAD) je okružena 3-0 svilenim šavom. Začepljenje koronarnih arterija u ovom regionu obično rezultuje ishemijom velike površine anterolateralnog i apikalnog zida ventrikula. Krajevi šava provučeni su kroz mali komad polietilenske cevi, formirajući zamku. Ishemija je izazvana povlačenjem niti kroz cev koja je uz malu stezaljku čvrsto postavljena uz koronarni zid arterija. Ishemija je rezultovala promenom boje (tj. cijanotike) miokarda. Nakon 15 minuta ishemije, životinjama je primenjen IV bolus, bilo nosača (standardni fiziološki rastvor) ili naznačenog test proizvoda; ishemija je nastavljena dodatnih 15 minuta (tj., 30 minuta ukupno vreme ishemije) nakon tretmana. Na kraju perioda ishemije, koronarne zamke su oslobođene, i prethodni ishemijski miokard reperfuziran je u roku od 3 sata. Kako bi se utvrdio/kvantifikovao stepen nepovratnog oštećenja miokarda (tj. infarkta) koji je posledica ishemije i reperfuzionog oštećenja sa i bez naznačenog tretmana, procenjena je površina infarkta.

[0300] Histopatologija/histomorfometrija. Po završetku protokola procenjeno je nepovratno oštećenje miokarda (tj. infarkt) koje je posledica I/R oštećenja. Ukratko, nakon završetka reperfuzije, srca su izvađena, postavljena na uređaj i perfuzovana sa standardnim fiziološkim rastvorom u trajanju od 2 minuta za uklanjanje krvi. Potom je koronarna ligatura povučena na istom mestu i 5 mL zelenog fluorescentnog mikrosfernog rastvora polimera (8 mg/ml; prečnik 3-8 µm; Fluoro-Max™, Thermo Scientific, CA, USA) je infuziran za razdvajanje normalno perfuzirane površine (bez ishemijske površine) i za označavanje površine miokarda pod rizikom (AAR, ishemijska površina) tokom ishemije. Srca su držana na -20°C tokom 24 sata i secirana su vertikalno duž svoje dugačke ose(od vrha do baze) na komade debljine 3 mm. Nakon toga, komadi su inkubirane tokom 20 minuta u 2% (TTC, Sigma) na 37°C i fiksirani u 10% ne-puferisanom rastvoru formalina.

[0301] Nakon fiksiranja, ukupna površina leve komore (LV), površina pod rizikom (AAR) i površina infarkta (IF) su ocrtani/mereni digitalno. Sa talasnom dužinom od 366 nm UV svetla, na svakom slajdu su razdvojeni ishemijska površina (AAR) od infarktirane zone (IF) i nema ishemijske površine. Sve površine su označene na acetatnoj ploči. Oznake su naknadno uvezene u program analize slike (Image J; National Institutes of Health), i kompjuterski podržana planometrija je izvršena za određivanje ukupne površine leve komore (LV), površine pod rizikomom (AAR) i infarkt (IF). Za svaki slajd, AAR je izražen kao procenat LV površine (AAR/LV), i IF je izražen kao procenat AAR (IF/AAR). U svim je slučajevima kvantitativna histomorfometrija izvršena od strane osoblja koje je bilo slepo za raspored tretmana/dizajn studije.

[0302] Analiza podataka/statistika. Statistička analiza izvedena je sa SPSS verzijom 21.0 (SPSS Inc., IL, USA). Vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost±standardna greška (SEM). Statističko poređenje numeričkih promenljivih između tri grupe analizirano je korišćenjem modela jednosmerne analize varijance (ANOVA) sa Bonferroni korekcionom analizom. Izračunata P-vrednost manja od 0,05 smatrala se statistički značajnom.

Opservacije životinja/rezultati.

[0303] Područje leve komore (LV) i ishemijska površina (AAR) bili su slični kod svih životinja i nisu se statistički razlikovali između ispitivanih grupa. Tretman dvostruke kombinacije eksenatida i CsA (0,150 mg/kg i 0,5 mg/kg, respektivno) izazvao je smanjenje površine infarkta za 50% (24,74±3,8%; P <0,05) u poređenju sa kontrolnom grupom (49,47±4). Dodatak kalijum kanrenoata (1 mg/kg) ovom tretmanu rezultovao je dodatnim smanjenjem površine infarkta za 70,6% (14,56±3%; P<0,001) u poređenju sa kontrolnom grupom. Slično tome, primena trostruke kombinacije eksenatida, kalijum kanrenoata i CsA 1mg/Kg smanjila je površinu infarkta za 74,8% (12,49±2,2%; P <0,001), u poređenju sa kontrolnom grupom.

[0304] Zanimljivo je da je efekat ovih trostrukih kombinacija bio statistički značajan (P<0,05) u poređenju sa dvostrukom kombinacijom eksenatida i CsA. Međutim, primena trostruke kombinacije eksenatida, kalijum kanrenoata i CsA 2,5mg/Kg izazvala je smanjenje stepena infarkta za 46,5% (26,48±2,93%; P<0,05), što nije bilo statistički značajno u poređenju sa dvostrukom kombinacijom eksenatida i CsA.

[0305] Tabela 10 prikazuje podatke koji pokazuju odnose površine pod rizikom i leve komore i površine infarkta i površine pod rizikom za svaku od grupa korišćenih u ovom ispitivanju.

4

[0306] Ovi rezultati pokazuju da u standardizovanom zečjem modelu akutne ishemije miokarda i reperfuzionog oštećenja, kombinovana primena eksenatida i CsA pruža blagotvoran efekat, dok dodavanje kalijum kanrenoata tretmanu pokazuje značajno veću dalju potencije kardioprotekcije kombinacije. Od velikog je interesa to što predmetni rezultati po prvi put pružaju snažne dokaze da je trostruko kombinovana terapija eksenatidom, CsA i kalijum kanrenoatom donela veće smanjenje stepena oštećenja miokarda u poređenju sa kombinovanim tretmanom eksenatidom i CsA. Shodno tome, ovi rezultati po prvi put pokazuju da je u terapiji reperfuzionog oštećega miokarda trostruko kombinovano primena eksenatida, CsA i kalijum kanrenoata korisnija, ima prednosti i omogućava superiorniji klinički ishod u odnosu ma monoterapije CsA i eksenatida, kada se primenjuju kao kombinovane terapije. Kao takvi, kombinovani eksenatid, CsA (barem u malim dozama) i kalijum kanrenoat su izuzetno korisni u postupcima za sprečavanje i tretman ishemijskoreperfuzionog oštećenja kod sisara.

Primer 5. Efekti eksenatida, ciklosporina i kalijum kanrenoata i njihovih dvostrukih ili trostrukih kombinovanih terapija u mišjem modelu akutnog oštećenja infarkta miokarda

[0307] Ova studija je osmišljena za testiranje narednog:

i) Dozno-zavisni efekti eksenatida, CsA i kalijum kanrenoata kao monoterapija u dodatnom životinjskom (mišjem) modelu reperfuzionom oštećenju miokarda.

ii) Efekti dvostruko kombinovane terapije eksenatida, CsA i kalijum kanrenoata u dozama koje su niže od optimalnih doza monoterapije.

iii) Efekat trostruke kombinovane terapije eksenatida, CsA i kalijum kanrenoata u istoj dozi svake komponente koja se koristi u dvostrukoj kombinaciji.

[0308] Studija je sprovedena sa ciljem da se na mišjem modelu pokaže da dvostruka kombinovana terapija eksenatidom, CsA i kalijum kanrenoatom, nakon početka ishemije i pre reperfuzije, rezultuje povećanim smanjenjem veličine infarkta u poređenju sa odgovarajućim monoterapijama i da je trostruka kombinovana terapija sa eksenatidom, CsA i kalijum kanrenoatom korisnija i povoljnija u poređenju sa dvostrukim kombinovanim terapijama.

[0309] U ovom ispitivanju korišćeni su C57BL/6 miševi. Miševi su bili mužjaci, stari 13-15 nedelja. Sve životinje tretirane su u skladu sa Direktivom 2010/63/UE od European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes, i u skladu sa Guide for the Care and Use of Laboratory Animals objavljenim od strane US National Institutes of Health (NIH Publication No.85-23, revidirano 1985). Odobrenja od Etičkih odbora i veterinarskih institucija dobijena su pre nego što je studija započeta. Kontrola okruženja u prostorijama za životinje postavljene su da održavaju temperaturu od 22°do 28°C i relativnu vlažnost vazduha između 30% i 70%. Sobna temperatura i vlaga beležili su se svaki sat i pratili svakodnevno. U prostorijama za životinje bilo je otprilike 10-15 razmena vazduha na sat. Raspored svetla bio je 12 sati svetla, i 12 sati mraka. Obavljena su svakodnevna rutinska opažanja. Na raspolaganju su bili standardna laboratorijska hrana za miševe i filtrirana voda iz česme, ad libitum.

[0310] Kao test proizvodi koriste se eksenatid (Byetta®; Eli Lilly Nederland BV), CsA (Sandimmun®, Novartis Pharma AG, Switzerland) i kalijum kanrenoat (Sigma-Aldrich, Germany), bilo u dvostrukoj ili u trostrukoj kombinovanoj terapiji. Dozni rastvori eksenatida, CsA i kalijum kanrenoata su pripremljeni neposredno pre primene miševima. Kao kontrola korišćen je standardni fiziološki rastvor (0,9% NaCl).

[0311] Test/kontrolni proizvodi primenjivani su intravenski, pod opštom anestezijom, kako bi se oponašao očekivani put primene u kliničkom okruženju akutnog infarkta miokarda i primarne perkutane koronarne intervencije.

[0312] Studija je pratila unapred određeni placebo kontrolirani dizajn. Ukratko, 149 zdravih, aklimatizovanih mužjaka miševa nasumično je dodeljeno jednom od dvadeset (20) krakova ispitivanja. U svim grupama, miševi su podvrgnuti 30 minuta regionalne ishemije srca (koronarno začepljenje), nakon čega je usledilo 120 minuta (2 sata) reperfuzije. U svim slučajevima, tretmani (intravenska bolus primena fiziološkog rastvora ili test proizvoda ili njihovih kombinacija) su izvedeni 20 minuta nakon početka ishemije (10 minuta pre početka reperfuzije). Eksperimenti su završeni 2 sata posle reperfuzije (kraj studije); nepovratno oštećenje miokarda (veličina infarkta pomoću histomorfometrije) u ovoj vremenskoj tački je procenjenp i to je bila primarna krajnja tačka studije. Dizajn studije sažet je u Tabeli 11.

Tabela 11. Protokol eksperimenta

[0313] Anestezija/hirurška priprema. Miševi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom (0,01 ml/kg) sa kombinacijom ketamina, ksilazina i atropina (krajnje doze ketamina, ksilazina i atropina bile su 100, 20 i 0,6 mg/kg, respektivno). Dubina anestezije procenjena je gubitkom pedalnog refleksa na stimulaciju nožnim prstima i brzinom disanja. Traheotomija je izvedena za veštačko disanje pri 120-150 udisaja/minut i pozitivan krajnji ekspiratorni pritisak 2,0 (0,2 ml ukupne zapreminske plimne ventilacije; Flexivent glodarski respirator, Scireq, Montreal, ON, Canada). Zatim je izvršena torakotomija između četvrtog i petog rebra, i perikard je pažljivo uvučen kako bi se vizuelno prikazao levi prednji silazni (LAD), koji je ligiran pomoću 8-0 prolenskog monofilamentnog polipropilenskog šava postavljenog 1 mm ispod vrha leve usne školjke. Srcu je ostavljeno da se stabilizuje 12 minuta pre vezivanja kako bi se izazvala ishemija. Nakon perioda ishemije, ligatura je oslobođena omogućavajući reperfuziono oštećenje miokarda. Tokom eksperimenata, telesna temperatura je održavana na 37±0,5°C pomoću podloge za grejanje i praćena je pomoću termoelementa koji je ubačen rektalno.

[0314] Histopatologija/histomorfometrija. Nakon reperfuzije, životinje su žrtvovane intraperitonealnom injekcijom mešavine anestetika ketamina (200mg/Kg) i ksilazina (50mg/Kg), srca su brzo izvađena iz miševa i direktno kanilirana i isprana sa 2,5 ml fiziološkog heparina 1% za uklanjanje krvi. Pet ml 1% TTC fosfatnog pufera 37°C je infuzirano u koronarnu cirkulaciju; tkivo se inkubira tokom 5 minuta u istom puferu. Evans plava 1% razblažena u destilovanoj vodi (2,5 ml) je infuzirana u srce. Srca su držana na -20°C tokom 24 sata, i zatim su secirana na komade od 1 mm paralelno sa atrioventrikularnim žlebovima, i zatim fiksirana u 4% formalinu preko noći. Komadi su zatim kompresovani između staklenih ploča udaljenih 1 mm i slikani digitalnim fotoaparatom Cannon Powershot A620 pomoću mikroskopa Zeiss 459300 i izmereni Scion Image programom. Površina tkiva miokarda pod rizikom i infarktom automatski su transformisana u zapremine. Zapremine infarkta i površine pod rizikom izražene su u cm<3>. Za svaki slajd, AAR je izražen kao procenat LV površine (AAR/LV), i IF je izražen kao procenat AAR (IF/AAR). U svim je slučajevima kvantitativna histomorfometrija je izvršena od strane osoblja slepog za raspored tretmana/dizajn studije.

[0315] Analiza podataka/statistika. Svi rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost SEM. Poređenja numeričkih promenljivih među grupama analizirana su korišćenjem jednosmerne analize varijance (ANOVA) s Bonferroni korekcijom i Turkey post hoc analizom. Analize su izvedene koristeći Stata 13.1 statistički softverski paket (StataCorp, TX, USA). Izračunata P-vrednost manja od 0,05 smatrala se statistički značajnom.

Opservacije životinja/rezultati.

[0316] Područje leve komore (LV) i ishemijska površina (AAR) bili su slični kod svih životinja i nisu se statistički razlikovali između grupa ispitivanja. Indukcija ishemije (30 minuta) i reperfuzije (120 minuta) u kontrolnoj grupi rezultovala je značajnim oštećenjima miokarda eksperimentalnih životinja (47,4±1,9%), što ukazuje na dovoljnu primenu modela i obnovljivost eksperimentalnog postupka studija.

[0317] Monoterapija eksenatidom (0,001 µg/kg - 1,5 µg/kg) izazvala je dozno-zavisni efekat pri dozama od 0,005 µg/kg i 0,05 µg/kg kako bi izazvalo smanjenje veličine infarkta za 36,9% (29,9±1,8%; P<0,05) i 31,6% (32,4±1,9%; P<0,05), respektivno, u poređenju sa kontrolnom grupom. Monoterapija ciklosporinom (0,001 mg/kg - 2,5 mg/kg) izazvala je dozno-zavisni efekat pri dozama od 0,01 mg/kg i 0,15 mg/kg kako bi izazvalo smanjenje veličine infarkta za 43,7% (26,7±2,8%; P<0,05) i 49,4% (24±1,9%; P<0,05), respektivno, u poređenju sa kontrolnom grupom. Monoterapija kalijum kanrenoatom (0,03 mg/kg - 10 mg/kg) izazvala je dozno-zavisni efekat pri dozama od 1 mg/kg i 10 mg/kg, kako bi izazvala smanjenje veličine infarkta za 30% (33,2±2,4%; P<0,05) i 58,9% (19,5±2,5%; P<0,05), respektivno, u poređenju sa kontrolnom grupom.

[0318] Dvostruka kombinacija eksenatida i ciklosporina izazvala je smanjenje stepena infarkta za 52,5% (22,5±2,3%; P <0,05) u poređenju sa kontrolnom grupom. Međutim, ovaj efekat nije bio statistički značajan u poređenju sa odgovarajućim dozama monoterapije eksenatida i ciklosporina. Dvostruka kombinacija eksenatida i kalijum kanrenoata izazvala je smanjenje stepena infarkta za 70,9% (13,8±1,3%; P<0,01) u poređenju sa kontrolnom grupom. Zanimljivo je da je efekat kombinacije takođe bio statistički značajan (P<0,05) u poređenju sa odgovarajućim dozama monoterapije eksenatida i kalijum kanrenoata. Međutim, kada je eksenatid kombinovan sa većom dozom (10 mg/kg) kalijum kanrenoata, smanjena je veličina infarkta za 52,3% (22,6±2%), što nije bilo statistički značajno kod odgovarajućih monoterapija. Dvostruka kombinacija ciklosporina i kalijum kanrenoata izazvala je smanjenje stepena infarkta za 61,4% (18,3±2,6%; P<0,05) u poređenju sa kontrolnom grupom.

Međutim, ovaj efekat nije bio statistički značajan u poređenju sa odgovarajućim dozama monoterapije ciklosporina i kalijum kanrenoata. Najzad, trostruka kombinacija eksenatida, ciklosporina i kalijum kanrenoata izazvala je smanjenje infarkta za 56,7% (20,5±2%; P<0,05)

1

u poređenju sa kontrolnom grupom. Međutim, ovaj efekat nije bio statistički značajan u poređenju sa odgovarajućim dozama monoterapije eksenatida, ciklosporina i kalijum kanrenoata.

[0319] Tabela 12 predstavlja podatke koji pokazuju odnose površine pod rizikom i leve komore i površine infarkta i površine pod rizikom za svaku od grupa korišćenih u ovom ispitivanju.

2

[0320] Ovi rezultati pokazuju da je u dodatnom standardizovanom modelu akutne ishemije i reperfuzionog oštećenja miokarda kombinovana terapija eksenatida, ciklosporina i kalijum kanrenoata, kada se primenjivala kao IV bolus na 10 minuta pre početka reperfuzije, mogla da proizvede veće smanjenje veličine infarkta miokarda u poređenju sa monoterapijskim grupama eksenatida ili CsA ili kalijum kanrenoata. Od velikog je interesa to što predmetni rezultati po prvi put pružaju snažne dokaze da je kombinovana terapija kalijum kanrenoata sa eksenatidom sinergetski smanjila stepen oštećenja miokarda, jer dobijena kombinaciona redukcija premašuje zbir odgovarajućih redukcija monoterapije. Shodno tome, ovi rezultati pokazuju da u terapiji reperfuzionog oštećenja miokarda kombinovana primena eksenatida i kalijum kanrenoata pruža najveći kardioprotektivni efekat u poređenju sa odgovarajućim monoterapijama ili drugim dvostrukim ili trostrukim kombinacijama. Kao takvi, kombinovani eksenatid i kalijum kanrenoat su izuzetno korisni u postupcima za sprečavanje i tretman ishemijsko-reperfuzionog oštećenja kod sisara.

[0321] Različite modifikacije i varijacije predmetnog pronalaska biće vidljive stručnjacima bez odstupanja od obima i duha pronalaska. Iako je pronalazak opisan u vezi sa specifičnim poželjnim otelotvorenjima, treba razumeti da pronalazak kako je definisan patentnim

4

zahtevima ne bi smeo biti neopravdano ograničen na takva specifična otelotvorenja. Zaista, predmetni pronalazak treba da obuhvati različite modifikacije opisanih načina izvođenja pronalaska, koje su očigledne onima stručnjacima u relevantnim oblastima.

[0322] Predmetni pronalazak uključuje sve modifikacije i ekvivalente predmetne materije koji su navedeni u paragrafima koji su ovde priloženi kako je dopušteno važećim zakonom.

[0323] Svi naslovi i podnaslovi su ovde korišćeni samo radi praktičnosti i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje pronalaska na bilo koji način.

Claims

Patentni zahtevi

1. Kombinacija koja sadrži modulator insulina, gde je modulator insulina eksenatid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i antagonist aldosterona, gde je antagonist aldosterona kalijum kanrenoat.

2. Kombinacija prema patentnom zahtevu 1, koja sadrži najmanje jedan dalji aktivni farmaceutski sastojak (API) izabran između beta blokatora, inhibitora renin-angiotenzina, statina (inhibitora HMG-CoA reduktaze), inhibitora aktiviranja ili agregacije trombocita, inhibitora fosfodiesteraze-3, senzibilizatora kalcijuma, antioksidansa i protiv-upalnog agensa.

3. Farmaceutski sastav koji sadrži kombinaciju prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

4. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 3 u obliku pogodnom za parenteralnu primenu, poželjno intravenoznu primenu.

5. Farmaceutski proizvod koji sadrži modulator insulina, gde je modulator insulina eksenatid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i antagonist aldosterona, gde je antagonist aldosterona kalijum kanrenoat.

6. Kombinacija prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 3 ili patentnom zahtevu 4, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju jednog ili više od ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja, ishemijskog moždanog udara, zatajenja srca, akutnog infarkta miokarda, neonatalne asfiksije i kardiogenog šoka, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova.

7. Kombinacija ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde ishemija i/ili reperfuziono oštećenje predstavljaju ishemiju i/ili reperfuziono oštećenje mozga, srca, pluća, bubrega, poželjno ishemija miokarda, reperfuzija miokarda ili akutni infarkt miokarda.

8. Kombinacija ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 ili 7, gde su komponente namenjene za intravensku primenu.

9. Kombinacija ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 6 do 8, gde su komponente namenjene za primenu tokom reperfuzije.

10, Kombinacija ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 6 do 8, gde su komponente namenjene za primenu pre reperfuzije.

11. Kombinacija ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 6 do 8, gde su komponente namenjene za primenu nakon reperfuzije.

12. Farmaceutski proizvod prema patentnom zahtevu 5, za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju jednog ili više od narednog: ishemija i/ili reperfuziono oštećenje, ishemijski moždani udar, zatajenje srca, akutni infarkt miokarda, neonatalna asfiksija i kardiogeni šok, ili za upotrebu u pružanju kardioprotekcije protiv kardiotoksičnih lekova, gde su komponente namenjene za primenu istovremeno, uzastopno ili odvojeno.

13. Farmaceutski proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, gde ishemija i/ili reperfuziono oštećenje predstavljaju ishemiju i/ili reperfuziono oštećenje mozga, srca, pluća, bubrega, poželjno ishemiju miokarda, reperfuziono oštećenje miokarda ili akutni infarkt miokarda.

14. Farmaceutski proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 12 ili patentnom zahtevu 13, gde su komponente za parenteralnu primenu, poželjno za intravensku primenu.

15. Farmaceutski proizvod za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 12 do 14, gde su komponente namenjene za primenu tokom reperfuzije.

16. Farmaceutski proizvod za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 12 do 14, gde su komponente namenjene za primenu pre reperfuzije.

17. Farmaceutski proizvod za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 12 do 14, gde su komponente namenjene za primenu nakon reperfuzije.

18. Farmaceutski proizvod za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 12 do 17, gde su komponente namenjene za istovremenu primenu.

19. Upotreba kombinacije koja sadrži modulator insulina, gde je modulator insulina eksenatid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i antagonista aldosterona, gde je antagonist aldosterona kalijum kanrenoat, za tretman i/ili sprečavanje ishemije i/ili reperfuzionog oštećenja u ex vivo organu pre transplantacije.

20, Upotreba prema patentnom zahtevu 19, gde ishemija i/ili reperfuziono oštećenje predstavljaju ishemiju miokarda, reperfuziono oštećenje miokarda ili akutni infarkt miokarda.

21. Upotreba prema patentnom zahtevu 19 ili 20, gde su komponente primenjene pre transplantacije.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5