RS60363B1 - Postupak za diferencijaciju pluripotentne matične ćelije indukovane iz mezenhimalne matične ćelije u hepatocit - Google Patents

Postupak za diferencijaciju pluripotentne matične ćelije indukovane iz mezenhimalne matične ćelije u hepatocit

Info

Publication number
RS60363B1
RS60363B1 RS20200314A RSP20200314A RS60363B1 RS 60363 B1 RS60363 B1 RS 60363B1 RS 20200314 A RS20200314 A RS 20200314A RS P20200314 A RSP20200314 A RS P20200314A RS 60363 B1 RS60363 B1 RS 60363B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
medium
stem cells
pluripotent stem
cells
differentiation
Prior art date
Application number
RS20200314A
Other languages
English (en)
Inventor
Sang Yeon Lee
Won Ju Jung
Ho Bin Kim
Min Sun Oh
Kye Ho Lee
Original Assignee
Bbhc Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bbhc Co Ltd filed Critical Bbhc Co Ltd
Publication of RS60363B1 publication Critical patent/RS60363B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/137—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. Msc from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1369—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. MSC from umbilical blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[Tehnička oblast]
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na postupak koji obuhvata: proizvodnju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija primenom kompozicije podloge za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija iz mezenhimalnih matičnih ćelija; i diferencijaciju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija u hepatocite.
[Stanje tehnike]
[0002] Matične ćelije generalno se odnose na nediferencirane ćelije pre diferencijacije, koje se mogu dobiti iz raznih tkiva. Matične ćelije imaju osobine da mogu da kontinulano proizvode ćelije idetične njima samima tokom određenog vremena u nediferenciranom stanju, a takođe imaju osobine da mogu da se diferenciraju u razne vrste ćelija koje, pod pogodnim uslovima, konstituišu biološka tkiva.
[0003] Matične ćelije se mogu široko klasifikovati u embrionske matične ćelije i odrasle matične ćelije, u skladu sa njihovim potencijalom diferencijacije i vremenom stvaranja. Dodatno, matične ćelije se mogu klasifikovati u skladu sa njihovim potencijalom diferencijacije u pluripotentne, multipotentne, i unipotentne matične ćelije.
[0004] Odrasle matične ćelije se mogu klasifikovati kao multipotentne ili unipotentne matične ćelije. Reprezentativne odrasle matične ćelije uključuju mezenhimalne matične ćelije (MSC) i hematopoietične matične ćelije (HSC). Poznato je da se mezenhimalne matične ćelije diferenciraju u hondrocite, osteoblaste, adipocite, miocite, i neurone, a da se hematopoietične matične ćelije uglavnom diferenciraju u krvna zrnca u krvi, kao što su eritirociti, leukociti, ili trombociti.
[0005] Sa druge strane, pluripotentne matične ćelije se odnose na matične ćelije sa višestrukom potencijom da se diferenciraju u sva tri sloja klica koje sačinjavaju telo, i tako su sposobne da se diferenciraju u svaku ćeliju ili tkivo organa ljudskog tela. Generalno, embrionske matične ćelije potpadaju pod ovu kategoriju. Humane embrionske matične ćelije pokreću mnoga etička pitanja, budući da su stvorene iz embriona koji su mogli da se razviju u ljudska bića. Međutim, poznato je da embrionske matične ćelije imaju odličnu sposobnost da proliferišu i da se diferenciraju, u poređenju sa odraslim matičnim ćelijama. Odrasle matične ćelije izazivaju manje etičkih problema, jer se one mogu dobiti iz koštane srži, krvi, mozga, kože, i slično. Međutim, odrasle matične ćelije imaju ograničenu sposobnost da se diferenciraju, u poređenju sa embrionskim matičnim ćelijama.
[0006] Kao rešenje za prevazilaženje ovih problema, raznim tehnikama je pokušano da se dediferenciraju ćelije izvedene iz odraslih matičnih ćelija čime bi se proizvele prilagođene pluripotentne matične ćelije slične embrionskim matičnim ćelijama. Reprezentativne tehnike uključuju fuziju sa ES ćelijama, nuklearni transfer somatskih ćelija, reprogramiranje genskim faktorom, i slično. U skladu sa fuzijom sa ES ćelijom, indukovane ćelije dalje imaju dva para gena, a to izaziva problem u pogledu stabilnosti ćelija. Nuklearni transfer somatskih ćelija ima probleme u tome što mu je potreban veliki broj jajašaca i ima veoma nisku efikasnost. Reprogramiranje genskim faktorom je tehnika upotrebe virusa koji sadrže onkogene za umetanje specifičnih gena da bi se na taj način indukovala dediferencijacija, a ova tehnika nosi visok rizik od pojavljivanja kancera i nije pogodna u pogledu mogućnosti razvijanja proizvoda ćelijske terapije zbog niske efikasnosti i poteškoća u pogledu postupaka.
[0007] Kako bi se dobile pluripotentne matične ćelije na uspešan i obilan način, kompozicije podloge u fazi uzgajanja izolovanih mononuklearnih ćelija pupčane vrpce, veoma su značajne. Zbog toga, potrebna su ispitivanja radi proizvodnje povećane količine pluripotentnih matičnih ćelija putem visoko efikasnog indukcionog postupka.
[0008] Pitanja navedena u gornjem stanju tehnike navedena su samo u cilju boljeg razumevanja pozadine ovog pronalaska. Međutim, treba imati na umu da ova pitanja ne potpadaju u stanje tehnike već poznato osobi koja poseduje uobičajeno znanje iz ove struke.
[Otkrivanje]
[Tehnički problem]
[0009] Pronalazači su se potrudili da pronađu postupak za visoko efikasno indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija čime se obezbeđuju proizvodi ćelijske terapije visoke bezbednosti i proizvodne efikasnosti u praksi. Kao rezultat, pronalazači su pronašli da kada se Ecklonia cava ekstrakt, koji je bezbedan prirodan ekstrakt, doda podlozi za uzgajanje ćelija, mogu se proizvesti indukovane pluripotentne matične ćelije iz mezenhimalnih matičnih ćelija primenom kompozicije podloge, a proizvedene indukovane pluripotentne matične ćelije mogu se dalje diferencirati u hepatocite na bezbedan i visoko efikasan način, čime se ispunjava ovo otkrivanje.
[0010] Prema tome, jedan aspekt ovog otkrivanja je da obezbedi kompoziciju podloge za dediferencijaciju mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije, koja sadrži Ecklonia cava ekstrakt.
[0011] Još jedan aspekt ovog otkrivanja je da obezbedi postupak koji obuhvata: dediferencijaciju mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u podlozi koja sadrži Ecklonia cava ekstrakt; i diferencijaciju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija u hepatocite.
[0012] Dalji aspekt ovog otkrivanja je da obezbedi hepatocite proizvedene ovim postupkom.
[0013] Još jedan dalji aspekt ovog otkrivanja je da obezbedi kompoziciju ćelijske terapije, koja obuhvata hepatocite.
[0014] Drugi aspekti i prednosti ovog otkrivanja postaće razumljiviji iz detaljnog opisa ovog otkrivanja, priloženih patentnih zahteva i pratećih crteža koji slede.
[Tehničko rešenje]
[0015] U skladu sa jednim aspektom ovog otkrivanja, obezbeđena je kompozicija podloge za dediferencijaciju mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije koje mogu da se diferenciraju u hepatocite, pri čemu ta kompozicija podloge sadrži Ecklonia cava ekstrakt.
[0016] U još jednom aspektu ovog otkrivanja, obezbeđen je postupak za diferencijaciju mezenhimalnih matičnih ćelija u hepatocite, koji obuhvata faze:
(a) dodavanja Ecklonia cava ekstrakta podlozi za uzgajanje ćelija;
(b) dediferencijacije mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u podlozi; i
(c) diferencijacije indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija u hepatocite.
[0017] Pronalazači su se potrudili da pronađu postupak za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija čime se obezbeđuju proizvodi ćelijske terapije visoke bezbednosti i proizvodne efikasnosti u praksi bez podizanja etičkih pitanja u vezi uništavanja embriona. Kao rezultat, pronalazači su pronašli da kada se Ecklonia cava ekstrakt, koji je bezbedan prirodan ekstrakt, dodaje podlozi za uzgajanje ćelija, mogu se proizvesti indukovane pluripotentne matične ćelije sa začuđujuće visokom efikasnošću, a indukovane pluripotentne matične ćelije mogu se dalje diferencirati u hepatocite.
[0018] Kako se ovde koristi, pojam "embrionske matične ćelije" odnosi se na ćelije koje imaju pluripotenciju, koje se mogu izolovati i uzgajati iz unutrašnje ćelijske mase blastocista, prva faza razvoja posle oplodnje. Kako se ovde koristi, pojam "pluripotentne matične ćelije" odnosi se na matične ćelije koje imaju pluripotenciju, koje su sposobne da se diferenciraju u sva tri sloja klica (tj., endoderm, mezoderm i ektoderm) koje sačinjavaju telo.
[0019] Kako se ovde koristi, pojam "diferencijacija" odnosi se na postupak kojim ćelije postaju specijalizovanije u strukturi ili funkciji tokom ćelijskog rasta putem deljenja i proliferacije, tj., postupka kojim se ćelije, tkiva, i slično, živog tela menjaju u obliku ili funkciji kako bi se izveo zadati zadatak.
[0020] Kako se ovde koristi, pojam "proizvod ćelijske terapije," koji je farmaceutski lek koji se primenjuje u cilju lečenja, dijagnostikovanja, i prevencije primenom ćelija i tkiva proizvedenih izolovanjem od ljudi, uzgajanjem, i specifičnom manipulacijom, odnosi se na farmaceutski lek koji se koristi za lečenje, dijagnostikovanje, i prevenciju putem serija aktivnosti, kao što je menjanje bioloških osobina ćelija proliferacijom ili odabirom alogenetskih ili ksenogenetskih ćelija in vitro, ili nekim drugim sredstvima, a kako bi se povratile funkcije ćelija ili tkiva. Ti proizvodi ćelijske terapije široko su klasifikovani u somatski proizvod ćelijske terapije i proizvod terapije matičnim ćelijama, u skladu sa stepenom diferencijacije ćelija. Ovo otkrivanje naročito se odnosi na proizvod terapije matičnim ćelijama.
[0021] Mezenhimalne matične ćelije koje se koriste u ovom otkrivanju su ćelije izolovane iz embrionskih matičnih ćelija ili odraslih matičnih ćelija izvedenih od sisara. Mezenhimalne matične ćelije poželjno su mezenhimalne matične ćelije pupčane vrpce, a poželjnije humane mezenhimalne matične ćelije pupčane vrpce. Ove matične ćelije mogu se sakupiti iz pupčane vrpce koja povezuje fetus i placentu u ljudskom telu. Sakupljanje mezenhimalnih matičnih ćelija iz pupčane vrpce može se izvesti primenom raznih postupaka. Primera radi, rastvor koji sadrži mononuklearne ćelije može se dobiti sakupljanjem pupčane vrpce iz ljudskog tela, pranjem sakupljene pupčane vrpce sa DPBS do prestanka pojavljivanja krvi, sečenjem oprane pupčane vrpce upotrebom hirurškog sečiva, i inkubisanjem isečene pupčane vrpce na 37°C.
[0022] U nastavku, svaka faza postupka u skladu sa ovim otkrivanjem, biće detaljno opisana.
Faza a) dodavanja Ecklonia cava ekstrakta podlozi za uzgajanje ćelija
[0023] Ecklonia cava, aktivni sastojak sadržan u kompoziciji podloge ovog otkrivanja, je višegodišnja braon morska alga koja pripada redu Laminariales, familije Lessoniaceae, koje se uglavnom javljaju na južnoj obali, i u okeanu van Jeju-do i Ulleung-do, Koreja. Uglavnom je hrana za školjke i spiralne školjke, i slično, a koristi se kao glavna sirovina za pripremu alginske kiseline, joda, ili kalijuma, ili kao morska hrana.
[0024] Ecklonia cava ekstrakt sadržan u kompoziciji podloge ovog otkrivanja može se pripremiti ekstrahovanjem uz primenu vode ili organskog rastvarača, kao što su (a) anhidrovani ili hidrovani niži alkohol koji ima 1 do 4 atoma ugljenika (metanol, etanol, propanol, butanol, n-propanol, izopropanol i n-butanol, ili slično), (b) smeša rastvarača nižeg alkohola i vode, (c) aceton, (d) etil acetat, (e) hloroform, (f) 1,3-butilenglikol, (g) heksan, (h) dietil etar, ili slično. Poželjno, može se pripremiti ekstrahovanjem uz primenu smeše rastvarača metanola ili etanola sa vodom. Kada se priprema ekstrahovanjem sa smešom rastvarača, sadržaj metanola ili etanola u smeši rastvarača poželjno je 50 do 80 vol./vol.%.
[0025] Nedavno, povećan je broj primera primene Ecklonia cava ekstrakta u kompozicijama za kožu kao što su kozmetički preparati (videti otvorene korejske patetne prijave Br.2013-0017159, 2012-0040488 i 2010-0097293, itd.). Međutim, primer primene Ecklonia cava ekstrakta u podlozi za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija još uvek nije prijavljen.
[0026] Kako se ovde koristi, pojam "podloga" odnosi se na mešavinu za in vitro uzgajanje ili diferencijaciju ćelija kao što su matične ćelije, koja sadrži komponente od suštinskog značaja za rast i proliferaciju ćelija, kao što su šećer, aminokiseline, razni nutrijenti, serum, faktori rasta, minerali, i slično.
[0027] Razne podloge prodaju se na tržištu ove struke, a podloga može biti i veštački pripremljena i korišćena. Podloge na tržištu uključuju neke kao Dulbecco-ova modifikovana Eagle-ova podloga (DMEM), Minimalna esencijalna podloga (MEM), Osnovna podloga Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-Minimalna esencijalna podloga (α-MEM), Glasgow-ova minimalna esencijalna podloga (G-MEM), Iscove-ova modifikovana Dulbecco-ova podloga (IMPM), AmnioMax kompletna podloga, AminoMaII kompletna podloga (Gibco, New York, USA), Chang-ova podloga, MesemCult-XF podloga (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada), i slično. Ove podloge, kao i podloge koje se mogu veštački proizvesti, mogu se primeniti kao osnovna podloga koja je sadržana u kompoziciji podloge ovog otkrivanja.
[0028] Komponenta seruma (npr., fetalni goveđi serum (FBS)), antibiotika (npr., penicilin, streptomicin), i slično, koje se obično dodaju, mogu se dodati osnovnoj podlozi. Koncentracija komponente seruma ili komponente antibiotika u osnovnoj podlozi može da varira unutar opsega kojim se postiže efekat ovog otkrivanja. Poželjno, osnovna podloga može da sadrži 10% FBS, 100 jedinica/mL penicilina, 50 µg/mL streptomicina, i slično.
[0029] Dodatno, podloga ovog otkrivanja može dalje da sadrži mešavinu nutrijenata. Mešavina nutrijenata je mešavina koja obuhvata razne aminokiseline, vitamine, mineralne soli, i slično, koje se generalno koriste u uzgajanju ćelija. Mešavina nutrijenata može se pripremiti mešanjem aminokiselina, vitamina, mineralnih soli, i slično, ili se može koristiti komercijalno pripremljena mešavina nutrijenata. Primeri komercijalno pripremljenih mešavina nutrijenata uključuju, ali se ne ograničavaju na, M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302, i slično.
[0030] Dodatno, podloga ovog otkrivanja može dalje da sadrži energetsku vodu za indukovanje i stabilizaciju pluripotentnih matičnih ćelija. Ta energetska voda može biti sadržana poželjno u količini od 0.01 do 10 vol./vol.%, poželjnije 0.05 do 0.5 vol./vol.%.
[0031] Kompozicija podloge ovog otkrivanja je podloga specifična za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija, i može se pripremiti dodavanjem Ecklonia cava ekstrakta osnovnoj podlozi. Kompozicija podloge može poželjno da sadrži Ecklonia cava ekstrakt u koncentraciji od 1 do 1,000 µg/mL, poželjnije 100 do 400 µg/mL, u odnosu na ukupnu kompoziciju podloge.
Faza b) dediferencijacije mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije [0032] Zatim, mezenhimalne matične ćelije diferenciraju se u indukovane pluripotentne matične ćelije primenom gore opisane podloge.
[0033] U jednom primeru ovog otkrivanja, može biti zapaženo da kada se primenjuje kompozicija podloge koja sadrži Ecklonia cava ekstrakt u skladu sa ovim otkrivanjem, kolonije pluripotentnih matičnih ćelija formiraju se na dan 8 do 10 (FIG.2 i 3), za razliku kada se koristi samo DMEM F-12 podloga.
[0034] Indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene u ovom otkrivanju imaju isti diferencijacioni potencijal kao embrionske matične ćelije, a takođe imaju suštinski isti oblik kao embrionske matične ćelije. U jednom primeru ovog otkrivanja, bilo koja karakteristika gena (Nanog, Oct4, Sox-2, i Klf) i proteina (SSEA4) embrionskih matičnih ćelija, koja bi mogla da se javi, bila je ispitana, i, kao rezultat, pokazano je da su ti geni i protein eksprimirani u indukovanim pluripotentnim matičnim ćelijama ovog otkrivanja na isti način kao u u embrionskim matičnim ćelijama (FIG.4).
Faza c) diferencijacije indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija u hepatocite
[0035] Zatim, indukovane pluripotentne matične ćelije koje su proizvedene kako je prethodno opisano, diferenciraju se u hepatocite.
[0036] Diferencijacija indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija u hepatocite može se izvesti primenom raznih podloga za diferencijaciju poznatih u struci. Poželjno, diferencijacija se izvodi korišćenjem podloge za diferencijaciju koja sadrži deksametazon, transferin, natrijumselenit, insulin i faktor rasta. Poželjno, podloga za diferencijaciju sadrži 1-100 nM deksametazona, 1-10 µg/ml transferina, 1-50 ng/ml natrijumselenita, 1-50 µg/ml insulina i 10-500 ng/ml HGF ili FGF.
[0037] Kao osnovna podloga za podlogu za diferencijaciju, mogu se koristiti DMEM (Dulbecco-ova modifikovana Eagle-ova podloga), MEM (Minimalna esencijalna podloga), BME (Osnovna podloga Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-MEM (α-Minimalna esencijalna podloga), G-MEM (Glasgow-ova minimalna esencijalna podloga), IMPM (Iscove-ova modifikovana Dulbecco-ova podloga), AmnioMax kompletna podloga, AminoMaxII kompletna podloga (Gibco, New York, USA), Chang-ova podloga, MesemCult-XF podloga (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) ili slično.
[0038] Indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene u ovom otkrivanju imaju istu pluripotenciju kao embrionske matične ćelije. U jednom primeru ovog otkrivanja, može biti zapaženo da indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene prema ovom otkrivanju, imaju pluripotenciju da se diferenciraju u ektoderm, mezoderm i endoderm (FIG.5).
[0039] Na taj način, indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene prema ovom otkrivanju, mogu efikasno da se diferenciraju u hepatocite.
[0040] U jednom primeru ovog otkrivanja, može biti zapaženo da ćelije koje se smatraju pluripotentnim matičnim ćelijama mogu da se diferenciraju u hepatocite (FIG.6).
[0041] U skladu sa još jednim aspektom ovog otkrivanja, obezbeđena je kompozicija ćelijske terapije koja obuhvata diferencirane hepatocite.
[0042] Kompozicija ćelijske terapije ovog otkrivanja može se davati bilo kojim putem, naročito, intraperitonealnim ili intratorakalnim putem, subkutanim putem, intravenoznim ili intraarterijalnim putem, intramuskularnim putem, topikalnim putem injekcijom, ili slično.
[0043] U ovom otkrivanju, kompozicija ćelijske terapije može se davati u obliku injektibilnog rastvora, suspenzije, emulzije, i slično, u skladu sa uobičajenim postupkom. Ukoliko je potrebno, kompozicija može biti suspendovana u adjuvansu kao što je kompletan Freund-ov adjuvans, ili se takođe mogu dati zajedno sa supstancom koja ima adjuvantnu aktivnost, kao što je BCG. Kompozicija može biti sterilisanaa, ili može da sadrži neki adjuvans, kao što je stabilizator, agens za hidrataciju, agens za ubrzavanje emulgovanja, ili so ili pufer za kontrolu osmotskog pritiska, i druge terapeutski korisne supstance. Kompozicija se može pripremiti primenom uobičajenog postupka mešanja, granulacije ili oblaganja. Kompozicija ćelijske terapije u skladu sa ovim otkrivanjem može da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač ili aditiv. Specifično, može da sadrži, pored aktivnog sastojka, razblaživač (npr., dekstroza, sorbitol, celuloza, glicin, laktota, saharoza, manitol), vezivo (npr., magnezijumaluminijumslilikat, skrobna pasta, tragakant guma, natrijum karboksimetilceluloza), sredstvo za razgradnju (npr., skrob, agar, alginska kiselina ili njena natrijumova so), mešavinu za ključanje i/ili apsorbent, zaslađivač, aromu, i boju.
[0044] Kompozicija ćelijske terapije u skladu sa ovim otkrivanjem može se primeniti na razne bolesti, i takođe se može primeniti kao alogenetski proizvod ćelijske terapije za ljude, na osnovu rezultata kliničkih ispitivanja na ljudima.
[Povoljni efekti]
[0045] Karakteristike i prednosti ovog otkrivanja sumirani su kako sledi.
(i) Ovo otkrivanje obezbeđuje kompoziciju podloge za dediferencijaciju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija, koja sadrži Ecklonia cava ekstrakt.
(ii) Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje postupak za diferencijaciju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija, proizvedenih primenom kompozicije podloge, u hepatocite.
(iii) Upotreba kompozicije podloge u skladu sa ovim otkrivanjem, omogućava da se indukovane pluripotentne matične ćelije efikasno proizvedu iz mezenhimalnih matičnih ćelija, a proizvedena pluripotentna matična ćelija može da se diferencira u hepatocite, i na taj način su korisni kao proizvod ćelijske terapije.
[Opis crteža]
[0046]
FIG.1 je prikaz da su pluripotentne matične ćelije koje su suštinski iste kao embrionske matične ćelije, indukovane kada se mezenhimalne matične ćelije uzgajaju primenom podloge koja sadrži podlugu sa Ecklonia cava ekstraktom.
FIG.2 prikazuje ekspresiju specifičnih proteina, što potvrđuje da su pluripotentne matične ćelije indukovane postupkom ovog otkrivanja pluripotentne matične ćelije.
FIG.3 prikazuje formiranje kolonija indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija, primenom raznih koncentracija Ecklonia cava ekstrakta u skladu sa postupkom ovog otkrivanja.
FIG.4 prikazuje ekspresiju gena kod pluripotentnih matičnih ćelija indukovanih postupkom ovog otkrivanja.
FIG.5 prikazuje rezultate ispitivanja in vivo diferencijacionog potencijala pluripotentnih matičnih ćelija indukovanih postupkom ovog otkrivanja.
FIG.6 prikazuje rezultate diferencijacije pluripotentnih matičnih ćelija, indukovanih postupkom ovog otkrivanja, u hepatocite i to primenom podloge za diferencijaciju hepatocita.
[Najbolji način ostvarivanja]
[0047] U nastavku, ovo otkrivanje biće detaljno opisano uz pozivanje na primere. Ovi primeri dati su samo u cilju detaljnijeg opisa ovog otkrivanja.
Primeri
Primer 1: Pripremanje Ecklonia cava ekstrakta
[0048] Biljni uzorak koji je upotrebljen u ovom eksperimentu kupljen je od Jeju-do, i upotrebljen je nakon precizne tačne procene.100 g osušenog biljnog uzorka dodato je u 1 L 70% metanola, ekstrahovan pod refluksom tokom 16 sati, i filtriran kroz filter papir. Filtrat je koncentrovan u rotacionom isparivaču pod sniženim pritiskom, a zatim odmah osušen zamrzavanjem.
Primer 2: Izolovanje i uzgajanje mezenhimalnih matičnih ćelija iz ljudske pupčane vrpce
Primer 2-1: Sakupljanje ljudske pupčane vrpce
[0049] Tkivo pupčane vrpce sakupljeno je odmah posle porođaja. Pre nego što je uzorak tkiva prebačen u laboratoriju, ispran je do čistoće, a zatim odmah prebačen u 500 mL sterilizovanu staklenu bocu koja sadrži F-12 podlogu i podlogu za transport (50 IU/mL penicilina, 50 µg/mL streptomicina (kupljen od Invitrogen)). U laboratoriji, ekstrakcija matičnih ćelija izvedena je u protočnom kabinetu (Klasa 100) pod sterilnim uslovima. Uzorak je prvo transferovan u sterilni kontejner od nerđajućeg čelika. Uzorak tkiva pupčane vrpce opran je nekoliko puta primenom PBS, zatim isečen na 2 cm duge komade i transferovan u sud za uzgajanje ćelija, prečnika 10 cm. Tu, uzorak je dodatno opran i podvrgnut anti-infektivnim tretmanom primenom 70% etanola, i opran nekoliko puta primenom PBS koji sadrži mešavinu antibiotika (50 IU/mL penicilina, 50 µg/mL streptomicina (kupljen od Invitrogen)) do dobijanja čistog rastvora.
Primer 2-2: Izolovanje matičnih ćelija iz ljudske pupčane vrpce i njihovo uzgajanje
[0050] Da bi se izolovao Wharton-ov želatin (osnova pupčane vrpce) iz krvnih sudova i drugih unutrašnjih elemenata pupčane vrpce, pupčana vrpca se prvo zaseca. Nakon uklanjanja krvnih sudova, izolovani Wharton-ov želatin se seče na male komade (0.5 cm x 0.5 cm) kako bi se ekstrahovale ćelije.
[0051] Eksplantovanje je izvedeno smeštanjem komada Wharton-ovog želatina iz pupčane vrpce u različite sudove za uzgajanje tkiva, koji imaju uslove za uzgajanje ćelija pogodne za ekstrakciju epitelnih matičnih ćelija ili mezenhimalnih matičnih ćelija.
[0052] Da bi se izolovale i uzgajale mezenhimalne matične ćelije, eksplantovano tkivo dodato je u 5 mL Dulbecco-ove modifikovane Eagle-ove podloge (DMEM) F-12 (Gibco) dopunjene sa 10% fetalnim goveđim serumom (FBS, Hyclone), 10% FBS, 100 jedinica/mL penicilina i 50 µg/mL streptomicina, i održavana u CO2inkubatoru na 37°C. Podloga je zamenjena svaka tri ili četiri dana. Rast ćelija praćen je optičkim mikroskopom. Ćelije koje rastu tretirane su tripsinom (0.125% tripsin/0.05% EDTA) radi daljeg širenja i zamznutog skladištenja (primenom DMEM/10% FBS).
[0053] Podloga je zamenjena svaka tri ili četiri dana. Rast ćelija iz eksplantovanog tkiva praćen je optičkim mikroskopom.
[0054] Kako bi se ekstrahovale mezenhimalne matične ćelije, peleti ćelija su resuspendovani u podlozi DMEM F-12 (Gibco), 10% FBS, 100 jedinica/mL penicilina, i 50 µg/mL streptomicina i izbrojane. Zatim, ćelije su inokulisane u 10-cm posudama za uzgajanje tkiva pri gustini od 1 x 10<6>ćelije/posuda. Podloga je zamenjena svaka tri ili četiri dana. Rast ćelija i formiranje kolonija praćeno je optičkim mikroskopom. Na konfluenciji od oko 90%, ćelije su pod-uzgajane kako je prethodno opisano.
Eksperimentalni Primer 1: Indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija iz mezenhimalnih matičnih ćelija
Eksperimentalni Primer 1-1: Proizvodnja pluripotentnih matičnih ćelija od humanih mezenhimalnih matičnih ćelija primenom raznih koncentracija Ecklonia cava ekstrakta
[0055] Izveden je eksperiment za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija iz matičnih ćelija ljudske pupčane vrpce, primenom raznih koncentracija Jeju Ecklonia cava ekstrakta. Za kontrolnu grupu, upotrebljena je podloga za MSC uzgajanje DMEM F-12 (Gibco) (koja sadrži 10% FBS, 100 jedinica/mL penicilina, i 50 µg/mL streptomicina) kao osnovna podloga. Za eksperimentalnu grupu, 1 µg/mL, 10 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL, 800 µg/mL i 1000 µg/mL Jeju Ecklonia cava ekstrakta, i 0.1 vol./vol.% energetske vode (prečišćena dejonizovana voda koja sadrži SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O, i LiO; STC Nara Co., Ltd., Korea), dodati su podlozi sa humanim mezenhimalnim matičnim ćelijama pupčane vrpce, koje su poduzgajane tri puta (FIG.1). Humane mezenhimalne matične ćelije pupčane vrpce su izolovane i oprane, a dobijene mononuklearne ćelije inokulisane su u pločama (sudovima) sa 6-bazenčića pri gustini od 1 x 10<4>ćelija i uzgajane pod uslovima od 37°C i 5% CO2.
1
[0056] Za pluripotentne matične ćelije indukovane postupkom ovog otkrivanja, ekspresije OCT4, SOX2 i za fazu-specifičan embrionski antigen4 (SSEA4), koji su proteini specifični za embrionske matične ćelije, analizirani su imunohemijskim bojenjem primenom antitela protiv tih proteina. Za bojenje, ćelije su fiksirane 4% paraformaldehidom, oprane upotrebom PBS, i blokirane 1% BSA rastvorom. Zatim, ćelije su tretirane primarnim antitelima protiv OCT4, SOX3 i SSEA4 i inkubisane na 4°C tokom 18 sati. Zatim, ćelije su oprane upotrebom PBS, i tretirane fluorescenciono (FITC)-obeleženim sekundarnim antitelima protiv primarnih antitela i inkubisane na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Nakon pranja primenom PBS, ekspresija proteina je analizirana primenom konfokalnog mikroskopa, a rezultati te analize prikazani su na FIG.2. Na FIG.2, BF ukazuje na svetlo polje, druga slika ukazuje na rezultate bojenja za ekspresiju svakog proteina, a treća slika ukazuje na spajanje ove dve slike (FIG.2).
[0057] Kao rezultat, u eksperimentalnoj grupi, zapaženo je da samo kada je koncentracija Jeju Ecklonia cava ekstrakta bila između 100 i 400 µg/mL, kolonije su formirane nakon 10 dana (FIG.3). Dalje, OCT4, SOX2 i SSEA4, koji su markeri specifično za pluripotentne matične ćelije, obojeni su samo u kolonijama, što sugeriše da su ćelije indukovane postupkom ovog otkrivanja, pluripotentne matične ćelije.
Eksperimentalni Primer 1-2: Analiza i poređenje gena pluripotentnih matičnih ćelija
[0058] Kolonije su odvojene od pluripotentnih matičnih ćelija (proizvedene u gornjem Primeru 2-1) primenom 200 µl pipete posmatranjem pluripotentnih matičnih ćelija mikroskopom, a zatim je ukupna RNK izolovana primenom TRIzol reagensa (proizveden od strane Invitrogen). cDNK je sintetizovana primenom lančane reakcija reverzne transkripcijske polimeraze (RT-PCR), a zatim je PCR izvedena primenom prajmera specifičnih za OCT4, Sox-2, Nanog, c-Myc, i kontrolnog gena gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH). Nanog, OCT4 i Sox-2 su karakteristični geni koji se javljaju u embrionskim matičnim ćelijama, a c-Myc gen je nespecifičan gen koji može biti pozitivan i kod embrionskih matičnih ćelija i kod odraslih matičnih ćelija. PCR proizvodi analizirani su elektroforezom na gelu agaroze da bi se potvrdila ekspresija ovih gena, a rezultati te analize prikazani su na FIG.4. Pozivajući se na FIG.4, nivo ekspresije OCT4, koji je karakterističan gen pluripotentnih matičnih ćelija, bio je nizak kod mezenhimalnih matičnih ćelija koje nisu prošle kroz postupak indukovanja, dok su nivoi ekspresije karakterističnih gena bili znatno visoki kod pluripotentnih matičnih ćelija (STC2013-F002) indukovanih postupkom ovog otkrivanja. SOX2 i Nanog, koji su geni matičnih ćelija, eksprimirani su u sličnim nivoima, a nivo ekspresije za c-Myc, nespecifičan gen, bio je niži kod ćelija (STC2013-F002) koje su prošle kroz postupak indukovanja, u odnosu na ćelije koje nisu prošle kroz postupak indukovanja.
Eksperimentalni Primer 2: Identifikacija pluripotentnih matičnih ćelija primenom Teratoma Testa [0059] Kako bi se analizirao in vivo diferencijacioni potencijal pluripotentnih matičnih ćelija indukovanih postupkom ovog otkrivanja, nediferencirane kolonije pluripotentnih matičnih ćelija uzgajane na nosećim

Claims (7)

  1. ćelijama odvojene su tretiranjm tripsin-EDTA na dan 5 uzgajanja, a zatim su dodate kolagenazi i održavane u inkubatoru tokom 30 minuta. Nediferencirane pluripotentne matične ćelije su izdvojene, i 1 x 10<6>ćelija subkutano je injektovano miševima sa teškom kombinovanom imunološkom deficijencijom (SCID). Posle 4 nedelje, formirani teratomi su sakupljeni, fiksirani 4% paraformaldehidom, i smešteni u parafin u skladu sa uobičajenim postupkom. Tkivo je sekcionisano na debljinu od 10 µm i obojeno hematoksilinom i eozinom.
    [0060] Pozivajući se na FIG.5, može se zapaziti da je teratom vidljivo formiran u oblasti u kojoj su ubrizgane indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene postupkom ovog otkrivanja. Specifično, histološki je pokazano da su formirani teratomi koji su sposobni da se diferenciraju u nervno tkivo izvedeno iz ektooderma (FIG.5a), mišićno tkivo izvedeno iz mezoderma (FIG.5b), i želudačno tkivo izvedeno iz endoderma (kolonasti epitel, FIG.5c). Kroz eksperiment, može se potvrditi da ćelije indukovane postupkom ovog otkrivanja suštinski imaju isti in vivo diferencijacioni potencijal kao embrionske matične ćelije, tj., pluripotenciju da se diferenciraju u ektoderm, mezoderm, i endoderm.
    Eksperimentalni Primer 3: Dediferencijacija u hepatocite
    [0061] Kako bi se indukovala diferencijacija u hepatocite, mezenhimalne matične ćelije su uzgajane u inkubatoru pod uslovima od 95% vlažnosti, 37 °C i 5% CO2upotrebom podloge koja obuhvata mešavinu Ecklonia cava ekstrakta i energetsku vodu, čime su indukovane pluripotentne matične ćelije iz mezenhimalnih matičnih ćelija. Zatim, ćelije su uzgajane u podlozi DMEM F-12 za diferencijaciju hepatocita (koja sadrži 20nM deksametazona, 5.5 µg/ml transferina, 7 ng/ml natrijumselenita, 100 ng/ml HGF, 50 ng/ml FGF, 10 µg/ml insulina, tokom 2 nedelje. Kako bi se verifikovala diferencijacija u hepatocite, izvedeno je imunohistohemijsko bojenje α-fetroteinom. Kao rezultat, kako je prikazano na FIG.6, ćelije su bile negativne na α-fetrotein pre tretiranja podlogom za diferencijaciju (FIG.6A i 6B), a pozitivne na α-fetrotein nakon tretiranja podlogom za diferencijaciju (FIGS.6C i 6D), što sugeriše da se ćelije koje se smatraju pluripotentnim matičnim ćelijama, mogu diferencirati u hepatocite.
    Patentni zahtevi
    1. Postupak za diferencijaciju mezenhimalnih matičnih ćelija u hepatocite, koji obuhvata faze:
    (a) dodavanja Ecklonia cava ekstrakta podlozi za uzgajanje ćelija;
    (b) dediferencijacije mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u podlozi; i
    (c) diferencijacije indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija u hepatocite.
  2. 2. Postupak prema zahtevu 1, u kojem se Ecklonia cava ekstrakt dodaje podlozi odabranoj iz grupe koju čine DMEM (Dulbecco-ova modifikovana Eagle-ova podloga), MEM (Minimalna esencijalna podloga), BME (Osnovna podloga Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM (α-Minimalna esencijalna podloga), G-MEM (Glasgow-ova minimalna esencijalna podloga), IMDM (Iscove-ova modifikovana Dulbecco-ova podloga), MacCoy-ova 5A podloga, AmnioMax kompletna podloga, AminoMaxII kompletna podloga, Chang-ova podloga i MesemCult-XF podloga.
  3. 3. Postupak prema zahtevu 1, u kojem se Ecklonia cava ekstrakt dodaje podlozi u količini od 100-400 µg/ml.
  4. 4. Postupak prema zahtevu 1, u kojem podloga dalje sadrži 0.01-10 vol./vol.% prečišćene dejonizovane vode koja sadrži SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O, i LiO.
  5. 5. Postupak prema zahtevu 1, u kojem se faza c) izvodi korišćenjem podloge koja sadrži deksametazon, transferin, natrijumselenit, insulin i faktor rasta.
  6. 6. Postupak prema zahtevu 5, u kojem podloga sadrži 3-izobutil-1-metilksantin, hidrokortizon i indometacin u podlozi koja se bira iz grupe koju čine DMEM (Dulbecco-ova modifikovana Eagle-ova podloga), MEM (Minimalna esencijalna podloga), BME (Osnovna podloga Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM (α-Minimalna esencijalna podloga), G-MEM (Glasgow-ova minimalna esencijalna podloga), IMDM (Iscove-ova modifikovana Dulbecco-ova podloga), MacCoy-ova 5A podloga, AmnioMax kompletna podloga, AminoMaxII kompletna podloga, Chang-ova podloga i MesemCult-XF podloga.
  7. 7. Upotreba kompozicije podloge koja obuhvata Ecklonia cava ekstrakt za dediferencijaciju mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotencione matične ćelije, pri čemu te indukovane pluripotencione matične ćelije mogu da se diferenciraju u hepatocite.
    1
RS20200314A 2013-11-01 2013-11-05 Postupak za diferencijaciju pluripotentne matične ćelije indukovane iz mezenhimalne matične ćelije u hepatocit RS60363B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130132058A KR101542849B1 (ko) 2013-11-01 2013-11-01 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 간세포로 분화시키는 방법
PCT/KR2013/009946 WO2015064802A1 (ko) 2013-11-01 2013-11-05 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 간세포로 분화시키는 방법
EP13896838.3A EP3064575B1 (en) 2013-11-01 2013-11-05 Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into hepatocyte

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60363B1 true RS60363B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=53004390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200314A RS60363B1 (sr) 2013-11-01 2013-11-05 Postupak za diferencijaciju pluripotentne matične ćelije indukovane iz mezenhimalne matične ćelije u hepatocit

Country Status (18)

Country Link
US (1) US10072248B2 (sr)
EP (1) EP3064575B1 (sr)
JP (1) JP6711757B2 (sr)
KR (1) KR101542849B1 (sr)
CN (1) CN105683359B (sr)
AU (1) AU2013403885B2 (sr)
CY (1) CY1122791T1 (sr)
DK (1) DK3064575T3 (sr)
ES (1) ES2776183T3 (sr)
HR (1) HRP20200474T1 (sr)
HU (1) HUE048804T2 (sr)
LT (1) LT3064575T (sr)
PL (1) PL3064575T3 (sr)
PT (1) PT3064575T (sr)
RS (1) RS60363B1 (sr)
SI (1) SI3064575T1 (sr)
SM (1) SMT202000129T1 (sr)
WO (1) WO2015064802A1 (sr)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3064572T3 (pl) 2013-11-01 2020-07-13 Bbhc Co. Ltd. Sposób wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z mezenchymalnych komórek macierzystych i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste wytworzone tym sposobem
KR101699761B1 (ko) * 2014-05-23 2017-01-25 주식회사 비비에이치씨 플로로탄닌 분획물을 이용한 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법
KR102018783B1 (ko) * 2015-08-13 2019-09-06 (주) 넥셀 간세포의 약물대사 기능 향상방법
CN105385651B (zh) * 2015-12-11 2019-06-14 湖南光琇高新生命科技有限公司 诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞
WO2018093233A1 (ko) 2016-11-21 2018-05-24 성균관대학교산학협력단 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 예방 또는 치료용 조성물
KR20180057546A (ko) 2016-11-21 2018-05-30 성균관대학교산학협력단 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 예방 또는 치료용 조성물
WO2020013719A1 (en) * 2018-07-10 2020-01-16 Uniwersytet Jagielloński Stem cell culture method using plant secretion
US20220184134A1 (en) 2018-12-14 2022-06-16 Thothscience Inc. Pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease, comprising bioimplant comprising mesenchymal stem cells
CA3175071A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Bit Bio Limited Method of generating hepatic cells
USD1055993S1 (en) 2023-01-02 2024-12-31 Samsung Electronics Co., Ltd. Refrigerator
USD1092573S1 (en) 2023-10-16 2025-09-09 Samsung Electronics Co., Ltd. Refrigerator

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100135970A1 (en) * 2006-10-27 2010-06-03 Caritas St. Elizabeth Medical Center Of Boston, In Methods for Reprogramming Adult Somatic Cells and Uses Thereof
KR20100001940A (ko) 2008-06-28 2010-01-06 최송화 마우스 내장용 키보드
WO2010014949A2 (en) * 2008-07-31 2010-02-04 The General Hospital Corporation Compositions comprising hepatocyte-like cells and uses thereof
KR101016761B1 (ko) 2009-02-26 2011-02-25 부경대학교 산학협력단 피부 미백활성을 갖는 감태 추출물
KR101073523B1 (ko) 2009-03-10 2011-10-17 (주)나우이앤씨 비개착식 터널 굴착 방법 및 이에 사용되는 터널시공구조체
US20120190059A1 (en) * 2009-07-23 2012-07-26 Beijing Huayuanbochuang Technology Co., Ltd. Methods for obtaining hepatocytes, hepatic endoderm cells and hepatic progenitor cells by induced differentiation
JP2012210154A (ja) * 2009-08-03 2012-11-01 Keio Gijuku 分化細胞由来多能性幹細胞の樹立方法
WO2011037301A1 (ko) * 2009-09-22 2011-03-31 서울대학교병원 성체세포로부터 만능줄기세포를 유도하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 만능줄기세포
KR20110079436A (ko) 2010-03-29 2011-07-07 (주) 세이텍 오토틸트형 휴대폰 슬라이딩 힌지
KR20120040488A (ko) 2010-10-19 2012-04-27 충남대학교산학협력단 곰피와 감태 추출물 유래의 플로로탄닌을 포함하는 화장품 조성물
KR101887956B1 (ko) 2011-08-10 2018-08-13 (주)아모레퍼시픽 효소 처리 감태 추출물을 포함하는 피부 미백용 조성물
CN102286532B (zh) * 2011-09-05 2012-10-17 浙江大学 一种获得诱导性多能干细胞的方法
KR101408106B1 (ko) * 2011-12-30 2014-06-19 박영준 줄기세포 분화능 개선용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013403885A1 (en) 2016-06-23
KR101542849B1 (ko) 2015-08-10
EP3064575B1 (en) 2020-02-26
PL3064575T3 (pl) 2020-08-10
AU2013403885B2 (en) 2018-04-05
WO2015064802A1 (ko) 2015-05-07
EP3064575A1 (en) 2016-09-07
SMT202000129T1 (it) 2020-05-08
SI3064575T1 (sl) 2020-08-31
LT3064575T (lt) 2020-06-10
KR20150050864A (ko) 2015-05-11
ES2776183T3 (es) 2020-07-29
US10072248B2 (en) 2018-09-11
JP6711757B2 (ja) 2020-06-17
CY1122791T1 (el) 2021-05-05
JP2016537022A (ja) 2016-12-01
US20160272936A1 (en) 2016-09-22
EP3064575A4 (en) 2017-07-26
HRP20200474T1 (hr) 2020-10-02
CN105683359B (zh) 2021-08-03
PT3064575T (pt) 2020-04-02
CN105683359A (zh) 2016-06-15
DK3064575T3 (da) 2020-03-16
HUE048804T2 (hu) 2020-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS60363B1 (sr) Postupak za diferencijaciju pluripotentne matične ćelije indukovane iz mezenhimalne matične ćelije u hepatocit
US10000735B2 (en) Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into neuron
US9994820B2 (en) Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into chondrocyte
US10494603B2 (en) Method for differentiating a pluripotent stem cell induced from a mesenchymal stem cell into an adipocyte
US10053669B2 (en) Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into osteoblast
US9938504B2 (en) Method for producing induced pluripotent stem cell from mesenchymal stem cell and induced pluripotent stem cell produced by the method
KR20150050823A (ko) 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포