RS60412B1 - Modulacija aktivnosti heparin-vezujućeg epidermalnog faktora rasta radi zarastanja bubne opne - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Perforacija bubne opne (BO) najčešće nastaje kao rezultat zapaljenja srednjeg uha, ili usled traume. Klinički najčešće manifestacije perforacije BO su konduktivni gubitak sluha i hronična infekcija. Najčešći uzrok perforacije BO je infekcija. Perforacije povezane sa nekomplikovanim akutnim zapaljenjem srednjeg uha su obično male; velika većina zaraste spontano nakon što se infekcija smiri. Pored toga, velike perforacije mogu biti posledica infekcije nekrotizujućim organizmima. Trauma uha je drugi glavni uzrok perforacija BO. Česti uzroci povreda su tupe i prodorne povrede, brze promene barometrijskog pritiska (barotrauma) i prekomerni akustični pritisak.

[0002] Nakon povrede poznato je da tkivo prolazi kroz nekoliko faza zarastanja. Iako zarastanje rana na bubnoj opni uključuje početne faze hemostatike i zapaljenja koje su slične uobičajenom zarastanju kože, proliferativna i migratorna faza bubne opne se jasno razlikuju od onih u ostalim tkivima. U većini situacija zarastanja rana formira se sloj granulacijskog tkiva, koji služi kao platforma na kojoj dolazi do reepitelizacije. Pri zarastanju bubne opne ovi događaji se odvijaju obrnuto. Skvamozni epitelni sloj u početku formira most preko rane, a tek nakon toga sledi ponovno formiranje vlaknaste komponente. BO je jedinstvena po tome što epidermalni sloj igra kritičnu početnu ulogu u migraciji, pri čemu bazalni proliferativni sloj kontroliše ovaj proces.

[0003] Većina perforacija bubne opne spontano zaraste, ali određeni broj faktora može odložiti ili sprečiti zatvaranje, što rezultuje hroničnom perforacijom. Trajne perforacije se obično javljaju u okolnostima uporne infekcije koja narušava proces reparacije. U tim situacijama, proces regeneracije opne se ometa, sprečavajući hemotaksiju i posledičnu migraciju epitela preko rane. Histološki, kod hroničnih perforacija, skvamozni epitel raste preko ivice perforacije kako bi se susreo sa medijalnim mukoznim slojem BO.

[0004] Tretman hronične perforacije BO kao ciljeve uključuje tretman ili sprečavanje hroničnog zapaljenja srednjeg uha i obnavljanje sluha. Konvencionalna terapija uključuje upotrebu transplanta tkiva, npr. autografti koji se koriste u timpanoplastici mogu koristiti temporalis fasciju kao autograft. Može se koristiti površna temporalna fascija sastavljena od fibroblasta u kolagenoj matrici. Iako je timpanoplastika sa autolognim graftom vezivnog tkiva izuzetno uspešan postupak za popravljanje upornih perforacija BO, bilo bi korisno razviti postupak koji ne zahteva mikrohirurške veštine, jeftiniji je i može se primeniti u kancelarijskim uslovima. Predmetni pronalazak se bavi ovom potrebom.

Publikacije

[0005] Santa Maria i dr. (2010) J Mol Histol. 2010 Dec; 41 (6):309-14. Santa Maria (2011) Thesis, University of Westarn Australia. Johnson i Wang (2013) J Control Release 166(2):124-9. Ishihara i dr. (2003) J Biomed Mater Res A. 64(3):551-9. Tolino i dr. (2011) Biochim Biophys Acta. 1810(9):875-8; Shirakata i dr. (2005) J Cell Sci. 118(Pt 11):2363-70; Hüttenbrink (2005) HNO 53(6):515-6; Ma i dr. (2002) Acta Otolaryngol.122(6):586-99. WO 2007/037514. US 2010/0222265

SAŽETAK PRONALASKA

[0006] Sastavi i postupci su pruženi za tretman hronične perforacije bubne opne. U postupcima predmetnog pronalaska, hronično perforirana bubna opna se lokalno dovodi u dodir sa efektivnom dozom heparinvezujućeg epidermalnog faktora rasta, HB-EGF, ili agensa koji ima HB-EGF aktivnost, tokom perioda koji je dovoljan da omogući poboljšanje zarastanja perforacije opne. U nekim otelotvorenjima doza HB-EGF je data u formulaciji sa produženim oslobađanjem; u drugim otelotvorenjima omogućena je redovna primena formulacije bez produženog oslobađanja. U nekim otelotvorenjima, formulacija sa produženim oslobađanjem je biorazgradiva. U drugim otelotvorenjima, produženo oslobađanje pruža uređaj, npr. pumpa ili drugi uređaj za oslobađanje.

[0007] BO koja se tretira je u dodiru sa HB-EGF tokom perioda koji je dovoljan da se poboljša zarastanje perforacije BO, tj. da dovede do značajnog zatvaranja perforacije, npr. do perforacije površine manje od oko 0,1 mm<2>. Zatvaranje se može posmatrati vizuelno, uključujući mikroskopski; funkcionalno, npr. u smanjenju gubitka sluha; i slično. Period dodira sa HB-EGF može biti najmanje jedan dan, najmanje 3 dana, najmanje 5 dana, najmanje 7 dana, najmanje 10 dana, najmanje 2 nedelje, najmanje 3 nedelje; i može biti do jednog dana, do 3 dana, do 5 dana, do 7 dana, do 10 dana, do 2 nedelje, do 3 nedelje ili više, u skladu sa potrebama pojedinca.

[0008] U određenim specifičnim otelotvorenjima, efektivna doza HB-EGF je data u ne-ototoksičnoj formulaciji sa produženim oslobađanjem, npr. gel, pena, uložak, itd., I poželjno biorazgradiva formulacija. U jednom takvom otelotvorenju, efektivna doza HB-EGF je formulisana u gelu koji sadrži hitozan, polimlečnu kiselinu i fibrinogen.

[0009] U jednoj otelotvorenju, pronalazak sadrži postupak (i) identifikovanja pacijenta koji ima hroničnu perforaciju BO; (ii) dovođenje u dodir pogođene BO sa delotvornom dozom HB-EGF, npr. pruženom u obliku kapi koje se primenjuju u odgovarajućim intervalima, u uređaju za produženo oslobađanje HB-EGF, u formulaciji sa produženim oslobađanjem, itd.; i (iii) praćenje pojedinca radi utvrđivanja efektivnog zatvaranja perforacije.

[0010] Naredni aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu agensa sa HB-EGF aktivnosti u proizvodnji leka za tretman hronične perforacije BO, gde se lek primenjuje pacijentu sa hroničnom perforacijom BO u periodu i dozi dovoljnoj za izvršenje zatvaranja perforacije.

[0011] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska pruža komplet za tretman hronične perforacije BO. Komplet uključuje formulaciju koja pruža efektivnu dozu HB-EGF, npr. u obliku kapi, uređaja, formulacija i slično. Komplet može takođe da sadrži uređaj za isporuku, npr. raspršivač za uho, špric za isporuku formulacije, dvokomorni špric za isporuku formulacije iz dva dela; i slično. Komplet takođe može da sadrži uputstva za upotrebu.

[0012] U drugim otelotvorenjima, pruženi su postupci za privremeno otvaranje bubne opne, npr. za ubacivanje cevi i slično. U takvim otelotvorenjima, BO je u dodiru sa efektivnom dozom HB-EGF inhibitora uključujući, bez ograničavanja, inhibitor izlivanja EGFR liganda tokom perioda koji je dovoljan da stvori malu perforaciju u BO. U nekim takvim otelotvorenjima, mala perforacija može biti mehanički napravljena pre dodira sa inhibitorom.

KRATAK OPIS SLIKA

[0013]

Slika 1. Reprezentativne slike BO nakon perforacije tretirane sa OSU8-1 (inhibitor izlivanja EGFR liganda) na (a) dan 2 (b), dan 14 (c), dan 44 (d), dan 90 (3 meseca). Perforacija je istaknuta plavom bojom.

Slika 2. AEP i DPOAE pragovi su mereni 60 dana nakon što su obe bubne opne hirurški perforirane kod 9 miševa. Jedno uho nije imalo injekciju (kontrola), dok je suprotno uho napunjeno polimerom za isporuku hitozana, fibrinogena i polilaktida.

Slika 3. ET pre (a) i posle (b) okluzije gutaperkom. Postupak kod pacova prilagođen je otvaranjem mehura koristeći uređaj za graviranje sa 0,5 mm nabojem. Otvaranje mehura bočno omogućava puštanje gutaperke niz ET uz manje povlačenje vazdušnih puteva. ET su pregledani posmrtno, potvrđujući potpunu okluziju.

Slika 4. GF tretman hroničnih perforacija u mišjem modelu okluzije ET. Gornji red (a) su reprezentativne slike grupe za tretman koje prikazuju zarasle perforacije. Donji red (b) su reprezentativne slike kontrolne (samo polimerne) grupe koje pokazuju upornu perforaciju (obris plave boje). Napomena: neke BO u gornjem redu su izlečene od timpanoskleroze.

Slika 5. Isporuka trans-bubnog faktora rasta

Slika 6. Isporuka trans-bubnog faktora rasta

Slika 7. Isporuka trans-bubnog faktora rasta

Slika 8. Isporuka intra-bubnog faktora rasta

Slika 9. Nosač za isporuku leka u blizinu bubne opne.

Slika 10. Formulacija za isporuku tečnog teka.

[0014] Karakteristike i mnoge druge prednosti pronalaska postaće bolje razumljive pozivanjem na naredni detaljan opis kada se uzme zajedno sa priloženim slikama.

DETALJAN OPIS OTELOTVORENJA

[0015] Pre nego što predmetni pronalazak bude opisan dalje, treba razumeti da pronalazak nije ograničen na konkretna otelotvorenja predmetnog pronalaska opisana u daljem tekstu, već se mogu napraviti varijacije pojedinih otelotvorenja tako da još uvek spadaju u obim priloženih patentnih zahteva. Takođe treba razumeti da je terminologija upotrebljena za svrhu opisivanja određenih otelotvorenja, i da nije namenjena ograničavanju. U ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju i pozivanje na množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0016] Tamo gde je dat raspon vrednosti, podrazumeva se da je pronalaskom obuhvaćena svaka međuvrednost, do desetine jedinice donje granice, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije, između gornje i donje granice tog raspona, kao i bilo koje druge navedene vrednosti ili međuvrednosti u navedenom rasponu. Gornja i donja granica ovih manjih raspona mogu nezavisno da budu obuhvaćene u manjim raspona, i takođe su obuhvaćene unutar pronalaska, i predmet su bilo kog specifično izuzetog ograničenju u navedenom rasponu. Kada navedeni raspon uključuje jednu ili obe granice, rasponi koji isključuju jedno ili oba obuhvaćena ograničenja takođe su obuhvaćeni u pronalasku.

[0017] Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao što je uobičajeno u struci kojoj predmetni pronalazak pripada. Iako se bilo koji postupak, uređaj i materijal sličan ili ekvivalentan opisanom ovde mogu koristiti u praksi ili ispitivanju pronalaska, ovde su opisani ilustrativni postupci, uređaji i materijali.

[0018] Sve ovde navedene publikacije uključene su referencama u svrhu opisivanja i obelodanjenja predmetnih komponenti pronalaska koje su opisani u publikacijama, i koje bi se mogle koristiti u vezi sa predmetno opisanim pronalaskom.

[0019] Predmetni pronalazak je opisan u smislu određenih otelotvorenja koje je pronašao ili predložio predmetni pronalazač, kako bi obuhvatio poželjne načine za izvođenje pronalaska. Stručnjaci u oblasti će uvideti da se, u svetlu predmetnog obelodanjenja, mogu izvršiti brojne modifikacije i promene u pojedinim primernim otelotvorenjima bez odstupanja od predviđenog obima pronalaska. Na primer, zbog biološke funkcionalne ekvivalencije, promene u strukturi proteina mogu se izvršiti bez uticaja na vrstu i količinu biološkog delovanja. Sve takve modifikacije su predviđene da budu obuhvaćene u obimu dodatih zahteva. Definicije

[0020] Izrazi korišćeni u ovoj specifikaciji uglavnom imaju svoje uobičajeno značenje u struci, u kontekstu predmetnog pronalaska i u specifičnom kontekstu gde se koristi svaki izraz. Određeni izrazi su diskutovani u daljem tekstu ili na drugom mestu u specifikaciji, kako bi se pružile dodatne smernice u opisu sastava i postupaka predmetnog pronalaska i načinu njihove izrade i upotrebe.

[0021] Pacijent. Pojedinci za tretman postupcima predmetnog pronalaska mogu biti bilo koje sisarske ili ptičje vrste, uključujući ljude. Životinje koje nisu ljudi uključuju, bez ograničenja, sisare, laboratorijske životinje poput miševa, pacova, zečeva, hrčaka, zamoraca, činčila itd.; domaće životinje kao što su psi i mačke; i domaće životinje poput ovaca, koza, svinja, konja i krava. Životinja koja nije čovek predmetnog pronalaska može biti sisar ili životinja koja sisar; kičmenjak ili beskičmenjak.

[0022] „Tretman“ pacijenta ili „tretiranje“ pacijenta za bolest ili stanje ovde znači smanjenje ili ublažavanje kliničkih simptoma bolesti ili stanja, kao što je hronična perforacija BO.

[0023] „Promovisati“, „poboljšati“ ili „unaprediti“ zarastanje bubne opne ili rane obično znači povećanje brzine kojom rana ili perforacija zarasta, ili smanjenje stepena zaostalog ožiljaka ili keloida ili nekrotičnog tkiva tokom ili nakon zarastanja rane ili perforacije.

[0024] „Rana“ je prekid ili diskontinuitet u strukturi organa ili tkiva, uključujući epitel, vezivno tkivo i mišićno tkivo. Primeri rana uključuju, ali nisu ograničeni na, rane na koži, modrice, čireve, rane od ležanja, posekotine, rasekotine, poderotine, punkcije, rane od psorijaze, perforacije bubne opne, abrazije rožnjače i prekide i opekotine.

[0025] „Lokalna“ primena se odnosi na nesistemsku lokalnu primenu aktivnog sastojka na površinu rane.

[0026] Bubna opna. Bubna opna je tanka membrana u obliku kupe koja odvaja spoljno uho od srednjeg uha kod ljudi i drugih sisara. Njena funkcija je prenošenje zvuka iz vazduha u slušnim košticama unutar srednjeg uha, i potom u ovalni prozor u pužnici ispunjenoj tečnošću. Dakle, ona na posletku pretvara i pojačava vibraciju u vazduhu u vibraciju u tečnosti. Čekić premošćuje jaz između bubne opne i ostalih slušnih koštica.

[0027] Postoje dva opšta regiona bubne opne: pars flacida i pars tensa. Pars flaccida se sastoji od dva sloja, relativno je krhka i povezana je sa disfunkcijom eustahijeve tube i holesteatomima. Veći pars tensa region sastoji se od tri sloja: kože, vlaknastog tkiva i sluzokože. On je relativno čvrst i predstavlja region koji je najčešće povezan sa perforacijama.

[0028] Ruptura ili perforacija BO može biti rezultat različitih trauma, infekcije i slično. Perforacije BO mogu dovesti do konduktivnog gubitka sluha (CHL) koji se kreće od zanemarljivog do 50 dB. Perforacije mogu varirati od regiona i lokacije, npr. prednja, zadnja ili obe; i po površini od oko 0,1 do oko 60 mm<2>, obično u rasponu od oko 2,5 do 10 mm<2>(pogledati Mehta i dr. (2006) Otol Neurotol. 27(2):136-143). Perforacija može biti akutna ili hronična. Akutna perforacija se uglavnom ne tretira, jer BO obično zarasta spontano. Međutim, kod nekih pojedinaca BO ne zarasta, što dovodi do hronične perforacije.

[0029] Hronična perforacija bubne opne. Perforacija koja ne zarasta u odsustvu tretmana, niti kada se tretira konvencionalnim postupcima, npr. sa antibiotskim tretmanom, može se smatrati hroničnom perforacijom. Stručnjaci će razumeti da mogu postojati razlike u dužini vremena potrebnom za zarastanje kod različitih pojedinaca, ali generalno perforacija koja se ne zaraste nakon do oko 3 meseca, nakon do oko 2 meseca, nakon do oko 1 meseca, može se klasifikovati kao hronično stanje.

[0030] Hronične ili rane koje ne mogu da zarastu su otvorene rane koje se ne uspevaju da epitelizuju i zatvore se u razumnom roku. Ove rane su klinički stagnirane i bez dokaza o daljem zatvaranju. Za hronične rane se može smatrati da nemaju odgovarajuće „startne“ signale. (Pogledati, na primer, Lorenz i Longaker, in Wounds: Biology, Pathology, and Management, Chapter 7, pp 77-88).

[0031] „Heparin-vezujući epidermalni faktor rasta“, kako se ovde koristi, odnosi se na endogeni sisarski, npr. ljudski, heparin-vezujući epidermalni faktor rasta, alelni heparin-vezujući epidermalni faktor rasta, funkcionalne konzervativne derivate heparin-vezujućeg epidermalnog faktora rasta, funkcionalne aktivne fragmente heparin-vezujućeg epidermalnog faktora rasta i homologe heparin-vezujućeg epidermalnog faktora rasta, kao što faktor rasta sličan heparin-vezujućem epidermalnom faktoru rasta. HB-EGF se takođe odnosi na varijantne oblika HB-EGF, npr. koje pružaju pojačanu aktivnost, povećanu stabilnost, veći prinos ili bolju rastvorljivost. Sastavi za upotrebu u postupcima predmetnog pronalaska mogu sadržati jednu ili koktel HB-EGF aktivnosti, npr. koja sadrži mnoštvo različitih HB-EGF molekula. Generalno aktivnost HB=-EGF, kako se ovde koristi, odnosi se na vezivanje za kognitivni receptor, aktivaciju receptora, biološke aktivnosti koje nastaju kao rezultat vezivanja i aktivacije receptora i slično.

[0032] HB-EGF je dominantni faktor rasta epitelizacije potreban za zarastanje kožnih rana. Mitogeni i migratorni efekti HB-EGF na keratinocite i fibroblaste promovišu dermalni oporavak i angiogenezu neophodnu za zarastanje rana i glavni su sastojak tečnosti rana. HB-EGF vezivanje na površini ćelije za heparan sulfat proteoglikane povećava sposobnosti promovisanja mitogena povećavajući brzinu zarastanja rana na koži, smanjuje vreme zarastanja ljudskog kožnog grafta i promoviše brzo zarastanje čira, opekotina i epidermalnih rana.

[0033] HB-EGF se sintetiše kao mitogeni i hemotaktični glikoprotein usidren membranom. HB-EGF je glikoprotein od 87 aminokiselina koji pokazuje visoko regulisano eksprimiranje gena. izlivanje ektodomena rezultuje rastvorljivim zrelim oblikom HB-EGF, koji utiče na mitogenost i hemotaktičke faktore za ćelije glatkih mišića i fibroblaste. Transmembranski oblik HB-EGF jedinstven je receptor za toksin difterije i funkcioniše u jukstakrinoj signalizaciji u ćelijama. Oba oblika HB-EGF učestvuju u normalnim fiziološkim procesima, kao i u patološkim procesima, uključujući progresiju i metastazu tumora, hiperplaziju organa i aterosklerotsku bolest. U svrhu pronalaska koristi se generalno rastvorljivi, zreli oblik proteina. Protein ili agens mogu biti značajno čisti, npr. bez drugih proteina, bez ćelijskog materijala, itd., obično najmanje oko 50%, najmanje, oko 75%, najmanje 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% čisti.

[0034] U poželjnom otelotvorenju, koristi se uglavnom čisti preparat ljudskog HB-EGF. HB-EGF se može kupiti u prečišćenom obliku, ili proizvesti prečišćavanjem komponente od ljudi ili drugih životinja, ili rekombinantnom proizvodnjom u ćelijama domaćina, uključujući prokariotske ćelije domaćina kao što su S. cerevisiae ili E. coli, i još poželjnije, sisarske ćelije domaćini, kao što su CHO ćelije. HB-EGF može biti ljudski divlji tip, sisarski homolog ili modifikovan/mutiran. Posebno se mogu koristiti fragmenti komponente koji zadržavaju bar deo željene aktivnosti komponente cele dužine.

[0035] U nekim otelotvorenjima HB-EGF je ljudski HB-EGF i sadrži aminokiselinsku sekvencu GenBank pristupni br.: L17032.1 GI 348175 ili GenBank pristupni br.: L17033.1 GI 34817 ili GenBank pristupni br.: L17032.1 GI 348175, uključujući naročito rastvorljive zrele oblike opisanih proteina.

[0036] „Funkcionalno-konzervativne varijante“ su proteini u kojima je dati aminokiselinski ostatak izmenjen bez izmene ukupne konformacije i funkcije proteina, uključujući, ali bez ograničavanja na, zamenu aminokiseline sa onom koja ima slična svojstva (kao što su npr. na primer, kisela, bazna, hidrofobna i slično). Aminokiseline sa sličnim svojstvima su dobro poznate u struci. Na primer, arginin, histidin i lizin su hidrofilne bazne aminokiseline i mogu biti zamenljive. Slično tome, izoleucin, hidrofobna aminokiselina, može biti zamenjen leucinom, metioninom ili valinom. Aminokiseline, osim onih koje su naznačene kao očuvane, mogu se razlikovati u proteinu ili enzimu tako da procenat sličnosti proteina ili aminokiselinskih sekvenci između bilo koja dva proteina slične funkcije može varirati, i može biti na primer od 70% do 99% kako je određeno u skladu sa šemom poravnanja kao što je postupak klastera, gde se sličnost zasniva na MEGALIGN algoritmu. „Funkcionalno-konzervativna varijanta“ takođe uključuje polipeptid ili enzim koji ima najmanje 60% identičnosti aminokiselina kako je određeno pomoću 20 BLAST ili FASTA algoritama, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90% i još poželjnije 95%, i koji ima ista ili suštinski slična svojstva ili funkcije kao izvorni protein ili enzim sa kojima se poredi.

[0037] Kako se ovde koristi, izraz HB-EGF može da uključuje varijante, homologe i ortologe pruženih sekvenci. Varijanta može biti suštinski slična nativnoj sekvenci, tj. razlikuje se najmanje po jednoj aminokiselini i može se razlikovati po najmanje dve, ali obično ne više od oko deset aminokiselina (broj razlika u zavisnosti od veličine nativne sekvence). Promene sekvence mogu biti supstitucije, umetanja ili brisanja. Skenirajuće mutacije koje sistematski uvode alanin ili druge ostatke mogu se koristiti za određivanje ključnih aminokiselina koje se održavaju u varijantama. Konzervativne supstitucije aminokiselina koje se mogu koristiti za pružanje varijante sekvence pronalaska obično uključuju supstitucije unutar narednih grupa: (glicin, alanin); (valin, izoleucin, leucin); (asparaginska kiselina, glutaminska kiselina); (asparagin, glutamin); (serin, treonin); (lizin, arginin); i (fenilalanin, tirozin).

[0038] Aminokiselinska sekvenca proteina koji se javlja u prirodi može se izmeniti na različite načine poznate u struci kako bi se generisale ciljane promene u sekvenci i tako pružile varijante sekvence pronalaska. Takve varijante će obično biti funkcionalno sačuvane varijante, koje se razlikuju, obično po sekvenci, od odgovarajućeg prirodnog ili matičnog proteina, ali ipak zadržavaju željenu ili pokazuju pojačanu biološku aktivnost i/ili funkciju. Različiti postupci poznati u struci mogu se koristiti za generisanje ciljanih promena, npr. prikaz faga u kombinaciji sa nasumičnim i ciljanim mutacijama, uvođenjem mutacija skeniranja i slično, i pružaju varijantu sekvence pronalaska. Obuhvaćeni su dodaci His ili epitopskih oznaka kako bi se pomoglo u prečišćavanju, kao što je ovde prikazano. Enzimi modifikovani da daju specifičnu karakteristiku koja nas zanima mogu se dalje modifikovati, npr. mutagenezom, mešanjem egzona itd., kao što je poznato u struci, praćeno skriningom ili selekcijom, tako da se optimizuje ili obnovi aktivnost enzima, npr. do nivoa divljeg tipa, i tako pruže druge varijante sekvenci pronalaska.

[0039] Izraz „HB-EGF“ takođe uključuje biološki aktivne fragmente. Fragmenti od interesa uključuju fragmente od najmanje oko 20 susednih aminokiselina, obično najmanje oko 50 susednih aminokiselina, i mogu sadržati 100 ili više aminokiselina, do kompletnog proteina, i mogu se proširiti dalje da sadrže dodatne sekvence.

[0040] Modifikacije koje su od interesa za protein koje ne menjaju primarnu sekvencu, ali pružaju druge varijante proteina predmetnog pronalaska uključuju hemijsku derivatizaciju proteina, uključujući, na primer, acilaciju, npr. lauril, stearil, mirsitil, decil, itd. grupe, PEGilaciju, estarifikaciju ili amidaciju. Takve modifikacije se mogu koristiti za povećanje otpornosti enzima prema proteolizi, npr. vezivanjem PEG bočnih lanaca ili lauril grupa na površinske lizine. Takođe su obuhvaćene modifikacije glikozilacije, npr. one napravljene modifikovanjem obrazaca glikozilacije proteina tokom njihove sinteze i prerade, ili u daljim koracima prerade; npr. izlaganjem proteina enzimima koji utiču na glikozilaciju, kao što su sisarski enzimi glikoziliranja ili deglikoziliranja. Takođe su obuhvaćene sekvence koje imaju fosforilirane aminokiselinske ostatke, npr. fosfotirozin, fosfoserin ili fosfotreonin.

[0041] Takođe su korisni u praksi i pruženi ovim pronalaskom proteini koji su modifikovani molekularnobiološkim tehnikama i/ili hemijom kako bi se poboljšala njihova otpornost na proteolitičku razgradnju, oksidaciju, itd., i kako bi se poboljšala svojstva rastvorljivosti ili kako bi se učinili pogodnijim kao terapeutski agens. Na primer, okosnica proteina može da se ciklizuje kako bi se povećala stabilnost (pogledati Friedler i dr. (2000) J. Biol. Chem. 275:23783-23789). Analozi takvih proteina uključuju one koji sadrže ostatke koji nisu prirodno prisutne L-aminokiseline, npr. D-aminokiseline ili sintetičke aminokiseline koje nisu prirodne.

[0042] HB-EGF mimetici. HB-EGF agensi od interesa takođe uključuju mimetike, npr. mali molekuli, proteini, aptameri i slično, koji pružaju biološku aktivnost HB-EGF. Takve aktivnosti uključuju vezivanje HB-EGF za EGF receptore i heparin sulfat proteoglikane na ćelijskoj površini.

[0043] Pro HB-EGF se sintetiše kao jedan transmembranski prekursor proteina tipa I, koji se zatim podvrgava širokoj proteolitičkoj obradi, nazvanoj izlivanje ektodomena (pogledati npr. Yan i dr. J Cell Biol.

2002;158(2):221-6; Asakurai dr. Nat Med. 2002;8(1):35-40; Izumi i dr. Embo J. 1998;17(24):7260-72; Nakagawa i dr. J Biol Chem. 1996;271(48):30858-63). Ovo oslobađa rastvorljivi zreli oblik HB-EGF. Metaloproteinaze (uključujući ADAM 9, 10, 12, 17) odgovorne za izlivanje ektodomena od pro HB-EGF pretežno regulišu vezivanje zrelog HB-EGF i regulišu aktivaciju EGFR (pogledati Cisse i dr. J Biol Chem.

2005; 280(49):40624-31; Peschon i dr. Science. 1998;282(5392):1281-4; Sahin i Blobel FEBS Lett.

2007;581(1):41-4; Sahin i dr. J Cell Biol. 2004;164(5):769-79). HB-EGF tada deluje i preko EGFR zavisnih i preko EGFR nezavisnih mehanizama. HB-EGF sadrži EGF-sličan domen za koji se smatra da je potreban da se članovi EGF porodice povezuju i aktiviraju EGFR (Thompson i dr. J Biol Chem.1994;269(4):2541-9).

[0044] Članovi EGF porodice mogu indukovati jukstakrinu, autokrinu, parakrinu ili endokrinu signalizaciju u zavisnosti od ćelijskog okruženja, jer se metaloproteinazama odstranjuju iz membrane kako bi formirali zreli rastvorljivi faktor rasta (Singh i Harris, Cell Signal.2005;17(10):1183-93). Postoje četiri identifikovana člana EGFR porodice (HER1, HER2, HER3 i HER4). Oni su strukturno srodne tirozin kinaze sa jednim membranskim domenom i domenom unutar citoplazme (Plowman, i dr. Proc Natl Acad Sci USA.

1993;90(5):1746-50; Taylor i dr. Semin Cell Dev Biol. 2014). Članovi EGF porodice imaju različite aktivnosti vezivanja za EGFR porodicu. Za razliku od EGF, HB-EGF se vezuje i za HER1 i HER4, kao i za betacelulin i neuregulin2. Pogledati Higashiyama i dr. Science. 1991 ;251(4996):936-9; Chang i dr. Nature.

1997;387(6632):509-12; Carraway i dr. Nature. 1997;387(6632):512-6; Shing i dr. Science. 1993; 259(5101):1604-7. HB-EGF takođe smanjuje epitelske markere kao što su keratini 1, 5, 10 i 14, istovremeno povećavajući gensku pokretljivost gena, kao što su SNA1, ZEB1, COKS-2 i MMP1 (pogledati Stoll i dr. J Invest Dermatol.2012; 132 (9): 2148-57).

[0045] „Efektivna količina“ ili „terapeutski efektivna količina“ HB-EGF, ili agensa koje pruža HB-EGF aktivnost je ona doza koja, kada se primenjuje tokom određenog vremena, pojačava zarastanje hronične perforacije BO.

[0046] Formulacija, tj kap tečnosti, gel sa produženim oslobađanjem, itd. može sadržati HB-EGF ili ekvivalentnu aktivnost agensa koji pruža HB-EGF aktivnost, u koncentraciji od najmanje oko 1 ng/ml, najmanje oko 10 ng/ml, najmanje oko 100 ng/ml, najmanje oko 1 µg/ml, najmanje oko 10 µg/ml, najmanje oko 100 µg/ml, najmanje oko 200 µg/ml, najmanje oko 500 µg/ml, najmanje oko 500 µg/ml, najmanje oko 750 µg/ml, najmanje oko 1 mg/ml, najmanje oko 5 mg/ml, najmanje oko 10 mg/ml, najmanje oko 50 mg/ml, najmanje oko 100 mg/ml, i do oko 10 mg/ml, do oko 25 mg/ml, do oko 50 mg/ml, do oko 100 mg/ml, do oko 500 mg/ml. Formulacija za trajno oslobađanje može da se pruži u višoj početnoj koncentraciji od formulacije za višestruku primenu.

[0047] Zapremina formulacije je obično ona koja je potrebna da bi se pružio koristan dodir sa bubnom opnom, npr. do oko 5 µl, do oko 10 µl, do oko 25 µl, do oko 35 µl. do oko 50 µl, do oko 75 µl, do oko 100 µl, do oko 250 µl, do oko 375 µl, do oko 500 µl. Alternativno, može se pružiti kapalica u kojoj je doza jedna kap, dve kapi, tri kapi, gde je, kao što je poznato u struci, kap zapremine oko 50 µl.

[0048] Terapeutski efektivna količina pruža klinički značajan odgovor kod pacijenta time što se, na primer, poboljšava zarastanje perforacije bubne opne. Alternativno, terapeutski efektivna količina je dovoljna da poboljša klinički značajno stanje zarastanja rana kod domaćina.

[0049] Formulacija ili uređaj sa održanim ili produženim oslobađanjem može biti projektovan tako da ima t1⁄2 za oslobađanje leka, tj. dužinu vremena za oslobađanje polovine aktivnog agensa, što je pogodno za početnu dozu i željenu lokalnu koncentraciju, npr. t1⁄2 od oko 24 sata, oko 48 sati, oko 3 dana, oko 4 dana, oko 5 dana, oko 1 nedelje, oko 10 dana, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, itd.

[0050] Formulacija koja nije za održano ili produženo oslobađanje, npr. tečne kapi za uši, itd., može se primenjivati u intervalima koji su pogodni za održavanje efektivne doze, npr. otprilike svaka 3 sata, otprilike svaka 4 sata, otprilike svakih 6 sati, otprilike svakih 12 sati, otprilike svakih 18 sati, otprilike svaka 24 sata, otprilike svakih 48 sati, itd.

[0051] Alternativno, efektivna količina HB-EGF, ili agensa koji pruža HB-EGF aktivnost, je količina koja rezultuje bržim zarastanjem perforacije ili rane u odnosu na zarastanje u odsustvu agensa. efektivna količina može takođe da označi količinu ili dozu dovoljnu za povećanje lokalnog i/ili sistemskog nivoa HB-EGF, npr., do oko 10 procenata, poželjno za oko 50 procenata, i još poželjnije za oko 100 procenata od nivoa otkrivenog pre primene aktivnog agensa ili leka.

[0052] Period za dodir sa HB-EGF može biti do jedan dan, do 2 dana, do 3 dana, do 5 dana, do 7 dana, do 10 dana, do 12 dana, do 2 nedelje, do 3 nedelje ili više, u skladu sa potrebama pojedinca.

[0053] „Kontrola“, „kontrolna vrednost“ ili „referentna vrednost“ u testu je vrednost koja se koristi za otkrivanje promene u, na primer, zarastanju perforirane bubne opne ili rane na koži, ili u bilo kom drugom ovde opisanom testu. Na primer, kada se proučava zarastanje perforacije bubne opne, inhibitorni/stimulativni efekat agensa može se proceniti upoređivanjem zarastanja rane ili perforacije sa kontrolom. Kontrola ili referenca mogu biti, na primer, unapred određena referentna vrednost, ili se mogu odrediti eksperimentalno. Na primer, u takvom testu, kontrola ili referenca mogu biti zarastanje slične rane ili perforacije kod životinje koja nije izložena leku ili aktivnom agensu, ili životinje koja je tretirana istim lekom ili aktivnim agensom, a koja nema oštećenu sposobnost zarastanja rana

[0054] „Inhibitor“ uključuje prirodni ili sintetički sastav ili supstancu koji sprečavaju dejstvo HB-EGF, koji snižavaju nivo HB-EGF ili njegovog receptora, i koji blokiraju unutarćelijsku signalizaciju kada HB-EGF aktivira svoj kognitivni receptor; itd. Inhibitori uključuju nukleinske kiseline, npr. anti-sens, siRNK, ribozimi itd.; antitela specifična za HB-EGF ili njegov kognitivni receptor, inhibitore malih molekula, itd. U nekim otelotvorenjima inhibitor je OSU8-1/KB-R7785 (pogledati Tokomaru i dr. (2000) JCB 151:209-219, ovde specifično uključeno referencom). Antitela specifična za HB-EGF i siRNK, shRNK reagensi su poznati u struci i komercijalno su dostupni (na primer, pogledati Santa Cruz Biotechnology, ili Bertram i dr. (2009) Mech. Ageing Dev.130: 657-669.

[0055] Alternativno, monoklonska antitela mogu da se generišu konvencionalnim postupcima za dobijanje monoklonskih antitela, i može se koristiti bilo koja tehnika koja pruža antitela proizvedena neprekidnim kulturama ćelijskih linija. Primeri uključuju tehniku hibridoma (Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)), tehniku trioma, tehniku hibridoma ljudskih B-ćelija (Kozbor i dr., Immunology Today 4:72 (1983)), i tehniku EBV-hibridoma za proizvodnju ljudskih monoklonskih antitela (Cole, i dr., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)). Opisane tehnike za proizvodnju jednolančanih antitela (SAD patent br. 4,946,778) mogu da se prilagode tako da proizvode jednolančana antitela za imunogene polipeptidne proizvode predmetnog pronalaska. Takođe, transgeni miševi se mogu koristiti za eksprimiranje humanizovanih antitela za imunogene polipeptidne proizvode predmetnog pronalaska.

[0056] „Struktura“, kada se odnosi na isporuku HB-EGF ili inhibitora HB-EGF, uključuje, ali nije ograničena na bilo koju skelu, polimer, konstrukciju, fabrikaciju, montažu, nosač, disk, blok, premaz, sloj, uporište, podlogu, uređaj, penu. Takođe uključuje upotrebu pacijentovog sopstvenog tkiva, ostataka ili transplanta, da deluju kao način isporuke. Struktura se može naneti u formiranom stanju ili se može primeniti kao viskozna tečnost koja tada formira čvrsto stanje ili ostaje u tečnom obliku.

[0057] „Nosač“, kada se odnosi na isporuku HB-EGF ili inhibitora HB-EGF uključuje, ali nije ograničen na, bilo koji polimer, agens, nosač, instrument, operaciju, medijum, aparat, uređaj, kontrapciju, gedžet, alat, dodatak, priključak ili pribor. Izraz „nosač“ se takođe odnosi na bilo koji rastvorljivi nosač ili ekscipijens, uključujući, ali bez ograničavanja na fiziološki rastvor, puferisan fiziološki rastvor, dekstrozu, vodu, glicerol i njihove kombinacije. Formulacija treba da odgovara načinu primene. Primeri pogodnih formulacija, poznati u struci, mogu se naći u Remington's Pharmaceutical Sciences (latest edition), Mack Publishing Company, and Easton, Pa.

[0058] Kako se ovde koristi, „oko“ ili „približno“ će značiti unutar 50 procenata, poželjno unutar 20 procenata, poželjnije unutar 5 procenata, određene vrednosti ili raspona.

[0059] Vrednost koja se „značajno razlikuje“ od druge vrednosti može značiti da postoji statistički značajna razlika između dve vrednosti. Bilo koji odgovarajući statistički postupak poznat u struci može se koristiti za procenu da li su razlike značajne ili ne.

[0060] „Statistički značajna“ razlika znači da se značaj određuje u intervalu pouzdanosti od najmanje 90%, još poželjnije u intervalu pouzdanosti od 95%.

[0061] U skladu sa predmetnim pronalaskom, mogu se upotrebiti konvencionalna molekularna biologija, mikrobiologija i rekombinantne DNK tehnike u okviru struke. Takve tehnike su u celosti objašnjene u literaturi. Pogledati npr. Sambrook i dr (Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Glover (DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985); Hames i Higgins (Nucleic Acid Hybridization, 1985); Hames and Higgins (Transcription And Translation, 1984); Freshney (Animal Cell Culture, 1986); Perbal (A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984); i Ausubel i dr. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994).

Farmaceutske formulacije

[0062] Formulacije koje se mogu koristiti za isporuku HB-EGF i HB-EGF agensa, ili HB-EGF inhibitora ili drugih sastava prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničene na, injekcione dozne oblike, infuzije, gelove, paste, balzame, voskove, losione, kreme za kožu i razne drugi formati za lokalnu primenu poznate u struci. Sastavi se takođe mogu primenjivati lokalno u obliku praška ili rastvora isprskanog na ranu. Alternativno, sastavi predmetnog pronalaska mogu biti prisutni u zavojima za rane, jastučićima, trakama, gazama ili drugim sredstvima koja se nanose na ranu, odakle se prenose u područje rane. Takvi uređaji uključuju i uređaje sa sporim oslobađanjem, koji kontinuirano oslobađaju HB-EGF ili HB-EGF inhibitor ili druge komponente tokom dužeg vremenskog perioda. Kada je reč o zarastanju bubne opne, primena preparata korišćenjem gela, spreja ili kapljičnog nanošenja preko spoljnog ušnog kanala je jedno poželjno otelotvorenje. Injektibilni dozni oblici ili infuzije sadrže rastvor HB-EGF ili HB-EGF inhibitora u farmaceutski prihvatljivoj tečnosti kao što su, na primer, izotonični fiziološki rastvor, sterilna voda ili vodeni sistem pufera. Nosač može takođe da obuhvata bilo koju strukturu koja prolazi kroz ranu. U slučaju bubne opne nosač uključuje, ali nije ograničen na, ventilacione cevi ili katetere.

[0063] Farmaceutski sastavi mogu da sadrže, u zavisnosti od željene formulacije, farmaceutski prihvatljive, netoksične nosače ili razblaživače, koji su definisani kao nosači koji se obično koriste za formulisanje farmaceutskih sastava za životinjsku ili ljudsku primenu. Razblaživač je izabran tako da ne utiče na biološku aktivnost aktivnog agensa. Primeri takvih razblaživača su destilovana voda, puferisana voda, fiziološki rastvor soli, PBS, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze i Henkov rastvor. Pored toga, farmaceutski sastav ili formulacija mogu da sadrže druge nosače, adjuvanse ili netoksične, neterapeutske, neimunogene stabilizatore, ekscipijense i slično. Sastavi takođe mogu da sadrže dodatne supstance za približavanje fizioloških uslova, kao što su agensi za prilagođavanje pH i puferisanje, agensi za prilagođavanje toksičnosti, agensa za vlaženje i deterdženti.

[0064] Sastav takođe može da obuhvata bilo koji od različitih stabilizatora, kao što je na primer antioksidans. Kada farmaceutski sastav uključuje polipeptid, polipeptid može biti kompleksiran sa različitim dobro poznatim jedinjenjima koja povećavaju in vivo stabilnost polipeptida, ili na drugi način poboljšavaju njegova farmakološka svojstva (npr. povećavaju poluživot polipeptida, smanjuju njegovu toksičnost, povećavaju rastvorljivost ili unos). Primeri takvih modifikacija ili agenasa za kompleksiranje uključuju sulfat, glukonat, citrat i fosfat. Polipeptidi sastava takođe mogu biti kompleksirani sa molekulima koji pojačavaju njihove in vivo atribute. Takvi molekuli uključuju, na primer, ugljene hidrate, poliamine, aminokiseline, druge peptide, jone (npr. natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, mangan) i lipide.

[0065] Dalja uputstva u vezi sa formulacijama pogodnim za različite vrste primene mogu se naći u Remington's Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985). Za kratak pregled postupaka za isporuku lekova, pogledati: Langer, Science 249:1527-1533 (1990).

[0066] Farmaceutski sastavi mogu se primeniti za terapeutske tretmane. Toksičnost i terapijska efektivnost aktivnog sastojka mogu se odrediti prema standardnim farmaceutskim postupcima u ćelijskim kulturama i/ili eksperimentalnim životinjama, uključujući, na primer, određivanje LD50(doza smrtonosna kod 50% populacije) i ED50(doza terapeutski efektivna kod 50% populacije). Odnos doze između toksičnih i terapijskih efekata je terapijski indeks i može se izraziti kao LD50/ ED50odnos. Poželjna su jedinjenja koja pokazuju velike terapeutske indekse.

[0067] Podaci dobijeni iz ćelijske kulture i/ili ispitivanja na životinjama mogu se koristiti u formulisanju raspona doza za ljude. Doziranje aktivnog sastojka se obično kreće u rasponu koncentracija u cirkulaciji koje uključuju ED50sa niskom toksičnošću. Doziranje može da varira u ovom rasponu u zavisnosti od korišćenog doznog oblika i načina primene.

[0068] Ovde opisani farmaceutski sastavi mogu se primenjivati na različite načine. Primeri uključuju primenu smeše koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač lokalnim putevima, npr. na površini BO, intrabubno, trans-bubno, itd.

[0069] Pogodne formulacije uključuju vodene i bezvodne, izotonične sterilne injekcione rastvore, koji mogu da sadrže antioksidante, pufere, bakteriostate i rastvore koji čine formulaciju izotoničnom, i vodene i bezvodne sterilne suspenzije koje mogu da sadrže agens za suspendovanje, solubilizatore, agens za zgušnjavanje, stabilizatore i konzervanse.

[0070] Komponente koje se koriste za formulisanje farmaceutskih sastava su poželjno visoke čistoće i suštinski bez potencijalno štetnih kontaminanata (npr., barem po National Food (NF) klase, uglavnom najmanje analitičke klase, a tipično najmanje farmaceutske klase). Pored toga, sastavi namenjeni in vivo upotrebi obično su sterilni. U meri u kojoj se neko jedinjenje mora sintetisati pre upotrebe, dobijeni proizvod je obično bez ikakvih potencijalno toksičnih agenasa, posebno bilo kojih endotoksina koji mogu biti prisutni tokom procesa sinteze ili prečišćavanja. Sastavi za parentalnu primenu su takođe sterilni, suštinski izotonični i napravljeni pod GMP uslovima.

[0071] Efektivna količina terapeutskog sastava koja će se primeniti određenom pacijentu zavisiće od različitih faktora, od kojih će se nekoliko razlikovati od pacijenta do pacijenta. Nadležni kliničar će moći da odredi efektivnu količinu terapeutskog agensa koju će dati pacijentu kako bi se pospešilo zarastanje hronične perforacije BO. Koristeći ED50podatke o životinjama i ostale dostupne informacije, kliničar može da odredi sigurnu dozu za pojedinca, u zavisnosti od puta primene. Sastavi koje se brzo izbacuju iz tela mogu se primenjivati u većim dozama ili u ponavljanim dozama, kako bi se održala terapijska koncentracija. Koristeći uobičajene veštine, nadležni kliničar će moći da optimizuje doziranje određenog terapeutskog sastava ili sastava za slikanje tokom rutinskih kliničkih ispitivanja. Obično doziranje iznosi 0,001 do 100 miligrama agensa po kilogramu telesne težine.

[0072] Formulacija, tj. kapi tečnosti, gel sa produženim oslobađanjem, itd. može sadržati HB-EGF ili ekvivalentnu aktivnost agensa koji pruža HB-EGF aktivnost, u koncentraciji od najmanje oko 1 µg/ml, najmanje oko 10 µg/ml, najmanje oko 100 µg/ml, najmanje oko 200 µg/ml, najmanje oko 500 µg/ml, najmanje oko 750 µg/ml, najmanje oko 1 mg/ml, najmanje oko 5 mg/ml, najmanje oko 10 mg/ml, najmanje oko 50 mg/ml, najmanje oko 100 mg/ml, i do oko 10 mg/ml, do oko 25 mg/ml, do oko 50 mg/ml, do oko 100 mg/ml, do oko 500 mg/ml. Formulacija za trajno oslobađanje može da se pruži u višoj početnoj koncentraciji od formulacije za ponavljanu primenu. Terapeutski aktivna količina može varirati u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pojedinca. Režim doziranja se može prilagoditi tako da pruži optimalan terapijski odgovor. Na primer, više od jedne podeljene doze može se primenjivati dnevno, ili se doza može srazmerno smanjiti što je naznačeno potrebama hitne terapeutske situacije.

[0073] Zapremina se može dobiti od oko 1 do 3 kapi, ili ako se primenjuje u čvrstom ili polu-čvrstom obliku može biti pripremljen sastava podešene zapremine, npr. zapremine od oko 5 µl do oko 500 µl. Uređaj se može oblikovati u bilo koji oblik ili konformaciju koji će olakšati njegovu upotrebu u ciljanom području radi promovisanja ili inhibicije zarastanja. Geometrija čvrstog ili polu-čvrstog oblika je bilo koja pogodna za isporuku na tipičnu membranu, npr. sfera, spljoštena sfera, film, flaster, disk jednolične ili nejednolične debljine i slično.

[0074] Formulacija se može primeniti pacijentu u nizu sa više od jedne primene. Za terapeutske sastave, ponekad će biti potrebna redovna periodična primenu (npr. svaka 4 sata, svakih 6 sati, svaka 12 sati, svaka 24 sata, itd.), npr. gde je formulacija pružena kao tečnost za topikalnu primenu.

[0075] Formulacije pogodne za lokalnu, transkutanu i transdermalnu primenu mogu se pripremiti upotrebom odgovarajućih agensa za suspendovanje, solubilizatora, zgušnjivača, stabilizatora i konzervansa. Lokalne formulacije se takođe mogu koristiti sa agensima za pružanje kontinuirane primene, na primer, ugradnjom u pelete sa sporim oslobađanjem, ili flastere sa kontrolisanim oslobađanjem.

[0076] Aktivni agens može biti formulisan i u biokompatibilnom gelu, koji se može primeniti topički ili implantirati (npr. kako bi se pružilo dugotrajno oslobađanje na mestu tretmana). Pogodni gelovi i postupci za formulisanje željenog jedinjenja za isporuku pomoću gela su dobro poznati u struci (pogledati, npr., SAD patentne br. 5,801,033; 5,827,937; 5,700,848; i MATRIGEL™). Primer ovog otelotvorenja je isporuka HB-EGF ili HB-EGF inhibitora kroz ušni kanal preko biokompatibilne tečnosti ili uređaja koji se zatim učvršćuje u ušnom kanalu pored bubne opne i isporučuje HB-EGF ili HB- EGF inhibitor kako se agens rastvara tokom vremena. Nosač se može smestiti u kanal, u tipičnu membranu ili u srednje uho.

[0077] Formulacije mogu biti pružene u jediničnom doznom obliku, gde se izraz „jedinični dozni oblik“ odnosi na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinstvene doze za ljude, i gde svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu proteaze u količini izračunatoj da je dovoljna da proizvede željeni efekat zajedno

1

sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem. Specifikacije za jedinične dozne oblike predmetnog pronalaska zavise od određenog kompleksa koji se koristi i efekta koji se postiže, kao i farmakodinamike povezane sa svakim kompleksom kod domaćina.

[0078] Aspekti predmetnog pronalaska uključuju sastave umreženih kopolimer hidrogelova koji sadrže efektivnu dozu apsorbovanog HB-EGF, kao što je opisano iznad. Sastavi umreženih kopolimer hidrogelova pronalaska prema određenim otelotvorenjima uključuje kopolimer hitozana i poliestra i veznik za umrežavanje koji može da hidrolizuje. U nekim otelotvorenjima, umreženi kopolimer hidrogelovi dalje uključuju fibrinogen. U nekim takvim otelotvorenjima, umreženi kopolimer hidrogelovi uključuju kopolimer hitozana i poliestra i veznik za umrežavanje koji može da hidrolizuje, npr. polilaktid. Umreženi hitozanpolilaktid hidrogelovi mogu da imaju odnos hitozana i polilaktida u rasponu od 1:1 do 10:1, kao što je 1:1 do 8:1, gde u određenim slučajevima umreženi hitozan-polilaktidni hidrogelovi imaju odnos hitosana i polilaktida od 8:1. Težinski procenat hitozana u umreženim kopolimer hidrogelovima može biti od 1% do 99%, i težinski procenat poliestra takođe može biti u rasponu od 1% do 99%. U nekim otelotvorenjima, kopolimer hidrogelovi uključuju jednu ili više estarskih i amidnih veza između komponenti hitozana i poliestra. Umreženi kopolimer hidrogelovi od interesa takođe uključuju veznik za umrežavanje. U nekim otelotvorenjima, veznik za umrežavanje je podešen da hidrolizuje u fiziološkim uslovima. U nekim otelotvorenjima, veznik za umrežavanje može biti akrilni veznik za umrežavanje, kao što je metakrilatni veznik za umrežavanje. Veznik za umrežavanje koji može hidrolizovati može biti prisutan u umreženom kopolimer hidrogelu u količini koja se kreće od 0,05% do 10% w/w veznika za umrežavanje, kao što je 0,1% do 9% w/w, kao što je 0,5% do 8% w/w, kao što je kao 0,75% do 7% w/w, uključujući 1% do 5% w/w. U zavisnosti od protokola korišćenog za umrežavanje predmetnih hidrogelova, gustina umrežavanja može da varira. U određenim slučajevima, hidrogel je umrežen hemijskim agensom za umrežavanje. Kao takva, gustina umrežavanja može da varira u zavisnosti od vrste i koncentracije korišćenog hemijskog agensa za umrežavanje. Alternativno, hidrogel može biti foto-umrežen, i gustina umrežavanja može da varira u zavisnosti od intenziteta elektromagnetnog zračenja u dodiru sa sastavom hidrogela, kao i od trajanja ozračenja. U nekim otelotvorenjima pronalaska, gustina umrežavanja predmetnih umreženih kopolimernih hidrogelova može biti u rasponu, kao što je od 1x10<-5>molova/cm<3>do 1x10<-3>molova/cm<3>. Shodno tome, u zavisnosti od količine umrežavanja, odnos nabubrenosti predmetnih hidrogelova može varirati, u rasponu od 1 do 35. Isto tako, modul kompresije hidrogelova može varirati, u rasponu od 1 kPa do 35 kPa. Pogledati, na primer, podnesenu Međunarodnu prijavu patenta PCT/US2014/033512, koja ovde posebno uključena referencom.

[0079] Formulacija hidrogela opciono uključuje fibrinogen. Fibrinogen se može ugraditi u sastav hidrogela pre ili nakon što je hidrogel umrežen. Na primer, u nekim slučajevima se fibrinogenu dodaje u sastav prekursora hidrogela. Fibrinogen može biti prisutan u umreženom kopolimer hidrogelu u količini koja se kreće od 0,05% do 50% w/w fibrinogena, kao što je od 0,1% do 45% w/w, kao što je od 0,5% do 40% w/w, kao što je od 0,75% do 35% w/w, kao što je od 1% do 30%, kao što je od 2% do 20%, kao što je od 5% do 15%, uključujući 10% w/w.

[0080] Hidrogelovi se mogu sintetisati kako bi se postigao određeni profil otpuštanja. U nekim otelotvorenjima, umreženi kopolimer hidrogelovi pruženi pronalaskom konfigurišu se da oslobađaju HB-EGF ili HB-EGF agens pod fiziološkim uslovima, suštinski pri brzini otpuštanja nultog reda. U drugim otelotvorenjima, predmetni umreženi kopolimer hidrogelovi su konfigurisani tako da oslobađaju HB-EGF ili HB-EGF agens pod fiziološkim uslovima, suštinski pri brzini otpuštanja prvog reda. U daljim otelotvorenjima, predmetni umreženi kopolimer hidrogelovi su konfigurisani tako da oslobađaju HB-EGF ili HB-EGF agens pod fiziološkim uslovima, suštinski pri brzini otpuštanja drugog reda. U nekim otelotvorenjima, predmetni umreženi kopolimer hidrogelovi su konfigurisani tako da imaju profil otpuštanja koji uključuje:1) prvi period kada se HB-EGF ili HB-EGF agens oslobađa iz hidrogela pri prvom unapred određenom brzinom; i 2) drugi period kada se HB-EGF ili HB-EGF agens oslobađa iz hidrogela pri drugom unapred određenom brzinom.

[0081] U nekim otelotvorenjima pronalaska, odnos hitozana i poliestra u hidrogelu može da varira, u nekim otelotvorenjima u rasponu između 10:1 i 9.5:1; 9.5:1 i 9:1; 9:1 i 8.5:1; 8.5:1 i 8:1; 8:1 i 7.5:1; 7.5:1 i 7:1; 7:1 i 6.5:1; 6.5:1 i 6:1; 6:1 i 5.5:1; 5.5:1 i 5:1; 5:1 i 4.5:1; 4.5:1 i 4:1; 4:1 i 3.5:1; 3.5:1 i 3:1; 3:1 i 2.5:1; 2.5:1 i 2:1; 2:1 i 1.5:1; 1.5:1 i 1:1 ili u njihovom raspnu. Na primer, maseni odnos komponente hitozana prema komponenti poliestra može biti u rasponu od 10:1 i 1:1, kao što je 8:1 i 1:1, kao što je 5:1 i 1:1, kao što je 4:1 i 1:1, uključujući 2:1 i 1:1. U određenim slučajevima, odnos hitozana i poliestra je 1:1. U drugim otelotvorenjima, odnos hitozana i poliestra može varirati, u nekim otelotvorenjima u rasponu između 1:1 i 1:1.5; 1:1.5 i 1:2; 1:2 i 1:2.5; 1:2.5 i 1:3; 1:3 i 1:3.5; 1:3.5 i 1:4; 1:4 i 1:4.5; 1:4.5 i 1:5; 1:5 i 1:5.5; 1:5.5 i 1:6; 1:6 i 1:6.5; 1:6.5 i 1:7; 1:7 i 1:7.5; 1:7.5 i 1:8; 1:8 i 1:8.5; 1:8.5 i 1:9; 1:9 i 1:9.5; 1:9.5 i 1:10 ili njihov raspon. Na primer, odnos hitozana i poliestra može biti u rasponu od 1:1 i 1:10, kao što je 1:1 i 1:8, kao što je 1:1 i 1:5, kao što je 1:1 i 1:4, uključujući 1:1 i 1:2.

[0082] Umreženi kopolimer hidrogelovi mogu biti 1 kDa ili više, kao što je 2 kDa ili više, kao što je 3 kDa ili više, poput 5 kDa ili više, kao što je 10 kDa ili više, kao što je 15 kDa ili više, kao što je 20 kDa ili više, kao što je 25 kDa ili više, kao što je 30 kDa ili više, poput 40 kDa ili više, kao što je 50 kDa ili više, kao što je 60 kDa ili više, uključujući 75 kDa ili više.

[0083] Nakon što se pripreme farmaceutski sastavi, oni se mogu staviti u odgovarajući kontejner i obeležiti za tretman naznačenog stanja. Za primenu sastava predmetnog pronalaska, takvo obeležavanje uključuje količinu, učestalost i način primene.

Kombinacije formulacija

[0084] Formulacije predmetnog pronalaska mogu da sadrže efektivnu dozu HB-EGF u kombinaciji sa drugim aktivnim agensom, posebno drugim antimikrobnim agensima. Na primer, drugi agensi od interesa uključuju širok izbor antibiotika, kao što je poznato u struci. Klase antibiotika uključuju peniciline, npr. penicilin G, penicilin V, meticilin, oksacilin, karbenicilin, nafcilin, ampicilin, itd.; penicilini u kombinaciji sa inhibitorima β-laktamaze, cefalosporine, npr. cefaklor, cefazolin, cefuroksim, moksalaktam, itd.; karbapeneme; monobaktame; aminoglikozide; tetracikline; makrolide; linkomicine; polimiksine; sulfonamide; hinolone; kloramfenikal; metronidazol; spektinomicin; trimetoprim; vankomicin; itd. Antivirusni agensi, npr. aciklovir, ganciklovir, itd., mogu biti uključeni.

[0085] Citokini i faktori rasta takođe pronalaze upotrebu u kombinaciji sa HB-EGF, npr. faktori rasta, kao što su transformišući faktor rasta (TGF)-β, faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF), faktor rasta fibroblasta (FGF) i epidermalni faktor rasta (EGF), VEGF, faktor nekroze tumora-α (TNF-α), endotelin-1, faktor rasta keratinocita i slično. Pogledati npr. Steed, D. i dr., J. Am. Call. Surg. 183:61-64 (1996); Richard, J. i dr., Diabetes Care 18: 64--69 (1995); Steed, D.,J. Vasc. Surg. 21:71-78 (1995); Kelley, S. i dr., Proc. Soc. Exp. Biol.194:320-326 (1990).

Načini upotrebe

[0086] Prema pronalasku, zarastanje rana hronične perforacije bubne opne poboljšava se pružanjem ili povećanjem nivoa HB-EGF. To se može postići na nekoliko različitih načina. Na primer, pacijent može da se tretira efektivnom količinom aktivnog agensa, kao što su, na primer, lek, hormon, citokin, antitelo ili neko drugo jedinjenje koje nadograđuje eksprimiranje HB-EGF; smanjuje razgradnju HB-EGF; ili povećava lokalni ili sistemski nivo HB-EGF ili HB-EGF homologa ili derivata. Nukleinske kiseline koje kodiraju HB-EGF takođe se mogu primenjivati u terapeutske svrhe.

[0087] Tipično formulacija koja sadrži HB-EGF protein, npr. rastvorljivi oblik ljudskog HB-EGF, lokalno se primenjuje pojedincu koji pati od hronične perforacije BO preko spoljnog ušnog kanala, u periodu vremena koji je dovoljan za značajno zatvaranje perforacije. Pacijent, koji može ali ne mora biti čovek, može ali ne mora da pati od stanja koje umanjuje ili usporava zarastanje perforacije bubne opne.

[0088] Pronalazak pruža sastave HB-EGF ili HB-EGF inhibitora koji, kada se primenjuju u efektivnoj količini, dovode do povećanog ili smanjenog nivoa HB-EGF u predelu rane pacijenta. Na primer, za ubrzavanje zarastanja od bubne opne, sastav koja sadrži HB-EGF može se primeniti na područje koje okružuje perforaciju bubne opne. HB-EGF inhibitor se takođe može primeniti da inhibira normalno ili prekomerno zarastanja rana. U slučaju HB-EGF sastava za ubrzavanje zarastanja bubne opne, smeša se može naneti na područje koje je susedno ili lokalno u odnosu na perforaciju bubne opne. Može se primeniti preko bilo kog biorazgradivog ili nebiorazgradivog izvora ili strukture.

[0089] U drugom otelotvorenju, postupak pronalaska se primenjuje da inhibira zarastanje perforirane membrane kod pacijenta. Pacijent, koji može ali ne mora biti čovek, može ali ne mora da pati od stanja koje umanjuje ili usporava zarastanje perforacije bubne opne. Na primer, takvi postupci se mogu primeniti kao zamena za miringotomiju i umetanje timpanostomijske cevi, što se obično propisuje za hronično zapaljenje srednjeg uha, malformacije bubne opne ili Eustahijeve tube, Daunov sindrom, razdvojeno nepce i barotraumu (povreda srednjeg uha izazvana smanjenjem vazdušnog pritiska), itd. Uobičajeno, timpanostomijska cev se ubacuje u BO i održava duže vreme, npr. do jednog meseca, do 2 meseca, do 3 meseca, do 4 meseca, do 6 meseci ili više.

[0090] Postupci takođe pronalaze upotrebu u proizvodnji životinjskog modela koji pruža klinički relevantan model za stanja perforiranih bubnih opni kod ljudi. U takvim modelima, životinja može biti bilo koja pogodna laboratorijska životinja, npr. glodari, lagomorfi itd., uključujući, bez ograničenja, miševe, pacove, zamorce, zečeve, mačke, pse, primate koji nisu ljudi; i slično.

[0091] U takvim otelotvorenjima, primenjuje se efektivna doza inhibitora izlivanja EGFR liganda, obično lokalnim dodirom sa bubnom opnom, kako bi se stvorila perforacija BO. U nekim takvim otelotvorenjima, može se prvo napraviti mala perforacija, npr. površina od oko 0,1 do 10 mm<2>, od oko 0,1 do oko 5 mm<2>, od oko 0,1 do 2,5 mm<2>, od oko 0,1 do oko 1 mm<2>. Nakon početne perforacije, rana se dovodi u vezu sa efektivnom dozom HB-EGF inhibitora, u formulaciji i tokom određenog vremenskog perioda kako je ovde navedeno. Aktivna doza inhibitora može se održavati tokom dužeg vremena tokom kog je željena perforacija.

Kompleti

[0092] Naredni aspekt predmetnog pronalaska pruža komplet za tretman hronične perforacije BO. Komplet uključuje formulaciju koja pruža efektivnu dozu HB-EGF, npr. u obliku kapi, uređaja, formulacija i slično. Komplet može takođe da sadrži uređaj za isporuku, npr. raspršivač za uho, špric za isporuku formulacije, dvokomorni špric za isporuku formulacije iz dva dela; i slično. Komplet takođe može da sadrži uputstva za upotrebu.

[0093] Alternativno, može se pružiti komplet za stvaranje hronične perforacije BO. Komplet uključuje formulaciju koja pruža efektivnu dozu HB-EGF inhibitora, npr. u obliku kapi, uređaja, formulacija i slično. Komplet može takođe da sadrži uređaj za isporuku, npr. raspršivač za uho, špric za isporuku formulacije, dvokomorni špric za isporuku formulacije iz dva dela; i slično. Komplet takođe može da sadrži uputstva za upotrebu. Komplet može dalje da sadrži sterilnu iglu ili lancetu za stvaranje početne perforacije u BO.

Primer 1

Inhibicija HB-EGF

[0094] HB-EGF je presudan za zarastanje epidermalnih rana u modelu bubne opne. Normalizovani intenzitet signala kao što je HB-EGF sličan faktor rasta nakon perforacije bubne opne kod pacova, pokazuje 8,5 puta veću regulaciju HB-EGF sličnog faktora rasta. Ovde je prikazana eksperimentalna inhibicija HB-EGF aktivnosti kako bi se sprečilo zarastanje perforacije bubne opne.

[0095] Izlivanje EGFR liganda može se inhibirati kako bi se stvorio hronični model perforacije bubne opne. Subtotalne perforacije su stvorene u pars tensa od BO kod 20 miševa pomoću zakrivljene igle. OSU8.1 (10mM), selektivni HB-EGF inhibitor (pogledati Tokumaru i dr. (2000) J. Cell Biol.), ubrizgan je u gel penu (postavljenu kroz i na perforaciju) tokom sedam dana. Miševi su žrtvovani u vremenskim tačkama (Dan, 2, 7, 14, 30, 44, 60 i 90) kako bi se posmatrali efekti na migraciju keratinocita. Kontralateralno uho je korišćeno kao kontrola sa fiziološkim rastvorom koji je stavljen na gel penu. Sve od njih su se zatvorile u roku od dve nedelje. Pet od sedam (71%) ušiju za tretman bilo je otvoreno nakon tri meseca. Reprezentativne slike hronične perforacije BO prikazane su na Slici 5. Veličina perforacije je bila stabilna tokom tri meseca (korišćenjem ImageJ za izračunavanje površine perforacije kao procenat pars tensa površine). Izvedena je veća kohorta sa 87,9% (n = 58) sa hroničnom perforacijom nakon 3 meseca. Naše preliminarno istraživanje po prvi put je sugerisalo uspostavljeni, reproducibilni model hroničnog BO životinjskog modela zasnovan na faktoru rasta.

[0096] Tabela 1 prikazuje rezultate primene HB-EGF inhibitora (OSU8-1) na akutne perforacije bubne opne kod miševa. 100% perforacija tretiranih HB-EGF inhibitorima bilo je prisutno tokom dva meseca u poređenju sa 5% kod kontrola, i 71% je bilo prisutno nakon tri meseca u poređenju sa 5% kod kontrola

TABELA 1

[0097] Stvaranje životinjskog modela za hronično supurativno zapaljenje srednjeg uha. Nakon kreiranja modela hronične perforacije sa okluzijom ET, dve vrste bakterija su inokulirane u srednje uho kroz postojeće

1

hronične perforacije. Nakon dve nedelje prikupljena je ušna tečnost i poslata je na lančanu reakciju polimeraze (PCR) kako bi se testirala na prisustvo bakterija. Izabrane bakterije bile su dve najčešće upletene u hroničnu bolest uha, streptokoknu pneumoniju tipa 3 (doza 6x10<6>jedinice koja formiraju koloniju po ml) i pseudomonas aeruginosa (doza 6x10<9>jedinice koja formiraju koloniju po ml).

Primer 2

Tretman hronične perforacije bubne opne

[0098] Dokazana je efektivnost HB-EGF tretmana za hronične perforacije BO.

[0099] Biokompatibilni injekcioni polimer koji se može apsorbovati za isporuku faktora rasta u ušni kanal. Kako bi se tretirala hronična perforacija BO, poželjno je da postoji tečnost koja se može kapati u uho, koja se potom stvrdne i polako resorbuje tokom određenog vremenskog okvira, istiskujući lek. Stopa razgradnje polimera i brzina istiskivanja leka mogu se lako podesiti u skladu sa ciljem koji nas zanima.

[0100] Biorazgradiv hidrogel na bazi hitozana za isporuku faktora rasta razvijen je tako da pruži biokompatibilan, bioresorbabilan, injekcioni polimer koji može nositi lek po izboru, i koji se zatim može uvući u ušni kanal. Gel ima dve tečne komponente, i može da se očvrsne u roku od nekoliko minuta nakon mešanja obe komponente. Ovo se može lako primenjivati dvokomornim špricem. Alternativno, rastvori se mogu mešati sa agensom za umrežavanje pre isporuke, i injektirati jednostrukim špricem.

[0101] Novorazvijeni hidrogel na bazi hitozana sastoji se od hidrofilnih molekula hitozanske kičme i bočnih lanaca hidrofobnih poliktida. Fibrinogen se može ugraditi u kopolimerne mreže kako bi se poboljšao afinitet vezivanja, pojačalo vezivanje ćelija i pružila proteolitički razgradiva mesta. Oslobađanje leka iz polimernog hidrogela varira u skladu sa karakteristikama kao što su hidrofilni afinitet, ponašanje bubrenja, razgradivost i gustina umrežavanja polimera. Izmereni su profili oslobađanja leka od rhBMP-2 iz hidrogela na bazi hitozana, i ponašanje razgradnje polimernog hidrogela u različitim uslovima.

[0102] Specifični odnos hitozana i polilaktida za gel korišćen u prikazanim primerima je 8:1. Pored toga, 10% w/w fibrinogena je ugrađeno u rastvor prepolimera. Formulacija hidrogela može da očvrsne u roku od nekoliko minuta nakon mešanja sa katalizatorom za hemijsko umrežavanje. Ovo se lako može primenjivati dvokomornim špricem ili jednokomornim špricem.

[0103] Hidrogelovi nisu ototoksični. Hidrogelovi su ubrizgani u bubne opne miševa nakon perforacija. Jedno uho je napunjeno polimerom, dok suprotno uho nije imalo injekciju (kontrolu). Akustički evocirani potencijali (AEP) i otoakustičke emisije proizvoda distorzije (DPOAE) izmereni su 60 dana nakon što su obe bubne opne hirurški perforirane kod 9 miševa. U trenutku kada su bubne opne spontano zarasle, nije bilo razlika u slušnim pragovima između dve strane (Slika 2). Podaci pokazuju da hidrogelovi nisu ototoksični.

[0104] HB-EGF tretira hronične perforacije bubne opne. Kada je kohorta hroničnih perforacija u mišjim ušima tretirana sa 40 µl gela koji sadrži rekombinantni HB-EGF u koncentraciji od 5 µg/ml (doza sa produženim oslobađanjem preko polimera na bazi hitozana koji se može apsorbovati), zaraslo je 92% (22 od 24), u poređenju sa 38% (10 od 26) kod kontrole (samo polimer) nakon 4 nedelje (p <0,01). Sposobnost da se prevaziđe ovaj kritični korak u BO hroničnom zarastanju rana korišćenjem GF za aktiviranje izlivanja GFR ektodomenskog liganda pokazuje njegovu pogodnost za intervenciju primenom bioterapeutika. Ovo je prvi tretman faktora rasta testiran na životinjskom modelu hronične perforacije koji je pokazao značajnu korist u odnosu na kontrolu.

[0105] HB-EGF zarasta hronične perforacije bubne opne sa okluzijom Eustahijeve tube. Stvoren je životinjski model hronične perforacije BO i okluzije ET, kao što je prikazano na Slici 3. Postojeći pacovski model ET pacova (pogledati Herda i dr. (2002) Laryngoscope 112:1657-62) je prilagođen miševima, i od tada je uspešno izveden na 80 živih miševa. Okluzija ET je izvedena gore opisanim modelom hronične perforacije. Ovo je stvorilo mokro sterilno pražnjenje perforacije u roku od 3 meseca. Ovaj model oponaša ljudsko stanje hronične perforacije u kombinaciji sa disfunkcijom ET.

[0106] Kada je kohorta miševa sa ovim modelom (hronična perforacija i okluzija ET) tretirana rekombinantnim HB-EGF, 40 µl u koncentraciji od 5 µg/ml (doza za produženo oslobađanje preko hitosan polimera koji se može bioapsorbovati), 94% (18 od 19) je zaraslo u poređenju sa 9% (2 od 23) sa kontrolom (samo polimer) nakon 6 nedelja (p <0,01). Reprezentativne slike zaraslih ili nezaraslih hroničnih perforacija prikazane su na Slici 4. Histološke perforacije su zatvorene debelim slojem keratinocita, u poređenju sa kontrolama kojima nedostaje sloj keratinocita, čak i u onim malim slučajevima kada je došlo do zatvaranja. Sposobnost da se prevaziđe ovaj kritični korak u zarastanju hroničnih BO rana, korišćenjem HB-EGF za aktiviranje izlivanja EGFR ektodomenskog liganda u prisustvu efuzija srednjeg uha i okluzije ET, korisna je u tretmanu pacijenata sa hroničnom perforacijom bubne opne.

[0107] Ispitivanje na životinjskom modelu za hronično supurativno zapaljenje srednjeg uha. Nakon kreiranja modela hronične perforacije sa okluzijom ET, Pseudomonas aeruginosa (doza 6x10<9>jedinice koja formiraju koloniju po ml) su inokulirane u srednje uho kroz postojeće hronične perforacije. Nakon dve nedelje sakupljena je ušna tečnost i poslata je na lančanu reakciju polimeraze (PCR) kako bi se potvrdilo prisustvo bakterija. Ovaj pozitivni PCR potvrdio je CSOM model.

[0108] Miševi su zatim podeljeni u dve kohorte. Jedna je primila samo polimer. Druga je primila polimer i HB-EGF pri 5 µg/ml (ista doza kao ona korišćena u gore navedenim modelima). 100% HB-EGF grupe je zaraslo (16 od 16) u poređenju sa 41% (7/17) u kontrolnoj grupi (p <0,01). U kontrolnoj grupi, kada se dogodilo isceljivanje je bilo različito. BO je često bila vrlo tanka i prozirna u poređenju sa blago neprozirnom normalnom BO. Zarastanje u HB-EGF grupi izgledalo je normalno. Postupak tretmana potvrđuje sposobnost da se prevaziđe ovaj kritični korak u zarastanju hroničnih BO rana korišćenjem HB-EGF za aktiviranje EGFR ektodominskog liganda, u modelu koji je najbliži ljudskom CSOM.

Primer 3

[0109] Trans-bubni način isporuke (Slike 5, 6 i 7). Isporuka Nosač za HB-EGF ili HB-EGF isporuka se postavljaju preko bubne opne ili se umeću putem trans-kanala ili kroz Eustahijevu tubu. Može se ukloniti nakon određenog vremenskog perioda, ili može biti biorazgradiv. Nosač može da sadrži dizajn koji će ga zadržati unutar bubne opne. To može biti kragna, manžetna, prirubnica, usek ili bilo koja promena u širini ili visini. Može da ih bude više od jednog, kako bi ga držali na mestu. Nosač može biti perforiran ili imati lumen bilo koje odgovarajuće dimenzije. Može postojati bilo koji broj prirubnica bilo koje širine i dimenzije, za koje se smatra da su dovoljne ili veće od onih potrebne da se nosač zadrži u bubnoj opni.

[0110] Na Slici 5 prikazan je ušni kanal 100; spoljno uho 110; i bubna opna 120. Takođe je prikazan uređaj za primenu transmembranskih lekova 125, koji ima širinu 130 i dužinu 140.

[0111] Na Slici 6 je prikazano alternativno otelotvorenje trans-bubnog uređaja za isporuku 126. Uređaj ima širinu 131 i dužinu 141. Uređaj 126 sadrži jedno ili oba od spoljnog ograničenja 150 i unutrašnjeg ograničenja 155, gde ograničenja ima širinu 160.

[0112] Na Slikama 7A-7B je prikazana još jedna varijanta trans-bubnog uređaja za isporuku 127. Slika 7A je pogled odozgo koji pokazuje ušni kanal 100 i bubnu opnu 120. Uređaj za isporuku 127 ima širinu 132 i dužinu 142. Uređaj sadrži mnoštvo prirubnica, 170, koje raspoređene po dužini uređaja, gde prirubnice imaju dužinu 171 i širinu 172. Slika 7B prikazuje presek uređaja.

Primer 4

Intra-bubni uređaj za isporuku

[0113] Uređaj za isporuku faktora rasta može se postaviti između slojeva bubne opne. Ako je čvrst nosač, može se postaviti podizanjem jednog ili više slojeva kao zakrilca, i zatim zamenom zakrilca nakon postavljanja. Ako je tečan, može se injektirati.

[0114] Na Slici 8 je prikazan intra-bubni uređaj za isporuku 128. Uređaj je ubačen u bubnu opnu, 120. Uređaj je širine 133 i dužine 143.

Primer 5

[0115] Postavljanje nosača kao čvrstog predmeta u blizini bubne opne (Slika 9). Nosač se može postaviti na bubnu opnu i pružiti lokalni izvor HB-EGF ili HB-EGF inhibitora. Nosač može biti postavljen medijalno ili bočno sa delom ili celom bubne opne. Deo kroz bubnu opnu može biti manji, veći ili iste veličine kao i perforacija, ako postoji.

[0116] Na Slici 9 prikazan je uređaj za isporuku faktora rasta 128 pored bubne opne 120. Uređaj je širine 134 i dužine 144.

Primer 6

[0117] Injekcioni postupak primene faktora rasta prikazana je na Slici 10. Formulacija koja sadrži faktor rasta 200 može se isporučiti u ušni kanal 100 radi uspostavljanja dodira sa bubnom opnom 120 na njenoj bočnoj i/ili medijalnoj površini, i može dalje teći u region perforacije bubne opne 121. Formulacija se može

1

otpustiti iz šprica 210, kroz cev za isporuku 220. Formulacija može da se pruži kao pojedinačni rastvor ili kao dva rastvora koja se mešaju u trenutku isporuke.

[0118] Dvokomorni špricevi su poznate u struci i lako su dostupni, npr. pogledati između ostalog: Lyo-Ject® dvokomorni špric; ili bilo koji od SAD patent bt. 5,971,953; SAD patentne prijave US20030040701; US20140012196; US 20130060232; Međunarodna prijava WO1999017820A1; itd.

[0119] Takve formulacije uključuju sastave koje se, posle mešanja, menjaju u viskoznije ili čvrsto stanje. Viskogeni agensa uključuju, ali nisu ograničeni na, gelan, N-izopropil akrilamid sa natrijum akrilatom i n-N-alkilakrilamidom, poliakrilnu kiselinu sa polietilen glikolom, polimetakrilnu kiselinu sa polietilen glikolom, CARBOPOL® sa hidroksipropilmetilcelulozom, celuloza acetat hidrogen ftalat lateks, natrijum altagat, ili reverzni termoodređujući gel kao što su poloksamer ili poloksamin.

[0120] Takve formulacije se mogu isporučiti na spoljnu, epidermalnu površinu bubne opne u tečnom stanju, tj. u tečnom obliku. Nakon primene, međutim, sastav se transformiše u čvrsto stanje, tako da sastav ostaje u dodiru sa bubnom opnom. Kao rezultat toga, sastav ostaje lokalizovana na bubnoj opni i farmakološki agens može da se prebaci na bubnu opnu. Viskozni ili čvrsti sastav može biti biorazgradiv ili nebiorazgradiv.

1

Claims (32)

Patentni zahtevi

1. Agens koje pruža aktivnost heparin-vezujućeg epidermalnog faktora rasta (HB-EGF) za upotrebu u tretmanu hronične perforacije bubne opne kod pojedinca.

2. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je agens HB-EGF protein.

3. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, gde je HB-EGF ljudski HB-EGF.

4. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde je HB-EGF protein rastvorljiv oblik HB-EGF proteina.

5. Agens za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4, gde tretman sadrži:

dovođenje u dodir mesta hronične perforacije bubne opne sa farmaceutskom formulacijom koja sadrži efektivnu dozu agensa u vremenskom periodu koji je dovoljan za značajno zatvaranje perforacije.

6. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, gde je formulacija u dodiru sa oštećenom bubnom opnom tokom perioda od najmanje 7 dana.

7. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je formulacija u dodiru sa oštećenom bubnom opnom tokom perioda od najmanje 2 nedelje.

8. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 4 ili 5, gde se formulacija primenjuje najmanje jednom dnevno.

9. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, gde formulacija pruža produženo oslobađanje agensa.

10. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, gde je formulacija pružena u obliku vodenog rastvora, gela, losiona, balzama, paste ili drugog nosača.

11. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, gde se formulacija primenjuje sprejem.

12. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, gde se formulacija primenjuje kao tečnost koja potom očvrsne kako bi ostala u blizini bubne opne.

13. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je formulacija gel sa produženim oslobađanjem koji sadrži umreženi kopolimer hitozana i polilaktida.

14. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde gel sa produženim oslobađanjem dalje sadrži fibrinogen.

15. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde se formulacija isporučuje pomoću uređaja koji pruža produženo oslobađanje agensa.

16. Agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde formulacija dalje sadrži najmanje jedan dodatni aktivan agens.

17. Farmaceutska formulacija za upotrebu u tretmanu hronične perforacije bubne opne, koja sadrži efektivnu dozu agensa koji pruža aktivnost heparin-vezujućeg epidermalnog faktora rasta (HB-EGF).

18. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, gde je agens HB-EGF protein.

19. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 18, gde je HB-EGF protein ljudski HB-EGF protein.

20. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, gde je HB-EGF protein rastvorljiv oblik HB-EGF proteina.

21. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 17-20, gde je formulacija u dodiru sa mestom hronične perforacije bubne opne u vremenskom periodu koji je dovoljan za značajno zatvaranje perforacije.

22. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 21, gde je formulacija u dodiru sa mestom hronične perforacije bubne opne tokom perioda od najmanje 7 dana.

23. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 21, gde je formulacija u dodiru sa mestom hronične perforacije bubne opne tokom perioda od najmanje 2 nedelje.

24. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 21, gde se formulacija primenjuje najmanje jednom dnevno.

25. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 21, gde formulacija pruža produženo oslobađanje agensa.

26. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, gde je formulacija pružena u obliku vodenog rastvora, gela, losiona, balzama, paste ili drugog nosača.

27. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, gde se formulacija primenjuje sprejem.

28. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, gde je formulacija primenjena kao tečnost koja potom očvrsne kako bi ostala u blizini bubne opne.

29. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, gde je formulacija pružena kao gel sa produženim oslobađanjem koji sadrži umreženi kopolimer hitozana i polilaktida.

30. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 29, gde gel sa produženim oslobađanjem dalje sadrži fibrinogen.

31. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, gde je formulacija isporučena pomoću uređaja koji pruža kontinuirano oslobađanje agensa.

32. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, gde formulacija dalje sadrži najmanje jedan dodatni aktivan agens.

1