RS60421B1 - Inhibitorni peptidi poreklom od aktivirajućeg receptora eksprimiranog na mijeloidnim ćelijama-1 (trem-1) i trem-sličnog transkripta 1 (tlt-1) i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak se odnosi na upotrebu peptida sa manje od 50 aminokiselina koji sadrži najmanje 6 uzastopnih aminokiselina odabranih iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 u lečenju kardiovaskularnih bolesti.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Kardiovaskularne bolesti, znak mnogih bolesti, vodeći su uzrok smrti širom sveta.

[0003] Infarkt miokarda ili mozga primer je složenog kliničkog sindroma koji je rezultat škodljive i oštećujuće, trajne ili privremene ishemije miokarda. Obično je uzrokovan okluzijom koronarne/cerebralne arterije, što dovodi do neravnoteže između snabdevanja i potrebe za kiseonikom.

[0004] Oštećenja tkiva zavise od trajanja ishemije. Kod ishemije od samo 5 minuta ishemično tkivo se na kraju oporavlja nakon reperfuzije, bez simptoma infarkta ili smrtonosnih posledica. Međutim, ishemija značajnog trajanja dovodi do infarkta i upalne reakcije. Zaista, infarkt je povezan sa upalnom reakcijom, koja je preduslov zaceljenja i stvaranja ožiljaka [Entman M.L. et al., 1994 and Mehta J.L. et al., 1999]. Ovaj odgovor se pojačava u pogledu jačine i trajanja pri reperfuziji ishemičnog tkiva.

[0005] Ovaj odgovor ima više faza: početna ishemija indukuje nekrozu, stvaranje kiseoničnih vrsta u vidu slobodnih radikala, aktivaciju komplementa i kaskadu citokina koja je pokrenuta oslobađanjem TNF-alfa. Faza reperfuzije područja zahvaćenog infarktom povezana je sa pojačanom i ubrzanom upalnom reakcijom odgovornom za regrutovanje leukocita na mestu ishemije. Regrutovani leukociti takođe učestvuju u in situ i sistemskom oslobađanju medijatora upale, što najzad dovodi do hiperaktiviranog zapaljenskog stanja, odgovornog za patofiziološke posledice infarkta.

[0006] Svi posrednici upale imaju kontroverzna dejstva. Zaista, fiziopatologija infarkta je izbalansirana između njihovih korisnih i štetnih efekata. Na primer, TNF-alfa pokazuje zaštitno delovanje na ćelije tokom ishemije miokarda, kao i štetne efekte [Harjot K Saini. et al., 2005], u zavisnosti od vremena, trajanja i nivoa njegove ekspresije i oslobađanja. Ovo može da objasni složenost terapije koja se zasniva na blokiranju takvih medijatora upale.

[0007] Oslobađanje medijatora upale (citokini, hemokini, ROS...) i masovno regrutovanje leukocita igraju važnu ulogu u svim fazama ishemijske kaskade, od ranih štetnih događaja pokrenutih arterijskom okluzijom, do kasnih regenerativnih procesa koji se nalaze u osnovi oporavka post-ishemijskog tkiva. Mnoge terapijske strategije koje ciljno deluju na ovaj upalni odgovor nisu pokazale nikakvu efikasnost. Sada deluje očigledno da je vredno pokušaja delovanje na amplifikacione petlje, a ne na pojedinačni medijator upale izazvan ishemijom.

[0008] Ateroskleroza dovodi do cerebrovaskularne bolesti i bolesti koronarnih arterija kroz stvaranje lezija koje se sporo razvija i suženje lumena arterija. Nakon rupture plakova i tromboze, ovi najčešći oblici kardiovaskularne bolesti manifestuju se kao akutni koronarni sindrom (ACS), infarkt miokarda ili moždani udar. Istraživanja na ljudima i životinjama utvrdila su da aterosklerozu pokreće hronični upalni proces unutar arterijskog zida iniciran uglavnom kao odgovor na endogeno modifikovane strukture, naročito oksidovane lipoproteine koji stimulišu i urođene i adaptivne imune odgovore. Urođeni odgovor je podstaknut aktiviranjem i vaskularnih ćelija i monocita/makrofaga, nakon čega se razvija adaptivni imuni odgovor protiv niza potencijalnih antigena koje efektorskim T limfocitima prezentuju antigen-prezentujuće ćelije [Ait-Oufella H et al., 2011]. Modeli u vidu genetski modifikovanih miševa naučili su nas da hemokini regrutuju cirkulišuće monocite u vaskularni zid, koji zatim postaju makrofagi i penaste ćelije napunjene lipidima. Makrofagi sloja intime podstiču razvoj plakova kroz oslobađanje citokina, pojačavanje upale i destabilizaciju plakova kroz proizvodnju proteaza i akumulaciju apoptoze [Libby P.2002].

[0009] Monocite/makrofage stimuliše nekoliko medijatora nazvanih PAMP (molekularni obrasci povezani sa patogenom) koji međusobno reaguju sa PRR (receptori za prepoznavanje patogena). Nekoliko PRR je umešano u fiziopatologiju ateroskleroze. Na primer, toll-u slični receptori se eksprimiraju u ateroskleroznim lezijama kod ljudi i životinja. Inhibicija TLR smanjuje razvoj ateroskleroze kod miševa što sugeriše da bi ciljno delovanje na takve puteve moglo da ispolji zaštitno dejstvo u odnosu na razvoj ateroskleroze [Bjorkbacka H et al., 2004].

[0010] Nedavno je opisna nova familija receptora eksprimiranih na mijeloidnim ćelijama: aktivirajući receptori eksprimirani na mijeloidnim ćelijama (TREM). U okviru ove familije, TREM-1 se eksprimira na monocitima/makrofagima i neutrofilima. Aktivacija TREM-1 dovodi do proizvodnje citokina i hemokina (TNF-α, IL-6, IL-8, MCP-1 i -3, MIP-1α...) zajedno sa brzom degranulacijom neutrofila i oksidativnom eksplozijom [Radsak MP et al., 2004 i Hara H, et al., 2009].

[0011] Funkcija TREM-1 je da moduliše/pojačava, pre nego da aktivira/inicira, zapaljenje u sinergiji sa TLR u cilju pokretanja snažnog imunog odgovora. Patofiziološka uloga TREM-1 prvo je utvrđena tokom zaraznih bolesti. Zaista, pokazalo se da su polipeptidi koji sadrže najmanje 6 uzastopnih aminokiselina iz TREM-1 sposobni da leče simptome sepse, septičkog šoka ili stanja sličnih sepsi. [WO2006/056492]. Za TREM-1 se takođe zna da igra presudnu ulogu tokom aseptične upale, kako akutne (mezenterična ishemija-reperfuzija, hemoragični šok, upala pankreasa...), tako i hronične (upalne bolesti creva, reumatske bolesti...). Nalazi iz laboratorije pronalazača pokazuju da primena sintetičkog peptida od 17 aminokiselina koje obuhvataju petlju 3 komplementarnog regiona TREM-1 kod pacova podvrgnutih crevnoj ishemiji-reperfuziji delimično sprečava kardiovaskularni kolaps, laktacidozu, sistemski i hepatični upalni odgovor povezan sa mezenteričnom ishemijom-reperfuzijom [Gibot et al. Crit Care Med.2008].

[0012] TLT-1 (Trem-slični transkript-1) je član familije TREM koji se isključivo nalazi na megakariocitima i trombocitima. Prvo je utvrđeno da TLT-1 igra ulogu tokom agregacije trombocita povezivanjem fibrinogena i stabilizovanjem agregata trombocita. Međutim, novi nalazi iz laboratorije pronalazača o TLT-1, rastvorljivom TLT-1 i polipeptidima poreklom od sTLT-1 pokazali su da TLT-1 ima važnu ulogu tokom upale zbog specifične inhibicije TREM-1 [Derive M et al., 2012, WO2010/124685].

[0013] Washington et al. su opisali da TLT-1 ima zaštitnu ulogu tokom zapaljenja tako što olakšava agregaciju trombocita na mestima oštećenja krvnog suda (Washington et al., J Clin Invest. 2009).

[0014] Budući da je poznato da je agregacija trombocita povezana sa najgorim ishodom tokom kardiovaskularnih bolesti (npr. infarkt miokarda i ateroskleroza), otkriće da peptidi poreklom od TLT-1 imaju terapijsko dejstvo na kardiovaskularne bolesti, bilo je iznenađujuće.

[0015] Pronalazači ovde opisuju da TREM-1 eksprimiraju 1) endotelne ćelije aorte, mezenterične arterije i mikrovaskularne ćelije 2) tkiva miokarda i da je njegova ekspresija ushodno regulisana u područjima zahvaćenim infarktom posle ishemije miokarda (trajna ishemija miokarda i prolazna ishemija miokarda) 3) makrofagi regrutovani u ateromatozne plakove.

[0016] Pronalazači su takođe pokazali da peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 mogu specifično da inhibiraju TREM-1, i smanje zapaljenski odgovor povezan sa TREM-1 kod infarkta miokarda i ateroskleroze.

[0017] Kao rezultat toga, primena ovih peptida tokom akutne faze dva različita modela ishemije miokarda (trajna ishemija i prolazna ishemija) bila je odgovorna za modulaciju in situ zapaljenskog odgovora i posledični protok leukocita, čime je ograničena post-ishemijska remodelacija srca i kasnije faze progresije bolesti. Zaista, srčana funkcija je dramatično poboljšana 6 nedelja nakon trajne ishemije, kao i prolazne ishemije (ishemija-reperfuzija). Ovo je dovelo do poboljšanog preživljavanja.

[0018] Pronalazači su najzad pokazali ulogu peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 u smanjenju stepena formiranja ateromatoznih plakova specifičnom inhibicijom TREM-1.

[0019] Prema tome, pronalazak se odnosi na peptid koji sadrži najmanje 6 uzastopnih aminokiselina odabranih iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 za upotrebu u lečenju kardiovaskularnih bolesti.

REZIME

[0020] Jedan od ciljeva pronalaska je peptid koji sadrži najmanje 6 uzastopnih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 za upotrebu u lečenju kardiovaskularnih bolesti, pri čemu je kardiovaskularna bolest odabrana od infarkta miokarda ili mozga, akutnog infarkta miokarda, koronarne bolesti srca, akutnog koronarnog sindroma, moždanog udara, aneurizme, stabilne ili naporom izazvane angine pektoris, kardiomiopatije, hipertenzivne bolesti srca, srčane slabosti (hronične i akutne), plućnog srca, poremećaja srčanog ritma, upalne bolesti srca poput endokarditisa, miokarditisa, periferne arterijske bolesti, miokardne i vaskularne disfunkcije povezane sa SIRS, i ateroskleroze.

[0021] U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid sadrži sekvencu od 6 uzastopnih aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ili SEQ ID NO: 7.

[0022] U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid ima dužinu od 6 do 20 aminokiselina.

[0023] U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ili SEQ ID NO: 7.

[0024] U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 4.

[0025] U jednom primeru izvođenja, kardiovaskularna bolest je infarkt miokarda.

[0026] U još jednom primeru izvođenja, kardiovaskularna bolest je ateroskleroza.

[0027] U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid treba da se injektuje subjektu kome je to potrebno za upotrebu u lečenju kardiovaskularne bolesti, gde je kardiovaskularna bolest odabrana od infarkta miokarda ili mozga, akutnog infarkta miokarda, koronarne bolesti srca, akutnog koronarnog sindroma, moždanog udara, aneurizme, stabilne ili naporom izazvane angine pektoris, kardiomiopatije, hipertenzivne bolesti srca, srčane slabosti (hronične i akutne), plućnog srca, poremećaja srčanog ritma, upalne bolesti srca poput endokarditisa, miokarditisa, periferne arterijske bolesti, miokardne i vaskularne disfunkcije povezane sa SIRS, i ateroskleroze.

[0028] U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid treba davati u kombinaciji sa jednim ili više drugih jedinjenja protiv kardiovaskularne bolesti.

[0029] U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid treba davati u kombinaciji sa jednim ili više drugih jedinjenja protiv kardiovaskularne bolesti odabranih od statinskih jedinjenja, antikoagulantnog pristupa, anti-aldosteronskih jedinjenja, ACE inhibitora i beta-blokatora.

DETALJAN OPIS

Definicije

[0030] U specifikaciji se koristi nekoliko pojmova i oni su definisani u sledećim paragrafima.

[0031] Kako se ovde koristi, pojam "TLT-1" za "TREM-sličan transkript 1" označava člana familije TREM. Početni rad grupe Mcvicar [Washington A.V. et al., 2004] pokazao je da je TLT-1 obilno zastupljen, specifičan za trombocitnu i megakariocitnu liniju, i smešten u α granulama trombocita. Nakon aktivacije trombocita pomoću trombina ili LPS, TLT-1 se premešta na površinu trombocita. TLT-1 sadrži ekstracelularni domen tipa v-seta Ig, transmembranski region i citoplazmatski rep koji sadrži imunoreceptorni tirozinski inhibitorni motiv (ITIM) i poliprolinom bogat domen. Za razliku od drugih članova familije TREM, TLT-1 se ne sparuje sa aktivirajućim lancem DAP 12, dok je pokazano da pojačava signalni put Ca<++>u pacovskim ćelijama bazofilne leukemije (RBL), što sugeriše da je TLT-1 ko-aktivatorni receptor. Aminokiselinska sekvenca TLT-1 opisana je kao aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 1.

[0032] Kako se ovde koristi, pojam "TREM-1", skraćeno od "aktivirajući receptor eksprimiran na mijeloidnim ćelijama 1" označava molekul ćelijske površine koji je identifikovan i na humanim i mišjim polimorfonuklearnim neutrofilima i zrelim monocitima. Pripada imunoglobulinskoj superfamiliji i aktivira nishodne signalne puteve uz pomoć proteinskog adaptera nazvanog DAP12. Ekspresija TREM-1 je snažno ushodno regulisana na neutrofilima i monocitima u prisustvu bakterija kao što su Pseudomonas aeruginosa ili Staphylococcus aureus, i u ćelijskoj kulturi, i u uzorcima tkiva uzetim od pacijenata sa infekcijom. Nasuprot tome, TREM-1 nije ushodno regulisan u uzorcima uzetim od pacijenata sa neinfektivnim zapaljenskim oboljenjima kao što su psorijaza, ulcerozni kolitis ili vaskulitis izazvan imunim kompleksima. Osim toga, kada je TREM-1 vezan za ligand, zapaža se sinergističko dejstvo LPS i pojačana sinteza proinflamatornih citokina kao što je TNF-[alfa] zajedno sa inhibicijom proizvodnje IL-10. Aminokiselinska sekvenca TREM-1 opisana je kao aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 2.

[0033] Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1, opisani su u tabeli 1 ispod.

Tabela 1: Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1.

[0034] Kako se ovde koristi, pojam "funkcionalno-konzervativne varijante" označava peptide poreklom od peptida prema pronalasku u kome je data aminokiselinska rezidua u proteinu ili enzimu izmenjena bez menjanja ukupne konformacije i funkcije peptida, uključujući, ali bez ograničenja, zamenu aminokiseline onom sa sličnim svojstvima (kao što je, na primer, polarnost, potencijal vezanja vodonika, kiselost, baznost, hidrofobnost, aromatičnost, i slično). Aminokiseline osim onih koje su označene kao konzervativne, mogu da se razlikuju u proteinu tako da procenat sličnosti proteinske ili aminokiselinske sekvence između bilo koja dva proteina slične funkcije može da varira i može da bude, na primer, od 70% do 99% određeno postupkom za poravnanje kao što je Metoda klastera, u kojoj se sličnost zasniva na algoritmu MEGALIGN. "Funkcionalno-konzervativna varijanta" takođe uključuje peptid koji ima najmanje 20% aminokiselinske identičnosti određeno pomoću algoritama BLAST ili FASTA, poželjno 40% poželjnije 60%, poželjno najmanje 75%, najpoželjnije najmanje 85%, i čak poželjnije najmanje 90%, i koji ima ista ili suštinski ista svojstva ili funkcije kao nativni ili parentalni protein sa kojim se poredi.

[0035] Kako se ovde koristi, pojam "derivat" se odnosi na varijaciju peptida prema pronalasku ili njegove funkcionalno-konzervativne varijante koja je drugačije modifikovana, tj. kovalentnim vezivanjem bilo kog tipa molekula za peptid, dodavanjem hemijskog jedinjenja u bilo kojoj od aminokiselina sekvence, u cilju modifikovanja in vitro ili in vivo konformacije, aktivnosti, specifičnosti, efikasnosti ili stabilnosti peptida.

[0036] Kako se ovde koristi, pojmovi "lečiti" ili "lečenje", označavaju reverziju, ublažavanje, inhibiciju napredovanja, ili prevenciju poremećaja ili stanja na koje se takav pojam primenjuje, ili jednog ili više simptoma takvog poremećaja ili stanja.

[0037] Prema pronalasku pojmovi "farmaceutski" ili "farmaceutski prihvatljiv" označavaju entitete i kompozicije koji ne proizvode štetne, alergijske ili druge neželjene reakcije kada se primene kod sisara, posebno čoveka, ako je prikladno. Farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens odnosi se na netoksični čvrsti, polu-čvrsti ili tečni punilac, razblaživač, materijal za inkapsulaciju ili pomoćno sredstvo za formulaciju bilo kog tipa.

[0038] Prema pronalasku, pojam "pacijent" ili "subjekt" koga treba lečiti, odnosi se na čoveka ili sisara koji nije čovek (kao što je glodar (miš, pacov), mačka, pas, ili primat) koji je pogođen ili je verovatno da će biti pogođen zapaljenskim poremećajima. Poželjno, subjekt je čovek.

Peptidi

[0039] Jedan aspekt pronalaska odnosi se na peptid koji sadrži najmanje 6 uzastopnih aminokiselina odabran iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 za upotrebu u lečenju kardiovaskularne bolesti, pri čemu je kardiovaskularna bolest odabrana od infarkta miokarda ili mozga, akutnog infarkta miokarda, koronarne bolesti srca, akutnog koronarnog sindroma, moždanog udara, aneurizme, stabilne ili naporom izazvane angine pektoris, kardiomiopatije, hipertenzivne bolesti srca, srčane slabosti (hronične i akutne), plućnog srca, poremećaja srčanog ritma, upalne bolesti srca poput endokarditisa, miokarditisa, periferne arterijske bolesti, miokardne i vaskularne disfunkcije povezane sa SIRS, i ateroskleroze.

[0040] U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid nije SEQ ID NO: 1.

[0041] U jednom primeru izvođenja, navedeni peptid nije SEQ ID NO: 2.

[0042] U jednom primeru izvođenja, peptid ima dužinu manju od 50 aminokiselina, manju od 40, 35, 30, 25, 20 aminokiselina.

[0043] U poželjnom primeru izvođenja, peptid prema pronalasku ima dužinu od 6 do 20 aminokiselina, ili 10 do 20 aminokiselina, ili 12 do 18 aminokiselina ili 14 do 16 aminokiselina.

[0044] U poželjnom primeru izvođenja, peptid prema pronalasku ima dužinu od 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 aminokiselina.

[0045] U još jednom primeru izvođenja, peptid prema pronalasku sadrži sekvencu od 6 uzastopnih aminokiselinska odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7.

[0046] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, peptid prema pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 3.

[0047] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, peptid prema pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 4.

[0048] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, peptid prema pronalasku sastoji se od aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7.

[0049] U još jednom primeru izvođenja, peptid prema pronalasku može da ima D- ili L-konfiguraciju.

[0050] U još jednom primeru izvođenja, aminokiselina na amino-kraju peptida prema pronalasku ima acetilovanu terminalnu amino grupu, a aminokiselina na karboksilnom kraju ima amidovanu terminalnu karboksilnu grupu. Prema tome, pronalazak takođe uključuje derivate peptida prema pronalasku u kojima je amino-terminalni kraj acetilovan ili u kojima je karboksi-terminalni kraj amidovan.

[0051] Pored toga, peptidi prema pronalasku mogu da podležu reverzibilnim hemijskim modifikacijama u cilju povećanja njihove bioraspoloživosti (uključujući stabilnost i rastvorljivost u mastima) i njihovu sposobnost da prodru kroz krvno-moždanu barijeru i epitelno tkivo. Primeri takvih reverzibilnih hemijskih modifikacija uključuju esterifikaciju karboksi-grupa glutaminskih i asparaginskih aminokiselina alkoholom, čime se uklanja negativno naelektrisanje aminokiseline i povećava njena hidrofobnost. Ova esterifikacija je reverzibilna, jer formiranu estarsku vezu prepoznaju intracelularne esteraze koje je hidrolizuju, ponovo uspostavljajući naelektrisanje na asparaginskim i glutaminskim reziduama. Neto efekat je nagomilavanje intracelularnog peptida, jer internalizovani, deesterifikovani peptid ne može da prođe kroz ćelijsku membranu.

[0052] Još jedan primer takvih reverzibilnih hemijskih modifikacija uključuje dodavanje dodatne peptidne sekvence, koja omogućava povećanje membranske permeabilnosti, kao što je peptid TAT ili peptid Penetratin (videti - Charge-Dependent Translocation of the Trojan. A Molecular View on the Interaction of the Trojan Peptide Penetratin with the 15 Polar Interface of Lipid Bilayers. Biophysical Journal, Volume 87, Issue 1, 1 July 2004, Pages 332-343).

[0053] Peptidi prema pronalasku mogu da se dobiju uobičajenim postupcima hemijske sinteze peptida na čvrstoj fazi, praćenjem metodologije Fmoc i/ili metodologije na bazi Boc 20 (videti Pennington, M.W. i Dunn, B.N. (1994). Peptide synthesis protocols. Humana Press, Totowa.).

[0054] Alternativno, peptidi prema pronalasku mogu da se dobiju uobičajenim postupcima na bazi tehnologije rekombinantne DNK, npr., postupkom koji, ukratko, uključuje inserciju sekvence nukleinske kiseline koja kodira peptid prema pronalasku u odgovarajući plazmid ili vektor, transformaciju kompetentnih ćelija navedenim plazmidom ili vektorom, i gajenje navedenih ćelija pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju peptida prema pronalasku i, ako je potrebno, izolovanje i (opciono) prečišćavanje peptida prema pronalasku uobičajenim sredstvima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira peptid prema pronalasku može lako da se izvede iz korelacije koja postoji između aminokiselina i nukleotidnih kodona koji kodiraju te aminokiseline. U tom slučaju, dodatni cilj pronalaska je izolovana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira peptid prema pronalasku. U konkretnom primeru izvođenja, navedena nukleinska kiselina odabrana je od jednolančane DNK, dvolančane DNK, i RNK. Dodatni ciljevi pronalaska su plazmidi i ekspresioni vektori koji sadrže navedenu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid prema pronalasku, kao i prokariotske ili eukariotske ćelije koje eksprimiraju peptid prema pronalasku. Pregled principa tehnologije rekombinantne DNK može da se nađe, na primer, u knjizi pod nazivom "Principles of Gene Manipulation: An 5 Introduction to Genetic Engineering," R.W. Old & S.B. Primrose, objavljenoj kod Blackwell Scientific Publications, 4. izdanje (1989).

[0055] Kao što je opisano, pronalazak takođe uključuje peptide koji su funkcionalno ekvivalentni peptidima prema pronalasku ili "funkcionalno-konzervativne varijante". U smislu upotrebljenom u ovom opisu, izraz "funkcionalno ekvivalentan" znači da peptid o kome je reč ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti kao peptid prema pronalasku, kao što je, na primer, sposobnost da smanji zapaljensku reakciju.

[0056] Dejstvo peptida prema pronalasku postaće očigledno stručnjaku u ovoj oblasti primenom jednostavnog testa za procenu smanjenja zapaljenske reakcije kod kardiovaskularnih bolesti zahvaljujući peptidima. Na primer, 5x10<5>izolovanih humanih neutrofila ili makrofaga ili endotelnih ćelija inkubira se u prisustvu100 ng/mL LPS i/ili 10 µg/mL anti-TREM-1 mAb sa ili bez 20 µg/mL polipeptida 24 časa na 37°C / 5% CO2. Zatim se sakupi supernatant i koncentracije TNF-α, IL-6 i GM-CSF se izmere ELISA testom. Ako ispitivani peptid inhibira TREM-1, koncentracije citokina moraju da opadnu za do 30% ili više u poređenju sa uslovima bez peptida.

Nukleinske kiseline, vektori i rekombinantne ćelije-domaćini prema pronalasku

[0057] Drugi aspekt pronalaska odnosi se na molekul nukleinske kiseline koja kodira peptide prema pronalasku.

[0058] U poželjnom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira peptid koji ima sekvencu SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7.

1

[0059] "Kodirajuća sekvenca" ili sekvenca "koja kodira" proizvod ekspresije, kao što je RNK, peptid, protein, ili enzim, je nukleotidna sekvenca koja, kada se eksprimira, rezultuje proizvodnjom te RNK, peptida, proteina, ili enzima, tj., nukleotidna sekvenca kodira aminokiselinsku sekvencu za taj peptid, protein ili enzim. Kodirajuća sekvenca za protein može da uključuje start kodon (obično ATG) i stop kodon.

[0060] Ovi molekuli nukleinske kiseline mogu da se dobiju uobičajenim postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, posebno usmerenom mutagenezom gena koji kodira nativni protein. Tipično, navedena nukleinska kiselina je molekul DNK ili RNK, koji može da bude ugrađen u pogodni vektor, kao što je plazmid, kozmid, epizom, veštački hromozom, fag ili virusni vektor.

[0061] Prema tome, sledeći cilj predmetnog pronalaska odnosi se na vektor i ekspresionu kasetu u kojoj je molekul nukleinske kiseline prema pronalasku povezan sa odgovarajućim elementima za kontrolu transkripcije (konkretno promotorom, pojačivačem i, opciono, terminatorom) i opciono translacije, kao i rekombinantne vektore u koje je ubačen molekul nukleinske kiseline prema pronalasku. Ovi rekombinantni vektori mogu, na primer, da budu klonirajući vektori, ili ekspresioni vektori.

[0062] Pojmovi "vektor", "klonirajući vektor" i "ekspresioni vektor" označavaju nosač pomoću koga sekvenca DNK ili RNK (npr. strani gen) može da bude introdukovana u ćeliju-domaćina, tako da transformiše domaćina i podstakne ekspresiju (npr. transkripciju i translaciju) introdukovane sekvence.

[0063] Bilo koji ekspresioni vektor za životinjsku ćeliju može da bude upotrebljen, sve dok gen koji kodira peptid ili himerni derivat prema pronalasku može da bude insertovan i eksprimiran. Primeri pogodnih vektora uključuju pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSG1 beta d2-4 i slično.

[0064] Drugi primeri plazmidi uključuju replicirajuće plazmide koji sadrže oridžin replikacije, ili plazmide koji se integrišu, kao što su na primer pUC, pcDNA, pBR, i slično.

[0065] Drugi primeri virusnog vektora uključuju adenovirusne, retrovirusne vektore, vektore na bazi herpes virusa i AAV vektore. Takvi rekombinantni virusi mogu da budu proizvedeni tehnikama poznatim u ovoj oblasti, na primer transficiranjem ćelija za pakovanje ili tranzijentnom transfekcijom upotrebom pomoćnih plazmida ili 30 virusa. Tipični primeri ćelija za pakovanje virusa uključuju ćelije PA317, ćelije PsiCRIP, ćelije GPenv+, ćelije 293, itd. Detaljni protokoli za proizvodnju takvih replikativno-defektnih rekombinantnih virusa mogu da se nađu na primer u WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 i WO 94/19478.

[0066] Primeri promotora i pojačivača upotrebljenih u ekspresionom vektoru za životinjsku ćeliju uključuju rani promotor i pojačivač SV40 (Mizukami T. et al. 1987), LTR promotor i pojačivač virusa mišje leukemije Moloney (Kuwana Y et al., 1987), promotor (Mason JO et al., 1985) i pojačivač (Gillies SD et al., 1983) H lanca imunoglobulina, i slično.

[0067] Pronalazak takođe uključuje sisteme za isporuku gena koji sadrže molekul nukleinske kiseline prema pronalasku, koji mogu da se koriste u genskoj terapiji in vivo ili ex vivo. Ovo uključuje na primer virusne vektore za prenos kao što su oni poreklom od retrovirusa, adenovirusa, virusa povezanog sa adenovirusom, lentivirusa, koji se uobičajeno koriste u genskoj terapiji. Ovo takođe uključuje sisteme za isporuku gena koji sadrže molekul nukleinske kiseline prema pronalasku i nosač za isporuku gena koji nije virusnog porekla. Primeri nosača za isporuku gena koji nisu virusnog porekla uključuju lipozome i polimere kao što su polietilenimini, ciklodekstrini, polimeri histidin/lizin (HK), itd.

[0068] Još jedan cilj pronalaska takođe je prokariotska ili eukariotska ćelija-domaćin genetički transformisana najmanje jednim molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku.

[0069] Pojam "transformacija" označava introdukciju "stranog" (tj. spoljašnjeg ili ekstracelularnog) gena, DNK ili RNK sekvence u ćeliju-domaćina, tako da ćelija-domaćin eksprimira introdukovani gen ili sekvencu proizvodeći željenu supstancu, tipično protein ili enzim kodiran introdukovanim genom ili sekvencom. Ćelija-domaćin koja primi i eksprimira introdukovanu DNK ili RNK je "transformisana".

[0070] Poželjno, za eksprimiranje i proizvodnju peptida, i posebno peptida prema pronalasku, biće odabrane eukariotske ćelije, konkretno sisarske ćelije, i još konkretnije humane ćelije.

[0071] Tipično, mogu da se koriste ćelijske linije kao što su CHO, BHK-21, COS-7, C127, PER.C6 ili HEK293 25, zbog njihove sposobnosti obrade u pravilne posttranslacione modifikacije derivata.

[0072] Konstruisanje ekspresionih vektora prema pronalasku, transformacija ćelija-domaćina može da se obavi upotrebom uobičajenih tehnika molekularne biologije. Derivati c-subjedinice V-ATPase prema pronalasku, mogu, na primer, da se dobiju kultivisanjem genetski transformisanih ćelija prema pronalasku i izdvajanjem derivata koji eksprimira navedena ćelija iz kulture. Oni zatim mogu, ako je potrebno, da budu prečišćeni prema uobičajenim procedurama, poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, na primer frakcionisanom precipitacijom, konkretno precipitacijom amonijum sulfatom, elektroforezom, gel filtracijom, afinitetnom hromatografijom, itd.

[0073] Konkretno, uobičajeni postupci za dobijanje i prečišćavanje rekombinantnih proteina mogu da se koriste za proizvodnju proteina u skladu sa pronalaskom.

Terapeutske metode, upotrebe i farmaceutske kompozicije

[0074] Treći cilj predmetnog pronalaska odnosi se na peptid prema pronalasku za upotrebu u lečenju kardiovaskularne bolesti.

[0075] Cilj pronalaska je postupak za lečenje kardiovaskularne bolesti kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine peptida kao što je opisano u tekstu iznad. U jednom primeru izvođenja, navedeni postupak obuhvata primenu peptida kao što je opisano u tekstu iznad, pri čemu navedeni peptid inhibira TREM-1.

[0076] Kardiovaskularna bolest prema pronalasku uključuje, ali nije ograničena na infarkt miokarda i mozga, akutni infarkt miokarda, ishemiju, koronarnu bolest srca, akutni koronarni sindrom, moždani udar, aneurizmu, stabilnu ili naporom izazvanu anginu pektoris, kardiomiopatiju, hipertenzivnu bolest srca, srčanu slabost (hroničnu i akutnu), plućno srce, poremećaje srčanog ritma, upalnu bolest srca poput endokarditisa, miokarditisa, perifernu arterijsku bolest, miokardnu i vaskularnu disfunkciju povezanu sa SIRS, aterosklerozu.

[0077] U jednom primeru izvođenja, stanje kardiovaskularne bolesti je infarkt miokarda.

[0078] U još jednom primeru izvođenja, stanje kardiovaskularne bolesti je arteroskleroza.

[0079] U još jednom primeru izvođenja, stanje kardiovaskularne bolesti je miokardna i vaskularna disfunkcija povezana sa SIRS.

[0080] U jednom primeru izvođenja, kardiovaskularna bolest nije mezenterična ishemijareperfuzija.

[0081] U još jednom primeru izvođenja, kardiovaskularna bolest ne obuhvata kardiovaskularnu zaštitu tokom polimikrobne sepse.

[0082] U jednom primeru izvođenja, peptidi prema pronalasku se ne koriste za lečenje sepse.

[0083] U jednom primeru izvođenja, peptidi prema pronalasku se ne koriste za lečenje sindroma ishemije i reperfuzije.

[0084] U jednom primeru izvođenja, peptidi prema pronalasku se ne koriste za lečenje pacijenata sa hiperkoagulativnim stanjima.

[0085] U jednom primeru izvođenja, peptidi prema pronalasku se ne koriste za lečenje hemoragije povezane sa zapaljenjem.

[0086] U jednom primeru izvođenja, peptidi prema pronalasku se ne koriste za lečenje akutnog virusnog miokarditisa.

[0087] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, peptidi prema pronalasku koriste se za lečenje kardiovaskularne bolesti izabrane u grupi koja se sastoji od infarkta miokarda i mozga, ishemije miokarda, koronarne bolesti srca, moždanog udara, aneurizme, stabilne ili naporom

1

izazvane angine pektoris, kardiomiopatije, hipertenzivne bolesti srca, srčane slabosti (hronične i akutne), plućnog srca, poremećaja srčanog ritma, upalne bolesti srca poput endokarditisa, miokarditisa, periferne arterijske bolesti, miokardne i vaskularne disfunkcije povezane sa SIRS, i ateroskleroze.

[0088] U konkretnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na peptid aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 za upotrebu u lečenju kardiovaskularne bolesti.

[0089] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se takođe odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu prema pronalasku ili na plazmid prema pronalasku ili na ekspresioni vektor prema pronalasku ili na ćeliju-domaćina prema pronalasku za upotrebu u lečenju kardiovaskularne bolesti.

[0090] Peptidi prema pronalasku mogu da leče zapaljensko stanje zahvaljujući svojstvima receptora-mamca.

[0091] Pod "receptor-mamac", podrazumeva se da polipeptidi prema pronalasku (peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1) zarobljavaju ligand TREM-1 i sprečavaju njegova fiziološka dejstva na TREM-1.

[0092] Peptidi prema pronalasku mogu stoga da čine deo kombinovane terapije (usmerene na nekoliko terapijskih ciljeva) u cilju efikasnijeg zaustavljanja kardiovaskularne bolesti.

[0093] Dodatni cilj ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja uključuje terapeutski efikasnu količinu najmanje jednog peptida prema pronalasku, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom. U jednom određenom primeru izvođenja, navedena farmaceutska kompozicija takođe sadrži jedan ili više (COOH) peptida. Alternativno, farmaceutska kompozicija prema pronalasku može da sadrži terapeutski efikasnu količinu vektora koji sadrži najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid prema pronalasku, zajedno sa najmanje jednim adjuvansom i/ili farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom. Navedeni vektor može da se koristi u genskoj terapiji.

[0094] Pod "terapeutski efikasna količina" podrazumeva se dovoljna količina himernog derivata prema pronalasku za lečenje kardiovaskularne bolesti pri razumnom odnosu korist/rizik primenljivom na bilo koji medicinski tretman.

[0095] Jasno je da će ukupnu dnevnu dozu jedinjenja i kompozicija predmetnog pronalaska odrediti nadležni lekar u okviru razumne medicinske procene. Specifični terapeutski efikasni nivo doze za bilo kog konkretnog pacijenta zavisiće od raznih faktora, uključujući poremećaj koji se leči i ozbiljnost poremećaja; aktivnost specifičnog jedinjenja koje se koristi; specifičnu kompoziciju koja se koristi, starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol, i ishranu pacijenta; vreme primene, put primene, i brzinu ekskrecije specifičnog jedinjenja koje se koristi; trajanje lečenja; lekova koji se koriste u kombinaciji ili istovremeno sa specifičnim peptidom koji se koristi; i sličnih faktora dobro poznatih u oblasti medicine. Na primer, kao što je poznato stručnjaku u ovoj oblasti, lečenje može da se započne dozama jedinjenja na nivoima nižim od onih potrebnih za postizanje željenog terapijskog dejstva i da se doza postepeno povećava do postizanja željenog dejstva. Međutim, dnevna doza proizvoda može da varira u širokom rasponu od 0.01 do 1,000 mg po odrasloj jedinki na dan. Poželjno, kompozicije sadrže 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 i 500 mg aktivnog sastojka za simptomatsko podešavanje doze prema pacijentu koji se leči. Lek tipično sadrži od oko 0.01 mg do oko 500 mg aktivnog sastojka, poželjno od 1 mg do oko 100 mg aktivnog sastojka. Efikasna količina leka obično se dostavlja na nivou doze od 0.0002 mg/kg do oko 20 mg/kg telesne težine na dan, posebno od oko 0.001 mg/kg do 7 mg/kg telesne težine na dan.

[0096] Aktivni proizvodi prema pronalasku (peptidi, nukleinska kiselina, plazmid, ekspresioni vektor ili ćelija-domaćin) mogu da se primene za upotrebu u lečenju kardiovaskularnih bolesti.

[0097] Terapeutski efikasna količina aktivnog proizvoda prema pronalasku [peptidi ili vektori (konstrukcije)] koja treba da se primeni, kao i doza za lečenje patološkog stanja peptidima i/ili farmaceutskim kompozicijama prema pronalasku, zavisiće od brojnih faktora, uključujući starost i stanje pacijenta, ozbiljnosti smetnje ili poremećaja, načina i učestalosti primene i konkretnog peptida koji treba da se upotrebi.

[0098] Prezentacija farmaceutskih kompozicija koje sadrže peptide ili vektore (konstrukcije) prema pronalasku može da bude u bilo kom obliku koji je pogodan za primenu, npr., čvrstom, tečnom ili polu-čvrstom, kao što su kreme, masti, gelovi ili rastvori, i ove kompozicije mogu da se primene na bilo koje pogodne načine, na primer, oralno, parenteralno, inhalacijom ili topikalno, tako da će uključivati farmaceutski prihvatljive ekscipijense neophodne da se napravi željeni dozni oblik za određeni način primene. Pregled različitih farmaceutskih oblika za primenu lekova i ekscipijenasa neophodnih za njihovo dobijanje može da se nađe, na primer, u "Tratado de Farmacia Gal nica" (Treatise on Galenic Pharmacy), C. Faul i Trillo, 1993, Luz n 5, S.A. Ediciones, Madrid.

[0099] U farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska za oralnu, sublingvalnu, subkutanu, intramuskularnu, intravensku, transdermalnu, lokalnu, pulmonalnu ili rektalnu primenu, aktivni princip, sam, ili u kombinaciji sa drugim aktivnim principom, može se davati životinjama i ljudima kao jedinični dozni oblik, kao smeša sa uobičajenim farmaceutskim podlogama. Pogodni jedinični dozni oblici obuhvataju oblike za oralnu primenu, kao što su tablete, gel kapsule, prahovi, granule i oralne suspenzije ili rastvori, oblike za sublingvalnu i

1

bukalnu primenu, aerosoli, implantate, oblike za subkutanu, transdermalnu, topikalnu, intraperitonealnu, intramuskularnu, intravensku, subdermalnu, transdermalnu, intratekalnu i intranazalnu primenu i oblike za rektalnu primenu.

[0100] Poželjno, farmaceutske kompozicije sadrže vehikulume koji su farmaceutski prihvatljivi za formulaciju koja može da se injektuje. To mogu da budu naročito izotonični, sterilni, slani rastvori (mononatrijum ili dinatrijum fosfat, natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijum hlorid i slično, ili mešavine takvih soli), ili suve, posebno osušene zamrzavanjem, kompozicije koje nakon dodavanja, zavisno od slučaja, sterilizovane vode ili fiziološkog rastvora, omogućavaju konstituisanje injektabilnih rastvora.

[0101] Farmaceutski oblici pogodni za injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije; formulacije koje uključuju susamovo ulje, ulje kikirikija ili vodeni propilen glikol; i sterilne prahove za pripremu neposredno pre upotrebe sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima, oblik mora da bude sterilan i mora da bude fluidan do stepena u kome može lako da se istisne iz šprica. Mora da bude stabilan pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora da bude konzervisan protiv dejstva kontaminacije mikroorganizmima, kao što su bakterije i gljive.

[0102] Rastvori koji sadrže jedinjenja prema pronalasku su slobodne baze ili farmakološki prihvatljive soli koje mogu da se pripreme u vodi pogodno pomešanoj sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije takođe mogu da se pripreme u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama, i u uljima. Pod uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans za sprečavanje rasta mikroorganizama.

[0103] Peptidi prema pronalasku mogu da budu formulisani u kompoziciju u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele adicione soli (obrazovane sa slobodnim amino grupama proteina) i koje su obrazovane sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonične ili fosforne kiseline, ili organskim kiselinama kao što su sirćetna, oksalna, vinska, mandelična, i slično. Soli obrazovane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu takođe da se dobiju iz neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum-, kalijum-, amonijum-, kalcijum-, ili feri-hidroksidi, i organskim bazama kao izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slično.

[0104] Nosač takođe može da sadrži rastvarač ili disperzioni medijum, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), njihove pogodne smeše, i biljna ulja. Pravilna fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom premaza, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može da se postigne različitim

1

antibakterijskim i antigljivičnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom, i slično. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključivanje izotoničnih agenasa, na primer, šećera ili natrijum hlorida. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može da se postigne upotrebom u kompozicijama agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0105] Sterilni injektabilni rastvori se pripremaju tako što se aktivni peptidi unose u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa nekoliko gore nabrojanih sastojaka, nakon čega, po potrebi, sledi sterilizacija filtracijom. Uopšteno, disperzije se pripremaju tako što se različiti sterilizovani aktivni sastojci unose u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i ostale potrebne sastojke od onih koji su gore nabrojani. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci za pripremu su tehnike sušenja vakuumom i sušenja zamrzavanjem koje daju prah aktivnog sastojka i bilo kog dodatnog željenog sastojka iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0106] Nakon formulacije, rastvori će se primenjivati na način kompatibilan sa doznom formulacijom i u količini koja je terapeutski efikasna. Formulacije se lako daju u različitim doznim oblicima, kao što je vrsta gore opisanih injektabilnih rastvora, ali se mogu koristiti i kapsule koje oslobađaju lek, i slično. Na primer, za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, rastvor treba da bude pogodno puferisan ako je potrebno, i tečni razblaživač najpre učinjen izotoničnim sa dovoljno fiziološkog rastvora ili glukoze. Ovi konkretni vodeni rastvori su posebno pogodni za intravensku, intramuskularnu, subkutanu i intraperitonealnu primenu. S tim u vezi, sterilni vodeni medijumi koji mogu da se koriste biće poznati onima koji poznaju ovo područje u svetlu ovog otkrića. Na primer, jedna doza može da se rastvori u 1 ml izotoničnog rastvora NaCl i da se doda ili u 1000 ml tečnosti za hipodermoklizu ili da se injektuje na predloženo mesto infuzije. U zavisnosti od stanja subjekta koji se leči, nužno će postojati neke varijacije u doziranju. Osoba odgovorna za primenu odrediće u svakom slučaju odgovarajuću dozu za svaku pojedinu osobu.

[0107] Peptid prema pronalasku može da bude formulisan kao terapeutska smeša tako da sadrži oko 0.0001 do 1.0 miligrama, ili oko 0.001 do 0.1 miligrama, ili oko 0.1 do 1.0 ili čak oko 10 miligrama po dozi ili slično. Mogu da se primene i višestruke doze.

[0108] Pored jedinjenja prema pronalasku formulisanih za parenteralnu primenu, kao što je intravenska ili intramuskularna injekcija, druge farmaceutski prihvatljive forme uključuju, npr. tablete ili druge čvrste oblike za oralnu primenu; lipozomalne formulacije; kapsule sa vremenskim oslobađanjem; i sve druge trenutno korišćene oblike.

1

[0109] Kao što je prethodno pomenuto, peptidi prema pronalasku mogu da budu deo kombinovane terapije u svrhu efikasnijeg zaustavljanja kardiovaskularne bolesti. U tom slučaju, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje najmanje jedan peptid prema pronalasku; zajedno sa još jednim ili drugim jedinjenjem/jedinjenjima protiv kardiovaskularne bolesti, na primer statinskim jedinjenjima, antikoagulantnim pristupima, antialdosteronskim jedinjenjima, ACE inhibitorima (inhibitor angiotenzin-konvertujućeg enzima) i betablokatorima.

[0110] Dodatno, pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje kardiovaskularne bolesti kod sisara koji se sastoji od davanja navedenom sisaru koji pati od navedene kardiovaskularne bolesti terapeutski efikasne količine najmanje jednog peptida prema pronalasku, ili vektora koji sadrži najmanje jednu DNK sekvencu koja kodira peptid prema pronalasku, poželjno u obliku farmaceutske kompozicije koja ga sadrži. U jednom konkretnom primeru izvođenja pronalaska, navedena farmaceutska kompozicija sadrži, pored peptida ili peptida prema pronalasku, jedan ili više (COOH) peptida.

[0111] U jednom primeru izvođenja, kardiovaskularne bolesti prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničene na infarkt miokarda i mozga, akutni infarkt miokarda, ishemiju, koronarnu bolest srca, akutni koronarni sindrom, moždani udar, aneurizmu, stabilnu ili naporom izazvanu anginu pektoris, kardiomiopatiju, hipertenzivnu bolest srca, srčanu slabost (hroničnu i akutnu), plućno srce, poremećaje srčanog ritma, upalnu bolest srca poput endokarditisa, miokarditisa, perifernu arterijsku bolest, miokardnu i vaskularnu disfunkciju povezanu sa SIRS, aterosklerozu.

[0112] Pronalazak će dodatno biti ilustrovan sledećim slikama i primerima. Međutim, ove primere i slike ne treba shvatiti ni na koji način kao ograničavajuće za obim predmetnog pronalaska.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0113]

Slika 1: Modulacija TREM-1 pomoću peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 je korisna protiv vaskularne disfunkcije indukovane in vitro pomoću αTREM-1 i LPS. Krive koncentracija-odgovor za fenilefrin (A i B) i acetilholin (C) u aortinim prstenovima. Aorte su sakupljene od zdravih pacova i stimulisane in vitro sa αTREM-1 (5 µg/mL) i LPS (10 µg/mL) sa ili bez peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 ili LR12-peptida sa nasumičnim redosledom aminokiselina. B: sa nekih aorti je uklonjen endotel (-E). Podaci su reprezentativni za najmanje 5 različitih eksperimenata, p vrednosti: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ns: nije značajno.

1

Slika 2: TREM-1 se eksprimira u endotelnim ćelijama konduktivnih i rezistentnih arterija.

Aorta miša (konduktivna arterija) (A) i mezenterična arterija pacova (rezistentna arterija) (B) stimulisane su sa ili bez LPS kao što je naznačeno. Ekspresija Trem-1 određena je pomoću qRT-PCR. Podaci su reprezentativni za najmanje 5 različitih eksperimenata, p vrednosti: *** p vrednost <0.001. ns (nije značajno).

Slika 3: TREM-1 je konstitutivno eksprimiran i inducibilan u mikrovaskularnim endotelnim ćelijama.

Ekspresija TREM-1 analizirana je protočnom citometrijom u CD146<+>/VEGFR2<+>ćelijama izolovanim iz pluća i jetre miša (LuMECs i LiMECs). TREM-1 se konstitutivno eksprimira na Li/LuMECs (A). Ekspresija TREM-1 je inducibilna in vivo tokom eksperimentalne sepse (A) ili in vitro nakon 1 časa stimulacije sa LPS (B). Kinetika TREM-1, i ekspresija VEGFR2 su takođe analizirane pomoću FACS (C). LPS je indukovao vremenski-zavisnu ushodnu regulaciju ekspresije TREM-1 i VEGFR2, koje su bile sprečene pomoću peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1. Podaci su reprezentativni za najmanje 10 različitih eksperimenata, p vrednosti: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

Slika 4: Kinetika ekspresije TREM-1 nakon stimulacije sa LPS.

(A) In vitro LuMEC (CD146+ , VEGFR2+) su stimulisane sa LPS tokom 4h i 12h i analizirane pomoću qRTPCR na ekspresiju (A) Trem-1, Tnf-α (B) i Il-6 (C). Podaci su reprezentativni za najmanje 10 različitih eksperimenata.

Slika 5: Delovanje peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 na proizvodnju citokina u ćelijama LuMEC stimulisanim 24h sa LPS.

(A) koncentracije proteina u supernatantima ćelija LuMEC stimulisanim 24h sa LPS analizirane su pomoću ELISA *, P < 0.05; **, P < 0.01.***, P < 0.001.

(B) Merenje citokina/hemokina u LuMEC stimulisanim 24h sa LPS. Podaci su izraženi kao odnos između kontrola i ćelija tretiranih peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 (odnos > 1 označava veću koncentraciju u kontrolama nego u tretiranim ćelijama).

Podaci su reprezentativni za najmanje 10 različitih eksperimenata.

Slika 6: Vaskularni intracelularni signalni putevi oštećeni in vivo tokom sepse su obnovljeni modulacijom TREM-1 pomoću peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 imaju sposobnost da obnove oštećenje Akt signalnog puta i ekspresiju Cox-1, kao i da obnove ushodnu regulaciju inducibilnog puta koga predstavljaju Cox-2 i iNOS. Ovo

1

dejstvo je mereno u aortama (A) i mezenteričnim arterijama (B). Podaci su reprezentativni za najmanje 5 različitih eksperimenata, p vrednosti: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

Slika 7: Modulacija TREM-1 peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 korisna je protiv srčane disfunkcije indukovane sepsom.

Primena peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 u pacovskom modelu srčane disfunkcije indukovane sepsom povezana je sa povećanjem intrinzičke srčane funkcije merene kateterom Millara (FEVG, ESPVR, dpdtmax/Ved, PRSW).

Podaci su reprezentativni za najmanje 10 različitih eksperimenata.

Slika 8: Modulacija TREM-1 peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 korisna je protiv hipotenzije i srčane disfunkcije indukovane sepsom.

(A) Primena peptida poreklom od TLT-1 i TREM-1 na mini-svinje koje služe kao model srčane disfunkcije indukovane sepsom povezana je sa smanjenjem infuzije norepinefrina potrebne za održavanje stabilnog srednjeg arterijskog pritiska (85 mmHg). Zaista, MAP je bio konstantno viši i doza norepinefrina niža kod životinja tretiranih peptidima poreklom od TLT-1 i TREM-1 nego kod kontrola.

(B) Promena srčanog indeksa, indeksa srčane snage, SvO2 i isporuke kiseonika. Svi ovi parametri bili su viši kod životinja tretiranih peptidima poreklom od TLT-1 i TREM-1 nego kod kontrola.

(C) Razvoj acidoze i hiperlaktatemije bili su umanjeni pomoću LR12. Grupa LR12, n=6 // grupa LR12 sa nasumičnim redosledom aminokiselina n=5.

Slika 9: Modulacija TREM-1 peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 korisna je protiv promene dijastolnog, sistolnog i srednjeg arterijskog pritiska izazvane sepsom.

Primena peptida poreklom od TLT-1 i TREM-1 kod majmunskog modela srčane disfunkcije (endotoksemije) izazvane sepsom potpuno sprečava prolazni pad krvnog pritiska indukovan endotoksinom (srednji (A), sistolni (B) i dijastolni (C)) (p<0.001 kontrolni peptid naspram LR12). Srednja vrednost ± SD. N=6/grupi.

Slika 10: TREM-1 se eksprimira u tkivu miokarda i ushodno je regulisan tokom ishemije.

(A) Kvantifikacija iRNK Trem-1 pomoću q-PCR u miokardu na polaznom nivou i u područjima zahvaćenim infarktom 6, 12, i 24 časa posle infarkta miokarda.

(B) Kvantifikacija TREM-1 proteina 24 časa posle infarkta miokarda.

2

Podaci su reprezentativni za najmanje 5 različitih eksperimenata. Rezultati su srednja vrednost ± SD. p vrednosti su *p<0.001 [zdrava naspram područja zahvaćenih infarktom].

Slika 11: Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1, modulacijom TREM-1, kontrolišu regrutovanje leukocita u miokard zahvaćen infarktom, kao i mobilizaciju leukocita iz udaljenih odeljaka.

(A) Kvantifikacija infiltracije leukocita u miokard zahvaćen infarktom protočnom citometrijom u različitim vremenskim tačkama kod miševa tretiranih peptidima poreklom od TLT-1 i TREM-1 ili kontrolnim peptidom (LR12-scr); n=5 miševa po grupi i po vremenskoj tački; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 naspram LR12-scr,<≠>p<0.05,<≠≠>p<0.01 naspram placeba.

(B) Kvantifikacija protočnom citometrijom podtipova leukocita u koštanoj srži, krvi i slezini u različitim vremenskim tačkama posle MI; n=6-7 u svakoj vremenskoj tački; ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 naspram LR12-scr tretiranih miševa;<≠≠>p<0.01,<≠>p<0.05 naspram lažno operisanih miševa.

(C) Koncentracije MCP-1 i MCP-3 u plazmi posle MI; n=5 miševa; ***p<0.001 naspram LR12-scr tretiranih životinja.

Slika 12: Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1, inhibicijom TREM-1, modulišu zapaljensku reakciju miokarda tokom ishemije kod miševa.

Za ove eksperimente, lizat miokarda dobijen je 24 časa posle indukcije infarkta miokarda iz miševa tretiranih peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 ili kontrolnim peptidom LR12 sa nasumičnim redosledom aminokiselina (’kontrole’). Ispitivana su dva područja: zdravo područje uzeto na udaljenosti od zone zahvaćene infarktom u kontrolnoj životinji i područje zahvaćeno infarktom. Podaci su reprezentativni za najmanje 5 različitih eksperimenata. Rezultati su srednja vrednost ± SD. p vrednosti su *p<0.001 [LR12 naspram kontrole].

Western Blot lizata tkiva miokarda analiziranih sa antitelom na fosfo (p)-p38, (p)-ERK1/2, iNOS, Cox2, (p)-Akt, (p)-GSK3β, Socs3.

Slika 13: Dejstva peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 na proizvodnju citokina u tkivu miokarda tokom ishemije kod miševa.

Za ove eksperimente, lizat miokarda dobijen je 6, 24 i/ili 96 časova posle indukcije infarkta miokarda iz miševa tretiranih peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 ili kontrolnim peptidom LR12 sa nasumičnim redosledom aminokiselina (’kontrole’). Proizvodnja citokina/hemokina analizirana je u područjima zahvaćenim infarktom. Podaci su reprezentativni za najmanje 5 različitih eksperimenata. p vrednosti su *p<0.001 [LR12 naspram kontrole].

(A) Merenje citokina/hemokina u tkivu miokarda zahvaćenom infarktom 24 časa posle infarkta miokarda. Podaci su prikazani kao odnos između kontrola i životinja tretiranih peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 (odnos > 1 ukazuje na veću koncentraciju u kontrolama nego kod tretiranih miševa).

(B) Ekspresija citokina: nivoi iRNK Tnf-α, Il-6 i IL-10 u tkivu miokarda zahvaćenom infarktom 6, 24, i 96 časova posle infarkta miokarda.

Slika 14: Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1, inhibicijom TREM-1, snižavaju aktivnost proteaze u područjima miokarda zahvaćenim infarktom.

Za ove eksperimente, lizat miokarda dobijen je 6, 24 i 96 časova posle indukcije infarkta miokarda iz miševa tretiranih peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 ili kontrolnim peptidom LR12 sa nasumičnim redosledom aminokiselina (’kontrole’). analizirana su područja zahvaćena infarktom. Podaci su reprezentativni za najmanje 5 različitih eksperimenata.

(A) Kvantifikacija iRNK Mmp9 pomoću Q-PCR;

(B) Timp-1 i;

(C) Reprezentativna in-gel zimografija koja odražava aktivnost želatinaze Mmp-9 na bazalnom nivou, 12, 24, i 96 časova posle infarkta miokarda. Gore: životinje tretirane kontrolnim peptidom; dole: životinje tretirane sa LR12.

Slika 15: Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1, inhibicijom TREM-1, poboljšavaju preživljavanje posle infarkta miokarda kod miševa.

Odrasli mužjaci miševa Balb/c (20-23 g) podvrgnuti su ishemiji miokarda i nasumično su grupisani (n= 10-15 po grupi) da ponovljeno prime peptide poreklom od TREM-1 i TLT-1 (100 µg u 0.2 mL NaCl 0.9% jednom dnevno tokom 5 dana), LR12 sa nasumičnim redosledom aminokiselina (100 µg u 0.2 mL NaCl 0.9% jednom dnevno tokom 5 dana), ili 10 µg anti-TREM-1 mAb u 0.2 mL NaCl 0.9% i.p. injekcijama. Preživljavanje je praćeno tokom 1 nedelje i analizirano testom Log Rank. (Nije bilo uginuća posle 5. dana). Podaci su reprezentativni za najmanje 15 različitih eksperimenata.

Slika 16: Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1, inhibicijom TREM-1, poboljšavaju srčanu funkciju posle ishemije-reperfuzije miokarda kod pacova.

Odrasli mužjaci Wistar pacova podvrgnuti su ishemiji-reperfuziji miokarda i nasumično grupisani (n= 10) da ponovljeno prime peptide poreklom od TREM-1 i TLT-1 (3 mg/kg u 0.2 mL NaCl 0.9% jednom dnevno tokom 5 dana) ili LR12 sa nasumičnim redosledom aminokiselina (3 mg/kg u 0.2 mL NaCl 0.9% jednom dnevno tokom 5 dana). Šest nedelja posle oštećenja miokarda, srčana funkcija je ispitivana pod anestezijom upotrebom katetera za merenje provodljivosti. Emax, ESPVR, i PRSW su bili viši kod životinja tretiranih peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 nego kod kontrolnih pacova. Sve vrednosti p<0.02 [kontrole naspram LR12]).

Slika 17: Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1, inhibicijom TREM-1, poboljšavaju sistolnu i dijastolnu funkciju posle infarkta miokarda kod pacova.

Odrasli mužjaci Wistar pacova podvrgnuti su ishemiji miokarda i nasumično grupisani (n= 20) da ponovljeno prime peptide poreklom od TREM-1 i TLT-1 (3 mg/kg u 0.2 mL NaCl 0.9% jednom dnevno tokom 5 dana) ili LR12 sa nasumičnim redosledom aminokiselina (3 mg/kg u 0.2 mL NaCl 0.9% jednom dnevno tokom 5 dana). Šest nedelja posle oštećenja miokarda, srčana funkcija je ispitivana pod anestezijom upotrebom katetera za merenje provodljivosti. Svi ispitivani parametri bili su bolji kod životinja tretiranih peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 nego kod kontrolnih pacova (sve vrednosti p<0.01 [kontrole naspram LR12]).

Slika 18: Aterosklerozni plakovi u aortinom sinusu apoE-/- miševa svakodnevno tretiranih intraperitonealnom injekcijom PBS (levo) ili LR12 (desno) tokom 4 nedelje.

Tretiranje peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 redukuje razvoj ateroskleroze u aortinom sinusu procenjeno bojenjem crvenim uljem: 103318 µm2 kod tretmana sa LR12 naspram 146736 µm2 kod primene vehikuluma, P=0.02. Podaci su reprezentativni za najmanje 15 različitih eksperimenata.

Slika 19: Bojenje makrofaga (anti-MOMA2, crveno) u ateroskleroznim plakovima.

Tretman peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 kod miševa apoE-/- redukuje infiltraciju makrofaga u aterosklerozne plakove (p=0.004) za 27% naspram kontrolnih životinja, kvantifikovano imunofluorescentnim bojenjem i imunohistohemijom (anti-MOMA2).

Slika 20: Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1, inhibicijom TREM-1, indukuju redukciju populacije cirkulišućih neklasičnih monocita 7. dana.

Cirkulišući monociti CD115<+>Gr1<low>i CD115<+>Gr1<high>su brojani posle bojenja protočnom citometrijom 7 dana kod modela aterosklerotičnih miševa. Podaci su reprezentativni za najmanje 5 različitih eksperimenata. (P<0.05).

Slika 21: Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1, inhibicijom TREM-1, redukuju leukocitozu 28. dana.

2

Cirkulišući monociti CD115<+>Gr1l<ow>i CD115<+>Gr1<high>su brojani posle bojenja protočnom citometrijom 28 dana u modelu aterosklerotičnih miševa. Podaci su reprezentativni za najmanje 5 različitih eksperimenata. *p<0.05; **p<0.001.

Slika 22: Tretman peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 redukuje infiltraciju monocita u lezije.

Monociti su obeleženi in vivo retro-orbitalnom IV injekcijom 1 µm običnih zelenih fluorescentnih mikrosfera Fluoresbrite razblaženih 1:4 u sterilnom PBS. Broj fluorescentnih perli u leziji odslikava regrutovanje monocita. Podaci su reprezentativni za najmanje 5 različitih eksperimenata. P<0.05.

PRIMERI

Materijal i metode

Peptidi

[0114] Na osnovu sekvenci TLT-1 i TREM-1 u GenBank|EMBL|DDBJ (pristupni brojevi AY078502, AF534822, AF241219 i AF287008), peptidi TREM-1- i TLT-1 su konstruisani tako da oponašaju različite delove njihovih vanćelijskih domena (TREM1-LP17, TREM1-LP12, TREM1-LP6-1, TREM1-LP6-2, TREM1-LP6-3, TLT1-LR17, TLT1-LR12, TLT1-LR6-1, TLT1-LR6-2 i TLT1-LR6-3). Oni su hemijski sintetisani (Pepscan Presto BV, Lelystad, Holandija) kao C-terminalno amidovani peptidi za in vivo testove. Ispravni peptidi su dobijeni sa >99% prinosa i bili su homogeni posle preparativnog prečišćavanja, što je potvrđeno masenom spektrometrijom i analitičkom reverzno-faznom tečnom hromatografijom visokih performansi. Ovi peptidi su bili bez endotoksina. Odgovarajući peptidi sa nasumičnim redosledom aminokiselina su sintetisani na sličan način i služili su kao kontrolni peptidi.

Životinje

[0115] Sve procedure je odobrio lokalni komitet za negu i upotrebu laboratorijskih životinja i one su obavljene prema međunarodnim smernicama o eksperimentisanju na životinjama. Miševi i pacovi su nabavljeni od Charles River (Strasbourg, Francuska).

Izolovanje torakalne aorte miša i mezenterične arterije pacova

[0116] Životinje su anestezirane intraperitonealnom injekcijom natrijum pentobarbitala. Napravljen je rez duž srednje linije abdomena, i grudni koš je otvoren da bi se oslobodila torakalna aorta (miševi) ili mezenterična arterija (pacovi).

[0117] Krvni sudovi su ispražnjeni od krvi i inkubirani 20 časova u medijumu RPMI obogaćenom sa 10% goveđeg fetalnog seruma i antibioticima. Nasumično su primenjeni različiti uslovi: 1) kontrolni krvni sud 2) krvni sud inkubiran ex vivo sa LPS (10 µg/mL) 3) LPS i peptidni tretman 4) agonistički αTREM-1 (5 µg/mL) 5) krvni sudovi sa uklonjenim endotelom inkubirani sa LPS i podvrgnuti tretmanu.

[0118] U nekim eksperimentima, ukupna RNK i proteini su ekstrahovani iz krvnih sudova posle stimulacije.

Vaskularna reaktivnost

[0119] Vaskularna reaktivnost aorte ispitivana je na žičanom miografu (EMKA Technologies, Francuska). Eksperimenti su izvedeni na 37°C u fiziološkom slanom rastvoru (PSS) sledećeg sastava: 119 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 14.9 mmol/L NaHCO -3, 1.2 mmol/L MgSO 2-4, 2.5 mmol/L CaCl -2, 1.18 mmol/L KH2PO4i 5.5 mmol/L glukoze, kontinuirano produvavanom sa 95% O2i 5% CO2). Posle perioda uravnotežavanja (najmanje 20 minuta) pod optimalnom pasivnom tenzijom, dve uzastopne kontrakcije kao odgovor na kombinaciju depolarizaciju sa KCl (100 mM) i 10 µM fenilefrina (Phe) (Sigma- Aldrich, Saint Quentin Falavier, Francuska) upotrebljene su da se ispita maksimalni kontraktilni kapacitet krvnih sudova. Posle perioda od 20 minuta bez delovanja leka, krive koncentracija-odgovor na PE dobijene su kumulativnom primenom ovog vazokonstriktivnog agonista (1 nM do 100 µM). Posle novog perioda bez delovanja leka, procenjena je relaksacija zavisna od endotela ispitivanjem relaksirajućeg dejstva acetilholina (ACh) (1 nM do 100 µM; Sigma, St Louis, MO, SAD) posle pre-kontrakcije pomoću 1 µM fenilefrina (Phe). Prisustvo funkcionalnog endotela potvrđeno je pomoću acetilholina (1 µM), koji je izazvao relaksaciju veću od 50%.

Izolovanje mikrovaskularnih endotelnih ćelija pluća i jetre (LuMEC i LiMEC)

[0120] Miševi su žrtvovani u dubokoj anesteziji (pentobarbital) da bi im se izvadila pluća i jetre. Izolovanje mikrovaskularnih endotelnih ćelija pluća i jetre miša izvedeno je prema prethodno opisanom protokolu [Daqing et al., 1998] sa izvesnim modifikacijama. Ukratko, organi su oprani u 10% FBS-DMEM, usitnjeni na kvadrate od 1-2 mm, i podvrgnuti digestiji kolagenazom tipa I (2 mg/ml, Gibco) na 37C° tokom 1 h uz povremeno mućkanje. Ćelijski proizvod digestije filtriran je kroz ćelijski filter promera 70 µm, centrifugiran na 1500 obr/m i ćelije su zasejane u sudove obložene želatinom koji sadrže medijum DMEM/F12 (Gibco) obogaćen sa 20% FBS, 100 µg/ml ECGS (BD Biosciences) i antibioticima. Prvog dana, uklonjene su ćelije koje plutaju i isprane sa PBS i dodat je svež medijum za kulturu. Posle 5 dana, sprovedeno je prvo

2

prečišćavanje ovih ćelija upotrebom kompleta CD146 MicroBead Kit. Posle tripsinizacije, ćelije su resuspendovane u medijumu za rast i zatim zasejane u nove sudove obložene želatinom. Posle 15 dana ćelije su podvrgnute drugom prečišćavanju prema istoj proceduri. Potvrđena je čistoća (> 85 %) i vijabilnost endotelnih ćelija. Dodatno, pomoću FACS analize, procenjen je fenotip ćelija određivanjem ekspresije VEGFR2 i CD146 protočnom citometrijom.

Priprema mini-svinja i praćenje sepsom-izazvane hipotenzije i sepsom-izazvane srčane disfunkcije

[0121] Odrasli mužjaci mini-svinja (Sus scrofa domestica, Vijetnamske mini-svinje, 30-40 kg) nabavljeni su kod Elevage Ferry (Vosges, Francuska). Pre operacije, životinje su izgladnjivane preko noći uz slobodan pristup vodi. Preanestezija je sprovedena intramuskularnom primenom ketamina (10 mg/kg) i midazolama (0.1 mg/kg). Anestezija je uvedena i održavana intravenskom primenom pentobarbitala (inicijalni bolus: 10 mg/kg, i primenom preko kože 6-8 mg/kg/h), povremenim davanjem sufentanila (10 µg), i pankuronijuma (4 mg) po potrebi. Životinje su podvrgnute mehaničkoj ventilaciji (disajni volumen 8 ml/kg, PEEP 5 cm H2O, FiO20.21, frekvencija disanja 14-16 udaha/min prilagođeno za održavanje normokapnije). Leva jugularna vena je izložena i postavljena je trolumenski kateter. Desna jugularna vena je takođe kateterizovana i postavljen je kateter Swan-Ganz koji omogućava kontinuirano beleženje srčanog minutnog volumena, SvO2, i pritisaka u desnoj pretkomori i plućnoj arteriji. U desnu karotidnu arteriju postavljen je kateter za kontinuirano merenje arterijskog pritiska. Kateter u bešici omogućavao je sakupljanje urina.

[0122] Nakon postavljanja instrumenata urađena je laparotomija srednje linije kako bi se izvadio izmet iz levog debelog creva: 1.5 g/kg je suspendovan u 200 mL 0.9% NaCl i inkubiran na 38°C tokom 2 časa. Posle operacije, postavljena je cev za indukciju peritonitisa i dreniranje ascitesa.

[0123] Posle operacije, životinje su ostavljene da se oporave 2 časa pre merenja bazalnih vrednosti (definisanih kao ’H0’). Tokom studije kontinuirano je primenjivan normalni slani rastvor (10 mL/kg/h). Telesna temperatura je održavana konstantnom (±1°C) upotrebom podloge za zagrevanje ili hlađenjem.

[0124] Nakon prikupljanja bazalnih vrednosti (H0), peritonitis je indukovan primenom autologog fecesa kroz abdominalnu cev koja je nakon toga držana zatvorenom. Posle 2 časa (H2), životinje su nasumično određene da prime LR12 (LR12 grupa, n=6) ili samo vehikulum (normalni slani rastvor) (kontrolna grupa, n=5). Bolus od 5 mg/kg (u 60 mL) je intravenski dat tokom 30 minuta, zatim je započeta infuzija od 1 mg/kg/h (15 mL/h) i trajala je tokom čitavog perioda ispitivanja.

2

[0125] Negu životinja zatim je pružao iskusni lekar intenzivne nege uz strogo pridržavanje sledećih smernica tokom perioda ispitivanja::

i) Hemodinamski ciljevi: glavni cilj bio je održavanje srednjeg arterijskog pritiska (MAP) iznad 85 mmHg. Za postizanje ovog cilja i dodatno održavanje, dozvoljena je primena 0.9% NaCl (7 mL/kg/h), hidroksietil skroba (do 20 mL/kg tokom čitavog perioda ispitivanja) (HES 130/0.4, Voluven®, Fresenius) pod uslovom da centralni venski pritisak (CVP) i pritisak okluzije plućne arterije (PAOP) bude < 18 mmHg. Kada je dostignuta maksimalna zapremina hidroksietil skroba, započeta je kontinuirana infuzija norepinefrina do 10 µg/kg/min.

ii) Respiratorni ciljevi: glavni cilj bio je održavanje odnosa PaO2/FiO2 > 300 i arterijskog PaCO2 na 35-45 mmHg. Podešavanja ventilatora su stoga mogla da budu modifikovana povećanjem odnosa udisaj/izdisaj blizu 1:1, PEEP do 15 cm H2O, i frekvencije disanja do 30 udaha/min.

iii) Telesna temperatura bi trebalo da bude održavana konstantnom (±1°C) upotrebom podloge za zagrevanje ili hlađenjem.

iv) Intravenska infuzija glukoze bi trebalo da se primeni kada je neophodno za održavanje glikemije na 5-7 mmol/L.

[0126] Hemodinamski parametri su kontinuirano praćeni, uključujući MAP, srednji pritisak plućne arterije (MPAP), pritisak desne pretkomore (RAP), srčani minutni volumen (CO), srčani indeks (CI) i SvO2. Sistemska isporuka kiseonika (DO2) i sistemski unos kiseonika (VO2) izračunati su pomoću Swan-Ganz monitora. Indeks srčane snage (W/m<2>) izračunat je kao MAP x CI / 451 (24).

Priprema majmuna i praćenje sepsom-izazvane hipotenzije i sepsom-izazvane srčane disfunkcije

[0127] Upotrebljeni su mužjaci cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis) (2.8 do 3.5 kg, stari 24 meseca, Le Tamarinier, La Route Royale, Tamarin, Mauricijus). Životinje su izgladnjivane dan pre stimulacije pomoću LPS uz potpuni pristup vodi. Francuski etički komitet CIToxLAB (CEC) je pregledao i odobrio sve planove za ispitivanje (Nr CEC: 02221).

[0128] Primena leka i in vivo stimulacija pomoću LPS.

[0129] Vitalni znaci i težina su zabeleženi dan pre stimulacije pomoću LPS. Sledećeg jutra, sakupljeni su osnovni klinički laboratorijski uzorci, i osnovni set vitalnih znakova je zabeležen. Lek je primenjen u cefaličnu ili safensku venu pomoću katetera Teflon. Vena sa suprotne strane tela upotrebljena je za primenu LPS.

2

[0130] Majmuni su nasumično raspoređeni da prime LR12 ili placebo (n=6 po grupi). Dodatna grupa od 4 majmuna sačinjena je da primi samo infuziju vehikuluma (NaCl 0.9%) i služila je kao kontrolna grupa.

[0131] U 0. vremenskoj tački, započela je intravenska infuzija od 15 minuta LR12 ili placebo rastvora, brzinom od 12 mL/h (5 mg/kg, 10 minuta, 2 mL), primenjena kalibrisanom špric pumpom (Harvard Apparatus). Kontinuirana infuzija je zatim primenjivana dodatnih 8 časova brzinom od 2 mL/h (1 mg/kg/h, 8 časova, 16 mL). Neposredno pre infuzije tretmana, intravenski bolus LPS (10 µg/kg) primenjen je tokom perioda od 10 minuta u kateter sa suprotne strane. Životinje su ostale budne u uspravnom položaju u stolicama sa sistemom za pričvršćivanje i nastavile da gladuju tokom čitavog perioda ispitivanja.

[0132] Brzina pulsa i krvni pritisak su praćeni svakih 15 minuta tokom 1 časa, a zatim svakih 30 minuta tokom 7 časova.

Mišji model infarkta miokarda

[0133] Sve procedure su sprovedene na mužjacima miševa C57BL/C starosti u opsegu od 6-8 nedelja. Miševi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom ksilazina (60 mg/kg) i učvršćeni u ležećem položaju. Traheja je intubirana i ventilirana (disajni volumen bio je 200 µl/25 g, a frekvencija disanja bila je 120 udaha/min). Posle leve torakotomije, leva koronarna arterija je identifikovana i podvezana prolenskim hirurškom koncem 8-0 na 1.0 mm udaljenosti od vrha leve pretkomore. Okluzija LAD je potvrđena promenom boje miokarda iz crvene u belu u ishemičnom području (leva komora). Grudni koš je zatvoren i koža je zašivena svilom 6-0. Životinje su vraćene u kaveze gde su nadgledane do potpunog oporavka.

[0134] Posle operacije praćen je mortalitet miševa. Miševi su nasumično raspoređeni da prime ili ne peptide (dnevna ip injekcija tokom 5 dana, 5 mg/kg) i praćeno je njihovo preživljavanje. Alternativno, miševi su žrtvovani posle 6h, 24h, 96h (n=6 po grupi) anestezijom praćenom prekomernom dozom natrijum pentobarbitala. Izvršena je sternotomija po srednjoj liniji praćena vađenjem srca i disekcijom ishemičnih i neishemičnih područja. Zatim je urađena ekstrakcija RNK i ekstrakcija proteina za RT-PCR, WB, imunohistologiju i analizu ELISA testom.

Protočna citometrija

[0135] Mikrovaskularne endotelne ćelije (MECs) zdravih C57BL/6 i septičnih (CLP) miševa su izolovane kao što je opisano i inkubirane sa anti-mišjim VEGFR2 i anti-TREM-1 konjugovanim sa FITC i PE tokom 20 minuta na 4°C. Ćelije su oprane dvaput sa PBS i fiksirane u 0.1%

2

formaldehidu, a zatim analizirane protočnim citometrom. Kao kontrola, upotrebljen je mišji izotip IgG2a u istoj koncentraciji.

[0136] U drugim eksperimentima MECs su stimulisane ili ne pomoću LPS (0.1 µg/ml) tokom 2 i 6 h pre FACS analize.

[0137] Za pripremu suspenzija pojedinačnih ćelija iz tkiva zahvaćenog infarktom, sakupljena su srca; usitnjena finim makazama; stavljena u koktel kolagenaze I, kolagenaze XI, DNase I, i hijaluronidaze (Sigma-Aldrich); i mućkana na 37°C tokom 1 h. Ćelije su zatim zdrobljene i centrifugirane (15 min, 500g , 4°C).

[0138] Slezine su uklonjene, zdrobljene u HBSS na 4°C vrhom šprica od 3 ml, i filtrirane kroz najlonske filtere (BD) pomera 70 µm. Ćelijska suspenzija je centrifugirana na 300 g 10 minuta na 4°C. Crvene krvne ćelije su lizirane (rastvor za liziranje crvenih krvnih ćelija, Miltenyi), i splenociti su oprani sa HBSS i resuspendovani u HBSS obogaćenom sa 0.2% (tež./zapr.) BSA. Periferna krv je uzeta preko srčane punkcije sa citratnim rastvorom kao antikoagulansom, i crvene krvne ćelije su lizirane. Najzad, suspenzije pojedinačnih ćelija koštane srži dobijene su iz butnih kosti posle njihovog ispiranja sa 1mL HBSS, filtrirane kroz najlonske filtere pomera 70 µm i centrifugirane na 300g tokom 10 minuta na 4°C. Ukupan broj vijabilnih ćelija određivan je iz alikvota upotrebom hemacitometra sa bojom Trypan blue (BioRad).

[0139] Ćelijske suspenzije su inkubirane u koktelu mAbs protiv CD4<+>ili CD8<+>T ćelija (CD4- ili CD8-APC, CD3ε-PE, CD45-FITC), B ćelija (CD19-PE, CD45-FITC), granulocita (CD45-FITC, Ly-6G-APC), podsetova monocita (CD115-PE, Ly-6C-APC, CD45-FITC), sva antitela su proizvođača Miltenyi Biotech. Prikazani brojevi ćelija izračunati su kao proizvod ukupnih živih ćelija (ukupni vijabilni leukociti po ml) i procenta ćelija unutar odabrane grupe, i izraženi po mg tkiva (srce), po organu (butna kost i slezina), ili po mL (krv). Podaci su dobijeni pomoću citometra FC500 (Beckman Coulter).

Ekstrakcija RNK i analiza lančane reakcije polimeraze

[0140] Ukupne RNK su ekstrahovane iz ćelija ili ishemičnih i neishemičnih područja upotrebom kompleta RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Francuska) i kvantifikovane pomoću NanoDrop (ThermoScientific) pre nego što su podvrgnute reverznoj transkripciji upotrebom kompleta za sintezu cDNK iScript (BioRad) i kvantifikovane pomoću kvantitativne PCR upotrebom proba dostupnih kod Qiagen (Quantitect Primers) na mTREM-1, mTNF-α, mIL-6, mMMP-9, mTIMP-1 i mActB. Alternativno, ukupne RNK su podvrgnute reverznoj transkripciji upotrebom kompleta RT2 First Strand Kit (SABiosciences, Tebu-bio, Le Perray-en-Yvelines, Francuska) za PCR matrice (Mouse Innate Immune / Endothelial Cells RT2 Profiler PCR Arrays,

2

SABiosciences). Sve PCR su urađene u aparatu MyiQ Thermal Cycler i kvantifikovane pomoću softvera iQ5 (Qiagen). Genska ekspresija je normalizovana sa ActB.

Analiza fosforilacije proteina

[0141] Tkiva iz ishemičnih i neishemičnih područja ili MECs su lizirana reagensom za ekstrakciju PhosphoSafe (Novagen) i centrifugirana 5 minuta na 16 000 g na 4°C da bi se sakupio supernatant. Koncentracija proteina određena je metodom po Bradfordu (Pierce). Lizati su zatim analizirani metodom Western Blot (Criterion XT Bis-Tris Gel, 4-12%, BioRad i PVDF membrane, Millipore), vizualizovani pomoću anti-fosfo-p38, -pERK1/2, -pAKT, -pGSK3β, -iNOS, -COX2, -SOCS3, -TREM-1 i odgovarajućeg sekundarnog antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (Cell Signaling) i supstratom SuperSignal West Femto (Pierce). Anti-p38, -ERK1/2, -AKT, -GSK3β, ili - Tubulin su upotrebljeni za normalizaciju. Panel višestruko fosforilisanih proteina takođe je ispitivan pomoću imunoblota (fosfokinazna matica; R&D Systems). Prepoznavanje i kvantitativne analize gustine signala urađene su pomoću aparata za vizualizaciju LAS-4000 i softvera Multi-Gauge (Fujifilm).

Merenje koncentracije citokina

[0142] Sadržaj citokina u lizatima miokarda (ishemična i neishemična područja) i MECs supernatantima izmeren je pomoću ELISA testa (Mouse Quantikine ELISA kits, R&Dsystems) i panela za ispitivanje citokina (Proteome Profiler Mouse Cytokine Array Kit, Panel A, R&Dsystems) prema uputstvu proizvođača.

Zimografija

[0143] Enzimska aktivnost MMP-9 u ekstraktima tkiva određena je pomoću SDS-PAGE zimografije na želatinu. MMP-9 prisutan u ekstraktima tkiva razgrađuje želatinsku matricu, stvarajući jasnu traku posle bojenja proteina na gelu. Ukratko, uzorci homogenizovanog i normalizovanog tkiva su denaturisani bez redukujućeg agensa i razdvojeni elektroforezom na 7.5% SDS-PAGE gelu koji sadrži želatin. Gelovi su zatim inkubirani u prisustvu Triton x-100 (za renaturaciju proteina) na sobnoj temperaturi 2h, a zatim na 37C° preko noći u puferu koji sadrži 10mM CaCl2, 0.15 M NaCl, i 50mM Tris (pH 7.5). Nakon toga, gelovi su obojeni 0.25% bojom komazi plavo. Analiza i kvantifikacija traka sprovedene su denzitometrijom.

Pacovski model trajne ishemije miokarda

[0144] Upotrebljeni su odrasli mužjaci Wistar pacova (360-380g). Svi pacovi su anestezirani ketaminom (100 mg/kg, intramuskularno) i podvrgnuti mehaničkoj ventilaciji. Posle leve torakotomije, leva koronarna arterija je identifikovana i podvezana prolenskim hirurškom koncem 6-0. Okluzija LAD je potvrđena promenom boje miokarda iz crvene u belu u ishemičnom području (leva komora). Grudni koš je zatvoren i koža je zašivena svilom 6-0. Životinje su vraćene u kaveze gde su nadgledane do potpunog oporavka. Postoperativna stopa mortaliteta svih pacova iznosila je 20%.

[0145] Posle hirurške okluzije LAD, značaj ishemičnog područja procenjivan je mikro-TEP vizualizacijom. Životinje su zatim nasumično raspoređene da primaju peptid (5 mg/kg) na svaka 24h tokom 5 dana ili placebo (vehikulum).

[0146] Sledeća procena je sprovedena na 6 nedelja pomoću mikro-TEP vizualizacije i katetera za merenje provodljivosti (Millar) da bi se ispitalo dejstvo tretmana na remodelovanje miokarda i funkciju miokarda.

Pacovski model ishemije-reperfuzije miokarda

[0147] Životinje su podvrgnute istoj operaciji kao kod modela trajne ishemije, ali sa reperfuzijom ishemičnog područja skidanjem ligature sa LAD posle 60 minuta ishemije. Zatim je primenjen isti protokol kao što je gore opisano.

Mikro-PET vizualizacija

[0148] Kod svih životinja, približno 70 MBq<18>F-FDG (u zapremini od 0.3-0.5 ml) ubrizgano je intravenski i pod kratkom anestezijom (inhalacijom 1.5-2.5% izoflurana) 60 min pre započinjanja PET snimanja. Snimanje je obavljeno u modu liste pod kontinuiranom anestezijom izoflurana, upotrebom namenskog PET sistema za sitne životinje (Inveon, Siemens, Knoxville, TN, SAD). Životinje su postavljene u ležećem položaju i smeštene na podlogu za grejanje da bi se telesna temperatura održala u normalnom opsegu. Životinje su povezane sa standardnim ECG monitorom pomoću tri elektrode smeštene na unutrašnjim stranama ekstremiteta. Vremena snimanja bila su 20 minuta za emisiju 18F i 6 minuta za transmisiju 57Co. Vremenski prozor slučajnosti postavljen je na 3.4 ns, a energetski prozor između 350 i 650 keV. Slike su rekonstruisane u 16 srčanih intervala, pružajući vremensku rezoluciju od 11-15 ms za uobičajene vrednosti otkucaja srca. Pod tim uslovima, aksijalna prostorna rezolucija bila je manja od 1,5 mm. Pored toga, na modelima LV pacova dobijenim postupkom stereolitografije, precizno određivanje stvarnih zapremina šupljina dato je FDG PET slikama iznad nivoa od 100 µl koji odgovara donjoj granici za endsistolnu zapreminu LV kod odraslih.

1

Studije sa kateterom za merenje provodljivosti

[0149] Pacovi su anestezirani izofluranom i mikro-manometarski kateter visoke vernosti 2 F (SPR-407, Millar Institute, Houston, TX, SAD) ubačen je u LV preko desne karotidne arterije. Kateter Millar je povezan sa sistemom Harvard Data Acquisition System povezanim sa računarom sa softverom AcqKnowledge III (ACQ 3.2).

Ateroskleroza kod miša

[0150] Mužjaci stari 12 nedelja ApoE-/- miševa stavljeni su na dijetu bogatu mastima (lipidi 15%, holesterol 1.25%, bez holata) i tretirani dnevnom intraperitonealnom injekcijom peptida (100 µg/dan) ili PBS. Posle 4 nedelje dijete bogate mastima, miševi su žrtvovani za analizu.

[0151] Aterosklerozni plakovi su obojeni upotrebom crvenog ulja i kvantifikovani u sinusu aorte. Upotrebom imunofluorescentnog bojenja i imunohistohemije, analizirali smo sastav plakova. Najzad, istraživali smo dejstva tretmana peptidima na regrutovanje monocita u aterosklerozne plakove upotrebom tehnike pulsnog bojenja koju je razvio Potteaux et al. Ukratko, monociti su obeleženi in vivo retro-orbitalnom i.v. injekcijom 1 µm običnih fluorescentno zelenih mikrosfera Fluoresbrite razblaženih 1:4 u sterilnom PBS [Potteaux et al., 2011]. Broj fluorescentnih perli u lezijama odražava regrutovanje monocita.

Rezultati

1. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 dovode do poboljšanja kod LPS-indukovane kontraktilne i endotelne disfunkcije aorte:

[0152] Da bismo ispitali da li modulacija TREM-1 može direktno da utiče na vazomotornu funkciju endotela, mi smo ex vivo stimulisali krvne sudove ili krvne sudove sa uklonjenim endotelom izdvojene iz organizma normalnih pacova, pomoću LPS, αTREM-1 (agonist TREM-1), peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 i kontrolnog peptida LR12 sa nasumičnim redosledom aminokiselina. Prvo, LPS, kao i αTREM-1, indukuje oštećenje vazomotorne funkcije (slika 1A i C). Zatim, peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 dovode do oporavka oštećenja vazomotorne funkcije povezanog sa LPS (slika 1B i C). Najzad, svi peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 gube svoja povoljna dejstva kada je endotel uklonjen (slika 1B).

2. TREM-1 se eksprimira u endotelnim ćelijama iz aorte i mezenterične arterije:

[0153] Da bismo odredili da li se TREM-1 eksprimira u endotelnim ćelijama iz aorte miša i mezenterična arterije pacova, stimulisali smo krvne sudove (sa ili bez endotela) sa LPS tokom 6h

2

(100 ng/ml). Ekspresija Trem-1 je bila ushodno regulisana nakon stimulacije sa LPS, samo kada je endotel bio prisutan, i kod aorte miša (slika 2A) i kod mezenterične arterije pacova (slika 2B).

[0154] Prema tome, mi smo prvi put pokazali da se TREM-1 eksprimira na endotelnim ćelijama aorte miša i mezenterične arterije pacova.

3. TREM-1 se eksprimira na mikrovaskularnim endotelnim ćelijama pluća i jetre (LuMEC i LiMEC):

[0155] TREM-1 se konstitutivno eksprimira na mikrovaskularnim endotelnim ćelijama pluća i jetre; njegova ekspresija je ushodno regulisana tokom sepse i LPS stimulacijom (slika 3). Ovi rezultati su dodatno potvrđeni metodom RT-PCR u realnom vremenu (slika 3C).

[0156] Ekspresija Trem-1 se snažno povećala nakon 4-časovne stimulacije sa LPS, a zatim se smanjila nakon toga. Slično, Tnf-α i Il-6 su ispoljili sličnu kinetiku (slika 4).

[0157] Kao što je i očekivano, 24-časovna stimulacija ćelija sa LPS vodila je obimnoj proizvodnji različitih citokina čije koncentracije su redukovane pomoću peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 (slika 5).

[0158] Prema tome, tretman peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 bio je u stanju da umanji proizvodnju proinflamatornih citokina u endotelnim ćelijama.

4. Modulacija TREM-1 dovodi do poboljšanja kod kardiovaskularne disfunkcije izazvane sepsom:

[0159] Mišji model: Zapazili smo da je primena peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 očuvala srednji arterijski pritisak i prigušila laktacidozu tokom septičkog šoka kod miševa. Istraživanje prenosa signala u krvnim sudovima pokazalo je da je put Akt oštećen tokom sepse, kao i ekspresija Cox-1 paralelno sa ushodnom regulacijom Cox-2 i iNOS. Ovi elementi, koji potvrđuju vaskularnu disfunkciju, obnovljeni su modulacijom TREM-1 (slika 6).

[0160] Pacovski model: Takođe smo se fokusirali na intrinzičku srčanu funkciju (slika 7; tabela 2) i pokazali da je modulacija TREM-1 peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 povezana sa poboljšanjem nekoliko srčanih parametara: ESPVR (odnos pritiska i volumena na kraju sistole), PRSW (regrutujući srčani rad u predopterećenju), (dP/dt)max/Ved (marker pritiska u levoj komori) i LVEF (ejekciona frakcija leve komore).

Tabela 2: Modulacija TREM-1 je korisna protiv kardiovaskularne disfunkcije izazvane sepsom.

[0161] Model mini-svinje: U modelu mini-svinje za sepsu, zapazili smo da primena peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 ublažava kardiovaskularnu slabost. Peritonitis je indukovao brz pad MAP (slika 8A) uprkos nadoknadi volumena cirkulišuće krvi (7750 ± 540 mL za kontrole vs. 6500 ± 800 mL za grupu koja prima LR12, p=0.137). Stoga, da bi se održao MAP > 85 mmHg, započeta je primena norepinefrina na H12 kod 4/5 i 1/6 kontrolnih i životinja koje su primale LR12, redom. Brzina infuzije norepinefrina potrebna za održavanje krvnog pritiska bila je značajno niža kod životinja koje su primale LR12 u poređenju sa kontrolnom grupom (slika 8A).

[0162] U vezi sa hipotenzijom, u kontrolnoj grupi primećeno je smanjenje i srčanog indeksa i indeksa srčane snage (za koji se smatra da bolje odražava funkciju srca). To je dovelo do progresivnog smanjenja SvO2 i DO2 (slika 8B). Ponovo, LR12 je pokazao značajna korisna dejstva kod ublažavanja srčane slabosti. U obe grupe se razvila progresivna laktacidoza (slika 8C), koja je u velikoj meri ublažena unošenjem LR12 (p=0.0005).

4

[0163] Majmunski model: U majmunskom modelu infuzije endotoksina, zapazili smo da primena peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 ublažava kardiovaskularnu slabost. Broj otkucaja srca je prolazno povećan nakon injekcije LPS bez uticaja infuzije LR12 (nije prikazano). Stimulacija pomoću LPS dovela je do blagog povećanja telesne temperature, posebno između HI i H2, ali razlika između životinja koje primaju placebo (LR12scr) i životinja koje primaju LR12 nije bila značajna (nije prikazano).

[0164] Čak i kada su upotrebljene doze LPS bile male, prolazna hipotenzija se razvila u grupi koja je primila placebo: sistolni arterijski pritisak se smanjio do 25% za 180 minuta, a dijastolni arterijski pritisak do 40% (p<0.001 vs. LR12 ili kontrolne grupe). Nasuprot tome, majmuni koji su primili LR12 ni u jednom trenutku nisu razvili hipotenziju i njihov arterijski pritisak se nije razlikovao od onog kod kontrolnih životinja (slika 9).

5. TREM-1 se eksprimira u tkivu miokarda i ushodno je regulisan tokom ishemije:

[0165] Da bi se odredilo da li se TREM-1 eksprimira u srčanom tkivu, miokard je sakupljen od miševa pre postavljanja koronarne ligature, a zatim na 6, 24 i 96 časova posle infarkta miokarda (MI) iz zdravih, kao i iz područja zahvaćenih infarktom. Bazalna ekspresija trem-1 bila je veoma niska, dok je ishemija indukovala progresivnu ushodnu regulaciju njegove ekspresije sa najvišim nivoom dostignutim 24 časa posle MI (slika 10A). Ista kinetika je zapažena na nivou proteina pomoću western blota (slika 10B). Nasuprot tome, ekspresija TREM-1 ostala je niska u područjima koja nisu zahvaćena infarktom (’zdravim područjima’) tokom čitavog perioda (podaci nisu prikazani).

6. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 modulišu regrutovanje leukocita tokom MI kod miševa i regulišu mobilizaciju leukocita iz udaljenih odeljaka:

[0166] Kod miša, i verovatno kod čoveka, postoje 2 različita podtipa monocita: Ly-6C<high>monociti su snažni medijatori zapaljenja, dok Ly-6C<low>monociti imaju suprotna dejstva [NAHRENDORF et al, 2007]. Modulacija Trem-1 peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 potpuno ukida infiltraciju miokarda zahvaćenog infarktom Ly-6C<high>monocitima, dok tranzijentno povećava regrutovanje Ly-6C<low>monocita. Infiltracija PMN takođe je bila blokirana tretmanom sa LR12 (slika 11A). Iako limfociti ne eksprimiraju TREM-1, modulacija Trem-1 je uticala na mobilizaciju B- i T-ćelija: infiltracija B- i CD8<+>-limfocita je smanjena, dok je regrutovanje CD4+-ćelija bilo povećano kod miševa koji su primili LR12.

[0167] Budući da izgleda da je Trem-1 važan za regulaciju regrutovanja leukocita u miokard zahvaćen infarktom, istraživali smo njegovo delovanje na mobilizaciju ćelija iz udaljenih odeljaka. Nakon infarkta miokarda, monociti izlaze iz slezine unutar 24 časa da bi infiltrirali srce (SWIRSKI, et al.,). Ovaj fenomen je ovde zapažen uz brzo opadanje broja monocita u slezini koje traje do 1 nedelje posle MI. Istovremeno, naglašen porast broja cirkulišućih monocita bio je prisutan na 72 časa, dok se progresivno nakupljanje javilo u koštanoj srži (BM) (slika 11B). Delecija ili modulacija Trem-1 skoro potpuno ukida smanjenje broja monocita slezine, kao i monocitozu krvi.

[0168] Broj neutrofila periferne krvi bio je povećan na 72 časa i vratio se na bazalni nivo za 7 dana. Ova neutrofilija nije zapažena kod Trem-1-knockout ili miševa koji su primali LR12. Izgleda da slezina ne daje veliki doprinos proizvodnji/oslobađanju neutrofila budući da se njihov sadržaj u slezini neznatno promenio. Progresivna i skromna akumulacija u BM takođe je zapažena, bez razlika među grupama (slika 11B).

[0169] Broj B-, CD4+-, CD8+-limfocita bio je drastično smanjen u slezini 24 časa posle MI, uz istovremenu limfopeniju CD4+ i CD8+ . Povećani broj cirkulišućih limfocita bio je prisutan na 72 časa pre povratka na bazalni nivo 7 dana posle MI. Blokiranje Trem-1 dovelo je do izostanka ovih obrazaca kinetike limfocita (slika 11B).

[0170] Monocitni hemoatraktantni protein 1 (MCP-1 ili CCL2), CX3CL1 (ili Fraktalkin), i MCP-3 (ili CCL7) su važni hemokini uključeni u regrutovanje redom Ly-6C<high>, Ly-6C<low>monocita i limfocita do mesta zapaljenja. Koncentracije MCP-1, CX3CL1 i MCP-3 u plazmi bile su povećane 24 časa nakon MI. Nivoi MCP-1 i MCP-3 bili su upadljivo sniženi kod tretiranih miševa (slika 11C).

7. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 modulišu zapaljensku reakciju miokarda tokom MI kod miševa:

[0171] Sledeće što smo istraživali je to da li modulacija TREM-1 peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 može da reguliše aktivaciju infiltrirajućih zapaljenskih ćelija. Zapaljenske ćelije koje brzo okupiraju miokard nakon MI aktiviraju fosforilacijom p38 MAPK, i ERK 1⁄2, zajedno sa ushodnom regulacijom ekspresije iNOS i COX2. Ova aktivacija je delimično ukinuta peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 (slika 12). Kada smo analizirali kinetiku fosforilacije/ ekspresije ovih proteina, peptidi su smanjivali njihove nivoe u svakom trenutku (nije prikazano). Nasuprot tome, nekoliko proteina uključenih u preživljavanje (AKT) ili poznatih kao oni koji slabe inflamaciju (SOCS3) bilo je ushodno regulisano svim peptidima. Na primer, kinaza glikogen sintaze 3 (GSK3β) ima ključnu ulogu u regulaciji proizvodnje pro- i anti-inflamatornih citokina. U urođenim imunim ćelijama, inaktivacija GSK3β (putem fosforilacije) suprimira proizvodnju citokina i poznato je da poboljšava preživljavanje kardiomiocita. Ovde smo zapazili da je fosforilacija GSK3β bila povećana pomoću peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 u poređenju sa kontrolama.

[0172] Kako je ćelijska pro-zapaljenska aktivnost izgleda modulisana peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1, mi smo zatim istražili da li ovo dovodi do smanjenja proizvodnje citokina/hemokina.

[0173] Među 168 gena uključenih u urođeni imunitet ili endotelnu funkciju koje smo zatim ispitivali, ekspresija 156 gena bila je izmenjena u miokardu posle podvezivanja koronarne arterije, uglavnom 24 časa posle MI. Primena LR12 se suprotstavila aktivaciji gena indukovanoj infarktom miokarda.

[0174] Kao što je očekivano, MI dovodi do obimne proizvodnje različitih citokina (IL6, IL13, IL17, IL27, IFNγ) i hemokina (MIP2, JE). Koncentracija ovih proteina bila je snižena primenom peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 (slika 13A). Kvantitativna PCR je potvrdila ove rezultate na nivou gena (slika 13B), posebno posle 6 časa od MI.

[0175] Prema tome, primena peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 mogla je da moduliše MI-zapaljensku reakciju u područjima zahvaćenim infarktom.

8. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 snižavaju aktivnost proteaze u tkivu miokarada zahvaćenom infarktom:

[0176] Infiltrirajući neutrofili i makrofagi eksprimiraju matriksnu metaloproteinazu 9 (Mmp-9) u miokardu zahvaćenom infarktom. Aktivnosti Mmp-9 može da se suprotstavi tkivni inhibitor metaloproteinaze-1 (Timp-1). Održavanje osetljive ravnoteže ova 2 proteina ima ključnu ulogu u sprečavanju remodelovanja komora koje vodi srčanoj slabosti. Ovde smo zapazili da je ekspresija Mmp-9 i Timp-1 iRNK povećana u područjima zahvaćenim infarktom kod kontrolnih miševa. Nasuprot tome, ekspresija Mmp-9 je ostala niska kod životinja tretiranih peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1, dok je Timp-1 značajno ushodno regulisan (slika 14A, B). Prema tome, odnos Mmp-9/Timp-1 bio je konstantno viši kod kontrolnih miševa. Želatinazna aktivnost Mmp-9 u područjima zahvaćenim infarktom bila je konstantno veća kod kontrolnih nego kod miševa koji su primali peptide poreklom od TREM-1 i TLT-1 (slika 14C).

[0177] Ovi rezultati podržavaju hipotezu da peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 mogu da imaju korisnu ulogu u očuvanju srčane arhitekture i u suprotstavljanju remodelovanju srca posle MI.

9. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 poboljšavaju preživljavanje nakon MI kod miševa:

[0178] Sledeće što smo hteli da razjasnimo je to da li primena peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 može da ima neka zaštitna dejstva tokom MI. Odraslim mužjacima Balb/c miševa nasumično su intraperitonealnim putem davane ponovljene doze (100 µg dnevno tokom 5 dana) peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1, ili LR12 peptida sa nasumičnim redosledom aminokiselina počevši od 60 minuta posle trajnog podvezivanja koronarne arterije. Sve osim 1 životinje koje su primale LR12 su preživele (slika 15) dok je 40% kontrolnih miševa uginulo (Log-Rank test; p<0.01). Slični rezultati dobijeni su sa drugim peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1.

[0179] Da bi se ispitalo da li produženo angažovanje TREM-1 može da bude još štetnije, dali smo miševima agonističko anti-TREM-1 mAb. Ovaj tretman je dramatično povećao stopu mortaliteta sa samo 20% preživelih.

10. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 poboljšavaju srčanu funkciju posle ishemije -reperfuzije miokarda kod pacova:

[0180] Da bismo ispitali ulogu peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 u relevantnijem modelu MI, izveli smo prolazno podvezivanje koronarne arterije (model ishemije-reperfuzije: IR) kod pacova. Nakon nasumičnog raspoređivanja, životinje su snimljene pod anestezijom (mikro-TEP) i dati su im peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 (3 mg/kg dnevno tokom 5 dana i.p.) ili peptid LR12 sa nasumičnim redosledom aminokiselina. Snimanje je zatim ponovljeno na 6 nedelja pre ispitivanja srčane funkcije upotrebom katetera za merenje provodljivosti (Millar).

[0181] Prvog dana, odmah nakon IR, obe grupe su bile uporedive. Područja zahvaćena infarktom su bila umereno izražena, a srčana funkcija je bila blago izmenjena. Na 6 nedelja, svi pacovi su se oporavili uz gotovo potpuno zaceljivanja područja infarkta i bez izraženog remodelovanja komora (tabela 3). Prema tome, peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 nisu imali dejstvo na parametre povezane sa mikro-TEP. Nasuprot tome, kada je srčana funkcija ispitivana pomoću katetera za merenje provodljivosti, zapazili smo da peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 dramatično poboljšavaju ključne sistolne parametre kao što su Emax ili PRSW (slika 16; tabela 4).

Tabela 4: Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 poboljšavaju srčanu funkciju posle ishemije-reperfuzije miokarda kod pacova.

[0182] Prema tome, čak i u ovom relativno blagom modelu ishemije miokarda, primena peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 bila je u stanju da obnovi sistolnu srčanu funkciju.

11. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 poboljšavaju sistolne i dijastolne funkcije posle infarkta miokarda kod pacova:

[0183] Zatim smo istraživali da li modulacija zapaljenskog odgovora izazvana peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 može da dovede do poboljšanja srčane funkcije nakon teškog MI. Sproveli smo trajno podvezivanje koronarne arterije kod pacova pre njihovog nasumičnog raspoređivanja u grupe i snimanja, kao što je gore opisano.

[0184] Još jednom, 1. dana, obe grupe su bile potpuno slične. Na 6 nedelja, došlo je do značajnog remodelovanja srca što je procenjeno na osnovu prisustva značajne dilatacije komore. Navedeno remodelovanje srca bilo je, bar delimično, izmenjeno pomoću peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 (tabela 5). Indirektni marker srčane slabosti je povećanje telesne težine kod životinja iz kontrolne grupe u poređenju sa pacovima tretiranim svim peptidima.

4

[0185] Kada je srčana funkcija ispitivana pomoću katetera za merenje provodljivosti, zapazili smo da peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 dramatično poboljšavaju ključne sistolne i dijastolne parametre kao što su Emax, ESPVR, PRSW, dP/dTmin, dP/dTmax, i Ved (slika 17).

[0186] Sve ukupno, ovi podaci podržavaju zaštitnu ulogu peptida poreklom od TREM-1 i TLT-1 u prevenciji remodelovanja srca i srčane slabosti posle infarkta miokarda.

12. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 sprečavaju razvoj ateroskleroze kod miša:

[0187] Aterosklerozni plakovi su obojeni upotrebom crvenog ulja i kvantifikovani u sinusu aorte. Zanimljivo je da tretman peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 indukuje značajnu redukciju od 30% veličine lezije u sinusu aorte (103318 µm<2>naspram 146736 µm<2>, P=0.02) (slika 18). Ovaj rezultat je potvrđen u drugom nizu eksperimenata.

13. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 menjaju ćelijski sastav ateromatoznog plaka:

[0188] Upotrebom imunofluorescentnog bojenja i imunohistohemije, analizirali smo sastav plakova. Nismo zapazili nikakvu razliku u pogledu infiltracije limfocita (anti-CD3 antitelo) i nakupljanja kolagena (Sirius Red) između grupa. Međutim, našli smo značajnu redukciju od 27% infiltracije makrofaga unutar ateroskleroznih lezija kod miševa tretiranih peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 (slika 19).

14. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 modifikuju populaciju leukocita krvi kod aterosklerotičnih miševa:

[0189] Upotrebom protočne citometrije, analizirali smo populacije leukocita krvi. Klasični monociti bili su CD115+Grlhigh, a neklasični monociti bili su CD115+Gr1low. Kod miševa apoE-/- na dijeti, samo neklasični monociti eksprimiraju TREM. Zanimljivo je da je dijeta sa visokim sadržajem masti povećala ekspresiju TREM-1 na neklasičnim monocitima (podaci nisu prikazani).

[0190] Zatim, analizirali smo populacije leukocita u krvi tokom tretmana. 7. dana, zapazili smo značajnu redukciju neklasičnih monocita u krvi miševa tretiranih peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 (slika 20).28. dana, zapazili smo značajnu redukciju klasičnih i neklasičnih monocita u krvi (slika 21).

15. Peptidi poreklom od TREM-1 i TLT-1 snižavaju regrutovanje monocita u aterosklerozne plakove:

[0191] Najzad, istraživali smo dejstva tretmana peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 na regrutovanje monocita u aterosklerozne plakove. Koristili smo tehniku pulsnog bojenja koju je razvio Potteaux et al. Ukratko, monociti su obeleženi in vivo retro-orbitalnom i.v. injekcijom 1 µm običnih zelenih fluorescentnih mikrosfera Fluoresbrite razblaženih 1:4 u sterilnom PBS [Ait-Oufella H. et al., 2011]. Broj fluorescentnih perli u lezijama odslikava regrutovanje monocita. Perle su injektovane 24 pre žrtvovanja tretiranih apoE-/- miševa. Zanimljivo, pronašli smo značajnu redukciju infiltracije monocita u grupi tretiranoj peptidima poreklom od TREM-1 i TLT-1 u poređenju sa kontrolnom grupom (slika 22).

REFERENCE

[0192]

U ovoj prijavi različite reference opisuju stanje tehnike na koje se ovaj pronalazak odnosi.

Ait-Oufella H, Taleb S, Mallat Z, Tedgui A. Recent advances on the role of cytokines in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 31 (5):969-979 (2011).

Bjorkbacka H, Kunjathoor VV, Moore KJ, Koehn S, Ordija CM, Lee MA, Means T, Halmen K., Luster AD., Golenbock DT., Freeman MW. Reduced atherosclerosis in MyD88-null mice links elevated serum cholesterol levels to activation of innate immunity signaling pathways. Nat Med 10 (4):416-421(2004).

Daqing W. Hartwell., Tanya N. Mayadas., Gaëtan Berger., Paul S. Frenette., Helen Rayburn., Richard O. Hynes., Denisa D. Wagner. Role of P-selectin cytoplasmic domain in granular targeting in vivo and in early inflammatory responses. Journal of Cell Biology; 1434:1129 1141 (1998).

Derive M, Bouazza Y, Sennoun N, Marchionni S, Quigley L, Washington V, Massin F, Max JP, Ford J, Alauzet C, Levy B, McVicar DW, Gibot S. Soluble TREM-like transcript-1 regulates leukocyte activation and controls microbial sepsis. J Immunol. 2012 Jun 1;188(11):5585-92. Epub 2012 May 2.

Entman M.L., Smith C.W.Postreperfusion inflammation. A model for reaction to injury in kardiovaskularna bolest. Cardiovasc Res 9:1301-1311 (1994).

Hara H, Saito T. CARD9 versus CARMA1 in innate and adaptive immunity. Trends in Immunology ;30:234-242 (2009).

Harjot K Saini., Yan-Jun Xu., Ming Zhang., Peter P Liu., Lorrie A Kirshenbaum., Naranjan SDhalla. Role of tumour necrosis factor-alpha and other cytokines in ischemia-reperfusioninduced injury in the heart. Exp Clin Cardiol.2005 Winter; 10(4): 213-222.

Libby P. Inflammation in atherosclerosis. Nature 420 (6917):868-874 (2002).

Mehta J.L., Li D.Y. Inflammation in ischemic heart disease: response to tissue injury or a pathogenetic villain. Cardiovasc Res;2:291-299 (1999).

Nahrendorf M, Swirski FK, Aikawa E, Stangenberg L, Wurdinger T, Figueiredo JL, Libby P, Weissleder R, Pittet MJ. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med 204, 3037-3047 (2007).

Potteaux S, Gautier EL, Hutchison SB, van Rooijen N, Rader DJ, Thomas MJ, Sorci-Thomas MG, Randolph GJ Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest 121 (5):2025-2036 (2011). doi:43802 [pii] 10.1172/JCI43802.

Radsak MP, Salih HR, Rammensee H, Schild H. Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in neutrophil inflammatory responses: differential regulation of activation and survival. J. Immunol;172:4956-4963 (2004).

Swirski FK, Nahrendorf M, Etzrodt M, Wildgruber M, Cortez-Retamozo V, Panizzi P, Figueiredo JL, Kohler RH, Chudnovskiy A, Waterman P, Aikawa E, Mempel TR, Libby P,

4

Weissleder R, Pittet MJ. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science 325, 612-616 (2009).

Washington AV, Gibot S, Acevedo I, Gattis J, Quigley L, Feltz R, De La Mota A, Schubert RL, Gomez-Rodriguez J, Cheng J, Dutra A, Pak E, Chertov O, Rivera L, Morales J, Lubkowski J, Hunter R, Schwartzberg PL, McVicar DW. TREM-like transcript-1 protects against inflammation-associated hemorrhage by facilitating platelet aggregation in mice and humans. J Clin Invest.2009 Jun;119(6):1489-5.

4

4

4

4

4

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Peptid sa manje od 50 aminokiselina koji sadrži najmanje 6 uzastopnih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 za upotrebu u lečenju kardiovaskularne bolesti, naznačen time što je kardiovaskularna bolest odabrana od infarkta miokarda ili mozga, akutnog infarkta miokarda, koronarne bolesti srca, akutnog koronarnog sindroma, moždanog udara, aneurizme, stabilne ili naporom izazvane angine pektoris, kardiomiopatije, hipertenzivne bolesti srca, hronične srčane slabosti, akutne srčane slabosti, plućnog srca, poremećaja srčanog ritma, upalne bolesti srca poput endokarditisa, miokarditisa, periferne arterijske bolesti, miokardne i vaskularne disfunkcije povezane sa SIRS, i ateroskleroze.

2. Peptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži sekvencu od 6 uzastopnih aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 7.

3. Peptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 4.

4. Peptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, dužine 6 do 20 aminokiselina.

5. Peptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, 2 ili 4, koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ili SEQ ID NO: 7.

6. Peptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 4.

7. Peptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačen time što je kardiovaskularna bolest infarkt miokarda.

8. Peptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačen time što je kardiovaskularna bolest ateroskleroza.

9. Peptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačen time što navedeni peptid treba da se injektuje subjektu kome je to potrebno.

10. Peptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačen time što navedeni peptid treba da se primeni u kombinaciji sa jednim ili više drugih jedinjenja protiv kardiovaskularne bolesti.

11. Peptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što je navedeno jedno ili više drugih jedinjenja protiv kardiovaskularne bolesti izabrano od statinskih jedinjenja, antikoagulantnih pristupa, anti-aldosteronskih jedinjenja, ACE inhibitora i beta-blokatora.

1