RS60454B1 - Određivanje nivoa enzimskih funkcionalnosti korišćenjem trodimenzionalnih oblaka tački predstavljajući fizičko-hemijska svojstva proteinskih šupljina - Google Patents

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na metod skrininga katalizatora predodređene hemijske reakcije kao što je definisano u patentnim zahtevima.

POZADINA

[0002] Enzimi se sve više koriste u biotehnološkim i biokatalitičkim procesima. Uprkos brojnim uspešnim aplikacijama, ipak, postalo je jasno da nisu sve potencijalno interesantne hemijske reakcije predstavljene u trenutnom enzimskom portfoliju. Dodatno, priodni enzimi generalno nisu u potpunosti optimizovani za njihovu upotrebu u industrijskim procesima, i stoga je identifikacija i/ili dizajn novih enzimskih funkcionalnosti i poboljšanje postojećih enzima od najvećeg značaja.

[0003] Nekoliko pristupa za identifikovanje vezujućih mesta proteina je opisano u literaturi. Na primer, infrastruktura za računanje oblaka bazirana na GPU je korišena za efikasno izvršenje strukturalnog poređenja mesta vezivanja proteina (Leinweber et al., (2012) IEEE International Conference on Digital Ecosystems and Technologies, art. no. 6227926).

[0004] Označeni model oblaka tačke je opisan kao pogodan za modeliranje biomolekula kao što su proteini i vezujuća mesta proteina, gde oznaka može predstavljati tip atoma ili fizičko-hemijsko svojstvo (Fober et a., (2011) IEEE/ACM Transactions on Computational Biology and Bioinformatics, 8(6), art. no. 5722954, pp. 1653-1666).

[0005] Metod za upoređivanje proteinske strukture u kom su informacije o geometriji i fizičko-hemijskim svojstvima takvih struktura predstavljene u formi označenih oblaka tački je opisan od strane Fober et al. ((2009) ISDA 2009 - 9th International Conference on Intelligent Systems Design and Applications, art. no. 5364137, pp.

1251-1256).

[0006] WO0023474 otkriva metod proteinskog inženjeringa pri čemu kreirana je pretraživa kompjuterska baza podataka koja sadrži unose u formi opisa lokacija i orijentacija u 3D prostoru bočnih lanaca konstituentnih aminokiselinskih ostataka okvirnog proteina za identifikovanje pogotka koji odgovara okvirnom proteinu koji ima strukturalnu sličnost sa proteinom uzorka.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0007] Pronalazak se odnosi na proteinski inženjering i napore dizajniranja na osnovu integracije strukturalnih i mehaničkih studija i usmerenih evolucionih pristupa kako bi se postigla optimalna i efikasna strategija koja utvrđuje nove enzimske funkcionalnosti korišćenjem trodimenzionalnih oblaka tačaka koji predstavljaju fizičkohemijska svojstva proteinskih šupljina.

[0008] Pored svoje originalne katalitičke aktivnosti, pokazalo se da neki enzimi takođe katalizuju potpuno različite hemijske reakcije kao sporednu aktivnost. Ovaj takozvani “katalitički promiskuitet” može biti polazna tačka za stvaranje kompetentnog enzima koji katalizuje neprirodnu hemijsku reakciju. Kataliti čki promiskuitet kod enzima je sposobnost enzima da katalizuju izrazito različite hemijske transformacije. Hemijska transformacija se može razlikovati u obuhvaćenoj funkcionalnoj grupi, odnosno tipu veze formirane ili cepane tokom reakcije i/ili se mo že razlikovati kod katalitičkog mehanizma ili putanji stvaranja ili raspada veze. Do sada je, ipak, identifikacija katalitičkog promiskuiteta bila bazirana na spletu okolnosti. Skrining strukturalnih baza podataka sa funkcionalnim motivima “katalofora”, koje je bazirano na fizičko-hemijskim svojstvima, predstavlja racionalniji pristup u predviđanju “katalitičkog promiskuiteta” u enzimima. Korišćenjem ove najsavremenije metode nedavno smo uspeli da identifikujemo dva enzima za koja se predviđa da će prikazati interesantne enoatno-reduktazne aktivnosti ali ne prikazuju bilo kakvu sličnost (na sekvenci kao i na strukturalnom nivou) sa poznatim enoatreduktazama (stari žuti enzimi). U ovom slučaju, dizajn funkcionalnih motiva korišćenih za skrining baze podataka se oslanjao na veliku količinu strukturalnih i mehaničkih informacija dostupnih za ovu enzimsku klasu. Međutim, ovaj pristup bi takođe mogao uključiti teorijski aktivno mesto strukturalnog motiva izvedeno od mehaničkih potreba određene hemijske reakcije.

[0009] Pored iskorišćavanja katalitičkog promiskuiteta u postojećim prirodnim enzimima nove funkcionalnosti enzima mogu biti stvorene putem de-novo dizajna aktivnih mesta graftovanjem kataliti čki važnih ostataka na stabilne proteinske konstrukcije. Očigledno, ovaj pristup takođe zahteva detaljna mehanička znanja i može imati veliku korist od velike količine podataka o neenzimskim organo i organo-metaličkim katalizatorima korišćenim u hemiji rastvora. Primeri u literaturi ukazuju da je dokaz principa takvog pristupa postignut. Do sada se, ipak, nije koristilo za dizajn novog katalizatora za industrijsku biokatalizu.

[0010] Veoma često je katalitička aktivnost enzima postignuta putem malog domena većeg proteina koji može uključiti druge domene koji su neophodni za fiziološku funkciju ali nevažni za biotehnološku aplikaciju. Redukcija veličine katalizatora – tj. dizajn “minimalnog enzima” – potencijalno ima velike koristi za ekspresiju proteina, stabilnost procesa ili za inženjering usmerenom evolucijom.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0011] Predmetni pronalazak se odnosi na metod kao što je definisano u patentnim zahtevima.

[0012] Iz tog razloga je razvijen metod za pronalaženje katalofora sa specifičnim geometrijama aktivnog mesta korišćenjem trodimenzionalnog šablona distance koji imitira minimalnu katalitičku konstelaciju aktivnog mesta.

[0013] U kontekstu ovog pronalaska, pojam “katalofor” se odnosi na opis aktivnog mesta proteina po željno enzima. Katalofor takođe obuhvata minimalni enzim ili deo ili fragment enzima koji sadr ži aktivno mesto pomenutog enzima uključujući 3D deskriptore aktivnog mesta.

[0014] Prema pronalasku, aktivno mesto može biti, ali se ne ograničava na, enzimsko, katalitičko, receptorsko vezivanje ili regulišuće mesto proteinske ekspresije.

[0015] Specifično u slučaju da je katalofor identifikovan inventivnim metodom, je izolovani kataloforni domen, pomenuti kataloforni domen poželjno ima iste ili slične karakteristike/aktivnost kao kataloforni domen prisutan u matičnom domenu. Alternativno, pomenuti domen može biti modifikovan tako da ima povećanu enzimsku, katalitičku aktivnost u poređenju sa matičnim domenom.

[0016] Ovde je opisan metod za utvrđivanje katalofora proteina, uključujući korake

a) stvaranje baze podataka oblaka tačke za ciljne proteinske strukture;

b) stvaranje upita oblaka tačke;

c) pretraživanje pomenute baze podataka sa pomenutim upitom kako bi se time identifikovalo jedno ili vi še katalofora.

[0017] U tekstu je takođe otkriven metod kao što je opisano u prethodnom delu, pri čemu je jedan oblak tačke izračunat za svako fizičko-hemijsko svojstvo ciljnih proteina.

[0018] U tekstu je takođe otkriven metod kao što je opisano u prethodnom delu, pri čemu su izračunati oblaci tački za dodatne interakcije kao H-veze za ciljne proteinske strukture.

[0019] U tekstu je takođe opisan metod kao što je opisano u prethodnom tekstu, pri čemu upit tačke oblaka je set tačke oblaka.

[0020] U tekstu je takođe opisan metod kao što je opisano u prethodnom delu, pri čemu set oblaka tački je dobijen iz katalitičke aktivnosti ciljnih proteina ili iz kvantno mehaničkih modela šablonskih reakcija.

[0021] U tekstu je takođe opisan metod kao što je opisano u prethodnom delu, pri čemu pomenuti upit oblaka tački i pomenuta baza podataka oblaka tačke su istaknuti.

[0022] U tekstu je takođe opisan metod kao što je opisano u prethodnom delu, pri čemu je pomenuti upit oblaka tačke nasumično rotiran i translatovan.

[0023] U tekstu je takođe opisan metod kao što je opisano u prethodnom delu, pri čemu su pomenute ciljne proteinske strukture homogenizovane.

[0024] U tekstu je takođe opisan enzim koji sadrži katalofor, pri čemu pomenuti katalofor je dobijen metodom kao što je opisano u prethodnom delu.

[0025] U tekstu je takođe opisan metod za konstruisanje baze katalofora sa predodređenim katalitičkim i fizičkohemijskim svojstvima, pri čemu pomenuti katalofor je dobijen putem metoda kao što je opisano u prethodnom delu.

[0026] U tekstu je takođe opisana baza katalofora sa predodređenim svojstvima dobijenim putem metoda kao što je opisano u prethodnom delu.

[0027] U tekstu je takođe opisana upotreba katalofora kao katalizatora za industrijsku biokatalizu.

[0028] Potencijalni pogoci u strukturalnim bazama podataka su eksperimentalno testirani na željenu aktivnost i poboljšana svojstva za industrijsku primenu. Kao primer šablon pretraživanja je dobijen iz aktivnog mesta od starih žutih enzima (OYE). Pokazalo se da članovi dobro poznate enoat-reduktaza familije poseduju visok potencijal kao biokatalizatori u asimetričnoj redukciji aktiviranih alkena. Proteini iz OYE familije katali šu redukciju aktiviranih C=C veza u α,β-nezasićenim jedinjenjima, i pokazalo se da predstavljaju efikasnu, biokatalitičku alternativu standardnoj organskoj sintezi. Pored toga, u kofaktoru flavin mononukleotida (FMN) samo katalitičko mesto obično obuhvata par ostataka (obično histidin/histidin ili asparagin/histidin) koji deluju kao H-vezujući donori na grupu koja povlači elektrone supstrata i konzervirani tirozinski ostatak, što je neophodno za isporuku protona u Coatom tokom prometa.

[0029] Cilj pronalaska je da se uoče drugi enzimi sa funkcionalnošću enoat-reduktaze u strukturalnim bazama podataka čak i unutar ove intenzivno istražene familije. Iz tog razloga je korišćen relativno prost trodimenzionalni prikaz aktivnog mesta, generisan poređenjem karakteristika aktivnog mesta reprezentativnih OYE struktura za pretraživanje drugih enzima sa ovom specifičnom konstelacijom aktivnog mesta. Kao platforma za pretraživanje korišćena je komercijalno dostupna Relibase+ baza podataka (v. 2.2), koja sadrži prethodno obrađene strukturalne informacije. Kao dodatak, razvijena je interna baza podataka (CATALObase) prethodno obra đenih struktura koje su pripremljene primenom YASARA strukturnih funkcija. Za Relibase+ pretragu napravljen je prikaz aktivnog mesta korišćenjem Relibase+ 2D/3D graditelja. 3D prikaz aktivnog mesta za pretraživanje korišćenjem interne baze podataka je generisan korišćenjem YASARA skripte. Sa oba pristupa pretraživanja su identifikovane tipične OYE strukture kao i dva “nova” proteina sa predviđenim aktivnostima starog žutog enzima. Džepna baza podataka CavBase je takođe korišćena koja je ugrađena u Relibase+ bazu podataka i koja sadrži informacije o šupljinama aktivnog mesta i apstraktovanih pseudo centara. U slučaju OYE i korišćenjem podešavanja kao što je opisano u prethodnom tekstu, proteini koji su pronađeni sa čistim geometrijskim pristupom unutar prvih 200 CavBase pogodaka nisu mogli biti identifikovani.

[0030] Konačna kataloforna pretraga je imala za rezultat upravljivu količinu od 46 pogodaka koja je dalje mogla biti smanjena primenom filtera kako bi se prepoznali očigledni pogoci poznatih OYE. To je urađeno sekvencom (korišćenjem BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) i strukturalnim poređenjem korišćenjem PDBefold kao i putem OYE sekventne šablonske klasifikacije, ostavljajući samo nove enzime sa sličnim rasporedom aktivnih mesta. Tako suženi rezultati su otkrili nekoliko struktura koje se sastoje od zahteva konstelacije aktivnog mesta šablona za 6 pogodaka.

[0031] Vizualnom inspekcijom identifikovane su dve oksidoreduktaze (PDB Code: 2i0k i 3fbs) gde tirozinski ostatak ima potrebnu distancu ali je na suprotnoj strani flavin kofaktora i šupljine aktivnog mesta, i iz tog razloga u nemogućnosti da obezbedi proton za potencijalni supstrat. Takođe identifikovana flavoproteinska podjedinica mutirane (N204Y) furmarat reduktaze je odbačena u prvom krugu istrage, zbog heme hetero komponente koja je možda poremetila pravilnu analitiku starog žutog enzima. Putativna monooksigenaza (PDB Code: 1usc i 1usf) i nekarakterisani protein PH0856 (PDB Code: 2r6v) su stoga izabrani za ispitivanje i karakterizaciju. Prona đeni enzimi nisu sekvencijalno niti strukturalno povezani sa bilo kojim poznatim OYE strukturama, i to je jo š iznenađujući rezultat. Konstelacija aktivnog mesta je pokazala približnu simetriju ogledalo-prikaza sa šablonskim strukturama, što ukazuje na različit stereo hemijski ishod. Putativna monooksigenaza iz termičkog termofilusa i nekarakterizovani protein PH0856 iz pyrococcus horikoshii su u sledećem tekstu označeni kao Tth i Pho, respektivno, zasnovani na organizmima gde su izolovani. Biokatalitička aktivnost ovih enzima je eksperimentalno evaluirana. Zaključno, dva enzima su uspešno identifikovana sa još uvek nepoznatom funkcijom za koju je otkriveno da ima sličnu arhitekturu aktivnog mesta u poređenju sa klasičnim enoat-reduktazama i ne prikazuje bilo kakvu sličnost ni na sekvenci ni na globalnom strukturalnom nivou sa bilo kojim poznatim OYE.

[0032] Kao sledeća izvedba pomenuti domen može biti uveden u proteinske strukture, pri čemu je sekundarna/tercijarna struktura katalofora sačuvana kako bi se održala njegova funkcionalnost. Kao alternativna izvedba, katalofor može biti modifikovan pomoću tehnika koje su poznate iskusnoj osobi, na primer, putem nasumičnih mutageneza kako bi se poboljšala ili promenila njegova funkcionalnost, naročito u pogledu enzimskog, ciljanog vezivanja ili katalitičke aktivnosti.

KRATAK OPIS SLIKA

[0033]

Slika 1 prikazuje pripremu oblaka proteinske tačke.

Slika 2 prikazuje tok rada procesa podudaranja oblaka tačke.

Slika 3 prikazuje process podudaranja.

PRIMERI

Primer 1 – Generacija oblaka tački

[0034] Ovaj pristup za identifikovanje katalitički aktivnih motiva “katalofora” je zasnovan na implementaciji novih protokola koji ponovo prilagođavaju unapred izračunate mrežne mape ciljnih proteinskih struktura generisanih sa modifikovanom verzijom AutoGrid4 koji je deo AutoDock4 programskog paketa (AutoDock, http://http://autodock.scripps.edu). Jedan oblak tačke je izračunat za svako fizičko-hemijsko svojstvo kao i oblaci tačaka specijalne namene koji predstavljaju dodatne interakcije kao H-veze (tabela 1 i slika 1).

Tabela 1: Fizičko-hemijska svojstva

[0035] Ove ciljne mrežne mape su konvertovane u datoteke oblaka tačke koje se dalje obrađuju unutar katalofornog softverskog protokola. Proteinske structure su pripremljene praćenjem standardnih protokola za dodavanje atoma vodonika, dodavanje nedostajućih atoma i ostataka nakon čega sledi automatska detekcija šupljine (slika 2). Oblasti identifikovane kao proteinske šupljine pogodne za vezivanje potencijalnih supstrata su naknadno karakterisane i skladištene kao oblaci tački svojstva.

[0036] Jedan skup oblaka tački je neophodan kako bi se opisao “upit pretrage”. Ovi oblaci tačaka se mogu izvesti iz enzima koji poseduju željenu katalitičku aktivnost ili iz kvantnih mehaničkih modela šablonskih reakcija. Ovi oblaci tačaka se porede sa oblacima tačaka koji su prethodno izračunati za sve dostupne proteinske strukture (slika 2).

Primer 2 – Uspostavljanje kataloforne baze podataka

[0037] Kako bi se homogenizovale ciljne proteinske strukture i stvorili oblaci tačaka za svaku identifikovanu šupljinu, strukture iz različitih izvora “fridges” su prikupljene i skladištene u standardizovanom formatu u sistemu relacione baze podataka CAT-ALObase (tabela 2).

Tabela 2: izvori podataka

[0038] Za svaku od ovih proteinskih struktura oblaci tačaka se automatski generišu i skladište za sledeći proces podudaranja.

Primer 3 – Podudaranje katalofora upita sa stavkama baze podataka

[0039] Upit i baza podataka oblaka tački su istaknuti a devijacija dve mrežne mape je evaluirana upoređivanjem najbližih mrežnih tačaka između cilja i obrasca. Za svaki tip oblaka tačke generiše se jedna “ocena identičnosti” koja predstavlja kvalitet podudaranja. Ova individualna ocena (jedna čina 1) je procenjena selektabilnim faktorom kako bi se omogućilo precizno podešavanje uticaja različitih mrežnih mapi (na primer podešavanje faktora ocenjivanja za oblake tački H-veze na nulu uzorkuje zanemarivanje ove interakcije). Nakon evaluiranja kvaliteta podudaranja, upit oblaka tačke se nasumično rotira i translatuje. Ukoliko je dobijeni novi kompleks bolji u odnosu na prethodni, ovaj korak se prihvata. Postupak se ponavlja sve dok nije vi še moguće dobiti bolje podudaranje (slika 3). Algoritmi su implementirani u samostalnoj verziji CATALOphore softvera u C++ na osnovu slobodno dostupnog izvornog koda AutoDock4 i PCL (The Point Cloud Library (PCL), http://pointclouds.org).

Primer 4 –

[0040] Kako bi se testirao postupak opisan u prethodnom tekstu, ekstraktovali smo oblake ta čaka za enzime koji pripadaju grupi starih žutih enzima. Ovi upiti oblaka tačaka su poređeni sa testnim podskupom CATALObase koji sadrži oblake tačaka koji predstavljaju 10 različitih proteinskih struktura (stari žuti enzimi, alkohol dehidrogenaze i lipaze). Tabela 2 rezimira rezultate procesa podudaranja. Najbolje podudaranje je ostvareno za proteinsku strukturu korišćenu za dizajn upita, kao što se i očekivalo, rangirano na osnovu naše “ocene identičnosti” sledeća dva pogotka su enzimi za koje se prethodno pokazalo da imaju aktivnost sličnu starom žutom enzimu ali nisu obeleženi niti biohemijski karakterisani. Negativna i pozitivna kontrola su rangirane kao što se i očekivalo.

Tabela 2: Najboljih 5 rezultata stari-žuti-enzim primera

Claims (2)

Patentni zahtevi

1. Metod skrininga za katalizator predutvrđene hemijske reakcije, obuhvatajući korake:

a) utvrđivanje fizičko-hemijskih svojstava na lokacijama mrežnih voksela, pri čemu mreža uključuje šupljinu aktivnog mesta prvog enzima, kako bi se dobio upit oblaka tački za svaki tip fizičko-hemijskog svojstva, pri čemu fizičko-hemijska svojstva su

potencijalne energije nevezujućih H atoma , izabrane od sumpora, hlora, kalcijuma, mangana, gvožđa, cinka, broma, joda, fluora, magnezijuma, fosfora, alifatičnog ugljenika, aromatičnog ugljenika, azota i vodonika, potencijalne energije prijemnika H-veze, izabrane od azota, sumpora i kiseonika,

potencijalne energije donora H-veze, kao vodonik, elektrostatički potencijal,

hidrofobnost, i

pristupačnost

b) kreiranje baze podataka oblaka tačke odgovarajućih oblaka tački za šupljine aktivnog mesta predodređenih proteina;

c) pretraživanje baze podataka sa upitom oblaka tački kako bi se time identifikovao jedan od predutvrđenih proteina koji ima šupljinu aktivnog mesta koja se podudara sa šupljinom aktivnog mesta prvog enzima, na taj način identifikujući drugi enzim kao katalizator, upoređivanjem upita oblaka tački sa odgovarajućim oblacima tački iz baze podataka oblaka tačke,

pri čemu

korak d) obuhvata isticanje upita oblaka tački i odgovarajućih oblaka tački iz baze podataka oblaka tačke, upoređivanje obuhvata poređenje fizičko-hemijskih svojstava na mrežnim vokselima upita oblaka tački sa fizičkohemijskim svojstvima na najbližim mrežnim vokselima odgovarajućih oblaka tački iz baze podataka oblaka tačke i generisanje individualne ocene identičnosti koja predstavlja kvalitet podudaranja za svako fizičko-hemijsko svojstvo, i generisanje ocene identičnosti kao procenjena suma individualnih ocena identičnosti.

2. Metod prema patentnom zahtevu 1, pri čemu korak d) sadrži nasumično rotiranje i translatovanje jednog ili više upita oblaka tački.