RS60527B1 - Probiotski sojevi za upotrebu u lečenju ili prevenciji osteoporoze - Google Patents

Probiotski sojevi za upotrebu u lečenju ili prevenciji osteoporoze

Info

Publication number
RS60527B1
RS60527B1 RS20200844A RSP20200844A RS60527B1 RS 60527 B1 RS60527 B1 RS 60527B1 RS 20200844 A RS20200844 A RS 20200844A RS P20200844 A RSP20200844 A RS P20200844A RS 60527 B1 RS60527 B1 RS 60527B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
dsm
bone
lactobacillus
ovx
probiotic
Prior art date
Application number
RS20200844A
Other languages
English (en)
Inventor
Anna Berggren
Niklas Larsson
Gunilla Önning
Ahrén Irini Lazou
Klara Sjögren
Claes Ohlsson
Original Assignee
Probi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Probi Ab filed Critical Probi Ab
Publication of RS60527B1 publication Critical patent/RS60527B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/306—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on bone mass, e.g. osteoporosis prevention
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
Tehnička oblast pronalaska
[0001] Prikazani pronalazak se odnosi na probiotski soj Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, ili probiotski soj Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, u kombinaciji sa bar još jednim probiotskim sojem Lactobacillus plantarum, za upotrebu u povećavanju apsorpcije Ca<2+>jona u lečenju ili prevenciji osteoporoze, i/ili povećavanju apsorpcije Ca<2+>jona u lečenju ili prevenciji gubitka kostiju kod sisara, poželjno kod ljudi.
Stanje tehnike
[0002] Osteoporoza je bolest u kojoj neke kosti postaju krhe i podložnije lomljenju. Uglavnom kosti gube gustinu, što se meri količinom kalcijuma i minerala u kostima. Osteoporoza je najuobičajeni tip bolesti kostiju. Oko polovina svih žena starosti preko 50 godina će imati frakturu kuka, zgloba ili pršljena (kosti kičme) u toku njihovog života. Kost je živo tkivo. Postojeća kost se konstanto zamenjuje sa novom kosti. Osteoporoza se javlja kada telo ne uspeva da stvori dovoljno nove kosti, kada je suviše postojeće kosti apsorbovano od strane tela ili oboje. Kalcijum je jedan od važnh minerala potrebnih da se stvore kosti. Ukoliko se ne dobija dovoljno kalcijum i vitamina D, ili vaše telo ne apsorbuje dovlojno kalcijuma iz vaše ishrane, vaše kosti mogu postati krhe i sklonije frakturi. Pad u estrogenu kod žena u vreme menopauze i pad u testosteronu kod muškaraca je vodeći uzrok gubitka kostiju.
[0003] Frakture izazvane osteoporozom čine glavni zdravstveni problem i dovode do velikog ekonomskog opterećenja zdravstvenog sistema. Životni rizik usled bilo koje frakture zbog osteporoze visok u zapadnom svetu (oko 50% za žene i 20% za muškarce) i frakture su u vezi sa značajnim mortalitetom i morbiditetom. Kortikalna kost čini do približno 80% kosti u telu i nekoliko ispitivanja je pokazalo da je kortikalna kost glavna determinanta za jačinu kostiju i prema tome podložnost na frakturu. Gubitak kosti posle starosi od 65 je uglavnom usled gubitka kortikalne kost, a ne trabekularne kosti (Lancet, 2010, May 15; 375(9727): 1729-36).
[0004] Skelet se prepravlja osteoblastima koji formiraju kosti (OBs) i osteoklastima koji resorbuju kosti (OCLs). Faktor stimulacije kolonije makrofaga (engl. Macrophage colony stimulating factor (M-CSF)) povećava proliferciju i preživljavanje prekursora OCLs ćelija kao i nadregulacije ekspresije aktivatora receptora nuklearnog faktora -κB (RANK) u OCL. Ovo dozvoljava RANK ligandu (RANKL) da se veže i počne signalnu kaskadu koja vodi do stvaranja OCL. Efekat RANKL može biti inhibiran osteoprotegerinom (OPG), koji je lažni receptor RANKL.
[0005] Veza između zapaljenja i gubitka kostiju je dobro ustanovljena i autoimune bolesti resorpcije kosti osteoklastima su vođene inflamatornim citokinima proizvedenm aktiviranim T-ćelija. Pored toga, nekoliko ispitivanja pokazuje sistemsko zapanjenje malog intenziteta, na koje ukazuju umereno povećani nivoi u serumu visoko osetljivog C-reaktivnog proteina (hsCRP), zajedno sa niskim BMD, povećanom resorpcijom kosti i povećanim rizikom od lomljenja. Nedostatak estrogena koji se javlja posle menopauze dovodi do povećanog stvaranja i produženog preživljavanja osteoklasta. Ovo je sugerisano usled brojnih faktora uključujući gubitak imunosupresivnih efekata estrogena, dovodeći do povećanog stvaranja citokina koji pospešuju osteoklastogenezu, i usmeravaju efekte estrogena na OCLs. U skladu sa ovim podacima, blokada inflamatornih citokina TNFα i IL-1 vodi do pada markera resorpcije kostiju kod žena u ranoj postmenopauzi.
[0006] Poslednjih godina, važnost mikrobiote creva (engl. gut mikrobiota - GM) za oboje i zdravlje i bolest je intenzivno proučavana. GM se sastoji od triliona bakterija koje kolektivno sadrže 150-puta više gena od našeg humanog genoma. Ona se stiče rođenjem i, mada je potpuno posebna, jasno koevulira sa humanim genom i može se smatrati multićelijskim organom koji komunicira sa i utiče na svog domaćina na brojne načine. Sastav GM oblikuju brojni spoljašnji faktori kao što su ishrana i antibiotski tretmani. Molekuli koje proizvode bakterije creva mogu biti i korisne i štetne i poznato je da utiču na endokrine ćelije u crevu, enterički nervni sistem, propustljivost creva i imuni sistem. Poremećeni mikrobialni sastav je ustanovljeno da je uključen u brojna inflamatorna stanja, u okviru i van creva uključujući Koronovu bolest, ulcerovni kolitis, reumatoidni artritis, multiple sklerozu, dijabetis, alergije na koži, ekscem i astmu kao i gojaznost i metabolički sindrom .
[0007] Probiotske bakterije su definisane kao živi mikroogranizmi koji kada se daju u dovoljnim količinama doprinose zdravlju domaćina i veruje se da menjaju sastav mikrobiote creva. Sugerisani mehanizmi u osnovi su mnogistruki uključujući povećanu rastvorljivost i apsorpciju minerala, povećanu funkciju barijere i modulaciju imunog sistema.
[0008] Kod Gilman et al, The effect of Probiotic Bacteria on Transepithelial Calcium Transport and Calcium uptake in Human Intestinal-like Caco-2 cells, Curr. Issues Intestinal Microbial. 7: 1-6, soj Lactobacillus salivarius (UCC 118) i soj Bifidobacterium infantis (UCC 35624) je testiran na preuzimanju kalcijuma i transepitelijalnom transportu kalcijuma kod ćelijske kulture Caco-2 slične humanom crevu. Pomenuti sojevi nisu imali efekat na transepitelijalnij transport kalcijuma u potpuno diferenciranim 16-dana starim Caco-2 ćelija. Preuzimanje kalcijuma u monosloj Caco-2 ćelija posle 24 h je bio značajno viši kod ćelija izloženih Lactobacillus salivarius.
[0009] WO99/02170 opisuje upotrebu laktobacila u dobijanju nefermentisanih enteričnih kompozicija za olakšavanje ili povećavanje apsorpcije minerala iz ishrane kao što su kalcijum, cink, gvožđe i magneziju. Ovde izvedeni eksperimenti, kao potvrda pomenute apsorpcije, su in vitro model kalcijumovog transporta pomoću Caco-2 intestinalnih linija (karcenogenih ćelijskih linija).
[0010] KR101279852 (KR 2013-0002543) opisuje kompozicije za prevenciju ili lečenje osteoporoze koja sadrži kalcijum i magnezijum pored specitičnih bakterijskih sojeva mlečne kiseline kao što su Streptococcus thermophilus sa depozitnim brojem KCTC11870BP, Lactobacillus rhamnosus sa depozitnim brojem KCTC 11868BP, i Lactobacillus paracasei sa depozitnim brojem KCTC11866BP.
[0011] Chiang et al (Effect of bioactive compounds in lactobacilli-fermented soy skim milk on femoral bone microstructure of aging mice, J Sci Food Agric, 2012, 92:328-335) opisuje sojino obrano mleko fermentisano sa Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101 i L. plantarum NTU 102, za upotrebu u umanjivanju gubitka kostiju izazvanom starenjem kod BALB/c miševa i mogućem smanjivanju rizika od osteopenije ili osteoporoze kod starenja .
[0012] JP 2009-114112 opisuje sredstvo protiv osteoporoze koje sadrži Lactobacillus paracasei KW3110 soj.
[0013] Još uvek postoji potreba u okviru stanja tehnike da se nađe efikasni postupci preventive i lečenja osteoporoze kod ljudi.
Suština pronalaska
[0014] Prikazani pronalazak je definisan sa priloženim patentim zahtevima. Prikazani pronalazak se odnosi u jednom aspektu na probiotski soj Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, ili probiotski soj Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, u kombinaciji sa bar jednim probiotskim sojem Lactobacillus plantarum, za upotrebu u povećavanju apsorpcije Ca<2+>jona u lečenju ili prevenciji osteoporoze, i/ili povećanju apsorpcije Ca<2+>jona u lečenju ili prevenciji gubitka kostiju, kod sisara, poželjno kod čoveka.
Kratak opis slika
[0015]
Sl. 1 prikazuje testirani transport Ca<2+>sa različitim bakterijskim sojevima opisanim u eksperimentima 1 i 2.
Sl. 2 prikazuje preostali intracelularni Ca<2+>u ćelijama posle 2 h kao što je opisano u eksperimentima 1 i 2.
Sl.3 prikazuje plan eksperimenta i telesnu masu u eksperimentu 3. Nacrt plana eksperimenta (A). Osam nedelja stari miševi su tretirani sa ili nosačem (veh), jednim Lactobacillus (L) sojem (L. para) ili smešom tri soja (L. mix) u toku 6 nedelja, polazeći dve nedelje pre ’ovx’ ili kontrolne hirurgije. L. Sojevi su dati preko vode za piće u koncentraciji od 10<9>jedinica koje obrazuju koloniju (cfu)/ml , dok su kontrolni miševi primali vodu iz slavine sa nosačem. Miševi su bili 14-nedelja stari na kraju ispitivanja, kada su sakupljena tkiva za kasnije analize. ’Ovx’ je dovelo do očekivanog porasta telesne mase u odnosu na miševe kontrolne grupe gde nije bilo promene posle probiotskog tretmana (B). Rezultati su dati kao srednja vrednost ±SEM (n=9-10), ** p≤ 0.01. Student-ov t test ’ovx’ naspram kontrole.
Sl. 4 prikazuje da probiotik štiti miševe od ’ovx’ izazvanog gubitka kortikalne kosti. Osam nedelja stari miševi su tretirani sa ili nosačem (veh), jednim Lactobacillus (L) sojem (L. para) ili smešom tri soja (L. mix) u toku 6 nedelja, polazećei dve nedelje pre ’ovx’ ili kontrolne hirurgije da bi se ispitao preventivni efekat probiotskog tretmana na ’ovx’ izazvani gubitak kosti. Na kraju eksperimenta, analizirane su secirane butne kosti sa µCT visoke rezolucije i perifernom kvantitativnom kompjuterskom tomografijom (pQCT). Reprezentativne mCT slike jednog kortikalnog dela iz veh i L. smeše tretirane kontrolne i ’ovx’ grupe (A). Mineralni sadržaj kortikalne kosti (BMC) (B) i kortikalna površina (C) su mereni sa pQCT u srednjoj dijafiznoj regiji butne kosti. Vrednosti su date kao srednja vrednost ±SEM, (n=9-10). ** p≤0.01, * p≤0.05. Studentov t test ’ovx’ naspram kontrole sham. # p≤0.05, ANOVA praćen sa Dunnet-ovim post hoc testom u okviru grupa, ’ovx’ L. Para i L. smeše naspram ’ovx’ veh.
Sl.5 prikazuje da probiotik smanjuje ekspresiju inflamatornih citokina i odnos RANKL/OPG u kortikalnoj kosti. QRT-PCR analize ekspresije gena poznate da pospešuju resorpciju kosti; (A) alfa faktor nekroze tumora (TNFα), (B) Interleukin-1β (IL-1β), (C) Interleukin-6 (IL-6), (D) odnos aktivatora receptora nuklearnog faktora kapa-B liganda (RANKL) i osteoprotegerina (OPG), i pojedinačnih grafika za (E) OPG, (F) RANKL i geni poznati da promovišu obrazovanje kosti; (G) Osteriks, (H) kolagen, tipa I, αl (Col1α1) i (I) osteokalcin u kortikalnoj kosti 14 nedelja starih ovariektomiziranih (’ovx’) miševa tretiranih ili sa nosačem (veh) ili smešom tri probiotička Lactobacillus soja (L. mix) u toku 6 nedelja, polazeći dve nedelje pre ’ovx’ ili kontrolne hirurgije radi ispitivanja preventivnog efekta probiotsokg tretmana na gubitak kostiju izazvan ’ovx’. Vrednosti su date kao srednja vrednost ±SEM, n=9-10. *P≤0.05 naspram tretmana veh, Student-ov t-test.
Sl.6 opisuje da frakciona ekskrecija Ca je bila povećana sa ’ovx’ kod veh tretiranih, ali ne kod miševa tretiranih sa L. para ili L. smešom. Ca i kreatini su mereni u serumu i urinu od 14-nedelja starih miševa koji su tretirani sa nosačem (veh), jednim Lactobacillus (L) sojem (L. para) ili smešom tri soja (L. mix) u toku 6 nedelja, polazeći dve nedelje pre ’ovx’ ili kontrolne hirurgije. Urinarna frakciona ekskrecija Ca je izračunata sa formulom FECa = (urin Ca x serumski kreatinin)/(serum Ca x urinski kreatinin). Vrednosti su date kao srednja vrednost ±SEM, n=5-10 u svakoj grupi. * p≤0.05. Student-ov t test ’ovx’ naspram. kontrole. # p≤0.05, ANOVA praćeni sa Dunnet-ovim post hoc testom u okviru grupa, ovx L. Para i L. smeše vs. ’ovx ’veh.
Opis pronalaska
[0016] Prikazni pronalazak se odnosi, u jenom izvođenju, na probiotski soj Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, ili probiotski soj Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, u kombinaciji sa bar jednim probiotskim sojem Lactobacillus plantarum, za upotrebu u povećavanju apsorpcije Ca<2+>jona u lečenju ili prevenciji osteoporoze, i/ili povećavanju apsorpcije Ca<2+>jona u lečenju ili prevenciji gubitka kostiju kod sisara, poželjno čoveka.
[0017] Prikazani opis se takođe odnosi na bar jedan probiotski soj za upotrebu u lečenju ili prevenciji osteoporoze sprečavanje gubitka kortikalne kosti, sprečavanjem sadržaja gubitka kostiju i sprečavanjem gubitka kostiju.
[0018] Kortikalna kost čini približno 80% kosti u telu i nekoliko ispitivanja je prikazalo da je je glavna determinanta jačina kortikalne kosti i prema tome osetljivost na frakturu. Pokazano je ovde u eksperimentima da probiotski soj vrsta Lactobacillus paracasei ili sam ili u kombinaciji sa sojevima vrsta Lactobacillus plantarum sprečava gubitak kortikalne kost. Takođe je ovdenavedeno u eksperimentima da probiotsko lečenje menja imuni status kosti dovodeći do smanjene resorpcije kostiju. Pored toga, takođe je pokazano ovde u eksperimentima da mineralni sadržaj kostiju nije bio smanjen u probiotskoj grupi u porećenju sa grupom sa nosačem (Slike 4a-c). Mineralni sadržaj kostiju u kortikalnoj kosti je bio viši u obe probiotske grupe u poređenju sa grupom sa nosačem (p<0.05, slika 4b).
[0019] Prikazani opis se takođe odnosi na probiotski soj Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, ili probiotski soj Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, u kombinaciji sa bar jednim probiotskim sojem Lactobacillus plantarum, za upotrebu u lečenju ili prevenciji osteoporoze, za sprečvanje gubitka mineralnog sadržaja kosti , za sprečavanje gubitka kosti kod sisara, poželjno kod čoveka.
[0020] Prikazani opis se takođe odnosi na probiotski soj Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, ili probiotski soj Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, u kombinaciji sa bar jednim probiotskim sojem izabranim između Lactobacillus plantarum, za upotrebu u spečavanju gubitka mineralnog sadržaja kosti, za sprečavanje gubitka kosti kod sisara, poželjno kod ljudi.
[0021] U izvođenju pronalaska bar dva ili više Lactobacillus plantarum soja je korišćeno zajedno u kombinaciji sa probiotskim sojem Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434. Takođe opisano je bar dva ili više, na primer tri ili više, Lactobacillus paracasei sojeva korišćenih zajedno u kombinaciji sa bar jednim sojem Lactobacillus plantarum.
[0022] U izvođenju prema pronalasku probiotski soj je živ, inaktiviran ili mrtav. U izvođenju pronalaska sojevi su prisutni u kompoziciji koja dodatno sadrži bar jedan nosač. Nosač treba da je bilo koji nosač koji je konvencionalno korišćen na primer kao dodatak ishrani. Nosač može biti bilo koji nosač na bazi žitarica kao što nosač na bazi ovsa ili nosač na bazi raži koji može biti korišćen u funkcionalnoj hrani ili bilo kojoj vrsti hrane. Nosač može biti voda ili bilo koji drugi vodeni rastvarač u kome je probiotski soj pomešan pre uzimanja.
[0023] Kompozicija može biti oplemenjanja sa dodatnim Ca<2+>u obliku na primer soli, npr. kalcijum karbonata, kalcijum hlorida, kalcijumovih soli limunske kiseline, klacijum glukonata, kalcijum glicerofosfata, kalcijum laktata, kalcijum oksida, kalcijum sulfata. Preporučeni dnevni unos (RDI) Ca<2+>je 800 mg. Količina Ca<2+>u kompoziciji može biti u opsegu od 10-40% RDI, poželjno u opsegu od 15-30% RDI. Prema tome, količina Ca<2+>npr. u obliku soli u kompoziciji može biti u ospegu 80 -320 mg, poželjno 120 -240 mg. Količina Ca<2+>dodata u kompoziciju treba da je podešena na bilo koju količinu u okviru gornjeg opisa tako da je kompozicija još uvek stabilna i obezbeđuje njene korisne efekte.
[0024] Kompozicija može biti suva, nefermentisana kompozicija ili fermentisana kompozicija. U slučaju suve, nefermentisane kompozicije, fermentisanje se dešava posle unosa kompozicije od strane pojedinca, tj. u gastrointestinalnom traktu. Pored toga, sojevi mogu biti prisutni u kompoziciji kao sojevi sušeni smrzavanjem.
[0025] Probiotski soj Lactobacillus paracasei može biti izabran između Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434. Takođe opisan je probiotski soj Lactobacillus paracasei 02:A,DSM 13432. Probiotski soj Lactobacillus plantarum može biti izabran između Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, i Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316.
[0026] Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, i Lactobacillus paracasei 02:A, DSM 13432, su oba deponovana10 April 2000 u Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
[0027] Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, i Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, su deponovani u Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH on 28 November 2002.
[0028] Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, je deponovan 21 marta 1995 i Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, je deponovan 5 Jula 1991 u Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
[0029] U izvođenju pronalaska, kompozicija koja uključuje probiotski(e) soj(eve) može biti izabrana iz grupe prehrambenog proizvoda, dodatka za ishranu, medicinske hrane, funkcionalne hrane i proizvoda za ishranu.
[0030] U slučaju kada je pomenuta kompozicija prehrambeni proizvod može biti izabrana iz grupe koju čine napitci, jogurt, sokovi, sladoled, hlebovi, biskviti, žitarice, energetske pločice i namazi.
[0031] Kada je bilo koji od gore pomenutih sojeva korišćen u kompoziciji kao što je dijetetski suplement nosač(i) koji se dodaju su poznati osobi iz struke. Bilo koji od sastojaka koji su normalno korišćeni u dijetetskim suplementima i mogu biti poznati osobi iz struke i mogu takođe biti dodati konvencionalno zajedno sa sojevima.
[0032] U izvođenju prema pronalasku, gore pomenuti probiotski soj(evi) su prisutni u kompoziciji od oko 1x10<6>do oko 1x10<14>CFU, poželjno 1x10<8>do 1x10<12>, i poželjnije 1x10<9>do 1x10<11>. Sojevi mogu biti takođe korišćeni sami u gornjim količinama u vodi ili u bilo kom drugom vodenom nosaču u kome sojevi mogu biti dodati pre uzimanja.
[0033] Pronalazak je pogodno da bude uzet od strane sisara i ljudi, kao što su stariji ljudi, žene u postmenomauzi i žene u premenopauzi, u kojima gubitak kosti, gubitak mineralnog sadržaja kosti i povećani gubitak kosti ili resorpcije kosti su ili mogu biti problem.
[0034] Zdravi ljudi mogu takođe imati koristi od pronalaska u cilju da ostanu zdravi i da se spreči da se razbole od osteoporoze.
Eksperimentalni deo
Eksperiment 1
Materijali i postupci
"Transportni rastvori"; ukupna zapremina 6 ml
[0035] Transportni rastvori koji sadrže Hankov balansirani rastvor soli (Hank’s Balanced Salt solution-HBSS) sa Ca i Mg, Hepes (2%), Glutamin (4 mM), D-Glc (3, 5 g/l) i CaCl2• 2 H2O (1.47 g/l). Analiza rastvora je dala [Ca<2+>] na 10,65 mM.
"Bazalni rastvor"
[0036] Slično transportnom rastvoru, ali uz dodavanje eksternog kalcijuma. Analiza rastvora je dala [Ca<2+>] 1,22 mM.
Primer 1 :
[0037]
1. Samo kontrola od transportnog rastvora
2. Liofilizovani Lactobacillus plantarum 299 v.0,788 mg koji odgovara 4,02 x 10<8>bakterija/6 ml u transportnom rastvoru
3. Lactobacillus plantarum 299v.4.02 x 10<8>bakterija/6 ml u transportnom rastvoru
4. Lactobacillus plantarum 299.4.95 x 10<8>bakterija/6 ml u transportnom rastvoru
5. Lactobacillus plantarum HEAL 19, 4.95 x 10<8>bakterija/6 ml u transportnom rastvoru
6. AMJ 1277. 4.95 x 10<8>bakterija/6 ml u transportnom rastvoru. AMJ 1277 je mutirani oblik Lactobacillus plantarum 299v.
Eksperiment 2:
1. CNCM I-2332, Lactobacillus acidophilus (La10); 4.95 x 10<8>bakterija/6 ml u transportnom rastvoru
2. Lactobacillus plantarum 299 v.4,02 x 10<8>bakterija/6 ml u transportnom rastvoru
3. Kontrola – samo transportni rastvor
[0039] Svi sojevi osim soja La10 su kultivisani aerobno u 30 ml MRS. (30 ° C, 210 oum). La10 je kultivisan u 37 ° C i prekriven sa sterilno profiltriranim azotom pre zatvaranja. Brojne inokulisane ćelije su bile 3 x 10<8>/balonu. Bakterija je prekultivisana u toku noći i bile su u eksponencijalnoj fazi pre inokulacije. Ćelije su sakupljene na OD600=0.1-0.5 i za svaki soj sakupljena je zapremina koja je odgovarala 4,02 x 10<8>ćelija. Ovi uzorci su centrifugorani na 5000 oum, 3 min, supernatant je sipan i ćelije su resuspendovane u NaCl (0.9%). Ćelije su centrifugirane ponovo i odsut je supernatat. Sada isprane pelete su zatim suspendovane u transportnom rastvoru.
[0040] Caco-2 ćelije su isprane sa PBS (2 puta) pre testa.<45>Ca Cl2(74kBq/ml) su dodati u transportni rastvor. Smeša je zatim dodata, u zapreminu od 0.5 ml, apikalno u Caco-2 ćelije koje su rasle na umetcima. Svaki bunarčić je zatim snabdeven sa 6.7 x 10<7>bakterija/ml. Samo bazalni rastvor (1.5 ml) koji je sadržao samo endogeni [Ca<2+>] u HBSS (1,22 mM) je dodat u bazalnu komoru. Suspenzije i kontrole je omogućeno da funkcionišu na Caco-2 ćelijama u toku 2 h. Zatim su aspirirane i ćelije su isprane sa ledeno-hladnim puferom za ispiranje 3 puta prema postupku opisanom u WO99/02170. Caco-2 ćelije su zatim lizirane u 0,5 ml NaOH (0.5 M). Rastvori u bazalnim komorama su sakupljeni za merenje transprota uz pomoć scintilatora (Tri-carb 2800TR, Perkin Elmer). Lizati su analizirani na<45>Ca, ali takođe i na proteinski sadržaj. Sve merne vrednosti za Ca<2+>transport/preuzimanje su normalizovane naspram proteinskog sadržaja u odgovarajućim ćelijama. Svi bunarčići su provereni pre i posle inkubacije sa rastvorima za testiranje u odnosu na transepitelijalnu otpornost (TEER). Ne primećuje se razlika u TEER, pre i posle ispitivanja. TEER je meren da bi se osiguralo da epitelijum ne curi. Razlika u otpornosti posle ispitivanja može voditi do sumnje da intercelularne veze mogu biti oštećenje korišćenim rastvorima.
Rezultati
[0041] Da bi se osposobilo upoređivanje rezultata iz eksperimenata 1 i 2, podaci transporta i preuzimanja iz ispitivanih sojeva su bili normalizovani naspram kontrolnog rastvora bez bakterija. Svi rezultati su prema tome prikazani kao procenat kontrole (slično, kao što je rađeno u WO99/02170). Takođe treba primetiti da eksperimenti 1 i 2 su rađeni dana 16 i 21 ćelijske kulture, respektivno. Generalno, primećeno je da standardne devijacije dobijenih rezultata su relativno velike. Ovo može biti usled nekih oblika agregacije bakterija i Ca<2+>, vodeći do varijacija u dostupnosti Ca<2+>. Ovo nije primećeno za bakterije sušene smrzavanjem kada su standardne devijacije relativno male u poređenju sa preostalim uzorcima.
Transport Ca<2+>
[0042] Rezultati eksperimenta 1 su pokazali značajno poboljšanje transporta Ca<2+>transport kada je prisutan soj AMJ1277 (134,7618,9%, p=0,002), videti sl. 1. Ni jedan od ostalih sojeva (Lp299v sušen smrzavanjem i živ, Lp299, Lp HEAL 19) nije dao značajne razlike u transportu Ca<2+>, videti tabelu 1. U eksperimentu 2 kada su La10 i Lp299v testirani nije bilo detektovano značajne razlike u transprotu Ca<2+>u poređenju sa uzorcima sa Lp299v vs kontrole bez bakterija (p=0,2). Za La10 blagi pad Ca<2+>transporta u prisutvu istih bakterija je primećen (79,5 ±19,3%) i ova promena je značajna (p=0,049).
Preuzimanje Ca<2+>
[0043] Ovde prikazani podaci preuzimanja pokazuju količinu Ca<2+>prisutnog u ćelijama posle 2 h. Za procenu podataka stvarnog preuzimanja, intracelularne količine Ca<2+>treba da se dodaju u detektovanu količinu Ca<2+>u lateralnim odecima. Zbir ovih podataka opisuje ukupnu količinu Ca<2+>koja je transportovana preko apikalne membrane. Rezultati ovih eksperimenata generalno pokazuju smanjenje u intracelularnom [Ca<2+>] u prisustvu bakterija, u poređenju sa kontrolnim rastvorima bez bakterija, videti sliku 2. Međutim, samo razlike liofilizovanih i vijabilinih Lp299v, su bile značajne (p = 0.04 i p = 0.02). Primetite, da intermedijerni intracelularni nivoi Ca<2+>su samo nekoliko procenata u poređenju sa transportovanom količinom Ca<2+>. Zbog toga, pokazani efekti preuzimanja Ca<2+>nemaju isti uticaj kao efekti na transport. Ovo može biti primećeno za liofilizovane i vijabilne Lp 299v, koje imaju viši intracelularni [Ca<2+>] ali ne pokazuje poboljšanje u transportu.
Zaključak
[0044] U prisustvu soja AMJ1277, mutant Lactobacillus plantarum 299v, primećen je povećani transport i čak sveukupno preuzimanje kalcijuma u porećenju sa oba kontrolnim i preostalim sojevima. Prema tome, postoji varijacija između posmatranih sojeva.
Eksperiment 3
Ovarijektomirani mišji model i probiotski tretman
[0045] Ovarijektomija (ovx) dovodi do gubitka kostiju u vezi sa izmenjenim imunim stanjem. Svrha ovog eksperimenta je da se odredi zaštita probiotskog tretmana miševa od ’ovx’ izazvanog gubitka kostiju. Miševi su tretirani ili sa jednim Lactobacillus (L) sojem, L. paracasei DSM13434 (L. para) ili smešom tri soja, L. paracasei DSM13434, L. plantarum DSM 15312 i DSM 15313 (L. mix) davanim preko vode za piće u toku 6 nedelja, polazeći dve nedelje pre ovx.
[0046] Šest nedelja stari C57BL/6N ženski miševi su nabavljeni od Charles River (Germany). Miševi su smešteni u standardnu životinjski smeštaj sa kontrolisanomm temperaturom (22 °C) i fotoperiodom (12-h svetlo, 12-h mrak) i imali su slobodan prilaz svežoj vodi i peletama hrane bez soje R70 (Lactamin AB, Stockholm, Sweden). Ovarijektomizirani (ovx) model za osteoporozu je uključen u smernice FDA za predkliničku i kliničku procenu za sredstva korišćena u lečenju osteoporoze u postmenopauzi. Probiotsko lečenje je počelo dve nedelje pre ’ovx’ da bi se proučavao preventivni efekat probiotskog tretmana na ’ovx’ izazvani gubitak kosti. Miševi su tretirani ili pojedinačnim Lactobacillus (L) sojem, L. paracasei DSM13434 (L. para) ili smešom tri soja, L. paracasei DSM 13434, L. plantarum DSM 15312 i DSM 15313 koji se naziva L. mešavina u toku 6 nedelja. Probiotski sojevi su izabrani na osnovu njihovih antiinflamatornih osobina. L. Sojevi su davani u pijaćoj vodi pri koncentraciji od 10<9>jedinica koje obrazuju koloniju (cfu)/ml dok kontrolni miševi su primali vodu iz česme sa nosačem. Flaše za vodu su menjane svako poslepodne. Preživljavanje L. sojeva u flašama za vodu je redovno kontrolisano i posle 24 h koncentracija je pala jednu log jedinicu na približno 10<8>cfu/ml. Svaki miš je popio u proseku 4.5 ml vode/danu. Posle dve nedelje probiotskog tretmana, miševi su bili ili kontrolno operisani ’ovx’ pod inhalacionom anestezijum sa izofluranom (Forene; Abbot Scandinavia, Solna, Sweden). Četiri nedelje posle operacije, sakupljena je krv iz aksilarne vene pod anestezijom sa Ketalar/Domitor vet, i miševi su zatim ubijeni cervikalnom dislokacijom. Tkiva za RNK preparate su trenutno uklonjena i brzo zamrznuta u tečnom azotu za kasnije analize. Kosti su isečene i fiksirane u 4% paraformaldehidu. Svi životinjski eksperimenti su odobreni od lokalnog Ethical Committees for Animal Research at the University of Gothenburg.
Periferna kvantitativna kompjuterizovana tomografija (pQCT)
[0047] Kompjuterizovani tomografski skanovi su izvedeni sa pQCT XCT RESEARCH M (version 4.5B, Norland, Fort Atkinson, WI, USA) koja radi pri rezoluciji od 70µm, as. Parametri kortikalne kosti su anlaizirani ex vivo u srednjem dijafizealnom regionu butne kosti.
µCT visoke rezolucije
[0048] Analize µCT visoke rezolucija su izvedeni na distalnoj butnoj kosti korišćenjem 1172 modela µCT (Bruker micro-CT, Aartselaar, Belgium). Butne kosti su snimljene sa kivetom za X-zrake pod naponom 50 kV i jačinom struje 201 µA, sa aluminijumskim filterom 0.5-mm. Skenirajuća ugaona rotacija je bila 180° i ugaoni inkriment je bio 0.70°. Veličina voksela je bila 4.48 µm izotropski. NRecon (verzija 1.6.9) je korišćena da se izvede rekonstrukcija posle skanova. U butnoj kosti, trabekularna kost proksimalna distalnoj ploči rasta je izabrana za analize u okviru odgovarajuće zone od interesa (isključena je korikalna kost) polazeći pri rastojanju od 538.5 µm od ploče rasta i produžavanjem dalje longitudilanog rastojanja 134.5 µm u proksimalno pravcu. Kortikalna merenja su izvedena u dijafizealnom regionu butne kosti polazeći od rastojanja 3.59 mm od ploče rasta i produžavanjem dalje longitudilane distance 134.5 µm u proksimalnom pravcu. Za BMD analize, oprema je kalibrisana sa keramičkim standardnim uzorcima.
RNK izolacija i PCR u realnom vremenu
[0049] Ukupna RNK je pripremljena iz kortikalne kosti (butne kosti sa uklonjenim krajevima i koštanom srži ispranom sa PBS pre smrzavanja) i koštane srži pomoću TriZol Reagensa (Invitrogen, Lidingö, Sweden). RNK je reverzno transkribovan u cDNK pomoću visokokapacitetnog cDNK reverznog transkribcionog Kita (#4368814, Applied Biosystems, Stockholm, Sweden). RT-PCR analize su izvedene korišćenjem ABI Prism 7000 sistema za detekciju sekvenci (PE Applied Biosystems). Mi smo prethodno osmišljene RT-PCR testove od Applied Biosystems (Sweden) za analizu IL-6 (Mm00446190_m1), IL-1β (Mm00434228_m1), TNFα (Mm00443258_m1), RANKL (Mm00441908_m1), OPG (Mm00435452_m1), Runx2 (Mm00501580_m1), Col1α1 (Mm00801666_g1), osteokalcin (Mm01741771_g1) i TGFβ1 (Mm03024053_m1) mRNK nivoe. mRNK zastupljenost svakog gena je izračunavana korišćenjem "postupka standardne krive" (User Bulletin 2; PE Applied Biosystems) i prilagođena za ekspresiju 18S (4308329) ribozomalne RNK.
Analiza krvi
[0050] Analize su izvedene prema uputstvu proizvođača za kalcijum u serumu i urinu (Quanti-Chrom™Calcium Assay Kit (DICA-500), Bioassays systems, Hayward, CA, USA), kreatinin u serumu i urinu (Mouse Creatinine Kit, Crystal Chem, Downers Grove, IL, USA). Kao marker resorpcije kostiju, nivoi u serumu fragmenata kolagena tipa I su procenjivani pomoću RatLaps ELISA kita (Nordic Bioscience Diagnostics, Herlev, Denmark). Nivoi u serumu osteokalcina, markera nastanka kosti, su određeni sa imunoradiometrijskim kitom za testiranje mišjeg osteokalcina (Immutopics, San Clemente, CA).
Protočna cirometrija
1
[0051] Ćelije koštane srži su sakupljene ispiranjem sa 5 ml PBS kroz šupljinu jedne butne kosti pomoću šprica. Posle centrifugiranja na 515 g u toku 5 min, pelete ćelija su resuspendovane u Tris-puferisanom 0.83% NH4Cl rastvoru (pH 7.29) u toku 5 min da bi se lizirali eritrociti i zatim isprali u PBS. Ćelije koštane srži su resuspendovane u medijumu RPMI kulture (PAA Laboratories, Pasching, Austria) pre upotrebe. Ukupni broj leukocita u koštanoj srži je izračunat korišćenjem automatizovanog brojača ćelija (Sysmex, Hamburg, Germany). Za analize protočne citometrije, ćelije su bojene sa alofikocijaninom (APC)-konjugovanim antitelima za CD4 za detekciju T pomoćničnih ćelija (Beckton-Dickinson) i fluorescein izotiocijanat (FITC)-konjugovana antitela za CD8 citotoksične T ćelije (Beckton-Dickinson) ili Peridininhlorofil proteini (PerCP)-konjugovana antitela za Gr-1/Ly-6G (BioLegend) da se eliminišu granulocite i FITC-konjugovana antitela za CD11b za detekciju OCL prekursorskih ćelija (Beckton-Dickinson). Ćelije su zatim podvrgnute analizi ćelijskog sortera fluorescentno aktiviranih ćelija (FACS) na FACSCalibur (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ USA) i analizirane pomoću FlowJo softvera. Rezultati su izraženi kao ćelijska frekvenca (%).
Statističke analize
[0052] Svi statistički rezultati su prikazani kao srednja vrednost ±SEM. Razlike između grupa su izračunate korišćenjem nesparenih t testova. Upoređivanje između višestrukih grupa je izračunato korišćenjem jednosmerne analize varijanse (ANOVA) praćeno sa Dunetovim testom korigovanim za višestruko upoređivanje. p ≤ 0.05 na dva kraja je smatrano značajnim.
Rezultati –Probiotski tretmani štite miševe od ’ovx’ izazvanog gubitka kortikalne kosti i povećane resorpcije kosti
[0053] Da bi se odredilo prevetivni efekat probiotskog tretmana na ’ovx’ izazvani gubitak kosti, osam nedelja stari miševi su tretirani sa nosačem (veh), pojedinačnim Lactobacillus (L) sojem (L. para) ili smešom tri soja (L. mix) u toku 6 nedelja, polazeći dve nedelje pre ’ovx’ ili kontrolne operacije (slika 3A). Masa uterusa može biti korišćena kao indikator statusa estrogena i ’ovx’ je dovela do očekivanog pada u masi uterusa koja je bila slična za sve tretmane (Tabela 2). Pored toga, ’ovx’ je povećala telesnu masu, masu masti i masu timusa u svim tretiranim grupama (Slike 3B, Tabela 2).
[0054] Na miševima tretiranim nosačem, ’ovx’ je smanjila mineralni sadržaj kortikalne kosti i površine poprečnog preseka koritkalne kosti kod srednjeg dijafizealnog regiona butne kosti (p<0.01, Slike 4a-c). Važno je, da ’ovx’ nije smanjilo mineralni sadržaj kortikalne kosti ili površinu poprečnog preseka korikalne kosti kod L. para ili L. smešom tretiranih miševa (Slike 4a-c). Mineralni sadržaj kortikalne kosti je bio viši kod obe L. para i L. smešom tretiranih ’ovx’ miševa u poređenju sa ’veh’ tretiranim ’ovx’ miševima (p<0.05, slika 4b). Da bi se odredilo da li preventivni efekat probiotika na koritikalnu kost je izazvan resorpcijom zahvaćene kosti, analizirani su nivoi u serumu C-terminalnih telopeptida (RatLaps). ’Ovx’ je povećala nivoe RatLaps kod miševa tretiranih veh (+45±11%, p<0.05 preko kontrole), ali ne u L. para tretiranim (2069 %, non-significant) ili L. smešom tretiranim (23±9 %, nije značajno) miševima. Obrazovanje kosti, na šta je ukazano serumskim osteokalcinom, nije bilo značajno izmenjeno sa probiotskim tretmanom (podaci nisu prikazani). Parametri trabekularne kosti (BV/TV i trabekularni BMD) u distalnom merafizealnom regionu butne kosti su značajno smanjeni sa ’ovx’ u svim tretiranim grupama (p<0.05 Table 2). Ovi podaci pokazuju da probiotski tretman štiti miševe od ’ovx’ izazvanog gubitka kosti i povećane resorpcije kosti.
Probiotici smanjuju ekspresiju inflamatornih citokina i RANKL/OPG udeo u korikalnoj kosti
[0055] Da bi se ispitao mehanizam efekata na tretman probiotikom na ’ovx’ izazvani gubitak kortikalne kosti, mi smo merili kost u vezi sa mRNK transkripcijom u kortikalnoj kosti (Slike 5). Nivoi mRNK TNFα, inflamatornih citokina proizvedenih od mijeloidnih ćelija koje pospešuju osteoklastogenzu, i IL-1β, nishodni regulator efekata TNFα na kost, su značajno smanjeni sa probiotskim tretmanom u poređenju sa tretmanom nosačem ’ovx’ miševa (TNFα -46%, p<0.05; IL-1β -61%, p<0.05, slike 5a i 5b). Ekspresija, IL-6 nije se razlikovala između tretmana mada je postojala tendencija za smanjivanje ekspresije u probiotski tretiranim grupama (-20%, p=0.12, Slika 5c).
[0056] Odnos RANKL/osteoprotegerin (OPG) je glavna determinatna osteoklastogeneze i prema tome, resorpcije kostiju. Ono što je važno, je da je probiotski tretman smanjio odnos RANKL/ OPG (-45%, p<0.05 u poređenju sa veh, slika 5d) i ovo je izazvano sa povećanom OPG ekspresijom (OPG; 28%, p<0.05 i RANKL; 1%, nije značajno, slike 5e, f). Nasuprto tome, nivoi mRNK tri gena u vezi sa osteoblastima, Osterix, Col1α1 i osteokalcina, nisu bili pod uticajem lečenja probiotika (Slika 5g-h).
Imuni status u koštanoj srži
[0057] Neki od anti-inflamatornih efekata i vršenih od probiotskih bakterija se misli da su posredovani pomoću indukcije regulatornih T (Treg) ćelija. FACS analize koštane srži su pokazale da učestalost Treg(CD4<+>CD25<+>Foxp3<+>) ćelija je smanjena sa ’ovx’ kod tretiranih ’veh’ ali ne kod probiotski tretiranih miševa (Tabela 2). Tregćelije zavisne od TGFβ u njihovoj indukciji i održavanju i ekspresiji TGFβ1 bile su povećane u koštanoj srži kod ’ovx ’miševa tretiranih probiotikom u poređenju sa ’ovx’ miševeima tretiranih sa nosačem (+77±19%, p<0.01).
[0058] Takođe je ispitivano da li probiotski tretman menja frekvencu prekursorskih ćelija osteoklasta (preOCLs) u koštanoj srži. Frekvenca preOCLs (CD11b<+>Gr1-) u koštanoj srži nije bila pod uticajem ’ovx’ u bilo kojoj od tretiranih grupa (Tabela 2).
Mineralni metabolizam
[0059] Urinarna frakciona ekskrecija kalcijuma (FECa = (urinski Ca x kreatinin u plazmi)/( Ca u plazmi x kreatinin u urinu)) je povećana sa ’ovx’ kod miševa tretiranih sa ’veh’ (+86%, p<0.05, Slika 6). ’Ovx’ izazvani porast u FECa je potpuno sprečen sa probiotskim tretmanom sugerišući povećane Ca (Slika 6). Bila je tendenca povećanih nivoa u serumu Ca posle ’ovx’ kod miševa tretiranih sa ’veh’ ali neprobiotski tretiranih (+13%, p=0.05, Taela 3). Odnos Ca/kreatinin u urinu nije bio pod uticajem ’ovx’ u bilo kojoj od tretiranih grupa (Tabela 3).
�
2
ela
Tab
[0060] Kao zaključak, podaci prema prikazanom pronalasku pokazuju da probiotici u vodi za piće smanjuju ’ovx’ izazvani gubitak kortikalne kosti sugrešući terapeutski potencijal za probiotika u lečenju osteoporoze u postmenopauzi. Pored toga, rezultati podržavaju ulogu mikrobita creva za regulaciju košatne mase.
[0061] Oba tretmana sa L. para i L. smešom zaštitilo je miševe od ’ovx’ izazvanog koritkalnog gubitka kosti i povećalo koštanu resorpciju. Mineralni sadržaj kortikalne kosti je bio viši za oba L. para i L. smešom tretirane ’ovx’ miševe u poređenju sa nosačem (veh) tretirane ’ovx’ miševe. Urinarna frakciona ekskrecija kalcijuma i resorpcioni marker RatLaps su bili povećani ’ovx’ kod ’veh’ tretiranih ali ne i L. para ili L. Smešom tretiranih miševa. Prema tome, probitotici inhibiraju ’ovx’ izazvanu ekskreciju kalcijuma u urinu. Probiotsko lečenje smanjuje ekspresiju dva inflamatorna citokina , TNFα i IL-1β, i povećava ekspresiju OPG u kortikalnoj kosti ’ovx’ miševa. Pored toga, ’ovx’ smanjuje frekvencu regulatornih T-ćelija (CD4+ CD25+ Foxp3+) u koštanoj srži ’veh’ tretiranih, ali ne probiotiski tretiranih miševa. Prema tome, probiotici inhibiraju ’ovx’ izazvani pad u frekvenciji regulatornih T-ćelija u koštanoj srži. Pored toga, probiotici povećavaju ekspresiju TGFb1 u koštanoj srži i probiotici inhibiraju ’ovx’ izazvani porast resorpcionog markera Rat Lap. Kao zaključak, tretiranje sa L. para ili L. smešom sprečava ’ovx’ izazvani gubitak korikalne kosti. Podaci prema pronalasku ukazuju da ovi probiotski tretmani menjaju imuni status u kosti kao što je pokazano smanjenom ekspresijom inflamatornih citokina i povećanom ekspresijom OPG, dovodeći do smanjenja resorpcije kostiju kod ’ovx ’ miševa.
Eksperiment 4
[0062] U ovom eksperimentu biće testirano da li isti probiotici kako je gore pomenuto će uticati na iste parametre kao gore (tj. gubitak kortikalne kosti, mineralni sadržaj kosti, resorpcije kosti) kod ženskih miševa koji su već ovarijektomizirani i prema tome već imaju gubitak koštane mase. Ovarijektomizirani ženski miševi su dobro ustanovljeni model gubitka kosti u postmenomauzi kod žena. Dole će biti naznačena vremenska linija eksperimenata .
Ovarijektomizirani miševi => 4 nedelje => Probiotski tretman u toku 6 nedelja => Kraj
Probiotici će biti dati u vodi za piće i prvo će početi posle 4 nedelje posle ovarijektomizacije. Doza će biti 10<9>cfu/ml/danu i ovarijektomizacija će se desiti pri starosti 9-10 nedelja. Analize posle završenih eksperimentata će biti (CT) kosti da bi se izmerila gustina i deljina, kao i analiza seruma i markera kosti.
1

Claims (11)

Patentni zahtevi
1. Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu u povećavanju apsorpcije Ca<2+>jona u lečenju ili prevenciji osteoporoze i/ili u povećanju apsorpcije Ca<2+>jona u tretmanu ili prevenciji gubitka kosti kod sisara.
2. Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema zahtevu 1, u kombinaciji sa bar jednim probiotskim sojem Lactobacillus plantarum.
3. Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema zahtevu 2, gde je pomenuti bar jedan probiotski soj Lactobacillus plantarum izabran između Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, i Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316.
4. Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM13434, za upotrebu prema zahtevu 1, u kombinaciji sa Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, i Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313.
5. Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-4, gde je sisar čovek.
6. Kompozicija koja sadrži Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, prema bilo kom od zahteva 1-5, za upotrebu u povećanju apsorpcije Ca<2+>jona u tretmanu ili prevenciji osteoporoze, i/ili u povećavanju apsorpcije Ca<2+>jona u lečenju ili prevenciji gubitka kosti, kod sisara, gde kompozicija sadrži dodatno bar jednan nosač.
7. Kompozicija koja sadrži Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema zahtevu 6, gde je pomenuta kompozicija obezbeđena u obliku prehrambenog proizvoda, dodatka ishrani, medicinske hrane, funkcionalne hrane ili proizvoda za ishranu.
8. Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-5, ili kompozicija koja sadrži Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema zahtevu 6 ili 7, gde su Lactobacilli prisutni u količini od oko 1x10<6>do oko 1x10<14>CFU.
9. Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema zahtevu 8 ili kompozicija koja sadrži Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema zahtevu 8, gde su Lactobacilli prisutni u količini od oko 1x10<8>do oko 1x10<12>CFU.
10. Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema zahtevu 9 ili kompozicija koja sadrži Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema zahtevu 9, gde su Lactobacilli prisutni u količini od oko 1x10<9>do oko 1x10<11>CFU.
11. Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-5 ili 8-10, ili kompozicije koja sadrži Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, za upotrebu prema bilo kom od zahteva 6-10, gde je osteoporoza osteoporoza u postmenopauzi.
RS20200844A 2013-04-03 2014-04-03 Probiotski sojevi za upotrebu u lečenju ili prevenciji osteoporoze RS60527B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1350414 2013-04-03
SE1351571 2013-12-20
PCT/SE2014/050399 WO2014163568A1 (en) 2013-04-03 2014-04-03 Probiotic strains for use in treatment or prevention of osteoporosis
EP14779522.3A EP2981274B1 (en) 2013-04-03 2014-04-03 Probiotic strains for use in treatment or prevention of osteoporosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60527B1 true RS60527B1 (sr) 2020-08-31

Family

ID=51659047

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200844A RS60527B1 (sr) 2013-04-03 2014-04-03 Probiotski sojevi za upotrebu u lečenju ili prevenciji osteoporoze

Country Status (19)

Country Link
US (1) US10245290B2 (sr)
EP (1) EP2981274B1 (sr)
JP (1) JP6103675B2 (sr)
KR (2) KR102000514B1 (sr)
CN (3) CN105188723A (sr)
AU (1) AU2014250113B2 (sr)
BR (1) BR112015025256B1 (sr)
CA (1) CA2908051C (sr)
DK (1) DK2981274T3 (sr)
ES (1) ES2804615T3 (sr)
HR (1) HRP20201139T1 (sr)
MX (1) MX371418B (sr)
NZ (1) NZ712959A (sr)
PL (1) PL2981274T3 (sr)
PT (1) PT2981274T (sr)
RS (1) RS60527B1 (sr)
RU (1) RU2636027C2 (sr)
WO (1) WO2014163568A1 (sr)
ZA (1) ZA201507275B (sr)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018030837A1 (ko) * 2016-08-12 2018-02-15 한국식품연구원 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 갱년기 예방 또는 치료용 조성물
KR101867768B1 (ko) 2016-08-12 2018-06-15 한국식품연구원 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 갱년기 예방 또는 치료용 조성물
CN106858605A (zh) * 2016-12-26 2017-06-20 吉林舒润生物科技有限公司 一种用于预防及治疗骨吸收相关疾病的益生菌钙功能食品
EP3568144B1 (en) * 2017-01-12 2024-05-08 Probi Ab Probiotic compositions and uses thereof
TWI604052B (zh) * 2017-02-20 2017-11-01 景岳生物科技股份有限公司 促進骨質再生的植物乳桿菌菌株ｇｍｎｌ－６６２及其組合物
CN108567800A (zh) 2017-03-07 2018-09-25 景岳生物科技股份有限公司 副干酪乳杆菌菌株gmnl-653用于制备抗骨质流失的组合物的用途
TWI607758B (zh) * 2017-03-07 2017-12-11 景岳生物科技股份有限公司 改善乾癬症狀的副乾酪乳桿菌菌株ｇｍｎｌ－６５３及其組合物
TWI607759B (zh) * 2017-07-07 2017-12-11 景岳生物科技股份有限公司 副乾酪乳桿菌菌株ｇｍｎｌ－６５３用於製備抗骨質流失的組合物的用途
CN108624520B (zh) * 2017-03-16 2022-01-25 景岳生物科技股份有限公司 促进骨质再生的植物乳杆菌菌株gmnl-662及其组合物
WO2019088379A1 (ko) * 2017-11-02 2019-05-09 경희대학교 산학협력단 신규 유산균 및 이의 용도
CN108030096A (zh) * 2017-12-18 2018-05-15 浙江民生健康科技有限公司 一种钙铁锌与益生菌组合物及其应用
AU2019216129B2 (en) * 2018-02-02 2022-03-17 Kobiolabs, Inc. Lactobacillus plantarum KBL396 strain and use thereof
TWI664910B (zh) * 2018-04-24 2019-07-11 葡萄王生技股份有限公司 乳酸桿菌屬、其醫藥組合物及可食用組合物於治療、預防或改善骨質疾病的用途
KR102770563B1 (ko) 2018-06-18 2025-02-21 프로비 에이비 락토바실러스 플란타룸 조성물 및 이의 용도
AU2019289515B2 (en) * 2018-06-18 2025-07-24 Probi Ab Probiotic compositions and uses thereof
KR102107443B1 (ko) * 2018-08-31 2020-05-07 (주)바이오리듬 여성 갱년기 증상 예방 또는 치료용 유산균 프로바이오틱스 제제
CA3111795A1 (en) 2018-09-05 2020-03-12 Solarea Bio, Inc. Methods and compositions for treating musculoskeletal diseases
US11980647B2 (en) 2018-09-05 2024-05-14 Solarea Bio, Inc. Methods and compositions for treating musculoskeletal diseases, treating inflammation, and managing symptoms of menopause
KR102120479B1 (ko) * 2018-10-30 2020-06-09 주식회사 종근당바이오 프로바이오틱스를 유효 성분으로 포함하는 이차성 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물
GB201905386D0 (en) * 2019-04-16 2019-05-29 Probi Ab Probiotic compositions and uses thereof
US12274719B2 (en) * 2019-06-25 2025-04-15 Synbio Tech Inc. Method for improving walking capacity of elderly subjects
FR3102774B1 (fr) * 2019-10-31 2021-10-01 Vf Bioscience Nouvelle souche de lactobacillus plantarum utile pour l’absorption intestinale du calcium
CN111109607A (zh) * 2020-01-10 2020-05-08 青岛康益生物科技有限公司 一种用于预防和治疗骨质疏松症的健康食品
CN111718903A (zh) * 2020-06-24 2020-09-29 江南大学 一种筛选可预防和/或治疗骨质疏松的药物的方法
CN111621449B (zh) * 2020-07-02 2022-07-12 安徽善和生物科技有限公司 一种益生菌及其在继发性骨质疏松中的应用
TWI770811B (zh) * 2021-02-05 2022-07-11 國立臺灣大學 一種益生菌、其組合物及用途
CN115607595B (zh) * 2021-07-13 2023-12-22 百岳特生物技术（上海）有限公司 诺丽果发酵物于制备改善体态及肌肤状况的组合物的用途
CA3238788A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Eric Michael Schott Methods and compositions for treating musculoskeletal diseases, treating inflammation, and managing symptoms of menopause
US20230190834A1 (en) 2021-12-21 2023-06-22 Solarea Bio, Inc. Immunomodulatory compositions comprising microbial entities
CN114634901B (zh) * 2022-05-18 2022-08-30 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌lc16及其培养方法与应用
CN115851506A (zh) * 2022-10-11 2023-03-28 中科嘉亿营养医学(山东)微生态研究院有限公司 一种预防骨质疏松的鼠李糖乳杆菌jylr-219及其菌剂和应用
WO2026017258A1 (en) * 2024-07-18 2026-01-22 Probi Ab Lacticaseibacillus compositions and uses thereof
KR102796426B1 (ko) * 2024-10-18 2025-04-24 (주)네오리젠바이오텍 락토바실러스 파라카세이 l-30 균주 및 이의 용도
CN119570677A (zh) * 2024-12-12 2025-03-07 江南大学 一株副干酪乳酪杆菌ccfm1394制备的调控骨稳态的后生元及应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002507997A (ja) 1997-07-05 2002-03-12 ソシエテ デ プロデユイ ネツスル ソシエテ アノニム 腸管細胞によるミネラルの吸収
GB9920578D0 (en) * 1999-08-31 1999-11-03 Nestle Sa Composition for maintenance of bone or dental health or treatment of bone or dental disorders
SE0003100D0 (sv) 2000-09-01 2000-09-01 Probi Ab New strains
SE529199C2 (sv) 2005-07-05 2007-05-29 Probi Ab Förstärkt absorption
CN1927010A (zh) * 2005-09-06 2007-03-14 天津科技大学 具有增加骨密度、抑制血管紧张素转化酶功能的无乳糖发酵大豆乳及其制备方法
WO2007040446A1 (en) * 2005-10-06 2007-04-12 Probi Ab Use of lactobacillus for treatment of autoimmune diseases
JP2009114112A (ja) 2007-11-06 2009-05-28 Tsujido Kagaku Kk 抗骨粗鬆症剤
JP2009114111A (ja) 2007-11-06 2009-05-28 Tsujido Kagaku Kk カルシウム吸収促進剤
JP2009144111A (ja) * 2007-12-18 2009-07-02 Kansai Paint Co Ltd 塗料組成物及び塗膜形成方法
SE533778C2 (sv) 2009-05-14 2011-01-11 Probi Ab Probiotisk fruktdryck
KR101279852B1 (ko) 2011-06-29 2013-07-09 주식회사 쎌바이오텍 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015147106A (ru) 2017-05-05
US10245290B2 (en) 2019-04-02
HK1220129A1 (en) 2017-04-28
EP2981274A1 (en) 2016-02-10
MX2015014016A (es) 2016-06-24
RU2636027C2 (ru) 2017-11-17
AU2014250113A1 (en) 2015-10-29
KR20170141820A (ko) 2017-12-26
CN117064923A (zh) 2023-11-17
EP2981274A4 (en) 2017-03-01
JP2016521123A (ja) 2016-07-21
NZ712959A (en) 2017-01-27
KR20150133284A (ko) 2015-11-27
AU2014250113B2 (en) 2017-03-30
BR112015025256A8 (pt) 2021-09-14
CA2908051C (en) 2021-03-02
BR112015025256B1 (pt) 2021-10-13
JP6103675B2 (ja) 2017-03-29
US20160067289A1 (en) 2016-03-10
CA2908051A1 (en) 2014-10-09
WO2014163568A1 (en) 2014-10-09
HRP20201139T1 (hr) 2020-10-30
BR112015025256A2 (pt) 2017-07-18
CN105188723A (zh) 2015-12-23
PT2981274T (pt) 2020-07-13
PL2981274T3 (pl) 2020-12-28
DK2981274T3 (da) 2020-07-06
EP2981274B1 (en) 2020-05-06
KR102000514B1 (ko) 2019-10-01
MX371418B (es) 2020-01-29
KR102129934B1 (ko) 2020-07-03
ES2804615T3 (es) 2021-02-08
ZA201507275B (en) 2022-03-30
CN116889579A (zh) 2023-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2981274B1 (en) Probiotic strains for use in treatment or prevention of osteoporosis
Caballero-Franco et al. The VSL# 3 probiotic formula induces mucin gene expression and secretion in colonic epithelial cells
Arora et al. Effect of Lactobacillus acidophilus NCDC 13 supplementation on the progression of obesity in diet-induced obese mice
JP5923492B2 (ja) 腸管神経系の改善に用いるためのプロバイオティクス株
CN103261399B (zh) 抑制炎症的组合物
US9737577B2 (en) Lactic acid bacterium-containing preparation
JP5925274B2 (ja) 子宮内膜症の予防及び／又は改善剤及びこれを含んでなる飲食品組成物
KR101545551B1 (ko) 인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물
JP2015502410A (ja) ポリポーシスおよび結腸直腸癌を低減する方法
HK1220129B (en) Probiotic strains for use in treatment or prevention of osteoporosis
Kiran Dedicated To My Beloved Parents, Mamajee &