RS60583B1

RS60583B1 - Ljudska monoklonalna antitela koja vrše neutralizaciju il-ss

Info

Publication number: RS60583B1
Application number: RS20200680A
Authority: RS
Inventors: Cheng-I Wang; Angeline Goh; Siok Ping Yeo; Alessandra Mortellaro; Subhra Kumar Biswas; Florent Ginhoux; Pingyu Zhong
Original assignee: Agency Science Tech & Res
Priority date: 2012-02-13
Filing date: 2013-02-13
Publication date: 2020-08-31
Also published as: US20210024627A1; EP2814843B1; JP6383665B2; US20150037248A1; PT2814843T; DK2814843T3; PL2814843T3; LT2814843T; JP2015518368A; EP2814843A2; WO2013122544A2; CY1123519T1; US20190144535A1; US11780913B2; US11702471B2; HRP20200964T1; EP3736289A1; CN105431452B; ES2798110T3; SMT202000321T1

Description

Opis

Tehničko polje

[0001] Dati su antigen vezujući proteini, naročito IL-1β antigen vezujući proteini. Preciznije, predmetni pronalazak se odnosi na sekvence vezujućih proteina i teške i lake lance. Sastavi koji sadrže antigen vezujuće proteine, upotreba antigen vezujućih proteina i metode za proizvodnju su takođe dati.

Pozadina

[0002] Interleukin-1 beta (IL-1β) je član porodice Interleukin-1 citokina i značajni je posrednik inflamatornog odgovora. Pro-inflamatorni je citokin i uključen je u proliferaciji, diferencijaciji i apoptozi ćelija.

[0003] Prekomerno ispoljavanje IL-1β je implicirano kod više inflamatornih i autoimunih bolesti kao što su kriopirin-povezani periodični sindromi i povezane bolesti, dijabetes, Kronova bolest, reumatoidni artritis, karcinom bubrežnih ćelija, giht i inflamatorne akne. Geiger i dr. (Clin Exp Rheumatol. 11(5): 515-522, 1993) pokazuje da kod mišijeg modela artritisa anti-IL-1β antitelo može sprečiti uništavanje zglobova. WO 2007/002261 obelodanjuje anti-IL-1β antitela i tretiranje inflamatornih bolesti, autoimunih bolesti, rakova, itd., upotrebom navedenih antitela. WO02/16436 obelodanjuje ACZ885 (sada se naziva kanakinumab), koje je postalo standardno antitelo za upotrebu u terapiji blokiranja IL-1b, primarno kod inflamacije.

[0004] Cilj predmetnog obelodanjivanja je da se pruže antigen vezujući proteini specifični za IL-1β koji mogu neutralisati aktivnost IL-1β kako bi se sprečile ili tretirale bolesti povezane sa povišenom proizvodnjom IL-1β.

[0005] Do danas, tri biološka ciljanja IL-1β signalnog puta su odobrena za kliničku upotrebu: anakinra (IL-1 receptor antagonist), rilonacept (fuzioni protein koji sadrži IL-1 receptor 1) i kanakinumab (monoklonalno antitelo).

[0006] Pored tri odobrena IL-1 blokatora spomenuta iznad, humanizovano monoklonalno antitelo XOMA-052 (gevokizumab) je trenutno u kliničkim ispitivanjima. Svaki molekul pokazuje jedinstvene mehanizme delovanja i pokazuje različitu unakrsnu reaktivnost i farmakološki profil.

Rezime pronalaska

[0007] Pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima i bilo koji drugi aspekt ili otelotvorenja koja su ovde izneta su samo radi informacija. Naročito, pronalazak se odnosi na izolovani IL-1β specifični antigen vezujući protein, njegove sekvence za kodiranje, vektore, ćelije domaćina i metodu proizvodnje kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

Definicije

[0008] Sledeće reči i termini koji se ovde koriste imaju ukazano značenje:

Termin „antigen vezujući protein“ kako se ovde koristi se odnosi na antitela, fragmente antitela i druge proteinske konstrukte, kao što su domeni, koji se mogu vezati za IL-1β□

[0009] Termin „antitelo“ kako se ovde koristi se u najširem smislu odnosi na molekule sa imunoglobulin-nalik domenom i obuhvataju monoklonalna, rekombinantna, poliklonalna, himerna, humanizovana, bispecifična, multispecifična i heterokonjugat antitela; jedan varijabilni domen, domen antitelo, antigen vezujuće fragmente, imunološki delotvorne fragmente, Fv sa jednim lancem, diatela, Tandab™, itd. (za rezime alternativnih formata „antitela“ videti Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, tom 23, br.9, 1126-1136).

[0010] Fraza „jedan varijabilni domen“ se odnosi na varijabilni domen antigen vezujućeg proteina (na primer, VH, VHH, VL) koji se specifično vezuje za antigen ili epitop nezavisno od drugog varijabilnog regiona ili domena.

[0011] „Domen antitelo“ ili „dAb“ se može smatrati istim kao i „jedan varijabilni domen“ koji se može vezati za antigen. Jedan varijabilni domen može biti varijabilni domen ljudskog antitela, ali takođe obuhvata varijabilne domene pojedinačnih antitela drugih vrsta kao što su glodari (na primer, kao što je obelodanjeno u WO 00/29004), ajkula dadilja i kamila VHHdAb. VHHkamile su polipeptidi imunoglobulin pojedinačnog varijabilnog domena koji su dobijeni iz vrsta uključujući kamilu, lamu, alpaku, jednogrbu kamilu, gvanako, koji proizvode antitela teškog lanca prirodno lišena lakih lanaca. Takvi VHHdomeni mogu biti humanizovani prema standardnim tehnikama dostupnim u struci i takvi domeni se smatraju „domen antitelima“. Kako se ovde koristi VHobuhvata VHHdomene kamila.

[0012] Kako se ovde koristi, termin „domen“ se odnosi na savijenu proteinsku strukturu koja ima tercijarnu strukturu nezavisnu od ostatka proteina. Uopšteno, domeni su odgovorni za diskretna funkcionalna svojstva proteina i u mnogo slučajeva se mogu dodati, ukloniti ili preneti na druge proteine bez gubitka funkcije ostatka proteina i/ili domena. „Jedan varijabilni domen“ se savijeni polipeptidni domen koji sadrži sekvence karakteristične za varijabilne domene antitela. Prema tome obuhvata kompletne varijabilne domene antitela i modifikovane varijabilne domene, na primer, kod kojih je jedna ili više petlji zamenjena sekvencama koje nisu karakteristične za varijabilne domene antitela, ili varijabilne domene koji su skraćeni ili sadrže N- ili C-terminalna produženja, kao i savijene fragmente varijabilnih domena koji zadržavaju bar aktivnost vezivanja i specifičnost domena pune dužine. Domen može vezati antigen ili epitop nezavisno od različitih varijabilnih regiona ili domena.

[0013] Antigen vezujući fragment može biti dat postavljanjem jednog ili više CDR na neantitelo proteinskim skeletima kao što je domen. Domen može biti domen antitelo ili može biti domen koji je derivat skeleta izabranog iz grupe koju čine CTLA-4 (evitelo); lipokalin; molekuli dobijeni od proteina A kao što je Z-domen proteina A (afitelo, SpA), A-domen (Avimer/maksitelo); proteini toplotnog šoka kao što su GroEl i GroES; transferin (trans-telo); protein sa ponavljanjem ankirina (DARPin); peptid aptamer; C-tip lektin domen (Tetranektin); ljudski γ-kristalin i ljudski ibikvitin (afilini); PDZ domeni; toksin škorpije tip domeni ljudskih inhibitora proteaze; i fibronektin (adnektin); koji je podvrgnut modifikaciji proteina kako bi se dobilo vezivanje za ligand koji nije njegov prirodni ligand.

[0014] CTLA-4 (citotoksični T limfocit-povezani antigen 4) je receptor iz CD28 familije koji se ispoljava uglavnom na CD4+ T ćelijama. Njegov vanćelijski domen ima savijeni Ig nalik varijabilnom domenu. Petlje koje odgovaraju CDR antitela se mogu zameniti sa heterolognom sekvencom kako bi se dodelila različita svojstva vezivanja. CTLA-4 molekuli modifikovani da imaju različite specifičnosti vezivanja su takođe poznati kao evitela. Za dodatne detalje videti Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)

[0015] Lipokalini su familija vanćelijskih proteina koji transportuju male hidrofobne molekule kao što su steroidi, bilini, retinoidi i lipidi. Oni imaju rigidnu β-tablastu sekundarnu strukturu sa brojem petlji na otvorenom kraju konične strukture koji se može modifikovati kako bi se vezala za različite ciljane antigene. Antikalini su veličine između 160-180 amino kiselina, i izvedeni su iz lipokalina. Za dodatne detalje videti Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 i US20070224633

[0016] Afitelo je skelet dobijen iz Proteina A Staphylococcus aureus koji se može modifikovati da se veže za antigen. Domen se sastoji od tri spiralna snopa od približno 58 amino kiselina. Biblioteke su stvorene randomizacijom površinskih ostataka. Za dodatne detalje videti Protein Eng. Des. Sel.17, 455-462 (2004) i EP1641818A1

[0017] Avimeri su multidomenski proteini dobijeni iz A-domen skelet familije. Nativni domeni od približno 35 amino kiselina usvajaju definisanu disulfidno vezanu strukturu.

Raznolikost se stvara mešanjem prirodnih varijacija ispoljenih familijom A domena. Za dodatne detalje videti Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) i Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (Jun 2007)

[0018] Transferin je monomerni glikoprotein za transport seruma. Transferini se mogu modifikovati da se veđu za različite ciljane antigene unošenjem peptidnih sekvenci u dozvoljenoj površinskoj petlji. Primeri modifikovanih transferin skeleta obuhvataju transtelo. Za dodatne detalje videti J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999).

[0019] Dizajnirani proteini sa ponavljanjem ankirina (DARPin) su dobijeni iz ankirina koji je familija proteina koji posreduju povezivanje integralnih membranskih proteina za citoskelet. Jedno ponavljanje ankirina je motiv 33-ostatka koji se sastoji od dve α-spirale i βzakrivljenja. Oni se mogu modifikovati da se vežu za različite ciljane antigene nasumičnom podelom ostataka u prvoj α-spirali i β-zakrivljenju svakog ponavljanja. Njihov interfejs vezivanja se može povećati povećavanjem broja modula (metoda afinitetnog sazrevanja). Za dodatne detalje videti J. Mol. Biol.332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) i J. Mol. Biol.369, 1015-1028 (2007) i US20040132028A1.

[0020] Fibronektin je skelet koji se može modifikovati tako da se veže za antigen. Adnektini se sastoje od glavnog lanca prirodne aminokiselinske sekvence 10. domena od 15 ponovljenih jedinica ljudskog fibronektin tipa III (FN3). Tri petlje na jednom kraju βsendviča se mogu modifikovati da omoguće Adnektin specifično prepoznavanje terapeutskog cilja od interesa. Za dodatne detalje videti Protein Eng. Des. Sel.18, 435-444

(2005), US20080139791, WO2005056764 i US6818418B1.

[0021] Peptidni aptameri su kombinatorni molekuli za prepoznavanje koji se sastoje od konstantnih skelet proteina, obično tioredoksina (TrxA) koji sadrži zadržanu varijabilnu peptidnu petlju unetu na aktivnom mestu. Za dodatne detalje videti Expert Opin. Biol. Ther.5, 783-797 (2005).

[0022] Mikrotela su dobijena iz prirodnih mikroproteina dužine od 25-50 amino kiselina koje sadrže 3-4 cisteinska mosta - primeri mikroproteina obuhvataju KalataB1 i konotoksin i knotine. Mikroproteini imaju petlju koja se može modifikovati da obuhvata do 25 amino kiselina bez uticanja na ukupni broj mikroproteina. Za dodatne detalje modifikovanih knotin domena, videti WO2008098796.

[0023] Drugi vezujući domeni obuhvataju proteine koji su korišćeni kao skelet za modifikovanje različitih ciljanih svojstava vezivanja antigena i obuhvataju ljudski γ-kristalin i ljudski ubikvitin (afilini), kunitz tip domene ljudskih inhibitora proteaze, PDZ domene Rasvezujućeg proteina AF-6, toksine škorpije (haribdotoksin), C-tip lektin domena (tetranektini) koji su razmatrani u Odeljku 7 - Non-Antibody Scaffolds u Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, urednik Stefan Dubel) i Protein Science 15:14-27 (2006). Domeni vezivanja predmetnog obelodanjivanja se mogu dobiti iz bilo kog od ovih alternativnih proteinskih domena.

[0024] Antigen vezujući fragment ili imunološki delotvorni fragment mogu sadržati parcijalne varijabilne sekvence teškog ili lakog lanca. Fragmenti su dugački bar 5, 6, 8 ili 10 amino kiselina. Alternativno, fragmenti su dugački bar 15, bar 20, bar 50, bar 75 ili bar 100 amino kiselina.

[0025] Termin „neutrališe“ kako se koristi u predmetnoj specifikaciji predstavlja da je biološka aktivnost IL-1β smanjena u prisustvu antigen vezujućeg proteina kao što je ovde opisano u poređenju sa aktivnošću IL-1β u odsustvu antigen vezujućeg proteina, in vitro ili in vivo. Neutralizacija može biti usled jednog ili više blokiranja IL-1β vezivanja za svoj receptor, sprečavajući IL-1β od aktiviranja svog receptora, regulisanje IL-1β na dole ili njegovog receptora, ili delovanje efektorske funkcije.

[0026] Smanjenje ili suzbijanje biološke aktivnosti može biti delimično ili potpuno.

Neutrališući antigen vezujući protein može vršiti neutralizaciju aktivnosti IL-1β za bar 20%, 30% 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% relativno u odnosu na IL-1β aktivnost u odsustvu antigen vezujućeg proteina.

[0027] Neutralizacija se može odrediti ili izmeriti upotrebom jedne ili više analiza koje su poznate stručnjaku ili koje su ovde opisane. Na primer, vezivanje antigen vezujućeg proteina za IL-1β se može proceniti u sendvič ELISA, sa BIAcore™, FMAT, FORTEbio, ili sličnim in vitro analizama, ali takođe i u funkcionalnim analizama baziranim na ćelijama.

[0028] „CDR“ su definisani kao regioni aminokiselinske sekvence koji determinišu komplementarnost antigen vezujućeg proteina. To su hipervarijabilni regioni imunoglobulin teškog i lakog lanca. Postoje tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca (ili CDR regiona) u varijabilnom delu imunoglobulina. Zbog toga, „CDR“ se ovde koristi da predstavlja sva tri CDR teškog lanca, sva tri CDR lakog lanca, sve CDR teškog i lakog lanca, ili bar dva CDR.

[0029] Kroz ovu specifikaciju, aminokiselinski ostaci u sekvencama varijabilnog domena i sekvencama antitela pune dužine su numerisani u skladu sa Kabat konvencijom o numerisanju. Slično, termini „CDR“, „CDRL1“, „CDRL2“, „CDRL3“, „CDRH1“, „CDRH2“, „CDRH3“ koji se koriste u Primerima slede Kabat konvenciju o numerisanju. Za dodatne informacije, videti Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. izdanje., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987).

[0030] Stručnjacima će biti očigledno da postoje alternativne konvencije o numerisanju aminokiselinskih ostataka u sekvencama varijabilnih domena i sekvencama antitela pune dužine. Takođe postoje alternativne konvencije o numerisanju CDR sekvenci, na primer, one iznete u Chothia i dr. (1989) Nature 342: 877-883. Struktura i proteinsko savijanje antitela može značiti da se drugi ostaci smatraju delom CDR sekvenci i bilo bi prihvaćeno od strane stručnjaka u ovoj oblasti.

[0031] Druge konvencije o numerisanju za CDR sekvence dostupne stručnjaku obuhvataju „AbM“ (University of Bath) i „kontakt“ (University College London) metode. Region minimalnog preklapanja koji koristi bar dve od Kabat, Chothia, AbM i kontakt metoda se može odrediti da pruža „minimalnu jedinicu vezivanja“. Minimalna jedinica vezivanja može biti pod-deo CDR.

[0032] Tabela ispod predstavlja jednu definiciju primenom svake konvencije o numerisanju za svaki CDR ili vezujuću jedinicu. Kabat šema numerisanja se koristi u Tabeli 1 za numerisanje aminokiselinske sekvence varijabilnog domena. Trebalo bi napomenuti da neke od CDR definicija mogu varirati u zavisnosti od korišćene pojedinačne publikacije.

[0033] Za nukleotidne i aminokiselinske sekvence, termin „identično“ ili „identičnost sekvence“ ukazuje na stepen identičnosti između dve nukleinske ili dve aminokiselinske sekvence kada su optimalno poravnate i upoređene sa odgovarajućim uvođenjima ili brisanjima.

[0034] Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj.% identičnosti = broj identičnih pozicija/ukupan broj pozicija puta 100), uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koju treba uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence se može uspostaviti matematičkim algoritmima, kao što je opisano ispod.

[0035] Procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence se može odrediti upotrebom GAP programa u GCG softverskom paketu, upotrebom NWSgapdna. CMP matrice i težine praznine od 40, 50, 60, 70, ili 80 i težine dužine od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Procenat identičnosti između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence se takođe može odrediti upotrebom algoritma od E. Meyers i W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) koji je inkorporiran u ALIGN program (verzija 2.0), upotrebom PAM120tabele težine ostatka, kazne za dužinu praznine od 12 i kazne za prazninu od 4. Dodatno, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence se može odrediti upotrebom Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) algoritma koji je inkorporiran u GAP program u GCG softverskom paketu, upotrebom Blossum 62 matrice ili PAM250 matrice sa težinom praznine od 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i težinom dužine od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.

[0036] Putem primera, polinukleotidna sekvenca može biti identična sa referentnom polinukleotidnom sekvencom kao što je ovde opisano (videti, na primer SEQ ID NO: X), koja je 100% identična, ili može obuhvatati do određenog celog broja nukleotidnih izmena u poređenju sa referentnom sekvencom, kao što je bar 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ili 99% identičnost. Takve izmene su izabrane iz bar jednog nukleotidnog brisanja, zamene, uključujući prelaz, transverziju ili uvođenje i gde se takve izmene mogu javiti bar na 5’ ili 3’ terminalnim pozicijama referentne nukleotidne sekvence ili bilo gde između tih terminalnih pozicija, raspoređeni pojedinačno među nukleotidima u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence. Broj nukleotidnih izmena je određen množenjem ukupnog broja nukleotida u referentnoj polinukleotidnoj sekvenci sa numeričkim procentom odgovarajućeg procenta identiteta (podeljeno sa 100) i oduzimanjem od navedenog ukupnog broja nukleotida u referentnoj polinukleotidnoj sekvenci kao što sledi:

gde je nnbroj nukleotidnih izmena, xnje ukupni broj nukleotida u referentnoj polinukleotidnoj sekvenci a y je 0,50 za 50%, 0,60 za 60%, 0,70 za 70%, 0,75 za 75%, 0,80 za 80%, 0,85 za 85%, 0,90 za 90%, 0,95 za 95%, 0,98 za 98%, 0,99 za 99% ili 1,00 za 100%, • je simbol za operator množenja i gde je proizvod koji nije ceo broj xni y je zaokružen na najbliži ceo broj pre oduzimanja od xn.

[0037] Slično, polipeptidna sekvenca može biti identična sa polipeptidnom referentnom sekvencom, koja je 100% identična, ili može obuhvatati do određenog celog broja aminokiselinskih izmena u poređenju sa referentnom sekvencom tako da % identičnosti bude manje od 100%, kao što je bar 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ili 99% identičnosti. Takve izmene su izabrane iz bar jednog aminokiselinskog brisanja, zamene, uključujući konzervativne i nekonzervativne zamene ili uvođenje i gde se takve izmene mogu javiti bar na amino ili karboksi- terminalnim pozicijama referentne polipeptid sekvence ili bilo gde između tih terminalnih pozicija, raspoređeni pojedinačno među nukleotidima u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence. Broj aminokiselinskih izmena je određen množenjem ukupnog broja amino kiselina u polipeptidnoj sekvenci kodiranoj od strane polipeptidne referentne sekvence sa numeričkim procentom odgovarajućeg procenta identiteta (podeljeno sa 100) i oduzimanjem od navedenog ukupnog broja amino kiselina u polipeptidnom referentnom sekvenci kao što sledi:

gde je nabroj nukleotidnih izmena, xaje ukupni broj nukleotida u referentnoj polinukleotidnoj sekvenci a y je 0,50 za 50%, 0,60 za 60%, 0,70 za 70%, 0,75 za 75%, 0,80 za 80%, 0,85 za 85%, 0,90 za 90%, 0,95 za 95%, 0,98 za 98%, 0,99 za 99% ili 1,00 za 100%, • je simbol za operator množenja i gde je proizvod koji nije ceo broj xai y je zaokružen na najbliži ceo broj pre oduzimanja od xa. % identičnosti se može odrediti po dužini sekvence.

[0038] Termin „specifično vezuje“ kako se koristi kroz predmetnu specifikaciju u vezi sa antigen vezujućim proteinima predstava da se antigen vezujući protein vezuje za ciljani epitop na IL-1β sa afinitetom većim od onog koji se dobija kada se veže za epitop koji nije ciljan. U određenim otelotvorenjima, specifično vezivanje se odnosi na vezivanje za cilj sa afinitetom koji je bar 10, 50, 100, 250, 500 ili 1000 puta veći od afiniteta epitopa koji nije ciljan. Na primer, afinitet vezivanja se može meriti rutinskim metodama, npr., kompetetivnom ELISA ili merenjem Kd sa BIACORE™, KINEXA™ ili PROTEON™.

[0039] Termin kako se ovde koristi predstavlja molarnu koncentraciju supstance (antagonista) koja smanjuje efikasnost referentnog agonista ili konstitutivnu aktivnost biološkog cilja za 50% krive antagonista (Vrh-Dno) za naročitu test supstancu.

1

[0040] Termin „EC50“ kako se ovde koristi predstavlja molarnu koncentraciju supstance (agonista) koja izaziva odgovor od 50% maksimalnog dejstva na krivi doza-odgovor.

[0041] Kroz ovu specifikaciju, aminokiselinski ostaci u sekvencama varijabilnog domena i sekvencama antitela pune dužine su numerisani u skladu sa Kabat konvencijom o numerisanju. Za dodatne informacije, videti Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. izdanje., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987).

[0042] Stručnjacima će biti očigledno da postoje alternativne konvencije o numerisanju aminokiselinskih ostataka u sekvencama varijabilnih domena i sekvencama antitela pune dužine. Takođe postoje alternativne konvencije o numerisanju CDR sekvenci, na primer, one iznete u Chothia i dr. (1989) Nature 342: 877-883. Struktura i proteinsko savijanje antitela može značiti da se drugi ostaci smatraju delom CDR sekvenci i bilo bi prihvaćeno od strane stručnjaka u ovoj oblasti.

[0043] Druge konvencije o numerisanju za CDR sekvence dostupne stručnjaku obuhvataju „AbM“ (University of Bath) i „kontakt“ (University College London) metode. Region minimalnog preklapanja koji koristi bar dve od Kabat, Chothia, AbM i kontakt metoda se može odrediti da pruža „minimalnu jedinicu vezivanja“. Minimalna jedinica vezivanja može biti pod-deo CDR.

[0044] Termin „farmaceutski prihvatljiv nosač“ je namenjen da obuhvati rastvarače, disperzione sredine, obloge, anti-bakterijska i anti-fungalna sredstva, izotonična i sredstva za odlaganje apsorpcije i slično. Upotreba takvih sredina i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u struci. Osim u slučaju da je bilo koja konvencionalna sredina ili sredstvo nespojivo sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim sastavima i metodama i profilaksi. Dopunjena aktivna jedinjenja se takođe mogu obuhvatiti u predmetnim sastavima. Naročito je pogodno formulisati parenteralne sastave u jediničnim oblicima za doziranje radi jednostavnosti davanja i uniformnosti doziranja.

[0045] Nukleinska kiselina kao što se ovde koristi predstavlja bilo koji pojedinačni ili dvolančani RNK ili DNK molekul, kao što su mRNK, cDNK i genomska DNK.

[0046] Kako se ovde koristi, termin „oko“, u kontekstu koncentracija komponenti formulacija, obično predstavlja /- 5% navedene vrednosti, češće /- 4% navedene vrednost, još češće /- 3% navedene vrednosti, još češće, /- 2% navedene vrednosti, čak još češće /-1% navedene vrednosti, a čak još češće /- 0,5% navedene vrednosti.

[0047] Kroz ovo obelodanjivanje, određena otelotvorenja su obelodanjena u formatu opsega. Trebalo bi prihvatiti da je opis u formatu opsega dat samo radi praktičnosti i sažetosti i ne treba ga tumačiti kao nefleksibilno ograničenje okvira obelodanjenih opsega. Prema tome, opis opsega bi trebalo smatrati da ima specifično obelodanjene sve moguće pod-opsege kao i pojedinačne numeričke vrednosti u tom opsegu. Na primer, opis opsega kao što je od 1 do 6 bi trebalo smatrati da ima naročito obelodanjene pod-opsege kao što je od 1 do 3, od 1 do 4, od 1 do 5, od 2 do 4 od 2 do 6, od 3 do 6 itd., kao i pojedinačne brojeve unutar tog opsega, na primer, 1, 2, 3, 4, 5 i 6. Ovo se odnosi bez obzira na širinu raspona.

Perspektive daljeg razvoja

[0048] Dodatno pronalasku, dati su sledeći aspekti kako bi se olakšao dalji razvoj antigen vezujućih proteina specifičnih za IL-1b. Ovi aspekti su eksplicitno isključeni iz okvira pronalaska.

[0049] Prvi takav apsekt predviđa izolovani IL-1β specifični antigen vezujući protein koji sadrži jednu ili više jedinica vezivanja izabranih iz grupe koji čine sledeće jedinice vezivanja:

(i) jedinica vezivanja L1 koja obuhvata Kabat ostatke 23-35 od SEQ ID NO: 3 ili Kabat ostatke 24-33 od SEQ ID NO: 4, 15 ili 16, ili njihove varijante koje sadrže bar jednu amino kiselinsku zamenu, uvođenje ili brisanje u jedinice vezivanja L1;

(ii) jedinica vezivanja L2 koja obuhvata Kabat ostatke 51-57 od SEQ ID NO: 3 ili Kabat ostatke 49-55 od SEQ ID NO: 4, 15 ili 16, ili njihove varijante koje sadrže bar jednu amino kiselinsku zamenu, uvođenje ili brisanje u jedinice vezivanja L2;

(iii) jedinica vezivanja L3 koja obuhvata Kabat ostatke 92-102 od SEQ ID NO: 3 ili Kabat ostatke 88-96 od SEQ ID NO: 4, 15 ili 16, ili njihove varijante koje sadrže bar jednu amino kiselinsku zamenu, uvođenje ili brisanje u jedinice vezivanja L3;

(iv) jedinica vezivanja H1 koja obuhvata Kabat ostatke 31-35 od SEQ ID NO: 1 ili Kabat ostatke 31-35 od SEQ ID NO: 2 ili 14, ili njihove varijante koje sadrže bar jednu amino kiselinsku zamenu, uvođenje ili brisanje u jedinice vezivanja H1;

(v) jedinica vezivanja H2 koja obuhvata Kabat ostatke 50-66 od SEQ ID NO: 1 ili Kabat ostatke 50-65 od SEQ ID NO: 2 ili 14, ili njihove varijante koje sadrže bar jednu amino kiselinsku zamenu, uvođenje ili brisanje u jedinice vezivanja H2; i

(vi) jedinica vezivanja H3 koja obuhvata Kabat ostatke 99-114 od SEQ ID NO: 1 ili Kabat ostatke 98-108 od SEQ ID NO: 2 ili 14, ili njihove varijante koje sadrže bar jednu amino kiselinsku zamenu, uvođenje ili brisanje u jedinice vezivanja

[0050] Alternativno, izolovani IL-1b specifični antigen vezujući protein sadrži teški lanac i/ili laki lanac gde teški lanac sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2 ili 14; i gde laki lanac sadrži ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence kodirane nukleotidnom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4, 15 ili 16.

[0051] Poželjno, antigen vezujući protein sadrži ili se sastoji od:

(i) teškog lanca SEQ ID NO:1 i lakog lanca SEQ ID NO:3; ili

(ii) teškog lanca SEQ ID NO:2: ili 14 i lakog lanca SEQ ID NO:4, 15 ili 16.

[0052] Kabat ostaci 88-96 od SEQ ID NO:4, 15 ili 16 se mogu izabrati iz ostataka koji se sastoje od grupe izabrane iz aminokiselinskih ostataka 1-9 od SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 ili SEQ ID NO:13.

[0053] Na kraju, u sledećoj alternativi, izolovani antigen vezujući protein ili njegov fragment sadrže ili se sastoje od aminokiselinske sekvence koja ima identičnost od bar 50%, bar 60%, bar 70%, bar 80% ili bar 90% sa SEQ ID NO:1, 2, 14, 3, 4, 15 ili 16.

[0054] Drugi od takvih aspekata pruža izolovani, IL-1β specifični antigen vezujući protein koji neutrališe IL-1β u analizi ćelijske stimulacije pri IC50 vrednosti manjoj od 20 nM, manjoj od 15 nM, manjoj od 10 nM, manjoj od 5 nM, manjoj od 3 nM, manjoj od 1 nM, manjoj od 0,5 nM ili manjoj od 0,2 nm, ili manjoj od oko 100 pM, manjoj od 50 pM, manjoj od 10 pM, manjoj od 5 pM ili oko 1 pM.

[0055] Treći od takvih aspekata predviđa izolovani IL-1β specifični antigen vezujući protein koji suzbija IL-1β izazvanu proizvodnju IL-6 u analizi ćelijskog suzbijanja pri IC50 vrednosti manjoj od 20 nM, manjoj od 15 nM, manjoj od 10 nM, manjoj od 5 nM, manjoj od 4 nM, manjoj od 3 nM, manjoj od 1 nM, manjoj od 0,5 nM ili manjoj od 0,4 nM; ili manjoj od oko 300 pM, manjoj od oko 200 pM, manjoj od oko 100 pM, manjoj od oko 50 pM, manjoj od oko 10 pM ili manjoj od oko 5 pM.

1

[0056] Četvrti od takvih aspekata predviđa izolovani IL-1β specifični antigen vezujući protein koji vezuje IL-1β pri KD vrednosti manjoj od 10 nM, manjoj od 5 nM, manjoj od 2 nM, manjoj od 1 nM, manjoj od 0,5 nM, ili manjoj od 0,1 nM.

[0057] U nekim slučajevima, takvi antigen vezujući proteini vezuju IL-1b i unakrsno reaguju sa IL1b miševa ili majmuna.

[0058] Zbog toga, peti od takvih aspekata predviđa izolovani IL-1β specifični antigen vezujući protein koji vrši neutralizaciju ljudskih IL-1β pri IC50 vrednosti od 1 pM do 100 pM; ili od 1 pM do 5 nM.

[0059] Šesti od takvih aspekata predviđa izolovani IL-1β specifični antigen vezujući protein koji vrši neutralizaciju mišijih IL-1β pri IC50 vrednosti od 100 pM do 1000 pM, ili od 100 pM do 15 nM.

[0060] Sedmi od takvih aspekata predviđa izolovani IL-1β specifični antigen vezujući protein gde navedeni antigen vezujući protein ima afinitet (KD) za ljudski IL-1β od 1 pM do 100 pM.

[0061] Osmi od takvih aspekata predviđa izolovani IL-1β specifični antigen vezujući protein gde navedeni antigen vezujući protein ima afinitet (KD) za ljudski IL-1β od 5 pM do 200 pM.

Opšti aspekti obelodanjivanja

[0062] Sledeći deo pruža detalje koji su relevantni za izvođenje pronalaska u praksi. Iste informacije se mogu koristiti u pogledu puteva daljeg razvoja koji su razmatrani u prethodnom delu.

[0063] Ukoliko se izričito ne odnose na zahtevani predmet , elementi sledećeg obelodanjivanja se ne smatraju delom pronalaska.

[0064] Gde izolovani IL-1b specifični antigen vezujući protein koji je ovde opisan sadrži teški lanac i/ili laki lanac, teški lanac se može izabrati iz grupe koju čine α, δ, ε, γ i µ teški lanci. Poželjno, teški lanac je γ.

[0065] Laki lanac je poželjno izabran iz A ili κ lakog lanca. Poželjno, laki lanac je λ.

[0066] Poželjno, izolovani antigen vezujući protein koji je ovde opisan je antitelo. Poželjnije, obelodanjeno antitelo je monoklonalno, poliklonalno, bispecifično ili je heterokonjugat.

[0067] Poželjno, antitelo može biti potpuno ljudsko.

[0068] Poželjno, izolovani antigen vezujući protein koji je ovde opisan je antitelo izabrano iz pod tipova IgG1, IgG2, IgG4 ili IgG3.

[0069] Poželjno, izolovani antigen vezujući protein koji je ovde opisan je jedan varijabilni domen, domen antitela, antigen vezujući fragment, imunološki delotvorni fragment, Fv sa jednim lancem, diatelo ili tetravalentno bispecifično antitelo (Tandab). Poželjnije, antigen vezujući fragment može sadržati jedan ili više CDR na ne-antitelo proteinskim skeletima kao što je domen.

[0070] Poželjno, izolovani antigen vezujući protein koji je ovde opisan je rekombinantni.

[0071] Poželjno, izolovani antigen vezujući protein koji je ovde obelodanjen sadrži sredstvo izabrano iz grupe koju čine imunoadhezioni molekul, sredstvo za pravljenje slika, terapeutsko sredstvo i citotoksično sredstvo.

[0072] Imunoadhezioni molekuli mogu sadržati jedan ili više od imunoglobulina (Ig) koji je superfamilija ćelijskih adhezionih molekula (CAM), intergrina, kadherina i selektina.

[0073] Posebno, sredstvo za pravljenje slika koje je ovde obelodanjeno se može izabrati iz grupe koju čine radio oznaka, enzim, fluorescentna oznaka, luminescentna oznaka, bioluminiscentna oznaka, magnetna oznaka i biotin.

[0074] Pogodni primeri radio oznaka obuhvataju ali nisu ograničeni na 32-Fosfor ili tricijum u obliku tritiranog timidina.

[0075] Primeri pogodnih fluorescentnih oznaka obuhvataju cijanin, fluorescein, rodamin, Alexa brašna, Daylight brašna, ATTO boje i BODIPY boje.

1

[0076] Primeri pogodnih luminiscentnih oznaka obuhvataju hemiluminiscentne oznake koje obuhvataju ali nisu ograničene na luminol i Rutenijum sonde i bioluminiscentne oznake koje obuhvataju ali nisu ograničene na luciferin.

[0077] Poželjno, sredstvo je terapeutsko ili citotoksično sredstvo. Terapeutsko ili citotoksično sredstvo može biti izabrano iz grupe koju čine anti-metabolit, sredstvo za alkilaciju, antibiotik, faktor rasta, citokin, sredstvo protiv angiogeneze, sredstvo protiv mitoze, antraciklin, toksin i sredstvo za apoptozu.

[0078] Ovde je dat izolovani antigen vezujući protein koji je obelodanjen iznad za upotrebu pri tretiranju raka, inflamatorne bolesti ili autoimune bolesti izabrane iz grupe koju čine artritis, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, reumatoidni artritis, giht, dijabetes, uveitis, kriopirin-povezani periodični sindromi i inflamatorne akne.

[0079] Takođe je ovde dat izolovani antigen vezujući protein koji je obelodanjen iznad za upotrebu pri pripremanju medikamenta za tretiranje raka, inflamatorne bolesti ili autoimune bolesti izabrane iz grupe koju čine artritis, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, reumatoidni artritis, giht, dijabetes, uveitis, kriopirin-povezani periodični sindromi i inflamatorne akne.

[0080] Kriopirin-povezani periodični sindromi mogu biti izabrani iz familijarnog hladnog autoinflamatornog sindroma (FCAS), Muckle-Wells sindroma (MWS) i multisistem inflamatorna bolest neonatalnog nastanka (NOMID, koji se takođe naziva hronični neurološki kutani i artikularni sindrom kod novorođenčadi ili CINCA).

[0081] Dodatno, dat je sastav koji sadrži antigen vezujući protein kao što je ovde opisano i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0082] Antigen vezujući protein koji je ovde obelodanjen se može davati injekcijom. U slučaju rastvora za ubrizgavanje, nosač može biti rastvarač ili disperziona podloga koja sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol i slično) i pogodne mešavine navedenog, i biljna ulja. Odgovarajuća protočnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge, kao što su lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja

1

mikroorganizama se može postići uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava. Pogodna sredstva su dobro poznata stručnjaku u ovoj oblasti i obuhvataju, na primer, parabene, hlorobutanol, fenol, benzil alkohol, askorbinsku kiselinu, timerozal i slično. U mnogo slučajeva, može biti pogodno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u sastavu. Prolongirana apsorpcija sastava za ubrizgavanje može biti dovedena uključivanjem u sastav sredstvo koje produžava apsorpciju, na primer, aluminijum monostearat i želatin.

[0083] Sterilni sastavi za ubrizgavanje mogu biti pripremljeni uključivanjem analoga u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka navedenih iznad, po potrebi, što je praćeno filitriranom sterilizacijom. Uopšteno, disperzije su pripremljene uključivanjem analoga u sterilni vehikulum koji sadrži osnovnu disperzionu podlogu i druge potrebne sastojke pored onih navedenih iznad.

[0084] Poželjno, farmaceutski sastav može dalje sadržati pogodni pufer kako bi se minimizovala kisela hidroliza. Pogodni puferi su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti i obuhvataju, ali nisu ograničeni na, fosfate, citrate, karbonate i njihove smeše.

[0085] Jedno ili više davanja predmetnih farmaceutskih sastava se može izvršiti. Stručnjak u ovoj oblasti može, rutinskim eksperimentima, odrediti delotvorne, ne-toksične nivoe predmetnog jedinjenja i/ili sastava i šablon davanja koji bi bio pogodan za tretiranje bolesti i/ili infekcija za koje su jedinjenja i sastavi primenljivi.

[0086] Dalje, biće očigledno stručnjaku u ovoj oblasti da se optimalni tok tretiranja, kao što je broj doza predmetnog jedinjenja ili sastava koji se da dnevno u određenom broju dana, može utvrditi upotrebom konvencionalnih testova za određivanje toka tretiranja.

[0087] Uopšteno, delotvorna doza svaka 24 sata može biti u opsegu između 0,0001 mg do oko 1000 mg po kilogramu telesne mase; pogodno, oko 0,001 mg do oko 750 mg po kg telesne mase; oko 0,01 mg do oko 500 mg po kg telesne mase; oko 0,1 mg do oko 500 mg po kg telesne mase; oko 0,1 mg do oko 250 mg po kg telesne mase; ili oko 1,0 mg do oko 250 mg po kg telesne mase. Pogodnije, delotvorna doza svaka 24 sata može biti u opsegu između 1,0 mg do oko 200 mg po kilogramu telesne mase; oko 1,0 mg do oko 100 mg po kg telesne mase; oko 1,0 mg do oko 50 mg po kg telesne mase; oko 1,0 mg do oko 25 mg po kg telesne

1

mase; oko 5,0 mg do oko 50 mg po kg telesne mase; oko 5,0 mg do oko 20 mg po kg telesne mase; ili oko 5,0 mg do oko 15 mg po kg telesne mase.

[0088] Alternativno, delotvorna doza može biti do 500 mg/m<2>. Na primer, uopšteno, delotvorna doza se očekuje da bude u opsegu od oko 25 do oko 500 mg/m<2>, oko 25 do oko 350 mg/m<2>, oko 25 do oko 300 mg/m<2>, oko 25 do oko 250 mg/m<2>, oko 50 do oko 250 mg/m<2>, i oko 75 do oko 150 mg/m<2>.

[0089] Ovde obelodanjeni sastav može dalje sadržati jedno ili više terapeutskih sredstava kao što je ovde opisano.

[0090] Takođe je data izolovana ćelijska linija koja može proizvoditi antigen-vezujući protein kao što je ovde opisano.

[0091] Primeri ćelijskih linija koje mogu proizvoditi antigen vezujući protein obuhvataju HEK293 i CHO.

[0092] Takođe je dat izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži ili se sastoji od sekvenci koje kodiraju antigen vezujuće proteine koji su ovde obelodanjeni, i njihove fragmente, kao i vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.

[0093] Vektor može biti plazmid ili virus. Stručna osoba će primetiti e da postoje mnogi pogodni vektori i da su oni obuhvaćeni obimom predmetnog pronalaska.

[0094] Poželjno, vektor sadrži sekvencu za kontrolisanje ispoljavanja koja je otvoreno povezana sa navedenim molekulom nukleinske kiseline.

[0095] Sekvenca za kontrolisanje ispoljavanja može biti fragment nukleinske kiseline koji promoviše, pojačava ili potiskuje ispoljavanje gena ili proteina od interesa.

[0096] Takođe je data ćelija domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline kao što je definisano iznad.

[0097] Ćelija domaćina može biti kultivisana ćelijska linija, ili ex vivo ćelija. Poželjno, ćelija

1

domaćina sadrži vektor kao što je ovde opisano.

[0098] Takođe je data metoda za proizvodnju antigen vezujućeg proteina kao što je ovde opisano koja obuhvata kultivisanje ćelije domaćina kao što je ovde opisano pod pogodnim uslovima i dobijanje navedenog proteina odatle.

[0099] Medicinske upotrebe izolovanog antigen vezujućeg proteina kao što je ovde opisano su date: one su za upotrebu pri metodama za tretiranje raka, inflamatorne bolesti ili autoimune bolesti izabranih iz grupe koju čine artritis, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, reumatoidni artritis, giht, dijabetes, uveitis, ciropirin-povezani periodični sindromi i inflamatorne akne.

Kratak opis slika

[0100]

Slika 1 prikazuje neutralizaciju IL-1β sa Fab klonovima 1H i 2H. IL-1β neutralizacija je izmerena na osnovu optičke gustine (OD) očitane pri 655 nm i koncentracije Fab. Rezultati pokazuju da klonovi 1H i 2H blokiraju aktiviranje IL-1β sa IC50 od 1,31 i 0,21 respektivno.

Slika 2 prikazuje rezultate sekvenciranja teškog i lakog lanca 1H i 2H Fab klonova.

Slika 3 prikazuje neutralizaciju ljudskih IL-1β sa IgG11H i 2H. IL-1β neutralizacija je izmerena na osnovu optičke gustine (OD) očitane pri 655 nm i koncentracije koncentraciji IgG. Rezultati pokazuju da klonovi 1H i 2H neutrališu ljudske IL-1β sa potentnošću (EC50) od 2,6 nM i 0,17 nM respektivno.

Slika 4 prikazuje neutralizaciju mišijih IL-1β sa IgG11H i 2H. IL-1β neutralizacija je izmerena na osnovu optičke gustine (OD) očitane pri 655 nm i koncentracije koncentraciji IgG. Rezultati pokazuju da klonovi 1H i 2H neutrališu mišije IL-1β sa potentnošću (EC50) od 11,5 nM i 1,5 nM respektivno.

Slika 5 pokazuje da IgG 1H i 2H suzbijaju proizvodnju IL-6 u MRC5 ćelijama izazvanu sa ljudskim IL-1β. Ljudski IL-1β potencijal neutralizacije je određen merenjem nivoa IL-6 proizvedenih u prisustvu IgG 1H i 2H. MRC5 ćelije su stimulisane sa 4 pM IL-1β zajedno sa različitim koncentracijama IgG 1H i 2H.

Rezultati pokazuju da IgG 1H i 2H imaju potentnost suzbijanja (EC50) od 3,92 nM i 0,35 nM respektivno.

Slika 6 pokazuje da IgG 2H suzbija proizvodnju IL-6 in vivo kod Balb/c miševa izazvanu ljudskim IL-1β. Potentnost neutralizacije IgG 2H je procenjena

1

ubrizgavanjem miševa intraperitonealno sa 4 ili 20 mg/kg 2H ili 400 µL PBS i ljudskim IL-1β ili PBS sledećeg dana. Krv je sakupljena i IL-6 je izmereno sa ELISA. Rezultati pokazuju da je IgG 2H bio u stanju da suzbije proizvodnju IL-6 kod miševa izazvanu ljudskim IL-1β na način koji je zavistan od doze.

Slika 7 pokazuje da je IgG 2H specifično za IL-1β i ne prepoznaje IL-1α. Specifičnost vezivanja IgG 2H je određena na osnovu optičke gustine (OD) pri 460 nm i koncentraciji IgG 2H. Rezultati pokazuju da, dok se IgG 2H vezuje i za ljudske i za mišije IL-1β na način koji je zavistan od doze, nije uspelo da se veže ili za ljudski ili za mišiji IL-1α.

Slike 8 i 9 pokazuju potentnost neutralizacije 5 IgG klonova dobijenih afinitetnim sazrevanjem IgG 2H. Potentnost neutralizacije je određena na osnovu koncentracije izlučenih IL-6 u poređenju sa koncentracijom svakog od IgG klonova. Rezultati su pokazali da su svi zreli IgG klonovi pokazali visoku potentnost neutralizacije i za mišije i za ljudske IL-1β. Rezultati takođe pokazuju da su zreli klonovi bili 2 do 8 puta delotvorniji pri neutralizaciji IL-1β (Slika 8) i 3 do 23 puta delotvorniji pri neutralizaciji ljudskih IL-1β (Slika 9) od IgG 2H koji nisu zreli.

Slika 10 pokazuje sekvencu P2D7KK. P2D7KK je dobijen od P2D7 menjanjem jednog argin i jednog arginin i jednog serin ostatka sa lizin ostacima (podebljani i podvučeni) na pozicijama 75 i 81 varijabilni region teškog lanca.

Slika 11 pokazuje rezultate za artritis kod DBA miševa nakon izazivanja artritisa antikolagen antitelima. Miševi ubrizgani ili sa 5 mg/kg izotipa, 5 mg/kg P2D7KK ili 15 mg/kg P2D7KK. Rezultati su pokazali da miševi tretirani sa P2D7KK imaju mnogo niže rezultate za artritis od miševa ubrizganih sa izotip kontrolom.

Slika 12 prikazuje reprezentativno oticanje prednjih (gore) i zadnjih (dole) šapa nakon izazivanja artritisa i davanje izotip kontrole (levo), P2D7KK 5 mg/kg (u sredini) ili P2D7KK 15 mg/kg (desno). Rezultati su pokazali da P2D7KK jasno sprečava inflamaciju kako miševi tretirani sa P2D7KK nisu imali otok šapa u poređenju sa miševima ubrizganim sa izotip kontrolom.

Slika 13 prikazuje reprezentativnu histološku analizu zglobova prednjih (gore) i zadnjih (dole) šapa miševa ubrizganih sa izotip antitelom (levo) ili tretiranih ili sa 5 mg/kg (u sredini) ili 15 mg/kg (desno) P2D7KK. Rezultati pokazuju da kod miševa tretiranih sa P2D7KK, zglobovi ostaju suštinski bez infiltracije imunih ćelija dok su zglobovi kod miševa ubrizganih izotipom bili mesto jake inflamatorne reakcije.

Slika 14 pokazuje infiltraciju imunih ćelija u peritonealnu šupljinu nakon

2

ubrizgavanja PBS (1) ili mononatrijum urat kristala što je praćeno davanjem PBS (2), Anakinra 30 mg/kg (3), izotip ljudskog antitela 15 mg/kg (4), P2D7KK 5 mg/kg (5) ili P2D7KK 15 mg/kg (6). Prikazane su srednje vrednosti ± s.g. T-test za nezavisne uzorke * p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001; n.z. nije značajno.

Slika 15 prikazuje rast tumora između dana 7 i 17 nakon inokulacije ćelija karcinoma kod miševa tretiranih sa P2D7KK ili sa izotip kontrolom. Prikazane su srednje vrednosti ± SD, dvostrani ANOVA test (Tukijevo višestruko upoređivanje) * = p<0,05.

Slika 16 pokazuje apsolutne brojeve ćelija kod dreniranja limfnih žlezda ušne školjke. Dijagram 1 predstavlja miševe koji nisu inficirani sa P. acnes; dijagram 4 predstavlja miševe inficirane sa P. acnes i ubrizgane sa PBS; dijagram 3 predstavlja miševe inficirane sa P. acnes i ubrizgane sa izotip kontrolom; dijagram 2 predstavlja miševe inficirane sa P. acnes i prečišćava sa sa P2D7KK.

Slika 17 pokazuje broj limfocita u epidermisu miševa koji nisu inficirani sa P. acnes (prva kolona sa leve strane svake grupe), inficiranih sa P. acnes i ubrizganih sa PBS (druga kolona sa leve strane svake grupe), inficiranih sa P. acnes i ubrizganih sa izotip kontrolom (treća kolona sa leve strane svake grupe) ili inficirane sa P. acnes i tretirane sa P2D7KK (četvrta kolona sa leve strane svake grupe). p-vrednosti se odnose na t-test za nezavisne uzorke.

Primeri

Primer 1 - Izolovanje anti-humanih IL-1β antitela i karakterizacija IL-1β kapaciteta neutralizacije u analizama baziranim na ćelijama

[0101] Anti IL-1β antitela su izolovana iz biblioteke prikaza faga ljudskih antitela (Humanyx HX-02 biblioteka) in vitro selekcijom. IL-1β specifična monoklonalna antitela u Fab formatu su inicijalno identifikovana sa ELISA. Ovi ELISA pozitivni Fab su dodati u HEK-Blue™ IL-1β ćelije (InvivoGen, SAD) koje su modifikovana HEK293 ćelijska linija koja prekomerno ispoljava rekombinantni IL-1 receptor.

[0102] Vezivanje IL-1β za svoj receptor IL-1R na površini HEK-Blue™ IL-1β ćelija izaziva signalnu kaskadu što dovodi do aktiviranja NF-kB i kao posledica toga do proizvodnje izlučene alkalne fosfataze (SEAP). Detekcija SEAP u supernatantu HEK-Blue™ IL-1β ćelija se može lako proceniti upotrebom QUANTI-Blue™, kolorimetrijskog SAP supstrata. HEK-Blue ćelije su osetljive i na ljudski i na mišiji IL-1B, ali nisu osetljive na ljudski IL-1α ili TNF-α.

[0103] Od 22 ELISA- pozitivnih Fab, dva klona, 1H i 2H, su pronađena da blokiraju aktiviranje HEK-Blue IL-1β ćelija IL-1β stimulisanjem sa IC50(suzbijanje koncentracije 50% IL-1β aktivnosti) 1,31 i 0,21 nM, respektivno (Sl.1). Rezultati sekvenciranja su otkrili da su oba klona posedovala A laki lanac. Sekvence teškog i lakog lanca klonova 1H i 2H su prikazane na Sl.2.

Primer 2 - Neutralizacija IL-1β sa IgG11H i 2H u HEK-Blue ćelijskoj analizi [0104] Dva Fab klona 1H i 2H su konvertovana u IgG pune dužine pojačavanjem teškog i lakog lanca svakog klona odvojeno sa PCR i kloniranjem u ekspresioni vektor ćelije sisara. Dobijeni plazmidi, sa ljudskim IgG1 pod tipom su zatim korišćeni u ispoljavanju antitela pune dužine prolaznom transfekcijom u ćelije sisara. Antitela su prečišćena Protein G kolonom.

Ljudski IL-18

[0105] Potencijal neutralizacije IgG klona 1H i 2H na ljudskim IL-1β je zatim procenjeno upotrebom HEK-Blue ćelija kao što je opisano iznad. Ćelije su stimulisane sa 4 pM ljudskih IL-1B zajedno sa različitim koncentracijama antitela. Krive odgovor-doza su podešene sigmoidalnom ne-linearnom regresionom (varijabilni nagib) jednačinom iz koje su EC50(polu maksimalna efektivna koncentracija) vrednosti izračunate. U ovoj analizi klonovi 1H i 2H su neutralizovali ljudske IL-1β sa potentnošću (EC50) od 2,6 nM i 0,17 nM, respektivno (Sl.3).

IL-1β miša

[0106] Potencijal neutralizacije IgG klona 1H i 2H na mišijim IL-1β je zatim procenjeno upotrebom HEK-Blue ćelija kao što je opisano iznad. Međutim, ćelije su stimulisane sa mišijim IL-1β zajedno sa različitim koncentracijama antitela. U ovoj analizi klonovi 1H i 2H su neutralizovali mišije IL-1β sa potentnošću (EC50) od 11,5 nM i 1,5 nM, respektivno (Sl.

4).

Primer 3 - Suzbijanje ljudskih Il-1β je uzrokovalo IL-6 proizvodnju IgG 1H i 2H In vitro

[0107] Suzbijanje ljudskih IL-1β koje je izazvalo IL-6 proizvodnju sa IgG 1H i 2H je ispitano in vitro upotrebom ljudske fibroblastne ćelijske linije MRC5. Stimulacija ljudske fibroblastne ćelije, MRC5, sa IL-1β je za rezultat dalo IL-6 proizvodnju.

[0108] Ljudski IL-1β potencijal neutralizacije IgG 1H i 2H je ispitan merenjem nivoa IL-6 proizvedenih u prisustvu antitela. Ćelije su stimulisane ljudskim IL-1β zajedno sa različitim koncentracijama antitela, i IL-6 je kvantifikovano sa ELISA. U ovoj analizi, IgG 1H i 2H su pokazali potentnost suzbijanja (EC50) os 3,92 i 0,35 nM, respektivno (Sl.5).

In vivo

[0109] Suzbijanje ljudskih IL-1β koje je izazvalo IL-6 proizvodnju sa IgG 1H i 2H je ispitano in vivo kod Balb/C miševa. Davanje ljudskih IL-1β Balb/C miševima je praćeno brzim lučenjem mišijeg IL-6 što se može detektovati u serumu sa ELISA.

[0110] Kako bi se procenila potentnost neutralizacije IgG 2H, miševi su ubrizgani intraperitonealno sa 4 ili 20 mg/kg 2H ili 400 µL PBS. Sledećeg dana, miševi su primili ljudski IL-1β ili PBS (negativna kontrola). Dva sata nakon ubrizgavanja IL-1β, krv je sakupljena i IL-6 je izmereno u serum sa ELISA.

[0111] Rezultati su pokazali da je 2H bilo u stanju da suzbije proizvodnju IL-6 izazvanu ljudskim IL-1B kod miševa na način koji je zavistan od doze (Sl.6).

Primer 4 - Specifičnost IgG 2H

[0112] Specifičnost vezivanja IgG 2H je ispitano u odnosu na dva pod tipa IL-1, α i β, direktnom ELISA. Rezultati pokazuju da, dok se IgG 2H vezuje i za ljudske i za mišije IL-1β na način koji je zavistan od doze, nije uspelo da se veže ili za ljudski ili za mišiji IL-1α pri testiranom opsegu koncentracija (Sl.7). Zbog toga, IgG 2H je pokazalo jaku selektivnost za IL-1β u odnosu na IL-1α. Prema tome, IgG 2H je specifično za IL-1β i ne prepoznaje IL-1α.

Primer 5 - Afinitetno sazrevanje IgG 2H

[0113] IgG 2H je afinitetno sazrevano metodom prikaza faga i 5 zrelih klonova sa mutacijama u CDR3 regionu lakog lanca je izabrano nakon IL-1β analize neutralizacije MRC5 ćelija.

[0114] Svi zreli IgG klonovi su pokazali visoku potentnost neutralizacije i za mišije i za ljudske IL-1β u ovoj analizi. Zreli klonovi su bili 2 do 8 puta delotvorniji pri neutralizaciji

2

mišijih IL-1β a 3 do 23 puta delotvorniji pri neutralizaciji ljudskih IL-1β od početnog IgG 2H, sa opsegom potentnosti od EC50vrednosti 158,4 do 623,2 pM za mišije citokine (Sl.8) i EC50vrednosti od 6,5 do 45,3 pM za svoj ljudski ekvivalent (Sl.9)

[0115] Zreli klonovi (osim P1E8) su testirani za afinitet prema mišijim i ljudskim Il-1β upotrebom ProteOn bioanalizatora (BioRad, Hercules, SAD).

[0116] Rezultati su pokazali da su afiniteti za mišije IL-1β bili 3 do 13 puta veći kod zrelih klonova u poređenju sa IgG 2H i 8 do 25 puta veći prema ljudskim IL-1β (Tabela 1).

Sekvence afinitetno zrelih klonova

[0117] Zreli klonovi su sekvencirani i aminokiselinske sekvence njihovog CDR3 regiona lakog lanca su prikazane u Tabeli 2.

[0118] Odgovarajuće nukleotidne sekvence CDR3 regiona lakog lanca nakon povratne translacije su prikazane ispod:

2

Primer 6 - In vivo efikasnost P2D7KK

Derivacija P2D7KK

[0119] Od 5 afinitetno zrelih klonova, P2D7 je izabran i modifikovan da bude germinalno antitelo, pod nazivom P2D7KK. P2D7KK je dobijeno iz P2D7 menjanjem jednog arginin i jednog serin ostatka sa lizin ostacima na pozicijama 75 i 81 varijabilni region teškog lanca (Sl. 10).

[0120] P2D7KK je zatim testirano za preliminarnu in vivo efikasnost kod 4 različita životinjska modela bolesti (1) CAIA: artritis izazvan kolagen antitelom, model reumatoidnog artritisa, (2) MSU: inflamacija izazvana mononatrijum urat kristalima, model koji oponaša giht (3) RCC: rast karcinoma bubrežnih ćelija, kako bi se procenila upotreba IL-1β antitela u tumorskom mikrookruženju kako bi se suzbio rast tumora i (4) P. acnes: model inflamatornih akni koji koristi Propionibacterium acnes.

CAIA - kolagen antitelo-izazvan artritis

[0121] Artritis je izazvan kod Balb/c miševa intraperitonealnom injekcijom 1,5 mg/mišu koktela anti-kolagen antitela na dan 0 što je praćeno injekcijom od 25 µg lipopolisaharida (LPS) na dan 3.

[0122] Grupa od 8 miševa je primila 5 mg/kg P2D7KK intraperitonealno na dane 2, 5 i 9. Druga grupa je primila 15 mg/kg P2D7KK i jedna kontrolna grupa je primila 5 mg/kg izotip kontrole praćenjem istog rasporeda.

[0123] Rezultati su pokazali da miševi tretirani sa P2D7KK imaju mnogo niže rezultate za

2

artritis od miševa ubrizganih sa izotip kontrolom (Sl.11). Prema tome, davanje P2D7KK je suzbilo razvijanje artritisa.

[0124] Rezultati su takođe pokazali da P2D7KK takođe sprečava inflamaciju kako miševi tretirani sa P2D7KK nisu imali otok šapa kao što su imali miševi ubrizgani sa izotip antitelom (Sl.12).

[0125] Histološka analiza zadnjih šapa je pokazala da kod miševa tretiranih sa P2D7KK, zglobovi ostaju suštinski bez infiltracije imunih ćelija dok su zglobovi kod miševa ubrizganih izotipom bili mesto jake inflamatorne reakcije (Sl.13).

MSU - inflamacija izazvana mononatrijum urat kristalima

[0126] Šest grupa C57/BL6 miševa je ubrizgano intraperitonealno sa 3 mg mononatrijum urata 200 µL PBS, ili samo sa PBS za kontrolnu grupu. Miševi su zatim ubrizgani sa:

• P2D7KK 5 mg/kg in 300 µL PBS (n=5)

• P2D7KK 15 mg/kg in 300 µL PBS (n=4)

• Izotip antitelo 15 mg/kg in 300 µL PBS (n=5)

• Anakinra 30 mg/kg in 300 µL PBS 9 n=5)

• 300 µL PBS (n=3, vehikulum kontrolna grupa)

• 300 µL PBS (n=5, kontrolna grupa bez MSU)

[0127] Šest sati nakon davanja antitela, peritoneum miševa je izvađen i ispran sa 5 mL hladnog potpunog medijuma. Neutrofili i monociti su izbrojani u tečnosti za ispiranje protočnom citometrijom.

[0128] Rezultati su pokazali da ubrizgavanje MSU u peritoneum izaziva regrutovanje neutrofila i monocita. Kao i Anakinra, P2D7KK je bilo u stanju da značajno smanji infiltraciju neutrofila (i pri 15 i 5 mg/kg) i monocita (samo pri 15 mg/kg) u peritonealnoj šupljini (Sl.14).

RCC - ksenograft karcinoma ljudskih bubrežnih ćelija

[0129] Ženke SCID miševa starosti 6-8 nedelja su ubrizgane intramuskularno sa 2x10<6>RCC4 ćelijama. Jedna grupa od 6 miševa je zatim primila 100 µg/mišu P2D7KK ubrizgano na mesto tumora na dane 1, 3, 5, 7 i 9 nakon inokulacije tumora. Druga grupa od 6 miševa je primila antitelo kontrolnog izotipa.

2

[0130] Rast tumora je praćen svaka 2 dana između dana 7 i 17.

[0131] Rezultati su pokazali da P2D7KK značajno smanjuje rast tumora kod tretiranih miševa (Sl. 15).

P. akne - inflamatorne akne

[0132] C57/BL6 miševi su ubrizgani intraperitonealno sa 400 µg ili P2D7KK ili kontrolnog izotopa na dan -1 ili na dan 1. Na dan 0, miševi su ubrizgani sa 0<8>jedinicama koje formiraju koloniju Propionibacterium acnes u desno uvo i primili su PBS u levo uvo. Neki kontrolni miševi nisu inficirani, neki od inficiranih miševa nisu primili antitelo.

[0133] Parametri imuniteta u dermisu i epidermisu su procenjeni na dane 2, 5 i 9.

[0134] Rezultati su pokazali da je na dan 9, P2D7KK smanjio inflamaciju kao što je primećeno smanjenjem broja ćelija u limfnim žlezdama (Sl.16). Bez želje da se veže teorijom, verovatno je da P2D7KK smanjuje limfocitnu infiltraciju u epidermisu (Sl.17).

[0135] Prema tome, P2D7KK je pokazao in vivo efikasnost kod 4 različita modela ljudske bolesti, naime reumatoidnog artritisa, gihta, karcinoma bubrežnih ćelija i inflamatornih akni.

2

1

2

4

Claims

Patentni zahtevi 1. Izolovani IL-1β specifični antigen vezujući protein koji sadrži sledeće CDR: - varijabilni region teškog lanca koji obuhvata CDR H1 = DYYWS, H2 = EIDHSGSTNYNPSLKS, H3 = ASPSSGWTLDY; i - varijabilni region lakog lanca koji obuhvata CDR L1 = GDKLGDKFAF, L2 = LDNKRPS, L3 = YAWADTYEV.
2. Izolovani antigen vezujući protein prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži teški lanac i/ili laki lanac, gde teški lanac sadrži QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGST NYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARASPSSGWTLDYWGQGTL, a laki lanac sadrži
3. Izolovani antigen vezujući protein prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je navedeni protein antitelo; opciono gde je antitelo monoklonalno antitelo, poliklonalno, bispecifično, multispecifično ili je heterokonjugat; opciono gde je antitelo potpuno ljudsko; opciono gde je navedeno antitelo pod tip IgG1, pod tip IgG2, pod tip IgG4 ili pod tip IgG3; opciono gde je navedeni protein jedan varijabilni domen, antitelo domena, antigen vezujući fragment, imunološki delotvorni fragment, Fv sa jednim lancem, diatelo ili tetravalentno bispecifično antitelo (Tandab); opciono gde navedeni fragment sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGST NYNPSL KSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARASPSSGWTLDYWGQGTL i laki lanac sadrži sekvencu
4. Izolovani antigen vezujući protein prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je navedeni protein rekombinantni; opciono gde navedeni vezujući protein dalje sadrži antigen izabran iz grupe koju čine imunoadhezioni molekul, sredstvo za pravljenje slika, terapeutsko sredstvo i citotoksično sredstvo; opciono gde je navedeno sredstvo sredstvo za pravljenje slika izabrano iz grupe koju čine radio oznaka, enzim, fluorescentna oznaka, luminescentna oznaka, bioluminiscentna oznaka, magnetna oznaka i biotin; opciono gde je navedeno sredstvo terapeutsko ili citotoksično sredstvo izabrano iz grupe koju čine anti-metabolit, sredstvo za alkilaciju, antibiotik, faktor rasta, citokin, sredstvo protiv angiogeneze, sredstvo protiv mitoze, antraciklin, toksin i sredstvo za apoptozu.
5. Izolovani antigen vezujući protein prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, za upotrebu pri tretiranju raka, inflamatorne bolesti ili autoimune bolesti je izabran iz grupe koju čine artritis, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, reumatoidni artritis, giht, dijabetes, uveitis, ciropirin-povezani periodični sindromi i inflamatorne akne.
6. Sastav koji sadrži izolovani antigen vezujući protein prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 4 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
7. Sastav prema patentnom zahtevu 6 koji dalje sadrži jedno ili više terapeutskih sredstava.
8. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira izolovani antigen vezujući protein prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, gde navedena nukleinska kiselina sadrži prvu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca i drugu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca navedenog antigen vezujućeg proteina.
9. Komplet dve izolovane nukleinske kiseline koje zajedno kodiraju izolovani antigen vezujući protein prema patentnom zahtevu 1, gde: - prva nukleinska kiselina sadrži sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca navedenog antigen vezujućeg proteina, i - druga nukleinska kiselina sadrži sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca navedenog antigen vezujućeg proteina. 4
10. Vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 8 ili komplet nukleinskih kiselina prema patentnom zahtevu 9.
11. Ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 8, ili komplet nukleinskih kiselina prema patentnom zahtevu 9 ili vektor prema patentnom zahtevu 10.
12. Metoda za proizvodnju izolovanog antigen vezujućeg proteina prema bilo kom od patentnih zahteva od 1-4, koja obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 11 pod pogodnim uslovima i dobijanje navedenog proteina odatle.