RS60625B1 - Hloridna so tat-nr2b9c - Google Patents

Hloridna so tat-nr2b9c

Info

Publication number
RS60625B1
RS60625B1 RS20200367A RSP20200367A RS60625B1 RS 60625 B1 RS60625 B1 RS 60625B1 RS 20200367 A RS20200367 A RS 20200367A RS P20200367 A RSP20200367 A RS P20200367A RS 60625 B1 RS60625 B1 RS 60625B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
tat
nr2b9c
formulation
peptide
concentration
Prior art date
Application number
RS20200367A
Other languages
English (en)
Inventor
Jonathan David Garman
Original Assignee
Nono Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nono Inc filed Critical Nono Inc
Publication of RS60625B1 publication Critical patent/RS60625B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • C07K14/163—Regulatory proteins, e.g. tat, nef, rev, vif, vpu, vpr, vpt, vpx
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Description

Opis
REFERENCE LISTE SEKVENCI
[0001] Popisuje se sekvencijalni spisak sa 446849SEKLIST.tkt od 16618 bajtova kreiranih 28. maja 2014.
POZADINA
[0002] Tat-NR2B9c (takođe poznat kao NA-1) je sredstvo koje inhibira PSD-95, na način što otežava vezivanje za N-metil-D-aspartat receptore (NMDAR) i sinteze azot-oksida neurona (nNOS) i smanjuje indukovanu ekscitoksičnost cerebralnom ishemijom. Lečenje smanjuje broj infarkta i funkcionalni deficit. TAT-NR2B9c je prošao uspešno ispitivanje faze II (videti WO 2010144721 i Aarts et al., Science 298, 846-850 (2002), Hill et al., Lancet Neurol. 11: 942 - 950 (2012)).
[0003] Buduć i da TAT-NR2B9c nema ozbiljnih nuspojava, može se primeniti u slučaju sumnje na moždani slučaju udara ili drugih ishemijskih stanja ili hemoragičnih stanja bez dijagnoze prema kriterijumuma priznatim u struci korišćenim radi potvrde o izostanku krvarenja. Na primer, TAT-NR2B9c se može primenjivati na mestu gde se dogodio moždani udar ili neurotrauma (npr. u kuć i pacijenata) ili u ambulantnom vozilu koje je prevozilo subjekt u bolnicu.
[0004] TAT-NR2B9c je ranije opisan kao tečni sastav normalnog fiziološkog rastvora ili fosfatnog putera ili liofilizovane kompozicije dobijene iz normalnog fiziološkog rastvora (WO2010144721). WO-A-2012/156308 opisuje inhibitore ternarnog proteinskog kompleksa nNOS, PSD-95 i NMDA receptora i farmaceutske kompozicije koje sadrže inhibitore za profilaksu i/ili lečenje bolesti povezane sa ekscitotoksičnošć u i hroničnih stanja bola kod subjekta. Opisani inhibitori su upoređeni sa TAT-NR2B9c.
SUŠTINA PRONALASKA
[0005] Pronalazak obezbeđuje hloridnu so peptida koji je TAT-NR2B9c (SEK ID BR: 6) ili se razlikuje od TAT-NR2B9c za do 5 supstitucija aminokiselina, dodavanja ili uklanjanja, pri čemu je više od 99 % anjona u soli hloridna. Hloridna so može se dobiti zamenom trifluoroacetata za hlorid u trifluoroacetatnu so TAT-NR2B9c. Hloridna so može takođe da se dobije zamenom trifluoroacetata u acetat i zatim acetata u hlorid koji se dobija iz trifluoroacetatne soli TAT-NR2B9c.
[0006] Pronalazak dalje obezbeđuje preliofiliziranu formulaciju koja sadrži hloridnu so kako je napred kao pufer i šeć er. Po izboru, hloridna so je hloridna so TAT-NR2B9c. Opciono, pufer je histidin, a še ć er trehaloza, a pH je 6-7. Po izboru, acetat i trifluoroacetat sadr že manje od 0,1 % mase anjona u formulaciji. Po izboru, hloridna so peptida je u koncentraciji 70-120 mg / ml, histidin je u koncentraciji 15-100 mM, a trehaloza je u koncentraciji 80-160 mM. Po izboru, hloridna so peptida je u koncentraciji 70-120 mg / ml, histidin je u koncentraciji 20-100 mM, a trehaloza je u koncentraciji 100-140 mM. Po izboru, Tat-NR2B9c je u koncentraciji 70-120 mg/ml, koncentracija histidina 20-50 mM, a koncentracija trehaloze je 100-140 mM. Po izboru, koncentracija histidina je 20 mM, a koncentracija trehaloze je 100-200 mM, poželjno 120 mM, a koncentracija TAT-NR2B9c je 90 mg / ml.
[0007] Pronalazak dalje obezbeđuje liofiliziranu formulaciju pripremljenu liofilizacijom bilo koje od prethodno preliofiliziranih formulacija, napred opisanih. Po izboru, acetat i trifluoroacetat sadr že manje od 0,1 % mase anjona u formulaciji.
[0008] Pronalazak dalje obezbeđuje rekonstituisanu formulaciju pripremljenu kombinovanjem bilo koje od napred opisanih liofiliziranih formulacija sa vodenim rastvorom. Po izboru, vodeni rastvor je voda ili uobičajni fiziološki rastvor. Opciono, zapremina rekonstituisane formulacije je 3-6 puta već a od zapremine preliofilizirane formulacije.
[0009] Pronalazak dalje obezbeđuje rekonstituisanu formulaciju koja sadrži TAT-NR2B9c ili drugo aktivno sredstvo iz pronalaska u koncentraciji 15-25 mg/ml, pufer i šeć er. Opciono, pufer je histidin u koncentraciji 4-20 mM, a šeć er je trehaloza u koncentraciji 20-30 mM, a pH je 6-7. Po izboru, acetat i trifluor-oacetat sadrže manje od 0,1 % mase anjona u formulaciji.
[0010] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak pripreme formulacije, koji sadrži skladištenje liofiliziranog uzorka formulacije, kao što je napred opisano, najmanje nedelju dana na temperaturi od najmanje 20 ° C; i rekonstitucije liofilizovane formulacije. Po izboru se liofilizirana formulacija rekonstitui še u vodi ili fiziološkom rastvoru. Opciono, metoda takođe uključuje davanje pacijentu rekonstituisane formulacije, opciono nakon daljeg razblaživanja u normalnom fiziološkom rastvoru. Po izboru, formulacija se čuva najmanje godinu dana. Opciono, skladištenje je na sobnoj temperaturi. Opciono, skladištenje uključuje periode u kojima temperatura prelazi 37°C. U nekim metodama pacijent ima mo ždani udar ili traumatičnu povredu CNS-a. U nekim metodama se liofilizirani uzorak čuva u vozilu hitne pomoć i. Kod nekih metoda pacijent ima subarahnoidalno krvarenje. Kod nekih metoda pacijent se podvrgava endovaskularnom lečenju aneurizme.
KRATAK OPIS SLIKA
[0011]
Slika 1: Grafikon prikazuje područje infarkta mozga pacova nakon udara 3PVO nakon tretmana različitim formulacijama TAT-NR2B9c.
Slike 2A, B: A) Grafički prikaz koji pokazuje stabilnost različitih formulacija TAT-NR2B9c na -20°C i 40°C. I osa predstavlja čistoć u TAT-NR2B9c nakon 1 nedelje pri temperaturi skladištenja izmerenom u % ukupne površine korišć enjem RP-HPLC. B) isti podaci kao A, ali sortirani po puferu i pH.
Slika 3: Grafički prikaz koji pokazuje stabilnost (pomoć u HPLC) 20 mg/ml TAT-NR2B9c u histidinskom puferu, pH 6,5, u prisustvu različitih sredstava za luženje i soli na -20oC i 40oC.
Slike 4A, B: Grafikoni diferencijalne skenirajuć e kalorimetrije od 20 mg/ml TAT-NR2B9c u histidinskom puferu pH 6,5 u prisustvu manitola (A) ili manitola i NaCl (B).
Slike 5A, B: Grafikoni diferencijalne skenirajuć e kalorimetrije od 20 mg/ml TAT-NR2B9c u histidinskom puferu pH 6,5 u prisustvu trehaloze (A) ili trehaloze i NaCl (B).
Slike 6A, B: Grafički dijagram diferencijalne skenirajuć e kalorimetrije od 20 mg/ml TAT-NR2B9c u histidinskom puferu pH 6,5, u prisustvu dekstrana-40 (A) ili dekstrana-40 i NaCl (B).
Slike 7A, B: A) Izgled kolača nakon liofilizacije 3 mL 90 mg/ml TAT-NR2B9c u 100 mM histidina pH 6,5 sa 120 mM trehaloze. B). Izgled kolača alternativnih TAT-NR2B9c formulacija sa različitim količinama histidina i trehaloze.
DEFINICIJE
[0012] Pored aktivnih sastojaka, liofilizirane formulacije mogu da sadrže jednu ili više sledeć ih klasa komponenti. Klase se međusobno ne isključuju; drugim rečima, isti agens može biti sadržan u više klasa.
"Sredstvo za luženje" pruža strukturu peptida osušenog smrzavanjem. Sredstva za zgušnjavanje uključuju manitol, trehalozu, dekstran-40, glicin, laktozu, sorbitol i saharozu. Pored pružanja farmaceutski poželjnog oblika, sredstva za poveć anje mase mogu takođe da imaju pozitivne efekte u pogledu modifikacije temperature, pružajuć i zaštitu od smrzavanja, odmašivanje, temperaturu i poboljšavajuć i stabilnost proteina tokom dugotrajnog skladištenja. Ova sredstva mogu takođe služiti kao modifikatori tonika.
Pufer je sredstvo koje održava pH rastvora u prihvatljivom rasponu pre liofilizacije. Poželjni pufer je histidin. Ostali puferi uključuju sukcinat (natrijum ili kalijum), histidin, citrat (natrijum), glukonat, acetat, fosfat, Tris i slično. Poželjni puferi su efikasni u rasponu pH od oko 5,5 do oko 7 ili oko 6 do oko 7; poželjno pH od oko 6,5. Primeri pufera koji kontrolišu pH u ovom rasponu uključuju sukcinat (kao što je natrijum sukcinat), glukonat, histidin, citrat i druge pufere organske kiseline.
"Krioprotektant" daje stabilnost peptidu protiv naprezanja izazvanih smrzavanjem, verovatno tako što se poželjno uklanja sa površine proteina. Takođe može pružiti zaštitu tokom primarnog i sekundarnog sušenja i dugoročnog skladištenja proizvoda. Primeri su polimeri kao što su dekstran i polietilen glikol; šeć eri (uključuju ć i še ć erne alkohole) kao što su saharoza, glukoza, trehaloza i laktoza; površinski aktivne supstance kao što su polisorbati; i aminokiseline kao što su glicin, arginin i serin.
Lioprotektant pruža stabilnost peptidu tokom procesa sušenja ili 'dehidracije' (primarni i sekundarni ciklus sušenja), verovatno tako što obezbeđuje amorfnu staklenu matricu i vezanjem sa proteinom vodonika, zamenjujuć i molekule vode koji su uklonjeni tokom procesa su šenja. Ovo daje pozitivan efekat u održavanju konformacije peptida, minimiziranju degradacije peptida tokom ciklusa liofilizacije i poboljšanju dugoročne stabilnosti proizvoda. Primeri uključuju poliole ili šeć ere, poput saharoze i trehaloze.
U meri koja nije već navedena, u druge stabilizatore ili inhibitore razgradnje mogu se uklju čiti inhibitori deamidacije, površinski aktivne materije, neke uobičajne su estri masnih kiselina sorbitan polietiksilata (npr. polisorbat 20 ili polisorbat 80), poloksamer 188 i deterdženti.
Izrazi "liofilizacija", "liofilizovani" i "liofilizirani" odnose se na postupak kojim se materijal koji se suši prvo zamrzava, a zatim ledi ili se smrznuti rastvarač uklanja sublimacijom u vakuum okruženju.
"Farmaceutska formulacija" ili kompozicija je preparat koji sadrži efikasno aktivno sredstvo i bez toksičnih komponenti toksičnih za subjekte kojima bi formulacija bila data.
"Vreme rekonstitucije" je vreme koje je potrebno da se rehidrira liofilizovana formulacija rastvaranjem u rastvor koji ne sadrži čestice vidljive golim okom.
"Stabilna" formulacija liofilizovanog peptida je ona bez značajnih promena koje su primeć ene na 20 ° C tokom najmanje jedne nedelje, meseca ili poželjnije najmanje tri meseca, najmanje šest meseci ili godinu. Promene se smatraju beznačajnim ako se ne razgradi više od 10 %, poželjno 5 %, peptida, kako je mereno SEC-HPLC. Rehidratizovani rastvor je bezbojan, bistar do blago opalescentan vizuelnom analizom. Koncentracija, pH i osmolalnost formulacije nemaju vi še od /-10 % promene nakon skladištenja. Potencija je unutar raspona 70-130 %, najpoželjnije 80-120 % ili ponekad 80-100 % sveže pripremljenog kontrolnog uzorka. Primeć uje se ne više od 10 %, poželjno 5 % odstupanja. Ne stvara se više od 10 %, poželjno 5 % agregacije. Stabilnost se može meriti različitim metodama prikazanim u Peptide and Protein Drug Deliveri, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nev Iork, N.I., Pubs. (1991) i Jones, A. Adv. Dostava lekova Rev. 10: 29-90 (1993).
Izraz "izotonični" znači da formulacija koja je od značaja ima u osnovi isti osmotski pritisak kao i ljudska krv. Izotonične formulacije ć e generalno imati osmotski pritisak od oko 270-328 mOsm. Blago hipotonični pritisak je 250-269, a blago hipertonični pritisak 328-350 mOsm. Osmotski pritisak se može meriti, na primer, korišć enjem pritiska pare ili osmometra sa ledom.
Modifikatori tonika: Soli (NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2) mogu se koristiti kao modifikatori tonika za kontrolu osmotskog pritiska. Pored toga, krioprotektanti/lioprotektanti i/ili sredstva za poveć anje mase kao što su saharoza, manitol ili glicin mogu služiti kao modifikatori tonika.
Numeričke vrednosti poput koncentracija ili pH date su u okviru tolerancije koja odra žava tačnost kojom se vrednost može meriti. Ako kontekst ne zahteva drugačije, frakcijske se vrednosti zaokružuju na najbliži celi broj. Ako kontekst ne nalaže drugačije, navođenje raspona vrednosti znači da se može koristiti bilo koji celi broj ili podbroj unutar raspona.
Izrazi "bolest" i "stanje" koriste se sinonimno da označe bilo kakav poremeć aj ili prekid normalne strukture ili funkcije subjekta.
DETALJAN OPIS
I. Opšte
[0013] Peptidi sintetizovani postupcima čvrstog stanja obično se proizvode kao trifluoroacetatne soli, jer se trifluoroocetna kiselina (TFA) koristi za uklanjanje zaštite peptida i/ili uklanjanje peptida iz smole. Za farmaceutsku upotrebu, trifluoroacetat se obično zamenjuje acetatom kao protivjon, jer acetat nije toksičan, a zamena trifluoroacetata acetatom je jednostavna. To je slu čaj za peptid TAT-NR2B9c sintetizovan do danas, kako je opisano u WO2010144721 ili WO-A-2014/085349 i drugde.
[0014] Acetat je često poželjni suprotni farmaceutski peptid jer se trifluoroacetat mo že zameniti za acetat uz manju promenu tipičnog procesa prečišć avanja peptida koji nastaje sintezom čvrste faze u kojoj se završno ispiranje vrši sirć etnom kiselinom umesto trifluorosir ć etnom kiselinom pra ć eno elucijom acetonitrilom. Povremeno se umesto toga koriste drugi protivjoni. Na primer, hlorid se ponekad koristi za slabo rastvorljive peptide, jer poboljšava njihovu rastvorljivost. Međutim, konverzija trifluorid acetata ili acetata u hlorid dovodi do gubitka nekog peptida. Štaviše, primećeno je da prisustvo HCl dobijene izmenom hlorida modifikuje strukturu i smanjuje termičku stabilnost nekih peptida (Biochemistri, 5. izdanje, Berg i dr. Eds, Freeman; 2002); J Pept Sci. Jan 2007; 13 (1): 37-43). TAT-NR2B9c je već visoko rastvorljiv peptid u obliku acetatne soli. Shodno tome, čini se da bi zamena soli trifluoroacetata ili acetata hloridom imala nedostatke smanjenog prinosa i moguć e smanjene stabilnosti bez ikakve nadoknade koristi.
[0015] Iznenađujuć e je da je pronađeno da hloridna so TAT-NR2B9c daje značajno ve ć u stabilnost u liofilizovanom obliku od acetatne soli TAT-NR2B9c u istoj formulaciji ili acetatne soli TAT-NR2B9c liofilizovanog iz fiziološkog rastvora. Hloridna so može ostati dovoljno stabilna za kliničku upotrebu čak i ako se skladišti u letnjem vremenu na sobnoj temperaturi koja dostiže ili čak pređe 37°C tokom nekoliko godina. Već a stabilnost hloridne soli nad acetatom je veče koristi iz razloga što nadoknađuje bilo kakav već i napor ili smanjeni prinos potreban za zamenu trifluoroacetata kao soli.
Pronalazak obezbeđuje liofilizovane formulacije aktivnih sredstava, naročito TAT-NR2B9c kao hloridne soli. Takve formulacije su stabilne na sobnoj temperaturi (npr., najmanje 20°C) čime se olakšava održavanje zaliha takve formulacije u ambulantnim vozilima ili slično ili u hitnim slučajevima za administraciju na mestu bolesti ili nesreć e ili između takvih prizora i medicinske ustanove.
[0016] Liofilizovane formulacije se pripremaju iz prelifilirane formulacije koja sadr ži aktivno sredstvo, pufer, sredstvo za punjenje i vodu. Ostale komponente, kao što su krio ili lioprezervansi, farmaceutski prihvatljivi nosači sredstva za tonik i slično mogu ili ne moraju da budu prisutni. Poželjno aktivno sredstvo je hloridna so TAT-NR2B9c. Poželjni pufer je histidin. Poželjno sredstvo za punjenje je trehaloza. Trehaloza takođe služi kao krio-i lio-konzervans. Primer preliofilirane formulacije sadrži aktivno sredstvo (npr. hloridnu sol TAT-NR2B9c), histidin (10-100 mM, 15-100 mM 15-80 mM, 40-60 mM ili 15-60 mM, na primer, 20 mM ili opciono 50 mM, ili 20-50mM)) i trehaloze (50-200 mM, poželjno 80-160 mM, 100-140 mM, poželjnije 120 mM). PH je 5,5 do 7,5, poželjnije 6-7, poželjnije 6,5. Koncentracija aktivnog sredstva (npr. hloridna so TAT-NR2B9c) je 20-200 mg / ml, poželjno 50-150 mg / ml, poželjnije 70-120 mg / ml ili 90 mg / ml. Dakle, primer prelifilirane formulacije je 20 mM histidina, 120 mM trehaloze i 90 mg / ml hloridne soli TAT-NR2B9c. Opciono sredstvo za uklanjanje acetilacije, poput lizina, može biti uključeno, kako je opisano u prijavi 057769-446850, da bi se dodatno smanjio preostali acetat ili trifluoroacetat u formulaciji.
[0017] Posle liofilizacije, liofilizovani produkti imaju mali sadržaj vode, poželjno od oko 0 % -5 % vode, još poželjnije ispod 2.5 % vode. Liofilizovane formulacije mogu se čuvati u zamrzivaču (npr. -20 ili -70 ° C), u frižideru (0-4°C) ili na sobnoj temperaturi (20-25°C).
[0018] Aktivna sredstva su rekonstituisana u vodenom rastvoru, poželjno voda za injekcije ili opciono u normalnom fiziološkom rastvoru (0,8-1,0 % fiziološkog rastvora i poželjno 0,9 % fiziološkog rastvora). Rekonstitucija može biti iste ili manje ili već e zapremine od prelifilirane formulacije. Po željno, zapremina je već a nakon rekonstitucije nego npr, 3-6 puta ve ć a. Na primer, zapremina preliofilizacije od 3-5 ml mo že se rekonstituisati kao zapremina od 10 ml, 12 ml, 13,5 ml, 15 ml ili 20 ml ili 10-20 ml između ostalih. Nakon rekonstitucije, koncentracija histidina je po željno 2-20 mM, npr. 2-7 mM, 4.0-6.5 mM, 4.5mM ili 6 mM; koncentracija trehaloze je poželjno 15-45 mM ili 20-40 mM ili 25-27 mM ili 35-37 mM. Koncentracija lizina je poželjno 100-300 mM, npr. 150-250 mM, 150-170 mM ili 210-220 mM. Aktivno sredstvo je poželjno u koncentraciji od 10-30 mg / ml, na primer 15-30, 18-20, 20 mg / ml aktivnog sredstva (npr. TAT-NR2B9c) ili 25-30, 26-28 ili 27 mg / mL aktivnog sredstva. Primer formulacije nakon rekonstitucije sadrži 4-5 mM histidina, 26-27 mM trehaloze, 150-170 mM lizina i 20 mg / ml TAT-NR2B9c (sa koncentracijama zaokruženim na najbliži celi broj). Druga ogledna formulacija nakon rekonstitucije sadrži 5-7 mM histidina, 35-37 mM trehaloze, 210-220 mM lizina i 26-28 mg / ml TAT-NR2B9c (sa koncentracijama zaokruženim na najbliži celi broj). Rekonstituisana formulacija se može dalje razblažiti pre primene, na način kao što je dodavanje u vre ć icu sa tečnoš ć u koja sadrži uobičajan fiziološki rastvor za intravensku infuziju.
[0019] Opis bilo koje formulacije koja sadrži ili uključuje (ili sličnu terminologiju) određene komponente treba shvatiti kao alternativu ili dodatno opisivanje formulacije koja se sastoji u osnovi od navedenih komponenti.
[0020] Metode sušenja smrzavanjem prikazane su, na primer, u Methods in Enzimologi, vol. 22, Pages 33-39, Academic Press, Nev Iork (1971); i u Freeze-Driing, E. V. Flosdorf, Rheinhold, Nev Iork (1949) . TAT-NR2B9c je poželjno liofilizovan u istoj bočici kao i onoj u kojoj ć e biti rekonstituisan za upotrebu. Vodeni rastvor TAT-NR2B9c se dodaje u bočicu opciono nakon filtriranja kroz sterilizacioni sistem za filtriranje, kao što je filter od 0,22 mikrona koji se obično koristi za peptide. Formulacije se mogu liofilizovati u kontrolisanom ciklusu, kao što je opisano u primerima. Preliofilizovana formulacija može se staviti u bočicu i liofilizovati na sniženoj temperaturi i pritisku. Nakon liofilizacije, bočice se mogu zatvoriti. Za upotrebu, liofilizat se rastvara sa vodom za injekcije, normalnim fiziolo škim rastvorom ili drugim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem.
[0021] Različite posude su pogodne za liofilizaciju. Posuda treba da bude u stanju da izdr ži spoljni pritisak kada je posuda zapečać ena i čuvana pod delimičnim vakuumom. Posuda treba da bude izrađena od materijala koji omoguć ava optimalan prenos toplote spolja i iznutra. Veličina posude treba da bude takva da rastvor koji se liofilizuje ne zauzima više od 20 % korisne zapremine ili može da se napuni viškom, u skladu sa prevladavajuć im USP preporukama za zapreminu u posudi. Na primer, 0,5 ml rastvora može da se stavi u bočicu od 3 ml. Bočice mogu biti napravljene od stakla, mogu biti npr. borosilikatne ili plasti čne, npr. od polipropilena.
[0022] Mogu se koristiti staklene boce koje se obično koriste za liofilizaciju bioloških materijala. Druga pogodna posuda je špric sa dva odeljka, gde jedan odeljak sadrži liofilirani sadržaj peptida TAT-NR2B9c, a drugi odeljak sadrži vodeni razblaživač. Po završetku liofilizacije, vakuum u bočicama ili ampulama može se osloboditi punjenjem sistema inertnim gasom, začepljen na mestu koristeć i standardnu opremu i zatim zapečać en. Takav postupak ć e osigurati sterilan finalni proizvod. Takođe se mogu koristiti i druge dvodelne posude, poput kesice sa lomljivim zaptivačem između liofilizovanog odeljka za lekove i razblaživača.
II Aktivni agensi
[0023] Iako se već i deo opisa odnosi na aktivno sredstvo TAT-NR2B9c u svrhu primera, druga aktivna sredstva kao što je opisano u daljem tekstu mogu se pripremiti kao hloridne soli ili formulisati u skladu sa principima opisanim za TAT-NR2B9c. Specifične koncentracije date za TAT-NR2B9c mogu se koristiti kao za drugi agensi ili se u njih pretvoriti da bi se dobile ekvimolarne koncentracije drugog sredstva i TAT-NR2B9c.
[0024] Aktivna sredstva inhibiraju interakciju između PSD-95 i jednog ili više NMDAR (npr. 2A, 2B, 2C ili 2D) ili nNOS (npr. Sviss-Prot P29475) vezanjem na PSD-95. Ova sredstva su korisna za smanjenje jednog ili više štetnih efekata moždanog udara i drugih neuroloških stanja posredovanih u najmanjem delimično ekscitotoksičnošć u NMDAR-a. Takva sredstva uključuju peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu, uključujuć i ili zasnovanu na PL motivu NMDA receptora ili PDZ domena PSD-95. Takvi peptidi mogu tako đe inhibirati interakciju između PSD-95 i nNOS i drugih receptora glutamata (npr. kainitskih receptora ili AMPA receptora), kao što su KV1.4 i GluR6. Poželjni peptidi inhibiraju interakciju između PDZ domena 1 i 2 proteina gustine-95 gustine (PSD-95) (humana aminokiselinska sekvenca obezbeđena Stathakismom, Genomics 44 (1): 71-82 (1997)) i C-terminalnom PL sekvencom jedne ili više NMDA receptora 2 podjedinica, uključuju ć i NR2B podjedinicu neuronskog N-metil-D-aspartatnog receptora (Mandich et al., Genomics 22, 216-8 (1994)). NMDAR2B ima GenBank ID 4099612, C-terminalnu, 20 aminokiselina FNGSSNGHVIEKLSSIESDV (SEK ID BR: 11) i PL motiv ESDV (SEK ID BR: 12). Poželjni peptidi inhibiraju humane oblike PSD-95 i humane NMDAR receptore. Međutim, inhibicija se može postići i iz varijanti vrsta proteina. Spisak NMDA i glutamatnih receptora koji se mogu koristiti nalazi se ispod:
[0025] Peptidi mogu da uključuju ili se zasnivaju na PL motivu sa C-kraja bilo koje od napred navedenih podjedinica i imaju sekvencu aminokiselina koja sadrži [S/T]-X-[V/L]. Ova sekvenca se poželjno dešava na C-kraju peptida iz ovog pronalaska. Poželjni peptidi imaju sekvencu aminokiselina koja sadrži [E/D/N/K] -[S/T]-[D/E/K/N] - [V/L] (SEK ID BR: 38) na svom C-završetku. Primeri peptida sadrže: ESDV (SEK ID BR: 12), ESEV (SEK ID BR: 29), ETDV (SEK ID BR: 39), ETEV (SEK ID BR: 40), DTDV (SEK ID BR: 41), i DTEV (SEK ID BR: 42) kao C-terminalne aminokiseline. Dva naročito poželjna peptida su KLSSIESDV (SEK ID BR: 5) i KLSSIETDV (SEK ID BR: 43). Takvi peptidi obično imaju 3-25 aminokiselina (bez peptida internalizacije), dužine peptida od 5-10 aminokiselina, a naročito je 9 aminokiselina (takođe bez penala za internalizaciju). Kod nekih takvih peptida sve aminokiseline su sa C-završetka NMDA receptora (ne uključuju aminokiseline iz internalizacionog peptida).
[0026] Peptidi i peptidomimetici iz pronalaska mogu sadržati modifikovane aminokiselinske ostatke, na primer, ostatke koji su N-alkilirani. N-terminalne modifikacije alkila mogu obuhvatati npr. N-metil, N-etil, N-propil, N-butil, N-cikloheksilmetil, N-cikliheksiletil, N-benzil, N-feniletil, N-fenilpropil, N-(3,4-dihlorofenil) propil, N- (3,4-difluorfenil) propil i N- (naftalen-2-il) etil).
[0027] Bach, J. Med. Chem. 51, 6450-6459 (2008) i WO 2010/004003 opisali su niz analoga NR2B9c (SEK ID BR: 6). Aktivnost vezivanja PDZ je izložena peptidima koji imaju samo tri C-terminalne aminokiseline (SDV). Bach takođe izveštava analoge koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se sastoji od X1tSX2V (SEK ID BR: 68), pri čemu su t i S alternativne aminokiseline, X1je izabran između E, K i A, ili njihov analog, X2je izabran između A, K, D, N, N-Me-A, N-Me-K, N-Me-D i N-Me-N ili njihovog analoga. Po izboru peptid je N-alkiliran u položaju P3 (treć a aminokiselina sa C-završetka, tj. Zauzet položaj tS). Peptid može biti N-alkiliran sa cikloheksanom ili aromatičnim supstituentom, i dalje sadrži razmačnu grupu između supstituenta i terminalne amino grupe peptida ili peptidnog analoga, pri čemu je odstojnik alkil grupa, poželjno izabrana između metilena, etilena, propilena i butilena. Aromatski supstituent mo že biti delom naftalen-2-il ili aromatični prsten supstituisan sa jednom ili dve halogene i/ili alkil grupe.
[0028] Ostale modifikacije se takođe mogu dodati bez negativnog uticaja na aktivnost i one uklju čuju supstituciju jedne ili više aminokiselina u prirodnom L-izomernom obliku sa aminokiselinama u D-izomernom obliku. Prema tome, svaka aminokiselina koja se prirodno pojavljuje u L-konfiguraciji (koja se takođe može nazvati R ili S, u zavisnosti od strukture hemijskog entiteta) može se zameniti aminokiselinom istog hemijskog strukturnog tipa ili peptidomimetikom , ali suprotne hiralnosti, koja se uglavnom naziva D-aminokiselina, ali koja se može dodatno nazvati i R- ili S-oblik. Prema tome, peptidomimetik može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5, najmanje 50 %, ili sve D-amino kiseline. Peptidomimetik koji sadrži neke ili sve D ostatke se ponekad naziva "inverso" peptidom.
[0029] Peptidomimetici takođe uključuju retro peptide. Retro peptid ima obrnutu sekvencu aminokiselina. Peptidomitici takođe uključuju retro inverso peptide u kojima je redosled aminokiselina obrnut, tako da se prvobitno C-terminalna aminokiselina pojavljuje na N-terminalu, a D-aminokiseline se koriste umesto L-aminokiselina. WO 2008/014917 opisuje retro-inverso analognog Tat-NR2B9c koji ima aminokiselinsku sekvencu vdseisslk-rrrkrrkkrgiin (SEK ID BR: 69) (mala slova koja označavaju D aminokiseline) i pokazuje da je efikasna u inhibiciji cerebralne ishemije. Sledeć i ovde opisani efikasni peptid je Rv-Tat-NR2B9c (RRRKRRKKGGKKLSSIESDV; SEK ID BR: 70).
[0030] Veznik, npr. veznik polietilen glikola, može se koristiti za dimeriziranje aktivne grupe peptida ili peptidomimetika da bi se poboljšao njegov afinitet i selektivnost prema proteinima koji sadrže tandem PDZ domene. Vidi npr., Bach et al., (2009) Angev. Chem. Int. Ed. 48: 9685-9689 i WO 2010/004003. Peptid koji sadrži PL motiv poželjno se dimerizira spajanjem N-terminala dva takva molekula, ostavljajuć i C-terminal slobodnim. Bach dalje izveštava da je pentamer peptid IESDV (SEK ID BR: 71) sa C-terminala NMDAR 2B bio efikasan u inhibiciji vezivanja NMDAR 2B na PSD-95. IETDV (SEK ID BR: 73) takođe se može koristiti umesto IESDV. Po izboru, oko 2-10 kopija PEG-a se mogu pridružiti u tandemu kao povezivači. Po izboru, veznik se takođe može vezati za internalizacioni peptid ili lipidatirati da bi se pobolj šao ć elijski unos. Primeri ilustrativnih dimernih inhibitora su prikazani dole (videti Bach et al., PNAS 109 (2012) 3317-3322). Bilo koji od ovde prikazanih inhibitora PSD-95 može se koristiti umesto IETDV, a bilo koji internalizacioni peptid ili lipidizacioni deo može se koristiti umesto TAT. Takođe na prikazanom se mogu koristiti i drugi veznici.
[0031] IETAV je dodeljena SEK ID BR: 26, IGRKKRRKRRR SEK ID BR: 2, a rrrkrrkkr, SEK ID BR: 10, mala slova označena sa D-amino kiselinama.
[0032] Odgovarajuć a farmakološka aktivnost peptida, peptidomimetika ili drugog sredstva može se, po izboru, potvrditi upotrebom na prethodno opisanom modelu pacova pre testiranja na primatima i klini čkim ispitivanjima opisanima u ovoj prijavi. Peptidi ili peptidomimetici se tako đe mogu testirati na sposobnost inhibicije interakcije između PSD-95 i NMDAR 2B korišć enjem testova opisanih u npr. US 20050059597. Korisni peptidi obično imaju IC50 vrednosti manje od 50 µM, 25 µM, 10 µM, 0,1 µM ili 0,01 µM u takvom testu. Poželjni peptidi obično imaju IC50 vrednost između 0,001-1 µM, a poželjnije 0,001-0,05, 0,05-0,5 ili 0,05 do 0,1 µM. Kada je za peptid ili drugo sredstvo karakteristično da inhibira vezivanje jedne interakcije, npr. interakcija PSD-95 na NMDAR2B, takav opis ne isključuje da peptid ili sredstvo takođe inhibira drugu interakciju, na primer, inhibiciju vezivanja PSD-95 za nNOS .
[0033] Peptidi poput upravo opisanih mogu opcionalno biti derivatizovani (npr. acetilirani, fosforilirani, mirisilizovani, geranilirani, pegilirani i/ili glikozilirani) da pobolj šaju afinitet vezivanja inhibitora, poboljšati sposobnost inhibitora da bude prenosiviji kroz ć elijsku membranu ili za pobolj šanje stabilnosti. Kao specifičan primer, za inhibitore kod kojih je treć i ostatak sa C-terminala S ili T, ovaj ostatak se mo že fosforilirati pre upotrebe peptida.
[0034] Farmakološko sredstvo može biti povezano sa internalizacionim peptidom da bi se olak šao unos u ć elije i/ili preko krvne moždane barijere. Peptidi za internalizaciju su dobro poznata klasa relativno kratkih peptida koji omoguć uju mnogim ć elijskim ili virusnim proteinima da prođu kroz membrane. Peptidi za internalizaciju, poznati i kao peptidi transdukcije ć elijske membrane ili peptidi koji prodiru kroz ć eliju, mogu imati, na primer, 5-30 aminokiselina. Takvi peptidi obično imaju katjonski naboj od iznad normalnog prikaza (u odnosu na proteine uopšte) ostataka arginina i/ili lizina za koje se smatra da olakšavaju njihov prolazak kroz membrane. Neki takvi peptidi imaju najmanje 5, 6, 7 ili 8 ostataka arginina i/ili lizina. Primeri uključuju protein antenepedije (Bonfanti, Cancer Res. 57, 1442-6 (1997)) (i njegove varijante), protein tankog virusa humane imunodeficijencije, protein VP22, proizvod UL49 gena virusa herpes simpleks virusa tipa 1. , Penetratin, SinB1 i 3, Transportan, Ampipathic, gp41NLS, poliArg, i nekoliko toksina biljnih i bakterijskih proteina, kao što su ricin, abrin, modecin, toksin difterije, toksin kolere, antraks, toksin labilne toplote i pseudomonas aeruginosa eke (Pseudomonas aerkinosa eke ETA). Ostali primeri su opisani u slede ć im referencama (Temsamani, Drug Discoveri Todai, 9 (23): 1012-1019, 2004; De Coupade, Biochem J., 390: 407-418, 2005; Saalik Bioconjugate Chem. 15: 1246-1253 , 2004; Zhao, Medicinal Research Reviev 24 (1): 1-12, 2004; Deshaies, Cellular and Molecular Sciences Science 62: 1839-49, 2005); Gao, ACS Chem. Biol. 2011, 6, 484-491, SG3 (RLSGMNEVLSFRVL (SEK ID NO: 9)), Stalmans PLOS ONE 2013, 8 (8) e71752, 1-11 i dodatak; Figueiredo et al., IUBMB Life 66, 182-194 (2014); Copolovici i dr., ACS Nano, 8, 1972-94 (2014); Lukanovski Biotech J. 8, 918-930 (2013); Stockvell, Chem. Biol. Drug Des.
83, 507-520 (2014); Stanzl et al. Cal. Chem. Res / 46, 2944-2954 (2013).
[0035] Poželjni internalizovani peptid je TAT iz virusa HIV. Peptid koji se opisuje u prethodnom sadr ži ili se sastoji od standardne aminokiselinske sekvence IGRKKRRKRRR (SEK ID BR: 2) pronađene u HIV TAT proteinu. Ako su prisutni dodatni agensi sa takvim motivom TAT-a (pored farmakolo škog agensa), ostaci mogu biti na primer prirodne aminokiseline koje pokrivaju ovaj segment iz amino kiselina proteina, rastojanja ili vezujuć ih aminokiselina vrste koja se obično koristi za spajanje dve domena peptida, npr. , gli (ser) 4 (SEK ID BR: 44), TGEKP (SEK ID BR: 45), GGRRGGGS (SEK ID BR: 46), ili LRKRDG-ERP (SEK ID BR: 47) (vidi npr. Tang et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686 .; Hennecke et al. (1998), Protein Eng.
11, 405-410)), ili mogu biti bilo koje druge aminokiseline kojima se ne smanjuje značajno kapacitet da se omoguć i prihvatanje varijante bez bočnih ostataka. Poželjno, broj bočnih aminokiselina osim aktivnog peptida ne prelazi deset na obe strane IGRKKRRKRRR (SEK ID BR: 2). Jedan po željan TAT peptid koji sadrži dodatne aminokiselinske ostatke koji pokrivaju C-terminal IGRKKRRKRRR (SEK ID BR: 2) je IGRKKRRKRRRPK (SEK ID BR: 48). Međutim, po moguć nosti, ne postoje bočne aminokiseline. Ostali peptidi koji se mogu koristiti uključuju GRKKRRKRRRPK (SEK ID BR: 4) i GRKKRRKRRRP (SEK ID BR: 72).
[0036] Varijante gornjeg TAT peptida koji imaju smanjenu sposobnost da se ve žu za N-terminal kalcijumovog kanala su opisane u WO/2008/109010. Takve varijante mogu da sadrže ili se sastoje od aminokiselinske sekvence XGRKKRRKRRR (SEK ID BR: 49), pri čemu je X aminokiselina koja nije I ili ništa (u kom slučaju G je slobodni N-terminalni ostatak). Poželjni TAT peptid ima N-terminalni ostatak I supstituisan sa F. Prema tome, poželjan je TAT peptid koji sadrži ili se sastoji od FGRKKRRKRRR (SEK ID BR: 3). Druga poželjna varijanta TAT peptida sastoji se od GRKKRRKRRR (SEK ID BR: 1). Drugi poželjni peptid u obliku TAT sadrži ili se sastoji od RRRKRRKKRG ili RRRKRRKKRGI (aminokiseline 1-10 ili 1-11 od SEK ID BR: 70). Ostali peptidi koji potiču od TAT-a koji olakšavaju unošenje farmakološkog sredstva bez inhibiranja N-tipa kalcijumovih kanala uključuju one predstavljene u nastavku.
1
[0037] X može predstavljati slobodni amino terminal, jednu ili vi še aminokiselina ili konjugovani deo. Peptidi za internalizaciju mogu se koristiti u inverso ili retro ili inverso retro obliku sa ili bez povezanog peptida ili peptidomimetika u takvom obliku. Na primer, poželjni himerni peptid ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se sastoji od IGRKKRRKRRR-KLSSIESDV (SEK ID BR: 6, takođe poznat kao TAT-NR2B9c ili TAT-NR2B9c), ili IGRKKRRKRRR-KLSSIETDV (SEK ID BR: 7). Ostali poželjni himerni peptidi se razlikuju od SEK ID BR: 6 ili BR: 7 do 1, 2, 3, 4 ili 5 supstitucija aminokiselina, uklanjanja ili dodavanja (unutra šnjih ili na krajevima). Drugi poželjni peptidi uključuju RRRKR-RKKRGI-KLSSIESDV (SEK ID BR: 70, takođe poznat kao RvTat-NR2B9c ili koji ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji ili se sastoji od RRRKRRKKGG-KLSSIETDV (SEK ID BR: 37).
[0038] Peptidi za internalizaciju mogu se povezati sa farmakološkim agensima konvencionalnim postupcima. Na primer, agensi se mogu pridružiti internalizacionim peptidima hemijskim povezivanjem, na primer preko sredstva za spajanje ili konjugaciju. Brojna takva sredstva su komercijalno dostupna i prikazana u S. S. Vong, Hemija konjugacije proteina i umrežavanje, CRC Press (1991). Neki primeri umrežavajuć ih reagensa uključuju J-sukcinimidil 3- (2-pirididitio) propionat (SPDP) ili N, N '- (1,3-fenilen) bismaleimid; N, N'-etilen-bis- (jodoacetamid) ili drugi takvi reagensi sa 6 do 11 mostova od ugljenika metilena (koji su relativno specifični za sulfhidrilne grupe); i 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen (koji formira nepovratne veze sa amino i tirozinskim grupama). Ostali reagensi za umrežavanje uključuju p, p'-difluorom, m'-dinitrodifenilsulfon (koji formira nepovratna umrežavanja sa amino i fenolnim grupama); dimetil adipimidat (koji je specifičan za amino grupe); fenol-l, 4-disulfonilhlorid (koji uglavnom reaguje sa amino grupama); heksametilendiizocijanat ili diizotiocijanat, ili azofenil-p-diizocijanat (koji uglavnom reaguje sa amino grupama); glutaraldehid (koji reaguje sa nekoliko različitih bočnih lanaca) i disdijazobenzidin (koji reaguje prevashodno sa tirozinom i histidinom).
[0039] Farmakološka sredstva koja su peptidi vezivanja na internalizacijski peptid mo že se spraviti generisanjem fuzionisanog proteina koji sadrži kondenzovanu sekvencu peptida, poželjno na njenom N-terminalu, na internalizacioni peptid.
[0040] Umesto ili kao povezivanje peptida (ili drugog sredstva) koji inhibira PSD-95 sa internalizacionim peptidom, takav peptid može biti povezan sa lipidom (lipidizacija) da bi se poveć ala hidrofobnost konjugata u odnosu na sam peptid i na taj način se olakšao prolazak povezanog peptida kroz ć elijske membrane i/ili preko moždane barijere. Lipidizacija se poželjno vrši na N-terminalnoj aminokiselini, ali se takođe može izvesti na unutrašnjim aminokiselinama, pod uslovom da peptid inhibicija interakcije izme đu PSD-95 i NMDAR 2B ne bude smanjena za više od 50 %. Poželjno je da se lipidacija vrši na aminokiselini koja nije jedna od četiri najčešć e C-terminalne aminokiseline. Lipidi su organski molekuli rastvorljiviji u eteru više nego nego u vodi i uključuju masne kiseline, gliceride i sterole. Poželjni oblici lipidiranja uključuju miristoilaciju, palmitoilaciju ili vezanje drugih masnih kiselina, po željno dužine lanca od 10-20 ugljenika, kao što su laurinska kiselina i stearinska kiselina, kao i geranilacija, geranilgeranilacija i izoprenilacija. Poželjne su lipidacije tipa koje se javljaju u posttranslacijskoj modifikaciji prirodnih proteina. Lipidizacija masnom kiselinom stvaranjem amidne veze prema alfa-amino grupi N-terminalne aminokiseline peptida je takođe poželjna. Lipidizacija može biti sprovedena sintezom peptida uključujuć i prelipidatu aminokiselinu, izvesti se enzimski in vitro ili rekombinantnom ekspresijom, hemijskim umrežavanjem ili hemijskom derivatizacijom peptida. Aminokiseline modifikovane miristoilacijom i druge modifikacije lipida su komercijalno dostupne.
[0041] Lipidizacija poželjno olakšava prolazak povezanog peptida (npr. KLSSIESDV (SEK ID BR: 5) ili KLSSIETDV (SEK ID BR: 43)) kroz ć elijsku membranu i/ili krvno-moždanu barijeru bez izazivanja prolaznog smanjenja krvnog pritiska kakav je utvrđen kada se standardni peptid TAT daje u velikoj dozi (npr., sa ili već om od 3 mg/kg) ili barem sa manjim smanjenjem od onog istog peptida povezanog sa standardnim TAT peptidom.
[0042] Farmakološki peptidi, opciono spojeni sa TAT peptidima, mogu se sintetizovati u čvrstoj fazi ili rekombinantnim postupcima. Peptidomimetici se mogu sintetizovati kori šć enjem različitih postupaka i metodologija opisanih u naučnoj i patentnoj literaturi, npr., Organic Sintheses Collective Volumes, Gilman et al. (izdanje) John Vilei & Sons, Inc., NI, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9: 205-223; Hrubi (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 114-119; Ostergaard (1997) Mol. Ronioci. 3: 17-27; Ostresh (1996) Metodi Enzimol. 267: 220-234.
III. Soli
[0043] Peptidi tipa koji su napred opisani obično se dobijaju sintezom u čvrstom stanju. Obzirom da se u sintezi čvrstog stanja koristi trifluoroacetat (TFA) za uklanjanje zaštitnih grupa ili uklanjanje peptida iz smole, obično se peptidi prvo proizvode kao trifloroacetatne soli. Trifluoroacetat se mo že zameniti sa drugim anjonom, na primer, vezanjem peptida na čvrsti nosač, kao što je kolona, ispiranjem kolone da bi se uklonio postojeć i protivion, izjednačavanjem kolone sa rastvorom koji sadrži novi protivion, a zatim eluiranjem peptida, npr. uvođenjem hidrofobnog rastvarača kao što je acetonitril u kolonu. Zamena trifluoroacetata acetatom se može obaviti ispiranjem acetata kao poslednjim korakom pre nego što je peptid eluiran u inače uobičajenoj sintezi čvrstog stanja. Zamena trifluoroacetata ili acetata sa hloridom može se obaviti ispiranjem amonijum-hloridom posle čega sledi elucija. Upotreba hidrofobnog nosača je poželjna, a preparat HPLC reverzne faze je naročito poželjan za zamenu jona. Trifluoroacetat se može zameniti hloridom direktno ili se prvo može zameniti acetatom, a zatim acetat zameniti hloridom.
[0044] Suprotna jedinjenja, bilo da su trifluoroacetat, acetat ili hlorid, vezuju se za pozitivno naelektrisane atome na TAT-NR2B9c, naročito za N-terminalnu amino grupu i ostatke arginina i lizina u bočnim lancima. Iako praksa ovog pronalaska ne zavisi od razumevanja tačne steheometrije peptida do aniona u soli TAT-NR2B9c, veruje se da ima oko 9 molekula suprotnoh jona po molekulu soli.
[0045] Iako se opisana zamena jednog suprotnog jona sa drugim dejstvom odvija efikasno, čistoć a krajnjeg anjona može biti manja od 100 %. Prema tome, upuć ivanje na hloridnu sol TAT-NR2B9c ili drugo aktivno sredstvo znači da u pripremi soli hlorid predstavlja pretežni anjon (ili moli) nad svim ostalim anjonima koji su prisutni u agregatu u soli. Drugim rečima, hlorid čini ve[e od 50 % i poželjno već e od 75 %, 95 %, 99 %, 99,5 % ili 99,9 % po težini ili molova svih anjona prisutnih u soli. U takvoj soli ili formulaciji koja se priprema od soli, acetata i trifluoroacetata u kombinaciji i pojedina čno čini manje od 50 %, 25 %, 5 %, 0,5 % ili 0,1 % anjona u soli ili formulaciji.
[0046] Predstavljeni pronalazak zahteva više od 99 % anjona u soli hlorida.
IV. Bolesti
[0047] Liofilizovane formulacije su korisne u lečenju različitih bolesti, naročito neuroloških bolesti, a naročito bolesti posredovanih delom ekscitotoksičnošć u. Takve bolesti i stanja uključuju moždani udar, epilepsiju, hipoksiju, subarahnoidno krvarenje, traumatsko o šteć enje CNS-a koje nije povezano sa moždanim udarom, poput traumatične povrede mozga i povrede kičmene moždine, drugu moždanu ishemiju, Alzheimerovu bolest i Parkinsonovu bolest. Ostale neurološke bolesti koje leče agensi iz ovog pronalaska za koje nije poznato da su povezane sa ekscitotoksičnošć u uključuju anksioznost i bol.
[0048] Moždani udar je stanje koje je posledica poremeć aja protoka krvi u CNS-u bez obzira na uzrok. Potencijalni uzroci uključuju emboliju, krvarenje i trombozu. Neke ć elije neurona umiru odmah zbog poremeć aja protoka krvi. Ove ć elije oslobađaju svoje sastavne molekule, uključuju ć i glutamat, koji zauzvrat aktivira NMDA receptore, koji podižu nivo unutarć elijskog kalcijuma i nivo unutar ć elijskih enzima što vodi ka daljoj smrti ć elija neurona (ekscitotoksičnost kaskada). Smrt tkiva CNS-a naziva se infarktom. Zapremina infarkta (tj. količina mrtvih neuronskih ć elija proisteklih iz moždanog udara) može se koristiti kao pokazatelj stepena patoloških ošteć enja nastalih usled moždanog udara. Simptomatski efekat zavisi i od volumena infarkta i od mesta gde se nalazi u mozgu. Indeks invalidnosti može se koristiti kao merilo simptomatskog ošteć enja, kao što je skala ishoda ranga moždanog udara ( Rankin, Scott Med J; 2: 200-15 (1957) i Barthelov indeks. Rankin lestvica je zasnovana na direktnoj proceni op štih stanja pacijenta, kao što sledi.
[0049]
0: Nema simptoma uopšte
1: Nema značajnog invaliditeta uprkos simptomima; u stanju je da obavlja sve uobičajene dužnosti i aktivnosti.
2: neznatna invalidnost; nesposoban da izvrši sve prethodne aktivnosti, ali može da brine o svojim potrebama bez pomoć i.
3: Umerena invalidnost koja zahteva određenu pomoć , ali može da hoda bez pomo ć i
4: Umerena do teška invalidnost; nesposobni da hodaju bez pomoć i i nisu u stanju da zadovolje sopstvene telesne potrebe bez pomoć i.
5: Teška invalidnost; ležeć i u krevetu, inkontinentni i zahtevaju stalnu negu i pažnju.
[0050] Barthelov indeks zasnovan je na nizu pitanja o pacijentovoj sposobnosti da obavlja 10 osnovnih svakodnevnih aktivnosti rezultirajuć i rezultatom između 0 i 100, pri čemu niži rezultat koji ukazuje na ve ć u invalidnost (Mahonei i dr., Mariland State Medical Journal 14: 56-61 (1965)).
[0051] Alternativno, težina / ishodi moždanog udara mogu se meriti korišć enjem NIH skale moždanog udara, dostupne na veb svetu ninds.nih.gov/doctors/NIH Stroke ScaleJBooklet.pdf.
Skala se zasniva na sposobnosti pacijenta da izvršava 11 grupa funkcija koje uključuju procenu pacijentovog nivoa svesti, motoričkih, senzornih i jezičkih funkcija.
[0053] Ishemijski moždani udar odnosi se konkretnije na tip moždanog udara koji je izazvan blokadom dotoka krvi u mozak. Osnovni uslov za ovu vrstu blokade je najčešć e stvaranje masnih naslaga koje oblažu zidove vena. Ovo stanje se naziva ateroskleroza. Ove masne naslage mogu izazvati dve vrste opstrukcije. Cerebralna tromboza se odnosi na tromb (krvni ugrušak) koji se razvija na začepljenom delu vene "Cerebralna embolija" odnosi se na krvni ugrušak koji se formira na drugom mestu u kardiovaskularnom sistemu, obično na srcu i velikim arterijama gornjeg dela grudnog koša i vrata. Deo krvnog ugruška potom se razgrađuje, ulazi u krvotok i putuje kroz krvne sudove mozga sve dok ne dođe do sudova premalih da bi ga mogli proć i. Drugi važan uzrok embolije je nepravilan rad srca, poznat kao arterijska fibrilacija. Stvara uslove u kojima se ugrušci mogu formirati u srcu, otpuštati i stići u mozak. Dodatni potencijalni uzroci ishemijskog moždanog udara su krvarenje, tromboza, disekcija arterije ili vene, zastoj srca, šok bilo kog uzroka, uključujuć i krvarenje, i jatrogeni uzroci, poput direktne hirur ške povrede krvnih sudova mozga ili žila koje vode do operacije mozga ili srca . Ishemijski moždani udar čini oko 83 % svih slučajeva moždanog udara.
1
[0054] Prolazni ishemijski napadi (TIA) su manji ili upozoravajuć i udari. U TIA su prisutni uslovi koji ukazuju na ishemijski moždani udar i razvijaju se tipični znakovi upozorenja za moždani udar. Međutim, opstrukcija (krvni ugrušak) se javlja za kratko vreme i ima tendenciju da se razreši kroz normalne mehanizme. Pacijenti koji se podvrgavaju operaciji srca izlo ženi su posebnom riziku od prolaznog cerebralnog ishemijskog napada.
[0055] Hemoragični moždani udar predstavlja oko 17 procenata slučajeva moždanog udara. Rezultat je oslabljenog suda koji pukne i krvari u okolni mozak. Krv se nakuplja i sažima okolno moždano tkivo. Dve opšte vrste hemoragičnih šloga su intracelebralno i subarahnoidno krvarenje. Hemoragični moždani udar nastao je rupturom oslabljene rupture krvnih žila. Potencijalni uzroci rupture iz oslabljenog krvnog suda uključuju hipertenzivno krvarenje, pri kojem visoki krvni pritisak izaziva puknuć e krvne žile, ili drugi osnovni uzrok oslabljenih krvnih sudova, poput rupturirane malformacije vaskularnog mozga, uklju čujuć i aneurizmu mozga, arteriovenske malformacije ( AVM) ili kavernozne malformacije. Hemoragi čni moždani udari takođe mogu nastati hemoragičnom transformacijom ishemijskog udara koji slabi krvne sudove u infarktu ili hemoragijom iz primarnih ili metastatskih tumora u CNS-u koji sadr že nenormalno slabe krvne sudove. Hemoragični moždani udar takođe može nastati iz jatrogenih uzroka poput direktne hirur ške povrede krvnih sudova mozga. Aneurizma je balon oslabljenog područja krvne žile. Ako se ne leči, aneurizma i dalje slabi sve dok ne pukne i iskrvari u mozak. Arteriovenska malformacija (AVM) je skupina nenormalno formiranih krvnih sudova. Kavernozna malformacija je venska abnormalnost koja mo že izazvati krvarenje iz oslabljenih venskih struktura. Bilo koja od ovih žila može se pokvariti, uzrokujuć i krvarenje u mozgu. Hemoragični moždani udar takođe može biti posledica fizičke traume. Hemoragični moždani udar u jednom delu mozga može dovesti do ishemijskog moždanog udara u drugom, usled nedostatka krvi izgubljene u hemoragičnom moždanom udaru.
[0056] Jedna klasa pacijenata koja podleže lečenju su pacijenti koji su podvrgnuti hirurškoj proceduri koja uključuje ili može uključivati krvni sud koji snabdeva mozak, ili na drugi način na mozak ili CNS. Neki primeri su pacijenti koji su podvrgnuti kardiopulmonalnom bajpasu, karotidnom stentiranju, dijagnosti čkoj angiografiji mozga ili koronarnih arterija aortnog luka, vaskularnim hirur škim procedurama i neurohirurškim procedurama. Dodatni primeri takvih pacijenata razmatrani su napred u odeljku IV. Pacijenti sa aneurizmom mozga su posebno pogodni. Takvi pacijenti se mogu le čiti različitim hirurškim zahvatima, uključujuć i odsecanje aneurizme da bi se isključila krv, ili izvođenje endovaskularne hirurgije kako bi se aneurizma blokirala malim zavojnicama ili unošenje stenta u krvni sud iz koga izlazi aneurizma ili ubacivanje mikrokafetera. Endovaskularni postupci su manje invazivni od rezanja aneurizme i povezani su sa boljim ishodom pacijenta, ali rezultat i dalje uključuje visoku učestalost malih infarkta. Takvi pacijenti se mogu lečiti inhibitorom interakcije PSD95 sa NMDAR 2B, a naročito agensima opisanim gore, uključujuć i peptid IGRKKRRKRRRKLSSIESDV (SEK ID NO: 6, takođe poznat kao Tat-NR2B9c). Vreme primene u odnosu na izvođenje operacije može biti opisano gore za kliničko ispitivanje.
[0057] Druga klasa pacijenata podložnih lečenju su pacijenti koji imaju subarahnoidno krvarenje sa ili bez aneurizme (videti WO2013088382).
IV. Efikasni načini primene
[0058] Nakon rekonstitucije, liofilirana formulacija je korisna da se dobije takvo aktivno sredstvo (npr. NR2B9c) u količini, učestalosti i putu primene efikasnom za lečenje, smanjenje ili inhibiciju daljeg pogoršanja bar jednog znaka ili simptoma bolesti kod pacijenta koji ima bolest koja se le či. Terapeutski efikasna količina znači količinu aktivnog sredstva dovoljnu za lečenje, smanjenje ili inhibiciju daljeg pogoršanja bar jednog znaka ili simptoma bolesti ili stanja koje treba lečiti u populaciji pacijenata (ili životinjskih modela) koji pate od lečene bolesti sa agensom ovog iz pronalaska u odnosu na ošteć enje kontrolne populacije pacijenata (ili životinjskih modela) koji pate od te bolesti ili stanja koji nisu lečeni sredstvom. Količina se takođe smatra terapeutski efikasnom ako pojedinačni lečeni pacijent postigne ishod povoljniji od srednjeg ishoda u kontrolnoj populaciji uporedivih pacijenata koji nisu le čeni metodama ovog pronalaska. Terapeutski efikasan režim uključuje davanje terapeutski efikasne doze u frekvenciji i putu primene potrebnim za postizanje predviđene svrhe.
[0059] Za pacijenta koji pati od moždanog udara ili drugog ishemijskog stanja, aktivno sredstvo je korisno da se primenjuje na načijn koji sadrži učestalost količine i način primene koji su efikasni za smanjenje štetnih efekata moždanog udara ili drugog ishemijskog stanja. Kada je stanje koje zahteva lečenje moždani udar, ishod se može odrediti volumenom infarkta ili indeksom invaliditeta, a doza se smatra terapeutski efikasnom ako pojedinačni lečeni pacijent pokaže invaliditet od dve ili manje na Rankinovoj skali i 75 ili više na Barthel-ovoj skali, ili ako populacija lečenih pacijenata pokazuje značajno poboljšanu (tj. manju invalidnost) raspodelu rezultata na skali odstupanja od uporedive nele čene populacije, vidi Lees et u L, N Engl J Med 2006; 354: 588-600. Za lečenje moždanog udara obično je dovoljna jedna doza sredstva.
[0060] Pronalazak takođe daje metode i formulacije za profilaksu poremeć aja kod subjekta koji rizikuje od tog poremeć aja. Obično takav subjekt ima pove ć anu verovatno ć u za razvoj poreme ć aja (npr. stanje, bolesti, poremeć aja ili bolest) u odnosu na kontrolnu populaciju. Kontrolna populacija, na primer, mo že da obuhvata jednu ili više pojedinaca odabranih nasumično iz opšte populacije (npr., podudarne po starosti, polu, rasi i/ili etničkoj pripadnosti), kojima nije dijagnostikovan ili imaju porodičnu istoriju poremeć aja. Subjekt se može smatrati rizičnim za poremeć aj ako se utvrdi da je „faktor rizika“ povezan s tim poremeć ajem povezan sa tim subjektom. Faktor rizika može uključivati bilo koju aktivnost, osobinu, događaj ili svojstvo povezano sa određenim poremeć ajem, na primer, putem statističkih ili epidemioloških studija na populaciji ispitanika. Subjekt se stoga može klasifikovati kao rizičan za poremeć aj čak i ako studije koje identifikuju osnovne faktore rizika nisu posebno uključivale predmet. Na primer, subjekt koji se podvrgava operaciji srca rizikuje od prolaznog cerebralnog ishemijskog napada jer se u čestalost prolaznog cerebralnog ishemijskog napada poveć ava u populaciji ispitanika koji su bili podvrgnuti operaciji na srcu u poređenju sa populacijom ispitanika koji to nisu učinili.
[0061] Drugi uobičajeni faktori rizika za moždani udar uključuju starost, porodičnu anamnezu, pol, ranu učestalost moždanog udara, prolazni ishemijski napad ili srčani udar, visok krvni pritisak, pušenje, dijabetes, karotidnu ili drugu bolest arterija, atrijsku fibrilaciju, druge sr čane bolesti poput kao srčane bolesti, zatajenje srca, proširena kardiomiopatija, bolest srčanih zalistaka i/ili urođene srčane mane; povišen holesterol u krvi i dijete sa visokim udelom zasić enih masti, trans masti ili holesterola.
[0062] U profilaksi, liofilizovana formulacija posle rekonstitucije se daje pacijentu koji rizikuje od bolesti, ali još uvek nema bolest u količini, učestalosti i putu dovoljnom da spreči, odloži ili inhibira razvoj bar jednog znaka ili simptoma bolest. Profilaktički efikasna količina znači količinu sredstva dovoljnu za sprečavanje, inhibiciju ili odlaganje barem jednog znaka ili simptoma bolesti u populaciji pacijenata (ili životinjskim modelima) u riziku od srodnika koji se tretira sa sredstvom u poređenju sa kontrolom populacija pacijenata (ili životinjskih modela) u riziku od bolesti koja nije tretirana himernim agensom ovog pronalaska. Količina se takođe smatra profilaktički efikasnom ako pojedinačni lečeni pacijent postigne ishod povoljniji od srednjeg ishoda u kontrolnoj populaciji uporedivih pacijenata koji nisu le čeni metodama ovog pronalaska. Profilaktički efikasan režim uključuje davanje profilaktički efikasne doze u frekvenciji i putu primene potrebnom za postizanje predviđene svrhe. Za profilaksu moždanog udara kod pacijenta sa neposrednim rizikom od moždanog udara (npr. pacijent koji je podvrgnut operaciji na srcu) obično je dovoljna jedna doza sredstva.
[0063] U zavisnosti od sredstva, primena može biti parenteralna, intravenska, nazalna, oralna, subkutana, intraarterijska, intrakranijalna, intratekalna, intraperitonealna, topi čka, intranazalna ili intramuskularna. Intravenozna primena je poželjna za peptidna sredstva.
[0064] Za primenu na ljudima, poželjna doza aktivnog agensa (npr. Tat-NR2B9c) je 2-3 mg/kg i poželjnije 2,6 mg/kg. Navedene doze treba razumeti kao da uključuju grešku koja je svojstvena tačnosti s kojom se doze mogu meriti u tipičnim bolničkim uslovima. Takve količine su za davanje pojedinačne doze, tj. jednu dozu po epizodi bolesti.
[0065] Aktivna sredstva, poput Tat-NR2B9c, poželjno se daju infuzijom u krvne sudove, poželjnije intravenskom infuzijom. Vreme infuzije može da utiče i na neželjene efekte (usled npr. degranulacije mastocita i oslobađanja histamina) i na efikasnost. Uopšteno, za određeni nivo doziranja, krać e vreme infuzije verovatnije ć e dovesti do oslobađanja histamina. Međutim, kra ć e vreme infuzije takođe može rezultirati poboljšanom efikasnošć u. Iako praksa ovog pronalaska ne zavisi od razumevanja mehanizma, poslednji rezultat se može objasniti i zato što je kašnjenje značajno u odnosu na razvoj patologije kod pacijenta i zbog toga što je kašnjenje značajno u odnosu na poluživot u plazmi himerno sredstvo, usled čega himerno sredstvo ne dostiže optimalni terapeutski nivo. Za himerno sredstvo Tat-NR2B9c, poželjno vreme infuzije koje obezbeđuje ravnotežu između ovih razmatranja je 5-15 minuta i poželjnije 10 minuta. Navedeno vreme treba shvatiti kao uključivanje obeležavanja greške od /- 10%. Vreme infuzije ne uključuje dodatno vreme difuzije ispiranja kako bi se isprale preostale kapljice iz po četne difuzije koja je inače nastavila do završetka. Vreme infuzije za Tat-NR2B9c takođe može poslužiti kao vodič za druga aktivna sredstva.
[0066] Iako je pronalazak detaljno opisan radi jasnoće razumevanja, određene modifikacije se mogu primeniti unutar obima dodatih zahteva. U meri u kojoj je vi še od jedne sekvence povezano sa pristupnim brojem u različitim vremenima, misli se na sekvence povezane sa pristupnim brojem od dana kada je efektivni datum za prijavu ove prijave. Datum efektivnog podno šenja prijave je datum najranije prijave za prioritet koji objavljuje predmetni pristupni broj. Ako iz konteksta nije druga čije vidljivo, bilo koji element, ostvarenje, korak, karakteristika ili aspekt ovog pronalaska može se izvesti u kombinaciji sa bilo
1
kojim drugim.
PRIMERI
[0067] Primeri 1-7 pokazuju da acetatna so TAT-NR2B9c može biti formulisana u liofilizovanom obliku sa histidinom i trehalozom. Primer 10 pokazuje da hloridna so TAT-NR2B9c nudi značajno već u stabilnost od acetatne soli u inače identičnoj liofilizovanoj formulaciji. Primer 9 pokazuje da hloridna sol TAT-NR2B9c formulisana u histidinu i trehalozi takođe daje poboljšanu stabilnost u odnosu na prethodno opisanu liofilizovanu formulaciju TAT-NR2B9c iz normalnog fiziološkog rastvora.
Primer 1: Dokaz da standardni puferi i ekscipijenti ne ometaju efikasnost TAT-NR2B9c in vivo.
[0068] Pet tečnih toksikoloških formulacija usmerenih na koncentraciju od 20 mg / mL TAT-NR2B9c. Tabela 1 sadrži sastav nosača, broj šarže i jačinu, čistoć u i pH u vreme mešanja. Otprilike 5 mL svake formulacije je obrisano za testiranje. Bočice su bile zamrznute na -20 da bi simulirali davanje ili uslove čuvanja tečnosti.
Tabela 1: Sastav formulacija TAT-NR2B9c za ispitivanje efikasnosti in vivo
[0069] Primeć eno je da formulacija puferisana fosfatima ne održava pH kao i histidinski puferi između formulacije i ispitivanja, što ukazuje da histidin može biti superioran pufer za formulaciju.
[0070] Formulacije 1-5 su testirane u modelu 3-PIAL okluzije posude (3PVO) moždanog udara kod pacova. Pacovima koji su bili izloženi moždanom udaru je data jedna od formulacija intravenskim davanjem u femoralnu venu, a zatim su životinje žrtvovane 24 sata posle moždanog udara. Mozak je skupljen, fiksiran i obojen trifeniltetrazolijum hloridom (TTC) da bi se vizualizovali ishemijski delovi mozga. Sve testirane formulacije bile su u stanju da obezbede značajnu neuroprotekciju kod životinja u odnosu na kontrolu koja je bila samo fiziološki rastvor (sl. 1).
Metode
Tri modela ishemije okluzije krvnih sudova
[0071] Eksperimenti su izvedeni na pacovima. Za trajnu okluziju tri sudova pial-a izvedeno je kao što je
1
prethodno opisano [Angiogena zaštita od žarišne ishemije blokadom receptora angiotenzina II tipa 1 kod pacova. Forder i dr., Am J Phisiol Heart Circ Phisiol. April 2005; 288 (4): H1989-96]. Ukratko, 250 g do 350 g pacova je anestezirano intramuskularnom injekcijom 0,5 ml kg intramuskularne injekcije tr žiketa (100 mg / kg), acepromazina (2 mg/kg) i ksilazina (5 mg/kg), dopunjenog treć inom početne doze prema potrebi. Umetnuta je sonda za analnu temperaturu i životinja je stavljena na podlogu za grejanje održavanu na oko 37 °C. Lobanja je bila sečena srednjim rezom i izrezana bez tkiva. Pomoć u mikroskopa za seciranje i pneumatske zubne bušilice napravljen je 6-8 mm kranijalni otvor preko desnog somatosenzornog korteksa (2 mm kaudal i 5 mm bočno od bregme) bušenjem pravougaonika kroz lobanju i podizanjem dela komada lobanja, zadržavajuć i tvrdu netaknutu. Katerizirane su tri granične arteriolarne grane srednje moždane arterije oko korte cevi su odabrani i električni katerizirani pomoć u trake. Nakon kauterizacije, vlasište je zašiveno. Svaki je pacov vrać en u svoj kavez pod lampom za zagrevanje radi održavanja telesne temperature dok se pacov ne oporavi u potpunosti. Hrana i voda su im davani. Sat vremena nakon 3PVO ishemije, pacovima je ubrizgana formulacija NA1 sa 3 nmol/g u 0,45 mL fiziolo škog rastvora na osnovu težine pacova. Doze su davane tokom 5 minuta.
[0072] Dvadeset i četiri sata nakon operacije, mozak je brzo skupljen. Koronalne kri ške (2 mm) su odnete kroz mozak i inkubirane u 2 % trifeniltetrazolijum hloridu (TTC) (Sigma-Aldrich St. Louis MO) tokom 15 minuta na 37 °C. Slike su skenirane (CanoScan 4200F Canon) i kvantitativno utvrđene.
Primer 2: Određivanje stabilnosti TAT-NR2B9c u različitim puferima i pri različitim vrednostima pH
Skeniranje pufera
[0073] Deset pufera je složeno u 1 mg / mL TAT-NR2B9c za skrining ekscipijenata. Uzorci su čuvani na 25 ° C / 60% relativne vlažnosti (RH) i 40 ° C / 75% RH. Uzorci su testirani na stabilnost (čistoć u) na t = 0 i t = 1 nedelju čistoć e pomo ć u RP-HPLC (TFA i MSA metode), a rezultati su prikazani u tabelama 2 i 3.
[0074] Rezultati ukazuju na poboljšanu stabilnost za TAT-NR2B9c u tečnim medijumima puferiranim između pH 6,0 i pH 6,5. Čini se da degradacija raste izvan ovog raspona u bilo kom pravcu. Podaci generisani MSA metodom pokazali su jasne obrasce razgradnje koji su zavisili i od pH i od puferiranja i dali dragoceni uvid u buduć i razvoj formulacije. Rezultati za najve ć u čisto ć u vrha prema % HPLC područja primenom MSA metode prikazani su u Tabeli 2, dok su rezultati za glavnu vršnu čistoć u po % HPLC površini pomoć u TFA metode prikazane u Tabeli 3.
Tabela 2. % površine glavnog vrha MSA metodom, TAT-NR2B9c
1
Tabela 3.% površine glavnog vrha metodom TFA, TAT-NR2B9c
[0075] Rezultati pokazuju da se stabilnost rastvora TAT-NR2B9c najbolje održava na pH punjenim medijuma od 6,0 do 6,5 i nosač još uvek dobro podnosi primenu IV. Generalno, histidinski i citratni puferski sistem su bili u stanju da održavaju TAT-NR2B9c u netaknutom obliku čak i kada su bili održavani u uslovima ubrzane stabilnosti od 25 ° C ili 40 ° C tokom 1 nedelje. Postoji nekoliko faktora koje treba uzeti u obzir prilikom odabira puferske vrste: specifični obrasci razgradnje koji se javljaju u svakom medijumu i bilo koji podaci o identifikovanim srodnim supstancama ili toksikolo škim problemima mogu pojednostaviti proces odlučivanja ako se izbegnu određene supstance. U ispitivanom periodu, histidinski i citratni puferi između pH 6 i 6,5 pokazali su malo produkata razgradnje. Sam histidinski pufer korišć en u ovom istraživanju sadrži kontaminant koji je bio prisutan u histidinskom puferu u odsustvu dodatka TAT-NR2B9c.
[0076] Prema tome, identifikacija dobavljača histidina bez takvog kontaminanta učinila bi analizu jednostavnijom. Tabela 4 daje rezime vrsta pufera sa stanovišta stabilnosti TAT-NR2B9c.
Tabela 4. Izbor vrsta pufera
1
Primer 3: Određivanje stabilnosti TAT-NR2B9c u histidinskim i citratnim puferima i pri različitim vrednostima pH sa različitim količinama natrijum hlorida.
[0077] Cilj ovog istraživanja bio je da se prikažu efekti natrijum hlorida (NaCl) na pH i stabilnost TAT-NR2B9c u tečnim formulacijama. Formulacije pufera sa 1 mg/mL TAT-NR2B9c navedene su u Tabeli 5, a rezultati za pH dati su u Tabeli 6. Podaci pokazuju prilično konzistentne rezultate tokom trajanja studije. Međutim, primetne su smene u citratu sa dodatkom NaCl, pri čemu je uticaj puferiran i pH pao za ∼ 0,2 jedinice. Odabrani pH od 6,0 i 6,5 nalaze se na spoljnoj ivici idealnog puferisanja citrata (pH 2,5-5,6), tako da to može prouzrokovati poteškoć e sa različitim aditivima tokom procesa mešanja i trebalo bi ih uzeti u obzir prilikom procene robusnosti formulacije.
Tabela 5: Formulacije pufera za ispitivanje uticaja soli na pH
Tabela 6: pH stabilnost formulacija TAT-NR2B9c u uslovima zamrznute i rastuće temperature
[0078] Rezultati pokazuju da dodavanje 200 mM NaCl u rastvorima TAT-NR2B9c puferiranih histidinom i citratima ne utiče značajno na pH rastvora bilo da su čuvani nedelju dana zamrznuti ili na rastućoj temperaturi od 40 °C.
[0079] Zatim smo ispitali stabilnost TAT-NR2B9c u ovim formulacijama kada se čuvaju 1 nedelju na smrznutim i rastućim temperaturama. Tabela 7 prikazuje rezultate ispitivanja upotrebom RP-HPLC metode sa gradijentom MSA. Podaci su takođe prikazani na slikama 2A i 2B. Na slici 2A prikazana je ubrzana
1
stabilnost formulacija sortiranih s leva na desno (niska do visoka stabilnost). Slika 2B prikazuje relativnu ubrzanu stabilnost puferskim agensom.
Tabela 7. Čistoć a (MSA metoda), TAT-NR2B9c
[0080] Ovi rezultati pokazuju da se stabilnost rastvora TAT-NR2B9c najbolje održava na pH 6,5, a dodavanje NaCl može ponuditi blago poboljšanje stabilnosti (Slike 2A i 2B). Zbog poboljšane sposobnosti pufera i uporedive stabilnosti histidinskog pufera, posebno kada je zagađivač koji migrira sa relativnim vremenom zadržavanja (RRT) od 0,28 (površina kontaminanta uključena u gornju tabelu, što rezultira nižom vrednošć u stabilnosti za TAT-NR2B9c površina vrha), vrsta pufera histidina pri pH 6,5 je najbolja formulacija za prelazak u studije liofilizacije.
[0081] Nosači sa pH 6,5 dobro se podnose davanjem IV.
Primer 4: Odabir sredstava za skupljanja za TAT-NR2B9c da bi se dobio stabilan liofilizovani kolač
[0082] Da bismo identifikovali sredstva za gomilanje koja bi stvorila lep kolač nakon liofilizacije i poboljšala stabilnost, prikupili smo nekoliko 20 mg / mL TAT-NR2B9c rastvora u 50 mM histidinskog pufera, sredstva za punjenje i NaCl kako je prikazano u Tabeli 8. Da bi simulirali vreme i temperatura rukovanja kojima TAT-NR2B9c formulacije mogu biti izložene tokom procesa liofilizacije, ovi uzorci su smešteni na -20 ° C (kontrola) i 40 ° C / 75% RH (test), i analizirani su nakon jedne nedelje skladištenje za čistoć u pomoć u HPLC (MSA metoda) i pH. Rezultati su za pH stabilnost prikazani u Tabeli 9, a rezultati za stabilnost TAT-NR2B9c u različitim tečnim formulacijama prikazani su u Tabeli 10 i na Slici 3.
Tabela 8. Matrica uzorka agensa za gomilanje
2
Tabela 9. pH, Uzorci agenasa za gomilanje
Tabela 10. Čistoća % oblasti TAT-NR2B9c vrha, MSA Metod
Rezultati tečnih formulacija rastvora agensa o stabilnosti TAT-NR2B9c
[0083] Manitol, Trehaloza i Dekstran-40 održavaju pH na 6,5 bunara (Tabela 9), a postoji približno 1 % smanjenje čistoć e (Tabela 10) tokom jedne nedelje kao formiranje tečnosti kada se čuva na visokoj temperaturi. U pogledu hemijske stabilnosti rastvora za punjenje liofilizacijom TAT-NR2B9c, manitol i trehaloza su poželjna sredstva za poveć anje mase jer daju TAT-NR2B9c bolju stabilnost u odnosu na rastvore dekstrana-40 (Slika 3).
Primer 5: Termička analiza sredstava za gomilanje za olakšavanje dizajna ciklusa liofilizacije [0084] Kao deo razvoja ciklusa liofilizacije za liofilizovani lek TAT-NR2B9c, predloženi rastvori za punjenje iz matrice uzorka agensa (tabela 8) su procenjeni diferencijalnom kalorimetrijom skeniranja (DSC) za termičke karakteristike uključujuć i stakleni prelaz (Tg) u formulacija Rezultati su navedeni u Tabeli 11, a DSC tragovi su prikazani na slikama 4A-6B.
Tabela 11. Stakleni prelazi rastvora za punjenje liofilizacijom TAT-NR2B9c
[0085] U koncentraciji TAT-NR2B9c od 20 mg /ml, testirane formulacije TAT-NR2B9c pokazale su toplotni profil karakterističan za širi događaj topljenja sa početkom na niskoj temperaturi. Ova produžena talina maskirala je događaj kristalizacije koji se obično vidi u formulacijama manitola i može ukazivati na to da se mora izvršiti robusni ciklus sušenja zamrzavanjem tamo gde proizvod nikada ne prelazi temperaturu stakla. U ovom slučaju, na osnovu posmatranih staklenih prelaza rastvora za punjenje leka TAT-NR2B9c, upotreba manitola kao sredstva za poveć anje mase zahtevala bi primarnu temperaturu su šenja nižu od -40 ° C, što je tipična granica izvodljivosti za ciklus skalabilnosti . U pogledu toplotnih profila, Trehaloza i Dekstran-40 su superiorni za upotrebu kao sredstvo za poveć anje mase. Međutim, s obzirom da je stabilnost TAT-NR2B9c u tečnim formulacijama koje sadrže trehalozu bila bolja od one koja sadrži Dekstran, trehaloza bi bila poželjno sredstvo za poveć anje mase ispitivanih uzoraka.
[0086] Zbog relativno niskih temperatura Tg za koje bi verovatno bio potreban du ži ciklus liofilizacije, osušili smo širi spektar standardnih sredstava za punjenje i pogledali smo da smanjimo zapreminu punjenja u sistemu za zatvaranje kontejnera kako bi do šlo do smanjenja zapremina tečnosti koja se liofilizira. U nastojanju da se smanji zapremina punjenja i odr ži 270 mg / bočica, izvedena je studija rastvorljivosti TAT-NR2B9c u Histidinu, pH 6,5 i u Histidinu Trehalozi, pH 6,5. Uzorci su vizuelno analizirani na 35, 50, 75 i 100 mg / mL. Svi rastvori su bili čisti u t = 0 i t = 24 sata. Na osnovu ovih podataka, mogli bismo upotrijebiti zapreminu punjenja manju od 3 ml, što bi pomoć u TAT-NR2B9c formulacije od 90 mg / ml dalo 270 mg u ciljanoj bočici. U bočici može biti potreban širok raspon količina, ali 270 mg obezbedić e dozu od 2,6 mg / kg za pacijenta od 100 kg. Pod pretpostavkom da je ciljna koncentracija za rekonstituciju pacijenta i dalje 20 mg / ml (ali mo že biti od 1 mg / ml do 100 mg / ml), tada se 20-ml bočica za liofilizaciju koja sadrži 270 mg TAT-NR2B9c može koristiti za rekonstituciju. zapremina 13,5 mL. Prema tome, optimalna zapremina tečnosti za liofilizaciju TAT-NR2B9c u bočici bila bi između 2,5 ml i 10 ml.
[0087] Širi spektar sredstava za gnojenje je testiran pre nego što su napredovali u razvoju liofilizacije, a Tg su prikazani u tabeli 12. 100 mg / mL TAT-NR2B9c u histidinu, pH 6,5 je takođe ocenjen pomoć u DSC i podaci su uključeni u Tabeli 12.
Tabela 12. Podaci o DSC, formulacije
[0088] Na osnovu podataka o DSC u Tabeli 12, postoji nekoliko opcija formulacije i za aktivne i za placebo lekove. Generalno, formulacije 5 i 11 su najperspektivnije za aktivni proizvod u odnosu na Tg. Bilo koji agens može biti pogodan za upotrebu u placebo proizvodu, ali formulacija 4 (Mannitol) ć e imati najkra ć u dužinu ciklusa ako se zapali i moždać e biti najpoželjnija ako izgled odgovara aktivnom.
[0089] Dok određujemo optimalnu aktivnu formulaciju, važno je razmotriti stabilnost rastvora, robusnost ciklusa liofilizacije i hemijsku stabilnost. Formulacija 5 iz Tabele 12 (Trehaloza) pokazala je dobru stabilnost rastvora i hemijsku stabilnost liofila u ubrzanim uslovima (podaci prikazani naknadno), ali zahteva duži ciklus liofilizacije sa konfiguracijom punjenja od 13,5 ml. Ova duža dužina ciklusa možda nije idealna za komercijalnu proizvodnju u buduć nosti, gde je poželjan kra ć i ciklus. Formulacija 11 iz Tabele 12 (bez sredstva za punjenje, na 100 mg / mL TAT-NR2B9c) ima višu temperaturu staklastog prelaza nego formulacija 5, što omoguć ava topliji, kra ć i ciklus. Pored toga, smanjena zapremina punjenja znatno ć e skratiti trajanje rada jer ć e biti manje leda za sublimiranje iz svake bočice.
Primer 6: Stabilnost TAT-NR2B9c sa promenljivim agensima, razmerama i uslovima liofilizacije
Stabilnost agenasa za ubrzanje stabilnosti
[0090] Mala šarža leka TAT-NR2B9c je liofilizovana da bi se procenila stabilnost čvrstog stanja posle 1 nedelje na 25 ° C, 40 ° C i 60 ° C. TAT-NR2B9c je pomešan u aktivnoj koncentraciji od 20 mg / mL u tri različita nosača. Uzorci su procenjeni na izgled, rekonstituciju, pH, količinu i čistoć u pomo ć u HPLC (MSA metoda) na t = 0 i t = 1 nedelju. Sadržaj vode procenjen je samo na t = 0.
[0091] Svi lekovi TAT-NR2B9c su se pojavili kao beli, liofilizovani kolači i rekonstituisani za manje od 10 sekundi pri t = 0 i t = 1 nedelji.
[0092] Nosači lekova opisani su u Tabeli 13 i navedeni su sa odgovarajuć om temperaturom stakla i rezultatom sadržaja vode. PH, količina TAT-NR2B9c i rezultati čistoć e TAT-NR2B9c opisani su u Tabelama 14-16.
2
Tabela 13. Uzorak matrice agensa za gomilanje: Tg i % sadržaja vode
Tabela 14. pH, sredstvo za poveć anje mase Lio Small Scale # 1
Tabela 15. Količina (mg / bočica), sredstvo za gomilanje Lio Small Scale # 1
Tabela 16. Čistoć a (% površine prema HPLC), agens za gomilanje Lio Small Scale # 1
[0093] Sva tri sredstva za punjenje, Trehalose, Dektran-40 i Trehalose: Dektran-40, održavaju pH na 6,5 (Tabela 14) i postoji opseg smanjenja čistoć e od 0,5-2,5% na 60 ° C posle 1 nedelje ( Tabela 15). Oba leka koja sadrže dekstran-40 i čuvana na 60 ° C pokazala su rast povezanih supstanci u vreme zadržavanja (RT) )6.0. Ovi povezani supstanci nisu bili prisutni u uzorcima trehaloze, što sugeriše da trehaloza ima stabilizujuć i efekat u liofilizovanom leku, a dekstran-40 može da prouzrokuje specifični produkt razgradnje.
[0094] Uključivanje dekstrana-40 u sredstvo za punjenje omoguć ava topliju primarnu temperaturu sušenja, ali je dekstran-40 kao sredstvo za poveć anje mase pokazao najnižu stabilnost. Kombinacija trehaloze i dekstrana-40 (1:1) dovodi do temperature stakla koja je približno 10 °C toplija od same trehaloze. Međutim, čini se da je stabilnost na 60 °C srednja prema uzorcima trehaloze i dekstrana, tako da je trehaloza poželjno sredstvo za gomilanje.
Liofilizirani razvoj formulacije TAT-NR2B9c: Eksperiment male skale # 2
[0095] Mala šarža leka TAT-NR2B9c je liofilizovana da se proceni podešavanje temperature police na 5 °C tokom primarnog sušenja. TAT-NR2B9c je jedinjen u aktivnoj koncentraciji od 27 mg/mL u 50 mM Histidina, pH 6,5 i 120 mM Trehaloze. Parametri ciklusa su prikazani u Tabeli 17. Četiri staklene bočice za liofilizaciju od 20 ml napunjene su sa 10 ml. Dve bočice su ispitivane temperaturnim sondama.
Tabela 17. Razvoj male skale 2, TAT-NR2B9c formulacija
[0096] Zbog velike zapremine punjenja, potrebno je podesiti temperaturu police znatno topliju od temperature stakla kako bi se nadoknadilo hlađenje isparavanjem. Temperatura rastvora tokom primarnog sušenja je bila -29 ° C, što je blizu temperature stakla od -28 ° C iz DSC termičke analize.
90 mg / mL TAT-NR2B9c ubrzana stabilnost liofila (mala skala 3)
[0097] Pre komponovanja rastvora za punjenje male skale 3, 90 mg / mL TAT-NR2B9c u puferu (50 mM Histidina, pH 6.5) je procenjeno na pH. PH rastvora je 6.04. Utvrđeno je da sa poveć anom koncentracijom TAT-NR2B9c, puferska snaga takođe treba da se poveć a. Rastvori su pripremljeni na 150 mM, 100 mM, 75 mM, i vodi i procenjeni na pH. PH su navedeni u Tabeli 18. Mala skala 3 je pome šana u 100 mM Histidin pufer na pH 6,5, a pH je ponovo podešen na 6,5 nakon dodavanja TAT-NR2B9c.
2
Tabela 18. pH, 90 mg / mL TAT-NR2B9c u puferima Histidina, pH 6,5
[0098] Mala šarža leka TAT-NR2B9c je liofilizovana da bi se procenila stabilnost čvrstog stanja posle skladištenja u trajanju od 1 nedelje na 25 ° C i 60 ° C. Dve formulacije od 90 mg / mL TAT-NR2B9c su spojene (pufer i pufer sa trehalozom). Uzorci su procenjeni za izgled, rekonstituciju, sadr žaj vode i čistoć u pomo ć u HPLC (MSA metoda) na t = 0 i t = 1 nedelju.
[0099] Svi lekovi TAT-NR2B9c su izgledali kao beli, liofilizovani kolači. Neki kolači su pukli. Formulacije placeba bile su vizuelno slične aktivnim formulacijama.
[0100] Vreme rekonstitucije bilo je približno 1,5 minuta u poređenju sa manje od 10 sekundi u prethodnim formulacijama. Poveć ano vreme rekonstitucije najverovatnije je posledica pove ć anih koncentracija TAT-NR2B9c i histidina. Dalji testovi su pokazali dobru stabilnost TAT-NR2B9c sa koncentracijama histidinskog pufera od 50 i 75 mM, sa skrać enim vremenima resuspenzije. Takođe, zbog veličine bočice od 2 ml korišć ene za ovo istraživanje, liofilu je dodat samo 1 ml vode. Stvarni volumen rekonstitucije iznosi 4,5 ml u ovoj maloj konfiguraciji. Vreme rekonstitucije najverovatnije ć e se poboljšati kada se koristi već a količina razblaživača.
[0101] Bočice su stavljene na stabilnost na 25 ° C i 60 ° C i testirane nakon skladištenja u trajanju od 1 nedelje.
[0102] Na osnovu podataka o vizuelnom izgledu, uzorak trehaloze dao je kolač elegantnijeg izgleda. Ciklus liofilizacije pušta se konzervativno tokom 5 dana, sa primarnom temperaturom su šenja -32 °. Na osnovu podataka temperaturne sonde, ciklus se može skratiti, pokazujuć i da ć e s ve ć om koncentracijom i manjom zapreminom punjenja optimizirani ciklus biti krać i.
[0103] Rezultati čistoć e prikazani su u Tabeli 19.
Tabela 19. Čistoć a (% površine prema HPLC), mala skala 3
[0104] Na osnovu ovih podataka o ubrzanoj stabilnosti, trehaloza pokazuje stabilizirajuć i efekat na pravljenje TAT-NR2B9c što poboljšava hemijsku stabilnost liofila. Iznenađujuć e je da trehaloza može da pruži ovaj stabilizujuć i efekat dok druga standardna sredstva za zgušnjavanje, kao što su dekstran i manitol koji se koriste za druge peptide, nemaju.
[0105] Smanjena zapremina punjenja minimizira konkurentno hlađenje okolnih bočica i smanjuje otpornost na subliminirajuć u vodu.
Razvoj ciklusa liofilizacije - mala skala 4 (placebo i aktivno)
[0106] Iniciran je mali obim 4 razvoja ciklusa liofilizacije radi testiranja izgleda kolača i uslova liofilizacije za napitak od 3 ml. Ispitivani uzorci su 100 mM His, pH 6,5 sa 120 mM Trehaloze i 90 mg / kg TAT-NR2B9c ili identičan uzorak koji uklanja Trehaloze. Konzervativni četverodnevni ciklus je izveden kao
2
što je opisano u Tabeli 20. Placebo i aktivne bočice su uključene sa konfiguracijom punjenja od 3 ml u staklenu bočicu za liofilizaciju od 20 ml umesto u male bočice korišć ene za prethodne eksperimente. Sonda za aktivnu temperaturu korišć ena je za potvrđivanje temperature tokom ciklusa liofilizacije. Dobijene aktivne bočice prikazane su na slici 7A.
Tabela 20. Parametri liofilizacije za malu skalu 4
[0107] Formulacija od 90 mg / ml u bočici od 20 ml formirala je kolač elegantnog izgleda tokom 4-dnevnog ciklusa, a podaci temperaturne sonde sugerisali su da se ciklus može skratiti na 3 dana.
[0108] Sadržaj vode za placebo i aktivno je bio 0,01 % i 0,00 %.
Razvoj ciklusa liofilizacije - mala skala 5 (placebo i aktivno)
[0109] Izvedena je mala skala 5 da bi se razvio odgovarajuć i placebo bočice za klinička ispitivanja i sagledalo vreme resuspenzije za formulacije na potencijalnom komercijalnom nivou (270 mg / bo čica). 10 placebo formulacija i 1 aktivna formulacija su procenjeni na osnovu izgleda i vremena rekonstitucije. Aktivni kolači bili su elegantni, beli kolači sa manjim skupljanjem što je rezultiralo pukotinom oko površine zida bočice. Placebo kolači su beli, sa više pukotina na kolačima koji sadrže sve već e količine trehaloze.
[0110] Bočice su rekonstituisane sa 13,5 ml vode. Vreme rastvaranja navedeno je u Tabeli 21. Aktivni liofil se ponovo suspendovao ali je tokom 17,6 sekundi pre nego što je postao bistr, bio običan bezbojan rastvor. Svi placebo bili su bistri, bezbojni rastvori.
2
Tabela 21. Rekonstitucija placeba i aktivnog (SS5)
[0111] Na osnovu stabilnosti, vremena resuspenzije i vremena liofilizacije, po željna komercijalna formulacija za TAT-NR2B9c, preliofilizacija, bila bi 20-100 mM Histidin, 120 mM Trehaloze, pH 6,5. Koncentracije trehaloze mogu se poveć ati bez gubitka stabilnosti ili elegancije poga če, ali vremena ponovnog suspendovanja.
Ispitivanje poveć ane Trehaloze u formiranju kolača i podudaranju sa placebom vizuelnim izgledom i vremenom resuspenzije.
[0112] Da bi se bolje uklopilo sa placebom, različite koncentracije Trehaloze su testirane sa i bez TAT-NR2B9c, i sa količinom punjenja od 3 ili 5 ml.
[0113] Prvo, aktivne formulacije i placebo formulacije bić e sumirane. Tada ć e se istaknuti jaka vizuelna podudaranja za 3-ml i 5-ml punjenja. Trenutno se analiziraju analiti čki uzorci (rastvor za punjenje i jedan uzorak potencije). Tabele 22 i 23 prikazuju podskup testiranih formulacija.
Tabela 22. Aktivne formulacije
Slika 7B prikazuje pojavljivanje aktivnih formulacija iz gornje liste.
2
Tabela 23. Placebo formulacije
Tabela 24 prikazuje uslove ciklusa liofilizacije za gornje uzorke Tabela 24. Parametri ciklusa
2
Tabela 25. Rezime glavnih podudaranja
Primer 7: Stabilnost liofilizovanog 270 mg TAT-NR2B9c u 20 mM histidinskom puferu pH 6,5 i 120 mM trehaloze
Priprema liofiliziranog leka
[0114] Mala šarža leka TAT-NR2B9c je formulisana u 90 mg/mL u 20 mM Histidina pH 6,5 i 120 mM trehaloze i liofilizovana da se proceni stabilnost čvrstog stanja posle 4 nedelje na -20 ° C, 40 ° C i 60 ° C. Tabela 25 prikazuje uslove liofilizacije.
Tabela 25. Uslovi ciklusa liofilizacije za primer 7
[0115] Uzorci su čuvani u rernama sa konstantnom temperaturom, a čistoć a, potencija i vreme rekonstitucije u 13,2 mL (tokom 13,5 konačnog zapremine) procenjeni su na 0, 1, 2 i 4 nedelje. Podaci za svaku temperaturu i vreme skladištenja predstavljeni su u tabelama 26A-C.
Tabela 26A: Stabilnost na -20°C
1
Tabela 26B: Stabilnost na 40°C
2
Tabela 26C: Stabilnost na 60°C
[0116] Ova formulacija TAT-NR2B9c je stabilna na -20 ° C. Za temperature skladištenja od 40 ° C i 60 ° C, potencijalne nečistoć e sa relativnim vremenima zadržavanja (RRT) od 1,07, 1,1 i 1,29 polako su se poveć avale koriš ć enjem MSA HPLC testa, a najve ć i rast se pojavio na 1,07 RRT. Za temperaturu skladištenja na 40 ° C, nečistoć a raste sa 0,09% na 0,27% tokom 1 meseca, a za skladištenje od 60 ° C nečistoć a raste od 0,09% do 0,59%. Nije prime ć ena nečisto ć a na -20 ° C. Nečisto ć e interpolirane korišć enjem Arrheniusove jednačine su manje od 0,5% nakon 16 meseci na 25 ° C ili 123 meseca na 5 ° C, i manje od 2% na> 60 meseci na sobnoj temperaturi i više godina na 5 ° C. Stoga su ove i srodne formulacije pogodne za skladištenje liofiliziranog leka na sobnoj temperaturi.
[0117] Ovom razgradnom ispitivanju dozvoljeno je da se nastavi još mesec dana kako bi se potvrdilo da su produkti razgradnje primeć eni na 60 ° C takođe očigledni na 40 ° C. Ove tri nečisto ć e dešavale su se na nižim temperaturama, što ukazuje da su verovatno produkti razgradnje koji nisu specifični za visoko povišene temperature. Identitet ovih vrsta utvrđen je LC/MS/MS studijama i utvrđeno je da sve obuhvata acetilaciju jedinjenja TAT-NR2B9c pune dužine. Ovi događaji acetilacije dogodili su se i na N-kraju peptida i na lizinskim bočnim lancima. Stoga se stabilnost TAT-NR2B9c može poveć ati dodavanjem sredstva za čišć enje ili drugih ekscipijenata za smanjenje acetilacije TAT-NR2B9c u liofilizovanom stanju ili smanjenjem ili uklanjanjem acetata tako da postoji smanjena moguć nost acetilacije.
Opšti zaključci
[0118] Na osnovu stabilnosti, vremena resuspenzije i vremena liofilizacije, po željna komercijalna formulacija za TAT-NR2B9c je 20-100 mM Histidin, 120 mM Trehaloza pH 6,5. Koncentracije trehaloze mogu se poveć ati bez gubitka stabilnosti ili elegancije pogače, ali vremena resuspenzije se pove ć avaju sa poveć anom koncentracijom trehaloze.
Primer 8: Razvoj i stabilnost hloridne soli TAT-NR2B9c (TAT-NR2B9c-Cl)
Priprema liofiliziranog leka
[0119] Zbog nestabilnosti prethodno razvijenih fizioloških formulacija TAT-NR2B9c, i primeć enja da acetilacija acetatne soli TAT-NR2B9c može da se dogodi u liofilizovanim formulacijama, acetatna so je izmenjena u hloridnu so. Ovo je urađeno preparativnom RP-HPLC upotrebom amonijum-hlorida. Cilj ove metode je identifikacija novog sastava materije i nove formulacije koja ć e omogu ć iti pobolj šanu stabilnost za TAT-NR2B9c, poželjno sa poboljšanom stabilnošć u i na sobnoj temperaturi i na 37 ° C. Budu ć i da je TAT-NR2B9c efikasan kada se daje potencijalnim žrtvama moždanog udara i drugih neuroloških poremeć aja, a rano lečenje ovih poremeć aja ima veliku vrednost, formulacija koja je stabilna izvan bolni čkih uslova bila bi korisna u pomaganju milionima obolelih od ovih poremeć aja svake godine. Na primer, takav lek se mo že čuvati u ambulantama ili malim klinikama, lekarskim ordinacijama ili čak biti dostupan pojedincima i pružati subjektima koji imaju neurološke poremeć aje poput moždanog udara ili drugih bolesti koje su podložne neuroprotektivnom agensu mnogo ranije nego što bi se mogli davati ako moraju da putuju u bolnicu na lečenje.
Opšti protokol procesa:
[0120]
Pufer A: Voda
Pufer B: Acetonitril
Kolona: Daisogel ODS C-18 (1 kg), 120 A, 15 µm, 10 cm (zapremina ležaja: ∼ 1L) Brzina protoka: 250 mL / min.
Talasna dužina: 230 nm
Gradijent: Izbačen sa 20% B
(1) Kolona je isprana sa 2 zapremine (BV) 80 % CH30H
(2) Prebačeno je 2 BV 0,025% HCl u vodi ili 0,1% TFA u vodi, što je bilo superiorno
(3) Učitani uzorak: 30 g TAT-NR2B9c acetata (PPL-NA11301) je rastvoreno u 1,5 L vode USP (20 g / L) pod kojim se uslovima TAT-NR2B9c veže na kolonu;
(4) Isprano sa 200 ml USP vode (takođe napunjenom u koloni) uklanjajuć i postoje ć i acetatni protivjon (5) Prebačen 3 BV 0,1M amonijum hlorid (NH4Cl) za snabdevanje novog hloridnog brojača;
(6) Prošao 2 BV 2%
(7) Pasirano je 20% B (acetonitril) da bi se eluirao proizvod
(8) Skupljene frakcije kada je vrh proizvoda eluiran
(9) Frakcije su analizirane analitičkom HPLC
(10) Kolona je ponovo isprana sa 3 BV 80% CH30H
Analitički HPLC sistem:
[0121] YMC ODS-A C18 Kolona, 5 mm, 120 A; Brzina protoka: 1,5 mL / min .; Talasna dužina: 210 nm; Temperatura: 50 ° C; Gradijent: 20% do 35% B za 15 min; Pufer A = 0,1M NaClO4pH 3,1, pufer B = 100% ACN
4
Sintetički rezultati i diskusije:
[0122] Dva glavna bazena sakupljena u toku te pomešana i liofilizovana (= 5L). Sakupljeno je 23,4 g finalnog proizvoda, čistoć e 99,01 %. Zaostali acetat je bio manji od 1 %. Standardna preciziranja protokola treba da budu u moguć nosti da pove ć aju prinos sa 78 % na > 95 %. Ovaj postupak se može na sličan način koristiti za razmenu TFA soli TAT-NR2B9c sa hloridnom soli, jer ć e TFA soli slično vezati kolonu u koraku 3. Formulacija liofiliziranog oblika TAT-NR2B9c-Cl i testiranje stabilnosti
[0123] TAT-NR2B9c-Cl je pomešan u 20 mM histidina i 120 mM trehaloze, pH 6,5, za direktno upoređivanje sa prethodnom poželjnom liofilizovanom formulacijom pod istim uslovima liofilizacije sa 270 mg/bočica (aktivna težina). Stabilnost ove formulacije je takođe upoređena sa prethodno opisanom formulacijom TAT-NR2B9c-Ac ponovo suspendovanom u fiziološkom rastvoru i liofilizovanom. Za poslednje, mala šarža leka TAT-NR2B9c-acetat je formulisana u koncentraciji od 90 mg/mL u fiziološkom rastvoru (bez drugih pomoć nih sastojaka) i liofilizovana sa 270 mg/bočica. Stabilnost formulacija u liofilizovanom stanju procenjena je posle 4 nedelje na -20 °C (kontrola), 40 °C i 60 °C.
Tabela 27: Stabilnost TAT-NR2B9c-Cl (20 mM histidina, 120 trehaloze) u odnosu na TAT-NR2B9c-Ac (fiziološki rastvor)
Tabela 28: Stabilnost TAT-NR2B9c-Cl (20 mM histidina, 120 trehaloze) u odnosu na TAT-NR2B9c-Ac (fiziološki rastvor) u 11 meseci
[0124] Tabela 27 prikazuje relativnu površinu svakog vrha primeć enog u svakom HPLC testu na svakoj temperaturi posle jednog meseca skladištenja i u svakom relativnom vremenu zadržavanja (identitet vrha) za direktno poređenje. I za formulacije i metode početne čistoć e su vrlo slične (98 % za TAT-NR2B9c-Cl vs 97,93% za TAT-NR2B9c-Ac metodom TFA, i 99,3% vs 99,13% za metod metansulfonske kiseline (MSA). Gledajuć i podatke od 60 °C, sastav TAT-NR2B9c-Cl histidin trehaloze je značajno stabilniji od formulacije fiziološkog rastvora TAT-NR2B9c obe metode. Za TFA metodu nakon mesec dana skladištenja na 60 °C, TAT-NR2B9c -Cl so zadržava 98,6 % glavnog vrha, dok TAT-NR2B9c-Ac fiziološka formulacija zadržava samo 96,8 % početnog materijala. Za MSA metod, razlika je još upečatljivija, gde so TAT-NR2B9c-Cl zadržava 99,4 % svog polaznog materijala, dok TAT-NR2B9c-Ac fiziološki rastvor zadržava samo 97,2 % početnog materijala.
[0125] Tabela 28 prikazuje relativnu površinu svakog vrha primeć enog u svakom HPLC testu na istim uzorcima posle 11 meseci pri različitim temperaturama skladištenja. Ovi podaci podržavaju poboljšanu stabilnost formulacije soli NA-1 Cl u odnosu na formulaciju NA-1-Ac u hloridu. Upoređujuć i površinu glavnih NA-1 vrhova u TFA testu na 40 °C, što je ubrzano stanje pomoć u ICH navođenja za podršku skladištenja liofiliziranog leka u sobnoj temperaturi, NA-1 - Cl zadržava čistoć u od 98,14 % od početka čistoć a 98,58, dok je NA-1-Ac u fiziološkom rastvoru pao sa 98,57 čisto na 96,48, što je ispod specifikacije čistoć e od 97% i ne bi se smatralo stabilnom nakon otprilike godinu dana. Isti trend je prime ć en za MSA test od 99,3% čisto do 98,71 čisto za NA-1-Cl i 97,08 za NA-1-Ac u fiziološkom rastvoru. Ispitivanjem rezultata čistoć e pri 60 °C posle 11 meseci (tabela 28), razlike su značajno dublje, a NA-1-Cl je značajno stabilniji od NA-1-Ac.
[0126] Sa kliničkog stanovišta, primeri ograničenja čistoć e za lek za ljude mogu da budu 97 % čisto ć e bez nepromenjene nečistoć e ve ć e od 0,5 % pri nominalnom stanju skladištenja. Pomo ć u Arhenijusove jednačine možemo koristiti podatke o stabilnosti od 40° C i 60 °C da predvidimo pad čistoć e glavnog vrha ili porast primeć enih nečisto ć a pri različitim temperaturama skladištenja (npr. 25 °C ili 37 °C nasuprot utvrđenim podacima sa 40 °C ili 60 °C). Pod pretpostavkom da ć e se lek čuvati na sobnoj temperaturi, bilo bi korisno pokazati stabilnost na 37 °C, jer ima mnogo okruženja bez hlađenja, gde bi letnja temperatura okoline mogla biti u ovom rasponu. Pod pretpostavkom da je potrebna čistoć a od 97,0 % na 37 °C i korišć enje reprezentativnih podataka o stabilnosti iz TFA testa za glavnu vr šnu čisto ć u, jer je najosetljiviji (tj. pokazuje najveć i pad čisto ć e na 40 °C i 60 °C) predviđa se da ć e formulacija fiziološkog rastvora imati rok trajanja od 29,8 meseci (ili malo više od dve godine), dok bi formulacija TAT-NR2B9c-Cl imala rok trajanja od 500 meseci, odnosno približno 41 godinu. Ovo je značajno poboljšanje stabilnosti.
[0127] Sa stanovišta rasta najveć e nečisto ć e (osim neprečišćavanjau relativnom vremenu zadržavanja (RTT) 1,02 metodom TFA kojom je identifikovana nečistoć a), najve ć i rast nečisto ć e posle 1 meseca za TAT-NR2B9c- Formulacija Cl je 0,17 do 0,43 (RRT 0,99 TFA metodom), dok je najveć i rast nečisto ć a za TAT-NR2B9c-Ac formulaciju fiziološkog rastvora 0,05-0,72 (1,13 RRT metodom TFA). Pretpostavljajuć i da je granica nečistoć e iznad 0,5 % na 37 °C i koriste ć i Arenhijusovu jednačinu zajedno sa podacima sa 40° C i 60 °C svake od tih nečistoć a, predviđa se da ć e formulacija fiziološkog rastvora imati rok trajanja od 8 4,8 meseci na 37 °C, dok se predviđa da ć e rok trajanja sastava TAT-NR2B9c-Cl biti > 10 godina. Stoga, bilo sa stanovišta ukupnog nivoa TAT-NR2B9c, bilo iz rasta najveć e nečisto ć e, sastav TAT-NR2B9c-Cl značajno je poboljšanje u odnosu na fiziološku formulaciju.
Primer 9: TAT-NR2B9c-Cl je stabilniji od TAT-NR2B9c-Ac u formulacijama Histidina, Trehaloze
[0128] Oba TAT-NR2B9c-Cl i TAT-NR2B9c-Ac su formulisana u 90 mg/mL u 20 mM histidina, 120 mM trehaloze pH 6,5. Tri mililitarska alikvota (270 mg) od svakog su liofilizirana u okviru istog programa kao što je predstavljeno, a po završetku su stavljeni u inkubatore na stalnu temperaturu i vlagu na -20 °C (kontrola), 40 °C i 60 °C. Nakon 4 nedelje, stabilnost svake formulacije testirana je pomoć u dve ortogonalne HPLC metode - jedna sa TFA kao nosačem i druga sa MSA kao nosačem.
[0129] Tabela 29 prikazuje relativnu površinu svakog vrha primeć enog u svakom od dva HPLC ispitivanja pri svakoj temperaturi posle jednog meseca skladištenja i u svakom relativnom vremenu zadržavanja (RRT; identitet vrha) za direktno upoređivanje. Levi panel predstavlja formulaciju TAT-NR2B9c-Ac, a desni panel prikazuje rezultate formulacije soli TAT-NR2B9c-Cl. Vrh na RRT od 1 odgovara netaknutom peptidu TAT-NR2B9c u svakom ispitivanju i koloni. I za formulacije i za metode, početne čistoć e su vrlo slične (98 % za TAT-NR2B9c-Cl vs 98,3 % za TAT-NR2B9c-Ac metodom TFA, i 99,3 % vs 99,2 % za MSA postupak). Gledajuć i podatke o temperaturi od 60 °C, kompozicija TAT-NR2B9c-Cl je značajno stabilnija od formulacije TAT-NR2B9c-Ac pomoć u obe metode. Za TFA metodu posle 1 meseca čuvanja na 60 °C, so TAT-NR2B9c-Cl zadržava 98,6 % glavnog vrha (96,64 % podeljeno sa 98 % početnog materijala), dok TAT-NR2B9c-Ac fiziološka formulacija zadržava samo 96 % polaznog materijala (94,44 % podeljeno sa 98,3% početne čistoć e). Iz MSA metode, razlika je još upečatljivija, gde so TAT-NR2B9c-Cl zadržava 99,4 % početnog materijala (98,68%/99,3%) dok TAT-NR2B9c-Ac fiziološki rastvor zadržava samo 95,6 % od početka materijala (94,81 %/ 99,2 %). Kada se pogledaju najveć e nečisto ć e za bilo koji sastav, jasno je da i za ubrzane uslove stabilnosti na 40 °C i 60 °C so TAT-NR2B9c-acetata ima već e nečisto ć e i samim tim je manje stabilna. Hloridna so TAT-NR2B9c je iznenađujuć e stabilnija od acetat soli u identičnim uslovima.
[0130] Tabela 30 prikazuje relativnu površinu svakog vrha primeć enog u svakom HPLC testu na istim uzorcima posle 11 meseci pri različitim temperaturama skladištenja. Ovi podaci podržavaju poboljšanu stabilnost formulacije soli NA-1 Cl u odnosu na NA-1-Ac sol kada je formulisana u potpuno istom puferu (20 mM histidina/120 mM trehaloze, pH 6,5). Upoređujuć i površinu glavnih NA-1 vrhova u TFA testu na 40 °C, što je ubrzano stanje pomoć u ICH navođenja za podršku skladištenja liofiliziranog leka na sobnoj temperaturi, NA-1-Cl zadržava čistoć u od 98,14 % od početne čisto ć e 98,58, dok je NA-1-Ac u fiziološkom rastvoru pao sa 98,57 čistoće na 95,91, što je ispod specifikacije čistoć e od 97 % i ne bi se smatralo stabilnom. Isti trend je primeć en za MSA test od 99,3 % čistoće do 98,71 čistoće za NA-1-Cl i 96,85 % za NA-1-Ac u fiziološkom rastvoru. Ispitivanjem rezultata čistoć e na 60 °C posle 11 meseci (Tabela 30), razlike su značajno veće, a NA-1-Cl je značajno stabilniji od NA-1-Ac (95 % čistoće za oba ispitivanja za hloridnu so u odnosu na ∼ 83% čistoće za acetatnu so). Prema tome, predviđa se da je NA-1 hloridna so iznenađujuć e i značajno stabilnija od acetatne soli u istom puferu.
Tabela 29: Stabilnost TAT-NR2B9c-Ac u odnosu na TAT-NR2B9c-Cl lipofiliziranog u 20 mM histidina 120 mM trehaloze pH 6.5 u 4 nedelje
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Hloridna so peptida koja je TAT-NR2B9c (SEK ID BR: 6) ili se razlikuje od TAT-NR2B9c za do 5 supstitucija aminokiselina, umetanjem ili brisanjem, pri čemu su anjoni već i od 99 % u hloridnoj soli.
2. Hloridna so prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je peptid TAT-NR2B9c.
3. Hloridna so prema patentnom zahtevu 1, dobijena zamenom trifluoroacetata za acetat i zatim acetat za hlorid polazeć i od soli trifluoroacetata TAT-NR2B9c.
4. Preliofilizovana formulacija obuhvatajući hloridnu so kako je definisano u bilo kom od prethodnom patentnom zahtevu, pufer i šeć er.
5. Preliofilizovana formulacija prema patentnom zahtevu 4, pri čemu acetat i trifluoroacetat svaki sadrži manje od 0,1 % težine anjona u formulaciji.
6. Preliofilizovana formulacija prema bilo kojem od patentnih zahteva od 4 do 5, pri čemu je hloridna so peptida u koncentraciji od 70-120 mg/ml, histidin je u koncentraciji od 15 do 100 mM, i trehaloza je u koncentraciji od 80 do 160 mM, ili pri čemu je hloridna so peptida u koncentraciji od 70 do 120 mg/ml, histidin je u koncentraciji od 20 do 100 mM i trehaloza je u koncentraciji od od 100 do 140 mM, ili pri čemu je Tat-NR2B9c u koncentraciji od 70 do 120 mg/ml, koncentracija histidina je od 20 do 50 mM, i koncentracija trehaloze je od 100 do 140 mM, ili pri čemu je koncentracija histidina 20 mM i koncentracija trehaloze je od 100 do 200 mM, poželjno 120 mM i koncentracija TAT-NR2B9c je 90 mg/ml.
7. Liofilizovana formulacija dobijena liofilizacijom preliofilizovane formulacije prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6.
8. Liofilizovana formulacija prema patentnom zahtevu 7, pri čemu acetat i trifluoroacetat svaki sadrži manje od 0,1 % težine anjona u formulaciji.
9. Rekonstituisana formulacija dobijena kombinovanjem liofilizovane formulacije prema bilo kojem od patentnih zahteva od 7 do 8 sa vodenim rastvorom.
10. Rekonstituisana formulacija prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je vodeni rastvor voda ili uobičajni fiziološki rastvor.
11. Rekonstituisana formulacija prema patentnom zahtevu 10, pri čemu zapremina rekonstituisane formulacije je od 3 do 6 puta zapremine preliofilizovane formulacije.
12. Postupak za pripremu formulacije, obuhvatajući
skladištenje liofilizovane formulacije prema bilo kojem od patentnih zahteva od 7 do 8 tokom najmanje nedelju dana na temperaturi od najmanje 20 °C; i
rekonstituisanje liofilizovane formulacije.
13. Postupak prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je formulacija skladištena najmanje godinu dana.
14. Postupak prema patentnom zahtevu 13, pri čemu skladištenje uključuje periode u kojima temperatura prelazi 37 °C.
15. Hloridna so prema patentnom zahtevu 1, pri čemu više od 99,5 % anjona u soli jeste hlorid.
RS20200367A 2014-05-28 2015-05-28 Hloridna so tat-nr2b9c RS60625B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462004142P 2014-05-28 2014-05-28
PCT/IB2015/053995 WO2015181756A1 (en) 2014-05-28 2015-05-28 Chloride salt of tat-nr2b9c
EP15799583.8A EP3149048B1 (en) 2014-05-28 2015-05-28 Chloride salt of tat-nr2b9c

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60625B1 true RS60625B1 (sr) 2020-09-30

Family

ID=54698210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200367A RS60625B1 (sr) 2014-05-28 2015-05-28 Hloridna so tat-nr2b9c

Country Status (27)

Country Link
US (4) US10206973B2 (sr)
EP (2) EP3757134B1 (sr)
JP (4) JP6622222B2 (sr)
KR (3) KR102311038B1 (sr)
CN (2) CN114057895A (sr)
AU (2) AU2015265487B2 (sr)
BR (1) BR112016027814A2 (sr)
CA (1) CA2950395C (sr)
CY (1) CY1122793T1 (sr)
DK (1) DK3149048T3 (sr)
ES (2) ES2784500T3 (sr)
HR (1) HRP20200462T1 (sr)
HU (1) HUE049074T2 (sr)
IL (1) IL249252B (sr)
LT (1) LT3149048T (sr)
ME (1) ME03790B (sr)
MX (2) MX374958B (sr)
PL (1) PL3149048T3 (sr)
PT (1) PT3149048T (sr)
RS (1) RS60625B1 (sr)
RU (2) RU2707885C2 (sr)
SG (2) SG10202001285XA (sr)
SI (1) SI3149048T1 (sr)
SM (1) SMT202000307T1 (sr)
UA (1) UA123820C2 (sr)
WO (1) WO2015181756A1 (sr)
ZA (1) ZA201608843B (sr)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2172211T3 (pl) * 2008-10-01 2015-05-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Kompozycja związanych z guzem peptydów i związana z tym szczepionka przeciwrakowa do leczenia glejaka (GBM) i innych rodzajów raka
US10251935B2 (en) * 2012-11-28 2019-04-09 Nono Inc. Lyophilized formulation comprising tat-NR2B9C, histidine and trehalose
GB201319446D0 (en) 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
WO2015181756A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Nono Inc. Chloride salt of tat-nr2b9c
CA2950392A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Nono Inc. Lyophilized formulation of tat-nr2b9c with acetylation scavenger
GB201511546D0 (en) 2015-07-01 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
CN108026154B (zh) 2015-07-01 2022-03-08 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于卵巢癌和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
GB201620611D0 (en) * 2016-12-05 2017-01-18 Univ Of Lancaster Treatment of neurological diseases
KR102403089B1 (ko) 2017-07-05 2022-06-02 바이오셀즈(베이징) 바이오테크 코., 엘티디. 폴리펩타이드의 약학적으로 허용 가능한 염 및 이의 용도
CN110627877A (zh) * 2019-09-25 2019-12-31 成都奥达生物科技有限公司 一种psd-95抑制剂
US20230055441A1 (en) * 2020-01-09 2023-02-23 Nono Inc. Plasmin-resistant peptides for treating stroke and related conditions
CN111560050A (zh) * 2020-05-25 2020-08-21 成都圣诺生物制药有限公司 一种Nerinetide的制备方法
US20240301003A1 (en) 2021-01-08 2024-09-12 Nono Inc. Plasmin-resistant peptides for improved therapeutic index
CN113735938B (zh) * 2021-07-30 2024-11-08 英纳氏(珠海)药业有限公司 一种神经保护多肽化合物及其应用
WO2024222819A1 (zh) 2023-04-26 2024-10-31 深圳信立泰药业股份有限公司 一种psd-95结构域抑制剂、其制备方法及其用途
WO2026012336A1 (zh) * 2024-07-08 2026-01-15 福建盛迪医药有限公司 一种psd-95多肽抑制剂的可药用盐及其制备方法

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2226575C (en) * 1995-07-27 2011-10-18 Genentech, Inc. Stabile isotonic lyophilized protein formulation
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
US7510824B2 (en) 1999-06-02 2009-03-31 Nono Inc. Method of screening peptides useful in treating traumatic injury to the brain or spinal cord
US9101590B2 (en) * 2005-07-29 2015-08-11 Yale University Defined culture conditions of human embryonic stem cells
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
EP1884521A1 (en) 2006-07-31 2008-02-06 Xigen S.A. Fusion peptide for inhibiting interaction of neuronal NMDA receptor (NMDAR) and NMDAR interacting proteins
ES2446292T3 (es) 2007-03-02 2014-03-07 Nono Inc. Tratamiento del accidente cerebrovascular y otras enfermedades sin inhibir los canales de calcio de tipo N
JP2010530846A (ja) * 2007-06-01 2010-09-16 アコロジックス インコーポレイティッド 高温で安定なペプチド製剤
US8008253B2 (en) * 2007-07-03 2011-08-30 Andrew Tasker Treatment for anxiety
DK2320927T3 (en) 2008-07-09 2015-09-14 Univ Copenhagen Modified peptides as potent inhibitors of the PSD-95 / NMDA receptor interaction
WO2010144721A2 (en) * 2009-06-10 2010-12-16 Arbor Vita Corporation Model systems and treatment regimes for treatment of neurological disease
EP2616094B1 (en) * 2010-08-12 2017-11-08 NoNO Inc. Treatment of penetrative injury to the brain
UA114592C2 (uk) * 2010-09-28 2017-07-10 Ноно Інк. Пептид nd2 та спосіб лікування неврологічного захворювання
JP6084207B2 (ja) * 2011-05-13 2017-02-22 ケベンハウンス ウニヴェルジテート（ユニバーシティ オブ コペンハーゲン）Ｋｏｅｂｅｎｈａｖｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ） 虚血性脳損傷及び疼痛治療用の効率的な神経保護剤としてのｐｓｄ−９５の高親和性二量体阻害剤
CN102241745A (zh) * 2011-05-19 2011-11-16 南京医科大学 多肽类似物Tat-HA-NR2B9C及其制备方法和应用
ES2912042T3 (es) * 2011-06-24 2022-05-24 Nono Inc Terapia de combinación para isquemia
US9241970B2 (en) * 2011-12-13 2016-01-26 Nono Inc. Therapy for subarachnoid hemorrhage and ischemia
MX364562B (es) 2011-12-13 2019-04-30 Nono Inc Terapia para hemorragia subaracnoidea e isquemia.
GB201220474D0 (en) * 2012-11-14 2012-12-26 Sagetis Biotech Sl Polypeptides
US10251935B2 (en) 2012-11-28 2019-04-09 Nono Inc. Lyophilized formulation comprising tat-NR2B9C, histidine and trehalose
CA2892965C (en) 2012-11-28 2021-06-01 Nono Inc. Lyophilized formulation of tat-nr2b9c
CA2950392A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-03 Nono Inc. Lyophilized formulation of tat-nr2b9c with acetylation scavenger
WO2015181756A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Nono Inc. Chloride salt of tat-nr2b9c

Also Published As

Publication number Publication date
RU2707885C2 (ru) 2019-12-02
AU2020267304B2 (en) 2023-10-05
EP3149048A1 (en) 2017-04-05
SI3149048T1 (sl) 2020-08-31
PL3149048T3 (pl) 2020-06-29
EP3757134B1 (en) 2024-03-06
CN106661126A (zh) 2017-05-10
CN106661126B (zh) 2021-12-10
US20170119845A1 (en) 2017-05-04
US20190175689A1 (en) 2019-06-13
AU2015265487B2 (en) 2020-08-13
RU2019138024A (ru) 2019-12-05
SG10202001285XA (en) 2020-04-29
AU2015265487A1 (en) 2017-01-12
LT3149048T (lt) 2020-05-11
EP3757134A1 (en) 2020-12-30
CA2950395A1 (en) 2015-12-03
CY1122793T1 (el) 2021-05-05
KR20220082113A (ko) 2022-06-16
RU2016150678A (ru) 2018-07-02
US11911438B2 (en) 2024-02-27
ZA201608843B (en) 2019-04-24
CA2950395C (en) 2023-03-21
HUE049074T2 (hu) 2020-08-28
CN114057895A (zh) 2022-02-18
WO2015181756A1 (en) 2015-12-03
ES2974228T3 (es) 2024-06-26
JP2022023122A (ja) 2022-02-07
US20220175880A1 (en) 2022-06-09
KR102605540B1 (ko) 2023-11-22
KR102407856B1 (ko) 2022-06-10
EP3757134C0 (en) 2024-03-06
JP2020045352A (ja) 2020-03-26
UA123820C2 (uk) 2021-06-09
BR112016027814A2 (pt) 2017-10-24
ES2784500T3 (es) 2020-09-28
IL249252A0 (en) 2017-02-28
ME03790B (me) 2021-04-20
IL249252B (en) 2021-06-30
JP2023113751A (ja) 2023-08-16
PT3149048T (pt) 2020-04-21
US11266714B2 (en) 2022-03-08
SG11201609911YA (en) 2016-12-29
KR102311038B1 (ko) 2021-10-07
US20200384071A1 (en) 2020-12-10
RU2016150678A3 (sr) 2018-12-25
KR20170020820A (ko) 2017-02-24
DK3149048T3 (en) 2020-04-14
AU2020267304C1 (en) 2024-03-14
HRP20200462T1 (hr) 2020-10-16
MX2016015457A (es) 2017-06-30
JP6622222B2 (ja) 2019-12-18
EP3149048B1 (en) 2020-01-29
JP7338890B2 (ja) 2023-09-05
MX2020009633A (es) 2020-10-08
EP3149048A4 (en) 2018-01-03
US10758589B2 (en) 2020-09-01
US10206973B2 (en) 2019-02-19
JP6961661B2 (ja) 2021-11-05
JP2017517517A (ja) 2017-06-29
KR20210125109A (ko) 2021-10-15
AU2020267304A1 (en) 2020-12-10
MX374958B (es) 2025-03-06
SMT202000307T1 (it) 2020-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11911438B2 (en) Chloride salt of TAT-NR2B9C
EP2925338B1 (en) Lyophilized formulation of tat-nr2b9c
US20220096383A1 (en) Lyophilized formulation of tat-nr2b9c with acetylation scavenger
US10912817B2 (en) Prelyophilized, lyophilized and reconstituted formulations comprising TAT-NR2B9C with d-amino acids, histidine and trehalose
HK40044216A (en) Chloride salt of tat-nr2b9c
HK1236205A1 (en) Chloride salt of tat-nr2b9c
HK1236205B (en) Chloride salt of tat-nr2b9c
HK1215793B (en) Lyophilized formulation of tat-nr2b9c