RS60649B1 - Kvasac za pripremu alkoholnih napitaka - Google Patents

Kvasac za pripremu alkoholnih napitaka

Info

Publication number
RS60649B1
RS60649B1 RS20200957A RSP20200957A RS60649B1 RS 60649 B1 RS60649 B1 RS 60649B1 RS 20200957 A RS20200957 A RS 20200957A RS P20200957 A RSP20200957 A RS P20200957A RS 60649 B1 RS60649 B1 RS 60649B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
yeast
yeast cell
ima1p
agt1
Prior art date
Application number
RS20200957A
Other languages
English (en)
Inventor
Natalia Y Solodovnikova
Jeppe Frank Andersen
Sanchez Rosa Garcia
Zoran Gojkovic
Original Assignee
Carlsberg Breweries As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carlsberg Breweries As filed Critical Carlsberg Breweries As
Publication of RS60649B1 publication Critical patent/RS60649B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C11/00—Fermentation processes for beer
    • C12C11/02—Pitching yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/04—Fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0101—Oligo-1,6-glucosidase (3.2.1.10), i.e. sucrase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C2200/00—Special features
    • C12C2200/05—Use of genetically modified microorganisms in the preparation of beer

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
  • Alcoholic Beverages (AREA)

Description

Opis
Pozadina pronalaska
[0001] Alkoholni napici se često pripremaju fermentacijom tečnosti bogate ugljenim hidratima sa kvascem. Na primer, pivo se priprema fermentacijom sladovine (wort) sa kvascem. Sladovina sadrži brojna jedinjenja, koja kvasac može da koristi. Na primer, sladovina je bogata šećerima, naročito maltozom, kao i amino-kiselinama i malim peptidima. Konvencionalni kvasac može da koristi maltozu i stoga konvencionalni kvasac može da fermentiše maltozu da proizvede etanol. Međutim, sladovina takođe sadrži druge ugljene hidrate pored maltoze, od kojih neke ne može da koristi konvencionalni kvasac, i naročito neke ne može da koristi lager kvasac.
[0002] Lager kvasac se generalno razlikuje od ejl (ale) kvasca na više načina. Lager kvasac pripada vrsti S. pastorianus. Često se lager kvasac označava kao "kvasac koji fermentiše pri dnu" pošto se taloži na dnu tokom fermentacije. Osim toga, sojevi lager kvasca su najbolji kada se upotrebljavaju na temperaturama u opsegu od 7 do 15 °C. Pored toga lager kvasac je sposoban da upotrebljava melibiozu kao jedini izvor ugljenika i ne može da raste na 37 °C.
[0003] Nasuprot tome, ejl kvasac pripada vrsti S. cerevisiae. Često se ejl kvasac označava kao "kvasac koji fermentiše pri vrhu", pošto se često podiže na površinu tokom fermentacije. Osim toga, sojevi ejl kvasca su najbolji kada se upotrebljavaju na temperaturama u opsegu od 10 do 25 °C, mada neki sojevi neće aktivno da fermentišu ispod 12 °C. Pored toga ejl kvasac nije sposoban da upotrebljava melibiozu kao jedini izvor ugljenika i može da raste na 37 °C.
[0004] Drugi kvasci se takođe mogu uposliti u pravljenju piva, npr. Saccharomyces diastaticus. Saccharomyces diastaticus pripada vrsti Saccharomyces cerevisiae varijetetu (var.) diastaticus i ima osobenost da ima enzimsku aktivnost glukoamilaze kodiranu najmanje jednim od sledećih gena STA1, STA2 ili STA3 što omogućava kvascu da koristi skrob kao jedini izvor ugljenika. STA geni su generalno odsutni u S. cerevisiae ili S. pastorianus ili drugim sojevima Saccharomyces vrste koji su analizirani, ali su prisutni u podgrupi S. cerevisiae var. diastaticus.
[0005] Deng et al., 2014, FEBS Open Bio 4, 200-212 opisuje sličnosti i razlike u biohemijskim i enzimskim svojstvima četiri izomaltaze iz Saccharomyces cerevisiae.
Specifičnije, Deng et al. istražuju njihovu funkcionalnu raznolikost, uz iscrpnu in vitro karakterizaciju njihovih enzimskih i biohemijskih svojstava.
[0006] Sanchez et al., 2012, Yeast, 29:343-355 opisuje da uzgoj lager kvasca sa Saccharomyces cerevisiae poboljšava otpornost na stres i izvođenje fermentacije.
Sažetak
[0007] Postoji potreba za poboljšanim sojevima kvasca, koji imaju karakteristike i lager kvasca (npr. S. pastorianus) kao i ejl kvasca (npr. S. cerevisiae). Pored toga, postoji potreba za sojevima kvasca, koji mogu da koriste što je moguće više različitih izvora energije. Naročito, postoji potreba za kvascima koji mogu da koriste šećere koji su prisutni u sladovini, koji nisu maltoza i kvascima koji mogu da koriste amino-kiseline i peptide u visokom stepenu. Zanimljivo je da pronalazak obezbeđuje hibridni kvasac, koji ima nekoliko važnih karakteristika lager kvasca, ali koji istovremeno može da koristi puno različitih izvora energije prisutnih u sladovini.
[0008] U skladu sa tim, aspekt pronalaska je da obezbedi ćeliju kvasca koja ima sledeće karakteristike i genotipove:
karakteristika II: sposobna da koristi panozu kao jedini izvor ugljenika; i
genotip IV: koji sadrži najmanje 3 gena koji kodiraju IMA1p, pri čemu je IMA1p odabran iz grupe koja se sastoji od IMA1p SEQ ID NO: 12, IMA1p SEQ ID NO: 13, IMA1p SEQ ID NO: 14, IMA1p SEQ ID NO: 15, IMA1p SEQ ID NO: 21, IMA1p SEQ ID NO: 22, IMA1p SEQ ID NO: 23, IMA1p SEQ ID NO: 24, IMA1p SEQ ID NO: 25 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima; i
genotip VI: koji sadrži najmanje 2 gena koji kodiraju AGT1 odabran iz grupe koja se sastoji od AGT1 SEQ ID NO: 18, AGT1 SEQ ID NO: 19, AGT1 SEQ ID NO: 20, AGT1 SEQ ID NO: 27, AGT1 SEQ ID NO: 28, AGT1 SEQ ID NO: 30, AGT1 SEQ ID NO: 31, AGT1 SEQ ID NO: 32 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima; i
karakteristika VIII: sposobna da koristi melibiozu kao jedini izvor ugljenika.
[0009] Pored gore pomenute karakteristike II ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom može imati dodatne karakteristike, na primer jednu ili više od sledećih karakteristika:
I. Sposobna da koristi izomaltozu kao jedini izvor ugljenika;
III. Sposobna da koristi jedan ili više dipeptida kao jedini izvor azota;
IV. Sposobna da koristi jedan ili više tripeptida kao jedini izvor azota;
V. Sposobna da smanji nivo jedne ili više amino-kiselina na ne više od 10% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca;
VI. Sposobna da generiše najmanje 4,7 promila etanola po °Plato, kada se navedena ćelija kvasca doda u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubira sve dok je nivo diacetila po spec; i/ili
VII. Sposobna da fermentiše šećer sa pravim stepenom fermentacije od najmanje 70, kada se navedena ćelija kvasca doda u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubira sve dok je nivo diacetila po spec.
[0010] Takođe je opisana ćelija kvasca koja ima najmanje jednu od sledećih karakteristika:
II. Sposobna da koristi panozu kao jedini izvor ugljenika;
III. Sposobna da koristi jedan ili više dipeptida kao jedini izvor azota.
[0011] Aspekt pronalaska je takođe da obezbedi ćeliju kvasca koja ima karakteristiku:
II. Sposobna da koristi panozu kao jedini izvor ugljenika.
[0012] Pored gore pomenute karakteristike II ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom može imati dodatne karakteristike, na primer jednu ili više od sledećih karakteristika:
I. Sposobna da koristi izomaltozu kao jedini izvor ugljenika;
IV. Sposobna da koristi jedan ili više tri-peptida kao jedini izvor azota;
V. Sposobna da smanji nivo jedne ili više amino-kiselina na ne više od 10% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca;
VI. Sposobna da generiše najmanje 4,7 promila etanola po °Plato, kada se navedena ćelija kvasca doda u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubira sve dok je nivo diacetila po spec; i/ili
VII. Sposobna da fermentiše šećer sa pravim stepenom fermentacije od najmanje 70, kada se navedena ćelija kvasca doda u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubira sve dok je nivo diacetila po spec.
[0013] Aspekt pronalaska je takođe da obezbedi postupke za proizvodnju napitka, navedeni postupci sadrže korake
I. Obezbeđivanje početne tečnosti
II. Obezbeđivanje ćelije kvasca u skladu sa pronalaskom
III. Fermentacija navedene početne tečnosti sa navedenom ćelijom kvasca.
Opis crteža
[0014] Slika 1 prikazuje rast različitih sojeva kvasca u definisanom medijumu sa 2 g/L panoze kao jedinim izvorom ugljenika. Prikazani podaci su reprezentativni od bioloških replikata. Panel A) prikazuje rast ejl kvasca 1, hibridnog kvasca 1, hibridnog kvasca 4 i lager kvasca 1. Panel B) prikazuje rast ejl kvasca 1, hibridnog kvasca 7 i lager kvasca 2. Panel C) prikazuje rast S. diastaticus i hibridnog kvasca 8.
[0015] Slika 2 prikazuje rast kvasca u definisanom medijumu sa 2 g/L izomaltoze kao jedinim izvorom ugljenika. Prikazani podaci su reprezentativni od bioloških replikata. Panel A) prikazuje rast ejl kvasca 1, hibridnog kvasca 1, hibridnog kvasca 4 i lager kvasca 2. Panel B) prikazuje rast ejl kvasca 1, hibridnog kvasca 7 i lager kvasca 1. Panel C) prikazuje rast S. diastaticus i hibridnog kvasca 8.
[0016] Slika 3 prikazuje rast ćelija kvasca u Bioscreen C MBR u definisanom medijumu sa 2 g/L melibioze kao jedinim izvorom ugljenika. Panel A prikazuje rast hibridnog kvasca 1 i hibridnog kvasca 4. Panel B prikazuje rast hibridnog kvasca 7.
[0017] Slika 4 prikazuje NMR analizu pojedinačnih šećera u finalnom flaširanom pivu poredeći pivo napravljeno sa lager kvascem 1 i hibridnim kvascem 1.
[0018] Slika 5 prikazuje poravnanje proteina DAL5 iz ejl kvasca 1, lager kvasca 1 i hibridnog kvasca 1. Sekvenca DAL5 hibridnog kvasca 1 je označena Sc_DAL5_Hibrid_1 (SEQ ID NO: 6).
[0019] Slika 6 prikazuje poravnanje proteina UBR1 koji je kodiran od strane Sc alela iz UBR1 ilustrujući prisustvo Sc alela lager kvasca 1 u hibridnom kvascu 1, dok je ejl kvasac 1 skraćen. Prikazan je samo deo poravnanja; ostaci osenčeni crno se razlikuju od sekvence hibridnog kvasca 1.
[0020] Slika 7 prikazuje poravnanje proteina UBR1 koji je kodiran od strane neSc alela iz UBR1 ilustrujući prisustvo Sc alela lager kvasca 1 u hibridnom kvascu 1.
[0021] Slika 8 prikazuje poravnanje proteina IMA1p koji je kodiran od strane IMA1 kratkih alela. IMA1p koji je kodiran od strane IMA1 kratkih alela koji se nalaze u hibridnom kvascu 1 označeni su IMA1_Sc_alel_kratak_A_Hibrid_1 i IMA1_Sc_ alel_kratak_B_Hibrid_1, respektivno.
[0022] Slika 9 prikazuje poravnanje proteina IMA1p koji je kodiran od strane IMA1 dugih alela. Slika 9A prikazuje poravnanje IMA1p koji je kodiran od strane dugih alela iz ejl kvasca 1, lager kvasca 1 i hibridnog kvasca 1. IMA1p koji je kodiran od strane IMA1 dugih alela koji se nalaze u hibridnom kvascu 1 označeni su DUGI_IMA1_A_Hib1_pl17 i DUGI_IMA1_B_Hib1_pl18, respektivno. Slika 9B prikazuje poravnanje IMA1p koji je kodiran od strane dugih alela iz ejl kvasca 1, lager kvasca 2, hibridnog kvasca 4 i hibridnog kvasca 7.
[0023] Slika 10 prikazuje poravnanje proteina IMA5p koji je kodiran od strane IMA5-sličnog. IMA5p koji je kodiran od strane IMA5-sličnog koji se nalazi u hibridnom kvascu 1 označeni su ScIMA5_Hibrid1_pl1 i ne-ScIMA5_Hibrid1, respektivno.
[0024] Slika 11 prikazuje poravnanje proteina AGT1 koji je kodiran od strane Sc alela iz AGT1. Slika 11A prikazuje poravnanje AGT1 koji je kodiran od strane Sc alela iz AGT1 iz lager kvasca 1, ejl kvasca 1 i hibridnog kvasca 1. AGT1 koji je kodiran od strane AGT1 koji se nalazi u hibridnom kvascu 1 označeni su Sc_AGT1_Hibrid1_pl37, Sc_AGT1_Hibrid1_pl38 i Sc_AGT1_Hibrid1_pl39, respektivno. Slika 11B prikazuje poravnanje AGT1 koji je kodiran od strane Sc alela iz AGT1 iz lager kvasca 2, ejl kvasca 1, hibridnog kvasca 4 i hibridnog kvasca 7.
[0025] Slika 12 prikazuje poravnanje proteina AGT1 koji je kodiran od strane ne-Sc alela iz AGT1. Slika 12A prikazuje poravnanje AGT1 koji je kodiran od strane ne-Sc alela iz AGT1 iz lager kvasca 1 i hibridnog kvasca 1. AGT1 koji je kodiran od strane AGT1 koji se nalazi u hibridnom kvascu 1 označen je Ne-Sc_AGT1_Hibrid1. Slika 12A prikazuje poravnanje AGT1 koji je kodiran od strane ne-Sc alela iz AGT1 iz lager kvasca 1, lager kvasca 2, hibridnog kvasca 1, hibridnog kvasca 4 i hibridnog kvasca 7.
[0026] Slika 13 prikazuje rast kvasca u definisanom medijumu sa 2 g/L maltotrioze kao jedinim izvorom ugljenika. Prikazani podaci su reprezentativni od bioloških replikata.
[0027] Slika 14 prikazuje rast kvasca u definisanom medijumu sa 2 g/L maltuloze kao jedinim izvorom ugljenika. Prikazani podaci su reprezentativni od bioloških replikata.
[0028] Slika 15 prikazuje rast kvasca u definisanom medijumu sa 2 g/L kojibioze kao jedinim izvorom ugljenika. Prikazani podaci su reprezentativni od bioloških replikata.
[0029] Slika 16 prikazuje prividni ekstrakt kao funkciju vremena tokom fermentacije sladovine sa lager kvascem 2, hibridnim kvascem 4 i hibridnim kvascem 7.
Detaljan opis
Definicije
[0030] Kao što se ovde upotrebljava, neodređeni član može značiti jedan ili više, u zavisnosti od konteksta u kom se upotrebljava.
[0031] Termin "AE" kao što se ovde upotrebljava je skraćenica od "prividni ekstrakt (Apparent Extract)". "Prividni ekstrakt" je mera gustine pivske sladovine u smislu procenta ekstrakta po težini i izražava se u Plato skali. To je krajnja gustina ili specifična gustina merena na kraju fermentacije piva. Gustina u kontekstu alkoholnih pića označava relativnu gustinu tečnosti u poređenju sa vodom. Što je više šećera rastvoreno u sladovini veća je gustina sladovine.
[0032] Amino-kiseline se ovde mogu imenovati upotrebom IUPAC jednoslovnih i troslovnih kodova.
[0033] Termin "pivo" kao što se ovde upotrebljava označava napitak pripremljen fermentacijom sladovine. Poželjno, navedenu fermentaciju obavlja kvasac.
[0034] Termin "izvor ugljenika" kao što se ovde upotrebljava označava bilo koji organski molekul, koji može obezbediti energiju kvascu i obezbeđuje ugljenik za ćelijsku biosintezu. Naročito, navedeni izvor ugljenika mogu biti ugljeni hidrati, i poželjnije, izvor ugljenika mogu biti mono- i/ili disaharidi.
[0035] Termin "ćelije u suspenziji" se ovde upotrebljava u vezi sa inkubacijom ćelija u tečnom medijumu u kontejneru. "Ćelije u suspenziji" su ćelije, koje se posle inkubacije nisu sedimentirale na dno kontejnera, već koje slobodno plutaju u tečnom medijumu. Ćelije u suspenziji se mogu odrediti uzimanjem uzorka tečnog medijuma iz gornjeg dela kontejnera, i brojanjem ćelija u njemu.
[0036] Termin "diacetil po spec." označava nivo diacetila koji je ispod unapred definisanog praga, koji je postavljen na nivo ispod praga koji se smatra nepoželjnom aromom (off-flavor) kod lager piva. Poželjno, smatra se da je diacetil po spec kada je nivo diacetila najviše 30 ppb.
[0037] Pod "kodiranjem" ili "kodiranim", u kontekstu specificirane nukleinske kiseline, se podrazumeva da sadrži informaciju za translaciju u specificirani protein. Nukleinska kiselina ili polinukleotid koji kodira protein može da sadrži ne-translatirajuće sekvence, npr. introne, unutar translatirajućih regiona nukleinske kiseline, ili im mogu nedostajati takve umetnute netranslatirajuće sekvence, npr. u cDNA. Informacija pomoću koje je protein kodiran je specificirana upotrebom kodona.
[0038] Kao što se ovde upotrebljava, "ekspresija" u kontekstu nukleinskih kiselina treba da se razume kao transkripcija i akumulacija sens iRNK ili antisens RNK izvedenih iz fragmenta nukleinske kiseline. "Ekspresija" upotrebljena u kontekstu proteina označava translaciju iRNK u polipeptid.
[0039] Termin "gen" znači segment DNK koji je uključen u proizvodnju polipeptidnog lanca; uključuje regione koji prethode i slede kodirajućem regionu (promotor i terminator). Osim toga, neki geni kvasca takođe sadrže introne iako samo 5% gena u genomu S. cerevisae sadrži introne. Posle transkripcije u RNK, introni se uklanjaju splajsovanjem kako bi se generisala zrela informaciona RNK (iRNK).
[0040] Termin "rast" kao što se ovde upotrebljava u odnosu na kvasac, označava proces u kojem se ćelije kvasca multipliciraju. Stoga, kada ćelije kvasca rastu, povećava se broj ćelija kvasca. Broj ćelija kvasca može se odrediti bilo kojom korisnom metodom, npr. određivanjem OD (620 nm). Povećanje OD (620 nm) odgovara povećanju broja ćelija kvasca. Uslovi koji omogućavaju rast kvasca su uslovi koji ćelijama kvasca omogućavaju da povećaju broj. Takvi uslovi generalno zahtevaju prisustvo adekvatnih hranljivih materija, npr. izvora ugljenika i izvora azota kao i adekvatnu temperaturu, koja je tipično u opsegu od 5 do 40 °C.
[0041] Termin "izvor azota" kao što se ovde upotrebljava označava bilo koji molekul koji sadrži organski azot i/ili molekule koji sadrže amonijak. Naročito, navedeni izvor azota može biti izvor organskog azota, na primer peptidi, amino-kiseline, i/ili drugi amini. Izvor azota može takođe biti amonijak. Stoga, N2se ovde ne smatra za "izvor azota".
[0042] Termin "slad" označava zrna žitarica, koja su maltirana (isklijala). Maltiranje je poseban oblik klijanja zrna žitarica (npr. zrna ječma) koje se odvija pod kontrolisanim uslovima sredine - uključujući, ali ne ograničavajući se na rezervoare za natapanje i kutije za klijanje fabrike slada. Generalno maltiranje uključuje natapanje navedenih zrna, koje prati klijanje. Postupak maltiranja se može zaustaviti sušenjem zrna žitarica (npr. zrna ječma), na primer, u postupku sušenja u sušnici, koji se uobičajeno izvodi na povišenim temperaturama. Slad se može preraditi, na primer, mlevenjem i stoga se označava kao "mleveni slad" ili "brašno".
[0043] "Komljenje" je inkubacija mlevenog slada u vodi. Komljenje se poželjno izvodi na specifičnoj temperaturi, i u specifičnoj zapremini vode. Temperatura i zapremina vode su od značaja, pošto utiču na stopu smanjenja aktivnosti enzima izvedenu iz slada, i samim tim posebno količine hidrolize skroba koja se može dešavati; dejstvo proteaze takođe može biti od značaja. Komljenje se može dešavati u prisustvu dodataka, što se podrazumeva da sadrži bilo koji izvor ugljenih hidrata drugi nego slad, kao što su, ali ne ograničavajući se na, ječam, ječmeni sirupi, ili kukuruz, ili pirinač - bilo kao cela zrna ili prerađeni proizvod kao što je griz, sirupi ili skrob. Svi prethodno navedeni dodaci mogu biti upotrebljeni uglavnom kao dodatni izvor ekstrakta (sirupi se tipično doziraju tokom zagrevanja sladovine). Zahtevi za preradom dodataka u pivari zavise od stanja i tipa dodataka koji se upotrebljavaju, i naročito od temperatura želatinizacije skroba ili likvefakcije skroba. Ukoliko je temperatura želatinizacije iznad one za normalnu saharifikaciju slada, onda se skrob želatinizira i likvefikuje pre dodavanja komini.
[0044] Termin "°Plato" kao što se ovde upotrebljava označava gustinu merenu na Plato skali. Plato skala je empirijski izvedena skala hidrometra za merenje gustine piva ili sladovine u smislu procenta ekstrakta po težini. Skala izražava gustinu kao procenat šećera po težini.
[0045] Pod terminom "sladovina" podrazumeva se tečni ekstrakt slada, kao što je mleveni slad, ili zeleni slad, ili mleveni zeleni slad. U varenju (brewing) ječma, sladovina se može takođe pripremiti inkubacijom ekstrakta nemaltiranog ječma sa smešom enzima koja hidrolizuje komponente ječma. Pored navedenih ekstrakata slada ili ekstrakata izvedenih iz ječma, tečni ekstrakt se može pripremiti od slada i dodatnih komponenti (npr. pomoćnih sastojaka), kao što je dodatni materijal koji sadrži skrob delimično pretvoren u fermentabilne šećere. Sladovina se generalno dobija komljenjem, opciono je praćena "ceđenjem komine" u postupku ekstrahovanja zaostalih šećera i drugih jedinjenja iz istrošenih zrna posle komljenja sa toplom vodom. Ceđenje komine se tipično sprovodi u posudi za ceđenje komine i ispiranje (lauter tun), posudi za filtriranje komine (mash filter), ili drugom uređaju koji omogućava odvajanje ekstrahovane vode od istrošenih zrna. Sladovina dobijena posle komljenja generalno se označava kao "prva sladovina", dok se sladovina dobijena posle ceđenja komine generalno označava kao "druga sladovina". Ukoliko nije specificirano, termin sladovina može biti prva sladovina, druga sladovina, ili kombinacija obe. Tokom konvencionalne proizvodnje piva, sladovina se kuva zajedno sa hmeljom, međutim ovde su opisani postupci za smanjivanje kuvanja ili izbegavanje kuvanja sladovine. Sladovina bez hmelja, može se takođe označiti kao "slatka sladovina", dok se sladovina koja se kuva/zagreva sa hmeljom može označiti kao "kuvana sladovina".
[0046] Termin "ćelija kvasca sposobna da koristi XX" kao što se ovde upotrebljava označava ćeliju kvasca, koja može da unese i razgradi XX.
[0047] Termin "ćelija kvasca sposobna da koristi XX kao jedini izvor ugljenika" kao što se ovde upotrebljava označava ćeliju kvasca, koja može da raste na medijumu koji sadrži XX kao jedini izvor ugljenika. Stoga, navedeni medijum poželjno ne sadrži nijedan drugi ugljeni hidrat osim XX.
Ćelija kvasca
[0048] Predmetni pronalazak se odnosi na ćeliju kvasca koja ima karakteristike II i VIII opisane ovde ispod.
[0049] Naročito je poželjno da navedena ćelija kvasca ima najmanje karakteristike I i II opisane ovde ispod.
[0050] Takođe je poželjno da navedena ćelija kvasca ima najmanje karakteristiku II opisanu ovde ispod. Takođe je poželjno da ćelija kvasca ima najmanje karakteristike II i III opisane ispod.
[0051] Karakteristika I može biti bilo koja od karakteristika I koje su opisane u odeljku "Karakteristika I" ovde ispod. Naročito karakteristika I može biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi izomaltozu kao jedini izvor ugljenika.
[0052] Karakteristika II može biti bilo koja od karakteristika V koje su opisane u odeljku "Karakteristika II" ovde ispod. Naročito karakteristika II može biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi panozu kao jedini izvor ugljenika.
1
[0053] Karakteristika III može biti bilo koja od karakteristika III koje su opisane u odeljku "Karakteristika III" ovde ispod. Naročito karakteristika III može biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi dipeptide kao jedini izvor azota.
[0054] Karakteristika IV može biti bilo koja od karakteristika IV koje su opisane u odeljku "Karakteristika IV" ovde ispod. Naročito karakteristika IV može biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi tripeptide kao jedini izvor azota.
[0055] Karakteristika V može biti bilo koja od karakteristika V koje su opisane u odeljku "Karakteristika III" ovde ispod. Naročito karakteristika III može biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo jedne ili više amino-kiselina na ne više od 10% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca.
[0056] Karakteristika VI može biti bilo koja od karakteristika VI koje su opisane u odeljku "Karakteristika VI" ovde ispod. Naročito karakteristika VI može biti da je ćelija kvasca sposobna da generiše najmanje 4,7 promila etanola po °Plato, kada se navedena ćelija kvasca doda u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubira sve dok je nivo diacetila po spec.
[0057] Karakteristika VII može biti bilo koja od karakteristika VII koje su opisane u odeljku "Karakteristika VII" ovde ispod. Naročito karakteristika VII može biti da je ćelija kvasca sposobna da fermentiše šećer sa pravim stepenom fermentacije od najmanje 70, kada se navedena ćelija kvasca doda u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubira sve dok je nivo diacetila po spec.
[0058] Karakteristika XI može biti bilo koja od karakteristika XI koje su opisane u odeljku "Karakteristika XI" ovde ispod. Naročito karakteristika XI može biti da je ćelija kvasca sposobna da fermentiše sladovinu sa vremenom primarne fermentacije od najviše 4 dana.
[0059] Ćelija kvasca može imati jednu ili više od karakteristika. Stoga, ćelija kvasca može imati najmanje dve, poželjno najmanje tri, poželjnije najmanje četiri, još poželjnije najmanje pet, kao što je najmanje 6, kao što su sve od karakteristika I, II, III, IV, V, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati najmanje dve, poželjno najmanje tri, poželjnije najmanje četiri, još poželjnije najmanje pet, kao što je najmanje 6, kao što su sve od karakteristika I, II, III, IV, V, VI, VII i XI.
[0060] Stoga, ćelija kvasca može imati karakteristike I i II. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I i III. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I i IV. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I i V. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II i III. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II i IV. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II i V. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III i IV. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III i V. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III, IV i V. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III, IV i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III, IV i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III, IV i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III, IV, V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III, IV, V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III, IV, V i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III, IV, V, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, II, III, IV, V, VI i XI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III i IV. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III i V. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, IV i V. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, IV i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, IV i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, IV i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, IV, V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, IV, V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, IV, V i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, IV, V, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, V i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, III, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV i V. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV, V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV, V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV, V i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV, VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV, V, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV, V, VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, IV, V, VI, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, V i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, V, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, V, VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, V, VI, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, VI, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike I, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II i III. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II i IV. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II i V. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III i IV. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III i V. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III, IV i V. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III, IV i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III, IV i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III, IV i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III, IV, V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III, IV, V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III, IV, V i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III, IV, V, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III, IV, V, VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, III, IV, V, VI, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, IV i V. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, IV i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, IV i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, IV i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, IV, V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, IV, V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, IV, V i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, IV, V, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, IV, V, VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, IV, V, VI, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, V i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, V, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, V, VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, V, VI, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, VI i XI.
1
Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, VI, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike II, VII i XI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III i IV. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III i V. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III i VI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III i XI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, IV i V. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, IV i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, IV i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, IV i XI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, IV, V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, IV, V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, IV, V i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, IV, V, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, IV, V, VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, IV, V, VI, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, V i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, VI, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike III, VII i XI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike IV i V. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike IV i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike IV i VII. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike IV, V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike IV, V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike IV, V, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike IV, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike IV, VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike IV, VI, VII i XI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati karakteristike V i VI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike V i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike V i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike V, VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike V, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike VI i VII. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike VI i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike VI, VII i XI. Ćelija kvasca može takođe imati karakteristike VII i XI.
[0061] Ovde opisana ćelija kvasca može imati sve od karakteristika I, II, III, IV, V, VI i VII. Ovde opisana ćelija kvasca može imati sve od karakteristika I, II, III, IV, V, VI, VII i XI.
[0062] Pored karakteristika istaknutih iznad, ćelije kvasca mogu imati jednu ili više dodatnih karakteristika.
[0063] Stoga, pored jedne ili više od karakteristika I, II, III, IV, V, VI, VII i/ili XI, tada ćelija kvasca može takođe imati karakteristiku VIII. Karakteristika VIII može biti bilo koja od karakteristika VIII koje su opisane u odeljku "Karakteristika VIII" ovde ispod. Naročito karakteristika VIII može biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi melibiozu kao jedini izvor ugljenika.
[0064] Pored jedne ili više od karakteristika I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII i/ili XI, tada ćelija kvasca može takođe imati karakteristiku IX. Karakteristika IX može biti bilo koja od karakteristika IX koje su opisane u odeljku "Karakteristika IX" ovde ispod. Naročito karakteristika IX može biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi disaharide i/ili trisaharide kao jedini izvor ugljenika.
[0065] Pored jedne ili više od karakteristika I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX i/ili XI, tada ćelija kvasca može takođe imati karakteristiku X. Karakteristika X može biti bilo koja od karakteristika X koje su opisane u odeljku "Karakteristika X" ovde ispod. Naročito karakteristika X može biti da ćelija kvasca ima samo mali broj ćelija u suspenziji.
[0066] Ovde opisana ćelija kvasca može imati sve od karakteristika I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X i XI.
[0067] Ćelija kvasca može biti ćelija kvasca bilo koje pogodne vrste. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska ćelija kvasca je hibrid između ćelije kvasca vrste S. pastorianus i ćelije kvasca vrste S. cerevisiae.
Karakteristika I
[0068] Ovde opisana ćelija kvasca može imati karakteristiku I, pri čemu je karakteristika I da je ćelija kvasca sposobna da koristi izomaltozu. Stoga, nako inkubacije u medijumu koji sadrži izomaltozu, tada je navedena ćelija kvasca sposobna da ukloni najmanje deo navedene izomaltoze.
[0069] Poželjnije karakteristika I je da je ćelija kvasca sposobna da koristi izomaltozu kao jedini izvor ugljenika. Stoga, ćelija kvasca je sposobna da raste u medijumu koji sadrži izomaltozu kao jedini izvor ugljenika. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje mono- i/ili disaharide osim izomaltoze, i poželjnije takav medijum ne sadrži bilo koje ugljene hidrate osim izomaltoze. Čak i ukoliko je ćelija kvasca sposobna da fermentiše izomaltozu, to ne mora nužno da znači da je navedena ćelija kvasca sposobna da koristi izomaltozu kao jedini izvor ugljenika. Stoga, poželjno je da je ćelija kvasca sposobna i da koristi izomaltozu, i da koristi izomaltozu kao jedini izvor ugljenika.
1
[0070] Naročito karakteristika I može biti da je ćelija kvasca sposobna da raste u medijumu koji sadrži izomaltozu kao jedini izvor ugljenika u opsegu od 1 do 5 g/L, na primer u opsegu od 1 do 3 g/L, kao što je 2 g/L. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje ugljene hidrate osim navedene koncentracije izomaltoze.
[0071] Jedan koristan postupak za određivanje da li je ćelija kvasca sposobna da koristi izomaltozu kao jedini izvor ugljenika opisan je ovde ispod u Primeru 5.
[0072] Ćelije kvasca koje imaju karakteristiku I, poželjno takođe imaju jedan ili više od genotipova IV, V i VI, poželjnije sve od genotipova IV, V i VI opisanih ispod.
Karakteristika II
[0073] Ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom ima karakteristiku II, pri čemu je karakteristika II da je ćelija kvasca sposobna da koristiti panozu kao jedini izvor ugljenika. Stoga, nakon inkubacije u medijumu koji sadrži panozu, tada je navedena ćelija kvasca sposobna da ukloni najmanje deo navedene panoze. Poželjno, navedena ćelija kvasca je sposobna da ukloni (npr. sposobna da fermentiše) najmanje 45%, kao što je najmanje 50%, na primer najmanje 60% panoze u navedenom medijumu. Navedeni medijum može naročito biti sladovina. Poželjno, navedena ćelija kvasca je sposobna da ukloni prethodno navedenu količinu panoze kada se inkubira u navedenoj sladovini dok je diacetil po spec, npr. tokom 4 do 6 dana, npr. tokom 5 dana. Inkubacija, na primer, može biti na 16 do 18 °C. Stoga, navedena ćelija kvasca može biti sposobna da ukloni najmanje 45%, kao što je najmanje 50%, na primer najmanje 60% panoze prisutne u sladovini kada se određuje fermentacijom sladovine kao što je opisano ovde ispod u Primeru 5.
[0074] Ćelija kvasca je sposobna da raste u medijumu koji sadrži panozu kao jedini izvor ugljenika. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje mono-, di- i/ili trisaharide osim panoze, i poželjnije takav medijum ne sadrži bilo koje ugljene hidrate osim panoze.
[0075] Čak i ukoliko je ćelija kvasca sposobna da fermentiše panozu, to ne mora nužno da znači da je navedena ćelija kvasca sposobna da koristi panozu kao jedini izvor ugljenika. Ćelija kvasca može biti sposobna i da koristi panozu, i da koristi panozu kao jedini izvor ugljenika.
[0076] Naročito karakteristika II može biti da je ćelija kvasca sposobna da raste u medijumu koji sadrži panozu kao jedini izvor ugljenika u opsegu od 1 do 5 g/L, na primer u opsegu od 1 do 3 g/L, kao što je 2 g/L. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje ugljene hidrate osim navedene koncentracije panoze.
1
[0077] Jedan koristan postupak za određivanje da li je ćelija kvasca sposobna da koristi panozu kao jedini izvor ugljenika opisan je ovde ispod u Primeru 5.
[0078] Ćelije kvasca koje imaju karakteristiku II, poželjno takođe imaju jedan ili više od genotipova IV, V i VI, poželjnije sve od genotipova IV, V i VI opisanih ispod.
Karakteristika III
[0079] Ovde opisana ćelija kvasca može imati karakteristiku III, pri čemu je karakteristika III da je ćelija kvasca sposobna da koristi dipeptide. Stoga, nakon inkubacije u medijumu koji sadrži dipeptide, tada je navedena ćelija kvasca sposobna da ukloni najmanje deo navedenih dipeptida.
[0080] Poželjnije karakteristika III je da jećelija kvasca sposobna da koristi dipeptide kao jedini izvor azota. Stoga, ćelija kvasca je sposobna da raste u medijumu koji sadrži dipeptide kao jedini izvor azota. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje amino-kiseline i peptide osim dipeptida, i poželjnije takav medijum ne sadrži bilo koje amino-kiseline, peptide i amonijak osim dipeptida.
[0081] Karakteristika III može biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi bilo koji dipeptid kao jedini izvor azota. Međutim, takođe je moguće da je navedeni kvasac sposoban da koristi samo jedan ili više specifičnih dipeptida kao jedini izvor azota.
[0082] Poželjno je da je karakteristika III da je ćelija kvasca sposobna da koristi najmanje jedan, kao što je najmanje dva, na primer najmanje tri, kao što je najmanje 4, na primer najmanje 5, kao što su svi od sledećih dipeptida:
Met-Tyr
Leu-Tyr
Val-Met
Phe-Tyr
Ile-Leu
Ile-Asn.
[0083] U jednom primeru izvođenja, karakteristika III je da je ćelija kvasca sposobna da koristi najmanje jedan, kao što je najmanje 3, na primer najmanje 5, kao što je najmanje 7, na primer najmanje 9, kao što su svi od sledećih dipeptida:
1
Gly-Arg
Ile-Asn
Lys-Tyr
Met-Lys
Val-Ala
Val-Asn
Val-Gly
Val-Gln
Val-Met
Val-Ser.
[0084] Karakteristika III može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi jedan ili više dipeptida formule Val-Xaa, pri čemu Xaa označava bilo koju amino-kiselinu. Na primer, karakteristika III može biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi najmanje 3, kao što je najmanje 4, na primer najmanje t6 različitih dipeptida formule Val-Xaa. Naročito, Xaa može biti amino-kiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Ala, Asn, Gly, Gin, Met i Ser.
[0085] Karakteristika III može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi jedan ili više dipeptida formule Ala-Xaa, pri čemu Xa označava bilo koju amino-kiselinu. Naročito, Xaa može biti amino-kiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od Glu, Gly, His i Thr. Često je sposobnost korišćenja dipeptida formule Ala-Xaa povezana sa sposobnošću korišćenja alantoata koji je intermedijer katabolizma alantoina. Stoga, poželjno je da je ćelija kvasca osim toga sposobna da koristi alantoin kao jedini izvor azota.
[0086] Karakteristika III može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi jedan ili više od sledećih dipeptida, na primer najmanje 3 od sledećih dipeptida, kao što je najmanje 5 od sledećih dipeptida, kao što su svi od sledećih dipeptida:
Met-Tyr
Leu-Tyr
Val-Met
Phe-Tyr
Ile-Leu
Ile-Asn
Ala-Xaa, pri čemu je Xaa bilo koja amino-kiselina i poželjno Xaa je Glu, Gly, His ili Thr.
1
[0087] Jedan koristan postupak za određivanje da li je ćelija kvasca sposobna da koristi dipeptide kao jedini izvor azota opisan je ovde ispod u Primeru 6. Stručna osoba će razumeti da se postupci opisani u Primeru 6 mogu upotrebljavati za testiranje da li se bilo koji dipeptid može koristiti kao jedini izvor azota zamenom testiranih dipeptida.
[0088] Ćelije kvasca koje imaju karakteristiku III, poželjno takođe imaju jedan ili više od genotipova I, II i III, poželjnije sve od genotipova I, II i III opisanih ispod.
Karakteristika IV
[0089] Ovde opisana ćelija kvasca može imati karakteristiku IV, pri čemu je karakteristika IV da je ćelija kvasca sposobna da koristi tripeptide. Stoga, nakon inkubacije u medijumu koji sadrži tripeptide, tada je navedena ćelija kvasca sposobna da ukloni najmanje deo navedenih tripeptida.
[0090] Poželjnije karakteristika IV je da je ćelija kvasca sposobna da koristi tripeptide kao jedini izvor azota. Stoga, ćelija kvasca je sposobna da raste u medijumu koji sadrži tripeptide kao jedini izvor azota. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje amino-kiseline i peptide osim tripeptida, i poželjnije takav medijum ne sadrži bilo koje amino-kiseline, peptide i amonijak osim tripeptida.
[0091] Karakteristika IV može biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi bilo koji tripeptid kao jedini izvor azota. Međutim, takođe je moguće da je navedeni kvasac sposoban da koristi samo jedan ili više specifičnih tripeptida kao jedini izvor azota.
[0092] Poželjno je da je karakteristika IV da je ćelija kvasca sposobna da koristi tripeptid Gly-Gly-Gly kao jedini izvor azota.
[0093] Jedan koristan postupak za određivanje da li je ćelija kvasca sposobna da koristi tripeptide kao jedini izvor azota opisan je ovde ispod u Primeru 6. Stručna osoba će razumeti da se postupci opisani u Primeru 6 mogu upotrebljavati za testiranje da li se bilo koji tripeptid može koristiti kao jedini izvor azota zamenom testiranih tripeptida.
[0094] Ćelije kvasca koje imaju karakteristiku IV, poželjno takođe imaju jedan ili više od genotipova I, II i III, poželjnije najmanje genotipove II i III opisane ispod.
Karakteristika V
1
[0095] Ovde opisana ćelija kvasca može imati karakteristiku V, pri čemu je karakteristika V visoko iskorišćavanje amino-kiselina.
[0096] Generalno poželjno je da je ovde opisana ćelija kvasca sposobna da koristi aminokiseline u visokom stepenu. Ovim se osigurava i iskorišćavanje energije pohranjene u aminokiselinama, kao što se osigurava i nizak nivo amino-kiselina posle fermentacije. Stoga, ukoliko se navedeni kvasac upotrebljava za pripremu piva, tada će krajnje pivo imati nizak nivo amino-kiselina. Štrekerovi (Strecker) aldehidi su važni sastojci "odležale" arome piva koji delom potiču i od amino-kiselina samog flaširanog piva. Amino-kiseline za koje je pokazano da učestvuju u stvaranju Štrekerovih aldehida sa niskim senzornim pragom uključuju valin, izoleucin, leucin, metionin i fenilalanin (Tabela 2). Formiranje Štrekerovih aldehida igra presudnu ulogu pošto povećanje njihove koncentracije daje sve veću senzornu percepciju "odlažalih ukusa".
[0097] U skladu sa tim, prednost kvasca u skladu sa ovde opisanim je da je ćelija kvasca sposobna da koristi amino-kiseline u višem stepenu i od konvencionalnih lager kvasca i ejl kvasaca.
[0098] Stoga, poželjno je da ovde opisane ćelije kvasca imaju karakteristiku V, pri čemu je karakteristika V da su navedene ćelije kvasca sposobne da smanje nivo jedne ili više aminokiselina na ne više od 10% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Naročito, karakteristika V može biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo najmanje 12, kao što je najmanje 13, na primer najmanje 14 različitih amino-kiselina na manje od 10% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Na primer, ćelija kvasca može biti u mogućnosti da smanji u opsegu od 12 do 20, kao što je u opsegu od 14 do 20 amino na ne više od 10% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca.
[0099] Karakteristika V može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji ukupni nivo amino-kiselina na manje od 30%, kao što je manje od 25% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca.
[0100] Karakteristika V može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo jedne ili više amino-kiselina na ne više od 5% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Naročito, karakteristika V može biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo najmanje 10, kao što je najmanje 11, na primer najmanje 13 različitih amino-kiselina na manje od 5% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca.
2
[0101] Karakteristika V može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo jedne ili više amino-kiselina na ne više od 1% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Naročito, karakteristika V može biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo najmanje 5, kao što je najmanje 6, na primer najmanje 7 različitih amino-kiselina na manje od 1% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca.
[0102] Karakteristika V može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo jedne ili više amino-kiselina koje stvaraju Štrekerov aldehid. Stoga, karakteristika V može biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo Met na manje od 10%, poželjno manje od 5%, još poželjnije na najviše 2%, i još poželjnije na manje od 1% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Naročito, ćelija kvasca može biti sposobna da ukloni suštinski sav Met posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Karakteristika V može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo Val na manje od 10%, poželjno manje od 5%, još poželjnije na najviše 2% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Karakteristika V može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo Ile na manje od 10%, poželjno manje od 5%, još poželjnije na najviše 2%, i još poželjnije na manje od 1% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Naročito, ćelija kvasca može biti sposobna da ukloni suštinski sav Ile posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Karakteristika V može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo Leu na manje od 10%, poželjno manje od 5%, još poželjnije na najviše 2% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Karakteristika V može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo Phe na manje od 10%, poželjno manje od 5%, još poželjnije na najviše 2%, i još poželjnije na manje od 1% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Naročito, ćelija kvasca može biti sposobna da ukloni suštinski sav Phe posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca.
[0103] Termin "da ukloni suštinski sav" se ovde upotrebljava da označi da je amino-kiselina uklonjena do nivoa koji je ispod nivoa detekcije, kada se detekcija izvodi pomoću UPLC.
[0104] Ovde je takođe opisano da je karakteristika V da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo najmanje 2, poželjno najmanje 3, poželjnije najmanje 4, još poželjnije svih aminokiselina Met, Val, Ile, Leu i Phe na manje od 10%, poželjno manje od 5%, još poželjnije na najviše 2% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca.
[0105] Karakteristika V može takođe biti da su ćelije kvasca sposobne da koriste najmanje 80% od najmanje jedne od amino-kiselina Met, Val, Ile, Leu i Phe, kada se navedena ćelija kvasca doda u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubira dok je nivo diacetila po spec.
[0106] Takođe je poželjno da ovde opisane ćelije kvasca imaju karakteristiku V, pri čemu je navedena karakteristika V da su ćelije kvasca sposobne da smanje ukupan nivo aminokiselina Met, Val, Ile, Leu i/ili Phe na najviše 400 mg/L, kao što je najviše 100 mg/L, kao što je najviše 50 mg/L, na primer na najviše 10 mg/L posle inkubacije tokom 6 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedene ćelije kvasca.
[0107] Karakteristika V može takođe biti kombinacija bilo kojih od prethodno pomenutih karakteristika V opisanih u ovom odeljku. Stoga, na primer, karakteristika V može biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo najmanje 12, kao što je najmanje 13, na primer najmanje 14 različitih amino-kiselina na manje od 10% i da je sposobna da smanji ukupan nivo amino-kiselina na manje od 30%, kao što je manje od 25% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Karakteristika V može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo najmanje 10 amino-kiselina na manje od 5% i da je sposobna da smanji ukupan nivo amino-kiselina na manje od 30%, kao što je manje od 25% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Karakteristika V može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da smanji nivo najmanje 5 amino-kiselina na manje od 1% i da je sposobna da smanji ukupan nivo amino-kiselina na manje od 30%, kao što je manje od 25% od početne koncentracije posle inkubacije tokom 5 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca. Uslovi koji omogućavaju rast navedenih ćelija kvasca opisani su ovde ispod u odeljku "Postupak za proizvodnju napitka". Navedeni uslovi mogu biti bilo koji od uslova fermentacije opisani u tom odeljku. Npr. navedeni uslovi mogu biti inkubacija na temperaturi u opsegu od 10 do 20 °C u sladovini. Nivo amino-kiselina može se odrediti bilo kojim korisnim postupkom, npr. upotrebom HPLC ili UPLC. Korisni postupci za određivanje da li ćelija kvasca ima visoko iskorišćavanje amino-kiselina opisani su ovde ispod u Primerima 4 i 9.
Karakteristika VI
[0108] Ovde opisana ćelija kvasca može imati karakteristiku VI, pri čemu je karakteristika VI visoka proizvodnja alkohola. Pošto je količina alkohola koju proizvodi određena ćelija kvasca pod velikim uticajem početnog materijala, poželjno je da je karakteristika I da je ćelija kvasca sposobna da generiše najmanje 4,7 promila etanola po °Plato. °Plato je mera gustine tečnosti, i stoga ukazuje na nivo šećera i drugih fermentibilnih hranljivih materija.
[0109] Naročito, poželjno je da je ćelija kvasca sposobna da generiše najmanje 4,7 promila etanola po °Plato, kada se navedena ćelija kvasca doda u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubira dok je nivo diacetila po spec.
[0110] Poželjno, smatra se da je diacetil po spec kada je nivo diacetila najviše 30 ppb.
Karakteristika VII
[0111] Ovde opisana ćelija kvasca može imati karakteristiku VII, pri čemu je karakteristika VII visok pravi stepen fermentacije (real degree of fermentation - RDF).
[0112] RDF meri stepen do kog je šećer u početnoj tečnosti fermentisan u alkohol. Stoga, ukoliko je početna tečnost sladovina RDF meri stepen do kog je šećer u sladovini fermentisan u alkohol u rezultujućem pivu.
[0113] Poželjno je da ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom ima karakteristiku VII, pri čemu je karakteristika VII da je ćelija kvasca sposobna da fermentiše šećer sa RDF od najmanje 68%, kao što je najmanje 69%, na primer najmanje 70%, i poželjnije sa RDF od najmanje 71%.
[0114] Naročito je poželjno da je ćelija kvasca sposobna da fermentiše šećer sa RDF koji je veći od RDF najmanje jednog od roditeljskih sojeva. Stoga, ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom može biti hibridna ćelija kvasca, koja je sposobna da fermentiše šećer sa RDF koji je najmanje 1% veći, na primer najmanje 2% veći od RDF jednog od roditeljskih sojeva. Naročito ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom može biti hibrid između roditeljskog soja S. pastorianus i roditeljskog soja S. cerevisiae. U takvim primerima izvođenja, ćelija kvasca može biti sposobna da fermentiše šećer sa RDF najmanje 1% višim od RDF roditeljskog soja S. pastorianus. Ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom može takođe biti hibrid između roditeljskog soja S. diastaticus i roditeljskog soja S. cerevisiae. U takvim primerima izvođenja, ćelija kvasca može biti sposobna da fermentiše šećer sa RDF najmanje 1% višim, poželjno najmanje 2% višim od RDF roditeljskog soja S. diastaticus.
Karakteristika VIII
2
[0115] Ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom ima karakteristiku VIII, pri čemu je karakteristika VIII da je ćelija kvasca sposobna da koristi melibiozu kao jedini izvor ugljenika. Stoga, nakon inkubacije u medijumu koji sadrži melibiozu, tada je navedena ćelija kvasca sposobna da ukloni najmanje deo navedene melibioze.
[0116] Ćelija kvasca je sposobna da raste u medijumu koji sadrži melibiozu kao jedini izvor ugljenika. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje mono- i/ili disaharide osim melibioze, i poželjnije takav medijum ne sadrži bilo koje ugljene hidrate osim melibioze.
[0117] Jedan koristan postupak za određivanje da li je ćelija kvasca sposobna da koristi melibiozu kao jedini izvor ugljenika opisan je ovde ispod u Primeru 7.
Karakteristika IX
[0118] Ovde opisana ćelija kvasca može imati karakteristiku IX, pri čemu je karakteristika IX da je ćelija kvasca sposobna da koristi disaharide i/ili trisaharide. Stoga, nakon inkubacije u medijumu koji sadrži disaharide i/ili trisaharide, tada je navedena ćelija kvasca sposobna da ukloni najmanje deo navedenih disaharida i/ili trisaharida.
[0119] Poželjnije karakteristika IX je da je ćelija kvasca sposobna da koristi disaharide i/ili trisaharide kao jedini izvor ugljenika. Stoga, ćelija kvasca je sposobna da raste u medijumu koji sadrži disaharide i/ili trisaharide kao jedini izvor ugljenika. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje saharide osim disaharida i/ili trisaharida.
[0120] Karakteristika IX može biti da je ćelija kvasca sposobna da koristi bilo koji disaharid i trisaharid kao jedini izvor ugljenika. Međutim, takođe je moguće da je navedeni kvasac sposoban da koristi samo jedan ili više specifičnih disaharida i/trisaharida kao jedini izvor ugljenika. Kao što je opisano iznad poželjno je da su ćelije kvasca sposobne da koriste izomaltozu (karakteristika I), panozu (karakteristika II), i/ili melibiozu (karakteristika VIII).
[0121] Stoga, karakteristika IX je poželjno da je ćelija kvasca sposobna da koristi jedan ili više disaharida i/ili trisaharida, koji nije izomaltoza, panoza, ili melibioza. Stoga, karakteristika IX može biti da je ćelija kvasca sposobna da korist jedan ili više disaharida i/ili trisaharida pored izomaltoze, panoze, ili melibioze. Ćelija kvasca može stoga biti sposobna da koristi jedan ili više disaharida i/ili trisaharida, koji nije izomaltoza, panoza, ili melibioza kao jedini izvor ugljenika, i pored toga navedena ćelija kvasca može imati jednu ili više od karakteristika I, II ili VIII.
[0122] Poželjno je da je karakteristika IX da je ćelija kvasca sposobna da koristi najmanje jedan, kao što je najmanje dva, na primer najmanje tri, kao što je najmanje 4, na primer najmanje 5, kao što su svi disaharidi odabrani iz grupe koja se sastoji od kojibioze, nigeroze, saharoze, turanoze, leukroze, i palatinoze kao jedini izvor ugljenika.
[0123] Takođe je poželjno da je karakteristika IX da je ćelija kvasca sposobna da koristi maltotriozu i/ili izomaltotriozu kao jedini izvor ugljenika.
[0124] Stoga, ćelije kvasca mogu biti sposobne da koriste maltotriozu kao jedini izvor ugljenika. Stoga, ćelija kvasca može biti sposobna da raste u medijumu koji sadrži maltotriozu kao jedini izvor ugljenika. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje mono- i/ili disaharide i/ili trisaharide osim maltotrioze, i poželjnije takav medijum ne sadrži bilo koje ugljene hidrate osim maltotrioze.
[0125] Naročito karakteristika IX može biti da je ćelija kvasca sposobna da raste u medijumu koji sadrži maltotriozu kao jedini izvor ugljenika u opsegu od 1 do 5 g/L, na primer u opsegu od 1 do 3 g/L, kao što je 2 g/L. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje ugljene hidrate osim navedene koncentracije maltotrioze.
[0126] Mnoge ćelije kvasca, npr. mnoge ćelije lager kvasca nisu sposobne da koriste maltotriozu kao jedini izvor ugljenika, naročito mnoge ćelije lager kvasca nisu sposobne da koriste maltotriozu kao jedini izvor ugljenika, kada je maltotrioza prisutna samo na niskim nivoima.
[0127] Ćelije kvasca mogu biti sposobne da koriste maltulozu kao jedini izvor ugljenika. Stoga, ćelija kvasca može biti sposobna da raste u medijumu koji sadrži maltulozu kao jedini izvor ugljenika. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje mono- i/ili disaharide osim maltuloze, i poželjnije takav medijum ne sadrži bilo koje ugljene hidrate osim maltuloze.
[0128] Naročito karakteristika IX može biti da je ćelija kvasca sposobna da raste u medijumu koji sadrži maltulozu kao jedini izvor ugljenika u opsegu od 1 do 5 g/L, na primer u opsegu od 1 do 3 g/L, kao što je 2 g/L. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje ugljene hidrate osim navedene koncentracije maltuloze.
[0129] Mnoge ćelije kvasca, npr. mnoge ćelije lager kvasca nisu sposobne da koriste maltulozu kao jedini izvor ugljenika.
[0130] Ćelije kvasca mogu biti sposobne da koriste kojibiozu kao jedini izvor ugljenika. Stoga, ćelija kvasca može biti sposobna da raste u medijumu koji sadrži kojibiozu kao jedini izvor ugljenika. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje mono- i/ili disaharide osim kojibioze, i poželjnije takav medijum ne sadrži bilo koje ugljene hidrate osim kojibioze.
2
[0131] Naročito karakteristika IX može biti da je ćelija kvasca sposobna da raste u medijumu koji sadrži kojibiozu kao jedini izvor ugljenika u opsegu od 1 do 5 g/L, na primer u opsegu od 1 do 3 g/L, kao što je 2 g/L. Takav medijum poželjno ne sadrži bilo koje ugljene hidrate osim navedene koncentracije kojibioze.
[0132] Mnoge ćelije kvasca, npr. mnoge ćelije lager kvasca nisu sposobne da koriste kojibiozu kao jedini izvor ugljenika.
[0133] Stoga, ovde opisane ćelije kvasca mogu biti sposobne da koriste jedan ili više od disaharida i/ili trisaharida opisanih u Tabeli 13.
Tabela 13
2
[0134] Korisni postupci za određivanje da li je ćelija kvasca sposobna da koristi disaharide i/ili trisaharide opisani su ovde ispod u Primerima 8 i 11. Koristan postupak za određivanje da li je ćelija kvasca sposobna da koristi disaharide i/ili trisaharide kao jedini izvor ugljenika opisan je ovde ispod u Primeru 5. Stručna osoba će razumeti da se postupci opisani u Primeru 5 mogu upotrebljavati za testiranje da li se bilo koji disaharid i/ili trisaharid može koristiti kao jedini izvor ugljenika zamenom panoze/izomaltoze, sa disaharidom i/ili trisaharidom koji treba testirati.
[0135] Ćelije kvasca koje imaju karakteristiku IX, poželjno takođe imaju jedan ili više od genotipova IV, V i VI, poželjnije sve od genotipova IV, V i VI opisanih ispod.
Karakteristika X
[0136] Ovde opisana ćelija kvasca može imati karakteristiku X, pri čemu je karakteristika X da ćelija kvasca ima samo mali broj ćelija u suspenziji, naročito ćelija kvasca ima mali broj ćelija u suspenziji posle inkubacije u tečnom medijumu u kontejneru. Navedena inkubacija je poželjno inkubacija tokom 1 do 14 dana, kao što je od 2 do 10 dana, na primer od 4 do 8 dana, na primer od 4 do 6 dana.
[0137] Naročito je poželjno da je karakteristika X da je najviše 12 miliona, kao što je najviše 10 miliona ćelija/ml u suspenziji posle inkubacije tokom 4 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedene ćelije kvasca. Stoga, karakteristika X može biti da je najviše 12 miliona, kao što je najviše 10 miliona ćelija/ml u suspenziji, kada je navedena ćelija kvasca dodata u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubirana tokom 4 dana. Karakteristika X može takođe biti da je najviše 12 miliona, kao što je najviše 10 miliona ćelija/ml u suspenziji, kada je navedena ćelija kvasca dodata u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubirana tokom 5 dana. Karakteristika X takođe može biti da je najviše 12 miliona, kao što je najviše 10 miliona ćelija/ml u suspenziji, kada je navedena ćelija kvasca dodata u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubirana tokom 6 dana. Navedena inkubacija može, na primer, biti na temperaturi u opsegu od 10 do 20 °C, kao što je u opsegu od 10 do 18 °C, na primer na 16 °C ili 18 °C. Početna koncentracija ćelija kvasca može biti na primer u opsegu od 10 do 20 mil ćelija/ml, npr. u opsegu od 14 do 15 mil ćelija/ml.
[0138] Takođe može biti poželjno da karakteristika X može biti da ćelija kvasca ima broj ćelija u suspenziji po ml koji je najviše 80%, kao što je najviše 70%, na primer najviše 60%,
2
kao što je najviše 50%, na primer najviše 40% od početnog broja ćelija po ml posle 4 do 6 dana, kao što je tokom 5 dana inkubacije pod uslovima koji omogućavaju rast navedenih ćelija.
[0139] Na primer, karakteristika X može biti da ćelija kvasca ima broj ćelija u suspenziji po ml koji je najviše 80%, kao što je najviše 70%, na primer najviše 60%, kao što je najviše 50%, na primer najviše 40% od početnog broja ćelija po ml posle 4 do 6 dana, kao što je tokom 5 dana inkubacije u kompoziciji sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato. Karakteristika X može takođe biti da ćelija kvasca ima broj ćelija u suspenziji po ml koji je najviše 80%, kao što je najviše 70%, na primer najviše 60%, kao što je najviše 50%, na primer najviše 40% od početnog broja ćelija po ml posle 6 dana inkubacije u kompoziciji sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato. Navedena inkubacija može, na primer, biti na temperaturi u opsegu od 15 do 20 °C, kao što je u opsegu od 10 do 18 °C, na primer na 16 °C ili 18 °C.
[0140] U jednom primeru izvođenja karakteristika X je da je najviše 25 miliona, poželjno najviše 20 miliona ćelija/ml u suspenziji posle inkubacije tokom 7 dana pod uslovima koji omogućavaju rast navedene ćelije kvasca. Stoga, karakteristika X može biti da je najviše 25 miliona, kao što je najviše 20 miliona ćelija/ml u suspenziji, kada je navedena ćelija kvasca dodata u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubirana tokom 7 dana na 18 °C.
[0141] Jedan koristan postupak za određivanje ćelija u suspenziji opisan je ovde ispod u Primeru 2.
Karakteristika XI
[0142] Ovde opisana ćelija kvasca može imati karakteristiku XI, pri čemu je karakteristika XI da je ćelija kvasca sposobna da fermentiše sladovinu sa vremenom primarne fermentacije od najviše 4 dana.
[0143] Karakteristika XI može biti da je ćelija kvasca sposobna da fermentiše sladovinu sa vremenom primarne fermentacije od najviše 3,5 dana.
[0144] Karakteristika XI može biti da je ćelija kvasca sposobna da fermentiše sladovinu sa vremenom primarne fermentacije od najviše 3 dana.
[0145] Karakteristika XI može takođe biti da je ćelija kvasca sposobna da fermentiše sladovinu sa vremenom primarne fermentacije, koje je najmanje jedan dan kraće od vremena primarne fermentacije najmanje jednim od roditeljskih sojeva pod istim uslovima. Stoga,
2
ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom može biti hibridna ćelija kvasca, koja je sposobna da fermentiše sladovinu sa vremenom primarne fermentacije, koje je najmanje jedan dan kraće od vremena primarne fermentacije najmanje jednim od roditeljskih sojeva pod istim uslovima. Naročito ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom može biti hibrid između roditeljskog soja S. pastorianus i roditeljskog soja S. cerevisiae. U takvim primerima izvođenja, ćelija kvasca može biti sposobna da fermentiše sladovinu sa vremenom primarne fermentacije, koje je najmanje jedan dan kraće od vremena primarne fermentacije roditeljskim sojem S. pastorianus pod istim uslovima.
[0146] Navedena sladovina može biti bilo koja standardna sladovina, ali je poželjno sladovina sa sadržajem šećera od najmanje 10° Plato. Stoga, navedena sladovina može naročito biti sladovina koja ima sadržaj šećera u opsegu od 10° Plato do 20° Plato. Naročito, navedena sladovina može biti sladovina koja ima sadržaj šećera od 14 do 16° Plato.
[0147] Termin "vreme primarne fermentacije" je vreme od dodavanja kvasca u sladovinu do završetka primarne fermentacije. Primarna fermentacija se smatra završenom kada je prividni ekstrakt stabilan i/ili kada više ne postoji aktivno ispuštanje CO2. Prividni ekstrakt se smatra stabilnim kada se prividni ekstrakt između dva merenja ne menja za više od /- 15%, poželjno ne za više od /- 10%.
[0148] Kvasac se može dodati na bilo kom korisnom nivou, na primer na 10 do 20 mil vijabilnih ćelija/ml, kao što je 13 do 16 mil vijabilnih ćelija/ml, na primer 14-15 mil vijabilnih ćelija/ml.
[0149] Vreme primarne fermentacije može se odrediti na temperaturi na kojoj je ćelija kvasca sposobna da raste. Stoga se vreme primarne fermentacije može odrediti na temperaturi u opsegu od 10 do 25 °C, poželjno na temperaturi u opsegu od 12 do 20 °C, na primer u opsegu od 14 do 18 °C.
[0150] Jedan postupak za određivanje vremena primarne fermentacije opisan je u Primeru 3 ovde ispod.
Genetička pozadina
[0151] Ovde opisane ćelije kvasca mogu imati jednu ili više od karakteristika I do XI opisanih ovde iznad.
[0152] Pored navedenih karakteristika, ovde opisana ćelija kvasca može imati jedan ili više od genotipova I do VI opisanih ovde ispod. Navedeni genotipovi mogu se povezati sa karakteristikama istaknutim iznad.
2
[0153] Ovde opisana ćelija kvasca može najmanje da ima genotip IV opisan ovde ispod. Pored toga što ima genotip IV navedeni kvasac može takođe imati jedan ili više od genotipova I, II, III, V, VI i jednu ili više od karakteristika I do XI.
[0154] U pronalasku, ćelija kvasca ima najmanje genotip IV opisan ispod, i genotip VI opisan ispod. Pored toga što ima genotipove IV i VI, navedeni kvasac može takođe imati jedan ili više od genotipova I, II, III, IV i jednu ili više od karakteristika I do XI.
[0155] Stoga, ovde opisana ćelija kvasca može imati genotipove I i II. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I i III. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I i IV. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I i V. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I i VI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I, II i III. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I, II i IV. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I, II i V. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I, II i VI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I, II, III i IV. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I, II, III i V. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I, II, III i VI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove I, II, III, IV i V. Ćelija kvasca može takođe imati genotipove I, II, III, IV i VI. Ćelija kvasca može takođe imati genotipove I, II, III, IV, V i VI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove II i III. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove II i IV. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove II i V. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove II i VI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove II, III i IV. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove II, III i V. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove II, III i VI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove II, III, IV i V. Ćelija kvasca može takođe imati genotipove II, III, IV i VI. Ćelija kvasca može takođe imati genotipove II, III, IV, V i VI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove III i IV. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove III i V. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove III i VI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove III, IV i V. Ćelija kvasca može takođe imati genotipove III, IV i VI. Ćelija kvasca može takođe imati genotipove III, IV, V i VI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove IV i V. Ćelija kvasca može takođe imati genotipove IV i VI. Ćelija kvasca može takođe imati genotipove IV, V i VI. Ovde opisana ćelija kvasca može takođe imati genotipove V i VI.
[0156] Ovde opisane ćelije kvasca mogu imati sve od genotipova I, II, III, IV, V i VI.
[0157] U jednom primeru izvođenja pronalaska, ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom može biti ćelija kvasca koja sadrži genomsku DNK sekvencu dostupnu pod DDBJ/EMBL/GenBank pristupnim brojem LOQJ00000000, naročito DNK sekvencu dostupnu pod DDBJ/EMBL/GenBank pristupnim brojem LOQJ00000000, verzija br. LOQJ01000000. Ova sekvenca je obezbeđena kao Shotgun projekat celog genoma i više detalja o ovoj sekvenci je obezbeđeno ovde ispod u Primerima.
[0158] U drugom primeru izvođenja pronalaska, ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom može biti ćelija kvasca koja sadrži genomsku DNK sekvencu dostupnu pod DDBJ/EMBL/GenBank pristupnim brojem LOQJ00000000, naročito DNK sekvencu dostupnu pod DDBJ/EMBL/GenBank pristupnim brojem LOQJ00000000, verzija br. LOQJ01000000. Ova sekvenca je obezbeđena kao Shotgun projekat celog genoma, i više detalja o ovoj sekvenci je obezbeđeno ovde ispod u Primerima.
[0159] Na osnovu ovde obezbeđenih genomskih sekvenci, mogu se pripremiti sintetički hromozomi kvasca. Ovo se može na primer izvesti kao što je opisano od strane Callaway u Nature u 2014. (Nature DOI: doi:10.1038/nature.2014.14941), ili od strane Annaluru et al., Science 4. april 2014: Vol. 344 br. 6179 str. 55-58 (DOI: 10.1126/science.1249252). "Sintetički kvasac 2.0" takođe obezbeđuje informacije o tome kako pripremiti sintetičke hromozome kvasca (videti npr. http://sintheticyeast.org/). Ćelije kvasca koje sadrže navedene sintetičke hromozome kvasca mogu se pripremiti upotrebom konvencionalne rekombinantne tehnologije.
Genotip I
[0160] Ovde opisana ćelija kvasca može imati genotip I, pri čemu je genotip I prisustvo gena koji kodira DAL5. Naročito je poželjno da ovde opisana ćelija kvasca sadrži gen koji kodira DAL5 SEQ ID NO: 6 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim. Poželjno, genotip I je prisustvo gena koji kodira DAL5 SEQ ID NO: 6.
[0161] Genotip I može biti prisustvo najmanje jednog alelnog gena koji kodira DAL5, pri čemu alelni gen koji kodira DAL5 kodira DAL5 odabran iz grupe koja se sastoji od DAL5 SEQ ID NO: 6, DAL5 SEQ ID NO: 39, DAL5 SEQ ID NO: 40 i njihovih funkcionalnih homologa koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa bilo kojim od prethodno pomenutih.
[0162] U jednom primeru izvođenja, genotip I može biti prisustvo sledeća 2 alelna gena:
1
1) gena koji kodira DAL5 SEQ ID NO: 39 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gena koji kodira DAL5 SEQ ID NO: 40 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0163] DAL5 je dipeptidni transporter koji transportuje dipeptide po ne-N-kraj pravilu. Ćelija kvasca može na primer imati genotip I u primerima izvođenja pronalaska, gde ćelija kvasca ima karakteristike III, IV i/ili VI, naročito kada ćelija kvasca ima karakteristiku III.
Genotip II
[0164] Ovde opisana ćelija kvasca može imati genotip II, pri čemu je genotip II prisustvo najmanje 3 gena koji kodiraju PTR2. Naročito, poželjno je da ovde opisana ćelija kvasca sadrži najmanje 3 gena koji kodiraju PTR2, pri čemu PTR2 može biti odabran iz grupe koja se sastoji od PTR2 SEQ ID NO: 7, PTR2 SEQ ID: 8, PRT2 SEQ ID NO: 9 i funkcionalnih homologa svakog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0165] Stoga, genotip II može biti da ćelija kvasca sadrži 3 gena odabrana iz grupe koja se sastoji od:
1) gena koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 7 ili funkcionalnih homologa svakog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence;
2) gena koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 8 ili funkcionalnih homologa svakog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence; i
3) gena koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 9 ili funkcionalnih homologa svakog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence.
[0166] Stoga, genotip II može biti da ćelija kvasca sadrži sledeća 3 gena:
2
1) gen koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 7 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim;
2) gen koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 8 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
3) gen koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 9 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0167] Stoga, genotip II može biti da ćelija kvasca sadrži 3 gena odabrana iz grupe koja se sastoji od:
1) gena koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 7;
2) gena koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 8; i
3) gena koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 9.
[0168] U jednom primeru izvođenja genotip II može biti da ćelija kvasca sadrži najmanje 2 alelna gena koji kodiraju PTR2. Na primer, genotip II može biti da ćelija kvasca sadrži najmanje dva alelna gena koji kodiraju PTR2 pojedinačno odabran iz grupe koja se sastoji od gena koji kodiraju PTR2 SEQ ID NO: 7, PTR2 SEQ ID: 8, PRT2 SEQ ID NO: 9, PRT2 SEQ ID NO: 37, PRT2 SEQ ID NO: 38, PRT2 SEQ ID NO: 43, PRT2 SEQ ID NO: 44 i funkcionalnih homologa svakog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0169] U jednom primeru izvođenja genotip II može biti da ćelija kvasca sadrži sledeća 2 alelna gena:
1) gen koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 37 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim;
2) gen koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 38 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0170] U jednom primeru izvođenja genotip II može biti da ćelija kvasca sadrži sledeća 2 alelna gena:
1) gen koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 43 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim;
2) gen koji kodira PRT2 SEQ ID NO: 44 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0171] PRT2 je transporter za di- i tripeptide, kao i druge peptide u ćeliju kvasca.
[0172] Ćelija kvasca može na primer imati genotip II, kada ćelija kvasca ima karakteristike III, IV i/ili V, takve kao u primeru izvođenja gde ćelija kvasca ima karakteristike III i/ili IV.
Genotip III
[0173] Ovde opisana ćelija kvasca može imati genotip III, pri čemu je genotip III prisustvo gena koji kodira UBR1. Naročito je poželjno da ovde opisana ćelija kvasca sadrži gen koji kodira UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 10, ili UBR1 SEQ ID NO: 11 ili funkcionalni homolog bilo kog od prethodno pomenutih koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima. Poželjno, genotip III je prisustvo najmanje dva gena koji kodiraju UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 10, ili UBR1 SEQ ID NO: 11 ili funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0174] Na primer genotip III može biti prisustvo sledeća 2 gena:
1) gena koji kodira UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 45 ili funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji deli najmanje 80%,
4
poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gena koji kodira UBR1 SEQ ID NO: 11 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0175] Naročito, genotip III može biti prisustvo sledeća 2 gena:
1) gena koji kodira UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 10; i
2) gena koji kodira UBR1 SEQ ID NO: 11.
[0176] Ćelija kvasca može na primer imati genotip III, kada ćelija kvasca ima karakteristike III i/ili IV.
[0177] Genotip III može biti da ćelija kvasca sadrži najmanje jedan alelni gen koji kodira UBR1 odabran iz grupe koja se sastoji od UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 10, UBR1 SEQ ID NO: 11, UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 41, UBR1 SEQ ID NO: 42, UBR1 koji sadrži SEQ IDN NO: 45 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0178] Genotip III može biti da ćelija kvasca sadrži najmanje dva alelna gena koji kodiraju UBR1 pojedinačno odabran iz grupe koja se sastoji od UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 10, UBR1 SEQ ID NO: 11, UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 41, UBR1 SEQ ID NO: 42 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0179] Na primer genotip III može biti prisustvo sledeća 2 gena:
1) gena koji kodira UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 41 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gena koji kodira UBR1 SEQ ID NO: 42 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0180] Ćelija kvasca može na primer imati genotip III, kada ćelija kvasca ima karakteristike III, IV i/ili V, takve kao u primeru izvođenja gde ćelija kvasca ima karakteristike III i/ili IV.
Genotip IV
[0181] Ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom ima genotip IV, pri čemu je genotip IV prisustvo najmanje 3 alelna gena, poželjno najmanje 4 alelna gena koji kodiraju IMA1p. Naročito, poželjno je da ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom sadrži najmanje 4 alelna gena koji kodiraju IMA1p odabran iz grupe koja se sastoji od IMA1p SEQ ID NO: 12, IMA1p SEQ ID NO: 13, IMA1p SEQ ID NO: 14, IMA1p SEQ ID NO: 15 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0182] IMA1p može biti kodiran različitim alelima, na primer kratkim alelom IMA1, ili dugim alelom IMA1. Jedna ćelija kvasca može sadržati i duge i kratke alele IMA1. U jednom primeru izvođenja, može biti poželjno da ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom sadrži najmanje 3 duga alela koji kodiraju IMA1p.
[0183] Na primer genotip IV može biti prisustvo najmanje 2 kratka alela IMA1. Navedena dva kratka alela IMA1 mogu biti geni koji kodiraju IMA1p odabran iz grupe koja se sastoji od IMA1p SEQ ID NO: 12, IMA1p SEQ ID NO: 13 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0184] U poželjnom primeru izvođenja, genotip IV može biti prisustvo najmanje 3 kratka alela IMA1. Navedena 3 kratka alela IMA1 mogu biti alelni geni koji kodiraju IMA1p odabran iz grupe koja se sastoji od IMA1p SEQ ID NO: 12, IMA1p SEQ ID NO: 13, IMA1p SEQ ID NO: 1, IMA1p SEQ ID NO: 2, IMA1p SEQ ID NO: 3, IMA1p SEQ ID NO: 4, IMA1p SEQ ID NO: 5, IMA1p SEQ ID NO: 33 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0185] Na primer genotip IV može biti prisustvo najmanje 2 duga alela IMA1. Navedena dva duga alela IMA1 mogu biti geni koji kodiraju IMA1p odabran iz grupe koja se sastoji od IMA1p SEQ ID NO: 14, IMA1p SEQ ID NO: 15 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0186] U jednom primeru izvođenja genotip IV može biti prisustvo najmanje 3 duga alela IMA1. Navedena 3 duga alela IMA1 mogu biti geni koji kodiraju IMA1p odabran iz grupe koja se sastoji od IMA1p SEQ ID NO: 21, IMA1p SEQ ID NO: 22, IMA1p SEQ ID NO: 3, IMA1p SEQ ID NO: 24, IMA1p SEQ ID NO: 25 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0187] U poželjnom primeru izvođenja, genotip IV može biti prisustvo najmanje 3 kratka alela IMA1 i najmanje 2 duga alela IMA1, pri čemu
a) navedena 3 kratka alela IMA1 pojedinačno su geni koji kodiraju IMA1p odabran iz grupe koja se sastoji od IMA1p SEQ ID NO: 12, IMA1p SEQ ID NO: 13, IMA1p SEQ ID NO: 1, IMA1p SEQ ID NO: 2, IMA1p SEQ ID NO: 3, IMA1p SEQ ID NO: 4, IMA1p SEQ ID NO: 5, IMA1p SEQ ID NO: 33 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima; i
b) navedena 2 duga alela IMA1 pojedinačno su geni koji kodiraju IMA1p odabran iz grupe koja se sastoji od IMA1p SEQ ID NO: 14, IMA1p SEQ ID NO: 15, IMA1p SEQ ID NO: 21, IMA1p SEQ ID NO: 22, IMA1p SEQ ID NO: 23, IMA1p SEQ ID NO: 24, IMA1p SEQ ID NO: 25 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0188] U jednom primeru izvođenja, genotip IV može biti da ćelija kvasca sadrži najmanje 5 alelnih gena koji kodiraju IMA1p, pri čemu su navedeni alelni geni pojedinačno odabrani iz grupe koja se sastoji od gena koji kodiraju IMA1p SEQ ID NO: 1, IMA1p SEQ ID NO: 2, IMA1p SEQ ID NO: 3, IMA1p SEQ ID NO: 4, IMA1p SEQ ID NO: 5, IMA1p SEQ ID NO: 12, IMA1p SEQ ID NO: 13, IMA1p SEQ ID NO: 14, IMA1p SEQ ID NO: 15, IMA1p SEQ ID NO: 21, IMA1p SEQ ID NO: 22, IMA1p SEQ ID NO: 23, IMA1p SEQ ID NO: 24, IMA1p SEQ ID NO: 25 i IMA1p SEQ ID NO: 33.
[0189] U jednom primeru izvođenja, genotip IV može biti da ćelija kvasca sadrži sledeća 4 alelna gena:
1) gen koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 12 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gen koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 13 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
3) gen koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 14 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
4) gen koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 15 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0190] U jednom primeru izvođenja, genotip IV može biti prisustvo sledeća 4 alelna gena:
1) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 12; i
2) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 13; i
3) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 14; i
4) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 15.
[0191] U jednom primeru izvođenja, genotip IV može biti prisustvo sledeća 3 alelna gena:
1) dva gena koji oba kodiraju IMA1p SEQ ID NO: 21 ili njihovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 22 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0192] U jednom primeru izvođenja, genotip IV može biti prisustvo sledeća 3 alelna gena:
1) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 23 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 24 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
3) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 25 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0193] U jednom primeru izvođenja, genotip IV može biti prisustvo sledećih 5 alelnih gena:
3) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 12 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
4) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 13 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
5) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 1 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
6) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 14 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
7) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 15 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0194] U jednom primeru izvođenja, genotip IV može biti prisustvo sledećih 6 alelnih gena:
1) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 2 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) najmanje dva gena koji kodiraju IMA1p SEQ ID NO: 3 ili njihovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
3) najmanje dva gena koji kodiraju IMA1p SEQ ID NO: 21 ili njihovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
4) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 22 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0195] U jednom primeru izvođenja, genotip IV može biti prisustvo sledećih 6 alelnih gena:
1) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 5 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) najmanje dva gena koji kodiraju IMA1p SEQ ID NO: 33 ili njihovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
3) najmanje dva gena koji kodiraju IMA1p SEQ ID NO: 4 ili njihovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
4) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 24 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
5) najmanje dva gena koji kodiraju IMA1p SEQ ID NO: 23 ili njihovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
6) gena koji kodira IMA1p SEQ ID NO: 25 ili njegovog funkcionalnog homologa koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0196] Ćelija kvasca može na primer imati genotip IV, gde ćelija kvasca ima karakteristike I, II, IX i/ili XI.
Genotip V
4
[0197] Ovde opisana ćelija kvasca može imati genotip V, pri čemu je genotip V prisustvo gena koji kodira IMA5p. Genotip V može takođe biti prisustvo najmanje dva alelna gena koji kodiraju IMA5p. Naročito, poželjno je da ovde opisana ćelija kvasca sadrži najmanje jedan alelni gen koji kodira IMA5p odabran iz grupe koja se sastoji od IMA5p SEQ ID NO: 16, IMA5p SEQ ID NO: 17 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima. Poželjno, genotip V je prisustvo najmanje dva gena koji kodiraju IMA5p SEQ ID NO: 16, ili IMA5p SEQ ID NO: 17 ili funkcionalnog homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0198] U jednom primeru izvođenja ćelija kvasca sadrži najmanje dva alelna gena koji kodiraju IMA5p pojedinačno odabrani od alelnih gena koji kodiraju IMA5p SEQ ID NO: 16, IMA5p SEQ ID NO: 17, IMA5p SEQ ID NO: 34, IMA5p SEQ ID NO: 35, IMA5p SEQ ID NO: 36 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0199] Naročito, genotip V može biti da ćelija kvasca sadrži sledeća 2 alelna gena:
1) gen koji kodira IMA5p SEQ ID NO: 16 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gen koji kodira IMA5p SEQ ID NO: 17 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0200] U jednom primeru izvođenja, genotip V može biti da ćelija kvasca sadrži sledeća 3 alelna gena:
1) gen koji kodira IMA5p SEQ ID NO: 16 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gen koji kodira IMA5p SEQ ID NO: 17 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
3) gen koji kodira IMA5p SEQ ID NO: 34 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0201] U jednom primeru izvođenja, genotip V može biti da ćelija kvasca sadrži sledeća 2 alelna gena:
1) gen koji kodira IMA5p SEQ ID NO: 35 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gen koji kodira IMA5p SEQ ID NO: 36 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0202] Naročito, genotip V može biti prisustvo sledeća 2 gena:
1) gena koji kodira IMA5p SEQ ID NO: 16; i
2) gena koji kodira IMA5p SEQ ID NO: 17.
[0203] Ćelija kvasca može na primer imati genotip V, gde ćelija kvasca ima karakteristike I, II, IX i/ili XI.
Genotip VI
[0204] Ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom ima genotip VI, pri čemu je genotip VI prisustvo najmanje 2 alelna gena koji kodiraju AGT1. Naročito, poželjno je da ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom sadrži najmanje 2 alelna gena koji kodiraju AGT1 odabran iz grupe koja se sastoji od AGT1 SEQ ID NO: 18, AGT1 SEQ ID NO: 19, AGT1 SEQ ID NO: 20, AGT1 SEQ ID NO: 26, AGT1 SEQ ID NO: 27, AGT1 SEQ ID NO: 28, AGT1 SEQ ID NO: 29, AGT1 SEQ ID NO: 30, AGT1 SEQ ID NO: 31, AGT1 SEQ ID NO: 32 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0205] U jednom primeru izvođenja ćelija kvasca može imati genotip VI, pri čemu je genotip VI prisustvo najmanje 2 alelna gena koji kodiraju AGT1 pune dužine. Naročito, poželjno je da ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom sadrži najmanje 2 alelna gena koji kodiraju AGT1 odabran iz grupe koja se sastoji od AGT1 SEQ ID NO: 18, AGT1 SEQ ID NO: 19, AGT1 SEQ ID NO: 20, AGT1 SEQ ID NO: 27, AGT1 SEQ ID NO: 28, AGT1 SEQ ID NO: 30, AGT1 SEQ ID NO: 31, AGT1 SEQ ID NO: 32 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0206] U jednom primeru izvođenja, genotip VI može biti da ćelija kvasca sadrži sledeća 3 alelna gena:
1) gen koji kodira AGT1 SEQ ID NO: 18 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gen koji kodira AGT1 SEQ ID NO: 19 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
3) gen koji kodira AGT1 SEQ ID NO: 20 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0207] Naročito, genotip VI može biti prisustvo sledeća 3 alelna gena:
1) gena koji kodira AGT1 SEQ ID NO: 18; i
2) gena koji kodira AGT1 SEQ ID NO: 19; i
3) gena koji kodira AGT1 SEQ ID NO: 20.
[0208] U jednom primeru izvođenja, genotip VI može biti da ćelija kvasca sadrži sledeća dva gena koji kodiraju AGT1:
1) gen koji kodira AGT1 SEQ ID NO: 27 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gen koji kodira AGT1 SEQ ID NO: 28 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
4
[0209] U jednom primeru izvođenja, genotip VI može biti da ćelija kvasca sadrži sledeća 3 alelna gena koji kodiraju AGT1:
1) gen koji kodira AGT1 SEQ ID NO: 30 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
2) gen koji kodira AGT1 SEQ ID NO: 31 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim; i
3) gen koji kodira AGT1 SEQ ID NO: 32 ili njegov funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njim.
[0210] Ćelija kvasca može na primer imati genotip VI, gde ćelija kvasca ima karakteristike I, II, IX i/ili XI.
Funkcionalni homolog
[0211] Termin "funkcionalni homolog" kao što se ovde upotrebljava označava polipeptid koji deli najmanje jednu biološku funkciju sa referentnim polipeptidom. Generalno navedeni funkcionalni homolog takođe deli značajnu identičnost sekvence sa referentnim polipeptidom. Poželjno funkcionalni homolog referentnog polipeptida je polipeptid koji ima istu biološku funkciju kao referentni protein i koji deli visok nivo identičnosti sekvence sa referentnim polipeptidom.
[0212] Visok nivo identičnosti sekvence ukazuje na verovatnoću da je prva sekvenca izvedena iz druge sekvence. Identičnost amino-kiselinske sekvence zahteva identične aminokiselinske sekvence između dve poravnate sekvence. Stoga, sekvenca kandidata koja deli 80% amino-kiselinske identičnosti sa referentnom sekvencom, zahteva da je, posle poravnanja, 80% amino-kiselina u sekvenci kandidata identično odgovarajućim aminokiselinama u referentnoj sekvenci. Identičnost u skladu sa predmetnim pronalaskom je određena pomoću računarske analize, kao što je, bez ograničavanja, ClustalW program za računarsko poravnanje (Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680), i u njemu predloženih osnovnih parametara. Softver ClustalW dostupan je od ClustalW WWW servisa Evropskog instituta za bioinformatiku na http://www.ebi.ac.uk/clustalw. Upotrebom ovog programa sa njegovim osnovnim postavkama, poravnavaju se zreli (bioaktivni) deo upita i referentni polipeptid. Prebrojava se broj potpuno konzerviranih ostataka i deli sa dužinom referentnog polipeptida. Stoga, identičnost sekvence se određuje preko cele dužine referentnog polipeptida.
[0213] Može biti poželjno da se konzervirane amino-kiseline zadrže u funkcionalnom homologu. Konzervirane amino-kiseline se mogu identifikovati pripremanjem poravnanja sličnog polipeptida, i upotrebom navedenog poravnanja kojim se identifikuju amino-kiselinski ostaci konzervirani između polipeptida. Primeri korisnih poravnanja prikazani su ovde na slikama 5-12.
Postupak za proizvodnju napitka
[0214] Aspekt ovog pronalaska je obezbeđivanje postupaka za proizvodnju napitka, pri čemu navedeni postupak sadrži korake
a) Obezbeđivanje početne tečnosti
b) Obezbeđivanje ćelije kvasca u skladu sa pronalaskom, npr. ćelije kvasca koja ima karakteristike II i VIII i genotipove IV i VI opisane iznad,
c) Fermentacija navedene početne tečnosti sa navedenom ćelijom kvasca,
na taj način proizvodeći napitak.
[0215] Početna tečnost može naročito biti ekstrakt žitarica, kao što je sladovina. Navedena početna tečnost može biti na primer pripremljena pripremanjem ekstrakta slada komljenjem i opciono ceđenjem komine kao što je ovde opisano u ovom odeljku.
[0216] Slad su zrna ječma koja su maltirana. Pod terminom "maltiranje" podrazumeva se klijanje natopljenih zrna ječma u postupku koji se odvija pod kontrolisanim uslovima sredine, nakon čega sledi korak sušenja. Navedeni korak sušenja može poželjno da bude sušenje u sušnici isklijalih zrna na povišenim temperaturama.
[0217] Ova prethodno pomenuta sekvenca događaja maltiranja važna je za sintezu brojnih enzima koji uzrokuju modifikaciju zrna, postupke koji uglavnom depolimerizuju ćelijske zidove mrtvog endosperma kako bi mobilizovali hranljive sastojke zrna i aktiviraju druge
4
depolimeraze. U naknadnom postupku sušenja, aroma i boja se generišu zbog hemijskih reakcija posmeđavanja.
[0218] Natapanje se može izvesti bilo kojim konvencionalnim postupkom poznatim stručnjaku. Jedan neograničavajući primer uključuje natapanje na temperaturi u opsegu od 10 do 25 °C, sa naizmeničnim suvim i vlažnim uslovima. Klijanje se može izvesti bilo kojim konvencionalnim postupkom poznatim stručnjaku. Jedan neograničavajući primer uključuje klijanje na temperaturi u opsegu od 10 do 25 °C, opciono sa promenom temperature u opsegu od 1 do 4 h.
[0219] Sušenje u sušnici se može izvesti na konvencionalnim temperaturama, kao što je najmanje 75 °C, na primer u opsegu od 80 do 90 °C, kao što je u opsegu od 80 do 85 °C. Stoga, slad se može, na primer proizvesti bilo kojim postupcima opisanim od strane Briggs et al. (1981) i Hough et al. (1982). Međutim, bilo koji drugi pogodan postupak za proizvodnju slada može se takođe upotrebljavati sa predmetnim pronalaskom, kao što su postupci za proizvodnju specijalnih sladova, uključujući, ali bez ograničavanja na, postupke pečenja slada.
[0220] Slad se može dalje preraditi, na primer mlevenjem. Poželjno mlevenje se izvodi u suvom stanju, tj. slad se melje dok je suv.
[0221] Slad, npr. mleveni slad može se komiti kako bi se pripremio vodeni ekstrakt navedenog slada. Početna tečnost za pripremu napitka može biti vodeni ekstrakt slada, npr. vodeni ekstrakt slada pripremljen komljenjem.
[0222] Stoga, postupak za pripremu napitka u skladu sa pronalaskom može da sadrži korak proizvodnje sladovine komljenjem slada i opciono pomoćnih sastojaka. Navedeni korak komljenja može takođe opciono da sadrži ceđenje komine, i u skladu s tim navedeni korak komljenja može biti korak komljenja koji uključuje korak ceđenja komine ili korak komljenja koji isključuje korak ceđenja komine.
[0223] Generalno, proizvodnja sladovine započinje mlevenjem slada i/ili ječma. Ukoliko se dodaju dodatni pomoćni sastojci, oni se takođe mogu mleti u zavisnosti od svoje prirode. Ukoliko je dodatak žitarica, može se, na primer samleti, dok se sirupi, šećeri i slično generalno neće mleti. Mlevenje će olakšati pristup vode česticama zrna u fazi komljenja. Za vreme komljenja enzimska depolimerizacija supstrata započeta tokom maltiranja se može nastaviti.
[0224] Generalno, sladovina se priprema kombinovanjem i inkubiranjem mlevenog slada i vode, tj. u postupku komljenja. Tokom komljenja, kompozicija slad/tečnost može biti suplementovana sa dodatnim kompozicijama pomoćnih sastojaka koji su bogati ugljenim
4
hidratima, na primer pomoćnim sastojcima mlevenog ječma, kukuruza ili pirinča. Nemaltirani pomoćni sastojci žitarica uobičajeno sadrže malo ili nimalo aktivnih enzima, zbog čega je važno suplementirati ih sa sladom ili egzogenim enzimima kako bi se obezbedili enzimi neophodni za depolimerizaciju polisaharida itd.
[0225] Tokom komljenja mlevenog slada i/ili mlevenog ječma - i opciono dodatni pomoćni sastojci inkubiraju se sa tečnom frakcijom, kao što je voda. Temperatura inkubacije se generalno održava konstantnom (izotermalno komljenje), ili postepeno povećava, na primer povećava na sekvencijalni način. U oba slučaja, rastvorljive supstance u sladu/ječmu/pomoćnim sastojcima se oslobađaju u pomenutu tečnu frakciju. Naknadna filtracija omogućava razdvajanje sladovine i zaostalih čvrstih čestica, potonje su takođe nazvane "istrošeno zrno". Tako dobijena sladovina može se označiti i kao "prva sladovina". Dodatna tečnost, kao što je voda može se dodati istrošenim zrnima tokom postupka koji se takođe označava ceđenje komine. Posle ceđenja komine i filtracije, može se dobiti "druga sladovina". Dodatne sladovine se mogu pripremiti ponavljanjem procedure. Neograničavajući primeri pogodnih procedura za pripremu sladovine opisuju Briggs et al. (supra) i Hough et al. (supra).
[0226] Kao što je pomenuto iznad, kompozicija sladovine se može pripremiti komljenjem nemaltiranih zrna ječma. Nemaltiranim zrnima ječma nedostaje ili sadrže samo ograničenu količinu enzima korisnih za proizvodnju sladovine, kao što su enzimi koji su sposobni da razgrade ćelijske zidove ili enzimi koji su sposobni da depolimerizuju skrob u šećere. Stoga, u primerima izvođenja pronalaska gde se za komljenje upotrebljava nemaltirani ječam, poželjno je da se jedan ili više pogodnih spoljnih enzima za varenje doda komini. Pogodni enzimi mogu biti lipaze, enzimi koji razgrađuju skrob (npr. amilaze), glukanaze [poželjno (1-4)- i/ili (1-3,1-4)-β-glukanaza], i/ili ksilanaze (kao što je arabinoksilanaza), i/ili proteaze, ili enzimske smeše koje sadrže jedan ili više od prethodno pomenutih enzima, npr. Cereflo, Ultraflo, ili Ondea Pro (Novozymes).
[0227] Kompozicija sladovine se može takođe pripremiti upotrebom smeše maltiranih i nemaltiranih zrna ječma, u kom slučaju se tokom pripreme može dodati jedan ili više pogodnih enzima. Specifičnije, ječam pronalaska se može upotrebljavati zajedno sa sladom u bilo kojoj kombinaciji za komljenje - sa ili bez spoljnih enzima za varenje - kao što je, ali nije ograničeno na, proporcije ječam:slad = približno 100:0, ili približno 75:25, ili približno 50:50, ili približno 25:75.
4
[0228] U drugim primerima izvođenja pronalaska, poželjno je da se ne dodaju spoljni enzimi pre ili tokom komljenja, naročito da se ne dodaju spoljne proteaze i/ili spoljne celulaze i/ili spoljne α-amilaze i/ili spoljne β-amilaze i/ili spoljne maltogene α-amilaze.
[0229] Sladovina dobijena posle komljenja može se takođe označiti kao "slatka sladovina". U konvencionalnim postupcima, slatka sladovina se kuva sa ili bez hmelja gde se posle toga može označiti kao kuvana sladovina.
[0230] Termin "približno" kao što se ovde upotrebljava, znači ±10%, poželjno ±5%, još poželjnije ±2%.
[0231] Sladovina se može zagrevati ili kuvati pre nego što se podvrgne fermentaciji sa kvascem pronalaska. Prva, druga i dodatne sladovine se mogu kombinovati, i posle toga podvrgnuti zagrevanju ili kuvanju. Sladovina se može zagrevati ili kuvati tokom bilo kog odgovarajućeg vremenskog perioda, npr. u opsegu od 60 min do 120 min.
[0232] Stoga, početna tečnost može biti sladovina npr. pripremljena kao što je opisano iznad. Napitak se može pripremiti fermentacijom početne tečnosti, npr. fermentacijom sladovine. Napitak u jednom poželjnom primeru izvođenja mogu biti napici od slada, čak poželjnije fermentisani napici, kao što su fermentisani napici od slada, poželjno alkoholni napici, kao što je pivo.
[0233] Napitak može biti bezalkoholni napitak, kao što je bezalkoholno pivo ili druge vrste bezalkoholnih napitaka, kao što su bezalkoholna pića od slada, kao što je kvas.
[0234] U jednom poželjnom primeru izvođenja napitak je pivo, na primer pivo može biti lager pivo ili ejl. Stoga, pivo može na primer biti odabrano iz grupe koja se sastoji od altbier, Amber ale, Barley wine, Berliner weisse, Bière de Garde, Bitter, Blonde Ale, Bock, Brown ale, California Common, Cream Ale, Dortmunder Export, Doppelbock, Dunkel, Dunkelweizen, Eisbock, Fruit lambic, Golden Ale, Gose, Gueuze, Hefeweizen, Helles, India pale ale, Kölsch, Lambic, Light ale, Maibock, Malt liquor, Mild, Märzenbier, Old ale, Oud bruin, Pale ale, Pilsener, Porter, Red ale, Roggenbier, Saison, Scotch ale, Steam beer, Stout, Schwarzbier, lager, Witbier, Weissbier i Weizenbock.
[0235] Stoga, pronalazak se takođe odnosi na postupke proizvodnje napitka koji sadrže korake:
(i) obezbeđivanje kompozicije slada;
(ii) prerada navedene kompozicije slada u napitak.
4
[0236] Generalno govoreći, alkoholni napici - kao što je pivo - mogu se proizvoditi od maltiranih i/ili nemaltiranih zrna ječma. Slad, pored hmelja i kvasca, doprinosi aromi i boji piva. Osim toga, slad funkcioniše kao izvor fermentabilnog šećera i enzima. Neograničavajući opisi primera pogodnih postupaka za maltiranje i varenje mogu se pronaći, na primer, u publikacijama Briggs et al. (1981) i Hough et al. (1982). Brojni, redovno ažurirani postupci za analize ječma, slada i proizvoda piva su dostupni, na primer, ali ne ograničavaju se na, Američko udruženje hemičara žitarica (American Association of Cereal Chemists) (1995), Američko udruženje hemičara za varenje (American Society of Brewing Chemists) (1992), Evropska konvencija pivara (European Brewery Convention) (1998), i Institut za varenje (Institute of Brewing) (1997). Poznato je da se koristi mnogo specifičnih postupaka za date pivare, sa najznačajnijim varijacijama koje se odnose na preferencije lokalnih potrošača. Bilo koji takav postupak proizvodnje piva može se upotrebljavati sa predmetnim pronalaskom.
[0237] Prvi korak proizvodnje piva iz sladovine poželjno uključuje zagrevanje navedene sladovine kao što je opisano ovde iznad, nakon čega sledi naknadna faza hlađenja sladovine i opciono mirovanje vrtloga. Posle hlađenja, sladovina se može prebaciti u fermentacione rezervoare koji sadrže kvasac u skladu sa pronalaskom, tj. kvasac koji ima jednu ili više od karakteristika I do X opisanih iznad. Sladovina će biti fermentisana tokom bilo kog pogodnog vremenskog perioda, generalno u opsegu od 1 do 100 dana. Fermentacija se izvodi na bilo kojoj korisnoj temperaturi, npr. na temperaturi u opsegu od 10 do 20 °C.
[0238] Tokom višednevnog postupka fermentacije, šećer se pretvara u alkohol i CO2istovremeno sa razvojem nekih supstanci arome.
[0239] Nakon toga, pivo se može dalje preraditi, na primer ohladiti. Takođe se može filtrirati i/ili lagerovati - postupak koji razvija prijatnu aromu i manje ukusa kvasca. Takođe se mogu dodati aditivi. Osim toga, može se dodati CO2. Konačno, pivo se može pasterizovati i/ili filtrirati, pre nego što se pakuje (npr. u flaše ili u konzerve).
[0240] Pivo proizvedeno fermentacijom sa kvascem u skladu sa pronalaskom ima vrhunsko generalno ima vrhunski prijatan ukus. Ukus može da analizira, na primer, specijalistički degustacioni panel za pivo. Poželjno je da je navedeni panel obučen za degustaciju i opisivanje aroma piva, sa posebnim fokusom na aldehide, kartonasti ukus, ostareli ukus, estre, više alkohole, masne kiseline i sumporne komponente.
[0241] Generalno, degustacioni panel će se sastojati u opsegu od 3 do 30 članova, na primer u opsegu od 5 do 15 članova, poželjno u opsegu od 8 do 12 članova. Degustacioni panel može da proceni prisustvo različitih aroma, kao što su kartonasta, oksidovana, ostarela, i hlebaste neželjene arome, kao i arome estra, viših alkohola, sumpornih komponenti i tela piva.
4
Lista sekvenci
1
2
�
�
�
�
Primeri
[0242] Pronalazak je dodatno ilustrovan pomoću sledećih primera, koje međutim ne treba tumačiti kao ograničavajuće za pronalazak.
[0243] U primerima su upotrebljeni sledeći sojevi kvasca:
[0244] Sekvenca genoma hibridnog kvasca 1 obezbeđena je kao SEQ ID NO: 1 u danskoj patentnoj aplikaciji PA 2014 70825 koja ima prioritet. SEQ ID NO: 1 iz PA 2014 70825 prikazuje sekvencu asembliranih skela iz sekvence genoma hibrida 1. Sekvence su obezbeđene u fasta formatu. Termin "skela (scaffold)" kao što se upotrebljava u vezi sa ovim označava deo sekvence genoma rekonstruisan iz preklapajućih kontiga. Termin "kontig" označava kontinuiranu preklapajuću sekvencu koja potiče od reasembliranih kratkih DNK fragmenata.
[0245] SEQ ID NO: 1 iz PA 2014 70825 obezbeđuje sekvencu od ukupno 1629 skela, numerisanih od broja 0 do 1628. U SEQ ID NO: 1 iz PA 2014 70825 sekvence svake skele obezbeđene su razdvojene terminom ">Scaffold_X", pri čemu X ukazuje na broj skele koja ima sledeću sekvencu.
[0246] Stoga, genom hibridnog kvasca 1 poželjno sadrži sve od skela 0 do 1628 distibuirane u mnoštvu hromozoma.
[0247] Sekvenca genoma hibridnog kvasca 1 takođe je dostupna pod DDBJ/EMBL/GenBank pristupnim brojem LOQJ00000000. Stoga je Shotgun projekat celog genoma u vezi sa hibridnim kvascem 1 deponovan kod DDBJ/EMBL/GenBank pod pristupom LOQJ00000000. Verzija opisana u ovom patentu je verzija LOQJ01000000.
[0248] Podaci podnošenja su bili sledeći:
[0249] Shotgun projekat celog genoma prikazuje sekvencu asembliranih skela iz sekvence genoma hibridnog kvasca 1. Termin "skela" kao što se upotrebljava u vezi sa ovim označava deo sekvence genoma rekonstruisan iz preklapajućih kontiga. Termin "kontig" označava kontinuiranu preklapajuću sekvencu koja potiče od reasembliranja kratkih DNK fragmenata. DDBJ/EMBL/GenBank pristup LOQJ00000000, verzija LOQJ01000000 obezbeđuje sekvencu od ukupno 8919 skela. Stoga, genom hibridnog kvasca 1 poželjno sadrži sve od skela 0 do 8919 distribuirane u mnoštvu hromozoma. U skladu sa tim, ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom takođe može sadržati sve od skela 0 do 8919 distribuirane u mnoštvu hromozoma.
[0250] Sekvenca genoma hibridnog kvasca 7 dostupna je pod DDBJ/EMBL/GenBank pristupnim brojem LOQK00000000.
[0251] Stoga je Shotgun projekat celog genoma u vezi sa hibridnim kvascem 7 deponovan u DBJ/EMBL/GenBank pod pristupom LOQK00000000. Verzija opisana u ovom patentu je verzija LOQK01000000.
[0252] Podaci podnošenja bili su sledeći:
[0253] Shotgun projekat celog genoma prikazuje sekvencu asembliranih skela iz sekvence genoma hibridnog kvasca 7. Termin "skela" kao što se upotrebljava u vezi sa ovim označava deo sekvence genoma rekonstruisan iz preklapajućih kontiga. Termin "kontig" označava kontinuiranu preklapajuću sekvencu koja potiče od reasembliranja kratkih DNK fragmenata. DDBJ/EMBL/GenBank pristup LOQK00000000, verzija LOQK01000000 obezbeđuje sekvencu od ukupno 9492 skela. Stoga, genom hibridnog kvasca 7 poželjno sadrži sve od skela 0 do 9492 distribuirane u mnoštvu hromozoma. U skladu sa tim, ćelija kvasca u skladu sa pronalaskom takođe može sadržati sve od skela 0 do 9492 distribuirane u mnoštvu hromozoma.
Primer 1
[0254] 10 hl piva pripremljeno je inokulacijom 10 miliona vijabilnih ćelija/ml kvasca u komercijalnu sladovinu na bazi slada (16° Plato) koja je dobijena od Soufflet nakon čega je sledila fermentacija na 17 °C sve dok je diacetil bio ispod unapred definisanog praga, koji je postavljen na nivo ispod praga koji se smatra nepoželjenom aromom kod lager piva. U predmetnom primeru prag diacetila postavljen je na 30 ppb.
[0255] Kod lager piva, vicinal diketoni kao što je diacetil i 2,3-pentanedion daju neželjenu nepoželjnu aromu ukoliko su prisutni preko praga koncentracije. I diacetil i 2,3-pentanedion imaju aromu karamele sa puterom (butterscotch), ali prag za diacetil je 10 puta niži. Deo upravljanja fermentacijom je da se osigura da gotovo pivo sadrži vicinal diketone, posebno diacetil, ispod svojih pragova.
[0256] Ćelije kvasca propagirane su u jednom rezervoaru (razmere od 9 hL) koji se upotrebljava za dobijanje ćelijskog inokuluma generacije 1 piva nakon čega je sledila generacija 2 piva (razmere od 10 hL, svaka). Svrha propagacije je da se proizvede zdrava čista kultura kvasca u dovoljnim količinama da inokulira kvasac za pravu fermentaciju piva. Fermentacija piva se vrši uzastopnim fermentacijama i kvasac se tipično zamenjuje posle 5 do 10 uzastopnih fermentacija; međutim učestalost unošenja novopropagiranog kvasca u pivaru je individualna odluka. Uzastopne fermentacije služe kao ćelijski inokulum za sledeću fermentaciju piva i često samo rezervoar za propagaciju obezbeđuje inokulum ćelija kvasca za prvu fermentaciju piva, takozvanu generaciju 1 piva. Fermentacija piva napravljena posle generacije 1 se naziva generacija 2 i tako dalje. Većina fermentacija piva izvodi se kvascem izvađenim iz prethodne fermentacije piva a ne iz rezervoara za propagaciju. Inokulum ćelija za fermentaciju piva je tipično 10<7>ćelija kvasca/ml.
[0257] U ovom primeru upotrebljena su 3 različita soja kvasca. Korišćeni su ista sladovina i uslovi fermentacije.
Ejl kvasac 1
Lager kvasac 1
Hibridni kvasac 1
[0258] Ejl kvasac 1 je kvasac vrste S. cerevisiae. Lager kvasac 1 je kvasac vrste S. pastorianus. Ejl kvasac 1 i lager kvasac 1 su hibridizovani i odabran je jedan od hibridnih sojeva pod nazivom hibridni kvasac 1.
[0259] Tabela 1 prikazuje konačne vrednosti Plato, Tabela 2 prikazuje % etanola (% zapr./zapr.) i Tabela 3 prikazuje RDF konačnog piva, dane u kojima je diacetil ispod unapred definisanog praga i dane za primarnu fermentaciju iz piva generacije 1 i 2 u pivo pripremljeno upotrebom 3 soja kvasca na kraju rezervoara za propagaciju (9 hL) i/ili u generacijama 1 i 2 piva.
[0260] Hibridni soj 1 ima mogućnost da raste na 37 °C (podaci nisu prikazani) i takođe dobro fermentiše na nižim temperaturama kao što je 16 °C (videti Tabele 1 do 3).
Tabela 1 Plato vrednosti
Tabela 2 % etanola (% zapr./zapr.)
Tabela 3
1
[0261] Stopa dodavanja kvasca je količina vijabilnog kvasca/mL dodata kao ćelijski inokulum za pokretanje fermentacije. Hibridni kvasac 1 imao je poboljšan RDF sa 2% u poređenju sa dva roditeljska soja (lager kvasac 1 i ejl kvasac 1) (videti Tabelu 3). Hibridni kvasac 1 takođe je imao niže nivoe konačnog Plato.
[0262] Hibridni kvasac 1 imao je poboljšan prinos etanola za 0,2% etanola ili više u poređenju sa dva roditeljska soja. Hibridni kvasac 1 imao je bolje izvođenje fermentacije i na temperaturama od 16 °C i od 18 °C. Hibrid 1 se poboljšao u smislu što ima kraće vreme u kome ima nivoe diacetila ispod praga (dani do DA po spec.) u poređenju sa ejl kvascem 1.
[0263] Hibridni kvasac 1 fermentiše skoro istom stopom kao i lager kvasac 1 (videti dani do primarne fermentacije u Tabeli 3) ali je imao malo duže vreme u kome ima diacetil ispod praga (videti dani do DA po spec.).
Primer 2
[0264] Ćelije kvasca iz zamrznutih štokova razmazane su na YPD ploče. One su upotrebljene za inokulaciju 20 ml pasterizovane konvencionalne sladovine od slada u bocama od 50 ml i uzgajane na temperaturi od 22 °C. Ćelijske kulture iz kulture od 20 ml upotrebljene su za ponovno dodavanje ćelija u zapreminu od 200 ml sladovine u bocama od 500 ml i uzgajane na 22 °C. Iz zapremine od 200 ml sladovine, inokuliran je rezervoar za propagaciju od 1,8 L sa ciljem da inokulira 14-15 miliona vijabilnih ćelija/ml i uzgaja na temperaturi od 16 ili 18 °C (ista kao i temperatura fermentacije). Slad koji je upotrebljen za pripremu sladovine kupljen je od DMG u Danskoj.
[0265] Broj ukupnih i vijabilnih ćelija izmeren je sa NucleoCounter. Iz rezervoara za propagaciju, takođe je izmeren broj vijabilnih ćelija. 14-15 miliona vijabilnih ćelija je upotrebljeno za inokulaciju 2 L sladovine sa sadržajem šećera od 15° Plato, kojima je bilo omogućeno da fermentišu tokom 6 dana na bilo 16 °C (hibridni kvasac 2, 3 i 4 i njegove odgovarajuće kontrole) ili 18 °C (hibridni kvasac 1 i njegove odgovarajuće kontrole) kako bi se dobila takozvana generacija 1 piva. Na kraju generacije 1, 14-15 miliona vijabilnih ćelija upotrebljeno je za inokulaciju generacije 2 piva. Na dan 4 inkubacije određen je broj ćelija u suspenziji. U Tabeli 4 prikazani su rezultujući brojevi ćelija iz piva iz generacije 2. Broj ćelija u suspenziji ne odražava ukupni rast ćelija, već pre flokulaciju i/ili sedimentaciju. Generalno je poželjno da min broj ćelija u suspenziji bude što je moguće manji u kasnijim fazama fermentacije, što ukazuje na povećanu flokulaciju i/ili sedimentaciju. Ukoliko se flokulacija
2
poveća prerano u toku postupka, ovo može dovesti do preuranjene flokulacije što rezultira sporom fermentacijom na kraju postupka.
Tabela 4a. Generacija 2 piva napravljena u razmeri od 2 L. Prikazani rezultati su iz bioloških duplikata istog eksperimenta.
[0266] Hibridni kvasac 1 proizveo je više biomase (mereno u gramima sakupljenog kvasca) od lager kvasca 1 ali je još uvek hibrid 1 imao manje ćelija u suspenziji.
Tabela 4b
[0267] Kao što je prikazano iznad, hibridni kvasci 2, 3 i 4 imaju manje ćelija u suspenziji od lager kvasaca, iako su proizveli malo više biomase (u gramima sakupljenih ćelija na kraju fermentacije).
[0268] U drugom pokušaju, ustanovljeno je da je hibridni kvasac 2 imao 7 mil/ml ćelija u suspenziji posle 6 dana fermentacije, dok je ejl kvasac 1 imao samo 4 mil/ml ćelija u suspenziji, a lager kvasac 2 ima 39 mil/ml ćelija u suspenziji posle 6 dana fermentacije. Stoga, takođe u ovom pokušaju hibridni kvasac je imao znatno niži nivo ćelija u suspenziji u poređenju sa lager kvascem.
[0269] Hibridi napravljeni od ejl kvasca 1 i lager kvasca 1 (hibridni kvasac 1) ili lager kvasca 2 (hibridni kvasci 2, 3, 4 i 7) imali su manje ćelija u suspenziji od dva roditeljska soja: ejl kvasca 1 i bilo kog od lager sojeva (lager kvasca 1 ili 2). Tako da su hibridi imali poboljšanu sedimentaciju ćelija. To je od interesa za varenje kako bi se izbegla nizvodna prerada ćelijske paste kvasca koja bi trebalo da se sakupi i upotrebi za ponovno dodavanje ćelija u naredne generacije pivskog postupka.
[0270] Rezultati još jednog pokušaja prikazani su u Tabeli 4c. Eksperimentalne postavke bile su kao što je opisano ovde iznad osim što su testirane navedene ćelije kvasca.
Tabela 4c
4
Primer 3
[0271] 50 L piva pripremljeno je inokulacijom konvencionalne sladovine na bazi slada (18° Plato) sa 10 miliona vijabilnih ćelija/ml kvasca nakon čega je sledila fermentacija na 18 °C. Slad koji je upotrebljen za pripremu sladovine kupljen je od DMG u Danskoj.
[0272] Upotrebljena su 2 različita soja kvasca. Korišteći su ista sladovina i uslovi fermentacije.
Lager kvasac 1
Hibridni kvasac 1
[0273] Tabela 5a prikazuje konačne vrednosti AE piva za 2 soja poređena u rezervoaru razmere od 50 L od piva napravljenog sa generacijom 1 i 2.
[0274] AE kao što se ovde upotrebljava je "prividni ekstrakt" koji je mera gustine pivske sladovine u smislu procenta ekstrakta po težini i koja je izražena u Plato skali.
Tabela 5a
[0275] Hibridni kvasac 1 imao je poboljšan 0,5% AE za 0,5% u poređenju sa lager kvascem 1.
[0276] Sličan test izveden je sa lager kvascem 2, hibridnim kvascem 4, hibridnim kvascem 7, hibridnim kvascem 8 i S. diastaticus. AE i RDF na dan 7 posle dodavanja kvasca prikazani su u Tabeli 5b. Eksperimentalne postavke bile su kao što je opisano ovde u Eksperimentu 2 iznad sa testiranim navedenim ćelijama kvasca.
Tabela 5b
[0277] Stopa fermentacije takođe je određena za lager kvasac 2, hibridni kvasac 4 i 7. Eksperimentalne postavke bile su kao što je opisano ovde u Eksperimentu 2 osim što je prividni ekstrakt određen u nekoliko vremenskih tačaka tokom toka fermentacije i inkubacija je bila na 18 °C. Slika 16 prikazuje prividni ekstrakt u ° Plato tokom vremena posle dodavanja kvasca sladovini. Upotrebljena sladovina imala je početni sadržaj šećera od 15° Plato. Kao što je prikazano, tada je vreme primarne fermentacije za hibridne kvasce 4 i 7 oko 3 dana, dok je vreme primarne fermentacije za Lager kvasac 2 oko 4 dana.
Primer 4
[0278] Sadržaj amino-kiselina u početnoj sladovini i pivu proizvedenom kao što je opisano u Primeru 1 određen je pomoću HPLC sa fluorescentnim detektorom.
[0279] Tabela 6a prikazuje koncentraciju amino-kiselina u konačnom pivu.
Tabela 6a
[0280] Hibridni kvasac 1 ima mnogo manje zaostalih amino-kiselina u konačnom pivu, što je korisno u smislu starenja piva i stabilnosti piva. Pivo fermentisano sa hibridom 1 generisaće manje količine Štrekerovih aldehida, koji se formiraju od tih amino-kiselina.
[0281] Štrekerovi aldehidi su važni sastojci "odležale (aged)" arome u pivu koja delom potiče od amino-kiselina samog flaširanog piva. Amino-kiseline za koje je pokazano da učestvuju u formiranju Štrekerovih aldehida sa niskim senzornim pragom uključuju valin, izoleucin, leucin, metionin i fenilalanin (Tabela 2). Formiranje Štrekerovih aldehida igra presudnu ulogu pošto povećanje njihove koncentracije daje povećanu senzornu percepciju "odležalih aroma". Pivo fermentisano sa hibridnim kvascem 1 imaće tada manje odležalih aroma zbog veće potrošnje amino-kiselina.
Tabela 2. Amino-kiseline koje deluju kao prekursori u formiranju Štrekerovih aldehida nepoželjne arome.
[0282] Pripremljena je druga fermentacija sa lager kvascem 2, hibridnim kvascem 4 ili hibridnim kvascem 7 i određena je koncentracija amino-kiseline u "zelenom pivu" na dan 7 fermentacije. Rezultat je prikazan u Tabeli 6b. Eksperimentalne postavke bile su kao što je opisano u Primeru 2 i urađena je analiza amino-kiselina kao što je opisano u Primeru 9. Hibridi, posebno hibridni kvasac 7, ima manje amino-kiselina preostalih u "zelenom pivu" od lager kvasca 2; to znači da je tamo manje prekursora za formiranje jedinjenja za odležalost u pivu;
Tabela 6b
Reference
[0283] Baert, J. J., J. De Clippeleer, P. S. Hughes, L. De Cooman i G. Aerts (2012). "On the Origin of Free and Bound Staling Aldehydes in Beer." Journal of Agricultural and Food Chemistry 60(46): 11449-11472.
Clapperton, J. F. i I. C. MacWilliam (1971). "Fermentation of minor wort carbohydrates by brewing yeasts." Journal of the Institute of Brewing 77(6): 519-522.
Deng, X., M. Petitjean, M. A. Teste, W. Kooli, S. Tranier, J. M. Francois i J. L. Parrou (2014). "Similarities and differences in the biochemical and enzymological properties of the four isomaltases from Saccharomyces cerevisiae." FEBS Open Bio 4: 200-212.
Teste, M. A., J. M. Francois i J. L. Parrou (2010). "Characterization of a new multigene family encoding isomaltases in the yeast Saccharomyces cerevisiae, the IMA family." J Biol Chem 285(35): 26815-26824.
Primer 5
[0284] 50 L piva pripremljeno je kao što je specificirano u Primeru 3 inokulacijom konvencionalne sladovine na bazi slada (16 ° Plato) pripremljene od dve različite vrste slada.
[0285] Konvencionalna sladovina na bazi slada inokulirana je sa 10 miliona vijabilnih ćelija/ml kvasca nakon čega je sledila fermentacija na 16 °C sve dok je diacetil bio ispod praga u pivu koji je specificiran u Primeru 1.
[0286] Drugi slad je inokuliran sa 15 miliona vijabilnih ćelija/ml kvasca nakon čega je sledila fermentacija na 16 °C za lager kvasac 1 i 18 °C za hibridni kvasac 1, sve dok je diacetil bio ispod praga u pivu koji je specificiran u Primeru 1.
[0287] Upotrebljena su 2 različita soja kvasca i dve različite sladovine napravljene od 2 različita slada. Korišćeni su ista sladovina i uslovi fermentacije da se uporede 2 soja paralelno.
Lager kvasac 1
Hibridni kvasac 1
[0288] Nivo izomaltoze i panoze u pivu određen je pomoću HPLC. Rezultati su prikazani u Tabeli 7.
Tabela 7
1
[0289] Početna koncentracija panoze i izomaltoze zavisi od sladovine ali objavljeno je da je u opsegu od 0,5 do 1 g/L izomaltoze i 0,4 do 0,8 g/L panoze (Clapperton et al. 1971). Stoga, veruje se da Hibridni kvasac 1 koristi u opsegu od 60% do 93% panoze.
[0290] Kvantitativni podaci korišćenja panoze i izomaltoze dobijeni su merenjem rasta različitih kvasaca u definisanom medijumu sa 2 g/L panoze ili 2 g/L izomaltoze kao jedinim izvorima ugljenika:
Ćelije kvasca iz zamrznutih štokova razmazane su na YPD ploče (1% ekstrakt kvasca, 2% pepton, 2% glukoza i 2% agar-agar) i rastuće ćelije su inokulirane u tečni YPD (1% ekstrakt kvasca, 2% pepton, 2% glukoza).
[0291] 3μL tečne YPD kulture koja je odležala preko noći inokulirano je u 100 μL YNB kulture (6,7 g/L) bez amino-kiselina ali sa amonijum sulfatom i puferisane sa kalijum hidrogen ftalatom na pH 5,5 (Hahn-Hagerdal B. et al. 2005) i sa 2 g/L panoze ili 2 g/L izomaltoze kao jedinim izvorima ugljenika. Ćelijski rast je praćen merenjem optičke gustine na 600 nm sa neprekidnim mešanjem i inkubacijom na temperaturi od 20 °C upotrebom Bioscreen C MBR (Oy Growth Curves Ab Ltd, Finska).
Odabrani hibridni sojevi lager i ejl kvasaca sa poboljšanim izvođenjem fermentacije stekli su sposobnost da koriste panozu (Slika 1A) i izomaltozu (Slika 2). Ovo poboljšanje korišćenja šećera je pokazano kao primer sa dva hibrida na Slikama 1A i 2A.
[0292] Slični eksperimenti su izvedeni sa ejl kvascem 1, lager kvascem 2 i hibridnim kvascem 7, kao i sa S. diastaticus i hibridnim kvascem 8 upotrebljavajući definisan medijum sa 2 g/L panoze kao jedinim izvorom ugljenika. Rezultati su prikazani na Slikama 1B i 1C, respektivno, i reprezentativni su od bioloških replikata. Kao što se može videti ni lager kvasac 1, ni lager kvasac 2, ni S. diastaticus nisu sposobni da koriste panozu kao jedini izvor ugljenika.
[0293] Slični eksperimenti su takođe izvedeni sa ejl kvascem 1, lager kvascem 2 i hibridnim kvascem 7 upotrebljavajući definisan medijum sa 2 g/L izomaltoze kao jedinim izvorom
2
ugljenika. Rezultati su prikazani na Slici 2B i reprezentativni su od bioloških replikata. Kao što se može videti ni lager kvasac 1, ni lager kvasac 2, ni S. diastaticus nisu sposobni da koriste izomaltozu kao jedini izvor ugljenika.
Reference
[0294] Clapperton J F, MacWilliam I C (1971) Fermentation of minor wort carbohydrates by brewing yeasts. Journal of the Institute of Brewing 77, 6: 519-522.
[0295] Hahn-Hagerdal B, Karhumaa K, Larsson CU, Gorwa-Grauslund M, Görgens J, van Zyl WH. (2005) . Role of cultivation media in the development of yeast strains for large scale industrial use. Microbial Cell Factories 10: 4-31.
Primer 6
[0296] Ćelije kvasca iz zamrznutih štokova razmazane su na YPD ploče. Upotrebljene su za inokulaciju 3 ml tečnog YPD i uzgajane preko noći uz mešanje na 22 °C u epruvetama od 15 ml. 3 ml uzgojene kulture je centrifugirano, supernatant je odbačen i ćelije su rastvorene u vodi. Epruvete su ponovo centrifugirane, supernatant je odbačen i rastvoren u 3 ml vode.
[0297] Izmerena je optička gustina (OD620 nm) i podešena tako da počinje na OD=0,2 za sve sojeve i rastvore bunarića na pločama sa 96 bunarića koje komercijalno obezbeđuje Biolog Inc. technology (Hayward CA, SAD). Svi rastvori sa Biolog ploča su specificirani za postupke sa S. cerevisiae i drugim kvascima. Ploče sa 96 bunarića su inkubirane tokom 4,5 dana na 22 °C.
[0298] Biolog sistem omogućava kvantitativno testiranje nivoa hiljada ćelijskih fenotipova u jednom eksperimentu. Svaki bunarić testa dizajniran je za testiranje jednog individualnog fenotipa. Biolog upotrebljava redoks hemiju kao sistem generalnog izveštavanja za analizu ćelijske respiracije. Ima tetrazolijum boju koja se redukuje, razvijajući boju, kada ćelija može da respirira jedinjenje koje je prisutno u bunariću ili u prisustvu jedinjenja u tom specifičnom bunariću.
[0299] Upoređena su tri soja kvasca, 2 roditeljska soja (lager kvasac 1 i ejl kvasac 1) i rezultujući hibrid (hibridni kvasac 1). Detalji o sojevima kvasca obezbeđeni su u Primeru 1. U nekim od uslova 3 soja su prikazala razlike u fenotipu. Hibridni soj 1 bio je u stanju da stekne nove fenotipske karakteristike na primer sposobnost da koristi nekoliko dipeptida i neke tripeptide (videti Tabelu 8a).
Tabela 8a
[0300] U sličnom eksperimentu poređeno je 6 sojeva kvasca, naime, sojevi lager kvasca 1, lager kvasca 2, ejl kvasca 1, hibridnog kvasca 1, hibridnog kvasca 4 i hibridnog kvasca 7. Rezultati su prikazani ovde ispod u Tabeli 8b. Kao što se vidi hibridi imaju nova svojstva koja se ne uočavaju kod roditelja. Lager kvasac 1 je pokazao manji rast na Ile-Asn u ovom eksperimentu, iako nije uočen rast u prethodnom eksperimentu. Međutim, rast lager kvasca 1 bio je ipak značajno manji od rasta hibridnog kvasca 1.
Tabela 8b
4
[0301] Hibridni kvasac 4 i 7 nisu pokazali značajan rast na Met-Tyr, Leu-Tyr, Phe-Tyr, Ile-Leu ili Gly-Gly-Gly kao jedinom izvoru azota.
[0302] Hibridni kvasac 1 takođe je stekao nekoliko fenotipova koji nisu pronađeni u lager kvascu 1, na primer sposobnost da raste na nekoliko dipeptida koji imaju formulu Ala-Xaa, pri čemu Xaa može biti bilo koja amino-kiselina. Ova sposobnost je često povezana sa sposobnošću korišćenja alantoina, koji je hibridni kvasac takođe sposoban da koristi (videti Tabelu 9a).
Tabela 9a
[0303] Takođe hibridni kvasac 4 i 7 sposobni su da koriste Ala-Xaa dipeptide kao jedini izvor azota kao što je prikazano u Tabeli 9b.
Tabela 9b
[0304] Dipeptidi i tripeptidi su deo FAN. FAN je slobodni amino azot, i on je mera za sadržaj azota sladovine ili piva. FAN je napravljen od amino-kiselina, amonijum jona i malih peptida koji su u sladovini i oni obezbeđuju poželjno izvođenje fermentacije za kvasac (Lekkas C, et al. 2009). Mnogo različitih dipeptidnih kombinacija se može naći u sladovini.
[0305] Hibridni kvasac 1 može da koristi nekoliko različitih testiranih dipeptida/tripeptida koji mogu biti prisutni u sladovini i ima zato veći opseg supstrata od FAN koji mogu biti prekursori za ćelijsku biomasu, izvor ugljenika ili prekursori za arome.
Reference
[0306] Lekkas C, Hill AE, Taidi B, Hodgson J, Stewart GG (2009). The role of small wort peptides in brewing fermentations. J. Inst. Brew.115 (2), 134-139.
Primer 7
[0307] Kvalitativni podaci o korišćenju melibioze izvedeni su replika-zasejavanjem YPD tečnih kultura kvasca uzgajanih u ploči sa 96 bunarića u ploče YPGalaktoze (1% ekstrakt kvasca, 2% pepton, 2% galaktoza i 2% agar-agar) sa 50 μg/ml x-alfa-gal (Clontech, Mountain View, SAD) i inkubiranjem ploča tokom 5 dana na 22 °C. X-alfa gal je hromogeni analog melibioze i ukoliko je kvasac sposoban da koristi melibiozu kolonija kvasca će postati plava i ukoliko kvasac nije sposoban da koristi melibiozu tada će kolonija kvasca biti bela.
[0308] Rezultati prikazuju (Tabela 9) da su svi testirani lager kvasci bili pozitivni na korišćenje melibioze (plava boja kolonije), svi testirani ejl kvasci bili su negativni na korišćenje melibioze (bela boja kolonije) i hibridi su bili pozitivni ili negativni na korišćenje melibioze (plava ili bela boja kolonije) u zavisnosti od toga šta su nasledili.
Tabela 9
[0309] Kvantitativni podaci melibioze urađeni su merenjem rasta kvasca u definisanom medijumu sa 2 g/L melibioze kao jedinim izvorom ugljenika:
Ćelije kvasca iz zamrznutih štokova razmazane su na YPD ploče i rastuće ćelije su inokulirane u tečni YPD.
[0310] 3μL tečne YPD kulture koja je odležala preko noći inokulirano je u 100 μL YNB kulture (6,7 g/L) bez amino-kiselina ali sa amonijum sulfatom puferisane sa kalijum hidrogen ftalatom na pH 5,5 (Hahn-Hagerdal B. et al. 2005) i sa 2 g/L melibioze kao izvorom ugljenika. Ćelijski rast je praćen merenjem optičke gustine na 600 nm sa
[0311] kontinuiranim mešanjem i inkubacijom na temperaturi od 20 °C upotrebom Bioscreen C MBR (Oy Growth Curves Ab Ltd, Finska). Hibridi lagera i ejla stekli su sposobnost da koriste melibiozu, ali ne svi hibridi (ovo je pokazano kao primer sa tri hibrida na Slici 3)
Reference:
[0312] Hahn-Hagerdal B, Karhumaa K, Larsson CU, Gorwa-Grauslund M, Görgens J, van Zyl WH. (2005) . Role of cultivation media in the development of yeast strains for large scale industrial use. Microbial Cell Factories 10: 4-31.
Primer 8
Poboljšano korišćenje disaharida i trisaharida
[0313] 50 L piva pripremljeno je kao što je specificirano u Primeru 3 inokulacijom sladovine na bazi slada sa 15 miliona vijabilnih ćelija/ml nakon čega je sledila fermentacija sve dok je diacetil bio ispod 30 ppb. Slad je pripremljen od konvencionalnog ječma za slad, ili od null-LOX ječma.
[0314] Upotrebljena su 2 različita soja kvasca: lager kvasac 1 i hibridni kvasac 1. Korišćeni su ista sladovina i uslovi fermentacije da se uporede 2 soja paralelno osim što je fermentacija sa lager kvascem 1 izvedena na 18 °C dok je fermentacija sa hibridnim kvascem 1 izvedena na 16 °C. Pripremljena su tri nezavisna varenja sa istim sojevima i nivo različitih šećera određen je pomoću NMR, Reprezentativni rezultati su prikazani na Slici 4 za nivoe specifičnih šećera koji su bili različiti u konačnom flaširanom pivu.
[0315] NMR rezultati prikazuju da je hibridni kvasac 1 imao poboljšano korišćenje izomaltoze, panoze, nigeroze, kojibioze i drugih neidentifikovanih ugljenih hidrata (Slika 4). Međutim lager kvasac 1 nije sposoban da koristi te šećere.
[0316] Disaharid izomaltoza, maltuloza i trisaharidi panoza i maltotriuloza su manje zastupljeni šećeri u medijumu sladovine koji se upotrebljava za varenje piva (Clapperton i MacWilliam 1971). Naši rezultati prikazuju da ima i drugih disaharida kao što su nigeroza, kojibioza i trehaloza koji su bili prisutni u pivu varenom sa lager kvascem 1 (Slika 4). Poboljšanje korišćenja šećera tih šećera koji su prisutni u malim količinama može doprineti boljem ukupnom korišćenju šećera i poboljšanju prinosa proizvodnje etanola hibridnim kvascem 1.
Primer 9
[0317] 50 L piva iz generacije 1 pripremljeno je inokulacijom konvencionalne sladovine na bazi slada (13,6° Plato) pripremljene od svog slada sa 15 miliona vijabilnih ćelija kvasca/ml kao inokulumom nakon čega je sledila fermentacija na 18° C tokom 5 dana i na 14° C tokom 2 dana. Ćelijski inokulum je dobijen iz prethodnog rezervoara za propagaciju. Slad upotrebljen za pripremu sladovine je kupljen od DMG u Danskoj. Na dan 6, uzorci fermentisane sladovine, koji odgovaraju uzorcima "zelenog piva", uzeti su i centrifugirani i supernatant je zamrznut na -20 °C dok nije bio analiziran (Tabela 10). Koncentracija slobodnih amino-kiselina određena je pomoću UPLC sa Photo Diode Array detekcijom upotrebom AccQ-Tag Ultra derivatizacionog kompleta od Waters, suštinski onako kao što je opisano od strane dobavljača. Razdvajanja su izvršena na Waters AccQ-Tag Ultra Amino acid Analysis Column upotrebom prethodno pomešanih eluenata A i B u skladu sa uputstvima proizvođača (Waters). Uzorak originalne sladovine upotrebljene za fermentaciju takođe je upoređen sa uzorcima koji su fermentisani. Koncentracija amino-kiseline je upoređena između svih uzoraka zelenog piva prema uzorku originalne sladovine (Tabela 10).
[0318] Nivo rezidualnih amino-kiselina u zelenom pivu fermentisanom sa hibridnim kvascima je mnogo niži u poređenju sa zelenim pivom fermentisanim sa lager kvascem 1, što je korisno u smislu starenja piva i stabilnosti piva. Veruje se da će se u pivu napravljenom sa hibridnim kvascima formirati manje Štrekerovih aldehida od tih amino-kiselina tokom skladištenja. Štrekerovi aldehidi su važni sastojci "odležale" arome u pivu koja delom potiče od amino-kiselina samog flaširanog piva. Amino-kiseline za koje je pokazano da formiraju Štrekerove aldehide sa niskim senzornim pragom su valin, izoleucin, leucin, metionin i fenilalanin (Baert, De Clippeleer et al. 2012). Formiranje Štrekerovih aldehida igra presudnu ulogu pošto povećanje njihove koncentracije daje povećanu senzornu percepciju "odležalih aroma". Pivo vareno sa hibridnim kvascem 1 i 4 imaće manje odležalih aroma zbog veće potrošnje amino-kiselina i ovaj efekat će biti izraženiji u fermentacijama visoke gustine ili sladovima sladovine sa većom koncentracijom izvora FAN.
[0319] Amino-kiselina prolin je takođe korišćena od strane hibridnih kvasaca 1 i 4 ali ne od strane lager kvasca u zelenom pivu. Amino-kiselina prolin je glavni sastojak amino-kiselina u sladovini mada je najteže asimilirati je tako da će hibridni kvasci sa poboljšanim korišćenjem prolina imati ovu ekstra sposobnost korišćenja ovog izvora azota koji lager kvasac ne može da koristi.
Tabela 10. Analiza amino-kiselina (mg/L) zelenog piva od dana
Primer 10
[0320] Sekvenca genoma hibribnog kvasca 1 koji je opisan u Primeru 1 određena je kao što sledi.
[0321] LGC Genomics GmbH (Berlin, Nemačka) je izvršio ekstrakciju DNK genoma i sekvenciranje celog genoma i asembliranje genoma. Za ekstra pojedinačno sekvenciranje gena, ekstrakcija DNK genoma sojeva izvršena je pomoću MasterPure TM Yeast DNA Purification kompleta (Epicentre, Ilumina Denmark ApS, Kopenhagen, Danska). PCR amplifikacija iz DNK genoma izvedena je sa High Fidelity PCR smešom enzima ili Dream
1
Taq polimerazom sa malim brojem PCR ciklusa, oba iz Thermo Fisher Scientific Baltics UAB (Vilnius, Litvanija). PCR proizvodi su prečišćeni pomoću NucleoSpin PCR Clean-up (Macherey-Nagel, Düren, Nemačka). Kloniranje PCR proizvoda izvedeno je sa TOPO®TA Cloning® kompletom za sekvenciranje i odabrani su na LB ampicilin pločama suplementovanim sa beta-X-galaktozom. Plazmidi su prečišćeni sa GeneJET Plasmid Miniprep kompletom iz Thermo Fisher Scientific Baltics UAB (Vilnius, Litvanija). Sekvenciranje plazmida izvršeno je u Eurofins Genomics (Ebersberg, Nemačka).
[0322] Hibridni kvasac 1, lager kvasac 1 i ejl kvasac 1 analizirani su za različite odabrane gene upotrebom bilo asemblirane sekvence genoma i/ili sekvence PCR proizvoda. Proteinska sekvenca je izvedena iz sekvence gena ili iz sekvence PCR proizvoda upotrebom genetičkog koda.
[0323] Hibridni kvasac 4, hibridni kvasac 7 i lager kvasac 2 analizirani su za različite odabrane gene upotrebom sekvence PCR proizvoda. Sekvence su dobijene PCR amplifikacijom sa High Fidelity PCR enzimom, nakon čega je sledilo kloniranje i sekvenciranje pojedinačnih PCR klonova kada je to primenljivo. Alelni geni hibridnog kvasca 4 i hibridnog kvasca 7 identifikovani su pomoću PCR, kloniranjem i sekvenciranjem. Alelni geni lager kvasca 2 identifikovani su pomoću PCR i sekvenciranjem (IMA1) ili je asembliran iz sekvence genoma (AGT1). Proteinska sekvenca je izvedena iz sekvence PCR proizvoda upotrebom genetičkog koda.
[0324] Ovde predstavljeni DUGI-IMA1 aleli definisani su pomoću kombinacije 3 aminokiseline: I (izoleucin) ili T (treonin) na poziciji 165, R (arginin) ili K (lizin) na poziciji 287, i Y (tirozin) ili F (fenilalanin) na poziciji 336. Motiv potpisa amino-kiseline za ejl 1 DUGI_IMA 1 alele je I-R-F i I-K-F. Lager kvasac 1 i lager kvasac 2 imaju T-R-Y motiv. Hibridni kvasac 1 sadrži I-K-F alel i T-R-Y alel. Hibridni kvasac 4 sadrži I-R-F motiv. Hibridni kvasac 4 takođe sadrži novi hibridni alel sa motivom potpisa I-R-Y. Hibridni kvasac 7 sadrži I-K-F alel, i T-R-Y alel. Hibridni kvasac 7 takođe sadrži novi hibridni alel sa I-R-Y motivom koji je identičan proteinu koji kodira hibridni kvasac_4.
[0325] Tabela 11a sumira status različitih gena koji su uključeni u korišćenje dipeptida u lager kvascu 1, ejl kvascu 1 i hibridnom kvascu 1.
Tabela 11a
2
[0326] Dodatno su proučavane sekvence genoma hibridnog kvasca 1 i hibridnog kvasca 7 i rezultati su sumirani u Tabeli 11b. Te se analize zasnivaju na sekvencama genoma koje su dostupne pod DDBJ/EMBL/GenBank pristupnim brojem LOQJ00000000, verzija LOQJ01000000 i DDBJ/EMBL/GenBank pristupom LOQK00000000, verzija LOQK01000000TPTR2, respektivno.
[0327] PTR2 analiza alelnih varijacija izvršena je na osnovu sekvenci genoma (videti pristupne brojeve iznad). Hibridni kvasac 1 i hibridni kvasac 7 su oba zadržala neSc_PTR2 kopiju. U Tabeli 11a predstavljena je fragmentisana Sc_kopija hibridnog kvasca 1. Tabela 11b prikazuje intaktnu kopiju Sc_PTR2 u hibridnom kvascu 1 u sekvenci genoma. Moguće je da hibridni kvasac 1 sadrži 3 alela koji kodiraju PTR2 kao što je navedeno u Tabeli 11a. Hibridni kvasac 7 takođe ima Sc_PTR2. U oba hibrida Sc_PTR2 proteinska sekvenca pokazuje hibridizaciju između Sc_PTR2 ejl kvasca 1 i Sc_PTR2 lager kvasca 1 i 2 kopija.
[0328] DAL5 analiza alelnih varijacija izvršena je na osnovu sekvenci genoma (videti pristupne brojeve iznad). Hibridni kvasac 1 i hibridni kvasac 7 zadržali su Sc_DAL5 od ejl kvasca 1. Hibridni kvasac 7 je takođe zadržao neSc_DAL5.
UBR1 analiza alelnih varijacija izvršena je na osnovu sekvenci genoma (videti pristupne brojeve iznad). Oba lager roditeljska kvasca imaju Sc_kopiju koja je različito skraćena. Ranije, lager 1 pretraga genomskih podataka donela je samo fragmentisanu sekvencu koja nije omogućavala da se odredi rani stop kodon. Oba hibridna kvasca zadržala su neSc_UBR1 od lager roditelja. Sc_kopija detektovana u oba hibrida nasleđena je od ejl 1 roditelja.
Tabela 11b
4
Tabela 12a sumira status različitih gena koji su uključeni u korišćenje šećera u lager kvascu 1, ejl kvascu 1 i hibridnom kvascu 1.
Tabela 12b sumira status različitih gena koji su uključeni u korišćenje šećera u lager kvascu 2, hibridnom kvascu 4 i hibridnom kvascu 7.
[0329] Nekoliko gena može biti uključeno u korišćenje izomaltoze. Ovo uključuje Agt1p koji je transporter šećera koji može da transportuje izomaltozu. Osim toga, postoji 5 različitih enzima izomaltaze koji su alfa-1,6-glukozidaze ali koji takođe imaju aktivnosti druge glukozidaze.
[0330] Na osnovu informacija o sekvenci genoma nijedan IMA1 gen sa punom kodirajućom sekvencom nije bio identifikovan u lager kvascu 1 i drugi sojevi S. pastorianus pronađeni u NCBI bazi podataka takođe nisu imali kopiju S. cerevisiae IMA1 gena. Zanimljivo je da hibridni kvasac 1 sadrži 4 različita alela IMA1 gena dve različite dužine.
[0331] Sekvenca IMA5-sličnog prisutna je u genomu lager kvasca 1. U hibridnom kvascu 1 postojala su 2 alela, jedna Ne-S. cerevisiae kopija identična sa lager kvascem 1 i jedna S.
cerevisiae kopija veoma nalik na sekvencu pronađenu u ejl 1 kvascu ali sa 3 amino-kiselinske promene.
[0332] Pokazano je da je transport maltotrioze i izomaltoze olakšan od strane alfaglukozidnog transportera visokog afiniteta koji je kodiran AGT1 genom. Ovaj transporter ima široku specifičnost supstrata.
[0333] Pronašli smo u lager kvascu 1 samo jednu punu kopiju AGT1 transportera poreklom od Ne-S. cerevisiae, S. cerevisiae kopija je bila skraćena. Nasuprot tome hibridni kvasac 1 imao je 3 pune kopije AGT1 gena, jednu identičnu sa ne-S. cerevisiae kopijom pronađenom u lager kvascu 1, i dva S. cerevisiae alela veoma nalik na AGT1 gene koji su pronađeni u ejl kvascu 1 ali svaki sa jednom amino-kiselinskom promenom.
[0334] U hibridnom kvascu 4, 2 kopije pune dužine Ne-S. cerevisiae AGT1 su identifikovane sa jednom kopijom koja nosi 1 amino-kiselinsku promenu. U hibridnom kvascu 7 identifikovane su 3 kopije pune dužine: jedna potpuno identična sa AGT1 ejl kvasca 1, i 2 alela ne-S. cerevisiae AGT1 sa jednom kopijom koja nosi 1 amino-kiselinsku promenu.
[0335] Pored proučavanja sekvence genoma kao što je opisano iznad, dodatne informacije su dobijene o IMA1 kratkom u lager kvascu 1 i lager kvascu 2, kao i u hibridnom kvascu 1, hibridnom kvascu 4 i hibridnom kvascu 7 kloniranjem i sekvenciranjem upotrebom specifičnih prajmera za IMA1_kratki lokus ejl kvasca 1 kao što je opisano iznad. Na osnovu informacija o sekvenci genoma, nijedan IMA1_kratki gen nije pronađen u sekvencama genoma lager 1 i lager 2 kvasaca. Međutim, kloniranje i sekvenciranje IMA1-kratkog iz oba roditeljska lager kvasca pokazalo je da je jedan gen prisutan, ali on kodira protein sa 6 aminokiselina razlike od odgovarajućeg IMA1 kratkog proteina ejl kvasca 1. Podaci su sumirani u Tabeli 12c ispod.
[0336] U kloniranju i sekvenciranju hibridnog kvasca 1 identifikovana su 3 IMA1 kratka alela - dva alela opisana ovde iznad i dodatni alel sa hibridnom prirodom na osnovu nukleotidne sekvence i takođe na nivou proteina (proteinska sekvenca obezbeđena kao SEQ ID NO: 1). Hibridni kvasci 4 i 7 su zadržali IMA1_kratki od oba roditelja, ali kloniranje je takođe identifikovalo dodatne alele sa jedinstvenim amino-kiselinskim promenama u oba hibrida. Stoga, sva tri hibridna soja su sadržala 3 IMA1 kratka alela.
[0337] IMA5 analiza alelnih varijacija izvršena je na osnovu sekvenci dostupnih u sekvencama genoma. Pored alela opisanih iznad u Tabeli 12a, hibridni kvasac 1 sadržao je jedan dodatni alel. Stoga su hibridni kvasac 1 i hibridni kvasac 7 oba zadržala Sc_IMA5 i neSc_IMA5 kopije. Hibridni kvasac 7 ima jedinstven hibridni Sc_IMA5 alel koji rezultira iz rekombinacije između ejl kvasca 1 i lager kvasca 2 na Sc_IMA5 lokusu. Hibridizacija je očigledna iz nukleotidnih sekvenci, i vidljiva je na proteinskoj sekvenci.
Tabela 12c
1
Primer 11
[0338] Podaci korišćenja maltuloze, maltotrioze i kojibioze dobijeni su merenjem rasta različitih kvasaca u definisanom medijumu sa 2 g/L maltuloze ili 2 g/L maltotrioze ili 2 g/L kojibioze kao jedinim izvorima ugljenika:
Ćelije kvasca iz zamrznutih štokova razmazane su na YPD ploče (1% ekstrakt kvasca, 2% pepton, 2% glukoza i 2% agar-agar) i rastuće ćelije su inokulirane u tečni YPD (1% ekstrakt kvasca, 2% pepton, 2% glukoza).
[0339] 3μL tečne YPD kulture koja je odležala preko noći inokulirano je u 100 μL YNB kulture (6,7 g/L) bez amino-kiselina ali sa amonijum sulfatom i puferisane sa kalijum hidrogen ftalatom na pH 5,5 (Hahn-Hagerdal B. et al. 2005) i sa 2 g/L maltuloze ili 2 g/L maltotrioze ili 2 g/L kojibioze kao jedinim izvorima ugljenika.
[0340] Ćelijski rast je praćen merenjem optičke gustine na 600 nm sa neprekidnim mešanjem i inkubacijom na temperaturi od 20 °C upotrebom Bioscreen C MBR (Oy Growth Curves Ab Ltd, Finska).
[0341] Testirano je da li su ejl kvasac 1, hibridni kvasac 1, hibridni kvasac 4 i hibridni kvas 7 sposobni da koriste maltotriozu kao jedini izvor ugljenika. Rezultati su prikazani na slici 13.
1 1
[0342] Takođe je testirano da li su ejl kvasac 1, hibridni kvasac 1, hibridni kvasac 4, hibridni kvasac 7, S. diastaticus i hibridni kvasac 8 sposobni da koriste maltulozu kao jedini izvor ugljenika. Rezultati su prikazani na slici 14.
[0343] Takođe je testirano da li su ejl kvasac 1, lager kvasac 1, lager kvasac 2, S. diastaticus, hibridni kvasac 1, hibridni kvasac 4, hibridni kvasac 7 i hibridni kvasac 8 sposobni da koriste kojibiozu kao jedini izvor ugljenika. Rezultati su prikazani na slici 15. Kao što se može videti, ni lager kvasac 1 ni lager kvasac 2 ne mogu da koriste kojibiozu kao jedini izvor ugljenika, dok samo S. diastaticus može da koristi kojibiozu kao jedini izvor ugljenika veoma slabo.
Primer 12
[0344] Da bi dodatno istražili pravi stepen fermentacije dobijen kada se fermentiše upotrebom hibridnog kvasca 7, izvedeni su pokušaji velikih razmera. Sladovina pripremljena u velikoj razmeri od različitih smeša fermentisana je na različitim lokacijama bilo sa lager kvascem 2 ili sa hibridnim kvascem 7 sve dok je diacetil bio po spec. Određen je pravi stepen fermentacije (RDF). Tabela 13 prikazuje apsolutno povećanje %RDF dobijenog posle fermentacije sa hibridnim kvascem 7 u poređenju sa RDF dobijenim posle fermentacije sa lager kvascem 2.
[0345] Sladovina je pripremljena mešanjem različitih odnosa slada, ječma (tj. nemaltiranih zrna ječma) i pirinča. Pored toga dodate su različite količine glukoznog sirupa. Odnosi slad:ječam:glukozni sirup:pirinač koji se upotrebljavaju za pripremu različitih sladovina takođe su navedeni u tabeli 13.
Tabela 13
Skraćenice
[0346]
1 2
RDF - pravi stepen fermentacije
YPD - (1% ekstrakt kvasca, 2% pepton, 2% glukoza)
YPD ploče (1% ekstrakt kvasca, 2% pepton, 2% glukoza i 2% agar-agar) YNB (azotna baza kvasca)
OD: Optička gustina
HPLC: Tečna hromatografija visokih performansi
YPGalaktozne ploče (1% ekstrakt kvasca, 2% pepton, 2% galaktoza i 2% agar-agar)
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Ćelija kvasca naznačena time što ima sledeće karakteristike i genotipove:
karakteristika II: sposobna da koristi panozu kao jedini izvor ugljenika; i genotip IV: koji sadrži najmanje 3 gena koji kodiraju IMA1p, pri čemu je IMA1p odabran iz grupe koja se sastoji od IMA1p SEQ ID NO: 12, IMA1p SEQ ID NO: 13, IMA1p SEQ ID NO: 14, IMA1p SEQ ID NO: 15, IMA1p SEQ ID NO: 21, IMA1p SEQ ID NO: 22, IMA1p SEQ ID NO: 23, IMA1p SEQ ID NO: 24, IMA1p SEQ ID NO: 25 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima; i genotip VI: koji sadrži najmanje 2 gena koji kodiraju AGT1 odabran iz grupe koja se sastoji od AGT1 SEQ ID NO: 18, AGT1 SEQ ID NO: 19, AGT1 SEQ ID NO: 20, AGT1 SEQ ID NO: 27, AGT1 SEQ ID NO: 28, AGT1 SEQ ID NO: 30, AGT1 SEQ ID NO: 31, AGT1 SEQ ID NO: 32 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima; i
karakteristika VIII: sposobna da koristi melibiozu kao jedini izvor ugljenika.
2. Ćelija kvasca u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačena time što ćelija kvasca osim toga ima karakteristiku:
I. sposobna da koristi izomaltozu kao jedini izvor ugljenika.
3. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što ćelija kvasca dodatno ima karakteristiku(e):
III. sposobna da koristi jedan ili više dipeptida kao jedini izvor azota i/ili IV. sposobna da koristi jedan ili više tripeptida kao jedini izvor azota.
4. Ćelija kvasca u skladu sa patentnim zahtevom 3, naznačena time što su dipeptidi odabrani iz grupe koja se sastoji od Met-Tyr, Leu-Tyr, Val-Met, Phe-Tyr, Ile-Leu, Ile-Asn, Gly-Arg, Lys-Tyr, Met-Lys, Val-Ala, Val-Asn, Val-Gly, Val-Gln, Val-Ser ili Ala-Xaa, pri čemu je Xaa bilo koja amino-kiselina.
5. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što ćelija kvasca dodatno ima karakteristiku(e):
VI. sposobna da generiše najmanje 4,7 promila etanola po °Plato, kada se navedena ćelija kvasca doda u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubira sve dok je nivo diacetila po spec; i/ili
VII. sposobna da fermentiše šećer sa pravim stepenom fermentacije od najmanje 68, kao što je najmanje 70, kada se navedena ćelija kvasca doda u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubira sve dok je nivo diacetila po spec.
6. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što je ćelija kvasca dodatno sposobna da fermentiše šećer sa RDF, koji je najmanje 1%, kao što je najmanje 2% veći od RDF jednog od njenih roditeljskih sojeva.
7. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što ćelija kvasca dodatno ima karakteristiku:
X. sposobna za sedimentaciju tako da je najviše 12 miliona, kao što je najviše 10 miliona ćelija/ml u suspenziji kada se navedena ćelija kvasca doda u kompoziciju sladovine koja ima sadržaj šećera od najmanje 10° Plato i inkubira tokom 4 dana.
8. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što ćelija kvasca dodatno ima karakteristiku:
IX. sposobna da koristi jedan ili više disaharida i/ili trisaharida pored izomaltoze, panoze, i/ili melibioze.
9. Ćelija kvasca u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačena time što je disaharid odabran iz grupe koja se sastoji od maltuloze, kojibioze, nigeroze, saharoze, turanoze, leukroze, i palatinoze.
10. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što ćelija kvasca osim toga ima karakteristiku
XI: sposobna da fermentiše sladovinu sa vremenom primarne fermentacije od najviše 4 dana, na primer najviše 3 dana.
11. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što ćelija kvasca ima genotip:
I. koji sadrži gen koji kodira DAL5, pri čemu alelni gen koji kodira DAL5 kodira DAL5 odabran iz grupe koja se sastoji od DAL5 SEQ ID NO: 6, DAL5 SEQ ID NO: 39, DAL5 SEQ ID NO: 40 i njihovih funkcionalnih homologa koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa bilo kojim od prethodno pomenutih.
12. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što ćelija kvasca ima genotip:
II. koji sadrži najmanje 2 alelna gena koji kodiraju PTR2, pri čemu su navedena najmanje dva alelna gena koji kodiraju PTR2 pojedinačno odabrani iz grupe koja se sastoji od gena koji kodiraju PTR2 SEQ ID NO: 7, PTR2 SEQ ID: 8, PRT2 SEQ ID NO: 9, PRT2 koji sadrži SEQ ID NO: 37, PRT2 SEQ ID NO: 38, PRT2 SEQ ID NO: 43, PRT2 SEQ ID NO: 44 i funkcionalnih homologa svakog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
13. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što ćelija kvasca ima genotip:
III. koji sadrži gen koji kodira UBR1, pri čemu je UBR1 na primer odabran iz grupe koja se sastoji od UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 10, UBR1 SEQ ID NO: 11, UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 41, UBR1 SEQ ID NO: 42, UBR1 koji sadrži SEQ ID NO: 45 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
14. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što ćelija kvasca ima genotip:
IV. koji sadrži najmanje 4 gena koji kodiraju IMA1p, pri čemu je IMA1p odabran iz grupe koja se sastoji od IMA1p SEQ ID NO: 12, IMA1p SEQ ID NO: 13, IMA1p SEQ ID NO: 14, IMA1p SEQ ID NO: 15, IMA1p SEQ ID NO: 21, IMA1p SEQ ID NO: 22, IMA1p SEQ ID NO: 23, IMA1p SEQ ID NO: 24, IMA1p SEQ ID NO: 25 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
15. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što ćelija kvasca ima genotip
V. Koji sadrži gen koji kodira IMA5p, poželjno najmanje dva alelna gena koji kodiraju IMA5p, pri čemu je IMA5p na primer odabran iz grupe koja se sastoji od IMA5p SEQ ID NO: 16, IMA5p SEQ ID NO: 17, IMA5p SEQ ID NO: 34, IMA5p SEQ ID NO: 35, IMA5p SEQ ID NO: 36 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
16. Ćelija kvasca u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što ćelija kvasca ima genotip:
VI. koji sadrži najmanje 3 gena koji kodiraju AGT1 odabran iz grupe koja se sastoji od
AGT1 SEQ ID NO: 18, AGT1 SEQ ID NO: 19, AGT1 SEQ ID NO: 20, AGT1 SEQ ID
NO: 26, AGT1 SEQ ID NO: 27, AGT1 SEQ ID NO: 28, AGT1 SEQ ID NO: 29, AGT1
SEQ ID NO: 30, AGT1 SEQ ID NO: 31, AGT1 SEQ ID NO: 32 i funkcionalnih homologa bilo kog od prethodno pomenutih koji dele najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
17. Postupak za proizvodnju napitka, naznačen time što navedeni postupak sadrži korake
a. Obezbeđivanje početne tečnosti
b. Obezbeđivanje ćelije kvasca u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 16
c. Fermentacija navedene početne tečnosti sa navedenom ćelijom kvasca, na taj način proizvodeći napitak.
24
RS20200957A 2014-12-23 2015-12-22 Kvasac za pripremu alkoholnih napitaka RS60649B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201470825 2014-12-23
DKPA201570351 2015-06-08
EP15823588.7A EP3237601B1 (en) 2014-12-23 2015-12-22 Yeast for preparing alcoholic beverages
PCT/DK2015/050413 WO2016101960A2 (en) 2014-12-23 2015-12-22 Yeast for preparing alcoholic beverages

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60649B1 true RS60649B1 (sr) 2020-09-30

Family

ID=55135178

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200957A RS60649B1 (sr) 2014-12-23 2015-12-22 Kvasac za pripremu alkoholnih napitaka

Country Status (13)

Country Link
US (1) US11034931B2 (sr)
EP (1) EP3237601B1 (sr)
JP (1) JP6967968B2 (sr)
CN (1) CN108064270B (sr)
AU (1) AU2015371749B2 (sr)
DK (1) DK3237601T3 (sr)
EA (1) EA037550B1 (sr)
ES (1) ES2812674T3 (sr)
LT (1) LT3237601T (sr)
PL (1) PL3237601T3 (sr)
PT (1) PT3237601T (sr)
RS (1) RS60649B1 (sr)
WO (1) WO2016101960A2 (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6663195B2 (ja) * 2015-09-16 2020-03-11 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料、ビールテイスト飲料の製造方法、及びビールテイスト飲料の香気改善方法
JP6663194B2 (ja) * 2015-09-16 2020-03-11 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料、ビールテイスト飲料の製造方法、及びビールテイスト飲料の香気改善方法
BR112018011902A2 (pt) * 2015-12-17 2018-12-04 Cargill Inc método de fermentação, levedura geneticamente modificada, construto de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, meio de fermentação e utilização da levedura geneticamente modificada
EA202091571A1 (ru) 2017-12-28 2020-10-12 Карлсберг А/С Быстрые способы получения экстрактов зерновых культур
US11028402B2 (en) * 2018-04-06 2021-06-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Polypeptide and yeast cell compositions and methods of using the same
CN108676840A (zh) * 2018-05-28 2018-10-19 广州南沙珠江啤酒有限公司 一种快速检测酵母发酵性能的方法
EP3785529A1 (en) 2019-08-28 2021-03-03 Carlsberg A/S Barley plants with altered protein content in grains
TW202215982A (zh) * 2020-07-02 2022-05-01 日商三得利控股股份有限公司 啤酒風味飲料
PE20260007A1 (es) 2023-03-01 2026-01-06 Carlsberg As Cepas progenie de levaduras de bajo diacetilo

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6433154B1 (en) * 1997-06-12 2002-08-13 Bristol-Myers Squibb Company Functional receptor/kinase chimera in yeast cells
US8257959B2 (en) 2004-06-08 2012-09-04 Microbiogen Pty Ltd Non-recombinant Saccharomyces strains that grow on xylose
CN101144098A (zh) * 2007-07-18 2008-03-19 武汉烁森生物科技有限公司 一种发酵用新型氮源--植物肽素的制备方法及应用
US20110091598A1 (en) * 2008-03-31 2011-04-21 Wm. Wrigley Jr. Company Chewing gum bulking agents
US20140162335A1 (en) * 2011-06-21 2014-06-12 Pedro Esteban Bortiri Recombinant Yeast Expressing AGT1
JP2015503351A (ja) * 2011-12-30 2015-02-02 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー ブタノール生産のための遺伝的スイッチ
JP5998589B2 (ja) * 2012-04-02 2016-09-28 味の素株式会社 γ−Ｇｌｕ−Ｘを含有する酵母
CN103525629A (zh) * 2013-10-28 2014-01-22 哈尔滨艾博雅食品科技开发有限公司 一种固体格瓦斯饮料及其使用方法
US20170073754A1 (en) * 2014-02-07 2017-03-16 Novartis Ag Impact of genetic factors on disease progression and response to anti-c5 antibody in geographic atrophy
EP3158075A2 (en) 2014-06-18 2017-04-26 Cargill, Incorporated Method for fermenting sugars using genetically engineered yeast
BR112018011902A2 (pt) 2015-12-17 2018-12-04 Cargill Inc método de fermentação, levedura geneticamente modificada, construto de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, meio de fermentação e utilização da levedura geneticamente modificada

Also Published As

Publication number Publication date
AU2015371749A1 (en) 2017-07-27
AU2015371749B2 (en) 2019-11-07
DK3237601T3 (da) 2020-08-10
JP2018500034A (ja) 2018-01-11
US20180163168A1 (en) 2018-06-14
EA037550B1 (ru) 2021-04-13
WO2016101960A3 (en) 2016-08-18
ES2812674T3 (es) 2021-03-17
US11034931B2 (en) 2021-06-15
JP6967968B2 (ja) 2021-11-17
CN108064270A (zh) 2018-05-22
PL3237601T3 (pl) 2020-10-19
PT3237601T (pt) 2020-08-20
LT3237601T (lt) 2020-09-10
EP3237601A2 (en) 2017-11-01
EP3237601B1 (en) 2020-05-13
WO2016101960A2 (en) 2016-06-30
CN108064270B (zh) 2022-05-24
EA201791318A1 (ru) 2017-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2015371749B2 (en) Yeast for preparing alcoholic beverages
JP2020000260A (ja) 発酵麦芽飲料及びその製造方法
EP4172301B1 (en) Low diacetyl yeast
JP2025163119A (ja) フェノール系オフフレーバーがない飲料を調製するための酵母
US11535823B2 (en) Hybrid ale yeast strain
AU2024229074A1 (en) Low diacetyl yeast progeny strains
EA046780B1 (ru) Дрожжи с низким содержанием диацетила
HK40091365B (en) Low diacetyl yeast
HK40091365A (en) Low diacetyl yeast
TW202607130A (zh) 生產高水準乙酸異戊酯的酵母菌株
CA3235163A1 (en) Co-cultures for efficiently producing a fermented beverage
WO2026003180A1 (en) Yeast strains producing high levels of isoamyl acetate
Piddocke The effect of high gravity on brewer’s yeast metabolismphysiological studies and “-omics” analyses
EA049232B1 (ru) Дрожжи для получения напитков без фенольного привкуса