RS60697B1 - Imidazo[1,2-a]piridini za lečenje ili prevenciju hiperurikemije ili gihta - Google Patents

Description

Opis

POLJE TEHNIKE

[0001] Ovaj pronalazak je iz polja medicinske hemije a posebno se odnosi na klasu derivata (4-hidroksifenil)(imidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona, na njihove kompozicije i na njihovu primenu u medicini.

POREKLO PRONALASKA

[0002] Giht je metabolička bolest izazvana hroničnim povećanjem vrednosti mokraćne kiseline (sUA) u serumu (hiperurikemija) zbog poremećaja metabolizma purina i/ili zbog nedovoljne eliminacije mokraćne kiseline preko bubrega. Nagomilavanje kristala urata u obliku iglica u zglobovima dovodi do bolnog inflamatornog artritisa. Hiperurikemija, definisana kao koncentracija sUA veća ili jednaka sa 6.8 mg/dL, može da rezultira u precipitaciji urata kao mono-natrijumove soli u sinovijalnoj tečnosti mekog tkiva ljudi, hrskavici perifernih zglobova, ušnoj školjki i čašici lakta. Kada su prisutni ovakvi simptomi, može da se postavi dijagnoza gihta. (Terkeltaub RA. Crystal Deposition Diseases. In:

Goldman L, Ausiello D, eds. The Cecil Textbook of Medicine, 23rd ed. Philadelphia, PA: Saunders Elsevier Co; 2008:2069-2075; Richette P, Bardin T. Gout. Lancet. 2010, 375(9711):318-328).

[0003] Giht je čest tip inflamatornog artritisa i ima incidencu od približno 1%-2%. Incidenca u razvijenim zemljama je relativno visoka, a kako se vidi iz izveštaja za 2007-2008. bilo je približno 8.3 miliona pacijenata sa gihtom u US. U Kini, incidenca gihta je dramatično porasla u poslednjoj dekadi. Objavljeno je da je broj pacijenata sa gihtom u Kini prešao 50 miliona a da je broj muškaraca sa gihtom mnogo veći nego broj žena.

[0004] U ovom trenutku, lekovi za giht obuhvataju kratkotrajni tretman bola i smanjenje inflamacije u toku akutnog napada, inhibiciju produkcije mokraćne kiseline i poboljšanje izlučivanja mokraćne kiseline. Lekovi za tretman akutnog napada gihta uglavnom uključuju hlorokin, ne-steroidne anti-inflamatorne lekove (NSAIDe), adrenokortikotropne hormone i glukokortikoide.

[0005] Dugotrajno lelečenje gihta obuhvata smanjenje formiranja mokraćne kiseline i/ili povećanje izlučivanja mokraćne kiseline preko bubrega. Allopurinol i Uloric su najčešće korišćeni lekovi za smanjenje formiranja mokraćne kiseline. Mehanizam ovih lekova je da smanje formiranje mokraćne kiseline inhibicijom ksantin oksidaze potrebne za transformaciju purina u mokraćnu kiselinu. Urikosurici su druga grupa sada raspoložive terapije za snižavanje urata koji deluju povećanjem eliminacije mokraćne kiseline preko bubrega. Tu spadaju probenecid, sulfinpirazon i benzbromaron itd.

[0006] Tretman akutnog napada gihta može samo da kontroliše simptome i da smanji bol pacijenata ali ne može da smanji koncentraciju sUA. Kolhicin je veoma toksičan, često praćen uobičajenim neželjenim reakcijama kao što su dijareja, povraćanje i pojava bolnih grčeva u stomaku. Allopurinol je jedan od inhibitora ksantin oksidaze. Potrebno je da se uzima u velikoj dozi i kod nekih ljudi može da izazove fatalni Stevens Johnson sindrom (eritema multiforme kože), često praćenog poremećajima u želucu, mučninon, dijarejom, glavoboljom, groznicom, gubitkom apetita, gubitkom težine, bolom pri uriniranju, hematourijom i drugim neželjenim efektima. Naredni inhibitor ksantin oksidaze je Uloric (febuksostat), koji je pokrenut u Evropi i US 2009. godine. Mada Uloric pokazuje dobru efikasnost na sniženju vrednosti mokraćne kiseline u organizmu, takođe ima veoma ozbiljne neželjene efekte kao što su kardiovaskularni problem i gastrointestinalni poremećaj, koji potencijalno izazivaju glavobolje i oštećenje jetre. Benzbromaron ima dobru urikosuričnu efikasnost, ali dovodi do fatalnog oštećenja jetre. I probenecid i sulfinpirazon su urikosurična sredstva koja zahtevaju primenu velike doze uz malu efikasnost i sa lošim neželjenim efektima.

[0007] Mehanizam urikosurika uključuje inhibiciju re-apsorpcije mokraćne kiseline u proksimalnim tubularnim ćelijama da se poveća izlučivanje mokraćne kiseline preko bubrega i smanji koncentracija mokraćne kiseline u krvi. Približno 70% izlučivanja mokraćne kiseline kod ljudi je preko bubrega a kod približno 80-85% pacijenata hiperurikemija je izazvana poremećajem izlučivanja mokraćne kiseline (Cheeseman C. Solute carrier family 2, member 9 i uric acid homeostasis. Current Opinion in Nephrology i Hypertension, 2009, 18 (5): 428-432).

[0008] Izlučivanje mokraćne kiseline igra veoma važnu ulogu u tretmanu hiperurikemije i gihta. Humani transporter 1 anjona urata (hURAT1) se nalazi u proksimalnim tubularnim epitelijalnim ćelijama membrane i čini super člana porodice transportera organskih anjona (OAT), označen kao SLC22A12 gen. Njegova cDNK ima nekoliko mutacija koje izazivaju nenormalan metabolizam mokraćne kiseline. Meta-analiza pokazuje da ovaj gen ima 0.13% promenljivih koje utiču na vrednost mokraćne kiseline u serumu (So A, Thorens B. Uric acid transport i disease. Journal of Clinical Investigation., 2010, 120 (6): 1791-1799). URAT1 kontroliše više od 90% re-apsorpcije mokraćne kiseline nakon glomerularne filtracije. Prema tome, selektivna inhibicija URAT1 može da smanji re-apsorpciju mokraćne kiseline i poboljša izlučivanje mokraćne kiseline u bubrezima i smanji vrednosti mokraćne kiseline u organizmu (Michael FW, Jutabha P, Quada B. Developing potent human uric acid ransporter 1 (hURAT1) inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 2011,54:2701-2713).

[0009] U savremenoj terapiji, benzbromaron kao URAT1 inhibitor se i dalje široko koristi na tržištu u tretmanu gihta. Njegov hemijski naziv je (3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-etilbenzofuran-3-il)metanon, razvila ga je francuska Sanofi-Synthelabo kompanija i pustila u promet 1976. On je najefikasnije urikosurično sredstvo na tržištu i koristi se skoro 40 godina. Ali upotreba benzobromarona nije odobrena u US i povučen je iz najvećeg broja evropskih država 2003. godine zbog svojih neželjenih efekata ozbiljne toksičnosti za jetru (Jansen TL, Reinders MK, van Roon EN i saradnici. Benzbromaron withdrawn from the European market: another case of "absence of evidence is evidence of absence". Clinical Experimental Rheumatology, 2004, 22(5): 651). Drugi nedostatak je što ima jak inhibitorni efekat na CYP2C9 enzim jetre. Međutim, više od 20 zemalja, kao što su Kina, Nemačka, Japan, Brazil i Novi Zeland i dalje ga uveliko koriste zbog nedostatka dobrih lekova za giht na tržištu.

Benzbromaron

[0010] Studije su pokazale da je fulminant ili fatalno oštećenje jetre uzrokovano benzobromaronom povezano sa njegovim reaktivnim metabolitima. Mogući mehanizam toksičnosti za jetru može da uključi bioaktivaciju benzobromarona preko sekvencijalne hidroksilacije benzofuran prstena u oblik 6-hidroksi-benzbromaron i katehol pomoću CYP2C9, koji dalje može da bude oksidisan preko P450s enzima u reaktivni hinon metabolit sposoban da pripoji tiol reagense/cistein ostatke (Matthew G. McDonald, Rettie AE.

Sequential metabolism i bioactivation of the hepatotoxin benzbromaron: formation of glutatione adducts from a catechol intermediate. Chemical Research in Toxicology. 2007, 20 (12):1833-1842). Benzbromaron ima takođe i druge neželjene efekte, kao što su dijareja, stomačni problemi, mučnina, simptomi digestivnog sistema, alergije kože kao što su makula, crvenilo, svrab i tako dalje.

[0011] Trenutno, ozbiljni neželjeni efekti ili na urikosurična sredstva ili inhibitore ksantin oksidaze značajno ometaju dugotrajnu upotrebu ovih lekova za giht. Prema tome, važno je da se razviju lekovi za giht koji su visoko efikasni a imaju malu toksičnost.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

[0012] Obezbeđena je grupa novih derivata (4-hidroksifenil)(imidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona kao URAT1 inhibitora, postupci za njihovu izradu i povezani sintetički međuproizvodi i kompozicije. Rezultati ispitivanja i in itro i in vivo pokazuju da jedinjenja iz ovog pronalaska mogu značajno da poboljšaju inhibitorni efekat na URAT1, kao i značajno da povećaju izlučivanje mokraćne kiseline kod miševa i smanje toksičnost na normalne ćelije jetre u poređenju sa benzbromaronom. Tolerisani maksimum oralne doze pri testu akutne toksičnosti na pacovima pokazuje da je toksičnost jedinjenja iz pronalaska mnogo manja nego kod benzbromarona. Studije su pokazala da je jedinjenje iz pronalaska značajno efikasnije pri izlučivanju mokraćne kiseline i da ima malu toksičnost.

0013] Naredni cilj ovog pronalaska je da obezbedi farmaceutsku kompoziciju koja sadrži derivate (4-hidroksi-fenil)(imidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona.

[0014] Pored toga, ovde opisana jedinjenja (4-hidroksifenil)(imidazo[1,2-a]piridin-3-il) metanona su korisna u prevenciji ili tretmanu hiperurikemije, nefropatije ili gihta. Ostvarenja pronalaska mogu da se postignu na sledeći način:

Jedinjenja iz ovog pronalaska su predstavljena Formulom (I)

ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju, pri čemu:

R<1>i R<2>su nezavisno izabrani iz grupe u koju spadaju vodonik, deuterijum, halogen, cijano, hidroksil, C1-5alkil, supstituisana C1-5alkil, C1-3alkoksi, supstituisana C1-3alkoksi, C1-3alkiltio i supstituisana C1-3alkiltio grupa;

R<3>je izabran od supstituisane ili nesupstituisane C1-4alkil i supstituisane ili nesupstituisane C3-4cikloalkil grupe a supstituenti su nezavisno izabrani iz grupe u koju spadaju deuterijum, halogen, C1-2alkil i C3-4cikloalkil grupa;

R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz grupe u koju spadaju halogen, deuterijum, cijano, C2-3alkenil, C2-3alkinil, C1-3alkil, supstituisana C1-3alkil, C1-3alkoksi, supstituisana C1-3alkoksi, C1-3alkiltio i supstituisana C1-3alkiltio grupa; gde su supstituenti u R<1>, R<2>, R<4>i R<5>nezavisno izabrani od deuterijuma, halogena, C1-3alkil, C3-4cikloalkil i C1-3alkoksi grupe.

R<1>, R<2>, R<4>i R<5>u pronalasku mogu da budu izabrani od jedne, dve ili više od dve pojedinačno definisane grupe. Kada su R<1>, R<2>, R<4>ili R<5>izabrani od dve ili više od dve grupe, ove grupe se nalaze na odgovarajućim položajima fenil prstena ili imidazo[1,2-a]piridil prstena. Na primer, kada R<4>koristi dve grupe, dve grupe mogu da budu na položajima 2 i 3 u 4-hidroksi fenil prstenu, tim redom.

[0015] U jednom ostvarenju, svaki R<1>ili R<2>je nezavisno izabran od vodonika, deuterijuma, halogena, cijano, hidroksilne, C1-5alkil, supstituisane C1-5alkil, C1-3alkoksi, supstituisane C1-3alkoksi, C1-3alkiltio i supstituisane C1-3alkiltio grupe; supstituenti su izabrani od deuterijuma, halogena, C1-3alkil, C3-4cikloalkil i C1-3alkoksi grupe.

[0016] U još jednom preferiranom ostvarenju, R<1>i R<2>su nezavisno izabrani od jednog ili više vodonika, deuterijuma, fluora, hlora, broma, cijano, hidroksilne, C1-3alkil, supstituisane C1-3alkil, C1-3alkoksi i supstituisane C1-3alkoksi grupe; supstituenti su izabrani od deuterijuma, halogena, C1-3alkil, C3-4cikloalkil i C1-3alkoksi grupe.

[0017] U nekim ostvarenjima, R<1>ili R<2>su nezavisno izabrani od jednog ili više vodonika, deuterijuma, fluora, hlora, broma, cijano, C1-3alkil, halaogenizovane C1-3alkil i C1-3alkoksi grupe.

[0018] U nekim ostvarenjima, R<1>i R<2>su nezavisno izabrani od vodonika, deuterijuma, fluora, hlora, broma, cijano, metil, etil, metoksi, etoksi, trifluorometil grupe i tako dalje.

[0019] U nekim ostvarenjima, R<3>je nezavisno izabran od C1-3alkil, supstituisane C1-3alkil, C1-4cikloalkil i supstituisane C3-4cikloalkil grupe; supstituenti su izabrani od deuterijuma, halogena, C1-2alkil i C3-4cikloalkil grupe.

[0020] U nekim ostvarenjima, R<3>je izabran od C2-3alkil i C3-4cikloalkil grupe.

[0021] U nekim ostvarenjima, R<3>je izabran od etil i ciklopropil grupe.

[0022] U nekim ostvarenjima, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani od deuterijuma, halogena, cijano, C2-3alkenil, C2-3alkinil, C1-3alkil, supstituisane C1-3alkil, C1-3alkoksi, supstituisane C1-3alkoksi, C1-3alkiltio i supstituisane C1-3alkiltio grupe; supstituenti su izabrani od deuterijuma, halogena, C1-3alkil, C3-4cikloalkil i C1-3alkoksi grupe.

[0023] U nekim ostvarenjima, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani od jednog ili više deuterijuma, halogena, cijano, etilen, acetilen, C1-2alkil, supstituisane C1-2alkil, C1-2alkoksi, supstituisane C1-2alkoksi, C1-2alkiltio i supstituisane C1-2alkiltio grupe; supstituenti su izabrani od deuterijuma, halogena, C1-2alkil, C3-4cikloalkil i C1-3alkoksi grupe.

[0024] U nekim ostvarenjima, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani od jednog ili više deuterijuma, halogena, cijano, C1-2alkil, halogenizovane C1-2alkil, C1-2alkoksi i C1-2alkiltio grupe.

[0025] U nekim ostvarenjima, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani od jednog ili više deuterijuma, halogena, cijano, metil, etil, metoksi, etoksi, trifluorometil, metiltio i etiltio grupe.

[0026] U nekim ostvarenjima, R<4>je izabran od jednog ili više halogena a R<5>je izabran od cijano grupe. U nekim ostvarenjima, "farmaceutski prihvatljive soli" su soli formirane od jedinjenja iz pronalaska i kiselina, dobijene reakcijom slobodne baze osnovnih jedinjenja sa neorganskim kiselinama ili organskim kiselinama, pri čemu u neorganske kiseline i organske kiseline spadaju (ali se ne ograničavaju samo na): na primer, hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina, sirćetna kiselina, propanoatna kiselina, akrilna kiselina, oksalna kiselina, (D) ili (L) jabučna kiselina, fumarna kiselina, maleinska kiselina, hidroksibenzoeva kiselina, γ-hidroksibuterna kiselina, metoksibenzoeva kiselina, ftalna kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, 1-naftalensulfonska kiselina, 2-naftalensulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina i slično.

[0027] Jedinjenje iz ovog pronalaska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je jedinjenje izabrano od:

(3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona;

(2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(4-hidroksi-3,5-dijodofenil)metanona;

(3-Hlor-4-hidroksi-5-jodofenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona;

3-Hlor-5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitrila;

(3-Bromo-4-hidroksi-5-jodofenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona;

(2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(4-hidroksi-3-jodo-5-metilfenil)metanona;

(3-Bromo-5-hlor-4-hidroksifenil)(2-etil-6-fluoroimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona;

(3-Hlor-4-hidroksi-5-jodofenil)(2-etil-6-fluoroimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona;

5-(2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksi-3-metilbenzonitrila;

(3-Bromo-4-hidroksi-5-(trifluorometil)fenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona; (3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-6-metilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona;

(3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-6-metoksiimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona;

3-Bromo-5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitrila;

5-(2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksi-3-jodobenzonitrila;

5-(2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-3-fluoro-2-hidroksibenzonitrila;

(3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-propilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona;

(3-Bromo-5-Hlor-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona;

(3-Bromo-5-fluoro-4-hidroksifenil)(2-etil-6-fluoroimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona; (2-Etil-6-fluoroimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3-fluoro-4-hidroksi-5-jodofenil)metanona;

(3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-6-hidroksiimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona;

(6-Bromo-2-etil-7-metilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)metanona; (3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-7-(trifluorometil)imidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona; 3-(3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)-2-etilimidazo[1,2-a]piridin-6-karbonitrila;

(2-Deuterijum-3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona; (6-Deuterijum-2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)metanona; (2-Ciklopropilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)metanona;

3-Bromo-5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitril vodonik hlorida; i 5-(2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksi-3-jodobenzonitril vodonik hlorida.

[0028] Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da se izrade po sledećim postupcima sinteze: Opšta šema 1:

[0029] U opštoj šemi 1, supstituisani 2-aminopiridin reaguje sa acil hloridom da se dobije odgovarajući amid, koji dalje reaguje sa supstituisanim 2-bromo-1-feniletanonom da se dobije odgovarajućing (imidazo[1,2-a]piridin-3-il)-(fenil)metanon. Jedinjenje može da bude finalni produkt, ili se ciljani produkt dobija demetilacijom, halogenacijom i/ili drugim reakcijama.

Opšta šema 2:

[0030] U opštoj šemi 2, supstituisani acetofenon reaguje sa odgovarajućim estrom da se dobije 1,3-diketon jedinjenje koje reaguje sa odgovarajućim 2-aminopiridinom da se dobije (imidazo[1,2-a]piridin-3-il)-(fenil)metanon. Ciljano jedinjenje se nakon toga dobija demetilacijom, halogenacijom i/ili drugim reakcijama.

[0031] Definicija svake grupe u šemama sinteze je kako je niže opisano.

[0032] Ukoliko nije drugačje navedeno, niže dati nazivi korišćeni u patentnim zahtevima i uputstvima imaju niže data značenja.

[0033] "Vodonik" se odnosi na protijum (1H) koji je glavni stabilni izotop vodonika.

[0034] "Deuterijum" je stabilni izotop vodonika i takođe se odnosi na teški vodonik i simbol ovog elementa je D.

[0035] "Halogen" se odnosi na atom fluora, atom hlora, atom broma ili atom joda.

[0036] "Alkil" je zasićena alifatična grupa koja ima 1 do 20 atoma ugljenika, uključujući grupu ravnog lanca i grupu račvastog lanca (navedeni numerički opseg (na primer, 1 do 20) pomenut u ovoj aplikaciji označava da ova grupa (alkil u ovom slučaju) može da sadrži jedan atom ugljenika, dva atoma ugljenika, tri atoma ugljenika ili čak dvadeset atoma ugljenika). Alkil grupa koja sadrži 1 do 4 atoma ugljenika se naziva niža alkil grupa. Niža alkil grupa bez bilo kog supstituenta se naziva nesupstituisana niža alkil grupa, na primer, metil, etil, propil, 2-propil, n-butil, izobutil, terc-butil ili slično. Alkil grupa može da bude supstituisana ili nesupstituisana.

[0037] "Alkoksi" predstavlja -O-(nesupstituisanu alkil) i -O-(nesupstituisanu cikloalkil) i dalje predstavlja -O-(nesupstituisanu alkil). U reprezentativne primere spadaju, ali bez ograničenja na, metoksi, etoksi, propoksi, butoksi, ciklopropoksi, ciklobutoksi, ciklopentioksi, cikloheksiloksi, ili slično.

[0038]"Alkiltio" predstavlja -S-(nesupstituisanu alkil) i -S-(nesupstituisanu cikloalkil) grupu, dalje označenu kao -S-(nesupstituisanu alkil). U reprezentativne primere spadaju, ali bez ograničenja na metionil, etiltio, propiltio, butiltio, ciklopropiltio, ciklobutiltio, ciklopentiltio, cikloheksiltio, ili slično.

[0039] "Alkenil" predstavlja ravnu ili račvastu hidrokarbil grupu koja ima od 2 do 7 atoma ugljenika i, u nekim ostvarenjima, od 2 do 6 atoma ugljenika ili 2 do 4 atoma ugljenika. U reprezentativne primere spadaju, na primer, etenil, propenil, alil i slično.

[0040] "Alkinil" predstavlja ravan monovalentni ugljovodonični radikal ili račvasti monovalentni ugljovodonični radikal koji ima od 2 do 7 atoma ugljenika a, u nekim ostvarenjima, od 2 do 6 atoma ugljenika ili 2 do 4 atoma ugljenika. U reprezentativne primere spadaju etinil, propinil, propargil i slično.

[0041] "Cikloalkil" predstavlja pojedinačni ili dvostruki prsten alkil grupe sa više od 3 atoma ugljenika, uključujući ali bez ograničenja na, ciklopropil, ciklobutil, cikloheksenil i dicikloheptil grupe. "Cijano" predstavlja -CN grupu.

[0042] "Farmaceutski prihvatljive soli" su soli formirane od jedinjenja formule (I) sa organskim kiselinama ili neorganskim kiselinama i predstavljaju soli koje zadržavaju bioraspoloživost i osobine osnovnih jedinjenja. U ove soli spadaju:

1

(1) soli formirane od jedinjenja sa kiselinama, koje su dobijene reakcijom slobodnih baza osnovih jedinjenja sa neorganskim kiselinama ili organskim kiselinama, pri čemu u organske kiseline spadaju (ali bez ograničenja na): na primer, hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina, metafosforna kiselina, sumporna kiselina, sumporasta kiselina, perhlorna kiselina i slično; u organske kiseline spadaju (ali bez ograničenja na): na primer, sirćetna kiselina, propanoatna kiselina, akrilna kiselina, oksalna kiselina, (D) ili (L) jabučna kiselina, fumarna kiselina, maleinska kiselina, hidroksibenzoeva kiselina, γ-hidroksibuterna kiselina, metoksibenzoeva kiselina, ftalna kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, 1-naftalensulfonska kiselina, 2-naftalensulfonska kiselina, ptoluensulfonska kiselina, salicilna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, mlečna kiselina, mandelinska kiselina, sukcinska kiselina, malonska kiselina i slično; i (2) soli nastale supstitucijom kiselih protona u osnovnim jedinjenjima sa jonima metala ili koordinacijom kiselih protona u osnovnim jedinjenjima sa organskim alkalijama, pri čemu u jone metala spadaju, na primer, joni alkalnih metala, joni zemnoalkalnih metala ili joni aluminijuma; a u organske alkalije spadaju, na primer, etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, trometamol, N-metilglukamin i slično.

[0043] "Farmaceutska kompozicija" se odnosi na smešu jednog ili više ovde opisanih jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli ili prolekova, zajedno sa drugim hemijskim komponentama, kao što su farmaceutski prihvatljivi nosači i podloge. Cilj farmaceutske kompozicije je da obezbedi oslobađanje leka u organizmu.

[0044] U narednom delu, ukoliko nije drugačije navedeno, treba da se razume da su jedinjenja (I), koja su aktivni sastojci terapeutskih sredstava, uključujući sve njihove farmaceutski prihvatljive soli, obuhvaćena okvirom ovog pronalaska. U ovoj specifikaciji, jedinjenja su zbog pogodnosti jednostavno označena kao jedinjenja formule (I).

[0045] Pronalazak uključuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bilo koje jedinjenje iz pronalaska, njegovu farmaceutski prihvaltjivu so ili njegov prolek u obliku estra koji se lako hidrolizuje kao aktivni sastojak uz dodatak farmaceutski prihvatljivih podloga.

[0046] Prethodna jedinjenja formule (I) u pronalasku su potvrđena u dalje datim ostvarenjima, ona mogu značajno da poboljšaju inhibitorni efekat na URAT1, značajno da povećaju izlučivanje mokraćne kiseline kod miševa a toksičnost je značajno manja nego toksičnost benzobromarona. Prema tome, jedinjenje dato u ovom pronalasku ima mnogo bolji efekat izlučivanja mokraćne kiseline i veću bezbednost. Na osnovu ovih osobina, jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu da se koriste kao medikament, posebno za povećavanje izlučivanja mokraćne kiseline, ili za tretman ili prevenciju hiperurikemije, nefroze ili gihta. .

SPECIFIČNI POSTUPCI IMPLEMENTACIJE

[0047] U narednim primerima jedinjenja označena sa * nisu obuhvaćena patentnim zahtevima.

Primer 1: Sinteza (3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]-piridin-3-il)metanona (4)

[0048]

[0049] Faza A: u smešu 2-aminopiridina (2.0 g, 21.3 mmol) i trietilamina (2.58 g, 25.5 mmol) u dihlormetanu (20 mL) se u kapima doda propionil hlorid (2.07 g, 22.4 mmol) u ledenom kupatilu. Nakon dodavanja, reaktivna smeša se zagreje na sobnu temperaturu i meša u toku noći, razblaži sa vodom (40 mL) i ekstrahuje sa dihlormetanom (40 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa slanim rastvorom (30 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:15-1:10) da se dobije N-(piridin-2-il)propionamid (1) (2.74 g) sa 85.6% prinosa.

[0050] Faza B: smeša jedinjenja 1 (300 mg, 2.0 mmol) i 2-bromo-1-(4-metoksifenil)-etanona (460 mg, 2.0 mmol) u toluenu (10 mL) se zagreva 48 h pod refluksom. Reaktivna smeša se ohladi na sobnu temperaturu, razblaži sa vodom (30 mL), podesi do pH 8-9 sa zasićenim kalijum karbonatom i ekstrahuje sa dihlormetanom (40 mLx3). Kombinovani organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar=1:30-1:1) da se dobije (2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)-(4-metoksifenil)metanon (2) (254 mg) sa 45.3% prinosa.<1>H NMR (DM-SO-d6, 500 MHz) δ 9.18 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.74-7.69 (m, 3H), 7.58-7.55 (m, 1H), 7.17-7.14 (m, 1H), 7.09 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.87 (s, 3H), 2.45 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 281.1 [M+H]<+>. Faza C: Bor tribromid (0.6 mL, 1.0 M rastvor u toluenu) se u kapima doda u rastvor jedinjenja 2 (80 mg, 0.285 mmol) u anhidrovanom dihlormetanu (6 mL) u ledenom kupatilu. Nakon dodavanja, reaktivna smeša se zagreje na sobnu temperaturu, meša u toku noći, sipa u vodu sa ledom (30 mL), podesi do pH 7-8 sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahuje sa etil acetatom (40 mLx2). Kombinovani organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i upari pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar =1:20-1:1) da se dobije (2-etilimidazo[1,2-a]-piridin-3-il)(4-hidroksifenil)metanon (3) (67 mg) sa 88.3% prinosa.<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 10.29 (s, 1H), 9.11 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.62-7.51 (m, 3H), 7.15-7.11 (m, 1H), 6.90 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 2.45 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.12 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 267.2 [M+H]<+>.

[0051] Faza D: u smešu jedinjenja 3 (67 mg, 0.252 mmol) i natrijum acetata (62 mg, 0.755 mmol) u sirćetnoj kiselini (5 mL) se doda brom (90 mg, 0.563 mmol) u sirćetnoj kiselini (1 mL). Dobijena smeša se meša 3 h na sobnoj temperaturi, neutrališe dodavanjem zasićenog vodenog rastvora natrijum bisulfata i koncentruje pod vakuumom. U ostatak se doda voda (30 mL) i smeša podesi na pH 7-8 sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahuje sa etil acetatom (40 mLx2). Kombinovani organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar=1:10-1:1) da se dobije (3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-imidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon (4) (48 mg) sa 44.9% prinosa.<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.19 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.87 (s, 2H), 7.75 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.63-7.58 (m, 1H), 7.22-7.17 (m, 1H), 2.44 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.17 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 422.9 [M+H]<+>.

1

Primer 2: Sinteza (2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(4-hidroksi-3,5-dijodofenil)metanona (5)

[0052]

[0053] Smeša jedinjenja 3 (556 mg, 2.09 mmol), natrijum acetata (367 mg, 4.58 mmol) i joda (1.17 g, 4.61 mmol) u metanolu (20 mL) se meša 1 h pod refluksom. Nakon toga se doda rastvor natrijum hidroksida (151 mg, 3.78 mmol) u vodi (20 mL). Reaktivna smeša se meša 1 h pod refluksom i ohladi na sobnu temperaturu. Doda se zasićeni vodeni rastvor natrijum bisulfata (20 mL). Formirani precipitati se sakupe filtriranjem, isperu sa vodom i suše. Sirovi produkt kristališe iz smeše petrol etar/etil acetat da se dobije (2-etilimidazo[1,2-a]-piridin-3-il)(4-hidroksi-3,5-dijodofenil)metanon (5) (924 mg) sa 85.3% prinosa.<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.17 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 8.05 (s, 2H), 7.75 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.64-7.58 (m, 1H), 7.22-7.17 (m, 1H), 2.45 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.17 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 518.8 [M+H]<+>.

Primer 3: Sinteza (3-Hlor-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona* (8) i (3-Hlor-4-hidroksi-5-jodofenil)(2-etilimidazo[1,2-a]-piridin-3-il)metanona (9)

[0054]

[0055] Faza A: rastvor 2-bromoacetil bromida (6.8 g, 33.7 mmol) u anhidrovanom dihlormetanu (10 mL) se u kapima doda u smešu 1-Hlor-2-metoksibenzena (4.0 g, 28.1 mmol) i aluminijum hlorida (4.12 g, 30.9 mmol) u anhidrovanom dihlormetanu (30 mL) u ledenom kupatilu. Nakon dodavanja, reaktivna smeša se meša još 1.5 h i sipa u vodu sa ledom (100 mL). Smeša se ekstrahuje sa dihlormetanom (60 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa vodom (30 mL), zasićenim natrijum bikarbonatom (30 mL32), vodom (30 mL) i slanim rastvorom (30 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira kroz kratku ploču silika gela i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se rekristališe sa smešom petrol etar/dihlormetan da se dobije 2-bormo-1-(3-Hlor-4-metoksifenil)etanon (6) (3.37 g) sa 45.5% prinosa.

[0056] Faza B: smeša jedinjenja 1 (780 mg, 5.23 mmol) i jedinjenja 6 (1.37 g, 5.20 mmol) u toluenu (20 mL) se meša 24 h pod refluksom i ohladi na sobnu temperaturu. Nakon dodavanja vode (50 mL), reaktivna smeša se podesi na pH 8-9 sa zasićenim kalijum karbonatom i ekstrahuje sa dihlormetanom (60 mLx3). Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:20-1:5) da se dobije (3- Hlor-4-metoksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon (7) (510 mg) sa 31.2% prinosa.

[0057] Faza C: bor tribromid (3.2 mL, 1.0 M u toluenu) se u kapima doda u smešu jedinjenja 7 (500 mg, 1.57 mmol) u anhidrovanom dihlormetanu (15 mL) u ledenom kupatilu.

Reaktivna smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku noći, sipa u vodu sa ledom (40 mL), podesi na pH 7-8 sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahuje sa etil acetatom (40 mLx2). Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa etil acetatom /petrol etar = 1:5-3:1) da se dobije (3-Hlor-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]-piridin-3-il)metanon (8) (380 mg) sa 79.5% prinosa. MS (El, m/z): 301.7 [M+H]<+>.

[0058] Faza D: smeša jedinjenja 8 (378 mg, 1.26 mmol), natrijum acetata (114 mg, 1.39 mmol) i joda (351 mg, 1.38 mmol) u metanolu (30 mL) se meša 1 h pod refluksom. Nakon dodavanja rastvora natrijum hidroksida (45 mg, 1.13 mmol) u vodu (13 mL), reaktivna smeša se meša 1 h pod refluksom i ohladi na sobnu temperaturu. Doda se zasićeni vodeni rastvor natrijum bisulfata (30 mL). Precipitati se sakupe filtriranjem, isperu sa vodom i suše. Sirovi produkt rekristališe sa smešom petrol etar/etil acetat da se dobije (3-Hlor-4-hidroksi-5-jodofenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon (9) (430 mg) sa 85.3% prinosa.<1>H NMR

1

(DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.04 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.71-7.68 (m, 2H), 7.54-7.51 (m, 1H), 7.13-7.10 (m, 1H), 2.49-2.47 (m, 2H), 1.18 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 426.9 [M+H]<+>.

Primer 4: Sinteza 3-Hlor-5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitrila (10)

[0059]

[0060] Smeša jedinjenja 9 (393 mg, 0.921 mmol) i bakar cijanida (124 mg, 1.38 mmol) u DMF (5 mL) se meša na 130°C u toku noći, ohladi na sobnu temperaturu, razblaži sa vodom (30 mL) i ekstrahuje sa etil acetatom (30 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa vodom (20 mLx2) i slanim rastvorom (10 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 2:1-5:1) da se dobije 3-Hlor-5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)- 2-hidroksibenzonitril (10).<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.11 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 7.94-7.90 (m, 2H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.68-7.63 (m, 1H), 7.26-7.21 (m, 1H), 2.50-2.48 (m, 2H), 1.17 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS (El, m/z): 324.0 [M-H]-.

Primer 5: Sinteza (3-bromo-4-hidroksi-5-jodofenil)(2-etilimidazo[1,2-a]-piridin-3-il)metanona (11)

[0061]

1

[0062] Jedinjenje 11 se izrađuje u skladu sa postupkom u primeru 3 korišćenjem 1-bromo-2-metoksibenzena u fazi A kao alternativnog reagensa.<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.16 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.62-7.56 (m, 1H), 7.20-7.16 (m, 1H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.18 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 470.9 [M+H]-.

Primer 6: Sinteza (2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(4-hidroksi-3-jodo-5-metilfenil)metanona (12)

[0063]

[0064] Jedinjenje 12 se izrađuje u skladu sa postupkom u primeru 3 korišćenjem 1 -metoksi-2-metilbenzena u fazi A kao alternativnog reagensa.<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.91 (s, 1H), 9.14 (dd, J = 0.9, 6.9 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.74-7.71 (m, 1H), 7.59-7.51 (m, 2H), 7.18-7.13 (m, 1H), 2.44 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.30 (s, 3H), 1.17 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 406.9 [M+H]<+>.

Primer 7: Sinteza (2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(4-hidroksi-3-jodofenil)-metanona (13)*

[0065]

[0066] Jedinjenje 13 se izrađuje u skladu sa postupcima iz faza A, B i C u primeru 3 korišćenjem 1-jodo-2-metoksibenzena kao alternativnog reagensa.<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 11.16 (s, 1H), 9.13 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.5 Hz,

1

1H), 7.61 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.57-7.54 (m, 1H), 7.16-7.13 (m, 1H), 7.01 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 2.45 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.15 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 392.9 [M+H]<+>.

Primer 8: Sinteza 5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksi-benzonitrila (14)*

[0067]

[0068] Upotrebom jedinjenja 13 kao početnog materijala, jedinjenje 14 se izrađuje u skladu sa postupkom u primeru 4.<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 11.91 (s, 1H), 9.19 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.85 (dd, J = 2.0, 8.5 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.61-7.57 (m, 1H), 7.19-7.15 (m, 2H), 2.43 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.13(t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 292.0 [M+H]<+>.

Primer 9: Sinteza (3-bromo-5-Hlor-4-hidroksifenil)(2-etil-6-fluoro-imidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona (18)

[0069]

1

[0070] Faza A: u smešu 2-amino-5-fluoropiridina (2.5 g, 22.3 mmol) i trietilamina (2.71 g, 26.8 mmol) u anhidrovanom dihlormetanu (25 mL) se u kapima doda propionil hlorid (2.17 g, 23.5 mmol) u ledenom kupatilu. Nakon dodavanja, reaktivna smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku noći, neutrališe sa vodom (40 mL) i ekstrahuje sa dihlormetanom (40 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa slanim rastvorom (30 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:5) da se dobije N-(5-fluoropiridin-2-il)propionamid (15) (3.04 g) sa 81.1% prinosa.

[0071] Faza B: smeša jedinjenja 15 (960 mg, 5.71 mmol) i jedinjenja 6 (1.5 g, 5.69 mmol) u toluenu (30 mL) se meša pod refluksom u toku noći, ohladi na sobnu temperaturu, razblaži sa vodom (30 mL), podesi na pH 8-9 sa zasićenim kalijum karbonatom i ekstrahuje sa dihlormetanom (40 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa vodom, suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:30-1:1) da se dobije (3-Hlor-4-metoksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon (16) (270 mg) sa 14.3% prinosa.

[0072] Faza C: 1.0 M rastvor Bor tribromida u toluenu (2.4 mL) se u kapima doda u smešu jedinjenja 16 (262 mg, 0.787 mmol) u anhidrovanom dihlormetanu (10 mL) u ledenom kupatilu. Reaktivna smeša se meša 6 h na sobnoj temperaturi, razblaži sa ledenom vodom (30 mL), podesi na pH 7-8 sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahuje sa etil acetatom (40 mLx3). Kombinovani organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:6-1:4) da se dobije (3-Hlor-4-hidroksifenil)(2-etil-6-fluoro-imidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon (17) (90 mg) sa 35.9% prinosa. MS (El, m/z): 339.7 [M+H]<+>.

[0073] Faza D: u smešu jedinjenja 17 (41 mg, 0.129 mmol) i natrijum acetata (26 mg, 0.317 mmol) u sirćetnoj kiselini (5 mL) se doda brom (25 mg, 0.156 mmol) u sirćetnoj kiselini (1 mL). Dobijena smeša se meša 1.5 h na sobnoj temperaturi, neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bisulfata i nakon toga koncentruje pod vakuumom. U ostatak se doda voda (20 mL) i smeša se podesi na pH 7-8 sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahuje sa etil acetatom (30 mLx3). Kombinovani organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:6-1:3) da se dobije (3-bromo-5-

1

Hlor-4-hidroksifenil)-(2-etil-6-fluoroimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon (18).<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 11.06 (s, 1H), 9.22-9.21 (m, 1H), 7.86-7.83 (m, 2H), 7.76-7.70 (m, 2H), 2.43 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.16 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 398.9 [M+H]<+>.

Primer 10: Sinteza (3-Hlor-4-hidroksi-5-jodofenil)(2-etil-6-fluoro-imidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona (19)

[0074]

[0075] Smeša jedinjenja 17 (41 mg, 0.129 mmol), natrijum acetata (12 mg, 0.146 mmol) i joda (36 mg, 0.142 mmol) u metanolu (10 mL) se meša 1 h pod refluksom a nakon toga se doda rastvor natrijum hidroksida (5 mg, 0.125 mmol) u vodi (3 mL). Reaktivna smeša se meša 1 h pod refluksom, ohladi na sobnu temperaturu i doda zasićeni vodeni rastvor natrijum bisulfata (10 mL). Formirani precipitati se sakupe filtriranjem, isperu sa vodom i suše. Sirovi produkt kristališe sa smešom petrol etar/etil acetat da se dobije (3-Hlor-4-hidroksi-5-jodofenil)(2-etil-6-fluoroimidazo[1,2-a] piridin-3-il)metanon (19).<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.13 (s, 1H), 7.97 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.83-7.80 (m, 1H), 7.71 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.69-7.65 (m, 1H), 2.46 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.17 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 444.9 [M+H]-.

Primer 11: Sinteza 5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksi-3-metilbenzonitrila (24)

[0076]

2

[0077] Faza A: smeša 1-(4-hidroksi-3-metilfenil)etanona (4.95 g, 33.0 mmol), natrijum acetata (2.98 g, 36.3 mmol) i joda (9.21 g, 36.3 mmol) u metanolu (80 mL) se meša 1 h pod refluksom a nakon toga se doda rastvor natrijum hidroksida (1.19 g, 29.7 mmol) u vodi (55 mL). Reaktivna smeša se meša 1 h pod refluksom i upari pod vakuumom do približno pola zapremine. Formirani precipitati se sakupe filtriranjem. Pogača se rastvori u etil acetatu (200 mL) i rastvor se ispere sa zasićenim vodenim rstvorom natrijum bisulfata (40 mL) i slanim rastvorom (40 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje da se dobije 1-(4-hidroksi-3-jodo-5-metilfenil)etanon (21) (7.91 g) sa 86.8% prinosa.

[0078] Faza B: smeša jedinjenja 21 (3.90 g, 14.1 mmol) i bakar cijanida (1.90 g, 21.2 mmol) u DMF (25 mL) se meša na 130 °C u toku noći. Reaktivna smeša se ohladi na sobnu temperaturu i filtrira kroz celite ploču. U filtrat se doda voda (100 mL). Smeša se ekstrahuje sa etil acetatom (50 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa vodom (30 mLx2) i slanim rastvorom (30 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/ petrol etar = 1:15-1:3) da se dobije 5-acetil-2-hidroksi-3-metil-benzonitril (22) (2.07 g) sa 83.8% prinosa.

[0079] Faza C: u rastvor jedinjenja 22 (500 mg, 2.85 mmol) u metanolu (10 mL) se doda brom (548 mg, 3.43 mmol) u metanolu (4 mL) i reaktivna smeša se meša 6 h na sobnoj temperaturi. Nakon dodavanja vode (50 mL), dobijena smeša se ekstrahuje sa etil acetatom (40 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa slanim rastvorom (20 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom da se dobije 5-(2-bromoacetil)-2-hidroksi-3-metilbenzonitril (23) (800 mg). Sirovi produkt 23 se koristi direktno u sledećoj fazi bez naknadnog prečišćavanja.

[0080] Faza D: smeša sirovog jedinjenja 23 (800 mg) i jedinjenja 1 (600 mg, 3.99 mmol) u toluenu (15 mL) se meša pod refluksom u toku noći i ohladi na sobnu temperaturu. U reaktivnu smešu se dodaju metanol (15 mL) i kalijum karbonat (1.10 g, 8.0 mmol). Dobijena smeša se meša 30 minuta na sobnoj temperaturi, razblaži sa vodom (40 mL) i ekstrahuje sa etil acetatom (50 mLx3). Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:30-1:1) da se dobije 5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksi-3-metilbenzonitril (24).<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 10.99 (s, 1H), 9.15 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.74-7.72 (m, 2H), 7.60-7.55 (m, 1H), 7.19-7.14 (m, 1H), 2.43 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 2.26 (s, 3H), 1.14 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 306.1 [M+H]<+>.

Primer 12: Sinteza (2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(4-hidroksi-3-( trifluorometil)fenil)metanona* (28) i (3-bromo-4-hidroksi-5-(trifluorometil)fenil)-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona (29)

[0081]

[0082] Faza A: smeša 1-(4-fluoro-3-(trifluorometil)fenil)etanona (1.0 g, 4.85 mmol) i natrijum metoksida (288 mg, 5.33 mmol) u DMF (5 mL) se meša 2 h u ledenom kupatilu i nakon toga na sobnoj temperaturi u toku noći. Reaktivna smeša se razblaži sa vodom (30 mL) i ekstrahuje sa etil acetatom (30 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa slanim rastvorom (20 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:40) da se dobije 1-(4- metoksi-3-(trifluorometil)fenil)etanon (25) (950 mg) sa 89.8% prinosa.

[0083] Faze B i C se izvode po postupcima korišćenima u fazama C i D primera 11.

[0084] Faza D: natrijum hidrid (60% u mineralnom ulju, 69 mg, 1.73 mmol) se u kapima doda u rastvor etantiola (107 mg, 1.73 mmol) u DMF (5 mL) i smeša meša približno 5 minuta na sobnoj temperaturi. U gornju smešu se doda rastvor jedinjenja 27 (200 mg, 0.574 mmol) u DMF (3 mL). Reaktivna smeša se meša 2 h na 120 °C, ohladi na sobnu temperaturu i razblaži sa vodom (40 mL). Smeša se podesi na pH 8-9 sa 2 M rastvorom hlorovodonične kiseline i ekstrahuje sa etil acetatom (40 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa vodom (30 mL) i slanim rastvorom (20 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:1) da se dobije (2- etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)-(4-hidroksi-3-(trifluorometil)fenil)metanon (28) (120 mg) sa 62.6% prinosa.<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 11.55 (s, 1H), 9.17 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.63-7.57 (m, 1H), 7.21-7.16 (m, 1H), 2.43 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.15 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 335.1 [M+H]<+>.

[0085] Faza E: u smešu jedinjenja 28 (96 mg, 0.287 mmol) i natrijum acetata (59 mg, 0.719 mmol) u sirćetnoj kiselini (5 mL) se doda brom (55 mg, 0.719 mmol) u sirćetnoj kiselini (1 mL). Dobijena smeša se meša 1.5 h na sobnoj temperaturi, neutrališe dodavanjem zasićenog vodenog rastvora natrijum bisulfata, koncentruje pod vakuumom i nakon toga razblaži sa vodom (20 mL). Smeša se podesi na pH 7-8 sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, ekstrahuje sa etil acetatom (40 mL32), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa etil acetatom /petrol etar = 1:5-3:2) da se dobije (3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)-metanon (29) (85 mg) sa 71.9% prinosa.<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.19 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.77 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.66-7.62 (m, 1H), 7.24-7.21 (m, 1H), 2.41 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.16 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 413.0 [M+H]<+>.

Primer 13: Sinteza (3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-6-metil-imidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona (30)

[0086]

2

[0087] Jedinjenje 30 se izrađuje u skladu sa postupkom u primeru 1 upotrebom 5-metilpiridin-2-amina kao alternativnog reagensa u fazi A.<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.04 (s, 1H), 7.87 (s, 2H), 7.69 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 2.42-2.38 (m, 5H), 1.15 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 436.9 [M-H]-.

Primer 14: Sinteza (3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-6-metoksi-imidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona (33)

[0088]

[0089] Faza A: u smešu 2-bromo-1-(4-hidroksifenil)etanona (639 mg, 2.98 mmol) i natrijum acetata (740 mg, 9.02 mmol) u sirćetnoj kiselini (10 mL) se doda brom (960 mg, 6.0 mmol) u sirćetnoj kiselini (5 mL) i dobijena smeša meša 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon dodavanja vode (40 mL), formirani precipitati se sakupe filtriranjem, isperu sa vodom i suše da se dobije 2-bromo-1-(3,5-dibromo- 4-hidroksifenil)etanon (31) (890 mg) sa 80.1% prinosa.

[0090] Faza B: u smešu 5-metoksipiridin-2-amina (1.0 g, 8.05 mmol) i trietilamina (981 mg, 9.69 mmol) u dihlormetanu (8 mL) se u kapima doda propionil hlorid (777 mg, 8.4 mmol) u ledenom kupatilu. Nakon dodavanja, reaktivna smeša se zagreje na sobnu temperaturu i meša u toku noći. U reaktivnu smešu se doda voda (40 mL) i smeša se ekstrahuje sa dihlormetanom (30 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa slanim rastvorom (30 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar=1: 30-1:8). Produkt se rekristališe sa petrol etrom da se dobije N-(5-metoksipiridin-2-il)-propionamid (32) (349 ) sa 21.4% prinosa.

[0091] Faza C: smeša jedinjenja 31 (790 mg, 2.12 mmol) i jedinjenja 32 (340 mg, 1.89 mmol) u toluenu (20 mL) se meša 48 h pod refluksom i ohladi na sobnu temperaturu. U smešu se doda voda (50 mL) i dobijena smeša podesi na pH 8-9 sa zasićenim kalijum karbonatom i ekstrahuje sa dihlormetanom (50 mLx3). Kombinovani organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:10-2:5) da se dobije (3,5-dibromo-4-hidroksifenil) (2-etil-6-metoksiimidazo[1,2-a]-piridin-3-il)-metanon (33) (87 ) sa 10.1% prinosa.<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 8.71 (s, 1H), 7.79(s, 2H), 7.64 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.34 (d, J =10.0 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 2.45 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.16 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 452.9 [M-H]-.

Primer 15: Sinteza 3-bromo-5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitrila (38)

[0092]

[0093] Faza A: 1-(4-Metoksifenil)etanon (44 g, 293 mmol) se doda u smešu 1-hlormetil-4-fluoro-1,4-diazoniabiciklo[2.2.2]oktan bis(tetrafluoroborata) (104 g, 294 mmol) i joda (38.6 g,

2

152 mmol) u acetonitrilu (440 mL) u ledenom kupatilu. Reaktivna smeša se zagreje na sobnu temperaturu i meša u toku noći. U smešu se doda voda (1350 mL). Formirani precipitati se sakupe filtriranjem, isperu sa vodom i suše da se dobije 1-(3-jodo-4-metoksifenil)etanon (34) (70 g) sa 86.5% prinosa.

[0094] Faza B: smeša jedinjenja 34 (70.0 g, 254 mmol) i bakar cijanida (34.0 g, 380 mmol) u DMF (400 mL) se meša na 130 °C u toku noći. Reaktivna smeša se ohladi na sobnu temperaturu i filtrira kroz celite ploču. U filtrat se doda voda (1600 mL) i smeša se ekstrahuje sa etil acetatom (800 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa vodom (40 mLx2) i slanim rastvorom (400 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod vakuumom da se dobije 5-acetil-2-metoksibenzonitril (35) (50.0 g). Sirovi produkt se koristi direktno u sledećoj fazi bez naknadnog prečišćavanja.

[0095] Faza C: u rastvor sirovog jedinjenja 35 (45.0 g) u metanolu (250 mL) se doda brom (49.0 g, 307 mmol) u metanolu (50 mL) i dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. U smešu se doda voda (900 mL) i precipitat se sakupi filtriranjem, ispere sa vodom i suši da se dobije 5-(2-bromoacetil)-2-metoksibenzonitril (36) (41.0 g). Ukupan prinos faza B i C je 70.6%.

[0096] Faza D: smeša jedinjenja 36 (41.0 g, 161 mmol) i jedinjenja 1 (24.0 g, 161 mmol) u toluenu (600 mL) se meša 48 h na refluksu. Reaktivna smeša se ohladi na sobnu temperaturu, razblaži sa vodom (400 mL), podesi na pH 7-8 sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahuje sa dihlormetanom (600 mLx3). Kombinovani organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:30-2:1) da se dobije 5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-metoksibenzonitril (37) (25.7 g) sa 52.3% prinosa.

[0097] Faza E: natrijum hidrid (60% disperzija u mineralnom ulju, 4.8 g, 120 mmol) se u kapima doda u rastvor etantiola (8.4 mL) u THF (30 mL). Reaktivna smeša se meša približno 5 minuta i filtrira. Pogača se doda u rastvor jedinjenja 37 (9.0 g, 29.5 mmol) u DMF (25 mL). Dobijena smeša se meša 2 h na 60 °C, ohladi na sobnu temperaturu i filtrira kroz celite ploču. U filtrat se doda voda (100 mL) i smeša se podesi na pH 5-6 sa 2 M vodenim rastvorom limunske kiseline. Formirani precipitati se sakupe filtriranjem, isperu sa vodom i suše. Pogača kristališe iz acetonitrila da se dobije 5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitril (14) (7.2 g) sa 83.8% prinosa. Faza F: u rastvor jedinjenja 14 (7.2 g, 24.7 mmol) u DMF (70 mL) se u porcijama doda N-bromosukcinimid (5.28 g, 29.7 mmol). Nakon

2

dodavanja, reaktivna smeša se meša još 1 h i razblaži sa vodom (210 mL). Precipitati se sakupe filtriranjem, isperu sa vodom i suše. Pogača kristališe iz acetonitrila da se dobije 3-bromo-5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitril (38) (7.0 g) sa 76.8% prinosa.

<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.01 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.78-7.75 (m, 1H), 7.65-7.59 (m, 1H), 7.22-7.17 (m, 1H), 2.58-2.50 (m, 2H), 1.19 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS (El, m/z): 368.0 [M-H]-.

Primer 16: Sinteza 5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksi-3-jodobenzonitrila (39)

[0098]

[0099] Upotrebom jedinjenja 14 kao početnog materijala, jedinjenje 39 se izrađuje u skladu sa postupkom u primeru 10.<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.04 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.66-7.63 (m, 1H), 7.23-7.21 (m, 1H), 2.56-2.50 (m, 2H), 1.20 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 416.0 [M-H]-.

Primer 17: Sinteza 5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-3-fluoro-2-hidroksibenzonitrila (40)

[0100]

2

[0101] Jedinjenje 40 se izrađuje u skladu sa postupcima iz faza A, B i C u primeru 11 i faze C u primeru 14 upotrebom 1-(3-fluoro-4-hidroksifenil)etanona kao alternativnog reagensa.<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.18 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.83-7.75 (m, 3H), 7.64-7.59 (m, 1H), 7.23-7.18 (m, 1H), 2.46-2.41 (m, 2H), 1.15 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS (El, m/z): 310.1 [M+H]<+>.

Primer 18: Sinteza (3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-propilimidazo[1,2-a]-piridin-3-il)metanona (41)

[0102]

[0103] Jedinjenje 41 se izrađuje u skladu sa postupkom u primeru 1 upotrebom buturil hlorida u fazi A.<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 10.81 (s, 1H), 9.18 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.86 (s, 2H), 7.73 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.61-7.58 (m, 1H), 7.19-7.17 (m, 1H), 2.38 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.68-1.63 (m, 2H), 0.76 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 436.9 [M-H]-.

Primer 19: Sinteza (2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(2-etilsulfanil-4-hidroksifenil)metanona (44)*

[0104]

2

[0105] Jedinjenje 44 se izrađuje u skladu sa postupcima iz faza B, C i D u primeru 12 upotrebom 1-(2-fluoro-4-metoksifenil)etanona kao alternativnog reagensa.<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 10.08 (s, 1H), 9.42 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.63-7.59 (m, 1H), 7.27-7.20 (m, 2H), 6.88 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.68 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz, 1H), 2.88 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 2.26 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.16 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 1.05 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 325.1 [M-H]-.

Primer 20: Sinteza (3-bromo-5-Hlor-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]-piridin-3-il)metanona (45)

[0106]

[0107] Upotrebom jedinjenja 8 kao početnog materijala, jedinjenje 45 se izrađuje u skladu sa postupkom iz faze D u primeru 9.<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.19 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.76-7.74 (m, 2H), 7.61-7.58 (m, 1H), 7.20-7.17 (m, 1H), 2.43 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.16 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 379.0 [M-H]-.

Primer 21: Sinteza (3-bromo-5-fluoro-4-hidroksifenil)(2-etil-6-fluoroimidazo-[1,2-a]piridin-3-il)metanona (48)

[0108]

2

[0109] Faza A: u rastvor 1-(3-fluoro-4-hidroksifenil)etanona (806 mg, 5.23 mmol) u DMF (10 mL) se u porcijama doda N-bromosukcinimid (977 mg, 5.49 mmol). Nakon dodavanja, reaktivna smeša se meša još 1 h. Doda se voda (50 mL) i smeša se ekstrahuje sa etil acetatom (50 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa vodom (30 mLx3) i slanim rastvorom (20 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak kristališe iz smeše petrol etar/etil acetat da se dobije 1-(3-bromo-5-fluoro-4-hidroksifenil)etanon (46) (1.0 g) sa 82.0% prinosa.

[0110] Faza B: u rastvor jedinjenja 46 (1.0 g, 4.29 mmol) u metanolu (20 mL) se doda brom (824 mg, 5.16 mmol) u metanolu (5 mL) i smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku noći, neutrališe sa vodom (60 mL) i ekstrahuje sa etil acetatom (60 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa slanim rastvorom (30 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar =1:5) da se dobije 2-bromo-1-(3-bromo-5-fluoro-4-hidroksi-fenil)-etanon (47) (940 ) sa 70.2% prinosa.

[0111] Faza C: smeša jedinjenja 15 (210 mg, 1.25 mmol) i jedinjenja 47 (300 mg, 0.962 mmol) u 1-metil-2-pirolidinonu (10 mL) se meša na 150 °C u toku noći. Reaktivna smeša se ohladi na sobnu temperaturu i doda se voda (50 mL). Smeša se podesi na pH 7-8 sa 2 M vodenim rastvorom limunske kiseline i ekstrahuje sa dihlormetanom (50 mLx3).

Kombinovani organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/ petrol etar = 1:25-1:5) da se dobije (3-bromo-5-fluoro-4-hidroksifenil)(2-etil-6-fluoroimidazo[1,2-a]-piridin-3-il)metanon (48).<1>H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 11.44 (s, 1H), 9.24-9.22 (m, 1H), 7.88-7.85 (m, 1H), 7.75-7.71 (m, 2H), 7.63-7.60 (m, 1H), 2.47 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.18 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 379.0 [M-H]-.

Primer 22: Sinteza (2-etil-6-fluoroimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3-fluoro-4-hidroksi-5-jodofenil)metanona (51)

[0112]

[0113] Upotrebom jedinjenja 15 kao početnog materijala, jedinjenje 51 se izrađuje u skladu sa postupcima iz faza B i C u primeru 9, po postupku u primeru 10.<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 11.44 (s, 1H), 9.19-9.17 (m, 1H), 7.86-7.81 (m, 2H), 7.73-7.66 (m, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 2.49-2.41 (m, 2H), 1.16 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 427.1 [M-H]-.

Primer 23: Sinteza (3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-6-hidroksiimidazo-[1,2-a]piridin-3-il)metanona (52)

[0114]

[0115] Upotrebom jedinjenja 33 kao početnog materijala, jedinjenje 52 se izrađuje u skladu sa postupkom iz faze C u primeru 1.<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 10.00 (s, 1H), 8.92 (s, 1H), 7.84 (s, 2H), 7.63 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.31-7.29 (m, 1H), 2.37 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.13 (t, J = 7.6 Hz, 3H). MS (El, m/z): 441.0 [M+H]<+>.

1

Primer 24: Sinteza (6-bromo-2-etil-7-metilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)-(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)metanona (56)

[0116]

[0117] Faza A: natrijum hidrid (60% disperzija u mineralnom ulju, 1.68 g, 42 mmol) se u porcijama doda u rastvor 1-(4-metoksifenil)etanona (3.0 g, 20.0 mmol) u DMF (15 mL) na -10-0 °C. Smeša se meša na ovoj temperaturi još 40 minuta i doda se etil propionat (2.04 g, 20 mmol). Reaktivna smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku noći, razblaži sa vodom (60 mL) i ekstrahuje sa etil acetatom (30 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa slanim rastvorom (20 mLx2), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:30) da se dobije 1-(4-metoksifenil)pentan-1,3-dion (53) (3.16 g) sa 76.6% prinosa.

[0118] Faza B: u rastvor 5-bromo-4-metilpiridin-2-amina (187 mg, 1.0 mmol) i jedinjenja 53 (247 mg, 1.2 mmol) u THF (6 mL) se doda diacetoksijodo)benzen (386 mg, 1.2 mmol) i bor trifluorid etar (28 mg, 0.2 mmol) u ledenom kupatilu. Nakon dodavanja, reaktivna smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku noći i razblaži sa vodom (30 mL). Smeša se podesi na pH 7-8 sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahuje sa etil acetatom (30 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa slanim rastvorom (20 mL), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa etil acetat/petrol etar = 1:30) da se dobije (6-bromo-2-etil-7-metilimidazo-[1,2-a]piridin-3-il)(4-metoksifenil)metanon (54) (120 ) sa 32.2% prinosa.

2

[0119] Postupci korišćeni u fazama C i D primera 1 se nastavljaju u fazama C i D da se dobije (6-bromo-2-etil-7-metilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)metanon (56).

<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 9.35 (s, 1H), 7.86 (s, 2H), 7.80 (s, 1H), 2.41 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.16 (t, J = 7.6 Hz, 3H). MS (El, m/z): 518.9 [M+H]-.

Primer 25: Sinteza (3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-7-(trifluorometil)-imidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona (57)

[0120]

[0121] Koristeći 5-(trifluorometil)piridin-2-amin kao početni materijal, jedinjenje 57 se izrađuje u skladu sa postupkom iz faze B u primeru 25 i postupcima iz faza C i D u primeru 1.

<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 9.23 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.93 (s, 2H), 7.45 (dd, J = 2.0, 7.2 Hz, 1H), 2.50-2.48 (m, 2H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS (El, m/z): 492.9 [M+H]<+>.

Primer 26: Sinteza 3-(3,5-dibromo-4-hidroksibenzoil)-2-etilimidazo[1,2-a]-piridin-6-karbonitrila (58)

[0122]

[0123] Koristeći 6-aminonikotinonitril kao početni materijal, jedinjenje 58 se izrađuje u skladu sa postupkom iz faze B u primeru 25 i postupcima iz faza C i D u primeru 1.<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 9.56-9.55 (m, 1H), 7.92-7.89 (m, 3H), 7.86-7.83 (m, 1H), 2.48-2.46 (m, 2H), 1.22-1.17 (m, 3H). MS (El, m/z): 450.0 [M+H]<+>.

Primer 27: Sinteza (2-deuterijum-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]-piridin-3-il)metanona* (62) i (2-deuterijum-3,5-dibromo-4-hidroksifenil)-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanona (63)

[0124]

[0125] Faza A: u smešu 1-(2-bromo-4-metoksifenil)etanona (1.28 g, 5.59 mmol) i deuteroksida (0.5 mL) u DMF (10 mL) se doda paladijum na aktivnom uglju (5%, 100 mg). Nakon razmene sa deuterijum gasom, reaktivna smeša se meša pod deuterijum gasom iz balona deuterijum gasa u toku noći i filtrira kroz celite ploču. U filtrat se doda voda (40 mL) i smeša ekstrahuje sa etil acetatom (30 mLx2). Kombinovani organski sloj se ispere sa vodom (10 mLx4), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, koncentruje pod vakuumom da se dobije 1-(2-deuterijum-4-metoksifenil)etanon (59) (910 ) sa 100% prinosa.

[0126] Postupak korišćen u fazi C primera 15 se nastavlja u fazi B da se dobije jedinjenje 60.

[0127] Postupci opisani u fazama B, C i D u primeru 1 se nastavljaju u fazama C, D i E da se dobije (2-deuterijum-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin- 3-il)metanon (62) i (2-deuterijum-3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon (63).

Jedinjenje 62:<1>H NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ 11.20 (s, 1H), 9.16 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.61-7.56 (m, 2H), 7.19-7.15 (m, 1H), 7.11-7.09 (m, 1H), 2.46 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.15 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS (El, m/z): 268.2 [M+H]<+>. Jedinjenje 63:

<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 9.19 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.76 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.63-7.59 (m, 1H), 7.21-7.18 (m, 1H), 2.44 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.17 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS (El, m/z): 426.0 [M+H]<+>.

4

Primer 28: Sinteza (6-deuterijum-2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)metanona (69)

[0128]

[0129] Faza A: smeša 5-bromopiridin-2-amina (5.19 g, 30.0 mmol), etildiizopropilamina (8.58 g, 66.4 mmol), 4-dimetilaminopiridina (366 mg, 3.0 mmol) i di-terc-butil dikarbonata (14.4 g, 66.0 mmol) u dihlormetanu (30 mL) se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Reaktivna smeša se koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:20-1:3) da se dobije (2-(4-bromo-2-piridinil)-1,3-bis(1,1-dimetiletil))estar imidodikarbonske kiseline (64) (5.38 g) sa 48.0% prinosa.

[0130] Faza B: u smešu jedinjenja 64 (5.59 g, 15.0 mmol), DMF (25 mL) i deuteroksida (0.5 mL) se doda paladijum na aktivnom uglju (5%, 200 mg). Nakon razmene sa deuterijum gasom, smeša se meša pod deuterijum gasom iz balona u tokuk 48 h. Reaktivna smeša se filtrira kroz celite ploču. U filtrat se doda voda (100 mL) i smeša ekstrahuje sa etil acetatom (50 mLx3). Kombinovani organski sloj se ispere sa vodom (30 mLx3), suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:40-1:1) da se dobije (2-(4-deuterijum-2-piridinil)-1,3-bis(1,1-dimetiletil))estar imidodikarbonske kiseline (65) (2.70 g) sa 60.9% prinosa.

[0131] Faza C: smeša jedinjenja 65 (2.69 g, 9.11 mmol), trifluorosirćetne kiseline (4 mL) i vode (0.5 mL) u dihlormetanu (20 mL) se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. U reaktivnu smešu se doda voda (30 mL) i smeša se podesi na pH 8-9 sa 2 M vodenim rastvorom natrijum hidroksida i ekstrahuje sa etil acetatom (40 mLx3). Kombinovani organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela (eluira sa smešom etil acetat/petrol etar = 1:10-1:1) da se dobije 2-amino-4-deuterijum-piridin (66) (676 ) sa 78.0% prinosa.

[0132] Postupci opisani u fazama B, C i D u primeru 25 se nastavljaju u fazama D, E i F da se dobije (6-deuterijum- 2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)metanon (69).<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 9.20-9.19 (m, 1H), 7.88 (s, 2H), 7.77-7.75 (m, 1H), 7.64-7.59 (m, 1H), 2.43 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.16 (t, J = 7.6 Hz, 3H). MS (El, m/z): 426.0 [M+H]<+>.

Primer 29: Sinteza (2-ciklopropilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)metanona (73)

[0133]

[0134] Koristeći etil ciklopropankarboksilat kao početni materijal, jedinjenje 71 se izrađuje u skladu sa postupcima iz faza A i B u primeru 24.<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 9.24-9.23 (m, 1H), 7.81-7.79 (m, 2H), 7.68-7.65 (m, 1H), 7.58-7.56 (m, 1H), 7.16-7.09 (m, 3H), 3.87 (s, 3H), 1.56-1.54 (m, 1H), 1.08-1.06 (m, 2H), 0.88-0.85 (m, 2H).

[0135] Postupak korišćen u fazi E u primeru 15 se nastavlja u fazi C da se dobije (2-ciklopropil-imidazo[1,2-a]piridin-3-il)(4-hidroksifenil)metanan (72).<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 9.17-9.16 (m, 1H), 7.72-7.70 (m, 2H), 7.66-7.64 (m, 1H), 7.55-7.51 (m, 1H), 7.14-7.10 (m, 1H), 6.91-6.89 (m, 2H), 1.62-1.60 (m, 1H), 1.07-1.05 (m, 2H), 0.88-0.85 (m, 2H).

[0136] Postupak korišćen u fazi F primera 15 se nastavlja u fazi D da se dobije (2-ciklopropilimidazo-[1,2-a]piridin-3-il)(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)metanon (73).<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 9.25-9.23 (m, 1H), 7.97 (s, 2H), 7.70-7.68 (m, 1H), 7.61-7.57 (m, 1H), 7.20-7.16 (m, 1H), 1.58-1.55 (m, 1H), 1.13-1.10 (m, 2H), 0.94-0.89 (m, 2H). MS (El, m/z): 437.0 [M+H]<+>.

Primer 30: Sinteza 3-bromo-5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitril vodonik hlorida (74)

[0137]

[0138] Smeša jedinjenja 38 (970 mg, 2.62 mmol) u etil acetata (200 mL) se meša pod refluksom 20 min da se dobije bistar rastvor, nakon toga ohladi na sobnu temperaturu i u mehurićima propusti vodonik hlorid u toku 5 minuta. Formirani precipitati se sakupe filtriranjem da se dobije 3-bromo-5-(2-etilimidazo[1,2-a]- piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitril vodonik hlorid (74) (794 ) sa 74.5% prinosa.<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.12 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 8.22 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.99-7.91 (m, 2H), 7.50-7.45 (m, 1H), 2.57 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.23 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 368.0 [M-H]-.

Primer 31: Sinteza 5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksi-3-jodobenzonitril vodonik hlorida (75)

[0139]

[0140] Upotrebom jedinjenja 39 kao početnog materijala, jedinjenje 75 se izrađuje po istom postupku kao primer 30.<1>H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.11 (d, J= 6.9 Hz, 1H), 8.41 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.02-7.95 (m, 2H), 7.54-7.49 (m, 1H), 2.59 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.25 (t, J = 7.5 Hz, 3H). MS (El, m/z): 416.0 [M-H]-.

Primer 32: ispitivanje inhibicije transporta mokraćne kiseline za jedinjenja u HEK293-hURAT1 transfektovanoj ćelijskoj liniji

1. Materijali

[0141] Benzbromaron je nabavljen od Sigma-Aldrich Co. LLC. Plasmid pCMV6-hURAT1 je nabavljena od Origene Technologies, Inc. G418 je nabavljen od Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. HEK293 ćelijska linija je nabavljena od Cell Resource Center of Shanghai Institutes for Biological Sciences of the Chinese Academy of Sciences.14C-Mokraćna kiselina je nabavljen od American Radiolabeled Chemicals, Inc. Natrijum glukonat, kalijum glukonat, kalcijum glukonat, KH2PO4, MgSO4, glukoza i HEPES su nabavljeni od Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. DMEM medijum kultura i serum fetusa govečeta su nabavljeni od Thermo Fisher Scientific Inc.

2. Eksperimentalni postupci

[0142]

2.1 Konstrukcija HEK293 stabilne ćelijske linije sa visokom ekspresijom hURAT1: plazmid pCMV6-hURAT1 se transfektuje u HEK293 ćelije, a nakon toga se dobija stabilni soj sa G418 (finalna koncentracija 500 µg/mL) za skrining rezistencije, koji je visoka ekspresija hURAT1 transportera proteina membrane. On može da se koristi za in vitro ispitivanje inhibicije hURAT1 transportera mokraćne kiseline. (Weaver YM, Ehresman DJ, Butenhoff JL i saradnici. Roles of rat renal organic anion transporters in transporting perfluorinated karboksilats with different chain lengths, Toxicological Sciences, 2009, 113(2):305-314).

2.2 U obloženu ploču sa 24 udubljenja se doda po 200 µL 0.1 mg/mL poli-lizina po udubljenju i ploča se ostavi u toku noći. Poli-lizin se ukloni iz udubljenja. Udubljenja se dobro očiste sa sterilnom vodom i osuše za upotrebu.

2.3 U prethodno obloženu ploču sa 24 udubljenja se dodaju HEK293-hURAT1 stabilne ćelije (2x10<5>ćelija po udubljenju). Ćelije se uzgajaju 3 dana na 37 °C uz 5% CO2.

2.4 Izrada HBSS pufera: sledeći reagensi se odmere i dodaju u dejonizovanu vodu da se dobije finalna koncentracija od 125 mM natrijum glukonata, 4.8 mM kalijum glukonata, 1.3 mM kalcijum glukonata, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 5.6 mM glukoze i 25 mM HEPES. Rastvor se dobro izmeša da se dobije HBSS pufer (pH vrednost: 7.4). Pufer se čuva na -20°C.

2.5 HBSS pufer se zagreje na 37°C u vodenom kupatilu. Ćelije se dva puta isperu sa HBSS i u svako udubljenje se doda po 160 µL HBSS i 20 µL test jedinjenja. Finalna koncentracija test jedinjenja po udubljenju je 500 nM. Udubljenje slepe probe sadrži samo 180 µL HBSS bez testiranog jedinjenja. Ploča se ostavi 30 min na sobnoj temperaturi.

2.6 U svako udubljenje se doda po 20 µL<14>C-mokraćne kiseline u koncentraciji od 50 µM. Ploča se ostavi 20 min na sobnoj temperaturi.

2.7 Rastvor iz svakog udubljenja se ukloni a ćelije u svakom udubljenju se isperu sa prethodno ohlađenim HBSS puferom. U svako udubljenje se doda 0.2 M NaOH da se ćelije rastvore. Rastvor koji sadrži fragmente ćelija se sakupi i doda se odgovarajuća količina scintilacione tečnosti. Intenzitet radioizotopa<14>C-mokraćne kiseline (CPM vrednost) se nakon toga detektuje na PerkinElmer MicroBeta Trilux 1450 analizatoru tečne scintilacije.

2.8 Svi testovi su ponovljeni tri puta a rezultati su uprosečeni i izračunata je standardna devijacija (SD). Formula za izračunavanje brzine inhibicije transporta mokraćne kiseline za jedinjenja je kako sledi:

CPM udubljenja slepe probe–CPM udubljenja test jedinjenja Brzina inhibicije (%)= x100

CPM udubljenja slepe probe

3. Rezultati testa

[0143] Brzina inhibicije transporta mokraćen kiseline za jedinjenja 4, 5, 9, 11, 12, 18, 19, 29, 30, 33, 38, 39, 41, 45, 51, 52, 56, 69, 74, 75 i benzbromarona pri 500 nM su dobijene u skladu sa prethodno datim eksperimentalnim procedurama. Rezultati testa su navedeni u Tabeli 1. Rezultati pokazuju da u poređenju sa benzbromaronom kao kontrolnim lekom, jedinjenja imaju jednak ili bolji inhibitorni efekat na transport mokraćne kiseline u HEK293-hURAT1 transfektovanoj ćelijskoj liniji.

Tabela 1. Brzina inhibicije transporta mokraćne kiseline za test jedinjenja i benzobromaron pri 500 nM u HEK293-hURAT1 transfektovanoj ćelijskoj liniji

Primer 33: Test citotoksičnosti jedinjenja na ćelijske linije L-02 i WRL-68 normalne jetre ljudi

[0144] Objavljeno je da benzbromaron ima ozbiljnu hepatotoksičnost. Zbog toga je u ovom ispitivanju benzbromaron korišćen kao lek pozitivne kontrole. Testirana je citotoksičnost jedinjenja na dve ćelijske linije normalne jetre ljudi L-02 i WRL-68, tim redom.

1. Materijali

4

[0145] Ćelijska linija L-02 normalne jetre ljudi je nabavljena od Procell Life Science & Technology Co., Ltd. Ćelijska linija WRL-68 normalne jetre ljudi je nabavljena od Life Science Institute of Nanjing University. Benzbromaron, Resazurin i Metilen plavo su nabavljeni od Sigma-Aldrich Co. LLC. Kalijum fericijanid i kalijum ferocijanid su nabavljeni od Aladdin (Shanghai) Biological Technology Co., Ltd. DMEM medijum za kulturu bez fenol crvenog i serum fetusa govečeta su nabavljeni od Thermo Fisher Scientific Inc. Penicilin i streptomicin su nabavljeni od Beyotime Biotechnology Co., Ltd.

2. Eksperimentalni postupci

[0146]

2.1 Ćelijske linije L-02 i WRL-68 normalne jetre se uzgajaju u DMEM medijumu za kulturu (sadrži 10% serum fetusa govečeta, 100 U/mL penicilina i 0.1 mg/mL streptomicina) u inkubatoru na 37 °C uz 5% CO2sve dok gustina ćelija ne bude približno 90%, tim redom. 2.2 Ćelije se inokuliraju u ploče sa 96 udubljenja u količini ćelija od 1x10<3>/udubljenje i nakon toga uzgajaju 24 h u inkubatoru na 37 °C uz 5% CO2.

2.3 Izrade se gradijenti test jedinjenja i benzbromarona u različitim koncentracijama korišćenjem DMEM medijuma za kulturu i dodaju u udubljenja pri koncentraciji od 100 µL/udubljenje kao udubljenja sa jedinjenjima. DMEM medijum za kulturu se doda u količini od 100 µL/udubljenje u udubljenja bez test jedinjenja kao udubljenja negativne kontrole. Sve ploče se stave u inkubator na 37 °C uz 5% CO2u toku 120 h.

2.4 Resazurin (15 mg/50 mL, 200x), Metilen plavo (25 mg/10 mL, 1000x), Kalijum fericijanid (0.329 g/100 mL, 100x) i Kalijum ferocijanid (0.422 g/100 mL, 100x) se rastvore u PBS (0.1 M, pH=7.4) da se dobije 10xAlamar Blue rastvor za rezervu. Ovaj 10xAlamar Blue rastvor se pre upotrebe razblaži u 1xAlamar Blue rastvor sa DMEM medijumom za kulturu bez fenol crvenog.

2.5 Ćelije se dva puta isperu sa PBS (0.1 M, pH=7.4). Alamar Blue rastvor se doda u udubljenja u količini od 100 µL/udubljenje.100 µL Alamar Blue rastvora se doda u udubljenja bez ćelija i to su udubljenja koja služe kao slepa proba. Ploče sa 96 udubljenja se ostave u inkubatoru 3 h na 37 °C uz 5% CO2. Svaka koncentracija jedinjenja se ponovi tri puta u toku testa.

2.6 Vrednost fluorescencije ćelija se detektuje na Ex 530/Em 590 nm pomoćšu ELISA Victor X4 (Perkin Elmer). Vrednost fluorescencije ćelija koje sadrže jedinjenje je F(test jedinjenje); vrednosti fluorescencije ćelija bez jedinjenja kao slepe probe je F(slepa proba); vrednost fluorescencije ćelija iz grupe negativne kontrole je F(negativna kontrola). Prosečna vrednost i standardna devijacija vijabilnosti ćelija tri ponovljenje koncentracije se izračunava po sledećoj formuli:

Vijabilnost ćelija ( x100

2.7 Polovina inhibitorne koncentracije (IC50) jedinjenja za ćelije L-02 i WRL-68 se dobija iz vijabilnosti ćelija pomoću Prism Graph softvera.

3. Rezultati testa

[0147] Polovina inhibitorne koncentracije (IC50) jedinjenja 4, 5, 9, 18, 33, 38, 39, 45, 51, 52, 56, 69, 74 i 75 u odnosu na ćelijske linije L-02 i WRL-68 normalne jetre ljudi su veće od 100 µM. IC50benzbromarona za L-02 i WRL-68 je 40.17 µM i 45.54 µM, tim redom.

Primer 34: test izlučivanja mokraćne kiseline sa jedinjenjem 74 kod hiperurikemije miševa

1. Materijali

1.1 Priprema za testiranje jedinjenja 74 i benzbromarona

[0148] U jedinjenje 74 ili benzbromaron se doda određena količina 0.5% CMC-Na rastvora i smeša se meša na sobnoj temperaturi da se dobije suspenzija na bazi označene doze, tim redom.

1.2 Životinje

[0149] Vrste: Kingming miševi (Clean Level); telesne težine: 25 do 30 g; starosti: 4 do 5 nedelja; pol: mužjaci. Ovi miševi su nabavljeni od Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. Certificate No.: SCXK (HU) 2012-2002. Certifikat kvaliteta životinja broj:

2015000522173.

1.3 Reagensi

[0150] Ekstrakt kvasca u prašku je nabavljen od Beijing Aoxing Biology Co., Ltd. Adenin i kalijum oksonat su nabavljeni od Aladdin (Shanghai) Biological Technology Co., Ltd. CMC-Na je nabavljen od Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Kit za ispitivanje mokraćne kiseline (postupak fosfovolframove kiseline) je nabavljen od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute.

2. Eksperimentalni postupaci

2.1 Izrada izmešane suspenzije ekstrakta kvasca i adenina

[0151] Određena količina adenina i ekstrakta kvasca u prašku se izmeri i doda se određena količina dvostruko destilisane vode. Smeša se meša 40 min na približno 60 °C da se dobije suspenzija, u kojoj je koncentracija ekstrakta kvasca 0.6 g/mL a koncentracija adenina je 12 mg/mL.

2.2 Izrada suspenzije kalijum oksonata

[0152] Suspenzija 20 mg/mL kalijum oksonata se izrađuje mešanjem određene količine kalijum oksonata sa 0.5%rastvorom CMC-Na rastvorom pre upotrebe.

2.3 Utvrđivanje modela miševa sa hiperurikemijom i primena materijala za testiranje

[0153] Mužjaci Kunming miševa su nasumično podeljeni u četiri grupe: grupa slepe probe, model grupa, grupa jedinjenja 74 i grupa benzbromarona. Svaka grupa je imala po šest miševa. Svim miševima je uskraćena hrana 2-3 h pre početka testa. Miševima u model grupi, benzbromaron grupi i grupi jedinjenja 74 je oralno data prethodno pripremljena suspenzija ekstrakta kvasca i adenina da se dostigne finalna doza od 10 g/kg (telesne težine) ekstrakta kvasca i 200 mg/kg (telesne težine) adenina, tim redom. Grupi slepe probe je oralno data

4

samo ista zapremina običnog fiziološkog rastvora. Nakon 2.5 h, svim miševima u grupi jedinjenja 74 i grupi benzbromarona je dato po 10 mL/kg suspenzije jedinjenja 74 (1.5 mg/mL) i 10 mL/kg suspenzije benzbromarona (1.5 mg/mL), tim redom. Grupi slepe probe i model grupi su oralno date iste zapremine 0.5% rastvora CMC-Na. Sve životinje su tretirane na isti način sedam dana koristeći prethodno opisane načine primene. Poslednjeg dana, nakon primene suspenzije ekstrakta kvasca i adenina za model grupu, grupu jedinjenja 74 i grupu benzbromarona, svim miševima u ove tri grupe je i.p. dato 12.5 mL/kg kalijum oksonata (20 mg/mL). Grupi slepe probe je i.p. data ista zapremina 0.5% rastvora CMC-Na. Nakon 30 min, miševima su oralno dati jedinjenje 74 i benzbromaron u istim dozama kao prethodno u grupi jedinjenja 74 i benzbromaron grupi, tim redom. Grupi slepe probe i model grupi je oralno data ista zapremina 0.5% rastvora CMC-Na.

2.3 Sakupljanje uzoraka i analiza

[0154] Uzimanje uzoraka urina: svi miševi su stavljeni u metaboličke kaveze uz pojedinačnu normalnu ishranu nakon davanja test jedinjenja poslednjeg dana. Sakupi se 24 h urin i meri se zapremina urina. Urin se centrifugira 20 min na 3000 opm i uzme se supernatant. Detekcija koncentracije mokraćne kiseline u uzorcima urina miševa: koncentracija mokraćne kiseline u uzorcima se detektuje pomoću kita za ispitivanje mokraćne kiseline (postupak fosfovolframove kiseline) a nakon toga po procedurama opisanim u uputstvu.

3. Test rezultati

[0155] Rezultati dobijeni izlučivanjem mokraćene kiseline kod miševa sa hiperurikemijom su navedeni u tabeli 2. I jedinjenje 74 i benzbromaron značajno povećavaju izlučivanje mokraćne kiseline kod miševa sa hiperurikemijom. Efikasnost jedinjenja 74 u poboljšanju izlučivanja mokraćne kiseline je značajno bolja nego kod benzbromarona. Poređenjem sa model grupom miševa sa hiperurikemijom, izlučivanje mokraćne kiseline uz jedinjenje 74 je povećano za približno 46.77%, dok je izlučivanje mokraćne kiseline uz benzbromaron povećano za približno 25.35%.

Tabela 2. Izlučivanje mokraćne kiseline test jedinjenjem 74 i benzbromaronom oralnom primenom kod miševa sa hiperurikemijom

Primer 35: Studija akutne toksičnosti pojedinačne doze jedinjenja 74 na pacovima

1. Materijali

1.1 Priprema testiranog jedinjenja 74 i benzbromarona

[0156] Jedinjenje 74 i benzbromaron se usitne i doda se određena količina 0.5% rastvora CMC-Na da se pre upotrebe izradi suspenzija, tim redom. Benzbromaron je nabavljen od Mianyang Kaixing Pharmaceutical Technology Co., Ltd. Lot Number is BXML-201506005.

1.2 Životinje

[0157] Vrste: SD pacovi (SPF nivo); telesna težina: 120 do 180 g; starost: 5 do 6 nedelja. Izvor: nabavljeni od Animal Research Center of Wuhan University; certifikat No.: SCXK (E) 2014-0004; certifikat o kvalitetu životinja broj: 2015000522173.

2. Eksperimentalni postupci i rezultati

4

[0158] U pre-eksperimentu akutne toksičnosti na pacovima, najveća doza od 5 g/kg jedinjenja 74 nije prouzrokovala smrt pacova. Prema tome, u ovoj analizi je određeno da doza jedinjenja 74 bude 5 g/kg. Doza benzbromarona od 0.14 g/kg u pre-eksperimentu nije prouzrokovala smrt kod pacova. Prema tome, u ovom eksperimentu je određeno da doza benzbromarona bude 0.14 g/kg.

[0159] Pacovi su nasumice podeljeni u grupu A1, grupu B1 i grupu slepe probe.U svakoj grupi se nalazi po 10 pacova, polovina mužjaka i polovina ženki. Data je pojedinačna doza suspenzije jedinjenja 74, suspenzije benzbromarona i 0.5% rastvora CMC-Na u količini od 20 mL/kg oralnom primenom na grupi A1, grupi B1 i grupi slepe probe, tim redom, nakon 6 sati gladovanja.

[0160] Doze i smrt pacova u svakoj grupi su pokazani u tabeli 3. Trenutna toksičnost nije nađena ni u jednoj grupi a ni odložena toksičnost nije nađena u periodu praćenja od 24 h do 14 dana. Svi pacovi su preživeli i bili u dobrom stanju uz povećanje težine. Promene težine su navedene u tabeli 4. Maksimalna tolerisana doza jedinjenja 74 i benzbromarona u testu akutne toksičnosti su 5 g/kg i 0.14 g/kg, tim redom.

Tabela 3. Doza i stepen smrtnosti SD pacova u svakoj grupi

4

Tabela 4. Promea težine SD pacova u svakoj grupi

Primer 36: Studija farmakokinetike jedinjenja 74 nakon intravenozne i oralne primene na SD pacovima

1. Materijali

1.1 Izrada rastvora testiranog jedinjenja 74

[0161] Izrada formulacije doze za PO: odmeri se tražena količina jedinjenja 74 i doda se približno 70% 0.5% CMC-Na uz mešanje, mućka i sonicira da se dobro meša sve dok se suspenzija ne vizualizuje. Nakon toga se doda preostala količina vehikuluma do tražene ukupne zapremine i izmeša mućkanjem.

[0162] Izrada formulacije doze za IV: odmeri se tražena količina jedinjenja 74, i doda se odgovarajuća količina DMSO uz sonikaciju sve do potpunog rastvaranja. Nakon toga se doda odgovarajuća količina vodenog rastvora HP-β-ciklodekstrina (20%, m/v)) uz mućkanje da se dobro izmeša.

1.2 Životinje

4

[0163] Vrsta: SD pacovi (SPF nivo); pol: mužjaci; izvor: Sino-British SIPPR/BK Lab Animal Ltd., Shanghai.

2. Postupci

2.1 Doza i primena

[0164] Životinje koje se doziraju oralno se ostave bez hrane u toku noći (10-14 sati) pre oralne primene. 4 h nakon doziranja, životinjama se omogući pristup hrani. Podatak o primenjenoj dozi je dat u tabeli 5.

Tabela 5. Doza jedinjenja na ŽSD pacovima

2.2 Uzimanje uzoraka i bioanaliza

[0165] Uzorci krvi (približno 250 µL/uzorak) su uzeti iz jugularne vene pre doze i nakon doze (5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h i 24 h). Uzorci krvi se stave u kivete u kojima se nalazi natrijum heparin i centrifugiraju 6 min pri 8000 opm na 2-8 °C da se odvoji plazma od uzoraka. Uzorci plazme (50 µL) se prenesu u kivete, nakon toga se u njih doda 250 µL IS rastvora (200 ng/mL tolbutamida). Nakon 1 min mućkanja i 5 minuta centrifugiranja pri 15000 opm, po 20 µL alikvota supernatanta se prenese u ploču sa 96 udubljenja za LC-MS/MS analizu. Kalibraciona kriva jedinjenja 74 je u rasponu od 1 do 1000 ng/mL. LLOQ je 1 ng/mL za plazmu.

4

2.3 Analiza farmakokinetike

[0166] Za izračunavanje parametara je korišćen ne-uporedni modul WinNonlin® Professional 5.2. Bioraspoloživost je izračunata kao F% = (doza(IV)x AUC(0-t)(PO)) / (doza(PO)x AUC(0-t)(IV)) x 100%.

3. Rezultati

[0167] Farmakokinetički parametri za SD pacove sa jedinjenjem 74 dobijenim prethodnim postupcima su pokazani u tabeli 6. Jedinjenje 74 iz ovog pronalaska ima dobre farmakokinetičke parametre i visoku bioraspoloživost kod SD pacova.

Tabela 6. Farmakokinetički parametri jedinjenja 74 kod SD pacova nakon oralne primene i intravenske primene

4

(nastavlja se)

Claims (11)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje Formule (I)

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što: R<1>i R<2>su nezavisno izabrani od jednog ili više vodonika, deuterijuma, halogena, cijano, hidroksil, C1-5alkil, supstituisane C1-5alkil, C1-3alkoksi, supstituisane C1-3alkoksi, C1- 3alkiltio i supstituisane C1-3alkiltio grupe; R<3>je izabran od supstituisane ili nesupstituisane C1-4alkil grupe i supstituisane ili nesupstituisane C3-4cikloalkil grupe a njeni supstituenti su izabrani iz grupe u koju spadaju deuterijum, halogen, C1-2alkil i C3-4cikloalkil grupa; R<4>i R<5>su nezavisno izabrani od jednog ili više od deuterijuma, halogena, cijano, C2-3alkenil, C2-3alkinil, C1- 3alkil, supstituisane C1-3alkil, C1-3alkoksi, supstituisane C1-3alkoksi, C1-3alkiltio i supstituisane C1-3alkiltio grupe; pri čemu su supstituenti u R<1>, R<2>, R<4>i R<5>nezavisno izabrani od deuterijuma, halogena, C1-3alkil, C3-4cikloalkil i C1-3alkoksi grupe.
2. 2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što: R<1>i R<2>su nezavisno izabrani od jednog ili više vodonika, deuterijuma, fluora, hlora, broma, cijano, hidroksila, C1-3alkil, supstituisane C1-3alkil, C1-3alkoksi i supstituisane C1-3alkoksi grupe; pri čemu su supstituenti nezavisno izabrani iz grupe u koju spadaju deuterijum, halogen, C1-3alkil, C3-4cikloalkil i C1-3alkoksi grupa.
3. 3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što: R<1>i R<2>su nezavisno izabrani od jednog ili više vodonika, deuterijuma, fluora, hlora, broma, CN, C1-3alkil, C1-3halogenizovane alkil i C1-3alkoksi grupe.
4. 4. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što: R<3>je izabran od supstituisane ili nesupstituisane C1-3alkil grupe i supstituisane ili nesupstituisane C3-4cikloalkil grupe; pri čemu su supstituenti nezavisno izabrani iz grupe u koju spadaju deuterijum, halogen, C1-2alkil i C3-4cikloalkil grupa.
5. 5. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što: R<4>i R<5>su nezavisno izabrani od jednog ili više deuterijuma, halogena, cijano, etilena, acetilena, C1-2alkil, supstituisane C1-2alkil, C1-2alkoksi, supstituisane C1-2alkoksi, C1-2alkiltio i supstituisane C1-2alkiltio grupe; pri čemu su supstituenti nezavisno izabrani iz grupe u koju spadaju deuterijum, halogen, C1-2alkil, C3-4cikloalkil i C1-3alkoksi grupa.
6. 6. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što: R<4>i R<5>su nezavisno izabrani od jednog ili više deuterijuma, halogena, cijano, C1-2alkil, C1-2halaogenizovane alkil, C1-2alkoksi i C1-2alkiltio grupe.
7. 7. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je izabrano iz grupe koja sadrži: (3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; (2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(4-hidroksi-3,5-dijodofenil)metanon; (3-Hlor-4-hidroksi-5-jodofenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; 3-Hlor-5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitril; (3-Bromo-4-hidroksi-5-jodofenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; (2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(4-hidroksi-3-jodo-5-metilfenil)metanon; (3-Bromo-5-Hlor-4-hidroksifenil)(2-etil-6-fluoroimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; (3-Hlor-4-hidroksi-5-jodofenil)(2-etil-6-fluoroimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; 5-(2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksi-3-metilbenzonitril; (3-Bromo-4-hidroksi-5-(trifluorometil)fenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; (3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-6-metilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; (3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-6-metoksiimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; 3-Bromo-5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitril; 5-(2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksi-3-jodobenzonitril; 5-(2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-3-fluoro-2-hidroksibenzonitril; (3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-propilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; (3-Bromo-5-Hlor-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; (3-Bromo-5-fluoro-4-hidroksifenil)(2-etil-6-fluoroimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; (2-Etil-6-fluoroimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3-fluoro-4-hidroksi-5-jodofenil)metanon; (3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-6-hidroksiimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; (6-Bromo-2-etil-7-metilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)-metanon; (3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)(2-etil-7-(trifluorometil)imidazo[1,2-a]piridin-3-il)-metanon; 3-(3,5-Dibromo-4-hidroksifenil)-2-etilimidazo[1,2-a]piridin-6-karbonitril; (2-Deuterijum-3,5-dibromo-4-hidroksifenil)(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metanon; (6-Deuterijum-2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)metanon; (2-Ciklopropilimidazo[1,2-a]piridin-3-il)(3,5-dibromo-4-hidroksifenil)metanon; 3-Bromo-5-(2-etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksibenzonitril vodonik hlorid; i 5-(2-Etilimidazo[1,2-a]piridin-3-karbonil)-2-hidroksi-3-jodobenzonitril vodonik hlorid.
8. 8. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 7 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so kao aktivni sastojak ili glavni aktivni sastojak, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
9. 9. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 7 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu kao medikament.
10. 10. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 7 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu za povećanje izlučivanja mokraćne kiseline.
11. 11. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 7 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu za lečenje ili prevenciju hiperurikemije, nefroze ili gihta. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5