RS60725B1 - Fuzioni proteini fgf21 sa dugotrajnim dejstvom i farmaceutska kompozicija koja obuhvata iste - Google Patents

Description

Opis

Tehnička oblast

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na fuzioni protein koji obuhvata mutantni protein faktora rasta fibroblasta 21 (FGF21) sa poboljšanim in vivo trajanjem, stabilnošću proteina i farmakološkim dejstvom, i farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata isti.

Stanje tehnike

[0002] Faktor rasta fibroblasta 21 (FGF21), sintetisan u jetri, je hormon koji je poznat da ima važnu ulogu u homeostazi glukoze i lipida. FGF21 pokazuje farmakološka dejstva u jetri, adipocitima, β ćelijama pankreasa, hipotalamusu u mozgu, i mišićnim tkivima, gde su i FGF21-specifični receptor, tj., FGF receptor, i β-kloto kompleks eksprimirani. Prijavljeno je da kod modela nehumanih primata i miševa različitih dijabetičkih i metaboličkih bolesti, FGF21 može da snizi nivoe glukoze u krvi na insulinski zavistan način, da smanji telesnu masu, i da se snize koncentracije triglicerida i lipoproteina niske gustine (LDL) u krvi. Pored toga, zbog svog efekta poboljšanja osetljivosti insulina, FGF21 ima potencijal za razvoj novog terapeustkog sredstva za dijabetes i gojaznost (pogledati WO2003/011213).

[0003] Shodno tome, kako bi se razvio novi anti-dijabetski lek baziran na FGF21, bilo je pokušaja da se poboljša njegovo biološko dejstvo i in vivo stabilnost konstruisanjem FGF21 mutanata baziranih na sekvenci divljeg tipa FGF21 putem supstitucije, umetanja, i brisanja nekih aminokiselina

(pogledati WO2010/065439). Međutim, budući da FGF21 ima veoma kratko poluvreme eliminacije, to se pokazalo kao problematično ukoliko se upotrebljava direktno kao bioterapeutsko sredstvo (Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635). In vivo poluvreme eliminacije FGF21 je 1 do 2 sata kod miševa, i 2.5 do 3 sata kod majmuna. Stoga, za FGF21 da bi se koristio u svom trenutnom obliku kao terapeutsko sredstvo za dijabetes, potrebno je dnevno davanje.

[0004] Različiti pristupi su prijavljeni prilikom pokušaja da se poveća in vivo poluvreme eliminacije rekombinantnih proteina FGF21. Jedan takav primer je da se veže polietilenglikol (PEG), tj., polimerni materijal, sa FGF21 da bi se povećala njegova molekulska masa, čime se inhibira renalna sekrecija i povećava in vivo vreme zadržavanja (pogledati WO2012/066075). Drugi pristup je bio pokušaj da se poboljša poluvreme eliminacije spajanjem sa masnom kiselinom, koja se vezuje za humani

albumin (pogledati WO2012/010553). Dodatni primer predstavlja pokušaj da se poveća poluvreme eliminacije a da se istovremeno održava farmakološko dejstvo ekvivalentno onom od FGF21 divljeg tipa stvaranjem antitela agonista, koje se specifično vezuje za humani FGF receptor sam ili kao kompleks sa β-kloto (pogledati WO2012/170438). U drugom primeru, poluvreme eliminacije je poboljšano pripremanjem fuzionih proteina sa dugotrajnim dejstvom, u kojima je Fc region IgG spojen sa FGF21 molekulom ( pogledati WO2013/188181).

[0005] Među raznim tehnologijama koje su dostupne da se stvore lekovi sa dugotrajnim dejstvom, tehnologija Fc fuzije je u širokoj upotrebi zato što ima manje nedostataka u poređenju sa drugim pristupima, kao što je indukovanje imunog odgovora ili toksičnosti istovremeno povećavajući in vivo poluvreme eliminacije. Za razvoj Fc-fuzionog FGF21 proteina kao terapeutskog leka sa dugotrajnim dejstvom, trebalo bi ispuniti sledeće uslove.

[0006] Prvo, smanjenje in vitro dejstva uzrokovano fuzijom bi trebalo da se svede na minimum. I N-terminus i C-terminus FGF21 su uključeni u dejstvo FGF21. U ovom smislu, poznato je da se dejstva FGF21 fuzionih proteina u velikoj meri razlikuju u zavisnosti od mesta fuzije. Samim tim, dejstva Fcspojenih FGF21 fuzionih proteina, u kojima su mutacije uvedene u FGF21, mogu biti izmenjena u zavisnosti od prisustva /odsustva ili mesta fuzije. Drugo, farmakokinetički profil koji omogućava davanje jednom nedeljno kod ljudi bi trebalo da da bude realizovan povećanjem in vivo poluvremena eliminacije fuzijom. Treće, uzimajući u obzir da imunogenost može da se očekuje kod većine pacijenata nakon davanja biofarmaceutika, rizik od imunogenosti usled fuzionog veznika ili mutacije bi trebalo da se svede na minimum. Četvrto, ne bi trebalo da postoje problemi vezano za stabilnost koji su posledica položaja fuzije ili uvođenja mutacije. Peto, pošto neželjeni imunološki odgovori mogu da se jave u zavisnosti od izotipova fuzionog imunoglobulina, neophodno je rešenje da bi se sprečili takvi odgovori.

[0007] Pokušaj da se razvije fuzioni protein sa dugotrajnim dejstvom povezivanjem Fc regiona imunoglobulina G (IgG) sa FGF21 molekulom je već prijavljen (pogledati WO 2013/188181). U slučaju jedne Fc-FGF21 strukture, gde je Fc spojen sa N-terminusom divljeg tipa FGF21, a da pri tom ne postoji jasna razlika u in vitro dejstvu u poređenju sa onim od FGF21 divljeg tipa, poznato je da je poluvreme eliminacije veoma kratko usled in vivo razgradnje proteina. Da bi se ovaj problem rešio, bio je pokušaj da se poboljša in vivo poluvreme eliminacije uvođenjem nekoliko mutacija na specifičnim lokacijama mesta FGF21 kako ne bi došlo do raspadanja proteina. Međutim, rizik od imunogenosti može da poveća uvođenje višestrukih mutacija. Nasuprot tome, u slučaju FGF21-Fc strukture, tamo gde je Fc spojen sa C-terminusom FGF21 molekula, poznato je da postoji značajno smanjenje dejstva uzrokovano fuzijom na ovom mestu u poređenju sa strukturom Fc-FGF21.

[0008] Pronalazači ovog pronalaska su nastojali da poboljšaju fiziološko dejstvo i stabilnost FGF21 i otkrili su da farmakološka efikasnost FGF21 može biti poboljšana a da in vivo izloženost i poluvreme eliminacije FGF21 mogu da se povećaju bez ugrožavanja in vitro dejstva kada se mutacija uvede na određeno mesto FGF21 i kada se sa njim poveže Fc region, čime se i postiže ovaj pronalazak.

Otkrivanje pronalaska

Tehnički problem

[0009] Predmet ovog pronalaska je da obezbedi fuzioni protein koji obuhvata mutantni protein FGF21 sa poboljšanim in vivo trajanjem, stabilnošću proteina i farmakološkom efikasnošću.

[0010] Drugi predmet ovog pronalaska je da obezbedi farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata fuzioni protein.

[0011] Dalji predmet ovog pronalaska je da obezbedi izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein, ekspresioni vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline, i ćeliju domaćina koja obuhvata ekspresioni vektor.

Rešenje problema

[0012] Ovaj pronalazak obezbeđuje fuzioni protein koji obuhvata mutantni protein FGF21 i Fc region imunoglobulina, pri čemu taj mutantni protein FGF21 obuhvata sledeću mutaciju :

(1) supstitucija aminokiselina na položajima 98 do 101 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinskom sekvencom EIRP (SEQ ID NO: 42).

Poželjno, fuzioni protein dalje obuhvata sledeću mutacija: supstitucija aminokiseline na položaju 180 od N-terminusa FGF21 proteina divljeg tipa aminokiselinom E.

Poželjnije, fuzioni protein dalje obuhvata najmanje jednu mutaciju izabranu iz grupe koju čine sledeće mutacije:

(2) supstitucija aminokiselina na položajima 170 do 174 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinskom sekvencom TGLEAV (SEQ ID NO: 43);

(3) supstitucija aminokiselina na položajima 170 do 174 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinskom sekvencom TGLEAN (SEQ ID NO: 44);

(4) supstitucija aminokiseline na položaju 170 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinom N ; i

(5) supstitucija aminokiseline na položaju 174 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinom N.

[0013] Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata fuzioni protein za lečenje dijabetesa, gojaznosti, dislipidemije, metaboličkog sindroma, bolesti nealkoholne masne jetre ili nealkoholnog steatohepatitisa.

[0014] Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein, ekspresioni vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline, i ćeliju domaćina koja obuhvata ekspresioni vektor.

Poželjni efekti pronalaska

[0015] Fuzioni protein ovog pronalaska, pripremljen povezivanjem Fc regiona humanog imunoglobulina sa mutantnim proteinom FGF21, ima poboljšano in vivo trajanje, stabilnost proteina i farmakološku efikasnost. Pored toga, farmaceutska kompozicija koja obuhvata fuzioni protein kao aktivni sastojak može da se koristi kao terapeutsko sredstvo za dijabetes, gojaznost, dislipidemiju, metabolički sindrom, bolest nealkoholne masne jetre ili nealkoholni steatohepatitis. Određenije, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska ima prednost dugog intervala davanje usled povećane in vivo stabilnosti FGF21 fuzionog proteina u poređenju sa onom od konvencionalne farmaceutske kompozicije koja obuhvata protein FGF21.

Kratak opis crteža

[0016]

FIG.1A do 1C predstavljaju grafikone koji prikazuju rezultate merenja in vitro dejstava fuzionih proteina uključujući mutantne proteine FGF21 (dalje u tekstu, "FGF21 mutantni fuzioni protein") upotrebom HEK293 ćelijske linije u kojoj je humani β-kloto prekomerno eksprimiran. Nijedna FGF21 varijanta mutantnog fuzionog proteina nije pokazala značajno smanjenje dejstva usled uvođenja mutacija.

FIG.2A i 2B predstavljaju grafikone koji prikazuju rezultate merenja in vitro dejstva FGF21 mutantnih fuzionih proteina u zavisnosti od veznika koji povezuju N-terminus FGF21 sa Fc regionom pomoću HEK293 ćelijske linije u kojoj je humani β-kloto prekomerno eksprimiran. Nijedna varijanta FGF21 mutantnog fuzionog proteina nije pokazala značajno smanjenje dejstva, iako su primećene blage razlike u smislu dejstva koje zavisi od sekvence veznika.

FIG.3 predstavlja grafikon koji pokazuje rezultate merenja in vitro dejstava RGE (Amgen), Fc-FGF21 (Lilly) iDFD1 pomoću HEK293 ćelijske linije u kojoj je humani β-kloto prekomerno eksprimiran. DFD1 i RGE (Amgen) su imali slična dejstva, dok je Fc-FGF21 (Lilly) imao in vitro dejstvo dva puta jače od drugih proteina.

FIG.4 prikazuje grafikone na kojima se poredi stabilnost DFD4 sa onom od DFD13 kako bi se potvrdio efekat EIRP mutacije (u FGF21) na stabilnost fuzionog proteina. Potvrđeno je da je DFD13 imao nižu brzinu agregata velike molekulske mase (HMW %) u početnoj fazi i u vremenskoj tački od više od 2 nedelje u poređenju sa DFD4, što ukazuje da uvođenje EIRP mutacije poboljšava stabilnost FGF21 mutantnog fuzionog proteina, čime se značajno smanjuje HMW %.

FIG.5 predstavlja grafikon koji pokazuje koncentraciju svakog proteina u krvi tokom 93 sati nakon supkutanog davanja FGF21 mutantnih fuzionih proteina. Podaci su označeni kao srednje vrednosti i standardna devijacija.

FIG.6 predstavlja grafikon koji pokazuje nivoe glukoze u krvi kod ob/ob modela miša nakon pojedinačne supkutane injekcije DFD18, DFD72, DFD74 ili Fc-FGF21 (Lilly). DFD18, DFD72 i DFD74 su svi imali efekat snižavanja nivoa glukoze u krvi kontinuirano. Podaci su označeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti (S.E.M.).

FIG.7 prikazuje grafikone koji označavaju promene u telesnim masama kod modela ob/ob miša oda dana davanja do 14. dana nakon pojedinačne supkutane injekcije DFD18, DFD72, DFD74 ili FcFGF21 (Lilly). DFD18, DFD72 i DFD74 su svi imali efekat smanjenja telesne mase u poređenju sa PBS-tretiranom grupom. Podaci su označeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.8 prikazuje grafikone koji označavaju promene u nivoima glikolizovanog hemoglobina kod ob/ ob modela miša na dan davanja (1. dana) i 16. dana nakon pojedinačne supkutane injekcije DFD18, DFD72, DFD74 ili Fc-FGF21 (Lilly). DFD18, DFD72 i DFD74 su svi uzrokovali snižene nivoe glikolizovanog hemoglobina 16.dana u poređenju sa onima na dan davanja. Podaci su označeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.9 predstavlja grafikon koji pokazuje nivoe glukoze u krvi kod HFD/STZ modela miša nakon pojedinačne supkutane injekcije DFD72 ili DFD74. I DFD72 i DFD74 su imali efekat snižavanja nivoa glukoze u krvi kontinuirano. Podaci su označeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.10 prikazuje grafikone koji označavaju promene u telesnim masama kod HFD/STZ modela miša od dana davanja do 14. dana nakon pojedinačne supkutane injekcije DFD72 ili DFD74. I DFD72 i DFD74 su imali efekat smanjenja telesne mase u poređenju sa PBS-tretiranom grupom. Podaci su označeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.11 prikazuje grafikone koji označavaju promene u nivoima glikolizovanog hemoglobina kod HFD/STZ modela miša 1. dana i 13. dana nakon pojedinačne supkutane injekcije DFD72 ili DFD74. Pokazano je da je tretiranje i DFD72 i DFD74 dovelo do većeg snižavanja nivoa glikolizovanog hemoglobina u poređenju sa PBS-tretiranom grupom. Podaci su označeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

FIG.12 prikazuje grafikone koji označavaju promene u telesnim masama merene kod modela miša sa gojaznošću koja ja izazvana ishranom od dana davanja do 14. dana nakon pojedinačnog davanja DFD18. DFD18 je imao odličan efekat na smanjenje telesne mase. Podaci su označeni kao srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti.

Najbolji način za izvođenje ovog pronalaska

[0017] Dalje u tekstu, ovaj pronalazak će biti detaljnije opisan.

[0018] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje fuzioni protein koji obuhvata mutantni protein faktora rasta fibroblasta 21 (FGF21) i Fc region imunoglobulina, pri čemu mutantni protein FGF21 obuhvata sledeću mutaciju:

(1) supstitucija aminokiselina na položajima 98 do 101 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinskom sekvencom EIRP (SEQ ID NO: 42) (dalje u tekstu, "EIRP").

Poželjno, fuzioni protein dalje obuhvata sledeću mutaciju: supstitucija aminokiseline na položaju 180 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinom E.

Poželjnije, fuzioni protein dalje obuhvata najmanje jednu mutaciju izabranu iz grupe koju čine sledeće mutacije:

(2) supstitucija aminokiselina na položajima 170 do 174 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinskom sekvencom TGLEAV (SEQ ID NO: 43) (dalje u tekstu, "TGLEAV");

(3) supstitucija aminokiselina na položajima 170 do 174 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinskom sekvencom TGLEAN (SEQ ID NO: 44) (dalje u tekstu, "TGLEAN");

(4) supstitucija aminokiseline na položaju 170 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinom N (dalje u tekstu, "G170N") ; i

(5) supstitucija aminokiseline na položaju 174 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinom N (dalje u tekstu, "G174N").

[0019] Divlji tip FGF21 proteina, hormon za koji se zna da ima važnu ulogu u homeostazi glukoze i lipida, može biti jedan koji se dobija od sisara kao što su ljudi, miševi, svinje, majmuni, itd., poželjno od ljudi. Poželjnije, protein FGF21 divljeg tipa može da bude humani FGF21 protein divljeg tipa sa aminokiselinskom sekvencom koju predstavlja SEQ ID NO: 1.

[0020] Takođe su opisani mutantni proteini FGF21 koji imaju bilo koju od mutacija EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N i G174N. Mutantni protein FGF21 ovog pronalaska može da ima kombinaciju bilo koje od mutacija TGLEAV, TGLEAN, G170N i G174N i mutacije EIRP. Ovde su takođe opisani mutantni proteini FGF21 koji imaju kombinaciju bilo koje od mutacija EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N i G174N i mutacije A180E. Mutantni protein FGF21 ovog pronalaska može da ima kombinaciju bilo koje od mutacija TGLEAV, TGLEAN, G170N ai G174N, mutacije EIRP i mutacije A180E. Dalje, opisani su mutantni proteini FGF21 koji mogu da imaju konformaciju, u kojoj je 1 do 10 aminokiselina na N-terminusu ili C-terminusu je (su) obrisan(i) u poređenju sa FGF21 proteinom divljeg tipa. Mutantni proteini FGF21 ovog pronalaska mogu da uključuju aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja bilo koja od SEQ ID NO: 6, 11 do 15, i 20 do 23. Drugi mutantni proteini FGF21 su opisani koji mogu da uključuju aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja bilo koja od SEQ ID NO: 7 do 10, 16 do 19, ili aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja bilo koja od SEQ ID NO: 6 do 23 i dalje imaju konformaciju, u kojoj je 1 do 10 aminokiselina na N-terminusu ili C-terminusu izbrisano u poređenju sa FGF21 proteinom divljeg tipa.

[0021] U fuzionom proteinu, aminokiselinski ostatak N mutantnog proteina FGF21 uveden mutacijom može da bude glikozilovan.

[0022] Kako se ovde upotrebljava, pojam "Fc region," "Fc fragment," ili "Fc" se odnosi na protein, koji uključuje konstantni region teškog lanca 1 (CH1), konstantni region teškog lanca 2 (CH2) i konstantni region teškog lanca 3 (CH3) imunoglobulina, ali ne uključuje varijabilne regione teških i lakih lanaca i konstantni region lakog lanca 1 (CL1) imunoglobulina. Pored toga, kako se ovde upotrebljava, pojam "Fc mutantni region" se odnosi na onaj koji je pripremljen supstituisanjem dela aminokiseline(a) Fc regiona ili kombinovanjem Fc regiona različitih vrsta.

[0023] Fc region imunoglobulina može da bude ceo Fc region koji čini antitelo, njegov fragment, ili Fc mutantni region. Pored toga, Fc region uključuje molekul u obliku monomera ili multimera, i može dalje da uključuje bočni region konstantnog regiona teškog lanca. Fc mutantni region može da bude modifikovan da bi se sprečilo cepanje na bočnom regionu. Dalje, bočna sekvenca Fc može da ima supstituciju u nekim aminokiselinskim sekvencama da bi se smanjila ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) ili citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC). Pored toga, deo aminokiselinske sekvence Fc bočne sekvence može biti supstituisan kako bi inhibirao preraspodelu Fab regiona. Lizinski ostatak na C-terminusu Fc može biti uklonjen.

[0024] Poželjno, Fc region imunoglobulina može biti bilo koje od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 i IgD Fc regiona; ili hibridni Fc, koji predstavlja njihovu kombinaciju. Dalje, hibridni Fc može da uključuje IgG4 region i IgD region. Dalje, hibridni Fc region može da uključuje deo bočne sekvence i CH2 IgD Fc, i CH2 i CH3 sekvence IgG4 Fc.

[0025] Pored toga, Fc fragment ovog pronalaska može biti u obliku glikozilovanog lanca divljeg tipa, više glikozilovanog lanca od divljeg tipa, manje glikozilovanog lanca od divljeg tipa, ili deglikozilovani lanac. Povećanje, smanjenje, ili uklanjanje glikozilovanog lanca može biti izvedeno konvencionalnim postupkom poznatim u tehnici, kao što je hemijski postupak, enzimski postupak, i postupak genetskog konstruisanja upotrebom mikroorganizama.

[0026] Dalje, Fc region imunoglobulina može da predstavlja SEQ ID NO: 24 ili 25.

[0027] Pored toga, Fc region imunoglobulina može da predstavlja SEQ ID NO: 26.

[0028] Pored toga, fuzioni protein može dalje da obuhvata veznik.

[0029] Fuzioni protein može biti u obliku, u kojem je mutantni protein FGF21 direktno povezan sa N-terminusom ili C-terminusom Fc regiona imunoglobulina, ili je mutantni protein FGF21 povezan sa Fc regionom imunoglobulina preko veznika.

[0030] U takvom slučaju, veznik može biti povezan sa N-terminusom, C-terminusom, ili slobodnim radikalom Fc fragmenta, a takođe može biti povezan sa N-terminusom, C-terminusom, ili slobodnim radikalom mutantnog proteina FGF21. Kad je taj veznik peptidni veznik, veza može da se javi u regionu. Na primer, veznik može biti povezan sa C-terminusom Fc regiona imunoglobulina i N-terminusom mutantnog proteina FGF21 da bi se formirao fuzioni protein Fc regiona imunoglobulina i mutantni protein FGF21.

[0031] Kada se veznik i Fc odvojeno eksprimiraju a zatim povezuju, veznik može da predstavlja sredstvo za umrežavanje poznato u tehnici. Primeri sredstva za umrežavanje mogu da uključuju 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, imidoestre uključujući estar N-hidroksisukcinimida kao što je 4-azidosalicijalna kiselina i estre disuckcinimidla kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidilpropionat), i bifunkcionalni malamidi kao što su bis-N-maleimido-1,8-oktan, ali bez ograničenja na iste.

[0032] Dalje, veznik može biti peptid. Poželjno, veznik može biti peptid koji se sastoji od 10 do 30 aminokiselinskih ostataka.

[0033] Dalje, alanin može dodatno biti pričvršćen za kraj veznika. Poželjno, veznik može biti peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja bilo koja od SEQ ID NO: 2 do 5.

[0034] Fuzioni protein može biti u obliku u kojem diamer ili multimer mutantnih proteina FGF21, u kojem je jedan ili više mutantnih proteina FGF21 povezanih zajedno, povezan sa Fc regionom imunoglobulina. Pored toga, fuzioni protein može biti u obliku dimera ili multimera u kojem su dva ili više Fc regiona imunoglobulina su povezani, pri čemu Fc regioni imunoglobulina imaju mutantni protein FGF21 povezan sa njima.

[0035] Pored toga, fuzioni protein može biti peptid koji poželjno ima aminokiselinsku sekvencu koju predstavljaju bilo koje od SEQ ID NO: 27 do 39. Poželjnije, fuzioni protein uključujući mutantni protein FGF21 može biti peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koju predstavljaju SEQ ID NO: 36, 37 ili 39.

[0036] Imunogenost proteina FGF21 divljeg tipa može da se predvidi konvencionalnim postupkom poznatim u tehnici. Na primer, potencijalna imunogenost proteina može biti detaljno pregledana pomoću, npr., iTope™ i TCED™ postupaka.

[0037] Dalje, mutacije za svođenje imunogenosti na minimum mogu biti dizajnirane konvencionalnim postupkom poznatim u tehnici. Na primer, kada je imunogenost uočena izvođenjem EpiScreen™ analize da bi se procenila potencijalna imunogenost, aminokiselinske sekvence koje izazivaju imunogenost mogu biti identifikovane putem mapiranja epitopa T-ćelija, a aminokiselinske sekvence koje izazivaju imunogenost mogu biti identifikovane putem mapiranja epitopa T-ćelija, a mutanti sa minimizovanom imunogenošću mogu biti dizajnirani putem in silico predviđanja.

[0038] Fuzioni protein može da ima oblik sa kojim je jedan ili više biološki aktivnih proteina dalje kuplovan. Biološki aktivni protein može da bude onaj koji je izabran iz grupe koju čine insulin, C-peptid, leptin, glukagon, gastrin, gastrični inhibitorni polipeptid (GIP), amilin, kalcitonin, holecistokinin, peptid YY, neuropeptid Y, koštani morfogenetički protein-6 (BMP-6), koštani morfogenetički protein-9 (BMP-9), oksintomodulin, oksitocin, peptid-1 (GLP-1) poput glukagona, peptid-2 (GLP-2) poput glukagona, irisin, fibronektin tipa III domen koji sadrži protein 5 (FNDC5), apelin, adiponektin, C1q i faktor nekroze tumora koji se odnosi na protein (CTRP porodica), resistin, visfatin, omentin, retinol vezujući protein-4 (RBP-4), glicentin, angiopoietin, interleukin-22 (IL-22), eksendin-4 i hormon rasta. Poželjno, biološki aktivni protein može biti jedan koji je izabran od GLP-1, njegovog mutanta i eksendina-4.

[0039] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fuzioni protein za lečenje poremećaja povezanih sa FGF21.

[0040] Kako se ovde upotrebljava, pojam "poremećaj povezan sa FGF21" može da uključi gojaznost, dijabetes tipa I i tipa II, pankreatitis, dislipidemiju, bolest nealkoholne masne jetre (NAFLD), nealkoholni steatohepatitis (NASH), insulinsku rezistentnost, hiperinsulinemiju, netoleranciju na glukozu, hiperglicemiju, metabolički sindrom, akutni infarkt miokarda, hipertenziju, kardiovaskularne bolesti, aterosklerozu, perifernu arterijsku bolest, apopleksiju, srčanu insuficijenciju, koronarnu arterijsku bolest srca, bolest bubrega, dijabetične komplikacije, neuropatiju, gastroparezu, poremećaj povezan sa ozbiljnom inaktivacionom mutacijom kod insulinskog receptora, i druge metaboličke poremećaje.

Poželjno, poremećaj povezan sa FGF21 može biti dijabetes, gojaznost, dislipidemija, metabolički sindrom, bolest nealkoholne masne jetre, nealkoholni steatohepatitis ili kardiovaskularne bolesti .

[0041] Dalje, farmaceutska kompozicija može dalje da uključi farmaceutskog nosača. Farmaceutski nosač može da bude bilo koji nosač sve dok je netoksičan materijal pogodan za isporučivanje antitela pacijentima. Na primer, destilovana voda, alkohol, masti, voskovi i neaktivni čvrsti materijali mogu biti uključeni kao nosač. Farmaceutski prihvatljivi adjuvansi (agensi za puferovanje, agensi za dispergovanje) takođe mogu da budu uključeni u farmaceutsku kompoziciju. U ovim formulacijama, koncentracija fuzionog proteina u velikoj meri može da varira.

[0042] Specifično, farmaceutska kompozicija može da sadrži formulaciju za menjanje, održavanje, ili konzervisanje pH, osmolaritet, viskozitet, transparentnost, boju, izotoničnost, miris, sterilitet, stabilnost, otpuštanje ili brzinu oslobađanja, apsorpciju, ili permeabilnost kompozicije. Primeri pogodnog materijala za formulisanje mogu da uključuju aminokiseline (npr., glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin), sredstva protiv mikroorganizama, antioksidanse (npr., askorbinsku kiselinu, natrijumsulfit ili natrijumbisulfit), sredstva za puferovanje (npr., borat, bikarbonate, Tris-HCl, citrat, fosfat ili druge organske kiseline), sredstva za povećanje zapremine (npr., manitol ili glicin), helatna sredstva (npr., etielendiaminetetraacetna kiselina (EDTA)), sredstva za obrazovanje kompleksa (npr., kofein, polivinilpirolidion, β-ciklodekstrin ili hidroksipropil-β-ciklodekstrin), punioce, monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate (npr., glukoza, manoza ili dekstrin), proteine (npr., albumin u serumu, želatin ili imunoglobulin), sredstva za bojenje, arome, razblaživače, emulgatore, hidrofilne polimere (npr., polivinilpirolidion), polipeptide niske molekulske mase, kontrajone koji formiraju soli (npr., natrijum), konzervanse (npr., benzalkoniumhlorid, benzoična kiselina, salicijalna kiselina, timerozal, fentil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonikperoksid), rastvarače (npr., glicerin, propilenglikol ili polietilenglikol), šećerne alkohole (npr., manitol ili sorbitol), sredstva za suspendovanje, surfaktante ili ovlaživače (npr., pluronici; PEG; estar sorbitana; polisorbat, npr., polsorbat 20 ili polisorbat 80; triton; trometamin; lecitin; holesterol ili tiloksapol), poboljšivači stabilnosti (npr., saharoza ili sorbitol), poboljšivači rasta (npr., alkalni metalni halidi, poželjno, natrijumhlorid ili kalijumhlorid; ili manitol, sorbitol), nosioci isporuke, razblaživači, ekscipijensi i/ili farmaceutski adjuvansi, ali bez ograničenja na iste.

[0043] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje fuzioni protein ovog pronalaska za upotrebu u postupku za sprečavanje ili lečenje poremećaja povezanih sa FGF21 uključujući davanje fuzionog proteina subjektu kojem je takvo sprečavanje ili lečenje potrebno. Ovaj postupak uključuje, određenije, davanje efektivne količine fuzionog proteina ovog pronalaska sisaru sa simptomom dijabetesa, gojaznosti, dislipidemije, metaboličkog sindroma, bolesti nealkoholne masne jetre, nealkoholnog steatohepatitisa ili kardiovaskularnih bolesti koje su poremećaji povezani sa FGF21.

[0044] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može da se daje bilo kojim putem. Kompozicija ovog pronalaska može da se da direktno životinji (npr., topikalno, davanjem u površine tkiva injekcijom, transplantacijom, ili topikalnim davanjem) ili sistemski (npr., oralnim ili paranteralnim davanjem) bilo kojim odgovarajućim sredstvima. Kada se kompozicija ovog pronalaska obezbeđuje parenteralno intravenski-, supkutano-, očno-, intraperitonealno-, intramuskularno-, oralno-, rektalno-, intraorbitalno-, intracerebralno-, intrakranijalno-, intraspinalno-, intraventrikularno-, intratekalno-, intracistenalno-, intrakapsularno-, intranazalno-, ili putem aerosoli, kompozicija je poželjno vodena ili može da uključi porciju fiziološki primenjive telesne tečne suspenzije ili rastvora. S tim u vezi, nosač ili nosilac mogu da se dodaju kompoziciji i da budu isporučeni pacijentu budući da je to fiziološki prihvatljivo. Stoga, fiziološkiprikladan slani rastvor generalno može da bude uključen kao nosač kao telesna tečnost za formulacije.

[0045] Dalje, učestalost davanja može da varira u zavisnosti od farmakokinetičkih parametara fuzionog proteina u formulacijama koje se koriste. Obično bi lekari davali kompoziciju dok se ne postigne doza davanja koja obezbeđuje željeni efekat. Shodno tome, kompozicija može da se daje kao jedinična doza, najmanje dve doze sa istim intervalima (mogu ili ne moraju da sadrže istu količinu ciljanog fuzionog proteina) ili se daje kontinuiranom injekcijom pomoću uređaja za transplantaciju ili katetera. Preciznost dodavanja odgovarajuće doze koja se daje mogu rutinski da izvedu stručnjaci, i odgovara obimu posla koji oni rutinski obavljaju.

[0046] Pored toga, poželjna jedinična doza fuzionog proteina kod ljudi može da bude u opsegu od 0.01 µg/kg do 100 mg/kg telesne mase, i poželjnije od 1 µg/kg do 10 mg/kg telesne mase. Iako je ovo optimalna količina, jedinična doza može da varira u zavisnosti od bolesti koja se leči ili prisustva/odsustva neželjenih efekata. Ništa manje, optimalna doza davanja može da se odredi izvođenjem konvencionalnog eksperimenta. Davanje fuzionog proteina može da bude izvedeno periodičnom bolus injekcijom, putem spoljašnjeg rezervoara (npr., intavenske kese), ili kontinuiranim intravenskim-, supkutanim-, ili intraperitonealnim davanjem iz unutrašnjeg izvora (npr., bioerodibilnim implantatom).

[0047] Pored toga, fuzioni protein ovog pronalaska može da se da subjektu primaocu zajedno sa drugim biološki aktivnim molekulima. Optimalna kombinacija fuzionog proteina i drugog molekula(a), doznih oblika, i optimalnih doza može biti određena konvencionalnim eksperimentom dobro poznatim u tehnici.

[0048] Opet u drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein.

[0049] Kako se ovde upotrebljava, pojam "izolovani molekul nukleinske kiseline" se odnosi na molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska, koji je izolovan iz oko najmanje 50% proteina, lipida, ugljenih hidrata, ili drugih materijala, otkrivenih u prirodi kada su ukupne nukleinske kiseline izolovane iz izvorne ćelije; koja je operativno povezana sa polinukleotidom koji po prirodi nije povezan; ili koji je deo veće polinukleotidne sekvence i ne javlja se u prirodi. Poželjno, u izolovanom molekulu nukleinskih kiselina ovog pronalaska, one nisu suštinski prisutne u bilo kojim drugim kontaminiranim nukleinskim kiselinama, ili drugim kontaminantima koji su otkriveni u prirodnom okruženju i inhibiraju upotrebe nukleinskih kiselina u proizvodnji polipeptida, ili lečenju, dijagnozi, sprečavanju, ili istraživanju.

[0050] U takvom slučaju, izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju fuzioni protein mogu da imaju različite sekvence jedni sa drugima usled smanjenja kodona. Dalje, dok izolovana nukleinska kiselina može da proizvede fuzioni protein, izolovana nukleinska kiselina može biti modifikovana na odgovarajući način, ili nukleotid može biti dodat N-terminusu ili C-terminusu izolovane nukleinske kiseline u skladu sa željenim svrhama.

[0051] Izolovana nukleinska kiselina može da uključi, na primer, nukleotidnu sekvencu koju predstavlja bilo koja od SEQ ID NO: 45 do 57.

[0052] Opet u drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji obuhvata izolovani molekul nukleinske kiseline, koji kodira fuzioni protein koji uključuje mutantni protein FGF21 i Fc region imunoglobulina.

[0053] Kako se ovde upotrebljava, pojam "ekspresioni vektor" se odnosi na vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline, koji je pogodan za transformaciju ćelije domaćina i koji usmerava ili kontroliše ekspresiju umetnute heterogenozne sekvence nukleinske kiseline. Ekspresioni vektor uključuje linearnu nukleinsku kiselinu, plazmid, fagemid, kozmid, RNK vektor, virusni vektor, i njihove analoge. Primeri virusnog vektora uključuju retrovirus, adenovirus i adeno-povezani virus, ali nije ograničen na iste.

[0054] Kako se ovde upotrebljava, pojam "ekspresija heterogenozne sekvence nukleinske kiseline" ili "ekspresija" ciljanog proteina se odnosi na transkripciju umetnute DNK sekvence, translacije mRNK transkripta, i proizvodnje proizvoda Fc fuzionog proteina, antitela ili fragmenta antitela.

[0055] Koristan ekspresioni vektor može biti RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) ili njegov mutant. Koristan ekspresioni vektor može da uključi promoter humanog citomegalovirusa (CMV) za promovisanje kontinuirane transkripcije ciljanog gena u ćeliji sisara, i poliadenilacione signalne sekvence goveđeg hormona rasta za pojačavanje nivoa post-transkripcione RNK stabilnosti. U primernom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ekspresioni vektor je pAD15, koji je modifikovani vektor RcCMV.

[0056] Opet u drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata ekspresioni vektor.

[0057] Kako se ovde upotrebljava, pojam "ćelija domaćina" se odnosi na prokariotičnu ćeliju ili eukariotičnu ćeliju u koju može da bude uveden rekombinantni ekspresioni vektor. Kako se ovde upotrebljava, pojam "transformisan" ili "transfektovan" se odnosi na uvođenje nukleinske kiseline (npr., vektora) u ćeliju raznim tehnologijama poznatim u tehnici.

[0058] Odgovarajuća ćelija domaćina može biti transformisana ili transfektovana sa DNK sekvencom ovog pronalaska i može da se koristi za ekspresiju i/ili sekreciju ciljnog proteina. Primeri odgovarajuće ćelije domaćina koji mogu da se koriste u ovom pronalasku uključuju besmrtne hibridniomske ćelije, NS/0 ćelije mijeloma, 293 ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, CAP ćelije (humane amniotičke ćelije dobijene iz tečnosti), i COS ćelije.

[0059] Dalje u tekstu, primerni načini ostvarivanja ovog pronalaska će biti detaljno opisani uz pozivanje na primere. Međutim, ovi primeri prema ovom pronalasku mogu biti modifikovani u mnogim oblicima i obim ovog pronalaska ne bi trebalo da se tumači kao ograničen na primere date u njemu.

Način funkcionisanja ovog pronalaska

Primer pripreme 1. Priprema i prečišćavanje fuzionog proteina koji sadrži mutantni protein FGF21 Primer pripreme 1-1. Priprema ekspresionih vektora za ekspresiju mutantnih proteina FGF21

[0060] Da bi se poboljšala stabilnost, dejstvo i farmakokinetički profili FGF21 u Fc-FGF21 strukturi, izvedena su ispitivanja mutacija FGF21.

[0061] Specifično, mutantni proteini su dizajnirani za LLLE region (aminokiseline na položajima 98 do 101 od N-terminusa FGF21 proteina) i GPSQG region (aminokiseline na položajima 170 do 174 od N-terminusa FGF21 proteina), i mesto A180, za koje se očekuje da značajno utiču na dejstva proteina bazirana na analizama 3-dimenzionalne strukture FGF21 proteina.

[0062] Položaj, informacije o sekvenci, cilj i očekivani efekat svake mutacije uvedene u FGF21 protein su navedeni u tabeli 1 u nastavku (u tabeli 1, N se odnosi na glikozilovan asparagin (N)). Dalje, mutantni proteini FGF21 koji uključuju mutacije opisane u tabeli 1 su navedeni u tabeli 2 u nastavku.

[Tabela 1]

[Tabela 2]

[0063] Ekspresioni vektori su pripremljeni da eksprimiraju aminokiseline tri komponente: fuzioni nosač, veznik i FGF21 mutant ovim redom od N-terminusa do C-terminusa. Šifra materijala svakog FGF21 mutantnog fuzionog proteina, sekvenca mutacije uvedene u FGF21, sekvenca fuzionog nosača i povezivačka sekvenca su navedeni u tabeli 3 u nastavku (u tabeli 3, N se odnosi na glikozilovani asparagin (N)).

[Tabela 3]

[0064] Da bi se proizveli mutanti fuzioni proteini FGF21, nukleotidne sekvence koje kodiraju svaki od mutantnih proteina FGF21 su sintetisane konsultovanjem sa Bioneer Corporation (Korea) bazirano na aminokiselinskoj sekvenci svakog proteina. NheI i NotI restrikcione enzimske sekvence su dodate 5' terminusu i 3' terminusu nukleotidnih sekvenci koje kodiraju svaki od mutantnih proteina FGF21a iniciacioni kodon za proteinsku translaciju i signalna sekvenca (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA) koja može da izluči eksprimirani protein izvan ćelije su umetnuti pored restrikcione enzimske sekvence na 5' terminusu. Terminacioni kodon je umetnut pored nukleotidne sekvence, koja kodira svaki od FGF21 mutantnih fuzionih proteina. Nukleotidna sekvenca koja kodira svaki od FGF21 mutantnih fuzionih proteina je klonirana u pTrans-prazni ekspresioni vektor upotrebom ta dva restrikciona

enzima NheI i NotI. pTrans-prazni ekspresioni vektor, koji ima jednostavnu strukturu uključujući CMV promoter, pUC-derivirano replikaciono poreklo, SV40-derivirano replikaciono poreklo i gen otporan na ampicilin, je nabavljen od CEVEC Pharmaceuticals (Nemačka).

[0065] U slučaju fuzionih proteina DFD6 (E. coli) i RGE (Amgen), nukleotidna sekvenca koja kodira svaki fuzioni protein je umetnuta u pET30a ekspresioni vektor za ekspresiju u E. coli.

Primer pripreme 1-2. Konstrukcija DNK plazmida za ekspresiju mutantnih fuzionih proteina FGF21 [0066] E. coli je transformisana sa svakim od ekspresionih vektora konstruisanih u primeru pripreme 1-1 da bi se dobila velika količina DNK plazmida koja se koristi za ekspresiju. Ćelije E. coli, čiji su ćelijski zidovi oslabljeni, su transformisane sa svakim ekspresionim vektorom putem toplotnog šoka, i transformanti su položeni u LB ploče da bi se dobile kolonije. Te kolonije dobijene na taj način su inokulisane u LB podloge, kultivisane na 37°C tokom 16 sati, i svaka kultura E. Coli koja sadrži svaki ekspresioni vektor je dobijena u zapremini od 100 mL. E. Coli koja je dobijena na taj način je centrifugirana da bi se ukonila podloga kulture, a zatim su dodati PI, P2, P3 rastvori (QIAGEN, Cat No.: 12963) da bise razbili ćelijski zidovi, čime se dobija DNK suspenzija u kojoj su proteini DNK odvojeni. DNK plazmid je prečišćen iz DNK suspenzije koji je tako dobijen upotrebom kolone Qiagen za prečišćavanje DNK. Eluisani plazmid DNK je identifikovan putem elektroforeze gela agaroze, a koncentracije i čistoće su izmerene upotrebom uređaja za nanokapljice (Thermo scientific, Nanodrop Lite). DNK dobijena na taj način je korišćena za ekspresiju.

Primer pripreme 1-3. Ekspresija fuzionih proteina u CAP-T ćelijama

[0067] Humane ćelijske linije su transfektovane sa svakim tipom plazmida DNK dobijenim u primeru pripreme 1-2. Svaki tip plazmida DNK je transduktovan u CAP-T ćelije (CEVEC), koje su kultivisane u PEM podlozi (Life technologies), upotrebom PEI rastvora (Polyplus, Cat. No.: 101-10N). Mešani rastvor DNK i PEI rastvora je izmešan sa ćelijskom suspenzijom upotrebom Freestyle293 podloge za ekspresiju (Invitrogen), kultivisane na 37°C tokom 5 sati, i dodata je PEM podloga. Nakon kultivisanja na 37°C tokom 5-7 dana, kultura je centrifugirana da bi se uklonile ćelije i dobijen je supernatant koji uključuje FGF21 mutantne fuzione proteine.

Primer pripreme 1-4. Ekspresija i prečišćavanje mutantnih fuzionih proteina FGF21 u E. coli [0068] E. coli soj BL21 (DE3) je transformisan sa svakim plazmidom DNK koji eksprimira DFD6 (E. coli) i RGE (Amgen) fuzione proteine. Ta transformisana E. Coli koja eksprimira svaki fuzioni protein je inokulisana u 20 mL LB podloga, kultivisanih na 37°C tokom 15 sati uz mešanje, a zatim je porcija podloga kultura inokulisana u 100 mL LB podloga, i kultivisana na 37°C tokom 16 sati uz mućkanje. Nakon završetka kultivisanja, kultura je centrifugirana da bi se dobile kuglice E. coli, i zatim su ćelije razbijene pomoću uređaja za razbijanje pod visokim pritiskom da bi se dobila inkluziona tela.

[0069] Dobijena inkluziona tela su prečišćenja pranjem i elucijom, nakon čega je usledio postupak ponovnog savijanja proteina. Specifično, dobijena inkluziona tela su oprana 2-3 puta puferisanim rastvorom (pH 8.0) koji sadrži 0.5% Triton X-100, 50 mM Tris, 1 mM EDTA i 0.1 M NaCl da bi se uklonio bakterijski protein, a zatim su ponovo suspendovana u 8 M puferu uree koji sadrži 8 M uree, 50 mM Tris i 1 mM DTT. Pošto su proteini u 8 M puferu uree bili potpuno denaturisani, a postupak ponovnog savijanja proteina je izveden na sledeći način.

[0070] Da bi se počelo, 8 M pufer uree je postepeno razblažen 20 mM glicerinom puferisanim rastvorom (pH 9.0) da bi se uklonila urea, a od koncentracije od 2 M, CuSO4je dodat koncentraciji od 80 µM da bi se izazvalo stabilno savijanje proteina. Protein koji završava procese savijanja je suspendovan u PBS puferisanom rastvoru (pH 7.4), i suspenzija je filtrirana sa 0.22 µm filterom da bi se uklonile nečistoće, i zatim se puni na hromatografsku kolonu sa afinitetom ka proteinu A. Kolona je oprana 1X PBS puferisanim rastvorom (pH 7.4) a zatim su proteini eluisani pomoću 100 mM glicerinom puferisanog rastvora (pH 3.0) da bi se pripremio DFD6 (E. coli) fuzioni protein.

[0071] U slučaju RGE (Amgen) fuzionog proteina, protein koji završava postupak ponovnog savijanja je suspendovan u 50 mM Tris puferisanom rastvoru (pH 8.0), suspenzija je filtrirana putem 0.22 µm filtera da bi se uklonile nečistoće, a zatim je napunjena u kolonu anjonsko izmenjivačku smole (POROS® HQ 50 µm, Thermo Fisher Scientific). Kolona je oprana sa 50 mM Tris puferisanim rastvorom (pH 8.0), a zatim je 50 mM Tris puferisani rastvor (pH 8.0) dat duž koncentracionog gradijenta da bi eluisao RGE (Amgen) fuzioni protein. RGE (Amgen) fuzioni protein dobijen anjonskom izmenjivačkom smolom je mešan sa amonijaksulfatom do koncentracije od 1 M, a zatim je prečišćen pomoću hidrofobne interakcione hromatografske kolone (Fenil sepharose FF, GE Healthcare). Specifično, kolona je oprana 50 mM Tris puferisanim rastvorom (pH 8.0) koji sadrži 1 M amonijumsulfat, 50 mM Tris puferisani rastvor (pH 8.0) je dat duž koncentracionog gradijenta, a eluisane frakcije su analizirane 10% Tris-glicin gel elektroforezom. Gel je obojen coomassie brilijantno plavom R uz umereno mućkanje, a frakcije koje sadrže mutantni fuzioni protein FGF21 visoke čistoće su sakupljene a zatim dijalizovane tokom noći na 4°C pomoću konačnog puferisanog rastvora (1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4). Po završetku dijalize, dobijeni proteinski osnovni rastvor je bio koncentrovan na 3,000 obrtaja po minutu upotrebom 30,000 MW odsečenog filtera za centrifugiranje na 4°C. Koncentracija mutantnog fuzionog proteina FGF21 je izmerena BCA kvantitativnom analizom.

Primer pripreme 1-5. Prečišćavanje mutantnih fuzionih proteina FGF21

[0072] Hromatografska kolona sa afinitetom ka proteinu A (GE Healthcare) je ekvilibrisana 1X PBS puferisanim rastvorom (pH 7.4). Kultivisani supernatant uključujući svaki mutantni fuzioni protein FGF21 dobijen u primeru pripreme 1-3 je filtriran 0.2 µm filterom, a zatim je napunjen u hromatografsku kolonu sa afinitetom ka proteinu A. Kolona je oprana 1X PBS puferisanim rastvorom (pH 7.4) a zatim su proteini eluisani upotrebom 100 mM glicinom puferisanim rastvorom (pH 3.0). Fuzioni proteini dobijeni hromatografijom afiniteta su prečišćeni upotrebom kolone anjonsko izmenjivačke smole (POROS® HQ 50 µm, Thermo Fisher Scientific). Kolona anjonsko izmenjivačke smole je ekvilibrisana 50 mM Tris puferisanim rastvorom (pH 8.0), pre nego što su mutantni fuzioni proteini FGF21 eluisani iz kolone. Specifično, nakon pranja kolone 50 mM Tris puferisanim rastvorom (pH 8.0), 50 mM Tris puferisani rastvor (pH 8.0) je razmeren duž koncentracionog gradijenta i eluisane frakcije su analizirane. Svaka eluisana frakcija je analizirana pomoću ekskluzione hromatografije (SEC-HPLC), i sakupljene su frakcije koje uključuju FGF21 mutantne fuzione proteine visoke čistoće. Koncentracija i kvantitativna analiza su izvedene prema postupcima opisanim u primeru pripreme 1-4.

Eksperimentalni primer 1. In vitro dejstva fuzionih proteina

Eksperimentalni primer 1-1. Efekat FGF21 mutacija na proteinsku aktivnost

[0073] In vitro dejstva fuzionih proteina DFD4, DFD5, DFD6, DFD6 (E. coli), DFD7, DFD9, DFD13, DFD18, DFD72, DFD73 i DFD74 pripremljenih u primeru pripreme 1 si izmerena.

[0074] Specifično, in vitro FGF21 dejstva fuzionih proteina su procenjena upotrebom HEK293 ćelijske linije (Yuhan Corporation, Korea) koja je modifikovana da prekomerno eksprimira humani β-kloto, zajednički receptor FGF21. radi procene aktivnosti, koncentrati koji sadrže fuzione proteine pripremljeni u primerima pripreme 1-4 i 1-5 su podvrgnuti 3-stukom serijskom razblaženju pri koncentraciji od 3 µM. Nakon kultivisanja u stanju kojem nedostaje serum tokom 5 sati, ćelijska linija koja prekomerno eksprimira humani β-kloto je tretirana razblaženim fuzionim proteinima tokom 20 minuta, a zatim su lizirana dodavanjem pufera citolize (Cisbio/Cat# 64ERKPEG) uz mešanje na 60 obrtaja po minutu na sobnoj temperaturi. Rastvor ćelijskog lizata je mešan sa antitelima (Cisbio/Cat# 64ERKPEG), koja mogu da detektuju ekstracelularnu signalom-regulisanu kinazu (ERK) i fosforilisani ERK, a mešavina je održavana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Fluorescencija je detektovana pomoću fluorometrijskog detektora r (TECAN/GENiosPro). Dejstva fuzionih proteina su izmerena poređenjem njihovih

EC50vrednosti.

[0075] Kako je prikazano na FIG.1A do 1C, potvrđeno je da in vitro dejstva fuzionih proteina pripremljenih uvođenjem mutacionih sekvenci u FGF21 protein divljeg tipa nisu bila inhibirana, a dejstva svakog fuzionog proteina su bila slična jedno drugom. Takođe je potvrđeno da putem DFD6 (E. coli) uzorka eksprimiranog u E. coli i DFD6 uzorka eksprimiranog u životinjskim ćelijama, in vitro dejstva fuzionih proteina pripremljenih uvođenjem mutacije N-glikosilacije u divlji tip proteina FGF21 nisu bila inhibirana.

Eksperimentalni primer 1-2. Dejstvo povezivačke sekvence na proteinsko dejstvo

[0076] In vitro dejstva fuzionih proteina DFD1, DFD3, DFD4 i DFD13 pripremljenih u primeru pripreme 1 su izmerena.

[0077] Specifično, FGF21 dejstva fuzionih proteina su izmerena pomoću koncentrata koji sadrže fuzione proteine pripremljene u primeru pripreme 1-5 u skladu sa postupcima opisanim u eksperimentalnom primeru 1-1. Rezultati su prikazani u FIG.2A i 2B.

[0078] Potvrđeno je da nijedan FGF21 mutantni fuzioni protein nije pokazao značajno smanjenje u dejstvu, iako se pokazala blaga razlika u dejstvu u zavisnosti od povezivačke sekvence, kako je prikazano na FIG.2A i 2B.

Eksperimentalni primer 1-3. Eksperimentalni rezultati za DFD1, RGE (Amgen) i Fc-FGF21 (Lilly)

[0079] In vitro dejstva fuzionog proteina DFD1 pripremljenog u primeru pripreme 1 i kontrolni proteini RGE (Amgen) i Fc-FGF21 (Lilly) su izmereni.

[0080] Specifično, FGF21 dejstva fuzionih proteina su izmerena upotrebom koncentrata koji sadrže fuzione proteine pripremljene u primeru pripreme 1-5 i kontrolne proteine u skladu sa postupcima opisanim u eksperimentalnom primeru 1-1. Rezultati su prikazani na FIG.3.

[0081] Potvrđeno je da su DFD1 i RGE (Amgen) imali slično in vitro dejstvo, dok je Fc-FGF21 (Lilly) imao in vitro dejstvo dva minuta veće od drugih proteina prikazanih na FIG.3.

Eksperimentalni primer 2. Procena stabilnosti fuzionih proteina

Eksperimentalni primer 2-1. Eksperimentalni postupak za procenu stabilnosti

[0082] Da bi se izmerio kvantitet proteinskih agregata u početnoj fazi pripreme uzorka, agregati veće molekulske mase (%HMW) su kvantifikovani upotrebom postupka hromatografije isključenja veličine (SEC-HPLC). Rezultati su prikazani na FIG.4.

[0083] Specifično, TosoHaas model TSK-GEL G3000SWXLkolona je korišćena za SEC-HPLC postupak. Kolona je ekvilibrisana proticanjem puferisanog rastvora (1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4) pri brzini protoka od 1 mL/min. Osnovni rastvori proteina DFD4 i DFD13 pripremljeni u primerima pripreme 1-5 su koncentrovani do ciljne koncentracije od 20 mg/mL ili više na 3,000 obrtaja po minutu upotrebom 30,000 MW odsečenog filtera za centrifugiranje na 4°C. Nakon merenja koncentracije svakog uzorka BCA kvantitaivnom analizom, uzorci su razblaženi puferisanim rastvorom (1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4) do konačne koncentracije od 20 mg/mL. Da bi se izmerio početni %HMW od DFD4 i DFD13, 20 mg/mL uzorci su razblaženi puferisanim rastvorom (1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4) do konačne koncentracije od 1 mg/mL, i svaki uzorak zapremine od 100 µℓ je analiziran SEC-HPLC kolonom.

[0084] Za procenu stabilnosti svakog uzorka, %HMW uzoraka je izmeren upotrebom SEC-HPLC postupka 4., 8., i 14. dana tokom njihovog čuvanja na 5°C, 25°C i 37°C tokom dve nedelje.

[0085] Kako je prikazano na FIG.4, potvrđeno je da je DFD13 imao niži kvantitet agregata velike molekulske mase (HMW %) u početnoj fazi i do 2 nedelje u poređenju sa DFD4, što ukazuje da uvođenje EIRP mutacija poboljšava stabilnost FGF21 mutantnog fuzionog proteina, čime se značajno smanjuje HMW %.

Eksperimentalni primer 2-2. Rezultati stabilnosti

[0086] Da bi se istražili efekti EIRP mutacije uvedene u originalnu sekvencu LLLE (98-101) od FGF21 na stabilnost, stabilnost DFD4 (SEQ ID NO: 29) i DFD13 (SEQ ID NO: 35) je izmerena u skladu sa postupcima opisanim u eksperimentalnom primeru 2-1. Rezultati analize za uzorak od nula sati (početna faza; dan 0) i 4-, 8-, i uzorci čuvani 14 dana DFD4 i DFD13 su prikazani u tabeli 4 u nastavku (u tabeli 4, N.D. znači "nije detektovano").

[Tabela 4]

[0087] Kako je prikazano u tabeli 4, kvantitet %HMW u početnoj fazi (dan 0) je bio 0.91% za DFD4, i 0.56% za DFD13. Nakon 2 nedelje, količina %HMW se povećala do 8.83% za DFD4, ali nije primećena kod DFD13, u uslovima čuvanja na 25°C. DFD13 je pokazao da ima nižu %HMW brzinu u početnoj fazi i 2 nedelje, u poređenju sa DFD4, što ukazuje na to da je brzina %HMW od mutantnog fuzionog proteina FGF21 značajno smanjena usled uvođenja EIRP mutacije.

Eksperimentalni primer 3. Farmakokinetička ocena fuzionih proteina

Eksperimentalni primer 3-1. Eksperimentalni postupak za farmakokinetičku ocenu

[0088] Mužjaci miševa stari šest nedelja nabavljeni od Orient BIO (Korea) su podeljeni u grupe (n = 3/vreme uzorkovanje krvi) kako bi imali slične srednje vrednosti za telesnu masu jedan dan pre tretiranja lekom, i supkutano im je dat jednom uzorak od 1 mg/kg (2 mg/kg za RGE). Uzorci krvi su zatim uzeti 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, i 96 sati nakon ubrizgavanja, tim redom. Koncentracija intaktnog FGF21 proteina pune dužine u krvi je izmerena upotrebom intaktnog humanog kompleta FGF21 ELISA (F1231-K01, Eagle Biosciences, USA), koji ima imunoreaktivnost sa N-terminusom i C-terminusom FGF21 proteina.

Koncentracije uzoraka iz krvi sakupljene do 96 sati nakon supkutanog ubrizgavanja svakog fuzionog proteina u miševe, su izmerene, i farmakokinetički parametri svakog uzorka su izračunati.

Eksperimentalni primer 3-2. Ocena farmakokinetičkog dejstva

[0089] Na osnovu grafikona koji pokazuje koncentracije svakog proteina u krvi nasuprot vremena nakon supkutanog davanja fuzionih proteina kod miševa (FIG.5), izračunati su farmakokinetički parametri. Podaci su prikazani u tabeli 5 u nastavku.

[Tabela 5]

[0090] Farmakokinetički profil svakog fuzionog proteina je upoređen i procenjen na osnovu vrednosti oblasti ispod krive (AUC) što ukazuje na stepen izloženosti leku.

[0091] Kako je prikazano u tabeli 5, po poređenju DFD4 sa DFD13, i DFD6 sa DFD73, određeno je da je uvođenje EIRP sekvence dovelo do približnog povećanja od 10 do 20% u AUC vrednosti. Poređenjem DFD9 sa DFD4, uvođenje TGLEAV je dovelo do približno 6-strukog povećanja kod AUC vrednosti.

[0092] Dalje, mutacije GLEAN, G170N i G174N su dizajnirane da produže poluvreme eliminacije uvođenjem N-glikosilacije u C-terminus FGF21, za koju se zna da je proteolizovana in vivo. Povećanje kod AUC usled uvođenja N-glikosilacije je potvrđeno poređenjem mutanata sa svakim kontrolnim materijalom. Da bi se potvrdio efekat poboljšanja kod AUC usled uvođenja N-glikosilacije, AUC vrednost za DFD6 (E. coli) proizvedena od strane E. Coli koja nema glikosilaciju je upoređena sa onom kod DFD6 proizvedenom od strane humane ćelijske linije. DFD6 proizveden od strane humane ćelijske linije je pokazao 3-struko ili veće povećanje AUC vrednosti u poređenju sa DFD6 (E. coli) koji proizvodi E. coli, što je pokazalo poboljšanje farmakokinetičkog profila usled glikosilacije.

[0093] A180E je mutacija otkrivena u WO 2009/149171 u vlasništvu Amgen Inc. Kada je ta mutacija A180E dalje uvedena u mutantni DFD13 ili DFD73 uključujući mutaciju TGLEAV ili G170N, redom, dobijeni mutantni DFD18 ili DFD74, redom, su pokazali približno 2- do 3-struko dodatno povećanje AUC vrednosti.

[0094] Ukratko, potvrđeno je da su farmakokinetički parametri poboljšani uvođenjem različitih mutacija i njihovih kombinacija, u poređenju sa DFD9, FGF21 fuzionim proteinom divljeg tipa. Fuzioni protein koji pokazuje najviše poboljšanu AUC vrednost je bio DFD74 koji sadrži mutacije EIRP, G170N i A180E, koje su pokazale približno 45-struko poboljšanje AUC vrednosti u poređenju sa DFD9. Dalje, uzimajući u obzir RGE (Amgen) u dozi od 2 mg/kg telesne mase, DFD74 može da ima veći stepen izloženosti leku u poređenju sa RGE. Sveukupna dejstva poboljšanja u farmakokinetici zbog mutacija su prikazana u tabeli 6 u nastavku.

[Tabela 6]

Eksperimentalni primer 4. Procena aktivnosti fuzionih proteina kod ob/ob miševa Eksperimentalni primer 4-1. Eksperimentalni postupak za procenu dejstva kod ob/ob miševa [0095] Ob/ob miševi, koje karakteriše ispoljavanje hiperglikemije, insulinske rezistentnosti, hiperfagije, masne jetre i gojaznosti usled genetskog nedostatka leptina, su u širokoj upotrebi za ispitivanja dijabetesa tipa 2. Mužjaci ob/ob miševa (Harlan, USA) su nabavljeni od Raonbio (Korea). Ovi miševi su bili stari 5 do 6 nedelja u vreme njihovog dolaska, i 8 do 9 nedelja stari u vreme njihovog tretiranja lekom nakon 3 nedelje adaptacije. Miševi su podeljeni u grupe (n=8/grupa) kako bi imali slične srednje vrednosti za telesnu masu i nivoe glukoze u krvi jedan dan pre tretiranja lekom (dan 0), i uzorci su supkutano davani jednom u skladu sa njihovim odgovarajućim dozama. Dulbekov fosfatom puferisan slani rastvor (DPBS, Gibco, USA) je davan kao tretiranje nosiocem, i koncentracija glukoze u krvi je izmerena pomoću merača za glukozu, GlucoDr (All Medicus, Korea). Nivoi glukoze tamo gde nije bilo izgladnjivanja i telesne mase su mereni svakog dana do 14. dana nakon davanja. Glikolizovani nivoi hemoglobina su takođe mereni u svakoj grupi pre davanja i nakon ispitivanja. Nivoi glkovanog hemoglobina su izračunati pomoću kompleta DCA 2000 HbAlc (Siemens, 5035C).

Eksperimentalni primer 4-2. Procena dejstva kod ob/ob miševa

[0096] Promene u nivoima glukoze u krvi kod izgladnjivanja i telesne mase kod mužjaka ob/ob miševa su primećene nakon pojedinačne supkutane injekcije od 30 ili 100 nmol/kg DFD18 i DFD72, ili 10, 30 ili 100 nmol/kg DFD74.

[0097] Potvrđeno je da su DFD18, DFD72 i DFD74 svi imali efekat snižavanja nivoa glukoze u krvi na dozno zavistan način. Poređenjem ova tri sredstva pri visokoj dozi od 100 nmol/kg, DFD72 i DFD74 su pokazali poboljšan efekat na snižavanje nivoa glukoze u krvi u odnosu na DFD18 (FIG.6). Pored toga, Fc-FGF21 (Lilly) koji je korišćen kao kontrolni materijal u ispitivanju, je bio manje efektivan u snižavanju nivoa glukoze u krvi u poređenju sa DFD18, DFD72 i DFD74 na istom doznom nivou (30 nmol/kg).

[0098] Što se tiče efekta na smanjenje telesne mase, poređenjem ova tri sredstva pri visokoj dozi od 100 nmol/kg, DFD72 je bio najefektivniji kod ob/ob miševa što je dovelo do približnog smanjenja telesne mase od 6%, a DFD18 je bio sledeći najefektivniji, nakon čega je usledio DFD74 (FIG.7).

[0099] Nakon završetka ispitivanja, nivoi glikolizovanog hemoglobina koji su pokazatelji srednjih vrednosti glukoze u krvi su izmereni a promene u srednjoj vrednosti glukoze u krvi su analizirane u svakoj ispitivanoj grupi. Sve ciljane grupe izuzev kontrolne grupe tretirane kontrolnim proteinom Fc-FGF21 (Lilly) su pokazale negativne vrednosti u razlikama između pre davanja i nakon ispitivanja, što je potvrdilo efektivnost ispitivanih proteina u poređenju sa kontrolnim materijalom kod snižavanja glukoze u krvi (FIG.8).

Eksperimentalni primer 5. Procena dejstva fuzionih proteina kod HFD/STZ miševa Eksperimentalni primer 5-1. Eksperimentalni postupak za procenu dejstva kod HFD/ STZ miševa [0100] Efekti FGF21 mutantnih fuzionih proteina na snižavanje glukoze u krvi i telesne mase su upoređeni i procenjeni u drugom dijabetskom modelu, HFD/STZ modelu miša. Konvencionalni modeli miševa čija je gojaznost izazvana ishranom (izazvana davanjem 60 kcal% visokomasne ishrane C57BL/6 miševima tokom osam nedelja ili duže) je imalo slabe hiperglikemijske i dijabetske karakteristike, iako je izazvalo insulinsku rezistentnost. HFD/STZ miševi, koji mogu da nadoknade defekte konvencionalnih modela miševa čija je gojaznost izazvana ishranom, su sposobni da proizvode disfunkcionalne β ćelije u pankreasu i smanjeno izlučivanje insulina kao rezultat visokomasne ishrane (HFD) i davanja streptozotocina niskog nivoa (STZ), i stoga su korisni u farmakološkim ispitivanjima dijabetesa tipa 2.

[0101] Specifično, da bi se izazvao HFD/STZ model miša, C57BL/6 miševi (Japan SLC) su bili na 60 kcal% visokomasnoj ishrani tokom četiri nedelje, a zatim im je davano 50 mg/kg STZ (Sigma, 85882) intraperitonealno svaki dan tokom 3 dana da bi se izazvala disfunkcija u β ćelijama pankreasa. Nakon visokomasne ishrane tokom dodatne 2 nedelje, miševi sa nivoima glukoze u krvi bez izgladnjivanja od 200 mg/dL ili više su korišćeni za ispitivanje. Miševi su podeljeni u grupe (n=6/grupa) da bi se imale slične srednje vrednosti telesne mase i kaudalni nivoi glukoze u krvi jedan dan pre tretiranja lekom (dan 0), i uzorci su supkutano davani jednom u skladu sa svakom od njihovih odgovarajućih doza. Dulbekov fosfatom puferisani slani rastvor (DPBS, Gibco, USA) je davan kao tretiranje nosiocem, a koncentracija glukoze u krvi je izmerena upotrebom merača glukoze, GlucoDr (All Medicus, Korea). Nivoi glukoze i telesne mase prilikom neizgladnjivanja su mereni svaki dan do 14.dana nakon davanja. Nivoi glikolizovanog hemoglobina su takođe mereni u svakoj grupi pre davanja i nakon ispitivanja. Nivoi glikolizovanog hemoglobina su izračunati pomoću kompleta DCA 2000 HbAlc (Siemens, 5035C).

Eksperimentalni primer 5-2. Procena dejstva kod HFD/STZ miševa

[0102] Promene u nivoima glukoze u krvi i telesnim masama prilikom neizgladnjivanja kod mužjaka miševa HFD/STZ tokom vremena su primećene nakon pojedinačne supkutane injekcije od 10 nmol/kg od DFD72 ili DFD74.

[0103] Gledajući promene kod nivoa glukoze u krvi prilikom neizgladnjivanja, potvrđeno je da su DFD72 i DFD74 imali slične efekte na snižavanje nivoa glukoze u krvi, i efekat snižavanja glukoze u krvi je održavan do 10.dana nakon davanja a zatim je izgubljen sa metabolizmom lekova nakon 10. dana (FIG.

9). DFD72 je pokazao produženiji efekat od DFD74 u smislu promena nivoa glukoze u krvi prilikom neizgladnjivanja nakon 10. dana nakon davanja.

[0104] Što se tiče smanjenja telesne mase usled davanja mutantnih proteina FGF21, potvrđeno je da su i DFD72 i DFD74 imali slične efekte na smanjenje telesne mase za približno 5%, i efekat je nestao nakon 10.dana nakon davanja (FIG.10).

[0105] Nakon završetka ispitivanja, nivoi glikolizovanog hemoglobina koji su pokazatelj srednje vrednosti glukoze u krvi su izmereni i promene srednje vrednosti glukoze u krvi su analizirane u svakoj ispitivanoj grupi. Dok je grupa koja je primala nosioca imala povećanje od 0.25 u nivoima glikolizovanog hemoglobina, grupa koja je tretirana sa DFD74 je imala povećanje od 0.1 a grupa tretirana sa DFD72 je imala smanjenje od 0.27 (FIG.11).

Eksperimentalni primer 6. Dejstvo fuzionih proteina kod miševa čija je gojaznost izazvana ishranom Eksperimentalni primer 6-1. Eksperimentalni postupak za procenu dejstva kod miševa čija je gojaznost izazvana ishranom

[0106] Efekat smanjenja telesne mase DFD18, mutantnog fuzionog proteina FGF21, je procenjen kod miševa čija je gojaznost izazvana ishranom. Za model gojaznosti izazvan ishranom, C57BL/6J miševi su nabavljeni od Central Lab. Animal Inc. i bili su na visokomasnoj ishrani koja sadrži 60 kcal % masti (Research diet) tokom 8 do 12 nedelja. Miševi su podeljeni u grupe (n=8/grupa) kako bi imali slične srednje vrednosti telesne mase jedan dan pre lečenja lekom (dan 0), a zatim je 30 nmol/kg uzoraka supkutano dato miševima. Promene u telesnim masama su upoređene sa grupom koja je tretirana nosiocem (PBS).

Eksperimentalni primer 6-2. Proteinska aktivnost kod miševa čija je gojaznost izazvana ishranom [0107] Za promene u telesnoj masi tokom vremena kod modela miša čija je gojaznost izazvana ishranom nakon jednog davanja od 30 nmol/kg DFD18, potvrđeno je da se efekat smanjenja mase nastavio do 10. dana nakon davanja, a maksimalno smanjenje mase (oko 18%) je bilo 11. dana nakon davanja, što je održavano do 14. dana (FIG.12).

Eksperimentalni primer 7. Predviđanje i procena imunogenosti

Eksperimentalni primer 7-1. Postupak za predviđanje imunogenosti i rezultati

[0108] Da bi se predvidela potencijalna imunogenost mutantnih fuzionih proteina FGF21, za svaki protein je izvedena in silico analiza imunogenosti.

[0109] Specifično, potencijalna imunogenost proteina je brzo detaljno pregledana upotrebom iTope™ i TCED™ postupaka (predviđanje imunogenosti terapeutskih proteina: validnost računarskih alata, BioDrugs, 2010). U smislu ta dva postupka, epitop T-ćelija može tačnije da se predvidi u poređenju sa in silico analitičkim postupkom koji zavisi samo od MHC analize II klase vezivanja.

Eksperimentalni primer 7-2. Ex vivo postupak procene za imunogenost i rezultati

[0110] Da bi se procenila potencijalna imunogenost mutantnih fuzionih proteina FGF21, izvedena je EpiScreen™ analiza (povećana biodistribucija i hemijska stabilnost u mozgu i smanjena imunogenost konstruisane varijante GDNF, Exp Neurol, 2015). Kada je imunogenost detektovana, aminokiselinske sekvence uključujući imunogenost mogu biti definisane putem mapiranja epitopa T-ćelija, a deimunizovani mutanti sa minimalnom imunogenošću mogu biti dizajnirani i pripremljeni putem in silico predviđanja u cilju ponovne procene imunogenosti.

[0111]

Claims (15)

1. Patentni zahtevi 1. Fuzioni protein koji obuhvata mutantni protein faktora rasta fibroblasta 21 (FGF21) i Fc region imunoglobulina, pri čemu mutantni protein FGF21 obuhvata sledeću mutaciju: (1) supstitucija aminokiselina na položajima 98 do 101 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinskom sekvencom EIRP (SEQ ID NO: 42).
2. 2. Fuzioni protein prema zahtevu 1, pri čemu mutantni protein FGF21 dalje obuhvata sledeću mutaciju: (6) supstitucija aminokiseline na položaju 180 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinom E.
3. 3. Fuzioni protein prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, pri čemu mutantni protein FGF21 dalje obuhvata najmanje jednu mutaciju izabranu iz grupe koju čine sledeće mutacije: (2) supstitucija aminokiselina na položajima 170 do 174 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinskom sekvencom TGLEAV (SEQ ID NO: 43); (3) supstitucija aminokiselina na položajima 170 do 174 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinskom sekvencom TGLEAN (SEQ ID NO: 44); (4) supstitucija aminokiseline na položaju 170 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinom N; i (5) supstitucija aminokiseline na položaju 174 od N-terminusa proteina FGF21 divljeg tipa aminokiselinom N.
4. 4. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je aminokiselinski ostatak N mutantnog proteina FGF21 uveden mutacijom glikozilovan.
5. 5. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu protein FGF21 divljeg tipa ima aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 1.
6. 6. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1, 4, i 5, pri čemu mutantni protein FGF21 ima aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja bilo koja od SEQ ID NO: 6, 11 do 15, i 20 do 23.
7. 7. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu je mutantni protein FGF21 povezan sa Fc regionom imunoglobulina preko veznika.
8. 8. Fuzioni protein prema zahtevu 7, pri čemu je veznik povezan sa C-terminusom Fc regiona imunoglobulina i N-terminusom mutantnog proteina FGF21, poželjno pri čemu taj veznik predstavlja peptid koji se sastoji od 10 do 30 aminokiselinskih ostataka, dalje poželjno pri čemu taj veznik ima aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja bilo koja od SEQ ID NO: 2 do 5.
9. 9. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu Fc region imunoglobulina predstavlja jedan od Fc regiona IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 i IgD, ili hibridni Fc koji sadrži njihovu kombinaciju.
10. 10. Fuzioni protein prema zahtevu 9, pri čemu hibridni Fc obuhvata IgG4 region i IgD region.
11. 11. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 10, pri čemu fuzioni protein ima aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 ili SEQ ID NO: 39.
12. 12. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 11 za lečenje dijabetesa, gojaznosti, dislipidemije, metaboličkog sindroma, bolesti nealkoholne masne jetre ili nealkoholnog steatohepatitisa.
13. 13. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 11.
14. 14. Ekspresioni vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 13.
15. 15. Ćelija domaćina koja obuhvata ekspresioni vektor prema zahtevu 14.