RS60805B1 - Soli i čvrsti oblici monobaktamskog antibiotika - Google Patents

Description

Opis

OBLAST OVOG PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na soli i kristalne oblike 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi)ciklopropankarboksilne kiseline koji su pogodni za komercijalnu proizvodnju, kao i farmaceutske kompozicije koje sadrže ove materijale, njihovu upotrebu u terapiji, i postupak pripreme hidriranog čvrstog oblika.

POZADINA

[0002] Tokom proteklih nekoliko decenija, učestalost antimikrobiološke rezistentnosti i njene povezanosti sa ozbiljnim infektivnim bolestima je alarmantno porasla. Rastuća prevalenca rezistentnosti među nozokomijalnim patogenima je naročito zbunjujuća. Od preko 2 miliona nozokomijalnih (u bolnici stečenih) infekcija koje se javljaju svake godine u Sjedinjenim Državama, 50 do 60% su uzrokovane antimikrobiološki-rezistentnim sojevima bakterije. Visok nivo rezistentnosti na uobičajeno korišćena antibakterijska sredstva povećava morbiditet, mortalitet, i troškove povezane sa nozokomijalnim infekcijama. U Sjedinjenim državama, smatra se da nozokomijalne infekcije doprinose ili uzrokuju više od 77,000 smrti godišnje i trošak od približno $5 do $10 milijardi godišnje.

[0003] Važni razlozi gram-negativne rezistentnosti uključuju β-laktamaze produženih spektara (ESBL), serinske karbapenemaze (KPC) i metalo-β-laktamaze (na primer NDM-1) kod Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, i Proteus mirabilis, rezistentnost β-laktamaze cefalosporina treće generacije visokog stepena (AmpC) među Enterobacter vrstama i Citrobacter freundii, i gene rezistentnosti na više lekova primećene kod Pseudomonas, Acinetobacter, i Stenotrophomonas. Problem antibakterijske rezistentnosti je usložnjen postojanjem bakterijskih sojeva rezistentnih na višestruke antibakterijske agense. Na primer, Klebsiella pneumonia harboring NDM-1 metalo-β-laktamaza često nosi dodatne serinske β-laktamaze na istom plazmidu koji nosi NDM-1.

[0004] Samim tim postoji potreba za novim antibakterijskim agensima, određenije antibakterijskim jedinjenjima koja su efektivna protiv postojećih mikroba rezistentnih na lekove, ili su manje osetljiva na razvoj nove bakterijske rezistentnosti. Ovaj pronalazak obezbeđuje čvrste oblike takvih jedinjenja koja su naročito dobro pogodna za komercijalnu proizvodnju zahvaljujući njihovim osobinama rukovanja u odgovarajućim uslovima rada proizvodnje.

[0005] Neobjavljena patentna prijava broj PCT/US2015/022011 opisuje određene monobaktamske antibiotike. Jedno jedinjenje u toj prijavi koje pokazuje jako dejstvo protiv gram-negativnih bakterija, uključujući sojeve koji pokazuju rezistentnost na druge monobaktamike, je 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi)ciklopropankarboksilna kiselina, koja je ovde u daljem tekstu označena kao jedinjenje X:

[0006] Za proizvodnju farmaceutskih jedinjenja i njihovih formulacija, važno je da aktivno jedinjenje bude u obliku kojim može pogodno da se rukuje i koji može da se obrađuje kako bi se dobio komercijalno održiv, pouzdan, i reproduktivan proizvodni postupak. Jedinjenje X i mnoge od njegovih soli su u čvrstom stanju na sobnoj temperaturi, i mogu da se proizvedu u različitim čvrstim oblicima, u zavisnosti od uslova koji se koriste da proizvedu, prečiste i kristališu materijal. Postojanje višestrukih čvrstih oblika, koji su često označeni kao polimorfi, je dobro poznato za čvrsta farmaceutska jedinjenja, i hemijska i fizička stabilnost kao i svojstva rukovanja takvih jedinjenja često zavise od toga koji se čvrsti oblik upotrebljava. S tim u vezi, izbor određenog čvrstog oblika aktivne supstance leka (npr., oblik soli, hidriran ili solvatisan oblik, ili polimorfni oblik) je često veoma važan u kreiranju pouzdanog i reproduktivnog proizvodnog postupka, i u čuvanju, rukovanju i distribuciji bezbednog i efektivnog oblika aktivnog sastojka.

[0007] Generalno je utvrđeno da postoje prednosti u proizvodnji određenog oblika u čvrstom stanju farmaceutskog sastojka, i ona su opisana u "Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection and Use", P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (Eds.) (Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich). Postupci proizvodnje oblika u čvrstom stanju su takođe opisani u "Practical Process Research

and Development", Neal G. Anderson (Academic Press, San Diego) i "Polymorphism: In the Pharmaceutical Industry", Rolf Hilfiker (Ed) (Wiley VCH).

[0008] Pronalazači ovog pronalaska su otkrili određene soli i polimorfne oblike jedinjenja X koji su naročito pogodni za upotrebu u proizvodnji, čuvanju ili davanju jedinjenja X kako je ovde opisano.

[0009] Važno je da lek bude dovoljno stabilan da bi se izbegla značajna razgradnja prilikom njegovog otpremanja i čuvanja u komercijalno praktičnim uslovima. Pronalazači su otkrili da se jedinjenje X u rastvoru poželjno upotrebljava i čuva na pH između 4 i 6, poželjno između 4.0 i 5.5, zbog maksimalne stabilnosti u prisustvu vlage. Optimalna stabilnost rastvora se postiže pri pH od oko 4.0 do 5.5. S tim u vezi, pronalazak otkriva farmaceutske kompozicije koja obuhvataju jedinjenje X pri pH između 4 i 6, poželjno između 4.0 i 5.5, i poželjnije pri pH od oko 5±0.5 ili pri pH od 5±0.2. Pogodne kompozicije obuhvataju jedinjenje X u vodenom rastvoru, kao što je dekstroza ili slani rastvor, koji može da bude izotoničan, i koji može da sadrži druge supstance kao što su stabilizatori, antioksidansi, puferi ili modifikatori pH, nutrijenti, i njima slični. U nekim od ovih načina ostvarivanja, željena pH je postignuta kombinovanjem jedinjenja X i pH modifikatora pogodnog za postizanje željene pH u vodenom rastvoru. Pogodni pH modifikatori uključuju natrijumhidroksid, natrijumkarbonat, natrijumbikarbonat, kalijumkarbonat, kalijumhidroksid, amine kao što su TRIS (tris(hidroksimetil)aminometan), i aminokiseline kao što su arginin, lizin, histidin, i njima slične. Poznati monobaktamici, uključujući aztreonam, su formulisani sa argininom.

[0010] Odgovarajuća pH može da se postigne dodavanjem pH modifikatora vodenom rastvoru jedinjenja X, ili dodavanjem jedinjenja X vodenom rastvoru koji sadrži pH modifikator. Odgovarajuće količine pH modifikatora i jedinjenja X stručnjak može brzo da odredi. Pogodni pH modifikatori uključuju natrijumhidroksid i arginin. Stoga rastvor ili suspenzija jedinjenja X mogu biti tretirani natrijumhidroksidom, ili argininom, da bi se proizveo rastvor koji obuhvata natrijumovu so ili so arginina jedinjenja. Štaviše, ovaj rastvor može da bude liofilizovan kako bi se uklonila voda i bilo koji od prisutnih zajedničkih rastvarača, čime se ostavlja liofilizovan čvrst oblik koji obuhvata

[0011] Jedinjenje X zajedno sa pH modifikatorom, ili solju formiranom jedinjenjem X i pH modifikatorom, npr., natrijumovom solju ili solju arginina jedinjenja X.

[0012] Dalje, u skladu sa ovim pronalaskom, obezbeđen je određen broj čvrstih oblika jedinjenja X koji obezbeđuju osobine rukovanja pogodne za industrijsku proizvodnju, zajedno sa postupcima proizvodnje ovih polimorfa.

[0013] Predstavljeni su sledeći nabrojani načini ostvarivanja ovog pronalaska:

1. So (L)-arginina 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline. 2. Liofilizovan čvrst oblik natrijumove soli 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline.

3. Hidriran čvrst oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline.

4. Hidriran čvrst oblik prema načinu ostvarivanja 3, koji se sastoji od 50% ili više materijala trihidrata 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline.

5. Postupak za pripremu hidriranog čvrstog oblika prema načinu ostvarivanja 4, koji obuhvata dovođenje u kontakt 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline sa atmosferom čija je relativna vlažnost između 25% i 50% na temperaturi između 20°C i 30°C.

6. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata jedinjenje prema bilo kom od načina ostvarivanja 1-4 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

7. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 1) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 6.6, 13.4, i 18.8. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 1 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

8. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 2) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.5, 19.3, i 20.0. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 2 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

9. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 3) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.3, 18.9, i 21.2. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 3 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

10. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 4) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.0, 8.6, 19.3 i 20.9. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 4 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

11. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 5) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.3, 9.3, i 27.8. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 5 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

12. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 6) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 8.1, 9.2, i 12.8; i opciono dodatnim pikovima na 21.2 i 24.7. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 6 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

13. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 7) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 6.7, 7.3 i 20.3. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 7 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

14. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi)ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 8) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 6.2, 21.8 i 25.9. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 8 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

15. Jedinjenje prema ovom pronalasku, ili njegov kristalni oblik za upotrebu u terapiji.

16. Terapija predstavlja lečenje infekcije izazvane gram-negativnim bakterijama.

17. Bakterija koja uzrokuje gram-negativne bakterijske infekcije je izabrana iz grupe koju čine Citrobacter, Enterobacter, Eschirichia, Haemophilus, Klebsiella, Morganella, Moraxella, Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, i Neisseria bacteria.

[0014] Takođe je otkriven kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 9) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 6.3, 12.6, i 22.3; i opciono jednim ili više dodatnih pikova izabranih iz grupe koju čine 22.1, 23.1, 27.0 i 27.5. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 9 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

[0015] Takođe je otkriven kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 10) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 6.6, 11.0, i 16.5; i opciono jednim ili više dodatnih pikova izabranih od 22.2 i 23.4. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 10 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

[0016] Takođe je otkriven kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 11) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.4, 9.7, i 29.3; i opciono jednim ili više dodatnih pikova izabranih od pikova na 17.0,19.5, 22.2, 26.3 i 28.1. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 11 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

[0017] Takođe je otkriven kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 12) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 19.0, 20.4, i 24.0; i opciono jednim ili više dodatnih pikova izabranih od pikova na 7.3, 24.7, i 27.2. U nekim načinima ostvarivanja, oblik 12 ima dodatne XRPD pikove kako je opisano u nastavku.

[0018] Ovde je otkrivena farmaceutska kompozicija koja obuhvata 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi)ciklopropankarboksilnu kiselinu i arginin.

[0019] Farmaceutska kompozicija dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač, koji je vodeni.

[0020] Farmaceutska kompozicija je na pH od oko 5.0.

[0021] Farmaceutska kompozicija dalje obuhvata najmanje jedan ekscipijens izabran iz grupe koju čine saharoza, fruktoza, trehaloza, manitol, i laktoza.

[0022] Takođe je otkrivena upotreba jedinjenja, ili njegovog kristalnog oblika, u proizvodnji leka za lečenje gram-negativne bakterijske infekcije, pri čemu bakterija koja uzrokuje gram-negativnu bakterijsku infekciju predstavlja vrstu odabranu iz grupe koju čine Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Haemophilus, Klebsiella, Morganella, Moraxella, Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, i Neisseria bakterije.

[0023] Stoga, u jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kristalni oblik jedinjenja X (Oblik 1) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 6.6, 13.4, i 18.8. U jednom načinu ostvarivanja, oblik 1 ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha : 6.6, 13.4, 16.6, 17.9, 18.8, 20.3, 25.1, i 28.9. U drugom načinu ostvarivanja, oblik 1 ispoljava najmanje karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha prikazane na listi 1, ili bilo koji podskup od najmanje pet pikova izabranih sa liste 1. Opet u drugom načinu ostvarivanja, oblik 1 ispoljava difraktogram X-zraka praha suštinski isti kao što je prikazano na Fig.1.

[0024] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kristalni oblik jedinjenja X (oblik 2) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.5, 19.3 i 20.0. U jednom načinu ostvarivanja, oblik 2 ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha : 6.7, 7.5, 13.3, 13.7, 15.3, 17.9, 18.7, 19.3 i 20.0. U drugom načinu ostvarivanja, oblik 2 ispoljava najmanje karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha prikazane na listi 2, ili bilo koji podskup od najmanje pet pikova izabranih sa liste 2. Opet u drugom načinu ostvarivanja, oblik 2 ispoljava difraktogram X-zraka praha suštinski isti kao onaj prikazan na Fig.2.

[0025] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kristalni oblik jedinjenja X (oblik 3) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.3, 18.9, i 21.2; i opciono dalje uključujući pik na 8.3. U jednom načinu ostvarivanja, oblik 3 ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha : 7.3, 13.9, 16.7, 18.9, 20.3, 21.2, i 24.6. U drugom načinu ostvarivanja, oblik 3 ispoljava najmanje karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha prikazane na listi 3, ili bilo koji podskup od najmanje pet pikova odabranih sa liste 3. Opet u drugom načinu ostvarivanja, oblik 3 ispoljava difraktogram X-zraka praha suštinski isti kao onaj prikazan na Fig.4.

[0026] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kristalni oblik jedinjenja X (oblik 4) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.0, 8.6, 19.3 i 20.9. U jednom načinu ostvarivanja, oblik 4 ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha : 7.0, 8.6, 15.2, 17.0, 18.0, 19.3, 20.9, 24.5, i 26.9. U drugom načinu ostvarivanja, oblik 4 ispoljava najmanje karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha prikazane na listi 4, ili bilo koji podskup od najmanje pet pikova odabranih sa liste 4. Opet u drugom načinu ostvarivanja, oblik 4 ispoljava difraktogram X-zraka praha suštinski isti kao onaj prikazan na Fig.5.

[0027] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kristalni oblik jedinjenja X (oblik 5) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.3, 9.3, i 27.8; i opciono dalje uključujući pik na 19.9. U jednom načinu ostvarivanja, oblik 5 ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha : 7.3, 9.3, 16.3, 18.6, 19.2, 19.9, 21.7, 24.1, 24.9, 27.3, 27.8 i 29.8. U drugom načinu ostvarivanja, oblik 5 ispoljava najmanje karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha prikazane na listi 5, ili bilo koji podskup od najmanje pet pikova odabranih sa liste 5. Opet u drugom načinu ostvarivanja, oblik 5 ispoljava difraktogram X-zraka praha suštinski isti kao onaj prikazan na Fig.6.

[0028] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kristalni oblik jedinjenja X (oblik 6) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 8.1, 9.2, 12.8, 21.2, i 24.7. U jednom načinu ostvarivanja, oblik 6 ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha : 8.1, 9.2, 12.8, 13.9, 14.4, 16.7, 20.1, 21.2, 24.7, i 26.6. U drugom načinu ostvarivanja, oblik 6 ispoljava najmanje karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha prikazane na listi 6, ili bilo koji podskup od najmanje pet pikova odabranih sa liste 6. Opet u drugom načinu ostvarivanja, oblik 6 ispoljava difraktogram X-zraka praha suštinski isti kao onaj prikazan na Fig.7.

[0029] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kristalni oblik jedinjenja X (oblik 7) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 6.7, 7.3 i 20.3. U jednom načinu ostvarivanja, oblik 7 ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha : 6.7, 7.3, 17.6, 18.0, 20.3, i 24.9. U drugom načinu ostvarivanja, oblik 7 ispoljava najmanje karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha prikazane na listi 7, ili bilo koji podskup od najmanje pet pikova odabranih sa liste 7. Opet u drugom načinu ostvarivanja, oblik 7 ispoljava difraktogram X-zraka praha suštinski isti kao onaj prikazan na Fig.8.

[0030] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kristalni oblik jedinjenja X (oblik 8) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 6.2, 21.8, i 25.9. U jednom načinu ostvarivanja, oblik 8 ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha : 6.2, 17.8, 20.7, 21.8, i 25.9. U drugom načinu ostvarivanja, oblik 8 ispoljava najmanje karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha prikazane na listi 8, ili bilo koji podskup od najmanje pet pikova odabranih sa liste 8. Opet u drugom načinu ostvarivanja, oblik 8 ispoljava difraktogram X-zraka praha suštinski isti kao onaj prikazan na Fig.9.

[0031] U jednom aspektu ovog pronalaska, polimorfi ovog pronalaska imaju svojstva kristala i poželjno su najmanje 50% kristalni, poželjnije najmanje 60% kristalni, dalje poželjnije najmanje 70% kristalni i najpoželjnije najmanje 80% kristalni. Kristalnost može biti ocenjena konvencionalnim tehnikama difraktometrije X-zraka ili infracrvenim spektroskopskim tehnikama.

[0032] U nekim načinima ostvarivanja, čvrst oblik jedinjenja X obuhvata jedan ili više ovde opisanih oblika. Čvrst oblik jedinjenja X može da uključi dva ili više ovih oblika, tj. može da bude mešavina dva ili više ovih oblika. U nekim načinima ostvarivanja, uzorak čvrstog oblika se uglavnom sastoji od jednog oblika izabranog od oblika 1-8, što znači da je 50% ili više materijala čvrstog oblika. Relativne količine različitih oblika u mešavini mogu da budu određene iz XRPD podataka. Kako je ovde opisano, neki od oblika, mogu da se razviju ili preusmeravaju u pogodnim uslovima, kao što su oblici 4 i 5, koji mogu da se jave kao mešavina, i mogu da se preusmeravaju u zavisnosti od relativne vlažnosti i temperature na kojoj se materijal održava.

[0033] U jednom aspektu ovog pronalaska, polimorfi ovog pronalaska predstavljaju od 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% do 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% kristala.

[0034] U ovoj specifikaciji, pikovi difrakcije X-zraka praha (izraženi u stepenima 2θ) su izmereni pomoću X-zraka bakra sa talasnom dužinom od 1.5406 Å (alfa1) i 1.5444 Å (alfa2). Lokacije pikova su prijavljene u stepenima 2θ i smatra se da su podložne malim numeričkim varijacijama i s tim u vezi se smatra da su uglovi podložni varijaciji od ±0.2°.

[0035] Kristalni oblici ovog pronalaska mogu da postoje ili u solvatisanim ili u nesolvatisanim oblicima. Pojam 'solvat' se koristi da se opiše molekulski kompleks koji obuhvata jedinjenje ovog pronalaska i količinu jednog ili više farmaceutski prihvatljivih rastvarača. Primeri farmaceutski prihvatljivih rastvarača uključuju etanol i vodu. Pojam 'hidrat' je korišćen kada je rastvarač voda. Nekoliko polimorfa jedinjenja X kako je ovde opisano predstavlja hidrate.

[0036] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje so ili kristalni oblik ovde definisan za upotrebu u terapiji. U drugom aspektu, ovaj pronalazak otkriva postupak lečenja terapijom, koja obuhvata davanje subjektu kojem je to potrebno farmaceutski prihvatljive količine soli ili kristalnog oblika.

[0037] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu ovde definisane soli ili kristalnog oblika u proizvodnji leka za upotrebu u terapiji.

[0038] U jednom načinu ostvarivanja, terapija predstavlja lečenje infekcije uzrokovane gram-negativnom bakterijom.

[0039] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupke za pripremu ovde opisanih kristalnih oblika. Stoga, u jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu bilo kog oblika 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, i 8 opisan ovde koji obuhvata kristalizaciju željenog oblika iz rastvora jedinjenja X, upotrebom sistema rastvarača i uslova opisanih u ovde obezbeđenim primerima.

[0040] U kontekstu ovog pronalaska, pozivanja u ovom tekstu na "lečenje" uključuju pozivanja na lekovito, palijativno i profilaktičko lečenje, ukoliko ne postoje specifične indikacije koje ukazuju na suprotno. Pojmovi "terapija, "terapeutski" i "terapeutsko" bi trebalo da se posmatraju na isti način.

[0041] Jedinjenje X se obično daje injekcijom ili infuzijom, i može da se pripremi za davanje rastvaranjem jedinjenja X u odgovarajućoj količini vode ili vodenog rastvora kao što su dekstroza ili slani rastvor, npr., izotonična dekstroza ili slani rastvor. Opciono, formulisana kompozicija takođe može da uključi pH modifikator kao što su natrijumhidroksid, natrijumbikarbonat, natrijumkarbonat, kalijumhidroksid, kalijumkarbonat, kalcijumhidroksid, magnezijumhidroksid, meglumin, TRIS, ili aminokiselinu (npr., lizin, histidin, ili arginin) u količini dovoljnoj da se obezbedi željena pH, kao što je pH između 4 i 6. Dok su aminokiseline upotrebljene u primerima bile (L)-aminokiseline, (D)-aminokiselina ili racemska mešavina bi mogle da budu upotrebljene umesto njih. Farmaceutske kompozicije koje obuhvataju jedinjenje X u rastvoru su obično podešene na pH između 4.5 i 5.5, često ili pri pH od oko 5, kao što je između pH 4.8 i 5.2.

[0042] U nekim načinima ostvarivanja, jedinjenje X je formulisano pH modifikatorom u vodenom rastvoru, i liofilizovano je u čvrst oblik za čuvanje i distribuciju. Radi davanja, liofilizovani lek može da se rekonstituiše dodavanjem vodenog rastvarača, obično sterilnim vodenim nosačem kao što je voda ili izotonična dekstroza ili slani rastvor, ili drugi IV rastvor kao što je Ringerov rastvor, Ringerov rastvor laktata, ili Hartmanov rastor. Shodno tome, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje liofilizat (čvrst oblik pripremljen liofilizacijom) koji obuhvata jedinjenje X i pH modifikator kao što su oni gorenavedeni, npr. (L)-arginin, (L)-lizin, meglumin, TRIS, natrijumhidroksid. Opciono, drugi ekscipijensi kao što je saharoza takođe mogu da budu uključeni. U jednom načinu ostvarivanja, rastvor jedinjenja X i arginina (dva ekvivalenta) je pripremljen, a pH je podešena na pH između 4.8 i 5.2 pomoću, na primer, natrijumhidroksida ili hlorovodonične kiseline po potrebi. Rastvor je zatim liofilizovan u beli do blago žuti čvrsti oblik, koji je stabilan za čuvanje i može lako da se rekonstituiše pogodnim sterilnim vodenim rastvorom za intravensko davanje.

[0043] U drugom načinu ostvarivanja, rastvor jedinjenja X, saharoze, i arginina (dva ekvivalenta) u vodi pogodan za ubrizgavanje je pripremljen, i pH je podešena na pH između 4.8 i 5.2 pomoću, na primer, natrijumhidroksida ili hlorovodonične kiseline po potrebi. Rastvor je zatim liofilizovan u beli do blago žuti čvrsti oblik, koji je stabilan za čuvanje i može lako da se rekonstituiše odgovarajućim vodenim rastvorom za intravensko davanje.

[0044] Soli i kristalni oblici ovog pronalaska mogu da se daju sami ili u kombinaciji sa jednim ili više lekova. Generalno, oni se daju kao formulacija zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Pojam "ekscipijens" je ovde upotrebljen da bi se opisao bilo koji sastojak a da to nije(su) jedinjenje(a) ovog pronalaska koji može da da ili funkcionalnu (tj., kontrolisanje brzine oslobađanja) i/ili nefunkcionalnu (tj., pomoć u obradi ili razblaživač) karakteristiku za formulacije. Izbor ekscipijensa će u velikoj meri zavisiti od faktora kao što su određeni način davanja, efekat ekscipijenasa na rastvorljivost i stabilnost , i priroda doznog oblika. Farmaceutske kompozicije takođe mogu da obuhvataju nosač, koji suštinski predstavlja inertni materijal, često tečnost, koji se upotrebljava za razblaživanje aktivnog sastoj(a)ka. Pogodni nosači su poznati u tehnici, i uključuju sterilnu vodu i sterilne rastvore slanog rastvora ili dekstroze, na primer.

[0045] Farmaceutske kompozicije pogodne za isporuku čvrstih oblika jedinjenja X i postupci za njihovu pripremu će stručnjacima postati lako očigledni. Takve kompozicije i postupci za njihovu pripremu mogu da se nađu, na primer, u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995).

[0046] Za davanje humanim pacijentima, ukupna dnevna doza soli ili kristalnog oblika je obično u opsegu od 1000 mg do 10,000 mg, ili između 2000 mg i 8000 mg, ili između 3000 mg i 8000 mg, ili između 4000 mg i 6000 mg, u zavisnosti od stanja subjekta i parametara kao što su telesna masa, uzrast, i pol subjekta. Ukupna dnevna doza može da se daje kao pojedinačna doza, ili može da bude podeljena na dve ili više doza i može, po nahođenju lekara, da bude i izvan ovde datog uobičajenog opsega. Obično, se dnevna doza isporučuje putem intravenske injekcije ili infuzijom, i daje se u jednoj, dve, tri ili četiri doze, kumulativno obezbeđuju željenu ukupnu dnevnu dozu. Infuzija može biti brza, ili može biti data tokom perioda od između oko 15 minuta i 4 sata, uobičajeno tokom perioda od 1-3 sata. Uobičajeni raspored doziranja obezbeđuje tri ili četiri infuzije dnevno, pri čemu svaka traje 0.25-2 sata ili 0.25-3 sata, pri čemu se isporučuje 1 do 2 ili 1 do 2.5 grama jedinjenja X po dozi, a uobičajena ukupna dnevna doza bi bila 3-8 grama. Na primer, raspored doziranja može da isporuči 2 grama jedinjenja X po infuziji, sa tri jednosatne infuzije po danu. Alternativno, jedna infuzija od 2-6 grama, ili 3-5 grama tokom 1 ili 1.5 ili 2 ili 2.5 ili 3 sata može biti upotrebljena. Gore pomenute doze su bazirane na prosečnom humanom subjektu koji ima masu od oko 60kg do 70kg, i mogu biti izvagane pogodno za druge subjekte. Lekar će lako moći da odredi doze za subjekte čije su mase van opsega, kao što su mala deca i stari.

Kratak opis crteža

[0047] Ovaj pronalazak će sada biti ilustrovan kroz sledeće primere. U tim primerima prikazani su sledeći crteži:

Fig.1: Difraktogram X-zraka praha oblika 1.

Fig.2: Difraktogram X-zraka praha oblika 2.

Fig.3: Difraktogram X-zraka praha oblika 1 nakon mešanja sa acetonom, prekriven XRPD za oblik 1 radi poređenja.

Fig.4: Difraktogram X-zraka praha oblika 3.

Fig.5: Difraktogram X-zraka praha oblika 4.

Fig.6A: Difraktogram X-zraka praha oblika 5 prekriven na XPRD za Fig.4.

Fig.6B: Difraktogram X-zraka praha oblika 5 iz pripreme veće skale.

Fig.7: Difraktogram X-zraka praha oblika 6.

Fig.8: Difraktogram X-zraka praha oblika 7.

Fig.9: Difraktogram X-zraka praha oblika 8.

Fig.10: Difraktogram X-zraka praha oblika 9.

Fig.11: Difraktogram X-zraka praha oblika 10.

Fig.12: Difraktogram X-zraka praha oblika 11.

Fig.13: Difraktogram X-zraka praha oblika 12.

Opšti eksperimentalni podaci

[0048] Svaki uzorak (nekoliko miligrama) je stavljen između tri polimerne folije (Kapton® i / ili polipropilen). Vredno je da se napomene da Kapton® ispoljava širok pik slabog intenziteta oko 2θ = 5.5 °.

[0049] Uzorak je zatim stavljen u PANALYTICAL X'PERT PRO MPD difraktometar konfigurisan u transmisionom režimu rada, i analiziran pomoću uslova naznačenih u nastavku. Analize su preformulisane između 2 ° i 50 ° (ukoliko nije drugačije naznačeno).

[0050] Svi polazni materijali, blokovi za gradnju, reagensi, kiseline, baze, sredstva za dehidrataciju, rastvarači, i kristali korisni za sintezu jedinjenja ovog pronalaska su ili komercijalno dostupni ili mogu biti proizvedeni organskom sintezom postupcima poznatim stručnjaku (Houben-Weyl 4th Ed.1952, METHODS OF ORGANIC SYNTHESIS, Thieme, Volume 21).

Opšti uslovi

[0051] Maseni spektri su stečeni na LC-MS, SFC-MS, ili GC-MS sistemima pomoću elektrospreja, postupaka jonizacije elektronskog uticaja od opsega instrumenata sledećih konfiguracija: Waters ACQUITY UPLC sistem i opremljen sa ZQ 2000 ili SQD MS sistemom gde se (M+1) odnosi na protonisani molekulski jon hemijskih vrsta, (M+) se odnosi na neprotonisani kvaternarni amonijumski katjon, (M+Na) se odnosi na natrijum-inkorporisan jon i (M-1) se odnosi na deprotonisani molekulski jon hemijskih vrsta.

[0052] NMR spektri su pokrenuti na Bruker AVANCE 500MHz ili Varian 400MHz NMR spektrometrima pomoću ICON-NMR, pod TopSpin kontrolnim programom. Spektri su izmereni na 298K, ukoliko nije drugačije naznačeno, i referentni su u odnosu na rezonancu rastvarača.

Instrumenti

MS Postupci: Upotreba Agilent 1100 HPLC sistema sa Agilent 6110 masenim spektrometrom [0053]

Postupak 2m_kiseli:

Kolona Kinetex C1850 x 2.1 mm, 2.6 µm

Temperatura kolone 50 °C

Eluenti A: H2O, B: acetonitril, pri čemu oba sadrže 0.1% TFA

Brzina protoka 1.2 mL/min

Gradijent 2% do 88% B za 1.30 min, 0.15 min 95% B

Postupak 2m_kiseli_polarni:

Kolona Kinetex C1850 x 2.1 mm, 2.6 µm

Temperatura kolone 50 °C

Eluenti A: H2O, B: acetonitril, pri čemu oba sadrže 0.1% TFA

Brzina protoka 1.2 mL/min

Gradijent 1% do 30% B za 1.30 min, 0.15 min 98% B

Priprema jedinjenja X

Intermedijar A: ((2S,3S)-3-(((benziloksi)karbonil)amino)-1-(2,4-dimetoksibenzil)-4-oksoazetidin-2-il)metilmetansulfonat.

[0054]

[0055] Rastvoru benzil ((2S,3S)-1-(2,4-dimetoksibenzil)-2-(hidroksimetil)-4-oksoazetidin-3-il)karbamata (5.37 g, 13.41 mmol) i TEA (3.72 mL, 26.8 mmol) u DCM na 0 °C je dodat metansulfonilhlorid (MsCI) (1.15 mL, 14.75 mmol). Nakon mešanja na 0 °C tokom 1 h, razblažen je vodom/DCM i slojevi su odvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (2x), a kombinovani organski slojevi su oprani slanim rastvorom, osušeni preko Na2SO4i koncentrovani u vakuumu. Neprečišćen ostatak je sakupljen u toluenu i koncentrovan (2x), čime se dobija naslovno jedinjenje u obliku beličaste čvrste materije. Korišćen je kao takav u narednim reakcijama. LCMS: Rt= 0.86 min, m/z = 479.2 (M+1) Postupak 2m_kiseli.

[0056] Polazni materijal za ovu fazu može biti pripremljen upotrebom sledećih pristupa ili neke kombinacije faza baziranih na ovim pristupima. U prvom pristupu, zaštićeni hiralni aldehid je kondenzovan sa 2,4-dimetoksibenzilaminom da bi se napravio hiralni imin.

[0057] Hiralni aldehid je poznat, i može da bude pripremljen od limunske kiseline:

[0058] Hiralni imin može da reaguje sa zaštićenim oblicima glicina kao što su ovi:

[0059] Potreban mešani anhidrid za drugu opciju može da bude pripremljen od CBZ-zaštićenog glicina i izopropilhloroformata u dihlorometanu. (DMB se odnosi na 2,4-dimetoksibenzil grupu). Dioksolan ovog zaštićenog intermedijara je zatim hidrolizovan u blago kiselim uslovima i oksidovan do aldehida, koji može lako da bude smanjen, npr. natrijumborohidridom, da bi se dobio di-zaštićen primarni alkohol kao što je prikazano.

[0060] Primarni alkohol ovog intermedijara može biti konvertovan u odlazeću grupu, na primer tretiranjem jodom i trifenilfosfinom da bi se proizveo primarni jodid, ili tretiranjem bazom i sulfonilhloridom da bi se proizveo npr. mezilat ili tozilat. Ovaj aktivirani intermedijar reaguje lako sa hidroksietilaminom kao što je prikazano u fazi 1 u nastavku.

Intermedijar B: 3-(((2R,3S)-3-amino-4-oksoazetidin-2-il)metil)oksazolidin-2-on.

[0061]

Faza 1: Benzil ((2R,3S)-1-(2,4-dimetoksibenzil)-2-(((2-hidroksietil)amino)metil)-4-oksoazetidin-3-il)karbamat. Rastvoru((2S,3S)-3-(((benziloksi)karbonil)amino)-1-(2,4-dimetoksibenzil)-4-oksoazetidin-2-il)metilmetansulfonata (6.43g, 13.4 mmol) u acetonitrilu (44.8 ml) je dodat etanolamin (8.13 ml, 134 mmol) nakon čega je usledio DIEA (7.0 ml, 40 mmol). Rastvor je zagrevan do 80°C tokom 20 h, nakon čega je ohlađen do sobne temperature, razblažen sa EtOAc, opran vodom, osušen preko Na2SO4i koncentrovan u vakuumu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje (4.47 g, 75%) u obliku bele čvrste materije. LCMS: Rt= 0.60 min, m/z = 444.2 (M+1).

Faza 2: Benzil ((3S,4R)-1-(2,4-dimetoksibenzil)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)azetidin-3-il)karbamat. Rastvoru benzil ((2R,3S)-1-(2,4-dimetoksibenzil)-2-(((2-hidroksietil)amino)metil)-4-oksoazetidin-3-il)karbamata (4.47g, 10.08 mmol) u hloroformu (50 ml) je dodat karbonildiimidazol (CDI) (4.90 g, 30.2 mmol). Nakon mešanja na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, reakciona mešavina je koncentrovana u vakuumu. Neprečišćen ostatak je prečišćen putem hromatografije na silika gelu (MeOH-DCM, 0-5%), čime se dobija naslovno jedinjenje (3.84 g, 81%) u obliku bele pene. LCMS: Rt= 0.76 min, m/z = 470.1 (M+1).

Faza 3: Benzil ((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)azetidin-3-il)karbamat. Pripremljen analogno pripremi kod Mastalerz et al. J. Med. Chem.1988, 31, 1190, upotrebom benzil ((3S,4R)-1-(2,4-dimetoksibenzil)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)azetidin-3-il)karbamata (3.84 g, 8.18 mmol), K2S2O8(3.10 g, 11.5 mmol) i K2HPO4(1.852 g, 10.6 mmol) u ACN:vodi (2:1, 136 mL) i zagrevanjem tokom 40 min na 90 °C. Više od K2S2O8(663 g, 2.45 mmol) i K2HPO4(370 mg, 2.13 mmol) su dodati i mešavina je zagrevana tokom dodatna 3 h. Više K2S2O8(332 mg, 1.23 mmol) i K2HPO4(185 mg, 1.06 mmol) su dodati, i zagrevani su dodatna 2 h, nakon čega je koncentrovan u vakuumu, pri čemu je uklonjena većina ACN. Mešavina je razblažena slanim rastvorom/EtOAc, a slojevi su odvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (3x), a kombinovani organski slojevi su osušeni preko Na2SO4. Neprečišćen ostatak je prečišćen putem hromatografije na silika gelu (EtOAc-Heptan, 0-100% zatim MeOH-DCM, 10%) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (1.61 g, 62%) u obliku bež pene. LCMS: Rt= 0.51 min, m/z = 320.0 (M+1) Postupak 2m_kiseli.

Faza 4: 3-(((2R,3S)-3-amino-4-oksoazetidin-2-il)metil)oksazolidin-2-one. Pripremljen prema Malmström et al. Bioorg. Med. Chem. Lett.2012, 22, 5293, upotrebom benzil ((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)azetidin-3-il)karbamata (96 mg, 0.30 mmol) i Pd/C 10% Degussa tip 101 (10%, 64 mg) i vodonika u EtOH:MeOH (4:1, 1.5 mL) tokom 1 h. Neprečišćen ostatak je upotrebljen kao takav u narednoj fazi. LCMS: Rt= 0.11 min, m/z = 186.0 (M+1) Postupak 2m_kiseli.

Jedinjenje X: 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi)ciklopropankarboksilna kiselina.

[0062]

Faza 1: Benzhidril 1-(((Z)-(1-(2-((tert-butoksikarbonil)amino)tiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)azetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi)ciklopropankarboksilat. Rastvoru (Z)-2-((1-((benzhidriloksi)karbonil)ciklopropoksi)imino)-2-(2-((tert-butoksikarbonil)amino)tiazol-4-il)sirćetne kiseline (854 mg, 1.59 mmol) pripremljenom prema objavljenoj patentnoj

prijavi US2011/0190254, intermedijar B (324 mg, 1.75 mmol) i HATU (785 mg, 2.07 mmol) u DMF (7.9 mL), DIPEA je dodat (832 µL, 4.77 mmol). Nakon 1 h mešanja, izliven je u vodu i ekstrahovan sa EtOAc. Slani rastvor je dodat vodenom sloju, i dalje je ekstrahovan etilacetatom (EtOAc) (3x). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani u vakuumu. Neprečišćen ostatak je prečišćen putem hromatografije na silika gelu (0-10% MeOH-DCM) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (1.09 g, 97%) u obliku bež pene. LCMS: Rt= 0.97 min, m/z = 705.3 (M+1) Postupak 2m_kiseli.

Umesto HATU, razni drugi kuplovani reagensi mogu da se upotrebe, kao što su bilo koji od uobičajenih karbodiimida, ili CDMT (2-hloro-4,6-dimetoksi-1,3,5-triazin) i N-metilmorfolin da bi se formirala amidna veza generisana u fazi 1.

Faza 2: (3S,4R)-3-((Z)-2-((1-((benzhidriloksi)karbonil)ciklopropoksi)imino)-2-(2-((tertbutoksikarbonil)amino)tiazol-4-il)acetamido)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)azetidin-1-sulfonska kiselina. Benzhidril 1-(((Z)-(1-(2-((tert-butoksikarbonil)amino)tiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)azetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi)ciklopropankarboksilat (1.00 g, 1.42 mmol) u DMF (7.0 mL) na 0 °C je tretirana SO3•DMF (448 mg, 2.84 mmol). Nakon 2 h mešanja na sobnoj temperaturi, rastvor je izliven u ledeni slani rastvor i ekstrahovan sa EtOAc (3x). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani u vakuumu, čime se dobija naslovno jedinjenje (pod pretpostavkom kvantitativno) u obliku bele čvrste materije. LCMS: Rt = 0.90 min, m/z = 785.2 (M+1) Postupak 2m_kiseli.

Faza 3: 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi)ciklopropankarboksilna kiselina.

[0063] Rastvoru (3S,4R)-3-((Z)-2-((1-((benzhidriloksi)karbonil)ciklopropoksi)imino)-2-(2-((tertbutoksikarbonil)amino)tiazol-4-il)acetamido)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)azetidin-1-sulfonske kiseline (1.10 g, 1.40 mmol) u DCM (1.5 mL) na 0°C, dodat je TFA (5.39 mL, 70.0 mmol), i posle 10 minuta, ledeno kupatilo je uklonjeno. Dodatni TFA (3.24 mL, 42.0 mmol) je dodat nakon 1 h na sobnoj temperaturi i rastvor je razblažen sa DCM i koncentrovan u vakuumu nakon dodatnih 30 min. Opciono, anizol može biti dodat TFA reakciji da bi se pomoglo da se smanji formiranje nus proizvoda, koji može da poveća prinos željenog proizvoda u ovoj fazi. Neprečišćen ostatak je prečišćen preparativnom HPLC na reverznim fazama (XSelect CSH, 30 x 100 mm, 5 µm, C18 kolona; ACN-voda sa modifikatorom 0.1 % mravlje kiseline, 60 mL/min), čime se dobija naslovno jedinjenje (178 mg, 23%) u obliku belog praška. LCMS: Rt= 0.30 min, m/z = 518.9 (M+1) Postupak 2m_kiseli;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.27 (d, J = 9.0 Hz, 1H) 6.92 (s, 1H) 5.23 (dd, J = 9.1, 5.7 Hz, 1H) 4.12-4.23 (m, 3H) 3.72-3.62 (m, 2H pretpostavljeno; zatamnjeno vodom) 3.61-3.52 (m, 1H pretpostavljeno; zatamnjeno vodom) 3.26 (dd, J = 14.5, 5.9 Hz, 1H) 1.36 (s, 4H).<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 7.23 (s, 1H), 5.48 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.71-4.65 (m, 1H), 4.44 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 3.89-3.73 (m, 3H), 3.54 (dd, J = 14.9, 4.9 Hz, 1H), 1.65-1.56 (m, 2H), 1.56-1.46 (m, 2H).

Proizvod ovo postupka je amorfni. Jedinjenje X može biti kristalizovano iz acetona, etanola, citratnog pufera na pH 3 (50 mM), ili acetatnog pufera na pH 4.5 (50 mM), pored rastvarača o kojima će biti reči u nastavku.

Instrumenti

[0064] DSC: Pyris Diamond DSC, gas azota (20 mL/min)

TGA: Pyris 1 TGA, gas azota (20 mL/min), koji se skenira na 10°C/min

XRPD: X'Pert Pro MPD Panalytical, Cu anoda, 40kV na 40 mA struji

Anoda cevi: (Cu)

Napon generatora: 40 kV

Struja u cevi: 40 mA

Početni ugao [2 θ]: 3

Krajni ugao [2 θ]: 40

Vreme skeniranja 2 minuta

Oblik 1 i oblik 2

[0065] Jedinjenje X je pripremljeno kako je prethodno opisano i kristalizovano iz rastvarača da bi se obezbedili materijali koji imaju difraktogram X-zraka praha (XRPD) na Fig.1 ili Fig.2. Ovi predstavljaju dve odvojene šarže kristalnog materijala, i odnose se na ovde dat oblik 1 i oblik 2. Oblici 1 i 2 imaju neke slične XRPD pikove, a XRPD za oblik 2 pokazuje proširene linije, tako da proizvod identifikovan kao oblik 2 može da sadrži neki materijal oblika 1, ili oba uzorka mogu da budu mešavine kristalnih oblika. Ova dva oblika su suštinski bezvodna, koja sadrže manje od oko 1 mas.% vode prema Karl Fišerovoj analizi.

[0066] Jedinjenje X oblika 1 (1.2 g) je suspendovano u 12 mL acetona i umešavano tokom 3 dana na 20°C. Uzorak se ne čini da se razvija: dok su se javila neka proširenja linije, XRPD proizvoda (Fig.3) se i dalje pojavljuje kao generalno konzistentna sa oblikom 1.

[0067] Uzorak koji daje XRPD na Fig.1 je pokazao jaku egzotermu tokom DSC na oko 205°C, i postepen gubitak mase preko TGA do iznosa od oko 2% gubitka do 180°C.

[0068] Uzorak koji je proizveo XRPD na Fig.2 (oblik 2) je pokazao jaku egzotermu tokom DSC na oko 203°C, i blago veći gubitak mase (3.7%) do 160°C u poređenju sa oblikom 1.

Lista 1: XRPD lista pikova za oblik 1 (2Teta: najintenzivniji pikovi su podvučeni)

1 6.6

2 11.1

3 13.4

4 14.4

5 15.2

6 16.6

7 17.9

8 18.8

10 22.5

11 23.3

12 25.1

13 27.7

14 28.9

15 30.2

[0069] Oblik 1 takođe može biti okarakterisan podskupom ovih pikova, na primer pikova na 6.6, 13.4 i 18.8.

Lista 2: XRPD lista pikova za oblik 2 (2Teta: najintenzivniji pikovi su podvučeni)

1 6.7

2 7.5

3 11.3

4 13.3

5 13.7

6 15.3

7 17.9

8 18.7

9 19.3

10 20.0

11 22.8

12 24.8

13 27.9

[0070] Oblik 2 takođe može biti okarakterisan podskupom ovih pikova, na primer pikova na 7.5, 19.3 i 20.0.

Oblik 3

[0071] Jedinjenje X oblika 1 je suspendovano u metanolu i u roku od par minuta se razvilo u lepljiv čvrst proizvod. Taj proizvod je pokazao XRPD model prikazan na Fig.4, i ovde je označen kao oblik 3. Trebalo bi imati u vidu da je različit oblik (oblik 8) je dobijen nakon produženog mešanja u metanolu na većoj opremi, kako je opisano u nastavku; stoga oblik 3 može da bude prelazni oblik ili se mešavina formirana kao oblik 1 razvija u ovom uslovima.

Lista 3: XRPD lista pikova za oblik 3 (2Teta: najintenzivniji pikovi su podvučeni)

1 6.6

2 7.3

3 8.3

4 12.7

5 13.3

6 13.9

7 16.7

8 18.9

9 20.3

10 21.2

11 22.2

12 23.9

13 24.6

14 25.1

15 27.2

16 28.0

[0072] Oblik 3 takođe može biti okarakterisan podskupom ovih pikova, na primer pikova na 7.3, 18.9 i 21.2.

Oblik 4

[0073] Jedinjenje X oblika 1 (1.2 g) je suspendovano u vodi (12 mL) i mešano na 20°C tokom 3 dana. Proizvod je pokazao XRPD model prikazan na Fig.5, i ovde je označen kao oblik 4. XRPD je od uzorka osušenog filter papirom. TGA analiza za oblik 4 pokazuje postepen gubitak mase počevši od oko 40°C i ubrzavajući oko 100°C, do visoravni na oko 60% originalne mase na 120-170°C. Iznad te temperature, primećen je postepen gubitak mase. Rani gubitak mase je konzistentan sa gubitkom vode iz oblika 4, i sa DSC, koji pokazuje jaku endotermu u istom temperaturnom opsegu i visoravni na oko 110-180°C. Slično, analiza dinamičke sorpcije pare (DVS) za oblik 4 pokazuje brz gubitak od oko 20% mase uzorka kako je relativna vlažnost pala na oko 50%, nakon čega je kruženje do niže zatim više zatim niže zatim više relativne vlažnosti proizvelo odgovarajuće smanjenje, porast, smanjenje i porast mase uzorka sa minimalnom masom od oko 65% originalnog, i maksimalnom masom na oko 80% originalne mase. Oblik 4 je samim tim hidrirani oblik, i razvija se u zavisnosti od RV. Stepen hidracije uzorka varira sa relativnom vlažnošću od bezvodnog oblika veoma niske vlažnosti, do trihidrata na RV oko 20-50%, do heksahidrata na RV od iznad 60%. Uzorak oblika 4 osušen na 0% relativne vlažnosti (RV) proizvodi XRPD konzistentan sa oblikom 1.

Lista 4: XRPD lista pikova za Oblik 4 (2Teta: najintenzivniji pikovi su podvučeni)

1 7.0

2 8.6

3 13.7

4 15.2

5 16.1

6 17.0

7 18.0

8 19.3

9 20.9

10 24.5

11 26.9

[0074] Oblik 4 takođe može biti okarakterisan podskupom ovih pikova, na primer pikova na 7.0, 8.6, 19.3 i 20.9.

Oblik 5

[0075] Uzorak oblika 4 je osušen pod protokom suvog vazduha za jedan dan, čime je dobijen prašak koji je ispoljio XRPD prikazan na Fig.6A. Ovaj materijal je ovde označen kao 5. DSC za oblik 5 pokazuje oštru egzotermu na oko 204°C, i uzorak počinje da se vraća na oko ove temperature, čime se ukazuje na dekompoziciju. TGA pokazuje oko 7% gubitka mase između 45°C i 160°C. Karl Fišerova analiza pokazuje sadržaj vode od 9.6% za oblik 5, što odgovara trihidratu, ali se čini da da uzorak gubi masu na RV ispod oko 30%; i na RV iznad 80%, konvertuje u oblik 4 u toku jednog dana.

[0076] Samim tim se čini da se oblici 1, 4 i 5 jedinjenja međusobno konvertuju kako relativna vlažnost varira, i to može biti mešavina ovih hidriranih oblika. Oblik 5 je poželjan oblik za rukovanje na ambijentalnim temperaturama oko 25°C tokom proizvodnje, jer se kristališe kao čvrst oblik koji se dobro ponaša koji je stabilniji tokom čuvanja i rukovanja od drugih oblika, pod uslovom da se održava pogodna vlažnost na oko 20-50% RV, poželjno 30-40%. U okviru ovih RV opsega, materijal je prevashodno trihidrat i pogodno se dobro ponaša i stabilan je za rukovanje i čuvanje bez posebnih mera opreza.

Veća priprema oblika 5

[0077] Voda (20 mL) i THF (40 mL) su mešani u sudu, a jedinjenje X (10 g, ca.91% prečišćeno HPLC) je dodato uz mešanje na 25°C da bi se dobio bistar žuti rastvor. Uzorak od 20 mg oblika 5 (pogledati gore) je dodat kao seme, i mešavina je mešana tokom 50 minuta. THF (140 mL) je zatim polako dodavan, tokom 1 h i mešavina je mešana 2 sata ili duže. Suspenzija je filtrirana, a vlažan kolač je opran hladnom (<5°C) vodom, zatim je bio sušen na 20-25°C tokom 11 sati pri pritisku od 100 mbar, čime se dobija 6.6 g trihidrata oblika 5 koji je bio 97.8% prečišćen HPLC. Uzorak je proizveo XRPD model prikazan na Fig.6B. Stabilan je kada se čuva na 25-50% relativne vlažnosti, poželjno 30-40% RV; na nižoj ili višoj relativnoj vlažnosti, može da se razvije u različita hidrirana stanja kako je ovde opisano. Prekomerno isušivanje proizvodi oblik koji se razgrađuje na sobnoj temperaturi za nekoliko sati, dalje pokazujući prednost stabilnosti hidriranih oblika.

Lista 5: XRPD lista pikova za Oblik 5 (2Teta: najintenzivniji pikovi su podvučeni)

1 7.3

2 9.3

3 12.0

4 13.6

5 15.8

6 16.3

7 18.0

8 18.6

9 19.2

10 19.9

11 20.2

12 21.7

13 23.0

14 23.5

15 24.1

16 24.9

17 27.3

18 27.8

[0078] Oblik 5 takođe može biti okarakterisan podskupom ovih pikova, na primer pikova na 7.3, 9.3, i 27.8; i opciono pikovima na 7.3, 9.3, 19.9 i 27.8.

[0079] Oblik 5 (trihidrat) može alternativno biti okarakterisan pojedinačnom kristalnom strukturom X-zraka koja je monoklinična, prostorna grupa P2(1), dimenzija ćelijske jedinice a = 13.121 (4) Å; b = 7.400(3) Å; c = 25.017(8) Å (α = 90°; β = 96.037°; γ = 90°); i zapreminom ćelijske jedinice od 2415.6(14) Å<3>. Podaci za ovu strukturu su sakupljeni na talasnoj dužini 1.54178 Å, 100 °K; teta opseg 3.99° do 68.44°; 47822 sakupljenih refleksija. Pojedinačna kristalna struktura potvrđuje prisustvo tri vodena molekula po molekulu jedinjenja X u ćelijskoj jedinici, sa vodenim molekulom koji se nalazi u kanalima.

Oblik 6

[0080] Jedinjenje X oblika 1 (1.2 g) je suspendovano u DMSO:vodi (25:75 vol./vol. odnos, 12 mL) i mešano je na 20°C tokom 3 dana. Uzorak čvrste materije je sakupljen i osušen filter papirom. Proizvod je pokazao XRPD model prikazan na Fig.7, i ovde je označen kao oblik 6. DSC i TGA su konzistentni sa gubitkom rastvarača do oko 130°C i ponovo između 150°C i 200°C, nakon čega je usledila razgradnja iznad 200°C.

Lista 6: XRPD lista pikova za Oblik 6 (2Teta: najintenzivniji pikovi su podvučeni)

1 6.6

2 8.1

3 9.2

4 12.8

5 13.9

6 14.4

7 16.7

8 17.8

9 19.4

10 20.1

11 21.2

12 24.7

13 26.6

14 27.3

[0081] Oblik 6 takođe može biti okarakterisan podskupom ovih pikova, na primer pikova na 8.1, 9.2, i 12.8; i opciono dodatnim pikovima na 21.2 i 24.7.

Oblik 7

[0082] Jedinjenje X oblika 6 pripremljeno kako je prethodno opisano je osušeno za jedan dan pod protokom suvog vazduha. Dobijeni prah je ispoljio XRPD model prikazan na Fig.8, i ovde je označen kao oblik 7. DSC pokazuje veliku egzotermu počevši od oko 134°C i računajući do oko 170°C.<1>H NMR pokazuje oko 2 ekvivalenta DMSO prisutna i nešto vode (3.6%). Karl Fišerova titracija potvrđuje prisustvo 3.6% vode, što odgovara 1 ekvivalentu. Samim tim ovaj oblik je solvat.

Lista 7: XRPD lista pikova za oblik 7 (2Teta: najintenzivniji pikovi su podvučeni)

1 6.7

2 7.3

3 9.2

4 10.6

5 12.8

6 14.4

7 16.0

8 17.6

9 18.0

10 19.5

11 20.0

12 20.3

13 24.9

14 27.0

15 27.6

[0083] Oblik 7 takođe može biti okarakterisan podskupom ovih pikova, na primer pikova na 6.7, 7.3 i 20.3.

Oblik 8

[0084] Jedinjenje X oblika 1 (1.2 g) je suspendovano u metanolu (12 mL) i mešano na 20°C tokom 3 dana. Uzorak čvrste materije je sakupljen i proizveo je XRPD model prikazan na Fig.9 (bez sušenja), koji je ovde označen kao 8. Kada je uzorak oblika 8 osušen pod protokom suvog vazduha, pikovi su se proširili suštinski ali se generalno pojavljuju oko istih položaja. TGA za osušen uzorak pokazuje postepen gubitak mase (oko 4%) izvan 140°C, i oštriji gubitak mase počevši oko 170°C. DSC pokazuje jaku egzotermu na oko 172°C koja može biti povezana sa razgradnjom uzorka.

List 8: XRPD lista pikova za Oblik 8 (2Teta: najintenzivniji pikovi su podvučeni)

1 6.2

2 12.5

3 16.8

4 17.8

5 19.5

6 20.7

7 21.8

8 25.9

[0085] Oblik 8 takođe može biti okarakterisan podskupom ovih pikova, na primer pikova na 6.2, 21.8 i 25.9.

Oblik 9

[0086] Jedinjenje X oblika 3 je suspendovano u acetonu i vodi na 25 °C do 40 °C. Odnos vode i acetona je varirao od 2:98 do 10:90. Nakon izjednačavanja za 24 sata, oblik hetero-solvata niske kristalnosti je dobijen u svakom slučaju. Dok je XRPD varirao sa proporcijom vode i acetona, svi uzorci su proizveli XRPD spektre sa širokim izbočinama pre nego sa oštrim pikovima. Fig.10 pokazuje XRPD za uzorak ekvilibrisan u 10:90 vodi/acetonu na 40°C tokom 24 sata, i sledeća tabela prikazuje XRPD podatke za ovaj uzorak. Ovaj čvrsti oblik je ovde označen kao 9.

U

6

1

1

1

1

1

1

1

2

2

[0087] Oblik 9 može biti okarakterisan podskupom ovih pikova, na primer pikova identifikovanih u tabeli iznad kao 'jak' relativni intenzitet, npr. pikovi na 6.3 i 12.6 i opciono jedan ili više pikova u tabeli umetenog relativnog intenziteta, kao što su pikovi na 22.1, 22.3, 23.1, 27.0 i 27.5

Oblik 10

[0088] Jedinjenje X oblika 1 (anhidrat) je izloženo do 43% relativne vlažnost tokom jednog dana ili više. Ispostavlja se da je kristalni proizvod seskvihidrat (Jedinjenje X-1.5 H2O) bazirano na određivanju sadržaja vode. Trebalo bi da se ima u vidu da bi oblik 5, trihidrat, u sličnim uslovima bio stabilan, opet kada se počinje sa anhidratom, jednak je seskvihidratom u ovim uslovima i ostaje u tom obliku najmanje 14 dana kada se čuva pri istoj relativnoj vlažnosti. Ovaj kristalni oblik proizvodi XRPD spektar prikazan na Fig.11, i ovde je označen kao oblik 10. Tabela u nastavku daje kratak prikaz glavnih pikova na XRPD ovog uzorka.

[0089] Oblik 10 može biti okarakterisan XRPD pikovima u gornjoj tabeli umerenih do jakih relativnih intenziteta, npr. pikovima na 6.6, 11.0, 13.3, 15.6, 16.5, 18.6, 22.2, 23.4 i 27.4. Takođe može biti okarakterisan podskupom ovih pikova, na primer pikova relativnog intenziteta od 40 ili više, npr. pikova na 6.6, 11.0, 16.5, 22.2, i 23.4, ili podskupom od najmanje 3 ili 4 ovih pikova.

Oblik 11

[0090] Jedinjenje X oblika 5, trihidrat, je izložen do relativne vlažnosti od 22% za oko 3 dana kako bi se obezbedila kristalna čvrsta materija okarakterisana kao dihidrat (jedinjenje X-2H2O) bazirano na analizi sadržaja vode. Ovaj materijal se lako vraća u trihidrat (oblik 5) ukoliko se izlaže relativnoj vlažnosti iznad oko 40%. Dihidrat, koji je ovde označen kao oblik 11, je proizveo XRPD spektar prikazan na Fig.12: glavni pikovi u tom XRPD spektru su dati u sledećoj tabeli.

U

3

7

9

1

1

1

[0091] Oblik 11 je okarakterisan XRPD pikovima u ovoj tabeli relativnih intenziteta od 20 ili više, ili alternativno onim pikovima relativnog intenziteta od najmanje 25, npr., pikovima na 7.4, 9.7, 17.0, 19.5, 22.2, 26.3, 28.1, i 29.3, ili podskupom od 3, 4 ili 5 od ovih pikova relativnog intenziteta od najmanje 26 ili najmanje 28 u tabeli.

Oblik 12

[0092] Jedinjenje X oblika 5 je izloženo vazduhu relativne vlažnosti od 65% za oko 3 dana, čime se dobija kristalni materijal okarakterisan kao tetra-hidrat baziran na analizi sadržaja vode. Ovaj materijal se lako vraća u trihidrat (oblik 5) ukoliko je relativna vlažnost smanjena na oko 40%. Tetrahidrat, koji je ovde označen kao oblik 12, proizveo je XRPD spektar prikazan na Fig.13: glavni pikovi u tom XRPD spektru su navedeni u sledećoj tabeli.

[0093] Oblik 12 može biti okarakterisan XRPD pikovima relativnog intenziteta od najmanje 40 u tabeli iznad, tj. XRPD pikovima na 7.3, 17.8, 19.0, 19.8, 20.4, 24.0, 24.7, 24.9, 27.2, 27.8 i 32.1. Alternativno, može biti okarakterisan podskupom od najmanje 3, ili najmanje 4, ili najmanje 5 od ovih pikova. Oblik 12 takođe može biti okarakterisan XRPD pikovima opisanim kao jak relativni intenzitet u tabeli, tj., pikovima na 7.3, 19.0, 20.4, 24.0, 24.7, i 27.2.

[0094] Uzorci hidrata jedinjenja X, uključujući oblike 5, 11 i 12 su se pokazali da se međusobno konvertuju lako jer je relativna vlažnost varirala od oko 22% do oko 92%. Trebalo bi imati u vidu da na 92% relativne vlažnosti, jedinjenje X je mešavina kristalnog oblika okarakterisana kao heksihidrat pomešan sa trihidratom oblika 12. Poređenjem, anhidrat (oblik 1) se poželjno konvertuje u seskvihidrat kako je relativna vlažnost porasla do 43%, i razvija se u trihidrat i tetrahidrat pri višim relativnim vlažnostima.

Farmaceutske kompozicije jedinjenja X

[0095] Jedinjenje X (500 mg) i L-arginin (332.5 mg) su kombinovani u bočici. Saharoza (kristalna, saharoza koja ne sadrži pirogene: 1000 mg) je dodata zajedno sa vodom pogodnom za injekcije (8.00 mL). pH rastvora je podešena, ukoliko je neophodno, pomoću 1.0N HCI ili 1.0N NaOH da bi se postigla pH od 5.0±0.5, poželjno pH od 5.0±0.2. Ovo obezbeđuje rastvor koji sadrži oko 62.5 mg/mL jedinjenja X u obliku soli arginina. Ovaj rastvor može biti filtriran ukoliko je neophodno, i može biti liofilizovan da bi se dobila bela ili beličasta čvrsta materija (liofilizat). Liofilizovana čvrsta materija može biti rekonstituisana sterilnom vodom ili farmaceutski prihvatljivim vodenim nosačem kao što su izotonični slani rastvor ili dekstroza kako bi se obezbedio rastvor pogodan za intravensko davanje. Liofilizat bi trebalo da se čuva u kontejneru koji isključuje svetlost da bi se zaštitio liofilizat od fotorazgradnje. Ovaj postupak može da se poveća ili smanji kako bi se obezbedile jedinične doze za čuvanje i distribuciju, ili rasuti materijal koji dalje može da bude obrađen po želji. Za povećanje, kontrola temperature je važna: jedinjenje X u rastvoru bi trebalo da se održava na temperaturi do 10°C, poželjno između 0°C i 8°C, i poželjnije između 2°C i 8°C, pre dodavanja arginina ili druge baze, jer je jedinjenje podvrgnuto hidrolitičkoj razgradnji u vodi u odsustvu baze ili izvan pH opsega od 4-6.

[0096] U jednom načinu ostvarivanja, mešavina prema gornjem primeru je pripremljena kako je opisano upotrebom trihidrata (oblik 5) jedinjenja X u količini koja sadrži oko 500 mg jedinjenja X bezvodnog, i liofilizovana je u bočici koja je zaptivena za čuvanje i distribuciju, poželjno upotrebom gumenog zatvarača od butila (npr., D777 zatvarač), pri čemu liofilizat u svakoj bočici sadrži oko 500 mg jedinjenja X. Bočice liofilizata su čuvane na ili ispod sobne temperature do upotrebe.

[0097] Alternativna formulacija pogodna za IV injekciju sadrži jedinjenje X (100 mg) i 0.5N natrijumbikarbonata (0.75 mL), i sredstvo za podešavanje pH ukoliko je neophodno (1 N NaOH ili 1 N HCl po potrebi) da bi se dobila pH do oko 5.5 (između pH 5 i pH 6), plus količina vode za injekciju dovoljna da se postigne krajnja koncentracija od 100 mg/ml.

Stabilnost jedinjenja X

[0098] Jedinjenje X predstavlja stabilan čvrst oblik, ali soli jedinjenja X su stabilnije u rastvoru nego u slobodnoj kiselini; samim tim postaje važno da se identifikuju pogodne farmaceutske prihvatljive soli koje se koriste za davanje. Soli jedinjenja X su pripremljene dodavanjem baze (1.0 ili 2.0 ekvivalent) jedinjenju X u vodi, i liofilizovanjem rastvora. Čvrsti oblici dobijeni na taj način su amorfni od strane XRPD. Na ovaj način, formulacija soli jedinjenja X je pokušana sa natrijumhidroksidom, (L)-lizinom, (L)-argininom, kalcijumhidroksidom, megluminom, i magnezijumhidroksidom. Zaključeno je da su natrijumove soli i soli arginina posebno stabilne i poželjne kao oblici za davanje u vodenim podlogama koje se uobičajeno koriste za intravenske injekcije ili infuzije.

[0099] Uzorci soli dinatrijuma i so di-(L)-arginina kao čvrsti oblici su podvrgnute ispitivanju stabilnosti na 25°C i 40°C. Uzorak natrijumove soli je bio 97.2% prečišćen putem HPLC u početku, a nakon 6 nedelja na 25°C, i dalje je bio 96.2% čist. Isti materijal je čuvan na 40°C je bio 94.8% čist nakon 3 nedelje, i 93.6% čist nakon 6 nedelja. Značajne nečistoće koje se pojavljuju ili povećavaju tokom ispitivanja se pojavljuju na relativnim retencionim vremenima (RRT) 0.34 i 1.11 (sa jedinjenjem X definisanim kao RRT = 1).

[0100] So arginina je bila 97.3% prečišćena putem HPLC početno, i bila je 96.3% čista nakon 6 nedelja na 25°C. Na 40°C, njena čistoća je pala na 95.1% nakon 3 nedelje i 94.2% nakon 6 nedelja. Značajne nečistoće koje su se pojavile ili porasle tokom ovog ispitivanja su se pojavile na relativnim retencionim vremenima (RRT) 1.09, 1.11 i 1.13 (sa jedinjenjem X definisanim kao RRT = 1). HPLC tragovi za uzorcima iz ovih ispitivanja stabilnosti nakon 6 nedelja na 25°C i 40°C redom su prikazani na Fig.10 i 11. Niži trag na svakom crtežu je uzorak upotrebljen da bi se izmerio limit kvantifikacije (LOQ); sledeći trag iznad koji prikazuje uzorak jedinjenja X upotrebljen za formulaciju soli; sledeći trag iznad koji je onaj za so arginina nakon 6 nedelja; i sledeći (najviši) trag je za natrijumovu so nakon 6 nedelja.

[0101] HPLC uslovi za ispitivanje stabilnosti (Fig.10 i 11):

Agilent 1290 sistem sa UV detektorom na 260 nm

Acquity HSS T3 kolona, 100mm x 2.1mm ID; 1.8 µm veličina čestica (nabavljena od Waters) Temperatura kolone: 40°C

Mobilne faze

A: 0.05% TFA u vodi

B: 0.05% TFA u metanolu

Brzina protoka: 0.45 mL/min

Gradijent (A/B odnos): 97:3 za 8 minuta; 75:25 za 3 minuta; 0:100 za 1 minut

[0102] Za jedinjenje X je takođe zaključeno da se razgrađuje fotohemisjki; samim tim bi jedinjenje X trebalo da se čuva u tamnim ili neprovidnim kontejnerima zbog najboljeg roka upotrebe. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, jedinjenje X je upakovano u kontejner koji suštinski smanjuje izloženost svetlosti, poželjno u atmosferi pri relativnoj vlažnosti od 25-50% vlažnosti i poželjnije pri relativnoj vlažnosti od 30-40% ili 30-45%.

Biološka aktivnost

Bakterijski prikazi i kulture

[0103] Bakterijski izolati su kultivisani od na -70°C smrznutih zaliha putem dva uzastopna prolaza tokom noći na 35°C na ambijentalnom vazduhu na 5% agara u krvi (Remel, Lenexa, Kans.). Kontrola kvaliteta i P. aeruginosa ATCC 27853) je iz Američke kolekcije uzoraka kultura (ATCC; Rockville, Md.) i PAO1 je primljen od Dr. K. Poole. Konstrukcija Escherichia coli izogenih sojeva Sojevi NB27273-CDY0026 (matični), NB27273-CDY0033 (KPC2) i NB27273-CDY0030 (SHV12)

[0104] Soj NB27273 (BW25113 pspB::Km<r>) je dobijen iz Keio kolekcije umetanja transpozona. Taj soj ima pspB gen zamenjen markerom kanamicinske rezistentnosti (BW25113 pspB::Km<r>). Ovaj soj je bio tretiran transpozonom u pspB putem FLP rekombinaze pomoću objavljene metodologije. Dobijeni soj, BW25113 pspB, je upotrebljen kao domaćin za multikopijske vektore koji eksprimiraju ključne βlaktamaze. Multikopijski plazmidi koji usmeravaju konstitutivnu ekspresiju β-laktamaza su bili ustanovljeni na sledeći način: sintetički, geni optimizovani kodonom koji kodiraju E. coli KPC2 i SHV12 -laktamaze su pripremljene putem DNK2.0 (Palo Alto, CA). Svaki od sintetičkih fragmenata je dizajniran tako da sadrži Notl i Ncol mesta restrikcije na njihovim krajevima, čime se omogućava ligacija u Notl/Ncol razloženom pET28a(+) derivatu za proteinsku ekspresiju. Umetanja u ove vektore su služila kao DNK obrazac za PCR amplifikaciju gena koji kodira KPC2 i SHV12, upotrebom parova prajmera E225 (tcgcCTCGAGgcgactgcgctgacgaatttgg) (SEQ ID NO:1) i E202 (aatcGAATTCttactgaccattaacgcccaagc) (SEQ ID NO:2) i E227 (tcgcCTCGAGgcgagcccgcaaccgctgga) (SEQ ID NO:3) i E204 (aatcGAATTCttaacgctgccagtgctcaatc) (SEQ ID NO:4), redom. Kodon je optimizovao nukleotidne sekvence, a podaci o prepoznavanju relevantnog prajmera su prikazani u nastavku:

SHV12

[0105]

E227 TCGCCTCGAGGCGAGCCCGCAACCGCTGGA (SEQ ID NO:6)

E204 AATCGAATTCTTAACGCTGCCAGTGCTCAATC (SEQ ID NO:7)

REV. COMP. E204 GATTGAGCACTGGCAGCGTTAAGAATTCGATT (SEQ ID NO:8)

KPC2

[0106]

E225 TCGCCTCGAGGCGACTGCGCTGACGAATTTGG (SEQ ID NO:10)

E202 AATCGAATTCTTACTGACCATTAACGCCCAAGC (SEQ ID NO:11)

REV. COMP. E202 GCTTGGGCGTTAATGGTCAGTAAGAATTCGATT (SEQ ID NO:12) PODVUČENO = DNK KOJA KODIRA BL

[0107] PCR proizvodi su zatim razloženi sa Xhol i EcoRI i ligirani u slično razložen plazmid pAH63-pstS(BlaP). Plazmid pAH63-pstS(BlaP) je derivat plazmida pAH63 (J Bacteriol:183(21): 6384-6393) pripremljen kloniranjem TEM-1 (bla) promotera i signalnog peptida koji kodira region iz plazmida pBAD (J Bacteriol.1995 Jul.177(14):4121-30) u plazmid pAH63. Ovaj fragment je bio PCR amplifikovan od pBAD upotrebom para prajmera E192 (ttcaCTGCAGtgaacgttgcgaagcaacggC) (SEQ ID NO:13) i E194 (TCGAggatcctcgagagcaaaaacaggaaggcaaaatgccg) (SEQ ID NO:14), razložen sa Pstl i BamHI i umetnut u slično razložen plazmid pAH63. Stoga, ekspresija β-laktamaze iz AH63-pstS(BlaP) bazirana na konstruktima je konstitutivna, a signalna sekvenca je obezbeđena da bi se usmerili ovi proteini na periplazam. Plazmid pAH63 baziran na vektorima se upotrebljava za umetanje u genom u pojedinačnoj kopiji, međutim, da bi se obezbedili viši nivoi ekspresije koji omogućavaju osetljiviju detekciju osetljivosti jedinjenja na β-laktamaze, ekspresiona umetanja sadržana u ovim vektorima su pomerena u replikativni multikopijski vektor pBAD-Kan (J Bacteriol.1995 Jul.177(14):4121-30). Da bi se ovo postiglo, umetanja koja obuhvataju gene β-laktamaza, sa povezanim TEM promoterom i signalnim sekvencama, su PCR amplifkovana od njihovih odgovarajućih vektora pomoću prajmera E269 (ccgTCTAGAcggatggcctttttgcgtttc) (SEQ ID NO:15) i E202 (aatcGAATTCttactgaccattaacgcccaagc) (SEQ ID NO:16) za KPC2 konstrukt i E204 (aatcGAATTCttaacgctgccagtgctcaatc) (SEQ ID NO:17) za SHV12 konstrukt. Ovi fragmenti su zatim razloženi sa Xbal i EcoRI, i svaki je umetnut u pBAD18-kan koji je bio razložen sa istim enzimom da bi se obrazovao par multikopijskih vektora koji eksprimiraju KPC2 i SHV12 redom. Ovi vektori su transformisani u BW25113 pspB da bi se obrazovali sojevi NB27273-CDY0033 (koji eksprimiraju KPC2) iNB27273-CDY0030 (koji eksprimiraju SHV12). pBAD18-kan vektor takođe sadrži region TEM promotera i signalnu sekvencu, (ali mu nedostaje bilo koji intaktni geni β-laktamaze) i transformisani su u BW25113 pspB pomoću standardnih protokola da bi se obrazovao kontrolni soj NB27273-CDY0026. Ekspresija β-laktamaza je potvrđena verifikovanjem smanjene osetljivosti na primerno ispitivanje antibiotika koji su poznati supstrati KPC2 ili SHV12.

Ispitivanje osetljivosti

[0108] Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) su određene postupkom mikrorazblaženja bujona u skladu sa smernicama Clinical and Laboratories Institute (CLSI). Ukratko, sveže bakterijske kulture od preko noći su supendovane u sterilnom slanom rastvoru, i podešena na 0.5 McFarland-ov standard turbidnosti. Bakterijske suspenzije su zatim razblažene u katjonski podešenom Mueller-Hinton-ovom bujonu (MHB II; BBL) da bi se dobio krajnji inokulum od približno 5x10<5>jedinica koje formulišu kolonije (CFU)/mL. Glavna ploča antibiotika je pripremljena pri koncentraciji ekvivalentnoj koncentraciji koja je sto puta veća od najveće finalne koncentracije u 100% dimetilsulfoksidu (DMSO). Glavna ploča sa antibiotikom je zatim razblažena serijskim dvostrukim razblaženjem sa multikanalnom pipetom.

Dobijene serije razblaženja jedinjenja su bile razblažene 1:10 sterilnom vodom što je dovelo do 10% DMSO finalne koncentracije. Zapremina od 10 µL serija razblaženja leka je prenesena u ploče sa 96 bunarčića za ispitivanje. Ploče za ispitivanje su inokulisane sa 90 µL bakterijskih suspenzija i inkubirane na 35-37°C tokom 20 sati. Ploče za ispitivanje su očitane upotrebom čitača za mikrotiter ploče (Molecular Devices) na 600nm kao i vizuelnim praćenjem sa ogledalom za očitavanje. Najniža koncentracija jedinjenja koja sprečava vidljiv rast kako je snimljena kao MIC. Izvođenje ispitivanja je praćeno ispitivanjem aztreonama prema laboratorijskim sojevima kontrole kvaliteta u skladu sa smernicama CLSI.

[0109] Referentna jedinjenja: za poređenje, sledeća poznata monobaktamska jedinjenja su ovde upotrebljena:

Referentno jedinjenje 1: Aztreonam

[0110]

Referentno jedinjenje 2: Karumonam

[0111]

Referentno jedinjenje 3: BAL30072

[0112]

Referentno jedinjenje 4: Aicuris WO2013110643

[0113]

Tabela A: Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) protiv izogenih sojeva E. coli, koji nose različite determinante rezistentnosti.

Soj 1: E.coli NB27273-CDY0026 (matični)

Soj 2: E.coli NB27273-CDY0033 (KPC2)

Soj 3: E.coli NB27273-CDY0030 (SHV12)

[0114] Podaci u tabeli A pokazuju da jedinjenje X ima dobru antibakterijsku potentnost protiv E. coli, uključujući sojeve koji pokazuju jaku rezistentnost na nekoliko poznatih monobaktamskih i sulfaktamskih antibiotika.

[0115] Podaci o dodatnom dejstvu za jedinjenje X su obezbeđeni u sledećoj tabeli. Jedinjenje X je ispitivano na soju E. coli 25922 i E. coli koja sadrži KPC-2 (Soj 2 gore naveden, koji je poznati karbapenemaza od Klebsiella pneumoniae), i ispoljilo je ove inhibitorne koncentracije (MIC), u mg/mL.

Claims (15)

1. Patentni zahtevi 1. So (L)-arginina 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline.
2. 2. Liofilizovan čvrst oblik natrijumove soli 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline.
3. 3. Hidriran čvrst oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline.
4. 4. Hidriran čvrst oblik prema zahtevu 3, koji se sastoji od 50% ili više materijala trihidrata 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline.
5. 5. Postupak za pripremu hidriranog čvrstog oblika prema zahtevu 4, koji obuhvata dovođenje u kontakt 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline sa atmosferom čija je relativna vlažnost između 25% i 50% na temperaturi između 20°C i 30°C.
6. 6. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-4 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.
7. 7. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 1) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 6.6. 13.4, i 18.8.
8. 8. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 2) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.5, 19.3, i 20.0.
9. 9. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 3) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.3, 18.9, i 21.2.
10. 10. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 4) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.0, 8.6, 19.3 i 20.9.
11. 11. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 5) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 7.3, 9.3, i 27.8
12. 12. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 6) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 8.1, 9.2, i 12.8; i opciono dodatnim pikovima na 21.2 i 24.7.
13. 13. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi) ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 7) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 6.7, 7.3 i 20.3.
14. 14. Kristalni oblik 1-(((Z)-(1-(2-aminotiazol-4-il)-2-okso-2-(((3S,4R)-2-okso-4-((2-oksooksazolidin-3-il)metil)-1-sulfoazetidin-3-il)amino)etiliden)amino)oksi)ciklopropankarboksilne kiseline (oblik 8) koji ispoljava najmanje sledeće karakteristične pikove difrakcije X-zraka praha (izražene u stepenima 2θ): 6.2, 21.8 i 25.9.
15. 15. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-4, ili njegov kristalni oblik prema bilo kom od zahteva 7 do 14, za upotrebu u terapiji.