RS60837B1 - Proizvodnja enzima za ligno-celuloznu biomasu - Google Patents

Proizvodnja enzima za ligno-celuloznu biomasu

Info

Publication number
RS60837B1
RS60837B1 RS20201068A RSP20201068A RS60837B1 RS 60837 B1 RS60837 B1 RS 60837B1 RS 20201068 A RS20201068 A RS 20201068A RS P20201068 A RSP20201068 A RS P20201068A RS 60837 B1 RS60837 B1 RS 60837B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sugars
sugar
composition
enzyme
ligno
Prior art date
Application number
RS20201068A
Other languages
English (en)
Inventor
Stefano Paravisi
Laura Volpati
Chiara Giorcelli
Elisa Raccagni
Piero Ottonello
Francesco Cherchi
Original Assignee
Versalis Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Versalis Spa filed Critical Versalis Spa
Publication of RS60837B1 publication Critical patent/RS60837B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B16/00—Regeneration of cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/2488—Mannanases
    • C12N9/2494—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01037—Xylan 1,4-beta-xylosidase (3.2.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01058—Glucan 1,3-beta-glucosidase (3.2.1.58)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01074—Glucan 1,4-beta-glucosidase (3.2.1.74)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01136—Glucuronoarabinoxylan endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.136), i.e. feraxanase or feraxan-endoxylanase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

Opis
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0001] Enzimi su proteini koji kataliziraju biohemijske reakcije. Enzime proizvode gotovo sve žive ćelije domaćina. Neki enzimi koje proizvode mikroorganizmi iz klasa gljiva korisni su u postupcima pretvaranja ligno-celulozne sirovine u hemijske supstance. U ovim postupcima konverzije, enzimi se koriste kao katalizator u reakciji hidrolize složenih šećera, poput celuloze i hemiceluloze, u šećere sa nižom molekulskom masom.
[0002] Poznato je da hidroliza celuloze i hemiceluloze iz lignoceluloznih sirovina zahteva dobro izbalansiranu mešavinu enzima koja se sastoji od endoglukanaza, celobiohidrolaza, β-glukozidaza, ksilanaza, mananaza i različitih enzima koji deluju na bočne lance ksilana i manana. Proizvodnja enzima važan je korak u obradi biomasa-u-etanol jer su proizvodnja i primena enzima ili enzimske smeše trenutno među skupljim koracima obrade za biološki zasnovane puteve do iskorišćavanja ligno-celulozne biomase.
[0003] Enzimski sistemi gljive Trichoderma reesei koja razgrađuje biljke su najopsežnije istraženi i veruje se da su najrasprostranjeniji organizam koji se koristi za dobijanje komercijalnih enzimskih smeša. T. reesei proizvodi brojne enzime koji razgrađuju celulozu i hemicelulozu, čak i ako je vanćelijsko lučenje β-glukozidaze malo. Kako je poznato da je sadržaj aktivnosti βglukozidaze kritičan za postizanje visoke konverzije celuloze, rastvor enzima T. reesei se obično dopunjuje s β-glukozidazama radi dobijanja dobro izbalansiranog enzimskog rastvora i daljeg unapređenja hidrolize celuloze. U drugim slučajevima, komercijalni rastvori enzima ili enzimskih mešavina mogu se dobiti i korišćenjem enzima proizvedenih od strane drugih, gljiva koje su dobar proizvođač β-glukozidaze.
[0004] Enzimi za postupke konverzije ligno-celuloznih sirovina nastaju uzgajanjem ćelija domaćina na složenim podlogama koje sadrže čistu celulozu i/ili još skuplje izvore ugljenika.
[0005] Da bi se smanjila konačna cena proizvodnje enzima, učinjeno je mnogo pokušaja upotrebe supstrata koji su jeftiniji od čiste celuloze. Prethodno obrađene ligno-celulozne sirovine korišćene su kao supstrat. Mnoge istraživačke grupe su pokušale da proizvedu enzime ili enzimske smeše koristeći na neki način istu sirovinu koja se koristi za proizvodnju bio-etanola da bi smanjili troškove konačnih enzimskih mešavina.
[0006] Međutim, u prethodnim studijama na T. reesei Rut C30 ili Penicillium brasilianum nije zabeležena jasna veza između supstrata koji je korišćen za kultivaciju i hidrolitičkog učinka rezultirajućih enzima na pojedinim supstratima. Pregled rezultata dobijenih kultivacijom enzima na različitim izvorima ugljenika može se naći u Juhasz, T., Szengyel, Z., Reczey, K., Siika-Aho, M., Viikari, L. " Characterization of enzyme or enzyme mixtures and hemienzyme or enzyme mixtures produced by Trichoderma reesei on various carbon sources", (Process Biochem, 40, 3519-3525) i u Jorgensen, H., Olsson, L.,"Production of cellulases by Penicillium brasilianum IBT 20888: Effect of substrate on hydrolytic performance"(Enzyme Microb Technol, 38, 381-390). Jedan takav postupak opisan je u WO 2007/005918. Ovim postupkom se dodaje opisani prethodno tretirani ligno-celulozni supstrat kao induktor rasta enzima, dok se istovremeno koristi konstantno dodavanje glukoze kao hrana za rast organizma. Navedena svrha ove tehnologije je zamena glukozne hrane i čiste celuloze koji se danas koriste za proizvodnju enzima ili enzimskih mešavina u ćeliji domaćina, materijalom koji bi se mogao koristiti ili kao glavni izvor ugljenika i kao induktor za proizvodnju enzima. Prednost ovoga je što se troškovi proizvodnje smanjuju zahvaljujući upotrebi induktora (ligno-celulozne biomase) koji je lako dostupan i samim tim jeftiniji od čiste celuloze. Kao induktor, WO 2007/005918 koristi malu količinu biomase i neprestano dodaje glukozu kako bi nahranio organizam.
[0007] US 7,494,792 stavlja na uvid javnosti postupak za proizvodnju celulolitičkih i/ili hemicelulolitičkih enzima koji koriste ostatak etanolne fermentacije enzimskih hidrolizata celulozne ili ligno-celulozne biomase. Postupak se može integrisati u postupak za proizvodnju etanola iz celulozne ili ligno-celulozne biomase, pri čemu ostatak služi za proizvodnju enzima koji se koriste u enzimskoj hidrolizi prethodno obrađenog supstrata. Rastvor šećera dobijen za proizvodnju etanola hidrolizom odvojen je od nehidrolizovane čvrste frakcije, u osnovi sastavljene od lignina i koristi se za etanolnu fermentaciju. Glukoza je glavni šećer koji se povlači u ovom koraku. Ostatak etanolne fermentacije, nakon odvajanja etanola, koristi se kao izvor indukcionog ugljenika ili kao glavni izvor ugljenika za proizvodnju enzima.
[0008] Kao opšte razmatranje, postoji interesovanje za pretvaranje svih ili najrelevantnijih frakcija prethodno obrađene ligno-celulozne sirovine u vredne proizvode. Upotreba frakcije prethodno obrađene ligno-celulozne sirovine kao supstrata za proizvodnju enzima može umanjiti prinos biljke za postupak pretvaranja ligno-celulozne sirovine u korisne proizvode.
[0009] Pregled glavnih opcija koje su dostupne u prethodnoj obradi biomase nađene su u Chiaramonti D., Prussi M., Ferrero S., Oriani L., Ottonello P., Torre P. i Cherchi F. "Review of pretreatment processes for lignocellulosic ethanol production, and development of an innovative method" (Biomass and Bioenergy (2012) 46, 25-35). Posebno se ovaj rad odnosi na novi postupak koji koristi samo vodu i paru kao reakcioni medijum umesto postupaka autohidrolize i eksplozije parom. Što se tiče efekta prethodne obrade na enzimsku hidrolizu, navedeni novi postupak prethodne obrade postigao je prinose slične eksploziji parom na glukanima: međutim, ovo je dobijeno smanjujući stvaranje produkata razgradnje iz šećera, uglavnom iz C5 šećera. Ovi rezultati učinili su predloženi sistem prethodne obrade pogodnim za dalji razvoj i industrijalizaciju na pilot i industrijskoj razmeri. Zbog toga postoji potreba za razvojem postupka koji bolje koristi lignocelulozne prethodno obrađenu sirovinu za proizvodnju enzima.
REZIME
[0010] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak kako je definisan u patentnim zahtevima, a to je postupak za proizvodnju najmanje prvog enzima koji je sposoban da hidrolizuje prvu prethodno obrađenu ligno-celuloznu biomasu, koji obuhvata korak kultivisanja ćelije domaćina u kultivacionoj sredini siromašnoj u šećeru koje sadrži ćeliju domaćina, vodu i čvrstu kompoziciju, dobijenu iz druge prethodno tretirane ligno-celulozne biomase koja sadrži složeni šećer izabran iz grupe polimernih u vodi nerastvornih glukana i ksilana, i lignin; pri čemu je odnos ukupne količine složenih šećera (glukana i ksilana) prema ukupnoj količini lignina u čvrstoj kompoziciji manji od odnosa ukupne količine složenih šećera prema ukupnoj količini lignina u drugoj prethodno tretiranoj ligno-celuloznoj biomasi.
[0011] Poželjna tehnička rešenja metode iz ovog pronalaska su kao što je definisano u zavisnim patentnim zahtevima. Takođe je stavljeno na uvid javnosti da se kultivacija može obavljati pod uslovima siromašnim u jednostavnim šećerima sa količinom dodatog jednostavnog šećera ili šećerima u opsegu od 0 do 10% po masi kultivacione sredine siromašne u šećeru na suvoj bazi tokom dela vremena kultivacije koje je najmanje 50% vremena kultivacije.
[0012] Dalje je otkriveno da se čvrsta kompozicija može dobiti iz druge prethodno tretirane lignocelulozne biomase postupkom koji obuhvata korake hidrolize bar frakcije druge prethodno tretirane ligno-celulozne biomase u prisustvu katalizatora hidrolize, za proizvodnju hidrolizovane kompozicije koja sadrži čvrstu kompoziciju i rastvor vode i šećera rastvorljivih u vodi; i uklanjanje najmanje 50% rastvora vode i šećera rastvorljivih u vodi iz hidrolizovane kompozicije.
[0013] Takođe je otkriveno da se uklanjanje frakcije hidrolizovane kompozicije može izvesti najmanje jednom metodom koja se nalazi u grupi dekantacije, sedimentacije, centrifugiranja, filtracije, filtracije presovanjem i pranja.
[0014] Dalje je otkriveno da se čvrsta kompozicija može dobiti iz druge prethodno tretirane lignocelulozne biomase postupkom koji obuhvata korake hidrolize barem frakcije druge prethodno tretirane ligno-celulozne biomase u prisustvu katalizatora hidrolize, da se dobije hidrolizovana kompozicija koja sadrži šećere rastvorljive u vodi, složene šećere i lignin; konvertovanje barem frakcije šećera rastvorljivih u vodi u hidrolizovanoj kompoziciji da se dobije konvertovana kompozicija koja sadrži najmanje jedan proizvod dobijen od šećera i čvrsta kompozicija; i uklanjanja frakcije konvertovane kompozicije, pri čemu navedena frakcija sadrži najmanje frakciju najmanje jednog proizvoda dobijenog od šećera.
[0015] Takođe je otkriveno da se uklanjanje frakcije konvertovane kompozicije može obaviti najmanje jednom metodom koja se nalazi u grupi dekantacije, sedimentacije, centrifugiranja, filtracije, filtracije presovanjem, pranja, isparavanja i destilacije.
[0016] Dalje je otkriveno da katalizator hidrolize može da sadrži drugi enzim ili enzimsku mešavinu, i da može biti izabran iz grupe koja se sastoji od jona vodonika, organskih kiselina i neorganskih kiselina.
[0017] Takođe je otkriveno da konverzija hidrolizovane kompozicije može da obuhvati fermentaciju.
[0018] Dalje je otkriveno da najmanje jedan proizvod dobijen od šećera može sadržati etanol.
[0019] Dalje je otkriveno da deo vremena kultivisanja pod uslovima siromašnim u jednostavnim šećerima može biti izabran iz grupe koja se sastoji od: najmanje 75% vremena kultivacije, najmanje 85% vremena kultivacije, najmanje 90% vremena kultivacije, najmanje 95% vremena kultivacije i najmanje 98% vremena kultivacije.
[0020] Takođe je stvljeno na uvid javnosti da deo vremena kultivacije pod uslovima siromašnim u jednostavnim šećerima može biti isti kao i vreme kultivacije.
[0021] Dalje je otkriveno da je količina dodatog jednostavnog šećera ili šećera u opsegu između 0 do 5%, 0 do 2.5%, 0 do 2.0%, 0 do 1.0% mase kultivacione sredine na suvoj bazi. Takođe je otkriveno da možda neće biti dodat jednostavni šećer u kultivacionu sredinu siromašnu u šećerima.
[0022] Dalje je otkriveno da je najmanje prvi enzim sakupljen razdvajanjem kultivacione sredine siromašne u šećeru, u najmanje prikupljenu kompoziciju, koja sadrži najmanje frakciju prvog enzima i iscrpljenu kompoziciju, koja sadrži najmanje frakciju čvrstog ostatka čvrste kompozicije.
[0023] Takođe je otkriveno da se enzim ili enzimska smeša može dalje koristiti za hidrolizu prve ligno-celulozne biomase i prve ligno-celulozne biomase i druge prethodno obrađene lignocelulozne biomase, obe sadrže ligno-celuloznu biomasu dobijenu iz grupe koja se sastoji od trave istog roda ili poželjnije iste vrste trave.
[0024] Dalje je otkriveno da ukupna količina složenih šećera u iscrpljenoj kompoziciji može biti prisutna u rasponu odabranom iz grupe koja se sastoji od 0 do 30%, 0 do 20%, 0 do 15%, 0 do 10%, 0 do 7.5 %, 0 do 5%, 0 do 2.5% po masi, na suvoj bazi.
Kratak opis slika
[0025]
Slika 1a je grafikon prinosa hidrolize glukoze prema uporednim i radnim primerima. Slika 1b je grafikon prinosa hidrolize ksiloze prema uporednim i radnim primerima.
Detaljan opis
[0026] Otkriven je postupak za proizvodnju enzima, koji je naznačen činjenicom da se ćelije domaćina koje proizvode enzime uzgajaju u kultivacionoj sredini siromašnoj u šećerima. Kultivaciona sredina siromašna u šećerima sadrži ćelije domaćina, vodu i čvrstu kompoziciju koja je dobijena iz prethodno obrađene ligno-celulozne biomase; čvrsta kompozicija sadrži složene šećere i lignin, a naznačena je odnosom ukupne količine složenih šećera prema ukupnoj količini lignina manjim od odnosa ukupne količine složenih šećera prema ukupnoj količini lignina prethodno obrađene ligno-celulozne biomase iz koje je dobijena. Drugim rečima, čvrsta kompozicija u kultivacionoj sredini siromašnoj u šećerima dobijena je iz prethodno tretirane lignocelulozne biomase uklanjanjem frakcije, ali ne svih, složenih šećera sadržanih u prethodno obrađenoj ligno-celuloznoj biomasi. Čvrsta kompozicija u kultivacionoj sredini siromašnoj u šećerima sadrži nižu količinu složenih šećera na suvoj bazi u odnosu na prethodno tretiranu lignoceluloznu biomasu, ali još uvek sadrži složene šećere.
[0027] Šećeri koji su uklonjeni iz prethodno obrađene ligno-celulozne biomase mogu se pretvoriti u korisne hemijske supstance, poput etanola.
[0028] Enzimi koje proizvode ćelije domaćina mogu se zatim koristiti u hidrolizi ligno-celulozne biomase i prethodno obrađene ligno-celulozne biomase. Celuloza, hemiceluloza i lignin su tri glavna polimera koji čine ligno-celuloznu biomasu. Celuloza i hemiceluloza su polimerni šećeri.
[0029] U kontekstu ovog otkrića, jednostavni šećeri su monomerni šećeri i mogu se izabrati iz grupe koja se sastoji od glukoze, ksiloze, arabinoze, manoze, galaktoze i fruktoze. Treba napomenuti da mogu biti i drugi jednostavni šećeri koji nisu na prethodnoj listi. Jednostavni šećeri pripadaju grupi šećera rastvorljivih u vodi. Rastvorljivi šećeri su šećeri koji kada su u prisustvu određenog rastvarača, poput vode, u rastvaraču formiraju homogeni rastvor.
[0030] Jednostavni šećeri mogu direktno hraniti ćeliju domaćina, to jest ćelija domaćina ne treba koristiti enzime za metabolizam jednostavnih šećera.
[0031] Oligomerni šećeri su polimerni šećeri koji su rastvorljivi u vodi. Oligomerni šećeri su sačinjeni od više od jednog monomernog šećera. Oligomerne šećere metaboliše ćelija domaćina samo u prisustvu jednog ili više enzima, koji obično proizvodi ćelija domaćina.
[0032] Kompleksni šećeri su polimerni šećeri koji nisu rastvorljivi u vodi, kao što su u vodi nerastvorljivi glukani i ksilani, kao što je definisano u patentnom zahtevu 1. Glukani su klasa složenih šećera koji sadrže polimerne molekule glukoze sa različitim stepenom polimerizacije. Ksilani su klasa složenih šećera koja sačinjavaju polimerne molekule ksiloze različitih stepena polimerizacije.
[0033] Mnogi postupci pretvaranja ligno-celulozne biomase u hemijske proizvode pretvaraju samo deo složenih šećera i proizvode kompoziciju koja sadrži uglavnom lignin i preostali deo nepretvorenih složenih šećera kao sporedni proizvod. U nekim slučajevima, čak i ako je moguće dalje konvertovati složene šećere u prethodno obrađenoj ligno-celuloznoj biomasi, postupak konvertovanja se zaustavlja jer bi bilo ekonomski nepogodno. Kompozicija koja još uvek sadrži preostali deo složenih šećera često se spaljuje radi proizvodnje toplote, to je nisko vredna primena šećera koji se nalaze u ligno-celuloznoj biomasi.
[0034] Pronalazači su iznenađujuće otkrili da ćelije domaćina mogu biti kultivisane u kultivacionoj sredini siromašnoj u šećerima, koja sadrži čvrstu kompoziciju dobijenu uklanjanjem najmanje dela složenih šećera iz prethodno obrađene ligno-celulozne biomase i da će ćelije domaćina moći da koriste preostali deo složenih šećera kao izvor ugljenika. Pronalazači su takođe otkrili da proizvodnja enzima iz ćelije domaćina može biti uporediva ili povećana u odnosu na proizvodnju enzima dobijenog upotrebom skupljeg supstrata kao izvora ugljenika.
[0035] Jednostavne šećere, kao što su glukoza i ksiloza kojima se tradicionalno hrane ćelije domaćina, mogu biti delimično ili u potpunosti zamenjeni jeftinijom čvrstom kompozicijom.
[0036] Poželjno, kultivaciona sredina siromašna u šećerima ne sadrži, ili ima nekoliko, jednostavnih šećera.
[0037] Bilo koja metoda ili kombinacija metoda poznatih u struci i koje još treba da se izmisle, mogu se koristiti za dobijanje čvrste kompozicije iz druge prethodno obrađene ligno-celulozne biomase. Metode mogu uključivati upotrebu hemijskih, fizičkih, bioloških postupaka ili kombinaciju postupaka.
[0038] Poželjno, složeni šećeri se uklanjaju iz prethodno obrađene ligno-celulozne biomase i pretvaraju u proizvode dobijene od šećera, koji su vredni hemijski proizvodi. Postupak konverzije može se realizovati u jednom koraku ili u više koraka, odnosno proizvodi dobijeni od šećera mogu se dobiti konvertovanjem uklonjenih složenih šećera u intermedijerne proizvode.
[0039] U poželjnom tehničkom rešenju, čvrsta kompozicija se može dobiti hidrolizovanjem bar dela složenih šećera u prethodno obrađenoj ligno-celuloznoj biomasi.
[0040] Hidroliza je postupak koji pretvara složene šećere u šećere koji su rastvorljivi u void a oligomerne šećere u šećere sa nižom molekulaskom masom.
[0041] Hidroliza prethodno obrađene biomase vrši se u prisustvu katalizatora hidrolize i eventualno drugih aditiva koji mogu biti korisni ili potrebni za efikasnu hidrolizu. U kontekstu ovog pronalaska, katalizator hidrolize i aditivi mogu se nazivati "kompozicijom katalizatora hidrolize".
[0042] U poželjnom tehničkom rešenju, kompozicija katalizatora hidrolize sadrži enzim ili enzimsku smešu, a hidroliza je enzimska hidroliza.
[0043] U drugom poželjnom tehničkom rešenju, enzimska hidroliza je izvedena u skladu sa postupkom stavljenim na uvid javnosti u WO 2010/113130.
[0044] U drugom tehničkom rešenju, katalizator hidrolize može da sadrži kiselinu, a hidroliza je kisela hidroliza. Mogu se koristiti sve organske i neorganske kiseline koje su sposobne da sprovedu hidrolizu druge prethodno tretirane ligno-celulozne biomase. Kiselina takođe može biti prisutna u razblaženim rastvorima. Joni vodonika se takođe mogu koristiti u postupku hidrolize.
[0045] Hidroliza prethodno obrađene ligno-celulozne biomase može se javiti u tečnoj sredini. Tečna sredina se može dobiti dodavanjem malo tečnosti, poželjno vode ili koje sadrže vodu, u prethodno obrađenu ligno-celuloznu biomasu. Tečnosti se takođe mogu dodati u postupku predobrađivanja ligno-celulozne biomase. Na primer, u poželjnom tehničkom rešenju lignocelulozna biomasa se prethodno obrađuje natapanjem ligno-celulozne biomase u tečnost koja sadrži vodu, a zatim parom eksplodirajući natopljenu ligno-celuloznu biomasu. Tečnost se takođe može dodati u koraku hidrolize ili u kompoziciju katalizatora hidrolize. U slučaju enzimske hidrolize, u enzimskoj smeši može biti prisutna tečnost. U slučaju kisele hidrolize, u razblaženom rastvoru kiseline može biti prisutna tečnost.
[0046] Kako se hidroliza prethodno obrađene ligno-celulozne biomase odvija u tečnom okruženju, koje poželjno sadrži vodu, hidrolizovana kompozicija dobijena iz ligno-celulozne biomase će sadržavati rastvor vode i šećera rastvorljivih u vodi, i čvrstu kompoziciju, koja sadrži složene šećere koji nisu hidrolizovani u šećere rastvorljive u vodi. Čvrsta kompozicija hidrolizovane kompozicije sadrži i lignin koji je sadržan u prethodno obrađenoj ligno-celuloznoj biomasi. Lignin je takođe mogao biti modifikovan i/ili delimično pretvoren u druge komponente kao efekat postupaka predobrade i hidrolize.
[0047] Čak i ako hidrolizovana kompozicija može da sadrži druge komponente, za obim predmetnog pronalaska, hidrolizovana kompozicija sadrži najmanje rastvor vode i šećere rastvorljive u vodi i čvrstu kompoziciju, koja dalje sadrži složene šećere i lignin čvrste kompozicije.
[0048] Čvrsta kompozicija se može dobiti uklanjanjem najmanje 50% rastvora vode i šećera rastvorljivih u vodi iz hidrolizovane kompozicije. Treba primetiti da, iako je uklanjanje najveće količine rastvora vode i šećera rastvorljivih u vodi poželjno tehničko rešenje, neki šećeri koji su rastvorljivi u vodi mogu i dalje biti prisutni u čvrstoj kompoziciji. U drugom tehničkom rešenju, čvrsta kompozicija ne sadrži šećere rastvorljive u vodi.
[0049] Frakcija uklonjena iz hidrolizovane kompozicije, koja sadrži vodu i šećere rastvorljive u vodi, može dalje da sadrži i druge komponente hidrolizovane kompozicije, kao što je najmanje deo katalizatora hidrolize i aditiva ili jedinjenja koja su formirana tokom prethodne obrade ili hidrolize. Uklonjena frakcija može dalje da sadrži deo čvrste kompozicije koji sadrži lignin i složene šećere. U poželjnom tehničkom rešenju, sredina siromašna u šećerima sadrži pretežno svu čvrstu kompoziciju u hidrolizovanoj kompoziciji, a uglavnom je uklonjen sav rastvor vode i šećera rastvorljivih u vodi.
[0050] U drugom tehničkom rešenju, sredina siromašna u šećerima sadrži svu čvrstu kompoziciju u hidrolizovanoj kompoziciji i uklanja se sav rastvor vode i jednostavnih šećera.
[0051] Bilo koja metoda i kombinacija metoda poznatih u struci, pa čak i koje se još mogu izmisliti, mogu se koristiti za uklanjanje najmanje 50% rastvora vode i šećera rastvorljivih u vodi iz hidrolizovane kompozicije. Ove metode obuhvataju hemijske i fizičke obrade hidrolizovane kompozicije. Hemijske i fizičke obrade mogu se izvoditi sekvencijalno ili istovremeno.
[0052] Poželjne metode za uklanjanje najmanje dela hidrolizovane kompozicije obuhvataju dekantaciju, sedimentaciju, centrifugiranje, filtraciju, uključujući membransku filtraciju i filtraciju presovanjem i pranje.
[0053] Hidroliza bar jednog dela prethodno obrađene ligno-celulozne biomase i uklanjanje najmanje 50% rastvora vode i šećera rastvorljivih u vodi mogu se odvijati sekvencijalno ili bar delimično istovremeno. U jednom aspektu, najmanje deo jednostavnih šećera može se ukloniti, na primer membranskom filtracijom, dok hidroliza traje.
[0054] Čvrsta kompozicija može biti dalje obrađivana pre nego što se ćelija domaćina ubaci u kultivacionu sredinu siromašnu u šećerima za proizvodnju enzima. Čvrsta kompozicija se takođe može isprati, najbolje vodom, radi daljeg uklanjanja šećera koji su rastvorljivi u vodi ili drugih komponenti koje mogu uticati na ili smanjiti proizvodnju enzima. Ostale komponente potrebne za kultivaciju ćelija domaćina mogu se dodati u čvrstu kompoziciju ili u kultivacionu sredinu siromašnu u šećerima.
[0055] Deo rastvora vode i šećera rastvorljivih u vodi uklonjenih iz hidrolizovane kompozicije može se pretvoriti u korisne hemijske proizvode.
[0056] U drugom poželjnom tehničkom rešenju, čvrsta kompozicija se može dobiti hidrolizovanjem bar dela složenih šećera u prethodno obrađenoj ligno-celuloznoj biomasi u prisustvu katalizatora hidrolize da bi se dobila hidrolizovana kompozicija koja sadrži složene šećere i lignin i rastvor vode i šećere rastvorljive u vodi; zatim, konvertovanjem bar dela šećera rastvorljivih u vodi u hidrolizovanoj kompoziciji u konvertovanu kompoziciju koja sadrži najmanje jedan proizvod dobijen od šećera i čvrstu kompoziciju koja sadrži složene šećere i lignin; i uklanjanjem najmanje dela proizvoda dobijenog od šećera iz konvertovane kompozicije.
[0057] Sva razmatranja o hidrolizi prethodno navedena u ovoj specifikaciji takođe se primenjuju za ovo tehničko rešenje. Hidrolizovana kompozicija može biti podvrgnuta daljoj preradi u okviru pronalaska. Na primer, postupak može da poboljša konverziju šećera rastvorljivih u vodi u proizvode i može da uključuje fizičke i hemijske obrade, na primer, odvajanje, prečišćavanje, korekciju pH, razblaživanje i koncentraciju. Šećeri rastvorljivi u vodi u hidrolizovanoj kompoziciji konvertuju se, delimično ili u celosti, u konvertovanu kompoziciju, koja sadrži najmanje jedan proizvod dobijen od šećera.
[0058] Konverzija ili modifikacija bilo koje druge komponente hidrolizovane kompozicije takođe se može dogoditi tokom konverzije jednostavnih šećera. Konkretno, na složene šećere i lignin u hidrolizovanoj kompoziciji može da utiče postupak konverzije da se dobije čvrsta kompozicija koja sadrži složene šećere i lignin; drugačije rečeno, čvrsta kompozicija može biti složeni šećeri i lignin u hidrolizovanoj kompoziciji ili modifikacija složenih šećera i lignina u hidrolizovanoj kompoziciji. Konvertovana kompozicija može dalje da sadrži više proizvoda dobijenih iz šećera rastvorljivih u vodi.
[0059] Konverzija šećera rastvorljivih u vodi može se dogoditi u prisustvu katalizatora. Katalizator na kraju može da sadrži i druge aditive, koji mogu biti korisni ili neophodni za
[0060] efikasnu konverziju. U kontekstu ovog pronalaska, katalizator i aditivi mogu biti označeni kao "kompozicija katalizatora".
[0061] Katalizator može biti bilo koje sredstvo koje pospešuje konverziju šećera rastvorljivih u vodi u najmanje jedag proizvod koji potiče od šećera. Katalizator može biti neorgansko, organsko ili biološko sredstvo.
[0062] Čak i ako se bilo koji postupak može koristiti za konverziju najmanje dela hidrolizovane kompozicije, fermentacija je poželjan postupak, a proizvod dobijen šećerom je fermentisani proizvod. Fermentacija je svaki postupak pretvaranja jednostavnih šećera u fermentisane proizvode u prisustvu mikroorganizama ili smeše mikroorganizama.
[0063] Poželjni mikroorganizam za pretvaranje najmanje dela hidrolizovane kompozicije je kvasac.
[0064] Kvasac obično označava jednoćelijsku, uglavnom askomicetnu gljivicu koja obično ima malo micelijuma ili uopšte nema, a koja se obično razmnožava bespolno tako što se stapaju sa ćerkama ćelijama koje su često vezane i koje mogu da fermentišu ugljene hidrate u alkohol i ugljen dioksid. Poželjno, kvasac pripada rodu Saccharomyces. Vrste Saccharomyces su definisane filogenetskim putem od strane Kurtzman (2003) FEMS Yeast Research 3: 417-432, i uključuju S. cerevisiae, S. paradoxus, S. ikatae, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. pastorianus i S. bayanus.
[0065] U zavisnosti od katalizatora ili mikroorganizma, mogu se proizvesti različiti proizvodi koji su dobijeni od šećera. Čak i ako se mogu proizvesti bilo koji drugi proizvodi koji su dobijeni od šećera, u poželjnom tehničkom rešenju proizvod dobijen od šećera je etanol. Hidroliza složenih šećera u hidrolizovanu kompoziciju i pretvaranje najmanje dela šećera rastvorljivog u vodi u hidrolizovanoj kompoziciji u bar jedan proizvod dobijen od šećera može se dogoditi sekvencijalno ili istovremeno. U poželjnom tehničkom rešenju, enzimska hidroliza i fermentacija u etanol se odvijaju istovremeno, a postupak je poznat u struci kao simultana saharifikacija i fermentacija.
[0066] Pretvaranje najmanje dela šećera rastvorljivih u vodi u hidrolizovanu kompoziciju može se desiti u tečnom okruženju. Tečno okruženje se može dobiti dodavanjem neke tečnosti, poželjno vode ili tečnosti koja sadrži vodu, u hidrolizovanu kompoziciju. Tečnosti takođe mogu da budu prisutne u hidrolizovanoj kompoziciji ili u kompoziciji katalizatora.
[0067] Kako se u tečnom okruženju, koje poželjno sadrži vodu, dešava konverzija najmanje dela šećera koji su rastvorljivi u void, konvertovana kompozicija će obično sadržati najmanje jedan proizvod dobijen od šećera, vodu i čvrstu kompoziciju, koja sadrži složene šećere i lignin. Lignin i složeni šećeri u hidrolizovanoj kompoziciji takođe se mogu modifikovati i/ili delimično pretvoriti u druge komponente kao efekat postupka hidrolize i konverzije. Šećeri rastvorljivi u vodi koji nisu konvertovani u proizvode mogu takođe da budu sadržani u konvertovanoj kompoziciji.
[0068] Za obim predmetnog pronalaska, konvertovana kompozicija sadrži najmanje jedan proizvod dobijen od šećera i čvrstu kompoziciju koja sadrži složene šećere i lignin. Barem jedan proizvod dobijen od šećera može biti rastvorljiv ili nerastvorljiv u konvertovanoj kompoziciji. U poželjnom tehničkom rešenju, proizvod dobijen od šećera je rastvorljiv u konvertovanoj kompoziciji. Na primer, etanol je rastvorljiv u fermentisanoj kompoziciji. Čvrsta kompozicija se dobija uklanjanjem dela konvertovane kompozicije koja sadrži najmanje deo proizvoda dobijenog od šećera. Treba napomenuti da iako uklanjanje najveće količine proizvoda dobijenog od šećera koliko je moguće je poželjno tehničko rešenje, neki proizvodi dobijeni od šećera i dalje mogu biti prisutni u čvrstoj kompoziciji. U drugom tehničkom rešenju, čvrsta kompozicija ne sadrži proizvod(e) dobijene od šećera.
[0069] Frakcija uklonjena iz konvertovane kompozicije može dalje da sadrži i druge komponente iz konvertovane kompozicije, poput šećera rastvorljivih u vodi koji nisu konvertovani, vode, najmanje deo katalizatora i aditiva. Dalje može da sadrži deo čvrste kompozicije koji sadrži lignin i složene šećere iz konvertovane kompozicije. U poželjnom tehničkom rešenju, sredina za kultivaciju siromašna u šećerima sadrži pretežno svu čvrstu kompoziciju u konvertovanoj kompoziciji, a deo uklonjen iz konvertovane kompozicije sadrži uglavnom sve tečnosti u konvertovanoj kompoziciji.
[0070] U još jednom tehničkom rešenju, sredina za kultivaciju siromašna u šećerima sadrži svu čvrstu kompoziciju u konvertovanoj kompoziciji, a deo uklonjen iz konvertovane kompozicije sadrži sve tečnosti u konvertovanoj kompoziciji.
[0071] Bilo koja metoda i kombinacija metoda koje su poznate u struci i koje se još mogu izmisliti mogu se koristiti za uklanjanje dela konvertovane kompozicije, koji sadrži najmanje jedan proizvod dobijen od šećera. Ove metode obuhvataju hemijske i fizičke obrade konvertovane kompozicije. Hemijske i fizičke obrade mogu se izvoditi sekvencijalno ili istovremeno.
[0072] Poželjne metode za uklanjanje bar dela konvertovane kompozicije obuhvataju dekantaciju, sedimentaciju, centrifugiranje, filtraciju, uključujući membransku filtraciju i filtraciju presovanjem, pranje, isparavanje i destilaciju.
[0073] U poželjnom tehničkom rešenju, konvertovani proizvod je etanol, a čvrsta kompozicija je dobijena iz konvertovane kompozicije isparavanjem ili destilacijom etanola i uklanjanjem većine delova tečnosti u konvertovanoj kompoziciji, najmanje metodom u grupi dekantacije, sedimentacije, centrifugiranja, filtracije, uključujući membransku filtraciju i filtraciju presovanjem i pranja.
[0074] Konvertovanje šećera rastvorljivih u vodi u hidrolizovanoj kompoziciji u bar jedan proizvod dobijen od šećera i uklanjanje dela konvertovane kompozicije koja sadrži najmanje deo konvertovanog proizvoda može se dogoditi barem delimično istovremeno. U jednom aspektu, konvertovani proizvod je etanol i može se ukloniti, na primer isparavanjem ili destilacijom, dok su jednostavni šećeri u hidrolizovanoj kompoziciji fermentisani u etanol.
[0075] U drugom tehničkom rešenju, hidroliza prethodno tretirane ligno-celulozne biomase, konvertovanje najmanje dela šećera rastvorljivih u vodi i uklanjanje dela konvertovane kompozicije događaju se bar delimično istovremeno. U poželjnom tehničkom rešenju, konvertovani proizvod je etanol i može se ukloniti, na primer isparavanjem i destilacijom, tokom istovremene saharifikacije i fermentacije.
[0076] Čvrsta kompozicija može biti dalje obrađivana pre nego što se ubace ćelije domaćina u kultivacionu sredinu siromašnu u šećerima za proizvodnju enzima. Čvrsta kompozicija se takođe može isprati, poželjno vodom, za uklanjanje dodatnih šećera koji su rastvorljivi u vodi ili drugih komponenti koje mogu uticati na ili smanjiti proizvodnju enzima.
Postupak proizvodnje enzima
[0077] U struci je dobro poznato kako se proizvode enzimi ili enzimska smeša u ćeliji domaćina gljivičnog porekla, kao što su filamentozne gljive ili bakterijskog porekla. Postupak razvoja ovog pronalaska može biti dobro poznat postupak, osim što hrana sadrži čvrstu kompoziciju dobijenu iz prethodno tretirane ligno-celulozne biomase i koja ima ukupnu količinu složenih šećera manju od ukupne količine složenih šećera u prethodno tretiranoj ligno-celuloznoj biomasi. U poželjnom tehničkom rešenju, ishrana jednostavnim šećerima je ograničena tokom kultivacije.
[0078] Postupci proizvodnje enzima dobro su poznati u stanju tehnike. U kontekstu ovog predmetnog pronalaska, enzim ili enzimska smeša je poželjno vanćelijski enzim ili enzimska smeša koja se iz ćelije domaćina izlučuje u kultivacionu sredinu. Alternativno, enzim ili enzimska mešavina je unutarćelijska.
[0079] Ćelija domaćina sposobna da proizvodi enzim ili enzimsku smešu uzgaja se u preciznim kulturološkim uslovima, pri određenoj brzini rasta. Kada se kultura ćelije domaćina uvede u kultivacionu sredinu, inokulirana kultura prolazi kroz više faza. U početku ne dolazi do rasta. Ovaj period se naziva fazom zastoja i može se smatrati periodom adaptacije. Tokom sledeće faze koja se naziva "eksponencijalna faza" stopa rasta kulture ćelija domaćina postepeno raste. Nakon perioda maksimalnog rasta stopa prestaje i kultura prelazi u stacionarnu fazu. Nakon dužeg perioda, kultura prelazi u fazu smrti i broj održivih ćelija opada. Kada će se u fazi rasta enzim ili enzimska mešavina od interesa eksprimirati, zavisi od enzima koji su od interesa i ćelije domaćina. Enzim ili enzimska smeša mogu se u jednom aspektu eksprimirati u eksponencijalnoj fazi. U drugom tehničkom rešenju, enzim ili enzimska smeša mogu se proizvesti u prelaznoj fazi između eksponencijalne faze i stacionarne faze. Enzim ili enzimska smeša takođe se može, po pronalasku, eksprimirati u stacionarnoj fazi i/ili neposredno pre sporulacije. Prema pronalasku, enzim ili enzimska smeša se takođe mogu proizvesti u više od jedne od gore navedenih faza.
[0080] Drugim rečima, prema pronalasku ćelija domaćina se uzgaja u pogodnoj sredini i pod uslovima koji omogućavaju da se bar jedan enzim ili enzimska smeša eksprimira, poželjno izlučuje i opciono obnavlja. Dok je gore pomenuto, rast ćelija domaćina ima mnogo tehničkih faza, za potrebe ove specifikacije, ove faze su grupisane u termin kultivacija. Kultivacija ćelije domaćina vrši se u kultivacionoj sredini siromašnoj u šećerima, a sadrži čvrstu kompoziciju dobijenu iz prethodno tretirane ligno-celulozne biomase uklanjanjem bar dela složenih šećera. Kultivaciona sredina siromašna u šećerima može dalje da sadrži dodatni izvor ugljenika, izvor azota i dodatne soli potrebne za metabolizam mikroorganizama.
[0081] Prema poželjnom tehničkom rešenju, prethodno tretirana ligno-celulozna biomasa je prethodno tretirana natapanjem/ispiranjem i zatim parnim eksplodiranjem kako je opisano u WO 2010/113129.
[0082] Posle kultivacije, enzim ili enzimska mešavina se može opciono obnoviti koristeći postupke dobro poznate u stanju tehnike. Na primer, oporavak vanćelijskih enzima ili enzimskih mešavina iz kultivacione sredine siromašne u šećerima može se obaviti korišćenjem uobičajenih postupaka koji uključuju, ali ne ograničavaju se na, centrifugiranje, filtraciju, ekstrakciju, sušenje raspršivanjem, isparavanje ili taloženje. Postupci oporavka unutarćelijskog enzima ili enzimske smeše su takođe dobro poznati u stanju tehnike.
[0083] Barem u kontekstu ovog pronalaska, termin "kultivacija" označava bilo koji postupak proizvodnje enzima ili enzimske smeše koristeći masenu kulturu koja se sastoji od jedne ili više ćelija domaćina. Ovaj pronalazak je koristan za proizvodnju u industrijskom obimu, na primer, sa sredinom za gajenje od najmanje 50 litara, poželjno najmanje 5 litara, poželjnije najmanje 1 litrom.
[0084] Enzim ili enzimska smeša može da uključuje, ali nije ograničena na bilo koju od onih koja pripadaju grupi enzima ili enzimske smeše koja sadrži endoglukanaze (endo-1,4-β-D-glukanaza), celobiohidrolaze ili egzoglukanaze (egzo-1,4-β-D-glukanaza), b-glukozidaza (1,4-β-D-glukozidaza), endo-1,4-β-ksilanaza, endo-1,4-β-mananaza, 1,4-β-ksilozidaza i 1,4-β-manozidaza.
[0085] Postupak pronalaska može se izvesti kao serijski (eng. batch), sa serijskim dodavanjem (eng. feed-batch), sa ponovljenim serijskim dodavanjem (repeted feed-batch) ili kontinuiran postupak.
[0086] Postupak ovog pronalaska može se izvesti aerobno ili anaerobno. Neki enzimi nastaju potapanjem, a neki površinskom kultivacijom. Prema pronalasku je poželjna submerzna kultivacija.
[0087] Prema tome, prema jednom aspektu, pronalazak, kao što je definisano u patentnim zahtevima, odnosi se na postupke proizvodnje enzima ili enzimske smeše u ćeliji domaćina koji obuhvata kultivaciju navedene ćelije domaćina koja je sposobna da proizvodi enzim ili enzimsku smešu pod uslovima pogodnim za proizvodnju enzima ili enzimske smeše, kao što je enzim ili enzimska smeša, pri čemu se čvrsta kompozicija dobijena iz prethodno tretirane ligno-celulozne biomase koristi za rast ćelije domaćina pod uslovima siromašnim u jednostavnim šećerima, u kojima je količina dodatnog jednostavnog šećera ili šećera u opsegu od 0 do 10% po masi kultivacione sredine siromašne u šećerima na suvoj bazi tokom dela vremena kultivacije koji je najmanje 50% vremena kultivacije. Vreme kultivacije predstavlja količinu vremena izmerenu od dodavanja zapremine predkulture ćelija domaćina kultivacionoj sredini siromašnoj u šećeru do sakupljanja, uklanjanja ili odvajanja enzima ili enzimske smeše iz kultivacione sredine siromašne šećerom. U slučaju višestrukog uklanjanja, vreme kultivacije se završava u trenutku kada je završeno poslednje uklanjanje prvog enzima ili enzimske smeše.
Količina čvrste kompozicije dobijene iz prethodno tretirane ligno-celulozne biomase koja je prisutna u šećerom-siromašnoj kultivacionoj sredini treba da bude dovoljna za rast ćelije domaćina da bi se proizveo enzim ili enzimska smeša.
[0088] Izraz kultivaciona sredina siromašna u jednostavnim šećerima uglavnom znači da više od 50% mase hrane ćelije domaćina potiče iz čvrste kompozicije dobijene iz druge prethodno obrađene ligno-celulozne biomase, a ne od dodatih jednostavnih šećera. Kultivaciona sredina siromašna u jednostavnim šećerima je kada je količina opcionih jednostavnih šećera dodatih u postupak, ako ih uopšte ima, u opsegu od 0 do 10% po masi kultivacione sredine siromašne u šećerima. Poželjnije, dodati opcioni jednostavni šećeri bi trebalo da budu u opsegu od 0 do 5% po masi kultivacione sredine siromašne u šećerima na suvoj bazi, pri čemu je 0 do 2.5% po masi još poželjnije, pri čemu je 0 do 2.0% najpoželjnije (ako se uopšte dodaju jednostavni šećeri). U najboljem slučaju, ne dodaju se jednostavni šećeri što je savršeno stanje siromašno u jednostavnim šećerima. Uz to, fraza dodatih jednostavnih šećera znači da bi mogao biti dodat jedan ili više jednostavnih šećera. U jednom tehničkom rešenju je opcionalni jednostavni šećer prisutan, ali pri manjem od naznačenog procenta.
[0089] Uslove siromašne u jednostavnim šećerima treba održavati najmanje deo vremena kultivacije. Kvantitativno izraženo, uslove siromašne u jednostavnim šećerima trebalo bi održavati najmanje 50% vremena kultivacije, pri čemu je 75% poželjnije, 85% je još poželjnije, a 95% je još poželjnije sa 99 i 100% kultivacije je najpoželjnije vreme. 100% vremena kultivacije je kada je bar deo vremena kultivacije jednak vremenu kultivacije.
Podloga
[0090] Podloge kao izvor ugljenika koje se obično koriste kao hrana za proizvodnju enzima ili enzimskih mešavina uključuju glukozu ili slične šećere, pod uslovom da je njihova potrošnja u odnosu na potrošnju složenih šećera unutar određenih granica. Podloge kao izvor azota, stimulatori rasta i slično mogu se dodati da poboljšaju kultivaciju i proizvodnju enzima ili enzimskih smeša. Izvori azota uključuju ureu, amonijačne soli (na primer NH4Cl ili NH4SO4) i peptide. Proteaza se može koristiti, na primer, za digestiju proteina za proizvodnju slobodnog amino azota (FAN – free amino nitrogen). Takve slobodne aminokiseline mogu funkcionisati kao nutrijent za ćeliju domaćina i na taj način povećati rast i proizvodnju enzima ili enzimskih mešavina. Poželjni stimulatori za rast uključuju vitamine i minerale. Primeri vitamina uključuju multivitamine, biotin, pantotenat, nikotinsku kiselinu, mezo-inozitol, tiamin, piridoksin, para-aminobenzoevu kiselinu, folnu kiselinu, riboflavin i vitamine A, B, C, D i E. Primeri minerala uključuju minerale i mineralne soli koje mogu obezbeđivati nutrijente koji sadrže P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn i Cu.
[0091] Čista celuloza, koja se obično koristi kao induktor (i izvor ugljenika) u postupcima proizvodnje enzima ili enzimskih mešavina, zamenjena je čvrstom kompozicijom dobijenom iz prethodno tretirane ligno-celulozne biomase; kompozicija je poželjno detoksifikovana ako je kiselinom prethodno tretirana, na primer ispiranjem.
[0092] Čvrsta kompozicija je izvor ugljenika i može se dodati u šećerom siromašnu kultivacionu sredinu, zajedno sa izvorom ugljenika, ali može da se dodaje i odvojeno od izvora ugljenika. Prema pronalasku, čvrsta kompozicija se može dodati u šećerom siromašnu kultivacionu sredinu bilo pre inokulacije, istovremeno sa inokulacijom ili posle inokulacije kulture ćelije domaćina u količini koja najmanje odgovara količini dostupnih složenih šećera potrebnih za rast ćelije domaćina. Kada se čvrsta kompozicija doda tokom kultivacije, vrši se novo izračunavanje količine opciono dodatih jednostavnih šećera ili odnosa opcionih jednostavnih šećera prema ligno-celuloznoj biomasi. Iako količina jednostavnih šećera možda nije bila dovoljno mala tokom početnog dela kultivacije, dodavanjem čvrste kompozicije u šećerom siromašnu kultivacionu sredinu, količina opcionih dodatih jednostavnih šećera bi pala u određene raspone, barem tokom vremena koje preostaje u vremenu kultivacije.
[0093] Osoba vešta u oblasti tehnike može lako da odredi kada treba dodati i koju količinu čvrste kompozicije prema postupku pronalaska. Tokom vremenskog perioda kultivacije, čvrstu kompoziciju obično konzumira ćelija domaćina i drži se u prethodno utvrđenim granicama.
[0094] Kao što je gore spomenuto, upotrebljava se čvrsta kompozicija na isti način na koji se glukoza koristi u poznatim postupcima proizvodnje enzima ili enzimskih mešavina.
Sakupljanje enzima
[0095] U postupku stavljenom na uvid javnosti, čvrsta kompozicija se koristi za hranjenje ćelija domaćina u postupku proizvodnje enzima. Čvrsta kompozicija je dobijena iz prethodno tretirane ligno-celulozne biomase, pri čemu navedena čvrsta kompozicija sadrži složene šećere i lignin. Dok se ćelije domaćina hrane složenim šećerima u čvrstoj kompoziciji, čvrsti ostatak čvrste kompozicije formira se iz najmanje dela čvrste kompozicije u šećerom-siromašnoj kultivacionoj sredini. Čvrsti ostatak sadrži najmanje deo lignina čvrste kompozicije i može da sadrži deo složenih šećera čvrste kompozicije. Lignin je može biti modifikovan u koraku gajenja ćelija domaćina.
[0096] Enzimi proizvedeni kultivacijom ćelija domaćina u šećerom-siromašnoj kultivacionoj sredini mogu se sakupljati razdvajanjem šećerom-siromašne kultivacione sredine, u najmanje dva dela, sakupljena kompozicija, koja sadrži najmanje deo enzima i iscrpljenua kompozicija, koja sadrži najmanje deo čvrstog ostatka čvrste kompozicije. Čvrsti ostatak može da sadrži većinu ćelija domaćina.
[0097] Pod "najmanje dva dela" podrazumeva se da se šećerom-siromašna kultivaciona sredina može odvojiti u više od dva dela, a ovo tehničko rešenje je unutar obima pronalaska.
[0098] Sakupljena kompozicija može dalje da sadrži ostale komponente šećerom-siromašne kultivacione sredine, kao što su na primer voda i aditivi sadržani u čvrstoj kompoziciji i/ili šećerom-siromašnoj kultivacionoj sredini i/ili dodati u kultivaciju ćelije domaćina. Dalje može da sadrži neku čvrstu kompoziciju i neki čvrsti ostatak. U poželjnom tehničkom rešenju, sakupljena kompozicija ne sadrži, ili ima vrlo malo, čvrstih jedinjenja. U drugom poželjnom tehničkom rešenju, obrađena kompozicija sadrži sve, ili skoro sve, proizvedene enzime.
[0099] Iscrpljena kompozicija sadrži najmanje deo čvrstog ostatka čvrste kompozicije i može dalje da sadrži i druge komponente šećerno-osiromašene kultivacione sredine, kao što su na primer voda i aditivi koji se nalaze u šećerom-siromašnoj kultivacionoj sredini i/ili se dodaju u korak kultivacije ćelija domaćina. Dalje može sadržati neke od enzima. U poželjnom tehničkom rešenju, iscrpljena kompozicija ne sadrži, ili ima vrlo malo, enzima. U drugom poželjnom tehničkom rešenju, iscrpljena kompozicija sadrži ceo ili skoro ceo, čvrsti ostatak čvrste kompozicije.
[0100] Bilo koji postupak i kombinacija metoda koje su poznate u struci, pa čak i da se još pronalaze, mogu se koristiti za odvajanje šećerom-siromašne kultivacione sredine u najmanje sakupljenoj kompoziciji i iscrpljenoj kompoziciji. Ove metode sadrže hemijske i fizičke obrade hidrolizovane kompozicije. Hemijske i fizičke obrade mogu se izvoditi sekvencijalno ili istovremeno.
[0101] Poželjni postupci za razdvajanje šećerom-siromašne kultivacione sredine u najmanje sakupljenoj kompoziciji i iscrpljenoj kompoziciji sadrže najmanje metodu u grupi centrifugiranja, filtracije, dijalize, ispiranja i filtriranja pod prsom.
[0102] Sakupljena kompozicija i iscrpljena kompozicija mogu se podvrgnuti bilo kojem daljem postupku u okviru pronalaska. Na primer, odvajanje, prečišćavanje, korekcije pH, razblaživanje, koncentracija.
Ligno-celulozna biomasa
[0103] Uglavnom, prirodna ili prirodno prisutna ligno-celulozna biomasa može se opisati kako sledi.
[0104] Pored skroba, tri glavna sastojka u biljnoj biomasi su celuloza, hemiceluloza i lignin, koji se uobičajeno nazivaju opštim pojmom ligno-celuloza. Biomasa koja sadrži polisaharide kao generički izraz uključuje i skrob i ligno-celulozne biomase. Stoga neke vrste sirovina mogu biti biljna biomasa, biomasa koja sadrži polisaharid i ligno-celulozna biomasa.
[0105] Biomase koje sadrže polisaharide uključuje bilo koji materijal koji sadrži polimerne šećere, npr. u obliku skroba, kao i rafinisanog skroba, celuloze i hemiceluloze.
[0106] Odgovarajuće vrste biomasa koje se javljaju u prirodi za izvođenje pronalaska za koji se traži zaštita mogu obuhvatati biomase dobijene iz poljoprivrednih useva izabranih iz grupe koja se sastoji od zrna koja sadrže skrob, rafinisanog skroba; kukuruzne stočne hrane, bagase, slame npr. od pirinča, pšenice, raži, zobi, ječma, repice, šećerne trske; mekog drveta, npr. Pinus sylvestris, Pinus radiate; tvrdog drveta, npr. Salix spp. Eucalyptus spp.; lukovica, npr. cvekle, krompira; žitarica npr. pirinča, pšenice, raži, zobi, ječma, repice, šećerne trske i kukuruza; otpadnog papira, frakcije vlakana od prerade biogasa, đubriva, ostataka od prerade palminog ulja, čvrstog komunalnog otpada ili slično. Iako su eksperimenti ograničeni na nekoliko primera nabrojane liste iznad, smatra se da je pronalazak primenljiv na sve, jer je karakterizacija prevashodna na jedinstvene karakteristike lignina i površine.
[0107] Sirovina ligno-celulozne biomase koja se koristi za dobijanje kompozicije je poželjno iz porodice koja se obično naziva travama. Pravo ime je porodica poznata pod nazivom Poaceae ili Gramineae u klasi Liliopsida (monokoti) cvetajućih biljaka. Biljke iz ove porodice obično se nazivaju travama, ili, kako bi ih razlikovali od ostalih graminoida, pravim travama. Bambus je takođe uključen. Postoji oko 600 rodova i oko 9.000-10.000 ili više vrsta trava (Kew index of World Grass Species).
[0108] Poaceae uključuje osnovna hranljiva zrna i useve žitarica koji se uzgajaju širom sveta, travnjake i stočne trave, i bambus. Poaceae obično imaju šuplje stabljike zvane debla, koje su utaknute (čvrsto) na intervalima nazvanim čvorovima, tačkama duž debla na kojima lišće raste. Listovi trava su obično naizmenični, dvoredni (u jednoj ravni) ili retko spiralni i paralelno venirani. Svaki list je diferenciran u donji plašt koji grli stabljiku na distanci i lisku sa ivicama obično celim. Lisne ploče mnogih trava učvršćene su fitolitima od silicijum dioksida, što pomaže u sprečavanju ispaše životinja. Kod nekih trava (poput Miskantusa) ovo čini ivice lisne ploče dovoljno oštrim da režu ljudsku kožu. Membranozni dodatak ili ivica dlaka, nazvan ligula, nalazi se na mestu spajanja između plašta i lisne ploče, sprečavajući da voda ili insekti prodru u omotač.
[0109] Liske trave rastu u osnovi liske, a ne sa izduženih vrhova stabljike. Ta niska tačka rasta evoluirala je kao odgovor na ispašu životinja i omogućava ispašu trave ili košenje bez ozbiljnih oštećenja biljke.
[0110] Cvetovi Poaceae su karakteristično poređani u klasiće, pri čemu svaki klasić ima jedan ili više cvetova (klasići su dalje grupisani u metlice ili klasove). Klasić se sastoji od dva (ili ponekad manje) priperka u osnovi, koja se nazivaju glume, a zatim jednog ili više cvetića. Cvetić se sastoji od cveta okruženog sa dva priperka zvana lema (spoljašnji) i palea (unutrašnji). Cvetovi su obično hermafroditni (kukuruz, jednodomni, je izuzetak), a oprašivanje je gotovo uvek anemofilno. Cvetni omotač je sveden na dve plevičice, zvane lodikule, koje se šire i skupljaju šireći lemu i paleu; one se generalno tumače kao modifikovani čašični listić.
[0111] Plod Poaceae je krupa u kojoj se semenski omotač spaja sa plodovim zidom i na taj način se ne može odvojiti od njega (kao u kukuruznom zrnu).
[0112] Postoje tri opšte klasifikacije načina rasta u travama; buketni tip (takođe zvane caespitosa), stoloniferozni i rizomatozni.
[0113] Uspeh trava leži delimično u njihovoj morfologiji i postupcima rasta, a delom i u njihovoj fiziološkoj raznolikosti. Većina trava se deli na dve fiziološke grupe, koristeći C3 i C4 fotosintetičke puteve za fiksaciju ugljenika. C4 trave imaju foto-sintetski put povezan sa Krancovom specijalizovanom anatomijom lista koja ih posebno prilagođava toplim klimama i atmosferi sa malo ugljen-dioksida.
[0114] C3 trave se nazivaju "travama hladne sezone" dok se biljke C4 smatraju "travama tople sezone". Trava može biti ili jednogodišnja ili višegodišnja. Primeri jednogodišnje hladne sezone su pšenica, raž, jednogodišnja livadska trava - eng. bluegrass (jednogodišnja vlasnjača -meadowgrass, Poa annua i zob). Primeri višegodišnje hladne sezone su ježevica (eng. orchard grass, cocksfoot, Dactilis glomerata), vijuk (Festuca spp), prava livadarka i višegodišnji ljuljevi (Lolium perenne). Primeri jednogodišnje tople sezone su kukuruz, sudanska trava i biserno proso. Primeri višegodišnje tople sezone su andropogon, indijanska trava, bermudska trava i travnata trava.
[0115] Jedna klasifikacija familija trava prepoznaje dvanaest podfamilija: To su 1) anomochlooideae, mala loza trava širokog-lišća koje uključuju dva roda (Anomochloa, Streptochaeta); 2) Pharoideae, mala loza trava koja uključuje tri roda, uključujući Pharus i Leptaspis; 3) Puelioideae mala loza koji uključuje afrički rod Puelia; 4) Pooideae koji uključuje pšenicu, ječam, zob, bezosni vlasen (Bronnus) i trsku-travu (Calamagrostis); 5) Bambusoideae koji uključuje bambus; 6) Ehrhartoideae, koja uključuje pirinač i divlji pirinač; 7) Arundinoideae, koja uključuje džinovsku trsku i običnu trsku; 8) Centothecoideae, mala podfamilija od 11 rodova koja se ponekad uključuje u Panicoideae; 9) Chloridoideae, uključujući ljubavne trave (Eragrostis, oko 350 vrsta, uključujući tef), sporobolus (Sporobolus, oko 160 vrsta), prstasto proso (Eleusine coracana (L.) Gaertn.), i muhlenbergia (Muhlenbergia, oko 175 vrsta); 10) Panicoideae, uključujući proso, kukuruz, sirak, šećernu trsku, većinu prosa, fonio i andropogon; 11) Micrairoideae i 12) Danthoniodieae, uključujući travu pampasa; sa Poa koji je rod od oko 500 vrsta trava, poreklom iz umerenih regiona obe hemisfere.
[0116] Poljoprivredne trave koje se uzgajaju zbog njihovog jestivog semena nazivaju se žitarice. Tri uobičajene žitarice su pirinač, pšenica i kukuruz. Od svih useva 70% su trave.
[0117] Šećerna trska je glavni izvor proizvodnje šećera. Trava se koristi za izgradnju. Skele napravljene od bambusa mogu izdržati vetrove jačine tajfuna koji bi slomili čelične skele. Veći bambusi i Arundo donax imaju snažne debla koji se mogu primenjvati na sličan način kao i drvena građa, a korenje trave stabiliše temelj zemunica. Arundo donax se koristi za pravljenje cevi za drvene instrumente, a bambus se koristi za nebrojene alatke.
[0118] Druga prirodna sirovina ligno-celulozne biomase mogu biti drvenaste biljke ili drveće. Drvenasta biljka je biljka koja koristi drvo kao svoje strukturno tkivo. To su tipično višegodišnje biljke čije stabljike i veći koreni su ojačani drvetom proizvedenim pored vaskularnog tkiva. Glavna stabljika, veće grane i korenje ovih biljaka obično su prekriveni slojem zadebljane kore. Drvenaste biljke su obično ili drveće, grmlje ili lijane. Drvo je strukturna ćelijska adaptacija koja omogućava da drvenaste biljke rastu iz nadzemnih stabljika iz godine u godinu, pa tako neke drvenaste biljke čini najvećim i najvišim biljkama.
[0119] Ovim biljkama je potreban vaskularni sistem za premeštanje vode i hranljivih materija iz korena u lišće (ksilem) i premeštanje šećera iz lišća u ostatak biljke (floem). Postoje dve vrste ksilema: primarna koja se formira tokom primarnog rasta iz prokambijuma i sekundarni ksilem koja se formira tokom sekundarnog rasta iz vaskularnog kambijuma.
[0120] Ono što se obično naziva "drvo" je sekundarni ksilem takvih biljaka.
[0121] Dve glavne grupe u kojima se može naći sekundarni ksilem su:
1) četinari (Coniferae): postoji oko šest stotina vrsta četinara. Sve vrste imaju sekundarni ksilem, koji je po strukturi relativno ujednačen u celoj grupi. Mnogi četinari postaju visoka stabla: sekundarni ksilem takvih stabala prodaje se kao meko drvo.
2) skrivenosemenice (Angiospermae): ima oko četvrtine miliona do četiri stotine hiljada vrsta skrivenosemenica. Unutar ove grupe nije pronađen sekundarni ksilem u monokotima (npr. Poaceae). Mnogo vrsta ne-monokotiledonih skrivenosemenica postaje drveće, a sekundarni ksilem ovih vrsta prodaje se kao tvrdo drvo.
[0122] Izraz meko drvo koristi se za opisivanje drveta sa drveća koja pripadaju golosemenicama. Golosemenice su biljke sa golim semenima koje nisu zatvorene u ovarijumu. Ti plodovi semenki smatraju se primitivnijim od tvrdog drveta. Stabla mekog drveta su obično zimzelena, rađaju šišarke i imaju iglice ili ljuske poput lišća. Uključuju četinarske vrste, npr. bor, smreka, jela i kedar. Tvrdoća drveta varira među četinarskim vrstama.
[0123] Izraz drvo tvrde građe koristi se za opisivanje drveta sa drveća koja pripadaju porodici skrivenosemenica. Skrivenosemenice su biljke sa semenim zametkom zatvorenim radi zaštite u ovarijumu. Ako se oplode, ovi semeni zameci se razvijaju u semenke. Drvo tvrde drvene građe obično je širokog lišća; u umerenim i severnim širinama uglavnom su listopadna, ali u tropskim i subtropskim predelima uglavnom zimzelena. Ovi listovi mogu biti jednostavni (pojedinačne oštrice) ili se mogu složiti sa listićima pričvršćenim na stabljiku lista. Iako su različitih oblika, svi listovi drveta tvrde građe imaju izrazitu mrežu sitnih žila. Biljke tvrdog drveta uključuju npr. jasiku, brezu, trešnju, javor, hrast i tik.
[0124] Zbog toga poželjna ligno-celulozna biomasa koja nastaje prirodno može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od trava i drveća. Druga poželjna ligno-celulozna biomasa koja nastaje prirodno, može se izabrati iz grupe koja se sastoji od biljaka koje pripadaju četinarima, skrivenosemenicama, Poaceae-ma i familijama. Druga poželjna prirodno prisutna ligno-celulozna biomasa može biti ona biomasa koja ima najmanje 10% po masi suve materije kao celuloza ili još poželjnije najmanje 5% po masi suve materije kao celuloza.
Predobrada
[0125] Prema pronalasku, ligno-celulozna biomasa se prethodno obrađuje. Izraz "prethodno tretiran" može se zameniti sa izrazom "obrađen". Međutim, preporučene tehnike su one koje su dobro poznate za "predobradu" ligno-celulozne biomase kao što će biti opisano u daljem tekstu.
[0126] Kao što je gore pomenuto, obrada ili predobrada može se izvesti korišćenjem uobičajenih metoda poznatih u struci, koje promovišu odvajanje i/ili oslobađanje celuloze i povećanu dostupnost celuloze iz ligno-celulozne biomase. Tehnike predobrade su dobro poznate u oblasti i uključuju fizičku, hemijsku i biološku predobradu, ili bilo koju kombinaciju istih. U poželjnim tehničkim rešenjima, predobrada ligno-celulozne biomase se izvodi kao serijski ili kontinuirani postupak.
[0127] Tehnike fizičke predobrade uključuju različite vrste mlevenja/usitnjavanja (smanjenje veličine čestica), ozračenje, parenje/eksploziju parom i hidrotermolizu, u poželjnom tehničkom rešenju, natapanje, uklanjanje čvrstih supstanci iz tečnosti, eksplozija parom čvrstih čestica da bi se stvorila prethodno tretirana ligno-celulozna biomasa.
[0128] Rezanje uključuje suvo, vlažno i mlevenje vibracionom kuglicom. Poželjno, fizička predobrada uključuje upotrebu visokog pritiska i/ili visoke temperature (eksplozija pare). U kontekstu ovog pronalaska, visok pritisak uključuje pritisak u opsegu od 3 do 6MPa, poželjno 3,1MPa. U kontekstu ovog pronalaska visoka temperatura uključuje temperature u opsegu od oko 100 do 300°C, poželjno od oko 160 do 235°C. U specifičnom tehničkom rešenju impregnacija se izvodi pod pritiskom od oko 3.1MPa i na temperaturi od oko 235°C. U poželjnom tehničkom rešenju fizička predobrada se vrši u skladu sa postupkom opisanim u WO 2010/113129.
[0129] Iako nisu potrebne ili poželjne, tehnike hemijske predobrade uključuju kiselinu, razblaženu kiselinu, bazu, organski rastvarač, kreč, amonijak, sumpor dioksid, ugljen dioksid, hidrotermolizu pod kontrolom pH, vlažnu oksidaciju i tretman rastvaračima.
[0130] Ako je postupak hemijske obrade postupak obrade kiselinom, poželjnije je kontinuirani tretman razblaženim ili blagim kiselinama, kao što je obrada sumpornom kiselinom ili drugom organskom kiselinom, kao što je sirćetna kiselina, limunska kiselina, vinska kiselina, sukcinska kiselina, ili bilo koja njihova smeša. Takođe se mogu koristiti i druge kiseline. Obrada blagom kiselinom znači najmanje u kontekstu ovog pronalaska, da pH obrada leži u opsegu od 1 do 5, poželjno 1 do 3.
[0131] U specifičnom tehničkom rešenju koncentracija kiseline je u opsegu od 0.1 do 2.0 mas % kiseline, poželjno sumporna kiselina. Kiselina je pomešana ili je u kontaktu sa ligno-celuloznom biomasom i smeša je zadržana na temperaturi u opsegu od oko 160-220°C, u periodu od nekoliko minuta do sekundi. Specifično uslovi predobrade mogu biti sledeći: 165-183°C, 3-12 minuta, koncentracija kiseline 0.5-1.4% (m/m), 15-25, poželjno oko 20% (m/m) ukupne koncentracije čvrstih materija. Ostale preporučene metode su opisane u američkim patentima sa brojevima 4,880,473, 5,366,558, 5,188,673, 5,705,369 i 6,228,177.
[0132] Tehnike vlažne oksidacije uključuju upotrebu oksidacionih sredstava, kao što su oksidansi na bazi sulfita i slično. Primeri obrade rastvaračima uključuju obradu sa DMSO (dimetil sulfoksid) i slično. Postupci hemijske obrade uglavnom se izvode od oko 5 do oko 10 minuta, ali mogu se izvoditi i za kraći ili duži vremenski period.
[0133] Tehnike biološke predobrade uključuju primenu mikroorganizama koji rastvaraju lignin (videti, na primer, Hsu, T.-A., 1996., Pre-treatment of biomass, u Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Vašington, D.C., 179-212; Ghosh, P., i Singh, A., 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of ligno-cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol.39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating ligno-cellulosic biomass: pregled, u Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., i Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Vašington, D.C., poglavlje 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., i Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, u Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson, L., i Hahn-Hagerdal, B., 1996, Fermentation of ligno-cellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; i Vallander, L., i Eriksson, K.-E. L., 1990, Production of ethanol from ligno-cellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).
[0134] U jednom tehničkom rešenju se vrši i hemijska i fizička predobrada, uključujući, na primer, obradu blagim kiselinama i obradu visokom temperaturom i pritiskom. Hemijska i fizička obrada se može izvoditi sekvencijalno ili istovremeno.
[0135] U poželjnom tehničkom rešenju, predobrada se izvodi kao korak natapanja vodom toplijom od 1°C, uklanjanjem ligno-celulozne biomase iz vode, nakon čega sledi korak eksplozije parom.
[0136] U poželjnom tehničkom rešenju, prethodno tretirana ligno-ocelulozna biomasa se sastoji od složenih šećera, takođe poznatih kao glukani i ksilani (celuloza i hemiceluloza) i lignin.
Enzim ili enzimska smeša
[0137] Enzim ili enzimska smeša znači celulolitički enzim ili mešavinu enzima koji mogu razgraditi ligno-celuloznu biomasu. Enzim ili enzimska mešavina dobijena prema opisanom postupku može biti bilo kog porekla, uključujući bakterijsko ili gljivično poreklo. Hemijski modifikovane ili proteinski modifikovane varijante su uključene. Odgovarajući enzim ili enzimske smeše uključuju enzim ili enzimske smeše iz opštih Cellulomonas, Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, Chrysosporium, Penicillium, Themobifida i Trichoderma, npr. gljivični enzim ili enzimske smeše proizvedene od strane Humicolace incesie, koju proizvodi Micosilosi enzim, proizveden od strane Humicolaso incese, koju proizvodi Humicola inso Cellulomonas fimi, Myceliophthora thermophila, Thielavia terrestris, Fusarium oxysporum, Chrysosporium lucknowense, Penicillium decumbens i Trichoderma reesei.
[0138] U jednom tehničkom rešenju proizvedeni enzim ili enzimska smeša je kompleks enzima ili enzimskih smeša homologan ćeliji domaćina. U jednom tehničkom rešenju, dobijeni enzim ili enzimska smeša je kompleks enzima ili enzimskih smeša homologan ćeliji domaćina soja Penicillium, poželjno loze Penicillium decumbens.
[0139] Treba razumeti da proizvedeni enzim ili enzimska smeša može takođe biti monokomponentni enzim ili enzimska smeša, npr. sadrži endoglukanazu, egzo-celobiohidrolazu, glukohidrolazu ili beta-glukozidazu proizvedenu rekombinantno u odgovarajućoj ćeliji domaćina. Enzim ili enzimska smeša može takođe da uključuje druge enzime ili enzimske klase proizvedene u rekombinantnim ćelijama koje koriste barem deo kodirajućeg regiona prethodno navedenih enzima, uključujući regulišuće i/ili promoterske regione poznate u oblasti. Pogodne ćelije domaćina su dalje opisane.
[0140] Proizvedeni enzim ili enzimska smeša takođe može biti preparat enzima ili enzimskih mešavina gde se jedan ili više homolognih enzima ili komponenti enzimskih mešavina brišu ili inaktiviraju iz ćelije domaćina koja prirodno proizvodi enzim ili enzimsku smešu.
Ćelija domaćina sposobna da proizvodi enzim ili enzimsku smešu
[0141] Ćelija domaćina može biti bilo kog porekla. Kao što je gore pomenuto, enzim ili enzimska smeša može biti homologna ili heterologna ćeliji domaćina koja može proizvesti enzim ili enzimsku smešu.
[0142] Termin "rekombinantna ćelija domaćina", koji se ovde koristi, označava ćeliju domaćina koja sadrži gen(e) koji kodira enzim ili enzimsku smešu i koja je sposobna da eksprimira navedeni gen(e) za proizvodnju enzima ili enzimske smeše, pri čemu je kodirajući gen(i) enzima ili enzimske smeše transformisan, transfektiran, transdukovani ili slično u ćeliju domaćina. Transformacija, transfekcija, transdukcija ili slična tehnika koja se koristi može biti dobro poznata u oblasti. U poželjnom tehničkom rešenju, gen je integrisan u genom rekombinantne ćelije domaćina u jednoj ili više kopija.
[0143] Kada je enzim ili enzimska smeša heterologna, rekombinantna ćelija domaćina koja je sposobna da proizvodi enzim ili enzimsku smešu je poželjno gljivičnog ili bakterijskog porekla. Izbor rekombinantne ćelije domaćina u velikoj meri zavisi od gena koji kodiraju enzim ili enzimsku smešu i porekla enzima ili enzimske smeše.
[0144] Termin "ćelija domaćina divljeg tipa", koji se ovde koristi, odnosi se na ćeliju domaćina koja izvorno sadrži gen(e) koji kodira enzim ili enzimsku smešu i koja je sposobna da eksprimira navedeni gen(e). Kada je enzim ili enzimska smeša homologni preparat ili kompleks enzima ili enzimske smeše, ćelija domaćina divljeg tipa ili njen mutant sposoban da proizvede enzim ili enzimsku smešu je poželjno gljivičnog ili bakterijskog porekla.
[0145] "Njegov mutant" može biti vrsta ćelije domaćina divljeg tipa u kojoj su jedan ili više gena izbrisani ili inaktivirani, na primer, kako bi se obogatio enzim ili preparat enzimske smeše u određenoj komponenti. Mutirana ćelija domaćina takođe može biti ćelija domaćina divljeg tipa transformisana sa jednim ili više dodatnih gena koji kodiraju dodatne enzime ili proteine kako bi se u kompleks enzima ili enzimske smeše ili preparata koji su proizvedeni uvodila jedna ili više dodatnih enzimskih ili drugih aktivnosti od strane ćelije domaćina divljeg tipa. Dodatni enzim(i) mogu imati istu aktivnost (npr. aktivnost enzima ili enzimske smeše) ili može samo biti neki drugi molekul enzima, npr. sa različitim svojstvima. Mutirana ćelija domaćina divljeg tipa može takođe imati dodatne homologne enzime koji kodiraju gene transformisane, transfektirane, transdukovane ili slično, po mogućnosti integrisane u genom, kako bi se povećalo eksprimiranje tog gena da se proizvede više enzima.
[0146] U poželjnom tehničkom rešenju, rekombinantna ili ćelija domaćina divljeg tipa je filamentozna gljivica. Primeri ćelija domaćina uključuju one odabrane iz grupe koja obuhvata: Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ili Trichoderma cell.
[0147] U još poželjnijem tehničkom rešenju filamentozna gljivična ćelija domaćina je izabrana iz grupe koja sadrži soj Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ili Aspergillus oryzae. U još povoljnijem tehničkom rešenju, soj je Penicillium decumbens.
[0148] U sledećem poželjnom tehničkom rešenju filamentozna gljivična ćelija domaćina je iz soja Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, or Fusarium ili ćelija Fusarium venenatum. U još jednom poželjnom rešenju, filamentozna gljivična ćelija domaćina izabrana je iz grupe koja obuhvata soj Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, ili Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium lucknowense, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Penicillium decumbens, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ili Trichoderma viride.
[0149] U još jednom poželjnom tehničkom rešenju, rekombinantna ćelija domaćina ili ćelija domaćina divljeg tipa je bakterijskog porekla. Primeri ćelija domaćina uključuju one odabrane iz grupe koja sadrži gram pozitivne bakterije kao što je soj Bacillus, npr. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, or Bacillus thuringiensis; ili soj Streptomyces, na primer, Streptomyces lividans ili Streptomyces murinus; ili gram negativne bakterije, npr. E. coli ili Pseudomonas sp.
Hidroliza
[0150] Biomasa će sadržati neka jedinjenja koja se mogu hidrolizovati u vrste rastvorljive u vodi koje je moguće dobiti hidrolizom biomase. U slučaju rastvorljivih hidrolizovanih vrsta celuloze, celuloza se može hidrolizovati u glukozu, celobiozu i polimere sa visokim nivoom glukoze i uključuje dimere i oligomere. Prema tome, neke od rastvorljivih hidrolizovanih vrsta celuloze su glukoza, celobioza i polimeri sa višim nivoom glukoze i uključuju njihove odgovarajuće dimere i oligomere. Celuloza se hidrolizuje u glukozu pomoću karbohidrolitičkih celulaza. Stoga su karbohidrolitičke celulaze primeri katalizatora za hidrolizu celuloze.
[0151] Prevladavajuće razumevanje celulolitičkog sistema deli celulaze u tri klase; egzo-1,4-[beta]-D-glukanaze ili celobiohidrolaze (CBH) (EC 3.2.1.91), koji odvajaju celobiozne jedinice sa krajeva celuloznih lanaca; endo-1,4-[beta]-D-glukanaze (EG) (EC 3.2.1.4), koje nasumično hidrolizuju unutrašnje [beta]-1,4-glukozidne veze u celuloznom lancu; 1,4-[beta]-D-glukozidaza (EC 3.2.1.21), koja hidrolizuje celobiozu u glukozu i takođe odvaja jedinice glukoze iz celooligosaharida. Prema tome, ako biomasa sadrži celulozu, onda je glukoza rastvorljiva u vodi hidrolizovana vrsta koja se može dobiti hidrolizom biomase, a gore pomenute celulaze su specifični primeri, kao i oni koji su pomenuti u eksperimentalnom odeljku, katalizatora za hidrolizu celuloze.
[0152] Sličnom analizom, proizvodi hidrolize hemiceluloze su vrste rastvorljive u vodi koje se mogu dobiti hidrolizom biomase, naravno pod pretpostavkom da biomasa sadrži hemicelulozu. Hemiceluloza uključuje ksilan, glukuronoksilan, arabinoksilan, glukomanan i ksiloglukan. Hemicelulaze oslobađaju različite šećere u hemicelulozi. Hemicelulitički sistem je složeniji od celulolitičkog sistema zbog heterogene prirode hemiceluloze. Sistemi mogu da uključuju, između ostalih, endo-1,4-[beta]-D-ksilanaze (EC 3.2.1.8), koje hidrolizuju unutrašnje veze u ksilanskom lancu; 1,4, [beta]-D-ksilozidaze (EC 3.2.1.37), koje napadaju ksilooligosaharide sa nereduktivnog kraja i oslobađaju ksilozu; endo-1,4-[beta]-D-mananaze (EC 3.2.1.78), koje cepaju unutrašnje veze; 1,4-[beta]-D-manozidaze (EC 3.2.1.25), koje cepaju manooligosaharide do manoze. Bočne grupe uklanjaju se brojnim enzimima; kao što su [alfa]-D-galaktozidaze (EC 3.2.1.22), [alfa]-L-arabinofuranosidaze (EC 3.2.1.55), [alpha]-D-glukuronidaze (EC 3.2.1.139), cinamoil esteraze (EC 3.1.1.-), acetil ksilan esteraze (EC 3.1.1.6) i feruloil esteraze (EC 3.1.1.73). Zbog toga, ako biomasa sadrži hemicelulozu, tada su ksiloza i manoza primeri hidrolizovanih vrsta rastvorljivih u vodi koje se mogu dobiti hidrolizom biomase koja sadrži hemicelulozu, a iznad pomenute hemicelulaze su specifični primeri, kao i oni navedeni u eksperimentalnom odeljku, katalizatora za hidrolizu hemiceluloze.
[0153] U postupak je uključen katalizator hidrolize. Kompozicija katalizatora hidrolize sastoji se od katalizatora, nosača i drugih aditiva/sastojaka koji se koriste za uvođenje katalizatora u postupak. Kao što je gore razmatrano, katalizator može sadržati najmanje jedan enzim ili mikroorganizam koji pretvara najmanje jedno od jedinjenja iz biomase u jedinjenje ili jedinjenja niže molekulske mase, sve do, i uključujući, osnovni šećer ili ugljeni hidrat korišćen za pravljenje jedinjenja u biomasi. Enzimi koji to mogu da urade za različite polisaharide kao što su celuloza, hemiceluloza i skrob su dobro poznati u oblasti i obuhvatali bi one koji još nisu pronađeni.
[0154] Kompozicija katalizatora hidrolize takođe može da sadrži neorgansku kiselinu, poželjno izabranu iz grupe koja se sastoji od sumporne kiseline, hlorovodonične kiseline, fosforne kiseline i slično, ili njihovih mešavina. Smatra se da je neorganska kiselina korisna za obradu na temperaturama većim od 100°C. Postupak se takođe može izvesti posebno bez dodavanja neorganske kiseline.
[0155] Tipično je dodavati katalizator hidrolize u postupak pomoću nosača, kao što je voda ili biomasa na organskoj bazi. Za svrhu ravnoteže mase, termin katalizatorska kompozicija stoga uključuje katalizator(e) plus nosač(e) koji se koriste za dodavanje katalizatora u postupak. Ako se uz katalizator doda pH pufer, onda je i on deo sastava katalizatora. Često će ligno-celulozna biomasa sadržati skrob. Važniji enzimi za upotrebu u hidrolizi skroba su alfa-amilaze (1,4-(alfa)-D-glukan glukanohidrolaze, (EC 3.2.1.1)). Ovo su endo-delujuće hidrolaze koje cepaju 1,4-[alfa]-D-glukozidne veze i mogu zaobići, ali ne mogu hidrolizovati 1,6-[alfa)-D-glukozidne grane. Međutim, egzo-delujuće glikoamilaze kao što su beta-amilaza (EC 3.2.1.2) i pululanaza (EC 3.2.1.41) mogu se koristiti za hidrolizu skroba. Rezultat hidrolize skroba je pre svega glukoza, maltoza, maltotrioza, [alfa]-dekstrin i različite količine oligosaharida. Kada se hidrolizat na bazi skroba koristi za fermentaciju, može biti korisno dodati proteolitičke enzime. Takvi enzimi mogu sprečiti flokulaciju mikroorganizma i mogu stvoriti aminokiseline dostupne mikroorganizmu. Zbog toga, ako biomasa sadrži skrob, tada su glukoza, maltoza, maltotrioza, [alfa]-dekstrin i oligosaharidi primeri hidrolizovanih vrsta rastvorljivih u vodi koje se mogu dobiti hidrolizom biomase koja sadrži skrob i gore pomenute alfa-amilaze su specifični primeri kao i oni koji su navedeni u eksperimentalnom odeljku, katalizatora za hidrolizu skroba.
Upotreba
[0156] Postupak takođe može imati dodatne korake u kojima se enzimi sakupljeni iz postupka dalje koriste za hidrolizu prve ligno-celulozne biomase. Poželjno je da prva ligno-celulozna biomasa i druga ligno-celulozna biomasa budu izvedene iz istog roda trave, a poželjnije da su izvedene iz iste vrste trava. Takođe je poželjno da se prva ligno-celulozna biomasa na kojoj će se sprovoditi enzimska hidroliza prethodno obradi pre enzimske hidrolize.
EKSPERIMENTALNI POSTUPAK PRIPREMA ČVRSTIH KOMPOZICIJA
[0157] Pripremljene su različite čvrste kompozicije od Arundo donax i pšenične slame. Biomase su bile podvrgnute predobradi, enzimskoj hidrolizi, fermentaciji i filtraciji pod pritiskom za pripremu različitih čvrstih kompozicija korišćenih u kultivacionim eksperimentima.
Predobrada
[0158] Ligno-celulozna biomasa uvođena je u reaktor sa kontinuiranim radom i podvrgnuta tretmanu kvašenja. Natopljena smeša je pomoću prese, odvojena u natopljenu tečnost i deo koji sadrži čvrstu natopljenu sirovinu. Deo koji sadrži čvrstu natopljenu sirovinu bio je podvrgnut eksploziji pare. Parametri predobrade za dve biomase zabeleženi su u Tabeli 1.
TABELA 1: Parametri postupka koji se koriste u predobradi
[0159] Proizvodi tretirana eksplozijom pare su razdvojeni u tečnost za eksploziju pare i parom eksplodiranu čvrstu supstamcu.
[0160] Čvrsta supstanca koja je parno eksplodirana je prethodno obrađena biomasa Arundo donax (AR) i prethodno obrađena biomasa pšenične slame (WS) koje se koriste u eksperimentima kultivacije.
Enzimska hidroliza
[0161] Prethodno obrađena biomasa je pomešana sa vodom da bi se dobila smeša koja ima 7.5% sadržaja suve materije i smeša je ubačena u enzimski reaktor. Dodat je enzimski koktel koji odgovara navedenoj koncentraciji proteina po gramu glukana sadržanih u prethodno obrađenoj biomasi. Enzimska hidroliza izvršena je za 72 sata pod agitacijom.
[0162] Pripremljena su dva različita hidrolizata, počev od prethodno obrađene biomase pšenične slame; svaki hidrolizat je odvojen centrifugiranjem (20 minuta, 8000 opm, 4°C) u tečnoj frakciji, koji sadrži šećere rastvorljive u vodi, i čvrstu kompoziciju. U eksperimentima kultivacije korišćene su čvrste kompozicije označene kao HW1 i HW2. Parametri hidrolize koji se koriste u pripremi HW1 i HW2 prikazani su u Tabeli 2 i izabrani su da bi se dobila dva različita nivoa osiromašenja složenih šećera; naročito je HW2 pripremljen sa višom koncentracijom enzima, što odgovara više osiromašenoj kompoziciji.
TABELA 2. Parametri koji se koriste u enzimskoj hidrolizi za proizvodnju čvrstih kompozicija HW1 i HW2
)
Fermentacija i filtracija presovanjem
[0163] Hidrolizat pšenične slame, pripremljen prema uslovima kompozicije HW2, ubačen je u bioreaktor sa 3 g/l uree i 0,5 g/l fermentisanog kvasca. pH je podešen na 5, a temperatura na 30°C i fermentacija je sprovedena tokom 48 sati. Enzimski koktel nije uklonjen iz hidrolizata, tako da se enzimska hidroliza nastavila tokom fermentacije. Fermentaciona čorba, koja sadrži čvrste supstance, etanol i druge tečne frakcije, je presovana filtriranjem pod presom pri temperaturi od 80°C na 15 bara, radi odvajanja etanola i tečnih komponenti iz frakcije bogate čvrstim materijama.
Frakcija bogata čvrstom supstancom koja sadrži lignin izvučen iz prese, označen kao HFW, korišćena je u eksperimentima kultivacije.
[0164] Hidrolizat Arundo Donax je pripremljen prema parametrima koji odgovaraju HW2 i fermentisan je prema proceduri koja se koristi za pšeničnu slamu. Frakcija bogata čvrstom supstancom izvučena iz prese, označena kao HFA, korišćena je u eksperimentima kultivacije.
Sastav
[0165] Sastav prethodno obrađene biomase i čvrstih kompozicija u smislu šećera rastvorljivih u vodi, složenih šećera, lignina i drugih jedinjenja određen je prema standardnim analitičkim metodama navedenim na kraju eksperimentalnog odeljka.
[0166] Tabela 3 prikazuje sastav prethodno obrađene biomase AR i WS, čvrste kompozicije izvedene iz WS hidrolizata HW1 i HW2 i čvrste kompozicije dobijene fermentacijom AR i WS hidrolizata (HFW i HFA). Tabela sadrži i kompozicije LS1 i LS2, koje su korišćene u sledećim eksperimentima i opisane su u sledećem eksperimentalnom odeljku.
[0167] Kompozicije su izražene u vidu složenih šećera C6, složenih šećera C5, ukupnih šećera rastvorljivih u vodi (C5 i C6) i ostalih komponenti (koje sadrže lignin i vodu). Složeni šećeri C6 zasnivaju se na glukozi, a složeni šećeri C5 uglavnom se sastoje od ksiloze.
TABELA 3. Kompozicije korišćene u zabeleženim eksperimentima
[0168] Za obim ovog pronalaska, kompozicije su pogodno okarakterisane odnosom složenih šećera i lignina. Složeni šećeri odgovaraju sumi složenih šećera C6 i složenih šećera C5. Uzimajući u obzir kompozicije dobijene iz WS, odnosno HW1, HW2 i HFW, primećeno je da:
• odnos složenih šećera i lignina u HW1 i HW2 niži je od složenih šećera prema ligninu u WS, odražavajući iscrpljivanje složenih šećera u hidrolizi;
• odnos složenih šećera i lignina u HW2 je niži od odnosa složenih šećera i lignina u HW1, što odražava efikasniju hidrolizu u HW2 koja se vrši pri višoj koncentraciji enzima;
• odnos složenih šećera i lignina u HWV niži je od odnosa složenih šećera i lignina u HW2, zbog činjenice da enzimi nisu deaktivirani i uklonjeni i hidroliza se nastavlja tokom fermentacije
KULTIVACIONI EKSPERIMENTI
[0169] Kultivacija ćelije domaćina za proizvodnju enzima odvijala se kao u sledećim primerima. Svaka kultivacija ćelije domaćina je u prijavljenim primerima koristila Trichoderma reesei i Penicillium decumbens jer je ćelija domaćin krenula iz rastvora spore oporavljenog sa PDA ploče zasejane svežim sporama sedam dana pre oporavka.
[0170] Eksperimenti su podeljeni u dva koraka:
1) predkultivacija koja nije deo postupka kultivacije za koji se traži zaštita i
2) kultivacija ćelije domaćina gde se ćelija domaćina uzgaja i proizvodi enzim(i).
PREDKULTIVACIJA:
Zasejavanje PDA ploče:
[0171]
1. 500 µl rastvora prethodno prikupljenih spora raspoređeno je u PDA ploču (3.9% krompirov dekstroza agar medijum) pripremljen kao što je poznato u stanju tehnike. 2. 500 µl sterilnog 0.9% rastvora NaCl za P. decumbens ili 1% rastvora Triton X-100 za T. reesei je raspodeljeno preko spora i tikvica je lagano rotirana sve dok površina nije bila prekrivena tečnošću.
3. Tikvica se zatvara pamučnim čepom prekrivenim aluminijumskom folijom i inkubira 7 dana na 30°C za P. decumbens ili 28°C za T. reesei.
Oporavak rastvora spora:
[0172]
4. Posle 7 dana, u tikvicu je raspodeljeno 10 ml odgovarajućeg sterilnog rastvora za P. decumbens i T. reesei (0.9% NaCl i 1% Triton X-100).
5. Tikvica je lagano rotirana dok tečnost nije postala zamućena.
6. Što je više moguće zapremina rastvora povučena je nazad kao moguće uklanjanje suspenzije spora u sterilnu epruvetu.
7. Rastvor spora je čuvan na 4°C.
Korak podešavanja pre kultivacije
[0173] Pre početka kultivacije ćelije domaćina bilo je potrebno podesiti predkultivaciju.
[0174] Medijum predkulture je pripremljen kako je navedeno u tabeli 4, odabirom odgovarajuće zapremine u odnosu na fazu gajenja ćelije domaćina (jedna desetina i dvadesetina za P. decumbens i T. reesei redom)
TABELA 4: Kompozicija medijuma predkulture
1. Glukoza i rastvor spora su dodati nakon sterilizacije. Zapremina rastvora spora je izabrana da bi se dobila konačna koncentracija od 5000 CFU/ml za P. decumbens i 50000 CFU/ml za T. reesei.
2. P. decumbens predkultura inkubirana je na 30°C, 170 opm tokom 30 h, dok je T. reesei predkultura inkubirana na 28°C, 170 opm tokom 64 h.
KULTIVACIJA ĆELIJE DOMAĆINA I PROIZVODNJA ENZIMA
[0175] Sredina za kultivaciju ćelija domaćina pripremljena je kako je navedeno u tabeli 5.
TABELA 5: Kompozicija medijuma za kultivaciju
[0176] Biomasa je izabrana iz grupe kompozicija pripremljenih za demonstriranje pronalaska (označenih kao WS, AR, HW1, HW2, HFW, HFA).
1. Posle sterilizacije pH je korigovan na 5.3 za P. decumbens i 6.0 za T. reesei i dodate suje zapremine predkulture. pH se kontroliše u tikvicama koristeći različite vrste puferskih rastvora (na primer 0,1 M fosfatni pufer).
2. Kultivacija ćelije domaćina i proizvodnja enzima izvršene su pri odgovarajućoj temperaturi i agitaciji za svaki mikroorganizam (30°C, 170 opm za P. decumbens i 28°C, 170 opm za T. reesei).
EKSPERIMENT 1
[0177]
Tabela 6: Aktivnost enzima od T. reesei u prisustvu različitih medijuma kultivacije.
[0178] Tabela 6 upoređuje aktivnost na različitim ligno-celuloznim biomasama koje se koriste za ishranu ćelije domaćina, Trichoderma reesei. U tabeli, „upotrebljena kompozicija“ ukazuje na biomasu koja se koristi u medijumu kultivacije kao izvor atoma ugljenika. Izračunato je da sadržaj medijuma daje približno istu količinu lignina u svakoj kultivacionoj sredini. Kako se svaka upotrebljena biomasa odlikuje smanjenjem odnosa složenog šećera prema ligninu, količina složenog šećera koji se koristi u svakom kultivacionom medijumu opada sa CE1 na WE3. Ovim se uspostavlja metoda za različite vrste ćelija domaćina. Aktivnosti CE1 odabrane su kao referenca za izražavanje eksperimentalnih rezultata na relativnoj skali u drugom odeljku tabele. U eksperimentima WE1, WE2 i WE3 korišćen je kultivacioni medijum gde je jedini izvor ugljenika bila kompozicija dobijena iz hidrolizovane (HW1 i HW2) i fermentisane (HFW) prethodno obrađene biomase. Vreme kultivacije je bilo isto u svim eksperimentima (169 sati).
[0179] Eksperimentalni rezultati jasno pokazuju da bi prethodno obrađena ligno-celulozna biomasa mogla biti zamenjena čvrstom kompozicijom dobijenom iz prethodno obrađene lignocelulozne biomase uklanjanjem frakcije složenih šećera. Štaviše, prinos konverzije - definisan kao ukupna aktivnost proizvedena prema odnosu složenog šećera - dobijen iz šećerom siromašne ligno-celulozne biomase iznenađujuće je veći od onog dobijenog iz prethodno obrađene lignocelulozne biomase sa povećanjem prinosa konverzije, što pokazuju rezultati prikazani u tabeli 7.
Tabela 7. Ukupna aktivnost dobijena iz različitog medijuma pripremljenog u različitoj kompoziciji sa smanjujućim sadržajem složenog šećera
EKSPERIMENT 2
[0180] U daljem eksperimentu, različite kompozicije koje nemaju ili imaju vrlo nizak sadržaj složenog šećera korišćene su u kultivacionoj sredini kao izvori ugljenika.
[0181] CE2 i CE3 proizvedeni su pomoću dva različita komercijalna uzorka lignina. CE2 je sadržao 8% Lignin alkali sa niskim sadržajem sulfonata (Sigma, šifra 471003), a CE38% Lignin alkali (Sigma, šifra 370959). Komercijalni lignin koji se koristi ima sadržaj složenog šećera niži od 5%.
[0182] Nakon postupka proizvodnje enzima, ostaci kultivacionog medija korišćeni u dva različita WE3 eksperimenta centrifugirani su tokom 20 minuta na 8000 opm i 4°C, a prikupljene su dve čvrste frakcije, označene kao LSI i LS2. CE1 iz Eksperimenta 1 prijavljen je kao kontrolni eksperiment.
[0183] Kompozicije LSI i LS2 sadržane su u tabeli 3. Kultivacioni medijumi WE4 i WE5 sadržali su 5 puta više materijala od CE1 u odnosu na sadržaj lignina i 2.5 – 2.8 puta više materijala od LS1 i LS2. Kao što je prikazano u tabeli 3, sadržaj složenog šećera u LS1 i LS2 je manji od 8%, a u tabeli je navedena odgovarajuća količina složenog šećera dodata u medijum.
[0184] Vreme trajanja kultivacije je169 sati.
Tabela 8. Aktivnost enzima od T. reesei za CE1, CE2, CE3, WE4 i WE5 eksperimente.
[0185] Kao što se jasno vidi iz prijavljenih podataka, u slučaju WE4 i WE5, količina složenog šećera, koja odgovara 20% složenih šećera u slučaju CE1, nije dovoljna za proizvodnju enzima, dok prisustvo 45% složenih šećera koji se koriste u CE1 je zabeleženo da povećava proizvodnju enzima (eksperiment WE3).
EKSPERIMENT 3
[0186] Dalji eksperimenti su izvedeni za proizvodnju enzima koristeći Penicillium decumbens kao ćeliju domaćina. Uporedni primer (CE4) izveden je korišćenjem AR prethodno tretirane biomase kao izvor ugljenika, dok je WE6 sproveden dodavanjem dovoljne količine HFA kompozicije da se dobije približno ista količina lignina korišćenog u CE4. Vreme kultivacije je bilo isto za sve eksperimente (138 sati).
[0187] Tabela 9 prikazuje aktivnosti dobijene nakon 138h proizvodnje enzima. Eksperimenti pokazuju da bi mogla da se proizvede najmanje ista količina ukupnih enzima kada se uzgaja Penicillium decumbens bilo u prisustvu prethodno obrađene ili šećerom siromašne ligno-celulozne biomase.
Tabela 9: Enzimska aktivnost proizvedena upotrebom Penicillium decumbens kao ćelije domaćina
[0188] Iz Tabele 9 je vidljivo da su enzimi, dobijeni iz ćelije domaćina koja se hrani šećerom siromašnom čvrstom kompozicijom dobijenom hidrolizom i fermentacijom ligno-celulozne biomase, vrlo blizu onima koji su dobijeni iz komparativnog primera dobijenog upotrebom prethodno obrađenog materijala.
EKSPERIMENT 4
[0189] Enzimi proizvedeni u WE3 na čvrstoj kompoziciji HFW pšenične slame dalje su korišćeni za hidrolizu prethodno obrađene biomase pšenične slame WS.
[0190] Prethodno obrađena biomasa je pomešana sa vodom da bi se dobila smeša koja ima 7.5% sadržaja suve materije i smeša je ubačena u posudu od 100 ml. Enzimske smeše uzgajane u WE3 napunjene su sa 60 i 90 mg proteina/g glukana prethodno obrađene biomase u eksperimentima WE7 i WE8 redom, a hidroliza je izvedena na pH 5.0 i 50°C tokom 72h. CE5 eksperiment je izveden upotrebom komercijalnog enzimskog rastvora prema specifikacijama proizvođača.
[0191] Koncentracije glukoze i ksiloze merene su u 6, 24, 48 i 72 sata i prikazane su u Tabeli 10. Glukoza i ksiloza koje su oslobođene su prijavljene u početnu količinu glukana i ksilana u prethodno obrađenoj biomasi WS da bi se kvantifikovao prinos hidrolize glukana i prinos hidrolize ksilana. Na Slici 1 su prikazani grafikoni prinosa hidrolize glukana (Slika 1a) i prinosa hidrolize ksilana (Slika 1b). Ovi eksperimenti naglašavaju da se enzimi proizvedeni prema ovom pronalasku mogu koristiti za efikasno hidrolizovanje prethodno tretirane ligno-celulozne biomase.
Tabela 10. Rezultati hidrolize eksperimenata CE5, WE7 i WE8 eksperimenata.
ANALITIČKE METODE
Utvrđivanje aktivnosti
[0192] FPU (aktivnost filter papira), aktivnost beta-glukozidaze i ksilanaze određivane su pomoću industrijski poznatih metoda određivanja enzimske aktivnosti. Razlika je u tome što je filter papir bio supstrat za FPU i salicin, a dole opisana smeša salicina i ksilana korišćena je kao test aktivnosti beta-glukozidaze i ksilanaze.
Određivanje kompozicije
[0193] Kompozicije su izvedene u skladu sa sledećim NREL standardima
NREL Analitička metoda
Određivanje strukturnih ugljenih hidrata i lignina u biomasi
[0194] Laboratorijski Analitički Postupak (LAP) Datum izdavanja: 4/25/2008
Tehnički Izveštaj NREL/TP-510-42618 Prerađen u Aprilu 2008
Određivanje ekstrakata u biomasi
[0195] Laboratorijski Analitički Postupak (LAP) Datum izdavanja: 7/17/2005
Tehnički Izveštaj NREL/TP-510-42619 januar 2008
Priprema uzoraka za kompozicionu analizu
[0196] Laboratorijski Analitički Postupak (LAP) Datum izdavanja: 9/28/2005
Tehnički Izveštaj NREL/TP-510-42620 januar 2008
Određivanje ukupnih čvrstih supstanci u biomasi i ukupnih rastvorenih čvrstih supstanci u uzorcima tečne obrade
[0197] Laboratorijski Analitički Postupak (LAP) Datum izdavanja: 3/31/2008
Tehnički Izveštaj NREL/TP-510-42621 Prerađen u martu 2008
Određivanje pepela u biomasi
[0198] Laboratorijski Analitički Postupak (LAP) Datum izdavanja: 7/17/2005
Tehnički Izveštaj NREL/TP-510-42622 januar 2008
Određivanje šećera, nusproizvoda i proizvoda degradacije u uzorcima procesa tečne frakcije
[0199] Laboratorijski Analitički Postupak (LAP) Datum izdavanja: 12/08/2006
Tehnički Izveštaj NREL/TP-510-42623 januar 2008
Određivanje nerastvorljivih čvrstih materija u prethodno obrađenom materijalu biomase
[0200] Laboratorijski Analitički Postupak (LAP) Datum izdavanja: 03/21/2008
NREL/TP-510-42627 mart 2008

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Postupak za proizvodnju najmanje prvog enzima sposobnog za hidrolizu prve prethodno obrađene ligno-celulozne biomase, koji obuhvata korak kultivacije ćelije domaćina u šećeromsiromašnoj kultivacionoj sredini koja sadrži ćeliju domaćina, vodu i čvrstu kompoziciju, dobijene iz druge prethodno obrađene ligno-celulozne biomase koja sadrži složeni šećer odabran iz grupe polimernih glukana i ksilana nerastvorljivih u vodi i lignin; pri čemu je odnos ukupne količine složenih šećera i ukupne količine lignina u čvrstoj kompoziciji manji od odnosa ukupne količine složenih šećera i ukupne količine lignina u drugoj prethodno obrađenoj ligno-celuloznoj biomasi; i pri čemu se pomenuta čvrsta kompozicija dobija uklanjanjem frakcije, ali ne svih, složenih šećera sadržanih u drugoj prethodno obrađenoj ligno-celuloznoj biomasi.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da se kultivacija vrši pod uslovima siromašnim u jednostavnim šećerima, sa količinom dodatog jednostavnog šećera ili jednostavnih šećera u opsegu između 0 i 10% po masi šećerom siromašne kultivacione sredine na suvoj bazi tokom dela vremena kultivacije koji je najmanje 50% vremena kultivacije; pri čemu su navedeni jednostavni šećeri odabrani od monomernih šećera.
3. Postupak prema patentnim zahtevima 1 ili 2, naznačen time da se čvrsta kompozicija dobija iz druge prethodno obrađene ligno-celulozne biomase postupkom koji obuhvata korake:
a) hidrolize najmanje frakcije druge prethodno obrađene ligno-celulozne biomase u prisustvu katalizatora hidrolize, da bi se dobila hidrolizovana kompozicija koja sadrži čvrstu kompoziciju i rastvor vode i rastvorljivih šećera i;
b) uklanjanja najmanje 50% rastvora vode i rastvorljivih šećera iz hidrolizovane kompozicije.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time da se uklanjanje rastvora vode i rastvorljivih šećera vrši najmanje jednom metodom izabranom iz grupe koja se sastoji od dekantacije, taloženja, centrifugiranja, filtriranja, filtriranja presovanjem i pranja.
5. Postupak prema patentnim zahtevima 1 ili 2, naznačen time da se čvrsta kompozicija dobija iz druge prethodno obrađene ligno-celulozne biomase postupkom koji obuhvata korake:
a) hidrolize najmanje frakcije druge prethodno obrađene ligno-celulozne biomase u prisustvu katalizatora hidrolize, da bi se proizvela hidrolizovana kompozicija koja sadrži pomenute složene šećere i lignin i rastvor vode i rastvorljivih šećera;
b) konvertovanja najmanje frakcije rastvorljivih šećera u hidrolizovanoj kompoziciji da bi se proizvela konvertovana kompozicija koja sadrži najmanje jedan proizvod dobijen od šećera i čvrstu kompoziciju;
c) uklanjanja frakcije najmanje jednog proizvoda dobijenog od šećera.
6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time da se uklanjanje frakcije najmanje jednog proizvoda dobijenog od šećera vrši najmanje jednom metodom odabranom iz grupe koja se sastoji od dekantacije, taloženja, centrifugiranja, filtriranja, filtriranja presovanjem, pranja, isparavanja i destilacije.
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 6, naznačen time da katalizator hidrolize sadrži drugi enzim ili smešu enzima.
8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 6, naznačen time da je katalizator hidrolize izabran iz grupe koja se sastoji od jona vodonika, organskih kiselina i neorganskih kiselina.
9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 8, naznačen time da konverzija hidrolizovane kompozicije obuhvata fermentaciju.
10. Postupak prema patentnom zahtevu 9, naznačen time da najmanje jedan proizvod dobijen od šećera sadrži etanol.
11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 10, naznačen time da deo vremena kultivacije pod uslovima siromašnim u jednostavnim šećerima iznosi najmanje 75% vremena kultivacije.
12. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 10, naznačen time da je deo vremena kultivacije pod uslovima siromašnim u šećerima isti kao vreme kultivacije.
13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 12, naznačen time da je količina dodatog jednostavnog šećera ili šećera u opsegu između 0 i 5% po masi šećerom siromašne kultivacione sredine na suvoj bazi.
14. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 12, naznačen time da u šećeromsiromašnoj kultivacionoj sredini nema dodatog jednostavnog šećera.
15. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, naznačen time da se najmanje prvi enzim sakuplja razdvajanjem šećerom siromašne kultivacione sredine u najmanje sakupljenu kompoziciju, koja sadrži najmanje frakciju količine prvog enzima, i iscrpljenu kompoziciju, koja sadrži najmanje frakciju količine čvrstog ostatka čvrste kompozicije.
16. Postupak prema patentnom zahtevu 15, naznačen time da je ukupna količina pomenutih složenih šećera u iscrpljenoj kompoziciji prisutna u opsegu od 0 do 30% po masi na suvoj bazi.
17. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16, naznačen time da se prvi enzim dalje koristi za hidrolizu prve ligno-celulozne biomase, a i prva ligno-celulozna biomasa i druga prethodno obrađena ligno-celulozna biomasa sadrže ligno-celuloznu biomasu dobijenu iz grupe koja se sastoji od istog roda trave i iste vrste trave.
RS20201068A 2012-06-21 2013-06-20 Proizvodnja enzima za ligno-celuloznu biomasu RS60837B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT000545A ITTO20120545A1 (it) 2012-06-21 2012-06-21 Produzione di enzima per biomassa ligno-cellulosica
EP13729968.1A EP2864493B1 (en) 2012-06-21 2013-06-20 Production of enzymes for ligno-cellulosic biomass
PCT/EP2013/062936 WO2013190064A1 (en) 2012-06-21 2013-06-20 Production of enzymes for ligno-cellulosic biomass

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60837B1 true RS60837B1 (sr) 2020-10-30

Family

ID=46800298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201068A RS60837B1 (sr) 2012-06-21 2013-06-20 Proizvodnja enzima za ligno-celuloznu biomasu

Country Status (24)

Country Link
US (1) US20150175984A1 (sr)
EP (1) EP2864493B1 (sr)
JP (1) JP2015519916A (sr)
KR (1) KR20150035727A (sr)
CN (1) CN104640995A (sr)
AU (1) AU2013279289B2 (sr)
BR (1) BR112014032061A2 (sr)
CA (1) CA2877425A1 (sr)
CO (1) CO7240397A2 (sr)
DK (1) DK2864493T3 (sr)
ES (1) ES2816631T3 (sr)
HR (1) HRP20201429T1 (sr)
HU (1) HUE050934T2 (sr)
IN (1) IN2014MN02550A (sr)
IT (1) ITTO20120545A1 (sr)
LT (1) LT2864493T (sr)
MX (1) MX2014015519A (sr)
PL (1) PL2864493T3 (sr)
PT (1) PT2864493T (sr)
RS (1) RS60837B1 (sr)
RU (1) RU2014151418A (sr)
SI (1) SI2864493T1 (sr)
WO (1) WO2013190064A1 (sr)
ZA (1) ZA201409404B (sr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3049957B1 (fr) 2016-04-08 2020-09-25 Ifp Energies Now Procede de production de cellulases avec du marc lignocellulosique pretraite
KR102255930B1 (ko) * 2019-12-03 2021-05-26 국립낙동강생물자원관 담수에서 분리한 리그닌 분해 활성을 가지는 플레비옵시스 크라사 nnibrfg4544 균주 및 이의 용도
CN113025506B (zh) * 2019-12-24 2022-12-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产乙醇的重组丝状真菌及其构建和应用
CN113019015B (zh) * 2019-12-24 2022-05-17 东北林业大学 一种饼形木纤维陶瓷发动机空气滤芯

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2881753B1 (fr) * 2005-02-09 2009-10-02 Inst Francais Du Petrole Procede de production d'enzymes cellulolytiques et hemicellulolytiques utilisant les residus de distillation de fermentation ethanolique d'hydrolysats enzymatiques de materiaux (ligno-)cellulosique
US7682811B2 (en) * 2006-01-27 2010-03-23 University Of Massachusetts Systems and methods for producing biofuels and related materials
US8551751B2 (en) * 2007-09-07 2013-10-08 Dyadic International, Inc. BX11 enzymes having xylosidase activity
JP2012520682A (ja) * 2009-03-17 2012-09-10 オルテック インコーポレイテッド リグノセルロース性の材料を発酵性糖に転換するための組成物および方法、ならびにそれらから生成される生成物
WO2011079388A1 (en) * 2009-12-30 2011-07-07 Iogen Energy Corporation Modified yeast strains exhibiting enhanced fermentation of lignocellulosic hydrolysates
ITTO20110918A1 (it) * 2011-10-13 2013-04-14 C5 6 Italy S R L Produzione di enzimi per biomassa lignocellulosica in carenza di zuccheri semplici

Also Published As

Publication number Publication date
IN2014MN02550A (sr) 2015-07-24
CO7240397A2 (es) 2015-04-17
BR112014032061A2 (pt) 2017-06-27
ZA201409404B (en) 2016-08-31
CN104640995A (zh) 2015-05-20
HUE050934T2 (hu) 2021-01-28
WO2013190064A1 (en) 2013-12-27
SI2864493T1 (sl) 2020-11-30
MX2014015519A (es) 2015-06-04
US20150175984A1 (en) 2015-06-25
LT2864493T (lt) 2020-12-10
CA2877425A1 (en) 2013-12-27
AU2013279289B2 (en) 2016-09-29
PT2864493T (pt) 2020-09-16
KR20150035727A (ko) 2015-04-07
ITTO20120545A1 (it) 2013-12-22
JP2015519916A (ja) 2015-07-16
PL2864493T3 (pl) 2021-01-11
AU2013279289A1 (en) 2015-01-29
RU2014151418A (ru) 2016-08-10
HRP20201429T1 (hr) 2020-11-27
DK2864493T3 (da) 2020-08-31
ES2816631T3 (es) 2021-04-05
EP2864493A1 (en) 2015-04-29
EP2864493B1 (en) 2020-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ang et al. Production of cellulases and xylanase by Aspergillus fumigatus SK1 using untreated oil palm trunk through solid state fermentation
US8790894B2 (en) Mutant cellobiohydrolase
Sørensen et al. Screening of carbon sources for beta-glucosidase production by Aspergillus saccharolyticus
Garcia et al. Production and characterization of-glucosidase from Gongronella butleri by solid-state fermentation
Olanbiwoninu et al. Production of cellulase and xylanase by Aspergillus terreus KJ829487 using cassava peels as subtrates
Chekushina et al. Comparing the efficiency of plant material bioconversion processes using biocatalysts based on Trichoderma and Penicillium verruculosum enzyme preparations
CN104975039A (zh) 一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用
Sherief et al. Lignocellulolytic enzymes and substrate utilization during growth and fruiting of Pleurotus ostreatus on some solid wastes
EP2864493B1 (en) Production of enzymes for ligno-cellulosic biomass
Oke et al. Enhanced endoglucanase production by Bacillus aerius on mixed lignocellulosic substrates
Begum et al. Bioconversion and saccharification of some lignocellulosic wastes by Aspergillus oryzae ITCC-4857.01 for fermentable sugar production
Oriente et al. Characterization of a novel Aspergillus niger beta-glucosidase tolerant to saccharification of lignocellulosic biomass products and fermentation inhibitors
Janveja et al. Kitchen waste residues as potential renewable biomass resources for the production of multiple fungal carbohydrases and second generation bioethanol
Abdul-Hadi et al. Purification and characterization of cellulase from Trichoderma reesei
JP2014528251A (ja) 単糖飢餓（Ｓｉｍｐｌｅｓｕｇａｒｓｔａｒｖｅｄ）リグノセルロース系バイオマス酵素生産
Azimova et al. Properties of the cellulase and xylanase enzyme complexes of Trichoderma harzianum UzCF-28.
Yuliana et al. Potential of basidiomycetes Marasmiellus sp. and Ganoderma lucidum in xylanase enzyme production and its activity using agroindustry waste
Abdel-Azeem et al. Biodegradation of agricultural wastes by Chaetomium species
ES2974426T3 (es) Proceso de hidrólisis enzimática de material lignocelulósico y fermentación de azúcares
Priyanka et al. Enhanced cellulase production from isolated fungus Aspergillus niger RKJP and its application in lignocellulosic saccharification for bioethanol production
KR101617222B1 (ko) 리그노셀룰로스의 전처리 방법에 따른 최적 당화효소 혼합물 및 이의 제조방법
Al-Bedak et al. Optimizing parameters for production of cell wall hydrolyzing enzymes by Aspergillus eucalypticola AUMC 15402 under submerged and solid-state conditions
CN109312380A (zh) 用于大规模酶生产的种子训练
Okonkwo et al. Time course for cellulase enzyme production by Aspergillus flavus using different organic nitrogen sources.
Singh et al. Enzymatic Transformation of