RS60848B1 - Novi fosfotriazolni analozi 5'-kapice irnk, kompozicije koje ih sadrže, molekul rnk u koji se ugrađuju, njihova primena i postupak sintetisanja molekula rnk, proteina ili peptida - Google Patents

Description

Opis

Oblat tehnike

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na nove foshotriazolne analoge 5'-kapice iRNK, kompoziciju koja sadrži isti, RNK molekul koji ga sadrži, njegovu upotrebu i postupak sinteze, in vitro ili in vivo, RNK molekula, kao i postupak sinteze proteina ili peptida in vitro, ili in vivo ili u kultivisanim ćelijama, pri čemu navedeni postupak sadrži translaciju RNK molekule

Stanje tehnike

[0002] Kapica 7-metilguanozina (m7G) prisutna na 5 'kraju eukariotskih iRNK ima ključnu ulogu u brojnim fundamentalnim ćelijskim procesima, uglavnom zaštitu iRNK od prevremenog cepanja i služi kao molekularna platforma za proteine koji deluju u transportu i translaciji mRNK.<1>Dakle, hemijske modifikacije 5' kapicee trasiraju put dizajnu molekularnih alata za selektivnu modulaciju procesa kojie zavise od kape i, shodno tome, metabolizma iRNK.<2>Prisustvo kapicee na 5'-kraju potrebno je za nadzor i efikasnu translaciju iRNK pod normalnim uslovima. Hemijski sintetisani analozi kapica iRNK tipa m<7>GpppG koriste se kao reagensi za in vitro sintezu iRNKs<3>sa kapama.

[0003] In vitro transkribovane (IVT) 5'-kapice iRNK korisni su alati za proučavanje translacije, transporta i obrt iRNK i predstavljaju novu klasu visoko obećavajućih terapijskih molekula. IVT iRNK pronalaze primenu u ekspresiji proteina u eukariotskim ćelijama, ekstraktima, kultivisanim ćelijama ili čak u celim organizmima. Konačno, IVT iRNK su nedavno skrenule veliku pažnju kao sredstvo za bezbednu distibuciju egzogenih proteina u svrhu vakcinacije protiv raka i terapije zamene gena.<4>

[0004] Sinteza 5'-kapica iRNK pomoću analoga iRNK može se postići in vitro transkripcijom.<3>Ovom metodom, koja se naziva ko-transkripciono vezivanje kape, sinteza RNK se vrši pomoću RNK polimeraze na DNK templatu u prisustvu sva 4 NTPs i dinukleotida sa kapom, kao što je m<7>GpppG. DNK templat je osmišljen tkao da uključi G kao prvi transkribovani nukleotid. Polimeraza pokreće transkripciju od GTP ili m<7>GpppG, na taj način ugrađujući jedan od nukleotida na 5 'kraju nascentne RNK. Da bi se povećao procenat ugradnje analoga kape(efikasnost formiranja kape), koncentracija GTP se smanjuje u odnosu na ostale NTPs, a koncentracija dinukleotida na kapi je povećana (sa 4- do 10-puta viška u odnosu na GTP). Na žalost, potencijalno se može dogoditi refersna ugradnja dinukleotida kapice, što rezultira frakcijom RNK sa 'Gpppm<7>G-sa kapom' , koje su translatorno neaktivne. Ovaj problem je rešen otkrićem "anti-reversnog analoga kape" (ARCA) koji su modifikovani na 2'- ili 3'-položajima 7-metilguanozina (obično zamenom jedne OH grupe sa OCH3) da bi blokirali reversnu ugranju.<5,6>

[0005] Pokazano je da metoda ko-transkripcionog formirnja kape omogućava inkorporaciju na RNL 5 'kraju različitih modifikovanih struktura kapa. Ove modifikovane strukture kapa mogu da nose molekularne oznake ili daju iRNK nove osobine kao što su povećana efikasnost i stabilnost translacije. Posebno korisni analozi kapa su među onim koji su modifikovani u trifosfatnom mostu.<7>Pokazano je da čak i supstitucije jednog atoma u 5 ', 5'-trifosfatnom mostu mogu značajno uticati na osobine iRNK. Na primer, supstitucija jednog atoma na β-položaju oligofosfatnog mosta kape, uvedena takozvanom β-S-ARCA, dovela je do značajnog povećanja in vitro i in vivo efikasnosti translacije iRNK,<8, 9>budući da je jedna supstitucija O u CH2na α-β položaju dovela do smanjenja efikasnosti translacije.<10>Drastično različiti biološki efekti različitih jedno-atomskih supstitucija unutar kape ukazuju na visoku osetljivost mehanizma translacije na modifikaciju oligofosfatnog lanca i sugeriše da je to oblast za dalja istraživanja.

[0006] Međutim, razvoj novih analoga kapa, bilo kao istraživačkih alata ili jedinjenja sa lekovitim potencijalom, ograničen je poteškoćama povezanim sa hemijskom sintezom ovih jedinjenja. Sinteza i prečišćavanje mono- i dinukleotidnih analoga kapa je izazovno zbog njihove visoko-jonske prirode i hemijske labilnosti 7-metilguanozina.<11, 12>Uobičajeni pristup sintezi, zasnovan na hemiji fosforimidazolida i nastajanju pirofosfatne veze pomoću viška dvovalentnog katjona u organskom rastvaraču,<7, 13, 14>je dugotrajno i zahtevno, izazovno je u transferu na industrijski nivo proizvodnje, zahteva više koraka prečišćavanja i povremeno rezultira složenim smešama proizvoda i sporednih proizvoda koje je teško razdvojiti. Povremeno, kao u slučaju β-S-ARCA,<15>ovaj pristup zahteva i stvaranje nestabilnih mononukleotidnih intermedijara, koji su skloni spontanoj razgradnji nakon skladištenja. Tako, tipičan sintetski pristup je obično efikasan za proizvodnju analoga kapa u donjem opsegu miligrama, ali je prilično niske propusnosti i vrlo težak za prebacivanje na industrijsku skalu. Sposobnost da se proizvedu analozi kapa visoke čistoće i prinosa sintetskim postupkom koji je lako podesiv za infustrijsku skalu proizvodnje bila bi presudna za mnoge primene, uključujući in vivo i medicinske primene lekova koji zahtevaju isporuku in vitro sintetisanih iRNK za kapama na životinje ili ljude.

[0007] "Click " hemija je termin koji opisuje grupu hemijskih reakcija koje su efikasne, imaju širok opseg, jednostavne su za izvođenje i lako se srazmeno povečavaju, stvaraju proizvode na regio- i stereospecifičan način, bez gotovo nikakvih sporednih proizvoda, i može se izvesti u blagim rastvaračima kao što je voda. Azid-alkiin cikloadicija katalizoavan bakrom koja dovodi do stvaranja supstituisanih 1,2,3-triazola je glavni primer takve reakcije. CuAAC se široko primenjuje u funkcionalizaciji RNK i RNK komponenti,<16, 17>uključujući obeležavanje 5 ' kraja,<18-22>biokonjugaciju,<23-26>i hemijsku ligaciju (vezivanje).<27>Otkriveno je da triazolni ostatak može da zameni jednu ili više 5' , 3'-fosfodiesterskih veza u DNK<28, 29>i RNK<30-33>da bi se stvorile funkcionalni mimici. Piecyk et al.<34>su izvestili o funkcionalizaciji analoga mononukleotidnih kapica pomoću CuAAC click chemistry da bi se dobili analozi koji sadrže 1,2,3-triazolni ostatak u N2- položaju nukleobaze, dok su Walczak et al.<45>objavili analoge kapica koji sadrže 1,2, 3-triazolni deo na 5 ' položaju nukleozidnog ostatka. Međutim, takva modifikacija nikada nije istraživana kao unutrašnja modifikacija 5 ', 5'-oligofosfatnog lanca unutar kapice niti bilo koji drugi biološki aktivni dinukleozid 5', 5'-oligofosfat.

[0008] Ostali analozi alkinil-derivatizovanih kapiva takođe su opisani u WO2013/059475 A1

OPIS PRONALASKA

[0009] Pronalazači su dobili novu klasu analoga dinukleotidnih kapica koji se mogu dobiti jednostavnijim i efikasnijim sintetskim pristupom, zasnovanim na click hemiji.<35>Pronalazači su primenili azid-alkin cikloadiciju (CuAAC) katalizovanu bakarom (I) u vodenoj sredini da bi se kombinovale dve 5'-mononukleotidne podjedinice u jednu 5 ', 5'-dinukleotidnu kapicu koja sadrži supstituisani 1,2,3-triazol kao unutrašnju modifikaciju oligofosfatnog lanca. Analozi se razlikuju u dužini lanca oligofosfata, položaju triazolne grupe u lancu oligofosfata i vrsti spejsera koji povezuju fosfatne grupe sa ostatkom trijazola. Po izboru, novi analozi takođe imaju 2'-O ili 3'-O-alkil grupu unutar 7-metilguanozina, poželjno metil grupu, proizvodeći analoge koji se nazivaju anti-reversni analozi kapica (ARCA). Svi novi analozi sintetisani su u vodenoj sredini pod standardnim katalitičkim uslovima CuAAC (CuSO4, natrijum-askorbat) od dva hemijski stabilna mononukleotidna intermedijara, u visokom prinosu, uz vrlo malo ili bez sporednih proizvoda. Nekoliko analoga fosfotriazola ima visoki afinitet za faktor inicijacije eukariotske translacije 4E (eIF4E). iRNK koje na terminalnim krajevima imaju nove analoge kapica mogu se dobiti standardnom reakcijom transkripcije in vitro. Efikasnost dodavanja kapica u kratke RNK transkripte (% modifikacije) je slična ili neznatno niža od onih sa nemodifikovanim kapicama. Kratki transkripti koji sadrže nove analoge podložni su uklanjanju kapice pomoću enzima Dcp2 za uklanjanje kapice in vitro, i tako se ponašaju kao RNK sa kapicama nepromenjenih struktura.Neočekivano, iRNK koji kodiraju luciferazu obuhvaćeni nekim od novih fosfotriazolnih analoga kapica imali su translaciona svojstva uporediva sa RNK koji nose standardne 5 'kapice, uprkos prisustvu velike triazolne grupe. To je u suprotnosti s ranije prijavljenim analozima kapica koji sadrže manje glomazne premosne modifikacije oligofosfata, npr. (supstitucije O sa NH ili O sa CH2)<10, 36,37>ili analozi koji sadrže 1,2,3-triazolni ostatak na 5 ' položaju nukleozidne grupe<45>), koji su svi promovisali prevod manje efikasno od standardnin analoga kapica. Tako, neočekivana i jedinstvena osobina fosfotriazolnih analoga kapica je da oni dobro funkciono imiiraju prirodne kapice. Kao takvi, fosfotriazolni analozi kapica su održiva alternativa standardnim analozima kapica koji se dobijaju zahtevnijom hemijskom sintezom.

[0010] Shodno ovom, predmet pronalaska je jedinjenje formule (I):

ili njegov stereoizomer ili so,

gde R<1>i R<2>su odabrani iz grupe koju čine N, N<+>-CH3, N<+>-C2H5, N<+>-C3H8, N<+>-C4H5, W-CH2C6H5pri čemu barem jedan od R<1>, R<2>nije N.

n i m su nezavisno odabrani iz grupe koju čine 0, 1 i 2;

X je odabrano iz grupe koju čine O, NH, S, CH2

k je 1 ili 2

Y nije prisutan ili je odabran iz grupe koju čine -CH2-, -CH2CH2-, -CH2O-, -CH2S-, -CH2NH-, -CH2CH2O-, -CH2CH2NH-, -CH2CH2S-R<3>, R<4>, R<5>, R<6>su odabrani iz grupe koju čine H, OH, OCH3, ili OCH2CH3; pri čemu R<3>i R<4>mogu biti isti ili različiti; R<5>i R<6>mogu biti isti ili različiti; ako bilo koji od R<3>, R<4>je različit od OH tada oba R<5>i R<6>su OH; ako bilo koji od R<5>, R<6>je različit od OH tada od oba R<3>i R<4>su OH.

[0011] U realizaciji jedinjenja prema pronalasku, R<1>is N<+>-CH3, R<3>i R<4>su odabrani iz grupe koju čine OH i OCH3i barem jedan od R<3>, R<4>nije OH, oba R<5>i R<6>su OH, n je barem 1.

[0012] U sledećoj realizaciji jedinjenja prema pronalasku R<2>je N<+>-CH3, R<5>i R<6>su odabrani iz grupe koju čine OH i OCH3i barem jedan od R<5>, R<6>nije OH, oba R<3>i R<4>su OH, m je barem 1.

[0013] Preferencijalno, jedinjenje pronalaska je odabrano iz grupe koju čine sledeća:

[0014] Predmet pronalaska je takođe kompozicija koja sadrži najmanje jedno jedinjenje pronalaska ili barem jedan njegov stereoizomer ili so i odgovarajući nosač ili razblaživač.

[0015] Predmet pronalaska je takođe molekul RNK čiji 5 'kraj uključuje jedinjenje pronalaska.

[0016] Predmet pronalaska je takođe metoda sinteze, in vitro ili in vivo, RNK molekula predmetnog pronalaska, pri čemu navedeni postupak uključuje reakciju ATP, CTP, UTP i GTP, jedinjenja pronalaska ili kompozicije pronalaska i polinukleotidni templat u prisustvu RNK polimeraze, u uslovima koji omogućavaju transkripciju polimeraze RNK polinukleotidnog templata u kopiju RNK; pri čemu će neke kopije RNK sadržavati jedinjenje pronalaska da bi se napravio molekul RNK predmetnog pronalaska.

[0017] Cilj pronalaska je takođe postupak sinteze proteina ili peptida in vitro, pomenuti postupak koji uključuje tranlsaciju molekula RNK predmetnog pronalaska u sistem za sintezu proteina bez ćelija, pri čemu molekul RNK sadrži otvoreni okvir čitanja, u uslovima koji omogućavaju translaciju otvorenog okvira čitanja molekula RNK u protein ili peptid kodiran otvorenim okvirom čitanja.

[0018] Predmetni pronalazak je takođe postupak sinteze proteina ili peptida in vivo ili u kultivisanim ćelijama, pri čemu navedeni postupak sadrži translaciju molekula RNK predmetnog pronalaska in vivo ili u kultivisanim ćelijama, pri čemu molekul RNK sadrži otvoren okvir čitanja, pod uslovima koji omogućavaju translaciju otvorenog okvira čitanja molekula RNK u protein ili peptid kodiran otvorenim okvirom čitanja.

[0019] Sledeći cilj pronalaska je upotreba jedinjenja predmetnog pronalaska ili kompozicije pronalaska u in vitro ili in vivo sintezi molekula RK.

[0020] Sledeći cilj pronalaska je upotreba molekula RNK predmetnog pronalaska u in vitro ili in vivo sintezi proteina ili peptida.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0021]

Slika 1 prikazuje sintezu fosfotriazolnih analoga kapica.

Slika 2 prikazuje primer RP HPLC analize CuAAC reakcije koja dovodi do fosfotriazolnog analoga kapice.

Slika 3 prikazuje analizu na poliakrilamidnom gelu kratkih RNK dobijenih in vitro transkripcijom u prisustvu odabranih analoga kapica fosfotriazola zajedno sa nekoliko analoga referentne kapice.

Slika 4 prikazuje reprezentativne rezultate jednog eksperimenta efikasnosti translacije za iRNK luciferaze pokrivene različitim strukturama kapica u zečjim retikulocitnim lizatima.

Slika 5 prikazuje elektroforetsku analizu na gelu reakcije uklanjanja kapica katalizovane sa Dcp2.

Slika 6 prikazuje relativnu efikasnost translacije odabranih fosfotriazolnih analoga kapica zajedno sa nekoliko analoga referentne kapice.

PRIMERI

Primer 1 – Sinteza i izolovanje analoga kapica

[0022] Fosfotriazolni analozi kapice sintetisani su u reakcijama CuAAC između dva mononukleotidna analoga koji mogu "kliknuti" ("clickable"), nukleotidnog guanina koji sadrži terminalni alkin unutar fosfatnog lanca i odgovarajućeg nukleotida koji sadrži azid (Slika 1). Reaktanti koji sadrže alkin i azid su kuplovani u različitim kombinacijama pod standardnim CuAAC uslovima (CuSO4, natrijum-askorbat) u vodi ili smeši vode i terc-butanola (Tabela 1).

[0023] Tabela 1. prikazuje nekoliko fosfotriazolni analoga kapica koji su sintetisani i okarakterisani hemijskim, biofizičkim, biohemijskim i molekularnim biološkim metodama. Takođe pokazuje strukture mononukleotida koji se koriste kao polazni materijali za sintezu i HPLC prinose odgovarajuće sinteze. Jedinjenja koja su posebno povoljna za proizvodnju iRNK sa kapicama uključuju m<7>GppptC2H4NHpG, m<7>GpppCH2tC2H4NHpG, m2<7,2-O>GppptC2H4NHpG, m2<7,2'-O>GppptC2H4NHppG, m2<7,2'-O>GppptC2H4OppG, m2<7,2'-O>GppptC2H4OpG, m2<7,2'-O>GPPtC2H4OppG.

1

[0024] Reakcije su zaustavljene dodatkom EDTA-om da bi se osiguralo efikasno uklanjanje bakarnih jona, koji bi u suprotnom mogli da utiču na naredne biološke eksperimente, i direktno prečišćeni pomoću reversno-fazne tečne hromatografije (RP HPLC). Svi analozi dinukleotidnih kapica dobijeni su prinosu od dobrog do odličnog (70-100%, obično veći od 90%) i izolovani kao oblici visoke čistoće. Polazni materijali su dobijeni u 2-3 koraka od komercijalno dostupnih polaznih materijala (Sigma-Aldrich). Analozi C-fosfonata koji sadrže alkin dobijeni su kuplovanjem posredovanim sa MgCl2između trietilamonijum soli C-fosfonatnih podjedinica i guanozin mono- ili difosfat imidazolida, praćeno N7-metilacijom metil jodidom. Analozi fosforamidata koji sadrže etarski ili alkin ili azidni ostatak sintetisani su reakcijom propargilamina ili 2-azidoetilamina i odgovarajućeg guanin nukleotidnog imidazolida u vodenom puferu. Analozi fosfoestra koji sadrže azid dobijeni su ili kuplovanjem posredstvom MgCl2trietilamonijum soli azidoetil fosfat nepodjedinice i guanozin monofosfat imidazolida ili reakcijom između zaštićenog guanozin H-fosfonata i azidoetanola nakon čega sledi uklanjanje zaštitnih grupa.

1.1. Polazni materijali i hemijski reagensi

[0025] Svi rastvarači i reagensi su stepena čistoće za sintezu i korišćeni su bez dalje obrade, osim ako nije drugačije navedeno. C-fosfonatni nukleotidni analozi C-fosfonatni nukleotidni analozi (GppC2H, GppC3H3, GppC4H5, GpppC2H, GpppC3H3, GpppC4H5),<38>2'-O-metilguanozin 5'-monofosfat<6>,2-azidoetanamin<39>i 2',3'-O,O-izopropilidenguanozin<46>sintetisani su kao što je prethodno opisano u citiranoj literaturi.

1.2. Hromatografija

1.2.1. Jono-izmenjivačka hromatografija

[0026] Sintetisani mononukleotidni analozi funkcionalizovani ili sa alkin ili sa azid grupom su prečišćeni iono-izmenjivačkom hromatografijom na koloni DEAE Sephadex A-25 (HCO3<->oblik). Posle nanošenja na kolonu reakcione smeše i ispiranja sa vodom, proizvodi su eluirani korišćenjem različitih gradijenata TEAB u dejonizovanoj vodi: 0-0,7 M za nukleozid monofosate, 0-1,0 M za nukleozid difosfate ili 0-1,2 M nukleozid trifosfate. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane zajedno nakon RP HPLC i spektrofotometrijske analize (na 260 nm). Uparavanje pod sniženim pritiskom uz ponavljano dodavanje 96% -tnog etanola, zatim 99,8% -tnog etanola i na kraju MeCN rezultira izolovanjem nukleotidnih analoga kao trietilamonijum (TEA) soli.

1.2.2. Analitička i preparativna reversno-fazna (RP)HPLC

1

[0027] I analitička i semi-preparativna HPLC izvedena je na Agilent Technologies Series 1200 sa UV detekcijom na 254 nm i detekcijom fluorescencije (Npr .: 260 nm, Em: 370 nm). Za hemijske i enzimske reakcije, praćenje analitičke HPLC izvršeno je korišćenjem Supelcosil LC-18-T kolone (4,6 x 250 mm, 5 µm brzina protoka 1,3 mL / min) sa jednim od tri različita linearna gradijenta metanola u 0,05 M amonijum acetatnom puferu (pH 5,9): program A -gradijent 0-25% metanola tokom 15 min, program B - gradijent 0-50% metanola tokom 15 min, program C - gradijent 0-50% metanola tokom 7,5 min, i zatim izokratsko eluiranje (50% metanol) do 15 min. Za studije degradacije zavisne od pH i praćenje reakcija različitih koraka analoga ARCA sintetička analitička HPLC psrovedena je korišćenjem Grace VisionHT C18-HL kolone (4,6 x 250 mm, 5µm, brzina protoka 1,3 mL / min) sa linearnim gradijentom 0-25% metanol u 0,05 M puferu amonijum acetata (pH 5,9) tokom 15 min. Semi-preparativna RP HPLC izvedena je korišćenjem Discovery RP Amide C-16 HPLC kolone (25 cm x 21,2 mm, 5 µm, protok 5,0 ml / min) sa linearnim gradijentima acetonitrila u 0,05 M amonijum acetatnom puferu (pH 5,9). Proizovdi su, nakon najmanje trostruke liofilizacije, izolovani kao amonijum soli.

[0028] Rezultati primera za RP HPLC analizu CuAAC reakcije koja dovodi do fosfotriazolnog analoga kapice prikazani su na Sl.2

1.3. Određivanja prinosa i koncentracija

[0029] Prinosi mononukleotidnih analoga nakon jono-izmenjivačkog prečišćavanja i koncentracije rastvora mono- i dinukleotidnih analoga korišćenih za biofizičke i biološke eksperimente određeni su na osnovu merenja apsorbancije izvedenih na 260 nm u 0,1 M fosfatnom puferu pH 6,0 za 7 -metilguanin mononukleotidne analoge i u 0,1 M fosfatnom puferu pH 7,0 za dinukleotidne analoge i guanin mononukleotidne analoge. Količine dobijenih jono-izmenjivački prečišćenih proizvoda izražene su kao milijedinica optičke gustine (opt. mu = apsorbanca rastvora u zapremini u ml). Za izračunavanje prinosa i koncentracija nakon molarnih ekstincionih koeficijenata [M<-1>cm<-1>] korišteni su: ε = 22600 (dinukleotidi), ε = 11400 (m<7>G mononukleotidi), ε = 12080 (G mononukleotidi). Koncentracije transkripta su određene pomoću spektrofotometra NanoDrop 2000c Spectrofotometer (Thermo Scientific).

1.4. NMR spektroskopija i masena spektrometrija

[0030] Struktura i čistoća svakog finalnog proizvoda potvrđene su masenom spektrometrijom visoke rezolucije koristeći negativnu ili pozitivnu elektrosprej ionizaciju (HRMS (-) ESI ili HRMS (+) ESI)<1>H NMR,<31>P NMR, gDQCOSY i gHSQCAD spektroskopiju. Maseni spektri su snimljeni na Thermo Scientific LTQ OrbitrapVelos spektrometru. NMR spektri snimljeni

2

su na Varian INOVA 400 MHz ili 500 MHz spektrometru opremljenom jedinicom za visoku stabilnost temperature pomoću sonde od 5 mm 4NUC, na 25 ° C ako nije drugačije navedeno, na 399,94 / 500,61 MHz ((<1>H NMR) i 161,90 / 202 MHz (<31>P NMR). Hemijska pomeranja<1>H NMR i<31>P NMR su prikazana u ppm i sa referencom na odgovarajuće unutrašnje standarde: natrijum 3- (trimetilsilil) -2,2',3,3' tetradeuteropropionat (TSP) i 20% fosforna kiselina u D2O. Signali<1>H NMR spektrima dinukleotida su dodeljeni u skladu sa 2D NMR spektrima (gDQCOSY, gHSQCAD). U naznaci signala<31>P dinukleotidnih analoga kapica, fosfati su analogno označeni kao m<7>G(pδ)pγpβpαG.

[0031] Neki analozi kapica postepeno se hidrolizuju u D2O. Iako su čista jedinjenja (videti HPLC profile, Propratna Informacija 2) rastvorena u D2O neposredno pre merenja, spektri su pokazali određeni nivo hidrolize. % hidrolize daje se zajedno sa podacima o karakterizaciji jedinjenja, ako je veći od 5%.

1.5. Sinteza derivata nukleotidnih imidazolida

1.5.1. Priprema jedinjenja za aktiviranje imidazola

Priprema trietilamonijum (TEA) soli

[0032] Komercijalno dostupna dinatrijumova so guanozin 5'-monofosfata (GMP) i tetranatrijum pirofosfat su konvertovani u trietilamonijum oblike propuštanjem njihovih vodenih rastvora (oko 1 g / 20 mL) kroz Dowex 50 W x 8 katjonit. Sakupljeni eluati su upareni pod sniženim pritiskom uz ponavljanje dodavanja etanola i acetonitrila do suva dajući nukleotid trietilamonijum sol kao belu čvrstu supstancu i trietilamonijum pirofosfat kao bezbojno ulje.

[0033] Trietilamonijum fosfat je pripremljen laganim dodavanjem trietilamina u nisko koncentrovani rastvor H2PO4u vodi do pH 7, a zatim isparavanjem da bi se dobio uljani, bezbojni ostatak.

Sinteza guanozin 5'-difosfat (GDP), guanozin 5'-trifosfat (GTP) i 2'-O-metilguanozin 5'-difosfat (m<2'-O>GDP)

[0034] Trietilamonijum fosfat (4 ekv.) ili trietilamonijum pirofosfat (4 ekv.) suspendovan je u DMF (oko 0,4 M) u prisustvu ZnCl2(4 ekv.) I mešan tokom ∼5 min da bi se dobio rastvor. Zatim je dodat GMP-Im ili m<2'-O>GMP-Im (1 ekviv.) zajedno sa drugom porcijom ZnCl2(4 ekv.) i smeša je mešana 1-2 sata na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena 10-strukim razblaživanjem vodom i dodavanjem EDTA (8 ekv.) i NaHCO3(približno 17,6 ekv.). Jonoizmenjivačkim prečišćavanjem dobijena je trietilamonijum so GDP (64%), GTP (79%) i m<2'-O>GDP (95%).

N7-metilacija nukleotidnih guanina (GMP, GDP i GTP)

[0035] Odgovarajući analog (GMP, GDP ili GTP, TEA so) je rastvoren u suvom DMSO da bi se dobilo pribl. 0,1 M rastvor praćen dodatkom CH3l (8 ekv.). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi nekoliko sati dok HPLC analiza nije pokazala više od 90% konverzije supstrata i prisustvo N<7>-metilovanog nukleotida kao glavnog proizvoda. Reakcija je zaustavljena 10-strukim razblaživanjem vodom, a jedinjenja rastvorna u organskim rastvaračima uklanjanju su trostrukim ispiranjem dietil etrom. Vodena faza je zatim tretirana sa izvesnom količinom Na2S2O5da bi se smanjio zaostali jod i pH rastvora je podešeno na 7 dodatkom čvrstog NaHCO3.Sledeće jono-izmenjivačko prečišćavanje daje trietilamonijum so m<7>GMP (63%), m<7>GDP (68%) ili m<7>GTP (58%).

1.5.2. Aktivacija imidazolom

Sinteza nukleotidnih imidazolida

[0036] Jedinjenja su pripremljena prema Mukaiyama i Hashimoto.<40>Odgovarajući nukleotid (1 ekv., TEA so), imidazol (10 ekv.), 2,2'-ditiodipiridin (3 ekv.) Su pomešani u DMF (-2,5) mL / 100 mg nukleotida) pre dodavanja trietilamina (3 ekv.) i trifenilfosfina (3 ekv.). Smeša je mešana 6-8 h na sobnoj temperaturi. Dodavanje rastvora anhidrovanog NaClO4(4 ekv.) u suvom acetonu (- 8 zapremina DMF-a) rezultira taloženjem proizvoda u obliku natrijumove soli. Suspenzija je ohlađena na 4 ° C i talog je profiltriran, ispran više puta hladnim, suvim acetonom i osušen u vakuumu iznad P4O10,Prinosi 90-100%.

1.6. Sinteza m7G C-fosfonatnih nukleotidnih analoga

Opšti postupak B (GP B): N<7>-metilacija nukleotidnih guanina korišćenjem CH3I

[0037] Odgovarajući nukleotid (TEA so) rastvoren je u suvom DMSO da se dobije ca.0,1 M rastvor praćen dodatkom CH3l (8 ekv.). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi nekoliko sati, sve dok HPLC analiza nije pokazala više od 90% konverzije supstrata i prisustvo N<7>-metilovanog nukleotida kao glavni proizvod. Reakcija je zaustavljena 10-strukim razblaživanjem dodatkom vode, a jedinjenja rastvorna u organskim rastvaračima uklonjena su trostrukim ispiranjem dietil etrom. Vodena faza je zatim tretirana izvesnom količinom Na2S2O5da bi se smanjio rezidualni jod i pH rastvora je podešeno na 7 dodatkom čvrstog NaHCO3. Proizvod je prečišćen jono-izmenjivačkom hromatografijom na DEAE Sephadex A-25 i uparen do suva kako je opisano u Opštim informacijama. Pre karakterizacije NMR-om, proizvod je dodatno prečišćen semi-preparativnom HPLC kao što je opisano u Opštim informacijama.

Opšti postupak C (GP C): N<7>-metilacija nukleotidnih guanina korišćenjem (CH3)2SO4

[0038] Odgovarajući nukleotid (TEA so) je rastvoren pri koncentraciji od ∼ 0,2 M u ca. 0,5 mM vodenom rastvoru CH3COOH (pH 4) tako da se dobije ca.0,2 M rastvor. Zatim je 5 porcija (CH3)2SO4(svaka po 2 ekv.) dodato na svakih 10 min u smešu uz jako mešanje i pH je održavan na 4 dodavanjem 10% KOH ako je potrebno. Mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi nekoliko sati, sve dok HPLC analiza nije pokazala više od 90% konverzije supstrata i prisustvo N7-metilovanog nukleotida kao glavnog proizvoda. Reakcija je zaustavljena 10-strukim razblaživanjem dodatkom vode, a jedinjenja rastvorlna u organskom rastvaraču uklonjena su trostrukim ispiranjem dietil etrom. pH vodene faze je zatim postavljen na 7 dodatkom čvrstog NaHCO3. Proizvod je prečišćen jono-izmenjivačkom hromatografijom na DEAE Sephadex A-25 i uparen do suva kako je opisano u Opštim informacijama. Pre karakterizacije NMR, proizvod je dodatno prečišćendemi-preparativnom HPLC kao što je opisano u Opštim informacijama.

β-C-(2-etinil), β-C-(2-propargil) i β-C-(3-butilil) guanozin difosfat i γ-C-(2-etinil), γ-C-(2-propargil) i γ-C-(3-butilil) guanozin trifosfat trietilamonijum soli (GppC2H, GppC3H3, GppC4H5, GpppC2H, GpppC3H3, GpppC4H5)

[0039] Jedinjenja su dobijena u skladu sa Wanat et al.<38>Ukratko, trietilamonijum 3-butilil C-fosfonat, tritilamonijum 3-trimetilsilil-1-propargil C-fosfonat ili trietilamonijum 2-etinil C-fosfonat (svaki 2,5 ekv.) su mešani u DMF ( oko 0,4 M) sve do potpunog rastvaranja. Zatim je dodat odgovarajući imidazolidni nukleotid (1 ekv.) zajedno sa MgCl2(8 ekv.) i smeša je mešana 1-2 sata na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena 10-strukim razblaživanjem vodom. Proizvod je prečišćen jono-izmenjivačkom hromatografijom na DEAE Sephadex A-25 i uparen do suva kako je opisano u Opštim informacijama da bi se dobili proizvodi u obliku trietilamonijum soli. Sa analoga trimetilsililpropargilofosfonatnog nukleotidna je zatim uklonjena zaštita inkubacijom u smeši TBAF / THF (1 M): ACN (1: 3, v / v) smeša (1,1 ekv. TBAF po nukleotidu) na sobnoj temperaturi tokom 24 sata. Nakon uklanjanja rastvarača pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod je direktno podvrgnut Click reakcijama klika. Prinosi: 45-90%.

β-C-(3-butilil) 7-metilguanozin difosfat amonijum so (m<7>GppC4H5)

[0040] Dobijen prema GP B polazeći od β-C-(3-butilil) guanozin difosfat trietilamonijum soli (11000 mOD, 0,910 mmol), CH3I (0,454 mL, 7,285 mmol) i DMSO (9,0 mL). Jonoizmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 7061 mOD (0,619 mmol, 68%) m<7>GppC4H5

2

trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je m<7>GppC4H5kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25°C) δH: 9,21 (1H, s, H8), 6,08 (1H, d, J1'-2'= 3,6, H1'), 4,70 (1H, dd, J1'-2'= 3,6, J2'-3'= 4,7, H2'), 4,51 (1H, dd, J2'-3'= 4,7, J3'-4'= 5,5, H3'), 4,39-4,43 (1H, m, H4'), 4,34 (1H, ddd, J5'-5"= 12,0, J = 4,2, 2,5, H5'), 4,22 (1H, ddd, J5'-5"= 12,0, J = 5,2, 2,2, H5"), 4,13 (3H, s, m<7>), 2,46 (2H, dtd, JCH2(C2H)-CH= 2,6, JCH2(C2H)-CH2(P)= 8,1, JCH2(C2H)-Pβ= 10,1, HCH2(C2H)), 2,34 (1H, t, JCH-CH2(C2H)= 2,6, HCH), 1,94 (2H, dt, JCH2(C2H)-CH2(P)= 8,1, JCH2(P)-Pβ= 16,9, HCH2(P));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 16,45 (1P, dtt, JCH2(C2H)-Pβ= 10,1, JCH2(P)-Pβ= 16,9, JPα-Pβ= 26,6, Pβ), -11,34 (1P, br d, JPα-Pβ= 26,6, Pα); HRMS (-) ESI m/z fdobijeno: 492,0692, izračunato za C15H20N5O10P2-: 492,0685, γ-C-(3-butilil) 7-metilguanozin trifosfat amonijum so (m<7>GpppC4H5)

[0041] Dobijen prema GP B polazeći od γ-C-(3-butilil) guanozin trifosfat trietilamonijum soli (GpppC4H5) (11000 mOD, 0,910 mmol), CH3l (0,454 mL, 7,285 mmol) i DMSO (9,0 mL). Jono- izmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 7677 mOD (0, 673 mmol, 74%) m<7>GpppC4H5trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je m<7>GpppC4H5kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25°C) δH: 9,23 (1H, s, H8), 6,08 (1H, d, J1'-2'= 3,5, H1'), 4,69 (1H, dd, J1'-2'= 3,5, J2'-3'= 4,7, H2'), 4,54 (1H, dd, J2'-3'= 4,7, J3'-4'= 5,5, H3'), 4,35-4,42 (2H, preklopljen H4' i H5'), 4,26 (1H, ddd, J5'-5"= 12,0, J = 5,2, 1,7, H5"), 4,13 (3H, s, m<7>), 2,44 (2H, dtd, JCH-CH2(C2H)= 2,5, JCH2(P)-CH2(C2H)= 8,3, JCH2(C2H)-Pγ= 11,2, HCH2(C2H)), 2,26 (1H, t, JCH-CH2(C2H)= 2,5, HCH), 1,99 (2H, dt, JCH2(P)-CH2(C2H)= 8,3, JCH2(P)-Pγ= 16,7, HCH2(P));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 16,46 (1P, dtt, JCH2(C2H)-Pγ= 11,2, JCH2(P)-Pγ= 16,7, JPβ-Pγ= 25,0, Pγ), -11,47 (1P, br d, JPα-Pβ= 19,2, Pα), -23,10 (1P, dd, JPα-Pβ= 19,2, JPβ-Pγ= 25,0, Pβ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno: 572,0357, izračunato za C15H21N5O13P3-: 572,0349,

β-C-(2-propargil) 7-metilguanozin difosfat amonijum so (m<7>GppC3H3)

[0042] Dobijen prema GP B polazeći od β-C-(2-propargil) guanozin difosfat trietilamonijum soli (8310 mOD, 0,688 mmol), CH3l 0,343 mL, 5,503 mmol) i DMSO (7,0 mL). Jonoizmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 4706 mOD (0,413 mmol, 60%) m<7>GppC3H3trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je m<7>GppC3H3kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25°C) δH: 6,06 (1H, d, J1'-2'= 3,5, H1'), 4,68 (1H, dd, J1'-2'= 3,5, J2'-3'= 5,0, H2'), 4,50 (1H, dd, J2'-3'= 5,0, J3'-4'= 5,5, H3'), 4,40-4,42 (1H, m, H4'), 4,36 (1H, ddd, J5'-5"=11,8, J = 4,0, 2,4, H5'), 4,23 (1H, ddd, J5'-5"=11,8, J =5,4, 2,0, H5"), 4,12 (3H, s, m<7>), 2,76 (2H, dd, JCH2-Pβ= 21,4, JCH2-CH= 2,7, HCH2), 2,34 (1H, dt, JCH-CH2= 2,7, JCH-Pβ= 6,5, HCH);<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 9,44 (1P, dtd, JPα-Pβ= 24,2, JCH2-Pβ= 21,4, JCH-Pβ= 6,5, Pβ), -10,76 (1P, br d, JPα-Pβ= 24,2, Pα); HRMS (-) ESI m/z dobijeno: 478,0521, izračunato za C14H18N5O10P2-: 478,0529,

γ-C-(2-propargil) 7-metilguanozin trifosfat amonijum so (m<7>GpppC3H3)

[0043] Dobijen prema GP B polazeći od γ-C-(2-propargil) guanozin trifosfat trietilamonijum soli (10000 mOD, 0,828 mmol), CH3l (0,412 mL, 6,622 mmol) i DMSO (8,0 mL). Jonoizmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 6324 mOD (0,555 mmol, 67%) m<7>GppC3H3trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je 11d kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25°C) δH: 6,06 (1H, d, J1'-2'= 3,49, H1'), 4,69 (1H, dd, J1'-2'= 3,49, J2'-3'= 4,73, H2'), 4,53 (1H, dd, J2'-3'= 4,73, J3'-4'= 5,48, H3'), 4,35-4,42 (1H, preklopljen H4' i H5'), 4,24-4,28 (1H, ddd, J5'-5"=11,7, J = 5,2, 2,0, H5"), 4,13 (3H, s, m<7>), 2,78 (2H, dd, JCH2-Pγ=21,7, JCH2-CH= 2,5, HCH2), 2,34 (1H, dt, JCH2-CH= 2,5, JCH-Pγ= 6,5, HCH);<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 9,38 (1P, dtd, JCH2-Pγ=21,7, JPβ-Pγ= 23,9, JCH-Pγ= 6,5, Pγ), -10,85 (1H, br d, JPα-Pβ= 19,2, Pα), -22,50 (1P, dd, JPα-Pβ= 19,2, JPβ-Pγ= 23,9, Pβ); HRMS (-) ESI m/z fdobijeno: 558,0184, izračunato za C14H19N5O13P3-: 558,0192,

β-C-(2-etinil) 7-metilguanozin difosfat amonijum so (m<7>GppC2H)

[0044] Dobijen prema GP C polazeći od β-C-(2-etinil) guanozin difosfat trietilamonijum soli (10000 mOD, 0,828 mmol), (CH3)2SO4(0,785 mL, 8,278 mmol) i rastvora CH3COOH pH 4 (8,0 mL). Jono- izmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 4814 mOD (0,422 mmol, 51%) m<7>GppC2H trietilamonijum salt. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je m<7>GppC2H kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 6,08 (1H, d, J1'-2'= 3,7, H1'), 4,70 (1H, dd, J1'-2'= 3,7, J2'-

3'= 4,7, H2'), 4,51 (1H, dd, J2'-3'= 4,7, J3'-4'= 5,5, H3'), 4,41-4,44 (1H, m, H4'), 4,38 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,3, 2,4, H5'), 4,24 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 5,3, 2,2, H5"), 4, 13 (3H, s, m<7>), 3,20 (1H, d, JPγ-C2H= 11,6, HC2H);<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: -10,58 (1P, br d, JPα-Pβ= 22,0, Pα),-20,86 (1P, dd, JPγ-Pβ= 22,0, JPγ-C2H= 11,6, Pβ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno: 464,0378, izračunato za C13H16N5O10P2-: 464,0372,

γ-C-(2-etinil) 7-metilguanozin trifosfat amonijum so (m<7>GpppC2H)

[0045] Dobijen prema GP B polazeći od γ-C-(2-etinil) guanozin trifosfat trietilamonijum soli (10000 mOD, 0,828 mmol), (CH3)2SO4(0,785 mL, 8,278 mmol) i rastvora CH3COOH pH 4 (8,0 mL). Jono- izmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 5569 mOD (0,488 mmol, 59%) m<7>GpppC2H trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog

2

proizvoda dobijen je m<7>GpppC2H kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 6,08 (1H, d, J1'-2'= 3,9, H1'), 4,70 (1H, dd, J1'-2'= 3,9, J2'-

3'= 4,9, H2'), 4,54 (1H, dd, J2'-3'= 4,7, J3'-4'= 5,3, H3'), 4,41-4,44 (1H, m, H4'), 4,38 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,1, 2,5, H5'), 4,24 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 5,1, 2,0, H5"), 4, 14 (3H, s, m<7>), 3,18 (1H, d, J = 12,9, HC2H);<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: -10,80 (1P, br d, JPα-Pβ= 20,5, Pα), -21,02 (1P, dd, JPγ-Pβ= 20,5, JPγ-C2H= 11,7, Pγ), -22,93 (1P, t, JPα-Pβ= JPγ-Pβ= 20,5, Pβ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno: 544,0042, izračunato za C13H17N5O13P3-: 544,0036, β-C-(2-etinil) 2'-O-metilguanozin difosfat trietilamonijum so m<2'-O>GppC2H

[0046] Trietilamonijum 2-etinil C-fosfonat (1,053 mmol, 0,35 M) je mešan u 3 mL DMF do potpunog rastvaranja. Zatim, dodati su 2'-O-metilguanozin 5'-monofosfat P-imidazolid natrijum so (4241 mOD, 0,35 mmol) zajedno sa MgCl2(268 mg, 2,8 mmol) o smeša je mešana 0,5 h na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena 10-strukim razblaživanjem vodom. Proizvod je prečišćen jono-izmenjivačkom hromatografijom na DEAE Sephadex A-25 i uparavanjem do suva kao što je opisano u Opštim infomracijama dajući 3647 mOD, (0,302 mmol, 86 %) m<2'-O>GppC2H trietilamonijum so. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je m<2'-O>GppC2H kao amonijum so.

<1>H NMR (500 MHz, Deuterijum Oksid) δ 8,14 (s, 1H, H8), 5,93 (d, J = 6,5 Hz, 1H, H1'), 4,85 (dd, J = 6,5, 5,2 Hz, 1H, H2'), 4,59 (dd, J = 5,2, 3,0 Hz, 1H, H3'), 4,40 - 4,35 (m, 1H, H4'), 4,28 (ddd, J = 11,5, 6,0, 3,4 Hz, 1H, H5'), 4,22 (ddd, J = 11,5, 4,9, 3,5 Hz, 1H), 3,18 (d, J = 12,9 Hz, 1H, HC2H);<31>P NMR (202 MHz, Deuterijum Oksid) δ -10,58 (dt, J= 18,7, 6,0 Hz, 1P, Pα), -20,84 (dd, J = 18,6, 12,9 Hz, 1P, Pδ), -22,53 (t, J = 18,0 Hz, 1P, Pβ ili Pγ), -23,04 (t, J = 18,0 Hz, 1P, Pβ ili Pγ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno: 464,0379, izračunato za : C13H16N5O10P2-464,0378,

γ-C-(2-etinil) 2'-O-metilguanozin trifosfat trietilamonijum so (m<2'-O>GpppC2H)

[0047] Trietilamonijum 2-etinil C-fosfonat (1,698 mmol, 0,2 M) je mešan u 8,5 mL DMF do potpunog rastvaranja. Zatim, dodat je 2'-O-metilguanozin 5'-difosfat β-P-imidazolid trinatrijum salt (6842 mOD, 0,566 mmol) zajedno sa MgCl2(431 mg, 4,531 mmol) i smeša je mešana u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena 10-strukim razblaživanjem vodom. Proizvod je prečišćen jono-izmenjivačkom hromatografijom na DEAE Sephadex A-25 i uparen do suva kao što je opisano u Opštim informacijama dajući 6385 mOD (0,528 mmol, 93%) m<2'-O>GpppC2H trietilamonijum so. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je m<2'-O>GpppC2H kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 8,13 (1H, s, H8), 5,99 (1H, d, J1'-2'= 6,5, H1'), 4,74 (1H, dd, J2'-3'= 5,1, J3'-4'= 3,1, H3'), 4,56 (1H, dd, J2'-3'= 5,1, J1'-2'= 6,5, H2'), 4,36-4,39 (1H, m,

2

H4'), 4,28 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, JPα-5'= 5,9, J4'-5'= 3,5, H5'), 4,24 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J4'-5"= 5,1, JPα-5"= 3,4, H5"), 3,47 (3H, s, m<2'O>), 3,18 (1H, d, JC2H-Pγ= 13,1, HC2H);<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: -10,80 (1P, ddd, JPα-Pβ= 20,5, JPα-5'= 5,9, JPα-5"= 3,4, Pα), -21,02 (1P, dd, JC2H-Pγ= 13,1, JPβ-Pγ= 19,1, Pγ), -22,99 (1P, dd, JPβ-Pγ= 10,1, JPα-Pβ= 20,5, Pβ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno: 544,0044, izračunato za C13H17N5O13P3-: 544,0036,

β-C-(2-etinil) 2'-O-N7-dimetilguanozin difosfat amonijum so (m2<7,2'-O>GppC2H)

[0048] Dobijen prema GP C polazeći od β-C-(2-etinil) 2'-O'metilguanozin difosfat trietilamonijum soli (3100 mOD, 0,257 mmol), (CH3)SO4(0,292 mL, 3,08 mmol) i rastvora CH3COOH pH 4 (3,1 mL). Jono- izmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 2180 mOD, (0,191 mmol, 74 %) m2<7,2'-O>GppC2H trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je m2<7,2'-O>GppC2H kao amonijum so.

<1>H NMR (500 MHz, Deuterijum Oksid) δ 6,16 (d, J= 3,5 Hz, 1H, H1'), 4,62 (t, J = 4,9, 5,5 Hz, 1H, H3'), 4,41 (dd, J = 4,9, 3,5 Hz, 1H, H2'), 4,40 - 4,38 (m, 1H, H4'), 4,36 (ddd, J = 11,8, 4,3, 2,4 Hz, 1H, H5'), 4,23 (ddd, J = 11,8, 5,2, 2,1 Hz, 1H, H5"), 4,13 (s, 3H, m<7>), 3,60 (s, 3H, m<2'O>), 3,19 (d, J = 12,5 Hz, 1H, C2H);<31>P NMR (202 MHz, Deuterijum Oksid) δ -11,00 (dt, J = 22,1, 4,5 Hz, 1P, Pα), -20,80 (dd, J = 22,1, 12,5 Hz, 1P, Pβ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 478,0537, izračunato za : C14H18N5O10P2<->478,0534,

γ-C-(2-etinil) 2'-O-N7-dimetilguanozin trifosfat amonijum salt (m2<7,2'-O>GpppC2H)

[0049] Dobijen prema GP C polazeći od γ-C-(2-etinil) 2'-O'metilguanozin trifosfat trietilamonijum soli (5380 mOD, 0,445 mmol), (CH3)SO4(0,422 mL, 4,454 mmol) i rastvora CH3COOH, pH 4 (5,0 mL). Jono- izmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 4014 mOD (0,352 mmol, 79%) m2<7,2'-O>GpppC2H trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je m2<7,2'-O>GpppC2H kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 6,16 (1H, d, J1'-2'= 3,1, H1'), 4,65 (1H, dd, J = 5,1, 5,5, H3'), 4,36-4,42 (3H, preklopljen H2', H4' i H5'), 4,26 (1H, ddd, J5'-5"= 12,5, JPα-5"= 4,8, J4'-5"= 2,7, H5"), 4,14 (3H, s, m<7>), 3,61 (3H, s, m<2'O>), 3,18 (1H, d, JPγ-C2H= 12,9, HC2H);<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: -10,80 (1P, ddd, JPα-Pβ= 20,5, JPα-5'= 7,3, JPα-5"= 4,8, Pα), -21,05 (1P, dd, JPβ-Pγ= 19,1, JPγ-C2H= 12,9, Pγ), -22,91 (1P, dd, JPβ-Pγ= 19,1, JPα-Pβ= 20,5, Pβ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 558,0200, izračunato za C14H19N5O13P3-: 558,0192.

1.7. Sinteza analoga nukleotidnih fosforamidatnih

Opšta procedura D (GP D): Kuplovanje nukletodnih imidazolida aminskim linkerom

[0050] Jedinjenja su sintetizovana analogno kao što je opisano u Guranowski et al. za reakciju diaminskih linkera sa guanozin 5'-fosforimidazolidom.<41>Odgovarajući nukleotid imidazolid je

2

rastvoren u 0,1 M Tris-HCI puferu pH 8,0 (približno 1 mL na 100 mg nukleotida) i dodat je propargilamin ili 2-azidoetiloamin (8 ekv.). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 časa. Reakcija je razblažena sa deset zapreina vode i isprana dietil etrom. Posle podešavanja pH na 7 dodatkom 5% HCI, vodena faza je ili podvrgnuta prečišćavanju jono-izmenjivačkom hromatografijom kao što je opisano u Opštim informacijama da bi se dobio željeni proizvod kao trietilamonijum so ili je direktno prečišćen semi-preparativnom HPLC da bi se dobio željeni proizvod kao amonijum so

1.7.1. Sinteza analoga azid-modifikovanih nukleotidnih fosforamidata

N-(2-azidoetil) fosforamidat guanozin monofosfat amonijum so (GpNHC2H4N3)

[0051] Dobijen prema GP D polazeći od guanozin 5'-monofosfat P-imidazolid natrijum soli (200 mg, 4800 mOD, 0,397 mmol), 2-azidoetilamina (0,349 mL, 3,179 mmol) i 2,0 mL o Tris-HCI pufera. Jono- izmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 4004 mOD (0,331 mmol, 83%) GpNHC2H4N3trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je GpNHC2H4N3kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 8,11 (1H, s, H8), 5,93 (1H, d, J1'-2'= 5,9, H1'), 4,84 (1H, dd, J1'-2'= 5,9, J2'-3'= 5,1, H2'), 4,51 (1H, dd, J2'-3'= 5,1, J3'-4'= 3,9, H3'), 4,31-4,34 (1H, m, H4'), 4,04 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,7, 3,1, H5'), 4,00 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 5,1, 3,5), 3,24 (2H, br t, JCH2(N3)-CH2(NH)= 5,9, HCH2(N3)), 2,89 (2H, dt, JCH2(N3)-CH2(NH)= 5,9, JCH2(N3)-Pα= 10,2,HCH2(NH));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 9,37-9,55 (1P, m, Pα); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 430,0991, izračunato za C12H17N9O7P-: 430,0989,

N-(2-azidoetil) β-fosforamidat guanozin difosfat amonijum so (GppNHC2H4N3)

[0052] Dobijen prema GP D polazeći od guanozin 5'-difosfat β-P-imidazolid dinatrijum soli (458 mg, 8244 mOD, 0,682 mmol), 2-azidoetilamina (0,600 mL, 5,460 mmol) i 4,5 mL Tris-HCI pufera. Jono- izmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 7085 mOD (0,586 mmol, 86%) GppNHC2H4N3trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je GppNHC2H4N3kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 8,12 (1H, s, H8), 5,93 (1H, d, J1'-2'= 6,3, H1'), 4,80 (1H, preklopljen sa HDO, H2'), 4,53 (1H, dd, J = 3,7, 5,3, H3'), 4,33-4,36 (1H, m, H4'), 4,18-4,21 (1H, m, H5' i H5"), 3,32 (2H, br t, JCH2(N3)-CH2(NH)= 5,9, HCH2(N3)), 3,03 (2H, dt, JCH2(N3)-CH2(NH)= 5,9, JCH2(N3)-Pβ= 10,4, HCH2-NH);<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: -1,04 (1P, dt, JCH2(N3)-

Pβ= 10,4, JPα-Pβ= 22,0, Pβ), -10,26 (1P, br d, JPα-Pβ= 22,0, Pα); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 510,0657, izračunato za C12H18N9O10P2-: 510,0652; hidroliza u D2O: 15%.

N-(2-azidoetil) fosforamidat 7-metilguanozin monofosfat amonijum salt (m<7>GpNHC2H4N3)

2

[0053] Dobijen prema GP D polazeći od 7-metil guanozin 5'-monofosfat P-imidazolid natrijum soli (450 mg, 9900 mOD, 0,868 mmol), 2-azidoetilamina (0,764 mL, 6,944 mmol) i 4,5 mL Tris-HCI pufera. Odmah nakon prečišćavanja na HPLC dobijeno je 3520 mOD m<7>GpNHC2H4N3(0,309 mmol, 36%) kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 6,08 (1H, d, J1'-2'= 3,9, H1'), 4,68 (1H, dd, J1'-2'= 3,9, J2'-

3'= 4,9, H2'), 4,48 (1H, dd, J2'-3'= 4,9, J3'-4'= 5,4, H3'), 4,38-4,41 (1H, m, H4'), 4,18 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,4, 2,4, H5'), 4, 12 (3H, s, m<7>), 4,06 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,9, 2,9, H5"), 3,35 (2H, t, JCH2(N3)-CH2(NH)= 5,9, HCH2(N3)), 3,0 (2H, dt, JCH2(N3)-CH2(NH)= 5,9, JPα-CH2(NH)= 10,3, HCH2(NH));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 9,32-9,44 (1P, m, Pα); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 444,1146, izračunato za C13H19N9O7P-: 444,1145,

N-(2-azidoetil) β-fosforamidat 7-metilguanozin difosfat amonijum so (m<7>GppNHC2H4N3)

[0054] Dobijen prema GP D polazeći od 7-metilguanozin 5'-difosfat β-P-imidazolid dinatrijum soli (238 mg, 3641 mOD, 0,319 mmol), 2-azidoetilamina (0,281 mL, 2,555 mmol) i 2,5mL Tris-HCI pufera. Jono- izmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 1785 mOD (0,156 mmol, 49%) m<7>GppNHC2H4N3trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je m<7>GppNHC2H4N3kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 6,08 (1H, d, J1'-2'= 3,5, H1'), 4,68 (1H, dd, J1'-2'= 3,5, J2'-

3'= 4,7, H2'), 4,51 (1H, J2'-3'= 4,7, J3'-4'= 5,5, H3'), 4,39-4,42 (1H, m, H4'), 4,34 (1H, ddd, J5'-

5"= 12,1, J = 4,3, 2,4, H5'), 4,22 (1H, ddd, J5'-5"= 12,1, J = 5,5, 2,4, H5"), 4,13 (3H, s, m<7>), 3,41 (2H, t, , JCH2(N3)-CH2(NH)= 5,9, HCH2(N3)), 3,10 (2H, dt, , JCH2(N3)-CH2(NH)= 5,9, JCH2(NH)-Pβ= 10,5, HCH2(NH));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: -0,82 (1P, dt, JCH2-Pβ= 10,5, JPα-Pβ= 22,7, Pβ), -10,28 (1P, br d, JPα-Pβ= 22,7, Pα); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 524,0819, izračunato za C13H20N9O10P2: 524,0808,

1.8 Sinteza analoga fosfoestra koji sadrže azide

Azidoetil fosfat

[0055] U balon je dodata H3PO3(50 mg, 0,610 mmol, 1 ekv.) i rastvorena u 2-azidoetanolu (1,385 ml, 18,293 mmol, 30 ekv.). Zatim je dodat TEA (253 µl, 1,819 mmol, 3 ekv.) i smeša je mešana 5 min. Zatim, postepeno je dodat jod (308 mg, 1,22 mmol, 2 ekv.) i smeša je mešana 96 h na sobnoj temperaturi. Proizvod je staložen nakon dodavate smeše 350 µl cikloheksilamina u 15,8 mL acetona. Talog je profiltriran, ispran više puta hladnom vodom, subim acetonom sve dok nije postao beo i zatim je osušen u vakuumu iznad P2O5,<31>P NMR (202 MHz, Deuterijum Oksid) δ 4,10 (t, J = 6,2 Hz).

2', 3-O,O-izopropilidenguanozin H-fosfonat 2'3'-iPr-GpH

2

[0056] 2',3'-O,O-izopropilidenguanozin H-fosfonat je sintetisan mešanjem 2',3'-O,O-izopropilidenguanozina (1,010 g, 3,128 mmol, 1 ekv.) sa PCl3(312 µl, 3,567 mmol, 1,1 ekv.) u prisustvu 15,24 mL trimetil fosfata na 0°C u trajanju od 1 h. Zatim je smeša razblažena sa oko 150 ml vode i pH je podešen na 7 dodatkom čvrstog NaHCO3. Jono- izmenjivačkom hromatografijom dobijeno je 17760 mOD, (1,470 mmol, 47 %) 2'3'-iPr-GpH trietilamonijum soli.

O-(2-azidoetil) guanozin fosfat amonijum so (GpOC2H4N3)

[0057] U flask koji sadrži 2'3'-iPr-GpH (3000 mOD, 0,248 mmol, 1 ekv.) dodati su BSA (607 µl, 2,48 mmol, 10 ekv.) i ACN (607 µl). Smeša je mešana 15 min nakon čega je dodat TEA (102 µl, 0,744 mmol, 3 ekv.) zajedno sa 2-azidoetanolom (564 µl, 7,44 mmol, 30 ekv.) i mešanje je nastavljeno još 5 min. Zatim, postepeno je dodat jod (126 mg, 0,496 mmol, 2 ekv.) i reakcija je mešana tokom 7 dana na 45 °C. Nakon toga, razblažena je sa oko 30 mL vode i pH je podešeno na 1,5 dodatkom konc. HCI. Dobijena smeša je mešana na 60°C tokom 1,5 h i zatim je pH podešen na 7 dodatkom čvrstog NaHCO3. Smeša je podvrgnuta jonoizmenjivačkoj hromatografiji pri čemu je dovijeno 1350 mOD (0,112mmol, 45 %) GpOC2H4N3trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je GpOC2H4N3kao amonijum so.

<1>H NMR (500 MHz, Deuterijum Oksid) δ 8,20 (s, 1H, H8), 5,95 (d, J = 5,4 Hz, 1H, H1'), 4,81 (dd, J = 5,3, 5,4 Hz, 1H, H2', preklopljen sa HDO), 4,52 (dd, J = 5,2, 4,0 Hz, 1H, H3'), 4,34-4,36 (m, 1H, H4'), 4,20 - 4,08 (m, 2H, H5', H5"), 3,98 - 3,88 (m, 2H, CH2-N3), 3,46 - 3,36 (m, 2H, CH2-O);<31>P NMR (202 MHz, Deuterijum Oksid) δ 0,94-1,05 (m, 1P, Pα); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 431,06262, izračunato za : C12H16N8O8P - 431,0834196(2).

β-O-(2-azidoetil) guanozin difosfat amonijum so (GppOC2H4N3)

[0058] U balon sa suvom azidoetil fosfat cikloheksilamonijum soli (ca. 0,610 mmol, 3 ekv.) dodati su DMF (3,7 mL) i MgCl2(74,2 mg, 0,78 mmol, 4 ekv.) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi do potpunog rastvaranja fosfatne podjedinice. Zatim, dodat je guanozin 5'-monofosfat imidazolid (106 mg, 2353 mOD, 0,195 mmol, 1 ekv.) zajedno sa drugom porcijom MgCl2(74,2 mg, 0,78 mmol, 4 ekv.). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 h. Reakcija je zatim zaustavljena razblaživanjem sa deset zapremina vode i podvrgnuta prečišćavnaju na jono-izmenjivačkoj koloni dajući tako 2047 mOD, (0,170 mmol, 87 %) GppOC2H4N3trietilamonijum soli. Dodatnim HPLC prečišćavanjem frakcije dobijenog proizvoda dobijen je GppOC2H4N3kao amonijum so.

<1>H NMR (500 MHz, Deuterijum Oksid) δ 8,35 (s, 1H, H8), 5,97 (d, J = 5,5 Hz, 1H, H1'), 4,78 (dd, J = 5,1, 5,5 Hz, 1H, H2'), 4,53 (dd, J = 5,1, 3,9 Hz, 1H, H3'), 4,37 (dt, J = 3,9, 2,3 Hz, 1H, H4'), 4,30 - 4,18 (m, 2H, H5' i H5"), 4,06-4,09 (m, 2H, CH2linker CH2-O), 3,48 (t, J = 5,0 Hz, 2H, CH2linker CH2-N3);<31>P NMR (202 MHz, Deuterijum Oksid) δ -10,57- -10,30 (m, 2P, preklopljen Pα i Pβ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 511,0503, izračunato za : C12H17N8O11P2<->511,0498, 1.9. Sinteza analoga dinukleotidnih kapica

Opšta procedura G (GP G): Sinteza analoga dinukleotidnih kapica koji sadrže triazol koji se nalazi između P-podjedinica (fosforamidatni analozi)

[0059] Vodeni rastvori nukleotida koji sadrže alkine (1 ekv., 0,2-1,0 M) i nukleotida koji sadrže azide (1 ekv., 0,2-1,0 M) su pomešani nakon čega je dodata H2O (koncentracija svakog analoga ca. 50-150 mM) i vodeni rastvori CuSO4·5H2O (0,2 ekv., 0,5-6,0 M) i natrijum askorbata (0,4 ekv., 1-12 M). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom nekoliko sati i praćena pomoću RP HPLC. Dodatne porcije rastvora CuSO4ili natrijum askorbata dodati nakon usporavanja brzina reakcija. Krajnja koncentracija reagenasa je data u detaljnim procedurama u daljem tekstu. Po završetku, reakcija je zaustavljena 5-strukim razblaženjem sa vodom i dodatkom Na2EDTA (deset ekvivalanata dodatog CuSO4) direktno nakon čega je izvedeno prečišćavanje semi-preparativnom RP HPLC.

Opšta procedura G (GP H): Sinteza analoga dinukleotidnih kapica koji sadrže triazol koji se nalazi između P-podjedinica (fosforesterski analozi)

[0060] Vodeni rastvori nukleotida koji sadrže alkile (1 ekv., 0,2-0,5 M) i nukleotida koji sadrže azide (1 ekv., 0,2-0,5 M) su zajedno pomešani nakon čega je dodata H2O i smeša H2O:t-BuOH (1:1,v/v) (koncetracija svakog analoga ca.26-53 mM, krajnji odnos H2O:t-BuOH (2-5:1, v/v)) i vodeni rastvori CuSO4·5H2O (0,4 ekv., 0,6-0,65 M) i natrijum askorbata (0,8 ekv., 1,2-1,3 M). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 0,5-1 h i praćena je sa RP HPLC. Krajnje koncetracije reagenasa su date u detaljnim procedurama u daljem tekstu. Po završetku, reakcija je zaustavljena 5-strukim razblaženjem vodom i dodatkom Na2EDTA (deset ekvivalenata dodatkog CuSO4) nakon čega je izvedeno prečišćavanje semi-preparativnom RP HPLC.

m<7>GpNHC2H4-triazo/e-CH2ppG

[0061] Dobijen prema GP G polazeći od GppC3H3(848 mOD, 0,070 mmol, 150 mM) i m<7>GpNHC2H4N3(800 mOD, 0,070 mmol, 150 mM) uz mešanje sa CuSO4(3,5 mg, 0,014 mmol, 30 mM) i natrijum askrobatom (5,5 mg, 0,028 mmol, 60 mM) u 0,70 mL H2O tokom 1 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (52,2 mg, 0,14 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>GpNHC2H4-triazol-CH2ppG kao amonijum so.

1

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 8,03 (1H, s, H8 G), 7,84 (1H, s, J = 2,0, Htriazol), 5,98 (1H, d, J1'-2'= 3,9, H1' m<7>G), 5,88 (1H, d, J1'-2'= 5,9, H1' G), 4,77 (1H, dd, J1'-2'= 5,9, J2'-3'= 5,1, H2' G), 4,69 (1H, dd, J1'-2'= 3,9, J2'-3'= 5,1, H2' m<7>G), 4,50 (1H, dd, J2'-3'= 5,1, J3'-4'= 3,9, H3' G), 4,42 (1H, dd, J2'-3'= 5,1, J3'-4'= 5,5, H3' m<7>G), 4,37 (2H, brt, JCH2(triazol)m7G-CH2(NH)= 6,1, HCH2(triazol)m7G), 4,31-4,34 (2H, m, preklopljen H4' G i m<7>G), 4,14-4,21 (2H, m, H5' i H5" G), 4,00 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,7, 2,7, H5' m<7>G), 3,90 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,9, 3,3, H5" m<7>G), 3,23-3,28 (2H, m, HCH2(NH)), 3,16 (2H, d, JPβ-CH2(P)= 20,2, HCH2(P));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 11,70 (1P, dt, JPβ-CH2(P)= 20,2, JPα-Pβ= 26,4, Pβ), 9,01-9,14 (1P, m, Pδ), -10,40 (1P, br d, JPα-Pβ= 26,4, Pα); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 909,1618, izračunato za C26H36N14O17P3-: 909,1596; hidroliza u D2O: 11%.

m<7>GpNHC2H4-triazo/e-CH2pppG

[0062] Dobijen prema GP G od GpppC3H3(742 mOD, 0,061 mmol, 150 mM) i m<7>GpNHC2H4N3(700 mOD, 0,061 mmol, 150 mM) uz nešanje sa CuSO4(3,0 mg, 0,012 mmol, 30 mM) i natrijum aslorbatom (4,8 mg, 0,024 mmol, 60 mM) u 0,409 mL H2O tokom 1 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (44,7 mg, 0,12 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>GpNHC2H4-triazol-CH2pppG kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 8,06 (1H, s, H8 G), 7,88 (1H, d, J = 2,0, Htriazol), 5,98 (1H, d, J1'-2'= 3,9, H1' m<7>G), 5,86 (1H, d, J1'-2'= 6,3, H1' G), 4,79 (1H, dd, J1'-2'= 6,3, J2'-3= 5,1, H2' G), 4,74 (1H, dd, J1'-2'= 3,9, J2'-3'= 5,1, H2' m<7>G), 4,54 (1H, dd, J2'-3'= 5,1, J3'-4'= 3,5, H3' G), 4,37 (1H, dd, J2'-3= 5,1, J2'-3= 5,1, H3' m<7>G), 4,37 (2H, br t, JCH2(triazol)m7G-CH2(NH)= 6,6, HCH2(triazol)m7G), 4,32-4,35 (2H, preklopljen H4' G i H4' m<7>G i H5' G), 4,28 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 5,3, 3,3, H5' m<7>G), 4,23 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 5,9, 3,9, H5" m<7>G), 4,06 (3H, s, m<7>), 4,02 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,7, 2,7, H5' G), 3,86 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 5,1, 3,5, H5' G), 3,21-3,26 (2H, m, HCH2(NH)), 3,22 (2H, d, JCH2(P)-Pγ= 20,4, HCH2(P));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 14,20 (1P, dt, JPβ-Pγ= 24,9, JPγ-CH2(P)= 20,4, Pγ), 11,20-11,32 (1P, m, Pε), -8,35 (1P, dt, JPα-Pβ= 19,1 JPα-5'/5"= 4,4, Pα), 20,05 (1P, JPα-Pβ= 19,1, JPβ-Pγ= 24,9, Pβ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 989,1276, izračunato za C26H37N14O20P4-: 989,1259; hidroliza u D2O: 7%.

m<7>GppCH2-triazol-C2H4NHpG

[0063] Dobijen prema GP G od m<7>GppC3H3(1132 mOD, 0,099 mmol, 150 mM) i GpNHC2H4N3(1200 mOD, 0,099 mmol, 150 mM) uz mešanje sa CuSO4(4,9 mg, 0,020 mmol, 30 mM) i natrijum askorbatom (7,9 mg, 0,040 mmol, 60 mM) u 0,662 mL H2O tokom 2 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (74,5 mg, 0,20 mmol), proizvod je

2

podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>GppCH2-triazol-C2H4NHpG kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 8,01 (1H, s, H8 G), 7,82 (1H, d, J = 2,0, Htriazol), 6,02 (1H, d, J1'-2'= 3,5, H1' m<7>G), 5,86 (1H, d, J1'-2'= 5,5, H1' G), 4,83 (1H, dd, J1'-2'= 5,5, J2'-3'= 5,5, H2'G), 4,68 (1H, dd, J1'-2'= 3,5, J2'-3'= 4,7, H2' m<7>G), 4,46 (2H, preklopljen H3' G i m<7>G), 4,35-4,37 (1H, m, H4' G ili m<7>G), 4,28-4,31 (3H, preklopljen H4' G ili m<7>G, HCH2(triazol)G'), 4,24 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,3, 2,4, H5' G ili m<7>G), 4,16 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J= 5,5, 2,4, H5" G ili m<7>G), 4,08 (3H, s, m<7>), 3,96 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,7, 3,1, H5" G ili m<7>G), 3,88-3,93 (1H, m, H5" G ili m<7>G), 3,22 (2H, d, JCH2(P)-Pγ= 20,5, HCH2(P)), 3,13-3,20 (2H, m, HCH2(NH));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 11,95 (1P, dt, JPγ-CH2(P)= 20,5, JPγ-Pδ= 26,4, Pγ), 9,05-9,18 (1P, m, Pα), -10,34 (1P, br d, JPα-Pβ= 26,4, Pδ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 909,1603, izračunato za C26H36N14O17P3-: 909,1596,

m<7>GpppCH2-triazol-C2H4NHpG

[0064] Dobijen prema GP G od m<7>GpppC3H3(742 mOD, 0,061 mmol, 100 mM) i GpNHC2H4N3(700 mOD, 0,061 mmol, 100 mM) uz mešanje sa CuSO4(6,0 mg, 0,024 mmol, 40 mM) i natrijum askorbatom (9,6 mg, 0,048 mmol, 80 mM) u 0,614 mL H2O tokom 24 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (89,4 mg, 0,24 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>GpppCH2-triazol-C2H4NHpG kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 8,00 (1H, s, H8 G), 7,84 (1H, d, JCH2(P)-H(triazol)= 2,2, Htriazol), 6,00 (1H, d, J1'-2'= 3,5, H1' m<7>G), 5,86 (1H, d, J1'-2'= 5,5, H1' G), 4,89 (1H, dd, J1'-2'= 5,5, J2'-3= 5,1, H2' G), 4,69 (1H, dd, J1'-2'= 3,5, J2'-3'= 5,1, H2' m<7>G), 4,56 (1H, dd, J2'-3'= 5,1, J3'-4'= 5,5, H3' m<7>G), 4,47 (1H, dd, J2'-3= 5,1, J2'-3= 4,3, H3' G), 4,36-4,41 (2H, preklopljen H4' i H5' m<7>G), 4,23-4,30 (4H, preklopljen H5" m<7>G, H4'G, HCH2(triazol)G), 4,08 (3H, s, m<7>), 3,98 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,3, 2,9, H5'G), 3,89-3,95 (1H, m, H5" G), 3,26 (2H, dd, JCH2-

Pγ= 20,5, JCH2(P)-H(triazol)= 2,2, HCH2(P)), 3,07-3,18 (2H, m, HCH2(NH));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 14,11 (1H, dt, JPγ-Pδ= 24,9, JCH2(P)-Pγ= 20,5, Pγ), 11,18-11,37 (1P, m, Pα), -8,40 (1P, br d, JPε-Pδ= 19,1, Pε), -19,96 (1P, dd, JPε-Pδ= 19,1, JPγ-Pδ= 24,9, Pδ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 494,0598, izračunato za C26H36N14O20P4<2->: 494,0590; hidroliza u D2O: 9%. m<7>GpNHC2H4-triazol-ppG

[0065] Dobijen prema GP G od GpppC3H3(700 mOD, 0,061 mmol, 100 mM) i m<7>GpNHC2H4N3(742 mOD, 0,061 mmol, 100 mM) mešanjem sa CuSO4(6,0 mg, 0,024 mmol, 40 mM) i natrijum askorbatom (9,6 mg, 0,048 mmol, 80 mM) u 0,614 mL H2O tokom 1 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (89,4 mg, 0,24 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>GpNHC2H4-triazol-ppG kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 8,25 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 7,94 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 5,98 (1H, d, J1'-2'= 3,9, H1' m<7>G), 5,83 (1H, d, J1'-2'= 5,9, H1' G), 4,66 (1H, dd, J1'-2'= 5,9, J2'-

3= 5,1, H2' G), 4,62 (1H, dd, J1'-2'= 3,9, J2'-3'= 5,1, H2' m<7>G), 4,42-4,46 (3H, preklopljen HCH2(triazol)m7G'i H3'G), 4,37 (1H, dd, J2'-3'= 5,1, J3'-4'= 5,1, H3' m<7>G), 4,29-4,32 (1H, m, H4' m<7>G), 4,25-4,28 (1H, m, H4' G), 4,13-4,15 (2H, m, H5' i H5" G), 4,06 (3H, s, m<7>), 3,92 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,7, 2,7, H5' m<7>G), 3,82 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 5,1, 3,1, H5' m<7>G), 3,25-3,31 (2H, m, HCH2(NH));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 8,92-9,04 (1P, m, Pδ), -6,87 (1P, d, JPα-Pβ= 22,7, Pβ), -10,80 (1P, dt, JPα-Pβ= 22,7, JPα-5'/5'''= 6,6, Pα); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 895,1456, izračunato za C25H34N14O17P3-: 895,1439; hidroliza u D2O: 14%. m<7>GpNHC2H4-triazol-pppG

[0066] Dobijen prema GP G od GpppC2H (700 mOD, 0,061 mmol, 100 mM) i m<7>GpNHC2H4N3(742 mOD, 0,061 mmol, 100 mM) uz mešanje sa CuSO4(6,0 mg, 0,024 mmol, 40 mM) i natrijum askorbatom (9,6 mg, 0,048 mmol, 80 mM) u 0,614 mL H2O tokom 2,5 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (89,4 mg, 0,24 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>GpNHC2H4-triazol-pppG kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 8,30 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 7,03 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 5,98 (1H, d, J1-2'= 3,7, H1' m<7>G), 5,85 (1H, d, J1'-2'= 6,3, H1' G), 4,73 (1H, dd, J1'-2'= 6,3, J2'-3= 5,1, H2' G), 4,66 (1H, dd, J1'-2'= 3,7, J2'-3'= 4,7, H2' m<7>G), 4,48 (1H, dd, J2'-3'= 5,1, J3'-4'= 3,5, H3' G), 4,45 (2H, br t, JCH2(triazol)m7G-CH2(NH)= 5,9, HCH2(triazol)m7G), 4,38 (1H, dd, J2'-3'= 4,7, J3'-4'= 5,9, H3' m<7>G), 4,31-4,34 (1H, m, H4' m<7>G), 4,27-4,30 (1H, m, H4' G), 4,14-4,16 (2H, m, H5' i H5" G), 4,06 (3H, s, m<7>), 3,96 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,7, 2,7, H5' m<7>G), 3,84 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 5,1, 3,5, H5' m<7>G), 3.29 (1H, dt, JCH2(triazol)-CH2(NH)=5,9, JCH2(NH)-Pε= 10,6, HCH2(NH)'i HCH2(NH)");<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 8,94-9,12 (1P, m, Pε), -6,56 (1P, d, JPβ-Pγ= 22,0, Pγ), -10,61 (1P, dt, JPα-Pβ= 19,1, JPα-5'/5"= 5,1, Pα), -22,49 (1p, dd, JPα-Pβ= 22,7, JPα-Pβ= 19,1, Pβ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 975,1124, izračunato za C25H35N14O20P4-: 975,1103; hidroliza u D2O: 9%.

m<7>Gpp-triazol-C2H4NHpG

[0067] Dobijen prema GP G od m<7>GppC2H (742 mOD, 0,061 mmol, 100 mM) i GpNHC2H4N3(700 mOD, 0,061 mmol, 100 mM) uz meanje sa CuSO4(6,0 mg, 0,024 mmol, 40 mM) i natrijum askorbatom (9,6 mg, 0,048 mmol, 80 mM) u 0,614 mL H2O tokom 2 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (89,4 mg, 0,24 mmol), proizvod je podvrgnut

4

prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>Gpp-triazol-C2H4NHpG kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 8,24 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 8,03 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 5,99 (1H, d, J1'-2'= 3,3, H1' m<7>G), 5,84 (1H, d, J1'-2'= 5,9, H1' G), 4,75 (1H, dd, J1'-2'= 5,9, J2'-

3= 5,1, H2' G), 4,64 (1H, dd, J1'-2'= 3,3, J2'-3'= 4,7, H2' m<7>G), 4,41-4,45 (2H, preklopljen sa H3' G i H3' m<7>G), 4,39 (2H, br t, JCH2(triazol)G-CH2(NH)= 6,3, HCH2(triazol)G), 4,34-4,36 (1H, m, H4' m<7>G), 4,24-4,29 (2H, m, preklopljen H5' m<7>G i H4' G), 4,18 (1H, ddd, J5'-5"= 11,9, J = 5,5, 2,3, H5" m<7>G), 4,04 (3H, s, m<7>), 3,90 (1H, ddd, J = J5'-5"= 11,7, J = 4,5, 2,9, H5' G), 3,77-3,83 (1H, m, H5" G), 3,17-3,28 (2H, m, HCH2(NH));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 8,93-9,1 (1P, m, Pα), -6,62 (1P, d, JPγ-Pδ= 23,5, Pγ), -10,75 (1P, br d, JPγ-Pδ= 23,5, Pδ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 895,1454, izračunato za C25H34N14O17P3-: 895,1439,

m<7>Gppp-triazol-C2H4NHpG

[0068] Dobijen prema GP G od m<7>GpppC2H (742 mOD, 0,061 mmol, 50 mM) i GpNHC2H4N3(700 mOD, 0,061 mmol, 50 mM) uz mešanje sa CuSO4(6,0 mg, 0,024 mmol, 20 mM) i natrijum askorbatom (9,6 mg, 0,048 mmol, 40 mM) u 1,228 mL H2O tokom 1 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (89,4 mg, 0,24 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>Gppp-triazol-C2H4NHpG kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH:8,23 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 8,02 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 6,00 (1H, d, J1'-2'= 3,5, H1' m<7>G), 5,86 (1H, d, J1'-2'= 5,5, H1' G), 4,84 (1H, dd, J1'-2'= 5,5, J2'-3= 5,1, H2' G), 4,66 (1H, dd, J1'-2'= 3,5, J2'-3'= 4,7, H2' m<7>G), 4,51 (1H, dd, J2'-3'= 4,7, J3'-4'= 5,5, H3' m<7>G), 4,44 (1H, dd, J2'-3= 5,1, J2'-3= 3,9, H3' G), 4,27-4,37 (5H, preklopljen H4' G i H4' m<7>G i H5' G ili m<7>G, HCH2(triazol)), 4,20 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 5,5, 2,4, H5" G ili m<7>G), 4,07 (3H, s, m<7>), 3,94 (1H, ddd, J5'-5"= 11,5, J = 4,3, 3,1, H5' m<7>G ili G), 3,84-3,89 (1H, m, H5' m<7>G ili G), 3,13-3,24 (2H, m, HCH2(NH));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 11,0,8-11,21 (1P, m, Pα), -4,38 (1P, d, JPβ-Pγ= 22,0, Pγ), -8,41 (1P, br d, JPα-Pβ= 19,1, Pε), -20,26 (1p, dd, JPα-Pβ= 22,0, JPα-Pβ= 19,1, Pγ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 975,1122, izračunato za C25H35N14O20P4-: 975,1103; hidroliza u D2O: 13%.

m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4NHpG

[0069] Dobijen prema GP G od m2<7,2'-o>GpppC2H (650 mOD, 0,057 mmol, 100 mM) i GpNHC2H4N3(689 mOD, 0,061 mmol, 50 mM) uz mešanje sa CuSO4·5H2O (2,7 mg, 0,011 mmol, 20 mM) i natrijum askorbatom (4,4 mg, 0,022 mmol, 40 mM) u 0,570 mL H2O:t-BuOH (2:1,v/v) ftokom 2 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (89,4 mg, 0,24 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m2<7,2-o>Gppptriazol-C2H4NHpG kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 9,14 (1H, q, JH8-m7= 0,8, H8 m<7>G), 8,24 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 8,02 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 6,06 (1H, d, J1'-2'= 2,7, H1' m<7>G), 5,84 (1H, d, J1'-2'= 5,5, H1' G), 4,80 (1H, preklopljen sa HDO, H2' G), 4,58 (1H, dd, J = 6,2, 4,7, H3' m<7>G), 4,42 (1H, dd, J = 5,1, 3,9, H3' G), 4,27-4,36 (6H, preklopljen H2'm<7>G, H4' G i m<7>G, H5' G ili m<7>G, HCH2(triazol)), 4,18 (1H, ddd, J5'-5"= 12,3, J = 5,3, 2,7, H5" G ili m<7>G), 4,06 (3H, d, JH8-m7= 0,8, m<7>), 3,92 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 4,3, 3,1, H5' G ili m<7>G), 3,84 (1H, ddd, J5'-5"= 11,7, J = 5,1, 4,7), 3,59 (3H, s, m<2'O>), 3,12-3,26 (2H, m, HCH2(NH));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 8,95-9,15 (1P, m, Pα), -6,57 (1P, d, JPγ-Pδ= 21,3, Pγ), -10,64 (1P, ddd, JPε-Pδ= 19,1, JPε-5'= 4,4, JPε-5"= 2,9, Pε), -22,42 (1P, dd, JPγ-Pδ= 21,3, JPε-Pδ= 19,1, Pδ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 989,1272, izračunato za C26H37N14O20P4-: 989,1259; hidroliza u D2O: 8%. m<7>GppNHC2H4-triazol-C2H4ppG

[0070] Dobijen prema GP G od GppC4H5(580 mOD, 0,048 mmol, 100 mM) i m<7>GppNHC2H4N3(437 mOD, 0,038 mmol, 80 mM) uz mešanje sa CuSO4(4,8 mg, 0,019 mmol, 40 M) i natrijum askorbatom (7,5 mg, 0,038 mmol, 80 mM) u 0,485 mL H2O tokom 0,5 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (0,7 mg, 0,19 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>GppNHC2H4-triazol-C2H4ppG kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 9,16 (1H, s, H8 m<7>G), 8,06 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 7,71 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 6,00 (1H, d, J1'-2'= 2,7, H1' G ili m<7>G), 5,88 (1H, d, J1'-2'= 5,5, H1' G ili m<7>G), 4,80 (1H, preklopljen sa HDO, H2' G ili m<7>G), 4,69 (2H, dd, J1'-2'= 2,7, J3'-4'=5,1, H2' G ili m<7>G), 4,49-4,54 (2H, preklopljen H3' G i m<7>G), 4,35-4,39 (4H, preklopljen H4' G i m<7>G, HCH2(triazol)m7G), 4,18-4,33 (4H, preklopljen H5' i H5"G i m<7>G), 4,06 (3H, s, m<7>), 3,30 (2H, dt, JCH2(NH)-Pδ= 11,9, JCH2(NH)-CH2(triazol)m7G= 6,5, HCH2(NH)), 2,78 (2H, m, HCH2(triazol)Gili HCH2(P)), 1,99 (2H, m, HCH2(triazol)Gili HCH2(P));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 17,61-18,01 (1P, m, Pβ), -1,54 (1P, dt, JPδ-Pε= 21,3, JPδ-CH2(NH)= 11,9, Pδ), -10,27 (1P, br d, JPδ-Pε= 21,3, Pε), -10,52 (1P, br d, JPα-Pβ= 27,9, Pα); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 1003,1435, izračunato za C27H39N14O20P4-: 1003,1421; hidroliza u D2O: 11%.

m<7>GppC2H4-triazol-C2H4NHppG

[0071] Dobijen prema GP G od m<7>GppC4H5(375 mOD, 0,033 mmol, 100 mM) i GppNHC4H5N3(397 mOD, 0,033 mmol, 100 mM) uz mešanje sa CuSO4(1,6 mg, 0,0066 mmol, 20 mM) i natrijum askorbatom (2,6 mg, 0,013 mmol, 40 mM) u 0,328 mL H2O tokom 1 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (24,6 mg, 0,066 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>GppC2H4-triazol-C2H4NHppG kao amonijum so.

<1>H NMR (400 MHz, D2O, 25 °C) δH: 9,18 (1H, s, H8 m<7>G), 8,12 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 7,69 (1H, s, H8 G ili Htriazol), 6,02 (1H, d, J1'-2'= 3,5, H1' G ili m<7>G), 5,88 (1H, d, J1'-2'= 5,5, H1' G ili m<7>G), 4,72-4,76 (2H, preklopljen H2' G i m<7>G), 4,50-4,54 (2H, preklopljen H3' G i m<7>G), 4,40-4,43 (1H, m, H4 G ili m<7>G), 4,33-4,39 (2H, preklopljen H4' G ili m<7>G i H5' G ili m<7>G), 4,28 (2H, br t, JCH2(triazol)G-CH2(NH)= 6,6, HCH2(triazol)G), 4,17-4,29 (3H, preklopljen H5" G i m<7>G i H5' G ili m<7>G), 4,06 (3H, s, m<7>), 3,20-3,28 (2H, m, HCH2(NH)), 2,79-2,85 (2H, m, HCH2(triazol)m7G)ili HCH2(P)), 1,99-2,08 (2H, m, HCH2(triazol)m7G)ili HCH2(P));<31>P NMR (162 MHz, D2O, 25°C) δP: 17,61-18,10 (1P, m, Pδ), -1,64 (1P, dt, JPα-Pβ= 22,0, JPβ-CH2(NH)= 12,5, Pβ), -10,22 (1P, br d, JPα-Pβ= 22,0, Pα), -10,50 (1P, br d, JPδ-Pε= 24,9, Pε); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 1003,1444, izračunato za C27H39N14O20P4-: 1003,1421; hidroliza u D2O: 10%.

m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4NHppG (m2<7,2'-O>GppptC2H4NHppG)

[0072] Dobijen prema GP H od m2<7,2'-O>GpppC2H (377 mOD, 0,033 mmol, 50 mM) i GppNHC2H4N3(400 mOD, 0,033 mmol, 50 mM) uz mešanje sa CuSO4(3,3 mg, 0,013 mmol, 20 mM) i natrijum askorbatom (5,2 mg, 0,026 mmol, 40 mM) u 662 mL H2O:t-BuOH (2:1, v/v) tokom 0,5 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (48,4 mg, 0,13 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>Gppp-triazol-C2H4NHppG kao amonijum so.

<1>H NMR (500 MHz, Deuterijum Oksid) δ 9,13 (s, 1H, H8 m<7>G), 8,24 (s, 1H, H8 G ili Htriazol), 8,06 (s, 1H, H8 G ili Htriazol), 6,08 (d, J = 3,1 Hz, 1H, H1' m<7>G), 5,87 (d, J = 5,8 Hz, 1H, H1' G), 4,82 (ovelapped with HDO, 1H, H2' G), 4,59 (dd, J = 6,1, 4,9 Hz, 1H, H3' m<7>G), 4,52 (dd, J = 5,3, 3,7 Hz, 1H, H3' G), 4,42 (t, J = 6,4 Hz, 2H, HCH2-triazol), 4,35-4,26 (m, 4H, preklopljen H2' m<7>G, H4' G i m<7>G, H5' G ili m<7>G), 4,25 - 4,13 (m, 3H, preklopljen H5' G ili m<7>G, H5" G i m<7>G), 4,07 (s, 3H, m<7>), 3,59 (s, 3H, m<2'O>), 3,32 (dt, J = 12,6, 6,4 Hz, 2H, HCH2-NH);<31>P NMR (202 MHz, Deuterijum Oksid) δ -1,36 - -1,72 (m, 1P, Pβ), -6,34 (d, J = 21,8 Hz, 1P, Pδ), -10,04 - -10,29 (m, 1P, Pα), -10,49- -10,65 (m, 1P, Pζ), -22,34 (dd, J = 21,8, 19,7 Hz, 1P, Pε); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 1069,0946, izračunato za : C26H38N14O23P5<->1069,0928,

m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4OppG (m2<7,2'Oo>GppptC2H4OppG)

[0073] Dobijen prema GP H od m2<7,2'-O>GpppC2H (330 mOD, 0,029 mmol, 48 mM) i GppOC2H4N3(350 mOD, 0,029 mmol, 48 mM) uz mešanje sa CuSO4(2,9 mg, 0,012 mmol, 19 mM) i natrijum askorbatom (4,6 mg, 0,023 mmol, 38 mM) u 0,600 mL of H2O:t-BuOH (5:1, v/v) tokom 1 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (44,7 mg, 0,12 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>Gppp-triazol-C2H4OppG kao amonijum so.

<1>H NMR (500 MHz, Deuterijum Oksid) δ 9,15 (s, 1H, H8 G ili m<7>G ili Htriazol), 8,38 (s, 1H, H8 G ili m<7>G ili Htriazol), 8,30 (s, 1H, H8 G ili m<7>G ili Htriazol), 6,09 (d, J = 3,1 Hz, 1H, H1' m<7>G), 5,93 (d, J = 5,3 Hz, 1H, H1' G), 4,77 (t, 1H, preklopljen sa HDO, H2' G), 4,66 (t, J = 5,4 Hz, 2H, CH2linker CH2-N), 4,58 (dd, J = 6,0, 4,9 Hz, 1H, H3' m<7>G), 4,48 (dd, J = 5,1, 4,0 Hz, 1H, H3' G), 4,39 -4,26 (m, 6H, preklopljen H2' m 7G, CH2linker CH2-O, H4'G, H4' m<7>G, H5' G ili m7G), 4,11-4,23 (m, 3H, H4' m<7>G, H5' G ili m<7>G, H5' i H5" G ili m<7>G), 4,08 (s, 3H, m<7>), 3,59 (s, 3H, m<2'-O>);<31>P NMR (202 MHz, Deuterijum Oksid) δ -6,58 (d, J = 21,6 Hz, 1P), -10,08 - -10,87 (m, 3P, preklopljen ), - 22,34 (t, J = 20,6 Hz, 1P, Pδ); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 1070,0792, izračunato za : C26H37N13O24P5<->1070,0768,

m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4OpG (m2<7,2'-O>GppptC2H4OpG)

[0074] Dobijen prema GP H od m2<7,2'-O>GpppC2H (330 mOD, 0,029 mmol, 25 mM) ai GpOC2H4N3(350 mOD, 0,029 mmol, 25 mM) uz mešanje sa CuSO4(2,9 mg, 0,012 mmol, 10 mM) i natrijum askorbatom (4,6 mg, 0,023 mmol, 20 mM) u 1,150 mL H2O:t-BuOH (3:1, v/v) tokom 0,5 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (44,7 mg, 0,12 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>Gppp-triazol-C2H4OpG kao amonijum so.

1H NMR (500 MHz, Deuterijum Oksid) δ 9,14 (s, 1H, H8 G ili m<7>G Htriazol), 8,31 (s, 1H, H8 G ili m<7>G ili Htriazol), 8,05 (s, 1H, H8 G ili m<7>G Htriazol), 6,06 (d, J = 2,9 Hz, 1H, H1' m<7>G), 5,83 (d, J = 5,8 Hz, 1H, H1' G), 4,70 (dd, J = 5,2, 5,8 Hz, 1H, H2' G), 4,65 (t, J = 5,2 Hz, 2H, CH2

linker CH2-N3), 4,57 (dd, J = 6,3, 4,9 Hz, 1H, H3' m<7>G), 4,27-4,34 (m, 4H, preklopljen H2' m<7>G i H3' G, H4' G ili H5' ili H5" m<7>G), 4,27 - 4,22 (m, 1H, H4' G), 4,16-4,21 (m, 3H, preklopljen CH2 linker CH2-Oi H4' G ili H5' ili H5" m<7>G), 4,06 (s, 3H, m<7>), 3,87 (ddd, J = 11,6, 4,6, 2,9 Hz, 1H), 3,81 (ddd, J = 11,6, 5,2, 4,0 Hz, 1H), 3,60 (s, 3H, m<2'-O>);<31>P NMR (202 MHz, Deuterijum Oksid) δ 0,65-0,67 (m, 1P, Pα), -6,73 (d, J = 22,2 Hz, 1P, Pγ), -10,49--10,69 (m, 1P, Pε), -22,36 (dd, J = 22,2, 18,7 Hz, 1P, Pδ); HRMS (-) ESIm/z dobijeno : 990,1097, izračunato za : C26H36N13O21P4<->990,11047,

m2<7,2'-O>Gpp-triazol-C2H4OppG (m2<7,2'-O>GpptC2H4OppG)

[0075] Dobijen prema GP H od m2<7,2'-O>GppC2H (330 mOD, 0,029 mmol, 48 mM) i GppOC2H4N3(350 mOD, 0,029 mmol, 48 mM) uz mešanje sa CuSO4(2,9 mg, 0,012 mmol, 19 mM) i natrijum askorbatom (4,6 mg, 0,023 mmol, 38 mM) u 0,600 mL H2O:t-BuOH (5:1, v/v) tokom 1 h. Nakon zaustavljanja reakcije dodatkom Na2EDTA (44,7 mg, 0,12 mmol), proizvod je podvrgnut prečišćavanju na RP HPLC pri čemu je dobijen m<7>Gpp-triazol-C2H4OppG kao amonijum so.

<1>H NMR (500 MHz, Deuterijum Oksid) δ 9,13 (s, 1H, H8 G ili m<7>G ili Htriazol), 8,31 (s, 1H, H8 G ili m<7>G ili Htriazol), 8,09 (s, 1H, H8 G ili m<7>G ili Htriazol), 6,06 (d, J = 3,0 Hz, 1H, H1' m<7>G), 5,85 (d, J = 6,0 Hz, 1H, H1' G), 4,75 (dd, J = 5,1, 6,0 Hz, 1H, H2' G), 4,68 (t, J = 5,1 Hz, 2H, CH2linker CH2-N), 4,53 (dd, J = 6,1, 4,9 Hz, 1H, H3 m<7>G), 4,47 (dd, J = 5,1, 3,4 Hz, 1H, H3' G), 4,38 - 4,29 (m, 5H, preklopljen preklopljen H2' m<7>G, CH2linker CH2-O, H4'G, H4' m<7>G), 4,26 (ddd, J = 11,9, 4,7, 2,6 Hz, 1H, H5' G ili m7G), 4,12-4,19 (m, 2H, preklopljen H5' G ili m<7>G, H5" G ili m<7>G), 4,05-4,10 (m, 1H, H5" G ili m<7>G), 4,04 (s, 3H, m<7>), 3,59 (s, 3H, m<2'-O>);<31>P NMR (202 MHz, Deuterijum Oksid) δ -6,52 (d, J = 24,3 Hz, 1P), -10,70- -10,37 (m, 3P); HRMS (-) ESI m/z dobijeno : 990,1133, izračunato za : C26H36N13O21P4<->990,1105, Primer 2 - ODređivanje KASza komplekse analog kapice-eIF4E

[0076] Konstante asocijacije za komplekse analog kapice-eIF4E određivane su metodom titracije gašenjem fluorescencije kao što je prethodno opisano.<42>Merenja su izvedena pomoću kvarcne kivete sa optičkom dužinom puta od 4 mm za apsorpciju i 10 mm za emisiju na LS-50B spektrofluorometru Perkin-Elmer Co. (Waltham, MA, USA). Titracionii eksperimenti su izvedeni na 20 ° C u 50 mM Hepes / KOH puferu, pH 7,20 koji sadrži 100 mM KCI, 0,5 mM EDTA i 1 mM DTT. Tokom eksperimenta, 1 µl alikvota rastvora liganda je dodato u 1400 µl 0,1 µM rastvora proteina. Fluorescencija proteina je praćena na 337 ili 345 nm (ekscitacija 280 ili 295 nm, respektivno). Za analizu podataka primenjena je korekcija intenziteta fluorescencije za razblaženje uzorka i efekat unutrašnjeg filtera. Konstante asocijacije su određene tako da odgovaraju teorijskoj zavisnosti intenziteta fluorescencije od ukupne koncentracije liganda. Svaki eksperiment je izveden u triplikatu, konstante asocijacije su izračunate kao prosečne težine.

[0077] Tabela 2. Navodi vrednosti za KASza komplekse elF4E i odabrane fosfotriazolne analoge kapica u odnosu na referentne analoge kapica.

TABELA 2

[0078] Primer 3 – Ugradnja analoga dinukleotidnih kapica na 5' kraju transkripta Tabela 3. Navodi sekvence DNK i RNK oligonukleotida koji su upotrebljeni u ekspreimentima molekularne biologije.

4

3.1. Sinteza transkripata za određivanje efikasnosti mdoficikacija

[0079] Pre in vitro transkripcije izvršeno je sparivanje templata DNK1 (SEQ ID NO: 1) i DNK2 (SEQ ID NO: 2) (svaka po 20 µM) se inkubirane u prisustvu 4 mM Tris-HCl pH 8,0, 15 mM NaCl i 0,1 mM EDTA na 95 ° C tokom 2 min i zatim na sobnoj temperaturi 30 min. Nakon 10-strukog razblaženja, smeša je direktno korišćena za in vitro transkripciju.

[0080] In vitro transkripcija izvedena je na prethodno vezanim DNK1 (SEQ ID NO: 1) i DNK2 (SEQ ID NO: 2) (svaka po 20 µM) DNK2 (SEQ ID NO: 2) (20 µM each) sa SP6 RNK polimerazom (New England BioLabs) (1 U/µl) u prisustvu 1 x RNK Pol reakcionog pufera (New England BioLabs), 5 mM DTT, RiboLock RNase inhibitora (ThermoFisher Scientific) (2,0 U/µl), 0,5 mM UTP, 0,5 mM ATP, 0,5 mM CTP, 0,125 mM GTP i 1,25 mM odgovarajućeg dinukleotidnih analoga kapice sa modifikovanim triazolom (m2<7,2'-O>Gppptriazol-G, m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4NHpG, m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4NHppG, m2<7,2'-O>Gppptriazol-C2H4OppG, m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4OpG, m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4OppG) i referentni GpppG, m<7>GpppG i m2<7,3'-O>GpppG.<6>Reakciona smeša je inkubirana na 40 ° C tokom 1,5 h, posle čega je dodata TURBO DNKse (Ambion) (0,1 U/µl) i inkubirana na 37 ° C tokom dodatnih 30 min. Reakcija je ugašena dodatkom 2 µl 0,5 M EDTA pH 8,0 i prečišćena sa RNK Clean & Concentrator-5 kompletom (Zymo Research) da bi se dobili modifikovnai lanci RNK1 (SEQ ID NO: 4).

[0081] Da bi se smanjila heterogenost, svaka modifikovana RNK1 (11,42 ng / µl, približno 1 uM) je inkubirana u prisustvu 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM MgCl2, MgCl2, RiboLock RNase Inhibitora (ThermoFisher Scientific) (2, 0 U / µl) i DNK3 (SEQ ID NO: 3) (1 µM) na 37 ° C tokom 1 h da bi se dobila RNK2 (SEQ ID NO: 5).<44>Reakcija je zaustavljena zamrzavanjem u tečnom azotu i direktno analizirana sa PAGE (Sl.3).

[0082] Relativni intenzitet opsega određen je korišćenjem CLIQS v1.0 program.

Primer 4 – Ispitivanja translacije

4.1. Sinteza transkripata

[0083] In vitro transkripcija izvedena je na PCR proizvodu koji kodira Firefly luciferazu pod kontrolom promotora SP6 (dobijen od pGEN-luc (Promega) upotrebom prajmera: DNK4 (SEQ ID NO: 6) i DNK5 (SEQ ID NO:7) (5 ng/µl) sa SP6 RNK polimerazom (1 U / µl) ) (New England BioLabs) u prisustvu 1 x RNK Pol reakcionog pufera (Nev England BioLabs), 5 mM DTT, RiboLock RNase inhibitora (ThermoFisher Scientific) (2,0 U/µl), 0,5 mM UTP, 0,5 mM ATP, 0,5 mM CTP, 0,125 mM GTP i 1,25 mM odgovarajućeg triazol-modifikovane dinukleotidne kapice i referentnog GpppG, m<7>GpppG i m2<7,3'-O>GpppG. Reakciona smeša je inkubirana na 40 ° C tokom 1,5 h, posle čega je dodat TURBO DNKse (Ambion) (0,1 U/µl) i inkubano na 37 ° C tokom dodatnih 30 minuta. Reakcija je ugašena dodatkom 2 µl 0,5 M EDTA pH 8,0 i prečišćeno sa NucleoSpin RNA Clean-up KSS kompletom (Macherey-Nagel) da bi se dobile luciferaza- kodirajući RNK lanci sa modifikovani odgovarajućim analognim kapicama.

4.2. Translacija

[0084] Za svaku luciferaza-kodirajuću RNK sa kapicom pripremljena su četiri razblažena rastvora - 3,0 ng/µl, 1.5 ng/µl, 0,75 ng/µl, 0,375 ng/µl. Ispitivanja translacije izvedena su upotrebom sistema zečjeg retikulocitnog lizata (Rabbit Reticulocyte Lysate System, Promega).

9 µl smeše koja sadrži zečji retikulocitni lizat (4 µl), smešu aminokiselina bez leucina (Amino

Acid Mixture Minus Leucine) (0,05 µl 1 mM rastvora), smešu aminokiselina bez metionina (Amino Acid Mixture Minus Methionine) (0,05 µl 1 mM rastvora), kalijum acetata (1,9 µl 1 M rastvora), MgCl2(0,4 µl 25 mM rastvora) i 2,1 µl vode inkubirano je na 30 ° C tokom 1 h, nakon čega je dodat 1 µl odgovarajućeg rastvora luciferaza-kodirajuće RNK i inkubacija reakcije nastavljena je na 37 ° C još jedan sat. Reakcija je zaustavljena zamrzavanjem u tečnom azotu.

[0085] Efikasnost translacije određena je korišćenjem Luciferaza Reporter Sistema (Promega). Uzorci su odmrzavani neposredno pre eksperimenta. U svaki uzorak dodato je 50 µl reakcionog agensa za ispitivanje luciferaze (Luciferase Assay Reagent ) neposredno pre merenja luminiscencije na Synergy H1 Microplate Reader (Bio Tek). Merenje je obavljeno za po četiri uzorka nezavisno zbog niske stabilnosti signala luminescencije. Rezultati su predstavljeni na Slici 4 kao proporcije između koeficijenata regresije linearnih odnosa između kondentracije luciferaza-koridajuće RNK sa kapicom u reakciji translacije (300 pg/µl, 150 pg/µl, 75 pg/µl, 37,5 pg/µl) i odgovarajućeg signala luminiscencije.

[0086] Tabela 4. prikazuje efikasnost omodifikacije kratkih oligonukleotida koji na krajevima imaju analoge fospotriazolnih kapica i efikasnosti translacije u zečjim retikulocitnim lizatima za iRNK koji kodiraju luciferazu svica modifikovane različitim analozima fosfotriazolnih kapica. Takođe navodi odgovarajuće podatake za nemodifikovani analog kapica (m<7>GpppG), modifikovani ARCA (m2<7,3'-O>GpppG), i primere analoga kapica koji sadrže triazolnu grupu unutar nukleozidnog ostatka radi poređenja (m<7>GtpppG i m<7>GtCH2OpppG).

TABELA 4

4

Primer 5 Susceptibilnost na degradaciju pomoću hDcp2

[0087] Reakciona smeša koja sadrži sintetizovanu RNK2 (SEQ ID NO: 5) modifikovanu sa m2<7,3'-O>GpppG, m2<7,2'-O>Gppp-triazol-G i m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4NHpG (za detalje o sinteza vidi 1.4.1) je istaložena i pelet je rastvoren u vodi i inkubiran u prisustvu 1 x TURBO DNase pufera (Ambion), RiboLock RNase inhibitora (ThermoFisher Scientific) (2,0 U / µl) i TURBO Dnase (Ambion) ) (0,1 U/µl) na 37 ° C tokom 30 min. Zatim je reakcija podvrgnuta ekstrakciji fenol-hloroform, praćeno taloženjem. Dobijeni vodeni rastvor RNK2 direktno je korišćen za eksperimente uklanjanja kapica katalizovanim sa Dcp2.

[0088] Odgovarajuća RNK2 je inkubirana u prisustvu 50 mM NH4Cl, 5 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,01% IGEPAL CA-630 (Sigma Aldrich), 2mM MnCl2, 1 mM DTT ai 7 nM hDcp2 na 37 °C. Sakupljeni su alikvoti reakcije od 5 µl nakon 5, 15, 30, 60 min inkubacije ili neposredno nakon dodavanja enzima ("0 min" vremenska tačka) i ugašeno bojom za nanošenje (5 M urea, 44% formamid, 20 mM EDTA , 0,03% bromfenol plava, 0,03% ksilen cijanol ) i direktno analizirano sa 15% PAGE (Sl.5).

Primer 6 - Ispitivanja stabilnosti

[0089] Analozi m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4NHppG, m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4OppG, m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4OpG, m2<7,2'-O>Gppp-triazol-C2H4OppG su inkubirani u zaptivenim bočicama u koncentraciji od 20 µM i na sobnoj temperaturi u četiri različita pufera: 0,1 M formatni puffer pH 3,0, 0,1 M acetatni pufer pH 5,0, 0,1 M HEPES pH 7,0 i 0,1 M boratni pufer pH 9,0. Uzorci od 50 µl za svaki od uslova su uzeti nakon 0, 2 i 24 sata i analizirani pomoću RP HPLC. Površina ispod pika polaznog jedinjenja određena je za svaku vremensku tačku i izračunat je % preostale kapice u odnosu na vremensku tačku 0 h.

TABELA 5

REFRENCE

[0090] (Brojevi u prijavi napisani gornjim indeksom označavaju jedan od dokumenata dati u daljem tekstu, na koje se pozivaju)

1. Moore, M., From birth to death: The complex lives of eukaryotic mRNAs. Science 2005, 309 (5740), 1514-1518.

2. Ziemniak, M.; Strenkowska, M.; Kowalska, J.; Jemielity, J., Potential therapeutic applications of RNA cap analogs. Future Medicinal Chemistry 2013, 5 (10), 1141-1172.

3. Grudzien-Nogalska, E.; Stepinski, J.; Jemielity, J.; Zuberek, J.; Stolarski, R.; Rhoads, R. E.; Darzynkiewicz, E., Synthesis of anti-reverse cap analogs (ARCAs) and their applications in mRNA translation and stability. Translation Initiation: Cell Biology, High-Throughput Methods, and Chemical-Based Approaches 2007, 431, 203-227.

4. Sahin, U.; Kariko, K.; Tureci, O., mRNA-based therapeutics - developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery 2014, 13 (10), 759-780.

5. Stepinski, J.; Waddell, C.; Stolarski, R.; Darzynkiewicz, E.; Rhoads, R. E., Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl(3 '-O-

4

methyl)GpppG and 7-methyl(3 '-deoxy)GpppG. Rna-a Publication of the Rna Society 2001, 7 (10), 1486-1495.

6. Jemielity, J.; Fowler, T.; Zuberek, J.; Stepinski, J.; Lewdorowicz, M.; Niedzwiecka, A.; Stolarski, R.; Darzynkiewicz, E.; Rhoads, R. E., Novel "anti-reverse" cap analogs with superior translational properties. Rna-a Publication of the Rna Society 2003, 9 (9), 1108-1122.

7. Jemielity, J.; Kowalska, J.; Rydzik, A. M.; Darzynkiewicz, E., Synthetic mRNA cap analogs with a modified triphosphate bridge - synthesis, applications and prospects. New Journal of Chemistry 2010, 34 (5), 829-844.

8. Grudzien-Nogalska, E.; Jemielity, J.; Kowalska, J.; Darzynkiewicz, E.; Rhoads, R. E., Phosphorothioate cap analogs stabilize mRNA and increase translational efficiency in mammalian cells. Rna-a Publication of the Rna Society 2007, 13 (10), 1745-1755.

9. Kuhn, A. N.; Diken, M.; Kreiter, S.; Selmi, A.; Kowalska, J.; Jemielity, J.; Darzynkiewicz, E.; Huber, C.; Tureci, O.; Sahin, U., Phosphorothioate cap analogs increase stability and translational efficiency of RNA vaccines in immature dendritic cells and induce superior immune responses in vivo. Gene Therapy 2010, 17 (8), 961-971.

10. Grudzien, E.; Kalek, M.; Jemielity, J.; Darzynkiewicz, E.; Rhoads, R. E., Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs. Journal of Biological Chemistry 2006, 281 (4), 1857-1867.

11. Gates, K. S.; Nooner, T.; Dutta, S., Biologically relevant chemical reactions of N7-alkylguanine residues in DNA. Chemical Research in Toxicology 2004, 17(7), 839-856.

12. Mikkola, S.; Salomaki, S.; Zhang, Z.; Maki, E.; Lonnberg, H., Preparation and properties of mRNA 5 '-cap structure. Current Organic Chemistry 2005, 9 (10), 999-1022.

13. Kadokura, M.; Wada, T.; Urashima, C.; Sekine, M., Efficient synthesis of gammamethyl-capped guanosine 5'-triphosphate as a 5'-terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate bond formation involving activation of methyl phosphorimidazolidate using ZnCl2 as a catalyst in DMF under anhydrous conditions. Tetrahedron Letters 1997, 38 (48), 8359-8362.

14. Jessen, H. J.; Ahmed, N.; Hofer, A., Phosphate esters and anhydrides - recent strategies targeting nature's favoured modifications. Organic & Biomolecular Chemistry 2014, 12 (22), 3526-3530.

15. Kowalska, J.; Lewdorowicz, M.; Zuberek, J.; Grudzien-Nogalska, E.; Bojarska, E.; Stepinski, J.; Rhoads, R. E.; Darzynkiewicz, E.; Davis, R. E.; Jemielity, J., Synthesis and characterization of mRNA cap analogs containing phosphorothioate substitutions that bind tightly to elF4E and are resistant to the decapping pyrophosphatase DcpS. Rna-a Publication of the Rna Society 2008, 14 (6), 1119-1131.

16. Schulz, D.; Rentmeister, A., Current Approaches for RNA Labeling in Vitro and in Cells Based on Click Reactions. Chembiochem 2014, 15 (16), 2342-2347.

4

17. Phelps, K.; Morris, A.; Beal, P. A., Novel Modifications in RNA. Acs Chemical Biology 2012, 7 (1), 100-109.

18. Luo, Y.; Eldho, N. V.; Sintim, H. O.; Dayie, T. K., RNAs synthesized using photocleavable biotinylated nucleotides have dramatically improved catalytic efficiency. Nucleic Acids Research 2011, 39 (19), 8559-8571.

19. Dojahn, C. M.; Hesse, M.; Arenz, C., A chemo-enzymatic approach to specifically click-modified RNA. Chemical Communications 2013, 49 (30), 3128-3130.

20. Seidu-Larry, S.; Krieg, B.; Hirsch, M.; Helm, M.; Domingo, O., A modified guanosine phosphoramidite for click functionalization of RNA on the sugar edge. Chemical Communications 2012, 48 (89), 11014-11016.

21. Samanta, A.; Krause, A.; Jaeschke, A., A modified dinucleotide for site-specific RNA-labelling by transcription priming and click chemistry. Chemical Communications 2014, 50 (11), 1313-1316.

22. Schulz, D.; Holstein, J. M.; Rentmeister, A., A Chemo-Enzymatic Approach for Site-Specific Modification of the RNA Cap. Angewandte Chemie-International Edition 2013, 52 (30), 7874-7878.

23. Yamada, T.; Peng, C. G.; Matsuda, S.; Addepalli, H.; Jayaprakash, K. N.; Alam, M. R.; Mills, K.; Maier, M. A.; Charisse, K.; Sekine, M.; Manoharan, M.; Rajeev, K. G., Versatile Site-Specific Conjugation of Small Molecules to siRNA Using Click Chemistry. Journal of Organic Chemistry 2011, 76 (5), 1198-1211.

24. Averick, S. E.; Paredes, E.; Dey, S. K.; Snyder, K. M.; Tapinos, N.; Matyjaszewski, K.; Das, S. R., Autotransfecting Short Interfering RNA through Facile Covalent Polymer Escorts. Journal of the American Chemical Society 2013, 135 (34), 12508-12511.

25. Dohmen, C.; Froehlich, T.; Laechelt, U.; Roehl, I.; Vornlocher, H.-P.; Hadwiger, P.; Wagner, E., Defined Folate-PEG-siRNA Conjugates for Receptor-specific Gene Silencing. Molecular Therapy-Nucleic Acids 2012, 1.

26. Iversen, F.; Yang, C.; Dagnaes-Hansen, F.; Schaffert, D. H.; Kjems, J.; Gao, S., Optimized siRNA-PEG Conjugates for Extended Blood Circulation and Reduced Urine Excretion in Mice. Theranostics 2013, 3 (3), 201-209.

27. Paredes, E.; Das, S. R., Click Chemistry for Rapid Labeling and Ligation of RNA. Chembiochem 2011, 12(1), 125-131.

28. Birts, C. N.; Sanzone, A. P.; EI-Sagheer, A. H.; Blaydes, J. P.; Brown, T.; Tavassoli, A., Transcription of Click-Linked DNA in Human Cells. Angewandte Chemie-International Edition 2014, 53 (9), 2362-2365.

29. EI-Sagheer, A. H.; Sanzone, A. P.; Gao, R.; Tavassoli, A.; Brown, T., Biocompatible artificial DNA linker that is read through by DNA polymerases and is functional in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2011, 108 (28), 11338-11343.

4

30. EI-Sagheer, A. H.; Brown, T., New strategy for the synthesis of chemically modified RNA constructs exemplified by hairpin and hammerhead ribozymes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010, 107 (35), 15329-15334.

31. Chen, X.; EI-Sagheer, A. H.; Brown, T., Reverse transcription through a bulky triazole linkage in RNA: implications for RNA sequencing. Chemical Communications 2014, 50 (57), 7597-7600.

32. Efthymiou, T. C.; Vanthi, H.; Oentoro, J.; Peel, B.; Desaulniers, J.-P., Efficient synthesis and cell-based silencing activity of siRNAS that contain triazole backbone linkages. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2012, 22 (4), 1722-1726.

33. Mutisya, D.; Selvam, C.; Kennedy, S. D.; Rozners, E., Synthesis and properties of triazole-linked RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2011, 21 (11), 3420-3422.

34. Piecyk, K.; Lukaszewicz, M.; Darzynkiewicz, E.; Jankowska-Anyszka, M., Triazolecontaining monophosphate mRNA cap analogs as effective translation inhibitors. Rna-a Publication of the Rna Society 2014, 20(10), 1539-1547.

35. Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B., Click chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions. Angewandte Chemie-International Edition 2001, 40(11), 2004-+.

36. Rydzik, A. M.; Lukaszewicz, M.; Zuberek, J.; Kowalska, J.; Darzynkiewicz, Z. M.; Darzynkiewicz, E.; Jemielity, J., Synthetic dinucleotide mRNA cap analogs with tetraphosphate 5 ',5 ' bridge containing methylenebis(phosphonate) modification. Organic & Biomolecular Chemistry 2009, 7(22), 4763-4776.

37. Rydzik, A. M.; Kulis, M.; Lukaszewicz, M.; Kowalska, J.; Zuberek, J.; Darzynkiewicz, Z. M.; Darzynkiewicz, E.; Jemielity, J., Synthesis and properties of mRNA cap analogs containing imidodiphosphate moiety - Fairly mimicking natural cap structure, yet resistant to enzymatic hydrolysis. Bioorganic and Medicinal Chemistry 2012, 20(5), 1699-1710.

38. Wanat, P.; Walczak, S.; Wojtczak, B. A.; Nowakowska, M.; Jemielity, J.; Kowalska, J., Ethynyl, 2-Propynyl, and 3-Butynyl C-Phosphonate Analogues of Nucleoside Di- and Triphosphates: Synthesis and Reactivity in CuAAC. Organic Letters 2015, 17(12), 3062-3065.

39. Bandyopadhyay, S.; Mukherjee, S.; Dey, A., Modular synthesis, spectroscopic characterization and in situ functionalization using "click" chemistry of azide terminated amide containing self-assembled monolayers. Rsc Advances 2013, 3 (38), 17174-17187.

40. Mukaiyam.T; Hashimot.M, SYNTHESIS OF OLIGOTHYMIDYLATES AND NUCLEOSIDE CYCLIC PHOSPHATES BY OXIDATION-REDUCTION CONDENSATION. Journal of the American Chemical Society 1972, 94 (24), 8528-&.

41. Guranowski, A.; Wojdyla, A. M.; Rydzik, A. M.; Stepinski, J.; Jemielity, J., Plant nucleoside 5 '-phosphoramidate hydrolase; simple purification from yellow lupin (Lupinus luteus) seeds and properties of homogeneous enzyme. Acta Biochimica Polonica 2011, 58 (1), 131-136.

4

42. Niedzwiecka, A.; Marcotrigiano, J.; Stepinski, J.; Jankowska-Anyszka, M.; Wyslouch-Cieszynska, A.; Dadlez, M.; Gingras, A. C.; Mak, P.; Darzynkiewicz, E.; Sonenberg, N.; Burley, S. K.; Stolarski, R., Biophysical studies of elF4E cap-binding protein: Recognition of mRNA 5 ' cap structure and synthetic fragments of elF4G and 4E-BP1 proteins. Journal of Molecular Biology 2002, 319 (3), 615-635.

43. Zuberek, J.; Jemielity, J.; Jablonowska, A.; Stepinski, J.; Dadlez, M.; Stolarski, R.; Darzynkiewicz, E., Influence of electric charge variation at residues 209 and 159 on the interaction of elF4E with the mRNA 5' terminus. Biochemistry 2004, 43 (18), 5370-5379.

44. Coleman, T. M.; Wang, G. C.; Huang, F. Q., Superior 5 ' homogeneity of RNA from ATP-initiated transcription under the T7 phi 2.5 promoter. Nucleic Acids Research 2004, 32 (1).

45. Walczak S. et al. Synthesis and properties of dinucleotide cap analogs containing a triazole ring within the oligophosphate bridge, Collection of Czechoslovak Chemical Communications, 2015, Volume 14, Pages 289-290.

46. Warminski, M.; Kowalska, J.; Buck, J.; Zuberek, J.; Lukaszewicz, M.; Nicola, C.; Kuhn, A.N.; Sahin, U.; Darzynkiewicz, E.; Jemielity, J.; The synthesis of isopropylidene mRNA cap analogs modified with phosphorothioate moiety and their evaluation as promoters of mRNA translation, Bioorg Med Chem Lett.2013, 23(13), 3753-8.

4

1

2

Claims (11)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule (I)

   ili njegov stereoizomer ili so, gde R<1>i R<2>su odabrani iz grupe koju čine N, N<+>-CH3, N<+>-C2H5, N<+>-C3H8, N<+>-C4H5, N<+>-CH2C6H5pri čemu barem jedan od R<1>, R<2>nije N. n i m su nezavisno odabrani iz grupe koju čine 0, 1 i 2; X je odabrano iz grupe koju čine O, NH, S, CH2 k je 1 ili 2 Y nije prisutan ili je odabran iz grupe koju čine -CH2-, -CH2CH2-, -CH2O-, -CH2S-, -CH2NH-,-CH2CH2O-, -CH2CH2NH-, -CH2CH2S-R<3>, R<4>, R<5>, R<6>su odabrani iz grupe koju čine H, OH, OCH3, ili OCH2CH3; pri čemu R<3>i R<4>mogu biti isti ili različiti; R<5>i R<6>mogu biti isti ili različiti; ako bilo koji od R<3>, R<4>je različit od OH tada oba R<5>i R<6>su OH; ako bilo koji od R<5>, R<6>je različit od OH tada oba R<3>i R<4>su OH.
2. 2. Jedinjenje prema zahtevu 1, gde R<1>je N<+>-CH3, R<3>i R<4>su odabrani iz grupe koju čine OH i OCH3i barem jedan od R<3>, R<4>nije OH, oba R<5>i R<6>su OH, i n je najmanje 1.
3. 3. Jedinjenje prema zahtevu 1, gde R<2>je N<+>-CH3, R<5>i R<6>su odabrani iz grupe koju čine OH i OCH3i barem jedan od R<5>, R<6>nije OH, oba R<3>i R<4>su OH, i m je najmanje 1.
4. 4. Jedinjenje prema zahtevu 1, gde je jedinjenje odabrano iz grupe koju čine sledeća jedinjenja: 4
5. 5. Kompozicija koja sadrži barem jedno od jedinjenja kao što je definisano u jednom od zahteva 1-4 ili barem jedan njegov stereoizomer ili so i odgovarajući nosač ili diluent.
6. 6. Molekul RNK čiji 5' kraj uključuje jedinjenje kao što je definisao u jednom od zahteva 1-4.
7. 7. Postupak in vitro sinteze molekula RNK kao što je definisan u zahtevu 6, gde postupak obuhvata reakciju ATP, CTP, UTP, i GTP, jedinjenje prema jednom od zahteva 1-4 ili kompozicija prema zahtevu 5, i polinukleotidni templat u prisustvu RNK polimeraze, pod uslovima koji omogućavaju transkripciju pomoću RNK polimeraze polinukleotidnog templata u kopiju RNK; pri čemu u neke od kopija RNK će se ugraditi jedinjenje prema jednom od zahteva 1-4 pri čemu nastaje molekul RNK kao što je definisano u zhtevu 6,
8. 8. Postupak in vitro sinteze proteina ili peptida, gde dati postupak obuhvata translaciju molekula RNK kao što je definisano u zhatevu 6 u sistemu sinteze proteina bez ćelija, gde RNK molekul sadrži otvoreni okvir čitanja, pod uslovima koji omogućavaju translaciju otvorenog okvira čitanja molekula RNK u protein ili peptid koji je kodiran otvorenim okvirom čitanja.
9. 9. Postupak sinteze proteina ili peptida u kultivisanim ćelijama, pri čemu navedeni postupak obuhvata translaciju molekula RNK kako je definisano u patentnom zahtevu 6 u kultivisanim ćelijama, pri čemu molekul RNK sadrži otvoreni okvir za čitanje, pod uslovima koji omogućavaju translaciju otvorenog okvira čitanja molekula RNK u protein ili peptid kodiran pomenutim otvorenim okvirom čitanja.
10. 10. Upotreba jedinjenja kako je definisano u jednom od zahteva 1-4 ili kompozicije kao što je definisano u zahtevu 5 u in vitro sintezi molekula RNK.
11. 11. Upotreba molekula RNK kao što je definisano u zahtevu 6 u in vitro sintezi proteina ili peptida.