RS60852B1 - Upotreba kanabidiolne kiseline u lečenju epilepsije - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na terapijski efikasnu količinu kanabidiolne kiseline (CBDA) za upotrebu u lečenju epilepsije. CBDA je u obliku visoko prečišćenog ekstrakta kanabisa, tako da je CBDA prisutna u više od 98% ukupnog ekstrakta (tež./tež.) ili je proizvedena sintetički. U jednom primeru izvođenja CBDA se upotrebljava u lečenju generalizovanih napada, poželjno tonično-kloničnih napada.

[0002] Poželjno, kanabinoidi tetrahidrokanabinol (THC) ili tetrahidrokanabinolna kiselina (THCA) su suštinski uklonjeni.

[0003] Pri upotrebi, CBD može da se upotrebljava istovremeno sa jednim ili više drugih antiepileptičkih lekova (AED). Alternativno, CBDA može da bude formulisana za primenu odvojeno, uzastopno ili istovremeno sa jednim ili više AED, ili se može obezbediti kombinacija u jednom doznom obliku. Kada je CBDA formulisana za odvojenu, uzastopnu ili istovremenu primenu, može da bude obezbeđena kao komplet, ili zajedno sa uputstvima za primenu jedne ili više komponenti na naznačen način. Može se upotrebljavati i kao jedini lek, tj. kao monoterapija.

OSNOV PRONALASKA

[0004] Epilepsija se javlja kod približno 1% svetske populacije, (Thurman et al., 2011) od čega je 70% u stanju da adekvatno kontroliše svoje simptome dostupnim postojećim antiepileptičkim lekovima (AED). Međutim, 30% od ove grupe pacijenata, (Eadie et al., 2012), nije u stanju da se oslobodi napada upotrebom AED koji su dostupni, i kao takvi su označeni kao oni koji pate od uporne ili "epilepsije otporne na lečenje" (TRE).

[0005] Međunarodna liga protiv epilepsije (ILAE) je 2009. godine definisala upornu ili epilepsiju otpornu na lečenje kao "neuspeh adekvatnih ispitivanja dva tolerisana i na odgovarajući način odabrana i upotrebljena AED rasporeda (bilo kao monoterapije ili u kombinaciji) da postignu trajno oslobađanje od napada" (Kwan et al., 2009).

[0006] Osobe koje razviju epilepsiju tokom prvih nekoliko godina života je često teško lečiti, i kao takve se često nazivaju otpornim na lečenje. Deca koja u detinjstvu pretrpe učestale napade često ostaju sa neurološkim oštećenjem koje može prouzrokovati kognitivna, bihejvioralna i motorička kašnjenja.

[0007] Dečja epilepsija je relativno uobičajen neurološki poremećaj kod dece i mladih odraslih osoba sa prevalencom od približno 700 na 100.000. Ovo je duplo veći broj od broja odraslih osoba sa epilepsijom po populaciji.

[0008] Kada se detetu ili mladoj odrasloj osobi ispolji napad, normalno se preduzimaju istrage kako bi se istražio uzrok. Dečja epilepsija može biti uzrokovana mnogim različitim sindromima i genetičkim mutacijama, i zbog toga postavljanje dijagnoze za ovu decu može potrajati neko vreme.

[0009] Glavni simptom epilepsije su ponovljeni napadi. Kako bi se odredio tip epilepsije ili epileptičkog sindroma od koga pacijent pati, preduzima se ispitivanje tipa napada koje pacijent doživljava. Sprovode se klinička posmatranja i testovi elektroencefalografije (EEG) i tip/tipovi napada se klasifikuju u skladu sa ILAE klasifikacijom koja je opisana ispod i na slici 1.

[0010] Međunarodna klasifikacija tipova napada koje je predložila ILAE usvojena je 1981. godine i revidirani predlog je objavljen od strane ILAE 2010. godine i još nije zamenio klasifikaciju iz 1981. godine. Slika 1 je prilagođena iz predloga iz 2010. godine za revidiranu terminologiju i uključuje predložene promene za zamenu termina "parcijalna" terminom "fokalna". Pored toga, termin "jednostavni parcijalni napad" zamenjen je terminom "fokalni napad gde svesnost/odzivnost nije poremećena", a termin "kompleksni parcijalni napad" zamenjen je terminom "fokalni napad gde je svesnost/svest poremećena".

[0011] Sa slike 1 može se videti da se generalizovani napadi, gde napad nastaje unutar i brzo zahvata bilateralno distribuirane mreže, mogu podeliti u šest podtipova: tonično-klonični (grand mal) napadi; apsans (petit mal) napadi; klonični napadi; tonični napadi; atonični napadi i mioklonični napadi.

[0012] Fokalni (parcijalni) napadi kod kojih napad potiče unutar mreža ograničenih na samo jednu hemisferu, takođe su podeljeni na potkategorije. Ovde se napad karakteriše u skladu sa jednom ili više odlika napada, uključujući auru, motorne odlike, autonomne odlike i svesnost/odzivnost. Kada napad počinje kao lokalizovani napad i brzo evoluira kako bi se distribuirao unutar bilateralnih mreža, taj napad je poznat kao bilateralni konvulzivni napad, što je terminologija koja je predložena da zameni sekundarne generalizovane napade (generalizovani napadi koji su evoluirali iz fokalnih napada i više ne ostaju lokalizovani).

[0013] Fokalni napadi kod kojih je svesnost/odzivnost subjekta izmenjena označavaju se kao fokalni napadi sa poremećajema a fokalni napadi kod kojih svesnost ili odzivnost subjekta nije poremećena označavaju se kao fokalni napadi bez poremećaja.

[0014] Fokalni napadi mogu da se jave kod epileptičkih sindroma uključujući: Lenoks-Gastoov (Lennox-Gastaut) sindrom; tuberozni sklerozni kompleks; Dravetov (Dravet) sindrom; CDKL5; neuronalne ceroidne lipofuscinoze (NCL); epileptički sindrom povezan sa febrilnom infekcijom (FIRES); Ekardijev (Aicardi) sindrom i abnormalnosti mozga.

[0015] Epileptički sindromi često su predstavljeni velikim brojem različitih tipova napada i identifikovanje tipova napada od kojih pacijent pati je važno, budući da su mnogi standardni AED usmereni na lečenje datog tipa napada, ili su efikasni samo protiv datog tipa/podtipa napada.

[0016] Uobičajeni AED definisani pomoću mehanizama delovanja opisani su u sledećim tabelama:

Tabela 1. Primeri AED uskog spektra

Tabela 2. Primeri AED širokog spektra

Tabela 3. Primeri AED koji se upotrebljavaju specifično kod dečje epilepsije

[0017] Tokom proteklih četrdeset godina bilo je više studija na životinjama i ljudima o upotrebi nepsihoaktivnog kanabinoida kanabidiola (CBD) za lečenje napada. Na primer, Consroe et al., (1982) su utvrdili da CBD može da spreči napade kod miševa posle primene prokonvulzivnih lekova ili električne struje.

[0018] Tokom proteklih četrdeset godina sprovođene su i studije sa CBD na odraslim osobama koje pate od epilepsije. Cunha et al. su izvestili da je primena CBD kod osam odraslih pacijenata sa generalizovanom epilepsijom dovela do značajnog smanjenja napada kod 4 pacijenta (Cunha et al., 1980).

[0019] U studiji iz 1978. godine u kojoj su četiri odrasla pacijenta dobijala 200 mg/dan čistog CBD, kod dva od četiri pacijenta napadi su prestali, dok je kod ostalih učestalost napada bila nepromenjena (Mechoulam i Carlini, 1978).

[0020] Za razliku od studija opisanih iznad, otvorena studija je izvestila da je 200 mg/dan čistog CBD bilo neefikasno u kontroli napada kod dvanaest institucionalizovanih odraslih pacijenata (Ames i Cridland, 1986).

[0021] Na osnovu činjenice da je hronološki poslednja studija koja je proučavala efikasnost CBD kod pacijenata sa epilepsijom sugerisala da CBD nije u stanju da kontroliše napade, može postojati manje očekivanja da bi CBD mogao da bude koristan kao sredstvo protiv konvulzija.

[0022] U proteklih četrdeset godina istraživanja bilo je preko trideset lekova odobrenih za lečenje epilepsije, od kojih nijedan nisu kanabinoidi. Zaista, čini se da je postojala predrasuda prema kanabinoidima, verovatno zbog očekivane prirode ovih jedinjenja i/ili činjenice da je THC, koji je poznata psihoaktivna supstanca, okarakterisan kao prokonvulziv (Consroe et al., 1977).

[0023] Nedavno objavljeni rad sugeriše da kanabis obogaćen kanabidiolom može da bude efikasan u lečenju epilepsije. Porter i Jacobson (2013) izveštavaju o anketiranju roditelja sprovedenom preko Fejsbuk grupe koje je istraživalo upotrebu kanabisa koji je obogaćen sa CBD kod dece sa epilepsijom otpornom na lečenje. Pronađeno je da je šesnaest od 19 anketiranih roditelja prijavilo poboljšanje epilepsije kod svog deteta. Deca anketirana za ovaj rad su sva uzimala ekstrakte kanabisa koji su navodno sadržali CBD u visokoj koncentraciji, iako količina prisutnog CBD i drugih sastojaka uključujući THC i ne-kanabinoidne komponente, kao što su terpeni, nije bila poznata u mnogim slučajevima. Zaista, dok su nivoi CBD bili u opsegu od 0,5 do 28,6 mg/kg/dan (u onim ekstraktima koji su testirani), prijavljeni su nivoi THC od čak 0,8 mg/kg/dan.

[0024] Članak koji je Gardener objavio 2013. opisuje da je kompanija GW Pharma podnela zahtev za istraživački novi lek (IND) za lečenje dečije epilepsije pomoću CBD.

[0025] WO 2012/093255 opisuje upotrebu CBD u kombinaciji sa antiepileptičkim lekovima u lečenju epilepsije.

[0026] Davanje deci oboleloj od TRE ekstrakta kanabisa koji sadrži THC, koji je opisan kao prokonvulziv (Consroe et al., 1977), u potencijalno psihoaktivnoj dozi od 0,8 mg/kg/dan, nije poželjno.

[0027] Iako su proizvodi dekokcije kanabisa koji će sadržati CBDA kao i THCA zajedno sa drugim kanabinoidnim i ne-kanabinoidnim komponentama upotrebljavani kod epilepsije, tretmani nisu bili fokusirani na izolovanu ili visoko prečišćenu CBDA. Umesto toga, donedavni fokus bio je na upotrebi dekarboksilisanog oblika CBDA, CBD u lečenju epilepsije.

[0028] Kanabinoid CBDA opisao je Rabinski 2015. u internet članku pod nazivom "Profil kanabinoida CBDA".

[0029] Međutim, nađeno je da je CBDA efikasna u lečenju mučnine, kao što je pokazano u WO 2003/063847, a kao TNF alfa inhibitor predložena je za upotrebu u lečenju stanja koja zahtevaju imunomodulatornu i antiinflamatornu aktivnost, kao što je prikazano u WO 2002/064109.

[0030] Patentna prijava GB 2,495,118 opisuje upotrebu kompozicije koja sadrži CBDV i CBD za upotrebu u lečenju epilepsije. Osim toga, prijava WO 2011/121351 opisuje upotrebu CBDV u lečenju epilepsije. Oba dokumenta opisuju upotrebu botaničke lekovite supstance CBDV koja sadrži malu količinu nedekarboksilisanog CBD kao CBDA. CBDA je prisutna u veoma malim količinama i kao takva nije prisutna u terapijski efikasnim količinama.

[0031] Patentna prijava US 2015/126595 opisuje upotrebu transdermalne kompozicije koja sadrži kanabinoide uključujući CBDA.

[0032] Patentne prijave CA 2,859,934 i CA 2,737,447 opisuju hemovar medicinskog kanabisa koji sadrži jedinjenje CBDA. Lako je razumeti da sve biljke kanabisa proizvode kanabinoide u obliku njihove kiseline koji se zatim lako dekarboksilišu da bi se proizveo tradicionalno prepoznati aktivni oblik CBD.

[0033] Iako sada izgleda da je CBD obećavajući kandidat za antiepileptički lek, postoje brojna potencijalna ograničenja uključujući: relativno velike doze koje su izgleda neophodne; i relativno slabu biološku raspoloživost CBD.

[0034] Zbog toga, bilo bi poželjno naći druga jedinjenja koja mogu da ispolje aktivnost i/ili specifičnost za određene podtipove napada i koja mogu da se primene u nižim koncentracijama. To donosi prednost manjih oblika za primenu, a sa poboljšanom biološkom raspoloživošću može da bude potrebna niža doza, a početak delovanja može biti brži.

KRATAK OPIS OTKRIĆA

[0035] Prema prvom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđena je terapijski efikasna količina kanabidiolne kiseline (CBDA) za upotrebu u lečenju epilepsije, pri čemu je CBDA u obliku visoko prečišćenog ekstrakta kanabisa, tako da je CBDA prisutna u više od 98% ukupnog ekstrakta (tež./tež.) ili je proizvedena sintetički.

[0036] U jednom primeru izvođenja epilepsija je generalizovana epilepsija. Poželjnije, epilepsija se karakteriše tonično-kloničnim napadima.

[0037] Terapijski efikasna količina je poželjno najmanje 0,1 mg, poželjno najmanje 0,5 mg, poželjnije najmanje 1 mg, još poželjnije najmanje 20 mg ili više.

[0038] Poželjno, kanabinoidi tetrahidrokanabinol (THC) ili tetrahidrokanabinolna kiselina (THCA) su suštinski uklonjeni. Poželjno, visoko prečišćeni ekstrakt sadrži manje od 1% (tež./tež.) tetrahidrokanabinola (THC) ili tetrahidrokanabinolne kiseline (THCA).

[0039] CBDA može takođe da se upotrebljava istovremeno sa jednim ili više drugih kanabinoida. Poželjno, CBDA se upotrebljava sa kanabidiolom (CBD).

[0040] Kada se CBDA upotrebljava u kombinaciji sa CBD poželjni su odnosi između 9:1 do 1:9 (CBDA: CBD). Rasponi odnosa uključuju 8:2 do 2:8 (CBDA: CBD); 7:3 do 3:7 (CBDA:CBD); 6:4 do 4:6 (CBDA:CBD); i 1:1 (CBDA:CBD) i bilo koje raspone između njih.

[0041] U sledećem primeru izvođenja pronalaska CBDA se upotrebljava istovremeno sa jednim ili više drugih antiepileptičkih lekova (AED).

[0042] CBDA može da se upotrebljava u dnevnoj dozi manjoj od 1000 mg. Poželjno, dnevna doza CBDA je manja od 800 mg, poželjno manja od 600 mg, i poželjnije manja od 400 mg.

[0043] Dnevna doza može da bude manja od 200 mg, manja od 100 mg, a može da se upotrebljava samo 10 mg ili samo 1 mg.

[0044] Budući da kanabinoid CBDA ima veću biološku raspoloživost nego njegov neutralni oblik CBD, verovatno je da će daleko niža doza CBDA biti potrebna u poređenju sa CBD pri lečenju iste indikacije. Na primer, dok primena doze od 20 mg/kg CBD za lečenje epilepsije kod humanog ispitanika može da bude efikasna, potrebna doza CBDA može da bude niža u logaritamskom opsegu.

[0045] Jasno je da su takve niže doze korisne pri lečenju.

[0046] Osim toga, veća biološka raspoloživost CBDA može da znači da ona može da deluje brže od CBD. Drugim rečima, kanabinoid CBDA može da ima niže Tmaxod CBD. Ovaj kvalitet bi mogao dovesti do korisnih kombinovanih proizvoda koji sadrže CBDA u kombinaciji sa CBD. CBDA može da bude korisna za obezbeđivanje brzog započinjanja dejstva, dok CBD može da bude koristan za obezbeđivanje produženog dejstva.

[0047] Predviđeno je da odnosne količine CBDA prema CBD, pri čemu je CBDA glavni kanabinoid, uključuju raspone od 95:5 do 55:45 (CBDA:CBD).

[0048] Alternativno, CBDA i CBD mogu da budu prisutni u suštinski jednakim količinama, odnosno 55:45 do 45: 55 (CBDA:CBD). U još jednom primeru izvođenja CBD može da bude glavni kanabinoid i raspon može da bude od 45:55 do 20:80 (CBDA:CBD).

[0049] Dalje, CBDA koja brže deluje može da bude koristan kandidat za upotrebu u lečenju epilepsije koja zahteva hitno lečenje, poput akutnih napada ili epileptičkog statusa. Poželjno, CBDA se primenjuje parenteralnim putem, na primer injekcijom u venu ili mišić.

[0050] Prema drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđena je kompozicija za upotrebu u lečenju epilepsije koja sadrži terapijski efikasnu količinu kanabidiolne kiseline (CBDA), i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, pri čemu je CBDA u obliku visoko prečišćenog ekstrakta kanabisa tako da je CBDA prisutna u više od 98% ukupnog ekstrakta (tež./tež.) ili je proizvedena sintetički.

[0051] Predviđeno je da se kompozicija primenjuje kao jedno ili više od: oralnog tečnog rastvora, čvrste supstance, polu-čvrste supstance, gela, injekcije, spreja, aerosola, inhalera, vaporizera, klizme ili supozitorije. Takvi lekovi mogu da se primene oralnim, bukalnim, sublingvalnim, parenteralnim, respiratornim, nazalnim putem i putem distalnog rektuma.

DEFINICIJE

[0052] Definicije nekih od termina koji se upotrebljavaju da opišu pronalazak detaljno su navedene ispod:

[0053] Kanabinoidi opisani u predmetnoj prijavi navedeni su ispod, zajedno sa svojim standardnim skraćenicama.

Tabela 4. Kanabinoidi i njihove skraćenice

1

[0054] Tabela iznad nije iscrpna i sadrži samo podatke o kanabinoidima koji su identifikovani u predmetnoj prijavi za referencu. Do sada je identifikovano preko 60 različitih kanabinoida i ovi kanabinoidi se mogu podeliti u različite grupe kako sledi: fitokanabinoidi; endokanabinoidi i sintetički kanabinoidi (koji mogu biti novi kanabinoidi ili sintetički proizvedeni fitokanabinoidi ili endokanabinoidi).

[0055] Patentna prijava broj WO 2004/026857 opisuje analizu visoko prečišćenog CBDA. CBDA je opisana kao prečišćena do više od 98% čistoće, sa manje od 0,1% CBD, 0,3% THCA, i manje od 0,1% THC.

[0056] "Fitokanabinoidi" su kanabinoidi koji potiču iz prirode i mogu se pronaći u biljci kanabisa. Fitokanabinoidi se mogu izolovati iz biljaka da bi se proizveo visoko prečišćeni ekstrakt ili se mogu sintetički reprodukovati.

[0057] "Visoko prečišćeni ekstrakti kanabinoida" su definisani kao kanabinoidi koji su ekstrahovani iz biljke kanabisa i prečišćeni do te mere da su drugi kanabinoidi i nekanabinoidne komponente koje su koekstrahovane sa kanabinoidima suštinski uklonjene, tako da je visoko prečišćeni kanabinoid čist više od, ili jednako 98% (tež./tež.).

[0058] "Sintetički kanabinoidi" su jedinjenja koja imaju kanabinoidnu ili kanabinoidu-sličnu strukturu i proizvode se upotrebom hemijskih sredstava umesto u biljci.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0059] Primeri izvođenja pronalaska su u nastavku dodatno opisani uz pozivanje na prateće crteže, na kojima:

Slika 1 prikazuje ILAE Predlog revidirane terminologije za sistem organizacije napada i epilepsija iz 2010;

Slike 2A, B, C i D prikazuju dejstvo kanabinoida na PTZ-indukovane generalizovane napade;

Slika 3 prikazuje dejstvo CBDA na rast ćelija D. discoideum;

Slika 4 prikazuje dejstvo CBD na rast ćelija D. discoideum;

Slika 5 prikazuje sekundarne grafikone dejstva CBDA i CBD na rast D. discoideum; i Slika 6 prikazuje HPLC zapis ekstrakta CBDA iz primera 3.

Legenda uz slike

[0060] Slika 2: Paneli A-D ilustruju dejstvo CBDA (10-100 mg/kg), CBD (100 mg/kg), i CBD+CBDA (odnos 9:1) na ozbiljnost napada (A), procenat mortaliteza (B), procenat životinja koje ispoljavaju tonično-klonične napade (C) i latentnost do početka napada (D). Na panelu A, medijana ozbiljnosti napada predstavljena je debelom sivom horizontalnom linijom, 25. i 75. percentil crnim pravougaonikom, a „viskeri“ označavaju minimalne i maksimalne vrednosti. Na panelu D, latencija početka prikazana je kao medijana sa IQR. Statističko ispitivanje sprovedeno je upotrebom Kruskal-Wallis analize sa post-hoc Mann-Whitney U-testovima (panel A i D) ili Hi-kvadrat analize sa post-hoc Fišerovim egzaktnim testovima (panel B i C): P ≤ 0,1 (#); P ≤ 0,05 (*); P ≤ 0,01 (**); P ≤ 0,001 (***); n = 15 po grupi.

[0061] Slika 3: Rast je meren tokom perioda od sedam dana u prisustvu CBDA pri koncentracijama u rasponu od 0,02 µM do 20 µM. Sekundarni grafikon gustine ćelija na 168 časova upotrebljen je za izračunavanje IC50 za 0,30 µM.

[0062] Slika 4: Rast je meren tokom perioda od sedam dana u prisustvu CBD (kompanije GW Pharmaceuticals) pri koncentracijama u rasponu od 0,25 µM do 20 µM. Sekundarni grafikon gustine ćelija na 144 časa upotrebljen je za izračunavanje IC50 za 1,63 µM.

[0063] Slika 5: Kanabinoidi imaju redosled jačine CBDA>CBD.

[0064] Slika 6: Botanička lekovita supstanca CBDA prikazana u HPLC zapisu sadržala je CBDA u količini od 62,4% tež./tež., a ostali izmereni kanabinoidi obuhvatali su CBD - 6,9% (tež./tež.), THC - 0,7% (tež./tež.) i kanabihromen (CBC) - 0.5% (tež./tež.).

DETALJAN OPIS

PRIMER 1: IN VIVO PROCENA CBDA U MODELU GENERALIZOVANOG NAPADA IZAZVANOG AKUTNIM PENTILENTETRAZOLOM (PTZ)

Materijali i metode

Životinje

[0065] Odrasli mužjaci pacova Wistar Kyoto upotrebljeni su u modelu napada izazvanog akutnom primenom PTZ (>P24, 70-110 g). Po pet životinja čuvano je u kavezu u prostoriji sa regulisanom temperaturom (21 °C) na dnevno/noćnom ciklusu 12:12 h (svetla na 0800) sa 50% vlage i imale su slobodan pristup standardnoj laboratorijskoj hrani (PCD Mod C, Special Diet Services, Wiltham, UK) i vodi. Sve procedure su preduzimane tokom perioda belog svetla.

Farmaceutska formulacija

[0066] Štok rastvor PTZ (Sigma-Aldrich, Poole, UK) za eksperimentalnu proceduru napravljen je u 0,9% tež./zapr. NaCl. Štokovi CBD (broj serije, CBD-CG-1001; GW Pharmaceuticals, Salisbury, UK) i CBDA (broj serije, CBDA040912; GW Pharmaceuticals) su napravljeni u vehikulumu od etanola, kremofora i fiziološkog rastvora u odnosu 2:1:17.

[0067] Sprovedena je analiza formulacije da bi se odredilo da li je CBDA dekarboksilisana u CBD zbog temperature i/ili ekscipijenasa u formulaciji. Analiza je pokazala sa CBDA nije pretvorena u CBD tokom postupka formulacije. Prema tome, CBDA nije modifikovana tokom postupka formulacije, i odnos 2:1:17 može da se upotrebljava u budućim ispitivanjima za ovaj fitokanabinoid.

PTZ-indukovani model generalizovanog napada

[0068] PTZ antagonizuje inhibiciju GABA vezivanjem za t-butil-bicikl-fosforotionatno mesto na GABAA receptorima. Osim toga, ovaj hemijski indukovani model može da bude indikativan za dejstva protiv apsans napada. Za indukovanje napada kod odraslih mužjaka Wistar pacova (n=15 po grupi) upotrebljen je PTZ (90 mg/kg) sa eksperimentalnom dozom koja je randomizovana upotrebom dizajna latinskih kvadrata. Životinje su smeštene u kontejnere od 6 L Perspex i ostavljene da se aklimatizuju na okruženje 10 min, pre primanja jedne od doza kanabinoida (videti tabelu 5) u vehikulumu, ili doze samog vehikuluma

1

odgovarajuće zapremine kao negativne kontrole. Posle 60 min od primene ispitivanog jedinjenja ili vehikuluma, životinjama je ubrizgan PTZ (90 mg/kg, i.p.) za indukciju napada i ponašanje životinja je beleženo tokom 30 min.

Tabela 5. Doze kanabinoida

[0069] Video zapis PTZ-indukovanih napada naknadno je ocenjivan pomoću standardne skale težine napada koja je odgovarajuća za generalizovane napade (tabela 6).

[0070] Ekvivalent humane doze (HED) može da se proceni upotrebom sledeće formule:

Kmza životinju

HED = Životinjska doza (mg/kg) pomnožena sa Kmza čoveka

Kmza pacova je 6, a Kmza čoveka je 37.

Kmza psa (primer 3) je 20.

Stoga bi doza od 10 mg/kg kod pacova bila jednaka humanoj dozi od oko 1,6 mg/kg. Doza od 50 mg/kg kod pacova bila bi jednaka humanoj dozi od oko 8,1 mg/kg. Doza od 100 mg/kg kod pacova bila bi jednaka humanoj dozi od oko 16,2 mg/kg.

Tabela 6. Skala za ocenjivanje težine napada.

Analiza podataka

[0071] Video zapisi o ponašanju napada nastali iz prilagođenog sistema za posmatranje ocenjivani su naknadno prema skalama napada koje odgovaraju PTZ modelu (tabela 6) upotrebom programa Observer Video-Pro software (Noldus, Wageningen, Holandija). Za PTZ model napada, usaglašenost bodovanja jednog, ili između više posmatrača, procenjena je upotrebom funkcije analize pouzdanosti posmatrača programa Video-Pro software: prozor tolerancije 1 s; Cohen’s Kappa koeficijent ≥ 0,95.

[0072] Specifični markeri ponašanja i razvoja napada procenjivani su i upoređeni između kontrolne grupe vehikuluma i grupa tretiranih lekovima. Latencija (s) do početka napada i procenat životinja koje su razvile tonično-klonične napade je zabeležen (videti tabelu 6). Pored toga, određena je maksimalna težina napada i procenat mortaliteta u svakoj grupi za model generalizovanog napada izazvan akutnom primenom PTZ.

Statistička analiza

[0073] Dejstva leka na latenciju do početka napada i maksimalnu težinu napada procenjena su upotrebom Krustal-Wallis analize sa post-hoc Mann-Whitney U-testovima. Dejstva leka na procenat životinja koje su razvile tonično-klonične napade i procenat mortaliteta procenjena su upotrebom Hi-kvadrat analize sa post-hoc Fišerovim egzaktnim testovima. U svim slučajevima, P ≤ 0,05 je smatrano značajnim.

Rezultati

[0074] Cilj prikazanog primera bio je da se ispita antikonvulzivni potencijal CBDA u PTZ-indukovanom akutnom modelu generalizovanog napada, sa uporednom dozom CBD. Dodatno, uključeni su i CBD i CBDA u odnosu 9:1 da bi se ispitale moguće interakcije između CBD i CBDA.

[0075] Tretman kanabinoidom je značajno smanjio težinu napada u akutnom PTZ-indukovanom modelu generalizovanog napada (slika 2. panel A; H = 14,31, P ≤ 0,05), gde su 100 mg/kg CBDA (P ≤ 0,05) i kombinacija CBD/CBDA (P ≤ 0,05) ispoljili značajna antikonvulzivna dejstva naspram kontrole vehikuluma.

1

[0076] Mortalitet je značajno smanjen (slika 2. panel B; X2(6) = 30,51, P ≤ 0,0001) nakon primene 100 mg/kg CBD (P ≤ 0,01) i postojao je trend ka značajnom smanjenju pri primeni 100 mg/kg CBDA (P = 0,0656) i kombinacije CBD/CBDA (P = 0,0656).

[0077] Tretman kanabinoidom je takođe značajno smanjio incidencu tonično-kloničnih napada (slika 2. panel C; X2(6) = 17,178, P ≤ 0.01) pri čemu je primena 100 mg/kg CBDA dovela do pojave trenda ka redukciji tonično-kloničnih napada (P ≤ 0,1).

[0078] Najzad, analiza je pokazala da primena kanabinoida značajno utiče na latenciju do pojave napada u PTZ-indukovanom modelu (slika 2. panel D; H = 37,37, P ≤ 0,0001), pri čemu 100 mg/kg CBD (P ≤ 0,05), CBD/CBDA (odnos 9:1; P ≤ 0,05) značajno povećava latenciju do pojave napada, dok je CBDA (100 mg/kg) pokazala trend ka povećanju latencije do pojave napada (P = 0,0929).

Zaključci

[0079] Kao što je prethodnim studijama predviđeno, CBD je ispoljio antikonvulzivna dejstva u ovom modelu akutnog generalizovanog napada, i tako pokazao da ovaj model za otkrivanje antikonvulzivnih dejstava biljnih kanabinoida ostaje važeći.

[0080] Primetno, kod tri od četiri merena parametra, CBDA je proizveo značajna antikonvulzivna dejstva i bio statistički efikasniji od CBD u ekvivalentnoj dozi.

[0081] Na primer, panel A slike 2 opisuje dejstvo CBDA i CBD na težinu napada. Medijana skora za maksimalnu težinu napada koju su životinje doživele sa 100 mg/kg CBDA bila je 3 (tabela 6 – potpuno razvijen bilateralni klonus prednjih udova, sa očuvanim refleksom ispravljanja), a medijana za 100 mg/kg CBD bila je 5 (tabela 6 – potpuno razvijen toničnoklonični napad, sa izgubljenim refleksom ispravljanja). Ovo pokazuje da je CBDA mogla da spreči da životinje pate od težih tipova napada, u odnosu na CBD.

[0082] Panel C dodatno pokazuje da je CBDA pri 100 mg/kg mogla da spreči razvoj toničnokloničnih napada kod više životinja u poređenju sa CBD pri 100 mg/kg. Zaista, podaci za 100 mg/kg CBDA bili su jedini statistički značajni podaci za ovaj parametar. Ovo sugeriše da će CBDA biti efikasnija od CBD u sprečavanju ili lečenju epilepsije, posebno u sprečavanju razvoja tonično-kloničnih napada.

[0083] Istovremena primena CBDA sa CBD, u ilustrativnom odnosu od 9:1, pokazala je da je kombinacija takođe bila efikasna kao antikonvulzivna. Budući da biljka prirodno proizvodi CBDA i da ona može da bude dekarboksilisana, ovo otvara mogućnost upotrebe delimično dekarboksilisanih fitokanabinoida ili njihovih ekstrakata, u datim odnosima. Takvi odnosi mogu da budu korisni iz brojnih razloga. Oni uključuju to da ciljno delovanje na različite

1

tipove napada, npr. CBD za parcijalne napade i CBDA za generalizovane napade, može da bude korisno na osnovu njihovih različitih aktivnosti u životinjskim modelima epilepsije. Takođe, razlika u lipofilnosti ili biološkoj raspoloživosti dva jedinjenja može da omogući razvoj kombinacija sa različitim profilima oslobađanja, npr. CBDA može brže da deluje od CBD i da bude u većoj meri biološki raspoloživa od CBD (videti primer 3).

[0084] Ovaj primer pokazuje prvi put da izolovani ili visoko prečišćeni kanabinoid CBDA ima antikonvulzivna dejstva, i zbog toga su neophodna dalja istraživanja u drugim modelima napada i epilepsije kako bi se utvrdio puni opseg njegove efikasnosti.

[0085] U cilju utvrđivanja da li CBD i CBDA deluju sličnim mehanizmima i imaju sličnu jačinu, podnosilac prijave je sproveo studiju na novom modelu Dictyostelium discoideum.

PRIMER 2: UPOTREBA MODELA DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM ZA IDENTIFIKOVANJE MOLEKULARNIH CILJEVA KANABINOIDA I NJIHOVA UPOTREBA KOD EPILEPSIJE

Uvod

[0086] Dictyostelium discoideum je ameba, koju Američki nacionalni institut za zdravlje navedi kao biomedicinski model sistem (Williams et al. 2006). Ona ima ćelijsku strukturu tipičnu za eukariote, sa nukleusom, Goldži aparatom, mitohondrijama i endoplazmatičnim retikulumom, a njen haploidni genom je u potpunosti okarakterisan i zabeležen (Dictybase.org), uključujući opise svakog proteina, fenotip mutanata kojima nedostaje svaki od proteina, i povezani objavljeni materijal. D. discoideum može da se gaji u tečnoj kulturi kao pojedinačne ćelije ili da se dozvoli da nakon gladovanja napreduje u višećelijski razvoj formiranjem višećelijskog plodonosnog tela.

[0087] Model D. discoideum je razvijen da bi se bolje razumeli molekularni mehanizmi kojima različiti lekovi i hemikalije ispoljavaju dejstva, za identifikovanje potentnijih ili bezbednijih jedinjenja, i za karakterizaciju ćelijske uloge humanih proteina.

[0088] Ovaj opseg metodologija je omogućio da D. discoideum bude upotrebljiva kao koristan model u različitim oblastima molekularne farmakologije i farmakogenetike. U ovim istraživačkim oblastima, primarno ciljno mesto delovanja ustanovljenih, ili novih farmaceutskih jedinjenja je u mnogim slučajevima nejasno, i jedinjenja često imaju sporedna dejstva van ciljnog mesta koja ostaju neokarakterisana, i koja mogu da rezultuju skupim odustajanjem od leka u kasnoj fazi ispitivanja i da potencijalno utiču na komplijansu pacijenta.

1

[0089] U istraživanju epilepsije, D. discoideum je korišćena za identifikovanje molekularnih dejstava valproinske kiseline (Cunliffe et al 2015; Chang et al. 2012), što je prevedeno na in vitro i in vivo sisarske modele, da bi se pokazala relevantnost za ljudsko zdravlje (Chang et al 2012, 2013, 2014). Jasno je da D. discoideum može da se upotrebi za identifikovanje klinički relevantnih terapijskih jedinjenja za lečenje epilepsije.

[0090] Predmetni primer prikazuje upotrebu D. discoideum za identifikovanje molekularnog mehanizma/mehanizama delovanja dva kanabinoida, (CBD i CBDA), u pogledu kontrole napada.

Materijali i metode

ISPITIVANJA RASTA

[0091] Ćelije D. discoideum divljeg tipa (Ax2) gajene su u kulturi koja se mućka (u medijumu HL5) dva dana pre ispitivanja rasta. U svaki bunarčić ploče sa 24 bunarčića dodate su ćelije (9900 u 495 µl medijuma) i u svaki bunarčić je dodato 5 µl kanabinoida u DMSO (ili samo DMSO) da bi se postigla svaka opisana koncentracija (1% finalne koncentracije DMSO), i ćelije su održavane na 22°C. Ćelije su brojane na 72 časa, a zatim na svaka 24 časa. Za svaku koncentraciju upotrebljena su četvorostruka ponavljanja.

ISPITIVANJA RAZVOJA

[0092] Ćelije D. discoideum divljeg tipa (Ax2) gajene su u kulturi koja se mućka u medijumu HL5 tokom dva dana pre ispitivanja razvoja. Ćelije su oprane fosfatnim puferom (KK2; 20 mM kalijum fosfatni pufer, pH 6,1), i 1x107 ćelija je raspoređeno na nitrocelulozne filtere (Millipore, Cork). Upijajući jastučići (Millipore, Cork), podeljeni na četvrtine, stavljeni su u posude za kulturu od 2 ml i natopljeni sa 0.5 ml KK2 koji sadrži kanabinoide u koncentraciji od 20 µM. 1 mM valproinska kiselina korišćena je kao pozitivna kontrola, dok je KK2 koji sadrži 1% DMSO upotrebljen kao kontrola rastvarača. Nitrocelulozni filteri koji sadrže ćelije su podeljeni na četiri dela i postavljeni na upijajuće jastučiće i održavani u vlažnoj sredini na 22°C tokom 24h. Morfologija plodonosnog tela je zabeležena upotrebom mikroskopa za disekciju i kamere.

BIOINFORMATIČKA ANALIZA

[0093] Aminokiselinska sekvenca potencijalnih ciljnih proteina navedenih kanabinoida kod H. sapiensa dobijena je upotrebom baze podataka Uniprot (www.uniprot.org). Pretrage

1

homologije genoma D. discoideum sprovedene su upotrebom internet algoritma Basic local alignment search (BLAST) dostupnog na dictybase.org. TMHMM server V. 2.0 softver za predviđanje transmembranskih regiona upotrebljen je za određivanje mogućih transmembranskih regiona unutar ortologih proteina D. discoideum. Regioni proteina koji sadrže visoko konzervativne rezidue potrebne za funkcionisanje proteina analizirani su višestrukim poravnanjem sekvence upotrebom ClustalW2.

PRETRAŽIVANJE POMOĆU PLOČA SA BAKTERIJAMA

[0094] Napravljene su ploče SM agara sa dodatkom CBDA ili CBD do finalnih koncentracija od 12,3 µM, odnosno 16,7 µM. Bakterija R. planticola ubijena toplotom (75°C tokom 30 minuta) raspoređena je na ploče i ~50 ćelija AX2 divljeg tipa je dodato i ostavljeno da raste na 22°C. Na pločama je redovno proveravan rast kolonija.

PRETRAŽIVANJE REMI BIBLIOTEKE MUTANATA

[0095] Ćelije REMI biblioteke su gajene u kulturi koja se mućka (u medijumu HL5) tokom dva dana pre pretraživanja. Ćelije (25000 u 2 ml medijuma) su dodate u svaki bunarčić ploče sa 6 bunarčića i ostavljene da se pričvrste za podlogu 20 minuta. Medijum iz svakog bunarčića zamenjen je medijumom koji sadrži: 4,88 µM CBDA ili 9,47 µM CBD. Ćelije su ispitivane u triplikatu tokom perioda od tri nedelje, održavane na 22°C sa zamenom medijuma na svaka dva dana. Kolonije potencijalno rezistentnog mutanta su izolovane i prenete na ploče sa bakterijama. Izogene ćelijske linije su uspostavljene iz pojedinačnih kolonija na pločama sa bakterijama.

POTVRĐIVANJE REZISTENCIJE POJEDINAČNOG MUTANTA:

[0096] Klonalne ćelije izolovane pretraživanjem biblioteke gajene su u tečnom medijumu (medijum HL5) da bi se dobio konfluentni sloj na ploči od 10 cm. U svaki bunarčić ploče sa 24 bunarčića dodate su ćelije (10 000 u 495 µl medijuma) i u svaki bunarčić je dodato 5 µl kanabinoida u DMSO da bi se dobilo 4,88 µM CBDA ili 9,47 µM CBD (1% finalne koncentracije DMSO), ćelije su održavane na 22°C. Osetljivost ćelija na ova dva kanabinoida praćena je tokom jedne nedelje.

Rezultati

1

ISPITIVANJA RASTA

[0097] Prvo je bilo potrebno odrediti da li je rast D. discoideum osetljiv na kanabinoide: kanabidiolnu kiselinu (CBDA) i kanabidiol (CBD). U ovim eksperimentima, D. discoideum su izložene opsegu koncentracija svakog kanabinoida tokom rasta u mirnoj kulturi u periodu od jedne nedelje. Oba kanabinoida su inhibirala rast ćelija D. discoideum na dozno-zavisan način (slike 3 do 5).

[0098] Konstanta inhibicije rasta (IC50) za CBDA bila je 0,30 µM (slika 3), pri čemu je 0.08 µM značajno inhibiralo rast ćelija (P<0,05), a 20 µM zaustavilo rast.

[0099] Konstanta inhibicije rasta (IC50) za CBD bila je 1.63 uM (slika 4), pri čemu je 0.5 µM značajno inhibiralo rast ćelija (P<0,05), a 20 µM zaustavilo rast.

[0100] Poređenje IC50 vrednosti za oba kanabinoida sugeriše da je CBDA najpotentnija, pri čemu CBD pokazuje smanjenje jačine od 8,7 puta. Stoga je redosled jačine koju kanabinoidi ispoljavaju na rast ćelija D. discoideum CBDA>CBD (slika 5).

ISPITIVANJA RAZVOJA

[0101] Ispitivana su dejstva koja CBDA i CBD imaju na razvoj D. discoideum. Ovo je postignuto stavljanjem ćelija u okruženje siromašno hranljivim sastojcima u prisustvu CBDA ili CBD u koncentracijama koje zaustavljaju rast ćelija (20 µM).

[0102] Razvoj ćelija na nitroceluloznom filteru tokom perioda od 24 časa u odsustvu kanabinoida dovodi do pojave plodonosnih tela koja se sastoje od glava sa sporama koje drške drže iznad supstrata. Poznato je da se razvoj ove morfologije sprečava široko upotrebljavanim antiepileptikom, valproinskom kiselinom (1 mM), pri čemu su ćelije sposobne da agregiraju, ali ne mogu da se razvijaju tako da formiraju plodonosna tela.

[0103] Nasuprot tome, ćelije D. discoideum tretirane sa CBDA ili CBD (20 µM) mogle su da agregiraju i razviju se tako da formiraju zrela plodonosna tela.

BIOINFORMATIČKA ANALIZA

[0104] Zatim su pretraživana poznata ciljna mesta delovanja CBDA i CBD kod H. sapiensa, kako bi se identifikovali potencijalni ortolozi unutar genoma D. discoideum. U aktuelnoj literaturi, objavljeno je 21 moguće ciljno mesto za CBDA i CBD kod sisara. Upotrebom humanih proteinskih sekvenci koje odgovaraju svakom potencijalnom ciljnom mestu, u kombinaciji sa BLAST analizom, pretražen je genom D. discoideum u potrazi za ortologim ciljnim mestima. Korišćenjem ovog pristupa, identifikovano je 10 mogućih ortologa D.

2

discoideum. Na osnovu sličnosti sekvence i veličine proteina, i očuvanosti katalitičkih mesta i motiva, identifikovana su tri proteina za dalje ispitivanje:

1: Ravnotežni nukleozidni transporter 1 (ENT1). Ovaj protein je potencijalno mesto delovanja CBD i ima ulogu u adenozinskom transportu. D. discoideum ima tri moguća ortologa ENT1, i sva tri imaju pretpostavljenu višestruku transmembransku strukturu nađenu u proteinu H. sapiensa. Tri ortologa D. discoideum imaju veličinu od 522, 482 i 430 ak, slično veličini od 456 ak ENT1 proteina H. sapiensa, i sadrže visoko konzervativni motiv smešten u prvom transmembranskom regionu. Ovaj motiv je nađen u ovom proteinu mnogih drugih vrsta.

2: Monoacilglicerid lipaza alfa (MAGLa). Ovaj protein je uključen u endokanabinoidni sistem. D. discoideum ima jedan mogući ortolog MAGLa. Ovaj ortologue ima 409 ak, slične veličine kao MAGLA protein H. sapiensa od 303 ak. I protein D. discoideum i H. sapiensa imaju konzervativni katalitički serinsku, aspartatsku i histidinsku reziduu koje su značajne za enzimsku funkciju i koje su široko očuvane kod mnogi drugih vrsta.

3: Diacilglicerol lipaza alfa (DAGLa). Ovaj protein je uključen u endokanabinoidni sistem. D. discoideum ima tri moguća ortologua. Tri ortologa D. discoideum imaju veličinu od 938, 856 i 826 ak, nešto manju od DAGLa proteina od 1042 ak H. sapiensa. Sva tri ortologa D.discoideum imaju iste konzervativne serinske i aspartatske rezidue koje su značajne za katalitičku funkciju, i koje su široko očuvane kod mnogi drugih vrsta.

PRETRAŽIVANJE POMOĆU PLOČA SA BAKTERIJAMA

[0105] Utvrđeno je da li rast D. discoideum na pločama sa bakterijom R. planticola predstavlja održiv metod u kome rezistentne ćelije REMI biblioteke mutanata mogu da budu izolovane. Ćelije AX2 divljeg tipa gajene su na pločama SM agara sa toplotom ubijenim R. planticola. Sve ploče SM agara sadržale su CBDA ili CBD u finalnoj koncentraciji od 12,3 µM, odnosno 16,7 µM. Nakon inkubacije tokom 4 dana, procenjivano je preživljavanje (rast kolonija) na pločama. Nije nađena nikakva razlika u broju kolonija ni za jedan kanabinoid u poređenju sa kontrolom (samo rastvarač).

PRETRAŽIVANJE REMI BIBLIOTEKE MUTANATA

[0106] Zatim su identifikovani mutanti u biblioteci koji su pokazali otpornost na kanabinoide tokom rasta u tečnoj kulturi. Ćelije biblioteke su gajene tokom perioda od tri nedelje u prisustvu 4,88 µM CBDA ili 9,47 µM CBD. Nakon perioda od dve nedelje, kolonije delimično rezistentnih ćelija bile su vidljive na pločama poreklom od biblioteke. Delimično rezistentne ćelije su prenete na ploče sa bakterijama i pasažirane da bi se osiguralo da svaki mutant bude izogen.

POTVRĐIVANJE REZISTENCIJE POJEDINAČNOG MUTANTA

[0107] Potvrđena je rezistencija svake ćelijske linije. Sve ćelijske linije su tretirane ili sa CBDA ili sa CBD u finalnoj koncentraciji od 4,88 µM, odnosno 9,47 µM i procenjivane posle jedne nedelje. Izogene ćelijske linije su pokazale izvesno preklapanje rezistencije na različite kanabinoide. Pokazano je da mutantne ćelije imaju 3 osnovna fenotipa u odnosu na svaki kanabinoid, klasifikovana kao odsustvo rezistencije, slaba rezistencija ili delimična rezistencija. Takođe je nađeno da mutantne ćelije ispoljavaju rezistenciju ili na jedan kanabinoid, ili na više kanabinoida.

Zaključci

[0108] Razvoj kanabinoida kao novih terapijskih tretmana za epilepsiju donosi uzbudljivo novo polje istraživanja, sa realnim potencijalom za poboljšanje zdravlja. Sveobuhvatno razumevanje mehanizama delovanja i relativna jačina ovih jedinjenja su od suštinskog značaja za terapijski razvoj, da bi se razumelo kako jedinjenja sprečavaju napade, kao i njihova potencijalna neželjena dejstva. Tradicionalni pristupi za identifikovanje ovih mehanizama su veoma složeni i spori. Kao alternativni pristup, D. discoideum je upotrebljavana za identifikovanje mehanizma široko korišćenog tretmana, valproinske kiseline, koji je potvrđen u sisarskim in vivo modelima.

[0109] U ovoj studiji, pokazano je da dva kanabinoida, CBDA, i CBD sprečavaju rast D. discoideum. Koncentracije koje utiču na rast su u niskom µM opsegu i ekvivalentne su koncentracijama za koje je pokazano da su antikonvulzivne u životinjskim modelima napada. Ovo ukazuje na to da su mesta delovanja oba kanabinoida prisutna u genomu D. discoideum. Ovo takođe sugeriše da ciljna mesta u D. discoideum imaju sličnu osetljivost na kanabinoide kakva je pokazana u sisarskim modelima.

[0110] Inhibitorno dejstvo na rast može zatim da se koristi za objektivno pretraživanje za identifikovanje ovih mesta delovanja kanabinoida. Upotrebom biblioteke insercionih mutanata, grupa mutanata može da se gaji u prisustvu svakog kanabinoida tokom perioda od 21 dana. Mutanti sa insercijama u genima koji kodiraju mesta delovanja kanabinoida će verovatno pokazati rezistenciju na ovu inhibiciju rasta i time potisnuti kompeticijom osetljive ćelije tokom ispitivanja. Identifikacija gena inaktivisanih insercijom u kolonijama rezistentnim na kanabinoid identifikovaće molekularne ciljeve (i mehanizam) ovih kanabinoida u objektivnom pristupu. Ovaj pristup pretraživanja u D. discodeium korišćen je za identifikovanje mesta i mehanizama delovanja mnogih jedinjenja.

[0111] D. discoideum se takođe široko upotrebljava kao model razvića, u kome obrazovanje plodonosnog tela uključuje agregaciju i diferencijaciju ćelija. Farmakološke studije su upotrebljavale ovaj proces razvića za identifikovanje mehanizama delovanja lekova. U vezi sa ovde ispitivanim kanabinoidima, ni jedno od dva jedinjenja nema nikakvo dejstvo na razviće D. discoideum, u koncentracijama za koje je pokazano da zaustavljaju rast. Ovo prvo sugeriše da zaustavljanje rasta D. discoideum nije toksično, budući da ćelije mogu da se razviju, i da su prema tome mesta delovanja kanabinoida uključena u zaustavljanje rasta ili deobe ćelija (citokinezu). Ovo takođe sugeriše da razviće D. discoideum ne može da se koristi za dalje ispitivanje ovih jedinjenja. U kombinaciji sa objektivnim pristupom za identifikovanje mesta delovanja kanabinoida, D. discoideum takođe donosi koristan model za istraživanje poznatih ciljnih mesta kod sisara.

[0112] Nađeno je da ukupno 25 mutantnih ćelijskih linija pokazuje rezistenciju na inhibiciju rasta. Ovaj opseg fenotipova rezistentnih na različite kanabinoide ukazuje na učestvovanje većeg broja gena.

PRIMER 3

POREĐENJE PK PODATAKA ZA CBD I CBDA IZ TOKSIKOLOŠKIH STUDIJA KOD PASA

[0113] Cilj studija bio je da se odredi toksičnost CBD (u obliku suštinski čistog jedinjenja – više od 95% čistoće) i CBDA (u obliku biljne lekovite supstance – više od 60% CBDA tež./tež. ukupnog ekstrakta i više od 85% tež./tež. ukupnog sadržaja kanabinoida) nakon dnevne oralne (putem gavaže) primene kod psa.

2

[0114] Ova studija je dizajnirana tako da ispuni poznate zahteve Evropske direktive 2001/83/EC i sve naknadne amandmane zajedno sa svim relevantnim smernicama Međunarodne konferencije o harmonizaciji (ICH).

[0115] Uzorci krvi za toksikokinetiku (0,5 mL nominalno) uzimani su od svih životinja 1. dana na 0,5, 1, 2, 4, 6 i 24 časa posle davanja životinjama doze od 100 mg/kg ili CBD ili CBDA.

[0116] Uzorci su uzimani iz jugularne vene u litijum heparin. Uzorci su pažljivo promešani rukom, a zatim su kontinuirano mešani najmanje 2 minuta na automatskoj mešalici i stavljeni na stalak Kryorack do centrifugiranja, koje je sprovedeno što je pre moguće, na približno 4°C. Dobijena plazma je odvojena pod uslovima slabog osvetljenja, prebačena u jedinstveno obeležene bočice od prozirnog stakla, smeštene u kutije otporne na svetlost i odmah smrznuta na <-50°C.

[0117] Toksikokinetički parametri koji su mereni uključuju Cmax(ng/mL), Tmax(h) i AUC0-t(h * ng/mL) i rezultati su prikazani u tabeli 7 za CBDA, tabeli 8 za CBD (mužjaci), tabeli 9 za CBD (ženke) i uporedni Cmaxi AUC0-tsu prikazani u tabeli 10 za mužjake i tabeli 11 za ženke.

Rezultati

[0118]

Tabela 7

Tabela 8

Tabela 9

2

Tabela 10

Tabela 11

ZAKLJUČCI:

[0119] Iz uporednih tabela 10 i 11 biće očigledno da količina CBDA ekvivalentna količini CBD rezultuje vrednostima Cmaxi AUC0-tkoje su izrazito značajno više (za red veličine) nego u slučaju CBD, sugerišući da CBDA deluje brže i ima veću biološku raspoloživost od CBD. Ovo ima značajne implikacije/koristi kada je u pitanju lečenje pacijenata.

UKUPNI ZAKLJUČAK:

[0120] Da rezimiramo, podaci prikazani u primerima 1, 2 i 3 pokazuju da:

[0121] CBDA ima antikonvulzivna dejstva u sisarskom modelu epilepsije i efikasna je u lečenju generalizovanih napada, konkretnije, tonično-kloničnih napada. I zaista, ovo jedinjenje deluje efikasnije od CBD po mnogim ispitivanim parametrima.

[0122] CBDA je značajno jača od CBD pri delovanju na rast D. discoideum; i CBDA deluje brže i ima veću biološku raspoloživost od CBD.

[0123] Ovi nalazi su od velikog značaja jer pokazuju da CBDA predstavlja alternativni antikonvulziv za CBD. Nalaz da je CBDA jača i da ima veću biološku raspoloživost od CBD

2

znači da mogu da budu upotrebljene manje dnevne doze aktivnog sastojka u lečenju epilepsije. U tom pogledu, iz primera 3 se vidi da doze manje od 400 mg i moguće doze od samo 1 mg – 100 mg, mogu da se koriste za lečenje humanih subjekata na osnovu podataka o PK i AUC0-tiz primera 3. U tom pogledu, tipičan odrasli pacijent može da ima težinu od 60 kg i prema tome, dnevna doza za takvog pacijenta može da bude od 0,016 mg/kg do 1,6 mg/kg.

Reference:

[0124]

Ames FR and Cridland S (1986). "Anticonvulsant effects of cannabidiol." S Afr Med J 69:14.

Chang, P., et al. "The antiepileptic drug valproic acid and other medium-chain fatty acids acutely reduce phosphoinositide levels independently of inositol in Dictyostelium." Dis.Model.Mech. 5.1 (2012): 115-24.

Chang, P., et al. "Seizure control by ketogenic diet-associated medium chain fatty acids." Neuropharmacology 69 (2013): 105-14.

Chang, P., M. C. Walker, and R. S. Williams. "Seizure-induced reduction in PIP3 levels contributes to seizure-activity and is rescued by valproic acid." Neurobiol.Dis.

62 (2014): 296-306.

Consroe P, Martin P, Eisenstein D. (1977). "Anticonvulsant drug antagonism of delta-9-tetrahydrocannabinol induced seizures in rabbits." Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 16:1-13

Consroe P, Benedicto MA, Leite JR, Carlini EA, Mechoulam R. (1982). "Effects of cannabidiol on behavioural seizures caused by convulsant drugs or current in mice." Eur J Pharmaco.83: 293-8

Cunha JM, Carlini EA, Pereira AE, Ramos OL, Pimental C, Gagliardi R et al. (1980). "Chronic administration of cannabidiol to healthy volunteers and epileptic patient." Pharmacology. 21:175-85

2

Cunliffe, Baines, Giachello, Lin, Morgan, Reuber, Russell, Walker and Williams Epilepsy "Research Methods Update: Understanding the causes of epileptic seizures and identifying new treatments using non-mammalian model organisms". Seizure: European Journal of Epilepsy. 24C (2015):44-51.

Eadie, MJ (December 2012). "Shortcomings in the current treatment of epilepsy." Expert Review of Neurotherapeutics 12 (12): 1419-27.

Kwan P, Arzimanoglou A, Berg AT, Brodie MJ, Hauser WA, Mathern G, Moshé SL, Perucca E, Wiebe S, French J. (2009) "Definition of drug resistant epilepsy: Consensus proposal by the ad hoc Task Force of the ILAE Commission on Therapeutic Strategies." Epilepsia.

Mechoulam R and Carlini EA (1978). "Toward drugs derived from cannabis." Die naturwissenschaften 65:174-9.

Porter BE, Jacobson C (December 2013). "Report of a parent survey of cannabidiolenriched cannabis use in paediatric treatment resistant epilepsy" Epilepsy Behaviour.

29(3) 574-7

Thurman, DJ; Beghi, E; Begley, CE; Berg, AT; Buchhalter, JR; Ding, D; Hesdorffer, DC; Hauser, WA; Kazis, L; Kobau, R; Kroner, B; Labiner, D; Liow, K; Logroscino, G; Medina, MT; Newton, CR; Parko, K; Paschal, A; Preux, PM; Sander, JW; Selassie, A; Theodore, W; Tomson, T; Wiebe, S; ILAE Commission on, Epidemiology (September 2011). "Standards for epidemiologic studies and surveillance of epilepsy." Epilepsia. 52 Suppl 7: 2-26

Williams, R. S., et al. "Towards a molecular understanding of human diseases using Dictyostelium discoideum." Trends Mol.Med.12.9 (2006): 415-24.

2

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Terapijski efikasna količina kanabidiolne kiseline (CBDA) za upotrebu u lečenju epilepsije, naznačena time što je CBDA u obliku visoko prečišćenog ekstrakta kanabisa, tako da je CBDA prisutna u više od 98% ukupnog ekstrakta (tež./tež.) ili je proizvedena sintetički.

2. Terapijski efikasna količina CBDA za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što je epilepsija generalizovana epilepsija.

3. Terapijski efikasna količina CBDA za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačena time što je epilepsija okarakterisana toničnokloničnim napadima.

4. Terapijski efikasna količina CBDA za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što je terapijski efikasna količina najmanje 0,1 mg.

5. Terapijski efikasna količina CBDA za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što visoko prečišćeni ekstrakt sadrži manje od 1% (tež./tež.) tetrahidrokanabinola (THC) ili tetrahidrokanabinolne kiseline (THCA).

6. Terapijski efikasna količina CBDA za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što se CBDA upotrebljava istovremeno sa jednim ili više drugih kanabinoida.

7. Terapijski efikasna količina CBDA za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačena time što se CBDA upotrebljava sa kanabidiolom (CBD).

8. Terapijski efikasna količina CBDA za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što je odnos CBDA: CBD u opsegu od 9:1 do 1:9 (CBDA: CBD).

2

9. Terapijski efikasna količina CBDA za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što se CBDA upotrebljava istovremeno sa jednim ili više drugih antiepileptičkih lekova (AED).

10. Terapijski efikasna količina CBDA za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što se CBDA upotrebljava u dozi manjoj od 400 mg.

11. Terapijski efikasna količina CBDA za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što se CBDA upotrebljava u dozi od 1 mg do 100 mg.

12. Kompozicija za upotrebu u lečenju epilepsije koja sadrži terapijski efikasnu količinu kanabidiolne kiseline (CBDA), i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, naznačena time što je CBDA u obliku visoko prečišćenog ekstrakta kanabisa, tako da je CBDA prisutna u više od 98% ukupnog ekstrakta (tež./tež.) ili je proizvedena sintetički.

13. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, koja je formulisana za dostavu u vidu oralnog tečnog rastvora, čvrste supstance, polu-čvrste supstance, gela, spreja, aerosola, inhalera, vaporizera, klizme ili supozitorije.