RS60919B1

RS60919B1 - Trimer koji stabilizuje mutacije proteina omotača hiv

Info

Publication number: RS60919B1
Application number: RS20201208A
Authority: RS
Inventors: Lucy Rutten; Daphné TRUAN; Nika Mindy Strokappe; Johannes Petrus Maria Langedijk
Original assignee: Janssen Vaccines & Prevention Bv
Priority date: 2016-09-15
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2020-11-30
Also published as: LT3512543T; US11820796B2; US11365222B2; AU2017327672B2; CA3036959A1; EP3747463A1; ES2824525T3; US20220315627A1; AU2017327672A1; EP3512543A1; BR112019004593A2; IL265186A; CN109689091A; JP2019534690A; US20180072777A1; KR102513146B1; PL3512543T3; AR109528A1; MA46230B1; MD3512543T2

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA

[0001] Virus humane imunodeficijencije (HIV) pogađa milione ljudi širom sveta, pa je prevencija HIV-a pomoću efikasne vakcine i dalje vrhunski prioritet, čak i u doba kada se široko primenjuje terapija protiv retrovirusa. Zbog antigenske raznovrsnost između različitih sojeva i kladusa virusa HIV, otežan je razvoj vakcine koja bi imala široku efikasnost. HIV-1 je najčešći i patogeni soj virusa, sa više od 90% slučajeva HIV/AIDS nastalih iz infekcije virusom HIV-1 grupe M. Grupa M je dalje podeljena na kladuse ili podtipove, od kojih je najveći kladus C. Efikasna vakcina bi idealno mogla da izazove moćan ćelijski odgovor i široko neutrališuća antitela koja mogu da neutrališu sojeve HIV-1 iz različitih kladusa.

[0002] Protein šiljka omotača (Env) na površini HIV sastavljen je od trimera heterodimera glikoproteina gp120 i gp41 (SL. 1A). Proteinski prekursor gp160 se pomoću furina cepa na gp120, koji predstavlja glavu šiljka i sadrži mesto vezivanja CD4 receptora, kao i velike hipervarijabilne petlje (V1 to V5), i gp41, koji predstavlja dršku proteina šiljka omotača ukotvljenu u membranu. Kao drugi fuzogeni proteini klase I, gp41 sadrži N-terminalni fuzioni peptid (FP), C-terminalni transmembranski (TM) domen, i citoplazmatski domen. Membranska fuzija između HIV i membrana ciljne ćelije zahteva niz konformacionih promena proteina omotača. Vakcine za HIV mogu da se razvijaju na bazi proteina omotača.

[0003] Međutim, različiti faktori doprinose da razvoj vakcine za HIV na osnovu proteina omotača predstavlja pravi izazov, uključujući veliku genetsku varijabilnost HIV-1, gust ugljenohidratni sloj proteina omotača, i relativno dinamičnu i labilnu prirodu strukture šiljka proteina omotača. Protein omotača divljeg tipa je nestabilan zbog svoje funkcije. Zato se stabilizujuće mutacije ponekad uvode u strukturu omotača da bi se napravili kandidati za vakcinu. Protein omotača je meta za neutrališuća antitela i veoma je glikozilovan, što smanjuje imunogenost usled zaštite proteinskih epitopa. Sva široko neutrališuća antitela (bNAt) sadrže ove glikane.

[0004] Za razvoj vakcine je poželjno koristiti proteine omotača koji mogu da indukuju bNAt. Međutim, većina bNAt prepoznaje samo konformacije nativnog proteina omotača pre nego što on pretrpi bilo kakve konformacione promene. Zato bi razvoj stabilnog proteina omotača u kompaktnoj i zatvorenoj konformaciji nalik na nativnu, uz istovremenu minimalnu prezentaciju nenativnih, pa time i neneutrališućih epitopa, mogao da poboljša efikasnost stvaranja takvih bNAt. Prethodni pokušaji stvaranja vakcine za HIV su bili usredsređeni na razvijanje vakcina koje sadrže predfuzioni ektodomen trimernog proteina omotača HIV, gp140. Gp140 nema transmembranske (TM) i domene citoplazme, ali, za razliku od gp120, može da formira strukture trimera. Pored toga, ovi prethodni pokušaji su uglavnom bili usmereni na kladus A. Međutim, obim indukovanog odgovora neutrališućeg antitela je još uvek ograničen. Zato bi bilo korisno da budu dostupni stabilizovani trimeri nativnog omotača protiv više kladusa HIV.

[0005] Već više od dve decenije se čine pokušaji da se razvije stabilan protein omotača u svojoj predfuzionoj konformaciji trimera, i ostvaren je ograničen uspeh u proizvodnji rastvornih, stabilnih trimera proteina omotača koji mogu da indukuju obiman odgovor neutrališućih antitela. Na primer, takozvane SOSIP mutacije (501C, 605C i 559P) uvedene su u sekvencu proteina omotača da bi se poboljšalo nastajanje rastvorne frakcije gp140 trimera (Sanders et al., (2002), J. Virol.76(17): 8875-89). Takozvane SOSIP mutacije uključuju cisteinske ostatke na pozicijama 501 i 605, i prolinski ostatak na poziciji 559 prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2, što je klasična šema numeracije koja se koristi u ovoj oblasti. Uvođenje dva cisteinska ostatka na pozicije 501 i 605, koji su međusobno bliski u trodimenzionalnoj strukturi proteina, dovodi do stvaranja disulfidnog mosta. Proteini omotača sa SOSIP mutacijom, kao što su BG505_SOSIP i B41_SOSIP (proteini omotača iz HIV sojeva BG505 i B41 (tj.9032-08.A1.4685) sojevi sa SOSIP mutacijama), opisani su i koriste se u studijama vakcine, i pokazalo se da indukuju autologna neutrališuća At 2. nivoa (Pugach et al, 2015, J Virol. 89: 3380-3395; Sanders et al., Science (2015), 349(6224): 139-140).

[0006] Međutim, iako takozvane SOSIP mutacije mogu da stabilizuju trimerni oblik proteina omotača, frakcija trimera takvog SOSIP mutanta obično je manja od 10%, sa velikim količinama monomera i agregata koji se i dalje proizvode. Čak i SOSIP mutant BG505_SOSIP, koji je za sada jedan od najperspektivnijih proteina omotača sa SOSIP mutacijama u pogledu svoje sposobnosti da stabilizuje trimerni oblik, obično daje najviše do 25% trimernog oblika (Julien et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (2015), 112(38), 11947-52). Štaviše, kod ove frakcije trimera, trimeri nisu sasvim stabilni jer se razmiču na apeksu. Tako, pored SOSIP mutacija, nekoliko dodatnih supstitucija, kao što su E64K, A316W i 201C-433C, dizajnirano je radi stabilizacije apeksa i sprečavanja njegovog razmicanja (de Taeye et al., Cell (2015), 163(7), 1702-15; Kwon et al., (2015) Nat. Struct. Mol. Biol.22(7) 522-31; WO 2016/037154).

[0007] Prema tome, postoji potreba za stabilizovanim trimerima proteina omotača HIV koji imaju bolji procenat nastajanja trimera, poboljšan prinos trimera i/ili poboljšanu stabilnost trimera. Poželjno, takvi stabilizovani trimeri proteina omotača HIV takođe bi trebalo da imaju dobro vezivanje sa široko neutrališućim antitelima (bNAt), i relativno ograničeno vezivanje za ne-široko neutrališuća antitela (ne-bNAt). Predmet pronalaska je da obezbedi proteine Env HIV sa poboljšanim procentom trimera, i poželjno takođe poboljšanim prinosom trimera.

KRATAK SAŽETAK PRONALASKA

[0008] Pronalazak se odnosi na rekombinantne proteine omotača HIV iz različitih kladusa koji imaju poboljšan procenat formiranja trimera i/ili poboljšani prinos trimera u poređenju sa prethodno opisanim trimerima omotača HIV. Savijanje Env je optimizovano, odlike specifične za soj su popravljene, a regioni predfuzione zatvorene konformacije koji su važni za proces fuzije su stabilizovani ovde opisanim mutacijama. To obezbeđuje univerzalni pristup radi optimizacije savijanja i stabilnosti predfuziono zatvorenih trimera omotača HIV-1. Dobijeni stabilni i dobro savijeni trimeri Env HIV korisni su za imunizaciju, npr. da poboljšaju šanse za uvođenje široko neutrališućih antitela i smanjenje indukcije neneutrališućih i slabo neutrališućih antitela nakon primene rekombinantnih trimera Env HIV. Pronalazak se takođe odnosi na izolovane molekule nukleinske kiseline i vektore koji kodiraju rekombinantne proteine omotača HIV, ćelije koje ih sadrže, i kompozicije rekombinantnog proteina omotača HIV, molekula nukleinske kiseline, vektora i/ili ćelija.

[0009] U jednom generalnom aspektu, pronalazak se odnosi na rekombinantne proteine omotača virusa humane imunodeficijencije (HIV) koji imaju posebne aminokiselinske ostatke na identifikovanim pozicijama u sekvenci proteina omotača koji stabilizuju formiranje trimera.

[0010] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni protein omotača (Env) HIV iz pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu Env proteina HIV koja ima navedene aminokiselinske ostatke najmanje na dve naznačene pozicije izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i

(vii) Phe, Met ili Ile na poziciji 647,

naznačeno time što numeracija pozicija je prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2. U nekim poželjnim otelotvorenjima, naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 651 je Phe; naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 655 je Ile; naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 535 je Asn; i/ili naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 573 je Phe.

[0011] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni Env protein HIV iz pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu Env proteina HIV i aminokiselinsku supstituciju navedenim aminokiselinskim ostatkom najmanje na jednoj naznačenoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i

(vii) Phe, Met ili Ile na poziciji 647,

naznačeno time što Env protein HIV je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(1) aminokiselinske sekvence konsenzusa Env HIV, npr. iz kladusa C (npr. koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili 3) ili iz kladusa B (npr.

koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili 5);

(2) sintetičkog proteina Env HIV, koji, npr., sadrži (a): aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, ili (b): SEQ ID NO: 6 sa mutacijom Glu u Arg na poziciji 166, ili (c): (a) ili (b) sa mutacijom aminokiselina na pozicijama 501 i 605 u ostatke Cys i mutacijom aminokiseline na poziciji 559 u ostatak Pro, ili (d): (a), (b) ili (c) sa dodatnom mutacijom mesta cepanja furinom, npr.

zamenom aminokiselina na pozicijama 508–511 sa RRRRRR (SEQ ID NO: 10), ili (e) SEQ ID NO: 7, ili (f) mozaičku Env sekvencu, kao što je Env koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili 9; i

(3) matičnog proteina Env HIV koji je poželjno protein Env HIV divljeg tipa, poželjno kladusa C, koji sadrži najmanje jednu mutaciju popravke na aminokiselinskom ostatku koji se nalazi na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću manjom od 7,5%, poželjno manjom od 2%, sekvenci Env HIV u kolekciji od najmanje 100, poželjno najmanje 1000, poželjno najmanje 10.000, sekvenci Env HIV divljeg tipa, naznačeno time što mutacija popravke je supstitucija aminokiselinskim ostatkom koji se nalazi na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću od najmanje 10% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji, i poželjno, mutacija popravke je supstitucija aminokiselinskim ostatkom koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji najčešće u pomenutoj kolekciji;

i numeracija pozicija je prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2. U nekim poželjnim otelotvorenjima, naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 651 je Phe; naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 655 je Ile; naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 535 je Asn; i/ili naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 573 je Phe.

[0012] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni Env protein HIV iz pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu Env proteina HIV i aminokiselinsku supstituciju navedenim aminokiselinskim ostatkom najmanje na jednoj naznačenoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i

(vii) Phe, Met ili Ile na poziciji 647,

naznačeno time što Env protein HIV je Env protein HIV sa SOSIP mutacijom koji sadrži najmanje jednu mutaciju koja dovodi do navedenih aminokiselinskih ostataka na navedenim pozicijama odabranu iz grupe koja se sastoji od:

(a) Cys na pozicijama 501 i 605;

(b) Pro na poziciji 559; i

(c) Cys na pozicijama 501 i 605 i Pro na poziciji 559; i

numeracija pozicija je prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2. U nekim poželjnim otelotvorenjima, naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 651 je Phe; naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 655 je Ile; naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 535 je Asn; i naznačeni aminokiselinski ostatak na poziciji 573 je Phe.

[0013] U drugim otelotvorenjima, rekombinantni Env protein HIV iz pronalaska dodatno sadrži navedeni aminokiselinski ostatak najmanje na jednoj naznačenoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od:

(viii) Gln, Glu, Ile, Met, Val, Trp ili Phe, poželjno Gln ili Glu, na poziciji 588;

(ix) Lys na poziciji 64 ili Arg na poziciji 66, ili Lys na poziciji 64 i Arg na poziciji 66;

(x) Trp na poziciji 316;

(xi) Cys na obe pozicije 201 i 433;

(xii) Pro na poziciji 556, ili Pro na poziciji 558, ili Pro na pozicijama 556 i 558;

(xiii) zamene petlje na pozicijama aminokiselina 548–568 (HR1-petlja) petljom koja ima 7–10 aminokiselina, poželjno petljom od 8 aminokiselina, npr. koja ima sekvencu odabranu od bilo koje od (SEQ ID NO: 12–17);

(xiv) Gly na poziciji 568, ili Gly na poziciji 569, ili Gly na poziciji 636, ili Gly na obe pozicije 568 i 636, ili Gly na obe pozicije 569 i 636; i/ili

(xv) Tyr na poziciji 302, ili Arg na poziciji 519, ili Arg na poziciji 520, ili Tyr na poziciji 302 i Arg na poziciji 519, ili Tyr na poziciji 302 i Arg na poziciji 520, ili Tyr na poziciji 302 i Arg na obe pozicije 519 i 520.

[0014] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni Env protein HIV prema pronalasku dodatno sadrži mutaciju u sekvenci cepanja furinom Env proteina HIV, kao što je zamena na pozicijama 508–511 sa RRRRRR (SEQ ID NO: 10).

[0015] U jednom otelotvorenju, rekombinantni Env protein HIV je protein gp140.

[0016] U drugom otelotvorenju, rekombinantni Env protein HIV je protein gp160.

[0017] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni Env protein HIV je skraćen u regionu citoplazme, npr. posle 7 aminokiselina regiona citoplazme.

[0018] U drugom generalnom aspektu, pronalazak se odnosi na trimerni kompleks koji sadrži nekovalentni oligomer od tri bilo koja ovde opisana rekombinantna Env proteina HIV.

[0019] Drugi generalni aspekt pronalaska je da obezbedi metodu za poboljšanje savijanja i stabilnosti (mereno preko povećanog procenta trimera i/ili prinosa trimera) matičnog Env proteina HIV, pri čemu metoda obuhvata popravku aminokiselinske sekvence matičnog Env proteina HIV uvođenjem najmanje jedne mutacije popravke, poželjno najmanje 3 mutacije popravke u matični Env protein HIV, naznačeno time što mutacija popravke je aminokiselinska supstitucija na aminokiselinskom ostatku koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću manjom od 7,5%, poželjno manjom od 2%, sekvenci Env HIV u kolekciji od najmanje 100, poželjno najmanje 500, poželjno najmanje 1000, poželjno najmanje 10.000, sekvenci Env HIV divljeg tipa, naznačeno time što supstitucija se vrši aminokiselinskim ostatkom koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću od najmanje 10% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji, i poželjno, supstitucija je supstitucija aminokiselinskim ostatkom koji je najčešće prisutan na odgovarajućoj poziciji u pomenutoj kolekciji. Pronalazak takođe obezbeđuje popravljeni Env protein HIV koji može da se dobije pomenutom metodom iz pronalaska za poboljšavanje savijanja i stabilnosti (mereno preko povećanog procenta trimera i/ili prinosa trimera) Env proteina HIV. Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži pomenuti popravljeni Env protein HIV. Pronalazak takođe obezbeđuje metodu za proizvodnju Env proteina HIV, koja obuhvata metodu za popravku ovde opisanog Env proteina HIV, i ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira popravljeni stabilizovani Env protein HIV u rekombinantnoj ćeliji domaćinu.

[0020] U drugom generalnom aspektu, pronalazak se odnosi na rekombinantni Env protein HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 2, naznačeno time što poželjno pozicije 204, 535, 573, 589, 647, 651 i 655, i poželjno dodatne pozicije 64, 66, 201, 316, 433, 501, 508–511, 556, 558, 559, 588, 548–568 i 605 nisu uzete u obzir pri određivanju % identičnosti, i naznačeno time što je numeracija u skladu sa numeracijom u gp160 HIV-1 izolata HXB2. U nekim otelotvorenjima, rekombinantni Env protein HIV sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 3, naznačeno time što poželjno pozicije 204, 535, 573, 589, 647, 651 i 655, i poželjno dodatne pozicije 64, 66, 201, 316, 433, 508–511, 556, 558, 588, i 548–568 nisu uzete u obzir pri određivanju % identičnosti, i naznačeno time što je numeracija u skladu sa numeracijom u gp160 HIV-1 izolata HXB2.

U drugom generalnom aspektu, pronalazak se odnosi na rekombinantni Env protein HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 4, naznačeno time što poželjno pozicije 204, 535, 573, 589, 647, 651 i 655, i poželjno dodatne pozicije 64, 66, 201, 316, 433, 501, 508–511, 556, 558, 559, 588, 548–568 i 605 nisu uzete u obzir pri određivanju % identičnosti, i naznačeno time što je numeracija u skladu sa numeracijom u gp160 HIV-1 izolata HXB2. U nekim otelotvorenjima, rekombinantni Env protein HIV sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 5, naznačeno time što poželjno pozicije 204, 535, 573, 589, 647, 651 i 655, i poželjno dodatne pozicije 64, 66, 201, 316, 433, 508–511, 556, 558, 588, i 548–568 nisu uzete u obzir pri određivanju % identičnosti, i naznačeno time što je numeracija u skladu sa numeracijom u gp160 HIV-1 izolata HXB2.

U ovim aspektima i otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselina na navedenim pozicijama koje nisu uzete u obzir za određivanje % identičnosti, poželjno su odabrane od aminokiselina navedenih ovde kao poželjne, npr. Ile na poziciji 204; Phe, Ala, Leu ili Trp na poziciji 651; itd. (vidite Tabele 1 i 2 u nastavku).

[0021] U drugom generalnom aspektu, pronalazak se odnosi na rekombinantni Env protein HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa bilo kojom od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ili 32, naznačeno time što SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ili 32 su posebno poželjne. U ovom aspektu, poželjno pozicije 204, 535, 573, 589, 647, 651, 655 i 658, i poželjno dodatne pozicije 64, 66, 201, 316, 433, 508–511, 556, 558, 588, i 548–568 nisu uzete u obzir pri određivanju % identičnosti, i naznačeno time što je numeracija u skladu sa numeracijom u gp160 HIV-1 izolata HXB2. Takođe u ovom aspektu, jedna ili više aminokiselina na navedenim pozicijama koje nisu uzete u obzir pri određivanju % identičnosti, poželjno su odabrane od aminokiselina koje su ovde navedene kao poželjne pod (i)–(vii) u Tabeli 1, (viii)– (xv) u Tabeli 2, i/ili (xvi) u Tabeli 1, npr. Ile na poziciji 204; Phe, Leu, Met ili Trp na poziciji 651; itd.

[0022] U drugom generalnom aspektu, pronalazak se odnosi na česticu, poželjno lipozom ili nanočesticu, npr. samosklapajuću nanočesticu, koja na svojoj površini prikazuje rekombinantni Env protein HIV iz pronalaska.

[0023] U drugom generalnom aspektu, pronalazak se odnosi na izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira rekombinantni Env protein HIV iz pronalaska i vektore koji sadrže izolovani molekul nukleinske kiseline operativno vezan za promoter. U jednom otelotvorenju, vektor je virusni vektor. U drugom otelotvorenju, vektor je ekspresioni vektor. U jednom poželjnom otelotvorenju, virusni vektor je vektor adenovirusa.

[0024] Drugi generalni aspekt odnosi se na ćeliju domaćina koja sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline ili vektor koji kodira rekombinantni Env protein HIV iz pronalaska. Takve ćelije domaćini mogu da se koriste za proizvodnju rekombinantnog proteina, ekspresiju rekombinantnog proteina, ili proizvodnju čestica virusa.

[0025] Drugi generalni aspekt odnosi se na metode za proizvodnju rekombinantnog Env proteina HIV, koje uključuju uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline ili vektor koji kodira rekombinantni Env protein HIV iz pronalaska, pod uslovima pogodnim za proizvodnju rekombinantnog Env proteina HIV.

[0026] Još jedan generalni aspekt se odnosi na kompoziciju koja sadrži rekombinantni Env protein HIV, trimerni kompleks, izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor, ili ćeliju domaćina kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

KRATAK OPIS SLIKA

[0027] Prethodni sažetak, kao i sledeći detaljan opis pronalaska, bolje će se razumeti kada se čitaju zajedno sa priloženim crtežima. Podrazumeva se da pronalazak nije ograničen na precizna otelotvorenja prikazana na crtežima.

[0028] Na slikama:

SL. 1A i 1B daju šematski prikaz strukture proteina omotača (Env) HIV;

SL. 1A prikazuje Env protein HIV pune dužine; i

SL. 1B prikazuje rastvorni Env protein HIV koji sadrži takozvane SOSIP mutacije i C-terminalno skraćenje polazeći od ostatka 664 prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2 (SOSIP.644 sekvenca);

SL. 2A i 2B prikazuju procenat formiranja trimera (SL. 2A) i prinos trimera (SL. 2B) za rekombinantne Env proteine HIV prema otelotvorenjima pronalaska, određen AlphaLISA testom, kao što je opisano u Primeru 3; ispitani rekombinantni Env proteini HIV su imali jednu,

1

dve ili tri aminokiselinske supstitucije uvedene u sekvencu skeleta konsenzusa Env kladusa C HIV ConC_SOSIP (SEQ ID NO: 3); procenat trimera i prinos trimera određeni su na bazi vezivanja trimer specifičnog monoklonskog antitela (mAt) PGT145 za svaki od rekombinantnih Env proteina HIV; prinos trimera i procenat formiranja trimera za svaki od rekombinantnih Env proteina HIV iz pronalaska upoređen je sa podacima za protein omotača sa sekvencom skeleta ConC_SOSIP bez bilo kakve dodatne ovde opisane stabilizujuće mutacije trimera;

SL. 3 prikazuje hromatograme dobijene hromatografijom na molekulskim sitima sa višeugaonim rasipanjem svetlosti (SEC-MALS) rekombinantnih Env proteina HIV prema otelotvorenju iz pronalaska; ispitani rekombinantni Env proteini HIV su imali jednu aminokiselinsku supstituciju uvedenu u sekvencu skeleta konsenzusa Env kladusa C HIV ConC_SOSIP (SEQ ID NO: 3) i prečišćeni su pomoću afinitetne hromatografije sa lektinom, kao što je opisano u Primeru 2; analiza SEC-MALS je izvedena kao što je opisano u Primeru 3; pik koji odgovara trimernom obliku naznačen je na svakom hromatogramu;

SL. 4 prikazuje toplotnu stabilnost rekombinantnih Env proteina HIV prema otelotvorenjima pronalaska, prijavljenu kao procenat trimera preostalih nakon podvrgavanja toploti; ispitani rekombinantni Env proteini HIV su imali jednu, dve ili tri aminokiselinske supstitucije uvedene u sekvencu skeleta konsenzusa Env kladusa C HIV ConC_SOSIP (SEQ ID NO: 3); rekombinantni Env proteini HIV su podvrgnuti toplotnom tretmanu, i procenat trimera preostalih nakon toplotnog tretmana određen je AlphaLISA testom, kao što je opisano u Primeru 4; takođe je prikazana toplotna stabilnost proteina omotača koji ima sekvencu skeleta ConC_SOSIP bez ikakvih dodatnih mutacija za stabilizaciju trimera;

SL. 5A–5B prikazuju procenat formiranja trimera (Sl. 5A) i prinos trimera (Sl. 5B) za rekombinantne Env proteine HIV sa jednom aminokiselinskom supstitucijom uvedenom u sekvencu skeleta konsenzusa HIV Env kladusa B ConB_SOSIP (SEQ ID NO: 5) prema otelotvorenjima pronalaska u poređenju sa podacima za protein omotača sa sekvencom skeleta ConB_SOSIP bez ikakvih dodatnih mutacija za stabilizaciju trimera iz pronalaska, kao što je opisano u Primeru 5; prinos trimera i procenat formiranja trimera određeni su AlphaLISA testom;

SL. 6A–6B prikazuju procenat formiranja trimera i prinos trimera za rekombinantne Env proteine HIV sa jednom aminokiselinskom supstitucijom uvedenom u sekvencu skeleta sintetičkog proteina omotača HIV DS_sC4_SOSIP_E166R prema otelotvorenjima pronalaska, kao što je opisano u Primeru 6; procenat formiranja trimera i prinos trimera određeni su AlphaLISA testom.

SL. 7 prikazuje hromatograme dobijene hromatografijom na molekulskim sitima sa višeugaonim rasipanjem svetlosti (SEC-MALS) rekombinantnih Env proteina HIV prema otelotvorenju iz pronalaska; ispitani rekombinantni Env proteini HIV su imali jednu mutaciju K655I i u svakoj sledećoj varijanti dodatnu mutaciju uvedenu u sekvencu skeleta konsenzusa Env kladusa C HIV ConC_SOSIP (SEQ ID NO: 3), i prečišćeni su pomoću afinitetne hromatografije sa lektinom, kao što je opisano u Primeru 2; analiza SEC-MALS je izvedena kao što je opisano u Primeru 3; pik koji predstavlja gp140 monomere u ConC_SOSIP naznačen je osenčenim okvirom, sa desne strane pika trimera. Donji panel prikazuje uvećanje donjeg dela dijagrama, tako da se može videti da svaka dodatna mutacija izaziva dodatno opadanje visine pika monomera gp140.

SL. 8A–8B prikazuju procenat formiranja trimera (Sl. 8A) i prinos trimera (Sl. 8B) za BG505_SOSIP (dobijen od soja divljeg tipa kladusa A) sa jednom aminokiselinskom supstitucijom i kombinacijama supstitucija uvedenih prema otelotvorenju pronalaska u poređenju sa podacima za protein omotača sa sekvencom skeleta BG505_SOSIP bez ikakvih dodatnih mutacija za stabilizaciju trimera iz pronalaska, kao što je opisano u Primeru 9. Prinos trimera i procenat formiranja trimera određeni su AlphaLISA testom.

SL. 9 prikazuje hromatograme dobijene hromatografijom na molekulskim sitima sa višeugaonim rasipanjem svetlosti (SEC-MALS) rekombinantnih Env proteina HIV prema otelotvorenju iz pronalaska; SEC-MALS analiza je izvedena na supernatantu kulture Env transficiranih ćelija. Pik koji odgovara obliku trimera eluiran je od 7 do 7,5 minuta. Tamnosiva linija je BG505_SOSIP (dobijen od soja divljeg tipa kladusa A) a svetlosiva linija je BG505_SOSIP sa supstitucijama L556P, K655I, M535N, N651F, D589V, K588E.

Sl. 10A–10B prikazuju prinos trimera za varijante C97ZA_SOSIP, opisane u Primeru 10. Prinos trimera C97ZA sa tri stabilizujuće supstitucije (L556P, T651F i M535N) (Sl.10A i B). Na Slici 10B, sekvenca Env je dalje optimizovana dodatnim mutacijama (21 dodatna mutacija) koje su dodate radi popravke Env sekvence C97ZA prema konceptualnom okviru opisanom na SL. 12 i uvođenjem dodatnih stabilizujućih supstitucija (K655I, D589V, A204I i K588E). Prinos trimera i procenat formiranja trimera određeni su AlphaLISA testom. Signali su normalizovani na signal ConC_SOSIP koji je podešen na 1. PNGS je potencijalno mesto N-glikozilacije.

SL. 11. Prinos trimera HIV-1 Env soja DU422 sa četiri stabilizujuće supstitucije (vidite detaljnije u Primeru 11). Svi brojevi su normalizovani na ConC_SOSIP (nije prikazano) koji je podešen na 1.

SL. 12. Univerzalni koncept za popravku HIV-1 Env sekvence ilustrovan za soj C97ZA. Ostatak sa najvećom učestalošću pojavljivanja (ovde se pominje kao „ostatak konsenzusa“) u ukupnoj bazi HIV-1 (gornje trake) i ostatak soja C97ZA (donje trake) poređani od malog do velikog procenta pojavljivanja pozicije ostatka C97ZA. Pozicije sekvenci C97ZA koje treba supstituisati u ostatak konsenzusa odabrane su na bazi sledećih kriterijuma: Pozicije sa ostatkom C97ZA koje se sreću manje od 2% u sekvencama baze podataka Env (crne trake). Pozicije sa ostatkom C97ZA koje se javljaju od 2% do 7,5% u sekvencama baze podataka Env i koje su zaklonjene ili delimično zaklonjene (tamnosive trake). Pozicije koje su izložene i hidrofobne u C97ZA i hidrofilni ostaci konsenzusa (dve najsvetlije sive trake) i pozicija koja je potencijalno mesto N-glikozilacije (PNGS) ostatka konsenzusa (S234N).

SL. 13. Predfuziono zatvoreni trimeri HIV ENV_SOSIP putem popravke sekvence i mutacione stabilizacije. Signali na AlphaLISA testu u supernatantu ćelijske kulture za sve varijante SOSIP normalizovane na ConC_SOSIP za široko neutrališuća antitela.

SL. 14. Analitički profil SEC kontrolnih varijanti Env_SOSIP (SOSIP skeleta), popravljene varijante Env prema konceptu opisanom u Primeru 12 i na SL.12, i varijante Env sa dodatnim stabilizujućim supstitucijama prema Tabeli 3 koristeći supernatante ćelijske kulture nakon transfekcije. Lažni signal supernatanta ćelijske kulture je oduzet od svih profila. Pikovi trimera su označeni sa *.

SL. 15. Prinos trimera varijanti HIV-1 Env ConC bez stabilizujućih SOSIP mutacija.

SL. 16. Prinos trimera (A) i procenat trimera (B) ConC_SOSIP sa mutacijama na pozicijama 589, 647, 651 i 655 u metionin. Svi brojevi su normalizovani na ConC_SOSIP (nije prikazano) koji je podešen na 1. Traka greške je prikazana na desnom kraju traka.

SL. 17A–17D prikazuju procenat formiranja trimera (SL.17A, B za različite eksperimente) i prinos trimera (SL.17C, D za različite eksperimente) za rekombinantne Env proteine HIV sa navedenim mutacijama kao što je opisano u Primeru 15, određeno AlphaLISA testom.

SL. 18 prikazuje hromatograme SEC-MALS rekombinantnih Env proteina HIV sa navedenim mutacijama, kao što je opisano u Primeru 15.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0029] Diskusija o dokumentima, postupcima, materijalima, uređajima, člancima ili slično, koji su uključeni u predmetnu specifikaciju, služi za davanje konteksta za pronalazak. Takva diskusija ne predstavlja priznanje da bilo koji od ovih materijala, ili svi, čine deo prethodnog stanja tehnike u pogledu bilo kojih pronalazaka koji su objavljeni ili su u zahtevima.

1

[0030] Ako nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni termini imaju isto značenje kako to uobičajeno razumeju stručnjaci sa uobičajenim znanjem u oblasti na koju se ovaj pronalazak odnosi. Inače, neki ovde korišćeni termini imaju značenje kao što je dato u specifikaciji. Treba napomenuti da, kao što se koristi ovde i u priloženim zahtevima, oblici za jedninu uključuju i množinu, ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0031] Ako nije drugačije rečeno, sve numeričke vrednosti, kao što je ovde opisana koncentracija ili opseg koncentracija, treba razumeti tako da su u svim slučajevima modifikovani terminom „oko“. Tako, numerička vrednost obično uključuje ± 10% od navedene vrednosti. Kao što se ovde koristi, upotreba numeričke vrednosti izričito uključuje sve moguće podopsege, sve pojedinačne numeričke vrednosti u okviru opsega, uključujući cele brojeve u tim opsezima i razlomke, ako kontekst jasno ne nagoveštava drugačije.

[0032] Aminokiseline se pominju u otkriću. Postoji dvadeset prirodnih aminokiselina, kao i mnogo neprirodnih aminokiselina. Svaka poznata aminokiselina, uključujući prirodne i neprirodne aminokiseline, ima puno ime, i skraćenu jednoslovnu šifru, i skraćenu troslovnu šifru, i sve su dobro poznate stručnjacima sa prosečnim znanjem. Na primer, troslovne i jednoslovne skraćene šifre koje se koriste za dvadeset prirodnih aminokiselina su sledeće: alanin (Ala; A), arginin (Arg; R), asparaginska kiselina (Asp; D), asparagin (Asn; N), cistein (Cys; C), glicin (Gly; G), glutaminska kiselina (Glu; E), glutamin (Gln; Q), histidin (His; H), izoleucin (Ile; I), leucin (Leu; L), lizin (Lys; K), metionin (Met; M), fenilalanin (Phe; F), prolin (Pro; P), serin (Ser; S), treonin (Thr; T), triptofan (Trp; W), tirozin (Tyr; Y) i valin (Val; V). Aminokiseline se mogu navoditi po punom imenu, jednoslovnoj skraćenoj šifri ili troslovnoj skraćenoj šifri.

[0033] Ako kontekst jasno ne nalaže drugačije, numeracija pozicije u aminokiselinskoj sekvenci proteina omotača HIV kao što se ovde koristi je prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2, kao što je, na primer, izneto u Korber et al. (Human Retroviruses and AIDS 1998: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Korber et al., urednici Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N. Mex.). Numeracija prema HXB2 je konvencionalna u oblasti Env proteina HIV. Gp160 HIV-1 izolata HXB2 ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1. Poravnavanje željene sekvence Env HIV sa ovom sekvencom može da se koristi da se nađe odgovarajuća numeracija aminokiselina u željenoj sekvenci.

[0034] Fraze „sadrži aminokiselinsku sekvencu Env proteina HIV koja ima navedeni aminokiselinski ostatak najmanje na jednoj naznačenoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od“ i „sadrži jedan ili više od sledećih (aminokiselinskih ostataka)“ ovde se naizmenično koriste.

[0035] Termin „procenat (%) identičnosti sekvence“ opisuje broj slaganja („pogodaka“) identičnih aminokiselina dva ili više poravnatih aminokiselinskih sekvenci u poređenju sa brojem aminokiselinskih ostataka koji čine ukupnu dužinu aminokiselinskih sekvenci. Drugim rečima, koristeći poravnavanje, za dve ili više sekvenci može biti određen procenat aminokiselinskih ostataka koji su isti (npr., 95%, 97% ili 98% identičnosti), kada se sekvence uporede i poravnaju tako da su maksimalno usklađene, mereno koristeći algoritam za poređenje sekvenci koji je poznat u struci, ili se ručno poravnaju i vizuelno pregledaju. Sekvence upoređene da se odredi identičnost sekvence mogu tako da se razlikuju po supstitucijama, adicijama ili delecijama aminokiselina. Pogodni programi za poravnavanje sekvenci proteina poznati su stručnjacima. Procenat identičnosti proteinskih sekvenci može, na primer, da se odredi programima kao što je CLUSTALW, Clustal Omega, FASTA ili BLAST, npr. koristeći algoritam NCBI BLAST (Altschul SF, et al (1997), Nucleic Acids Res.25:3389-3402).

[0036] „Kolekcija Env sekvenci HIV“, kao što se ovde koristi, predstavlja kolekciju reprezentativnog broja (npr. najmanje 100, ili 500, ili 1000, ili više) nasumičnih sekvenci Env proteina HIV divljeg tipa, koje mogu biti iz istog kladusa (npr. kladus C) ili iz različitih kladusa (npr. kladusi A, B, C, itd.). Pogodne kolekcije takvih sekvenci su dostupne u bazama podataka, ili se odatle mogu izvući potkolekcije, npr. baza podataka sekvenci HIV (Los Alamos National Laboratory). Takva kolekcija poželjno sadrži najmanje 100 sekvenci Env proteina HIV, 1000 sekvenci Env proteina HIV, najmanje 10.000 sekvenci Env proteina HIV, najmanje 50.000 sekvenci Env proteina HIV, i može da sadrži više od 90.000 sekvenci Env proteina HIV.

[0037] „Odgovarajuća pozicija“ u Env proteinu HIV odnosi se na poziciju aminokiselinskog ostatka kada su poravnate najmanje dve Env sekvence HIV. Ako nije drugačije naznačeno, numeracija pozicije aminokiselina u te svrhe je prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2, kao što je uobičajeno u struci.

1

[0038] „Stabilizujuća mutacija“, kao što se ovde koristi, jeste mutacija kao što je ovde opisana u bilo kojoj od stavki (i)–(vii), ili (xvi), u Tabeli 1, ili (viii)–(xv) u Tabeli 2, koja povećava procenat trimera i/ili prinos trimera (koji, na primer, može da se odredi prema ovde opisanim testovima AlphaLISA ili SEC-MALS) Env proteina HIV u poređenju sa matičnim molekulom kada se uvede mutacija supstitucijom odgovarajuće aminokiseline u pomenutom matičnom molekulu. Aminokiseline dobijene takvom stabilizujućom mutacijom obično se retko, ili uopšte ne nalaze u Env proteinima HIV izolata divljeg tipa.

[0039] „Mutacija popravke“, kao što se ovde koristi, je supstitucija aminokiselinskog ostatka u matičnom Env proteinu HIV, i taj aminokiselinski ostatak je prisutan manje od 7,5%, poželjno manje od 2%, na odgovarajućoj poziciji u kolekciji sekvenci Env proteina HIV, naznačeno time što supstitucija se vrši aminokiselinom koja je češće prisutna na odgovarajućoj poziciji u pomenutoj kolekciji, npr. u najmanje 10% Env proteina HIV u pomenutoj kolekciji, i poželjno se vrši aminokiselinom koja je prisutna na odgovarajućoj poziciji u pomenutoj kolekciji u najmanje 20% Env proteina HIV ili je najčešće prisutna aminokiselina na odgovarajućoj poziciji u pomenutoj kolekciji. Aminokiseline dobijene od takvih mutacija popravke obično se tako nalaze u relativno velikom procentu Env proteina HIV izolata divljeg tipa, i mogu u nekoliko slučajeva biti iste kao one na odgovarajućoj poziciji u sekvencama konsenzusa Env HIV.

[0040] „Popravljena i stabilizovana“ sekvenca Env HIV, kao što se ovde koristi, obično sadrži najmanje jednu mutaciju popravke i najmanje jednu mutaciju stabilizacije, poželjno više mutacija popravke i više mutacija stabilizacije u poređenju sa matičnom sekvencom Env HIV.

[0041] Termini „prirodni“ ili „divljeg tipa“ ovde se koriste naizmenično kada se govori o sojevima HIV (ili proteinima Env iz njih), i odnose se na sojeve HIV (ili proteine Env iz njih) kao što se sreću u prirodi, npr. kod pacijenata zaraženih HIV-om.

[0042] Pronalazak se generalno odnosi na rekombinantne proteine omotača (Env) HIV koji sadrže neke supstitucije aminokiselina na navedenim pozicijama u sekvenci proteina omotača koje stabilizuju trimerni oblik proteina omotača. Uvođenje jedne ili više identifikovanih supstitucija aminokiselina iz pronalaska u sekvencu proteina omotača HIV može dovesti do povećanog procenta formiranja trimera i/ili povećanog prinosa trimera. To se, na primer, može odrediti koristeći antitela specifična za trimer, tačku topljenja, hromatografiju na molekulskim

1

sitima, i vezivanje za antitela koja se vezuju za pravilno savijeni (stabilni trimerni) ili alternativno nepravilno savijeni (nestabilni ili netrimerni) protein Env, a smatra se da povećani procenat trimera i/ili prinosa trimera ukazuje na stabilni, nativni, pravilno savijeni protein Env.

[0043] Virus humane imunodeficijencije (HIV) je član roda Lentivirinae, koji pripada porodici Retroviridae. Dve vrste HIV su zarazne za čoveka: HIV-1 i HIV-2. HIV-1 je najčešći soj virusa HIV, i poznato je da ima izraženija patogena svojstva od HIV-2. Kao što se ovde koriste, termini „virus humane imunodeficijencije“ i „HIV“ odnose se, bez ograničenja, na HIV-1 i HIV-2. U poželjnim otelotvorenjima, HIV se odnosi na HIV-1.

[0044] HIV je podeljen u više kladusa sa velikim stepenom genetske raznovrsnosti. Kao što se ovde koriste, termini „kladus HIV“ ili „podtip HIV“ odnose se na povezane viruse humane imunodeficijencije podeljene prema stepenu genetske sličnosti. Najveća grupa izolata HIV-1 se zove grupa M (glavni sojevi) i sastoji se od najmanje deset kladusa, od A do J.

[0045] U jednom generalnom aspektu, pronalazak se odnosi na rekombinantni protein omotača (Env) HIV. Termin „rekombinantni“, kada se odnosi na protein, odnosi se na protein koji se proizvodi rekombinantnom tehnikom ili hemijskom sintezom in vitro. Prema otelotvorenjima pronalaska, „rekombinantni“ protein ima veštačku aminokiselinsku sekvencu u kojoj sadrži najmanje jedan element sekvence (npr. aminokiselinsku supstituciju, deleciju, adiciju, zamenu sekvence itd.) koja ne postoji u odgovarajućoj prirodnoj sekvenci. Poželjno, „rekombinantni“ protein je protein omotača HIV koji ne postoji u prirodi, koji je optimizovan da indukuje imunski odgovor ili da proizvede imunitet na jedan ili više prirodnih sojeva HIV.

[0046] Termini „protein omotača HIV“, „HIV Env“ i „Env protein HIV“ odnose se na protein, ili njegov fragment ili derivat, koji se u prirodi eksprimira na omotaču viriona HIV i omogućava da HIV bude usmeren na membranu plazme ćelije inficirane HIV-om i da se za nju veže. Termini „omotač“ i „Env“ se koriste naizmenično u ovom otkriću. Env gen HIV kodira prekursorski protein gp160, koji se proteolitički cepa na dva zrela glikoproteina gp120 i gp41. Reakcija cepanja je posredovana proteazom ćelije domaćina, furinom (ili proteazama nalik na furin), na veoma očuvanom motivu sekvence u prekursorskim glikoproteinima omotača retrovirusa. Konkretnije, gp160 se trimerizuje u (gp160)3a zatim podleže cepanju na dva nekovalentno vezana zrela glikoproteina gp120 i gp41. Ulazak virusa je zatim posredovan trimerom heterodimera gp120/gp41. Gp120 je receptor vezujući fragment, i vezuje se za CD4

1

receptor (i koreceptor) na ciljnoj ćeliji koja ima takav receptor, kao što je, na primer, T-pomoćnička ćelija. Gp41, koji je nekovalentno vezan za gp120, je fuzioni fragment i obezbeđuje drugi korak kojim HIV ulazi u ćeliju. Gp41 je prvobitno zaklonjen u omotaču virusa, ali kada se gp120 veže za CD4 receptor i koreceptor, gp120 menja svoju konformaciju i izaziva da gp41 postane izložen, gde može da pomogne pri fuziji sa ćelijom domaćinom. Gp140 je ektodomen gp160.

[0047] Prema otelotvorenjima pronalaska, „protein omotača (Env) HIV“ može biti protein gp160 ili gp140, ili njihove kombinacije, fuzije, skraćeni oblici ili derivati. Na primer, „protein omotača HIV“ može da sadrži protein gp120 nekovalentno vezan za protein gp41. „Protein omotača HIV“ može takođe da bude skraćeni protein omotača HIV, uključujući, bez ograničenja, proteine omotača koji sadrže C-terminalno skraćenje u ektodomenu (tj. domenu koji se pruža u vanćelijski prostor), skraćenje u gp41, kao što je skraćenje u ektodomenu gp41, u transmembranskom domenu gp41, ili skraćenje u citoplazmatskom domenu gp41. Protein omotača HIV takođe može biti gp140, što odgovara ektodomenu gp160, ili produžena ili skraćena verzija gp140. Ekspresija proteina gp140 opisana je u nekoliko publikacija (npr. Zhang et al., 2001; Sanders et al., 2002; Harris et al., 2011), i protein takođe može da se poruči od proizvođača, u različitim varijantama, npr. na bazi različitih sojeva HIV. Gp140 protein prema pronalasku može da ima mutaciju mesta cepanja tako da se gp120 domen i gp41 ektodomen ne cepaju i ne vezuju kovalentnom vezom, ili alternativno gp120 domen i gp41 ektodomen mogu da se cepaju i vezuju kovalentnom vezom, npr. putem disulfidnog mosta (kao što je, na primer, u varijantama SOSIP). „Protein omotača HIV“ može dalje da bude derivat prirodnog proteina omotača HIV koji ima mutacije sekvence, npr. na mestima cepanja furinom, i/ili takozvane SOSIP mutacije. Protein omotača HIV prema pronalasku takođe može da ima mesto cepanja tako da gp120 domen i gp41 ektodomen mogu nekovalentno da se vežu.

[0048] U poželjnim otelotvorenjima pronalaska, protein omotača HIV je protein gp140 ili protein gp160, i poželjnije protein gp140. U drugim poželjnim otelotvorenjima pronalaska, protein Env je skraćen, npr. delecijom ostataka posle 7. ostatka citoplazmatskog regiona u poređenju sa prirodnim proteinom Env.

[0049] Prema otelotvorenjima pronalaska, „protein omotača HIV“ može da bude trimer ili monomer, i poželjno je trimer. Trimer može biti homotrimer (npr. trimeri koji sadrže tri identične polipeptidne jedinice) ili heterotrimer (npr. trimeri koji sadrže tri polipeptidne

1

jedinice koje nisu identične). Poželjno, trimer je homotrimer. U slučaju gp140 ili gp160 dobijenih cepanjem, to je trimer polipeptidnih jedinica koje su dimeri gp120-gp41, a u slučaju da su sva tri dimera ista, smatra se homotrimerom.

[0050] „Protein omotača HIV“ može biti rastvorni protein, ili membranski vezan protein. Membranski vezani proteini omotača obično sadrže transmembranski domen, kao kod proteina omotača HIV pune dužine koji sadrži transmembranski domen (TM), kao što je prikazano na SL. 1A. Membranski vezani proteini mogu da imaju citoplazmatski domen, ali im nije potreban citoplazmatski domen da bi se vezali za membranu. Rastvorni proteini omotača sadrže najmanje delimičnu ili potpunu deleciju transmembranskog domena. Na primer, C-terminalni kraj proteina omotača HIV pune dužine može biti skraćen tako da se ukloni transmembranski domen, tako dajući rastvorni protein, kao što je prikazano na SL.1B. Međutim, protein omotača HIV može i dalje biti rastvoran sa manjim skraćenjima i sa alternativnim pozicijama skraćenja u odnosu na one prikazane na SL.1B. Skraćivanje može da se izvrši na različitim pozicijama, a neograničavajući primeri su posle aminokiseline 664, 655, 683 itd., što sve daje rastvorni protein. Membranski vezani protein Env prema pronalasku može da sadrži kompletni ili delimični C-terminalni domen (npr. delimičnom delecijom C-terminalnog citoplazmatskog domena, npr. u nekim otelotvorenjima posle 7. ostatka citoplazmatskog regiona) u poređenju sa nativnim proteinom Env.

[0051] Signalni peptid je obično prisutan na N-terminusu Env proteina HIV kada je eksprimiran, ali se cepa signalnom peptidazom pa nije prisutan u zrelom proteinu. Signalni peptid može biti zamenjen drugim signalnim sekvencama, i neki neograničavajući primeri signalnih peptida su ovde dati u SEQ ID NO: 11, 18, 33 i 34.

[0052] Prema otelotvorenjima pronalaska, protein omotača HIV, npr. gp160, ili gp140, može biti izveden iz sekvence proteina omotača HIV iz bilo kog kladusa HIV (ili „podtipa“). npr. kladus A, kladus B, kladus C, kladus D, kladus E, kladus F, kladus G, kladus H itd., ili njihovih kombinacija (kao u „cirkulišućim rekombinantnim oblicima“ ili CRF dobijenih rekombinacijom virusa različitih podtipova, npr. BC, AE, AG, BE, BF, ADG itd.). Sekvenca proteina omotača HIV može biti prirodna sekvenca, mozaička sekvenca, sekvenca konsenzusa, sintetička sekvenca, ili bilo koji njen derivat ili fragment. „Mozaička sekvenca“ sadrži više epitopa dobijenih od najmanje tri sekvence omotača HIV jednog ili više kladusa HIV, i može biti dizajnirana pomoću algoritama koji optimizuju pokrivenost epitopa T ćelija. Primeri za

1

sekvence mozaičkih proteina omotača HIV uključuju one opisane, npr. u Barouch et al, Nat Med 2010, 16: 319-323; i WO 2010/059732, kao što su, na primer, one prikazane u SEQ ID NO: 8 i 9. Kao što se ovde koristi, „sekvenca konsenzusa“ označava veštačku sekvencu aminokiselina na bazi poravnavanja aminokiselinskih sekvenci homologih proteina, npr. kao što je određeno poravnavanjem (npr. koristeći Clustal Omega) aminokiselinskih sekvenci homologih proteina. To je proračunati redosled najčešćih aminokiselinskih ostataka na svakoj poziciji u poravnavanju sekvenci, na bazi sekvenci Env od najmanje 1000 prirodnih izolata HIV. „Sintetička sekvenca“ je protein omotača HIV koji ne postoji u prirodi, koji je optimizovan da indukuje imunski odgovor ili da proizvede imunitet na više od jednog prirodnog soja HIV. Mozaički proteini omotača HIV su neograničavajući primeri sintetičkih proteina omotača HIV. U poželjnim otelotvorenjima pronalaska, Env protein HIV je Env protein konsenzusa ili sintetički Env protein, koji ima najmanje jednu od navedenih aminokiselina na navedenim pozicijama (i)–(vii) prema pronalasku. Posebno poželjni su Env proteini konsenzusa koji imaju najmanje jedan, poželjno najmanje dva navedena aminokiselinska ostatka na navedenim pozicijama (i)–(vii) prema pronalasku, i poželjno imaju dodatne SOSIP i/ili mutacije mesta cepanja furinom, kao što je dole opisano.

[0053] U nekim otelotvorenjima pronalaska, protein omotača HIV, bilo da je prirodna sekvenca, mozaička sekvenca, sekvenca konsenzusa, sintetička sekvenca itd., sadrži dodatne mutacije sekvence, npr. na mestima cepanja furinom i/ili takozvane SOSIP mutacije.

[0054] U nekim otelotvorenjima pronalaska, protein omotača HIV je „Env protein HIV sa SOSIP mutacijom“. Takozvane SOSIP mutacije su mutacije za stabilizaciju trimera koje uključuju „SOSIP mutacije“(ostatke Cys na pozicijama 501 i 605, što dovodi do uvođenja mogućeg disulfidnog mosta između novostvorenih ostataka cisteina) i „IP mutacije“(ostatak Pro na poziciji 559). Prema otelotvorenjima pronalaska, Env protein sa SOSIP mutacijom sadrži najmanje jednu mutaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od Cys na pozicijama 501 i 605; Pro na poziciji 559; i poželjno Cys na pozicijama 501 i 605 i Pro na poziciji 559. Env protein HIV sa SOSIP mutacijom dodatno može da sadrži druge mutacije sekvence, npr. na mestu cepanja furinom. Pored toga, u nekim otelotvorenjima je moguće dalje dodavanje mutacija tako da Env protein sadrži Pro na poziciji 556 ili na poziciji 558 ili na pozicijama 556 i 558, za koje je ovde utvrđeno da mogu da deluju ne samo kao alternative Pro na poziciji 559 u SOSIP varijanti, nego i kao dodatne mutacije koje mogu dodatno da poboljšaju formiranje trimera SOSIP varijante koja već ima Pro na poziciji 559.

2

[0055] U nekim poželjnim otelotvorenjima pronalaska, Env protein HIV sa SOSIP mutacijom sadrži Cys na pozicijama 501 i 605, i Pro na poziciji 559.

[0056] U nekim otelotvorenjima, protein omotača HIV iz pronalaska dodatno sadrži mutaciju na mestu cepanja furinom. Mutacija u sekvenci cepanja furinom može biti aminokiselinska supstitucija, delecija, umetanje ili zamena jedne sekvence drugom, ili zamena aminokiselinskom sekvencom linkera. Poželjno u predmetnom pronalasku, mutacija mesta cepanja furinom može da se koristi za optimizaciju mesta cepanja, tako da je cepanje furinom poboljšano u odnosu na divlji tip, na primer, zamenom sekvence na ostacima 508–511 sa RRRRRR (SEQ ID NO: 10) [tj. zamena tipične aminokiselinske sekvence (npr. EK) na pozicijama 509–510 sa četiri ostatka arginina (tj. dve zamene i dve adicije), dok na pozicijama 508 i 511 već postoje ostaci arginina prisutni u većini Env proteina HIV, tako da oni obično ne moraju da budu zamenjeni, ali pošto se krajnji rezultat u literaturi često navodi kao aminokiselinska sekvenca RRRRRR, ovde smo zadržali tu nomenklaturu]. Takođe su poznate druge mutacije koje poboljšavaju cepanje furinom, koje mogu da se koriste. Alternativno, moguće je linkerom zameniti mesto cepanja furinom, tako da cepanje furinom više ne bude potrebno, ali će protein zauzeti konformaciju nalik na nativnu (npr. opisanu u (Sharma et al, 2015) i (Georgiev et al, 2015)).

[0057] U konkretnim otelotvorenjima pronalaska, protein omotača HIV iz pronalaska dodatno sadrži i takozvane SOSIP mutacije (poželjno Cys na pozicijama 501 i 605, i Pro na poziciji 559) i mutaciju sekvence na mestu cepanja furinom, poželjno zamenu sekvence na ostacima 508–511 sa RRRRRR (SEQ ID NO: 10). U nekim poželjnim otelotvorenjima, Env protein HIV sadrži obe navedene mutacije, SOSIP i na mestu cepanja furinom, i pored toga dodatno sadrži ostatak Pro na poziciji 556 ili 558, najpoželjnije na obe pozicije, 556 i 558.

[0058] U poželjnim otelotvorenjima pronalaska, aminokiselinska sekvenca proteina omotača HIV je sekvenca konsenzusa, kao što je konsenzus omotača HIV kladusa C ili konsenzus omotača HIV kladusa B. U posebno poželjnom otelotvorenju, aminokiselinska sekvenca proteina omotača HIV je konsenzus omotača HIV kladusa C.

[0059] Primeri za proteine omotača HIV koji mogu da se koriste u pronalasku uključuju konsenzus omotača HIV kladusa C (SEQ ID NO: 2) i konsenzus omotača HIV kladusa B (SEQ ID NO: 4). Ove sekvence konsenzusa omotača HIV kladusa C i kladusa B mogu da sadrže dodatne mutacije koje, npr., povećavaju stabilnost i/ili formiranje trimera, kao što su, na primer, takozvane SOSIP mutacije i/ili mutacija sekvence na mestu cepanja furinom kao što je opisano iznad, kao što je, na primer, u sekvenci ConC_SOSIP prikazanoj u SEQ ID NO: 3 i sekvenci ConB_SOSIP prikazanoj u SEQ ID NO: 5.

[0060] Drugi neograničavajući primeri za poželjne sekvence proteina omotača HIV koje mogu da se koriste u pronalasku (kao „osnovni“ ili „matični“ molekul, naznačeno time što je uvedena jedna ili više mutacija iz pronalaska) uključuju sintetičke Env proteine HIV, na primer sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, ili SEQ ID NO: 6 sa mutacijom Glu u Arg na poziciji 166, i svaka od njih opciono ima dodatne SOSIP i/ili mutacije mesta cepanja furinom, kao što je gore opisano. Drugi neograničavajući primer je SEQ ID NO: 7. Dodatni neograničavajući primeri su mozaički proteini omotača HIV, kao što su oni koji imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili 9.

[0061] U nekim otelotvorenjima, matični molekul je Env protein HIV divljeg tipa, naznačeno time što je jedna ili poželjno više aminokiselina popravljena prema ovde opisanim metodama. Takvi matični molekuli sadrže najmanje jednu mutaciju popravke na aminokiselinskom ostatku koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću manjom od 7,5%, poželjno manjom od 2%, sekvenci Env HIV u kolekciji od najmanje 100, poželjno najmanje 500, poželjno najmanje 1000, poželjno najmanje 10.000, poželjno najmanje 20.000 sekvenci Env HIV divljeg tipa, naznačeno time što mutacija popravke je supstitucija aminokiselinskim ostatkom koji se nalazi na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću od najmanje 10% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji. Poželjno, pomenuta supstitucija se vrši aminokiselinskim ostatkom koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću od najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji. Poželjno, pomenuta supstitucija se vrši aminokiselinskim ostatkom koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa najvećom učestalošću u pomenutoj kolekciji. U nekim poželjnim otelotvorenjima, pomenuti matični molekul sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili najmanje 20 takvih mutacija popravke. Poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili svi aminokiselinski ostaci koji su prisutni na odgovarajućim pozicijama sa učestalošću manjom od 2% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji su popravljeni u matičnom molekulu u poređenju sa Env proteinom divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili svi aminokiselinski ostaci koji su prisutni na odgovarajućim pozicijama sa učestalošću manjom od 7,5% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji su popravljeni u matičnom molekulu u poređenju sa Env proteinom divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, Env protein HIV divljeg tipa je iz kladusa soja A, B ili C, poželjno iz kladusa soja C. Usled tih mutacija popravke, matični molekul će imati više sličnosti sa sekvencom konsenzusa Env HIV nego originalni soj divljeg tipa, pa se popravljeni aminokiselinski ostatak ovde ponekad naziva „aminokiselina konsenzusa“ ili „ostatak konsenzusa“. Rezultat ove popravke su veoma pojačana svojstva rezultujućeg matičnog molekula u pogledu savijanja, trimerizacije, ekspresije i/ili stabilnosti, i rezultujući molekul se ovde naziva „popravljeni protein Env“. Dodavanje stabilizujućih mutacija iz pronalaska (npr. jedna ili više od (i)–(vii) (Tabela 1), i/ili (xvi) (Tabela 1), i/ili opciono (viii)–(xv) (Tabela 2), u takve matične molekule dovodi čak do dodatnog poboljšanja jednog ili više od procenta trimera, prinosa trimera, stabilnosti, vezivanja široko neutrališućih antitela, savijanja, i rezultujući molekuli koji su izvedeni iz Env proteina HIV divljeg tipa se ovde pominju kao „popravljeni i stabilizovani protein Env“. Stručnjak će razumeti da uvođenjem stabilizujućih mutacija rezultujuća sekvenca zapravo malo odstupa od sekvence konsenzusa, tako da je ukupni rezultat veoma poboljšanih svojstava popravljenih i stabilizovanih molekula Env HIV zasnovan na dva potpuno različita koncepta.

[0062] Mutacije koje daju navedene aminokiseline na pozicijama (i)–(vii) prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste kod Env proteina HIV, naznačeno time što nema prisutnih SOSIP mutacija (npr. u sekvencama Env konsenzusa ili u Env proteinima iz izolata HIV divljeg tipa) i verovatno će takođe poboljšati njegovu trimerizaciju, jer su mutacije iz pronalaska nezavisne od SOSIP mutacija, i pored toga se pokazalo da funkcionišu u nekoliko različitih skeleta Env proteina HIV. Zaista, ovde je pokazano da mutacije prema pronalasku mogu da funkcionišu u odsustvu SOS mutacija, kao i u odsustvu IP mutacija poboljšavajući svojstva trimerizacije HIV Env.

[0063] Rekombinantni protein omotača HIV prema otelotvorenjima pronalaska sadrži protein omotača HIV koji ima određene aminokiselinske ostatke na naznačenim pozicijama u aminokiselinskoj sekvenci proteina omotača HIV. Konkretno, identifikovano je sedam pozicija u proteinu omotača, kao konkretni aminokiselinski ostaci koji su poželjni na svakoj identifikovanoj poziciji. Identifikovane pozicije u sekvenci proteina omotača uključuju (i) poziciju 651, (ii) poziciju 655, (iii) poziciju 535, (iv) poziciju 589, (v) poziciju 573, (vi) poziciju 204 i (vii) poziciju 647, naznačeno time što je numeracija pozicija prema numeraciji

2

u gp160 HIV-1 izolata HXB2. Env protein HIV prema pronalasku ima navedene aminokiselinske ostatke najmanje na jednoj od navedenih pozicija (i)–(vii), poželjno najmanje na dve navedene pozicije (i)–(vii), poželjnije najmanje na tri navedene pozicije (i)–(vii). Konkretni aminokiselinski ostaci koji su poželjni na svakoj identifikovanoj poziciji prema otelotvorenjima pronalaska prikazani su u Tabeli 1. Poželjne pozicije ovih opcija su (i), (ii), (iii), (iv), (vi) i/ili (vii). Posebno poželjne pozicije ovih opcija su (i), (ii), (iii), (iv) i/ili (vii). Dodatna poželjna opcija je (xvi), koja se ovde detaljnije pominje u nastavku.

Tabela 1: Poželjne aminokiseline na navedenim pozicijama u rekombinantnim Env proteinima HIV prema otelotvorenjima pronalaska

[0064] Aminokiselinska sekvenca proteina omotača HIV u koju je uvedena jedna ili više supstitucija poželjne aminokiseline (ili navedene aminokiseline) na jednoj ili više navedenih pozicija naziva se „sekvenca skeleta omotača HIV“ ili „matična sekvenca omotača HIV“. Na primer, ako je pozicija 651 u sekvenci ConC_SOSIP SEQ ID NO: 3 mutirana u Phe, onda se sekvenca ConC_SOSIP smatra „skeletom“ ili „matičnom“ sekvencom. Svaki protein omotača HIV može da se koristi kao „skelet“ ili „matična“ sekvenca u koju se može uvesti nova stabilizujuća mutacija prema otelotvorenju pronalaska, bilo sama ili u kombinaciji sa drugim mutacijama, kao što su takozvane SOSIP mutacije i/ili mutacije na mestu cepanja furinom. Neograničavajući primeri za Env protein HIV koji može da se koristi kao skelet uključuju Env protein HIV iz prirodnog izolata HIV, sintetički Env protein HIV, ili Env protein konsenzusa HIV, i u nekim neograničavajućim primerima uključuju one koji sadrže SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 9.

[0065] Prema otelotvorenjima pronalaska, protein omotača HIV može imati navedeni aminokiselinski ostatak najmanje na jednoj od navedenih pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od pozicija 651, 655, 535, 589, 573, 204 i 647, kao što je navedeni aminokiselinski ostatak na jednoj, dve, tri, četiri, pet, šest ili sedam pozicija. Poželjno, protein omotača HIV je supstituisan na jednoj, dve ili tri navedene pozicije, i poželjnije protein omotača HIV je supstituisan najmanje na dve navedene pozicije. Još poželjnije, Env protein HIV je supstituisan na tri navedene pozicije, pet navedenih pozicija, šest navedenih pozicija, ili svih sedam navedenih pozicija. Poželjno, protein omotača HIV sadrži navedene aminokiselinske ostatke najmanje na dve navedene pozicije. Poželjnije, protein omotača HIV sadrži navedene aminokiselinske ostatke na tri navedene pozicije. U drugim poželjnim otelotvorenjima, protein omotača HIV sadrži navedene aminokiselinske ostatke na četiri, pet, šest, ili svih sedam navedenih pozicija.

[0066] Otelotvorenja Env proteina HIV sa navedenim aminokiselinama na više pozicija (pozicije su numerisane prema numeraciji gp160 HIV-1 izolata HXB2 i dodata je jednoslovna šifra za ostatak aminokiseline prisutan na toj poziciji, a pozicije u jednom Env proteinu HIV su odvojene zarezima [npr. otelotvorenje Env proteina koji ima Phe na poziciji 651 i Ile na poziciji 655 opisano je kao 651F, 655I], dok su različita otelotvorenja (tj. različiti Env proteini HIV) odvojena tačkom i zarezom) uključuju sledeće. Za Env proteine sa navedenim aminokiselinama na dve pozicije: 651F, 6551; 651F, 655F; 651F, 655M; 651F, 655W; 651F, 535N; 651F, 535Q; 651F, 589V; 651F, 5891; 651F, 589A; 651F, 573F; 651F, 573W; 651F, 204I; 651F, 647F; 651F, 6471; 651F, 647M; 651L, 6551; 651L, 655F; 651L, 655M; 651L, 655W; 651L, 535N; 651L, 535Q; 651L, 589V; 651L, 5891; 651L, 589A; 651L, 573F; 651L, 573W; 651L, 2041; 651L, 647F; 651L, 6471; 651L, 647M; 651M, 6551; 651M, 655F; 651M, 655A; 651M, 655L; 651M, 655W; 651M, 535N; 651M, 535Q; 651M, 589V; 651M, 5891; 651M, 589A; 651M, 573F; 651M, 573W; 651M, 2041; 651M, 647F; 651M, 6471; 651M, 647M; 651W, 6551; 651W, 655F; 651W, 655M; 651W, 655W; 651W, 535N; 651W, 535Q; 651W, 589V; 651W, 5891; 651W, 589A; 651W, 573F; 651W, 573W; 651W, 2041; 651W, 647F; 651W, 6471; 651W, 647M; 6551, 535N; 6551, 535Q; 6551, 589V; 655I, 5891; 6551,

2

589A; 6551, 573F; 6551, 573W; 655I, 204I; 6551, 647F; 655I, 6471; 6551, 647M; 655F, 535N; 655F, 535Q; 655F, 589V; 655F, 5891; 655F, 589A; 655F, 573F; 655F, 573W; 655F, 2041; 655F, 647F; 655F, 6471; 655F, 647M; 655M, 535N; 655M, 535Q; 655M, 589V; 655M, 5891; 655M, 589A; 655M, 573F; 655M, 573W; 655M, 204I; 655M, 647F; 655M, 6471; 655M, 647M; 655W, 535N; 655W, 535Q; 655W, 589V; 655W, 5891; 655W, 589A; 655W, 573F; 655W, 573W; 655W, 2041; 655W, 647F; 655W, 6471; 655W, 647M; 535N, 589V; 535N, 5891; 535N, 589A; 535N, 573F; 535N, 573W; 535N, 2041; 535N, 647F; 535N, 6471; 535N, 647M; 535Q, 589V; 535Q, 5891; 535Q, 589A; 535Q, 573F; 535Q, 573W; 535Q, 2041; 535Q, 647F; 535Q, 6471; 535Q, 647M; 589V, 573F; 589V, 573W; 589V, 2041; 589V, 647F; 589V, 6471; 589V, 647M; 5891, 573F; 5891, 573W; 5891, 2041; 5891, 647F; 5891, 6471; 5891, 647M; 589A, 573F; 589A, 573W; 589A, 2041; 589A, 647F; 589A, 6471; 589A, 647M; 573F, 2041; 573F, 647F; 573F, 647I; 573F, 647M; 573W, 204I; 573W, 647F; 573W, 647I; 573W, 647M; 204I, 647F; 204I, 647I; 201I, 647M. Svako od ovih otelotvorenja može prema pronalasku biti prisutno u bilo kojoj Env sekvenci HIV, kao što je izolat divljeg tipa, ili Env protein HIV sa SOSIP mutacijom, ili Env protein konsenzusa HIV, ili sintetički Env protein HIV. Svako od ovih otelotvorenja može da se kombinuje sa jednom od poželjnih aminokiselina prema pronalasku na trećoj poziciji jedne od ostalih navedenih pozicija (i)–(vii) prema pronalasku. Takva otelotvorenja, koja imaju poželjne aminokiselinske ostatke na tri pozicije od navedenih pozicija (i)–(vii) mogu se kombinovati sa jednom od poželjnih aminokiselina na četvrtoj poziciji jedne od ostalih navedenih pozicija (i)–(vii) prema pronalasku. Takva otelotvorenja, koja imaju poželjne aminokiselinske ostatke na četiri pozicije od navedenih pozicija (i)–(vii) mogu se kombinovati sa jednom od poželjnih aminokiselina na petoj poziciji jedne od ostalih navedenih pozicija (i)–(vii) prema pronalasku. Takva otelotvorenja, koja imaju poželjne aminokiselinske ostatke na pet pozicija od navedenih pozicija (i)–(vii) mogu se kombinovati sa jednom od poželjnih aminokiselina na šestoj poziciji jedne od ostalih navedenih pozicija (i)–(vii) prema pronalasku. Takva otelotvorenja, koja imaju poželjne aminokiselinske ostatke na šest pozicija od navedenih pozicija (i)–(vii) mogu se kombinovati sa jednom od poželjnih aminokiselina na sedmoj poziciji jedne od ostalih navedenih pozicija (i)–(vii) prema pronalasku, tako da Env protein ima poželjnu aminokiselinu prema pronalasku na svih sedam navedenih pozicija (i)–(vii) prema pronalasku. Svako od ovih dodatnih otelotvorenja koje ima poželjne aminokiseline prema pronalasku na tri, četiri, pet, šest ili sedam pozicija (v)–(vii) iz pronalaska, može biti prisutno u svakom Env proteinu HIV, kao iz izolata divljeg tipa, SOSIP varijante, Env proteina konsenzusa HIV, sintetičkog Env proteina HIV, i slično.

2

[0067] Poželjni Env proteini prema pronalasku sa navedenim aminokiselinama na dve pozicije su: 651F, 6551; 651F, 535N; 651F, 589V; 651F, 5891; 651F, 573F; 651F, 2041; 651F, 647F; 6551, 535N; 6551, 589V; 6551, 5891; 6551, 573F; 655I, 204I; 6551, 647F; 535N, 589V; 535N, 5891; 535N, 573F; 535N, 2041; 535N, 647F ; 589V, 573F; 589V, 2041; 589V, 647F; 5891, 573F; 589I, 204I; 5891, 647F; 573F, 2041; 573F, 647F; 2041, 647F. Posebno poželjni Env proteini sa poželjnim aminokiselinama najmanje na dve pozicije prema pronalasku uključuju: 651F, 6551; 6551, 535N; 6551, 589V; 535N, 589V; 535N, 647F.

[0068] Neki poželjni Env proteini HIV sa poželjnim aminokiselinskim ostacima na tri pozicije su: 651F, 6551, 535N; 651F, 589V, 535N; 651F, 5891, 535N; 651F, 573F, 535N; 651F, 204I, 535N; 651F, 647F, 535N; 6551, 589V, 535N; 6551, 5891, 535N; 6551, 573F, 535N; 655I, 204I, 535N; 6551, 647F, 535N; 589V, 573F, 535N; 589V, 2041, 535N; 589V, 647F, 535N; 5891, 573F, 535N; 589I, 204I, 535N; 5891, 647F, 535N; 573F, 204I, 535N; 573F, 647F, 535N; 2041, 647F, 535N; 651F, 6551, 589V; 651F, 573F, 589V; 651F, 204I, 589V; 651F, 647F, 589V; 6551, 573F, 589V; 6551, 2041, 589V; 655I, 647F, 589V; 573F, 204I, 589V; 573F, 647F, 589V; 2041, 647F, 589V; 651F, 6551, 5891; 651F, 573F, 5891; 651F, 204I, 5891; 651F, 647F, 5891; 6551, 573F, 5891; 655I, 204I, 5891; 6551, 647F, 5891; 573F, 2041, 5891; 573F, 647F, 5891; 2041, 647F, 5891; 651F, 6551, 573F; 651F, 204I, 573F; 651F, 647F, 573F; 655I, 204I, 573F; 6551, 647F, 573F; 2041, 647F, 573F; 651F, 6551, 2041; 651F, 647F, 2041; 6551, 647F, 2041; 651F, 6551, 647F; 6551, 651F, 647F; 6551, 651F, 535N; 6551, 589V, 573F; 6551, 589V, 2041. Posebno poželjni Env proteini sa poželjnim aminokiselinama najmanje na tri pozicije prema pronalasku uključuju: 651F, 6551, 535N; 6551, 589V, 535N; 6551, 573F, 589V; 655I, 204I, 589V; 651F, 6551, 647F.

[0069] Neki poželjni Env proteini HIV sa poželjnim aminokiselinskim ostacima na četiri pozicije su: 651F, 655I, 535N, 589V; 651F, 6551, 535N, 573F; 651F, 6551, 589V, 573F; 651F, 535N, 589V, 573F; 655I, 535N, 589V, 573F; 651F, 655I, 535N, 204I; 651F, 6551, 589V, 204I; 651F, 535N, 589V, 204I; 655I, 535N, 589V, 204I; 651F, 6551, 573F, 204I; 651F, 535N, 573F, 204I; 6551, 535N, 573F, 204I; 651F, 589V, 573F, 2041; 6551, 589V, 573F, 2041; 535N, 589V, 573F, 2041; 651F, 6551, 535N, 647F; 651F, 6551, 589V, 647F; 651F, 535N, 589V, 647F; 6551, 535N, 589V, 647F; 651F, 6551, 573F, 647F; 651F, 535N, 573F, 647F; 6551, 535N, 573F, 647F; 651F, 589V, 573F, 647F; 6551, 589V, 573F, 647F; 535N, 589V, 573F, 647F; 651F, 6551, 2041, 647F; 651F, 535N, 2041, 647F; 655I, 535N, 2041, 647F; 651F, 589V, 204I,

2

647F; 655I, 589V, 2041, 647F; 535N, 589V, 204I, 647F; 651F, 573F, 2041, 647F; 6551, 573F, 2041, 647F; 535N, 573F, 2041, 647F; i 589V, 573F, 204I, 647F.

Neki primeri za poželjne Env proteine HIV sa poželjnim aminokiselinskim ostacima najmanje na četiri pozicije uključuju: 651F, 6551, 647F, I535N; 651F, 6551, 573F, 589V. Poželjan primer za Env protein HIV koji sadrži navedene aminokiselinske ostatke najmanje na četiri pozicije uključuje 535N, 589V, 651F, 655I. Neograničavajući primeri takvih Env proteina HIV dati su u SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31 i 32. Poželjno, takav Env protein HIV je Env protein HIV kladusa C ili Env protein HIV kladusa A, najpoželjnije Env protein HIV kladusa C. U nekim otelotvorenjima, pomenuti Env protein HIV dodatno sadrži 588E, tj. sadrži barem 535N, 588E, 589V, 651F, 655I. Neograničavajući primeri takvog Env proteina HIV dati su u SEQ ID NO: 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31 i 32. U nekim otelotvorenjima, pomenuti Env protein HIV dodatno sadrži 556P, tj. sadrži barem 535N, 556P, 589V, 651F, 6551, ili barem 535N, 556P, 588E, 589V, 651F, 6551. Neograničavajući primeri takvog Env proteina HIV dati su u SEQ ID NO: 22, 24, 26, 27, 29, 30, 31 i 32.

[0070] U jednom otelotvorenju, rekombinantni Env protein HIV prema pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu Env proteina HIV koja ima navedene aminokiselinske ostatke najmanje na dve naznačene pozicije izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i

(vii) Phe, Met ili Ile na poziciji 647.

Na primer, rekombinantni Env protein HIV može da ima jedan od Phe, Leu, Met ili Trp na poziciji 651, i Asn ili Gln na poziciji 535, opciono, dodatne navedene aminokiselinske ostatke na dodatnim navedenim pozicijama. Poželjno, najmanje jedna od aminokiselina pod (i)–(vii) uvedena je u rekombinantni Env protein HIV putem aminokiselinske supstitucije. Na primer, rekombinantni Env protein HIV može da se proizvede od Env proteina HIV koji ne sadrži, ili sadrži samo jedan od aminokiselinskih ostataka pod (i)–(vii) iznad tako da su svi, ili jedan ili više od najmanje dva navedena aminokiselinska ostatka uvedeni u rekombinantni Env protein HIV putem aminokiselinske supstitucije.

2

[0071] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni Env protein HIV iz pronalaska dodatno sadrži (viii) Gln, Glu, Ile, Met, Val, Trp ili Phe na poziciji 588, naznačeno time što su poželjni Gln ili Glu.

[0072] Aminokiselinska sekvenca Env proteina HIV u koju su uvedene goreopisane supstitucije može biti bilo koji Env protein HIV poznat u struci u pogledu predmetnog otkrića, kao što je, na primer, prirodna sekvenca iz HIV kladusa A, kladusa B, kladusa C, itd.; mozaička sekvenca; sekvenca konsenzusa, npr. sekvenca konsenzusa kladusa B ili kladusa C; sintetička sekvenca; ili bilo koji njen derivat ili fragment. U nekim otelotvorenjima pronalaska, aminokiselinska sekvenca Env proteina HIV sadrži dodatne mutacije, kao što su, na primer, takozvane SOSIP mutacije i/ili mutacija na mestu cepanja furinom.

[0073] U jednom konkretnom otelotvorenju, skelet Env proteina HIV je Env protein HIV sa SOSIP mutacijom koji sadrži najmanje jednu mutaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od Cys na pozicijama 501 i 605; Pro na poziciji 559. U poželjnom otelotvorenju, Env protein HIV sa SOSIP mutacijom sadrži Cys na pozicijama 501 i 605, i Pro na poziciji 559. Prema ovom otelotvorenju, rekombinantni Env protein HIV sadrži aminokiselinsku sekvencu Env proteina HIV sa SOSIP mutacijom i aminokiselinsku supstituciju navedenim aminokiselinskim ostatkom najmanje na jednoj naznačenoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i

(vii) Phe, Met ili Ile na poziciji 647.

Env protein HIV sa SOSIP mutacijom može dodatno da sadrži mutaciju na mestu cepanja furinom, kao što je zamena na pozicijama 608–511 sekvencom SEQ ID NO: 10.

[0074] U drugom otelotvorenju, rekombinantni Env protein HIV prema pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu Env proteina HIV i aminokiselinsku supstituciju navedenim aminokiselinskim ostatkom najmanje na jednoj naznačenoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp na poziciji 651;

2

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i

(vii) Phe, Met ili Ile na poziciji 647,

naznačeno time što Env protein HIV je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(1) sekvence konsenzusa Env HIV, kao što je sekvenca konsenzusa kladusa C ili kladusa B, npr. koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, 3, 4 ili 5;

(2) sintetičkog proteina Env HIV, koji, npr., sadrži aminokiselinsku sekvencu (a) SEQ ID NO: 6; (b) SEQ ID NO: 6 sa mutacijom Glu u Arg na poziciji 166; (c) SEQ ID NO: 7; (d) SEQ ID NO: 8 ili 9, (a), (b) ili (d) opciono ima dodatne SOSIP i/ili mutacije mesta cepanja furinom, kao što je gore opisano.

Poželjno, rekombinantni Env protein HIV sadrži aminokiselinsku sekvencu Env proteina HIV i aminokiselinsku supstituciju navedenim aminokiselinskim ostatkom najmanje na dve naznačene pozicije izabrane iz grupe koja se sastoji od (i)–(vii) iznad, kao što su dve pozicije ili tri pozicije. Međutim, rekombinantni Env protein HIV može da sadrži aminokiselinsku supstituciju navedenim aminokiselinskim ostatkom najmanje na jednoj ili više naznačenih pozicija, kao što je jedna, dve, tri, četiri, pet, šest ili sedam naznačenih pozicija.

[0075] U jednom posebnom otelotvorenju, skelet Env proteina HIV je konsenzus Env HIV kladusa C koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2. Poželjno, sekvenca konsenzusa HIV kladusa C SEQ ID NO: 2 dodatno sadrži takozvane SOSIP mutacije, tj. Cys na pozicijama 501 i 605, i Pro na poziciji 559, i poželjnije dodatno sadrži takozvane SOSIP mutacije i mutaciju na mestu cepanja furinom, kao što je, na primer, zamena na pozicijama 508–511 sekvencom SEQ ID NO: 10. U posebno poželjnom otelotvorenju, skelet Env proteina HIV sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 3, ili sekvencu koja je najmanje 95% identična sa njom, naznačeno time što poželjno aminokiseline na pozicijama 501, 559, 605 i 508–511 zamenjene sa SEQ ID NO: 10, nisu mutirane u poređenju sa SEQ ID NO: 3.

[0076] U drugom posebnom otelotvorenju, skelet Env proteina HIV je konsenzus Env HIV kladusa B koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4. Poželjno, sekvenca konsenzusa HIV kladusa B SEQ ID NO: 4 dodatno sadrži takozvane SOSIP mutacije, tj. Cys na pozicijama 501 i 605, i Pro na poziciji 559, i poželjnije dodatno sadrži takozvane SOSIP mutacije i mutaciju na mestu cepanja furinom, kao što je, na primer, zamena na pozicijama 508–511 sekvencom SEQ ID NO: 10. U posebno poželjnom otelotvorenju, skelet Env proteina HIV sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 5, ili sekvencu koja je najmanje 95% identična sa njom, naznačeno tim što poželjno aminokiseline na pozicijama 501, 559, 605 i 508–511 zamenjene sa SEQ ID NO: 10, nisu mutirane u poređenju sa SEQ ID NO: 5.

[0077] U drugom posebnom otelotvorenju, skelet Env proteina HIV je sintetički protein Env HIV, npr. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (a) SEQ ID NO: 6; (b) SEQ ID NO: 6 sa mutacijom Glu u Arg na poziciji 166; (c) SEQ ID NO: 7; ili (d) SEQ ID NO: 8 ili 9, (a), (b) ili (d) opciono ima dodatne SOSIP (501C, 605C, 559P) i/ili mutacije mesta cepanja furinom (508-511RRRRRR), kao što je gore opisano.

[0078] U drugim posebnim otelotvorenjima, skelet Env proteina HIV je Env protein HIV kladusa A ili kladusa C divljeg tipa virusa HIV, koji opciono sadrži mutacije za popravku sekvence prema ovde opisanim metodama.

[0079] Primeri kombinacija dve pozicije u Env proteinu HIV koje mogu biti istovremeno supstituisane uključuju ostatke 535,589; 535,647; i 589,655; kao što je, na primer, u dvostrukim mutantima I535N, D589V; I535N, E647F i D589V, K655I. Ostali dvostruki mutanti uključuju K655I, I535N; N651F, K655I; i K655I, I573F. Primeri kombinacije tri pozicije u Env proteinu HIV koje mogu biti istovremeno supstituisane uključuju ostatke 535,589,655, kao što je, na primer, u trostrukom mutantu I535N, D589V, K655I. Ostali trostruki mutanti uključuju K655I, D589V, I573F; i K655I, N651F, I535N.

[0080] U nekim otelotvorenjima pronalaska, rekombinantni Env protein HIV prema pronalasku može dalje da sadrži navedeni aminokiselinski ostatak (npr. putem supstitucije) na jednoj ili više dodatnih naznačenih pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od pozicija (viii) 588, (ix) 64 ili 66, (x) 316, (xi) 201/433, (xii) 556 ili 558 ili 556 i 558, (xiii) 548–568, (xiv) 568, 569 i 636, ili (xv) 302, 519 ili 520, kao što je prikazano u Tabeli 2 ispod. Za neke od ovih aminokiselinskih supstitucija (npr. (viii)), predmetni pronalazači su utvrdili da se veoma dobro kombinuju sa mutacijama (njihovim kombinacijama) (i)–(vii) prema pronalasku, kao što je gore opisano. Druge od ovih aminokiselinskih supstitucija su prethodno objavljene u literaturi.

1

Na primer, De Taeye et al. (Cell (2015) 163(7), 1702-15) objavili su protein omotača HIV koji ima dvostruku mutaciju E64K i T316W, i Env protein HIV koji ima mutaciju 66R; i u WO 2016/037154 i Kwon et al. (Nat. Struct. Mol. Biol. (2015) 22(7) 522-31) objavljen je protein omotača HIV koji ima disulfidnu supstituciju I204C, A433C; i Guenaga et al. (Immunity (2017) 46, 792-803) objavili su protein omotača HIV koji ima trostruku supstituciju L568G, T569G ili N636G, i N302Y, F519R, L520R. Međutim, prema saznanju pronalazača, ove prethodno opisane mutacije nisu opisane u kombinaciji ni sa jednom od novih supstitucija opisanih ovde, npr. supstitucija navedenih u Tabeli 1. Ove aminokiselinske mutacije u kombinaciji sa aminokiselinskim supstitucijama iz pronalaska mogu dodatno da poboljšaju prinos trimera i/ili procenat formiranja trimera. Ove aminokiselinske supstitucije mogu da se uvedu u bilo koji ovde opisani rekombinantni Env protein HIV pored supstitucija naznačenim aminokiselinskim ostatkom na jednoj ili više navedenih pozicija, kao što je opisano u Tabeli 1.

Tabela 2: Dodatne pozicije aminokiselinskih supstitucija i ostatak supstitucije

2

Supstitucije identifikovane na navedenim pozicijama predmetnog pronalaska [(i)–(vii), vidite npr. Tabelu 1] nisu prisutne, ili su retko prisutne u prirodnim sekvencama, ne nalaze se u kombinaciji u prethodno objavljenim sekvencama Env proteina HIV, i prethodno nije predloženo da dovode do poboljšane trimerizacije Env proteina HIV, poboljšanog prinosa trimera i/ili povećane stabilnosti trimera. Mutacije (ix)–(xi) u Tabeli 2 (koje su prethodno drugi prijavili), sve su u gp120 regionu, za koji se vezuje trimer specifično antitelo PGT145. Te mutacije drže trimer zatvorenim na apeksu (koji je na vrhu molekula). Sve supstitucije (xii) i (xiii) su u HR1 gp41. Osim pozicije 204, sve mutacije iz predmetnog pronalaska u Tabeli 1 su u regionu gp41 (na donjem delu molekula), ali izvan HR1 regiona. Jasno je da prethodno opisane mutacije ne predstavljaju sugestiju za uvođenje mutacija iz predmetnog pronalaska, niti njihovog neočekivanog efekta na formiranje trimera sa zatvorenim apeksom, što se određuje vezivanjem PGT145. Osim tačkastih mutacija (viii)–(xii) u Tabeli 2, takođe je moguće zameniti HR1 petlju proteina Env (aminokiselinski ostaci 548–568 u sekvenci divljeg tipa, sa numeracijom prema gp160 HXB2 izolata) kraćom i manje elastičnom petljom sa 7–10 aminokiselina, poželjno petljom sa 8 aminokiselina, npr. koja ima sekvencu izabranu od bilo koje od (SEQ ID NO: 12-17), vidite npr. Kong et al (Nat Commun. 2016 Jun 28;7:12040. doi: 10.1038/ncomms12040) koji opisuju takve kraće petlje koje zamenjuju HR1 petlju. Takva varijanta Env, koja dodatno ima navedene aminokiselinske ostatke najmanje na jednoj, i poželjno najmanje na dve naznačene pozicije (i)–(vii) prema pronalasku, takođe je otelotvorenje pronalaska. Mutacije nabrojane u (viii)–(xiii) u nekim otelotvorenjima pronalaska mogu da se dodaju Env proteinima HIV iz pronalaska, tj. koji imaju jednu ili više navedenih aminokiselina na pozicijama (i)–(vii). Takođe, mogu se napraviti kombinacije u okviru grupa (viii)–(xiii), a neograničavajući primer je kombinacija mutacija (pored najmanje jedne mutacije (i)–(vii)) pod (viii) i (xii) (npr. I535N, A556P, K588E). Neki neograničavajući primeri dvostrukih mutanata koji su napravljeni u osnovi Env HIV sa SOSIP mutacijama i kombinovanjem mutacija najmanje na jednoj poziciji (i)–(vii) i najmanje na jednoj poziciji (viii)–(xiii) uključuju: 535,588; 588,589; 655,588; 558,535; i 655,556; kao što je, na primer, I535N, K588E; 588Q, D589V; K655I, K588E; A558P, I535N; i K655I, L556P. Neki neograničavajući primeri takvih trostrukih mutanata uključuju 558,535,588; 558,535,589; 558,535,655; i 558,535,651, kao što je, na primer, A558P, I535N, K588E; A558P, 1535, D589V; A558P, I535N, K655I; i A558P, I535N, N651F.

Dodatni neograničavajući primeri kombinacija prema pronalasku uključuju 6551, 573F, 589V, 588E; 651F, 6551, 573F, 589V, 588E; 651F, 6551, 573F, 589V, 588E, 535N; 651F, 6551, 573F, 589V, 588E, 535N, 2041; 651F, 6551, 556P; 651F, 535N, 556P; 651F, 589V, 556P; 651F, 5891, 556P; 651F, 573F, 556P; 651F, 2041, 556P; 651F, 647F, 556P; 6551, 535N, 556P; 6551, 589V, 556P; 6551, 5891, 556P; 6551, 573F, 556P; 655I, 204I, 556P; 6551, 647F, 556P; 535N, 589V, 556P; 535N, 5891, 556P; 535N, 573F, 556P; 535N, 2041, 556P; 535N, 647F, 556P; 589V, 573F, 556P; 589V, 2041, 556P; 589V, 647F, 556P; 5891, 573F, 556P; 589I, 204I, 556P; 5891, 647F, 556P; 573F, 204I, 556P; 573F, 647F, 556P; 651F, 655I, 558P; 651F, 535N, 558P; 651F, 589V, 558P; 651F, 5891, 558P; 651F, 573F, 558P; 651F, 204I, 558P; 651F, 647F, 558P; 6551, 535N, 558P; 6551, 589V, 558P; 655I, 589I, 558P; 6551, 573F, 558P; 655I, 204I, 558P; 6551, 647F, 558P; 535N, 589V, 558P; 535N, 5891, 558P; 535N, 573F, 558P; 535N, 2041, 558P; 535N, 647F , 558P; 589V, 573F, 558P; 589V, 2041, 558P; 589V, 647F, 558P; 5891, 573F, 558P; 5891, 2041, 558P; 5891, 647F, 558P; 573F, 204I, 558P; 573F, 647F, 558P; 6551, 589V, 535N, 556P; 651F, 6551, 535N, 556P; 556P, 651F; 556P, 651F, 6551, 535N; 6551, 589V, 573F, 651F, 588E, 556P; 556P, 651F, 6551, 535N, 573F; 556P, 651F, 655I, 535N, 573F, 589V; 556P, 651F, 6551, 535N, 573F, 589V, 2041; 556P, 651F, 6551, 535N, 573F, 589V, 2041, 588Q; 556P, 651F, 6551, 535N, 573F, 589V, 2041, 588Q, 647F; 556P, 651F, 535N, 573F; 556P, 651F, 535N, 573F, 589V; 556P, 651F, 535N, 573F, 589V, 2041; 556P, 651F, 535N, 573F, 589V, 2041, 588Q; 556P, 651F, 535N, 573F, 589V, 2041, 588Q, 647F; 556P, 6551, 535N, 573F; 556P, 6551, 535N, 573F, 589V; 556P, 6551, 535N, 573F, 589V, 2041; 556P, 6551, 535N, 573F, 589V, 2041, 588Q; 556P, 6551, 535N, 573F, 589V, 2041, 588Q, 647F. Ponovo, svako od ovih otelotvorenja može biti u bilo kom Env proteinu HIV, npr. izolatu divljeg tipa, Env konsenzusu, sintetičkom Env proteinu, Env proteinu sa SOSIP mutacijom, izolatu divljeg tipa koji sadrži mutacije popravke prema ovde opisanom konceptu, itd. Neke poželjne kombinacije prema pronalasku uključuju 655I, 589V, 573F, 651F, 588E, 535N, 204I; 556P, 6551, 535N, 573F, 589V, 2041, 588Q; 204I, 535N, 556P, 588E, 589V, 651F, 655I; 535N, 556P, 589V, 65IF, 655I; i 535N, 556P, 588E, 589V, 651F, 655I.

U nekim poželjnim otelotvorenjima, Env protein HIV sadrži sekvencu koja je najmanje 95% identična, poželjno najmanje 96%, 97%, 98%, 99% identična, poželjno 100% identična, bilo kojoj od SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31 i 32. Kod određivanja % identičnosti,

4

poželjno se pozicije (i)–(xv) iz Tabele 1 i 2, i poželjno takođe pozicije 501, 559 i 605, ne uzimaju u obzir. Poželjno, aminokiselinski ostaci na tim pozicijama su oni iz sekvenci SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, odnosno 32.

[0081] U nekim otelotvorenjima, Env protein HIV iz pronalaska dodatno sadrži: (xvi) aminokiselinski ostatak odabran od Val, Ile, Phe, Met, Ala ili Leu na poziciji 658. Poželjno, aminokiselina na poziciji 658 je Val ili Ile, najpoželjnije Val. Nađeno je da ona jako povećava procenat trimera i prinos trimera Env proteina, bilo sama ili u kombinaciji sa mutacijama izabranim od (i)–(vii) iz Tabele 1 i/ili (viii)–(xv) iz Tabele 2 koje su ovde opisane.

[0082] Prema otelotvorenjima pronalaska, rekombinantni Env protein HIV ima najmanje jedno od (a) poboljšanog procenta formiranja trimera i (b) poboljšanog prinosa trimera u poređenju sa Env proteinom HIV koji nema naznačene aminokiselinske ostatke na jednoj ili više pozicija 651, 655, 535, 589, 573, 204 i 647, kao što je prikazano u Tabeli 1.

[0083] Kao što se ovde koristi, „poboljšani procenat formiranja trimera“ znači da nastaje veći procenat trimera kada sekvenca skeleta proteina omotača HIV sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija iz pronalaska u poređenju sa procentom trimera koji nastaje kada sekvenca skeleta proteina omotača HIV ne sadrži takve aminokiselinske supstitucije. Kao što se ovde koristi, „poboljšani prinos trimera“ znači da se dobija veća ukupna količina trimernog oblika proteina omotača kada sekvenca skeleta proteina omotača HIV sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija iz pronalaska u poređenju sa ukupnom količinom trimernog oblika proteina omotača koji se dobija kada sekvenca skeleta proteina omotača HIV ne sadrži takve aminokiselinske supstitucije.

[0084] Formiranje trimera može da se odredi testom vezivanja antitela, koristeći antitela koja se specifično vezuju za trimerni oblik Env proteina HIV. Primeri za trimer specifična antitela koja mogu da se koriste za detektovanje oblika trimera uključuju, bez ograničenja, monoklonska antitela (mAt) PGT145, PGDM1400, PG16 i PGT151. Poželjno, trimer specifično antitelo je mAt PGT145. Svaki test vezivanja antitela poznat u struci, kao što je ELISA, AlphaLISA, itd., u pogledu predmetnog otkrića može da se koristi za određivanje procenta formiranja trimera rekombinantnog Env proteina HIV iz pronalaska.

[0085] U posebnom otelotvorenju, formiranje trimera se određuje pomoću testa AlphaLISA. AlphaLISA je test bliskog rastojanja na bazi perlica, u kome se molekuli singleta kiseonika, nastali ozračivanjem donorskih perlica velikom energijom, prenose na akceptorske perlice koje su u okviru rastojanja od oko 200 nm u odnosu na donorske perlice. Transfer molekula singleta kiseonika na akceptorske perlice aktivira kaskadnu seriju hemijskih reakcija koja dovodi do hemiluminescentnog signala koji onda može da se detektuje (Eglen et al. Curr. Chem. Genomics, 2008, 25(1): 2-10). Na primer, rekombinantni proteini omotača HIV obeleženi oznakom Flag-His mogu da se inkubiraju sa trimer specifičnim mAt, donorskim perlicama konjugovanim sa antitelom koje se vezuje za trimer specifično mAt, donorskim perlicama konjugovanim sa niklom, akceptorskim perlicama konjugovanim sa anti-His antitelom, i akceptorskim perlicama konjugovanim sa anti-Flag antitelom. Nastala količina trimera može da se odredi merenjem hemiluminescentnog signala koji generiše par donorskih perlica konjugovanih sa antitelom koje se vezuje za trimer specifično mAt i akceptorskih perlica konjugovanih sa anti-His antitelom. Ukupna količina eksprimiranog proteina omotača HIV može da se odredi merenjem hemiluminescentnog signala koji generiše par donorskih perlica konjugovanih sa niklom i akceptorskih perlica konjugovanih sa anti-Flag antitelom. Na primer, količina trimera i ukupnog eksprimiranog proteina omotača može da se odredi testom AlphaLISA, kao što je detaljno opisano u Primeru 3. Procenat formiranja trimera može da se izračuna deljenjem količine formiranog trimera ukupnom količinom eksprimiranog proteina omotača.

[0086] Količina formiranog trimera i ukupna količina eksprimiranog proteina omotača takođe može da se odredi koristeći hromatografske tehnike kojima može da se razdvoji trimerni oblik od drugih oblika proteina omotača HIV, npr. monomernog oblika. Primeri za takve tehnike koje mogu da se koriste uključuju, bez ograničenja, hromatografiju na molekulskim sitima sa višeugaonim rasipanjem svetlosti (SEC-MALS). Prema nekim otelotvorenjima, procenat formiranja trimera je određen pomoću SEC-MALS. Prema nekim otelotvorenjima, prinos trimera je određen pomoću SEC-MALS.

Nukleinska kiselina, vektori i ćelije

[0087] U drugom generalnom aspektu, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira rekombinantni Env protein HIV prema pronalasku, i vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline. Molekuli nukleinske kiseline iz pronalaska mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK dobijene kloniranjem ili proizvedene sintetički. DNK može biti dvolančana ili jednolančana. DNK može, na primer, da sadrži cDNK, genomsku DNK, ili njihove kombinacije. Molekuli nukleinske kiseline i vektori mogu da se koriste za proizvodnju rekombinantnih proteina, ekspresiju proteina iz ćelije domaćina, ili proizvodnju virusnih čestica.

[0088] Prema otelotvorenjima pronalaska, nukleinska kiselina koja kodira rekombinantni Env protein HIV operativno je vezana za promoter, što znači da je nukleinska kiselina pod kontrolom promotera. Promoter može biti homologi promoter (tj. dobijen od istog genetskog izvora kao vektor), ili heterologi promoter (tj. dobijen od različitog vektora ili genetskog izvora). Primeri za pogodne promotere uključuju trenutni rani promoter humanog citomegalovirusa (hCMV IE, ili skraćeno „CMV“) i promoter Rausovog virusa sarkoma (RSV). Poželjno, promoter se nalazi ushodno od nukleinske kiseline u ekspresionoj kaseti.

[0089] Prema otelotvorenjima pronalaska, vektor može biti ekspresioni vektor. Ekspresioni vektori uključuju, bez ograničenja, vektore za ekspresiju rekombinantnih proteina i vektore za isporuku nukleinske kiseline u ispitanika radi ekspresije u tkivu ispitanika, kao što je virusni vektor. Primeri za virusne vektore pogodne za primenu sa pronalaskom uključuju, bez ograničenja, adenovirusne vektore, adeno-povezane virusne vektore, vektore virusa boginja, modifikovane vakcinija Ankara (MVA) vektore, vektore enterijskih virusa, vektore virusa venecuelanskog encefalitisa konja, vektore virusa Semliki šume, vektore mozaičkog virusa duvana, lentivirusne vektore, itd. Vektor takođe može biti nevirusni vektor. Primeri za nevirusne vektore uključuju, bez ograničenja, plazmide, bakterijske veštačke hromozome, veštačke hromozome kvasca, bakteriofage itd.

[0090] U nekim otelotvorenjima pronalaska, vektor je adenovirusni vektor, npr. rekombinantni adenovirusni vektor. Rekombinantni adenovirusni vektor može, na primer, da se dobije od humanog adenovirusa (HAdV ili AdHu), ili majmunskog adenovirusa, kao što je adenovirus šimpanze ili gorile (ChAd, AdCh ili SAdV) ili adenovirus rezusa (rhAd). Poželjno, adenovirusni vektor je rekombinantni humani adenovirusni vektor, na primer rekombinantni humani adenovirusni vektor serotipa 26, ili bilo koji od serotipova 5, 4, 35, 7, 48 itd. rekombinantnog humanog adenovirusa. U drugim otelotvorenjima, adenovirusni vektor je vektor rhAd, npr. rhAd51, rhAd52 ili rhAd53.

[0091] Priprema rekombinantnih adenovirusnih vektora je dobro poznata u struci. Na primer, priprema rekombinantnih vektora adenovirusa 26 je opisana, npr., u WO 2007/104792 i u Abbink et al., (2007) Virol.81(9): 4654-63. Primeri za sekvence genoma adenovirusa 26 mogu se naći u GenBank pristupu EF 153474, i u SEQ ID NO: 1 WO 2007/104792. Primeri za sekvence genoma za rhAd51, rhAd52 i rhAd53 nalaze se u US 2015/0291935.

[0092] Prema otelotvorenjima pronalaska, bilo koji ovde opisani rekombinantni Env protein HIV može biti eksprimiran i/ili kodiran bilo kojim ovde opisanim vektorom. U pogledu degeneracije genetskog koda, stručnjak je upoznat da može biti dizajnirano nekoliko sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju isti protein, prema sasvim rutinskim metodama u struci. Nukleinska kiselina koja kodira rekombinantni Env protein HIV iz pronalaska može opciono biti sa optimizovanim kodonom, kako bi se obezbedila pravilna ekspresija u ćeliji domaćinu (npr. bakterijskoj ćeliji ili ćeliji sisara). Optimizacija kodona je tehnologija koja se mnogo koristi u struci.

[0093] Pronalazak takođe obezbeđuje ćelije, poželjno izolovane ćelije, koje sadrže bilo koje ovde opisane molekule nukleinskih kiselina i vektore. Ćelije mogu, na primer, da se koriste za proizvodnju rekombinantnih proteina, ili za proizvodnju čestica virusa.

[0094] Otelotvorenja pronalaska se takođe odnose na metodu za dobijanje rekombinantnog Env proteina HIV. Metoda obuhvata transficiranje ćelije domaćina ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rekombinantni Env proteina HIV prema otelotvorenju iz pronalaska operativno vezan za promoter, uzgajanje transficiranih ćelija pod uslovima pogodnim za ekspresiju rekombinantnog Env proteina HIV, i opciono prečišćavanje ili izolovanje rekombinantnog Env proteina HIV eksprimiranog u ćeliji. Rekombinantni Env protein HIV može biti izolovan ili sakupljen iz ćelije bilo kojom metodom poznatom u struci, uključujući afinitetnu hromatografiju, hromatografiju na molekulskim sitima itd. Tehnike primenjene za ekspresiju rekombinantnog proteina biće dobro poznate stručnjaku sa prosečnim znanjem u pogledu predmetnog otkrića. Eksprimirani rekombinantni Env protein HIV takođe može da se proučava bez prečišćavanja ili izolovanja eksprimiranog proteina, npr. analizom supernatanta ćelija transficiranih ekspresionim vektorom koji kodira rekombinantni Env protein HIV i uzgajanim pod uslovima pogodnim za ekspresiju Env proteina HIV.

[0095] U poželjnom otelotvorenju, eksprimirani rekombinantni Env protein HIV je prečišćen pod uslovima koji omogućavaju asocijaciju proteina tako da se formira stabilizovani trimerni kompleks. Na primer, ćelije sisara transficirane ekspresionim vektorom koji kodira rekombinantni Env protein HIV operativno vezan za promoter (npr. CMV promoter) mogu biti uzgajane na 33–39 °C, npr.37 °C, i 2–12% CO2, npr.8% CO2. Ekspresija takođe može da se vrši u alternativnim ekspresionim sistemima, kao što su ćelije insekata ili ćelije kvasca, koji su uobičajeni u struci. Eksprimirani Env protein HIV onda može da se izoluje iz ćelijske kulture, na primer, putem afinitetne hromatografije sa lektinom, koji vezuje glikoproteine. Env protein HIV vezan za kolonu može da se eluira manopiranozidom. Env protein HIV eluiran sa kolone može biti podvrgnut daljim koracima prečišćavanja, kao što je hromatografija na molekulskim sitima, po potrebi, da bi se uklonili svi zaostali kontaminanti, npr. ćelijski kontaminanti, ali i agregati Env, monomeri gp140 i monomeri gp120. Alternativne metode prečišćavanja, neograničavajući primeri uključujući afinitetnu hromatografiju antitela, negativnu selekciju pomoću ne-bNAt, anti-tag prečišćavanje, ili druge hromatografske metode, kao što je jonoizmenjivačka hromatografija itd., kao i druge metode poznate u struci, takođe mogu da se koriste za izolovanje Env proteina HIV.

[0096] Molekuli nukleinske kiseline i ekspresioni vektori koji kodiraju rekombinantni Env protein HIV iz pronalaska mogu da se naprave bilo kojom metodom poznatom u struci u pogledu predmetnog otkrića. Na primer, nukleinska kiselina koja kodira rekombinantni Env protein HIV može da se pripremi uvođenjem najmanje jedne aminokiselinske supstitucije na navedenim pozicijama u sekvenci skeleta omotača HIV koristeći genetsko inženjerstvo i tehnike molekularne biologije, npr. mutagenezu usmerenu na mesto, lančanu reakciju polimeraze (PCR), koje su dobro poznate u struci. Molekul nukleinske kiseline onda može da se uvede ili „klonira“ u ekspresioni vektor takođe koristeći standardne tehnike molekularne biologije. Rekombinantni protein omotača HIV onda može da se eksprimira iz ekspresionog vektora u ćeliji domaćinu, a ekspresioni protein da se prečisti iz ćelijske kulture bilo kojom metodom poznatom u struci u pogledu predmetnog pronalaska.

Trimerni kompleks

[0097] U drugom generalnom aspektu, pronalazak se odnosi na trimerni kompleks koji sadrži nekovalentni oligomer od tri rekombinantna Env proteina HIV prema pronalasku. Trimerni kompleks može da sadrži bilo koje ovde opisane rekombinantne Env proteine HIV. Poželjno, trimerni kompleks sadrži tri identična monomera (ili identične heterodimere ako se cepa gp140) rekombinantnih Env proteina HIV prema pronalasku. Trimerni kompleks može da se razdvoji od ostalih oblika Env proteina HIV, kao što je monomerni oblik, ili trimerni kompleks može biti prisutan zajedno sa drugim oblicima Env proteina HIV, kao što je monomerni oblik.

Kompozicije i metode

[0098] U drugom generalnom aspektu, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži rekombinantni Env protein HIV, trimerni kompleks, izolovanu nukleinsku kiselinu, vektor, ili ćeliju domaćina, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kompozicija može da sadrži bilo koji rekombinantni Env protein HIV, trimerni kompleks, izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor, ili ćeliju domaćina koji su ovde opisani.

[0099] Nosač može da uključi jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, kao što su veziva, dezintegransi, sredstva za bubrenje, sredstva za suspendovanje, emulgatori, kvašljivci, lubrikansi, arome, zaslađivači, konzervansi, boje, sredstva za rastvaranje i premazi. Tačna priroda nosača ili druge supstance može da zavisi od načina primene, npr. intramuskularni, intradermalni, supkutani, oralni, intravenski, kutani, intramukozni (npr. creva), intranazalni ili intraperitonealni način primene. Za tečne injektibilne preparate, na primer, suspenzije i rastvore, pogodni nosači i aditivi uključuju vodu, glikole, ulja, alkohole, konzervanse, sredstva za bojenje i slično. Za čvrste oralne preparate, na primer, praškove, kapsule, obložene tablete, gel kapsule i tablete, pogodni nosači i aditivi uključuju skrobove, šećere, razblaživače, sredstva za granulaciju, lubrikanse, veziva, sredstva za dezintegraciju i slično. Za nazalne sprejeve/smeše za inhalaciju, vodeni rastvor/suspenzija može da sadrži vodu, glikole, ulja, sredstva za omekšavanje, stabilizatore, kvašljivce, konzervanse, aromatična sredstva, arome i slično, kao pogodne nosače i aditive.

[0100] Kompozicije iz pronalaska mogu da budu formulisane u svakoj materiji pogodnoj za primenu na ispitaniku kako bi se olakšala primena i povećala efikasnost, uključujući, bez ograničenja, oralnu (enteralnu) primenu i parenteralne injekcije. Parenteralne injekcije uključuju intravensku injekciju ili infuziju, supkutanu injekciju, intradermalnu injekciju i intramuskularnu injekciju. Kompozicije iz pronalaska mogu da budu formulisane za druge načine primene, uključujući transmukoznu, okularnu, rektalnu, implantaciju dugoročnog dejstva, sublingvalnu primenu, pod jezik, iz sluzokože usta uz premošćavanje portalne cirkulacije, inhalaciju ili intranazalnu primenu.

4

[0101] Otelotvorenja pronalaska se takođe odnose na metode za dobijanje kompozicija. Prema otelotvorenjima pronalaska, metoda za proizvodnju kompozicija uključuje mešanje rekombinantnog Env proteina HIV, trimernog kompleksa, izolovane nukleinske kiseline, vektora, ili ćelije domaćina iz pronalaska, sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Stručnjak sa prosečnim znanjem je upoznat sa klasičnim tehnikama za pripremu takvih kompozicija.

[0102] Antigeni HIV (npr. proteini ili njihovi fragmenti dobijeni od genskih proizvoda HIV gag, pol, i/ili env) i vektori, kao što su virusni vektori, koji eksprimiraju antigene HIV prethodno su korišćeni u imunogenim kompozicijama i vakcinama za vakcinisanje ispitanika protiv infekcije HIV-om, ili za stvaranje imunskog odgovora na infekciju HIV-om. Kao što se ovde koristi, „ispitanik“ označava svaku životinju, poželjno sisara, najpoželjnije čoveka, kome će biti data, ili mu je već data, imunogena kompozicija prema otelotvorenjima pronalaska. Termin „sisar“, kao što se ovde koristi, obuhvata svakog sisara. Primeri za sisare uključuju, bez ograničenja, miševe, pacove, zečeve, zamorce, majmune, ljude itd., poželjno čoveka. Rekombinantni Env proteini HIV iz pronalaska takođe mogu da se koriste kao antigeni za indukovanje imunskog odgovora na virus humane imunodeficijencije (HIV) kod ispitanika kome je to potrebno. Imunski odgovor može biti na jedan ili više kladusa HIV, kao što je kladus A, kladus B, kladus C itd. Kompozicije mogu da sadrže vektor iz koga se eksprimira rekombinantni Env protein HIV, ili kompozicija može da sadrži izolovani rekombinantni Env protein HIV prema otelotvorenju iz pronalaska.

[0103] Na primer, kompozicije koje sadrže rekombinantni protein HIV ili njegov trimerni kompleks mogu da se primene na ispitaniku kome je to potrebno da bi se izazvao imunski odgovor na infekciju ispitanika HIV-om. Kompozicija koja sadrži vektor, kao što je vektor adenovirusa, koji kodira rekombinantni Env protein HIV iz pronalaska, naznačeno time što je rekombinantni Env protein HIV eksprimiran od strane vektora, takođe može biti primenjena na ispitaniku kome je to potrebno da se izazove imunski odgovor na infekciju ispitanika HIV-om. Ovde opisane metode takođe uključuju primenu kompozicije iz pronalaska u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih antigena HIV (npr. proteina ili njihovih fragmenata dobijenih od genskih proizvoda HIV gag, pol, i/ili env) koji se poželjno eksprimiraju iz jednog ili više vektora, kao što su vektori adenovirusa ili MVA vektori, uključujući metode kondicioniranja i povećavanja imunskog odgovora.

[0104] U nekim otelotvorenjima, Env protein HIV može biti izložen na čestici, kao što je lipozom, čestica nalik na virus (VLP), nanočestica, virozom ili egzozom, opciono u kombinaciji sa endogenim i/ili egzogenim adjuvansima. U poređenju sa samostalnim rastvornim ili monomernim Env proteinima, takve čestice obično prikazuju povećanu efikasnost prezentacije antigena in vivo.

Primeri za VLP koji izlažu Env protein HIV mogu se napraviti npr. koekspresijom Env proteina HIV sa samosklapajućim virusnim proteinima, kao što je Gag jezgro HIV ili drugi proteini retrovirusa. VLP liče na viruse, ali nisu infektivni jer ne sadrže genetski materijal virusa. Ekspresija strukturnih proteina virusa, kao što je omotač ili kapsid, može dovesti do samosastavljanja VLP. VLP su dobro poznati stručnjaku, i njihova primena u vakcinama je, na primer, opisana u (Kushnir et al, 2012).

U nekim poželjnim otelotvorenjima, čestica je lipozom. Lipozom je sferna vezikula koja ima najmanje jedan lipidni dvosloj. Env trimerni proteini HIV mogu, na primer, da budu nekovalentno povezani sa takvim lipozomima elektrostatičkim interakcijama, npr. dodavanjem His oznake C-terminusu Env trimera HIV i dvovalentnog helirajućeg atoma, kao što je Ni<2+>ili Co<2+>ugrađenog u glavnu grupu derivatizovanih lipida u lipozomu. U nekim neograničavajućim otelotvorenjima datim kao primer, lipozom sadrži 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DSPC), holesterol, i so nikla ili kobalta 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-karboksipentil)iminodisirćetna kiselina)sukcinil] (DGS-NTA(Ni<2+>) ili DGS-NTA(Co<2+>)) u molskom odnosu 60:36:4. U poželjnim otelotvorenjima, Env trimerni proteini HIV su kovalentno vezani za površinu lipozoma, npr. preko maleimidne funkcionalne grupe integrisane u površinu lipozoma. U nekim neograničavajućim otelotvorenjima datim kao primer, lipozom sadrži DSPC, holesterol i 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[4-(p-maleimidometil)cikloheksankarboksamid] lipid u molskom odnosu 54:30:16. Env protein HIV može biti vezan za njega npr. preko dodatnog C-terminalnog cisteina u Env proteinu HIV. Kovalentno vezane varijante su stabilnije, izazivaju visoke titre antigen specifičnih IgG, i epitopi na antigenski manje relevantnom „dnu“ Env trimera su maskirani. Poznate su metode za pripremu Env trimera HIV vezanih za lipozome, kao i njihova karakterizacija, i opisani su, na primer, u (Bale et al, 2017). Pronalazak takođe obezbeđuje Env protein HIV iz pronalaska fuzionisan sa lipozomom i/ili izložen na njemu.

U nekim otelotvorenjima, Env protein HIV iz pronalaska je fuzionisan sa samosklapajućim česticama, ili izložen na nanočestici. Antigenske nanočestice su sklopovi polipeptida koji predstavljaju više kopija antigena, npr. Env protein HIV iz trenutnog pronalaska, što dovodi do više mesta vezivanja (aviditet) i može da obezbedi poboljšanu stabilnost i imunogenost antigena. Priprema i upotreba samosklapajućih proteinskih nanočestica za primenu u vakcinama je dobro poznata stručnjacima, vidite npr. (Zhao et al, 2014), (López-Sagaseta et al, 2016). Kao neograničavajući primeri, samosklapajuće nanočestice mogu biti na bazi feritina, bakterioferitina ili DPS. DPS nanočestice koje izlažu proteine na svojoj površini su, na primer, opisane u WO2011/082087. Opis trimernih HIV-1 antigena na takvim česticama je, na primer, opisan u (He et al, 2016). Druge samosklapajuće proteinske nanočestice, kao i njihovi preparati, opisani su, na primer, u WO 2014/124301 i US 2016/0122392. Pronalazak takođe obezbeđuje Env protein HIV iz pronalaska fuzionisan sa samosklapajućom nanočesticom i/ili izložen na njoj. Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije koje sadrže VLP, lipozome, ili samosklapajuće nanočestice prema pronalasku.

[0105] U nekim otelotvorenjima, u kompoziciju iz pronalaska je uključen adjuvans, ili se primenjuje sa kompozicijom iz pronalaska. Primena adjuvansa je opciona, i može dalje da poveća imunski odgovor kada se kompozicija koristi za vakcinisanje. Adjuvansi pogodni za zajedničku primenu ili uključivanje u kompozicije prema pronalasku poželjno su oni koji su potencijalno bezbedni, dobro se podnose i delotvorni su na ljudima. Takvi adjuvansi su dobro poznati stručnjaku, i neograničavajući primeri uključuju QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL- 1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-alethine, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, soli aluminijuma, kao što je aluminijum fosfat (npr. AdjuPhos) ili aluminijum hidroksid, i MF59.

[0106] Drugi aspekti pronalaska se odnose na rekombinantne proteine omotača HIV koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4, koje predstavljaju sekvence konsenzusa omotača HIV kladusa C, odnosno konsenzusa kladusa B. Te sekvence konsenzusa nisu nađene ni u jednoj prirodnoj sekvenci, i zato se smatra da su novi proteini omotača HIV. Rekombinantni protein omotača HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4 opciono može dodatno da sadrži takozvane SOSIP mutacije i/ili mutacije u mestu cepanja furinom, kao što je, na primer, u onim sekvencama prikazanim u SEQ ID NO: 3, ili SEQ ID NO: 3 i dodatno sadrži Pro na poziciji 558 i/ili na poziciji 556; i SEQ ID NO: 5, ili SEQ ID NO: 5 i dodatno sadrži Pro na poziciji 558 i/ili na poziciji 556. Kada se određuje % identičnosti tih sekvenci, aminokiseline na mutiranom mestu cepanja furinom i na pozicijama 501, 605, 559, 556 i 558 se poželjno ne uzimaju u obzir. Neočekivano je nađeno da su takvi

4

proteini eksprimirani na visokim nivoima i imaju visok nivo stabilnosti i formiranja trimera. Takvi Env proteini HIV mogu u nekim otelotvorenjima da se koriste kao proteini skeleta, naznačeno time što mogu da se načine goreopisane mutacije da bi se dobio molekul iz pronalaska. Izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju te sekvence, vektori koji sadrže te sekvence operativno povezani sa promoterom, i kompozicije koje sadrže protein, izolovani molekul nukleinske kiseline ili vektor takođe su razmatrani u pronalasku.

OTELOTVORENJA

[0107]

Otelotvorenje 1 je rekombinantni Env protein HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Env proteina HIV koja ima navedene aminokiselinske ostatke najmanje na dve naznačene pozicije izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp, poželjno Ile, na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln, poželjno Asn, na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala, poželjno Val ili Ile, na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i

(i) Phe, Met ili Ile, poželjno Phe, na poziciji 647,

naznačeno time što numeracija pozicija je prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2. Otelotvorenje 2 je rekombinantni Env protein HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Env proteina HIV i aminokiselinsku supstituciju navedenim aminokiselinskim ostatkom najmanje na jednoj naznačenoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp, poželjno Ile, na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln, poželjno Asn, na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala, poželjno Val ili Ile, na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp, poželjno Phe na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i

(i) Phe, Met ili Ile, poželjno Phe, na poziciji 647,

naznačeno time što Env protein HIV je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(1) Env proteina HIV sa sekvencom konsenzusa, na primer iz kladusa C ili iz kladusa B, na primer koja sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 2, 3, 4 ili 5); ili

(2) sintetičkog proteina Env HIV, koji, na primer, sadrži aminokiselinsku sekvencu (a) SEQ ID NO: 6; (b) SEQ ID NO: 6 sa mutacijom Glu u Arg na poziciji 166; (c) SEQ ID NO: 7; ili (d) SEQ ID NO: 8, ili SEQ ID NO: 9), naznačeno time što (a), (b) ili (d) opciono može da ima dodatne SOSIP (Cys na pozicijama 501 i 605 i Pro na poziciji 559) i/ili mutacije mesta cepanja furinom (npr. SEQ ID NO: 10 koje zamenjuju aminokiseline 508–511); ili

(3) proteina Env HIV divljeg tipa, poželjno kladusa C, koji sadrži najmanje jednu mutaciju popravke na aminokiselinskom ostatku koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću manjom od 7,5%, poželjno manjom od 2%, sekvenci Env HIV u kolekciji od najmanje 100, poželjno najmanje 1000, poželjno najmanje 10.000, sekvenci Env HIV divljeg tipa, naznačeno time što mutacija popravke je supstitucija aminokiselinskim ostatkom koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću od najmanje 10% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji, i poželjno, mutacija popravke je supstitucija aminokiselinskim ostatkom koji je najčešće prisutan na odgovarajućoj poziciji u pomenutoj kolekciji; i

naznačeno time što numeracija pozicija je prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2. Otelotvorenje 3 je rekombinantni Env protein HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Env proteina HIV i aminokiselinsku supstituciju navedenim aminokiselinskim ostatkom najmanje na jednoj naznačenoj poziciji izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp, poželjno Ile, na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln, poželjno Asn, na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala, poželjno Val ili Ile, na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i

(i) Phe, Met ili Ile, poželjno Phe, na poziciji 647,

naznačeno time što Env protein HIV je Env protein HIV sa SOSIP mutacijom koji sadrži najmanje jednu mutaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od:

(a) Cys na pozicijama 501 i 605;

(b) Pro na poziciji 559;

(c) Cys na pozicijama 501 i 605 i Pro na poziciji 559; i

numeracija pozicija je prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2.

Otelotvorenje 4 je rekombinantni Env protein HIV iz otelotvorenja 2, koji sadrži navedene aminokiselinske ostatke najmanje na dve naznačene pozicije izabrane iz grupe koja se sastoji od (i) do (vii).

4

Otelotvorenje 5 je rekombinantni Env protein HIV iz otelotvorenja 3, koji sadrži navedene aminokiselinske ostatke najmanje na dve naznačene pozicije izabrane iz grupe koja se sastoji od (i) do (vii).

Otelotvorenje 6 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1, 2 i 4, koji dodatno sadrži Cys na pozicijama 501 i 605 ili Pro na poziciji 559, poželjno Cys na pozicijama 501 i 605 i Pro na poziciji 559.

Otelotvorenje 7 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 6, koji sadrži navedene aminokiselinske ostatke najmanje na tri naznačene pozicije izabrane iz grupe koja se sastoji od (i) do (vii).

Otelotvorenje 8 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 6, koji sadrži navedene aminokiselinske ostatke najmanje na četiri naznačene pozicije izabrane iz grupe koja se sastoji od (i) do (vii).

Otelotvorenje 9 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 6, koji sadrži navedene aminokiselinske ostatke najmanje na pet naznačenih pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od (i) do (vii).

Otelotvorenje 10 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 6, koji sadrži navedene aminokiselinske ostatke najmanje na šest naznačenih pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od (i) do (vii).

Otelotvorenje 11 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 6, koji sadrži navedene aminokiselinske ostatke na sedam naznačenih pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od (i) do (vii).

Otelotvorenje 12 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1, 4 i 5, naznačeno tim što najmanje dve naznačene pozicije i ostaci predstavljaju kombinaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od: 651F, 6551; 651F, 535N; 651F, 589V; 651F, 5891; 651F, 573F; 651F, 2041; 651F, 647F; 6551, 535N; 6551, 589V; 6551, 5891; 6551, 573F; 655I, 204I; 6551, 647F; 535N, 589V; 535N, 5891; 535N, 573F; 535N, 2041; 535N, 647F ; 589V, 573F; 589V, 2041; 589V, 647F; 5891, 573F; 589I, 204I; 5891, 647F; 573F, 2041; 573F, 647F; i 2041, 647F. Otelotvorenje 13 je rekombinantni Env protein HIV iz otelotvorenja 7, naznačeno time što najmanje tri naznačene pozicije i ostaci predstavljaju kombinaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od: 651F, 6551, 535N; 651F, 589V, 535N; 651F, 5891, 535N; 651F, 573F, 535N; 651F, 2041, 535N; 651F, 647F, 535N; 6551, 589V, 535N; 6551, 5891, 535N; 6551, 573F, 535N; 655I, 204I, 535N; 6551, 647F, 535N; 589V, 573F, 535N; 589V, 2041, 535N; 589V, 647F, 535N; 5891, 573F, 535N; 589I, 204I, 535N; 5891, 647F, 535N; 573F, 2041, 535N; 573F, 647F, 535N; 2041, 647F, 535N; 651F, 6551, 589V; 651F, 573F, 589V; 651F, 2041, 589V; 651F,

4

647F, 589V; 6551, 573F, 589V; 655I, 204I, 589V; 6551, 647F, 589V; 573F, 2041, 589V; 573F, 647F, 589V; 2041, 647F, 589V; 651F, 6551, 5891; 651F, 573F, 5891; 651F, 2041, 5891; 651F, 647F, 5891; 6551, 573F, 5891; 655I, 204I, 5891; 6551, 647F, 5891; 573F, 204I, 5891; 573F, 647F, 5891; 2041, 647F, 5891; 651F, 655I, 573F; 651F, 204I, 573F; 651F, 647F, 573F; 655I, 204I, 573F; 6551, 647F, 573F; 2041, 647F, 573F; 651F, 6551, 2041; 651F, 647F, 204I; 6551, 647F, 204I; 651F, 655I, 647F; 6551, 651F, 647F; 6551, 651F, 535N; 6551, 589V, 573F; i 6551, 589V, 2041.

Otelotvorenje 14 je rekombinantni Env protein HIV iz otelotvorenja 8, naznačeno time što najmanje četiri naznačene pozicije i ostaci predstavljaju kombinaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od: 651F, 6551, 535N, 589V; 651F, 6551, 535N, 573F; 651F, 6551, 589V, 573F; 651F, 535N, 589V, 573F; 6551, 535N, 589V, 573F; 651F, 6551, 535N, 2041; 651F, 6551, 589V, 2041; 651F, 535N, 589V, 2041; 6551, 535N, 589V, 2041; 651F, 6551, 573F, 2041; 651F, 535N, 573F, 2041; 6551, 535N, 573F, 2041; 651F, 589V, 573F, 2041; 6551, 589V, 573F, 2041; 535N, 589V, 573F, 2041; 651F, 6551, 535N, 647F; 651F, 6551, 589V, 647F; 651F, 535N, 589V, 647F; 6551, 535N, 589V, 647F; 651F, 6551, 573F, 647F; 651F, 535N, 573F, 647F; 6551, 535N, 573F, 647F; 651F, 589V, 573F, 647F; 6551, 589V, 573F, 647F; 535N, 589V, 573F, 647F; 651F, 6551, 2041, 647F; 651F, 535N, 2041, 647F; 6551, 535N, 2041, 647F; 651F, 589V, 2041, 647F; 6551, 589V, 2041, 647F; 535N, 589V, 2041, 647F; 651F, 573F, 2041, 647F; 6551, 573F, 2041, 647F; 535N, 573F, 2041, 647F; i 589V, 573F, 2041, 647F.

Otelotvorenje 15 je rekombinantni Env protein HIV iz otelotvorenja 9, naznačeno time što najmanje pet naznačenih pozicija i ostataka predstavljaju kombinaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od: 651F, 6551, 535N, 589V, 573F; 651F, 6551, 535N, 589V, 2041; 651F, 6551, 535N, 573F, 2041; 651F, 6551, 589V, 573F, 2041; 651F, 535N, 589V, 573F, 2041; 6551, 535N, 589V, 573F, 2041; 651F, 6551, 535N, 589V, 647F; 651F, 6551, 535N, 573F, 647F; 651F, 6551, 589V, 573F, 647F; 651F, 535N, 589V, 573F, 647F; 6551, 535N, 589V, 573F, 647F; 651F, 6551, 535N, 2041, 647F; 651F, 6551, 589V, 2041, 647F; 651F, 535N, 589V, 2041, 647F; 6551, 535N, 589V, 2041, 647F; 651F, 6551, 573F, 2041, 647F; 651F, 535N, 573F, 2041, 647F; 6551, 535N, 573F, 2041, 647F; 651F, 589V, 573F, 2041, 647F; 6551, 589V, 573F, 2041, 647F; i 535N, 589V, 573F, 2041, 647F.

Otelotvorenje 16 je rekombinantni Env protein HIV iz otelotvorenja 10, naznačeno time što najmanje šest naznačenih pozicija i ostataka predstavljaju kombinaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od: 651F, 6551, 535N, 589V, 573F, 2041; 651F, 6551, 535N, 589V, 573F, 647F; 651F, 6551, 535N, 589V, 2041, 647F; 651F, 6551, 535N, 573F, 2041, 647F; 651F, 6551,

4

589V, 573F, 2041, 647F; 651F, 535N, 589V, 573F, 2041, 647F; i 6551, 535N, 589V, 573F, 2041, 647F.

Otelotvorenje 17 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 16, koji dodatno sadrži aminokiselinsku supstituciju navedenim aminokiselinskim ostatkom najmanje na jednoj naznačenoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od:

(ix) Lys na poziciji 64 ili Arg na poziciji 66, ili i Lys na poziciji 64 i Arg na poziciji 66;

(x) Trp na poziciji 316;

(xi) Cys na obe pozicije 201 i 433;

(xii) Pro na poziciji 556 ili 558 ili na obe pozicije 556 i 558; i

(xv) Tyr na poziciji 302, ili Arg na poziciji 519, ili Arg na poziciji 520, ili Tyr na poziciji 302 i Arg na poziciji 519, ili Tyr na poziciji 302 i Arg na poziciji 520, ili Tyr na poziciji 302 i Arg na obe pozicije 519 i 520,

naznačeno time što numeracija pozicija je prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2. Otelotvorenje 18 je rekombinantni Env protein HIV prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 17, koji dodatno sadrži mutaciju u sekvenci cepanja furinom Env proteina HIV.

Otelotvorenje 19 je rekombinantni Env protein HIV iz otelotvorenja 18, naznačeno time što mutacija na mestu cepanja furinom je zamena na pozicijama 508–511 sa RRRRRR (SEQ ID NO: 10).

Otelotvorenje 20 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 19, koji je gp140 ili gp160 protein.

Otelotvorenje 21 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 20, naznačeno time što rekombinantni Env protein HIV ima najmanje jedno od poboljšanog procenta formiranja trimera i poboljšanog prinosa trimera u poređenju sa Env proteinom HIV koji ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka na navedenim pozicijama izabranim iz grupe koja se sastoji od (i) do (vii).

Otelotvorenje 22 je rekombinantni Env protein HIV iz otelotvorenja 21, naznačeno time što formiranje trimera se meri hromatografijom na molekulskim sitima sa višeugaonim rasipanjem svetlosti (SEC-MALS).

4

Otelotvorenje 23 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 22, koji dalje sadrži aminokiselinski ostatak odabran od Val, Ile, Phe, Met, Ala ili Leu, poželjno Val ili Ile, najpoželjnije Val, na poziciji 658.

Otelotvorenje 24 je rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 23, koji sadrži kombinaciju aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od:

(a) 655I, 589V, 573F, 651F, 588E, 535N, 2041;

(b) 556P, 6551, 535N, 573F, 589V, 2041, 588Q;

(d) 535N, 556P, 589V, 651F, 6551; i

(e) 535N, 556P, 588E, 589V, 651F, 6551.

Otelotvorenje 25 je rekombinantni Env protein HIV prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 24, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identična, ili 100% identična, sa bilo kojom od SEQ ID NO: 3, 5, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ili 32, poželjno najmanje 98% identična sa bilo kojom od SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ili 32.

Otelotvorenje 26 je trimerni kompleks koji sadrži nekovalentni oligomer od tri rekombinantna Env proteina HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 25.

Otelotvorenje 27 je čestica, npr. lipozom ili nanočestica, npr. samosklapajuća nanočestica, koja izlaže rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1–25, ili trimerni kompleks iz otelotvorenja 26.

Otelotvorenje 28 je bilo koji izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 25.

Otelotvorenje 29 je vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz otelotvorenja 28 operativno vezan za promoter.

Otelotvorenje 30 je vektor iz otelotvorenja 29, koji je vektor adenovirusa.

Otelotvorenje 31 je ćelija domaćin koja sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz otelotvorenja 28 ili vektor iz otelotvorenja 29 ili 30.

Otelotvorenje 32 je metoda za proizvodnju rekombinantnog Env proteina HIV, koja obuhvata uzgajanje ćelije domaćina iz otelotvorenja 31 pod uslovima pogodnim za proizvodnju rekombinantnog Env proteina HIV.

Otelotvorenje 33 je metoda za proizvodnju rekombinantnog Env proteina HIV, koja obuhvata dobijanje ekspresionog vektora koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu iz otelotvorenja 28 operativno vezanog za promoter; transfekciju ćelije ekspresionim vektorom; uzgajanje transficirane ćelije pod uslovima pogodnim za ekspresiju rekombinantnog Env proteina HIV;

4

i prečišćavanje rekombinantnog Env proteina HIV pod uslovima koji omogućavaju formiranje stabilizovanog trimernog kompleksa.

Otelotvorenje 34 je metoda za proizvodnju rekombinantnog Env proteina HIV prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 25, koje obuhvata uvođenje najmanje jedne aminokiselinske supstitucije koja dovodi do toga da navedeni aminokiselinski ostatak bude na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od (i)–(vii) u sekvenci skeleta proteina omotača HIV.

Otelotvorenje 35 je metoda prema otelotvorenju 34, naznačeno time što nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku supstituciju se uvodi u nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu skeleta proteina omotača HIV.

Otelotvorenje 36 je metoda prema otelotvorenjima 34 ili 35, naznačeno time što je sekvenca skeleta proteina omotača HIV odabrana iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 6 sa mutacijom Glu u Arg na poziciji 166; SEQ ID NO: 6 sa Cys na pozicijama 501 i 605 i Pro na poziciji 559 i/ili ima SEQ ID NO: 10 koja zamenjuje aminokiseline 508–511; SEQ ID NO: 6 sa mutacijom Glu u Arg na poziciji 166, koja dalje ima Cys na pozicijama 501 i 605 i Pro na poziciji 559 i/ili ima SEQ ID NO: 10 koja zamenjuje aminokiseline 508–511; SEQ ID NO: 8 sa Cys na pozicijama 501 i 605 i Pro na poziciji 559 i/ili ima SEQ ID NO: 10 koja zamenjuje aminokiseline 508–511; SEQ ID NO: 9 sa Cys na pozicijama 501 i 605 i Pro na poziciji 559 i/ili ima SEQ ID NO: 10 koja zamenjuje aminokiseline 508–511; i Env protein HIV divljeg tipa koji ima mutacije koje dovode barem do (a), (b) ili (c), poželjno najmanje dva od (a), (b) ili (c), najpoželjnije (a), (b) i (c) od sledećeg: (a) Cys na pozicijama 501 i 506 i Pro na poziciji 559,

(b) ima SEQ ID NO: 10 koja zamenjuje aminokiseline 508–511; i/ili

(c) najmanje jednu mutaciju popravke na aminokiselinskom ostatku koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću manjom od 7,5%, poželjno manjom od 2%, sekvenci Env HIV u kolekciji od najmanje 100, poželjno najmanje 1000, poželjno najmanje 10.000, sekvenci Env HIV divljeg tipa, naznačeno time što mutacija popravke je supstitucija aminokiselinskim ostatkom koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću od najmanje 10% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji, i poželjno, mutacija popravke je supstitucija aminokiselinskim ostatkom koji je najčešće prisutan na odgovarajućoj poziciji u pomenutoj kolekciji.

Otelotvorenje 37 je kompozicija koja sadrži rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 25, trimerni kompleks iz otelotvorenja 26, česticu iz otelotvorenja 27, izolovani molekul nukleinske kiseline iz otelotvorenja 28, i vektor iz otelotvorenja 29 ili 30, i ćeliju domaćina iz otelotvorenja 31, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Otelotvorenje 38 je kompozicija iz otelotvorenja 37, koja dodatno sadrži adjuvans.

Otelotvorenje 39 je metoda za proizvodnju kompozicije iz otelotvorenja 37, koja uključuje mešanje rekombinantnog Env proteina HIV, trimernog kompleksa, izolovane nukleinske kiseline, vektora, ili ćelije domaćina sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Otelotvorenje 40 je metoda za vakcinisanje ispitanika protiv infekcije HIV-om, koja obuhvata primenu na ispitaniku kompozicije koja sadrži rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 25, trimerni kompleks iz otelotvorenja 26, česticu iz otelotvorenja 27, ili vektor iz otelotvorenja 29 ili 30.

Otelotvorenje 41 je metoda za dobijanje imunskog odgovora na infekciju HIV-om kod ispitanika kome je to potrebno, koja obuhvata primenu na ispitaniku kompozicije koja sadrži rekombinantni protein omotača HIV iz bilo kog od otelotvorenja 1 do 25, trimerni kompleks iz otelotvorenja 26, česticu iz otelotvorenja 27, ili vektor iz otelotvorenja 29 ili 30.

Otelotvorenje 42 je rekombinantni Env protein HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, ili sekvencu koja je najmanje 95% identična njoj.

Otelotvorenje 43 je rekombinantni Env protein HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, ili sekvencu koja je najmanje 95% identična njoj.

Otelotvorenje 44 je rekombinantni Env protein HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, ili sekvencu koja je najmanje 95% identična njoj.

Otelotvorenje 45 je rekombinantni Env protein HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, ili sekvencu koja je najmanje 95% identična njoj.

Otelotvorenje 46 je izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 42 do 45.

Otelotvorenje 47 je vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz otelotvorenja 46 operativno vezan za promoter.

Otelotvorenje 48 je vektor iz otelotvorenja 47, koji je vektor adenovirusa.

Otelotvorenje 49 je ćelija domaćin koja sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz otelotvorenja 46 ili vektor iz otelotvorenja 47 ili 48.

Otelotvorenje 50 je kompozicija koja sadrži rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od otelotvorenja 42 do 45, izolovani molekul nukleinske kiseline iz otelotvorenja 46, vektor iz otelotvorenja 47 ili 48, ili ćeliju domaćina iz otelotvorenja 49, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Otelotvorenje 51 je metoda za poboljšanje procenta trimera i/ili prinosa trimera (koji predstavljaju savijanje i stabilnost) matičnog Env proteina HIV, gde metoda obuhvata popravku aminokiselinske sekvence matičnog Env proteina HIV uvođenjem najmanje jedne mutacije popravke, poželjno najmanje 3 mutacije popravke u matični Env protein HIV,

1

naznačeno time što mutacija popravke je aminokiselinska supstitucija na aminokiselinskom ostatku koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću manjom od 7,5%, poželjno manjom od 2%, sekvenci Env HIV u kolekciji od najmanje 100, poželjno najmanje 500, poželjno najmanje 1.000, poželjno najmanje 10.000, sekvenci Env HIV divljeg tipa, naznačeno time što supstitucija se vrši aminokiselinskim ostatkom koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću od najmanje 10% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji, i poželjno, supstitucija je supstitucija aminokiselinskim ostatkom koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji najčešće u pomenutoj kolekciji.

Otelotvorenje 52 je metoda iz otelotvorenja 51, naznačeno time što najmanje 50%, poželjno najmanje 80%, aminokiselinskih ostataka u matičnom Env proteinu HIV koji su prisutni na odgovarajućim pozicijama sa učestalošću manjom od 7,5% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji su popravljeni.

Otelotvorenje 53 je metoda iz otelotvorenja 51, naznačeno time što najmanje 50%, poželjno najmanje 80%, aminokiselinskih ostataka u matičnom Env proteinu HIV koji su prisutni na odgovarajućim pozicijama sa učestalošću manjom od 2% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji su popravljeni.

Otelotvorenje 54 je metoda iz bilo kog od otelotvorenja 51 do 53, naznačeno time što matični Env protein HIV je iz kladusa C.

Otelotvorenje 55 je metoda iz bilo kog od otelotvorenja 51 do 54, naznačeno time što matični Env protein HIV je Env protein HIV divljeg tipa.

Otelotvorenje 56 je metoda iz bilo kog od otelotvorenja 51 do 54, naznačeno time što matični Env protein HIV sadrži jedno ili više od sledećeg:

(a) Cys na pozicijama 501 i 506 i Pro na poziciji 559;

(b) mutaciju u sekvenci mesta cepanja furinom Env proteina HIV, koja npr. ima SEQ ID NO: 10 koja zamenjuju aminokiseline 508–511;

(c) Phe na poziciji 651;

(d) Ile na poziciji 655;

(e) Asn na poziciji 535;

(f) Val na poziciji 589;

(g) Phe na poziciji 573;

(h) Ile na poziciji 204;

(i) Phe na poziciji 647;

(j) Val na poziciji 658;

(k) Gln ili Glu na poziciji 588; i/ili

2

(l) Pro na poziciji 556, 558, ili 556 i 558.

Otelotvorenje 57 je rekombinantni Env protein HIV koji se može dobiti metodom iz bilo kog od otelotvorenja 51 do 56.

PRIMERI

Primer 1: Generisanje sekvence konsenzusa omotača HIV kladusa C i kladusa B

Sekvenca konsenzusa omotača HIV kladusa C

[0108] Sekvenca konsenzusa proteina omotača (Env) HIV kladusa C je razvijena kao sekvenca skeleta za ispitivanje efekata raznih mutacija na formiranje trimera Env proteina HIV. Poravnavanje sekvenci za 3434 sekvence proteina omotača poznatih izolata virusa HIV preuzeto je iz baze podataka Los Alamos (http://www.hiv.lanl.gov/content/index). Od 3434 sekvence, 1252 sekvence samo kladusa C su odabrane radi generisanja sekvence konsenzusa Env proteina HIV kladusa C. Na pozicijama za koje ostatak konsenzusa nije mogao jasno da bude identifikovan na osnovu poravnavanja, sekvenca konsenzusa je korišćena za identifikovanje najbližih sekvenci divljeg tipa BLAST pretragom. Ostatak konsenzusa na tim pozicijama je zatim izabran kao aminokiselina u najbližim sekvencama divljeg tipa identifikovanih BLAST pretragom. Sekvenca konsenzusa Env proteina HIV kladusa C je prikazana u SEQ ID NO: 2. Dve sekvence sa najvećom homologijom u odnosu na SEQ ID NO: 2 koristeći BLAST su bile sekvence sa Genbank brojevima ADM30337.1 i ADM30340.1, koje obe imaju identičnost sekvence 90% sa SEQ ID NO: 2.

[0109] Sekvenca konsenzusa Env HIV kladusa C je dodatno modifikovana uvođenjem takozvanih SOSIP mutacija, što uključuje cisteinske ostatke na pozicijama 501 i 605 i prolinski ostatak na poziciji 559, kao i optimizovanje mesta cepanja furinom zamenom mesta furina na ostacima 508–511 sa 6 ostataka arginina. Nadalje, Val na poziciji 295 je mutiran u Asn (V295N), da bi se stvorilo N-vezano mesto glikozilacije prisutno u većini HIV sojeva, i to može da poboljša vezivanje za neka antitela korišćena u nekim eksperimentima. Pored toga, C-terminus je skraćen na ostatku 664, što daje sekvencu koja kodira rastvorni HIV protein gp140. Sve gore opisane supstitucije/modifikacije su u odnosu na numeraciju u gp160 HIV-1 izolata HXB2. Rezultujuća sekvenca HIV gp140, koja se naziva „ConC_SOSIP“, prikazana je u (SEQ ID NO: 3). Sekvenca ConC_SOSIP je korišćena kao skelet ili matična sekvenca omotača HIV u koju su uvedene dodatne mutacije, npr. pojedinačne i dvostruke aminokiselinske supstitucije, da bi se dobili rekombinantni Env proteini HIV prema otelotvorenjima iz pronalaska.

Sekvenca konsenzusa omotača HIV kladusa B

[0110] Sekvenca konsenzusa Env HIV kladusa B je generisana koristeći sličan postupak kao što je opisan za stvaranje sekvence konsenzusa Env HIV kladusa C. Sekvenca konsenzusa kladusa B je generisana koristeći 1708 sekvenci proteina omotača kladusa B iz poznatih izolata virusa kladusa B. Sekvenca konsenzusa Env proteina HIV kladusa B je prikazana u SEQ ID NO: 4.

[0111] Sekvenca konsenzusa Env proteina HIV kladusa B je dalje modifikovana uvođenjem SOSIP mutacija, optimizacijom mesta cepanja furinom zamenom mesta furina sa 6 ostataka arginina, i skraćivanjem C-terminusa na ostatku 664, kao što je opisano iznad, što daje sekvencu koja kodira sekvencu konsenzusa rastvornog HIV gp140 kladusa B. Rezultujuća sekvenca Env proteina HIV gp140, koja se naziva „ConB_SOSIP“, prikazana je u (SEQ ID NO: 5).

[0112] Neočekivano je nađeno da su molekuli na bazi konsenzusa imali poboljšane ekspresione nivoe u odnosu na molekule na bazi prirodnih izolata, i osim toga su već imali poboljšane nivoe trimerizacije. Tako, molekuli sa SEQ ID NO: 2–5 već imaju iznenađujuće povoljna svojstva.

Primer 2: Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog Env proteina HIV

[0113] Rekombinantni Env proteini HIV su eksprimirani i prečišćeni kao rastvorni protein gp140. Pojedinačne mutacije (aminokiselinske supstitucije) i njihove kombinacije (npr. dvostruke i trostruke mutacije) uvedene su u sekvencu konsenzusa skeleta ConC_SOSIP dajući seriju rekombinantnih varijanti Env proteina HIV.

Generisanje i ekspresija konstrukata i varijanti HIV gp140 Env

[0114] DNK koja kodira sekvencu konsenzusa Env HIV kladusa C ConC_SOSIP prikazanu u SEQ ID NO: 3 je sintetisana i kodoni su optimizovani u kompaniji (Piscataway, NJ 08854) ili Gene Art (Life Technologies, Carlsbad, CA). Sekvenca sa optimizovanim kodonima je zatim klonirana u vektor pcDNA2004 da se dobije konstrukt Env HIV kladusa C gp140, koji je korišćen kao sekvenca skeleta omotača HIV za uvođenje dodatnih mutacija. Mutacije su uvedene u sekvencu skeleta ConC_SOSIP pomoću mutageneze usmerene na mesto i lančane

4

reakcije polimeraze (PCR) izvedene na Env konstruktu pcDNA2004 HIV kladusa C gp140. HEK-Expi293F ćelije ili HEK293F ćelije su prolazno transficirane sa 90% pcDNA2004 vektora koji kodira ConC _SOSIP sekvencu ili njenu varijantu i 10% pcDNA2004 vektora koji kodira furinsku proteazu (furin-pCDNA2004) prema uputstvu proizvođača. Transficirane ćelije su uzgajane 5 dana na 37 °C i 10% CO2. Supernatanti kulture su centrifugirani 10 minuta na 1250 x g. Centrifugirani supernatant je zatim sterilno filtriran koristeći vakuum filter od 0,22 µm i čuvan do upotrebe na 4 °C. Za ekspresiju u formatu sa 96 bunarčića, ćelije su uzgajane 3 dana na 37 °C i 10% CO2.4 ul Optimem (medijum za uzgajanje) pomešano je sa 4 ul 100 ng/ul DNK, i 8 ul smeše Expi293F (54 ul/ml Optimem) dodato je i inkubirano tokom 20 minuta. Zatim je dodato 200 ul/bunarčiću Expi293F ćelija pri 2,5 x 10E6 ćelija/ml. Supernatant kulture je sakupljen i centrifugiran tokom 5 minuta na 300 g da se uklone ćelije i otpaci od ćelija. Centrifugirani supernatant je zatim sterilno filtriran koristeći vakuum filter od 0,22 µm i čuvan do upotrebe na 4 °C.

Prečišćavanje Env proteina HIV gp140

[0115] Env protein HIV gp140 eksprimiran iz vektora pcDNA2004 prečišćen je prema dvostepenom protokolu za prečišćavanje koristeći kolonu sa lektinom iz Galantus nivalis (Vectorlabs, AL-1243) za prvo prečišćavanje, i kolonu Superdex200 Increase (GE) u sledećem koraku da bi se uklonili zaostali kontaminanti. U prvom koraku, koristeći kolonu sa lektinom iz Galantus nivalis, supernatant kulture je razblažen puferom (40 mM Tris, 500 mM NaCl pH 7,5) i propušten kroz lektin agaroza kolonu CV Tricorn 10-50 od 4 ml brzinom od 4 ml u minuti. Zatim je kolona isprana sa četiri zapremine kolone pufera (40 mM Tris, 500 mM NaCl pH 7,5) i eluirana sa četiri zapremine kolone 40 mM Tris, 500 mM NaCl, i 1 M manopiranozidom pH 7,5 sa ushodnim protokom od 1,6 ml/min, što znači da je smer protoka menjan od nishodnog do ushodnog da bi se povećala brzina eluiranja proteina omotača i smanjila eluciona zapremina. Eluat je koncentrovan koristeći centrifugalni koncentrator (50K, Amicon Ultra, Millipore).

[0116] Env protein HIV gp140 je dodatno prečišćen na koloni Superdex200 koristeći 50 mM Tris, 150 mM NaCl pH 7,4 kao radni pufer. Drugi pik koji je eluiran sa kolone sadržao je Env protein HIV gp140. Frakcije koje sadrže ovaj pik su objedinjene, i identitet pika je potvrđen kao Env protein HIV gp140 koristeći vestern blot i SDS-PAGE, i/ili SEC-MALS analizu. Koncentracija prečišćenog Env proteina HIV gp140 je određena merenjem optičke gustine na 280 nm, i prečišćeni Env protein HIV gp140 je čuvan do dalje upotrebe na 4 °C.

Analize SDS-PAGE i vestern blot

[0117] Supernatanti ćelijske kulture koji sadrže uzorke eksprimiranog Env proteina HIV gp140 i prečišćenog Env proteina HIV gp140 analizirani su na 4–12% (m/V) Bis-Tris NuPAGE gelovima, 1X MOPS (Life Technologies) pod redukujućim ili neredukujućim uslovima, i blotovani koristeći tehnologiju iBlot (Life Technologies). Svi postupci su izvedeni prema uputstvu proizvođača. Za analizu čistoće, gelovi su obojeni infracrvenom proteinskom bojom Krypton (Thermo Scientific) ili proteinskom bojom SYPRO Rubi (Bio-Rad). Za vestern blot analizu, membrane su sondirane sa anti-6x-Histidine-Tag antitelom (anti-His-HRP). Gelovi i blotovane membrane su skenirani na instrumentu Odyssey (Li-Cor), i slike su analizirane koristeći Odyssey 3.0 softver (Li-Cor).

Snimanje formacija Env trimera HIV elektronskom mikroskopijom sa negativnim bojenjem

[0118] Elektronska mikroskopija sa negativnim bojenjem (NS-EM) korišćena je za snimanje trimera proteina omotača koji imaju sekvencu skeleta ConC_SOSIP, koji su prečišćeni koristeći lecitin iz Galanthus nivalis, a zatim hromatografiju na molekulskim sitima, i izvedena je kao što su opisali Julien et al.2015 (Proc. Natl. Acad. Sci. (2015) 112(38) 11947-52). Uzorci trimera su razblaženi na 0,01–0,5 mg/ml u fiziološkom rastvoru sa tris puferom (TBS), pH 7,4, i naneti na ugljenikom prevučenu Cu rešetku od 200 meša (EMS CF200-Cu) koja je podvrgnuta tinjavom pražnjenju na vazduhu 2<∗>10-1 mbar, 25 mA, 30 sekundi, neposredno pre upotrebe. Nakon toga, kapljica od 3 µl razblaženog uzorka trimera je naneta na rešetku tokom 1 min, pa je upijena filter papirom (Whatman br.1 ili 4). Rešetke su sušene jedan minut, i bojene sa 3 µl 2,3% uranil acetata (UAc) tokom 60 sekundi. Prikupljeni su podaci koristeći elektronski mikroskop FEI Tecnai F20 na 120 keV, sa uvećanjem od 25.000x koji je dao veličinu piksela od 4,68 Å u ravni uzorka. Slike su dobijene pomoću ultraskenera Gatan BM.

[0119] Skoro sve čestice na slikama (ovog materijala obogaćenog trimerom) bili su dobro formirani zatvoreni trimeri (podaci nisu prikazani).

Primer 3: Pretraživanje varijanti rekombinantnog Env HIV gp140 na prinos trimera i procenat formiranja trimera

[0120] Varijante rekombinantnog Env proteina HIV generisanog u Primeru 2 pretražene su na formaciju trimera da se identifikuju te mutacije koje poboljšavaju procenat formiranog trimera i/ili poboljšavaju prinos trimera u odnosu na sekvencu skeleta ConC_SOSIP. Visokoprotočni skrining procenta trimera i prinosa trimera je izveden koristeći AlphaLISA test da bi se procenilo vezivanje panela široko neutrališućih HIV antitela (bNAt) i ne-bNAt za rekombinantne Env proteine HIV. Rezultati AlphaLISA testa su potvrđeni hromatografijom na molekulskim sitima i višeugaonim rasipanjem svetlosti (SEC-MALS).

Analiza AlphaLISA® testom

[0121] Ukupna ekspresija Env proteina HIV gp140 i ukupna količina pravilno savijenog nativnog trimera za više od 200 varijanti HIV gp140 sa jednom aminokiselinskom supstitucijom uvedenom u sekvencu ConC_SOSIP generisanu kao što je opisano u Primeru 2 izmerene su u supernatantu ćelijske kulture AlphaLISA testom. Varijante HIV gp140 sa dvostrukim i trostrukim mutacijama su takođe testirane. Env protein HIV sa sekvencom ConC_SOSIP bez dodatnih mutacija testiran je radi poređenja.

[0122] Sledeća monoklonska antitela (mAt) su, između ostalog, korišćena za analizu: mAt PGT145, mAt PGDM1400, mAt PG16, mAt PGT151, mAt 35O22, mAt PGT128, mAt PG9, mAt F105, mAt B6, mAt 447-52d, mAt 14e i mAt 17b. MAt 447-52D (AB014), PG9 (AB015) i PG16 (AB016) su nabavljena od Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH (Klosterneuburg, Austrija). Neneutrališuće antitelo b6 je dobijeno od Denisa R. Bartona (Dennis R. Burton) (The Scripps Research Institue, La Jolla, CA), a neneutrališuće antitelo 14e je dobijeno od Džejmsa E. Robinsona (James E. Robinson) (Tulane University, New Orleans, LA). Za mAt PGT145 (PDB: 3U1S), PGDM1400 (PDB: 4RQQ), PGT151 (PDB: 4NUG), 35O22 (PDB: 4TVP), F105 (PDB: 1U6A), PGT128 (PDB: 3TYG) i 17b (PDB: 4RQS) nukleinska kiselina koja kodira objavljene sekvence je klonirana u ekspresioni vektor i proizvedena za procenu Env proteina HIV. Sa izuzetkom mAt F105, B6, 447-52d, 14e i 17b, antitela korišćena za analizu su široko neutrališuća antitela (bNAt). bNAt mogu da neutrališu više sojeva virusa HIV. Od bNAt, PGT145, PGDM1400 i PG16 su vezivači apeksa i specifična su za trimer. PGT151 je takođe trimer specifičan, ali se vezuje za međupovršinu dva protomera gp120 i gp41, i zavisan je od cepanja. Vezivanje ne-bNAt je pokazatelj nepravilnog savijanja otvorene konformacije trimera.

[0123] Savijanje proteina je takođe testirano merenjem vezivanja rastvornih varijanti Env proteina HIV gp140 za antitelo (mAt 17b) za koje se zna da se vezuju za mesto vezivanja koreceptora proteina omotača HIV, koji je izložen samo nakon vezivanja CD4 (podaci nisu prikazani). Konkretno, rastvorni receptor CD4 (sCD4) je korišćen u kombinaciji sa mAt 17 da se proceni CD4-indukovana konformaciona izmena. Vezivanje mAt 17b za varijantu Env proteina HIV gp140 bez prethodnog vezivanja CD4 za protein omotača predstavlja naznaku delimično razmotanog ili prethodno aktiviranog proteina omotača (tj. nestabilni Env koji usvaja „otvorenu“ konformaciju u odsustvu vezivanja CD4).

[0124] Za AlphaLISA test, pripremljeni su konstrukti Env HIV gp140 u vektoru pcDNA2004 koji sadrži linker praćen oznakom sortaze A praćen oznakom Flag, praćen fleksibilnim (G4S)7linkerom i koji se završava his oznakom (sekvenca oznake koja je stavljena na C-terminus Env proteina HIV, data je u SEQ ID NO: 19). Konstrukti Env HIV gp140 su eksprimirani u HEK-Expi293 ćelijama, koje su uzgajane tokom tri dana na pločama sa 96 bunarčića (200 µl/bunarčiću). Sirovi supernatanti su razblaženi 120 puta u AlphaLISA puferu (PBS 0,05% Tween-20 0,5 mg/ml BSA). Za testove na bazi mAt 17b, supernatanti su razblaženi 12 puta. Zatim je 10 µl svakog razblaženja preneto na ploču sa 96 bunarčića i pomešano sa 40 µl akceptorskih perlica, donorskih perlica, i jednim od gorenavedenih mAt. Donorske perlice su konjugovane sa ProtA (kat. br.: AS102M, serijski br.1831829, Perkin Elmer), koji se vezuje za mAt. Akceptorske perlice su konjugovane sa anti-His antitelom (kat. br.: AL128M, Perkin Elmer), koje se vezuje za His-tag konstrukta. Za kvantifikaciju ukupnog prinosa proteina, uključujući sve oblike proteina omotača, korišćena je kombinacija donorskih perlica konjugovanih sa niklom (kat. br.: AS101M, Perkin Elmer) za detekciju His-oznake sa akceptorskim perlicama konjugovanim sa anti-Flag antitelom (kat. br.: AL112R, Perkin Elmer) za detekciju Flag oznake. Za testove u kojima se koristi mAt 17b u kombinaciji sa sCD4-His, korišćena je kombinacija ProtA donorskih perlica i anti-Flag akceptorskih perlica (podaci nisu prikazani). Jedan uzorak je pomešan sa donorskim i akceptorskim perlicama da bi se detektovalo formiranje trimera, a drugi uzorak iste varijante Env je pomešan sa niklkonjugovanim donorskim perlicama i anti-Flag konjugovanim akceptorskim perlicama da se izmeri ukupna količina eksprimiranog proteina (tj. ukupan prinos proteina).

[0125] Smeša supernatanta koji sadrži eksprimirani Env protein HIV gp140, mAt, donorske perlice i akceptorske perlice, inkubirana je na sobnoj temperaturi tokom 2 sata bez trešenja. Nakon toga, hemiluminescentni signal je meren pomoću čitača ploča Synergy NEO (BioTek). Prosečni osnovni signal koji se pripisuje lažno transficiranim ćelijama je oduzet od AlphaLISA broja određenog za svaku varijantu Env HIV gp140. Zatim je ceo skup podataka podeljen signalom izmerenim za Env protein HIV sa signalom sekvence skeleta ConC_SOSIP da bi se normalizovao signal za svaku od ispitanih varijanti Env HIV gp140 na skelet. Podaci vezivanja za svaku varijantu Env HIV gp140 za trimer specifično mAt PGT145 korišćeni su za određivanje procenta formiranja trimera i prinosa trimera za svaku varijantu. Vezivanje za druga mAt je korišćeno za procenu generalnog šablona vezivanja varijanti Env HIV za bNAt i ne-bNAt (nije prikazano).

[0126] Procenat formiranja trimera za svaku varijantu Env HIV izračunat je deljenjem normalizovanog hemiluminescentnog signala dobijenog od smeše uzoraka varijanti Env HIV, mAt PGT145, ProtA-konjugovanih donorskih perlica i anti-His-konjugovanih akceptorskih perlica, normalizovanim hemiluminescentnim signalom dobijenim od smeše uzoraka varijanti Env HIV, anti-His-konjugovanih donorskih perlica i anti-Flag-konjugovanih akceptorskih perlica.

[0127] Prinos trimera za svaku od varijanti Env HIV određen je u odnosu na prinos trimera za Env protein HIV sa ConC_SOSIP sekvencom skeleta bez dodatnih mutacija. Normalizovani hemiluminescentni signal dobijen od vezivanja mAt PGT145 za protein omotača ConC_SOSIP podešen je na 1, i normalizovani hemiluminescentni signal dobijen od vezivanja mAt PGT145 za svaki od proteina HIV gp140 normalizovan je na ovu vrednost.

Rezultati AlphaLISA testa – procenat trimera i prinos trimera

[0128] Procenat formiranja trimera kao što je određeno AlphaLISA testom za više pojedinačnih, dvostrukih i trostrukih aminokiselinskih supstitucija sa spiska (i)–(vii) u Tabeli 1 iznad u sekvenci skeleta ConC_SOSIP prikazan je na SL.2A. Od oko 200 ispitanih varijanti Env HIV gp140 sa jednom aminokiselinskom supstitucijom, identifikovano je sedam pozicija supstitucije za koje je procenat formiranog trimera povećan za najmanje 25% u odnosu na procenat trimera formiranog za sekvencu skeleta ConC_SOSIP bez dodatnih aminokiselinskih supstitucija.

[0129] Rezultati prikazani na SL. 2A pokazuju da sedam poželjnih pozicija supstitucije kod kojih je primećen značajan porast procenta formiranja trimera uključuju N651, K655, 1535, D589, 1573, A204 i E647 prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2. Konkretno, pojedinačna aminokiselinska supstitucija koja je dovela do najviše poboljšanog procenta formiranja trimera uključuje N651F, K655I(/F/W) (mada je postojao i eksperiment u kome K655F nije dovela do poboljšanja), I535N, D589V(/A), I573F, A204I, E647F. Neke mutacije koje su ispitane u kombinaciji sa nekoliko ovih mutacija, uključile su K588Q/E, I556P i A558P, i one su dodatno poboljšale procenat trimera mutanata sa poželjnim aminokiselinama na pozicijama iz pronalaska ((i)–(vii) u Tabeli 1) u ovom eksperimentu.

[0130] Sve dvostruke supstitucije ispitane u ovom eksperimentu imale su veći procenat formiranja trimera od odgovarajućih pojedinačnih supstitucija, a sve ispitane trostruke supstitucije imale su veći procenat formiranja trimera od odgovarajućih pojedinačnih i dvostrukih mutacija (SL.2A). Ti nepredvidljivi i iznenađujući rezultati ukazuju da te mutacije mogu da prikažu oblik sinergije u ovim eksperimentima u pogledu trimerizacije proteina omotača.

[0131] Pored poboljšanog procenta formiranja trimera, takođe je poželjan povećani prinos trimera. Zato je prinos trimera varijanti HIV gp140 koje sadrže pojedinačne, dvostruke i trostruke mutacije u sekvenci skeleta ConC_SOSIP takođe određen AlphaLISA testom. Rezultati su prikazani na SL. 2B. Većina varijanti HIV gp140 sa pojedinačnim mutacijama (osim I535N, D589A i D589I) imale su veći prinos trimera nego protein omotača ConC_SOSIP. Međutim, preciznija SEC-MALS analiza mutanta I535N, kao što je dole opisano, pokazala je povećanje prinosa trimera. Pored toga, dodatne mutacije u kombinaciji sa I535N, kao što je D589V, dovele su do istog prinosa trimera primećenog za protein omotača sa tom konkretnom dodatnom supstitucijom u odsustvu mutacije I535N. Prinos trimera varijanti sa dvostrukim mutacijama takođe je povećan, gde je svaka pojedinačna varijanta mutacije imala veći prinos trimera nego protein omotača ConC_SOSIP (SL.2B).

[0132] Procenat formiranja trimera za varijante HIV gp140 sa dvostrukim mutacijama u skeletu ConC_SOSIP koje su prethodno opisane u literaturi je takođe ispitan, uključujući dvostruku supstituciju E64K, T316W koju su opisali (De Taeye et al., supra), i disulfidnu dvostruku supstituciju I204C, A433C koju su opisali (Kwon et al., supra). Dvostruka supstitucija E64K, T316W dovela je do manjeg procenta formiranja trimera nego protein omotača ConC_SOSIP, tj. 15% (podaci nisu prikazani). Mada je disulfidna dvostruka supstitucija I204C, A433C povećala procenat trimera na 43% (podaci nisu prikazani), ovde opisane nove dvostruke supstitucije, kao što je I535N/K588E, K588Q/D589V, K655I/K588E, I535N/D589V, I535N/E647F, D589V/K655I i I535N/K655I (SL. 2A) dovele su do još većeg procenta formiranja trimera u eksperimentu sa AlphaLISA testom.

[0133] Dodatne mutacije (prolin na ostacima 558 i/ili 556) takođe su uvedene u skelet ConC_SOSIP, a procenat formiranja trimera i prinos trimera izmereni su za ove Env proteine HIV gp140. Obe pojedinačne supstitucije Pro na pozicijama 558 ili 556, i dvostruka supstitucija prolina na obe pozicije 556 i 558 pored SOSIP mutacija već prisutnih u skeletu ConC_SOSIP (tj. Cys na pozicijama 501 i 605, i Pro na poziciji 559) povećale su procenat formiranja trimera i prinos trimera (podaci nisu prikazani). Zaista, uvođenje jedne ili više novih stabilizujućih aminokiselinskih supstitucija iz pronalaska u skelet ConC_SOSIP koji dodatno sadrži ostatke Pro na pozicijama 558 i/ili 556, dodatno poboljšava procenat formiranja trimera i/ili prinos trimera (npr. Sl. 2A, npr. A558P/I535N, K655I/L556P, i neki trostruki mutanti, uključujući mutaciju A558P).

[0134] Podaci o vezivanju Env varijanti HIV gp140 za druge bNAt i ne-bNAt pokazali su da većina ispitanih pojedinačnih, dvostrukih i trostrukih mutacija koje povećavaju prinos trimera i procenat formiranja trimera, kao što su one navedene na SL.2A i 2B, takođe imaju povećano vezivanje za bNAt, i isto ili smanjeno vezivanje za ne-bNAt u odnosu na količinu vezivanja primećenu za bNAt i ne-bNAt kod proteina omotača HIV koji ima sekvencu skeleta ConC_SOSIP (podaci nisu prikazani). Za razvoj vakcine, poželjno je povećano vezivanje za bNAt i smanjeno vezivanje za ne-bNAt. Podaci tako pokazuju da proteini omotača HIV koji obuhvataju aminokiselinske supstitucije na pozicijama (i)–(vii) navedenim u Tabeli 1 iznad imaju željena svojstva u pogledu šablona vezivanja za široko neutrališuća antitela i ne-široko neutrališuća antitela.

Analiza SEC-MALS

[0135] Analiza SEC-MALS je takođe korišćena da se proveri prinos trimera i procenat formiranja trimera za varijante HIV gp140 ispitanih pomoću AlphaLISA testa. Varijante HIV gp140 su eksprimirane u 30 ml kultura u povećanom obimu i prečišćene primenom supernatanta bez ćelija na perlicama sa 200 µl lektina Galanthus nivalis (Vectorlab kat. br. AL-1243) na Polyprep kolonama sa gravitacionim protokom (Biorad kat. br.731-1550). Perlice su isprane sa 2 ml vezujućeg pufera (40 mM Tris, 500 mM NaCl pH 7,4). Proteini su eluirani koristeći 250–500 µl 40 mM Tris, 500 mM NaCl, 1 M manopiranozida pH 7,4. Sistem za tečnu hromatografiju visokih performansi (Agilent Technologies) i instrument MiniDAWN TREOS (Wyatt) povezan sa detektorom indeksa prelamanja Optilab T-rEX (Wyatt) korišćen je za izvođenje eksperimenta sa SEC-MALS. Ukupno je 100 µl lektinskog eluata ili oko 30 µg proteina naneto na kolonu TSK-Gel G3000SWxl (Tosoh Bioscience) ekvilibrisanu u radnom

1

puferu (150 mM natrijum fosfat, 50 mM NaCl, pH 7,0) pri 1 ml/min. Podaci su analizirani koristeći softverski paket Astra 6, i izračunavanja molekulske mase su izvedena iz signala indeksa prelamanja.

[0136] Hromatogrami za SEC-MALS proteina omotača ConC_SOSIP i varijante HIV gp140 sa pojedinačnim mutacijama prikazani su na SL. 3. Generalno, rezultati dobijeni analizom SEC-MALS su uporedivi i konzistentni sa rezultatima dobijenim putem analize AlphaLISA. Hromatogram proteina omotača ConC_SOSIP ima četiri glavna pika, gde je drugi pik koji se eluira na oko 7,3 minuta pik trimera. Određeno je da je protein omotača ConC_SOSIP oko 27% trimerni. Formiranje agregata i monomera ukazuje na to da ima malo pogrešnog savijanja i nestabilnosti vezane sa time što Env protein HIV gp140 ima sekvencu konsenzusa ConC_SOSIP. Kao što pokazuju hromatogrami prikazani na SL.3, sve pojedinačne supstitucije su dovele do relativno višeg pika trimera u poređenju sa pikom trimera za protein omotača ConC_SOSIP, ukazujući da je prinos trimera povećan za svaku varijantu HIV gp140.

[0137] Sveukupno, rezultati pokazuju da aminokiselinske supstitucije identifikovane ovde pod (i)–(vii) u Tabeli 1 obezbeđuju rekombinantni Env protein HIV sa poboljšanim procentom formiranja trimera i/ili poboljšanim prinosom trimera. Konkretno, varijante Env proteina HIV sa više supstitucija na identifikovanim pozicijama (i)–(vii) u Tabeli 1, kao što su kombinacije dve ili više identifikovanih mutacija tipično su pokazale čak još više poboljšan prinos trimera i/ili procenat formiranog trimera u odnosu na varijante Env proteina HIV koje imaju samo jednu mutaciju, što pokazuje mogući sinergijski efekat kombinacija mutacija (i)–(vii) u Tabeli 1. Prema saznanjima pronalazača, nijedna od ovih mutacija aminokiselinskih supstitucija nije prijavljena u prirodnim sekvencama proteina omotača HIV, i verujemo da sve kombinacije ((i)–(vii)) predstavljaju nove kombinacije mutacija za stabilizaciju trimera. Proteini omotača HIV koji imaju povećan procenat formiranja trimera, kao što su rekombinantni Env proteini HIV iz pronalaska, povoljni su sa stanovišta proizvodnje, kao za vakcine, jer će biti potrebno manje prečišćavanja i uklanjanja proteina omotača prisutnih u preparatu u neželjenim nenativnim konformacijama. Takođe, povećani ukupni prinos ekspresije trimera je pogodan za proizvodnju vakcine.

Primer 4: Stabilnost trimernih proteina omotača HIV

[0138] Termička stabilnost rekombinantnih Env proteina HIV prema otelotvorenjima pronalaska ispitana je pomoću AlphaLISA i diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC).

2

Merenja termičke stabilnosti pomoću AlphaLISA

[0139] Termička stabilnost je ispitana merenjem gubitka netaknutog trimera nakon termičkog tretmana na osnovu vezivanja za trimer-specifično mAt PGT145. Sirovi supernatant (20 µl) zagrevan je na 60 °C tokom 1 sata. Uzorci su onda centrifugirani na maksimalnoj brzini tokom pet minuta da se uklone agregati. AlphaLISA test je izveden kao što je opisano iznad u Primeru 3.

[0140] Rezultati su prikazani na SL. 4, a podaci su prijavljeni kao procenat trimera koji su ostali neizmenjeni nakon termičkog tretmana. Iz rezultata se vidi da najveći broj rekombinantnih Env proteina HIV gp140 sa jednom mutacijom iz pronalaska ima veću termičku stabilnost od proteina omotača ConC_SOSIP. Proteini omotača HIV imaju ovde opisane dvostruke i trostruke mutacije koje stabilizuju trimer koje su testirane i takođe je nađeno da imaju veću termičku stabilnost od proteina omotača ConC_SOSIP.

Merenja termičke stabilnosti pomoću DSC

[0141] Tačka topljenja (Tm) varijanti Env HIV gp140 određena je putem DSC koristeći kapilarni sistem MicroCal za DSC. Svako merenje je izvršeno sa početnom temperaturom od 20 °C i krajnjom temperaturom od 110 °C sa brzinom skeniranja od 100 °C/sat. Uzorak proteina koncentracije 0,5 mg/ml (400 µl) korišćen je za svako merenje. Podaci su analizirani koristeći softver Origin J. (alat za analizu MicroCal VP).

[0142] Tačka topljenja (Tm) proteina omotača ConC_SOSIP izmerena putem DSC iznosi 69,8 °C, a temperatura početka topljenja je 60,1 °C. Tmizmerena za protein omotača ConC_SOSIP viša je nego za protein omotača BG505_SOSIP (protein omotača HIV virusnog izolata BG505 koji ima takozvane SOSIP mutacije), čija Tmiznosi 67,0 °C (Kwon et al, 2015). To ukazuje da protein omotača HIV sa sekvencom skeleta ConC_SOSIP ima povoljnije osobine u pogledu termičke stabilnosti od drugih poznatih sekvenci omotača HIV sa mutacijama za stabilizaciju trimera.

[0143] Izmerena TmK655I mutanta ConC_SOSIP iznosi 72,3 °C a temperatura početka topljenja je 63,7 °C, što je čak više od Tmproteina omotača ConC_SOSIP. Izmerena Tm A558P, N651F, I535N mutanta ConC_SOSIP iznosi 77,29 °C, a temperatura početka topljenja je 74,87 °C. Rezultati DSC tako potvrđuju rezultate termičke stabilnosti dobijene putem AlphaLISA testa.

[0144] Ovi rezultati zajedno pokazuju da Env proteini HIV koji sadrže najmanje jednu ovde opisanu amino supstituciju tipično imaju veću termičku stabilnost od proteina omotača koji nemaju takve mutacije. Rezultati takođe pokazuju da sve varijante Env proteina HIV sa dvostrukom supstitucijom imaju veću termičku stabilnost od proteina omotača ConC_SOSIP. Varijante Env proteina HIV sa trostrukom supstitucijom takođe su stabilnije od proteina omotača ConC_SOSIP.

Primer 5: Varijante rekombinantnog proteina omotača HIV na bazi sekvenci konsenzusa proteina omotača kladusa B

[0145] Rekombinantni Env proteini HIV prema otelotvorenjima pronalaska koji sadrže jednu aminokiselinsku supstituciju (I535N, D589V, N651F ili K655I) uvedenu u sekvencu konsenzusa kladusa B ConB_SOSIP (SEQ ID NO: 5) generisani su i prečišćeni kao što je opisano u Primeru 2. Prinos trimera i procenat formiranja trimera izmereni su AlphaLISA testom, kao što je opisano u Primeru 3.

[0146] Rezultati su prikazani na SL.5A (procenat formiranja trimera) i SL.5B (prinos trimera). Prijavljene vrednosti su relativne u odnosu na vrednost izmerenu za protein omotača ConB_SOSIP, koji je postavljen na 1 i za procenat formiranja trimera, i za prinos trimera. Rezultati pokazuju da sve ispitane mutacije povećavaju procenat formiranja trimera. Prinos trimera je bio otprilike isti ili poboljšan u odnosu na protein omotača ConB_SOSIP za sve ispitane mutacije.

[0147] Ti rezultati pokazuju da te mutacije takođe imaju stabilizujući efekat na protein omotača, npr. poboljšavaju prinos trimera, poboljšavaju procenat formiranja trimera itd., kada se uvode u različite sekvence skeleta proteina omotača HIV, u ovom slučaju sekvence konsenzusa izvedene iz kladusa B.

[0148] Primer 6: Varijante rekombinantnog proteina omotača HIV na bazi sintetičke sekvence proteina omotača

4

[0149] Rekombinantni Env proteini HIV prema otelotvorenjima pronalaska koji sadrže aminokiselinske supstitucije uvedene u sintetički protein omotača HIV (nazvan „DS_sC4_SOSIP_E166R“) koji imaju sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 7 pripremljeni su i prečišćeni kao što je opisano u Primeru 2. Sintetički protein omotača HIV DS_sC4_SOSIP_E166R ima takozvane SOSIP mutacije (Cys na ostacima 501 i 605, i Pro na ostatku 559), Cys na ostacima 201 i 433 koji dovodi do uvođenja disulfidne veze (DS), i Arg na poziciji 166 radi stabilizacije apeksa. Pored toga, protein je skraćen na poziciji 655. Procenat formiranja trimera i prinos trimera izmereni su AlphaLISA testom, kao što je opisano u Primeru 3.

[0150] Rezultati su prikazani na SL. 6, koja daje poređenje procenta formiranja trimera za svaku od ispitanih varijanti sa procentom formiranja trimera (Sl.6A) i prinosom trimera (Sl.

6B) za skelet DS_sC4_SOSIP_E166R. Veći procenat formiranja trimera primećen je kod svake ispitane varijante u poređenju sa sekvencom skeleta.

[0151] Pored E166R, još neke aminokiseline koje se retko javljaju su zamenjene češćim aminokiselinama na odgovarajućoj poziciji u kolekciji Env proteina HIV divljeg tipa (A114Q, E117K, T375S i I434M), da bi se „popravio“ protein prema okviru detaljnije objašnjenom u primeru 12 ispod i na sl.12. U ovom „popravljenom“ proteinu, stabilizujuće mutacije A204I i K655I dodatno poboljšavaju sC4_SOSIP (sl.13).

[0152] Rezultati ovog primera odgovaraju rezultatima iz Primera 5, pokazujući da ovde opisane mutacije takođe imaju stabilizujući efekat na protein omotača, npr. poboljšani procenat formiranja trimera i/ili poboljšani prinos trimera itd., kada se uvedu u različite sekvence skeleta proteina omotača HIV, u ovom slučaju sintetičke sekvence Env koje nisu konsenzus.

Primer 7: Dodatne kombinacije mutacija Env HIV

[0153] Rekombinantni Env proteini HIV prema otelotvorenjima pronalaska koji sadrže aminokiselinske supstitucije uvedene u ConC_SOSIP (koji imaju sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 3) pripremljeni su i prečišćeni kao što je opisano u Primeru 2. Procenat formiranja trimera izmeren je AlphaLISA testom, kao što je opisano u Primeru 3. Zatim je manja selekcija kombinacija (one koje su u nastavku prikazane u kurzivu, i dodatno K655I; I535N, D589V; I535N, K655I; D589V, K655I) prečišćena koristeći lektin iz Galanthus nivalis, i sadržaj trimera je analiziran pomoću SEC-MALS, kao što je opisano u Primeru 3. Stabilnost je određena kao što je opisano u Primeru 4.

[0154] Za ovaj eksperiment su pripremljeni sledeći mutanti:

K6551, N651F;

K655I, N651F, E647F;

K655I, N651F, E647F, I535N;

K655I, N651F, I535N;

K655I, I573F;

K655I, D589V, I573F;

K655I, D589V, I573F, N651F;

K655I, D589V, I573F, K588E;

K655I, D589V, I573F, N651F, K588E;

K655I, D589V, I573F, N651F, K588E, I535N;

K6551, D589V, I573F, N651F, K588E, I535N, A204I;

K655I, D589V, I535N, L556P;

K655I, D589V, I573F, N651F, K588E, L556P;

K655I, D589V, A204I;

L556P, N651F;

L556P, N651F, K655I;

L556P, N651F, K655I, I535N;

L556P, N651F, K655I, I535N, I573F;

L556P, N651F, K655I, I535N, I573F, D589V;

L556P, N651F, K655I, I535N, I573F, D589V, A204I;

L556P, N651F, K655I, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q;

L556P, N651F, K655I, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q, E647F;

L556P, N651F, I535N;

L556P, N651F, I535N, I573F;

L556P, N651F, I535N, I573F, D589V;

L556P, N651F, I535N, I573F, D589V, A204I;

L556P, N651F, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q;

L556P, N651F, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q, E647F;

L556P, K655I, I535N;

L556P, K655I, I535N, I573F;

L556P, K655I, I535N, I573F, D589V;

L556P, K655I, I535N, I573F, D589V, A204I;

L556P, K655I, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q;

L556P, K655I, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q, E647F;

L556P, N651F, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q sa uklonjenim SOS mutacijama.

[0155] Sve ispitane kombinacije supstitucija u skeletu ConC_SOSIP imale su veći procenat trimera, veći prinos trimera i veću stabilnost trimera na 60 °C u poređenju sa skeletom na AlphaLISA (podaci nisu prikazani). Analiza SEC_MALS je potvrdila da je procenat trimera poboljšan za sve ispitane mutacije u skeletu (podaci nisu prikazani).

[0156] U skupu koji sadrži jednu po jednu dodatnu mutaciju do devet mutacija, analiza SEC_MALS je pokazala da sa uvođenjem svake sledeće mutacije raste odnos trimer/monomer, kako se smanjuje visina pika monomera, dok visina pika trimera ostaje ista na dijagramu SEC (SL. 7). Od svih varijanti ispitanih pomoću SEC-MALS, varijante sa supstitucijama L556P, N651F, K655I, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q, E647F imale su najveći procenat trimera (najmanje monomera gp140 i najmanje monomera gp120), najveći prinos ukupnih proteina i jednu od najvećih termičkih stabilnosti. To znači da ove mutacije mogu da se kombinuju bez gubitka trimera u odnosu na skelet. Pored toga, to nagoveštava da, generalno, dodatak mutacija opisan pod (i)–(vii) u Tabeli 1, opciono kombinovan sa mutacijama opisanim u Tabeli 2 dovodi do dodatno poboljšane trimerizacije.

[0157] Konstrukt sa mutacijama L556P, N651F, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q, gde su „SOS mutacije“ uklonjene (tj. dva cisteinska ostatka na pozicijama 501 i 605 su vraćena na aminokiselinske ostatke koji su prvobitno bili prisutni u sekvenci konsenzusa kladusa C), takođe je ispitan. Iako je njegova temperaturna stabilnost manja, mutant ima uporediv procenat trimera i prinos kao njegov odgovarajući mutant koji sadrži SOS mutaciju. Mutant kod koga su SOS mutacije uklonjene ima prednost što vezuje manje ne-bNAt od svog parnjaka koji sadrži SOS (ima mutacije L556P, N651F, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q). To pokazuje da povoljna svojstva ovog pronalaska, kao što je veliki procenat trimerizacije, takođe mogu da se dobiju kod Env proteina HIV koji nemaju sve SOSIP mutacije.

[0158] Jedan mutant (ispitan u skeletu ConC_SOSIP), na bazi kombinacije povoljnih svojstava na ekspresionom nivou, formiranja trimera i vezivanja za široko neutrališuće antitelo PGT151, ima sledeće mutacije: L556P, N651F, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q.

[0159] U osnovi ConC_SOSIP, 9 najuspešnijih supstitucija su bile L556P, E647F, N651F, K655I, I535N, D589V, I573F i K588E kod gp41 i A204I kod gp120. Kombinacija svih ovih 9 supstitucija je dovela do povećane stabilnosti, sadržaja trimera i prinosa trimera. Pošto dodavanje L556P u ovoj varijanti sa 9 supstitucija ima relativno ograničen efekat na poboljšan procenat trimera, a supstitucija E647F u ovom kontekstu ometa vezivanje PGT151, ove dve mutacije nisu uvek korišćene u dodatnim varijantama, i utvrđeno je da je varijanta sa 7 supstitucija (nazvana ConC_SOSIP_7mut, ponekad se ovde pominje i kao „stabilizovani ConC_SOSIP“ ili „ConC_base“, koja uključuje N651F, K655I, I535N, D589V, I573F, K588E i A204I) neznatno stabilnija (povećana temperatura topljenja) od varijante sa 9 supstitucija navedenih iznad. Kompletna sekvenca ove varijante (stabilizovani ConC_SOSIP Env, HIV 160544) data je u SEQ ID NO: 20.

[0160] U ovom trenutku, posebno poželjan mutant [ispitan na skeletu ConC_SOSIP sa sledećim dodatnim mutacijama: (a) D279N, A281V, A362Q (povećava sličnost sa osnovnim virusima, kao što su drugi opisali); (b) Del139-152 (delecija varijabilne petlje da bi se smanjila verovatnoća uvođenja antitela u ovu petlju); i (c) V295N (uvođenje mesta glikana koje je prisutno kod većine sojeva HIV)], na osnovu kombinacije povoljnih svojstava na ekspresionom nivou, formiranja trimera i vezivanja za široko neutrališuće antitelo, ima sledeće stabilizujuće mutacije iz pronalaska: N651F, K655I, I535N, I573F, D589V, A204I, K588E. Kompletna sekvenca ove varijante (stabilizovani ConC_SOSIP.v3 Env (HIV170654, ConC_SOSIP.v3)) data je u SEQ ID NO: 28.

[0161] U dodatnoj varijanti, mutacija K658V je dodata ovom konstruktu (vidite takođe primer 15 ispod), što je dodatno poboljšalo rezultate.

Primer 8: Samosklapajuće čestice koje prikazuju stabilizovani Env protein HIV [0162] Pripremljeni su feritin i DPS samosklapajuće čestice koje prikazuju stabilizovane Env proteine HIV na sličan način kao što je opisano u (He et al, 2016). Da bi se to uradilo, protein gp140 je fuzionisan sa N-terminusom čestica preko kratkog aminokiselinskog linkera (npr. GSG ili AAAGS, ali mogu da se koriste i drugi linkeri, vidite npr. He et al, 2016) na nivou DNK i eksprimiran fuzioni protein u Expi293F ćelijama. Jedan primer za česticu pripremljenu na ovaj način je baziran na feritinu fuzionisanom sa ConC_SOSIP (SEQ ID NO: 3) Env proteinom HIV sa sledećim mutacijama: I535N, A558P, D589V, K655I. Takođe su pripremljene čestice feritina sa ovim Env proteinom koji ima dodatnu mutaciju V570D, za koju je objavljeno da poboljšava trimerizaciju (Kesavardhana et al, 2014), ali je primećeno da ova mutacija dovodi do jakog porasta vezivanja neneutrališućeg antitela (17b), što je nepoželjno. Env sa ovih pet mutacija je takođe fuzionisan sa dva tipa DPS čestica, iz Helicobacter pylori i iz Mycobacterium smegmatis (vidite npr. WO2011/082087 za pripremu DPS čestica). Env sa ovih pet mutacija i pored toga disulfidnim mostom koji uvodi dvostruku mutaciju I201C-A433C takođe je fuzionisan sa feritinom.

[0163] Čestice su prečišćene iz supernatanta bez ćelija sa afinitetnim perlicama PGDM140, i čestice su analizirane koristeći SEC-MALS sa kolonom TSKgel G6000PWCL. SEC-MALS analiza, kao i nativna PAGE (3–12%), potvrdile su da su nastale čestice otprilike očekivane veličine.

[0164] Na sličan način, feritin i samosklapajuće DPS nanočestice koje prikazuju HIV Env sa sekvencom ConC_SOSIP sa sledećom kombinacijom mutacija: (L556P, N651F, I535N, I573F, D589V, A204I, K588Q), takođe su pripremljene.

[0165] Dodatni lipozomi i/ili samosklapajuće nanočestice koje prikazuju druge ovde opisane varijante HIV Env, npr. HIV Env sa SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ili 32, takođe su pripremljene.

Primer 9: Varijante rekombinantnog proteina omotača HIV na bazi sekvenci proteina omotača kladusa A

[0166] Rekombinantni Env proteini HIV prema otelotvorenjima pronalaska koji sadrže jednu aminokiselinsku supstituciju (I535N, D589V, N651F, K655I, I573F, A204I ili E647F) uvedeni su u protein omotača HIV divljeg tipa kladusa A sa SOSIP modifikacijom (nazvan „BG505_SOSIP“), kao što je opisano u Primeru 2. Protein omotača HIV BG505_SOSIP ima takozvane SOSIP mutacije (Cys na ostacima 501 i 605, i Pro na ostatku 559), kao i dodatni Cys na ostacima 201 i 433 koji dovodi do uvođenja disulfidne veze (DS), i potencijalno mesto N-glikozilacije na poziciji 332 (mutacija T332N). Protein je skraćen na poziciji 664. Sekvenca BG505_SOSIP prikazana je u SEQ ID NO: 21.

[0167] Procenat formiranja trimera i prinos trimera izmereni su AlphaLISA testom, kao što je opisano u Primeru 3. Procenat formiranja trimera i prinos trimera kod svake ispitane varijante upoređen je sa BG505_SOSIP. Veći procenat formiranja trimera primećen je za supstitucije M535N, D589V, N651F ili K655I, u poređenju sa sekvencom skeleta (npr., sl. 8A). Kombinacija npr. L556P, K655I i M535N imala je još više povećan prinos i procenat trimera (npr. sl.8A i 8B). Kombinacija N651F i D589V još više je poboljšala prinos i procenat trimera (podaci nisu prikazani). Rezultati ovog primera za virus kladusa A su u saglasnosti sa onima iz primera 10 i 11 (kladus C) ispod i primera 5 (kladus B), u kojima su mutacije I535N, D589V, N651F i K655I takođe imale stabilizujući efekat na protein omotača izveden iz sojeva divljeg tipa, npr. poboljšani procenat formiranja trimera i/ili poboljšani prinos trimera. Naravno, ove mutacije iz pronalaska takođe mogu da poboljšaju trimerizaciju Env HIV izvedenog iz sojeva kladusa A divljeg tipa.

[0168] U ovom trenutku, posebno poželjan mutant (ispitan na skeletu BG505_SOSIP, na bazi kombinacije povoljnih svojstava na ekspresionom nivou, formiranja trimera i vezivanja za široko neutrališuće antitelo, je onaj koji ima sledeće mutacije: L556P, K655I, M535N, N651F, D589V, (vidite npr., sl.9, koja prikazuje jako poboljšano formiranje trimera takvog mutanta u analizi SEC-MALS, i sl. 13, koja prikazuje vidno poboljšano vezivanje široko neutrališućih antitela takvog mutanta). Sekvenca ovog stabilizovanog BG505_SOSIP Env (HIV170863) prikazana je u SEQ ID NO: 22.

[0169] Dodatak mutacije Q658V obezbedio je malo dodatno poboljšanje.

[0170] Dodatni poželjni konstrukt sadrži mutacije L556P, K655I, M535N, N651F, D589V, kao i „DS“ mutacije (Cys na pozicijama 201 i 433 koji dovodi do uvođenja disulfidne veze), R588E i Q658V. Sekvenca ove varijante (BG505_SOSIP.v2 Env, HIV171814) data je u SEQ ID NO: 29.

Primer 10: Varijante rekombinantnog proteina omotača HIV na bazi sekvence proteina omotača kladusa C divljeg tipa

[0171] Rekombinantni Env proteini HIV prema otelotvorenjima pronalaska koji sadrže jednu aminokiselinsku supstituciju T651F, dvostruku aminokiselinsku supstituciju T651F, M535N uvedenu u Env sekvencu WT C97ZA_SOSIP (SEQ ID NO: 23) sa dodatnom supstitucijom L556P (C97ZA_SOSIP_L556P) generisani su i eksprimirani kao što je opisano u Primeru 2. Prinos trimera i procenat formiranja trimera izmereni su AlphaLISA testom, kao što je opisano u Primeru 3.

[0172] Rezultati su prikazani na SL. 10A i B. Prinos trimera C97ZA_SOSIP_L556P_T651F_M535N je pet puta veći nego kod skeleta C97ZA_SOSIP.

[0173] Supstitucije L556P, T651F i M535N su dale veliko poboljšanje C97ZA_SOSIP, ali su vezivanje za bNAt i procenat trimera za ovu varijantu dobijenu od kladusa C divljeg tipa i dalje bili mnogo manji nego kod skeleta ConC_SOSIP. Pošto wt Env može da se prilagodi domaćinu, i može da smanji njegovu opštu sposobnost, pri čemu može biti oštećeno savijanje, Env sekvenca je „popravljena“ prema konceptualnom okviru opisanom ispod u Primeru 12 i na SL.12. Promenjen je ukupno 21 ostatak, da se popravi sekvenca, i dodata su tri potencijalna mesta N-glikozilacije (PNGS) da se popune takozvane „glikanske praznine“ (pozicije gde je kod najmanje 50% Env proteina sojeva HIV divljeg tipa prisutno moguće mesto N-glikozilacije). Mutacije uvedene praćenjem ovog okvira za C97ZA_SOSIP navedene su u Tabeli 3 u koloni „mutacije popravke“. Ovde objavljeno dodavanje stabilizujuće mutacije K655I još više je povećalo procenat i prinos trimera, kao što su D589V, A204I i K588E.

[0174] Ovi rezultati pokazuju da ovde opisane mutacije T651F, M535N i K655I, D589V, A204I i K588E takođe imaju stabilizujući efekat na protein omotača, npr. poboljšani procenat formiranja trimera, poboljšani prinos trimera kada se uvedu u C97ZA_SOSIP (izveden iz Env proteina kladusa C divljeg tipa) i njegove varijante.

[0175] U ovom trenutku, posebno poželjna varijanta (ispitana na skeletu C97ZA_SOSIP), na bazi kombinacije povoljnih svojstava na ekspresionom nivou, formiranja trimera i vezivanja za široko neutrališuće antitelo, je ona koja ima sledeće mutacije: Q567K (prethodno su je drugi opisali); A198T, S243N, K236T, V295N (za popunjavanje glikanskih praznina); M34L, T46K, T58A, Q171K, G172V, P179L, L183Q, I192R, N209T, M307I, Q350R, N352H, Y353F, D412N, G429E, V455T, I489V, L491I, G500K, S547G, T578A, T651N (za popravku sekvence); V505N, E507T, T663N (dodata potencijalna mesta N-glikozilacije na osnovu molekula); i A204I, M535N, L556P, K588E, D589V, T651F, K655I (stabilizujuće mutacije iz pronalaska). Podaci za ovu varijantu su, na primer, prikazani na sl. 13, vidite konkretno „stabilizovani i popravljeni C97ZA“), koja prikazuje veliki porast vezivanja široko

1

neutrališućeg antitela u poređenju sa originalnim molekulom wt C97ZA Env. Sekvenca ove varijante (stabilizovani i popravljeni C97ZA_SOSIP Env (HIV170690)) data je u SEQ ID NO: 24.

[0176] Dodavanje mutacije K658V još više je stabilizovalo ovaj protein.

[0177] Dodatna poželjna varijanta uključuje „DS“ mutaciju i K658V, i sekvenca ove varijante (C97ZA_SOSIP.v2 Env, HIV171810) data je u SEQ ID NO: 30.

Primer 11: Varijante rekombinantnog proteina omotača HIV na bazi druge sekvence proteina omotača kladusa C divljeg tipa

[0178] U Env protein iz kladusa C soj Du422, uvedene su SOSIP mutacije i dve glikanske praznine su popunjene na pozicijama 295 i 386 mutacijama K295N i D386N. Pored toga, neki ostaci su popravljeni prema konceptualnom okviru opisanom u Primeru 12 i na sl. 12 (V272I, W456R, G466E i F643Y), i uvedene su stabilizujuće supstitucije L556P, I535N, N651F i D589V. Sve dodatne supstitucije su dovele do većih prinosa trimera i procenta trimera (npr. sl.

11).

[0179] U specifičnoj ispitanoj varijanti sa ove četiri stabilizujuće mutacije (SEQ ID NO: 25), dodatna supstitucija K655I je dalje povećala prinos trimera i procenat trimera za faktor 1,3, odnosno 1,4 (podaci nisu prikazani).

[0180] U ovom trenutku, posebno poželjna varijanta Du422_SOSIP Env, na bazi kombinacije povoljnih svojstava na ekspresionom nivou, formiranja trimera i vezivanja za široko neutrališuće antitelo, je ona koja ima sledeće mutacije: L556P, K655I, M535N, N651F, D589V, K588E, I201C, A433C, V272I, W456R, G466E, F643Y, D386N i K295N. Sekvenca ove varijante (stabilizovani i popravljeni Du422_SOSIP Env (HIV170859) data je u SEQ ID NO: 26. Podaci za ovu varijantu su, na primer, prikazani na sl. 13 (vidite stabilizovani i popravljeni Du422), koja prikazuje veliki porast vezivanja široko neutrališućeg antitela u poređenju sa originalnim molekulom wt Du422 Env.

[0181] Dodatna poželjna varijanta dodatno sadrži „DS“ mutaciju i K658V, i sekvenca ove varijante (Du422_SOSIP.v1 Env, HIV171812) data je u SEQ ID NO: 31.

2

Primer 12: Popravka i stabilizacija raznih sekvenci Env HIV-1

[0182] Pošto su wt sekvence iz virusa izolovanih iz inficiranih pacijenata mogle da steknu destabilizujuće mutacije koje sprečavaju pravilno savijanje, wt Env sekvence kladusa C C97ZA, DU422 i mozaik sC4 su prve popravljene.

[0183] Da bi se tražile neoptimalne mutacije kod sekvenci divljeg tipa, izvršeno je poravnavanje svih Env sekvenci HIV-1 u bazi podataka UniProt i bazi podataka Los Alamos HIV (∼90.000 sekvenci) i distribucija aminokiselina je izračunata za svaku aminokiselinu. Generalno, više relativno retkih aminokiselina u sekvencama wt Env je supstituisano uobičajenijim aminokiselinama (na bazi učestalosti u bazi podataka na odgovarajućoj poziciji) prema konceptualnom okviru opisanom na SL.12.

[0184] Nadalje, uvedene su dve dodatne supstitucije Y353F i Q171K na apeksu C97ZA_SOSIP da bi se eventualno poboljšalo vezivanje antitela usmerenih na apeks, i uvedena su dodatna mesta glikana supstitucijom D411N, K236T i V295N jer su ta potencijalna mesta N-glikozilacije (PNGS) očuvana >50%. Zatim su stabilizujuće supstitucije opisane u prethodnom primeru prenete na opravljenu sekvencu.

[0185] Stabilizovani ConC_SOSIP sadrži supstitucije A204I, I535N, I573F, K588E, D589V, N651F i K655I (stabilizovani ConC_SOSIP). Kompletna sekvenca stabilizovanog ConC_SOSIP data je u SEQ ID NO: 20.

[0186] Pregled nekih varijanti Env proteina i njihovih mutacija je dat u Tabeli 3.

Tabela 3. Varijante Env proteina HIV.

4

[0187] Tabela 3. Neke ovde opisane varijante Env proteina HIV. Kolona „mutacije iz literature“ opisuje mutacije korišćene u ovim konstruktima koje su drugi prethodno opisali.

Kolona „dodati PNGS“ opisuje mutacije kojima se dodaje potencijalno mesto N-glikozilacije (na pozicijama gde mnogi Env proteini divljeg tipa sadrže takvo mesto). Kolona „vodeća sekvenca“ opisuje koja vodeća sekvenca je korišćena za ekspresiju ako to nije originalna (nativna) vodeća sekvenca. Kolona „mutacije popravke“ opisuje mutacije koje poboljšavaju savijanje i stabilnost (mereno kao prinos i procenat trimera, na bazi vezivanja za bNAt) nekih Env proteina divljeg tipa, kao što je opisano u Primeru 12 i na sl. 12. Kolona „stabilizujuće mutacije“ opisuje mutacije iz pronalaska koje stabilizuju protein i poboljšavaju trimerizaciju, kao što je ovde objavljeno. Kolona „ostale mutacije“ opisuje dodatne mutacije načinjene za neke konstrukte. Kolona „terminus“ opisuje poziciju poslednje aminokiseline (numeracija u tabeli je u odnosu na sekvencu Env HXB2).

[0188] Supernatanti ćelija prolazno transficiranih Env varijantama divljeg tipa (wt), popravljenim i stabilizovanim, ispitani su na vezivanje više trimer-specifičnih široko neutrališućih antitela usmerenih na apeks. Supstitucije popravke i posebno stabilizujuće supstitucije imale su dramatičan uticaj na sadržaj trimera (sl. 13 i 14), određen testovima AlphaLISA (sl.13) i SEC-MALS (sl.14).

[0189] Sekvenca poželjne varijante popravljenog i stabilizovanog Env proteina DS_sC4 (popravljeni i stabilizovani DS_sC4_SOSIP Env (HIV170686)) data je u SEQ ID NO: 27.

[0190] Druga njena poželjna varijanta je data u SEQ ID NO: 32 (popravljeni i stabilizovani sC4_SOSIP.v4 Env.

Primer 13: Stabilizujuće mutacije iz pronalaska funkcionišu u odsustvu SOSIP mutacija [0191] Kao što je prikazano u prethodnim primerima, 7 mutacija (A204I, I535N, I573F, K588E, D589V, N651F i K655I) poboljšalo je prinos i procenat trimera u ConC_SOSIP (dovodeći do „ConC_base“ ili „stabilizujućeg ConC_SOSIP“ ili „ConC_SOSIP 7mut“) (npr. sl. 13 i 15).

[0192] Ovaj primer pokazuje da različite SOSIP mutacije (npr. „SOS“ mutacija: 2 supstitucije ostacima Cys na pozicijama 501 i 605; i „IP mutacija“: supstitucija ostatkom Pro na poziciji 559) doprinose daljoj stabilizaciji, ali nisu neophodne da bi se ostvarile koristi od mutacija iz pronalaska.

[0193] Dokazano je da 7 mutacija takođe poboljšava prinos trimera u takozvanom ConC_SOS, koji ne sadrži stabilizujuću mutaciju I559P („IP“ mutacija), kao što je prikazano na sl. 15 (uporedite ConC_SOS sa ConC_SOS, 7mut). Tako, „IP“ mutacija nije ključna za obezbeđivanje koristi od ovde opisanih mutacija. Dodavanje mutacije I559P dovodi do velikog porasta, što pokazuje da je „IP“ mutacija korisna u ovom konstruktu pored 7 mutacija iz pronalaska. Stabilizujuća IP mutacija (I559P) takođe može biti zamenjena sa A558P ili L556P, gde obe takođe dovode do velikog porasta u odnosu na varijantu bez mutacije I559P.

[0194] Takođe, ConC_IP, 7 mut, koji sadrži 7 mutacija iz pronalaska opisanih iznad, ali nema „SOS“ mutacije, još uvek je imao veoma veliki prinos trimera, što pokazuje da ni „SOS“ mutacije nisu ključne za dobijanje koristi od ovde opisanih mutacija (uporedite npr. ConC_SOSIP i ConC_IP, 7 mut), u skladu sa zapažanjima u primeru 7. Dodavanje „SOS“ mutacije dodatno povećava prinos trimera.

[0195] Tako, dok Env trimeri koji sadrže ovde opisane stabilizujuće mutacije mogu da imaju korist od dodatne stabilizacije SOSIP mutacijama, nije potrebna nijedna od 3 SOSIP mutacije za dobijanje koristi (npr. poboljšani prinos trimera) od ovde opisanih stabilizujućih mutacija.

Primer 14: Supstitucija metioninom na pozicijama 647, 651 ili 655 poboljšava kvalitet trimera

[0196] Pored mutacija opisanih u primeru 2, pozicije 589, 647, 651 i 655 su pojedinačno supstituisane Met ostatkom u skeletu ConC_SOSIP (SEQ ID NO: 3), i ispitan je procenat trimerizacije i prinos koristeći goreopisane metode. Pokazalo se da Met na pozicijama 647, 651 ili 655, kao mutacije opisane u primeru 2, poboljšava kvalitet trimera (veći procenat i prinos trimera, povećano vezivanje bNAt), kao što se može videti na sl.16.

[0197] Tako, pored supstitucije pomoću Phe, Ala ili Trp na poziciji 651, supstitucija sa Met na poziciji 651 takođe poboljšava formiranje trimera; pored supstitucije pomoću Phe, Ile ili Trp na poziciji 655, supstitucija sa Met na poziciji 655 takođe poboljšava formiranje trimera; i pored supstitucije pomoću Phe ili Ile na poziciji 647, supstitucija sa Met na poziciji 647 takođe poboljšava formiranje trimera.

Primer 15: Env protein HIV sa mutacijom za stabilizaciju trimera na poziciji 658.

[0198] Pripremljeni su rekombinantni Env proteini HIV sa supstitucionim mutacijama na poziciji 658 (numeracija prema gp160 HIV-1 izolata HXB2), u skeletu ConC_SOSIP (SEQ ID NO: 3). K658 je mutiran u Val, Ile, Phe, Leu, Met ili Ala. Pored toga, napravljeni su neki dvostruki mutanti, naznačeno time što su te mutacije kombinovane sa jednom od stabilizujućih mutacija opisanih iznad, K655I. Procenat formiranja trimera određen je AlphaLISA testom, kao što je opisano u Primeru 3.

[0199] Rezultati su prikazani na sl. 17A i B (procenat trimera, meren u različitim eksperimentima, otuda dva panela) i sl. 17C i D (prinos trimera, meren u različitim eksperimentima, otuda dva panela). Ovi rezultati pokazuju da supstitucija na poziciji 658 sa Ile, Phe, Met, Leu, Ala ili Val dovodi do poboljšanog procenta formiranja trimera i poboljšanog prinosa trimera. Supstitucija sa Ile na poziciji 658 dovela je do povećanja koja su otprilike u istom opsegu kao mutacija K655I (sl. 17A, C), koji je najefikasniji mutant sa jednom mutacijom od mutacija (i)–(vii) u Tabeli 1 opisanoj iznad (vidite npr. sl.2A). Supstitucija sa Val na poziciji 658 dovela je do još većeg poboljšanja (sl.17A, C).

[0200] Rezultati su takođe pokazali da supstitucija na poziciji 658 sa Ile ili Val može da se kombinuje sa mutacijom K655I koja je opisana iznad, i to je dovelo do daljeg poboljšanja svakog od odgovarajućih mutanata sa jednom mutacijom (sl.17A, C).

[0201] Mutant K658V je takođe ispitan koristeći SEC-MALS. Kulture u 96 bunarčića uzgajane su tri dana, kao što je urađeno za AlphaLISA test. Supernatant je direktno nanet na kolonu za SEC-MALS. Hromatogrami dobijeni za lažni supernatant (sa ekspresijom furina) oduzeti su od hromatograma supernatanta sa Env proteinima. Trimerni protein je eluiran sa kolone između 7 i 8 minuta. Rezultati su prikazani na sl. 18, i potvrdili su da mutant K658V pokazuje poboljšanu trimerizaciju u odnosu na osnovni Env protein, i Env protein sa mutacijom K655I.

[0202] Ovaj primer pokazuje da supstitucija aminokiselina na poziciji 658 u Env proteinu HIV sa Val, Ile, Phe, Met, Leu ili Ala dovodi do poboljšavanja procenta trimera i prinosa trimera.

[0203] Dodatni eksperimenti za merenje formiranja trimera varijanti koristeći AlphaLISA i/ili SEC-MALS izvedeni su na Env varijantama HIV, naznačeno time što je mutacija K658V prisutna u kombinaciji sa drugim mutacijama iz Tabela 1 i/ili 2 kao što je ovde opisano, kao i kod sojeva HIV iz kladusa A i B. Na primer, već je prikazano da mutacija 658V poboljšava varijantu ConC_SOSIP,7mut, kao što je gore opisano (primer 7), kao i BG505_SOSIP sa L556P, K655I, M535N, N651F, D589V, K588E (primer 9), kao i popravljeni i stabilizovani C97ZA_SOSIP (primer 10).

[0204] Na osnovu rezultata opisanih iznad, očekuje se da će mutacija aminokiseline na poziciji 658 u ostatak valina, izoleucina, fenilalanina, leucina, metionina ili alanina, poželjno valina, poboljšati formiranje trimera i/ili prinos trimera u različitim osnovnim Env proteinima HIV.

Primer 16. Imunizacija stabilizovanim Env proteinima HIV

[0205] Studija imunizacije zeca je izvedena sa rastvornim Env proteinom i sa Env proteinima kuplovanim sa lipozomima. Kondicioniranje je izvedeno sa stabilizovanim ConC_SOSIP.v3 (SEQ ID NO: 28) i praćeno sa četiri pojačanja, svako sa drugim proteinom, tj. sa 1) popravljenim i stabilizovanim sC4_SOSIP.v4 (SEQ ID NO: 32); 2) popravljenim i stabilizovanim C97ZA_SOSIP.v2 (SEQ ID NO: 30); 3) popravljenim i stabilizovanim Du422_SOSIP.v1 (SEQ ID NO: 31); i 4) stabilizovanim BG505_SOSIP.v2 (SEQ ID NO: 29).

[0206] Serum je izolovan nakon sukcesivnih imunizacija, i analiziran na indukovana antitela koja se posebno vezuju za stabilne, zatvorene, predfuzione konformacije Env (koristeći ELISA test), kao i na indukciju bNAt (koristeći testove neutralizacije virusa).

[0207] Gornji primeri pokazuju da pronalazak obezbeđuje univerzalni pristup za optimizaciju savijanja i stabilnosti predfuziono zatvorenih trimera proteina omotača HIV.

[0208] Podrazumeva se da su ovde opisani primeri i otelotvorenja samo ilustracija, i da se mogu napraviti izmene u gornjim otelotvorenjima. Zato se podrazumeva da ovaj pronalazak nije ograničen na konkretna priložena otelotvorenja, nego je definisan priloženim zahtevima.

SPISAK SEKVENCI

[0209]

SEQ ID NO: 1 gp160 HIV-1 izolata HXB2 (signalna sekvenca u kurzivu; aminokiseline na pozicijama (i)-(vii) za mutacije prema pronalasku naznačene sivim senčenjem)

SEQ ID NO: 2 HIV Env konsenzus kladusa C (samo sekvenca konsenzusa, bez bilo koje signalne sekvence, transmembranskog domena (664 je poslednja aminokiselina), SOSIP mutacija i/ili mutacija mesta cepanja furinom; aminokiseline na pozicijama (i)-(vii) za mutaci e prema pronalasku naznačene sivim senčen em)

SEQ ID NO: 3 ConC_SOSIP (sekvenca zrelog konsenzusa kladusa C sa SOSIP mutacijama i mestom cepanja furinom (u kurzivu), i C-terminalnim skraćenjem; aminokiseline na pozicijama (i)-(vii) za mutacije prema pronalasku naznačene sivim senčenjem)

SEQ ID NO: 4 HIV Env konsenzus kladusa B (samo sekvenca konsenzusa, bez bilo koje signalne sekvence, transmembranskog domena (664 je poslednja aminokiselina), SOSIP mutacija i/ili mutacija mesta cepanja furinom; aminokiseline na pozicijama (i)-(vii) za mutacije prema pronalasku naznačene sivim senčenjem)

1

SEQ ID NO: 5 ConB_SOSIP (sekvenca zrelog konsenzusa kladusa B sa SOSIP mutacijama i mestom cepanja furinom (u kurzivu), i C-terminalnim skraćenjem; aminokiseline na pozici ama (i)-(vii) za mutaci e prema pronalasku naznačene sivim senčen em)

SEQ ID NO: 6 sintetički protein omotača HIV Mos2S Env C4 fragment; aminokiseline na pozici ama (i)-(vii) za mutaci e prema pronalasku naznačene sivim senčen em)

SEQ ID NO: 7 (sekvenca DS_sC4_SOSIP_E166R; aminokiseline na pozicijama (i)-(vii) za mutaci e prema pronalasku naznačene sivim senčen em)

SEQ ID NO: 8 (Mos1.Env, sekvenca proteina omotača mozaik HIV; aminokiseline na pozicijama (i)-(vii) za mutacije prema pronalasku naznačene sivim senčenjem)

2

SEQ ID NO: 9 (Mos2.Env, sekvenca proteina omotača mozaik HIV; aminokiseline na pozicijama (i)-(vii) za mutacije prema pronalasku naznačene sivim senčenjem)

SEQ ID NO: 10 (mutantna sekvenca mesta cepanja furinom)

RRRRRR SEQ ID NO: 11 (primer signalne sekvence (npr. korišćene za ConC_SOSIP, i neke varijante dobijene od divljeg tipa))

MRVRGILRNWQQWWIWGILGFWMLMICNVVG (napomena: poslednji VG može biti početak zrelog proteina ili kraj signalne sekvence)

SEQ ID NO: 12 (primer 8 aminokiselinskih sekvenci koje mogu da zamene HR1 petlju) NPDWLPDM SEQ ID NO: 13 (primer 8 aminokiselinskih sekvenci koje mogu da zamene HR1 petlju) GSGSGSGS SEQ ID NO: 14 (primer 8 aminokiselinskih sekvenci koje mogu da zamene HR1 petlju) DDVHPDWD SEQ ID NO: 15 (primer 8 aminokiselinskih sekvenci koje mogu da zamene HR1 petlju) RDTFALMM SEQ ID NO: 16 (primer 8 aminokiselinskih sekvenci koje mogu da zamene HR1 petlju) DEEKVMDF SEQ ID NO: 17 (primer 8 aminokiselinskih sekvenci koje mogu da zamene HR1 petlju) DEDPHWDP SEQ ID NO: 18 (primer signalne sekvence (npr. korišćene za ConB_SOSIP)

MRVKGIRKNYQHLWRWGTMLLGMLMICSA

SEQ ID NO: 19 (oznaka korišćena za HIV gp140 konstrukte u AlphaLISA testu) AAALPETGGGSDYKDDDDKPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SHHHHHH

SEQ ID NO: 24 (popravljeni i stabilizovani C97ZA_SOSIP Env protein (HIV170690))

4

SEQ ID NO: 25 (varijanta popravljenog i stabilizovanog konstrukta Du422 (HIV161818))

SEQ ID NO: 29 (stabilizovani BG505 SOSIP.v2 (HIV171814))

SEQ ID NO: 32 (popravljeni i stabilizovani sC4_SOSIP.v4)

SEQ ID NO: 33 (primer signalne sekvence (npr. korišćene za varijante DS_sC4_SOSIP) MRVRGMLRNWQQWWIWSSLGFWMLMIYSV SEQ ID NO: 34 (primer signalne sekvence (npr. korišćene za varijante BG505_SOSIP) MRVMGIQRNCQHLFRWGTMILGMIIICSA

REFERENCE

[0210]

1. Sanders et al. J. Virol. (2002) 76(17), 8875-89

2. Sanders et al. Science (2015) 349(6224), 139-140

3. Julien et al. Proc. Nat. Acad. Sci. (2015) 112(38), 11947-52

4. de Taeye et al. Cell (2015) 163(7), 1702-15

5. Kwon et al. (2015) Nat. Struct. Mol. Biol.22(7), 522-31

6. Eglen et al. Curr. Chem. Genomics, (2008) 25(1), 2-10

7. Kong et al, Nat Commun. 2016 Jun 28;7:12040. doi: 10.1038/ncomms12040

8. Julien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2015) 112(38) 11947-52

9. Barouch et al, Nat Med2010, 16: 319-323

10. WO 2010/059732

11. Evropska patentna prijava EP15200138.4

12. Sharma SK, et al. Cell Rep. (2015) 11(4):539-50. doi: 10.1016/j.celrep.2015.03.047.

13. Georgiev IS, et al. J Virol. (2015) 89(10):5318-29. doi: 10.1128/JVI.03451-14. 14. López-Sagaseta J, et al (2016) Computational and Struct Biotechnol J 14: 58-68. 15. Zhao L, et al (2014) Vaccine 32: 327-337

16. He L, et al (2016) Nat Commun. 2016 Jun 28;7:12041. doi: 10.1038/ncomms12041 17. WO 2011/082087

18. Kesavardhana A i Varadarajan R (2014) J Virol 88: 9590-9604

19. Guenaga J, et al (2015) Immunity 46: 792-803

20. Bale S, et al (2017) J. Virol. doi:10.1128/JVI.00443-17

21. Abbink et al (2007) Virol.81(9): 4654-64

22. Altschul SF et al (1997) Nucleic Acid Res.25: 3389-3402

23. Harris et al (2011) PNAS 108 (28): 11440-11445

24. Kushnir et al (2012) Vaccine (31): 58-83

25. WO 2007/104792

26. WO 2014/124301

27. US 2016/0122392

28. WO 2016/037154

29. Pugach et al, 2015, J Virol.89: 3380-3395

�

1

11

��

�

14

�

1

�

11

��

12

��

12

��

�

11

12

�

��

1

�

1

��

Claims

Patentni zahtevi

1. Rekombinantni protein omotača (Env) virusa humane imunodeficijencije (HIV), koji sadrži dva ili više od sledećih aminokiselinskih ostataka:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp, poželjno Ile, na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln, poželjno Asn, na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala, poželjno Val, na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i/ili

(i) Phe, Met ili Ile, poželjno Phe, na poziciji 647,

naznačeno time što numeracija pozicija je prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2.

2. Rekombinantni Env protein HIV, koji sadrži dva ili više od sledećih aminokiselinskih ostataka:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp, poželjno Ile, na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln, poželjno Asn, na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala, poželjno Val, na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i/ili

(i) Phe, Met ili Ile, poželjno Phe, na poziciji 647,

naznačeno time što Env protein HIV je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(1) sekvence konsenzusa Env HIV, na primer iz kladusa C, na primer, koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili 3, ili na primer iz kladusa B, na primer, koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili 5;

(2) sintetičkog proteina Env HIV, koji, na primer, sadrži aminokiselinsku sekvencu (a): SEQ ID NO: 6; ili (b): SEQ ID NO: 6 sa mutacijom Glu u Arg na poziciji 166; ili (c): (a) ili (b) sa mutacijom aminokiselina na pozicijama 501 i 605 u ostatke Cys i mutacijom aminokiseline na poziciji 559 u ostatak Pro; ili (d): (a), (b) ili (c) sa dodatnom mutacijom mesta cepanja furinom, npr. zamenom aminokiselina na pozicijama 508–511 sa RRRRRR (SEQ ID NO: 10); ili (e) SEQ ID NO: 7; ili (f) SEQ ID NO: 8, ili SEQ ID NO: 9; i

(3) matičnog proteina Env HIV koji je poželjno protein Env HIV divljeg tipa, poželjno kladusa C, koji sadrži najmanje jednu mutaciju popravke na aminokiselinskom ostatku koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću manjom od 7,5%, poželjno manjom od 2%, sekvenci Env HIV u kolekciji od najmanje 1000, poželjno najmanje 10.000, sekvenci Env HIV divljeg tipa, naznačeno time što mutacija popravke je supstitucija aminokiselinskim ostatkom koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji sa učestalošću od najmanje 10% sekvenci Env HIV u pomenutoj kolekciji, i poželjno, mutacija popravke je supstitucija aminokiselinskim ostatkom koji je prisutan na odgovarajućoj poziciji najčešće u pomenutoj kolekciji;

i

3. Rekombinantni Env protein HIV, koji sadrži dva ili više od sledećih aminokiselinskih ostataka:

(i) Phe, Leu, Met ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp, poželjno Ile, na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln, poželjno Asn, na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala, poželjno Val, na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i/ili

(i) Phe, Met ili Ile, poželjno Phe, na poziciji 647,

naznačeno time što protein Env HIV je protein Env HIV koji sadrži najmanje jedno od sledećeg:

(a) Cys na pozicijama 501 i 605;

(b) Pro na poziciji 559;

(c) Cys na pozicijama 501 i 605 i Pro na poziciji 559; i

numeracija pozicija je prema numeraciji u gp160 HIV-1 izolata HXB2.

4. Rekombinantni Env protein HIV iz zahteva 2 ili 3, koji sadrži dva ili više aminokiselinskih ostataka navedenih pod (i) do (vii).

5. Rekombinantni HIV Env protein iz bilo kog od zahteva 1, 2 i 4, koji sadrži Cys na pozicijama 501 i 605 ili Pro na poziciji 559, poželjno Cys na pozicijama 501 i 605 i Pro na poziciji 559.

6. Rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od zahteva 1 do 5, koji sadrži tri ili više aminokiselinskih ostataka navedenih pod (i) do (vii).

7. Rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od zahteva 1 do 5, koji sadrži četiri ili više aminokiselinskih ostataka navedenih pod (i) do (vii).

8. Rekombinantni Env protein HIV prema bilo kom od zahteva 1 do 7, koji sadrži Phe na poziciji 651, Ile na poziciji 655, Asn na poziciji 535 i Val na poziciji 589.

9. Rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od zahteva 1 do 8, koji sadrži pet ili više aminokiselinskih ostataka navedenih pod (i) do (vii).

10. Rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od zahteva 1 do 9, koji dodatno sadrži jedan ili više od sledećeg:

(ix) Lys na poziciji 64 ili Arg na poziciji 66 ili Lys na poziciji 64 i Arg na poziciji 66;

(x) Trp na poziciji 316;

(xi) Cys na obe pozicije 201 i 433;

(xii) Pro na poziciji 556 ili 558 ili na obe pozicije 556 i 558;

(xiii) zamenu petlje na pozicijama aminokiselina 548–568 (HR1-petlja) petljom koja ima 7–10 aminokiselina, poželjno petljom od 8 aminokiselina, na primer, koja ima sekvencu odabranu od bilo koje od (SEQ ID NO: 12–17);

11. Rekombinantni Env protein HIV prema bilo kom od zahteva 1 do 10, koji dodatno sadrži mutaciju u sekvenci cepanja furinom Env proteina HIV, poželjno zamenu na pozicijama 508– 511 sa RRRRRR (SEQ ID NO: 10).

12. Rekombinantni Env protein HIV prema bilo kom od zahteva 1 do 11, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa bilo kojom od SEQ ID NO: 3, 5, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ili 32.

14

13. Rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od zahteva 1 do 12, koji dodatno sadrži: (xvi) aminokiselinski ostatak odabran od Val, Ile, Phe, Met, Ala ili Leu, poželjno Val ili Ile, najpoželjnije Val, na poziciji 658.

14. Rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od zahteva 1 do 13, koji je protein gpl40 ili gpl60.

15. Rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od zahteva 1 do 14, koji je iz kladusa C ili kladusa A, poželjno iz kladusa C.

16. Trimerni kompleks koji sadrži nekovalentni oligomer od tri rekombinantna Env proteina HIV iz bilo kog od zahteva 1 do 15.

17. Čestica, poželjno lipozom ili nanočestica, koja na svojoj površini izlaže rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od zahteva 1 do 15 ili trimerni kompleks iz zahteva 16.

18. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od zahteva 1 do 15.

19. Vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz zahteva 18 operativno vezan za promoter.

20. Vektor iz zahteva 19, koji je vektor adenovirusa.

21. Ćelija domaćin koja sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz zahteva 18 ili vektor iz zahteva 19 ili 20.

22. Metoda za proizvodnju rekombinantnog Env proteina HIV, koja uključuje uzgajanje ćelije domaćina iz zahteva 21 pod uslovima pogodnim za proizvodnju rekombinantnog Env proteina HIV.

23. Kompozicija koja sadrži rekombinantni Env protein HIV iz bilo kog od zahteva 1 do 15, trimerni kompleks iz zahteva 16, česticu iz zahteva 17, izolovani molekul nukleinske kiseline iz zahteva 18, ili vektor iz zahteva 19 ili 20, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

24. Metoda za poboljšanje formiranja trimera Env proteina HIV, metoda koja obuhvata supstituciju jednog ili više aminokiselinskih ostataka u matičnom Env proteinu HIV, naznačeno time što jedna ili više supstitucija dovodi do jedne ili više od sledećih aminokiselina: (i) Phe, Leu, Met ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 651;

(ii) Phe, Ile, Met ili Trp, poželjno Ile, na poziciji 655;

(iii) Asn ili Gln, poželjno Asn, na poziciji 535;

(iv) Val, Ile ili Ala, poželjno Val, na poziciji 589;

(v) Phe ili Trp, poželjno Phe, na poziciji 573;

(vi) Ile na poziciji 204; i/ili

(i) Phe, Met ili Ile, poželjno Phe, na poziciji 647,

14