RS60920B1 - Kombinovane terapije primenom anti-pseudomonas psl i pcrv vezujućih molekula - Google Patents

Description

Opis

OSVRT NA SPISAK SEKVENCI PRILOŽEN ELEKTRONSKIM PUTEM

[0001] Sadržaj spiska sekvenci priloženog elektronskim putem u ASCII tekstualnoj datoteci nazvanoj sequencelisting_PCTascii.txt koji je kreiran 6. novembra 2012. i ima veličinu 382 kilobajta podnet sa prijavom.

POZADINA

Polje otkrića

[0002] Ovo otkriće se odnosi na kombinovane terapije koje koriste anti-Pseudomonas Psl i PcrV vezujuće domene za upotrebu u prevenciji i lečenju infekcija koje izaziva Pseudomonas. Nadalje, otkriće obezbeđuje kompozicije koje su korisne u takvoj terapiji.

Pozadina otkrića

[0003] Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) je gram negativni oportunistički patogen koji uzrokuje akutne i hronične infekcije kod ugroženih pojedinaca (Ma i sar. Journal of Bacteriology 189(22):8353-8356 (2007)). To je delom zbog velike urođene otpornosti bakterije na klinički korišćene antibiotike, a delom zbog nastanka biofilmova koji su veoma otporni na antibiotike (Drenkard E., Microbes Infect 5:1213-1219 (2003); Hancokc i Speert, Drug Resist Update 3:247-255 (2000)).

[0004] P. aeruginosa je uobičajen uzrok bolničkih infekcija u zapadnom svetu. On često predstavlja izazivač bakterijemije kod žrtava opekotina i osoba sa kompromitovanim imunskim sistemom (Lyczak i sar. Microbes Infect 2:1051-1060 (2000)). Takođe je najčešći uzrok nozokomijalne gram negativne pneumonije (Craven i sar. Semin Respir Infect 11:32-53 (1996)), naročito kod pacijenata kod kojih se koristi asistirana ventilacija, i najrasprostranjeniji je patogen u plućima pojedinaca sa cističnom fibrozom (Pier i sar. ASM News 6:339-347 (1998)).

[0005] Pseudomonas Psl egzopolisaharid je ukotvljen za površinu P. aeruginosa, i smatra se da je značajan za olakšavanje kolonizacije tkiva domaćina i uspostavljanje/održavanje formiranja biofilma (Jackson, K.D., i sar. J Bacteriol 186, 4466-4475 (2004)). Njegova struktura sadrži ponavljajući pentasaharid bogat manozom (Byrd, M.S., i sar. Mol Microbiol 73, 622-638 (2009)).

[0006] PcrV je relativno očuvana komponenta sekrecionog sistema tip III. Izgleda da je PcrV sastavna komponenta translokacionog aparata sekrecionog sistema tipa III koji posreduje u isporučivanju sekretornih toksina tipa III u ciljne eukariotske ćelije (Sawa T., i sar. Nat. Med.

5, 392-398 (1999)). Aktivna i pasivna imunizacija protiv PcrV poboljšala je akutnu povredu pluća i mortalitet miševa inficiranih citotoksičnim P. aeruginosa (Sawa i sar. 2009). Do značajnog dejstva imunizacije protiv PcrV došlo je usled blokade translokacije sekretornih toksina tipa III u eukariotske ćelije. US2011/0150896 otkriva monoklonska antitela usmerena na P. aeruginosa PcrV.

[0007] Usled rastuće otpornosti na višestruke lekove, u struci ostaje potreba za razvojem novih strategija za identifikovanje novih profilaktičkih i terapeutskih agenasa specifičnih za Pseudomonas.

KRATAK SAŽETAK

[0008] Pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje vezuje Pseudomonas Psl i PcrV prema zahtevu 1, kompoziciju koja sadrži bispecifično antitelo iz zahteva 3 i antitelo za upotrebu u prevenciji ili lečenju infekcije pseudomonasom prema zahtevu 8. Ovde je otkriven vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment koji specifično vezuje Pseudomonas PcrV, koji sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži SYAMN (SEQ ID NO:218) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije; CDR2 teškog lanca koji sadrži AITISGITA YYTDSVKG (SEQ ID NO: 219) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije; i CDR3 teškog lanca koji sadrži EEFLPGTHYYYGMDV (SEQ ID NO: 220) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije; (b) CDR1 lakog lanca koji sadrži RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 221) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije; CDR2 lakog lanca koji sadrži SASTLQS (SEQ ID NO: 222) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije; i CDR3 lakog lanca koji sadrži LQDYNYPWT (SEQ ID NO: 223) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije; ili kombinacije (a) i (b). Ovde je otkriven vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment koji specifično vezuje Pseudomonas PcrV, i sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži SYAMN (SEQ ID NO: 218), CDR2 teškog lanca koji sadrži AITISGITAYYTDSVKG (SEQ ID NO: 219) i CDR3 teškog lanca koji sadrži EEFLPGTHYYYGMDV (SEQ ID NO: 220); i (b) CDR1 lakog lanca koji sadrži RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 221), CDR2 lakog lanca koji sadrži SASTLQS (SEQ ID NO: 222) i CDR3 lakog lanca koji sadrži LQDYNYPWT (SEQ ID NO: 223). Ovde je otkriven izolovani vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment koji specifično vezuje Pseudomonas PcrV i sadrži (a) varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 216; (b) varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 217; ili kombinacije (a) i (b). U drugom primeru, vezujući molekul ili njegov fragment sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 216; (b) varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 217; ili kombinacije (a) i (b). U drugom primeru, vezujući molekul ili njegov fragment je V2L2 i sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 216; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 217.

[0009] U jednom primeru, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za isti epitop Pseudomonas PcrV kao antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži VH i VL region V2L2. U drugom primeru, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas PcrV i konkurentski inhibira vezivanje Pseudomonas PcrV putem antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL iz V2L2. U jednom otelotvorenju, vezujući molekul ili njegov fragment je rekombinantno antitelo. U jednom otelotvorenju, vezujući molekul ili njegov fragment je monoklonsko antitelo. U jednom otelotvorenju, vezujući molekul ili njegov fragment je himerno antitelo. U jednom otelotvorenju, vezujući molekul ili njegov fragment je humanizovano antitelo. U jednom otelotvorenju, vezujući molekul ili njegov fragment je humano antitelo. U jednom otelotvorenju, vezujući molekul ili njegov fragment je bispecifično antitelo.

[0010] U jednom otelotvorenju, vezujući molekul ili njegov fragment inhibira isporučivanje sekretornih toksina tipa III u ciljne ćelije.

[0011] Ovde je obezbeđeno bispecifično antitelo koje sadrži vezujući domen koji se vezuje za Pseudomonas Psl i vezujući domen koji se vezuje za Pseudomonas PcrV, kako je prikazano u zahtevu 1. Psl vezujući domen sadrži fragment scFv, a PcrV vezujući domen sadrži netaknuti imunoglobulin. U jednom primeru, Psl vezujući domen sadrži netaknuti imunoglobulin, a pomenuti PcrV vezujući domen sadrži fragment scFv. U jednom primeru, scFv je fuzionisan sa amino terminusom VH regiona netaknutog imunoglobulina. U jednom primeru, scFv je fuzionisan sa karboksi terminusom CH3 regiona netaknutog imunoglobulina. ScFv je umetnut u region šarke netaknutog imunoglobulina.

[0012] U jednom otelotvorenju, anti-Psl vezujući domen specifično se vezuje za isti epitop Pseudomonas Psl kao antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) najmanje 90% identičan sa odgovarajućim regionom WapR-004. U jednom otelotvorenju, anti-Psl vezujući domen specifično se vezuje za Pseudomonas Psl i konkurentski inhibira vezivanje Pseudomonas Psl putem antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL region najmanje 90% identičan sa odgovarajućim regionom WapR-004. U jednom otelotvorenju, VH i VL WapR-004 sadrže SEQ ID NO:11, odnosno SEQ ID NO:12. U jednom otelotvorenju, sekvenca WapR-004 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229 i SEQ ID NO:235. U jednom otelotvorenju, anti-PcrV vezujući domen se specifično vezuje za isti epitop Pseudomonas PcrV kao antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži VH i VL region V2L2. U jednom otelotvorenju, anti-PcrV vezujući domen se specifično vezuje za Pseudomonas PcrV i konkurentski inhibira vezivanje Pseudomonas PcrV putem antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL iz V2L2. U jednom otelotvorenju, anti-PcrV vezujući domen specifično se vezuje za isti epitop Pseudomonas PcrV kao antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži VH i VL region najmanje 90% identičan sa odgovarajućim regionom V2L2. U jednom otelotvorenju, VH i VL V2L2 sadrže SEQ ID NO:216, odnosno SEQ ID NO:217. U jednom otelotvorenju, VH i VL WapR-004 (SEQ ID NO:11, odnosno 12) i VH i VL V2L2 (SEQ ID NO: 216, odnosno 217). U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229 i SEQ ID NO:235.

[0013] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:216 ili SEQ ID NO:217. Polipeptid je antitelo.

[0014] Ovde je otkrivena ćelija koja sadrži ili proizvodi ovde otkriveni vezujući molekul ili polipeptid.

[0015] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje izolovani molekul polinukleotida koji sadrži polinukleotid koji kodira ovde opisani vezujući molekul ili polipeptid. U jednom otelotvorenju, molekul polinukleotida sadrži sekvencu polinukleotida izabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO:238 i SEQ ID NO:239. Ovde je otkriven vektor koji sadrži ovde opisani polinukleotid. Ovde je otkrivena ćelija koja sadrži polinukleotid ili vektor.

[0016] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje kompoziciju koja sadrži ovde opisano bispecifično antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0017] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje kompoziciju koja sadrži vezujući domen koji se vezuje za Pseudomonas Psl i vezujući domen koji se vezuje za Pseudomonas PcrV. U jednom primeru, anti-Psl vezujući domen specifično se vezuje za isti epitop Pseudomonas Psl kao antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) najmanje 90% identičan sa odgovarajućim regionom WapR-004 Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR-003, ili WapR-016. U jednom primeru, anti-Psl vezujući domen specifično se vezuje za Pseudomonas Psl i konkurentski inhibira vezivanje Pseudomonas Psl putem antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL region najmanje 90% identičan sa odgovarajućim regionom WapR-004 Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR-003, ili WapR-016. U jednom otelotvorenju, VH i VL WapR-004 sadrže SEQ ID NO:11, odnosno SEQ ID NO:12, VH i VL Cam-003 sadrže SEQ ID NO:1, odnosno SEQ ID NO:2, VH i VL Cam-004 sadrže SEQ ID NO:3, odnosno SEQ ID NO:2, VH i VL Cam-005 sadrže SEQ ID NO:4, odnosno SEQ ID NO:2, VH i VL WapR-001 sadrže SEQ ID NO:5, odnosno SEQ ID NO:6, VH i VL WapR-002 sadrže SEQ ID NO:7, odnosno SEQ ID NO:8, VH i VL WapR-003 sadrže SEQ ID NO:9, odnosno SEQ ID NO:10, a VH i VL WapR-016 sadrže SEQ ID NO: 15 odnosno SEQ ID NO:16. U jednom otelotvorenju, anti-PcrV vezujući domen se specifično vezuje za isti epitop Pseudomonas PcrV kao antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži VH i VL region V2L2. U jednom otelotvorenju, anti-PcrV vezujući domen se specifično vezuje za Pseudomonas PcrV i konkurentski inhibira vezivanje Pseudomonas PcrV putem antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL iz V2L2. U jednom otelotvorenju, anti-PcrV vezujući domen specifično se vezuje za isti epitop Pseudomonas PcrV kao antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrže VH i VL region najmanje 90% identičan sa odgovarajućim regionom V2L2. U jednom otelotvorenju, VH i VL V2L2 sadrže SEQ ID NO:216, odnosno SEQ ID NO:217. U jednom otelotvorenju, anti-Psl vezujući domen sadrži VH i VL region WapR-004, i pomenuti anti-PcrV vezujući domen sadrži VH i VL region V2L2, ili njegove antigen vezujuće fragmente.

[0018] Ovde je otkrivena kompozicija koja obuhvata prvi vezujući molekul koji sadrži pomenuti anti Psl-vezujući domen, i drugi vezujući molekul koji sadrži PcrV-vezujući domen. U jednom primeru, prvi vezujući molekul je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, a pomenuti drugi vezujući molekul je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. U jednom primeru, antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od: monoklonskog, humanizovanog, himernog, humanog, Fab fragmenta, Fab' fragmenta, F(ab)2 fragmenta i scFv fragmenta. U jednom primeru, vezujući domeni, vezujući molekuli ili njihovi fragmenti vezuju dva ili više, tri ili više, četiri ili više, ili pet ili više različitih serotipova P. aeruginosa. U jednom primeru, vezujući domeni, vezujući molekuli ili njihovi fragmenti vezuju se za najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% sojeva P. aeruginosa koji su izolovani od inficiranih pacijenata. U jednom primeru, sojevi P. aeruginosa su izolovani iz jednog ili više od pluća, ispljuvka, oka, gnoja, izmeta, urina, sinusa, rane, kože, krvi, kosti ili vode u kolenu. U jednom primeru, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se dalje konjuguje sa agensom izabranim iz grupe koja se sastoji od antimikrobnog agensa, terapijskog agensa, proleka, peptida, proteina, enzima, lipida, modifikatora biološkog odgovora, farmaceutskog agensa, limfokina, heterologog antitela ili njegovog fragmenta, oznake koja može da se detektuje, polietilen glikola (PEG) i kombinacije dva ili više bilo kojih navedenih agenasa. U jednom otelotvorenju, oznaka koja može da se detektuje je izabrana iz grupe koja se sastoji od enzima, fluorescentne oznake, hemiluminescentne oznake, bioluminescentne oznake, radioaktivne oznake ili kombinacije dve ili više bilo kojih navedenih oznaka koje mogu da se detektuju.

[0019] Ovde je otkriven postupak za prevenciju ili lečenje infekcije pseudomonasom kod pojedinca kome je to potrebno, koji obuhvata primenu na ispitaniku delotvorne količine kompozicije koja je ovde opisana, pri čemu navedena primena obezbeđuje sinergijski terapeutski efekat u prevenciji ili lečenju infekcije pseudomonasom kod navedenog ispitanika, i pri čemu je navedeni sinergijski efekat veći od zbira pojedinačnih efekata primene jednakih molskih količina pojedinačnih vezujućih domena. U jednom primeru, sinergijski terapeutski efekat dovodi do većeg procenta preživljavanja od zbirnog procenta preživljavanja ispitanika na kojima je primenjen samo jedan vezujući domen, u jednom primeru, kompozicija se primenjuje u dva ili više ciklusa prevencije/lečenja. U jednom primeru, vezujući domeni ili vezujući molekuli se primenjuju istovremeno. U jednom primeru, vezujući domeni ili vezujući molekuli se primenjuju sekvencijalno. U jednom primeru, infekcija pseudomonasom je infekcija pomoću P. aeruginosa. U jednom primeru, ispitanik je čovek. U jednom primeru, infekcija je infekcija oka, infekcija pluća, infekcija opekotine, infekcija rane, infekcija kože, infekcija krvi, infekcija kosti ili kombinacija dve ili više navedenih infekcija. U jednom primeru, ispitanik ima akutnu pneumoniju, opekotinu, infekciju rožnjače, cističnu fibrozu, ili njihovu kombinaciju.

[0020] Ovde je otkriven postupak za prevenciju ili lečenje infekcije pseudomonasom kod pojedinca kome je to potrebno, koji obuhvata primenu na ispitaniku delotvorne količine vezujućeg molekula ili njegovog fragmenta, bispecifičnog antitela, polipeptida, ili ovde opisane kompozicije.

[0021] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži ovde opisanu kompoziciju.

KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA

[0022]

Slika 1 (A-F): Fenotipski skrining celih ćelija sa bibliotekama faga humanih antitela identifikovao je funkcionalno aktivna specifična antitela za P. aeruginosa. (A) Pregled kompletne strategije odabira antitela. (B) Dijagram toka koji opisuje proces za izolovanje gena varijabilnog regiona antitela od pacijenata koji su nedavno bili izloženi P. aeruginosa. (C) Karakteristike biblioteke displeja faga scFv, koje ukazuju na veličinu i raznovrsnost repertoara kloniranih antitela. (D) Poređenje efikasnosti selekcije displeja faga koristeći biblioteku antitela pacijenta ili biblioteku naivnih antitela, kada je izabran na P. aeruginosa 3064 Δ WapR (<1>) ili P. aeruginosa PAO1 MexAB OprM Δ WapR (<2>) u suspenziji. Stupci pokazuju izlazne titre (u CFU) za svaku rundu selekcije, a krugovi pokazuju proporciju dupliranih sekvenci CDR3 VH, što ukazuje na klonsko obogaćenje. (E) ELISA skrining scFv iz displeja faga radi testiranja vezivanja za višestruke sojeve P. aeruginosa. Podaci iz ELISA (apsorbanca na 450 nm) prikazani su za osam pojedinačnih fag-scFv iz selekcije i jedan nebitni fag-scFv. (F) FACS vezivanje P. aeruginosa specifičnih antitela sa reprezentativnim uzorcima iz jedinstvenih serotipova P. aeruginosa. Za svako testirano antitelo, antitelo humanog IgG za negativnu kontrolu je prikazano kao osenčeni pik.

Slika 2 (A-B): Ispitivanje mAb koja promovišu OPK P. aeruginosa (A) Test opsonofagocitoze sa luminescentnom serogrupom P. aeruginosa O5 soja (PAO1.lux), sa razblaženjem prečišćenih monoklonskih antitela dobijenih spiranjem faga. (B) Test opsonofagocitoze sa luminescentnom serogrupom P. aeruginosa soja O11 (9882-80.lux), sa razblaženjem prečišćenih WapR-004 i Cam-003 monoklonskih antitela dobijenih panovanjem faga. U A i B, R347, izotipski podudarno monoklonsko antitelo koje ne vezuje antigene P. aeruginosa, korišćeno je kao negativna kontrola.

Slika 3 (A-I): Identifikovanje ciljnog P. aeruginosa Psl egzopolisaharida za antitela dobijena iz fenotipskog skrininga. Reaktivnost antitela je utvrđena putem indirektne ELISA na pločama koje su premazane naznačenim sojevima P. aeruginosa: (A) divlji tip PAO1, PAO1ΔwbpL. PAO1ΔrmlC i AO1ΔgalU. (B) PAO1ΔpslA. Genway antitelo je specifično za protein spoljne membrane P. aeruginosa i korišćeno je kao pozitivna kontrola. (C) FACS analiza vezivanja Cam-003 za PAO1 i PAO1ΔpslA. Cam-003 je označen punom crnom linijom i neobojenim pikom; izotipski podudarno humano IgG antitelo nespecifično za P. aeruginosa je korišćeno kao negativna kontrola i označeno je sivom linijom i osenčenim pikom. (D) LPS prečišćen iz PAO1 and PAO1ΔpslA razdvojen je pomoću SDS-PAGE i urađen je imunoblot sa antiserumima dobijenim od miševa vakcinisanih sa PAO1ΔwapRΔalgD, mutantnim sojem bez transporta O antigena do spoljne membrane i proizvodnje alginata. (E) Vezujući podaci ELISA za Cam-003 sa izogenim mutantima PAO1. Cam-003 može da se vezuje samo za sojeve koji eksprimiraju Psl. pPW145 je ekspresioni vektor pUCP koji sadrži pslA. (F i G) Testovi opsonofagocitoze koji pokazuju da Cam-003 posreduje samo u ubijanju sojeva koji mogu da proizvode Psl (PAO1 divljeg tipa i PAO1ΔpslA dopunjen in trans genom pslA). (H i I) ELISA podaci koji pokazuju reaktivnost anti-Psl antitela WapR-001, WapR-004 i WapR-016 sa PAO1 ΔwbpLΔalgD i PAO1 ΔwbpLΔalgDΔpslA. R347 je korišćen kao negativna kontrola u svim eksperimentima.

Slika 4: Anti-Psl mAb inhibiraju ćelijsko vezivanje luminescentnog PAO1.lux soja P. aeruginosa za A549 ćelije. PAO1.lux u log fazi su dodati u konfluentni monosloj A549 ćelija pri multiplicitetu infekcije 10, a zatim je analiziran RLU nakon ponovljenog ispiranja da se ukloni nevezani P. aeruginosa, Rezultati predstavljaju tri nezavisna eksperimenta izvedena u duplikatu za svaku koncentraciju antitela.

Slika 5 (A-C): In vivo presejani sojevi P. aeruginosa održavaju/povećavaju ekspresiju Psl. Cam-003 antitelo je prikazano punom crnom linijom i neobojenim pikom; humano IgG antitelo za negativnu kontrolu je prikazano kao siva linija i osenčeni pik. (A) Za pozitivnu kontrolu, Cam-003 je testiran na vezivanje za sojeve uzgajane do logaritamske faze iz kulture preko noći (∼5 x 10<8>/ml). (B) Inokulumi za svaki soj su pripremljeni do 5 x 10<8>CFU/ml na ploči sa TSA, rastom preko noći do bakterijskog travnjaka, i ispitana je reaktivnost na Cam-003 protočnom citometrijom. (C) Četiri sata nakon intraperitonealnog izazova, bakterije su sakupljene iz miševa putem peritonealnog ispiranja i testirane na prisustvo Psl sa Cam-003 pomoću protočne citometrije.

Slika 6 (A-F): Stope preživljavanja za životinje lečene anti-Psl monoklonskim antitelima Cam-003 ili WapR-004 na P. aeruginosa modelu akutne pneumonije. (A-D) Životinje su lečene sa Cam-003 sa 45, 15 i 5 mg/kg i R347 sa 45 mg/kg ili PBS-om 24 sata pre intranazalne infekcije sa (A) PAO1 (1,6 x 10<7>CFU), (B) 33356 (3 x 10<7>CFU), (C) 6294 (7 x 10<6>CFU), (D) 6077 (1 x 10<6>CFU). (E-F) Životinje su lečene sa WapR-004 sa 5 i 1 mg/kg, kao što je naznačeno, a zatim inficirane sa 6077, sa (E) (8 x 10<5>CFU), ili (F) (6 x 10<5>CFU). Preživljavanje životinja je pažljivo praćeno do 72 sata (A-D) ili tokom 120 sati (E-F). U svim eksperimentima, PBS i R347 su bili negativna kontrola. Rezultati su predstavljeni kao Kaplan-Majerove krive preživljavanja; razlike u preživljavanju su izračunate pomoću logrank testa za Cam-003 u odnosu na R347. (A) Cam-003 (45 mg/kg - P<0,0001; 15 mg/kg -P=0,0003; 5 mg/kg - P=0,0033). (B) Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0012; 15 mg/kg - P=0,0012; 5 mg/kg - P=0,0373). (C) Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0007; 15 mg/kg - P=0,0019; 5 mg/kg -P=0,0212). (D) Cam-003 (45 mg/kg - P<0,0001; 15 mg/kg - P<0,0001; 5 mg/kg - P=0,0001). Rezultati su reprezentativni za najmanje dva nezavisna eksperimenta. (E) [Cam-003 (5 mg/kg) u odnosu na R347 (5 mg/kg): P=0,02; Cam-003 (1 mg/kg) u odnosu na R347 (5 mg/kg): P=0,4848; WapR-004 (5 mg/kg) u odnosu na R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (1 mg/kg) u odnosu na R347 (5 mg/kg): P=0,0886; WapR-004 (5 mg/kg) u odnosu na Cam-003 (5 mg/kg): P=0,0017; WapR-004 (1 mg/kg) u odnosu na Cam-003 (1 mg/kg): P=0,2468; R347 (5 mg/kg) u odnosu na PBS: P=0,6676] (F) [Cam-003 (5 mg/kg) u odnosu na R347 (5 mg/kg): P=0,0004; Cam-003 (1 mg/kg) u odnosu na R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (5 mg/kg) u odnosu na R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (1 mg/kg) u odnosu na R347 (5 mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (5 mg/kg) u odnosu na Cam-003 (5 mg/kg): P=0,0002;

1

WapR-004 (1 mg/kg) u odnosu na Cam-003 (1 mg/kg): P=0,2628; R347 (5 mg/kg) u odnosu na PBS: P=0,6676]. Rezultati su reprezentativni za pet nezavisnih eksperimenata.

Slika 7 (A-F): Anti-Psl monoklonska antitela, Cam-003 i WapR-004, smanjuju opterećenje organa nakon indukcije akutne pneumonije. Miševi su tretirani Cam-003 antitelom 24 sata pre infekcije sa (A) PAO1 (1,1 x 10<7>CFU), (B) 33356 (1 x 10<7>CFU), (C) 6294 (6,25 x 10<6>CFU) (D) 6077 (1 x 10<6>CFU), i WapR-004 antitelom 24 sata pre infekcije sa (E) 6294 (∼1 x 10<7>CFU), i (F) 6206 (∼1 x 10<6>CFU).24 sata nakon infekcije, životinje su eutanazirane, a zatim su sakupljeni organi za identifikaciju vijabilnih CFU. Razlike u vijabilnim CFU su određene putem Man-Vitnijevog U testa za Cam-003 ili WapR-004 u odnosu na R347. (A) Pluća: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0015; 15 mg/kg - P=0,0021; 5 mg/kg - P=0,0015); Slezina: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0120; 15 mg/kg - P=0.0367); Bubrezi: Cam-003 (45 mg/kg -P=0,0092; 15 mg/kg - P=0,0056); (B) Pluća: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0010; 15 mg/kg -P<0,0001; 5 mg/kg - P=0,0045); (C) Pluća: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0003; 15 mg/kg -P=0,0039; 5 mg/kg - P=0,0068); Slezina: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0057; 15 mg/kg -P=0,0230; 5 mg/kg - P=0,0012); (D) Pluća: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0005; 15 mg/kg -P=0,0003; 5 mg/kg - P=0,0007); Slezina: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0015; 15 mg/kg -P=0,0089; 5 mg/kg - P=0,0089); Bubrezi: Cam-003 (45 mg/kg - P=0,0191; 15 mg/kg -P=0,0355; 5 mg/kg - P=0,0021). (E) Pluća: WapR-004 (15 mg/kg - P=0,0011; 5 mg/kg -P=0,0004; 1 mg/kg - P=0,0002); Slezina: WapR-004 (15 mg/kg - P<0,0001; 5 mg/kg -P=0,0014; 1 mg/kg - P<0,0001), F) Pluća: WapR-004 (15 mg/kg - P<0,0001; 5 mg/kg -P=0,0006; 1 mg/kg - P=0,0079); Slezina: WapR-004 (15 mg/kg - P=0,0059; 5 mg/kg -P=0,0261; 1 mg/kg - P=0,0047); Bubreg: WapR-004 (15 mg/kg - P-0,0208; 5 mg/kg -P=0,0268.

Slika 8 (A-G): Anti-Psl monoklonska antitela Cam-003 i WapR-004 su aktivna u P. aeruginosa modelu keratitisa i modelu toplotne povrede. Miševi su lečeni kontrolnim IgG1 antitelom ili Cam-003 sa 45 mg/kg (A, B) ili 15 mg/kg (C, D) ili PBS-om ili kontrolnim IgG1 antitelom ili Cam-003 sa 45 mg/kg ili WapR-004 sa 45 mg/kg ili 15 mg/kg ili 5 mg/kg (F, G) 24 sata pre infekcije sa 6077 (O11-citotoksično - 2x10<6>CFU). Neposredno pre infekcije, tri ogrebotine od 1 mm su načinjene na levoj rožnjači svake životinje nakon čega sledi topikalna primena P. aeruginosa u 5 µl inokuluma. 24 sata nakon infekcije, rezultati patologije rožnjače su izračunati, nakon čega je oko uklonjeno radi utvrđivanja vijabilnih CFU. Razlike u patološkim rezultatima i vijabilni CFU su određeni putem Man-Vitnijevog U testa. (A) P=0,0001, (B) P<0,0001, (C) P=0,0003, (D) P=0,0015. (F) i (G) Cam-003 (45 mg/kg) u odnosu na WapR-004 (45 mg/kg): P=0,018; Cam-003 (45 mg/kg) u odnosu na WapR-004 (15 mg/kg): P=0,0025; WapR-004 (45 mg/kg) u odnosu na WapR-004 (15 mg/kg):

P=0,1331; WapR-004 (5 mg/kg) u odnosu na Ctrl: P<0,0001. Rezultati su reprezentativni za pet nezavisnih eksperimenata. (E) Analiza preživljavanja CF-1 miševa lečenih sa Cam-003 i R347 na modelu termičke povrede P. aeruginosa nakon 6077 infekcija (2 x 10<5>CFU) (logrank: R347 u odnosu na Cam-00315 mg/kg, P=0,0094; R347 u odnosu na Cam-0035 mg/kg, P=0,0017). Rezultati su reprezentativni najmanje za tri nezavisna eksperimenta, (n) se odnosi na broj životinja u svakoj grupi. Slika 8 (H): Anti-Psl i anti-PcrV monoklonska antitela su aktivna na modelu mišjeg očnog keratitisa P. aeruginosa. Miševima je intraperitonealno (IP) injektovan PBS ili kontrolno IgG1 antitelo (R347) sa 45 mg/kg ili WapR-004 (α-Psl) sa 5 mg/kg ili V2L2 (α-PcrV) sa 5mg/kg, 16 sati pre infekcije sa 6077 (O11-citotoksični- 1x10<6>CFU). Neposredno pre infekcije, miševi su anestezirani i inicirane su tri ogrebotine od 1 mm na rožnjači i površinskoj stromi jednog oka svakog miša koristeći iglu od 27 gejdža pod mikroskopom za disekciju, a zatim je topikalno primenjen P. aeruginosa soj 6077 u 5 µl inokuluma.

Slika 9 (A-C): Cam-003 Fc mutantno antitelo, Cam-003-TM, ima smanjenu OPK i in vivo efikasnost, ali zadržava aktivnost antićelijskog vezivanja. (A) Test OPK PAO1.lux sa Cam-003 i Cam-003-TM, koji nosi mutacije u Fc domenu koji sprečava Fc interakcije sa Fcγ receptorima (Oganesyan, V., i sar. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64, 700-704 (2008)). R347 je korišćen kao negativna kontrola. (B) Test ćelijskog vezivanja PAO1 sa Cam-003 i Cam-003-TM. (C) Model akutne pneumonije koji poredi efikasnost Cam-003 u odnosu na Cam-003-TM.

Slika 10 (A-C): A: Mapiranje epitopa i identifikovanje relativnog afiniteta vezivanja za anti-Psl monoklonska antitela. Mapiranje epitopa je obavljeno pomoću kompetitivnog ELISA testa i potvrđeno koristeći OCTET® protočni sistem sa Psl dobijenim iz supernatanta kulture preko noći P. aeruginosa soja PAO1. Relativni afinitet vezivanja je izmeren na instrumentu FORTEBIO® OCTET® 384. Takođe su prikazane koncentracije antitela pri kojima je ćelijsko vezivanje maksimalno inhibirano, i EC50 vrednosti OPK za svako antitelo. B, C. Relativni afiniteti vezivanja različitih WapR-004 mutanata, izmereni na instrumentu FORTEBIO® OCTET® 384. Takođe su prikazane EC50 vrednosti OPK za različite mutante. Slika 11 (A-M): Procena WapR-004 (W4) mutantnih klonova u testu opsonofagocitnog ubijanja (OPK) P. aeruginosa (A-M) OPK test sa luminescentnim P. aeruginosa sojem serogrupe O5 (PAO1.lux), sa razblaživanjem različitih W4 mutantnih klonova u scFv-Fc formatu. U nekim slučajevima, W4 IgG1 je uključen u test i označen je sa W4-IgG1. W4-RAD-Cam i W4-RAD-GB predstavljaju istu sekvencu WapR-004RAD koja je ovde opisana.

„W4-RAD“ je skraćeni naziv za WapR-004RAD, a W4-RAD-Cam i W4-RAD-GB nazivi u panelima D do M predstavljaju dva različita preparata WapR-004RAD. (N-Q): Procena optimizovanih anti-Psl mAb izvedenih iz vodeće (WapR-004) optimizacije na OPK testu P. aeruginosa. (N-O) OPK test sa luminescentnim PAO1.lux koristeći razblaženja prečišćenih vodećih optimizovanih monoklonskih antitela. (P-Q) Ponovljeni OPK test sa PAO1.lux sa razblaženjem prečišćenih mAb za potvrdu rezultata. (N-Q): W4-RAD je korišćen kao uporedna pozitivna kontrola. U svim eksperimentima, R347, humano IgG1 monoklonsko antitelo koje ne vezuje antigene P. aeruginosa, korišćeno je kao negativna kontrola.

Slika 12 (A-H): (A) Raznovrsnost epitopa PcrV. (B) Procentualna inhibicija analize citotoksičnosti za matično V2L2 mAb, mAb166 (pozitivna kontrola) i R347 (negativna kontrola). (C) Procena sposobnosti V2L2 mAb, mAb166 (pozitivna kontrola) i R347 (negativna kontrola) da spreči lizu RBC. (D) Procena sposobnosti V2L2 mAb sa germinativnim mutacijama (V2L2-GL) i optimizovanih V2L2-GL mAb (V2L2-P4M, V2L2-MFS, V2L2-MD i V2L2-MR) da spreče lizu RBC, (E) Procena sposobnosti mAb 1E6, 1F3, 11A6, 29D2, PCRV02 i V2L7 da spreče lizu RBC (F) Procena sposobnosti mAb V2L2 i 29D2 da spreče lizu RBC. (G-H) Relativni afiniteti vezivanja V2L2-GL i V2L2-MD antitela. Slika 13 (A-I): In vivo studija preživljavanja miševa lečenih anti-PcrV antitelom. (A) Miševi su lečeni 24 sata pre inficiranja sa: 1,03 x 10<6>CFU 6077 (exoU<+>) sa 45 mg/kg R347 (negativna kontrola), 45 mg/kg, 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, ili 1,0 mg/kg mAb166 (pozitivna kontrola), ili 15 mg/kg, 5,0 mg/kg, 1,0 mg/kg, ili 0,2 mg/kg V2L2. Preživljavanje je praćeno tokom 96 sati. (B) Miševi su lečeni 24 sata pre inficiranja sa: 2,1 x 10<7>CFU 6294 (exoS<+>) sa 15 mg/kg R347 (negativna kontrola), 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, ili 1,0 mg/kg mAb166 (pozitivna kontrola), ili 15 mg/kg, 5,0 mg/kg, ili 1,0 mg/kg V2L2. Preživljavanje je praćeno tokom 168 sati. Miševi su lečeni 24 sata pre inficiranja sa: (C) 6294 (O6) ili (D) PA103A sa R347 (negativna kontrola), 5 mg/kg PcrV antitela PcrV-02, ili 5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 0,2 mg/kg, ili 0,04 mg/kg V2L2. Miševi su lečeni 24 sata pre inficiranja sojem 6077 sa R347 (negativna kontrola), 5 mg/kg PcrV antitela PcrV-02, V2L7 (5 mg/kg ili 1 mg/kg), 3G5 (5 mg/kg ili 1 mg/kg), ili 11A6 (5 mg/kg ili 1 mg/kg) (E), ili 25 mg/kg V2L7, 1E6, 1F3, 29D2, R347 ili 1 mg/kg PcrV antitela PcrV-01 (F), ili 25 mg/kg 21F1, V2L2, 2H3, 4A8, SH3, LE10, R347 ili 1 mg/kg PcrV-02 (G), ili 29D2 (1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg), V2L2 (1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg) R347 ili 1 mg/kg PcrV-02 (H). Miševi su lečeni 24 sata pre inficiranja sa: 6294 (O6) ili PA103A sa V2L2 (0,04 mg/kg, 0,2 mg/kg, 1 mg/kg ili 5 mg/kg), R347 ili 5mg/kg PcrV-02. Procenat preživljavanja je testiran na modelu akutne pneumonije.

1

Slika 14: Analiza opterećenja organa miševa lečenih sa V2L2. Miševi su lečeni 24 sata pre inficiranja sa 6206 sa (A) R347 (negativna kontrola), 1 mg/kg, 0,2 mg/kg, ili 0,07 mg/kg V2L2 i (B) 15 mg/kg R347 (negativna kontrola); 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, ili 1,0 mg/kg mAb166 (pozitivna kontrola); ili 5,0 mg/kg, 1,0 mg/kg, ili 0,2 mg/kg V2L2. Jedinice formiranja kolonije su identifikovane po gramu tkiva u plućima, slezini i bubregu.

Slika 15: Analiza opterećenja organa miševa lečenih sa V2L2 i WapR-004 (W4). Miševi su lečeni 24 sata pre inficiranja sa 6206 (O11-ExoU+) sa R347 (negativna kontrola), samo V2L2, ili V2L2 (0,1 mg/kg) u kombinaciji sa rastućim koncentracijama W4 (0,1, 0,5, 1,0, ili 2,0 mg/kg). Jedinice formiranja kolonije su identifikovane po gramu tkiva u plućima, slezini i bubregu.

Slika 16 (A-G): Stope preživljavanja za životinje lečene anti-PcrV monoklonskim antitelom V2L2 na modelu akutne pneumonije sa P. aeruginosa. Oznake V2L2-GL, V2L2-MD, V2L2-PM4, V2L2-A i V2L2-MFS u panelima A do G predstavljaju različite preparate V2L2. (A-C) Životinje su lečene sa V2L2 sa 1 mg/kg, 0,5 mg/kg ili R347 sa 0,5 mg/kg pre intranazalne infekcije sa (A) 6077 (9,75 x 10<5>CFU), (B, C) 6077 (9,5 x 10<5>CFU). (D-F) Životinje su lečene sa V2L2 sa 0,5 mg/kg, 0,1 mg/kg ili R347 sa 0,5 mg/kg nakon infekcije sa 6077 (D) (1 x 10<6>CFU), (E) (9,5 x 10<5>CFU) ili F (1,026 x 10<6>CFU). (G) Životinje su lečene sa V2L2-MD sa (0,04 mg/kg, 0,2 mg/kg, 1 mg/kg ili 5 mg/kg), mAb166 (pozitivna kontrola) sa (0,2 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg ili 15 mg/kg), ili R347 sa 0,5 mg/kg nakon infekcije sa 6206 (2 x 10<7+>CFU).

Slika 17 (A-B): Šematski prikaz (A) Bs1-TNFα/W4, Bs2-TNFα/W4, Bs3-TNFα/W4 i (B) Bs2-V2L2/W4-RAD, Bs3-V2L2/W4-RAD, i Bs4-V2L2-W4-RAD Psl/PcrV bispecifičnih antitela. (A) Za Bsl-TNFα/W4, W4 scFv je fuzionisan sa amino-terminusom TNFα VL putem (G4S)2 linkera. Za Bs2-TNFα/W4, W4 scFv je fuzionisan sa amino-terminusom TNFα VH putem (G4S)2 linkera. Za Bs3-TNFα/W4, W4 scFv je fuzionisan sa karboksi-terminusom CH3 putem (G4S)2 linkera. (B) Za Bs2-V2L2-2C, W4-RAD scFv je fuzionisan sa aminoterminusom V2L2 VH putem (G4S)2 linkera. Za Bs2-W4-RAD-2C, V2L2 scFv je fuzionisan sa amino-terminusom W4-RAD VH putem (G4S)2 linkera. Za Bs3-V2L2-2C, W4-RAD scFv je fuzionisan sa karboksi-terminusom CH3 putem (G4S)2 linkera. Za Bs4-V2L2-2C, W4-RAD scFv je umetnut u region šarke, povezan putem (G4S)2 linkera sa N-terminalom ili C-terminalom scFv.

Slika 18: Procenjivanje scFv aktivnosti WapR-004 (W4) u bispecifičnim konstruktima koji su opisani na Slici 17A. ScFv W4 je ligiran na dva različita bispecifična konstrukta (naizmenično u N- ili C-terminalnom smeru) koji imaju TNFα vezujući krak. Svaki W4TNFα bispecifični konstrukt (Bs1-TNFα/W4, Bs2-TNFα/W4 i Bs3-TNFα/W4) zadržao je sposobnost da inhibira vezivanje ćelija slično kao W4 koristeći PAO1.lux (O5) test što pokazuje da W4 scFv zadržava svoju aktivnost u bispecifičnom formatu. R347 je korišćen kao negativna kontrola.

Slika 19 (A-C): Anti-Psl i anti-PcrV vezujući domeni su kombinovani u bispecifičnom formatu zamenom TNFα antitela sa slike 17B sa V2L2. Ovi konstrukti su identični onima koji su prikazani na Slici 17B, osim što se nestabilizovani W4-scFv koristi umesto stabilizovanog W4-RAD scFv. I W4 i W4-RAD su usmereni na identične epitope i imaju identične funkcionalne aktivnosti. Procenat inhibicije citotoksičnosti je analiziran za BS2-V2L2 i BS3-V2L2 koristeći (A) 6206 i (B) 6206ΔpslA tretirane A549 ćelije. (C) BS2-V2L2, BS3-V2L2, i BS4-V2L2 su procenjeni na sposobnost da spreče lizu RBC u poređenju sa matičnom kontrolom. Svi bispecifični konstrukti su zadržali anti-citotoksičnu aktivnost sličnu matičnom V2L2 antitelu koristeći 6206 i 6206ΔpslA inficirane ćelije i sprečili su lizu RBC slično kao matična kontrola (V2L2). R347 je korišćen kao negativna kontrola u svim eksperimentima.

Slika 20 (A-C): Ispitivanje anti-Psl/anti-PcrV bispecifičnih konstrukata na promovisanje OPK P. aeruginosa. Test opsonofagocitoze je prikazan sa luminescentnom serogrupom P. aeruginosa soja O5 (PAO1.lux), sa razblaženjem prečišćenih Psl/TNFα bispecifičnih antitela (Bs2-TNFα i Bs3-TNFα); W4-RAD ili V2L2-IgG1 matičnih antitela; Psl/PcrV bispecifičnih antitela Bs2- V2L2 ili Bs3-V2L2, ili Bs2-V2L2-2C, Bs3-V2L2-2C, Bs4-V2L2-2C ili Bs4-V2L2-2C antitela koje nosi YTE mutaciju (Bs4-V2L2-2C-YTE). (A) Dok je Bs2-V2L2 antitelo pokazalo slično ubijanje u poređenju sa matičnim W4-RAD antitelom, ubijanje za Bs3-V2L2 antitelo je bilo smanjeno. (B) Dok su Bs2-V2L2-2C i Bs4-V2L2-2C antitela pokazala slično ubijanje u poređenju sa matičnim W4-RAD antitelom, ubijanje za Bs3-V2L2-2C antitelo je bilo smanjeno. (C) Nazivi W4-RAD i W4-RAD-YTE predstavljaju različite preparate W4-RAD. Nazivi Bs4-V2L2-2C (stara serija) i Bs4-V2L2-2C (nova serija), predstavljaju različite preparate Bs4-V2L2-2C. YTE modifikacija u Bs4-V2L2-2C-YTE je modifikacija načinjena na antitelima koja produžava poluživot antitela. Različiti preparati Bs4 antitela (stara serija u odnosu na novu seriju) prikazali su slično ubijanje u poređenju sa matičnim W4-RAD antitelom, međutim, Bs4-V2L2-2C-YTE antitela su imala 3-struki pad OPK aktivnosti u poređenju sa Bs4-V2L2-2C (vidite tabelu za EC50). R347 je korišćen kao negativna kontrola u svim eksperimentima.

Slika 21 (A-I): In vivo studija preživljavanja anti-Psl/anti-PcrV bispecifičnim antitelima Bs2-V2L2, Bs3-V2L2, Bs4-V2L2-2C i Bs4-V2L2-2C-YTE tretiranih miševa na 6206 sistemu

1

modela akutne pneumonije. Miševi (n=10) su tretirani sa (A): R347 (negativna kontrola 0,2 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,28 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,28 mg/kg), V2L2 (0,2 mg/kg) ili W4-RAD (0,2 mg/kg); (B-C): R347 (negativna kontrola, 1 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,5 mg/kg ili 1 mg/kg), ili Bs4-V2L2-2C (0,5 mg/kg ili 1 mg/kg); (D): R347 (negativna kontrola, 1 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,5 mg/kg ili 1 mg/kg), ili Bs4-V2L2-2C (0,5 mg/kg ili 1 mg/kg); (E): R347 (negativna kontrola, 2 mg/kg), kombinacijom pojedinačnih W4 i V2L2 antitela (0,5 mg/kg ili 1 mg/kg svako) ili Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ili 2 mg/kg); (F): R347 (negativna kontrola, 1 mg/kg), smešom pojedinačnih W4 i V2L2 antitela (0,5 mg/kg ili 1 mg/kg svako) ili Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ili 0,5 mg/kg). Dvadeset četiri sata nakon tretmana, svi miševi su inficirani sa ∼ (6,25x10<5>-1x10<6>CFU/životinji) 6206 (O11-ExoU+). Svi miševi su praćeni tokom 120 sati. (A): Svi kontrolni miševi su podlegli infekciji za približno 30 sati nakon infekcije. Sve Bs3-V2L2 životinje su preživele, zajedno sa onima koje su dobijale V2L2 kontrolu. Približno 90% W4-RAD imunizovanih životinja je preživelo. Nasuprot tome, približno 50% Bs2-V2L2 životinja je podleglo infekciji za 120 sati. (B-F): Svi kontrolni miševi su podlegli infekciji za približno 48 sati nakon infekcije. (B): Bs4-V2L2-2C je imalo veću aktivnost u poređenju sa Bs2-V2L2 pri 1,0 i 0,5 mg/kg. (C): Čini se da Bs4-V2L2-2C ima veću aktivnost u poređenju sa Bs2-V2L2 pri 1,0 mg/kg (rezultati nisu statistički značajni). (D): Bs4-V2L2-2C je imalo veću aktivnost u poređenju sa Bs3-V2L2 pri 0,5 mg/kg. (E): Bs4-V2L2-2C je sa 2 mg/kg i 1 kg/mg imalo veću aktivnost u poređenju sa smešom antitela sa 1,0 i 0,5 mg/kg. (F): Bs4-V2L2 (1 mg/kg) je imalo sličnu aktivnost i pri 1,0 i 0,5 mg/kg. (G-H): I Bs4-V2L2-2C i Bs4-V2L2-2C-YTE su imala sličnu aktivnost i pri 1,0 i 0,5 mg/kg. Rezultati su prikazani kao Kaplan-Majerove krive preživljavanja; razlike u preživljavanju su izračunate pomoću log-rank testa za (B) Bs4-V2L2-2C u odnosu na Bs2-V2L2 (1 mg/kg - P=0,034; 0,5 mg/kg - P=0,0002); (D) Bs4-V2L2-2C u odnosu na Bs3-V2L2 (0,5 mg/kg - P<0,0001); (E): Bs4-V2L2-2C (2 mg/kg) u odnosu na smešu antitela (1 mg/kg svako)-P=0,0012; Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg) u odnosu na smešu antitela (0,5 mg/kg svako)-P=0,0002. (G-H): Miševi (n=8) su tretirani sa: R347 (negativna kontrola, 1 mg/kg), Bs4-V2L2-2C (1 i 0,5 mg/kg), i Bs4-V2L2-2C-YTE (1 i 0,5 mg/kg) i 6206 (9e5 CFU). Nije uočena razlika u preživljavanju između Bs4-V2L2-2C i Bs4-V2L2-2C-YTE pri bilo kojoj dozi pomoću log-rank. (I): Kako bi se analizirala efikasnost svakog konstrukta antitela, miševi su tretirani sa 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg ili 15 mg/kg i analizirani na preživljavanje na modelu 6206 smrtonosne pneumonije. Procenat preživljavanja je prikazan u tabeli dok je broj životinja za svako poređenje prikazan u zagradi.

1

Slika 22: Analiza opterećenja organa anti-Psl/PcrV bispecifičnim antitelom tretiranih životinja koristeći 6206 model akutne pneumonije. Miševi su tretirani 24 sata pre infekcije sa 6206 (O11-ExoU+) sa R347 (negativna kontrola), samo V2L2 ili W4-RAD (0,2 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,28 mg/kg), ili BS3-V2L2 (0,28 mg/kg). Jedinice formiranja kolonije su identifikovane po gramu tkiva u plućima, slezini i bubregu. Pri testiranim koncentracijama, i Bs2-V2L2 i Bs3-V2L2 značajno smanjuju opterećenje organa kod pluća. Međutim, nijedan od bispecifičnih konstrukata nije bio sposoban da u velikoj meri utiče na opterećenje organa kod slezine ili bubrega u poređenju sa matičnim antitelima.

Slika 23 (A-B): Analiza opterećenja organa anti-Psl/PcrV bispecifičnim antitelom tretiranih životinja koristeći model sistema 6294. Miševi su tretirani 24 sata pre infekcije sa 6294 sa R347 (negativna kontrola), samo V2L2 ili W4-RAD (0,5 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,7 mg/kg), ili Bs3-V2L2 (0,7 mg/kg) (A), ili V2L2 ili W4-RAD samostalno (0,2 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,2 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,2 mg/kg) ili kombinacijom pojedinačnih W4-RAD i V2L2 antitela (0,1 mg/kg svako) (B). Dvadeset četiri sata nakon primene antitela, svi miševi su inficirani inokulumom koji sadrži 2,5 x 10<7>CFU 6294 (A) ili 1,72 x 10<7>CFU 6294 (B). Jedinice formiranja kolonije su identifikovane po gramu tkiva u plućima, slezini i bubregu. Koristeći model sistema 6294, (A) i BS2-V2L2 i BS3-V2L2 značajno smanjuju opterećenje organa u svim tkivima do nivoa koji je uporediv sa V2L2 matičnim antitelom. W4-RAD matično antitelo nije imalo dejstvo na smanjenje opterećenja organa. (B) Kombinacija Bs2-V2L2, Bs3-V2L2 i W4-RAD+V2L2 značajno smanjuje opterećenje organa u svim tkivima do nivoa koji je uporediv sa V2L2 matičnim antitelom.

Slika 24: In vivo studija preživljavanja Bs2-W4/V2L2 i Bs3-W4/V2L2-tretiranih miševa na modelu sistema 6294. Miševi su tretirani sa R347 (negativna kontrola, 0,2 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,28 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,28 mg/kg), V2L2 (0,2 mg/kg) ili W4-RAD (0,2 mg/kg).

Dvadeset četiri sata nakon tretmana, svi miševi su inficirani sa 6294. Svi miševi su praćeni tokom 120 sati. Svi kontrolni miševi su podlegli infekciji za približno 75 sati nakon infekcije. Šezdeset posto Bs3-V2L2 i 50% Bs2-V2L2 životinja je preživelo 120 sati nakon inokulacije. Kao što se moglo videti u studijama opterećenja organa, W4-RAD imunizacija nije uticala na preživljavanje, i svi miševi su podlegli infekciji u približno isto vreme kao i kontrolni.

Slika 25 (A-D): Analiza opterećenja organa kod anti-Psl/PcrV bispecifičnog antitela ili W4 V2L2 kombinovane terapije na modelu sistema 6206. Suboptimalne koncentracije antitela su korišćene (A-C) da se omogući dešifrovanje aktivnosti antitela. (D) Korišćene su velike koncentracije Bs4. Miševi su tretirani 24 sata pre infekcije sa 6206 sa R347 (negativna kontrola), samo V2L2 ili W4-RAD (0,2 mg/kg), Bs2-V2L2 (0,2 mg/kg), Bs3-V2L2 (0,2

1

mg/kg), Bs4 (15,0, 5,0 i 1,0 mg/kg) ili kombinacijom pojedinačnih W4 i V2L2 antitela (0,1 mg/kg svako). Dvadeset četiri sata nakon primene antitela, svi miševi su inficirani inokulumom koji sadrži (A), (B) 4,75 x 10<5>CFU 6206 (O11-ExoU+), ili (C) 7,75 x 10<5>CFU 6206 (O11-ExoU+) ili (D) 9,5 x 10<5>CFU 6206 (O11-ExoU+). Jedinice formiranja kolonije su identifikovane po gramu tkiva u plućima, slezini i bubregu. Koristeći model sistema 6206, i BS2-V2L2 i BS3-V2L2 smanjuju opterećenje organa u plućima, slezini i bubrezima do nivoa koji je uporediv sa kombinacijom W4 V2L2. U plućima, kombinacija je značajno smanjila broj bakterijskih CFU Bs2- i Bs3-V2L2 i V2L2 koristeći Kraskal-Volisov test uz Danov post test. Nisu uočene značajne razlike u bakterijskom opterećenju u slezini i bubrezima, mada je zabeležen trend ka smanjenju. (D) Kada su korišćene optimalne koncentracije Bs4-V2L2-2C (15,0, 5,0, i 1,0), uočen je brz i efikasan bakterijski klirens iz pluća. Pored toga, bakterijsko širenje na slezinu i bubrege je takođe ukinuto. Zvezdice obeležavaju statističku značajnost kada se poredi sa R347 kontrolnim antitelom koristeći Kraskal-Volisov test uz Danov post test.

Slika 26 (A-J): Terapeutska pomoćna terapija: Bs4-V2L2-2C antibiotik. (A)-(B) Miševi su tretirani 24 sata pre infekcije sa 1 x 10<6>CFU 6206 sa 0,5 mg/kg R347 (negativna kontrola) ili Bs4-V2L2-2C (0,2 mg/kg ili 0,5 mg/kg) ili ciprofloksacinom (CIP) (20 mg/kg ili 6,7 mg/kg) 1 sat nakon infekcije, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C 24 sata pre infekcije i CIP 1 sat nakon infekcije (0,5 mg/kg 20 mg/kg ili 0,5 mg/kg 6,7 mg/kg ili 0,2 mg/kg 20 mg/kg, odnosno 0,2 mg/kg 6,7 mg/kg). (C) Miševi su tretirani 1 sat nakon infekcije sa 9,5 x 10<5>CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 ili CIP (20 mg/kg ili 6,7 mg/kg) ili Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ili 5 mg/kg), ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i CIP (5 mg/kg 20 mg/kg ili 5 mg/kg 6,7 mg/kg ili 1 mg/kg 20 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 6,7 mg/kg). (D) Miševi su tretirani 2 sata nakon infekcije sa 9,5 x 10 CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 ili CIP (20 mg/kg ili 6,7 mg/kg) ili Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ili 5 mg/kg), ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i cipro (5 mg/kg 20 mg/kg ili 5 mg/kg 6,7 mg/kg ili 1 mg/kg 20 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 6,7 mg/kg). (E) Miševi su tretirani 2 sata nakon infekcije sa 9,75 x 10<5>CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 ili Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ili 5 mg/kg) ili CIP (20 mg/kg ili 6,7 mg/kg) 1 sat nakon infekcije, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C 2 sata nakon infekcije i CIP 1 sat nakon infekcije (5 mg/kg 20 mg/kg ili 5 mg/kg 6,7 mg/kg ili 1 mg/kg 20 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 6,7 mg/kg). (F) Miševi su tretirani 1 sat nakon infekcije sa 9,5 x 10<5>CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 ili meropenemom (MEM) (0,75 mg/kg ili 2,3 mg/kg) ili Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ili 5 mg/kg), ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i MEM (5 mg/kg 2,3 mg/kg ili 5 mg/kg 0,75 mg/kg ili 1 mg/kg 2,3 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 0,75 mg/kg). (G) Miševi su tretirani 2 sata nakon

1

infekcije sa 9,75 x 10<5>CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 ili Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ili 5 mg/kg) ili MEM (0,75 mg/kg ili 2,3 mg/kg) 1 sat nakon infekcije, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C 2 sata nakon infekcije i MEM 1 sat nakon infekcije (5 mg/kg 2,3 mg/kg ili 5 mg/kg 0,75 mg/kg ili 1 mg/kg 2,3 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 0,75 mg/kg). (H) Miševi su tretirani 2 sata nakon infekcije sa 1 x 10<6>CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 ili Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ili 5 mg/kg) ili MEM (0,75 mg/kg ili 2,3 mg/kg), ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C 2 i MEM (5 mg/kg 2,3 mg/kg ili 5 mg/kg 0,75 mg/kg ili 1 mg/kg 2,3 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 0,75 mg/kg). (I) Miševi su tretirani 4 sata nakon infekcije sa 9,25 x 10<5>CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 ili CIP (6,7 mg/kg) ili Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ili 5 mg/kg) ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i CIP (5 mg/kg 6,7 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 6,7 mg/kg), (J) Miševi su tretirani 4 sata nakon infekcije sa 1,2 x 10<6>CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 CIP (6,7 mg/kg), CIP (6,7 mg/kg), ili Bs4-V2L2-2C (1 mg/kg ili 5 mg/kg) ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i CIP (5 mg/kg 6,7 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 6,7 mg/kg). (A-J) Bs4 antitelo u kombinaciji sa CIP ili MEM povećava delotvornost terapije antibioticima, što ukazuje na sinergijsku zaštitu kada su molekuli kombinovani. Pored toga, iako antibiotik isporučen samostalno ili u kombinaciji sa antitelom nespecifičnim za P. aeruginosa može da smanji ili kontroliše bakterijske CFU u plućima, samo antibiotik ne štiti miševe od smrti u ovim uslovima. Optimalna zaštita u ovim uslovima zahteva uključivanje Bs4-V2L2-2C u kombinaciji sa antibiotikom.

Slika 27 (A-C): Razlika u funkcionalnoj aktivnosti bispecifičnih antitela BS4-WT, BS4-GL i BS4-GLO: test opsonofagocitnog ubijanja (A), test antićelijskog vezivanja (B) i test anticitotoksičnosti lize RBC (C).

Slika 28 (A-B): Procenat zaštite od smrtonosne pneumonije kod miševa izazvanih u profilaktičkim (A) ili terapeutskim (B) postavkama sojevima P. aeruginosa. Procenat preživljavanja je prikazan u tabeli dok je broj životinja za svako poređenje prikazan u zagradi. Kose crte ukazuju na izostanak testiranja.

Slika 29 (A-B): Stope preživljavanja za životinje koje su tretirane bispecifičnim antitelom Bs4-GLO na modelu smrtonosne bakteremije P. aeruginosa. (A) Životinje su tretirane pomoću Bs4-GLO sa 15 mg/kg, 5 mg/kg, 1 mg/kg ili sa R347, sa 15 mg/kg 24 sata pre intraperitonealne infekcije putem 6294 (O6) (5,58 x 10<7>CFU). (A) Životinje su tretirane pomoću Bs4-GLO sa 5 mg/kg, 1 mg/kg, 0,2 mg/kg ili pomoću R347 sa 5 mg/kg 24 sata pre intraperitonealne infekcije putem 6206 (O11-ExoU<+>) (6,48 x 10<6>CFU). Rezultati su predstavljeni kao Kaplan-Majerove krive preživljavanja; razlike u preživljavanju su izračunate pomoću log-rank testa za BS4-GLO pri svakoj koncentraciji u odnosu na R347. (A) Bs4-GLO pri svim koncentracijama u odnosu na R347 P<0,0001. (B) Bs4-GLO pri svim

1

koncentracijama u odnosu na R347 P=0,0003. Rezultati su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta.

Slika 30 (A-C): Stope preživljavanja za životinje koje su profilaktički tretirane (preventivno) sa Bs4-GLO na modelu termičke povrede P. aeruginosa. (A) Životinje su tretirane pomoću Bs4-GLO sa 15 mg/kg, 5 mg/kg ili pomoću R347 sa 15 mg/kg 24 sata pre izazivanja termičke povrede i supkutane infekcije putem P. aeruginosa soja 6077 (O11-ExoU<+>) sa 1,4 x 10<5>CFU neposredno ispod rane. (B) Životinje su tretirane pomoću Bs4-GLO sa 15 mg/kg ili pomoću R347 sa 15 mg/kg 24 sata pre izazivanja termičke povrede i supkutane infekcije putem P. aeruginosa soja 6206 (O11-ExoU<+>) sa 4,15 x 10<4>CFU neposredno ispod rane. (C) Životinje su tretirane pomoću Bs4-GLO sa 15 mg/kg, 5 mg/kg ili pomoću R347 sa 15 mg/kg 24 sata pre izazivanja termičke povrede i supkutane infekcije putem P. aeruginosa soja 6294 (O6) sa 7,5 x 10<1>CFU neposredno ispod rane. Rezultati su predstavljeni kao Kaplan-Majerove krive preživljavanja; razlike u preživljavanju su izračunate pomoću log-rank testa za Bs4-GLO pri svakoj koncentraciji u odnosu na R347. (A) Bs4-GLO pri svim koncentracijama u odnosu na R347 - P<0,0001. Rezultati su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta za svaki soj P. aeruginosa.

Slika 31 (A-B): Stope preživljavanja za životinje koje su terapeutski tretirane (lečene) sa Bs4-GLO na modelu termičke povrede P. aeruginosa. (A) Životinje su tretirane pomoću Bs4-GLO sa 42,6 mg/kg, 15 mg/kg ili pomoću R347 sa 45 mg/kg 4 sata nakon izazivanja termičke povrede i supkutane infekcije putem P. aeruginosa soja 6077 (O11-ExoU<+>) sa 1,6 x 10<5>CFU neposredno ispod rane. (B) Životinje su tretirane pomoću Bs4-GLO sa 15 mg/kg, 5 mg/kg ili pomoću R347 sa 15 mg/kg 12 sati nakon izazivanja termičke povrede i supkutane infekcije putem P. aeruginosa soja 6077 (O11-ExoU<+>) sa 1,0 x 10<5>CFU neposredno ispod rane. Rezultati su predstavljeni kao Kaplan-Majerove krive preživljavanja; razlike u preživljavanju su izračunate pomoću log-rank testa za BS4-GLO pri svakoj koncentraciji u odnosu na R347. (A) Bs4-GLO pri obe koncentracije u odnosu na R347 - P=0,0004. (B) Bs4-GLO sa 5 mg/kg u odnosu na R347 - P=0,048. Rezultati su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta.

Slika 32 (A-B): Terapeutska pomoćna terapija: Bs4GLO ciprofloksacin (CIP): (A) Miševi su tretirani 4 sata nakon infekcije putem 9,5 x 10<5>CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 CIP (6,7 mg/kg) ili Bs4-WT (1 mg/kg ili 5 mg/kg) ili kombinacijom Bs4-WT i CIP (5 mg/kg 6,7 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 6,7 mg/kg). (B) Miševi su tretirani 4 sata nakon infekcije putem 9,5 x 10<5>CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 CIP (6,7 mg/kg) ili Bs4-GLO (1 mg/kg ili 5 mg/kg) ili kombinacijom Bs4-GLO i CIP (5 mg/kg 6,7 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 6,7 mg/kg

2

Slika 33 (A-B): Terapeutska pomoćna terapija: Bs4-GLO meropenem (MEM): (A) Miševi su tretirani 4 sata nakon infekcije putem 9,5 x 10<5>CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 MEM (0,75 mg/kg) ili Bs4-WT (1 mg/kg ili 5 mg/kg) ili kombinacijom Bs4-WT i MEM (5 mg/kg 0,75 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 0,75 mg/kg). (B) Miševi su tretirani 4 sata nakon infekcije putem 9,5 x 10<5>CFU 6206 sa 5 mg/kg R347 MEM (0,75 mg/kg) ili Bs4-GLO (1 mg/kg ili 5 mg/kg) ili kombinacijom Bs4-GLO i MEM (5 mg/kg 0,75 mg/kg, odnosno 1 mg/kg 0,75 mg/kg).

Slika 34 (A-C): Terapeutska pomoćna terapija: Bs4-GLO antibiotik na modelu smrtonosne bakteremije. Miševi su tretirani 24 sata pre intraperitonealne infekcije putem P. aeruginosa soja 6294 (O6) 9,3 x 10<7>sa Bs4-GLO sa (0,25 mg/kg ili 0,5 mg/kg) ili R347 (negativna kontrola). Jedan sat nakon infekcije, miševi su supkutano tretirani sa (A) 1 mg/kg CIP, (B) 2,5 mg/kg MEM ili (C) 2,5 mg/kg TOB. Rezultati su predstavljeni kao Kaplan-Majerove krive preživljavanja; razlike u preživljavanju su izračunate pomoću log-rank testa za Bs4-GLO pri svakoj koncentraciji u odnosu na R347.

Slika 35 (A-B) Šematski prikaz alternativnih formata za Bs4 konstrukte (A) anti-PcrV varijabilni regioni su zasebno prisutni na teškim i lakim lancima dok su anti-Psl varijabilni regioni prisutni kao scFv u regionu šarke teškog lanca i (B) anti-Psl varijabilni regioni su zasebno prisutni na teškim i lakim lancima dok su anti-PcrV varijabilni regioni prisutni kao scFv u regionu šarke teškog lanca.

DETALJNI OPIS

I. DEFINICIJE

[0023] Jasno je da se termini za jedninu za entitet odnose na jedan ili više tih entiteta; na primer, jasno je da se „vezujući molekul koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV“ koristi da se predstavi jedan ili više vezujućih molekula koji se specifično vezuju za Pseudomonas Psl i/ili PcrV. Kao takvi, termini „jedan“, „jedan ili više“ i „najmanje jedan“ ovde se mogu koristiti naizmenično.

[0024] Kako se ovde koristi, termin „polipeptid“ treba da obuhvati pojedinačni „polipeptid“ kao i množinu „polipeptida“ i odnosi se na molekul sačinjen od monomera (aminokiselina) linearno povezanih putem amidnih veza (poznate i kao peptidne veze). Termin „polipeptid“ se odnosi na bilo koji lanac ili lance dve ili više aminokiselina, i ne odnosi se na specifičnu dužinu proizvoda. Tako, peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein“, „lanac aminokiselina“ ili bilo koji drugi termin koji se koristi da se ukaže na lanac ili lance dve ili više aminokiselina obuhvaćeni su definicijom „polipeptida“, i termin „polipeptid“ može da se koristi umesto bilo kog od ovih termina ili naizmenično sa njima. Termin „polipeptid“ takođe treba da označava proizvode postekspresionih modifikacija polipeptida, uključujući, bez ograničenja, glikozilaciju, acetilovanje, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju pomoću poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičko cepanje, ili modifikacije pomoću aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi. Polipeptid može da se dobije iz prirodnog biološkog izvora ili se proizvodi putem rekombinantne tehnologije, ali nije nužno preveden iz naznačene sekvence nukleinske kiseline. Može se stvoriti bilo kojim putem, uključujući hemijsku sintezu.

[0025] Polipeptid, kako je ovde otkriveno, može biti veličine od oko 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više, 200 ili više, 500 ili više, 1000 ili više ili 2000 ili više aminokiselina. Polipeptidi mogu da imaju definisanu trodimenzionalnu strukturu, mada ne moraju nužno imati takvu strukturu. Polipeptidi sa definisanom trodimenzionalnom strukturom se označavaju kao savijeni, a polipeptidi koji nemaju definisanu trodimenzionalnu strukturu, već mogu da zauzmu veliki broj različitih konformacija, nazivaju se nesavijeni. Kako se ovde koristi, termin glikoprotein se odnosi na protein koji je kuplovan sa najmanje jednim ugljovodoničnim ostatkom koji je vezan za protein putem bočnog lanca aminokiselinskog ostatka koji sadrži kiseonik ili azot, npr. serinski ostatak ili asparaginski ostatak.

[0026] Pod „izolovanim“ polipeptidom ili njegovim fragmentom, varijantom ili derivatom podrazumeva se polipeptid koji nije u svom prirodnom okruženju. Nije potreban određeni nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid može biti uklonjen iz svog nativnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini eksprimirani u ćelijama domaćina smatraju se izolovanim kako je ovde otkriveno, kao i nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani ili delimično ili značajno prečišćeni putem bilo koje odgovarajuće tehnike.

[0027] Drugi polipeptidi koji su ovde otkriveni su fragmenti, derivati, analozi ili varijante prethodnih polipeptida, i bilo koja njihova kombinacija. Termini „fragment“, „varijanta“, „derivat“ i „analog“, kada se odnose na vezujući molekul kao što je antitelo koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV kako je ovde otkriveno, obuhvataju bilo koje polipeptide koji zadržavaju barem deo antigen-vezujućih svojstava odgovarajućeg nativnog antitela ili polipeptida. Fragmenti polipeptida uključuju, na primer, proteolitičke fragmente, kao i delecione fragmente, pored specifičnih fragmenata antitela koji su razmotreni u drugim delovima ovog teksta. Varijante vezujućeg molekula, npr. antitelo koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV kako je ovde otkriveno, uključuju fragmente kao što je prethodno opisano, a takođe i polipeptide sa izmenjenim aminokiselinskim sekvencama usled aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija. Varijante se mogu javiti u prirodi, ili su one koje ne postoje u prirodi. Varijante koje se ne javljaju u prirodi mogu da se proizvedu korišćenjem tehnika mutageneze koje su poznate u struci. Varijante polipeptida mogu da sadrže konzervativne ili nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, delecije ili adicije. Derivati vezujućeg molekula, npr. antitelo koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV kako je ovde otkriveno, su polipeptidi koji su izmenjeni tako da ispoljavaju dodatna svojstva koja se ne mogu naći kod nativnog polipeptida. Primeri uključuju fuzione proteine. Varijante polipeptida ovde takođe mogu da se nazivaju i „polipeptidni analozi“. Kako se ovde koristi, „derivat“ vezujućeg molekula, npr. antitelo koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV odnosi se na predmetni polipeptid koji ima jedan ili više hemijski derivatizovanih ostataka putem reakcije funkcionalne bočne grupe. Kao „derivati“ su uključeni i oni peptidi koji sadrže jedan ili više prirodnih aminokiselinskih derivata dvadeset standardnih aminokiselina. Na primer, 4-hidroksiprolin može biti supstituisan na mestu prolina; 5-hidroksilizin može biti supstituisan na mestu lizina; 3-metilhistidin može biti supstituisan na mestu histidina; homoserin može biti supstituisan na mestu serina; i ornitin može biti supstituisan na mestu lizina.

[0028] Termin „polinukleotid“ treba da obuhvata pojedinačnu nukleinsku kiselinu kao i više nukleinskih kiselina, i odnosi se na izolovani molekul ili konstrukt nukleinske kiseline, npr. informacionu RNK (iRNK) ili plazmidnu DNK (pDNK). Polinukleotid može da sadrži konvencionalnu fosfodiestarsku vezu ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što se može naći u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK)). Termin „nukleinska kiselina“ označava jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. fragmente DNK ili RNK, prisutnih u polinukleotidu. Pod „izolovanom“ nukleinskom kiselinom ili polinukleotidom podrazumeva se molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog prirodnog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira vezujući molekul, npr. antitelo koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV, sadržan u vektoru smatra se izolovanim kako je ovde otkriveno. Dalji primeri izolovanog

2

polinukleotida uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterologim ćelijama domaćina, ili prečišćene (delimično ili značajno) polinukleotide u rastvoru.

Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro transkripte RNK polinukleotida.

Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline dalje uključuju takve molekule koji su sintetički proizvedeni. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu da budu ili da obuhvataju regulatorni element kao što je promoter, mesto vezivanja ribozoma ili terminator transkripcije.

[0029] Kako se ovde koristi, „kodirajući region“ je deo nukleinske kiseline koji se sastoji od kodona prevedenih u aminokiseline. Iako „zaustavni kodon“ (TAG, TGA ili TAA) nije preveden u aminokiselinu, on se može smatrati delom kodirajućeg regiona, ali bilo koje bočne sekvence, na primer promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Dva ili više kodirajućih regiona može biti prisutno u jednom polinukleotidnom konstruktu, npr. u jednom vektoru, ili u zasebnim polinukleotidnim konstruktima, npr. u zasebnim (različitim) vektorima. Nadalje, svaki vektor može da sadrži jedan kodirajući region, ili može da sadrži dva ili više kodirajućih regiona, npr. jedan vektor može zasebno da kodira varijabilni region teškog lanca imunoglobulina i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu da kodiraju heterologe kodirajuće regione, koji su fuzionisani ili nefuzionisani sa nukleinskom kiselinom koja kodira vezujući molekul koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat. Heterologi kodirajući regioni uključuju, bez ograničenja, specijalizovane elemente ili motive kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologi funkcionalni domen.

[0030] U određenim otelotvorenjima, polinukleotid ili nukleinska kiselina je DNK. U slučaju DNK, polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid uobičajeno može da obuhvata promoter i/ili druge kontrolne elemente transkripcije ili translacije koji su operativno povezani sa jednim ili više kodirajućih regiona. Operativna povezanost je kada je kodirajući region za genski proizvod, npr. polipeptid, povezan sa jednom ili više regulatornih sekvenci na takav način da stavlja ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulatornih sekvenci. Dva fragmenta DNK (kao što je kodirajući region polipeptida i sa njime povezani promoter) su „operativno povezani“ ako indukovanje funkcije promotera dovodi do transkripcije iRNK koja kodira željeni genski proizvod i ako priroda veze između dva fragmenta DNK ne ometa sposobnost ekspresione regulatorne sekvence da usmerava ekspresiju genskog proizvoda ili ne utiče na sposobnost šablona DNK da se transkribuje. Tako, promoterski region je operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid ako je promoter sposoban da sprovodi transkripciju te nukleinske kiseline.

Promoter može biti promoter specifičan za ćeliju koji usmerava znatnu transkripciju DNK samo u prethodno određenim ćelijama. Drugi kontrolni elementi transkripcije, osim promotera, na primer pojačivači, operatori, represori i signali za prekid transkripcije, mogu biti operativno povezani sa polinukleotidom radi usmeravanja transkripcije specifične za ćeliju. Odgovarajući promoteri i drugi transkripcioni kontrolni regioni su ovde prikazani.

[0031] Raznovrsni transkripcioni kontrolni regioni su poznati stručnjacima. Oni uključuju, bez ograničenja, transkripcione kontrolne regione koji deluju u ćelijama kičmenjaka, kao što su, bez ograničenja, segmenti promotera i pojačivača iz citomegalovirusa (neposredni rani promoter u konjunkciji sa intronom-A), simijan virusa 40 (rani promoter) i retrovirusa (kao što je Rausov virus sarkoma). Drugi transkripcioni kontrolni regioni uključuju one koji su dobijeni od gena kičmenjaka kao što je aktin, protein toplotnog šoka, goveđi hormon rasta i zečji β-globin, kao i druge sekvence sposobne da kontrolišu ekspresiju gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni odgovarajući transkripcioni kontrolni regioni uključuju promotere i pojačivače specifične za tkivo, kao i promotere koji se mogu indukovati limfokinom (npr. promoteri koji se mogu indukovati putem interferona ili interleukina).

[0032] Slično tome, raznovrsni translacioni kontrolni elementi su poznati osobama sa uobičajenim veštinama u struci. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, mesta vezivanja ribozoma, kodone za pokretanje i završetak translacije, i elemente dobijene od pikornakvirusa (naročito interno mesto ulaska ribozoma, ili IRES (internal ribosome entry site), koje se naziva i CITE sekvenca).

[0033] U drugim otelotvorenjima, polinukleotid može biti RNK, na primer, u obliku informacione RNK (iRNK).

[0034] Regioni koji kodiraju polinukleotid i nukleinsku kiselinu mogu biti povezani sa dodatnim kodirajućim regionima koji kodiraju sekretorne ili signalne peptide, koji usmeravaju sekreciju polipeptida kodiranog sa polinukleotidom kako je ovde otkriveno, npr. polinukleotid koji kodira vezujući molekul koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat. Prema signalnoj

2

hipotezi, proteini izlučeni od strane ćelija sisara imaju signalni peptid ili sekretornu vodeću sekvencu koja je otcepljena od zrelog proteina kada započne izvoz rastućeg proteinskog lanca kroz hrapavi endoplazmatični retikulum. Osobe sa uobičajenim veštinama u struci znaju da polipeptidi koje luče ćelije kičmenjaka obično imaju signalni peptid fuzionisan sa N-terminusom polipeptida, koji se otcepljuje od polipeptida koji je ceo ili „kompletne dužine“ kako bi se proizveo izlučeni ili „zreli“ oblik polipeptida. U određenim otelotvorenjima, koristi se nativni signalni peptid, npr. signalni peptid teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulina, ili funkcionalni derivat te sekvence koji zadržava sposobnost da usmerava izlučivanje polipeptida koji je operativno povezan sa njim. Alternativno, mogu da se koriste heterologi signalni peptid sisara ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, vodeća sekvenca divljeg tipa može da se supstituiše vodećom sekvencom ljudskog tkivnog plazminogenog aktivatora (TPA) ili mišje β-glukuronidaze.

[0035] Ovde su otkriveni određeni vezujući molekuli ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati. Osim ako se specifično ne odnosi na antitela u punoj veličini poput antitela koja se javljaju u prirodi, termin „vezujući molekul“ obuhvata antitela u punoj veličini kao i antigen-vezujuće fragmente, varijante, analoge ili derivate takvih antitela, npr. antitelo koje se javlja u prirodi ili molekuli imunoglobulina ili konstruisani molekuli antitela ili fragmenti koji vezuju antigen na način sličan molekulima antitela.

[0036] Kako se ovde koristi, termin „vezujući molekul“ se u svom najširem smislu odnosi na molekul koji specifično vezuje antigenu determinantu. Kao što je ovde dalje opisano, vezujući molekul može da sadrži jedan ili više ovde opisanih vezujućih domena. Kako se ovde koristi, „vezujući domen“ obuhvata mesto koje se specifično vezuje za antigenu determinantu. Neograničavajući primer antigen-vezujućeg molekula je antitelo ili njegov fragment koji zadržava antigen-specifično vezivanje.

[0037] Termini „antitelo“ i „imunoglobulin“ ovde mogu da se koriste naizmenično. Antitelo (ili njegov fragment, varijanta ili derivat, kako je ovde otkriveno) sadrži barem varijabilni domen teškog lanca i barem varijabilne domene teškog lanca i lakog lanca. Osnovne strukture imunoglobulina u sistemima kičmenjaka su relativno dobro proučene. Videti, npr. Harlow i sar. Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd.1988).

2

[0038] Kao što će u nastavku biti detaljnije razmotreno, termin „imunoglobulin“ obuhvata različite obimne klase polipeptida koje mogu da se razlikuju biohemijski. Stručnjacima je poznato da se teški lanci klasifikuju kao gama, mi, alfa, delta ili epsilon (γ, µ, α, δ, ε), uz postojanje određenih potklasa (npr. γ1-γ4). Priroda ovog lanca je ta koja određuje „klasu“ antitela kao IgG, IgM, IgA IgG, odnosno IgE. Potklase imunoglobulina (izotipovi), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, itd., dobro su okarakterisane i poznato je da daju funkcionalnu specijalizaciju. Modifikovane verzije svake od ovih klasa i izotipova stručnjak lako može da razlikuje u pogledu ovog predmetnog otkrića i, shodno tome, nalaze se u opsegu ovog otkrića.

[0039] Laki lanci su klasifikovani kao kapa ili lambda (κ, λ). Svaka klasa teškog lanca može da se vezuje sa kapa ili lambda lakim lancem. Uopšteno, laki i teški lanci su međusobno kovalentno vezani, a „repni“ delovi dva teška lanca su međusobno vezani putem kovalentnih disulfidnih veza ili nekovalentnih veza kada su imunoglobulini stvoreni putem hibridoma, B ćelija ili genetski modifikovanih ćelija domaćina. U teškom lancu, aminokiselinske sekvence idu od N-terminusa na razgranatim krajevima račvaste konfiguracije do C-terminusa na kraju svakog lanca.

[0040] I laki i teški lanci su podeljeni u regione strukturne i funkcionalne homologije.

Termini „konstantni“ i „varijabilni“ se funkcionalno koriste. U tom pogledu, biće jasno da varijabilni domeni delova lakog (VL) i teškog lanca (VH) određuju prepoznavanje antigena i specifičnost. Suprotno tome, konstantni domeni lakog lanca (CL) i teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) daju važna biološka svojstva, kao što su sekrecija, transplacentalna mobilnost, vezivanje Fc receptora, komplementno vezivanje, i slično. Po konvenciji, numeracija domena konstantnog regiona raste sa njihovim udaljavanjem od mesta vezivanja antigena ili aminoterminusa antitela. N-terminalni deo je varijabilni region, a na C-terminalnom delu je konstantni region; CH3 i CL domeni zapravo sadrže karboksi-terminus teškog, odnosno lakog lanca.

[0041] Kao što je prethodno naznačeno, varijabilni region omogućava vezujućem molekulu da selektivno prepoznaje i specifično vezuje epitope na antigenima. To jest, VL domen i VH domen, ili podskup regiona za određivanje komplementarnosti (CDR), vezujućeg molekula, npr. antitela, kombinuju se da formiraju varijabilni region koji definiše trodimenzionalno mesto vezivanja antigena. Ova kvaternerna vezujuća struktura molekula gradi mesto

2

vezivanja antigena na kraju svakog kraka Y. Specifičnije, mesto vezivanja antigena je definisano sa tri CDR-a na svakom od lanaca VH i VL.

[0042] Kod antitela koja se javljaju u prirodi, šest „regiona za određivanje komplementarnosti“ ili „CDR“ koji su prisutni u svakom antigen-vezujućem domenu su kratke, neuzastopne sekvence aminokiselina koje su specifično pozicionirane da grade antigen-vezujući domen dok antitelo poprima svoju trodimenzionalnu konfiguraciju u vodenom okruženju. Preostale aminokiseline u antigen-vezujućim domenima, koje se nazivaju regioni „okvira“, pokazuju manju intermolekulsku varijabilnost. Regioni okvira uglavnom poprimaju konformaciju β-ravni i CDR grade petlje koje povezuju strukturu βravni, a u nekim slučajevima čine njen deo. Tako, regioni okvira grade konstrukciju koja obezbeđuje pozicioniranje CDR-a u pravilnom smeru putem međulančanih, nekovalentnih interakcija. Antigen-vezujući domen koji grade pozicionirani CDR definiše komplementarnost površine sa epitopom na imunoreaktivnom antigenu. Ova komplementarna površina promoviše nekovalentno vezivanje antitela za njegov srodni epitop. Prosečno obučeni stručnjak lako može da identifikuje aminokiseline koje sadrže CDR, odnosno regione okvira, za bilo koji varijabilni region teškog ili lakog lanca, pošto su one precizno definisane (vidite „Sequences of Proteins of Immunological Interest,“ Kabat, E., i sar. U.S. Department of Health and Human Services, (1983); i Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 796:901-917 (1987).

[0043] U slučaju kada postoji dve ili više definicija pojma koji se koristi i/ili je prihvaćen u struci, ovde korišćena definicija pojma je predviđena da obuhvati sva takva značenja, ako nije izričito navedeno drugačije ili suprotno. Specifičan primer je upotreba pojma „region za određivanje komplementarnosti“ („CDR“) da bi se opisala nesusedna mesta kombinovanja antigena koja se nalaze u varijabilnom regionu polipeptida teškog i lakog lanca. Ovaj konkretan region su opisali Kabat i sar. U.S. Dept. of Health and Human Services, „Sequences of Proteins of Immunological Interest“ (1983) i Chothia i sar. J. Mol. Biol.

196:901-917 (1987), gde definicija uključuje preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka kada se međusobno porede. Bez obzira na to, primena bilo koje definicije da se odnosi na region određivanja komplementarnosti (CDR) antitela ili njegove varijante je predviđena da bude unutar obima pojma kako je definisano i korišćeno ovde. Odgovarajući ostaci aminokiseline koji obuhvataju CDR, kako je definisano svakom od gore citiranih referenci, izneti su dole u Tabeli I kao poređenje. Tačan broj ostataka koje obuhvata

2

specifičan CDR će se razlikovati zavisno od sekvence i veličine CDR-a. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci obuhvataju specifični CDR na osnovu sekvence aminokiseline varijabilnog regiona antitela.

TABELA 1: Definicije<1>CDR

[0044] Kabat i sar. su takođe definisali sistem numerisanja za sekvence varijabilnog domena koji je primenljiv na bilo koje antitelo. Običan stručnjak u ovoj oblasti može nepogrešivo da dodeli ovaj sistem „Kabatove numeracije“ bilo kojoj sekvenci promenljivog domena, a da se ne oslanja na bilo koje eksperimentalne podatke izvan same sekvence. Kao što se ovde koristi, „Kabatova numeracija“ se odnosi na sistem numerisanja koji su izneli Kabat i sar. U.S. Dept. of Health and Human Services, „Sequence of Proteins of Immunological Interest“ (1983). Ako nije drugačije naznačeno, reference na numerisanje specifičnih pozicija aminokiselinskih ostataka u vezujućem molekulu koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat, kako je ovde otkriveno, su prema Kabatovom sistemu numerisanja.

[0045] Vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati uključuju, bez ograničenja, poliklonska, monoklonska, humana, humanizovana ili himerna antitela, jednolančana antitela, epitop-vezujuće fragmente, npr. Fab, Fab' i F(ab')2, Fd, Fv, jednolančane Fv (scFv), jednolančana antitela, disulfidno vezane Fv (sdFv), fragmente koji sadrže VL ili VH domen, fragmente proizvedene putem ekspresione

2

biblioteke Fab. Molekuli ScFv su poznati u struci i opisani su, npr. u US patentu 5,892,019. Molekuli imunoglobulina ili antitela obuhvaćeni ovim otkrićem mogu biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili potklase molekula imunoglobulina.

[0046] Pod „specifično vezuje“, uobičajeno se podrazumeva da se vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, vezuje za epitop putem svog antigen vezujućeg domena, i da vezivanje podrazumeva određenu komplementarnost između antigen vezujućeg domena i epitopa. Prema ovoj definiciji, za vezujući molekul se kaže da se „specifično vezuje“ za epitop kada se vezuje za taj epitop putem svog antigen vezujućeg domena lakše nego što bi se vezao za nasumični, nevezani epitop. Termin „specifičnost“ se ovde koristi da se odredi relativni afinitet sa kojim se određeni vezujući molekul vezuje za određeni epitop. Na primer, za vezujući molekul „A“ se može reći da ima veću specifičnost prema datom epitopu nego vezujući molekul „B“, ili se može reći da se vezujući molekul „A“ vezuje za epitop „C“ sa većom specifičnošću nego što je ima prema povezanom epitopu „D“.

[0047] „Preferencijalno vezuje“ znači da se antitelo specifično vezuje za epitop lakše nego što bi se vezalo za povezani, slični, homologni ili analogni epitop. Dakle, antitelo koje se „preferencijalno vezuje“ za dati epitop će se verovatnije vezati za taj epitop nego za povezani epitop, iako takvo antitelo može unakrsno da reaguje sa povezanim epitopom.

[0048] Kao neograničavajući primer, može se smatrati da vezujući molekul, npr. antitelo, preferencijalno vezuje prvi epitop ako vezuje navedeni prvi epitop sa konstantom disocijacije (KD) koja je manja od KDantitela za drugi epitop. U drugom neograničavajućem primeru, može se smatrati da vezujući molekul kao što je antitelo preferencijalno vezuje prvi antigen ako vezuje prvi epitop sa afinitetom koji je najmanje jedan red veličine manji od KDantitela za drugi epitop. U drugom neograničavajućem primeru, može se smatrati da vezujući molekul preferencijalno vezuje prvi epitop ako vezuje prvi epitop sa afinitetom koji je najmanje dva reda veličine manji od KDantitela za drugi epitop.

[0049] U drugom neograničavajućem primeru, može se smatrati da vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, preferencijalno vezuje prvi epitop ako vezuje prvi epitop sa brzinom disocijacije (k(off)) koja je manja od k(off) antitela za drugi epitop. U drugom neograničavajućem primeru, može se smatrati da vezujući molekul preferencijalno vezuje prvi epitop ako vezuje prvi epitop sa afinitetom koji je najmanje jedan red veličine manji od k(off) antitela za drugi epitop. U drugom neograničavajućem primeru, može se smatrati da vezujući molekul preferencijalno vezuje prvi epitop ako vezuje prvi epitop sa afinitetom koji je najmanje dva reda veličine manji od k(off) antitela za drugi epitop.

[0050] Može se reći da vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat koji su ovde otkriveni, vezuje ciljni antigen, npr. ovde prikazani polisaharid ili njegov fragment ili varijantu, sa brzinom disocijacije (k(off)) koja je manja ili jednaka 5 X 10<-2>s<-1>, 10<-1>s<-1>, 5 X 10<-3>s<-1>ili 10<-3>s<-1>. Može se reći da vezujući molekul, kako je ovde otkriven, vezuje ciljni antigen, npr. polisaharid, sa brzinom disocijacije (k(off)) koja je manja ili jednaka 5 X 10<-4>s<-1>, 10<-4>s<-1>, 5 X 10<-5>s<-1>ili 10<-5>s<-1>5 X 10<-6>s<-1>, 10<-6>s<-1>, 5 X 10<-7>s<-1>ili 10<-7>s<-1>.

[0051] Može se reći da vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov ovde prikazan antigenvezujući fragment, varijanta ili derivat, vezuje ciljni antigen, npr. polisaharid, brzinom asocijacije (k(on)) koja je veća ili jednaka 10<3>M<-1>s<-1>, 5 X 10<3>M<-1>s<-1>, 10<4>M<-1>s<-1>ili 5 X 10<4>M<-1>s<-1>. Može se reći da vezujući molekul, kako je ovde otkriven, vezuje ciljni antigen, npr. polisaharid, brzinom asocijacije (k(on)) koja je veća ili jednaka 10<5>M<-1>s<- 1>, 5 X 10<5>M<-1>s<-1>, 10<6>M<-1>s<-1>ili 5 X 10<6>M<-1>s<-1>ili 10<7>M<-1>s<-1>.

[0052] Kaže se da vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, kompetitivno inhibira vezivanje referentnog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta za dati epitop ako se preferencijalno vezuje za taj epitop u tolikoj meri da blokira, do određenog stepena, vezivanje referentnog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta za epitop.

Kompetitivna inhibicija može da se utvrdi bilo kojim postupkom koji je poznat u struci, na primer, kompetitivnim ELISA testovima. Može se reći da vezujući molekul kompetitivno inhibira vezivanje referentnog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta za dati epitop za najmanje 90%, najmanje 80%, najmanje 70%, najmanje 60% ili najmanje 50%.

[0053] Kako se ovde koristi, termin „afinitet“ se odnosi na jačinu vezivanja pojedinačnog epitopa za CDR molekula imunoglobulina. Vidite, npr. Harlow i sar. Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd.1988) strana 27-28. Kako se ovde koristi, termin „avidnost“ se odnosi na sveukupnu stabilnost kompleksa između populacije imunoglobulina i antigena, to jest, na funkcionalnu kombinovanu jačinu smeše

1

imunoglobulina sa antigenom. Vidite, npr. Harlow na strani 29-34. Avidnost je povezana sa afinitetom pojedinačnih molekula imunoglobulina u populaciji sa specifičnim epitopima, a takođe i sa valencama imunoglobulina i antigena. Na primer, interakcije između dvovalentnog monoklonskog antitela i antigena sa veoma ponavljajućom strukturom epitopa, kao što je polimer, bila bi interakcija sa velikom avidnošću.

[0054] Vezujući molekuli ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati, kako su ovde prikazani, takođe mogu da se opišu ili naznače u pogledu unakrsne reaktivnosti. Kako se ovde koristi, termin „unakrsna reaktivnost“ odnosi se na sposobnost vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata, specifičnog za jedan antigen, da reaguje sa drugim antigenom; mera srodnosti između dve različite antigene supstance. Tako, vezujući molekul je unakrsno reaktivan ako se vezuje za epitop koji nije onaj koji je indukovao njegov nastanak. Unakrsno reaktivni epitop generalno obuhvata mnogo istih komplementarnih strukturnih karakteristika kao indukujući epitop, a u nekim slučajevima, može zapravo da se uklapa bolje nego original.

[0055] Vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, može takođe da se opiše ili naznači u pogledu afiniteta vezivanja za antigen. Na primer, vezujući molekul može da se vezuje za antigen sa konstantom disocijacije ili KDkoja nije veća od 5 x 10<-2>M, 10<-2>M, 5 x 10<-3>M, 10<-3>M, 5 x 10<-4>M, 10<-4>M, 5 x 10<-5>M, 10<-5>M, 5 x 10<-6>M, 10<-6>M, 5 x 10<-7>M, 10<-7>M, 5 x 10<-8>M, 10<-8>M, 5 x 10<-9>M, 10<-9>M, 5 x 10<-10>M, 10<-10>M, 5 x 10<-11>M, 10<-11>M, 5 x 10<-12>M, 10<-12>M, 5 x 10<-13>M, 10<-13>M, 5 x 10<-14>M, 10<-14>M, 5 x 10<-15>M, ili 10<-15>M.

[0056] Fragmenti antitela, uključujući jednolančana antitela, mogu da sadrže varijabilne regione samostalno ili u kombinaciji sa celinom ili delom od sledećeg: regiona šarke, domena CH1, CH2 i CH3. Takođe su uključeni antigen-vezujući fragmenti koji takođe sadrže bilo koju kombinaciju varijabilnih regiona sa regionom šarke i domenima CH1, CH2 i CH3.

Vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi ovde prikazani antigen-vezujući fragmenti, mogu biti bilo kog životinjskog porekla, uključujući ptice i sisare. Antitela mogu biti ljudska, mišja, magareća, zečja, kozja, zamorca, kamile, lame, konjska ili kokošja antitela. U drugom otelotvorenju, varijabilni region može biti poreklom od košljoriba (npr. ajkula). Kako se ovde koristi, „humana“ antitela uključuju antitela koja imaju aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i uključuju antitela izolovana iz bibilioteka humanog imunoglobulina ili iz životinja transgenih za jedan ili više humanih imunoglobulina, koja ne eksprimiraju endogene

2

imunoglobuline, kako je opisano ispod i, na primer, u U.S. Pat. br.5,939,598 čiji su autori Kucherlapati i sar.

[0057] Kako se ovde koristi, termin „deo teškog lanca“ uključuje aminokiselinske sekvence dobijene od teškog lanca imunoglobulina, vezujući molekul, npr. antitelo koje sadrži deo teškog lanca obuhvata najmanje jedan od: domena CH1, domena šarke (npr. gornji, srednji i/ili donji region šarke), domena CH2, domena CH3 ili njihovih varijanti ili fragmenata. Na primer, vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, može da sadrži lanac polipeptida koji sadrži domen CH1; lanac polipeptida koji sadrži domen CH1, barem deo domena šarke i domen CH2; lanac polipeptida koji sadrži domen CH1 i domen CH3; lanac polipeptida koji sadrži domen CH1, barem deo domena šarke i domen CH3, ili lanac polipeptida koji sadrži domen CH1, barem deo domena šarke, domen CH2 i domen CH3. U drugom otelotvorenju, vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, sadrži lanac polipeptida koji sadrži domen CH3. Nadalje, vezujućem molekulu za upotrebu u otkriću može da nedostaje barem deo domena CH2 (npr. ceo domen ili deo domena CH2). Kao što je prethodno rečeno, stručnjaku sa prosečnim znanjem će biti jasno da ovi domeni (npr. delovi teškog lanca) mogu da se modifikuju tako da se razlikuju po aminokiselinskoj sekvenci od molekula imunoglobulina koji se javlja u prirodi.

[0058] Delovi teškog lanca vezujućeg molekula, npr. antitelo kao što je ovde prikazano, mogu se dobiti od različitih molekula imunoglobulina. Na primer, deo teškog lanca polipeptida može da sadrži CH1 domen dobijen od molekula IgG1 i region šarke dobijen od molekula IgG3. U drugom primeru, deo teškog lanca može da sadrži region šarke dobijen, delimično, od molekula IgG1 i, delimično, od molekula IgG3. U drugom primeru, deo teškog lanca može da sadrži himernu šarku dobijenu, delimično, od molekula IgG1 i, delimično, od molekula IgG4.

[0059] Kako se ovde koristi, termin „deo lakog lanca“ uključuje aminokiselinske sekvence dobijene od lakog lanca imunoglobulina. Deo lakog lanca sadrži najmanje jedan od VL ili CL domena.

[0060] Vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati prikazani ovde, mogu se opisati ili naznačiti u pogledu epitopa ili delova antigena, npr. ciljni polisaharid koji prepoznaju ili ga specifično vezuju. Deo ciljnog polisaharida koji specifično interaguje sa antigen vezujućim domenom antitela je „epitop“ ili „antigenska determinanta“. Ciljni antigen, npr. polisaharid, može da sadrži jedan epitop, ali obično sadrži najmanje dva epitopa i može da uključuje bilo koji broj epitopa, u zavisnosti od veličine, konformacije i tipa antigena.

[0061] Kao što je prethodno naznačeno, strukture podjedinica i trodimenzionalna konfiguracija konstantnih regiona različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate. Kako se ovde koristi, termin „VH domen“ uključuje amino terminalni varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, a termin „CH1 domen“ uključuje prvi (krajnji amino terminalni) domen konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina. CH1 domen je pored VH domena i amino terminalan je u odnosu na region šarke molekula teškog lanca imunoglobulina.

[0062] Kako se ovde koristi, termin „CH2 domen“ uključuje deo molekula teškog lanca koji se proteže, npr. otprilike od ostatka 244 do ostatka 360 antitela koristeći konvencionalne šeme za numeraciju (ostaci 244 do 360, Kabatov sistem numeracije, i ostaci 231-340, EU sistem numeracije, vidite Kabat EA i sar. op. cit. CH2 domen je jedinstven po tome što nije blisko sparen sa drugim domenom. Umesto toga, dva N-povezana razgranata ugljovodonična lanca su umetnuta između dva CH2 domena netaknutog nativnog molekula IgG. Takođe je temeljno dokumentovano da se CH3 domen pruža od CH2 domena do C-kraja molekula IgG i sadrži približno 108 ostataka.

[0063] Kako se ovde koristi, termin „region šarke“ uključuje deo molekula teškog lanca koji spaja CH1 domen sa CH2 domenom. Ovaj region šarke sadrži približno 25 ostataka i fleksibilan je, te tako omogućava da se dva N-terminalna antigen vezujuća regiona nezavisno kreću. Regioni šarke mogu biti dalje podeljeni u tri različita domena: gornji, srednji i donji region šarke (Roux i sar., J. Immunol.161:4083 (1998)).

[0064] Kako se ovde koristi, termin „disulfidna veza“ obuhvata kovalentnu vezu nastalu između dva atoma sumpora. Aminokiselina cistein sadrži tiolnu grupu koja može da gradi disulfidnu vezu ili most sa drugom tiolnom grupom. U najprirodnijim molekulima IgG, regioni CH1 i CL su povezani putem disulfidne veze i dva teška lanca su povezana putem dve disulfidne veze na pozicijama koje odgovaraju 239 i 242 koristeći Kabatov sistem numerisanja (pozicija 226 ili 229, EU sistem numerisanja).

4

[0065] Kako se ovde koristi, termin „himerno antitelo“ će označavati bilo koje antitelo u kome je imunoreaktivni region ili mesto dobijeno ili izvedeno od prve vrste, a konstantni region (koji može biti netaknut, parcijalni ili modifikovani) dobijen je od druge vrste. U nekim otelotvorenjima, ciljni vezujući region ili mesto će biti iz nehumanog izvora (npr. miša ili primata), a konstantni region je ljudski.

[0066] Termin „bispecifično antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje ima mesta vezivanja za dva različita antigena u okviru jednog molekula antitela. Biće jasno da se drugi molekuli osim kanonske strukture antitela mogu konstruisati sa dve vezujuće specifičnosti. Dalje će biti jasno da vezivanje antigena putem bispecifičnih antitela može biti simultano ili sekvencijalno. Triomi i hibridni hibridomi su dva primera ćelijskih linija koje mogu da izlučuju bispecifična antitela. Bispecifična antitela takođe mogu da se konstruišu rekombinantnim putem. (Ströhlein i Heiss, Future Oncol.6:1387-94 (2010); Mabry i Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010)).

[0067] Kako se ovde koristi, termin „konstruisano antitelo“ se odnosi na antitelo u kome je varijabilni domen u teškom ili lakom lancu ili u oba izmenjen putem barem delimične zamene jednog ili više CDR-a iz antitela poznate specifičnosti i, ako je neophodno, delimičnom zamenom regiona okvira i promenom sekvence. Iako CDR može biti izveden iz antitela iste klase ili čak potklase kao antitelo iz kog su izvedeni regioni okvira, predviđeno je da će CDR biti izvedeni iz antitela različite klase i poželjno iz antitela različite vrste.

Konstruisano antitelo u kome je jedan ili više „donorskih“ CDR iz nehumanog antitela poznate specifičnosti graftovano u region okvira humanog teškog ili lakog lanca ovde se naziva „humanizovano antitelo“. Ne mora biti neophodno da se zamene svi CDR sa kompletnim CDR iz donorskog varijabilnog regiona da bi se preneo kapacitet za vezivanje antigena jednog varijabilnog domena na drugi. Pre će jedino može biti neophodno da se prenesu oni ostaci koji su neophodni za održavanje aktivnosti mesta za vezivanje antigena. Pošto su objašnjenja data, npr. u U.S. Pat. br.5,585,089, 5,693,761, 5,693,762 i 6,180,370, stručnjaci će biti u mogućnosti da dobiju funkcionalno konstruisano ili humanizovano antitelo, bilo putem izvođenja rutinskih eksperimenata ili testiranjem postupkom probe i greške.

[0068] Kako se ovde koristi, termin „ispravno savijeni polipeptid“ uključuje polipeptide (npr. anti-Pseudomonas Psl i PcrV antitela) u kojima su svi funkcionalni domeni koji sadrže polipeptid izrazito aktivni. Kako se ovde koristi, termin „neispravno savijeni polipeptid“ uključuje polipeptide u kojima najmanje jedan od funkcionalnih domena polipeptida nije aktivan. U jednom otelotvorenju, ispravno savijeni polipeptid sadrži lance polipeptida koji su povezani putem najmanje jedne disulfidne veze, a, suprotno tome, neispravno savijeni polipeptid sadrži lance polipeptida koji nisu povezani putem najmanje jedne disulfidne veze.

[0069] Kako se ovde koristi, termin „konstruisano“ obuhvata obradu molekula nukleinske kiseline ili polipeptida sintetičkim putem (npr. pomoću rekombinantnih tehnika, in vitro sinteze peptida, putem enzimskog ili hemijskog kuplovanja peptida ili neke kombinacije ovih tehnika).

[0070] Kako se ovde koriste, termini „povezan“, „fuzionisan“ ili „fuzija“ koriste se naizmenično. Ovi termini se odnose na spajanje dva ili više elemenata ili komponenata, bilo kojim putem, uključujući hemijsku konjugaciju ili rekombinantne metode. „Fuzija u okviru“ se odnosi na spajanje dva ili više otvorenih okvira za čitanje (open reading frame, ORF) polinukleotida kako bi nastao neprekidan duži ORF, na način koji održava pravi translacioni okvir za čitanje prvobitnih ORF. Tako, rekombinantni fuzioni protein je jedan protein koji sadrži dva ili više segmenata koji odgovaraju polipeptidima koji su kodirani pomoću prvobitnih ORF (ti segmenti obično nisu tako spojeni u prirodi). Mada je okvir za čitanje na ovaj način postao neprekidan u fuzionisanim segmentima, segmenti mogu biti fizički ili prostorno razdvojeni pomoću, na primer, sekvence linkera u okviru. Na primer, polinukleotidi koji kodiraju CDR-e varijabilnog regiona imunoglobulina mogu biti fuzionisani, u okviru, ali razdvojeni putem polinukleotida koji kodira najmanje jedan region okvira imunoglobulina ili dodatne regione CDR, sve dok su „fuzionisani“ CDR zajedno prevedeni kao deo neprekidnog polipeptida.

[0071] U kontekstu polipeptida, „linearna sekvenca“ ili „sekvenca“ je redosled aminokiselina u polipeptidu u smeru od amino do karboksilnog terminusa u kome su susedni ostaci u sekvenci uzastopni u primarnoj strukturi polipeptida.

[0072] Termin „ekspresija“, kako se ovde koristi, odnosi se na proces putem kojeg gen proizvodi biohemijski proizvod, na primer, polipeptid. Proces obuhvata svaku manifestaciju funkcionalnog prisustva gena u ćeliji, uključujući, bez ograničenja, izbacivanje gena, kao i prolaznu ekspresiju i stabilnu ekspresiju. On obuhvata, bez ograničenja, transkripciju gena u informacionu RNK (iRNK) i translaciju takve iRNK u polipeptid(e). Ako je konačni željeni proizvod biohemijski, ekspresija obuhvata stvaranje tog biohemijskog proizvoda i bilo kojih prekursora. Ekspresija gena daje „genski proizvod“. Kako se ovde koristi, genski proizvod može biti nukleinska kiselina, npr. informaciona RNK proizvedena transkripcijom gena, ili polipeptid koji je preveden iz transkripta. Ovde opisani genski proizvodi dalje uključuju nukleinske kiseline sa posttranskripcionim modifikacijama, npr. poliadenilacijom, ili polipeptide sa posttranslacionim modifikacijama, npr. metilacijom, glikozilacijom, dodavanjem lipida, povezivanjem sa drugim proteinskim podjedinicama, proteolitičkim cepanjem, i slično.

[0073] Kako se ovde koriste, termini „lečiti“ ili „lečenje“ se odnose na terapijsko lečenje i profilaktičke ili preventivne mere, pri čemu je cilj da se spreči ili uspori (oslabi) neželjena fiziološka promena, infekcija ili poremećaj. Korisni ili željeni klinički rezultati obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, ublažavanje simptoma, umanjenje nivoa bolesti, stabilizovano (tj. bez pogoršanja) stanje bolesti, klirens ili smanjenje infektivnog agensa kao što je P. aeruginosa kod ispitanika, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, poboljšanje ili palijaciju stanja bolesti, i remisiju (bilo delimičnu ili ukupnu), bilo da može ili ne može da se otkrije. „Lečenje“ takođe može da znači produžetak preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem ako nije primljeno lečenje. Oni kojima je potrebno lečenje obuhvataju pacijente koji već imaju infekciju, stanje ili poremećaj, kao i one koji su skloni tome da imaju stanje ili poremećaj. ili one kod kojih to stanje ili poremećaj treba sprečiti, npr. pacijente sa opekotinama ili pacijente sa oslabljenim imunskim sistemom koji su podložni infekciji putem P. aeruginosa.

[0074] Pod „ispitanik“ ili „pojedinac“ ili „životinja“ ili „pacijent“ ili „sisar“ se misli na bilo kog ispitanika ili pacijenta, specifično na ispitanika koji je sisar, za koga se želi dijagnoza, prognoza, ili terapija. Ispitanici koji su sisari obuhvataju ljude, domaće životinje, životinje sa farme, i životinje iz zoološkog vrta, životinje za sport ili kućne ljubimce, kao što su psi, mačke, zamorci, zečevi, pacovi, miševi, konji, stoka, krave, medvedi, i tako dalje.

[0075] Kako se ovde koriste, fraze poput „ispitanik koji bi imao koristi od primene anti-Pseudomonas Psl i PcrV vezujućih domena ili vezujućih molekula“ i „životinja kojoj je potrebno lečenje“ obuhvataju ispitanike, kao što su ispitanici sisari, koji bi imali koristi od primene anti-Pseudomonas Psl i PcrV vezujućih domena ili vezujućeg molekula, kao što je antitelo, koji sadrže jedan ili više vezujućih domena. Takvi vezujući domeni ili vezujući molekuli mogu da se koriste, npr. za detekciju Pseudomonas Psl ili PcrV (npr. za dijagnostičku proceduru) i/ili za lečenje, tj. palijaciju ili prevenciju bolesti, pomoću Pseudomonas Psl i PcrV vezujućih molekula. Kao što je ovde detaljnije opisano, Pseudomonas Psl i PcrV vezujući molekuli mogu da se koriste u nekonjugovanom obliku ili mogu biti konjugovani, npr. sa lekom, prolekom ili izotopom.

[0076] Termin „sinergijsko dejstvo“, kako se ovde koristi, odnosi se na terapeutsko dejstvo veće od zbirnog, nastalo pomoću kombinacije jedinjenja, pri čemu terapeutsko dejstvo dobijeno sa kombinacijom premašuje zbirna dejstva koja bi inače nastala usled pojedinačne primene jedinjenja. Određena otelotvorenja uključuju postupke za proizvodnju sinergijskog dejstva u lečenju infekcija putem Pseudomonas, pri čemu je navedeno dejstvo najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500% ili najmanje 1000% veće nego odgovarajuće zbirno dejstvo.

[0077] „Zajednička primena“ se odnosi na primenu različitih jedinjenja, poput anti-Psl i anti-PcrV vezujućeg domena ili vezujućeg molekula, koja sadrže jedan od anti-Psl i anti-PcrV vezujućeg domena ili oba, tako da jedinjenja izazivaju sinergijsko dejstvo na imunitet na Pseudomonas. Jedinjenja mogu da se primene u istoj ili različitim kompozicijama koje se, ako su odvojene, primenjuju blizu jedna drugoj, uopšteno u roku od 24 sata jedna od druge, a uobičajenije u roku od oko 1-8 sati jedna od druge, a još uobičajenije u roku od 1-4 sata jedna od druge, ili skoro istovremeno. Relativne količine su doze koje ostvaruju željenu sinergiju.

II. VEZUJUĆI DOMENI I VEZUJUĆI MOLEKULI

[0078] Antitela koja vezuju Psl i formati za upotrebu tih antitela su opisani u struci. Vidite, na primer, Međunarodnu prijavu br. PCT/US2012/041538, podnetu 8. juna 2012, i PCT/US2012/63639, podnetu 6. novembra 2012. (advokatski izvod br. AEMS-115WO1, pod nazivom „MULTISPECIFIČNI I MULTIVALENTNI VEZUJUĆI PROTEINI I NJIHOVA PRIMENA“).

[0079] Ovde su otkriveni vezujući domeni koji se specifično vezuju za Pseudomonas PcrV, pri čemu vezivanje može da ometa aktivnost sekrecionog sistema toksina tipa III. U određenim otelotvorenjima, vezujući domeni imaju istu specifičnost vezivanja Pseudomonas kao antitelo V2L2.

[0080] Ovde su takođe otkriveni vezujući domeni koji se specifično vezuju za Pseudomonas Psl ili PcrV, pri čemu primena oba vezujuća domena daje sinergijsko dejstvo protiv infekcija Pseudomonasom putem (a) inhibicije vezivanja Pseudomonas aeruginosa za epitelne ćelije, (b) promovisanja, posredovanja ili pojačavanja opsonofagocitnog ubijanja (OPK) P. aeruginosa, (c) inhibicije vezivanja P. aeruginosa za epitelne ćelije ili (d) ometanja aktivnosti sekrecionog sistema toksina tipa III. U određenim primerima, vezujući domeni imaju istu specifičnost vezivanja Pseudomonasa kao antitela Cam-003, WapR-004, V2L2 ili 29D2.

[0081] Ovde su otkriveni izolovani vezujući molekuli koji sadrže jedan ili oba vezujuća domena koji se specifično vezuju za Pseudomonas Psl i/ili PcrV, pri čemu primena vezujućeg molekula dovodi do sinergijskog dejstva protiv infekcije Pseudomonasom. U određenim primerima, vezujući molekul može da sadrži vezujući domen iz antitela ili njihovih fragmenata koja uključuju, ali nisu ograničena na, Cam-003,WapR-004, V2L2 ili 29D22.

[0082] Kako se ovde koriste, termini „vezujući domen“ ili „antigen vezujući

domen“ obuhvataju mesto koje specifično vezuje epitop na antigenu (npr. epitop Pseudomonas Psl ili PcrV). Antigen vezujući domen antitela obično obuhvata barem deo varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina i barem deo varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina. Mesto vezivanja nastalo od tih varijabilnih regiona određuje specifičnost antitela.

[0083] Otkriće je specifičnije usmereno na kompoziciju koja sadrži najmanje dva anti-Pseudomonas vezujuća domena, pri čemu jedan vezujući domen specifično vezuje Psl, a drugi vezujući domen specifično vezuje PcrV. U jednom primeru, kompozicija sadrži jedan vezujući domen koji se specifično vezuje za isti epitop Pseudomonas Psl kao antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) iz WapR-004, Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR-003 ili WapR-016. U određenim primerima, drugi vezujući domen specifično se vezuje za isti epitop Pseudomonas PcrV kao antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) iz V2L2 ili 29D2.

[0084] U jednom primeru, kompozicija sadrži jedan vezujući domen koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili konkurentski inhibira vezivanje Pseudomonas Psl putem antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL iz WapR-004, Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR-003 ili WapR-016. U određenim primerima, drugi vezujući domen specifično se vezuje za isti epitop Pseudomonas PcrV i/ili konkurentski inhibira vezivanje Pseudomonas PcrV putem antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) iz V2L2 ili 29D2.

[0085] Drugi primer je usmeren na izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za isti epitop Pseudomonas PcrV kao antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži VH i VL region iz V2L2 ili 29D2.

[0086] Ovde je takođe otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas PcrV i konkurentski inhibira vezivanje Pseudomonas PcrV putem antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL iz V2L2 ili 29D2.

[0087] Jedan primer je usmeren na izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za isti epitop Pseudomonas Psl kao antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži VH i VL region iz WapR-001, WapR-002 ili WapR-003.

[0088] Ovde je takođe otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i konkurentski inhibira vezivanje Pseudomonas Psl putem antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL iz WapR-001, WapR-002 ili WapR-003.

[0089] Ovde je dalje otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za isti epitop Pseudomonas Psl kao antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži VH i VL region iz WapR-016.

4

[0090] Ovde je takođe otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i konkurentski inhibira vezivanje Pseudomonas Psl putem antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL iz WapR-016.

[0091] Postupci pravljenja antitela su dobro poznati u struci i opisani su u ovom tekstu. Kada se proizvedu antitela za različite fragmente ili Pseudomonas Psl ili PcrV kompletne dužine bez signalne sekvence, aminokiseline ili epitop Pseudomonas Psl ili PcrV za koje se antitelo ili antigen vezujući fragment vezuju mogu da se odrede protokolima za mapiranje epitopa kao što je ovde opisano, kao i postupcima koji su poznati u struci (npr. dvostruko antitelosendvič ELISA kao što je opisano u Poglavlju 11 - Immunology, Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel i sar. v.2, John Wiley & Sons, Inc. (1996)). Dodatni protokoli za mapiranje epitopa mogu se naći u Morris, G. Epitope Mapping Protocols, New Jersey: Humana Press (1996). Mapiranje epitopa takođe može da se izvrši komercijalno dostupnim sredstvima (tj. ProtoPROBE, Inc. (Milwaukee, Wisconsin)).

[0092] Ovde je otkriven vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa afinitetom koji karakteriše konstanta disocijacije (KD) koja je manja od KDza navedeno referentno monoklonsko antitelo.

[0093] U određenim primerima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat kao što je ovde otkriveno, specifično se vezuje za najmanje jedan epitop Psl ili PcrV, tj. vezuje se za takav epitop lakše nego što bi se vezao za nepovezani ili nasumični epitop; vezuje se preferencijalno za najmanje jedan epitop Psl ili PcrV, tj. vezuje se za takav epitop lakše nego što bi se vezao za povezani, slični, homologni ili analogni epitop; konkurentski inhibira vezivanje referentnog antitela koje se i samo specifično ili preferencijalno vezuje za određeni epitop Psl ili PcrV; ili se vezuje za najmanje jedan epitop Psl ili PcrV sa afinitetom koji karakteriše konstanta disocijacije KDkoja je manja od oko 5 x 10<-2>M, oko 10<-2>M, oko 5 x 10<-3>M, oko 10<-3>M, oko 5 x 10<-4>M, oko 10<-4>M, oko 5 x 10<-5>M, oko 10<-5>M, oko 5 x 10<-6>M, oko 10<-6>M, oko 5 x 10<-7>M, oko 10<- 7>M, oko 5 x 10<-8>M, oko 10<-8>M, oko 5 x 10<-9>M, oko 10<-9>M, oko 5 x 10<-10>M, oko 10<-10>M, oko 5 x 10<-11>M, oko 10<-11>M, oko 5 x 10<-12>M, oko 10<-12>M, oko 5 x 10<-13>M, oko 10<-13>M, oko 5 x 10<-14>M, oko 10<-14>M, oko 5 x 10<-15>M, ili oko 10<- 15>M.

[0094] Kako se koristi u kontekstu konstanti disocijacije vezivanja, termin „oko“ dopušta stepen varijacije svojstven postupcima koji se koriste za merenje afiniteta antitela. Na primer, u zavisnosti od nivoa preciznosti korišćenih instrumenata, standardne greške na osnovu broja izmerenih uzoraka i greške prilikom zaokruživanja, termin „oko 10<-2>M“ može da uključuje, na primer, od 0,05 M do 0,005 M.

[0095] U specifičnim primerima, vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, varijanta ili derivat, vezuje Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa brzinom disocijacije (k(off)) koja je manja ili jednaka 5 X 10<-2>s<-1>, 10<-2>s<-1>, 5 X 10<-3>s<-1>ili 10<-3>s<-1>. Alternativno, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat vezuju Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa brzinom disocijacije (k(off)) koja je manja ili jednaka 5 X 10<-4>s<-1>, 10<-4>s<-1>, 5 X 10<-5>s<-1>ili 10<-5>s<-1>5 X 10<-6>s<-1>, 10<-6>s<-1>, 5 X 10<-7>s<-1>ili 10<-7>s<-1>.

[0096] U drugim primerima, vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat prikazan ovde, vezuje Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa brzinom asocijacije (k(on)) koja je veća ili jednaka 10<3>M<-1>s<-1>, 5 X 10<3>M<-1>s<-1>, 10<4>M<-1>s<-1>ili 5 X 10<4>M<-1>s<-1>. Alternativno, vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat prikazan ovde, vezuje Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa brzinom asocijacije (k(on)) koja je veća ili jednaka 10<5>M<-1>s<- 1>, 5 X 10<5>M<-1>s<-1>, 10<6>M<-1>s<-1>ili 5 X 106 M<-1>s<-1>ili 10<7>M<-1>s<-1>.

[0097] U različitim primerima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat opisan ovde, promoviše opsonofagocitno ubijanje Pseudomonasa, ili inhibira vezivanje Pseudomonasa za epitelne ćelije. U određenim otelotvorenjima koja su ovde opisana, Pseudomonas Psl ili PcrV je meta Pseudomonas aeruginosa Psl ili PcrV. U drugim otelotvorenjima, određeni vezujući molekuli koji su ovde opisani mogu da se vezuju za strukturno povezane molekule polisaharida bez obzira na njihovo poreklo. Za takve molekule slične Psl bi se očekivalo da budu identični ili da imaju dovoljnu strukturnu povezanost sa P. aeruginosa Psl da omoguće specifično prepoznavanje od strane jednog ili više otkrivenih vezujućih molekula. U drugim otelotvorenjima, određeni vezujući molekuli koji su ovde opisani mogu da se vezuju za strukturno povezane molekule polipeptida bez obzira na njihovo poreklo. Za takve molekule slične PcrV bi se očekivalo da budu identični ili da imaju dovoljnu strukturnu povezanost sa P. aeruginosa PcrV da omoguće specifično prepoznavanje od strane jednog ili više otkrivenih vezujućih molekula. Stoga, na primer, određeni ovde opisani vezujući molekuli mogu da se vezuju za molekule slične Psl i/ili PcrV koje proizvode druge vrste bakterija, na primer, molekule slične Psl ili PcrV koje proizvode druge vrste Pseudomonasa, npr.

Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida ili Pseudomonas alcaligenes. Alternativno, određeni vezujući molekuli koji su ovde opisani mogu da se vezuju za molekule slične Psl i/ili PcrV koji se proizvode sintetički ili ih proizvode ćelije domaćini genetski modifikovane da proizvode molekule slične Psl ili PcrV.

[0098] Osim ako nije specifično naznačeno, kako se ovde koristi, „njegov fragment“ u odnosu na vezujući molekul, npr. antitelo, odnosi se na antigen-vezujući fragment, tj. deo antitela koji se specifično vezuje za antigen.

[0099] Anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi antigenvezujući fragmenti, varijante ili derivati, mogu da sadrže konstantni region koji posreduje u jednoj ili više efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje C1 komponente komplementa sa konstantnim regionom antitela može da aktivira sistem komplementa. Aktivacija komplementa je važna u opsonizaciji i lizi patogena. Aktivacija komplementa takođe stimuliše inflamatorni odgovor i takođe može imati ulogu u autoimunoj hipersenzitivnosti. Nadalje, antitela se vezuju za receptore na različitim ćelijama putem Fc regiona, sa Fc receptorskim mestom vezivanja na Fc regionu antitela koje se vezuje za Fc receptor (FcR) na ćeliji. Postoji više Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptore), IgE (epsilon receptore), IgA (alfa receptore) i IgM (mi receptore).

Vezivanje antitela Fc receptora na površini ćelije pokreće više važnih i raznolikih bioloških odgovora uključujući obuhvatanje i uništavanje čestica obloženih antitelom, čišćenje imunskih kompleksa, lizu ciljnih ćelija obloženih antitelom od strane ćelija ubica (nazvanu ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela ili ADCC), otpuštanje inflamatornih medijatora, placentarni transfer i kontrolu proizvodnje imunoglobulina.

[0100] Shodno tome, određena otelotvorenja koja su ovde otkrivena uključuju anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijantu ili derivat, u kome je barem frakcija jednog ili više domena konstantnog

4

regiona izbačena ili na drugi način izmenjena kako bi se dobile željene biohemijske karakteristike, kao što su smanjene efektorske funkcije, sposobnost nekovalentne dimerizacije, povećana sposobnost lociranja na mestu tumora, smanjen poluživot u serumu ili povećan poluživot u serumu u poređenju sa celim, neizmenjenim antitelom približno iste imunogenosti. Na primer, određeni vezujući molekuli koji su opisani ovde su antitela sa izbačenim domenom koja sadrže polipeptidni lanac sličan teškom lancu imunoglobulina, ali kome nedostaje najmanje deo jednog ili više domena teškog lanca. Na primer, u određenim antitelima, jedan ceo domen konstantnog regiona modifikovanog antitela će biti izbačen, na primer, ceo CH2 domen ili njegov deo će biti izbačen.

[0101] Modifikovani oblici anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujućih molekula, npr. antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati, mogu se dobiti od celih prekursorskih ili matičnih antitela koristeći tehnike koje su poznate u struci. Primeri tehnika su razmotreni u drugom delu ovog teksta.

[0102] U određenim otelotvorenjima, i varijabilni i konstantni regioni anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujućih molekula, npr. antitela ili antigen-vezujućih fragmenata, u potpunosti su humani. Potpuno humana antitela mogu da se proizvedu koristeći tehnike koje su poznate u struci i opisane u ovom tekstu. Na primer, potpuno humana antitela na specifični antigen mogu da se pripreme primenom antigena na transgenoj životinji koja je modifikovana da proizvodi takva antitela kao odgovor na antigenski izazov, ali čiji endogeni lokusi su onemogućeni. Primeri tehnika koje se mogu koristiti za proizvodnju takvih antitela su opisani u US patentima: 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140. Druge tehnike su poznate u struci. Potpuno humana antitela se takođe mogu proizvesti različitim displej tehnologijama, npr. displejem faga ili drugim sistemima virusnog displeja, kao što je detaljnije opisano u drugom delu ovog teksta.

[0103] Anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi antigenvezujući fragmenti, varijante ili derivati otkriveni ovde, mogu se napraviti ili proizvesti koristeći tehnike koje su poznate u struci. U određenim otelotvorenjima, vezujući molekuli ili njihovi fragmenti se „rekombinantno proizvode“, tj. proizvode se koristeći tehnologiju rekombinantne DNK. Primeri tehnika za proizvodnju molekula antitela ili njihovih fragmenata su detaljnije razmotreni u drugom delu ovog teksta.

[0104] Kod određenih anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujućih molekula, npr. antitela ili njihovih ovde opisanih antigen-vezujućih fragmenata, varijanti ili derivata, Fc deo može biti mutiran da bi se smanjila efektorska funkcija koristeći tehnike poznate u struci. Na primer, delecija ili inaktivacija (kroz tačkaste mutacije ili na druge načine) domena konstantnog regiona može da smanji vezivanje Fc receptora cirkulišućeg modifikovanog antitela, što povećava lokalizaciju u tumoru. U drugim slučajevima je moguće da modifikacije konstantnog regiona ograničavaju vezivanje komplementa i tako smanjuju poluživot u serumu i nespecifično povezivanje konjugovanog citotoksina. Druge modifikacije konstantnog regiona mogu biti korišćene da se modifikuju disulfidne veze ili oligosaharidni ostaci koji dozvoljavaju povećanu lokalizaciju usled povećane antigenske specifičnosti ili fleksibilnosti antitela. Nastali fiziološki profil, bioraspoloživost i drugi biohemijski efekti modifikacija, kao što su lokalizacija, biodistribucija i poluživot u serumu, lako se mogu izmeriti i kvantifikovati koristeći dobro poznate imunološke tehnike bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0105] U određenim primerima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati, neće izazvati štetan imunski odgovor kod životinje koja se leči, npr. kod čoveka. U jednom primeru, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati, modifikovani su radi smanjenja njihove imunogenosti koristeći tehnike prepoznate u struci. Na primer, antitela mogu biti humanizovana, deimunizovana ili himerna antitela. Ove vrste antitela su dobijene od nehumanog antitela, obično antitela miša ili primata, koje zadržava ili u velikoj meri zadržava antigen-vezujuća svojstva matičnog antitela, ali koje je manje imunogeno za ljude. To se može postići različitim postupcima, uključujući (a) graftovanje celih nehumanih varijabilnih domena na humane konstantne regione kako bi se stvorila himerna antitela; (b) graftovanje barem dela jednog ili više nehumanih regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) u humani okvir i konstantne regione uz zadržavanje kritičnih ostataka okvira ili bez njih; ili (c) transplantaciju celih nehumanih varijabilnih domena, ali „maskirajući“ ih odeljcima koji su slični humanim putem zamene površinskih ostataka. Takvi postupci su prikazani u Morrison i sar. Proc. Natl. Acad. Sci.81:6851-6855 (1984); Morrison i sar. Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen i sar. Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun.28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), i U.S. Pat. br.5,585,089, 5,693,761, 5,693,762 i 6,190,370.

4

[0106] Deimunizacija takođe može da se koristi da se smanji imunogenost antitela. Kako se ovde koristi, termin „deimunizacija“ obuhvata menjanje antitela radi modifikovanja T ćelijskih epitopa (vidite, npr. WO9852976A1, WO0034317A2). Na primer, sekvence VH i VL iz početnog antitela se analiziraju i humani T ćelijski epitopi se „mapiraju“ iz svakog V regiona pokazujući lokaciju epitopa u odnosu na regione za određivanje komplementarnosti (CDR) i druge ključne ostatke u sekvenci. Pojedinačni T ćelijski epitopi iz mape T ćelijskih epitopa se analiziraju, kako bi se identifikovale alternativne aminokiselinske supstitucije sa malim rizikom od izmene aktivnosti konačnog antitela. Konstruisan je niz alternativnih sekvenci VH iVL koje sadrže kombinacije aminokiselinskih supstitucija, i te sekvence su zatim inkorporisane u niz vezujućih polipeptida, npr. antitela specifična za Pseudomonas Psli/ili PcrV ili njihovi ovde prikazani antigen vezujući fragmenti, koji su zatim testirani na funkciju. Kompletni geni teških i lakih lanaca koji sadrže modifikovane V i humane C regione su zatim klonirani u ekspresione vektore, i nastali plazmidi su uvedeni u ćelijske linije za proizvodnju celog antitela. Antitela se zatim upoređuju u odgovarajućim biohemijskim i biološkim testovima, i identifikuje se optimalna varijanta.

[0107] Anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi antigenvezujući fragmenti, varijante ili derivati, mogu se napraviti bilo kojim odgovarajućim postupkom koji je poznat u struci. Poliklonska antitela na antigen od interesa mogu se proizvesti različitim procedurama koje su dobro poznate u struci. Na primer, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu da se primene na različitim životinjama domaćinima uključujući, bez ograničenja, zečeve, miševe, kokoške, hrčke, koze, magarce, itd. kako bi se indukovala proizvodnja seruma koji sadrže poliklonska antitela specifična za antigen. Različiti adjuvansi mogu da se koriste za povećanje imunološkog odgovora, u zavisnosti od vrste domaćina, i uključuju, ali nisu ograničeni na, Frojndov (kompletni ili nekompletni), mineralne gelove kao što je aluminijum hidroksid, površinski aktivne supstance kao što je lizolecitin, pluronske poliole, polianjone, peptide, uljane emulzije, hemocijanine iz školjke Megathura crenulata, dinitrofenol i potencijalno korisne humane adjuvanse kao što je BCG (bacil Kalmet-Gerin) i Corynebacterium parvum. Takvi adjuvansi su takođe dobro poznati u struci.

[0108] Monoklonska antitela mogu da se pripreme koristeći širok dijapazon tehnika koje su poznate u struci, uključujući korišćenje tehnologije hibridoma, rekombinantne tehnologije i

4

tehnologije displeja faga, ili njihovu kombinaciju. Na primer, monoklonska antitela mogu da se proizvedu koristeći tehnike hibridoma, uključujući one koje su poznate u struci i obrađene, na primer, u Harlow i sar. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd. (1988)

[0109] DNK kodirajuća antitela ili fragmenti antitela (npr. mesta vezivanja antigena) takođe mogu da se dobiju iz bibilioteka antitela, kao što su biblioteke displeja faga. Naročito, takav fag može da se koristi za prikaz antigen vezujućih domena eksprimiranih iz repertoara ili biblioteke kombinatornih antitela (npr. ljudske ili mišje). Fag koji eksprimira antigen vezujući domen koji se vezuje sa željenim antigenom može se odabrati ili identifikovati antigenom, npr. koristeći označeni antigen ili antigen vezan ili uhvaćen na čvrstoj površini ili perlici. Fag korišćen u ovim metodama je obično filamentozni fag, uključujući fd i M13 vezujuće domene eksprimirane iz faga sa scFv, Fab, Fv OE DAB (individualni Fv region iz lakih ili teških lanaca) ili disulfidno stabilizovane Fv domene antitela rekombinantno spojene sa genom faga III ili proteinom gena VIII. Primeri postupaka su dati, na primer, u EP 368684 B1; U.S. patentu 5,969,108, Hoogenboom, H.R. i Chames, Immunol. Today 21:371 (2000); Nagy i sar. Nat. Med. 8:801 (2002); Huie i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2682 (2001); Lui i sar. J. Mol. Biol.315:1063 (2002). Nekoliko publikacija (npr. Marks i sar.

Bio/Technology 10:779-783 (1992)) opisuje proizvodnju humanih antitela sa velikim afinitetom putem mešanja lanaca, kao i kombinatornom infekcijom i in vivo rekombinacijom kao strategijom za stvaranje velikih biblioteka faga. U drugom otelotvorenju, displej ribozoma može da se koristi da zameni bakteriofag kao platformu za displej (vidite, npr. Hanes i sar. Nat. Biotechnol.18:1287 (2000); Wilson i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750 (2001); ili Irving i sar. J. Immunol. Methods 248:31 (2001)). U još jednom otelotvorenju, biblioteke površine ćelija mogu da se pretražuju na antitela (Boder i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10701 (2000); Daugherty i sar. J. Immunol. Methods 243:211 (2000)). Takve procedure pružaju alternative tradicionalnim tehnikama hibridoma za izolovanje i naknadno kloniranje monoklonskih antitela.

[0110] U metodama prikaza faga, funkcionalni domeni antitela su prikazani na površini čestica faga koje nose polinukleotidne sekvence koje ih kodiraju. Na primer, DNK sekvence koje kodiraju VH i VL regione su amplifikovane iz biblioteka životinjske cDNK (npr. biblioteke humane ili mišje cDNK limfoidnih tkiva) ili biblioteke sintetičke cDNK. U određenim otelotvorenjima, DNK koja kodira VH i VL regione je spojena putem scFv linkera

4

pomoću PCR i klonirana u fagemidni vektor (npr. p CANTAB 6 ili pComb 3 HSS). Vektor je elektroporisan u E. coli i E. coli je inficirana pomoćnim fagom. Fag koji je korišćen u ovim postupcima je obično filamentozni fag uključujući fd i M13, i VH i VL regioni su obično rekombinantno fuzionisani sa genom faga III ili genom VIII. Fag koji eksprimira antigen vezujući domen koji se vezuje za željeni antigen (tj. Pseudomonas Psl ili PcrV) može se odabrati ili identifikovati antigenom, npr. koristeći označeni antigen ili antigen vezan ili uhvaćen na čvrstoj površini ili perlici.

[0111] Dodatni primeri postupaka displeja faga koji se mogu koristiti za stvaranje antitela uključuju one koji su prikazani u Brinkman i sar. J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames i sar. J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough i sar. Eur. J. Immunol, 24:952-958 (1994); Persic i sar. Gene 187:9-18 (1997); Burton i sar. Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT prijava br. PCT/GB91/01134; PCT publikacije WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; i U.S. Pat. br.5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 i 5,969,108.

[0112] Kao što je opisano u prethodnim referencama i primerima u nastavku, nakon izbora faga, kodirajući regioni antitela iz faga se mogu izolovati i koristiti da se dobiju cela antitela, uključujući humana antitela, ili bilo koji drugi poželjni antigen vezujući fragment, i eksprimirati u bilo kom željenom domaćinu, uključujući ćelije sisara, ćelije insekata, ćelije biljaka, kvasca i bakterija. Na primer, tehnike za rekombinantnu proizvodnju Fab, Fab' i F(ab')2fragmenata takođe se mogu koristiti primenom metoda koje su poznate u struci, kao što su one prikazane u PCT publikaciji WO 92/22324; Mullinax i sar. BioTechniques 12(6):864-869 (1992); i Sawai i sar. AJRI 34:26-34 (1995); i Better i sar. Science 240:1041-1043 (1988).

[0113] Primeri tehnika koje se mogu koristiti za proizvodnju jednolančanih Fv i antitela uključuju one opisane u US pat. br.4,946,778 i 5,258,498; Huston i sar. Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu i sar. PNAS 90:7995-7999 (1993); i Skerra i sar. Science 240:1038-1040 (1988). U određenim otelotvorenjima poput terapeutske primene, mogu se koristiti himerna, humanizovana ili humana antitela. Himerno antitelo je molekul u kome su različiti delovi antitela dobijeni od različitih životinjskih vrsta, kao što su antitela koja imaju varijabilni region dobijen od mišjeg monoklonskog antitela i konstantni region humanog

4

imunoglobulina. Postupci proizvodnje himernih antitela su dobro poznati u struci. Vidite, npr. Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi i sar. BioTechniques 4:214 (1986); Gillies i sar. J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); U.S. Pat. br.5,807,715; 4,816,567; i 4,816397. Humanizovana antitela su molekuli antitela od antitela nehumane vrste koji vezuju željeni antigen koji ima jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) nehumanih vrsta i regione okvira molekula humanog imunoglobulina. Ostaci okvira u humanim regionima okvira često mogu biti supstituisani odgovarajućim ostatkom iz CDR donorskog antitela kako bi se izmenilo, poželjno poboljšalo, vezivanje antigena. Ove supstitucije okvira su identifikovane pomoću postupaka dobro poznatih u struci, npr. modelovanjem interakcija ostataka CDR i okvira radi identifikovanja ostataka okvira važnih za vezivanje antigena i poređenjem sekvenci radi identifikovanja neuobičajenih ostataka okvira na konkretnim pozicijama. (vidite, npr. Queen i sar. U.S. Pat. br.5,585,089; Riechmann i sar. Nature 332:323 (1988)) Antitela mogu da se humanizuju koristeći različite tehnike poznate u struci, uključujući, na primer, CDR graftovanje (EP 239,400; PCT publikacija WO 91/09967; U.S. Pat. br.5,225,539; 5,530,101; i 5,585,089), glaziranje ili ponovno oblaganje (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka i sar. Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. i sar. PNAS 91:969-973 (1994)), i mešanje lanaca (U.S. Pat. br.5,565,332).

[0114] Potpuno humana antitela su naročito poželjna za terapeutsko lečenje ljudskih pacijenata. Humana antitela se mogu napraviti raznovrsnim postupcima koji su poznati u struci, uključujući postupke displeja faga koji su prethodno opisani koristeći biblioteke antitela dobijene od sekvenci humanog imunoglobulina. Vidite, takođe, US pat. br.4,444,887 i 4,716,111; i PCT publikacije WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, i WO 91/10741.

[0115] Humana antitela se takođe mogu proizvesti koristeći transgene miševe koji nisu sposobni da eksprimiraju funkcionalne endogene imunoglobuline, ali koji mogu da eksprimiraju gene humanog imunoglobulina. Na primer, kompleksi gena teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina mogu se uvesti nasumično ili putem homologe rekombinacije u mišje embrionske matične ćelije. Pored toga, različite kompanije se mogu angažovati da obezbede humana antitela proizvedena u transgenim miševima usmerena na izabrani antigen koristeći tehnologiju sličnu onoj koja je prethodno opisana.

4

[0116] Potpuno humana antitela koja prepoznaju izabrani epitop mogu da se stvore koristeći tehniku koja se naziva „vođena selekcija“. U ovom pristupu, odabrano nehumano monoklonsko antitelo, npr. mišje antitelo, koristi se za vođenu selekciju potpuno humanog antitela koje prepoznaje isti epitop. (Jespers i sar. Bio/Technology 12:899-903 (1988). Videti takođe U.S. Patent br.5,565,332.)

[0117] U drugom otelotvorenju, DNK koja kodira željena monoklonska antitela se može lako izolovati i sekvencirati koristeći konvencionalne procedure (npr. koristeći oligonukleotidne sonde koje mogu specifično da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela). Izolovane i potklonirane ćelije hibridoma ili izolovani fag, na primer, mogu da posluže kao izvor takve DNK. Nakon izolovanja, DNK može da se ubaci u ekspresione vektore, koji se zatim transficiraju u prokariotske ili eukariotske ćelije domaćina, kao što su ćelije E. coli, majmunske COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode imunoglobuline. Konkretnije, izolovana DNK (koja može biti sintetička kako je ovde opisano) može da se koristi za kloniranje sekvenci konstantnog i varijabilnog regiona radi proizvodnje antitela, kako opisuju Newman i sar. U.S. Pat. br.

5,658,570, podnet 25. januara 1995. Transformisane ćelije koje eksprimiraju željeno antitelo mogu da se uzgajaju u relativno velikim količinama da bi se obezbedile kliničke i komercijalne zalihe imunoglobulina.

[0118] U jednom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul, npr. antitelo, sadrži najmanje jedan CDR teškog ili lakog lanca molekula antitela. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul sadrži najmanje dva CDR iz jednog ili više molekula antitela. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul sadrži najmanje tri CDR iz jednog ili više molekula antitela. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul sadrži najmanje četiri CDR iz jednog ili više molekula antitela. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul sadrži najmanje pet CDR iz jednog ili više molekula antitela. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul iz opisa sadrži najmanje šest CDR iz jednog ili više molekula antitela.

[0119] U jednom specifičnom primeru, aminokiselinska sekvenca varijabilnih domena teškog i/ili lakog lanca može da se ispita kako bi se identifikovale sekvence regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) koristeći postupke koji su dobro poznati u struci, npr. koristeći poređenje sa poznatim aminokiselinskim sekvencama drugih teških i lakih lanaca kako bi se odredili regioni hipervarijabilnosti sekvence. Koristeći rutinske tehnike rekombinantne DNK, jedan ili više CDR može da se insertuje u regione okvira, npr. u humane regione okvira kako bi se humanizovalo nehumano antitelo. Regioni okvira mogu biti regioni okvira koji se javljaju u prirodi ili regioni okvira konsenzusa, a poželjno humani regioni okvira (za spisak humanih regiona okvira vidite, npr. Chothia i sar. J. Mol. Biol.278:457-479 (1998)).

Polinukleotid koji je stvoren kombinovanjem regiona okvira i CDR može da kodira antitelo koje se specifično vezuje za najmanje jedan epitop željenog antigena, npr. Psl ili PcrV. Jedna ili više aminokiselinskih supstitucija može biti načinjena u regionima okvira, i aminokiselinske supstitucije mogu da poboljšaju vezivanje antitela za njegov antigen.

Dodatno, takvi postupci mogu da se koriste da se načine aminokiselinske supstitucije ili delecije jednog ili više cisteinskih ostataka varijabilnog regiona koji učestvuju u međulančanoj disulfidnoj vezi kako bi se dobili molekuli antitela kojima nedostaje jedna ili više međulančanih disulfidnih veza. Druge izmene na polinukleotidu su obuhvaćene predmetnim otkrićem i poznate su osobi sa znanjem u struci.

[0120] Ovde su takođe otkriveni vezujući molekuli koji sadrže, u suštini se sastoje od, ili se sastoje od, varijanti (uključujući derivate) molekula antitela (npr. VH regiona i/ili VL regiona) koje su ovde opisane, pri čemu se vezujući molekuli ili njihovi fragmenti specifično vezuju za Pseudomonas Psl ili PcrV. Standardne tehnike koje su poznate stručnjacima mogu da se koriste za uvođenje mutacija u sekvencu nukleotida koja kodira vezujući molekul ili njegov fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV, uključujući, bez ograničenja, mutagenezu usmerenu na mesto i PCR-posredovanu mutagenezu, što dovodi do aminokiselinskih supstitucija. Varijante (uključujući derivate) kodiraju polipeptid koji sadrži manje od 50 aminokiselinskih supstitucija, manje od 40 aminokiselinskih supstitucija, manje od 30 aminokiselinskih supstitucija, manje od 25 aminokiselinskih supstitucija, manje od 20 aminokiselinskih supstitucija, manje od 15 aminokiselinskih supstitucija, manje od 10 aminokiselinskih supstitucija, manje od 5 aminokiselinskih supstitucija, manje od 4 aminokiselinske supstitucije, manje od 3 aminokiselinske supstitucije ili manje od 2 aminokiselinske supstitucije u poređenju sa referentnim VH regionom, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL regionom, VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3. „Konzervativna aminokiselinska supstitucija“ je ona u kojoj je jedan aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac sa sličnim naelektrisanjem. Familije aminokiselinskih ostataka koje imaju bočne lance sa sličnim naelektrisanjem su definisane u struci. Te familije uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr. lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim

1

polarnim bočnim lancima (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarnim bočnim lancima (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta razgranatim bočnim lancima (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Alternativno, mutacije mogu da se uvedu nasumično duž cele kodirajuće sekvence ili njenog dela, recimo putem mutageneze zasićenjem, i dobijeni mutanti mogu da se ispitaju na biološku aktivnost kako bi se identifikovali mutanti koji zadržavaju aktivnost (npr. sposobnost vezivanja za Pseudomonas Psl ili PcrV).

[0121] Na primer, moguće je uvesti mutacije samo u regione okvira ili samo u CDR regione molekula antitela. Uvedene mutacije mogu biti tihe ili neutralne pogrešne mutacije, tj. imaju nepostojeći ili mali efekat na sposobnost antitela da vezuje antigen. Ove vrste mutacija mogu biti korisne u optimizaciji korišćenja kodona ili poboljšanju proizvodnje antitela od strane hibridoma. Alternativno, neneutralne pogrešne mutacije mogu da izmene sposobnost antitela da vezuje antigen. Lokacija većine tihih i neutralnih pogrešnih mutacija će verovatno biti u regionima okvira, dok će lokacija većine neneutralnih pogrešnih mutacija biti u CDR, mada to nije u potpunosti neophodno. Osoba sa znanjem u struci će biti sposobna da konstruiše i testira mutantne molekule sa željenim svojstvima, kao što je nepostojanje promene antigen vezujuće aktivnosti ili promena vezujuće aktivnosti (npr. poboljšanja antigen vezujuće aktivnosti ili promena specifičnosti antitela). Nakon mutageneze, kodirani protein može rutinski da se eksprimira i funkcionalna i/ili biološka aktivnost kodiranog proteina (npr. sposobnost da vezuje najmanje jedan epitop Pseudomonas Psl ili PcrV) može da se utvrdi koristeći tehnike koje su ovde opisane, ili pomoću rutinskih tehnika modifikacije koje su poznate u struci.

[0122] Jedno otelotvorenje obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži anti-Pseudomonas Psl i PcrV vezujući domen koji je ovde otkriven. U određenim otelotvorenjima, bispecifično antitelo sadrži prvi Psl vezujući domen i drugi PcrV vezujući domen. Razmatrana su bispecifična antitela sa više od dve valence. Na primer, trispecifična antitela takođe mogu da se pripreme koristeći postupke koji su ovde opisani. (Tutt i sar. J. Immunol., 147:60 (1991)).

[0123] Ovde je otkriven postupak proizvodnje bispecifičnog antitela, koji koristi jedan laki lanac koji može da se upari sa oba varijabilna domena teškog lanca koji su prisutni u bispecifičnom molekulu. Kako bi se identifikovao ovaj laki lanac, mogu se primeniti različite

2

strategije. U jednom primeru, identifikovane su serije monoklonskih antitela za svaki antigen koja mogu da se ciljaju bispecifičnim antitelom, nakon čega sledi utvrđivanje koji od lakih lanaca koji se koriste u ovim antitelima može da funkcioniše kada se spari sa teškim lancem bilo kog od antitela koja su identifikovana kao drugi cilj. Na taj način može da se identifikuje laki lanac koji može da deluje sa dva teška lanca da omogući vezivanje za oba antigena. U drugom primeru, tehnike displeja, poput displeja faga, mogu da omoguće identifikaciju lakog lanca koji može da deluje sa dva ili više teških lanaca. U jednom otelotvorenju, konstruiše se biblioteka faga koja sadrži raznovrsni repertoar varijabilnih domena teškog lanca i jedan varijabilni domen lakog lanca. Ova biblioteka može dalje da se koristi za identifikovanje antitela koja se vezuju za različite željene antigene. Tako, u određenim otelotvorenjima, identifikovana antitela će deliti zajednički laki lanac.

[0124] Bispecifično antitelo sadrži najmanje jedan jednolančani Fv (scFv). U određenim otelotvorenjima, bispecifično antitelo sadrži dva scFv. Na primer, scFv može biti fuzionisan sa jednim ili oba polipeptida koja sadrže CH3 domen sadržana u antitelu. Neki postupci obuhvataju proizvodnju bispecifičnog molekula, pri čemu se jedan ili oba konstantna regiona teškog lanca koji sadrže barem CH3 domen koriste zajedno sa jednolančanim Fv domenom da bi se dobilo vezivanje antigena.

III. POLIPEPTIDI ANTITELA

[0125] Otkriće je dalje usmereno na izolovane polipeptide koji sačinjavaju vezujuće molekule, npr. antitela ili njihove antigen vezujuće fragmente, koji se specifično vezuju za Pseudomonas Psl i/ili PcrV i na polinukleotide koji kodiraju takve polipeptide. Vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi fragmenti kako su ovde otkriveni, sadrže polipeptide, npr. aminokiselinske sekvence koje kodiraju, na primer, Psl-specifične i/ili PcrV-specifične antigen vezujuće regione dobijene od molekula imunoglobulina. Polipeptid ili aminokiselinska sekvenca „dobijena od“ naznačenog proteina odnosi se na poreklo polipeptida. U određenim slučajevima, polipeptid ili aminokiselinska sekvenca dobijena od određenog polaznog polipeptida ili aminokiselinske sekvence ima aminokiselinsku sekvencu koja je suštinski identična sa polaznom sekvencom, ili njenim delom, pri čemu se deo sastoji od najmanje 10-20 aminokiselina, najmanje 20-30 aminokiselina, najmanje 30-50 aminokiselina, ili prosečno vešt stručnjak može na drugi način da identifikuje da ima poreklo od polazne sekvence.

[0126] Takođe je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona (VH) teškog lanca imunoglobulina koja je najmanje 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identična sa jednom ili više od sekvenci: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0127] Dalje je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VH koja je identična sa, ili je identična osim jedne, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija sa jednom ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0128] Neki primeri uključuju izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH, pri čemu je jedan ili više od VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 regiona VH najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identično sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 referentnog teškog lanca jedne ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0129] Dalje je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH, pri čemu je jedan ili više od VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 regiona VH identičan sa, ili identičan osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci VHCDR1, VHCDR2 i/ili VHCDR3 referentnog teškog lanca jedne ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 kao što je prikazano u Tabeli 2. Tako, prema ovom primeru, VH sadrži jedan ili više od VHCDR1, VHCDR2, ili VHCDR3 koji su identični sa, ili identični osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa jednom ili više od aminokiselinskih sekvenci VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 koje su prikazane u Tabeli 3.

4

[0130] Takođe je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrže aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) imunoglobulina koja je najmanje 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identična sa jednom ili više od SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0131] Takođe je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VL koja je identična sa, ili je identična osim jedne, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija sa jednom ili više od SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kako je prikazano u Tabeli 2.

[0132] Takođe je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL, pri čemu je jedan ili više od VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 regiona VL najmanje 80%, 85%, 90%. 95% ili 100% identičan sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 referentnog lakog lanca jedne ili više od: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0133] Dalje je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL, pri čemu je jedan ili više od VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 regiona VL identičan sa, ili identičan osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci VLCDR1, VLCDR2 i/ili VLCDR3 referentnog lakog lanca jedne ili više od: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kao što je prikazano u Tabeli 2. Tako, prema ovom primeru VL sadrži jedan ili više od VLCDR1, VLCDR2, ili VLCDR3 koji su identični sa, ili identični osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa jednim ili više od aminokiselinskih sekvenci VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 koje su prikazane u Tabeli 3.

[0134] Ovde je otkriveno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koje sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od aminokiselinskih sekvenci VH i VL koje su najmanje 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identične sa:

(a) SEQ ID NO: 1 odnosno SEQ ID NO: 2, (b) SEQ ID NO: 3 odnosno SEQ ID NO:2, (c) SEQ ID NO: 4 odnosno SEQ ID NO: 2, (d) SEQ ID NO: 5 odnosno SEQ ID NO: 6, (e) SEQ ID NO: 7 odnosno SEQ ID NO: 8, (f) SEQ ID NO: 9 odnosno SEQ ID NO: 10, (g) SEQ ID NO: 11 odnosno SEQ ID NO: 12, (h) SEQ ID NO: 13 odnosno SEQ ID NO: 14, (i) SEQ ID NO: 15 odnosno SEQ ID NO: 16, (j) SEQ ID NO: 74 odnosno SEQ ID NO: 12. U određenim otelotvorenjima, prethodno opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 11 i VL sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 12. U nekim primerima, prethodno opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1 i VL sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2. U drugim otelotvorenjima, prethodno opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 11 i VL sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 12.

[0135] Ovde je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, koji sadrži VH imunoglobulina i VL imunoglobulina, od kojih svaki obuhvata region za određivanje komplementarnosti 1 (CDR1), CDR2 i CDR3, pri čemu, VH CDR1 je PYYWT (SEQ ID NO:47), VH CDR2 je YIHSSGYTDYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), VH CDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od ADWDRLRALDI (Psl0096, SEQ ID NO:258), AMDIEPHALDI (Psl0225, SEQ ID NO:267), ADDPFPGYLDI (Psl0588, SEQ ID NO:268), ADWNEGRKLDI (Psl0567, SEQ ID NO:269), ADWDHKHALDI (Psl0337, SEQ ID NO:270), ATDEADHALDI (Psl0170, SEQ ID NO:271), ADWSGTRALDI (Psl0304, SEQ ID NO:272), GLPEKPHALDI (Psl0348, SEQ ID NO:273), SLFTDDHALDI (Psl0573, SEQ ID NO:274), ASPGVVHALDI (Psl0574, SEQ ID NO:275), AHIESHHALDI (Psl0582, SEQ ID NO:276), ATQAPAHALDI (Psl0584, SEQ ID NO:277), SQHDLEHALDI (Psl0585, SEQ ID NO:278), i AMPDMPHALDI (Psl0589, SEQ ID NO:279), VL CDR1 je RASQSIRSHLN (SEQ ID NO:50), VL CDR2 je GASNLQS (SEQ ID NO:51), a VL CDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od QQSTGAWNW (Psl0096, SEQ ID NO:280), QQDFFHGPN (Psl0225, SEQ ID NO:281), QQSDTFPLK (Psl0588, SEQ ID NO:282), QQSYSFPLT (WapR0004, Psl0567, Psl0573, Psl00574, Psl0582, Psl0584, Psl0585, SEQ ID NO:52), QDSSSWPLT (Psl0337, SEQ ID NO:283), SQSDTFPLT (Psl0170, SEQ ID NO:284), GQSDAFPLT (Psl0304, SEQ ID NO:285), LQGDLWPLT (Psl0348, SEQ ID NO:286), i QQSLEFPLT (Psl0589, SEQ ID NO:287), pri čemu su VH i VL CDR prema Kabatovom sistemu numerisanja.

[0136] Ovde je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, koji sadrži VH imunoglobulina i VL imunoglobulina, od kojih svaki obuhvata region za određivanje komplementarnosti 1 (CDR1), CDR2 i CDR3, pri čemu, VH CDR1 je PYYWT (SEQ ID NO:47), VH CDR2 je YIHSSGYTDYNPSLKS (SEQ ID NO: 48), VL CDR1 je RASQSIRSHLN (SEQ ID NO:50), VL CDR2 je GASNLQS (SEQ ID NO:51), a VH CDR3, odnosno VL CDR3 sadrži ADWDRLRALDI (Psl0096, SEQ ID NO:258) i QQSTGAWNW (Psl0096, SEQ ID NO:280); AMDIEPHALDI (Psl0225, SEQ ID NO:267) i QQDFFHGPN (Psl0225, SEQ ID NO:281); ADDPFPGYLDI (Psl0588, SEQ ID NO:268) i QQSDTFPLK (Psl0588, SEQ ID NO:282); ADWNEGRKLDI (Psl0567, SEQ ID NO:269) i VL CDR3 je QQSYSFPLT (WapR0004, Psl0567, Psl0573, Psl00574, Psl0582, Psl0584, Psl0585, SEQ ID NO:52);

ADWDHKHALDI (Psl0337, SEQ ID NO:270) i QDSSSWPLT (Psl0337, SEQ ID NO:283); ATDEADHALDI (Psl0170. SEQ ID NO:271) i SQSDTFPLT (Psl0170, SEQ ID NO:284); ADWSGTRALDI (Psl0304, SEQ ID NO:272) i GQSDAFPLT (Psl0304, SEQ ID NO:285); GLPEKPHALDI (Psl0348, SEQ ID NO:273) i (Psl0348, SEQ ID NO:286); SLFTDDHALDI (Psl0573, SEQ ID NO:274) i SEQ ID NO:52; ASPGVVHALDI (Psl0574, SEQ ID NO:275) i SEQ ID NO:52; AHIESHHALDI (Psl0582, SEQ ID NO:276) i SEQ ID NO:52;

ATQAPAHALDI (Psl0584, SEQ ID NO:277) i SEQ ID NO:52; SQHDLEHALDI (Psl0585, SEQ ID NO:278) i SEQ ID NO:52; ili AMPDMPHALDI (Psl0589, SEQ ID NO:279) i QQSLEFPLT (Psl0589, SEQ ID NO:287).

[0137] Ovde je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, koji sadrži VH imunoglobulina i VL imunoglobulina, pri čemu VH sadrži QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKX1LELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWDRLRALDIWG QGTMVTVSS, pri čemu, X1 je G ili C (Psl0096, SEQ ID NO:288), a VL sadrži DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSTGAWNWFGX2GTKVEIK, pri čemu, X2 je G ili C (Psl0096, SEQ ID NO:289); pri čemu VH sadrži QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAMDIEPHALDIWGQ GTMVTVSS (Psl0225, SEQ ID NO:290), a VL sadrži DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDDGFPNFGGGTKVEIK (Psl0225, SEQ ID NO:291); pri čemu VH sadrži QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADDPFPGYLDIWGQ GTMVTVSS (Psl0588, SEQ ID NO:292), a VL sadrži DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDTFPLKFGGGTKVEIK (Psl0588, SEQ ID NO:293); pri čemu VH sadrži QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWNEGRKLDIWG QGTMVTVSS (Psl0567, SEQ ID NO:294), a VL sadrži SEQ ID NO:11; pri čemu VH sadrži QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWDHKHALDIWG QGTMVTVSS (Psl0337, SEQ ID NO:295), a VL sadrži DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQDSSSWPLTFGGGTKVEIK (Psl0337, SEQ ID NO:296); pri čemu VH sadrži EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARATDEADHALDTWG QGTLVTVSS (Psl0170, SEQ ID NO:297), a VL sadrži EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSDTFPLTFGGGTKLEIK (Psl0170, SEQ ID NO:298); pri čemu VH sadrži EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARADWSGTRALDIWG QGTLVTVSS (Psl0304, SEQ ID NO:299), a VL sadrži EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCWASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSDAFPLTFGGGTKLEIK (Psl0304, SEQ ID NO:300); pri čemu VH sadrži

EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARGLPEKPHALDIWGQ GTLVTVSS (Psl0348, SEQ ID NO:301), a VL sadrži EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGDLWPLTFGGGTKLEIK (Psl0348, SEQ ID NO:302); pri čemu VH sadrži EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARSLFTDDHALDIWGQ GTLVTVSS (Psl0573, SEQ ID NO:303), a VL sadrži SEQ ID NO:11; pri čemu VH sadrži EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARASPGVVHALDIWGQ GTLVTVSS (Psl0574, SEQ ID NO:304), a VL sadrži SEQ ID NO:11; pri čemu VH sadrži EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARAHIESHHALDIWGQ GTLVTVSS (Psl0582, SEQ ID NO:305), a VL sadrži SEQ ID NO:11; pri čemu VH sadrži EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARATQAPAHALDIWG QGTLVTVSS (Psl0584, SEQ ID NO:306), a VL sadrži SEQ ID NO:11; pri čemu VH sadrži EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARSQHDLEHALDIWGQ GTLVTVSS (Psl0585, SEQ ID NO:307), a VL sadrži SEQ ID NO:11; ili pri čemu VH sadrži EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGY TDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARAMPDMPHALDIWG QGTLVTVSS (Psl0589, SEQ ID NO:308), a VL sadrži EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLEFPLTFGGGTKLEIK (Psl0589, SEQ ID NO:325).

[0138] Takođe je otkriven jednolančani Fv (scFv) fragment izolovanog antitela koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl („anti-Psl ScFv“), koji sadrži formulu VH-L-VL ili alternativno VL-L-VH, gde L predstavlja sekvencu linkera. U određenim aspektima, linker može da sadrži (a) [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, (b) [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, ili kombinaciju (a) i (b). Na primer, primer linkera sadrži:

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:326). U određenim otelotvorenjima, linker dalje sadrži aminokiseline ala-leu na C-terminusu linkera. U određenim primerima, anti-Psl ScFv sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:253, SEQ ID NO:254, ili SEQ ID NO:262.

[0139] Takođe je otkriven jednolančani Fv (ScFv) fragment izolovanog antitela koji se specifično vezuje za Pseudomonas PcrV („anti-PcrV ScFv“), koji sadrži formulu VH-L-VL ili alternativno VL-L-VH, gde L predstavlja sekvencu linkera. U određenim primerima, linker može da sadrži (a) [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, (b) [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, ili kombinaciju (a) i (b). Na primer, primer linkera sadrži:

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:326). U određenim primerima, linker dalje sadrži aminokiseline ala-leu na C-terminusu linkera.

[0140] Takođe je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas PcrV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) imunoglobulina koja je najmanje 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 216 ili SEQ ID NO: 217.

[0141] Dalje je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas PcrV koji sadrži VH, pri čemu je jedan ili više od VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 regiona VH identičan sa, ili identičan osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci VHCDR1, VHCDR2 i/ili VHCDR3 referentnog teškog lanca jednog ili više od: SEQ ID NO: 218-220 kao što je prikazano u Tabeli 3. Tako, prema ovom primeru, VH sadrži jedan ili više od VHCDR1, VHCDR2, ili VHCDR3 koji su identični sa, ili identični osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa jednom ili više od aminokiselinskih sekvenci VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 koje su prikazane u Tabeli 3.

[0142] Dalje je obezbeđen izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas PcrV koji sadrže VL, pri čemu je jedan ili više od VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 regiona VL identičan sa, ili identičan osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci VLCDR1, VLCDR2 i/ili VLCDR3 referentnog teškog lanca jednog ili više od: SEQ ID NO: 221-223 kao što je prikazano u Tabeli 3. Tako, prema ovom primeru VL sadrži jedan ili više od VLCDR1, VLCDR2, ili VLCDR3 koji su identični sa, ili identični osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa jednim ili više od aminokiselinskih sekvenci VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 koje su prikazane u Tabeli 3.

[0143] Ovde je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas PcrV koji sadrži VH i VL, pri čemu VH sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:255 i SEQ ID NO:257, i pri čemu VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:256.

[0144] Ovde je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Pcrv, koji sadrži VH i VL, od kojih svaki sadrži CDR1, CDR2 i CDR3, pri čemu, VH CDR1 je (a) SYAMS (SEQ ID NO:311), ili njena varijanta koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije, VH CDR2 je AISGSGYSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 312) ili njena varijanta koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije; i VHCDR3 je EYSISSNYYYGMDV (SEQ ID NO: 313), ili njena varijanta koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije; ili (b) pri čemu, VL CDR1 je WASQGISSYLA (SEQ ID NO:314), ili njena varijanta koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije, VL CDR2 je AASTLQS (SEQ ID NO:315), ili njena varijanta koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije, i VL CDR3 je QQLNSSPLT (SEQ ID NO:316), ili njena varijanta koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije; ili (c) kombinacija (a) i (b); pri čemu, VH i VL CDR su prema Kabatovom sistemu numerisanja. U određenim aspektima ovog otelotvorenja, (a) VH sadrži sekvencu aminokiseline koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:317, (b) VL sadrži sekvencu aminokiseline koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:318; ili (c) kombinacija (a) i (b).

[0145] Takođe je obezbeđen izolovani bispecifični vezujući molekul, npr. bispecifično antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i Pseudomonas PcrV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) imunoglobulina koja je najmanje 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO:229 ili SEQ ID NO: 235.

1

[0146] U određenim primerima, ovde otkriveno bispecifično antitelo ima strukturu BS1, BS2, BS3 ili BS4, sve kako je prikazano na Sl.17. Kod bispecifičnih antitela koja su ovde obezbeđena, vezujući domen koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl sadrži molekul anti-Psl ScFv. U drugim primerima, vezujući domen koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl sadrži konvencionalni teški lanac i laki lanac. Slično tome, kod nekih bispecifičnih antitela koja su ovde obezbeđena, vezujući domen koji se specifično vezuje za Pseudomonas PcrV sadrži molekul anti-PcrV ScFv. U drugim aspektima, vezujući domen koji se specifično vezuje za Pseudomonas PcrV sadrži konvencionalni teški lanac i laki lanac.

[0147] U određenim aspektima, ovde otkriveno bispecifično antitelo ima BS4 strukturu, detaljno otkrivenu u U.S. privremenoj prijavi br.61/624,651 koja je podneta 16. aprila 2012. i u Međunarodnoj prijavi br: PCT/US2012/ 63639, koja je podneta 6. novembra 2012.

(advokatski izvod br. AEMS-115WO1, pod nazivom „MULTISPECIFIČNI I MULTIVALENTNI VEZUJUĆI PROTEINI I NJIHOVA PRIMENA“ („MULTISPECIFIC AND MULTIVALENT BINDING PROTEINS AND USES THEREOF“)). Na primer, ovo otkriće obezbeđuje bispecifično antitelo u kome je molekul anti-Psl ScFv umetnut u region šarke svakog teškog lanca anti-PcrV antitela ili njegovog fragmenta.

[0148] Ovo otkriće obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži teški lanac antitela i laki lanac antitela, gde teški lanac antitela sadrži formulu VH-CH1-H1-L1-S-L2-H2-CH2-CH3, pri čemu, CH1 je domen-1 konstantnog regiona teškog lanca, H1 je prvi fragment regiona šarke teškog lanca, L1 je prvi linker, S je anti-PcrV ScFv molekul, L2 je drugi linker, H2 je drugi fragment regiona šarke teškog lanca, CH2 je domen-2 konstantnog regiona teškog lanca, i CH3 je domen-3 konstantnog regiona teškog lanca. U određenim primerima, VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:255, SEQ ID NO:257 ili SEQ ID NO:317. U određenim aspektima, L1 i L2 su isti ili različiti, i nezavisno sadrže (a) [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, (b) [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, ili kombinaciju (a) i (b). U određenim otelotvorenjima, H1 sadrži EPKSC (SEQ ID NO:320), i H2 sadrži DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:321).

[0149] U određenim primerima, S sadrži anti-Psl ScFv molekul koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:253, SEQ ID

2

NO:254, ili SEQ ID NO:262, ili bilo koju kombinaciju dve ili više od ovih aminokiselinskih sekvenci.

[0150] U daljim aspektima, CH2-CH3 sadrži (SEQ ID NO:322), pri čemu, X1 je M ili Y, X2 je S ili T, i X3 je T ili E. U daljim aspektima, laki lanac antitela sadrži VL-CL, pri čemu, CL je kapa konstantni region lakog lanca antitela ili lambda konstantni region lakog lanca antitela. U daljim primerima, VL sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:256 ili SEQ ID NO:318. CL može da obuhvata, npr. aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:323.

[0151] Ovde je obezbeđeno bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i Pseudomonas PcrV koje sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:264 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:263.

[0152] U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela iz pronalaska mogu biti tandemski jednolančani (sc) Fv fragment, koji sadrži dva različita scFv fragmenta (tj. V2L2 i W4) kovalentno povezana pomoću linkera (npr. polipeptidnog linkera). (Ren-Heidenreich i sar. Cancer 100:1095-1103 (2004); Korn i sar. J Gene Med 6:642-651 (2004)). U nekim primerima, linker može da sadrži, ili da bude, ceo konstantni region teškog lanca polipeptida, kao što je CH1 domen, ili njegov deo. U nekim primerima, dva fragmenta antitela mogu da budu kovalentno povezana pomoću poliglicin-serin ili poliserin-glicin linkera, kao što je, npr. opisano u U.S. pat. br.7,112,324, odnosno 5,525,491. Postupci za stvaranje bispecifičnih tandemskih scFv antitela su, npr. opisani u Maletz i sar. Int J Cancer 93:409-416 (2001); i Honemann i sar. Leukemia 18:636-644 (2004). Alternativno, antitela mogu biti „linearna antitela“ kao što je, npr. opisano u Zapata i sar. Protein Eng. 8:1057-1062 (1995). Ukratko, ova antitela sadrže par tandemskih Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji grade par antigen vezujućih regiona.

[0153] Otkriće takođe prihvata varijante oblika bispecifičnih antitela kao što su molekuli četvorovalentnog dvojnog varijabilnog domena imunoglobulina (DVD-Ig) opisani u Wu i sar. (2007) Nat Biotechnol 25(11): 1290-1297. DVD-Ig molekuli su konstruisani tako da dva različita varijabilna domena lakog lanca (VL) grade dva različita matična antitela koja su u tandemu povezana direktno ili putem kratkog linkera pomoću tehnika rekombinacije DNK, nakon čega sledi konstantni domen lakog lanca. Na primer, polipeptid lakog lanca DVD-Ig može da sadrži u tandemu: (a) VL iz V2L2; i (b) VL iz WapR-004. Slično tome, teški lanac sadrži dva različita varijabilna domena teškog lanca (VH) povezana u tandemu, nakon čega sledi konstantni domen CH1 i Fc region. Na primer, polipeptid teškog lanca DVD-Ig može da sadrži u tandemu: (a) VH iz V2L2; i (b) VH iz WapR-004. U tom slučaju, ekspresija dva lanca u ćeliji daje heterotetramer koji sadrži četiri mesta kombinovanja antigena, dva koja se specifično vezuju za V2L2 i dva koja se specifično vezuju za Psl. Postupci za stvaranje molekula DVD-Ig iz dva matična antitela su dalje, npr. opisani u PCT publikacijama br. WO 2008/024188 i WO 2007/024715.

[0154] U određenim primerima, izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment kako je ovde opisan, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa afinitetom koji karakteriše konstanta disocijacije (KD) koja nije veća od 5 x 10<-2>M, 10<-2>M, 5 x 10<-3>M, 10<-3>M, 5 x 10<-4>M, 10<-4>M, 5 x 10<-5>M, 10<-5>M, 5 x 10<-6>M, 10<-6>M, 5 x 10<-7>M, 10<-7>M, 5 x 10<-8>M, 10<-8>M, 5 x 10<-9>M, 10<-9>M, 5 x 10<-10>M, 10<-10>M, 5 x 10<-11>M, 10<-11>M, 5 x 10<-12>M, 10<-12>M, 5 x 10<-13>M, 10<-13>M, 5 x 10<-14>M, 10<-14>M, 5 x 10<-15>M, ili 10<-15>M.

[0155] U specifičnim primerima, izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment kako je ovde opisan, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa afinitetom koji karakteriše konstanta disocijacije (KD) u opsegu od oko 1 x 10<-10>do oko 1 x 10<-6>M. U jednom primeru, izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment kako je ovde opisan, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa afinitetom koji karakteriše KDod oko 1,18 x 10<-7>M, kako se utvrđuje pomoću OCTET® testa vezivanja koji je ovde opisan. U drugom primeru, izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako je ovde opisan, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa afinitetom koji karakteriše KDod oko 1,44 x 10<-7>M, kako se utvrđuje pomoću OCTET® testa vezivanja koji je ovde opisan.

[0156] Neki primeri uključuju izolovane vezujuće molekule, npr. antitelo ili njegov fragment kako je prethodno opisan, koji (a) mogu da inhibiraju vezivanje Pseudomonas aeruginosa za epitelne ćelije, (b) mogu da promovišu OPK P. aeruginosa, ili (c) mogu da inhibiraju vezivanje P. aeruginosa za epitelne ćelije i mogu da promovišu OPK P. aeruginosa.

[0157] U nekim primerima, izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment kako je prethodno opisan, gde se maksimum inhibicije vezivanja P. aeruginosa za epitelne ćelije ostvaruje pri koncentraciji antitela od oko 50 µg/ml ili manje, 5,0 µg/ml ili manje ili

4

oko 0,5 µg/ml ili manje, ili pri koncentraciji antitela u opsegu od oko 30 µg/ml do oko 0,3, ili pri koncentraciji antitela od oko 1 µg/ml ili pri koncentraciji antitela od oko 0,3 µg/ml.

[0158] Određeni primeri uključuju izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment kako je prethodno opisan, kada je EC50 OPK manja od oko 0,5 µg/ml, manja od oko 0,05 µg/ml, ili manja od oko 0,005 µg/ml, ili kada je EC50 OPK u rasponu od oko 0,001 µg/ml do oko 0,5 µg/ml, ili kada je EC50 OPK u rasponu od oko 0,02 µg/ml do oko 0,08 µg/ml, ili kada je EC50 OPK u rasponu od oko 0,002 µg/ml do oko 0,01 µg/ml ili kada je EC50 OPK manja od oko 0,2 µg/ml, ili kada je EC50 OPK manja od oko 0,02 µg/ml. U određenim primerima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov ovde opisani fragment, varijanta ili derivat, specifično se vezuje za isti epitop Psl kao monoklonsko antitelo WapR-004, WapR-004RAD, Cam-003, Cam-004 ili Cam-005, ili konkurentski inhibira takvo monoklonsko antitelo kod vezivanja za Pseudomonas Psl.

WapR-004RAD je identičan sa WapR-004, osim aminokiselinske supstitucije G98A VH aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:11.

[0159] Neki primeri uključuju mutante WapR-004 (W4) koji sadrže aminokiselinsku sekvencu molekula scFv-Fc koja je identična sa, ili identična osim za jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija sa jednim ili više od: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; ili SEQ ID NO: 146.

[0160] Drugi primeri uključuju mutante WapR-004 (W4) koji sadrže aminokiselinsku sekvencu molekula scFv-Fc koja je najmanje 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identična sa jednim ili više od: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; ili SEQ ID NO: 146.

[0161] U nekim primerima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov ovde opisani fragment, varijanta ili derivat, specifično se vezuje za isti epitop kao monoklonsko antitelo WapR-001, WapR-002, ili WapR-003, ili konkurentski inhibira takvo monoklonsko antitelo kod vezivanja za Pseudomonas Psl.

[0162] U određenim primerima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov ovde opisani fragment, varijanta ili derivat, specifično se vezuje za isti epitop kao monoklonsko antitelo WapR-016, ili konkurentski inhibira takvo monoklonsko antitelo kod vezivanja za Pseudomonas Psl.

TABELA 2: Referentne aminokiselinske sekvence VH i VL*

Naziv VH VL

Naziv VH VL

Naziv VH VL

TABELA 3: referentne aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 VH i VL

1

[0163] U određenim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov ovde opisani fragment, varijanta ili derivat, specifično se vezuje za isti epitop PcrV kao monoklonsko antitelo V2L2 i/ili konkurentski inhibira takvo monoklonsko antitelo kod vezivanja za Pseudomonas PcrV.

[0164] U određenim primerima, anti-Pseudomonas PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, sadrži V2L2-GL i/ili V2L2-MD.

2

[0165] U određenim primerima, anti-Pseudomonas PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov ovde opisani fragment, varijanta ili derivat, specifično se vezuje za isti epitop PcrV kao monoklonsko antitelo 29D2 i/ili konkurentski inhibira takvo monoklonsko antitelo kod vezivanja za Pseudomonas PcrV.

[0166] Svi anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi ovde opisani fragmenti, varijante ili derivati, mogu dalje da uključuju dodatne polipeptide, npr. signalni peptid za usmeravanje sekrecije kodiranog polipeptida, konstantne regione antitela kao što je ovde opisano ili druge heterologe polipeptide kao što su ovde opisani. Pored toga, vezujući molekuli ili njihovi fragmenti iz opisa uključuju fragmente polipeptida kao što je opisano na drugom mestu. Pored toga, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi ovde opisani fragmenti, varijante ili derivati, mogu biti fuzioni polipeptidi, Fab fragmenti, scFv ili drugi derivati, kako je ovde opisano.

[0167] Takođe, kao što je detaljnije opisano u drugom delu ovog teksta, otkriće obuhvata kompozicije koje sadrže anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujuće molekule, npr. antitela ili njihove ovde opisane fragmente, varijante ili derivate.

[0168] Osobi sa uobičajenim znanjem u struci će takođe biti jasno da anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi ovde opisani fragmenti, varijante ili derivati, mogu biti modifikovani tako da se razlikuju po aminokiselinskoj sekvenci od vezujućih polipeptida koji se javljaju u prirodi od kojih su dobijeni. Na primer, polipeptid ili aminokiselinska sekvenca dobijena od naznačenog proteina može biti slična, npr. imati određeni procenat identičnosti sa polaznom sekvencom, npr. može biti 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% identična sa polaznom sekvencom.

[0169] Kao što je poznato u struci, „identičnost sekvence“ između dva polipeptida se određuje poređenjem aminokiselinske sekvence jednog polipeptida sa sekvencom drugog polipeptida. Kada se ovde razmatra da li je određeni polipeptid najmanje oko 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% identičan sa drugim polipeptidom, to može da se odredi koristeći postupke i kompjuterske programe/softver koji su poznati u struci kao što je, bez ograničenja, program BESTFIT (paket za analizu sekvenci Wisconsin, verzija 8 za Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711).

BESTFIT koristi algoritam za lokalnu homologost čiji su autori Smith i Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), kako bi se pronašao najbolji segment homologosti između dve sekvence. Kada se koristi BESTFIT ili bilo koji drugi program za poravnavanje sekvenci da se utvrdi da li je određena sekvenca, na primer, 95% identična sa referentnom sekvencom, parametri su postavljeni, naravno, tako da se procenat identičnosti izračunava za celu dužinu sekvence referentnog polipeptida i da su dozvoljene praznine u homologiji do 5% ukupnog broja aminokiselina u referentnoj sekvenci.

[0170] Procenat „identičnosti sekvence“ takođe može da se utvrdi poređenjem dve optimalno poravnate sekvence u okviru za poređenje. Kako bi se sekvence za poređenje optimalno poravnale, deo sekvence polinukleotida ili polipeptida u okviru za poređenje može da sadrži adicije ili delecije koje se nazivaju praznine, dok referentna sekvenca ostaje konstantna. Optimalno poravnavanje je poravnavanje koje, čak i sa prazninama, daje najveći mogući broj „identičnih“ pozicija između referentnih i uporednih sekvenci. Procenat „identičnosti sekvence“ između dve sekvence može se odrediti korišćenjem verzije programa „BLAST 2 Sequences“ koja je dostupna kod Nacionalnog centra za biotehnološke informacije od 1. septembra 2004. godine, i taj program obuhvata programe BLASTN (za poređenje sekvenci nukleotida) i BLASTP (za poređenje sekvenci polipeptida), i ti programi su zasnovani na algoritmu čiji su autori Karlin i Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). Kada se koriste „sekvence BLAST 2“, mogu da se koriste sledeći parametri koji su bili podrazumevani 1. septembra 2004.: word size (3), open gap penalty (11), extension gap penalty (1), gap drop-off (50), expect value (10), i svaki drugi potreban parametar, uključujući, bez ograničenja, opciju matrice.

[0171] Nadalje, mogu se načiniti supstitucije, delecije ili insercije nukleotida ili aminokiselina koje dovode do konzervativnih supstitucija ili promena u regionima „neesencijalnih aminokiselina“. Na primer, sekvenca polipeptida ili aminokiseline dobijena od naznačenog proteina može biti identična sa polaznom sekvencom osim jedne ili više pojedinačnih aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija, npr. jedne, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, petnaest, dvadeset ili više pojedinačnih aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija. U određenim otelotvorenjima, sekvenca polipeptida ili aminokiseline dobijena od naznačenog proteina ima jednu do pet, jednu do deset, jednu do petnaest ili jednu do dvadeset pojedinačnih aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija u odnosu na polaznu sekvencu.

4

[0172] Anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov ovde opisani fragment, varijanta ili derivat, može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od fuzionog proteina. Fuzioni proteini su himerni molekuli koji sadrže, na primer, antigenvezujući domen imunoglobulina sa najmanje jednim mestom vezivanja cilja i najmanje jednim heterologim delom, tj. delom sa kojim nije prirodno povezan u prirodi.

Aminokiselinske sekvence mogu uobičajeno da postoje u posebnim proteinima koji su dovedeni u kontakt u fuzionom polipeptidu ili mogu uobičajeno da postoje u istom proteinu ali su stavljene u novi raspored u fuzionom polipeptidu. Fuzioni proteini mogu da se dobiju, na primer, putem hemijske sinteze, ili putem kreiranja i prevođenja polinukleotida u kome su regioni peptida kodirani u željenom odnosu.

[0173] Termin „heterologi“ kada se odnosi na polinukleotid, polipeptid ili drugi ostatak znači da su polinukleotid, polipeptid ili drugi ostatak dobijeni od različitog entiteta od ostatka entiteta sa kojim se poredi. U neograničavajućem primeru, „heterologi polipeptid“ koji će se fuzionisati sa vezujućim molekulom, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat, dobijen je od neimunoglobulinskog polipeptida iste vrste, ili imunoglobulinskog ili neimunoglobulinskog polipeptida različite vrste.

IV. FUZIONI PROTEINI I KONJUGATI ANTITELA

[0174] U nekim primerima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati, mogu se primeniti više puta u konjugovanom obliku. U još jednom primeru, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati, mogu se primeniti u nekonjugovanom obliku, zatim u konjugovanom obliku, ili obrnuto.

[0175] U specifičnim primerima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati, mogu biti konjugovani sa jednim ili više antimikrobnih agenasa, na primer, sa polimiksinom B (PMB). PMB je mali lipopeptidni antibiotik koji je odobren za lečenje gram-negativnih infekcija otpornih na više lekova. Pored njegovog baktericidnog delovanja, PMB vezuje lipopolisaharid (LPS) i neutrališe njegovo proinflamatorno dejstvo. (Dixon, R.A. & Chopra, I, J Antimicrob Chemother 18, 557-563 (1986)). Smatra se da LPS značajno doprinosi inflamaciji i nastanku gram-negativne sepse. (Guidet, B., i sar. Chest 106, 1194-1201 (1994)). Pokazalo se da konjugati PMB sa molekulima nosačima neutrališu LPS i posreduju u zaštiti kod životinjskih modela endotoksemije i infekcije. (Drabick, J.J., i sar. Antimicrob Agents Chemother 42, 583-588 (1998)). Takođe je otkriven postupak za vezivanje jednog ili više molekula PMB za cisteinske ostatke koji su uvedeni u Fc region monoklonskih antitela (mAb) iz otkrića. Na primer, konjugati Cam-003-PMB su zadržali specifično, mAb-posredovano vezivanje za P. aeruginosa i takođe su zadržali aktivnost OPK. Nadalje, konjugati mAb-PMB su vezivali i neutralisali LPS in vitro. U specifičnim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati, mogu da se kombinuju sa antibioticima (npr. ciprofloksacinom, meropenemom, tobramicinom, aztreonamom).

[0176] U određenim primerima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov ovde opisani fragment, varijanta ili derivat, može da sadrži heterologu aminokiselinsku sekvencu ili jedan ili više drugih ostataka koji obično nisu povezani sa antitelom (npr. antimikrobni agens, terapeutski agens, prolek, peptid, protein, enzim, lipid, modifikator biološkog odgovora, farmaceutski agens, limfokin, heterologo antitelo ili njegov fragment, oznaku koja može da se detektuje, polietilen glikol (PEG) i kombinaciju dva ili više bilo kojih od navedenih agenasa). U daljim primerima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, može da sadrži oznaku koja može da se detektuje izabranu iz grupe koja se sastoji od enzima, fluorescentne oznake, hemiluminescentne oznake, bioluminescentne oznake, radioaktivne oznake ili kombinacije dve ili više bilo koje od navedenih oznaka koje mogu da se detektuju.

V. POLINUKLEOTIDI KOJI KODIRAJU VEZUJUĆE MOLEKULE

[0177] Ovde su takođe obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline prema zahtevu 2.

[0178] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) imunoglobulina najmanje 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identičnu sa jednim ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ IS NO: 74, ili SEQ ID NO:216 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0179] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) imunoglobulina SEQ ID NO:257 ili SEQ ID NO:259. Na primer, sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO:261, odnosno SEQ ID NO: 259.

[0180] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu VH koja je identična sa, ili je identična osim jedne, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija sa jednim ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 74, ili SEQ ID NO:216 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0181] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira VH, pri čemu je jedan ili više od VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 regiona VH identičan sa, ili identičan osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci VHCDR1, VHCDR2 i/ili VHCDR3 referentnog teškog lanca jednog ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 74, ili SEQ ID NO:216 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0182] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH, pri čemu je jedan ili više od VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 regiona VH identičan sa, ili identičan osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci VHCDR1, VHCDR2 i/ili VHCDR3 referentnog teškog lanca jednog ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0183] Ovde je otkriven izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili antigen-vezujući fragment koji sadrži VH kodiran polinukleotidom koji se specifično ili preferencijalno vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV.

[0184] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) imunoglobulina najmanje 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identičnu sa jednim ili više od: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, ili SEQ ID NO:217 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0185] Drugo otelotvorenje obezbeđuje izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) imunoglobulina SEQ ID NO:256, npr. aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:260.

[0186] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu VL koja je identična sa, ili je identična osim jedne, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih susptitucija sa jednim ili više od: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, ili SEQ ID NO:217 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0187] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira VL, pri čemu je jedan ili više od VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 regiona VL najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci referentnog lakog lanca VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 jednog ili više od : SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16, ili SEQ ID NO:217 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0188] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL, pri čemu je jedan ili više od VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 regiona VL identičan sa, ili identičan osim četiri, tri, dve ili jedne aminokiselinske supstitucije, sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci referentnog lakog lanca VLCDR1, VLCDR2 i/ili VLCDR3 jednog ili više od: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, ili SEQ ID NO:217 kao što je prikazano u Tabeli 2.

[0189] Ovde su otkriveni izolovani vezujući molekuli, npr. antitelo ili antigen-vezujući fragment koji sadrži VL kodiran polinukleotidom koji se specifično ili preferencijalno vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV.

[0190] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira molekul scFv koji obuhvata VH i VL, pri čemu je scFv najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan sa jednim ili više od SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70 kao što je prikazano u Tabeli 4.

TABELA 4: Referentne sekvence nukleinskih kiselina scFv

Naziv scFv nukleotidne sekvence

1 Naziv scFv nukleotidne sekvence

2

Naziv scFv nukleotidne sekvence

4 Naziv scFv nukleotidne sekvence

Naziv scFv nukleotidne sekvence

[0191] U nekim primerima, izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kodirani sa jednim ili više od prethodno opisanih polinukleotida, koji se specifično vezuju za Pseudomonas Psl i/ili PcrV, sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od aminokiselinskih sekvenci VH i VL koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identične sa:

(a) SEQ ID NO: 1 odnosno SEQ ID NO: 2, (b) SEQ ID NO: 3 odnosno SEQ ID NO: 2, (c) SEQ ID NO: 4 odnosno SEQ ID NO: 2, (d) SEQ ID NO: 5 odnosno SEQ ID NO: 6, (e) SEQ ID NO: 7 odnosno SEQ ID NO: 8, (f) SEQ ID NO: 9 odnosno SEQ ID NO: 10, (g) SEQ ID NO: 11 odnosno SEQ ID NO: 12, (h) SEQ ID NO: 13 odnosno SEQ ID NO: 14, (i) SEQ ID NO: 15 odnosno SEQ ID NO: 16, (j) SEQ ID NO: 74 odnosno SEQ ID NO: 12.

[0192] U određenim primerima, izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, kodirano sa jednim ili više od prethodno opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa afinitetom koji karakteriše konstanta disocijacije (KD) koja nije veća od 5 x 10<-2>M, 10<-2>M, 5 x 10<-3>M, 10<-3>M, 5 x 10<-4>M, 10<-4>M, 5 x 10<-5>M, 10<-5>M, 5 x 10<-6>M, 10<-6>M, 5 x 10<-7>M, 10<-7>M, 5 x 10<-8>M, 10<-8>M, 5 x 10<-9>M, 10<-9>M, 5 x 10<-10>M, 10<-10>M, 5 x 10<-11>M, 10<-11>M, 5 x 10<- 12>M, 10<-12>M, 5 x 10<-13>M, 10<-13>M, 5 x 10<-14>M, 10<-14>M, 5 x 10<-15>M, ili 10<-15>M.

[0193] U specifičnim primerima, izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, kodirano sa jednim ili više od prethodno opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa afinitetom koji karakteriše konstanta disocijacije (KD) u opsegu od oko 1 x 10<-10>do oko 1 x 10<- 6>M. U jednom primeru, izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kodirano sa jednim ili više od prethodno opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV sa afinitetom koji karakteriše KDod oko 1,18 x 10<-7>M, kako je utvrđeno pomoću OCTET® testa vezivanja koji je ovde opisan. U drugom primeru, izolovani vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kodiran sa jednim ili više od prethodno opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV, sa afinitetom koji karakteriše KDod oko 1,44 x 10<-7>M, kako je utvrđeno pomoću OCTET® testa vezivanja koji je ovde opisan.

[0194] U određenim primerima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, kodiran sa jednim ili više od prethodno opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za isti epitop Psl kao monoklonsko antitelo WapR-004, WapR-004RAD, Cam-003, Cam-004, ili Cam-005, ili konkurentski inhibira vezivanje takvog monoklonskog antitela za Pseudomonas Psl; i/ili se specifično vezuje za isti epitop PcrV kao monoklonsko antitelo V2L2, ili konkurentski inhibira vezivanje takvog monoklonskog antitela za Pseudomonas PcrV. WapR-004RAD je identičan sa WapR-004 osim G293C supstitucije nukleinske kiseline VH sekvence nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu VH SEQ ID NO:11 (supstitucija nukleotida u VH-kodirajućem delu SEQ ID NO:71 na poziciji 317). Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira VH WapR-004RAD je predstavljena kao SEQ ID NO:76.

[0195] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu W4 mutantnog molekula scFv-Fc koja je identična sa, ili je identična osim jedne, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih susptitucija sa jednim ili više od: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; ili SEQ ID NO: 146.

[0196] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu W4 mutantnog molekula scFv-Fc koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sa jednim ili više od: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; ili SEQ ID NO: 146.

[0197] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira W4 mutantni molekul scFv-Fc, pri čemu je nukleinska kiselina najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sa jednim ili više od SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, ili SEQ ID NO: 152, SEQ IS NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ 10 NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ 10 NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214; ili SEQ ID NO: 215.

[0198] Ovde je otkriven izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira V2L2 polipeptid, pri čemu je nukleinska kiselina najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sa jednim ili više od SEQ ID NO: 238 ili SEQ ID NO: 239.

[0199] U drugim primerima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, kodiran sa jednim ili više od prethodno opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za isti epitop kao monoklonsko antitelo WapR-001, WapR-002, ili WapR-003, ili konkurentski inhibira takvo monoklonsko antitelo kod vezivanja za Pseudomonas Psl.

[0200] U određenim primerima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, kodiran sa jednim ili više od prethodno opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za isti epitop kao monoklonsko antitelo WapR-016, ili konkurentski inhibira takvo monoklonsko antitelo kod vezivanja za Pseudomonas Psl.

[0201] Otkriće takođe obuhvata fragmente polinukleotida kao što je opisano na drugom mestu u ovom tekstu. Pored toga, polinukleotidi koji kodiraju fuzione polinukleotide, Fab fragmente i druge derivate, kako je ovde opisano, takođe su obezbeđeni.

[0202] Polinukleotidi mogu da se naprave ili proizvedu bilo kojim postupkom koji je poznat u struci. Na primer, ako je nukleotidna sekvenca antitela poznata, polinukleotid koji kodira antitelo može da se sastavi od hemijski sintetisanih oligonukleotida (npr. kako opisuju Kutmeier i sar. BioTechniques 17:242 (1994)), što, ukratko, uključuje sintezu preklapajućih oligonukleotida koji sadrže delove sekvence koja kodira antitelo, komplementarno vezivanje prajmera i ligaciju tih oligonukleotida, i zatim amplifikaciju ligiranih oligonukleotida putem PCR.

[0203] Alternativno, polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijantu ili derivat može da se dobije od nukleinske kiseline iz odgovarajućeg izvora. Ako klon koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira konkretno antitelo nije dostupan, ali je sekvenca molekula antitela poznata, nukleinska kiselina koja kodira antitelo može biti hemijski sintetisana ili dobijena iz pogodnog izvora (npr. biblioteke kDNK antitela ili biblioteke kDNK dobijene od nukleinske kiseline, ili nukleinske kiseline, poželjno poli A RNK, izolovane iz bilo kog tkiva ili ćelija koje eksprimiraju antitelo, ili takvih ćelija, kao što su ćelije hibridoma izabrane za ekspresiju antitela) putem PCR amplifikacije koristeći sintetičke prajmere koji mogu da se hibridizuju sa 3' i 5' krajevima sekvence ili putem kloniranja koristeći oligonukleotidnu sondu specifičnu za konkretnu sekvencu gena da se identifikuje, npr. kDNK klon iz biblioteke kDNK koji kodira antitelo. Amplifikovane nukleinske kiseline stvorene pomoću PCR zatim mogu da se kloniraju u replikabilne klonirajuće vektore koristeći bilo koji postupak koji je dobro poznat u struci.

[0204] Nakon što je utvrđena sekvenca nukleotida i odgovarajuća aminokiselinska sekvenca anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata, njegova sekvenca nukleotida može da se obradi koristeći postupke koji su dobro poznati u struci za obradu sekvenci nukleotida, npr. tehnike rekombinantne DNK, mutagenezu usmerenu na mesto, PCR, itd. (vidite, na primer, tehnike opisane u Sambrook i sar. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. izd. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) i Ausubel i sar. izd., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998 ), radi nastanka antitela koja imaju različitu aminokiselinsku sekvencu, na primer, radi nastanka aminokiselinskih supstitucija, delecija i/ili insercija.

[0205] Polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijantu ili derivat, može biti sačinjen od poliribonukleotida ili polidezoksiribonukleotida, koji može biti nemodifikovana RNK ili DNK ili modifikovana RNK ili DNK. Na primer, polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijantu ili derivat, može biti sačinjen od jednolančane i dvolančane DNK, DNK koja je smeša jednolančanih i dvolančanih regiona, jednolančane i dvolančane RNK, i RNK koja je smeša jednolančanih i dvolančanih regiona, hibridnih molekula koji sadrže DNK i RNK koja može biti jednolančana ili, uobičajenije, dvolančana ili smeša jednolančanih i dvolančanih regiona. Pored toga, polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijantu ili derivat, može biti sačinjen od trolančanih regiona koji sadrže RNK ili DNK, ili i RNK i DNK. Polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijantu ili derivat, može takođe da sadrži jednu ili više modifikovanih baza ili skeleta DNK ili RNK modifikovanih za stabilnost ili iz drugih razloga. „Modifikovane“ baze uključuju, na primer, tritilovane baze i neuobičajene baze kao što je inozin. Raznovrsne modifikacije mogu da se načine na DNK i RNK; stoga, „polinukleotid“ obuhvata hemijski, enzimski ili metabolički modifikovane oblike.

[0206] Izolovani polinukleotid koji kodira varijantu polipeptida koja se ne javlja u prirodi dobijenu od imunoglobulina (npr. deo teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulina) može se napraviti putem uvođenja jedne ili više supstitucija, adicija ili delecija nukleotida u sekvencu nukleotida imunoglobulina, tako da je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija uvedeno u kodirani protein. Mutacije mogu da se uvedu putem standardnih tehnika, kao što su mutageneza usmerena na mesto i PCR-posredovana mutageneza. Konzervativne aminokiselinske supstitucije su načinjene na jednom ili više neesencijalnih aminokiselinskih ostataka.

VI. EKSPRESIJA POLIPEPTIDA ANTITELA

[0207] Kao što je dobro poznato, RNK može da se izoluje iz prvobitnih ćelija hibridoma ili iz drugih transformisanih ćelija putem standardnih tehnika, kao što su ekstrakcija gvanidinijum izotiocijanatom i taloženje praćeno centrifugiranjem ili hromatografijom. Kada je to poželjno, iRNK može da se izoluje iz ukupne RNK putem standardnih tehnika, kao što je hromatografija na oligo dT celulozi. Odgovarajuće tehnike su poznate u struci.

[0208] U jednom primeru, kDNK koje kodiraju lake i teške lance anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata, mogu da se naprave, istovremeno ili posebno, koristeći reversnu transkriptazu i DNK polimerazu u skladu sa dobro poznatim postupcima. PCR može da se inicira prajmerima konstantnog regiona konsenzusa ili specifičnijim prajmerima na bazi objavljenih aminokiselinskih sekvenci DNK teškog i lakog lanca. Kao što je prethodno razmotreno, PCR se takođe može koristiti za izolovanje klonova DNK koji kodiraju lake i teške lance antitela. U tom slučaju, biblioteke mogu biti skrinovane pomoću prajmera konsenzusa ili većih homologih sondi, kao što su sonde mišjeg konstantnog regiona.

1

[0209] DNK, obično plazmidna DNK, može da se izoluje iz ćelija koristeći tehnike poznate u struci, mapira sa ograničenjima i sekvencira u skladu sa standardnim, dobro poznatim tehnikama koje su detaljno predstavljene, npr. u prethodnim referencama koje se odnose na tehnike rekombinacije DNK. Naravno, DNK može biti sintetička u skladu sa predmetnim otkrićem u bilo kom trenutku tokom procesa izolovanja ili kasnije analize.

[0210] Nakon obrade izolovanog genetskog materijala radi dobijanja anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata iz otkrića, polinukleotidi koji kodiraju anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujuće molekule se obično ubacuju u ekspresioni vektor za uvođenje u ćeliju domaćina koja može da se koristi za proizvodnju željene količine anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujućih molekula.

[0211] Rekombinantna ekspresija antitela ili njegovog fragmenta, derivata ili analoga, npr. teškog ili lakog lanca antitela koji se vezuje za ovde opisani ciljni molekul, npr. Psl i/ili PcrV, zahteva konstruisanje ekspresionog vektora koji obuhvata polinukleotid koji kodira antitelo. Kada se dobije polinukleotid koji kodira molekul antitela ili teški ili laki lanac antitela, ili njegov deo (koji sadrži varijabilni domen teškog ili lakog lanca) iz otkrića, vektor za proizvodnju molekula antitela može da se proizvede pomoću tehnologije rekombinacije DNK koristeći tehnike koje su poznate u struci. Tako, ovde su opisani postupci za pripremu proteina putem ekspresije polinukleotida koji sadrži antitelo koje kodira sekvencu nukleotida. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima mogu da se koriste za konstruisanje ekspresionih vektora koji sadrže sekvence koje kodiraju antitelo i odgovarajuće transkripcione i translacione kontrolne signale. Ovi postupci uključuju, na primer, tehnike in vitro rekombinacije DNK, sintetičke tehnike i in vivo genetsku rekombinaciju. Tako, ovde su otkriveni replikabilni vektori koji sadrže sekvencu nukleotida koja kodira molekul antitela iz otkrića, ili njegov teški ili laki lanac, ili varijabilni domen teškog ili lakog lanca, operativno povezan sa promoterom. Takvi vektori mogu da uključuju sekvencu nukleotida koja kodira konstantni region molekula antitela (vidite, npr. PCT publikaciju WO 86/05807; PCT publikaciju WO 89/01036; i U.S. Pat. br.5,122,464) i varijabilni domen antitela može da se klonira u takav vektor za ekspresiju celog teškog ili lakog lanca.

[0212] Termin „vektor“ ili „ekspresioni vektor“ se ovde koristi da označi vektor koji se koristi u skladu sa predmetnim otkrićem kao sredstvo za uvođenje i ekspresiju željenog gena

2

u ćeliji domaćina. Kao što je poznato stručnjaku, takvi vektori mogu lako da se izaberu iz grupe koja se sastoji od plazmida, faga, virusa i retrovirusa. Uopšteno, vektori kompatibilni sa predmetnim otkrićem imaju selekcioni marker, odgovarajuća mesta restrikcije za olakšavanje kloniranja željenog gena i sposobnost da uđu i/ili se replikuju u eukariotskoj ili prokariotskoj ćeliji.

[0213] Za svrhe ovog otkrića, mogu se koristiti brojni sistemi ekspresionih vektora. Na primer, jedna klasa vektora koristi elemente DNK koji su dobijeni od životinjskih virusa kao što je goveđi papiloma virus, virus polioma, adenovirus, virus vakcinije, bakulovirus, retrovirus (RSV, MMTV ili MOMLV) ili SV40 virus. Druge uključuju upotrebu policistronskih sistema sa internim mestima vezivanja ribozoma. Pored toga, ćelije koje su integrisale DNK u svoje hromozome mogu da se izaberu putem uvođenja jednog ili više markera koji omogućavaju odabir transficiranih ćelija domaćina. Marker može da obezbedi prototrofiju za auksotrofnog domaćina, biocidnu otpornost (npr. antibiotici) ili otpornost na teške metale poput bakra. Selektabilni marker gen može biti direktno povezan sa sekvencama DNK koje treba da se eksprimiraju ili uveden u istu ćeliju putem kotransformacije. Dodatni elementi mogu takođe biti neophodni za optimalnu sintezu iRNK. Ti elementi mogu da uključuju signalne sekvence, splajs signale, kao i transkripcione promotere, pojačivače i signale za terminaciju.

[0214] U nekim primerima, klonirani geni varijabilnog regiona su ubačeni u ekspresioni vektor zajedno sa sintetičkim genima konstantnog regiona teškog i lakog lanca (npr. humanog) kao što je prethodno razmotreno. Naravno, bilo koji ekspresioni vektor koji je sposoban da izazove ekspresiju u eukariotskim ćelijama može da se koristi u predmetnom otkriću. Primeri odgovarajućih vektora uključuju, ali nisu ograničeni na plazmide pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 i pZeoSV2 (dostupne od kompanije Invitrogen, San Diego, CA), i plazmid pCI (dostupan od kompanije Promega, Madison, WI). Uopšteno, skrining velikog broja transformisanih ćelija da bi se otkrile one koje eksprimiraju odgovarajuće visoke nivoe teških i lakih lanaca imunoglobulina je rutinski eksperiment koji se može obaviti, na primer, pomoću robotskih sistema.

[0215] Još uopštenije, nakon pripreme vektora ili sekvence DNK koja kodira monomernu podjedinicu anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujućeg molekula, npr. antitelo ili njegov fragment, varijantu ili derivat iz otkrića, ekspresioni vektor može da se uvede u odgovarajuću ćeliju domaćina. Uvođenje plazmida u ćeliju domaćina može da se postigne različitim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima. One uključuju, ali nisu ograničene na, transfekciju (uključujući elektroforezu i elektroporaciju), fuziju protoplasta, taloženje kalcijum fosfata, ćelijsku fuziju sa DNK omotača, mikroinjektovanje i infekciju netaknutim virusom. Vidite Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodriguez i Denhardt, Eds., Butterworths, Boston, Mass., Poglavlje 24.2, str.470-472 (1988). Obično, uvođenje plazmida u domaćina je putem elektroporacije. Ćelije domaćina koje nose ekspresione konstrukte se uzgajaju u uslovima koji su odgovarajući za proizvodnju lakih lanaca i teških lanaca, i testiraju se na proteinsku sintezu teškog i/ili lakog lanca. Primeri tehnika za testiranje uključuju test sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), radioimunološki test (RIA), ili analizu sortiranja fluorescentno aktiviranih ćelija (FACS), imunohistohemiju i slično.

[0216] Ekspresioni vektor je prebačen u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama, i transficirane ćelije su zatim uzgajane konvencionalnim tehnikama kako bi se proizvelo antitelo za upotrebu u ovde opisanim postupcima. Tako, otkrivene su ćelije domaćina koje sadrže polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijantu ili derivat, ili njegov teški ili laki lanac, operativno povezan sa heterologim promoterom. U nekim primerima za ekspresiju dvolančanih antitela, vektori koji kodiraju i teške i lake lance mogu se koeksprimirati u ćeliji domaćinu za ekspresiju celog molekula imunoglobulina, kako je detaljno prikazano u nastavku.

[0217] Određeni primeri uključuju izolovani polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira prethodno opisane VH i VL, pri čemu vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment eksprimiran od strane polinukleotida specifično vezuje Pseudomonas Psl i/ili PcrV. U nekim primerima, opisani polinukleotid kodira molekul scFv koji obuhvata VH i VL, najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan sa jednim ili više od SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, ili SEQ ID NO: 70 kao što je prikazano u Tabeli 4.

[0218] Neki primeri uključuju vektore koji sadrže prethodno opisane polinukleotide. U daljim primerima, polinukleotidi su operativno povezani sa promoterom. U dodatnim primerima, otkriće obezbeđuje ćelije domaćina koje sadrže takve vektore. U daljim primerima, otkriće

4

obezbeđuje vektore u kojima je polinukleotid operativno povezan sa promoterom, pri čemu vektori mogu da eksprimiraju vezujući molekul koji specifično vezuje Pseudomonas Psl i/ili PcrV u odgovarajućoj ćeliji domaćinu.

[0219] Ovde je otkriven postupak za proizvodnju vezujućeg molekula ili njegovog fragmenta koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i/ili PcrV, koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži vektor koji obuhvata prethodno opisane polinukleotide, i izolovanje navedenog antitela ili njegovog fragmenta. U daljim primerima, otkriće obezbeđuje izolovani vezujući molekul ili njegov fragment proizveden putem prethodno opisanog postupka.

[0220] Kako se ovde koristi, „ćelije domaćini“ se odnosi na ćelije koje nose vektore konstruisane koristeći tehnike rekombinantne DNK i kodiraju najmanje jedan heterologi gen. U opisima procesa za izolovanje antitela iz rekombinantnih domaćina, termini „ćelija“ ili „ćelijska kultura“ se koriste naizmenično da se označi izvor antitela, ako nije prethodno nedvosmisleno naznačen. Drugim rečima, izolovanje polipeptida iz „ćelija“ može da znači bilo iz centrifugiranjem istaloženih celih ćelija, ili iz ćelijske kulture koja sadrži medijum i suspendovane ćelije.

[0221] Različiti sistemi domaćin-ekspresioni vektor mogu da se koriste za ekspresiju molekula antitela za upotrebu u ovde opisanim postupcima. Takvi sistemi domaćinekspresioni vektor predstavljaju sredstva putem kojih se kodirajuće sekvence od interesa mogu proizvesti i nakon toga prečistiti, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu, kada se transformišu ili transficiraju odgovarajućim sekvencama za kodiranje nukleotida, da eksprimiraju molekul antitela iz otkrića in situ. To uključuje, bez ograničenja, mikroorganizme kao što su bakterije (npr. E. coli, B. subtilis) transformisane rekombinantnom DNK bakteriofaga, ekspresionim vektorima plazmidne DNK ili kozmidne DNK koji sadrže sekvence za kodiranje antitela; kvasac (npr. Saccharomyces, Pichia) transformisan rekombinantnim ekspresionim vektorima kvasca koji sadrže sekvence za kodiranje antitela; ćelijske sisteme insekata inficirane rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr. bakulovirus) koji sadrže sekvence za kodiranje antitela; ćelijske sisteme biljaka inficirane rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr. virus mozaika karfiola, CaMV; virus mozaika duvana, TMV) ili transformisane rekombinantnim plazmidnim ekspresionim vektorima (npr. Ti plazmid) koji sadrže sekvence za kodiranje antitela; ili ćelijske sisteme sisara (npr. COS, CHO, BLK, 293, 3T3 ćelije) koji nose rekombinantne ekspresione konstrukte koji sadrže promotere dobijene iz genoma ćelija sisara (npr. metalotioneinski promoter) ili iz virusa sisara (npr. kasni promoter adenovirusa, promoter vakcinija virusa 7.5K). Bakterijske ćelije poput Escherichia coli, ili eukariotske ćelije, naročito za ekspresiju celog molekula rekombinantnog antitela, koriste se za ekspresiju molekula rekombinantnog antitela. Na primer, ćelije sisara, kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) u konjunkciji sa vektorima kao što je veliki intermedijerni element ranog promotera gena iz humanog citomegalovirusa, mogu da budu efektivni ekspresioni sistem za antitela (Foecking i sar. Gene 45:101 (1986); Cockett i sar. Bio/Technology 8:2 (1990)).

[0222] Ćelijska linija domaćina koja se koristi za ekspresiju proteina je često sisarskog porekla; stručnjaci su kadri da odrede konkretne ćelijske linije domaćina koje su najpogodnije da se u njima eksprimira željeni genski proizvod. Primeri ćelijskih linija domaćina uključuju, ali nisu ograničeni na, CHO (ćelije jajnika kineskog hrčka), DG44 i DUXB11 (linije jajnika kineskog hrčka, DHFR minus), HELA (humani karcinom grlića materice), CVI (linija bubrega majmuna), COS (derivat CVI sa SV40 T antigenom), VERY, BHK (bubreg bebe hrčka), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblast kineskog hrčka) BALBC/3T3 (mišji fibroblast), HAK (linija bubrega hrčka), SP2/O (mišji mijelom), P3x63-Ag3.653 (mišji mijelom), BFA-lclBPT (goveđe endotelne ćelije), RAJI (humani limfocit) i 293 (humani bubreg). Ćelijske linije domaćina su obično dostupne od komercijalnih ustanova, Američke kolekcije kulture tkiva ili iz objavljene literature.

[0223] Pored toga, može se odabrati soj ćelija domaćina koji moduliše ekspresiju umetnutih sekvenci, ili modifikuje i obrađuje genske proizvode na željeni specifičan način. Takve modifikacije (npr. glikozilacija) i obrađivanje (npr. cepanje) proteinskih proizvoda mogu biti važne za funkciju proteina. Različite ćelije domaćini imaju karakteristike i specifične mehanizme za posttranslacionu obradu i modifikaciju proteina i genskih proizvoda.

Odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina mogu se izabrati kako bi se osigurala ispravna modifikacija i obrada stranih proteina koji se eksprimiraju. U tu svrhu, mogu da se koriste eukariotske ćelije domaćini koje poseduju ćelijski mehanizam za odgovarajuću obradu primarnog transkripta, glikozilaciju i fosforilaciju genskog proizvoda.

[0224] Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina sa visokim prinosom, preferirana je stabilna ekspresija. Na primer, mogu da se konstruišu ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju molekul antitela. Umesto da se koriste ekspresioni vektori koji sadrže virusno poreklo replikacije, ćelije domaćini mogu da se transformišu sa DNK koja je pod kontrolom odgovarajućih ekspresionih kontrolnih elemenata (npr. promoter, pojačivač, sekvence, terminatori transkripcije, mesta poliadenilacije, itd.) i selektabilnog markera. Nakon uvođenja strane DNK, konstruisane ćelije mogu da se ostave da rastu tokom 1-2 dana u obogaćenom medijumu, a zatim se prebacuju u selektivni medijum. Selektabilni marker u rekombinantnom plazmidu daje otpornost na selekciju i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u svoje hromozome i rastu kako bi formirale fokuse koji se zauzvrat mogu klonirati i ekspandovati u ćelijske linije. Ovaj postupak može da bude koristan za konstruisanje ćelijskih linija koje stabilno eksprimiraju molekul antitela.

[0225] Mogu da se koriste brojni selekcioni sistemi, uključujući, ali se ne ograničavajući na gene timidin kinaze herpes simpleks virusa (Wigler i sar. Cell 11:223 (1977)), hipoksantinguanin fosforiboziltransferaze (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)) i adenin fosforiboziltransferaze (Lowy i sar. Cell 22:8171980) koji mogu da se koriste u tk-, hgprt-, odnosno aprt-ćelijama. Takođe antimetabolička otpornost može da se koristi kao osnov za odabir sledećih gena: dhfr, koji daje otpornost na metotreksat (Wigler i sar. Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, koji daje otpornost na mikofenolnu kiselinu (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, koji daje otpornost na aminoglikozid G-418 Clinical Pharmacy 72:488-505; Wu i Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev.

Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); i Morgan i Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993);, TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993); i hygro, koji daje otpornost na higromicin (Santerre i sar. Gene 30:147 (1984). Postupci koji su uobičajeno poznati u oblasti tehnologije rekombinantne DNK koji mogu da se koriste su opisani u Ausubel i sar. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); i u Poglavljima 12 i 13, Dracopoli i sar. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin i sar. J. Mol. Biol.150:1 (1981)

[0226] Ekspresioni nivoi molekula antitela mogu da se povećaju putem amplifikacije vektora (za pregled, vidite Bebbington i Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, sveska 3. (1987)). Kada marker u sistemu vektora koji eksprimira antitelo može da se amplifikuje, porast nivoa inhibitora prisutnog u kulturi ćelije domaćina povećava broj kopija marker gena. Pošto je amplifikovani region povezan sa genom antitela, proizvodnja antitela će se takođe povećati (Crouse i sar. Mol. Cell. Biol.3:257 (1983)).

[0227] In vitro proizvodnja omogućava povećanje obima kako bi se dobile velike količine željenih polipeptida. Tehnike za uzgajanje ćelija sisara u uslovima kulture tkiva su poznate u struci, i uključuju homogenu suspenzionu kulturu, npr. u pneumatskom reaktoru ili reaktoru sa kontinualnim mešanjem, ili imobilisanoj ili zarobljenoj ćelijskoj kulturi, npr. u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, na agaroznim mikroperlicama ili keramičkim patronama. Ako je to neophodno i/ili poželjno, rastvori polipeptida mogu da se prečiste putem uobičajenih postupaka hromatografije, na primer gel filtracijom, jonoizmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom preko DEAD-celuloze ili (imunsko-)afinitetnom hromatografijom, npr. nakon preferencijalne biosinteze sintetičkog polipeptida regiona šarke ili pre ili nakon koraka HIC hromatografije koji je ovde opisan.

[0228] Konstrukti koji kodiraju anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujuće molekule, npr. antitela ili njihove fragmente, varijante ili derivate, kako je ovde otkriveno, takođe mogu da se eksprimiraju u nesisarskim ćelijama kao što su ćelije bakterija ili kvasca ili biljaka.

Bakterije koje spremno preuzimaju nukleinske kiseline uključuju članove enterobacteriaceae, kao što su sojevi Escherichia coli ili Salmonella; Bacillaceae, skao što je Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, i Haemophilus influenzae. Dalje će biti jasno da, kada se eksprimiraju u bakterijama, heterologi polipeptidi obično postaju deo inkluzionih tela.

Heterologi polipeptidi moraju da se izoluju, prečiste i zatim sastave u funkcionalne molekule. Kada su poželjni četvorovalentni oblici antitela, podjedinice će se same sastavljati u četvorovalentna antitela (WO02/096948A2).

[0229] U bakterijskim sistemima, brojni ekspresioni vektori mogu da budu pogodno izabrani u zavisnosti od nameravane upotrebe za molekul antitela koje se eksprimira. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina takvog proteina, za stvaranje farmaceutskih kompozicija molekula antitela, mogu biti poželjni vektori koji usmeravaju ekspresiju visokih nivoa proizvoda fuzionog proteina koji se lako prečišćavaju. Takvi vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, ekspresioni vektor E. coli pUR278 (Ruther i sar. EMBO J.2:1791 (1983)), u kome kodirajuća sekvenca antitela može biti pojedinačno ligirana u vektor u okviru sa lacZ kodirajućim regionom tako da se proizvodi fuzioni protein; pIN vektore (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res.13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol Chem. 24:55035509 (1989)); i slično. pGEX vektori takođe mogu da se koriste za ekspresiju stranih polipeptida kao fuzionih proteina sa glutation S-transferazom (GST). Uopšteno, takvi fuzioni proteini su rastvorljivi i mogu lako da se prečiste iz liziranih ćelija putem adsorpcije i vezivanja za matricu glutation-agaroznih perlica, a zatim eluiranja u prisustvu slobodnog glutationa. pGEX vektori su dizajnirani da uključuju trombin ili mesta cepanja faktora Xa proteaze tako da proizvod kloniranog ciljnog gena može da se otpusti iz ostatka GST.

[0230] Pored prokariota, mogu da se koriste i eukariotski mikrobi. Saccharomyces cerevisiae, ili običan pekarski kvasac, najčešće je korišćen od eukariotskih mikroorganizama, mada su komercijalno dostupni i brojni drugi sojevi, npr. Pichia pastoris.

[0231] Za ekspresiju u kvascu Saccharomyces, uobičajeno se koristi plazmid YRp7 se, na primer, (Stinchcomb i sar. Nature 282:39 (1979); Kingsman i sar. Gene 7:141 (1979);

Tschemper i sar. Gene 10:157 (1980)). Ovaj plazmid već sadrži gen TRP1 koji obezbeđuje selekcioni marker za mutantni soj kvasca koji nema sposobnost da raste u triptofanu, na primer ATCC br.44076 ili PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). Prisustvo trpl lezije koje je karakteristika genoma ćelije domaćina kvasca zatim pruža delotvorno okruženje za detekciju transformacije putem rasta u odsustvu triptofana.

[0232] U sistemu insekta, virus nuklearne poliedroze Autographa californica (AcNPV) obično se koristi kao vektor za ekspresiju stranih gena. Virus raste u ćelijama Spodoptera frugiperda. Kodirajuća sekvenca antitela može biti klonirana pojedinačno u neesencijalne regione (na primer polihedrinski gen) virusa i stavljena pod kontrolu AcNPV promotera (na primer, polihedrinski promoter).

[0233] Kada je anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, kako je ovde otkriveno rekombinantno eksprimiran, on može biti prečišćen bilo kojim postupkom koji je poznat u struci za prečišćavanje molekula imunoglobulina, na primer, putem hromatografije (npr. jonoizmenjivačka, afinitetna, naročito po afinitetu prema specifičnom antigenu nakon proteina A, i gel hromatografija), centrifugiranja, diferencijalne rastvorljivosti, ili putem bilo koje druge standardne tehnike prečišćavanja proteina. Još jedan postupak za povećanje afiniteta antitela iz otkrića je prikazan u US 20020123057 A1.

VII. IDENTIFIKOVANJE VEZUJUĆIH MOLEKULA INDIFERENTNIH PREMA SEROTIPU

[0234] Ovo otkriće obuhvata indiferentan pristup prema meti sa celom ćelijom, za identifikovanje serotipski nezavisnih terapeutskih vezujućih molekula, npr. antitela ili njihovih fragmenata sa superiornom ili željenom terapeutskom aktivnošću. Postupak može da se koristi za identifikovanje vezujućih molekula koji mogu da antagonizuju, neutrališu, uklone ili blokiraju neželjenu aktivnost infektivnog agensa, npr. bakterijskog patogena. Kao što je poznato u struci, mnogi infektivni agensi ispoljavaju značajne varijacije u svojim dominantnim površinskim antigenima, što im omogućava da izbegnu imunski nadzor.

Postupak za identifikovanje koji je ovde opisan može da identifikuje vezujuće molekule koji ciljaju antigene koji su zajednički za mnogo različitih vrsta Pseudomonas ili druge gramnegativne patogene, što obezbeđuje terapeutski agens koji može da cilja više patogena iz više vrsta. Na primer, postupak je korišćen za identifikovanje niza vezujućih molekula koji se vezuju za površinu P. aeruginosa na način nezavisan od serotipa, a kada se vežu za bakterijske patogene, posreduju, promovišu ili pojačavaju opsonofagocitnu (OPK) aktivnost usmerenu na bakterijske ćelije kao što su bakterijski patogeni, npr. oportunističke vrste Pseudomonas (npr. Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida i Pseudomonas alcaligenes) i/ili inhibiraju vezivanje takvih bakterijskih ćelija za epitelne ćelije.

[0235] Ovde je otkriven postupak za identifikovanje vezujućih molekula indiferentnih prema serotipu koji obuhvata: (a) pripremu naivnih i/ili konvalescentnih biblioteka antitela u fagu, (b) uklanjanje antitela specifičnih za serotip iz biblioteke putem panovanja iscrpljivanjem, (c) skrining biblioteke na antitela koja se specifično vezuju za cele ćelije nezavisno od serotipa, i (d) skrining dobijenih antitela na željena funkcionalna svojstva.

[0236] Određeni primeri pružaju pristup za fenotipski skrining cele ćelije kao što je ovde otkriveno sa bibliotekama antitela faga koje su dobijene od naivnih pacijenata ili konvalescentnih pacijenata inficiranih sa P. aeruginosa. Koristeći strategiju panovanja koja je prvobitno izabrana protiv reaktivnosti specifične za serotip, izolovani su različiti klonovi koji vezuju cele ćelije P. aeruginosa. Izabrani klonovi su konvertovani u humana IgG1 antitela i potvrđeno je da reaguju sa kliničkim izolatima P. aeruginosa bez obzira na serotipsku klasifikaciju ili mesto izolovanja tkiva (vidite Primere). Ovde opisana ispitivanja funkcionalne aktivnosti su pokazala da su antitela bila delotvorna u prevenciji vezivanja P.

1

aeruginosa za ćelije sisara i posredovala su u opsonofagocitnom (OPK) ubijanju na način zavisan od koncentracije i nezavisan od serotipa.

[0237] U daljim primerima, prethodno opisani vezujući molekuli ili njihovi fragmenti, antitela ili njihovi fragmenti, ili kompozicije, vezuju se za dva ili više, tri ili više, četiri ili više ili pet ili više različitih serotipova P. aeruginosa, ili za najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% sojeva P. aeruginosa koji su izolovani od inficiranih pacijenata. U daljim otelotvorenjima, sojevi P. aeruginosa su izolovani iz jednog ili više od pluća, ispljuvka, oka, gnoja, izmeta, urina, sinusa, rane, kože, krvi, kosti ili vode u kolenu.

VIII. FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE KOJE SADRŽE ANTI-PSEUDOMONAS PSL I/ILI PCRV VEZUJUĆE MOLEKULE

[0238] Farmaceutske kompozicije koje se koriste u ovom otkriću sadrže farmaceutski prihvatljive nosače koji su dobro poznati osobama sa uobičajenim znanjem u struci. Preparati za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvore, suspenzije i emulzije. Određene ovde obezbeđene farmaceutske kompozicije mogu biti oralno primenjene u prihvatljivoj doznoj formi koja uključuje npr. kapsule, tablete, vodene suspenzije ili rastvore. Određeni farmaceutski sastavi mogu biti primenjeni putem nazalnog aerosola ili inhalacije. Takođe, mogu biti prisutni konzervansi i drugi aditivi poput, na primer, antimikrobnih sredstava, antioksidanasa, helirajućih agenasa i inertnih gasova, i slično.

Odgovarajuće formulacije za upotrebu u ovde opisanim terapijskim postupcima opisane su u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16. izd. (1980).

[0239] Količina anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujućeg molekula, npr. antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata koja može biti kombinovana sa materijalima za prenošenje za proizvodnju pojedinačnog doznog oblika variraće u zavisnosti od lečenog ispitanika i određenog načina primene. Dozni režimi takođe mogu biti prilagođeni da se obezbedi optimalni željeni odgovor (npr. terapeutski ili profilaktički odgovor). Kompozicije takođe mogu da sadrže anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujuće molekule, npr. antitela ili njihove fragmente, varijante ili derivate dispergovane u biokompatibilnom materijalu nosača koji deluje kao odgovarajući sistem za isporuku ili podlogu za jedinjenja.

IX. POSTUPCI LEČENJA KORISTEĆI TERAPEUTSKE VEZUJUĆE MOLEKULE

1 1

[0240] Postupci za pripremu i primenu anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujućih molekula, npr. antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata, kao što je ovde otkriveno na ispitaniku kome je to potrebno, dobro su poznati stručnjacima ili ih oni lako mogu utvrditi. Način primene anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujućih molekula, npr. antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata, može biti, na primer, oralni, parenteralni, putem inhalacije ili topikalni. Izraz parenteralno, kako se ovde koristi, uključuje, npr. intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu, intramuskularnu ili potkožnu primenu. Odgovarajući oblik za primenu biće rastvor za injekciju, naročito za intravensku ili intraarterijsku injekciju ili infuziju. Međutim, u drugim postupcima koji su kompatibilni sa ovde datim razmatranjima, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, kao što je ovde otkriveno, mogu da se isporuče direktno na mesto štetne ćelijske populacije, npr. infekcije, čime se direktno povećava izloženost bolesnog tkiva terapeutskom agensu. Na primer, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekul može biti direktno primenjen na očno tkivo, opekotinu ili plućno tkivo.

[0241] Anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati, kao što je ovde otkriveno, mogu da se primenjuju u farmaceutski delotvornoj količini za in vivo lečenje infekcije Pseudomonasom. U ovom pogledu, opisani molekuli za vezivanje će biti formulisani tako da olakšaju primenu i promovišu stabilnost aktivnog agensa. Za svrhe predmetnog pronalaska, smatra se da farmaceutski delotvorna količina znači količina dovoljna za postizanje delotvornog vezivanja za cilj i za ostvarivanje koristi, npr. lečenja, poboljšanja, ublažavanja, uklanjanja ili prevencije infekcije Pseudomonasom.

[0242] Neki primeri su usmereni na postupak za prevenciju ili lečenje infekcije pseudomonasom kod pojedinca kome je to potrebno, koji obuhvata primenu na ispitaniku delotvorne količine vezujućeg molekula ili njegovog fragmenta, antitela ili njegovog fragmenta, kompozicije, polinukleotida, vektora ili ćelije domaćina opisanih ovde. U daljim primerima, infekcija pseudomonasom je infekcija sa P. aeruginosa. U nekim primerima, ispitanik je čovek. U određenim primerima, infekcija je infekcija oka, infekcija pluća, infekcija opekotine, infekcija rane, infekcija kože, infekcija krvi, infekcija kosti ili kombinacija dve ili više navedenih infekcija. U daljim primerima, ispitanik ima akutnu pneumoniju, opekotinu, infekciju rožnjače, cističnu fibrozu, ili njihovu kombinaciju.

1 2

[0243] Određeni primeri su usmereni na postupak za blokiranje ili prevenciju vezivanja P. aeruginosa za epitelne ćelije koji obuhvata dovođenje u kontakt smeše epitelnih ćelija i P. aeruginosa sa vezujućim molekulom ili njegovim fragmentom, antitelom ili njegovim fragmentom, kompozicijom, polinukleotidom, vektorom, ili ćelijom domaćina kako je ovde opisano.

[0244] Takođe je otkriven postupak za pojačavanje OPK P. aeruginosa koji obuhvata dovođenje u kontakt smeše fagocitnih ćelija i P. aeruginosa sa vezujućim molekulom ili njegovim fragmentom, antitelom ili njegovim fragmentom, kompozicijom, polinukleotidom, vektorom, ili ćelijom domaćina kako je ovde opisano. U daljim otelotvorenjima, fagocitne ćelije su diferencirane ćelije HL-60 ili humani polimorfonuklearni leukociti (PMN).

[0245] U saglasnosti sa obimom ovog otkrića, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati mogu biti primenjeni na ljudima ili drugim životinjama u skladu sa gorepomenutim metodama lečenja u količini dovoljnoj da proizvede terapijski efekat. Anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. ovde otkrivena antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati, mogu da se primenjuju na ljudima ili drugim životinjama u uobičajenom doznom obliku koji je pripremljen kombinovanjem antitela iz otkrića sa uobičajenim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem u skladu sa poznatim tehnikama.

[0246] Delotvorne doze kompozicija iz predmetnog otkrića za lečenje infekcije pseudomonasom variraju u zavisnosti od mnogo različitih faktora, uključujući način primene, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge lekove koji se primenjuju, i da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. Obično, pacijent je čovek, ali nehumani sisari, uključujući transgene sisare, mogu takođe biti tretirani. Doze za lečenje mogu biti titrisane korišćenjem rutinskih postupaka poznatih stručnjacima da se optimizuje bezbednost i efikasnost.

[0247] Anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati mogu da se primenjuju više puta sa različitom učestalošću u zavisnosti od raznovrsnih faktora koji su poznati stručnjacima. Alternativno, anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati mogu da se

1

primenjuju kao formulacija sa produženim otpuštanjem, i u tom slučaju je potrebna manje česta primena. Doze i učestalost variraju u zavisnosti od poluživota antitela u pacijentu.

[0248] Kompozicije iz otkrića mogu da se primenjuju bilo kojim odgovarajućim postupkom, npr. parenteralno, intraventrikularno, oralno, putem spreja za inhalaciju, topikalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili putem implantiranog rezervoara. Termin „parenteralno“, kako se ovde koristi, obuhvata supkutane, intravenske, intramuskularne, intraartikularne, intrasinovijalne, intrasternalne, intratekalne, intrahepatske, intralezione i intrakranijalne tehnike injekcije ili infuzije.

X. SINERGIJA

[0249] Chou i Talalay (Adv. Enzyme Regul., 22:27-55 (1984)) razvili su matematičku metodu za opisivanje eksperimentalnih nalaza kombinovanog dejstva lekova na kvalitativan i kvantitativan način. Za međusobno isključive lekove, pokazali su da uopštena izobol jednačina važi za bilo koji stepen dejstva (vidite stranu 52 u Chou i Talalay). Izobol ili izobologram je grafički prikaz svih doznih kombinacija dva leka koje imaju isti stepen dejstva. U izobologramima, prava linija prikazuje aditivno dejstvo, udubljena kriva (kriva ispod prave linije) predstavlja sinergijsko dejstvo, a ispupčena kriva (kriva iznad prave linije) predstavlja antagonističko dejstvo. Ove krive takođe pokazuju da će kombinacija dva međusobno isključiva leka pokazati istu vrstu dejstva u celom rasponu koncentracija, bilo da je kombinacija aditivna, sinergijska ili antagonistička. Većina kombinacija lekova pokazuje aditivno dejstvo. U nekim slučajevima međutim, kombinacije pokazuju dejstvo koje je manje ili veće od zbirnog. Te kombinacije se nazivaju antagonističke, odnosno sinergijske.

Kombinacija ispoljava terapeutsku sinergiju ako je terapeutski superiorna u odnosu na jedan ili drugi konstituent koji se koristi pri optimalnoj dozi. Vidite, T. H. Corbett i sar. Cancer Treatment Reports, 66, 1187 (1982). Tallarida RJ (J Pharmacol Exp Ther.2001 Sep; 298 (3):865-72) takođe primećuju da: „Dva leka koja proizvode pretežno slično dejstvo će ponekad proizvesti prekomerno ili umanjeno dejstvo kada se koriste istovremeno.

Kvantitativna procena je neophodna da se ti slučajevi razlikuju od prostog aditivnog dejstva.“

[0250] Sinergijsko dejstvo može da se izmeri koristeći postupak kombinovanog indeksa (CI) koju su dali Chou i Talalay (vidite Chang i sar. Cancer Res.45: 2434-2439, (1985)) koji se zasniva na principu srednjeg dejstva. Ovaj postupak izračunava stepen sinergije, aditivnosti ili antagonizma između dva leka pri različitim nivoima citotoksičnosti. Kada je vrednost CI

1 4

manja od 1, postoji sinergija između dva leka. Kada je vrednost CI 1, postoji aditivno dejstvo, ali ne i sinergijsko dejstvo. CI vrednosti veće od 1 ukazuju na antagonizam. Što je manja vrednost CI, veće je sinergijsko dejstvo. U drugom primeru, sinergijsko dejstvo se utvrđuje koristeći frakcionu inhibitornu koncentraciju (FIC). Ova frakciona vrednost se utvrđuje putem ekspresije IC50 leka koji deluje u kombinaciji, kao funkcija IC50 leka koji deluje sam. Za dva interagujuća leka, zbir vrednosti FIC za svaki lek predstavlja meru sinergijske interakcije. Kada je FIC manja od 1, postoji sinergija između dva leka. Vrednost FIC jednaka 1 ukazuje na aditivno dejstvo. Što je manja vrednost FIC, veća je sinergijska interakcija.

[0251] U nekim primerima, sinergijsko dejstvo se ostvaruje u lečenju Pseudomonasa kada se jedan ili više vezujućih agenasa primenjuje u „maloj dozi“ (tj. koristeći dozu ili doze koje bi se smatrale neterapeutskim kada bi se samostalno primenjivale), pri čemu primena male doze vezujućeg agensa u kombinaciji sa drugim vezujućim agensima (koji se primenjuju u maloj ili terapeutskoj dozi) daje sinergijsko dejstvo koje premašuje zbirno dejstvo koje bi inače nastalo usled samostalne pojedinačne primene vezujućeg agensa. U nekim primerima, sinergijsko dejstvo se postiže putem primene jednog ili više vezujućih agenasa primenjenih u „maloj dozi“ pri čemu se mala doza daje da bi se smanjila ili izbegla toksičnost ili druga neželjena dejstva.

XI. IMUNOLOŠKI TESTOVI

[0252] Anti-Pseudomonas Psl i/ili PcrV vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati, mogu da se testiraju na imunospecifično vezivanje bilo kojim postupkom koji je poznat u struci. Imunološki testovi koji mogu da se koriste uključuju, ali nisu ograničeni na, kompetitivne i nekompetitivne sisteme testova koji koriste tehnike kao što su vestern blot, radioimunološki testovi, ELISA (test sa imunosorbentom vezanim za enzim), „sendvič“ imunološki testovi, testovi imunoprecipitacije, reakcije precipitacije, precipitinske reakcije gel difuzije, testovi imunodifuzije, testovi aglutinacije, testovi za fiksiranje komplementa, imunoradiometrijski testovi, fluoroscentni imunotestovi i imunotestovi sa proteinom A, da navedemo samo nekoliko. Takvi testovi su rutinski i dobro poznati u struci (vidite, npr. Ausubel i sar. eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, sveska 1 (1994). Primeri imunoloških testova su ukratko opisani u nastavku (ali ih ne treba tumačiti kao ograničenje).

1

[0253] Postoje raznovrsne metode koje su dostupne za merenje afiniteta interakcije antiteloantigen, ali relativno mali broj za određivanje konstanti brzine. Većina postupaka se oslanja na obeležavanje antitela ili antigena, što neizbežno komplikuje rutinska merenja i uvodi nesigurnosti u izmerene količine. Afinitet antitela može da se izmeri brojnim postupcima, uključujući OCTET®, BIACORE®, ELISA i FACS.

[0254] OCTET® sistem koristi biosenzore u formatu ploče sa 96 bunarčića za objavljivanje kinetičke analize. Vezivanje proteina i događaji vezani za disocijaciju mogu da se prate putem merenja vezivanja jednog proteina u rastvoru sa drugim proteinom koji je imobilisan na FortéBio biosenzoru. U slučaju merenja vezivanja anti-Psl ili PcrV antitela za Psl ili PcrV, Psl ili PcrV je imobilisan na OCTET® vrhovima nakon čega sledi vezivanje antitela, koje je u rastvoru. Asocijacija i disocijacija antitela za imobilisani Psl ili PcrV su zatim detektovani pomoću senzora instrumenta. Podaci su zatim sakupljeni i eksportovani u GraphPad Prism radi konstruisanja krive.

[0255] Površinska plazmonska rezonanca (SPR) koja se obavlja na BIACORE® pruža brojne prednosti u odnosu na uobičajene postupke za merenje afiniteta interakcija antitelo-antigen: (i) nije potrebno obeležavati ni antitelo ni antigen; (ii) antitela ne moraju biti unapred prečišćena, supernatant ćelijske kulture može neposredno da se koristi; (iii) merenje u realnom vremenu, koje omogućava brzo polukvantitativno poređenje interakcija različitih monoklonskih antitela, omogućeno je i dovoljno za mnoge svrhe procenjivanja; (iv) biospecifična površina može da se regeneriše tako da nizovi različitih monoklonskih antitela mogu lako da se porede u istim uslovima; (v) analitičke procedure su u potpunosti automatizovane, a obimna merenja mogu da se obave bez intervencije korisnika.

BIAapplications Handbook, verzija AB (ponovo štampana 1998.), BIACORE® kod br. BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, verzija AB (ponovo štampana 1998.), BIACORE® kod br. BR-1001-84.

[0256] Studije vezivanja zasnovane na SPR zahtevaju da jedan član vezujućeg para bude imobilisan na površini senzora. Vezujući partner koji je imobilisan se naziva ligand. Vezujući partner koji je u rastvoru se naziva analit. U nekim slučajevima, ligand je vezan indirektno za površinu putem vezivanja za drugi imobilisani molekul, koji se naziva molekul za hvatanje. SPR odgovori odražavaju promenu koncentracije mase na detektorskoj površini kada se analiti vezuju ili disociraju.

1

[0257] Na osnovu SPR, BIACORE® merenja u realnom vremenu prate interakcije neposredno kada se dese. Tehnika je veoma prikladna za određivanje kinetičkih parametara. Komparativno rangiranje afiniteta je izuzetno jednostavno obaviti, i kinetičke i afinitetne konstante se mogu dobiti iz podataka senzorgrama.

[0258] Kada se analit injektuje kao diskretni impuls preko površine liganda, nastali senzorgram može da se podeli u tri ključne faze: (i) Povezivanje analita sa ligandom tokom injektovanja uzorka; (ii) Ravnoteža ili stanje mirovanja tokom injektovanja uzorka kada je brzina vezivanja analita uravnotežena sa disocijacijom iz kompleksa; (iii) Disocijacija analita sa površine tokom protoka pufera.

[0259] Faze asocijacije i disocijacije daju informacije o kinetičkim parametrima interakcije analit-ligand (kai kd, brzine nastanka kompleksa i disocijacije, kd/ka= KD). Faza ravnoteže daje informacije o afinitetu interakcije analit-ligand (KD).

[0260] BIAevaluation softver pruža opsežne pogodnosti za konstruisanje krive, koristeći numeričku integraciju i algoritme za globalno konstruisanje. Uz odgovarajuću analizu podataka, pojedinačne konstante brzine i afiniteta za interakciju mogu da se dobiju iz jednostavnih BIACORE® ispitivanja. Raspon afiniteta koji mogu da se mere putem ove tehnike je veoma širok i proteže se od mM do pM.

[0261] Specifičnost epitopa je važna karakteristika monoklonskog antitela. Mapiranje epitopa tehnikom BIACORE®, nasuprot konvencionalnih tehnika koje koriste radioimunološki test, ELISA ili druge postupke površinske adsorpcije, ne zahteva obeležavanje ili prečišćena antitela, i omogućava testove specifičnosti za više mesta koristeći sekvencu nekoliko monoklonskih antitela. Dodatno, brojne analize mogu automatski da se obrade.

[0262] Eksperimenti vezivanja u parovima testiraju sposobnost dva MAb da se istovremeno vežu za isti antigen. MAb usmerena na različite epitope će se vezivati nezavisno, dok će MAb usmerena na identične ili blisko povezane epitope jedno drugom ometati vezivanje. Ovi eksperimenti vezivanja tehnikom BIACORE® su jednostavni za izvođenje.

1

[0263] Na primer, molekul za hvatanje može da se koristi za vezivanje prvog Mab, nakon čega sledi redom dodavanje antigena i drugog Mab. Senzorgrami će pokazati: 1. koliko antigena se vezuje za prvo Mab, 2. u kojoj meri se drugo Mab vezuje za antigen vezan na površini, 3. ako se drugo Mab ne vezuje, da li će promena redosleda testa u paru izmeniti rezultate.

[0264] Peptidna inhibicija je još jedna tehnika koja se koristi za mapiranje epitopa. Ovaj postupak može da dopuni studije vezivanja antitela u paru, i može da poveže funkcionalne epitope sa strukturnim svojstvima kada je primarna sekvenca antigena poznata. Peptidi ili fragmenti antigena su testirani na inhibiciju vezivanja različitih MAb za imobilisani antigen. Peptidi koji ometaju vezivanje datog MAb se smatraju strukturno srodnim sa epitopom koji definiše to MAb.

XII. PRIMENA

[0265] Kompozicija koja sadrži anti-Psl vezujući domen ili anti-PcrV vezujući domen, ili kompozicija koja sadrži i anti-Psl i anti-PcrV vezujući domen, primenjuje se na takav način da oni pružaju sinergijsko dejstvo u lečenju Pseudomonasa kod pacijenta. Primena može biti bilo kojim odgovarajućim putem, pod uslovom da primena daje željeno terapeutsko dejstvo, npr. sinergiju. U određenim primerima, antitela se primenjuju tokom istog ciklusa terapije, npr. tokom jednog ciklusa terapije u propisanom vremenskom periodu, oba antitela se primenjuju na ispitaniku. U nekim primerima, primena antitela može biti tokom sekvencijalne primene u različitim ciklusima terapije, npr. prvi ciklus terapije obuhvata primenu anti-Psl antitela, a drugi ciklus terapije obuhvata primenu anti-PcrV antitela. Doza vezujućih domena koja se primenjuje na pacijentu će takođe zavisiti od učestalosti primene, i može je lako odrediti osoba sa uobičajenim znanjem u struci.

[0266] U drugim primerima, vezujući domeni se primenjuju više od jednom tokom ciklusa lečenja. Na primer, u nekim primerima, vezujući domeni se primenjuju nedeljno tokom tri uzastopne nedelje u ciklusu lečenja od tri ili četiri nedelje.

[0267] Primena kompozicije koja sadrži jedan ili više vezujućih domena može biti istog ili različitih dana, pod uslovom da primena daje željeno terapeutsko dejstvo.

1

[0268] Stručnjacima će biti jasno da su druge doze ili učestalost primene koje daju željeno terapeutsko dejstvo pogodne za upotrebu u predmetnom pronalasku.

XII. KOMPLETI

[0269] U još nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje komplete koji mogu da se koriste za obavljanje postupaka koji su ovde opisani. U određenim otelotvorenjima, komplet sadrži bispecifično antitelo ili njegov fragment iz zahteva 1 u jednoj ili više ambalaža. Stručnjak će lako da prepozna da opisani vezujući domeni, polipeptidi i antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti lako uključeni u jedan od utvrđenih oblika kompleta koji su dobro poznati u struci.

[0270] Primena otkrića će koristiti, ako nije drugačije naznačeno, uobičajene tehnike ćelijske biologije, ćelijskog uzgajanja, molekularne biologije, transgene biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK i imunologije, koje su pokrivene znanjima u struci. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Vidite, na primer, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. izd. Sambrook i sar. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i sar. ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., sveske I i II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis i sar. U.S. Pat. br: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); studiju, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller i M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, sveske 154 i 155 (Wu i sar. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer i Walker, izd., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, sveske I-IV, D. M. Weir i C. C. Blackwell, izd., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); i u Ausubel i sar. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).

[0271] Opšti principi konstruisanja antitela su dati u Antibody Engineering, 2. izdanje, C.A.K. Borrebaeck, Ed., Oxford Univ. Press (1995). Opšti principi konstruisanja proteina su dati u Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., i sar. izd., IRL Press at

1

Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995). Opšti principi antitela i vezivanja antitelo-hapten su dati u: Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2. izd. Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); i Steward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman and Hall, New York, NY (1984). Pored toga, standardni postupci u imunologiji poznati u struci koji nisu specifično opisani generalno se prate kao u Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites i sar. (izd), Basic and Clinical -Immunology (8. izd.), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) i Mishell i Shiigi (izd), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., New York (1980).

[0272] Standardni referentni radovi koji postavljaju generalne principe imunologije uključuju Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, R., i sar, izd., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" u Burden, R., i sar. izd., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, sveska 13, Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby Immunnology 4. izd. izdav. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt i Barbara A. Osborne, H. Freemand & Co. (2000); Roitt, I., Brostoff, J. i Male D., Immunology 6. izd. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. i Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology izd.5, Elsevier Health Sciences Division (2005); Kontermann i Dubel, Antibody Engineering, Springer Verlan (2001); Sambrook i Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach i Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003).

PRIMERI

Primer 1: Konstruisanje i skrining biblioteka displeja faga humanih antitela

[0273] Ovaj primer opisuje pristup panovanja ciljne indiferentne cele ćelije sa bibliotekama faga humanog antitela koje su dobijene od naivnih i oporavljajućih pacijenata koji su inficirani sa P. aeruginosa kako bi se identifikovali novi zaštitni antigeni protiv infekcije Pseudomonasom (Slika 1A). Testovi uključuju in vitro funkcionalna ispitivanja, uključujući testove opsonofagocitnog (OPK) ubijanja i testove vezivanja ćelija koristeći epitelnu ćelijsku

11

liniju A549. Vodeći kandidati, izabrani na osnovu superiorne in vitro aktivnosti, testirani su u modelima P. aeruginosa za akutnu pneunomoniju, keratitis i infekcije opekotina.

[0274] Slika 1B pokazuje konstruisanje bibilioteke displeja faga pacijentovog antitela. Puna krv je sakupljena od 6 oporavljajućih pacijenata 7-10 dana nakon dijagnoze, nakon čega je ekstrahovana RNK i konstruisana je biblioteka faga, kao što je prethodno opisano (Vaughan, T.J., i sar. Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996); Wrammert, J., i sar. Nature 453, 667-671 (2008)). Slika 1C pokazuje da finalna biblioteka kloniranih scFv sadrži 5,4 x 10<8>transformanata i sekvenciranje je pokazalo da je 79% gena scFv bilo kompletne dužine i u okviru. CDR3 petlje VH, koje su često značajne za određivanje specifičnosti epitopa, bile su 84% raznovrsne na aminokiselinskom nivou pre izbora biblioteke.

[0275] Pored biblioteke pacijenta, biblioteka displeja faga naivnog humanog scFv koja sadrži 1x10<11>vezujućih članova (Lloyd, C., i sar. Protein Eng Des Sel 22, 159-168 (2009)) korišćena je za izolovanje antitela (Vaughan, T.J., i sar. Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996)). Toplotno ubijena P.aeruginosa (1x10<9>) je imobilisana u IMMUNO™ epruvetama (Nunc; MAXISORP™), nakon čega sledi izbor displeja faga kao što je opisano (Vaughan, T.J., i sar. Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996)) sa izuzetkom trietanolamina (100 nM) koji se koristi kao eluirajući pufer. Za odabir P. aeruginosa u suspenziji, toplotno ubijene ćelije su blokirane, nakon čega sledi dodavanje blokiranih faga u ćelije. Nakon ispiranja, eluirani fag je korišćen za inficiranje ćelija E. coli kao što je opisano (Vaughan, 1996). Izvlačenje faga iz E. coli i vezivanje za toplotno ubijene P. aeruginosa putem ELISA obavljeno je kako je opisano (Vaughan, 1996).

[0276] Nakon razvoja i potvrđivanja metodologije afinitetnog izbora cele ćelije, nove biblioteke oporavljajućih pacijenata i prethodno konstruisana naivna biblioteka (Vaughan, T.J., i sar. Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996)) prošle su afinitetni odabir u suspenzijama P. aeruginosa soja 3064 sa kompletnim O-antigenom, kao i izogenog wapR mutantnog soja kome nedostaje površinska ekspresija O-antigena. Slika 1D prikazuje da se izlazni titri iz sukcesivnih selekcija iz biblioteke pacijenata povećavaju većom brzinom za biblioteku pacijenata nego za naivnu biblioteku (1x10<7>prema 3x10<5>u 3. ciklusu). Pored toga, otkriveno je da je dupliranje sekvenci CDR3 petlje VH u bibliotekama (mera klonskog obogaćenja tokom selekcije) takođe veće u biblioteci pacijenta, gde dostiže 88-92%, u poređenju sa 15-25% u naivnoj biblioteci u 3. ciklusu (Slika 1D). Pojedinačni scFv fagi iz afinitetnih odabira su zatim ispitani putem ELISA na reaktivnost sa P. aeruginosa sojevima heterologog serotipa (Slika 1E). ELISA ploče (Nunc; MAXISORP™) premazane su sojevima P. aeruginosa iz kultura uzgajanih preko noći kao što je opisano (DiGiandomenico, A., i sar. Infect Immun 72, 7012-7021 (2004)). Razblažena antitela su dodata blokiranim pločama tokom 1 sata, isprana i tretirana sa HRP-konjugovanim anti-humanim sekundardnim antitelima tokom 1 sata, nakon čega sledi razvoj i analiza kao što je opisano (Ulbrandt, N.D., i sar. J Virol 80, 7799-7806 (2006)). Dominantne vrste faga dobijene iz odabira celih ćelija sa obe biblioteke dale su reaktivnost specifičnu za serotip (podaci nisu prikazani). Klonovi koji ispoljavaju serotipski nezavisno vezivanje u odsustvu nespecifičnog vezivanja za E. coli ili albumin goveđeg seruma izabrani su za dalje ispitivanje.

[0277] Za ekspresiju IgG, VH i VL lanci izabranih antitela su klonirani u ekspresione vektore humanog IgG1, koeksprimirani u HEK293 ćelijama i prečišćeni pomoću afinitetne hromatografije sa proteinom A, kao što je opisano (Persic, L., i sar. Gene 187, 9-18 (1997)). Za antitela humanog IgG1 koja su napravljena sa varijabilnim regionima iz ovih izabranih faga nezavisnih od serotipa potvrđena je specifičnost prema P. aeruginosa i dat im je prioritet za dalju analizu putem vezivanja celih ćelija sa dominantnim klinički relevantnim serotipovima putem FACS analize (Slika 1F), pošto je ovaj postupak stroži nego ELISA. Za testove vezivanja zasnovane na protočnoj citometriji, P. aeruginosa sojevi srednje log faze su koncentrovani u PBS-u do OD650od 2,0. Nakon inkubacije antitela (10 µg/ml) i bakterija (∼1 x 10<7>ćelija) tokom 1 h na 4°C uz trešenje, isprane ćelije su inkubirane sa ALEXA FLUOR 647® kozjim anti-humanim IgG antitelom (Invitrogen, Carlsbad, CA) tokom 0,5 h na 4°C. Isprane ćelije su obojene sa BACLIGHT™ zelenom bakterijskom bojom kao što je preporučeno (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uzorci su ubačeni u LSR II protočni citometar (BD Biosciences) i analizirani koristeći BD FacsDiva (v. 6.1.3) i FlowJo (v.9.2; TreeStar).

Antitelima koja pokazuju vezivanje od strane FACS je dalje dat prioritet za testiranje funkcionalne aktivnosti u testu opsonofagocitnog ubijanja (OPK).

Primer 2: Ispitivanje mAb koja promovišu OPK P. aeruginosa

[0278] Ovaj primer opisuje ispitivanje prioritizovanih humanih IgG1 antitela koja promovišu OPK P. aeruginosa. Slika 2A pokazuje da uz izuzetak WapR-007 i antitela za negativnu kontrolu R347, sva antitela posreduju u koncentraciono zavisnom ubijanju luminescentnog soja P. aeruginosa serogrupe O5 (PAO1.lux). WapR-004 i Cam-003 ispoljavaju superiornu aktivnost OPK. Testovi OPK su obavljeni kako je opisano u (DiGiandomenico, A., i sar.

Infect Immun 72, 7012-7021 (2004)), uz modifikacije. Ukratko, testovi su obavljeni na pločama sa 96 bunarčića koristeći 0,025 ml svake komponente OPK; sojeve P. aeruginosa; razblaženi serum bebe zeca; diferencirane HL-60 ćelije; i monoklonsko antitelo. U nekim testovima OPK, korišćeni su luminescentni sojevi P. aeruginosa, koji su konstruisani kako je opisano (Choi, K.H., i sar. Nat Methods 2, 443-448 (2005)). Luminescentni testovi OPK su obavljeni kako je prethodno opisano ali sa utvrđivanjem relativnih jedinica luciferaze (RLU) koristeći Perkin Elmer ENVISION Multilabel čitač ploča (Perkin Elmer).

[0279] Procenjena je sposobnost WapR-004 i Cam-003 antitela da posreduju u aktivnosti OPK protiv drugog klinički relevantnog soja serotipa O-antigena, 9882-80.lux. Slika 2B pokazuje da se pojačana OPK aktivnost WapR-004 i Cam-003 proteže na soj 9882-80 (O11).

[0280] Pored toga, ovaj primer opisuje procenu WapR-004 (W4) mutanata u scFv-Fc formatu da promovišu OPK P. aeruginosa. Jedan mutant, Wap-004RAD (W4-RAD), specifično je stvoren putem mutageneze usmerene na mesto da bi se uklonio RGD motiv u VH. Drugi W4 mutanti su pripremljeni na sledeći način. PCR sa dvostrukim prajmerom je izvedena kao što je opisano (Roux, K.H., PCR Methods Appl 4, S185-194 (1995)), da bi se umnožile varijante W4 (izvedene iz somatskih hipermutacija) iz biblioteke scFv izvedene od pacijenata koji se oporavljaju od infekcije putem P. aeruginosa, za analizu. To je biblioteka iz koje je dobijen WapR-004. Fragmenti varijanti W4 su potklonirani i sekvencirani koristeći standardne procedure koje su poznate u struci. Laki lanci (LC) W4 mutanta su rekombinovani sa teškim lancem (HC) WapR-004 da se dobiju W4 mutanti u scFv-Fc formatu. Pored toga, mutanti teškog lanca (HC) WapR-004 RAD su rekombinovani sa matičnim LC M7 i M8 u scFv-Fc formatu. Konstrukti su pripremljeni koristeći standardne procedure koje su poznate u struci. Slike 11 (A-M) pokazuju da uz izuzetak antitela za negativnu kontrolu R347, svi WapR-004 (W4) mutanti posreduju u koncentraciono zavisnom ubijanju luminescentnog soja P. aeruginosa serogrupe O5 (PAO1.lux).

[0281] Varijabilni region WapR-004-RAD je germinativno mutiran da se smanji potencijalna imunogenost, dajući WapR-004-germinativnu liniju („WapR-004-GL“) i optimizovan je koristeći mutagenezu usmerenu na mesto. Klonovi sa poboljšanim afinitetom prema Psl su izabrani u ispitivanjima zasnovanim na konkurenciji. Najbolji klonovi su rangirani po poboljšanju afiniteta i analizirani u in vitro funkcionalnom testu.14 vodećih optimizovanih

11

klonova su: Psl0096, Psl0170, Psl0225, Psl0304, Psl0337, Psl348, Psl0567, Psl0573, Psl0574, Psl0582, Psl0584, Psl0585, Psl0588 i Psl0589.

Primer 3: Anti-P.aeruginosa antitela nezavisna od serotipa ciljaju Psl egzopolisaharid [0282] Ovaj primer opisuje identifikovanje cilja anti-P. aeruginosa antitela dobijenih od fenotipskog skrininga. Analiza cilja je obavljena da bi se testiralo da li antitela nezavisna od serotipa ciljaju protein ili ugljovodonične antigene. Nije uočen gubitak vezivanja u ELISA za PAO1 ekstrakte cele ćelije koji su temeljno digestirani sa proteinazom K, što ukazuje na to da je reaktivnost ciljala površinski dostupne ostatke ugljovodonika (podaci nisu prikazani). Izogeni mutanti su konstruisani u genima koji su odgovorni za O-antigen, alginat i biosintezu LPS jezgra; wbpL (sa deficitom O-antigena); whpL/algD (sa deficitom O-antigena i alginata); rmlC (sa deficitom O-antigena i okrnjenim spoljašnjim jezgrom); i galU (sa deficitom O-antigena i okrnjenim unutrašnjim jezgrom). P. aeruginosa mutanti su konstruisani na osnovu strategije zamene alela koji je opisao Schweizer (Schweizer, H.P., Mol Microbiol 6, 1195-1204 (1992); Schweizer, H.D., Biotechniques 15, 831-834 (1993)). Vektori su mobilisani iz E. coli soja S17.1 u P. aeruginosa soj PAO1; rekombinanti su izolovani kao što je opisano (Hoang, T.T., i sar. Gene 212, 77-86 (1998)). Delecija gena je potvrđena putem PCR. Mutanti P. aeruginosa su dopunjeni konstruktima zasnovanim na pUCP30T koji imaju gene divljeg tipa. Reaktivnost antitela je utvrđena putem indirektne ELISA na pločama koje su premazane prethodno naznačenim sojevima P. aeruginosa: Slika 3A pokazuje da vezivanje Cam-003 za wbpL ili wbpL/algD dvostruki mutant nije promenjeno, međutim vezivanje za rmlC i galU je ukinuto. Mada su ovi rezultati bili konzistentni sa vezivanjem za LPS jezgro, reaktivnost prema LPS prečišćenom iz PAO1 nije uočena. Nedavno se pokazalo da su geni rmlC i galU potrebni za biosintezu Psl egzopolisaharida, koji je ponavljajući pentasaharidni polimer koji se sastoji od D-manoze, L-ramnoze i D-glukoze. Testirano je vezivanje Cam-003 za izogeni pslA nokaut PAO1Δpsl4, pošto je pslA potreban za biosintezu Psl (Byrd, M.S., i sar. Mol Microbiol 73, 622-638 (2009)). Vezivanje Cam-003 za PAOP1ΔpslA je ukinuto kada je testirano putem ELISA (Slika 3B) i FACS (Slika 3C), dok je molekul LPS u ovom mutantu ostao nepromenjen (Slika 3D). Vezivanje Cam-003 je obnovljeno u trostrukom mutantu PAO1ΔwbpL/algD/pslA dopunjenom sa pslA (Slika 3E) kao i sposobnost Cam-003 da posreduje u opsonskom ubijanju za dopunjeni PAO1ΔpslA nasuprot mutantu (Slika 3F i 3G). Vezivanje Cam-003 antitela za Pel egzopolisaharidni mutant je takođe nepromenjeno, što dalje potvrđuje Psl kao naše ciljno antitelo (Slika 3E). Testovi vezivanja su potvrdili da su preostala antitela takođe vezivala Psl (Slika 3H i 3I).

Primer 4: Anti-Psl mAb blokiraju vezivanje P. aeruginosa za uzgajane epitelne ćelije.

[0283] Ovaj primer pokazuje da su anti-Psl antitela blokirala povezivanje P. aeruginosa sa epitelnim ćelijama. Anti-Psl antitela su dodata u konfluentni monosloj A549 ćelija (humana alveolarna bazna epitelna ćelijska linija adenokarcinoma) uzgajan na neprozirnim pločama sa 96 bunarčića (Nunc Nunclon Delta). Luminescentni P. aeruginosa soj PAO1 (PAO1.lux) u log fazi je dodat pri MOI od 10. Nakon inkubacije PAO1.lux sa A549 ćelijama na 37°C tokom 1 sata, A549 ćelije su isprane, pa je dodat LB+0,5% glukoze. Bakterije su kvantifikovane nakon kratke inkubacije na 37°C kao što je obavljeno u testu OPK koji je opisan u Primeru 2. Merenja iz bunarčića bez A549 ćelija su korišćena kao korekcija za nespecifično vezivanje. Slika 4 pokazuje da su, izuzimajući Cam-005 i WapR-007, sva antitela smanjila povezivanje PAO1.lux sa A549 ćelijama na način zavisan od doze. MAb koja su se najbolje pokazala u testovima OPK, WapR-004 i Cam-003 (vidite Slike 2A-B i Primer 2), takođe su bila najaktivnija u inhibiranju vezivanja ćelija P. aeruginosa za A549 epitelne ćelije pluća, što daje do ∼80% smanjenja u poređenju sa negativnom kontrolom. WapR-016 je bilo treće najaktivnije antitelo, ispoljavajući sličnu inhibitorsku aktivnost kao WapR-004 i Cam-003, ali pri 10-struko većoj koncentraciji antitela.

Primer 5: In vivo presejani sojevi P. aeruginosa održavaju/povećavaju ekspresiju Psl [0284] Da bi se testiralo da li je održana Psl ekspresija in vivo, miševima su intraperitonealno ubrizgani izolati P. aeruginosa, nakon čega sledi sakupljanje bakterija peritonealnim ispiranjem tokom četiri sata nakon infekcije. Prisustvo Psl je analizirano sa kontrolnim antitelom i Cam-003 pomoću protočne citometrije dok su uslovi za vezivanje antitela stroži i omogućavaju kvantifikaciju ćelija koje su pozitivne ili negativne na ekspresiju Psl. Za ex vivo vezivanje, bakterijski inokulumi (0,1 ml) pripremljeni su sa TSA ploče preko noći i isporučeni intraperitonealno BALB/c miševima. 4 sata nakon izazova, bakterije su sakupljene, RBC su lizirani, podvrgnuti ultrazvuku i ponovo suspendovani u PBS-u sa dodatkom 0,1% Tween-20 i 1% BSA. Uzorci su obojeni i analizirani kao što je prethodno opisano u Primeru 1. Slika 5 pokazuje da su bakterije sakupljene nakon peritonealnog ispiranja sa tri soja P. aeruginosa divljeg tipa pokazale snažno bojenje Cam-003, uporedivo sa uzgajanim bakterijama u log fazi (uporedite Slike 5A i 5C). In vivo presejane bakterije divljeg tipa su ispoljile pojačano bojenje u poređenju sa inokulumom (uporedite Slike 5B i 5C). U inokulumima, Psl nije detektovan za soj 6077 i minimalno je detektovan za sojeve PAO1 (O5) i 6206 (O11-citotoksični). Vezivanje Cam-003 za bakterije je povećano u odnosu

11

na inokulume, što ukazuje na to da se ekspresija Psl održava ili raste in vivo. Sojevi divljeg tipa 6077, PAO1 i 6206 eksprimiraju Psl nakon in vivo presejavanja, međutim, soj PAO1 koji ima deleciju pslA (PAO1ΔpslA) nije sposoban da reaguje sa Cam-003. Ovi rezultati dalje potvrđuju Psl kao metu monoklonskih antitela.

Primer 6: Stope preživljavanja za životinje lečene anti-Psl monoklonskim antitelima Cam-003 i WapR-004 na modelu akutne pneumonije sa P. aeruginosa

[0285] Antitela ili PBS su primenjeni 24 sata pre infekcije na svakom modelu. Modeli akutne pneumonije, keratitisa i infekcije termičke povrede sa P. aeruginosa sprovedeni su kao što je opisano (DiGiandomenico, A., i sar. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 4624-4629 (2007)), uz modifikacije. U modelu akutne pneumonije, BALB/c miševi (The Jackson Laboratory) inficirani su putem sojeva P. aeruginosa koji su suspendovani u 0,05 ml inokuluma. U modelu termičke povrede, CF-1 miševima (Charles River) naneta je opekotina veličine 10% ukupne površine tela putem metalnog žiga koji je zagrejan do 92°C tokom 10 sekundi.

Životinje su supkutano inficirane P. aeruginosa sojem 6077 u naznačenoj dozi. Za eksperimente opterećenja organa, akutna pneumonija je indukovana kod miševa, nakon čega su sakupljena pluća, slezina i bubrezi 24 sata nakon infekcije za utvrđivanje CFU.

[0286] Monoklonska antitela Cam-003 i WapR-004 su procenjena na modelu akutne smrtonosne pneumonije, na sojevima P. aeruginosa koji predstavljaju najčešće serotipove koji su povezani sa kliničkim oboljenjem. Slike 6A i 6C pokazuju značajno preživljavanje zavisno od koncentracije kod miševa lečenih sa Cam-003 koji su inficirani sojevima PAO1 i 6294 u poređenju sa kontrolom. Slike 6B i 6D pokazuju da je potpuna zaštita od izazova putem 33356 i citotoksičnog soja 6077 dobijena od Cam-003 sa 45 i 15 mg/kg dok je preživljavanje od 80 i 90% uočeno pri 5 mg/kg za 33356, odnosno 6077. Slike 6E i 6F pokazuju značajno preživljavanje zavisno od koncentracije kod miševa lečenih sa WapR-004 u modelu akutne pneumonije sa sojem 6077 (O11) (8 x 10<5>CFU) (Slika 6E) ili 6077 (011) (6 x 10<5>CFU) (Slika 6F).

[0287] Cam-003 i WapR-004 su zatim ispitani na sposobnost da smanje opterećenje organa sa P. aeruginosa u plućima i širenje na distalne organe, a kasnije su životinje lečene različitim koncentracijama WapR-004, Cam-003, ili kontrolnim antitelima u nekoliko različitih koncentracija. Cam-003 je delotvoran u smanjivanju opterećenja pluća sa P. aeruginosa za sva četiri testirana soja. Cam-003 je bio najdelotvorniji protiv veoma

11

patogenog citotoksičnog soja, 6077, gde je mala doza bila delotvorna koliko i velika doza (Slika 7D). Cam-003 je takođe imao izraženo dejstvo u smanjenju širenja na slezinu i bubrege kod miševa koji su inficirani sa PAO1 (Slika 7A), 6294 (Slika 7C) i 6077 (Slika 7D), dok širenje na ove organe nije uočeno kod miševa inficiranih sa 33356 (Slika 7B). Slike 7E i 7F pokazuju da je slično tome, WapR-004 smanjio opterećenje organa nakon indukovanja akutne pneumonije putem 6294 (O6) i 6206 (O11). Specifično, WapR-004 je bio delotvoran u smanjenju širenja P. aeruginosa na slezinu i bubrege kod inficiranih miševa.

Primer 7: Konstruisanje anti-PcrV monoklonskog antitela V2L2

[0288] VelocImmune® miševi (Regeneron Pharmaceuticals) imunizovani su putem UltraShort postupka imunizacije sa r-PcrV i praćeni su serumski titri za vezivanje za PcrV i neutralisanje hemolitičke aktivnosti živih P.aeruginosa. Miševi koji pokazuju antihemolitičku aktivnost u serumu su žrtvovani, i sakupljeni su slezina i limfni čvorovi (aksijalni, ingvinalni i poplitealni). Ćelijske populacije iz ovih organa su panovane sa biotinilovanim r-Pcrv kako bi se izabrale anti-PcrV specifične B-ćelije. Izabrane ćelije su zatim fuzionisane sa partnerskim mišjim mijelomom P3X63-Ag8 i zasejane sa 25Kćelija/bunarčiću u selekcionom medijumu hibridoma. Nakon 10 dana, medijum iz bunarčića hibridoma je u potpunosti zamenjen svežim medijumom i nakon 3-4 dana supernatanti hibridoma su testirani na antihemolitičku aktivnost. Kolonije koje pokazuju antihemolitičku aktivnost su klonirane u ograničenom razblaženju sa 0,2 ćelija/bunarčiću ploča sa 96 bunarčića, i test antihemolitičke aktivnosti je ponovljen. Klonovi koji pokazuju antihemolitičku aktivnost su prilagođeni medijumu za uzgajanje hibridoma koji sadrži Ultralow IgG. IgG iz kondicioniranog medijuma je prečišćen i testiran na in vitro antihemolitičku aktivnost i in vivo na zaštitu od infekcije putem P.aeruginosa. Antitela su takođe kategorizovana u različite grupe pomoću konkurentskog testa. Varijabilni (V) domeni antitela od interesa su potklonirani iz kDNK koja je dobijena od njihovih različitih odgovarajućih klonova. Potklonirani V-segmenti su fuzionisani u okviru sa kDNK iz odgovarajućeg konstantnog domena u ekspresionom plazmidu sisara. Rekombinantni IgG su eksprimirani i prečišćeni iz HEK293 ćelija. U slučajevima kada je više od jedne V-sekvence kDNK dobijeno od konkretnog klona, sve kombinacije varijabilnih teških i lakih lanaca su eksprimirane i okarakterisane za identifikovanje funkcionalnog IgG.

11

Primer 8: Stope preživljavanja za životinje lečene anti-Psl monoklonskim antitelima Cam-003, WapR-004 i anti-PcrV monoklonskim antitelom V2L2 na modelu infekcije rožnjače sa P. aeruginosa

[0289] Delotvornost Cam-003 i WapR-004 je sledeća procenjena na modelu infekcije rožnjače sa P. aeruginosa koji naglašava sposobnost patogena da se vežu i kolonizuju oštećeno tkivo. Slike 8 A-D i 8 F-G pokazuju da miševi koji dobijaju Cam-003 i WapR-004 imaju značajno manju patologiju i smanjen broj bakterija u ukupnim homogenatima oka nego što je uočeno kod životinja lečenih negativnom kontrolom. Slika 8E pokazuje da je Cam-003 takođe delotvoran kada se testira na modelu termičke povrede, i pruža značajnu zaštitu pri 15 i 5 mg/kg u poređenju sa antitelom lečenom kontrolom. Slika 8 (H): Aktivnost anti-Psl i anti-PcrV monoklonskih antitela V2L2 je testirana na mišjem modelu keratitisa oka sa P. aeruginosa. C3H/HeN miševima je intraperitonealno (IP) injektovan PBS ili kontrolno IgG1 antitelo (R347) sa 45 mg/kg ili WapR-004 (α-Psl) sa 5 mg/kg ili V2L2 (α-PcrV) sa 5mg/kg, 16 sati pre infekcije sa 6077 (O11-citotoksični- 1x10<6>CFU). Neposredno pre infekcije, miševi su anestezirani i inicirane su tri ogrebotine od 1 mm na rožnjači i površinskoj stromi jednog oka svakog miša koristeći iglu od 27 gejdža pod mikroskopom za disekciju, a zatim je topikalno primenjen P. aeruginosa soj 6077 u 5 µl inokuluma. Oči su fotografisane 48 sati nakon infekcije, a zatim je ocenjena rožnjača putem vizuelnog pregleda očiju pod mikroskopom za disekciju. Ocenjivanje infekcije rožnjače je izvršeno kao što su prethodno opisali Preston i sar. (Preston, MJ., 1995, Infect. Immun. 63:3497). Ukratko, inficirane oči 48 h nakon infekcije putem soja 6077 ocenio je istraživač koji nije bio upoznat sa lečenjem životinja. Korišćena je sledeća šema za ocenjivanje: ocena 0, oko je makroskopski identično sa neinficiranim okom; ocena 1, blaga zamućenost koja delimično prekriva zenicu; ocena 2, gusta zamućenost koja prekriva zenicu; ocena 3, gusta zamućenost koja prekriva celu zenicu; ocena 4, perforacija rožnjače (skupljanje očne jabučice). Miševi koji su dobijali sistemski doziran (IP) Cam-003 ili WapR-004RAD pokazali su znatno manju patologiju i smanjen broj bakterijskih jedinica formiranja kolonije (CFU) u ukupnim homogenatima oka nego što je uočeno kod životinja lečenih sa R347 kontrolnim mAb. Slični rezultati su uočeni kod životinja lečenih sa V2L2 u poređenju sa kontrolama lečenim sa R347.

Primer 9: Cam-003 Fc mutantno antitelo, Cam-003-TM, ima smanjenu OPK i in vivo efikasnost, ali zadržava aktivnost antićelijskog vezivanja.

[0290] Uzevši u obzir potencijal dvojnih mehanizama delovanja, stvoren je Fc mutant Cam-003, Cam-003-TM, koji nosi mutacije u Fc domenu koje smanjuju njegovu interakciju sa Fcγ

11

receptorima (Oganesyan, V., i sar. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64, 700-704 (2008)), kako bi se identifikovalo da li je zaštita u većoj korelaciji sa antićelijskim vezivanjem ili OPK aktivnošću. Mutanti P. aeruginosa su konstruisani na osnovu strategije zamene alela koji je opisao Schweizer (Schweizer, H.P., Mol Microbial 6, 1195-1204 (1992); Schweizer, H.D., Biotechniques 15, 831-834 (1993)). Vektori su mobilisani iz E. coli soja S17.1 u P. aeruginosa soj PAO1; rekombinanti su izolovani kao što je opisano (Hoang, T.T., i sar. Gene 212, 77-86 (1998)). Delecija gena je potvrđena putem PCR. Mutanti P. aeruginosa su dopunjeni konstruktima zasnovanim na pUCP30T koji imaju gene divljeg tipa. Slika 9A pokazuje da Cam-003-TM ispoljava 4-struki pad aktivnosti OPK u poređenju sa Cam-003 (EC50od 0,24, odnosno 0,06) ali je bio delotvoran u testu vezivanja ćelija (Slika 9B). Slika 9C pokazuje da je Cam-003-TM takođe bio manje delotvoran protiv pneumonije, što ukazuje na to da je optimalna aktivnost OPK neophodna za optimalnu zaštitu. Testovi OPK i ćelijskog vezivanja su obavljeni kao što je prethodno opisano u Primerima 2, odnosno 4.

Primer 10: Mapiranje epitopa i relativni afinitet prema anti-Psl antitelima

[0291] Mapiranje epitopa je obavljeno pomoću kompetitivnog ELISA testa i potvrđeno koristeći OCTET® protočni sistem sa Psl dobijenim iz supernatanta kulture preko noći P. aeruginosa soja PAO1. Za kompetitivni ELISA test, antitela su biotinilovana koristeći EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin i komplet za biotinilovanje (Thermo Scientific). Ploče premazane antigenom su tretirane sa EC50biotinilovanih antitela koja su inkubirana zajedno sa neobeleženim antitelima. Nakon inkubacije sa HRP-konjugovanim streptavidinom (Thermo Scientific), ploče su razvijene kao što je prethodno opisano. Konkurentski eksperimenti između anti-Psl mAb su utvrdili da antitela ciljaju najmanje tri jedinstvena epitopa, i nazivaju se antitela klase 1, 2 i 3 (Slika 10A). Antitela klase 1 i 2 se ne takmiče za vezivanje, dok antitelo klase 3, WapR-016, delimično inhibira vezivanje antitela klase 1 i 2.

[0292] Afinitet antitela je utvrđen pomoću OCTET® testova vezivanja koristeći Psl dobijen od supernatanta PAO1 kultura preko noći. KDantitela je određena putem uprosečavanja kinetike vezivanja sedam koncentracija za svako antitelo. Merenja afiniteta su obavljena pomoću instrumenta FORTEBIO® OCTET® 384 koristeći ploče sa bunarčićima kosih ivica sa 384 bunarčića. Supernatant iz PAO1 kultura preko noći ± pslA su korišćeni kao izvor Psl. Uzorci su naneti na OCTET® aminopropilsilanske (hidrirane u PBS-u) senzore i blokirani, nakon čega sledi merenje anti-Psl mAb vezivanja pri nekoliko koncentracija, i disocijacija u PBS 1% BSA. Sve procedure su obavljene kao što je opisano (Wang, X., i sar. J Immunol

11

Methods 362, 151-160). Sirovi ΔnM podaci za asocijaciju i disocijaciju su naneti na krivu pomoću GraphPad Prism. Slika 10A prikazuje relativne afinitete vezivanja anti-Psl antitela koja su prethodno okarakterisana. Antitela klase 2 su imala najveće afinitete od svih anti-Psl antitela. Slika 10A takođe prikazuje sažetak ćelijskog vezivanja i podatke iz OPK eksperimenata. Slika 10B pokazuje relativne afinitete vezivanja i EC50 vrednosti OPK Wap-004RAD (W4RAD) mutanta kao i drugih W4 mutanata koji su vodeći optimizovani putem mutageneze usmerene na mesto, kako je opisano u Primeru 2. Slika 10C prikazuje relativne afinitete vezivanja Wap-004RAD (W4RAD), Wap-004RAD-germinativne linije (W4RAD-GL) kao i vodećih optimizovanih anti-Psl monoklonskih antitela (Psl0096, Psl0170, Psl0225, Psl0304, Psl0337, Psl348, Psl0567, Psl0573, Psl0574, Psl0582, Psl0584, Psl0585, Psl0588 i Psl0589). Istaknuti klonovi Psl0096, Psl0225, Psl0337, Psl0567 i Psl0588 su izabrani na osnovu njihove pojačane aktivnosti OPK, kao što je prikazano u Primeru 10 u nastavku.

Primer 11: Procena vodećih optimizovanih WapR-004 (W4) mutantnih klonova i vodećih optimizovanih anti-Psl monoklonskih antitela u P. aeruginosa testu opsonofagocitnog ubijanja (OPK)

[0293] Ovaj primer opisuje testiranje vodećih optimizovanih WapR-004 (W4) mutantnih klonova i vodećih optimizovanih anti-Psl monoklonskih antitela da promovišu OPK P. aeruginosa koristeći postupak opisan u Primeru 2. Slike 11A-Q pokazuju da uz izuzetak antitela za negativnu kontrolu R347, sva antitela posreduju u koncentraciono zavisnom ubijanju luminescentnog soja P. aeruginosa serogrupe O5 (PAO1.lux).

Primer 12: Anti-PcrV monoklonsko antitelo V2L2 smanjuje smrtnost od akutne pneumonije kod više sojeva

[0294] Raznovrsnost epitopa PcrV je analizirana koristeći tri pristupa: postupak citometrije zasnovan na perlicama, kompetitivni ELISA i vestern blot fragmentovanog rPcrV.

Konkurentski eksperimenti između anti-PcrV mAb su utvrdili da antitela ciljaju najmanje šest jedinstvenih epitopa, i nazivaju se antitela klase 1, 2, 3, 4, 5 i 6 (Slika 12A). Antitela klase 2 i 3 delimično se takmiče za vezivanje. MAb koja predstavljaju dodatne klase epitopa: klasu 1 (V2L7, 3G5, 4C3 i 11A6), klasu 2 (1E6 i 1F3), klasu 3 (29D2, 4A8 i 2H3), klasu 4 (V2L2) i klasu 5 (21F1, LE10 i SH3) testirana su na in vivo zaštitu kao što je opisano u nastavku.

[0295] Nova anti-PcrV mAb su izolovana koristeći tehnologiju hibridoma i najpotentniji inhibitori T3SS su izabrani koristeći test inhibicije lize zečjih eritrocita. Analiza procenta

12

inhibiranja citotoksičnosti je obavljena za matično V2L2 mAb, mAb166 (pozitivna kontrola) i R347 (negativna kontrola), kada su antitela primenjena na uzgajanu ćelijsku liniju bronhoepitelnih ćelija A549 u kombinaciji sa log-fazom P. aeruginosa soja 6077 (exoU+) pri MOI od približno 10. Liza A549 je testirana merenjem aktivnosti i lize otpuštene laktat dehidrogenaze (LDH) u prisustvu mAb u poređenju sa bunarčićima bez mAb kako bi se utvrdio procenat inhibicije. V2L2 mAb, mAb166 (pozitivna kontrola) i R347 (negativna kontrola) ispitana su na sposobnost da spreče lizu RBC, kada su antitela pomešana sa logfazom P. aeruginosa 6077 (exoU<+>) i ispranim zečjim eritrocitima (RBC) i inkubirana tokom 2 sata na 37°. Netaknuti RBC su peletirani i obim lize je utvrđen merenjem OD405supernatanta bez ćelija. Liza u prisustvu anti-PcrV mAb je upoređena sa bunarčićima bez mAb da bi se odredio procenat inhibicije. Antitelo za pozitivnu kontrolu, mAb166, je prethodno okarakterisano anti-PcrV antitelo (J Infect Dis.186: 64-73 (2002), Crit Care Med.

40: 2320-2326 (2012)).(B) Matično V2L2 je pokazalo inhibiciju citotoksičnosti sa IC50 od 0,10 µg/ml i ispoljilo IC50 koncentraciju koja je 28-struko manja od mAb166 (IC50 od 2,8 µg/ml). (C) V2L2 je takođe pokazalo prevenciju lize RBC sa IC50 od 0,37 µg/ml i ispoljilo IC50 koncentraciju koja je 10-struko manja od mAb 166 (IC50 od 3,7 µg/ml).

[0296] Varijabilni region V2L2 je bio u potpunosti germinativno mutiran kako bi se smanjila potencijalna imunogenost. V2L2 je afinitetno sazrelo koristeći pristup škrte mutageneze kako bi se randomizovala svaka pozicija sa 20 aminokiselina za svih šest CDR, tako identifikujući pojedinačne mutacije sa poboljšanim afinitetom. Zatim je korišćena kombinatorna bibilioteka, koja kodira sve moguće kombinacije pojedinačnih mutacija sa poboljšanim afinitetom. Klonovi sa poboljšanim afinitetom prema PcrV su izabrani koristeći vezujući ELISA u IgG formatu. Najbolji klonovi su rangirani po poboljšanju afiniteta i analizirani u in vitro funkcionalnom testu. CDR V2L2 su sistematski mutagenizovani i klonovi sa poboljšanim afinitetom prema PcrV su izabrani u ispitivanjima zasnovanim na konkurenciji. Klonovi su rangirani po povećanju afiniteta i analizirani u funkcionalnom testu. Kao što je prikazano na Slici 12D, liza RBC je analizirana na V2L2-germinativno mutirana MAb (V2L2-GL), V2L2-GL optimizovana mAb (V2L2-P4M, V2L2-MFS, V2L2-MD i V2L2-MR) i antitelo za negativnu kontrolu R347 koristeći A549 ćelije inficirane Pseudomonas sojem 6077. V2L2-GL, V2L2-P4M, V2L2-MFS, V2L2-MD i V2L2-MR pokazuju prevenciju lize RBC. Kao što je prikazano na Slici 12E, mAb 1E6, 1F3, 11A6, 29D2, PCRV02 i V2L7 pokazuju prevenciju lize RBC. Kao što je prikazano na Slici 12F, V2L2 je potentniji u prevenciji lize RBC nego 29D2.

[0297] Kinetika vezivanja V2L2-GL i V2L2-MD je izmerena koristeći instrument Bio-Rad ProteOn™ XPR36. Antitela su uhvaćena na GLC biosenzorskom čipu koristeći antihumane IgG reagense, rPcrV protein je injektovan sa više koncentracija i usledila je faza disocijacije tokom 600 sekundi. Podaci su zabeleženi i analizirani koristeći softver ProteOn Manager. Slika 12 (G-H) pokazuje relativne afinitete vezivanja (G) V2L2-GL i (H) V2L2-MD antitela. Klon V2L2-MD ima povećanu Kd za 2-3 puta u odnosu na V2L2-GL.

[0298] In vivo dejstvo primene anti-PcrV antitela je ispitano kod miševa koristeći model akutne pneumonije. Grupe miševa su tretirane ili rastućim koncentracijama V2L2 antitela, anti-PcrV antitelom za pozitivnu kontrolu (mAb166) ili negativnom kontrolom (R347), kao što je prikazano na Slici 13 (A-B). Grupe miševa su takođe tretirane ili rastućim koncentracijama V2L2 antitela, PcrV antitelom PcrV-02 ili negativnom kontrolom (R347), kao što je prikazano na Slici 13 (C-D). Dvadeset četiri sata nakon tretiranja, svi miševi su inficirani sa 5 x 10<7>CFU (C) Pseudomonas aeruginosa 6294 (O6) ili (D) PA103A (O11). Kao što je prikazano na Slici 13, skoro sve životinje tretirane kontrolom su podlegle infekciji do 48 sati nakon infekcije. Međutim, V2L2 je pokazalo dejstvo zavisno od doze na poboljšano preživljavanje čak i do 168 sati nakon infekcije. Nadalje, V2L2 je pružilo daleko potentniju zaštitu nego mAb166 pri sličnim dozama (P=0,025, 5 mg/kg za soj 6077; P < 0,0001, 1 mg/kg za soj 6294).

[0299] Grupe miševa su tretirane ili rastućim koncentracijama 11A6, 3G5 ili V2L7, istim koncentracijama 29D2, 1F3, 1E6, V2L2, LE10, SH3, 4A8, 2H3, ili 21F1, rastućim koncentracijama 29D2, rastućim koncentracijama V2L2, PcrV antitelom PcrV-02 ili negativnom kontrolom (R437), kao što je prikazano na Slici 13 (E-H). Miševima su intraperitonealno (IP) injektovana mAb 24 sata pre intranazalne infekcije Pseudomonas sojem 6077 (1 x 10<6>CFU/životinji). Kao što je prikazano na Slici 13E, mAb 11A6, 3G5 i V2L7 nisu pružila zaštitu in vivo. Kao što je prikazano na Slici 13F, mAb 29D2 pruža zaštitu in vivo. Kao što je prikazano na Slici 13G, mAb V2L2 takođe pruža zaštitu in vivo. Slika 13H pokazuje in vivo poređenje 29D2 i V2L2. Slika 13I pokazuje da mAb V2L2 štiti od dodatnih sojeva Pseudomonas (tj.6294 i PA103A).

[0300] Opterećenje organa pseudomonasom inficiranih miševa je takođe ispitivano kao odgovor na primenu V2L2. Slika 14 (A) Miševi su tretirani ili sa 1 mg/kg R347 (kontrola), ili 1 mg/kg, 0,2 mg/kg, ili 0,07 mg/kg V2L2, a zatim intranazalno inficirani sa 1,2 x 10<6>cfu Pseudomonas 6206. Slika 14 (B) Miševi su takođe tretirani ili sa 15 mg/kg R347 (negativna kontrola); 15,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, ili 1,0 mg/kg mAb166 (pozitivna kontrola); ili 5,0 mg/kg, 1,0 mg/kg, ili 0,2 mg/kg V2L2, a zatim intranazalno inficirani sa 5,5 x 10<6>cfu Pseudomonas 6206. Kao što je prikazano na Slici 14 (A-B), dok je V2L2 imao malo dejstvo na klirens u bubrezima, značajno je smanjilo širenje na pluća i slezinu na način zavisan od doze. Dodatno, V2L2 je obezbedio značajno veće smanjenje CFU u organima nego mAb166 sa sličnim dozama (P < 0,0001, 1 mg/kg, pluća).

Primer 13: In vivo aktivnost kombinovane terapije koristeći WapR-004 (anti-Psl) i V2L2 (anti-PcrV) antitela

[0301] In vivo dejstvo kombinovane primene anti-Psl i anti-PcrV vezujućih domena je dalje ispitivano kod miševa koristeći antitela V2L2 i WapR-004 (RAD). Grupe miševa su tretirane sa R347 (2,1 mg/kg - negativna kontrola), V2L2 (0,1 mg/kg), W4-RAD (0,5 mg/kg), ili kombinacijom V2L2/W4 (ili 0,1, 0,5, 1,0 ili 2,0 mg/kg svako). Dvadeset četiri sata nakon primene antitela, svi miševi su inficirani inokulumom koji sadrži 5,25 x 10<5>cfu 6206 (O11-ExoU+). Dvadeset četiri sata nakon infekcije, pluća, slezina i bubrezi su sakupljeni, homogenizovani i naneti radi identifikacije jedinica koje formiraju kolonije (CFU) po gramu tkiva. Kao što je prikazano na Slici 15, pri testiranim koncentracijama, i V2L2 i W4 su delotvorna u smanjivanju opterećenja organa, kombinacija V2L2/W4 je pokazala aditivni efekat u klirensu tkiva. Histološko ispitivanje plućnog tkiva je otkrilo manje krvarenja, manje edema i manje inflamatornog infiltrata u poređenju sa miševima koji dobijaju samo V2L2 ili WapR-004 (Tabela 5).

[0302] Slično imunizovane životinje su takođe procenjene na preživljavanje kod akutnih infekcija pneumonijom.

Tabela 5

Grupa Lečenje Ukupan utisak Krvarenje Edem Inflamatorni Gram

12

Grupa Lečenje Ukupan utisak Krvarenje Edem Inflamatorni Gram

Grupa Lečenje Ukupan utisak Krvarenje Edem Inflamatorni Gram

Primer 14: Stopa preživljavanja za životinje lečene anti-PcrV monoklonskim antitelom V2L2 na modelu akutne pneumonije sa P. aeruginosa

[0303] Monoklonska antitela V2L2-GL, V2L2-MD, V2L2-A, V2L2-C, V2L2-PM4 i V2L2-MFS su testirana na modelu akutne smrtonosne pneumonije na P. aeruginosa soj 6077 kao što je prethodno opisano u Primeru 11. Slike 16 (A-F) prikazuju preživljavanje kod miševa tretiranih sa V2L2 koji su inficirani putem soja 6077 u poređenju sa kontrolom. Međutim, nije uočena značajna razlika u preživljavanju između V2L2 antitela pri bilo kojoj dozi: 0,5 mg/kg i 1 mg/kg (A-C) ili 0,5 mg/kg i 0,1 mg/kg (D-F). Slike 16 (G-I) prikazuju preživljavanje kod miševa tretiranih sa V2L2 koji su inficirani putem soja 6077 u poređenju sa kontrolom. Nije uočena značajna razlika u preživljavanju između V2L2 antitela pri bilo kojoj dozi: 0,5 mg/kg i 1 mg/kg (G-I). (A-H)

[0304] Svi kontrolni miševi su podlegli infekciji za približno 48 sati nakon infekcije.

Primer 15: Konstruisanje WapR-004/V2L2 bispecifičnih antitela

[0305] Slika 17A pokazuje model TNFα bispecifičnih konstrukata. Za Bs1-TNFα/W4, W4 scFv je fuzionisan sa amino-terminusom TNFα VL putem (G4S)2 linkera. Za Bs2-TNFα/W4, W4 scFv je fuzionisan sa amino-terminusom TNFα VH putem (G4S)2 linkera. Za Bs3-TNFα/W4, W4 scFv je fuzionisan sa karboksi-terminusom CH3 putem (G4S)2 linkera.

12

[0306] Pošto kombinacija WapR-004 V2L2 pruža zaštitu od izazova Pseudomonasom, stvoreni su bispecifični konstrukti koji sadrže WapR-004 scFv (W4-RAD) i V2L2 IgG (Slika 17B). Radi stvaranja Bs2-V2L2-2C, W4-RAD scFv je fuzionisan sa N-terminalnim V2L2 VH putem (G4S)2 linkera. Radi stvaranja Bs3-V2L2-2C, W4-RAD scFv je fuzionisan sa C-terminalnim CH3 putem (G4S)2 linkera. Radi stvaranja Bs4-V2L2-2C, W4-RAD scFv je umetnut u region šarke, povezan putem (G4S)2 linkera na N-kraj ili C-kraj scFv. Radi stvaranja Bs2-W4-RAD-2C, V2L2 scFv je fuzionisan sa amino-terminusom W4-RAD VH putem (G4S)2 linkera.

[0307] Radi stvaranja W4-RAD scFv za Bs3 konstrukt, W4-RAD VH i VL su amplifikovani pomoću PCR. Prajmeri koji su korišćeni za amplifikaciju VH W4-RAD su: W4-RAD VH direktni prajmer: uključuje (G4S)2 linker i 22bp VH N-terminalne sekvence (GTAAAGGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGAGGTGCAGCTGTTGG AGTCGG (SEQ ID NO:224)); i W4-RAD VH reversni prajmer: uključuje deo (G4S)4 linkera i 22 bp VH C-terminalne sekvence (GATCCTCCGCCGCCGCTGCCCCCTCCCCCAGAGCCCCCTCCGCCACTCGAGA CGGTGACCAGGGTC (SEQ ID NO:225). Slično tome, VL W4-RAD je amplifikovan putem PCR koristeći prajmere: W4-RAD VL direktni prajmer: uključuje deo (G4S)2 linkera i 22 bp VL N-terminalne sekvence (AGGGGGCAGCGGCGGCGGAGGATCTGGGGGAGGGGGCAGCGAAATTGTGTT GACACAGTCTC (SEQ ID NO:226)); i W4-RAD VL reversni prajmer: uključuje deo sekvence vektora i 22 bp VL C-terminalne sekvence (CAATGAATTCGCGGCCGCTCATTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAC SEQ ID NO:227)), Preklapajući fragmenti su onda zajedno fuzionisani da formiraju W4-RAD scFv.

Sekvenca scFv W4-RAD u Bs3 vektoru: podvučene sekvence su G4S linker

[0308]

[0309] Nakon što je scFv fragment W4-RAD amplifikovan, prečišćen je pomoću gela i ligiran u vektor Bs3 koji je digestovan putem BamHI/NotI. Ligacija je obavljena koristeći

12

sistem In-Fusion, nakon čega sledi transformacija u Stellar kompetentne ćelije. Kolonije su sekvencirane da bi se potvrdio ispravan scFv insert W4-RAD.

[0310] Radi stvaranja Bs3-V2L2-2C, IgG deo u Bs3 vektoru je zamenjen sa V2L2 IgG.

Ukratko, Bs3 vektor koji sadrži scFv W4-RAD je digestovan putem BssHII / SalI i dobijeni vektor je prečišćen pomoću gela. Slično tome, vektor koji sadrži V2L2 vektor je digestovan putem BssHII / SalI i dobijeni V2L2 insert je prečišćen pomoću gela. V2L2 insert je zatim ligiran pomoću Bs3-W4-RAD scFv vektora i kolonije su sekvencirane da bi se potvrdio ispravan V2L2 IgG insert.

[0311] Sličan pristup je korišćen za stvaranje Bs2-V2L2-2C.

VH sekvence W4-RAD scFv-V2L2 u Bs2 vektoru: podvučene sekvence su G4S linker [0312]

[0313] Sledeći prajmeri su korišćeni za amplifikovanje W4-RAD scFv. VH (direktni prajmer) i VL (reversni prajmer): W4-RAD VH direktni prajmer za vektor Bs2 koji uključuje izvesnu količinu introna, 3' signalnog peptida i 22bp W4-RAD VH N-terminalne sekvence (TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGG (SEQ ID NO:230)) i W4-RAD VL reversni prajmer za vektor Bs2: Uključuje (G4S)2 linker i 32 bp VL C terminalne sekvence (CCCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCACAGCC GAAAG (SEQ ID NO:231))

[0314] Za amplifikovanje VH regiona V2L2, korišćeni su sledeći prajmeri: V2L2 VH direktni prajmer: uključuje (G4S)2 linker i 22 bp V2L2 VH N-terminalne sekvence (GGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGAGATGCAGCTGTTGGAGTCT GG (SEQ ID NO:232)); i V2L2 VH reversni prajmer: uključuje izvesnu količinu CH1 N-

12

terminalne sekvence i 22 bp V2L2 VH C-terminalne sekvence (ATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC (SEQ ID NO: 233)).

[0315] Ovi prajmeri su onda korišćeni za amplifikaciju V2L2 VH, koji je zatim preklapanjem spojen sa W4-RAD scFv i V2L2 VH da se dobije W4-RAD scFv-V2L2-VH, W4-RAD scFv-V2L2 VH je zatim ligiran u Bs2 vektor prečišćavanjem na gelu W4-RAD scFv - V2L2 VH (iz PCR preklapanja); digestija Bs2 vektora sa BsrGI/SalI, i traka vektora prečišćavanjem na gelu. W4-RAD scFv-V2L2-VH je zatim ligiran sa Bs2 vektorom pomoću sistema In-Fusion i transformisan u Stellar kompetentne ćelije, i za kolonije je potvrđen ispravan W4-RAD scFv-V2L2 VH insert. Da bi se VL u Bs2 vektoru zamenio sa VL V2L2, Bs2 vektor koji sadrži W4-RAD scFv-V2L2-VH je digestovan putem BssHII / BsiWI i dobijeni vektor je prečišćen pomoću gela. Vektor pOE-V2L2 je zatim digestovan putem BssHII / BsiWI i VL insert V2L2 je prečišćen pomoću gela. VL V2L2 insert je zatim ligiran pomoću Bs2-W4-RAD scFv-V2L2-VH vektora i kolonije su sekvencirane da bi se potvrdio ispravan V2L2 IgG insert.

[0316] Konačno, sličan pristup zasnovan na PCR je korišćen za stvaranje konstrukta Bs4-V2L2-2C. Region šarke sa sekvencom linkera je prikazan u nastavku:

Region šarke sa sekvencom linkera:

[0317]

Sekvence scFv W4-RAD u BS4 vektoru: W4-RAD scFv je ispisan podebljanim kurzivom dok su G4S linkeri podvučeni i ispisani podebljanim kurzivom; regioni šarke su dvostruko podvučeni

[0318]

12

W4-RAD scFv je predstavljen podebljanim kurzivom dok su G4S linkeri podvučeni i ispisani podebljanim kurzivom

[0319]

[0320] ScFv W4-RAD je stvoren koristeći PCR i sledeće prajmere: W4-RAD VH direktni prajmer za vektor Bs4: uključuje izvesnu količinu sekvenci linkera i 24 bp W4-RAD VH N-terminalne sekvence (GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGGGC (SEQ ID NO:236)); i W4-RAD VL reversni prajmer za vektor Bs4: uključuje izvesnu količinu sekvence šarke, linker i 21 bp W4-RAD VL C-terminalne sekvence (GTGTGAGTTTTGTCggatccCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTTTGATCTCCA GCTTGGTCCC (SEQ ID NO: 237)).

[0321] W4-RAD scFv je zatim ligiran u Bs4 vektor dajući Bs4-V2L2-2C prečišćavanjem na gelu W4-RAD scFv (sa PCR); vektor Bs4-V2L2 je digestovan sa BamHI i traka vektora je prečišćena na gelu. ScFv W4-RAD je ligiran sa Bs4 vektorom pomoću sistema In-Fusion i vektorski transformisan u Stellar kompetentne ćelije. Kolonije su sekvencirane radi ispravnog scFv inserta W4-RAD.

[0322] Sekvence za laki lanac i teški lanac konstrukta Bs4-V2L2-2C su date u SEQ ID NO: 327, odnosno 328.

Primer 16: Psl/PcrV bispecifično antitelo promoviše preživljavanje u modelima pneumonije

[0323] Za početak, Bs2 i Bs3 bispecifična antitela su testirana da se ispita da li zadržavaju aktivnost W4 ili V2L2 u bispecifičnom formatu. Za matični scFv W4, stvoreno je bispecifično antitelo koje ima W4 i TNF-alfa vezujući krak. Test ćelijskog vezivanja je obavljen kao što je prethodno opisano koristeći luminescentni P. aeruginosa soj PAO1.lux. Kao što je prikazano na Slici 18, svi bispecifični konstrukti su imali sličan učinak kao matični konstrukt W4-IgG1.

12

[0324] Kao što je prikazano na Slici 19 (A-C), procenat inhibicije citotoksičnosti je analiziran za Bs2-V2L2 i Bs3-V2L2 koristeći ćelije inficirane putem (A) 6206 i (B) 6206ΔpslA i (C) procenat inhibicije lize RBC je analiziran za Bs2-V2L2-2C, Bs3-V2L2-2C i Bs4-V2L2-2C koristeći ćelije inficirane putem 6206. Kao što je prikazano na Slici 19 (A-C), sva antitela su zadržala anticitotoksičnu aktivnost i inhibirala lizu RBC na nivoima koji su slični matičnom V2L2 antitelu koristeći ćelije inficirane putem 6206 i 6206ΔpslA.

[0325] Sposobnost Bs2 i Bs3 bispecifičnih antitela da posreduju u OPK P. aeruginosa je procenjena koristeći postupak opisan u Primeru 2. Dok je Bs2-V2L2 antitelo pokazalo slično ubijanje u poređenju sa matičnim W4-RAD antitelom, ubijanje za Bs3-V2L2 antitelo je bilo smanjeno (Slika 20A). Dok su Bs2-V2L2-2C i Bs4-V2L2-2C antitela pokazala slično ubijanje u poređenju sa matičnim W4-RAD antitelom, ubijanje za Bs3-V2L2-2C antitelo je bilo smanjeno (Slika 20B). Slika 20C prikazuje da različite pripreme Bs4 antitela (stara serija prema novoj seriji) pokazuju slično ubijanje u poređenju sa matičnim W4-RAD antitelom, međutim, Bs4-V2L2-2C-YTE antitela su imala 3-struko opadanje OPK aktivnosti u poređenju sa Bs4-V2L2-2C. YTE mutant obuhvata kombinaciju tri „YTE mutacije“: M252Y, S254T i T256E, pri čemu je numeracija prema EU indeksu kako je dat kod Kabata, uvedene u teški lanac IgG. Videti U.S. Patent br.7,658,921. Pokazalo se da YTE mutant produžava poluživot antitela u serumu približno četvorostruko u poređenju sa verzijama divljeg tipa istog antitela. Vidite, npr. Dall'Acqua i sar. J. Biol. Chem.281:23514-24 (2006) i U.S. Patent br. 7,093,784.

[0326] Nakon potvrde da i W4 i V2L2 zadržavaju aktivnost u bispecifičnom formatu, konstrukti Bs2-V2L2, Bs3-V2L2 i Bs4-V2L2 su testirani na preživljavanje od infekcija akutne pneumonije. Kao što je prikazano na Slici 21A, svi kontrolni miševi su podlegli infekciji za približno 30 sati nakon infekcije. Sve Bs3-V2L2 životinje su preživele, zajedno sa onima koje su dobijale V2L2 kontrolu. Približno 90% W4-RAD imunizovanih životinja je preživelo. Nasuprot tome, Slike B-F pokazuju da je približno 50% Bs2-V2L2 životinja podleglo infekciji za 120 sati. Svi kontrolni miševi su podlegli infekciji za približno 48 sati nakon infekcije. Slike G-H ne pokazuju razliku u preživljavanju između Bs4-V2L2-2C i Bs4-V2L2-2C-YTE tretiranih miševa pri bilo kojoj dozi. Ti rezultati sugerišu da oba antitelo deluju jednako na 6206 modelu akutne pneumonije. Slika 21 I pokazuje da je smeša antitela Bs2-V2L2, Bs4-V2L2-2C i W4-RAD V2L2 najdelotvornija u zaštiti od smrtonosne pneumonije kod miševa izazvane P. aeruginosa sojem 6206 (ExoU+).

1

[0327] Opterećenje organa je takođe ispitano za slično imunizovane miševe kao što je prethodno opisano. Nakon imunizacije kao što je prethodno opisano, miševi su izazvani sa 2,75 x 10<5>CFU 6206. Kao što je prikazano na Slici 22, pri testiranim koncentracijama, i Bs2-V2L2 i Bs3-V2L2 značajno smanjuju opterećenje organa kod pluća. Međutim, nijedan od bispecifičnih konstrukata nije bio sposoban da u velikoj meri utiče na opterećenje organa kod slezine ili bubrega u poređenju sa matičnim antitelima usled korišćenja suboptimalnih koncentracija bispecifičnih konstrukata. Suboptimalne koncentracije su korišćene da se omogući dešifrovanje aktivnosti antitela.

[0328] Preživljavanje i dejstvo na opterećenje organa za bispecifična antitela takođe su ispitani koristeći soj 6294. Koristeći sistem 6294 modela, i BS2-V2L2 i BS3-V2L2 značajno smanjuju opterećenje organa u svim tkivima do nivoa koji je uporediv sa matičnim antitelom V2L2. Matično antitelo W4-RAD nije imalo dejstvo na smanjenje opterećenja organa (Slika 23A). Kao što je prikazano na Slici 23B, kombinacija Bs2-V2L2, Bs3-V2L2 i W4-RAD+V2L2 značajno smanjuje opterećenje organa u svim tkivima do nivoa koji je uporediv sa matičnim antitelom V2L2.

[0329] Podaci o preživljavanju za imunizovane miševe su bili slični kod miševa izazvanih sa 6294 kao i pre. Kao što je prikazano na Slici 24, BS3-V2L2 pokazuje sličnu aktivnost preživljavanja kao kod miševa tretiranih samo sa V2L2, dok miševi tretirani sa BS2-V2L2 pokazuju malo manji nivo zaštite od izazova.

[0330] Opterećenje organa je takođe ispitano kod životinja tretiranih bispecifičnim antitelom u odnosu na životinje tretirane kombinacijom, kao što je prethodno opisano. Kao što je prikazano na Slici 25 (A-C), i BS2-V2L2 i BS3-V2L2 smanjuju opterećenje organa u plućima, slezini i bubrezima do nivoa koji je uporediv sa kombinacijom W4 V2L2. U plućima, kombinacija je značajno smanjila broj bakterijskih CFU Bs2- i Bs3-V2L2 i V2L2 koristeći Kraskal-Volisov test uz Danov post test. Nisu uočene značajne razlike u bakterijskom opterećenju u slezini i bubrezima, mada je zabeležen trend ka smanjenju.

Studija opterećenja organa je takođe sprovedena sa Bs4-GLO koristeći 6206 na modelu pneumonije. Kao što je prikazano na Slici 25 (D), kada se veće koncentracije antitela koriste za profilaksu kod miševa, uočen je značajan (Kraskal-Volisov test uz Danov post test) nivo

1 1

smanjenja bakterijskog opterećenja pluća. Takođe je uočeno značajno smanjenje bakterijskog širenja na slezinu i bubrege kada se koriste veće koncentracije Bs4-GLO na ovom modelu.

[0331] Ovi rezultati su potvrđeni histološkim pregledom plućnog tkiva imunizovanih BALB/c miševa koji su izazvani sa 1,33x10<7>CFU koristeći P. aeruginosa soj 6294 (Tabela 6A), 1,7x10<7>CFU koristeći P. aeruginosa soj 6294 (Tabela 6B) i 9,25 x 10<5>CFU koristeći P. aeruginosa soj 6206 (Tabela 7).

Primer 17: Terapeutska pomoćna terapija: Bs4-V2L2-2C antibiotik

[0332] Dejstvo na preživljavanje Bs4 bispecifičnog antitela i pomoćne terapije antibiotikom je procenjeno na modelu akutne smrtonosne pneumonije protiv P. aeruginosa soja 6206 kao što je prethodno opisano u Primeru 6 (Slika 26 (A-J)). (A-B) Miševi su tretirani 24 sata pre infekcije putem 6206 sa R347 (negativna kontrola) ili Bs4-V2L2-2C ili ciprofloksacinom (CIP) 1 sat nakon infekcije, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C 24 sata pre infekcije i cipro 1 sat nakon infekcije. (C) Miševi su tretirani 1 sat nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili CIP ili Bs4-V2L2-2C, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i CIP. (D) Miševi su tretirani 2 sata nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili CIP ili Bs4-V2L2-2C, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i CIP. (E) Miševi su tretirani 2 sata nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili Bs4-V2L2-2C ili CIP 1 sat nakon infekcije, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C 2 sata nakon infekcije i CIP 1 sat nakon infekcije. (F) Miševi su tretirani 1 sat nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili meropenemom (MEM) ili Bs4-V2L2-2C, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i MEM. (G) Miševi su tretirani 2 sata nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili Bs4-V2L2-2C ili MEM 1 sat nakon infekcije, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C 2 sata nakon infekcije i MEM 1 sat nakon infekcije. (H) Miševi su tretirani 2 sata nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili Bs4-V2L2-2C ili MEM, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C 2 i MEM. (I) Miševi su tretirani 4 sata nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili cipro ili Bs4-V2L2-2C, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i Cipro. Svi kontrolni miševi su podlegli infekciji za približno 24 sata nakon infekcije. Kao što je prikazano na slikama 26 (A-I), Bs4 antitelo u kombinaciji sa CIP ili MEM povećava delotvornost terapije antibioticima, što ukazuje na sinergijsku zaštitu kada su molekuli kombinovani. Dalje studije su se fokusirale na nivo bakterijskog opterećenja kod miševa koji su tretirani sa Bs4 ili CIP samostalno ili u kombinaciji (Bs4+CIP). Kao što je prikazano na slici 26 (J), nivo bakterijskog opterećenja u svim organima (pluća, slezina i bubrezi) je bio sličan za R347+CIP i Bs4+CIP, međutim, samo miševi kod kojih je Bs4 uključen u kombinaciji sa CIP preživljavaju infekciju (Slike 26 (A-E, I)). Zajedno, ovi podaci

1 2

pokazuju da su antibiotici važni za smanjenje bakterijskog opterećenja u ovoj postavci životinjskog modela, međutim, specifično antitelo je potrebno za smanjenje bakterijske patogenosti, štiteći tako uobičajeni imunitet domaćina.

[0333] Dejstvo na preživljavanje Bs4 bispecifičnog antitela i pomoćne terapije antibiotikom tobramicinom će biti procenjeno na modelu akutne smrtonosne pneumonije protiv P. aeruginosa soja 6206 kao što je prethodno opisano u Primeru 6. Miševi će biti tretirani 24 sata pre infekcije putem 6206 sa R347 (negativna kontrola) ili Bs4-V2L2-2C ili tobramicinom 1 sat nakon infekcije, ili sa kombinacijom Bs4-V2L2-2C 24 sata pre infekcije i tobramicinom 1 sat nakon infekcije. Miševi će takođe biti tretirani 1 sat nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili tobramicinom ili Bs4-V2L2-2C, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i tobramicina. Pored toga, miševi će biti tretirani 2 sata nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili tobramicinom ili Bs4-V2L2-2C, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i tobramicina. Nadalje, miševi će biti tretirani 2 sata nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili Bs4-V2L2-2C ili tobramicinom 1 sat nakon infekcije, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C 2 sata nakon infekcije i tobramicina 1 sat nakon infekcije. Miševi će biti tretirani 4 sata nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili tobramicinom ili Bs4-V2L2-2C, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i tobramicina.

[0334] Dejstvo na preživljavanje Bs4 bispecifičnog antitela i pomoćne terapije antibiotikom aztreonamom će biti procenjeno na modelu akutne smrtonosne pneumonije protiv P. aeruginosa soja 6206 kao što je prethodno opisano u Primeru 6. Miševi će biti tretirani 24 sata pre infekcije putem 6206 sa R347 (negativna kontrola) ili Bs4-V2L2-2C ili aztreonamom 1 sat nakon infekcije, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C 24 sata pre infekcije i aztreonamom 1 sat nakon infekcije. Miševi će takođe biti tretirani 1 sat nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili aztreonamom ili Bs4-V2L2-2C, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i aztreonama. Pored toga, miševi će biti tretirani 2 sata nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili aztreonamom ili Bs4-V2L2-2C, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i aztreonama. Nadalje, miševi će biti tretirani 2 sata nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili Bs4-V2L2-2C ili aztreonamom 1 sat nakon infekcije, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C 2 sata nakon infekcije i aztreonamom 1 sat nakon infekcije. Miševi će biti tretirani 4 sata nakon infekcije putem 6206 sa R347 ili aztreonamom ili Bs4-V2L2-2C, ili kombinacijom Bs4-V2L2-2C i aztreonama.

Primer 18: Konstruisanje BS4-GLO bispecifičnog antitela

1

[0335] BS4-GLO (germinativno mutirani vodeći optimizovani) bispecifični konstrukt je generisan uključujući anti-Psl scFv (Psl0096 scfv) i V2L2-MD (VH+VL), kao što je prikazano na Slici 35A. Laki lanac BS4-GLO sadrži germinativno mutirani vodeći optimizovani anti-PcrV varijabilni region lakog lanca antitela (tj. V2L2-MD). Teški lanac BS4-GLO sadrži formulu VH-CH1-H1-L1-S-L2-H2-CH2-CH3, pri čemu, CH1 je domen-1 konstantnog regiona teškog lanca, H1 je prvi fragment regiona šarke teškog lanca, L1 je prvi linker, S je anti-PcrV ScFv molekul, L2 je drugi linker, H2 je drugi fragment regiona šarke teškog lanca, CH2 je domen-2 konstantnog regiona teškog lanca, i CH3 je domen-3 konstantnog regiona teškog lanca.

Laki lanac Bs4-GLO:

[0336]

GLO (germinativno mutirani vodeći optimizovani) V2L2 (tj. V2L2-MD) varijabilni region lakog lanca je podvučen

Teški lanac Bs4-GLO:

[0337]

1 4

GLO (germinativno mutirani vodeći optimizovani) V2L2 (tj. V2L2-MD) varijabilni region lakog lanca je podvučen; CHI je u zagradama [ ]; GLO (germinativno mutirani vodeći optimizovani) W4-RAD (tj. Psl0096) scFv je podebljan u kurzivu, dok su G4S linkeri podvučeni i podebljani u kurzivu; regioni šarke su dvostruko podvučeni.

[0338] Alternativni bispecifični konstrukt Bs4-GLO koji sadrži anti-PcrV ScFv i anti-Psl (VH+VL) prikazan je na Slici 35B, i dobijen je na sličan način.

Primer 19: Ispitivanje funkcionalne aktivnosti i delotvornosti Bs4-GLO bispecifičnog antitela

[0339] Bispecifična antitela Bs4-WT (ovde se nazivaju i Bs4-V2L2-2C), Bs4-GL (sadrži germinativno mutirane varijabilne regione anti-PcrV i anti-Psl) i Bs4-GLO koja su proizvedena kako je opisano u Primeru 18 testirana su na razlike u funkcionalnoj aktivnosti u testu opsonofagocitnog ubijanja (Slika 27A), kao što je prethodno opisano u Primeru 2, testu antićelijskog vezivanja (Slika 27B), kao što je prethodno opisano u Primeru 4, i testu anticitotoksičnosti lize RBC (Slika 27C), kao što je prethodno opisano u Primeru 12. Nije uočena in vitro razlika u funkcionalnim aktivnostima između antitela.

[0340] In vivo delotvornost Bs4-GLO je ispitana na sledeći način. Za profilaktičko ispitivanje, miševi su profilaktički lečeni sa nekoliko koncentracija Bs4-GLO (tj.0,007 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg ili 15 mg/kg) (Slika 28A), 24 sata pre infekcije sledećim sojevima P. aeruginosa (6206 (1,0 x 10<6>), 6077 (1,0 x 10<6>), 6294 (2,0 x 10<7>) ili PA103 (1,0 x 10<6>)). Za terapeutsko ispitivanje, miševi su terapeutski lečeni sa nekoliko koncentracija Bs4-GLO (tj.0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, ili 45 mg/kg) (Slika 28B), jedan sat nakon infekcije sledećim sojevima P. aeruginosa (6206 (1,0 x 10<6>), 6077 (1,0 x 10<6>), 6294 (2,0 x 10<7>) ili PA 103 (1,0 x 10<6>)).

[0341] Dejstvo na preživljavanje Bs4-GLO bispecifičnog antitela je procenjeno na modelu akutne smrtonosne pneumonije protiv različitih sojeva P. aeruginosa, kao što je prethodno opisano u Primeru 6. Slika 29 prikazuje stopu preživljavanja za životinje koje su tretirane sa Bs4-GLO na modelu smrtonosne bakteremije sa P. aeruginosa. Aspekti modela bakteremije su detaljno prikazani u U.S. privremenoj prijavi br.61/723,128, koja je podneta 6. novembra 2012. (advokatski izvod br. ATOX-500P1, pod nazivom „METODE LEČENJA BOLESTI

1

VEZANIH ZA S. AUREUS“ ("METHODS OF TREATING S. AUREUS ASSOCIATED DISEASES")).

[0342] Životinje su lečene sa Bs4-GLO ili R347, 24 sata pre intraperitonealne infekcije putem (A) 6294 (O6) ili (B) 6206. BS4-GLO je delotvoran pri svim testiranim koncentracijama u zaštiti od smrtonosne pneumonije kod miševa izazvanih P. aeruginosa sojevima (A) 6294 i (B) 6206.

[0343] Dejstvo bispecifičnog antitela Bs4-GLO na preživljavanje je ispitano na P. aeruginosa modelu termičke povrede za različite sojeve P. aeruginosa. Slika 30 prikazuje stopu preživljavanja za životinje koje su profilaktički tretirane sa Bs4-GLO na modelu termičke povrede sa P. aeruginosa. Životinje su tretirane pomoću Bs4-GLO ili pomoću R347 satima pre izazivanja termičke povrede i supkutane infekcije putem P. aeruginosa soja (A) 6077 (O11-ExoU<+>) ili (B) 6206 (O11-ExoU<+>) ili (C) 6294 (O6) neposredno ispod rane. BS4-GLO je delotvoran pri svim testiranim koncentracijama u prevenciji na modelu termičke povrede sa P. aeruginosa kod miševa koji su izazvani sa P. aeruginosa sojevima (A) 6077, (B) 6206 i (C) 6294.

[0344] Slika 31 prikazuje stopu preživljavanja životinja koje su terapeutski tretirane bispecifičnim antitelom Bs4-GLO na modelu termičke povrede sa P. aeruginosa. (A) Životinje su tretirane pomoću Bs4-GLO ili pomoću R347 (A) 4 sata ili (B) 12 sati nakon izazivanja termičke povrede i supkutane infekcije putem P. aeruginosa soja 6077 (O11-ExoU<+>) neposredno ispod rane. Bs4-GLO je delotvoran pri svim testiranim koncentracijama za lečenje na modelu termičke povrede sa P. aeruginosa kod miševa koji su tretirani sa Bs4-GLO (B) 4 sata ili (B) 12 sati nakon izazivanja termičke povrede i supkutane infekcije P. aeruginosa sojem 6077.

Primer 20: Terapeutska pomoćna terapija: Bs4-GLO antibiotik

[0345] Dejstvo na preživljavanje Bs4-GLO bispecifičnog antitela i pomoćne terapije antibiotikom će biti procenjeno na modelu akutne smrtonosne pneumonije P. aeruginosa soja 6206 kao što je prethodno opisano u Primeru 6.

[0346] Slika 32 prikazuje terapeutsku pomoćnu terapiju sa ciprofloksacinom (CIP). (A) Miševi su tretirani 4 sata nakon infekcije putem P. aeruginosa soja 6206 sa R347 CIP ili

1

Bs4-WT ili kombinacijom Bs4-WT i CIP. (B) Miševi su tretirani 4 sata nakon infekcije putem P. aeruginosa soja 6206 sa R347 CIP ili Bs4-GLO ili kombinacijom Bs4-GLO i CIP. (A-B) Bs4-WT ili BS4-GLO antitelo u kombinaciji sa CIP povećavaju delotvornost antibiotske terapije.

[0347] Slika 33 prikazuje terapeutsku pomoćnu terapiju sa meropenemom (MEM): (A) Miševi su tretirani 4 sata nakon infekcije putem P. aeruginosa soja 6206 sa R347 MEM ili Bs4-WT ili kombinacijom BS4-WT-WT i MEM. (B) Miševi su tretirani 4 sata nakon infekcije putem P. aeruginosa soja 6206 sa R347 MEM ili BS4 ili kombinacijom Bs4-GLO i MEM. (A-B) Bs4-WT ili Bs4 antitelo u kombinaciji sa MEM povećavaju delotvornost antibiotske terapije.

[0348] Slika 34 prikazuje terapeutsku pomoćnu terapiju: Bs4-GLO plus antibiotik u modelu smrtonosne bakteremije. Miševi su tretirani 24 sata pre intraperitonealne infekcije putem P. aeruginosa soja 6294 sa Bs4-GLO u naznačenim koncentracijama, za koje je prethodno utvrđeno da su subterapeutske zaštitne doze u ovom modelu, i R347 (negativna kontrola). Jedan sat nakon infekcije, miševi su supkutano tretirani antibioticima u naznačenim koncentracijama, za koje je prethodno utvrđeno da su subterapeutske zaštitne doze (A) ciprofloksacina (CIP), (B) meropenema (MEM) ili (C) tobramicina (TOB). Preživljavanje životinja je pažljivo praćeno do 72 sata nakon infekcije. Bs4-GLO antitelo u kombinaciji sa CIP, MEM ili TOB, u subzaštitnim dozama, povećava delotvornost antibiotske terapije.

[0349] Otkriće nije ograničeno u obimu specifičnim opisanim otelotvorenjima koja služe kao pojedinačne ilustracije individualnih aspekata otkrića, i sve kompozicije i postupci koji su funkcionalno jednaki spadaju u obim ovog pronalaska. Zaista, različite modifikacije otkrića pored onih koje su ovde prikazane i opisane biće jasne osobama sa znanjem u struci na osnovu prethodnih opisa i pratećih crteža. Takve modifikacije spadaju u opseg priloženih zahteva.

1

Tabela 6A

Grupa(n) Lečenje Ukupan utisak Krvarenje Edem Inflamatorni Bakterije

1

Tabela 6B

1

Tabela 7

14 Grupa Lečenje Ukupan utisak Krvarenje Edem Inflamatorni Bakterije

14

14

14

14

14

14

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

21

21

21

21

21

21

21

22

22

22

22

22

22

22

2

21

22

2

24

2

2

2

�

�

24

24

24

24

24

24

24

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

�

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

�

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

2

�

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Bispecifično antitelo koje sadrži vezujući domen koji se vezuje za Pseudomonas Psl i vezujući domen koji se vezuje za Pseudomonas PcrV, pri čemu bispecifično antitelo sadrži fuzioni protein anti-PcrV teški lanac-anti-Psl scFv, pri čemu, Psl scFv je u regionu šarke teškog lanca anti-PcrV, i navedeni fuzioni protein ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 264 i laki lanac anti-PcrV ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 263.

2. Izolovani molekul polinukleotida koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira bispecifično antitelo iz zahteva 1.

3. Kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo iz zahteva 1 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

4. Kompozicija iz zahteva 3, koja dalje sadrži antibiotik.

5. Kompozicija iz zahteva 4, pri čemu, antibiotik je izabran iz grupe koja se sastoji od ciprofloksacina, meropenema i njihove kombinacije.

6. Kompozicija iz bilo kog od zahteva 3 do 5 za upotrebu u prevenciji ili lečenju infekcije pseudomonasom kod ispitanika kome je to potrebno.

7. Komplet koji sadrži kompoziciju iz bilo kog od zahteva 3 do 5.

8. Bispecifično antitelo ili njegov fragment iz zahteva 1 za upotrebu u prevenciji ili lečenju infekcije pseudomonasom kod ispitanika.

9. Bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 8, pri čemu, ispitanik je čovek.

10. Bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 8 ili 9, pri čemu, infekcija pseudomonasom je infekcija sa P. aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, ili Pseudomonas alcaligenes.

11. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 8 do 10, pri čemu, infekcija je infekcija oka, infekcija pluća, infekcija opekotine, infekcija rane, infekcija kože, infekcija krvi, infekcija kosti, ili kombinacija dve ili više navedenih infekcija.

12. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 8 do 10, pri čemu ispitanik ima akutnu pneumoniju, opekotinu, infekciju rožnjače, cističnu fibrozu, ili njihovu kombinaciju.