RS60943B1 - Cis80 konjugovani imunoglobulini - Google Patents

Cis80 konjugovani imunoglobulini

Info

Publication number
RS60943B1
RS60943B1 RS20201246A RSP20201246A RS60943B1 RS 60943 B1 RS60943 B1 RS 60943B1 RS 20201246 A RS20201246 A RS 20201246A RS P20201246 A RSP20201246 A RS P20201246A RS 60943 B1 RS60943 B1 RS 60943B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
variable region
immunoglobulin
light chain
chain variable
Prior art date
Application number
RS20201246A
Other languages
English (en)
Inventor
Luigi Grasso
Jared Spidel
James Bradford Kline
Earl Albone
Original Assignee
Eisai R&D Man Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai R&D Man Co Ltd filed Critical Eisai R&D Man Co Ltd
Publication of RS60943B1 publication Critical patent/RS60943B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A61K47/6897—Pre-targeting systems with two or three steps using antibody conjugates; Ligand-antiligand therapies
    • A61K47/6898—Pre-targeting systems with two or three steps using antibody conjugates; Ligand-antiligand therapies using avidin- or biotin-conjugated antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
LISTA SEKVENCI
[0001] Sadašnja prijava sadrži listu sekvenci koja je elektronski podneta u ASCII formatu i time je u celosti uključena referencom. Kopija ASCII, kreirana 16. juna 2016. godine, nazvana je 104018.000953_SL.txt i veličine je 379,441 bajtova.
OBLAST TEHNIKE
[0002] Ovde su obezbeđeni Cis80 konjugovani imunoglobulini i metode njihove izrade.
POZADINA
[0003] Korisnost monoklonskih antitela se proteže od osnovnih istraživanja do terapijskih i dijagnostičkih primena. Sposobnost konjugacije antitela sa funkcionalnim agensima dodatno proširuje njihovu funkcionalnost. Proizvodnja konjugovanih antitela obično, uključuje konjugaciju veznika, leka ili drugog funkcionalnog agensa za reaktivne lizinske ili cisteinske ostatke na teškim (HC) i lakim (LC) lancima monoklonskog antitela (mAt). Lizinska konjugacija je obično hemijski posredovana na bazi sukcinimida (NHS) ili na bazi izotiocijanata. S obzirom na broj izloženih lizina na površini antitela, pristupi konjugacije na bazi amina rezultiraju modifikovanjem višestrukih lizina, mada nisu svi ostaci lizina modifikovani u istoj meri. Stoga je konačni proizvod heterogena smeša monoklonskih antitela sa raspodelom odnosa leka i antitela (DAR).
[0004] Većina cisteina unutar antitela je uključena bilo u među- ili unutar-lančane disulfidne veze. Konjugacija za cisteine stoga, zahteva bar delimičnu redukciju antitela. Kao i konjugacija zasnovana na lizinu, i konjugacija zasnovana na cisteinu daje heterogenu smešu konjugovanih antitela koja se razlikuju u punjenju lekom i mestu konjugacije. Svaka vrsta konjugovanih antitela može imati različita svojstva, što zauzvrat može dovesti do širokih varijacija in vivo farmakokinetičkih svojstava. Pored toga, takva heterogenost može predstavljati izazove u proizvodnji konjugovanog antitela.
[0005] WO 2008/136694 A1 opisuje "metode skrininga i proizvodnje polipeptida koji se imunospecifično vezuju za antigen, koji : polipeptidi sadrže vezivne domene koji su dobijeni iz zečjeg imunoglobulina. Koristeći osnove teškog ili lakog lanca zečjeg antitela, postupci…omogućavaju identifikaciju novih CDR petlji i okvirnih regiona koji daju poboljšanu stabilnost i/ili afinitet prema izolovanim imunoglobulinskim varijabilnim domenima, posebno u vezi sa tim izvedenih iz antitela glodara".
[0006] WO 2011/156328 A1 opisuje "cisteinski konstruisana antitela koja sadrže slobodnu aminokiselinu cistein u teškom lancu ili lakom lancu".
[0007] WO 2008/144757 A1 opisuje "metode za humanizovanje zečjih teških i lakih varijabilnih regiona. Nastali humanizovani zečji teški i laki lanci i antitela i fragmenti antitela koji ih sadrže su dobro primerni za upotrebu u imunoterapiji i imunodijagnostici, pošto oni zadržavaju afinitet za vezivanje antigena roditeljskog antitela i na osnovu njihovog veoma visokog nivoa identičnosti sekvenci sa sekvencama humanog antitela trebalo bi da budu suštinski neimunogeni kod ljudi".
[0008] WO 2005/016950 A1 opisuje "metodu za humanizovanje zečjeg monoklonskog antitela".
[0009] WO 2014/031476 A1 opisuje "korišćenje tehnologije hibridoma zeca, zajedno sa grupom odsečenih fragmenata mezotelinskog domena, za identifikaciju mAt-a protiv mezotelina koja vezuju specifične regione mezotelina".
[0010] WO 2006/017759 A1 opisuje "antitela koja vezuju tumorski endotelijelni marker 1 (TEM1)".
[0011] Lyon i sar. Methods in Enzymology, poglavlje 6, vol. 502, 2012-01-01, strane 123-138 opisuju metodu koja "može biti proporcionalno redukovana za proizvodnju mikrogramskih količina konjugata za rani skrining, i u proizvođačkoj postavci može biti proporcionalno povećana za proizvodnju grama ili kilograma konjugata za klinička ispitivanja i komercijalizaciju".
[0012] WO 2014/033074 A1 opisuje "transfere krvno-moždane barijere koji vezuju receptore na krvno moždanoj barijeri (R/BBB) i postupke korišćenja istih".
[0013] Popkov i sar. Journal of Molecular Biology, vol.325, br.2, 2003-01-10, strane 325-335 "ocenjuju različitost neodabranih i odabranih himernih zečjih/humanih Fab biblioteka koje su izvedene iz različitih alotipova lakog lanca kapa".
SAŽETAK
[0014] Ovde su otkriveni postupci za generisanje konjugovanog imunoglobulina, postupci koji uključuju: uklanjanje zaštite sa cisteina na aminokiselinskom položaju 80 („Cis80“) u varijabilnom regionu lakog lanca imunoglobulina izvedenog iz zeca, pri čemu imunoglobulin sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca; i konjugaciju tiolreaktivnog jedinjenja sa Cis80, pri čemu tiol-reaktivno jedinjenje sadrži tiol-reaktivnu grupu.
[0015] Takođe su otkrivene metode za generisanje molekula za vezivanje antigena, metode koje obuhvataju inkubiranje prvog konjugovanog imunoglobulina sa drugim konjugovanim imunoglobulinom za generisanje molekula za vezivanje antigena, pri čemu: prvi konjugovani imunoglobulin sadrži varijabilni region prvog teškog lanca i varijabilni region prvog lakog lanca, varijabilni region prvog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80<1>"), pri čemu je Cis80<1>konjugovan sa prvim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu; a drugi konjugovani imunoglobulin sadrži varijabilni region drugog teškog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80<2">), pri čemu je Cis80<2>konjugovan sa drugim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu.
[0016] Ovde su takođe, opisani imunoglobulini koji sadrže varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, varijabilni region lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80") i aminokiselinu koja nije Fen, Liz, ili Cis na položaju 83, kao što su molekule nukleinske kiseline koje kodiraju imunoglobuline i ćelije domaćina koji sadrže molekule nukleinske kiseline.
[0017] Dalje su obezbeđeni konjugovani imunoglobulini koji sadrže otkrivene imunoglobuline, pri čemu je cistein na položaju 80 konjugovan sa tiol-reaktivnim jedinjenjem, a tiol-reaktivno jedinjenje sadrži tiol-reaktivnu grupu.
[0018] Takođe su ovde otkriveni postupci za lečenje raka kod subjekta koji uključuju primenu farmaceutski efikasne količine konjugovanog mezotelinskog imunoglobulina kod subjekta, pri čemu konjugovani mezotelinski imunoglobulin sadrži: bilo koji od otkrivenih mezotelinskih imunoglobulina i tiol-reaktivno jedinjenje koje sadrži tiol-reaktivnu grupu, linker i funkcionalni agens.
[0019] Opisane su molekule za vezivanje antigena koje sadrže: prvi konjugovani imunoglobulin koji sadrži varijabilni region prvog teškog lanca i varijabilni region prvog lakog lanca, varijabilni region prvog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80<1>"), pri čemu je Cis80<1>konjugovan sa prvim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu, a drugi konjugovani imunoglobulin sadrži varijabilni region drugog teškog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80<2">), pri čemu je Cis80<2>konjugovan sa drugim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu.
[0020] Ovde su takođe, otkriveni varijabilni regioni lakog lanca za upotrebu u konjugovanom imunoglobulinu, varijabilni region lakog lanca koji ima cistein na aminokiselinskom položaju 80 („Cis80“) i aminokiselinski ostatak izuzev Fen, Liz ili Cis na aminokiselinskom položaju 83, pri čemu je Cis80 neuparen.
[0021] Realizacije prema sadašnjem pronalasku su postavljene u priloženim patentnim zahtevima. U jednoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje metodu za generisanje konjugovanog imunoglobulina, a metoda obuhvata:
uklanjanje zaštite sa cisteina na aminokiselinskom položaju 80 („Cis80“) u varijabilnom regionu lakog lanca imunoglobulina izvedenog iz zeca, Cis80 baziran na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja, pri čemu imunoglobulin sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca;
i konjugaciju tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80, pri čemu tiol-reaktivno jedinjenje sadrži tiol-reaktivnu grupu.
[0022] U drugoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje metodu za generisanje molekule za vezivanje antigena, metoda koja obuhvata inkubiranje prvog konjugovanog imunoglobulina sa drugim konjugovanim imunoglobulinom za generisanje molekule za vezivanje antigena, pri čemu:
prvi konjugovani imunoglobulin sadrži varijabilni region prvog teškog lanca i varijabilni region prvog lakog lanca, varijabilni region prvog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80<1>"), pri čemu je Cis80<1>konjugovan sa prvim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu, a pri čemu je imunoglobulin izveden iz zeca i Cis80<1>je baziran na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja; i
drugi konjugovani imunoglobulin sadrži varijabilni region drugog teškog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80<2">), pri čemu je Cis80<2>konjugovan sa drugim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu, a pri čemu je imunoglobulin izveden iz zeca i Cis80<2>je baziran na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja.
[0023] U drugoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje molekulu za vezivanje antigena proizvedenu prema postupku iz sadašnjeg pronalaska za generisanje molekule za vezivanje antigena.
[0024] U drugoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje imunoglobulin izveden iz zeca koji sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, varijabilni region lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80"), pri čemu je Cis80 neuparen i aminokiselinu osim Fen, Liz, ili Cis na položaju 83, a pri čemu su Cis80 i položaj 83 bazirani na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja.
[0025] U drugoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje jedan konjugovani imunoglobulin koji sadrži: imunoglobulin prema sadašnjem pronalasku, pri čemu je cistein na položaju 80 konjugovan sa tiol-reaktivnim jedinjenjem, a tiol-reaktivno jedinjenje sadrži tiol-reaktivnu grupu.
[0026] U drugoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje konjugovani mezotelinski imunoglobulin, za upotrebu u postupku lečenja raka kod subjekta, pri čemu konjugovani mezotelinski imunoglobulin sadrži:
(E) imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani mezotelin i sadrži:
a. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-142 xi33O11HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-131 xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
b. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-145 od zu33O11HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-131 zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122); c. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-137 od xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-127 xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
d. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
e. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-132 od xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-127 od xi237N18LC (SEK ID BR: 128); ili
f. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-137 od xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-127 od xi383I18LC (SEK ID BR: 130), ili
(F) imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani mezotelin i sadrži:
a. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi33O11HC, kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 176, 178, i 180, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi33O11LC, kao što je dalje navedeno u SEK ID BR: 338, 340 i 342, respektivno; b. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od zu33O11HC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 182, 184 i 186, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od zu33O11LC-CXXA kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 350, 352 i 354, respektivno, ili zu33O11LC-CXXI kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 356, 358 i 360, respektivno;
c. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi324O5HC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 188, 190 i 192, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi324O5LC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 362, 364 i 366, respektivno;
d. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi178F16HC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 194, 196 i 198, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi178F16LC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 368, 370 i 372, respektivno;
e. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi237N18HC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 200, 202 i 204, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi237N18LC, kako je navedeno kao SEK ID BR: 374, 376 i 378, respektivno; ili f. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi383I18HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 206, 208, odnosno 210, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi383I18LC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 380, 382, odnosno 384, i
jedno tiol-reaktivno jedinjenje koje sadrži tiol-reaktivnu grupu, linker i funkcionalni agens, pri čemu funkcionalni agens sadrži fluorofor, fluorescentnu boju, polipeptid, imunoglobulin, antibiotik, nukleinsku kiselinu, radionuklid, hemijski veznik, mali molekul, helator, lipid i lek.
[0027] U drugoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje molekulu za vezivanje antigena koja sadrži: prvi konjugovani imunoglobulin koji sadrži varijabilni region prvog teškog lanca i varijabilni region prvog lakog lanca, varijabilni region prvog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80<1>"), pri čemu je Cis80<1>konjugovan sa prvim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu, a pri čemu je imunoglobulin dobijen iz zeca i Cis80<1>je baziran na sistemu numerisanja Kabat ili Chothia, i
drugi konjugovani imunoglobulin koji sadrži varijabilni region drugog teškog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80<2">), pri čemu je Cis80<2>konjugovan sa drugim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu, a pri čemu je imunoglobulin dobijen iz zeca i Cis80<2>je baziran na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja.
[0028] U drugoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje molekulu nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulin iz sadašnjeg pronalaska.
[0029] U drugoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži molekulu nukleinske kiseline iz sadašnjeg pronalaska.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0030] Rezime, kao i detaljni opis koji sledi je dalje razumljiv kada se čita zajedno sa priloženim crtežima. U svrhu ilustracije otkrivenih metoda, konjugovani imunoglobulini, molekule za vezivanje antigena, imunoglobulini i varijabilni regioni lakog lanca, prikazani su na crtežima primernih izvođenja; međutim, postupci, konjugovani imunoglobulini, molekule za vezivanje antigena, imunoglobulini i varijabilni regioni lakog lanca nisu ograničeni na specifične opisane realizacije. Na crtežima:
SL. 1 predstavlja poravnanje sekvenci zečjeg i humanog lakog lanca. (A) Poravnanje sekvenci germinativne linije Vκ od zeca (IGKV1S2, X02336) i čoveka (IGKV1-5, Z00001). Boldirani ostatak označava Cis80 (prema numerisanju bilo Kabat ili Chothia) u zečjoj sekvenci. (B) Poravnanje sekvenci germinativne linije Cκ od zeca (IGKC1, K01360) i čoveka (IGKC, J00241). Boldirani ostatak označava Cis171 (EU numerisanje) u sekvenci zeca.
SL. 2 predstavlja strukturne modele (A) zečjeg mAt-a, prikazujući disulfidnu vezu Cis80-Cis171, (B) humanog mAt-a i (C) himernog zečjeg-humanog mAt-a, prikazujući nespareni Cis80.
SL. 3 ilustruje poravnanje familija zečje germinativne linije Vκ. Ostatak na položaju 80 je označen strelicom.
SL. 4 ilustruje primer masene spektrometrijske analize lakog lanca xi155D5 kada je (A) redukovan korišćenjem drastičnih uslova (20 mM DTT, 60 º C, 5 minuta) i (B) redukovan korišćenjem blagih uslova (100 µM DTT, 22 ° C, 30 minuta).
SL. 5 ilustruje primer SE-HPLC analize stabilnosti xi155D5. (A) Stabilnost xi155D5 skladištenog na -80 ° C. (B) Stabilnost xi155D5 skladištenog na 37 ° C tokom 1 nedelje. Primećen je samo vrlo mali porast u obrazovanju agregata ili proizvoda razgradnje. Y osa, mAU; x osa, vreme zadržavanja (minuti).
SL. 6 predstavlja ogledni eksperiment za uklanjanje zaštite koji pokazuje da cistein koji pokriva Cis80, može biti uklonjen blagim redukcionim uslovima (puferom koji sadrži 5 mM cisteina tokom 16 sati, praćeno ispiranjem sa puferom koji sadrži Tris bez cisteina tokom 60 sati; sve inkubacije su izvedene na 4 ° C). Masa xi155D5 pre (A) i posle (B) uklanjanja zaštite je bila 145.464, odnosno 145.221 Da. Razlika (243 Da) odgovara približno dvema slobodnim cisteinima.
SL. 7 predstavlja primer eksperimenta konjugacije koji pokazuje da nepokriveni Cis80 može biti konjugovan sa maleimid-PEG2-biotinom. (A) Laki lanac redukovanog xi155D5 (predviđene mase od 23.399 Da) je imao masu od 23.384 Da, a (B) nakon inkubacije sa maleimid-PEG2-biotinom, 94% proizvoda je pokazalo povećanje mase za 526 Da (23.910 Da). Zvezdice označavaju pikove lanca koji nije laki.
SL. 8 predstavlja zečje 155D5 Vκ i VH sekvence poravnane sa najviše homolognim varijabilnim domenima humane germinativne linije. Okvirni region (FWR) i region za određivanje komplementarnosti (CDR) zasnovan na Kabat numerisanju identifikovani su iznad sekvenci. CDR-ovi zasnovani na numerisanju Chothia su podvučeni. Polovina C-terminala Kabatovog CDR2 se ne smatra CDR-om prema Chothia numerisanju i označen je u italiku.
SL. 9 ilustruje primer standardnog prečišćavanja proteina A od zu155D5-1. zu155D5-1 je nađen obložen (A), što je dokazano promenom mase nakon uklanjanja prevlake (B) za 233 Da, približno odgovarajući dvoma cisteinima sa poklopcima.
SL. 10 ilustruje primerne strukturne modele himerizovanog xi155D5. Modelovanje za određivanje blizine Cis80 je izvedeno kao na slici 2. Ostaci koji se razlikuju između xi155D5 i zu155D5-1 su istaknuti i za svakog je izmerena udaljenost do Cis80. (A) Ostaci Val11, Ala14, Gli17, Tre18; (B) Liz63; (C) Tre76, Gli77, Val78, Ala83; i (D) Glu103 i Leu104, su unutar 11 Å od Cis80, osim za Liz63 (18 Å). Ovi ostaci su promenjeni nazad u zečje aminokiseline u prisustvu Cis80.
SL. 11 ilustruje primerna humanizovana mAt-a od sekvenci lakih lanaca 155D5, 1E4, 166B3 i 33011.
SL. 12 predstavlja (A-D) skrining protočnom citometrijom seruma iz imunizovanih životinja i (E) ELISA skrining seruma imunizovanih životinja. (A-D) Ćelije su inkubirane sa post-imunizacionim serumskim uzorkovanjima krvi u naznačenim razblaženjima (A: serum zeca 1 nakon krvarenja, razblažen u 1: 1000; B: serum zeca 1 nakon krvarenja, razblažen u 1: 5000; C: nakon krvarenja, serum zeca 2 razblažen u 1: 1000; i D: nakon krvarenja, serum zeca 2 razblažen u 1: 5000). Prikazani su signali iz ćelija koje privremeno izražavaju humani MSLN (+ MSLN) i onaj iz MSLN negativnih ćelija (-MSLN). (E) ELISA ploče su preko noći obložene sa 1 μg/mL humanog MSLN na 4 ° C i blokirane korišćenjem 1% BSA u PBS-u sa 0,01% Tween-a (PBST) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon uklanjanja pufera za blokiranje, u bazenčiće su dodati serijski razblaženi uzorci krvarenja pre i posle imunizacije. Ploča je inkubirana tokom 2 sata na sobnoj temperaturi, a zatim isprana tri puta sa PBST-om. Kozje anti-zečje antitelo konjugovano sa HRP-om je dodato u pufer za blokiranje i inkubirano tokom 1 sata. Ploča je isprana tri puta i dodata je TMB podloga. Reakcija je zaustavljena i merena je apsorbanca na 450 nm.
SL. 13 predstavlja primer proteinskog pika dekonvulisane analize masene spektrometrije pre i posle konjugacije maleimido-PEG2-auristatin F (AuF) sa Cis80.
SL. 14 ilustruje (A) citotoksičnost Cis80 konjugovanih mAt-a MSLN-AuF nasuprot MSLN-negativnih A431 ćelija i (B) citotoksičnost Cis80 konjugovanih mat-a MSLN-AuF nasuprot MSLN-pozitivnih A431-MSLN ćelija.
SL. 15 predstavlja prosečne tumorske zapremine između različitih lečenih grupa.
SL. 16 predstavlja (A) prosečne zapremine tumora A431-MSLN (levi bok) među različitim lečenim grupama i (B) prosečne zapremine tumora među različitim grupama lečenja za A431 (desni bok).
SL. 17 predstavlja SDS-PAGE analizu primernog konjugovanog antitela xi155D5-800CW.
(A) mtm, marker molekulske težine; traka 1, xi155D5, nekonjugovan, neredukovan; traka 2, xi155D5, xi155D5-800CW, neredukovan; traka 3, blanko; traka 4, nekonjugovan xi155D5, redukovan; traka 5, xi155D5, xi155D5-800CW, redukovan.
Sve trake sadrže 5 µg proteina, obojenih Coomassie-om. (B) Isti gel kao u A, snimljen na IVIS sistemu. Rezultati pokazuju da je IRDye 800CW konjugovan samo na lakom lancu xi155D5. ELISA analiza xi155D5-800CW pokazuje da je zadržano potpuno vezivanje za CA9 (podaci nisu prikazani).
1
SL. 18 prikazuje tumorski specifičnu lokalizaciju primernog antitela konjugovanog sa DyeIR 800CW (xi155D5-800CW). Humane ćelije colo205 (A-D) i HT-29 (E-H) su presađene u gole miševe, kojima je kasnije injektovan xi155D5-800CW. Fluorescentni signal (narandžasto-crveni) je praćen u različitim vremenskim periodima, uključujući 0 sati (A i E), 4 sata (B i F), 24 sata (C i G) i 72 sata (D i H) (prikazano samo 0-72 sati i desni bok). Prikazana je približna lokacija bubrega (K) i tumora (T).
SL. 19 ilustruje primer prečišćavanja xi155D5/xi1-55-2 bivalentnog/bispecifičnog molekula za vezivanje antigena. Grafik gel-filtracione hromatografije koji pokazuje pik koji odgovara xi155D5/ xi1-55-2 bivalentnom / bispecifičnom molekulu za vezivanje antigena (koji se naziva „biFab“) (A). Molekulska veličina frakcija je analizirana pomoću SDS-PAGE (B). Frakcije koje sadrže xi155D5/xi1-55-2 bivalentni / bispecifični antigen vezujući molekul (biFab) su objedinjene i masa je određena masenom spektrometrijom (C).
SL. 20 ilustruje bispecifičnost primernog xi155D5/xi1-55-2 bivalentnog / bispecifičnog molekula koji vezuje antigen (biFab). Biotinilovani humani CA9 je uhvaćen na vrhovima biosenzora streptavidin okteta. Jedinjenja su dodavana kako je označeno prvom strelicom („jedinjenje“), a zatim je omogućeno da se vežu. Nakon toga je dodat rastvorljivi humani TEM-1 (druga strelica; „TEM-1“) i mereno je njegovo vezivanje za uhvaćene komplekse CA9/jedinjenja. Pomeranje odgovora (dvostruka strelica), koje ukazuje na hvatanje rastvorljivog TEM-1, primećeno je samo sa xi155D5/xi1-55-2 bivalentnim/bispecifičnim molekulom za vezivanje antigena (biFab).
SL. 21 ilustruje SDS-PAGE analizu xi33O11-Aβ (1-16) Cis80 konjugovanih mAt-a i xi1-55-2-Aβ (1-16) Cis80 konjugovanih mAt-a. Prikazani su proizvodi pre (B) i posle (A) konjugacije mAt-DBCO sa peptidom Aβ (1-16). MW, marker molekulske težine. LC, laki lanac.
SL. 22 ilustruje primer masene spektrometrijske analize xi1-55-2 i xi33O11 roditeljskog lakog lanca (LC) (A i B, respektivno), xi1-55-2-DBCO Cis80 konjugovanog LC i xi33O11-DBCO Cis80 konjugovanog LC (C i D, respektivno) i xi1-55-2-Aβ (1-16) Cis80 konjugovanog LC i xi33O11-Aβ (1-16) Cis80 konjugovanog LC (E i F, respektivno). SL. 23 ilustruje primer šeme za generisanje molekula koji vezuju antigen. Imunoglobulini izvedeni iz zeca mogu biti digestirani papainom da bi se stvorili Fab-ovi. Prvi Fab može biti inkubiran sa maleimido-DBCO, a drugi Fab može biti inkubiran sa maleimido-azidom. Prvi i drugi Fab-ovi mogu biti kombinovati da bi formirali bi-specifični-Fab-Fab vezivni molekul. SPAAC = konjugacija alkin-azidom promovisana sojem.
DETALJAN OPIS ILUSTRATIVNIH REALIZACIJA
[0031] Otkrivene metode, konjugovani imunoglobulini, molekule za vezivanje antigena, imunoglobulini i varijabilni regioni lakog lanca se mogu lakše razumeti pozivanjem na sledeći detaljni opis uzet u vezi sa pratećim slikama, koji čini deo ovog pronalaska. Podrazumeva se da otkriveni postupci, konjugovani imunoglobulini, molekule za vezivanje antigena, imunoglobulini i varijabilni regioni lakog lanca nisu ograničeni na specifične realizacije ovde opisane i/ili prikazane, i da je ovde korišćena terminologija u svrhu opisivanja određenih realizacija samo radi primera i nije namenjena ograničavanju zahtevanih metoda, konjugovanih imunoglobulina, molekula koji vezuju antigen, imunoglobulina i varijabilnih regiona lakog lanca.
[0032] Ukoliko specifično nije drugačije naznačeno, bilo koji opis mogućeg mehanizma ili načina delovanja ili razloga za poboljšanje treba da bude samo ilustrativan, a otkriveni postupci, konjugovani imunoglobulini, molekule za vezivanje antigena, imunoglobulini i varijabilni regioni lakog lanca ne treba da budu ograničeni tačnošću ili netačnošću bilo kog predloženog mehanizma ili načina delovanja ili razloga za poboljšanje.
[0033] U celom tekstu, opisi se odnose na konjugovane imunoglobuline, molekule za vezivanje antigena, imunoglobuline i varijabilne regione lakog lanca i metode za njihovo generisanje. Tamo gde pronalazak opisuje ili zahteva karakteristiku ili realizaciju povezanu sa konjugovanim imunoglobulinom, molekulom za vezivanje antigena, imunoglobulinom ili varijabilnim regionom lakog lanca, takva karakteristika ili realizacija je podjednako primenjiva na metode generisanja istih. Slično, gde pronalazak opisuje ili štiti karakteristiku ili realizaciju povezanu sa metodom generisanja konjugovanog imunoglobulina, molekula za vezivanje antigena, imunoglobulina ili varijabilnog regiona lakog lanca, takva karakteristika ili realizacija je podjednako primenljiva prema konjugovanom imunoglobulinu, antigen-vezujućem molekulu, imunoglobulinu ili varijabilnom regionu lakog lanca.
[0034] Pozivanje na određenu numeričku vrednost uključuje najmanje tu posebnu vrednost, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Kada je izražen Opiseg vrednosti, druga realizacija uključuje od jedne određene vrednosti i/ili do druge određene vrednosti. Dalje, referenca na vrednosti navedene u Opisezima uključuje svaku vrednost unutar tog Opisega. Svi Opisezi su uključeni i kombinovani.
[0035] Kada su vrednosti izražene kao aproksimacije, upotrebom prethodnika „približno“, razumeće se da određena vrednost formira drugo izvođenje.
[0036] Treba imati na umu da određene karakteristike otkrivenih metoda, konjugovani imunoglobulini, molekule za vezivanje antigena, imunoglobulini i varijabilni regioni lakog lanca, koji su ovde radi jasnoće opisani u kontekstu odvojenih realizacija, takođe mogu biti obezbeđeni u kombinaciji u pojedinačnoj realizaciji. Suprotno tome, razne karakteristike opisanih metoda, konjugovani imunoglobulini, molekule za vezivanje antigena, imunoglobulini i varijabilni regioni lakog lanca, koji su radi kratkoće opisani u kontekstu jedne realizacije, takođe, mogu biti obezbeđeni odvojeno ili u bilo kojoj podkombinaciji.
[0037] Kako se ovde koristi, oblici jednine „jedan“, „izvesni“ i „taj“ uključuju množinu.
[0038] Izraz „sadrži“ podrazumeva primere obuhvaćene izrazima „koji se u osnovi sastoje od“ i „sastoji se od“; slično, izraz „koji se sastoji u osnovi od“ je namenjen da obuhvati primere obuhvaćene izrazom „koji se sastoji od”.
[0039] Različiti izrazi koji se odnose na aspekte opisa su korišćeni u celoj specifikaciji i patentnim zahtevima. Takvim izrazima treba dati uobičajeno značenje u tehnici, ukoliko nije drugačije naznačeno. Ostali posebno definisani izrazi se moraju tumačiti na način koji je u skladu sa ovde datim definicijama.
[0040] Izraz „oko“ kada se koristi u odnosu na numeričke Opisege, granične vrednosti ili specifične vrednosti je korišćen da bi se naznačilo da se navedene vrednosti mogu razlikovati i do 10% od navedene vrednosti. Dakle, izraz „oko“ se koristi da obuhvati varijacije od ± 10% ili manje, varijacije od ± 5% ili manje, varijacije od ± 1% ili manje, varijacije od ± 0,5% ili manje, ili varijacije od ± 0,1% ili manje od navedene vrednosti.
[0041] Kako se ovde koristi, izraz „biološki uzorak“ se odnosi na uzorak dobijen od subjekta, uključujući uzorak porekla iz biološkog tkiva ili tečnosti dobijen in vivo ili in vitro. Takvi uzorci mogu biti, ali nisu ograničeni na, telesnu tečnost (npr. krv, krvna plazma, serum, mleko, spinalna tečnost, ascites ili urin), organe, tkiva, frakcije i ćelije izolovane od sisara, uključujući ljude. Biološki uzorci takođe, mogu obuhvatati delove uzorka dobijene od subjekta, uključujući tkiva (npr. odsečene delove organa ili tkiva). Biološki uzorci mogu takođe, uključivati ekstrakte iz uzorka dobijenog od subjekta, na primer, izvesni antigen iz biološke tečnosti (npr. krv ili urin).
[0042] Izraz „cistein koji zatvara“ se odnosi na slobodni cistein iz rastvora koji obrazuje disulfidnu vezu sa Cis80 varijabilnog regiona lakog lanca.
[0043] Izraz „himerizovano“, „himerno“, „himerno antitelo“ i slični izrazi se odnose na imunoglobulin koji sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, tj. region za vezivanje antigena, iz jednog izvora ili vrste i najmanje deo konstantnog regiona teškog lanca i konstantnog regiona lakog lanca izveden iz drugog izvora ili vrste. Ovi delovi se
1
mogu hemijski spojiti konvencionalnim tehnikama (npr. sintetskim) ili pripremiti kao susedni polipeptid, koristeći tehnike genetskog inženjeringa (na primer, DNK koja kodira proteinske delove himernog antitela, može biti izražena da bi se dobio susedni polipeptidni lanac). Primeri himernih imunoglobulina uključuju one koji sadrže zečji varijabilni region i humani konstantni region. Takvi himerni imunoglobulini zeca / čoveka su proizvod izraženih imunoglobulinskih gena koji sadrže DNK segmente koji kodiraju varijabilne regione zečjeg imunoglobulina i DNK segmente koji kodiraju konstantne regione humanog imunoglobulina. Ostali oblici „himernih imunoglobulina“ obuhvaćeni sadašnjim pronalaskom su oni u kojima je klasa ili podklasa modifikovana ili promenjena u odnosu na onu iz prvobitnog imunoglobulina (koji se takođe nazivaju „imunoglobulini promenjene klase“). Kroz ceo pronalazak himerni imunoglobulini su označeni kao „xi. ”Ovde se„ himerni imunoglobulin ”i slični izrazi odnose na sekvencu imunglobulina, pre nego na postupak koji se koristi za generisanje antitela.
[0044] Kako se ovde koristi, „Cis80“ se odnosi na cisteinski ostatak na aminokiselinskom položaju 80 varijabilnog regiona lakog lanca u odnosu na varijabilni region lakog lanca koji nema vodeću sekvencu. Na primer, varijabilni regioni lakog lanca otkriveni u tabeli 25 sadrže vodeću sekvencu 19 aminokiselina (kodiranu pomoću 57 nukleotida). „Cis80“ se javlja na aminokiselinskom položaju 99 kada je prisutna vodeća sekvenca i na aminokiselinskom položaju 80 kada je vodeća sekvenca odsutna. Numerisanje Cis80 se zasniva na sistemu numerisanja Kabat/Chothia.
[0045] Izraz "dekapiranje" se odnosi na uklanjanje zatvarajućeg cisteina korišćenjem ovde obezbeđenih postupaka pod uslovima koji minimalizuju poremećaj nativnih intra- i međulančanih disulfida imunoglobulina.
[0046] Izraz „imunoglobulin izveden iz“ se odnosi na imunoglobuline ili njihove delove, koji imaju barem CDR regione zečjeg imunoglobulina. „Imunoglobulin izveden iz“ uključuje, zečje / humane himere ili humanizovane zečje imunoglobuline. Nivo tolerisane varijabilnosti pri dobijanju imunoglobulina iz zeca može da odredi, na primer, Savet za usvojena imena Sjedinjenih Država (USAN) Američkog lekarskog udruženja (AMA).
[0047] Kako se ovde koristi, „funkcionalni agens“ se odnosi na agens koji ima terapeutska, dijagnostička ili druga funkcionalna svojstva. Razni funkcionalni agensi koji spadaju unutar obima pronalaska su ovde opisani na drugom mestu.
[0048] Izraz „humanizovani“, „humanizovani imunoglobulin“ i slični izrazi se odnose na imunoglobuline zečjeg porekla u kojima su aminokiselinske sekvence duž varijabilnih regiona izmenjene u sekvence koje imaju homologiju sa humanim varijabilnim regionom. Primeri humanizovanih imunoglobulina, mogu da sadrže zečji varijabilni domen pri čemu su ostaci u celom okvirnom regionu (FWR) i/ili CDR regionima zamenjeni sekvencama homolognim humanom imunoglobulinu. U nekim slučajevima, FWR ostaci zečjeg imunoglobulina nisu zamenjeni odgovarajućim humanim ostacima. Alternativno, izrazi „humanizovani“, „humanizovani imunoglobulin“ i slični izrazi mogu da se odnose na imunoglobuline humanog porekla u kojima su ostaci duž okvirnih regiona i/ili CDR regiona zamenjeni sekvencama homolognim zečjem imunoglobulinu. Na primer, humanizovani imunoglobulini mogu biti humani imunoglobulini u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona humanog imunoglobulina zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog regiona zečjeg imunoglobulina koji ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. Dalje, humanizovani imunoglobulini mogu da sadrže ostatke koji nisu nađeni u imunoglobulinu primaoca ili u donorskom imunoglobulinu. Ove modifikacije su napravljene radi daljeg usavršavanja imunoglobulinskih performansi. Generalno, humanizovani imunoglobulin će suštinski sadržati sve od najmanje jednog, i tipično dva varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi iz hipervarijabilne petlje odgovaraju onima od imunoglobulina koji nisu humani i svi ili suštinski svi okvirni regioni su oni iz sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovani imunoglobulin takođe, može opciono da sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj iz humanog imunoglobulina. Videti, na primer, Riechmann, L., i sar., Nature 332 (1988) 323-327; i Neuberger, M. S., i sar., Nature 314 (1985) 268-270. Tokom celog pronalaska, „humanizovani imunoglobulini“ su označeni kao „zu”. Ovde se „humanizovani imunoglobulin” i slični izrazi odnose na sekvencu imunoglobulina, a ne na postupak koji se koristi za generisanje imunoglobulina.
[0049] Izraz „donorski imunoglobulin“ se odnosi na nehumani imunoglobulin koji daje aminokiselinske sekvence njegovih varijabilnih regiona, CDR regiona ili drugih funkcionalnih fragmenata ili njihovih analoga humanizovanom imunoglobulinu, i time obezbeđuje humanizovanom imunoglobulinu antigensku specifičnost i aktivnost neutralizacije karakterističnu za donorski imunoglobulin.
[0050] Izraz „imunoglobulin primalac“ se odnosi na imunoglobulin heterologan donorskom imunoglobulinu, koji obezbeđuje aminokiselinske sekvence okvirnih regiona njegovog teškog i/ili lakog lanca i/ili konstantne regione njegovog teškog i/ili lakog lanca humanizovanom imunoglobulinu. Primajući imunoglobulin može biti dobijen od bilo kog sisara. U poželjnim realizacijama, imunoglobulin primalac nije imunogen kod ljudi. Poželjno je da je primajući imunoglobulin humani imunoglobulin.
[0051] „Humanizovanje“ se odnosi na postupak generisanja humanizovanog imunoglobulina i uključuje bilo koji postupak za generisanje humanizovanih imunoglobulina koji imaju gore
1
navedene karakteristike, uključujući, ali nisu ograničeni na, in silico humanizaciju, konstruisanje CDR-ova vrste/domaćina u humanim imunoglobulinima, zamenjujući ostatke okvirnog regiona himernog imunoglobulina da odgovara odgovarajućem humanom okvirnom regionu, itd.
[0052] „Hidrofobna aminokiselina“ se odnosi na aminokiselinu koja pokazuje hidrofobnost veću od nule prema normalizovanoj konsenzusnoj skali hidrofobnosti Eisenberga, 1984, J. Mol. Biol.
179:125-142. Genetski kodirane hidrofobne aminokiseline uključuju Pro (P), Ile (I), Fen (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gli (G) i Tir (Y).
[0053] "Imunoglobulin", kako se ovde koristi, odnosi se na protein koji se sastoji od jednog ili više polipeptida koji su u suštini kodirani od strane imunoglobulinskih gena, uključujući kapa i lambda lake lance i alfa, gama, delta, epsilon i mu teške lance. „Laki lanci“ imunoglobulina pune-dužine (oko 25 Kd ili 214 aminokiselina) su kodirani genom varijabilnog regiona na NH2-završetku (oko 110 aminokiselina) i genom kappa ili lambda konstantnog regiona na COOH-završetku. Slično, „teški lanci“ imunoglobulina pune dužine (oko 50 Kd ili 446 aminokiselina) su kodirani genom varijabilnog regiona (oko 116 aminokiselina) i jednim od ostalih gore pomenutih gena konstantnog regiona, npr. gama (koji kodira oko 330 aminokiselina). „Imunoglobulini“ uključuju: (a) imunoglobulinske polipeptide, tj. polipeptide iz familije imunoglobulina koji sadrže mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za određeni antigen (npr. MSLN, CA9, TEM1, itd.), uključujući sve izotipove imunoglobulina (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD i IgY), klase (npr IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), podklase i različite monomerne i polimerne oblike svakog izotipa, ukoliko nije drugačije naznačeno; i (b) konzervativno supstituisane varijante takvih imunoglobulinskih polipeptida koji se imunospecifično vezuju za antigen (npr. MSLN, CA9, TEM1, itd.). Imunoglobulini su generalno opisani u, na primer, Harlow & Lane, Antitela: Laboratorijski priručnik (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
[0054] Jedan oblik ovde otkrivenog imunoglobulina čini osnovnu strukturnu jedinicu antitela. Na primer, antitelo može da uključuje jedan tetramer i sastoji se od dva identična para imunoglobulinskih lanaca, od kojih svaki par ima jedan laki lanac i jedan teški lanac. Generalno, u svakom paru su varijabilni regioni lakog i teškog lanca zajedno odgovorni za vezivanje za antigen, a konstantni regioni su odgovorni za efektorske funkcije antitela.
[0055] Pored antitela, imunoglobulini mogu da postoje u raznim drugim oblicima, uključujući, na primer: fragmente za vezivanje antigena ili delove imunoglobulina, kao što su Fv, Fab, (Fab')2i Fv fragmenti; i alternativne formate antitela kao što su jednolančani imunoglobulini (scFV i scFab), dijatela, trijatela, tetratela, linearna antitela i multispecifična antitela, da
1
pomenemo samo neke. Videti, na primer, James D. Marks, Konstruisanje antitela, poglavlje 2, Oxford University Press (1995) (Carl K. Borrebaeck, Ed.)
[0056] Kako se ovde koristi, izraz "imunospecifično" se odnosi na sposobnost imunoglobulina da se specifično veže za antigen protiv kojeg je generisan imunoglobulin, a nespecifično se vezuje za druge peptide ili proteine. Imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za antigen protiv kojeg je generisan imunoglobulin se ne mora vezivati za druge polipeptide ili proteine ili se može vezivati za druge polipeptide ili proteine sa nižim afinitetom vezivanja od antigena protiv kojeg je generisan imunoglobulin, kako je određeno pomoću, na primer, imunoeseja, BIAcore ili drugih testova poznatih u struci. Imunoglobulin se imunospecifično vezuje za antigen protiv kojeg je generisan imunoglobulin kada se vezuje za antigen sa većim afinitetom vezivanja nego za bilo koji unakrsno-reaktivni antigen, kao što je utvrđeno eksperimentalnim tehnikama, kao što su, ali nisu ograničene na, radioimunotestove (RIA) i enzimski povezane imunosorbentne testove (ELISA) (videti, na primer, Paul, ur., Fundamental Immunology, 2. izd., Raven Press, New York, str. 332-336 (1989) za diskusiju koja se odnosi na specifičnost antitela).
[0057] "Linker", kako se ovde koristi, odnosi se na razdelnika, koji može biti ravan ili razgranati lanac, za povezivanje imunoglobulina (preko tiol-reaktivne grupe na nesparenom Cis80) sa funkcionalnim sredstvom. Takvi veznici mogu biti odvojivi (npr. kiselinski labilni ili se mogu odvojiti proteazama) ili neodvojivi.
[0058] Izraz „monoklonsko antitelo“ se odnosi na antitelo koje je izvedeno iz klona jedne ćelije, uključujući bilo koji eukariotski ili prokariotski ćelijski klon ili klon faga, a ne na metod kojim je ono proizvedeno. Monoklonsko antitelo pokazuje pojedinačnu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Izraz „monoklonsko antitelo“ nije ograničen na antitela proizvedena preko tehnologije hibridoma.
[0059] „Nativni“ se odnosi na sekvencu imunoglobulina divljeg tipa, iz vrste u kojoj je imunoglobulin izveden. Na primer, u realizacijama gde je Cis80 prisutan u varijabilnom regionu lakog lanca od vrste iz koje potiče, kaže se da je Cis80 prisutan u nativnom varijabilnom regionu lakog lanca.
[0060] Kako se ovde koristi, „procenat identičnosti“ i slični izrazi su korišćeni u opisu veza sekvenci između dve ili više nukleinskih kiselina, polinukleotida, proteina ili polipeptida, i razumljiv je u kontekstu i zajedno sa izrazima koji uključuju: (a) referentnu sekvencu, (b) prozor za poređenje, (c) identičnost sekvence i (d) procenat identičnosti sekvence.
1
(a) „Referentna sekvenca“ je definisana sekvenca koja se koristi kao osnova za poređenje sekvence. Referentna sekvenca može biti podskup ili celina specifične sekvence; na primer, segment cDNK pune dužine ili genske sekvence, ili kompletne sekvence cDNK ili gena. Za polipeptide, primerne dužine referentne polipeptidne sekvence uključuju, najmanje oko 16 aminokiselina, najmanje oko 20 aminokiselina, najmanje oko 25 aminokiselina, najmanje oko 35 aminokiselina, najmanje oko 50 aminokiselina ili najmanje oko 100 aminokiselina. Za nukleinske kiseline, primer dužine referentne sekvence nukleinske kiseline uključuje, najmanje oko 50 nukleotida, najmanje oko 60 nukleotida, najmanje oko 75 nukleotida, najmanje oko 100 nukleotida ili najmanje oko 300 nukleotida, ili bilo koju celu celinu oko toga ili između njih.
(b) „Prozor za poređenje“ uključuje referencu na susedni i specifikovani segment polinukleotidne ili polipeptidne sekvence, pri čemu se polinukleotidna ili polipeptidna sekvenca može porediti sa referentnom sekvencom i pri čemu deo polinukleotidne ili polipeptidne sekvence u prozoru za poređenje može sadržati dodavanja, supstitucije ili delecije (tj. praznine) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži dodavanja, zamene ili brisanja) za optimalno poravnanje dve sekvence. Primerni prozori za poređenje mogu biti najmanje u dužini 20 susednih nukleotida ili aminokiselina, a opciono mogu biti 30, 40, 50, 100 ili duži. Stručnjaci u ovoj oblasti razumeju da se, kako bi se izbegla obmanjujuće velika sličnost sa referentnom sekvencom zbog uključivanja praznina u polinukleotidnoj ili polipeptidnoj sekvenci, obično uvodi kazna za razmak i oduzima od broja podudaranja.
(c) Metode poravnanja sekvenci za poređenje su dobro poznate u tehnici. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje, može biti izvedeno pomoću lokalnog algoritma homologije od strane Smitha i Watermana, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981; algoritmom za homologno poravnanje, Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970; metodom traženja sličnosti od Pearsona i Lipmana, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 8: 2444, 1988; kompjuterizovanim implementacijama ovih algoritama, uključujući, ali ne ograničavajući se na: CLUSTAL u PC/Genskom programu kompanije Intelligenetics, Mountain View, CA, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA i TFASTA u softverskom paketu Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 7 Science Dr., Madison, Wisconsin, SAD; program CLUSTAL je dobro opisan od strane Higginsa and Sharpa, Gene, 73: 237-244, 1988; Corpet, i sar., Nucleic Acids Research, 16: 881-90, 1988; Huang, i sar., Računarske primene u bionaukama, 8: 1-6, 1992; i Pearson, i sar., Methods in Molecular Biology, 24: 7-331, 1994. Porodica programa BLAST koji se mogu
1
koristiti za pretragu sličnosti baza podataka uključuju: BLASTN za nukleotidne sekvence upita prema sekvencama nukleotidne baze podataka; BLASTX za nukleotidne sekvence upita prema sekvencama baze podataka proteina; BLASTP za sekvence upita o proteinima prema sekvencama baze podataka o proteinima; TBLASTN za sekvence upita proteina prema sekvencama baze podataka nukleotida; i TBLASTX za nukleotidne sekvence upita prema sekvencama nukleotidne baze podataka. Videti, Trenutni protokoli u molekularnoj biologiji, poglavlje 19, Ausubel, i sar., Izd., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995. Nove verzije gore navedenih programa ili novi programi, svi zajedno nesumnjivo će postati dostupni u budućnosti i mogu biti korišćeni sa sadašnjim pronalaskom.
(d) „Procenat identičnosti“ označava vrednost utvrđenu poređenjem dve optimalno poravnane sekvence preko okvira poređenja, pri čemu deo polinukleotida ili polipeptidne sekvence u prozoru za upoređivanje može sadržati dodavanja, supstitucije ili delecije (tj. praznine) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži dodavanja, zamene ili brisanja) za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat se izračunava određivanjem broja položaja na kojima se u obe sekvence javlja identična baza nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak da bi se dobio broj podudarnih položaja, deleći broj podudarnih položaja sa ukupnim brojem položaja u prozoru poređenja i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identitčnosti sekvence.
[0061] „Farmaceutski efikasna količina“ se odnosi na količinu imunoglobulina koja leči subjekta.
[0062] „Polarna aminokiselina“ se odnosi na hidrofilnu aminokiselinu koja ima bočni lanac koji je nenaelektrisan pri fiziološkom pH, ali koji ima najmanje jednu vezu u kojoj se jedan elektronski par zajednički deljen od strane dva atoma drži bliže jednim od atoma. Polarne aminokiseline genetski kodirane uključuju, Asn (N), Gln (Q) Ser (S) i Thr (T).
[0063] Izraz "subjekt", kako se ovde koristi, odnosi se na humani ili nehumani organizam. Stoga su ovde opisani postupci, imunoglobulini i konjugovani imunoglobulini primenljivi i na humane i na veterinarske bolesti i stanja. Subjekti mogu biti „pacijenti“, tj. živi ljudi ili nehumani organizmi koji primaju medicinsku negu zbog bolesti ili stanja, ili humani ili nehumani organizmi bez definisane bolesti koji se istražuju zbog znakova patologije ili prisustva/odsustva određenog stanja.
[0064] „Supstituisanje“ se odnosi na zamenu jednog aminokiselinskog ostatka sa drugim. „Supstitucija“ uključuje, na primer, pogrešne mutacije u jednom ili više parova baza DNK koji
1
kodiraju aminokiselinske ostatke ili konstruišu protein da razmenjuje jednu aminokiselinu sa drugom.
[0065] Kako se ovde koriste, izrazi „lečenje“ i slični se odnose na smanjenje težine i/ili učestalosti simptoma bolesti, uklanjanje simptoma bolesti i/ili osnovnog uzroka pomenutih simptoma, smanjenje učestalosti ili verovatnoće pojave simptoma bolesti i/ili njihovog osnovnog uzroka, i poboljšanje ili otklanjanje uzrokovane štete, direktno ili indirektno, bolešću. Primeri bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na, rak.
[0066] „Tiol-reaktivna grupa“ se odnosi na reagens ili grupu koja može da obrazuje kovalentnu vezu sa tiolskom grupom u cisteinu.
[0067] „Neupareni Cis80“ se odnosi na Cis80 prisutan u imunoglobulinu koji ima tiolsku funkcionalnu grupu koja nije uključena u intramolekularnu ili intermolekularnu disulfidnu vezu. Na primer, tiolska funkcionalna grupa „nesparenog Cis80“ nije uključena u disulfidnu vezu sa Cis171.
[0068] Kako se ovde koristi, „90% identično sa“ obuhvata najmanje 90% identično, 91% identično, 92% identično, 93% identično, 94% identično, 95% identično, 96% identično, 97% identično, 98% identično, 99% identično ili 100% identično referentnoj jedinici (npr., biološka sekvenca).
[0069] Sledeće skraćenice su korišćene kroz celokupni pronalazak: konjugati leka i antitela (ADC); lek prema antitelu (DAR); okvirni region (FWR); region za određivanje komplementarnosti (CDR); ugljenična anhidraza IX (CA9); mezotelin (MSLN); auristatin F (AuF); varijabilni teški region (VH); varijabilni laki region (VL); varijabilni kappa (Vκ); zec (Rb; zec); gama konstantni region (Cγ); kappa konstantni region (Cκ); monoklonsko antitelo (mAt); cistein na aminokiselinskom položaju 80 (Cis80).
Generisanje konjugovanih imunoglobulina
[0070] Ovde su otkriveni postupci za generisanje konjugovanog imunoglobulina, postupci koji sadrže:
oslobađanje cisteina na aminokiselinskom položaju 80 („Cis80“) u varijabilnom regionu lakog lanca imunoglobulina izvedenog iz zeca, pri čemu imunoglobulin sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca; i
konjugaciju tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80, pri čemu tiol-reaktivno jedinjenje sadrži tiol-reaktivnu grupu.
2
[0071] Pogodni varijabilni regioni lakog lanca uključuju, na primer, varijabilni region lakog lanca kapa. Varijabilni region lakog lanca otkrivenih imunglobulina potiče od zeca. U nekim realizacijama, Cis80 može biti prisutan u nativnom varijabilnom regionu lakog lanca zečjeg imunoglobulina. Primerni zečevi od kojih se može dobiti varijabilni region lakog lanca koji ima Cis80 uključuju, ali nisu ograničeni na, Oryctolagus cuniculus. U nekim aspektima, na primer, varijabilni region lakog lanca može biti dobijen od novozelandskog belog (NZW) zeca. U ostalim aspektima, varijabilni region lakog lanca može biti dobijen od b9 zeca.
[0072] Primerne metode oslobađanja Cis80 u varijabilnom regionu lakog lanca imunoglobulina uključuju, inkubaciju imunoglobulina sa redukcionim puferom, praćenu inkubacijom imunoglobulina sa oksidacionim puferom. Redukcioni puferi sadrže jedan ili više redukcionih agenasa. Pogodni agensi za redukciju uključuju, na primer, cistein (uključujući L-cistein i D-cistein), 2-merkaptoetilamin, Tris (2-karboksietil) fosfin, 2-merkaptoetansulfonsku kiselinu, 2-merkaptopropionsku kiselinu ili njihove kombinacije. U poželjnim realizacijama, redukcioni pufer može sadržati blagi reduktans kao što je cistein. Koncentracija redukcionog agensa može biti u rasponu od oko 0,2 mM do oko 100 mM, od oko 1 mM do oko 100 mM, od oko 2 mM do oko 100 mM, od oko 5 mM do oko 100 mM, od oko 10 mM do oko 100 mM, od oko 20 mM do oko 100 mM, od oko 40 mM do oko 100 mM, od oko 50 mM do oko 100 mM, od oko 0,2 mM do oko 90 mM, od oko 0,2 mM do oko 80 mM, od oko 0,2 mM do oko 70 mM, od oko 0,2 mM do oko 50 mM, od oko 0,2 mM do oko 30 mM, od oko 0,2 mM do oko 25 mM, od oko 0,2 mM do oko 10 mM, ili od oko 0,2 mM do oko 5 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 0,2 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 1 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 2 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 5 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 10 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 15 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 20 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 25 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 30 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 40 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 50 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 60 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 70 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 80 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 90 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 100 mM.
[0073] U nekim realizacijama, na primer, redukciono sredstvo može da sadrži od oko 2 mM do oko 10 mM cisteina. U nekim realizacijama, redukciono sredstvo može da sadrži od oko 2 mM do oko 10 mM D-cisteina. U nekim realizacijama, redukciono sredstvo može da sadrži od oko 2 mM do oko 10 mM L-cisteina. U nekim realizacijama, redukciono sredstvo može da sadrži od oko 10 mM do oko 100 mM 2-merkaptoetilamina. U nekim realizacijama, redukciono sredstvo može da sadrži od oko 0,2 mM do oko 5 mM Tris (2-karboksietil) fosfina. U nekim realizacijama, redukciono sredstvo može da sadrži od oko 2 mM do oko 20 mM 2-merkaptoetansulfonske kiseline. U nekim realizacijama, redukciono sredstvo može da sadrži od oko 2 mM do oko 20 mM 2-merkaptopropionske kiseline.
[0074] Redukcioni pufer može dalje da sadrži puferska sredstva kao što su natrijum fosfat, kalijum fosfat, MOPIS, HEPES, natrijum borat, kalijum borat ili bilo koju njihovu kombinaciju. Pogodne koncentracije puferskog agensa uključuju, ali nisu ograničene na, od oko 10 mM do oko 100 mM, od oko 15 mM do oko 100 mM, od oko 20 mM do oko 100 mM, od oko 30 mM do oko 100 mM, od oko 35 mM do oko 100 mM, od oko 40 mM do oko 100 mM, od oko 60 mM do oko 100 mM, od oko 80 mM do oko 100 mM, od oko 10 mM do oko 90 mM, od oko 10 mM do oko 80 mM, od oko 10 mM do oko 60 mM, od oko 10 mM do oko 40 mM, od oko 10 mM do oko 30 mM, ili od oko 10 mM do oko 20 mM.
[0075] U nekim realizacijama, na primer, redukcioni pufer može da sadrži od oko 10 mM do oko 100 mM natrijum fosfata. U nekim realizacijama, redukcioni pufer može da sadrži od oko 10 mM do oko 100 mM kalijum fosfata. U nekim realizacijama, redukcioni pufer može da sadrži od oko 10 mM do oko 100 mM MOPIS-a. U nekim realizacijama, redukcioni pufer može da sadrži od oko 10 mM do oko 100 mM HEPES. U nekim realizacijama, redukcioni pufer može da sadrži od oko 10 mM do oko 100 mM natrijum borata. U nekim realizacijama, redukcioni pufer može da sadrži od oko 10 mM do oko 100 mM kalijum borata.
[0076] Redukcioni pufer takođe, može da sadrži helatni agens koji uključuje, ali nije ograničen na, EDTA (etilendiamintetrasirćetnu kiselinu), DTPA (dietilen triamin pentasirćetnu kiselinu) ili njihovu kombinaciju. Pogodne koncentracije helatnih agenasa uključuju, od oko 10 mM do oko 100 mM, od oko 10 mM do oko 80 mM, od oko 10 mM do oko 60 mM, od oko 10 mM do oko 40 mM, od oko 10 mM do oko 30 mM, od oko 10 mM do oko 20 mM, od oko 20 mM do oko 100 mM, od oko 30 mM do oko 100 mM, od oko 40 mM do oko 100 mM, od oko 50 mM do oko 100 mM, od oko 60 mM do oko 100 mM, ili od oko 80 mM do oko 100 mM.
[0077] Pogodni rasponi pH redukcionog pufera uključuju, od oko 6,8 do oko 8,0. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 6,8. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 6,9. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 7,0. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 7,1. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 7,2. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 7,3. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 7,4. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 7,5. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 7,6. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 7,7. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 7,8. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 7,9. U nekim realizacijama, pH redukcionog pufera može biti oko 8,0.
[0078] Imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom za vreme oko 12 sati do oko 96 sati, od oko 18 sati do oko 96 sati, od oko 24 sata do oko 96 sati, od oko 30 sati do oko 96 sati, od oko 36 sati do oko 96 sati, od oko 42 sata do oko 96 sati, od oko 48 sati do oko 96 sati, od oko 54 sati do oko 96 sati, od oko 60 sati do oko 96 sati, od oko 12 sati do oko 90 sati, od oko 12 sati do oko 84 sata, od oko 12 sati do oko 78 sati, od oko 12 sati do oko 72 sata, od oko 12 sati do oko 66 sati, od oko 12 sati do oko 60 sati, od oko 12 sati do oko 54 sata, od oko 12 sati do oko 48 sata, od oko 12 sati do oko 42 sata, od oko 12 sati do oko 36 sati, ili od oko 12 sati do oko 30 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 12 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 18 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 24 sata. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 30 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 36 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 42 sata. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 48 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 54 sata. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 60 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 66 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 72 sata. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 78 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 84 sata. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 90 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom oko 96 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa redukcionim puferom duže od 96 sati.
[0079] Pogodni oksidacioni puferi uključuju, ali nisu ograničeni na, pufere na bazi Tris-a, glutamina, arginina ili drugih aminokiselina ili pufere na bazi primarnih amina. Koncentracija oksidacionog pufera može biti u rasponu od oko 20 mM do oko 100 mM, od oko 40 mM do oko 100 mM, od oko 60 mM do oko 100 mM, od oko 80 mM do oko 100 mM, od oko 20 mM do oko 80 mM, od oko 20 mM do oko 60 mM, ili od oko 20 mM do oko 40 mM. Koncentracija
2
oksidacionog pufera može biti oko 20 mM. Koncentracija oksidacionog pufera može biti oko 25 mM. Koncentracija oksidacionog pufera može biti oko 30 mM. Koncentracija oksidacionog pufera može biti oko 40 mM. Koncentracija oksidacionog pufera može biti oko 50 mM. Koncentracija oksidacionog pufera može biti oko 60 mM. Koncentracija oksidacionog pufera može biti oko 70 mM. Koncentracija oksidacionog pufera može biti oko 80 mM. Koncentracija oksidacionog pufera može biti oko 90 mM. Koncentracija redukcionog agensa može biti oko 100 mM.
[0080] Imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom za vreme oko 24 sata do oko 96 sati, od oko 30 sati do oko 96 sati, od oko 36 sati do oko 96 sati, od oko 42 sata do oko 96 sati, od oko 48 sati do oko 96 sati, od oko 54 sata do oko 96 sati, od oko 60 sati do oko 96 sati, od oko 24 sata do oko 90 sati, od oko 24 sata do oko 84 sata, od oko 24 sata do oko 78 sati, od oko 24 sata do oko 72 sata, od oko 24 sata do oko 66 sati, od oko 24 sata do oko 60 sati, od oko 24 sata do oko 54 sata, od oko 24 sata do oko 48 sati, od oko 24 sata do oko 42 sata, ili od oko 24 sata do oko 36 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 24 sata. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 30 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 36 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 42 sata. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 48 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 54 sata. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 60 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 66 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 72 sata. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 78 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 84 sata. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 90 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom oko 96 sati. U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti inkubiran sa oksidacionim puferom duže od 96 sati.
[0081] Pogodni rasponi pH vrednosti oksidacionog pufera uključuju od oko 7,5 do oko 9,0. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 7,5. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 7,6. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 7,7. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 7,8. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 7,9. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 8,0. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 8,1. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 8,2. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 8,3. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 8,4. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 8,5. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 8,6. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 8,7. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 8,8. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 8,9. U nekim realizacijama, pH oksidacionog pufera može biti oko 9,0.
[0082] Postupak može dalje obuhvatiti imobilisanje imunoglobulina na matrici pre inkubacije sa redukcionim sredstvom i eluiranje imunoglobulina iz matrice nakon inkubacije sa oksidacionim puferom. Pogodne matrice uključuju, bilo koju površinu za koju se imunoglobulin može vezati i eluirati, uključujući, ali ne ograničavajući se na, protein A, protein G, protein L, anti-Fab antitelo, anti-Fc antitelo, nosače na bazi afiniteta protiv MAt i jake katjonske izmenjivačke smole. U nekim realizacijama, matrica može biti protein A. U nekim realizacijama, matrica može biti protein G. U nekim realizacijama, matrica može biti protein L. U nekim realizacijama, matrica može da sadrži antitelo protiv Fab. U nekim realizacijama, matrica može da sadrži anti-Fc antitelo. U nekim realizacijama, matrica može da sadrži anti-MAt. U nekim realizacijama, matrica može da sadrži jaku katjonsku izmenjivačku smolu.
[0083] Otkriveni postupci za oslobađanje imunoglobulina mogu da sadrže: ekvilibrisanje matrice; imobilizaciju imunoglobulina na matrici; inkubiranje imobilizovanog imunoglobulina na matrici sa redukcionim puferom za uklanjanje pokrivajuće grupe; inkubaciju imobilizovanog imunoglobulina na matrici sa oksidacionim puferom; eluiranje imunoglobulina iz matrice i neutralizaciju imunoglobulina.
[0084] Stručnjaci u ovoj oblasti prepoznaju da će pufer, koncentracija, pH i vreme za eluiranje imunoglobulina iz matrice, barem delimično, zavisiti od matrice. Na primer, u realizacijama gde je matrica protein A, imunoglobulin se može eluirati iz proteina A upotrebom glicina (na primer 0,1 M pri pH 2,9). U nekim realizacijama, eluiranje se može izvesti u puferu sa niskim pH.
[0085] Neutralizacija imunoglobulina može da uključuje, inkubiranje imunoglobulina u puferu na bazi Tris-a, natrijum-fosfata ili kalijum-fosfata (ovde se naziva „pufer za neutralizaciju“). Neutralizacioni pufer može imati koncentraciju od oko 0,5 M do oko 2 M i pH od oko 8,0 do oko 9,5.
[0086] Konjugacija se može izvršiti rastvaranjem tiol-reaktivnog jedinjenja u rastvoru za rastvaranje i inkubiranjem rastvorenog tiol-reaktivnog jedinjenja sa imunoglobulinom u konjugacionom puferu.
2
[0087] Za nerastvorljiva u vodi tiol-reaktivna jedinjenja, koja mogu da uključuju, ali nisu ograničena na, jedinjenja na bazi maleimida, pogodni rastvori za rastvaranje, uključuju organske rastvarače koji se mešaju sa vodom, poput dimetilsulfoksida (DMSO). Za tiol-reaktivna jedinjenja rastvorljiva u vodi, pogodni rastvori za rastvaranje uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu ili puferovane vodene rastvore, kao što je fiziološki rastvor puferovan fosfatom, pH 7,2 (1 x PBS).
[0088] Pogodne koncentracije tiol-reaktivnih jedinjenja uključuju, od oko 5 mM do oko 100 mM, od oko 10 mM do oko 100 mM, od oko 25 mM do oko 100 mM, od oko 40 mM do oko 100 mM, od oko 55 mM do oko 100 mM, od oko 70 mM do oko 100 mM, od oko 10 mM do oko 90 mM, od oko 10 mM do oko 75 mM, od oko 10 mM do oko 60 mM, od oko 10 mM do oko 50 mM, od oko 10 mM do oko 40 mM, ili od oko 10 mM do oko 30 mM. U nekim realizacijama, koncentracija tiol-reaktivnog jedinjenja može biti oko 10 mM. U nekim realizacijama, koncentracija tiol-reaktivnog jedinjenja može biti oko 20 mM. U nekim realizacijama, koncentracija tiol-reaktivnog jedinjenja može biti oko 30 mM. U nekim realizacijama, koncentracija tiol-reaktivnog jedinjenja može biti oko 40 mM. U nekim realizacijama, koncentracija tiol-reaktivnog jedinjenja može biti oko 50 mM. U nekim realizacijama, koncentracija tiol-reaktivnog jedinjenja može biti oko 60 mM. U nekim realizacijama, koncentracija tiol-reaktivnog jedinjenja može biti oko 70 mM. U nekim realizacijama, koncentracija tiol-reaktivnog jedinjenja može biti oko 80 mM. U nekim realizacijama, koncentracija tiol-reaktivnog jedinjenja može biti oko 90 mM. U nekim realizacijama, koncentracija tiol-reaktivnog jedinjenja može biti oko 100 mM.
[0089] Pogodne koncentracije imunoglobulina uključuju, od oko 0,1 mg/ml do oko 20 mg/ml, od oko 0,5 mg/ml do oko 20 mg/ml, od oko 1 mg/ml do oko 20 mg/ml, od oko 5 mg/ml do oko 20 mg/ml, od oko 10 mg/ml do oko 20 mg/ml, od oko 0,1 mg/ml do oko 15 mg/ml, od oko 0,1 mg/ml do oko 12 mg/ml, od oko 0,1 mg/ml do oko 10 mg/ml, od oko 0,1 mg/ml do oko 5 mg/ml, ili od oko 0,1 mg/ml do oko 2 mg/ml. U nekim realizacijama, koncentracija imunoglobulina može biti oko 0,1 mg/ml. U nekim realizacijama, koncentracija imunoglobulina može biti oko 0,5 mg/ml. U nekim realizacijama, koncentracija imunoglobulina može biti oko 1 mg/ml. U nekim realizacijama, koncentracija imunoglobulina može biti oko 2 mg/ml. U nekim realizacijama, koncentracija imunoglobulina može biti oko 5 mg/ml. U nekim realizacijama, koncentracija imunoglobulina može biti oko 10 mg/ml. U nekim realizacijama, koncentracija imunoglobulina može biti oko 15 mg/ml. U nekim realizacijama, koncentracija imunoglobulina može biti oko 20 mg/ml.
2
[0090] Odgovarajući odnosi tiol-reaktivnog jedinjenja prema imunoglobulinu uključuju od oko 3:1 do 20:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja prema imunoglobulinu može biti 3:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja prema imunoglobulinu može biti 4:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja: imunoglobulin može biti 5:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja prema imunoglobulinu može biti 6:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja prema imunoglobulinu može biti 7:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja prema imunoglobulinu može biti 8:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja prema imunoglobulinu može biti 9:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja prema imunoglobulinu može biti 10:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja: imunoglobulinu može biti 11:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja: imunoglobulinu može biti 12:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja: imunoglobulinu može biti 13:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja: imunoglobulinu može biti 14:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja: imunoglobulinu može biti 15:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja: imunoglobulinu može biti 16:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja: imunoglobulinu može biti 17: 1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja: imunoglobulinu može biti 18:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja: imunoglobulinu može biti 19:1. U nekim realizacijama, odnos tiol-reaktivnog jedinjenja: imunoglobulinu može biti 20:1.
[0091] Inkubacija se može izvesti u brojnim pogodnim puferima za konjugaciju, uključujući, na primer, 1xPBS, pH 7,2, natrijum fosfat, kalijum fosfat, natrijum borat i HEPES, da navedemo samo neke. Koncentracije pufera za konjugaciju uključuju, od oko 5 mM do oko 100 mM, od oko 10 mM do oko 100 mM, od oko 20 mM do oko 100 mM, od oko 30 mM do oko 100 mM, od oko 45 mM do oko 100 mM od oko 60 mM do oko 100 mM, od oko 75 mM do oko 100 mM, od oko 10 mM do oko 90 mM, od oko 10 mM do oko 75 mM, od oko 10 mM do oko 60 mM, od oko 10 mM do oko 45 mM, ili od oko 10 mM do oko 30 mM. U nekim realizacijama, koncentracija pufera za konjugaciju može biti oko 10 mM. U nekim realizacijama, koncentracija pufera za konjugaciju može biti oko 20 mM. U nekim realizacijama, koncentracija pufera za konjugaciju može biti oko 30 mM. U nekim realizacijama, koncentracija pufera za konjugaciju može biti oko 40 mM. U nekim realizacijama, koncentracija pufera za konjugaciju može biti oko 50 mM. U nekim realizacijama, koncentracija pufera za konjugaciju može biti oko 60 mM. U nekim realizacijama, koncentracija pufera za konjugaciju može biti oko 70 mM. U nekim realizacijama, koncentracija pufera za konjugaciju može biti oko 80 mM. U nekim
2
realizacijama, koncentracija pufera za konjugaciju može biti oko 90 mM. U nekim realizacijama, koncentracija pufera za konjugaciju može biti oko 100 mM.
[0092] Konjugacioni pufer može dalje da sadrži natrijum hlorid. Pogodne koncentracije natrijum hlorida uključuju od oko 0 mM do oko 500 mM, od oko 25 mM do oko 500 mM, od oko 50 mM do oko 500 mM, od oko 75 mM do oko 500 mM, od oko 100 mM do oko 500 mM, od oko 150 mM do oko 500 mM, od oko 200 mM do oko 500 mM, od oko 250 mM do oko 500 mM, od oko 300 mM do oko 500 mM, od oko 350 mM do oko 500 mM, od oko 400 mM do oko 500 mM, od oko 0 mM do oko 400 mM, od oko 0 mM do oko 350 mM, od oko 0 mM do oko 300 mM, od oko 0 mM do oko 250 mM, od oko 0 mM do oko 200 mM, od oko 0 mM do oko 150 mM, od oko 0 mM do oko 100 mM, od oko 0 mM do oko 50 mM ili od oko 0 mM do oko 25 mM. U nekim realizacijama, koncentracija natrijum hlorida može biti oko 25 mM. U nekim realizacijama, koncentracija natrijum hlorida može biti oko 50 mM. U nekim realizacijama, koncentracija natrijum hlorida može biti oko 75 mM. U nekim realizacijama, koncentracija natrijum hlorida može biti oko 100 mM. U nekim realizacijama, koncentracija natrijum hlorida može biti oko 150 mM. U nekim realizacijama, koncentracija natrijum hlorida može biti oko 200 mM. U nekim realizacijama, koncentracija natrijum hlorida može biti oko 250 mM. U nekim realizacijama, koncentracija natrijum hlorida može biti oko 300 mM. U nekim realizacijama, koncentracija natrijum hlorida može biti oko 350 mM. U nekim realizacijama, koncentracija natrijum hlorida može biti oko 400 mM. U nekim realizacijama, koncentracija natrijum hlorida može biti oko 500 mM.
[0093] pH konjugacionog pufera može biti od oko 6,5 do oko 8,5. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 6,5. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 6,6. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 6,7. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 6,8. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 6,9. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 7,0. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 7,1. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 7,2. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 7,3. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 7,4. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 7,5. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 7,6. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 7,7. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 7,8. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 7,9. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 8,0. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 8,1. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 8,2. U nekim realizacijama, pH pufera za
2
konjugaciju može biti oko 8,3. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 8,4. U nekim realizacijama, pH pufera za konjugaciju može biti oko 8,5.
[0094] Da bi se olakšala rastvorljivost tiol-reaktivnog jedinjenja u konjugacionom puferu, konačna koncentracija organskog rastvarača koji se meša sa vodom u konjugacionom puferu može biti od oko 0% do oko 20%, od oko 2% do oko 20%, od oko 5% do oko 20%, od oko 8% do oko 20%, od oko 11% do oko 20%, od oko 16% do oko 20%, od oko 0% do oko 18%, od oko 0% do oko 15 %, od oko 0% do oko 12%, od oko 0% do oko 10%, od oko 0% do oko 8%, od oko 0% do oko 6%, ili od oko 0% do oko 2%.
[0095] Konjugacioni pufer može dalje, da sadrži propilenglikol radi lakše rastvorljivosti tiolreaktivnog jedinjenja u konjugacionom puferu. Pogodne koncentracije propilenglikola uključuju, od oko 10% do oko 50%, od oko 20% do oko 50%, od oko 30% do oko 50%, od oko 40% do oko 50%, od oko 10% do oko 40% , od oko 10% do oko 30%, ili od oko 10% do oko 20%. U nekim realizacijama, koncentracija propilenglikola može biti oko 10%. U nekim realizacijama, koncentracija propilenglikola može biti oko 20%. U nekim realizacijama, koncentracija propilenglikola može biti oko 30%. U nekim realizacijama, koncentracija propilenglikola može biti oko 40%. U nekim realizacijama, koncentracija propilenglikola može biti oko 50%.
[0096] Konjugacioni pufer može dalje, da sadrži nejonski deterdžent da olakša rastvorljivost konjugovanog imunoglobulina u konjugacionom puferu. Primeri nejonskih deterdženata uključuju, ali nisu ograničeni na, polisorbat-20 ili polisorbat-80. Pogodne koncentracije nejonskog deterdženta uključuju, od oko 0% do oko 1%, od oko 0,1% do oko 1%, od oko 0,3% do oko 1%, od oko 0,5% do oko 1%, od oko 0,7% do oko 1%, od oko 0% do oko 0,8%, od oko 0% do oko 0,6%, od oko 0% do oko 0,4% ili od oko 0% do oko 0,2%. U nekim realizacijama, koncentracija nejonskog deterdženta može biti oko 0,1%. U nekim realizacijama, koncentracija nejonskog deterdženta može biti oko 0,2%. U nekim realizacijama, koncentracija nejonskog deterdženta može biti oko 0,3%. U nekim realizacijama, koncentracija nejonskog deterdženta može biti oko 0,4%. U nekim realizacijama, koncentracija nejonskog deterdženta može biti oko 0,5%. U nekim realizacijama, koncentracija nejonskog deterdženta može biti oko 0,6%.
U nekim realizacijama, koncentracija nejonskog deterdženta može biti oko 0,7%. U nekim realizacijama koncentracija nejonskog deterdženta može biti oko 0,8%. U nekim realizacijama, koncentracija nejonskog deterdženta može biti oko 0,9%. U nekim realizacijama koncentracija nejonskog deterdženta može biti oko 1,0%.
[0097] Inkubacija se može izvoditi u vremenskom periodu oko 2 sata do oko 48 sati, za oko 6 sati do oko 48 sati, za oko 12 sati do oko 48 sati, za oko 24 sata do oko 48 sati, za oko 30 sati do
2
oko 48 sati, za oko 36 sati do oko 48 sati, za oko 42 sata do oko 48 sati, za oko 2 sata do oko 42 sata, za oko 2 sata do oko 36 sati, za oko 2 sata do oko 30 sati, za oko 2 sata do oko 24 sata, za oko 2 sata do oko 18 sati, za oko 2 sata do oko 12 sati, ili za oko 2 sata do oko 6 sati. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvesti za 2 sata. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvoditi tokom 6 sati. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvoditi tokom 12 sati. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvoditi tokom18 sati. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvoditi tokom 24 sata. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvoditi tokom 30 sati. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvoditi tokom 36 sati. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvoditi tokom 42 sata. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvoditi tokom 48 sati.
[0098] Temperatura inkubacije može biti od oko 18 ° C do oko 37 ° C, od oko 20 ° C do oko 37 ° C, od oko 22 ° C do oko 37 ° C, od oko 24 ° C do oko 37 ° C, od oko 26 ° C do oko 37 ° C, od oko 28 ° C do oko 37 ° C, od oko 30 ° C do oko 37 ° C, od oko 32 ° C do oko 37 ° C, od oko 34 ° C do oko 37 ° C, od oko 18 ° C do oko 34 ° C, od oko 18 ° C do oko 32 ° C, od oko 18 ° C do oko 30 ° C, od oko 18 ° C do oko 28 ° C, od oko 18 º C do oko 26 º C, ili od oko 18 º C do oko 24 º C. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvesti na 18 º C. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvesti na 20 ° C. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvesti na 22 ° C. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvesti na 24 º C. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvesti na 26 ° C. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvesti na 28 ° C. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvesti na 30 ° C. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvesti na 32 ° C. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvesti na 34 ° C. U nekim realizacijama, inkubacija se može izvesti na 37 ° C.
[0099] Neinkorporirana tiol-reaktivna jedinjenja mogu biti odvojena od konjugovanog imunoglobulina desalinizacionom hromatografijom koristeći brojne pogodne smole, uključujući, ali ne ograničavajući se na, G-25 smolu, G-50 smolu, Biogel P10 ili druge smole sa granicama isključenja od Opisega 5.000-10.000 Da. Hromatografija se može izvoditi u formatu kolone ili u obliku spin-kolone, u zavisnosti od skale. Pogodni puferi za odvajanje soli uključuju, na primer, 1xPBS, natrijum fosfat, kalijum fosfat, natrijum borat ili pufere na bazi HEPES-a koji mogu zameniti 1x PBS.
[0100] U primernoj realizaciji, konjugacija se može izvršiti rastvaranjem tiol-reaktivnog jedinjenja na bazi maleimida u 100% dimetilsulfoksidu (DMSO), pri konačnoj koncentraciji tiol-reaktivnog jedinjenja od 10 mM. Rastvoreno tiol-reaktivno jedinjenje se zatim može inkubirati sa imunoglobulinom pri koncentraciji imunoglobulina od 5 mg/ml u 1xPBS, pH 7,2 pri molarnom odnosu tiol-reaktivnog jedinjenja prema imunoglobulin od 5:1 i potpuno izmešati. Inkubacija se može izvoditi tokom 24 sata na 22ºC. Neugrađeno tiol-reaktivno jedinjenje može biti uklonjeno iz konjugovanog imunoglobulina desalinizacionom hromatografijom koristeći G-25 smolu sa 1x PBS-om kao puferom proticanja.
[0101] Poželjno je da je tiol-reaktivno jedinjenje konjugovano sa Cis80 preko tiol-reaktivne grupe. Tiol-reaktivne grupe uključuju haloacetile, maleimide, aziridine, akriloile, arilatne agense, vinilsulfone, piridil disulfide, TNB-tiole i disulfidne redukcione agense. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati maleimid. U nekim realizacijama, tiolreaktivna grupa može sadržati haloacetil. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati aziridin. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati akriloil. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati sredstvo za arilovanje. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati vinilsulfon. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati piridil disulfid. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati TNB-tiol. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati sredstvo za redukciju disulfida.
[0102] Tiol reaktivne grupe se mogu dobiti iz brojnih pogodnih reagenasa, uključujući jodoacetamide, maleimide, benzil halogenide i bromometilketone, koji mogu reagovati S-alkilacijom tiola da bi stvorili stabilne tioetarske proizvode.
[0103] Tiol-reaktivna grupa se može pripojiti linkeru. Linkeri mogu biti neodvojivi ili odvojivi linkeri. Primerni veznici uključuju, na primer, linkere koji sadrže disulfid, linkere na bazi acetala i linkere na bazi ketala. U nekim aspektima, linker može biti linker koji se ne može odvojiti. Pogodni neodvojivi linkeri uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilenglikol (PEG) ili alkil. U nekim realizacijama, linker može da sadrži PEG. U nekim aspektima, veznik može biti linker koji se može odvojiti. Pogodni cepljivi linkeri uključuju, na primer, valin-citrulin-para aminobenzil. U nekim aspektima, linker može biti linker koji sadrži disulfid. U nekim aspektima, linker može biti linker na bazi acetala. U nekim aspektima, linker može biti veznik na bazi ketala. Primeri veznika kovalentno dodatih na tiol-reaktivnu grupu su dati, na primer, u U.S. Publ. Br.20140050746.
[0104] Tiol-reaktivno jedinjenje može dalje da sadrži funkcionalno sredstvo. Pogodni funkcionalni agensi uključuju, na primer, fluorofore, fluorescentne boje, polipeptide, imunoglobuline, antibiotike, nukleinske kiseline, radionuklide, hemijske veznike, male molekule, helatore, lipide i lekove. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži fluorofor. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži fluorescentnu boju. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži polipeptid. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži imunoglobulin. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži antibiotik. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži
1
nukleinsku kiselinu (poput DNK ili RNK). U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži radionuklid. U nekim aspektima, funkcionalni agens može da sadrži hemijski linker (na primer dibenzilciklooktin (DBCO) ili azid). U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži mali molekul. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži helator (na primer, DOTA, CHX-A"-DTPA, NOTA, između ostalih). U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži lipid. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži lek. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži kombinaciju bilo kog od gore navedenih funkcionalnih agenasa.
[0105] Tiol-reaktivno jedinjenje (tj. prvo tiol-reaktivno jedinjenje) može biti vezano za drugo tiol-reaktivno jedinjenje, pri čemu je drugo tiol-reaktivno jedinjenje vezano za drugi imunoglobulin koji ima varijabilni region drugog teškog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca koji ima cistein na aminokiselinskom položaju 80 („Cis80<2>“), pri čemu drugo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu vezanu za Cis80<2>. Na primer, prvo tiol-reaktivno jedinjenje i drugo tiol-reaktivno jedinjenje mogu da imaju prvi i drugi hemijski linker kao prvo, odnosno drugo funkcionalno sredstvo. Prvi i drugi hemijski veznici mogu biti međusobno vezani brojnim pogodnim sredstvima, uključujući, na primer, hemijom klika.
[0106] U poželjnim realizacijama, Cis80 može biti neuparen. Pogodna sredstva za neuparivanje Cis80 uključuju, na primer, himerizaciju varijabilnog regiona lakog lanca koji ima Cis80 sa konstantnim domenom koji ima aminokiselinski ostatak koji nije cistein na položaju 171.
[0107] Otkriveni postupci se mogu izvoditi na himerizovanom imunoglobulinu. Prema tome, u nekim realizacijama, imunoglobulin može biti himerizovani imunoglobulin. U realizacijama gde je imunoglobulin himerizovan, postupci za generisanje konjugovanog imunoglobulina mogu da obuhvataju: oslobađanje Cis80 u varijabilnom regionu lakog lanca himerizovanog imunoglobulina, pri čemu himerizovani imunoglobulin sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca; i konjugovanje tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80, pri čemu tiolreaktivno jedinjenje sadrži tiol-reaktivnu grupu.
[0108] Alternativno, otkriveni postupci mogu dalje da uključuju himerizaciju imunoglobulina pre uklanjanja kape. Na primer, postupci za generisanje konjugovanog imunoglobulina mogu da sadrže: himerizaciju imunoglobulina koji sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, varijabilni region lakog lanca koji ima Cis80; dekapiranje Cis80; i konjugaciju tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80, pri čemu tiol-reaktivno jedinjenje sadrži tiolreaktivnu grupu.
2
[0109] Otkriveni postupci mogu biti izvedeni na humanizovanom imunoglobulinu. Stoga, u nekim realizacijama, imunoglobulin može biti humanizovani imunoglobulin. U realizacijama u kojima je imunoglobulin humanizovan, postupci za generisanje konjugovanog imunoglobulina mogu da obuhvataju: oslobađanje Cis80 u varijabilnom regionu lakog lanca humanizovanog imunoglobulina, pri čemu humanizovani imunoglobulin sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca; i konjugaciju tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80, pri čemu tiolreaktivno jedinjenje sadrži tiol-reaktivnu grupu.
[0110] Alternativno, otkriveni postupci mogu dalje da uključuju humanizaciju imunoglobulina pre uklanjanja kapica. Na primer, postupci za generisanje konjugovanog imunoglobulina mogu da sadrže: humanizaciju imunoglobulina koji sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, varijabilni region lakog lanca koji ima Cis80; oslobađanje Cis80; i konjugaciju tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80, pri čemu tiol-reaktivno jedinjenje sadrži tiolreaktivnu grupu.
[0111] Postupci mogu dalje da uključuju supstituciju aminokiseline na položaju 83 sa aminokiselinskim ostatkom koji nije Fen, Liz ili Cis. U nekim aspektima, metode mogu da uključuju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa alaninom („Ala83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa valinom („Val83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa izoleucinom („Ile83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa treoninom („Tre83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa argininom („Arg83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa asparaginom („Asn83“). U nekim aspektima, postupci mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa asparaginskom kiselinom („Asp83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa glutaminskom kiselinom („Glu83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa glutaminom („Gln83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa glicinom („Gli83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa histidinom („His83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa leucinom („Leu83“).
U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa metioninom („Met83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa prolinom („Pro83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa serinom („Ser83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa triptofanom („Trp83“). U nekim aspektima, metode mogu da obuhvataju supstituciju fenilalanina na položaju 83 varijabilnog regiona lakog lanca sa tirozinom („Tir83“). U nekim realizacijama, metode mogu da obuhvataju supstituciju aminokiseline na položaju 83 sa polarnom ili hidrofobnom aminokiselinom, uključujući, ali bez ograničenja, alanin, valin, izoleucin ili treonin.
[0112] Aminokiselinski ostatak, osim Fen, Liz ili Cis na položaju aminokiseline 83, u kombinaciji sa otkrivenim metodama uklanjanja kapice može smanjiti agregaciju i povećati efikasnost konjugacije Cis80, iz imunoglobulina. Pogodna agregacija imunoglobulina postignuta otkrivenim metodama uključuje, na primer, manje od oko 5%, manje od oko 7%, manje od oko 10%, manje od oko 12%, manje od oko 15%, manje od oko 17%, manje od oko 20%, manje od oko 22% ili manje od oko 25%. Pogodne efikasnosti konjugacije postignute otkrivenim metodama uključuju, na primer, veće od oko 70%, veće od oko 73%, veće od oko 76%, veće od oko 79%, veće od oko 82%, veće od oko 85%, veće od oko 88%, veće od oko 91%, veće od oko 94%, veće od oko 97% ili veće od oko 99%.
Metode generisanja molekula za vezivanje antigena
[0113] Takođe su ovde otkrivene metode za generisanje molekula koji vezuju antigen, metoda koji uključuje inkubiranje prvog konjugovanog imunoglobulina sa drugim konjugovanim imunoglobulinom za generisanje molekula koji vezuje antigen, pri čemu:
prvi konjugovani imunoglobulin sadrži varijabilni region prvog teškog lanca i varijabilni region prvog lakog lanca, varijabilni region prvog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80<1>"), pri čemu je Cis80<1>konjugovan sa prvim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu; i
drugi konjugovani imunoglobulin sadrži varijabilni region drugog teškog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 ("Cis80<2">), pri čemu je Cis80<2>konjugovan sa drugim tiol-
4
reaktivnim jedinjenjem koje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu.
[0114] Molekule za vezivanje antigena uključuju, multivalentne i/ili multispecifične molekule koje vezuju antigen. Na primer, molekule za vezivanje antigena uključuju dvovalentne, trovalentne i tetravalentne molekule za vezivanje antigena i koje su monospecifične ili bispecifične. U nekim aspektima, molekul koji vezuje antigen može biti dvovalentan i monospecifičan. U nekim aspektima, molekul koji vezuje antigen može biti dvovalentan i bispecifičan. U nekim aspektima, molekul koji vezuje antigen može biti trovalentan i monospecifičan. U nekim aspektima, molekul koji vezuje antigen može biti trovalentan i bispecifičan. U nekim aspektima, molekul koji veže antigen može biti tetravalentan i monospecifičan. U nekim aspektima, molekul koji vezuje antigen može biti tetravalentan i bispecifičan. U nekim aspektima, valentnost može biti veća od četvorovalentne. U nekim aspektima, specifičnost može biti veća od bispecifične.
[0115] Cis80<1>, Cis80<2>, ili oba mogu biti nespareni. Pogodna sredstva za nesparivanje Cis80 uključuju, na primer, himerizaciju varijabilnog regiona lakog lanca koji ima Cis80 sa konstantnim domenom koji ima aminokiselinski ostatak koji nije cistein na položaju 171.
[0116] U nekim aspektima, metode mogu dalje da obuhvataju uklanjanje kapice sa Cis80<1>. U nekim aspektima, metode mogu dalje da obuhvataju uklanjanje kapice sa Cis80<2>. U ostalim aspektima, metode mogu dalje da obuhvataju oslobađanje Cis80<1>i Cis80<2>.
[0117] Uklanjanje kapice može da sadrži inkubaciju prvog imunoglobulina, drugog imunoglobulina ili oba, sa redukcionim puferom, praćeno inkubacijom prvog imunoglobulina, drugog imunoglobulina, ili oba, sa oksidacionim puferom. U nekim aspektima metoda za generisanje molekula za vezivanje antigena, uklanjanje zaštite može dalje obuhvatati imobilizaciju prvog imunoglobulina, drugog imunoglobulina ili oba na matrici pre inkubacije sa redukcionim puferom i eluiranje prvog imunoglobulina, drugog imunoglobulina, ili oba iz matrice sledeći inkubaciju sa oksidacionim puferom.
[0118] Pogodni uslovi za uklanjanje kapice i konjugaciju, uključujući redukcione pufere, oksidacione pufere, koncentracije, pH, vremena i matrice, otkriveni su u odeljku pod naslovom „generisanje konjugovanih imunoglobulina“ i ovde su podjednako primenljivi.
[0119] U nekim aspektima, postupci mogu dalje da obuhvataju konjugaciju prvog tiolreaktivnog jedinjenja sa Cis80<1>, pri čemu prvo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži prvu tiolreaktivnu grupu. U nekim aspektima, postupci mogu dalje da obuhvataju konjugaciju drugog tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80<2>, pri čemu drugo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži drugu tiolreaktivnu grupu. U još drugim aspektima, postupci mogu dalje da obuhvataju konjugaciju prvog tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80<1>i drugog tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80<2>, pri čemu prvo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu i drugo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu.
[0120] Postupci mogu dalje da obuhvataju i uklanjanje kapice i konjugaciju. Na primer, metode mogu dalje da sadrže, pre koraka inkubacije,
uklanjanje zaštite sa Cis80<1>, Cis80<2>ili oboje; i
konjugaciju prvog tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80<1>, drugog tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80<2>, ili oba, pri čemu prvo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu, a drugo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu.
[0121] Prvi imunoglobulin, drugi imunoglobulin, ili oba, mogu biti himerizovani. Suprotno tome, metode mogu dalje da obuhvataju himerizaciju prvog imunoglobulina, himerizaciju drugog imunoglobulina ili himerizaciju i prvog imunoglobulina i drugog imunoglobulina. Na primer, i bez namere da budu ograničavajuće, metode mogu dalje da sadrže, pre koraka inkubacije:
himerizaciju prvog imunoglobulina koji sadrži Cis80<1>da bi se generisao prvi himerni imunoglobulin;
himerizaciju drugog imunoglobulina koji sadrži Cis80<2>da bi se generisao drugi himerni imunoglobulin;
oslobađanje Cis80<1>, Cis80<2>ili oboje; i
konjugaciju prvog tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80<1>, drugog tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80<2>, ili oboje, pri čemu prvo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu i drugo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu.
[0122] Prvi imunoglobulin, drugi imunoglobulin, ili oba, mogu biti humanizovani. Suprotno tome, metode mogu dalje da obuhvataju humanizovanje prvog imunoglobulina, humanizovanje drugog imunoglobulina, ili humanizovanje oba i prvog imunoglobulina i drugog imunoglobulina. Na primer, bez namere da budu ograničavajuće, metode mogu dalje da sadrže, pre koraka inkubacije:
humanizovanje prvog imunoglobulina koji sadrži Cis80<1>da bi se dobio prvi
humanizovani imunoglobulin;
humanizovanje drugog imunoglobulina koji sadrži Cis80<2>da bi se dobio drugi
humanizovani imunoglobulin;
oslobađanje Cis80<1>, Cis80<2>ili oba; i
konjugaciju prvog tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80<1>, drugog tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80<2>, ili oba, pri čemu prvo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu, a drugo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu.
[0123] Poželjno je da je prvo i drugo tiol-reaktivno jedinjenje konjugovano sa Cis80<1>i Cis80<2>, respektivno, preko prve tiol-reaktivne grupe i druge tiol-reaktivne grupe. Pogodne, tiolreaktivne grupe uključuju haloacetile, maleimide, aziridine, akriloile, agense za arilovanje, vinilsulfone, piridil disulfide, TNB-tiole i agense za redukciju disulfida. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati maleimid. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati haloacetil. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati aziridin. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati akriloil. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati sredstvo za arilovanje. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati vinilsulfon. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati piridil disulfid. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati TNB-tiol. U nekim realizacijama, prva tiol- reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati sredstvo za redukciju disulfida.
[0124] Prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe mogu biti vezane za linker. U nekim aspektima, prva tiol-reaktivna grupa može biti dodata vezniku („prvi veznik“). U nekim aspektima, druga tiol-reaktivna grupa može biti dodata vezniku („drugi veznik“). U još drugim aspektima, prva tiol-reaktivna grupa može biti dodata prvom vezniku, a druga tiolreaktivna grupa može biti dodata drugom vezniku. Pogodni prvi i drugi linkeri mogu biti neodvojivi linkeri ili cepljivi linkeri. Primerni prvi i drugi linkeri uključuju, na primer, linkere koji sadrže disulfid, linkere na bazi acetala i linkere na bazi ketala. U nekim aspektima, prvi veznik, drugi veznik ili oba, mogu biti linker koji se ne može odvojiti. Pogodni necepljivi linkeri uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilenglikol (PEG) ili alkil. U nekim realizacijama, prvi linker, drugi linker ili oba, mogu sadržati PEG. U nekim aspektima, prvi veznik, drugi veznik, ili oba, mogu biti odvojivi linker. Pogodni cepljivi linkeri uključuju, na primer, valin-citrulinpara aminobenzil. U nekim aspektima, prvi linker, drugi linker ili oba, mogu biti linker koji sadrži disulfid. U nekim aspektima, prvi linker, drugi linker ili oba mogu biti linker na bazi acetala. U nekim aspektima, prvi veznik, drugi veznik ili oboje mogu biti veznici zasnovani na ketalu. Primeri veznika kovalentno dodatih na tiol-reaktivnu grupu su dati, na primer, u U.S. Publ. Br.20140050746.
[0125] Prvo tiol-reaktivno jedinjenje, drugo tiol-reaktivno jedinjenje, ili oba, mogu dalje da sadrže funkcionalno sredstvo. U nekim aspektima, prvo tiol-reaktivno jedinjenje može dalje da sadrži jedno funkcionalno sredstvo („prvo funkcionalno sredstvo“). U nekim aspektima, drugo tio-reaktivno jedinjenje može dalje da sadrži jedno funkcionalno sredstvo („drugo funkcionalno sredstvo“). U još nekim aspektima, prvo tiol-reaktivno jedinjenje može dalje da sadrži prvo funkcionalno sredstvo, a drugo tiol-reaktivno jedinjenje može dalje da sadrži drugo funkcionalno sredstvo.
[0126] Pogodni funkcionalni agensi uključuju, na primer, hemijske veznike. Poželjno je da hemijski veznik prvog tiol-reaktivnog jedinjenja („prvi hemijski veznik“) i hemijski veznik drugog tiol-reaktivnog jedinjenja („drugi hemijski veznik“) mogu biti kuplovani. Na primer, i bez namere da bude ograničavajući, jedan od prvog ili drugog hemijskog veznika može biti dibenzilciklooktin (DBCO), a drugi od prvog ili drugog hemijskog veznika može biti azid. U nekim realizacijama, na primer, prvi hemijski linker može biti DBCO, a drugi hemijski linker može biti azid. Suprotno tome, prvi hemijski veznik može biti azid, a drugi hemijski veznik može biti DBCO. DBCO i azid mogu biti kuplovani, što rezultira konjugacijom prvog imunoglobulina i drugog imunoglobulina. Na primer, prvi imunoglobulin i drugi imunoglobulin mogu biti međusobno konjugovani hemijom klika.
[0127] U primernoj realizaciji, tiol-reaktivna jedinjenja mogu da uključuju maleimido-PEG4-azid i maleimido-PEG4-dibenzociklooktin. U nekim aspektima, na primer, prvo tiol-reaktivno jedinjenje može biti maleimido-PEG4-azid, a drugo tiol-reaktivno jedinjenje može biti maleimido-PEG4-dibenzociklooktin. U nekim aspektima, prvo tiol-reaktivno jedinjenje može biti maleimido-PEG4-dibenzociklooktin, a drugo tiol-reaktivno jedinjenje može biti maleimido-PEG4-azid.
[0128] Prvi imunoglobulin, drugi imunoglobulin, ili oba, mogu biti Fab fragmenti. U nekim realizacijama, prvi imunoglobulin može biti jedan Fab („prvi Fab“). U nekim realizacijama, drugi imunoglobulin može biti jedan Fab („drugi Fab“). U još drugim realizacijama, prvi imunoglobulin može biti prvi Fab, a drugi imunoglobulin može biti drugi Fab.
[0129] U nekim realizacijama, postupci uključuju generisanje prvog Fab-a, drugog Fab-a ili oba, pre inkubacije. Pogodne tehnike za generisanje Fab-ova su poznate u tehnici i uključuju, na primer, digestiju potpunog ili delimičnog imunoglobulina da bi se dobio jedan Fab ili rekombinantno izražavanje imunoglobulina u obliku Fab-a. Na primer, metode generisanja molekula za vezivanje antigen mogu dalje da sadrže, pre inkubacije,
digestiju prvog imunoglobulina, drugog imunoglobulina ili oba, sa papainom da bi se generisao prvi Fab, drugi Fab ili prvi i drugi Fab, pri čemu prvi imunoglobulin sadrži prvi teški lanac i prvi laki lanac, prvi laki lanac ima cistein na položaju 80 („Cis80<1>“), a pri čemu drugi imunoglobulin sadrži drugi teški lanac i drugi laki lanac, drugi laki lanac koji ima cistein na položaju 80 („Cis80<2>“); ili
rekombinantno eksprimiranje prvog Fab fragmenta koji sadrži prvi teški lanac i prvi laki lanac koji ima cistein na položaju 80 (Cis80<1>), rekombinantno eksprimiranje drugog Fab fragmenta koji sadrži drugi teški lanac i drugi laki lanac koji ima cistein na položaju 80 ( Cis80<2>), ili oboje; i konjugacija prvog Fab na Cis80<1>sa prvim tiol-reaktivnim jedinjenjem da bi se dobio prvi konjugovani Fab, konjugacija drugog Fab na Cis80<2>sa drugim tiol-reaktivnim jedinjenjem da bi se dobio drugi konjugovani Fab, ili oboje.
[0130] Postupci za generisanje molekula za vezivanje antigena mogu dalje, da sadrže supstituisanje aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca sa aminokiselinskim ostatkom koji nije Fen, Liz ili Cis. Postupci za stvaranje molekula koji vezuju antigen mogu dalje da sadrže supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca sa aminokiselinskim ostatkom koji nije Fen, Liz ili Cis. Postupci generisanja molekula za vezivanje antigena mogu dalje da sadrže supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca sa aminokiselinskim ostatkom koji nije Fen, Liz ili Cis i supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca sa aminokiselinskim ostatkom koji nije Fen, Liz ili Cis.
[0131] U nekim aspektima, postupci mogu da uključuju supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca, supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca ili supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca i varijabilnog regiona drugog lakog lanca sa alaninom („Ala83“), valinom („Val83“), izoleucinom („Ile83“), treoninom („Tre83“), argininom („Arg83“), asparaginom („Asn83”), asparaginskom kiselinom („Asp83“), glutaminskom kiselinom („Glu83“), glutaminom („Gln83“), glicinom („ Gli83“), histidinom („His83“), leucinom („Leu83“), metioninom („Met83”), prolinom („Pro83“), serinom („Ser83“), triptofanom („Trp83“) ili tirozinom („Tir83“).
[0132] Aminokiselina na položaju 83 u varijabilnom regionu prvog lakog lanca može biti ista kao i aminokiselina na položaju 83 u varijabilnom regionu drugog lakog lanca. Suprotno tome, aminokiselina na položaju 83 u varijabilnom regionu prvog lakog lanca se može razlikovati od polarne ili hidrofobne aminokiseline na položaju 83 u varijabilnom regionu drugog lakog lanca. Aminokiselina na položaju 83, osim Fen, Liz ili Cis u varijabilnom regionu prvog lakog lanca i/ili aminokiselina na položaju 83, osim Fen, Liz ili Cis, u varijabilnom regionu drugog lakog lanca, može biti polarna ili hidrofobna aminokiselina uključujući, ali nije ograničena na, alanin, valin, izoleucin ili treonin. U nekim aspektima, postupci mogu da obuhvataju supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca, supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca ili supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca i varijabilnog regiona drugog lakog lanca sa valinom („Val83“). U nekim aspektima, postupci mogu da obuhvate supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca, supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca ili supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca i varijabilnog regiona drugog lakog lanca sa izoleucinom („Ile83“). U nekim aspektima, postupci mogu da uključuju supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca, supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca ili supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca i varijabilnog regiona drugog lakog lanca sa treoninom („Tre83“). Polarna ili hidrofobna aminokiselina na položaju 83 u varijabilnom regionu prvog lakog lanca može biti ista kao ili različita od polarne ili hidrofobne aminokiseline na položaju 83 u varijabilnom regionu drugog lakog lanca.
[0133] Pogodni varijabilni regioni lakog lanca uključuju, na primer, varijabilni region lakog lanca kapa. U nekim realizacijama, Cis80<1>, Cis80<2>, ili oboje, mogu biti prisutni u varijabilnom regionu nativnog lakog lanca. Varijabilni region prvog lakog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca su izvedeni od zeca. Primerni zečevi iz kojih se mogu dobiti varijabilni region prvog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca, ili oba, uključuju, ali nisu ograničeni na, Oryctolagus cuniculus. U nekim aspektima, na primer, varijabilni region (i) lakog lanca može biti dobijeni od novozelandskog belog (NZW) zeca. U drugim aspektima, varijabilni region (i) lakog lanca može biti dobijeni od zeca b9.
Imunoglobulinske komponente konjugovanih imunoglobulina
[0134] Ovde su otkriveni imunoglobulini koji sadrže varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, varijabilni region lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 („Cis80“) i aminokiselinu izuzev Fen, Liz ili Cis na položaju 83.
[0135] Pogodni varijabilni regioni lakog lanca uključuju, na primer, varijabilni region lakog lanca kapa. Varijabilni region lakog lanca potiče od zeca. U nekim realizacijama, Cis80 može biti prisutan u varijabilnom regionu nativnog lakog lanca zečjeg imunoglobulina. Primerni
4
zečevi od kojih se može dobiti varijabilni region lakog lanca koji ima Cis80 uključuju, ali nisu ograničeni na, Oryctolagus cuniculus. U nekim aspektima, na primer, varijabilni region lakog lanca može biti dobijen od novozelandskog belog (NZW) zeca. U drugim aspektima, varijabilni region lakog lanca može biti dobijen od b9 zeca.
[0136] Aminokiselina izuzev Fen, Liz ili Cis na položaju 83, uključuje alanin („Ala83“), valin („Val83“), izoleucin („Ile83“), treonin („Tre83“), arginin („Arg83“), asparagin („Asn83“), asparaginsku kiselinu („Asp83“), glutaminsku kiselinu („Glu83“), glutamin („Gln83“), glicin („Gli83“), histidin („His83“), leucin („Leu83“) , metionin („Met83“), prolin („Pro83“), serin („Ser83“), triptofan („Trp83“) ili tirozin („Tir83“).
[0137] U nekim realizacijama, aminokiselina izuzev Fen, Liz ili Cis na položaju 83, može biti polarna ili hidrofobna aminokiselina koja uključuje, ali nije ograničena na, alanin, valin, izoleucin ili treonin. U nekim aspektima, polarna ili hidrofobna aminokiselina izuzev Phe na položaju 83 je alanin („Ala83“). U nekim aspektima, polarna ili hidrofobna aminokiselina osim Phe na položaju 83 je valin („Val83“). U nekim aspektima, polarna ili hidrofobna aminokiselina, osim Phe na položaju 83, je izoleucin („Ile83“). U nekim aspektima, polarna ili hidrofobna aminokiselina izuzev Phe na položaju 83 je treonin („Thr83“).
[0138] Cis80 može biti neuparen. Na primer, varijabilni region lakog lanca koji ima Cis80 može biti himerizovan sa konstantnim domenom koji ima aminokiselinski ostatak koji nije cistein na položaju 171.
[0139] Poželjno je Cis80 oslobođen.
[0140] U nekim realizacijama, imunoglobulini mogu biti himerizovani. U drugim realizacijama, imunoglobulini mogu biti humanizovani.
[0141] U nekom izvođenju, otkriveni imunoglobulin se imunospecifično vezuje za humani CA9. U nekim realizacijama, imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani CA9 sadrži:
a. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-141 od xi155D5HC (SEK ID BR: 52) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od xi155D5LC (SEK ID BR: 78);
b. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-144 od zu155D5HC (SEK ID BR: 54) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-130 od zu155D5LC-3 (SEK ID BR: 84), zu155D5LC-4 (SEK ID BR: 86), zu155D5LC-5 (SEK ID BR: 88), zu155D5LC-6 (SEK ID BR: 90), zu155D5LC-7 (SEK ID BR: 92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEK ID BR: 96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEK ID BR: 100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEK ID BR: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEK ID BR: 104); ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEK ID BR: 106);
c. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-138 od xi1E4HC (SEK ID BR: 58) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od xi1E4LC (SEK ID BR: 110);
d. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-140 od zu1E4HC (SEK ID BR: 60) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od zu1E4LC-CXXA (SEK ID BR: 114);
e. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-142 od xi166B3HC (SEK ID BR: 74) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-130 od xi166B3LC (SEK ID BR: 132); ili
f. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-145 od zu166B3HC (SEK ID BR: 76) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-130 od zu166B3LC-CXXA (SEK ID BR: 136).
[0142] U nekim realizacijama, imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani CA9 sadrži:
a. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-141 od xi155D5HC (SEK ID BR: 52) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 od xi155D5LC (SEK ID BR: 78);
b. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-144 od zu155D5HC (SEK ID BR: 54) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 od zu155D5LC-3 (SEK ID BR: 84), zu155D5LC-4 (SEK ID BR: 86), zu155D5LC-5 (SEK ID BR: 88), zu155D5LC-6 (SEK ID BR: 90), zu155D5LC-7 (SEK ID BR: 92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEK ID BR: 96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEK ID BR: 100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEK ID BR: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEK ID BR: 104); ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEK ID BR: 106);
c. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-138 od xi1E4HC (SEK ID BR: 58) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 od xi1E4LC (SEK ID BR: 110);
d. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-140 od zu1E4HC (SEK ID BR: 60) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 od zu1E4LC-CXXA (SEK ID BR: 114);
e. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-142 od xi166B3HC (SEK ID BR: 74) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 od xi166B3LC (SEK ID BR: 132); ili
f. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-145 od zu166B3HC (SEK ID BR: 76) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 od zu166B3LC-CXXA (SEK ID BR: 136), ili
[0143] U nekim realizacijama, imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani CA9 sadrži:
a. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi155D5HC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 146, 148, odnosno 150, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi155D5LC kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 224, 226, odnosno 228;
b. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od zu155D5HC prikazane kao SEK ID BR: 152, 154, odnosno 156, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od zu155D5LC-3 prikazane kao SEK ID BR: 242, 244, odnosno 246, zu155D5LC-4 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 248, 250, odnosno 252, zu155D5LC-5 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 254, 256, odnosno 258, zu155D5LC-6 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 260, 262, odnosno 264, zu155D5LC-7 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 266, 268, odnosno 270, zu155D5LC-huVK2-40 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 278, 280, odnosno 282, zu155D5LC-huVK4-1 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR 290, 292, odnosno 294, zu155D5LC-huVK6-21, kako je dalje navedeno kao SEK ID BR 296, 298, i 300, respektivno, zu155D5LC-huVK6D-41 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR 302, 304, odnosno 306; ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 308, 310, odnosno 312;
c. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi1E4HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 164, 166, odnosno 168, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi1E4LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 320, 322, odnosno 324;
4
d. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu1E4HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 170, 172, odnosno 174, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu1E4LC-CXXA kako je navedeno kao SEK ID BR: 332, 334, odnosno 336;
e. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi166B3HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 212, 214, odnosno 216, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi166B3LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 386, 388, odnosno 390; ili
f. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od zu166B3HC, kako je navedeno kao SEK ID BR: 218, 220, odnosno 222, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od zu166B3LC-CXXA, kako je navedeno kao SEK ID BR: 398, 400, odnosno 402.
[0144] U nekim realizacijama, otkriveni imunoglobulini se imunospecifično vezuju za humani TEM1. U nekim realizacijama, imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani TEM1 sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-139 od xi1-55-2HC (SEK ID BR: 56) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-129 od xi1-55-2LC (SEK ID BR: 108).
[0145] U nekim realizacijama, imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani TEM1 sadrži varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-139 od xi-1-55-2HC (SEK ID BR: 56) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-129 od xi1-55-2LC (SEK ID BR: 108).
[0146] U nekim realizacijama, imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani TEM1 sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi1-55-2HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 158, 160, odnosno 162, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi1-55-2LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 314, 316, i 318, respektivno.
[0147] U nekim realizacijama, otkriveni imunoglobulini se imunospecifično vezuju za humani mezotelin. U nekim realizacijama, imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani mezotelin sadrži:
a. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-142 xi33O11HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-131 od xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
b. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-145 zu33O11HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-131 od zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122);
c. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
d. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
e. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-132 od xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi237N18LC (SEK ID BR: 128); ili
f. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 od xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-127 od xi383I18LC (SEK ID BR: 130).
[0148] U nekim realizacijama, imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani mezotelin sadrži:
a. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-142 xi33O11HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-131 xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
b. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-145 zu33O11HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-131 zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122);
c. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
4
d. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
e. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-132 od xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 od xi237N18LC (SEK ID BR: 128); ili
f. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi383I18LC (SEK ID BR: 130).
[0149] U nekim realizacijama, imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani mezotelin sadrži:
a. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi33O11HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 176, 178 i 180, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi33O11LC kako je prikazano kao SEK ID BR: 338, 340, odnosno 342;
b. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od zu33O11HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 182, 184, odnosno 186, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu33O11LC-CXXA kako je navedeno kao SEK ID BR: 350, 352, odnosno 354, ili zu33O11LC-CXXI kako je navedeno kao SEK ID BR: 356, 358, odnosno 360;
c. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi324O5HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 188, 190, odnosno 192, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi324O5LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 362, 364, odnosno 366;
d. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi178F16HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 194, 196, odnosno 198, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi178F16LC kako su predstavljeni kao SEK ID BR: 368, 370, odnosno 372;
e. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi237N18HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 200, 202, odnosno 204, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi237N18LC, kako je navedeno kao SEK ID BR: 374, 376, odnosno 378;
ili
f. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi383I18HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 206, 208, odnosno 210, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi383I18LC prikazane kao SEK ID BR: 380, 382, odnosno 384.
4
Konjugovani imunoglobulini
[0150] Ovde su takođe, otkriveni konjugovani imunoglobulini koji sadrže bilo koji od ovde otkrivenih imunoglobulina, pri čemu je cistein na položaju 80 („Cis80“) konjugovan sa tiolreaktivnim jedinjenjem, tiol-reaktivno jedinjenje koje sadrži tiol-reaktivnu grupu.
[0151] U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulini sadrže imunoglobulin koji sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, varijabilni region lakog lanca koji ima Cis80 i aminokiselinu koja nije Fen, Liz ili Cis na položaju 83, gde je Cis80 konjugovan sa tiol-reaktivnim jedinjenjem, tiol-reaktivno jedinjenje sadrži tiol-reaktivnu grupu. U nekim realizacijama, varijabilni region lakog lanca može da ima Cis80 i polarnu ili hidrofobnu aminokiselinu, izuzev Fen, Liz ili Cis, na položaju 83.
[0152] Imunoglobulin sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca. Pogodni varijabilni regioni lakog lanca uključuju, na primer, varijabilni region lakog lanca kapa.Varijabilni region lakog lanca potiče od zeca. U nekim realizacijama, Cis80 može biti prisutan u nativnom varijabilnom regionu lakog lanca zečjeg imunoglobulina. Primerni zečevi od kojih se može dobiti varijabilni region lakog lanca koji ima Cis80 uključuju, ali nisu ograničeni na, Oryctolagus cuniculus. U nekim aspektima, na primer, varijabilni region lakog lanca može biti dobijen od novozelandskog belog (NZW) zeca. U ostalim aspektima, varijabilni region lakog lanca može biti dobijen od b9 zeca.
[0153] Varijabilni region lakog lanca može da ima Cis80 i aminokiselinu izuzev Fen, Liz ili Cis na položaju 83. Aminokiselina koja nije Fen, Liz ili Cis na položaju 83 uključuje, alanin („Ala83“), valin („Val83“), izoleucin („Ile83“), treonin („Tre83“), arginin („Arg83“), asparagin („Asn83“), asparaginsku kiselinu („Asp83“), glutaminsku kiselinu („Glu83“), glutamin („Gln83“), glicin („Gli83“), histidin („His83“), leucin („Leu83“), metionin („Met83“), prolin („Pro83“), serin („Ser83“), triptofan („Trp83“) ili tirozin („Tir83“). U nekim realizacijama, varijabilni region lakog lanca može da ima Cis80 i polarnu ili hidrofobnu aminokiselinu koja nije Fen, Liz ili Cis na položaju 83. Pogodne polarne ili hidrofobne aminokiseline uključuju, ali nisu ograničene na, alanin, valin, izoleucin ili treonin. U nekim aspektima, polarna ili hidrofobna aminokiselina koja nije Fen na položaju 83 je alanin („Ala83“). U nekim aspektima, polarna ili hidrofobna aminokiselina osim Fen na položaju 83 je valin („Val83“). U nekim aspektima, polarna ili hidrofobna aminokiselina, osim Fen na položaju 83, je izoleucin („Ile83“). U nekim aspektima, polarna ili hidrofobna aminokiselina koja nije Fen na položaju 83 je treonin („Tre83“).
4
[0154] Cis80 može biti neuparen. Na primer, varijabilni region lakog lanca koji ima Cis80 može biti himerizovan sa konstantnim domenom koji ima aminokiselinski ostatak koji nije cistein na položaju 171.
[0155] Poželjno je da je Cis80 oslobođen.
[0156] U nekim realizacijama, imunoglobulin može biti himerizovan. U drugim realizacijama, imunoglobulin može biti humanizovan.
[0157] Poželjno je da je tiol-reaktivno jedinjenje konjugovano sa Cis80 preko tiol-reaktivne grupe. Tiol-reaktivne grupe uključuju haloacetile, maleimide, aziridine, akriloile, agense za arilovanje, vinilsulfone, piridil disulfide, TNB-tiole i redukcione agense disulfida. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati maleimid. U nekim realizacijama, tiolreaktivna grupa može sadržati haloacetil. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati aziridin. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati akriloil. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati agens za arilovanje. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati vinilsulfon. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati piridil disulfid. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati TNB-tiol. U nekim realizacijama, tiol-reaktivna grupa može sadržati sredstvo za redukciju disulfida.
[0158] Tiol-reaktivna grupa može biti dodata linkeru. Veznici mogu biti linkeri koji se ne mogu otcepiti ili linkeri koji se mogu otcepiti. Primerni linkeri uključuju, na primer, linkere koji sadrže disulfid, linkere na bazi acetala i linkere na bazi ketala. U nekim aspektima, linker može biti linker koji se ne može otcepiti. Pogodni neodvojivi linkeri uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilenglikol (PEG) ili alkil. U nekim realizacijama, linker može sadržati PEG. U nekim aspektima, povezivač može biti veznik koji se može otcepiti. Pogodni cepljivi linkeri uključuju, na primer, valin-citrulin-para aminobenzil. U nekim aspektima, linker može biti linker koji sadrži disulfid. U nekim aspektima, linker može biti linker na bazi acetala. U nekim aspektima, linker može biti veznik zasnovan na ketalu. Primeri veznika kovalentno dodatih u tiol-reaktivnu grupu su dati, na primer, u U.S. Publ. Br.20140050746.
[0159] Tiol-reaktivno jedinjenje može dalje da sadrži funkcionalno sredstvo. Pogodni funkcionalni agensi uključuju, na primer, fluorofore, fluorescentne boje, polipeptide, imunoglobuline, antibiotike, nukleinske kiseline, radionuklide, hemijske veznike, male molekule, helatore, lipide i lekove. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži fluorofor. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži fluorescentnu boju. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži polipeptid. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži imunoglobulin. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži antibiotik. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži
4
nukleinsku kiselinu (poput DNK ili RNK). U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži radionuklid. U nekim aspektima, funkcionalni agens može da sadrži hemijski linker (na primer dibenzilciklooktin (DBCO) ili azid). U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži mali molekul. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži helator (na primer, DOTA, CHX-A"-DTPA, NOTA, između ostalih). U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži lipid. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži lek. U nekim aspektima, funkcionalno sredstvo može da sadrži kombinaciju bilo kog od gore navedenih funkcionalnih sredstava.
[0160] Shodno tome, otkriveni konjugovani imunoglobulini uključuju:
konjugate Cis80 imunoglobulina i fluorofora, konjugate Cis80 imunoglobulina i fluorescentne boje, imunoglobulin-polipeptid Cis80 konjugate, imunoglobulin-imunoglobulin Cis80 konjugate, Cis80 konjugate imunoglobulina i antibiotika, Cis80 konjugate imunoglobulina i nukleinske kiseline, Cis80 konjugate imunoglobulina i radionuklida, imunoglobulin-hemijski linker Cis80 konjugate, Cis80 konjugate imunoglobulina i male molekule, imunoglobulinhelator Cis80 konjugate, imunoglobulin-lipid Cis80 konjugate i imunoglobulin-lek Cis80 konjugate.
[0161] Bilo koji od ovde otkrivenih imunoglobulina, može biti konjugovan sa bilo kojim ovde opisanim funkcionalnim agensima. Na primer, konjugovani imunoglobulin može da sadrži imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani CA9 i fluorofor, fluorescentnu boju, polipeptid, imunoglobulin, antibiotik, nukleinsku kiselinu, radionuklid, hemijski linker, mali molekul, helator, lipid ili lek. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je Cis80 konjugat CA9-fluorofora. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je CA9-fluorescentna boja Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je CA9-polipeptid Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je CA9-imunoglobulin Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je konjugat CA9-antibiotika Cis80. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je Cis80 konjugat CA9-nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je Cis80 konjugat CA9-radionuklida. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je Cis80 konjugat CA9-hemijskog veznika. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je CA9-mali molekul Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je CA9-helator Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je Cis80 konjugat CA9-lipida. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je Cis80 konjugat CA9-leka.
[0162] Pogodni imunoglobulini koji se imunospecifično vezuju za humani CA9 koji mogu biti konjugovani na Cis80 sa bilo kojim od gore navedenih funkcionalnih sredstava uključuju:
4
a. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-141 od xi155D5HC (SEK ID BR: 52) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20 -130 od xi155D5LC (SEK ID BR: 78);
b. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-144 zu155D5HC (SEK ID BR: 54) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od zu155D5LC-3 (SEK ID BR: 84), zu155D5LC-4 (SEK ID BR: 86), zu155D5LC-5 (SEK ID BR: 88), zu155D5LC-6 (SEK ID BR: 90), zu155D5LC-7 (SEK ID BR: 92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEK ID BR: 96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEK ID BR: 100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEK ID BR: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEK ID BR: 104); ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEK ID BR: 106);
c. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-138 od xi1E4HC (SEK ID BR: 58) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od xi1E4LC (SEK ID BR: 110);
d. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-140 od zu1E4HC (SEK ID BR: 60) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od zu1E4LC-CXXA (SEK ID BR: 114);
e. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-142 od xi166B3HC (SEK ID BR: 74) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od xi166B3LC (SEK ID BR: 132);
f. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-145 od zu166B3HC (SEK ID BR: 76) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od zu166B3LC-CXXA (SEK ID BR: 136);
g. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-141 xi155D5HC (SEK ID BR: 52) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 xi155D5LC (SEK ID BR: 78);
h. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-144 od zu155D5HC (SEK ID BR: 54) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 zu155D5LC-3 (SEK ID BR: 84), zu155D5LC-4 (SEK ID BR: 86), zu155D5LC-5 (SEK ID BR: 88), zu155D5LC-6 (SEK ID BR: 90), zu155D5LC-7 (SEK ID BR: 92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEK ID BR: 96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEK ID BR: 100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEK ID BR: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEK ID BR: 104); ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEK ID BR: 106);
i. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-138 od xi1E4HC (SEK ID BR: 58) i varijabilni deo lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 od xi1E4LC (SEK ID BR: 110);
j. varijabilni region teškog lanca naveden kao aminokiseline 20-140 od zu1E4HC (SEK ID BR: 60) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 zu1E4LC-CXXA (SEK ID BR: 114);
k. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-142 od xi166B3HC (SEK ID BR: 74) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 od xi166B3LC (SEK ID BR: 132);
l. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-145 zu166B3HC (SEK ID BR: 76) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 zu166B3LC-CXXA (SEK ID BR: 136);
m. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi155D5HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 146, 148, odnosno 150, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi155D5LC kako su predstavljeni kao SEK ID BR: 224, 226, odnosno 228;
n. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu155D5HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 152, 154, odnosno 156 i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu155D5LC-3 kako je navedeno kao SEK ID BR: 242, 244, odnosno 246, zu155D5LC-4 prikazan kao SEK ID BR: 248, 250, odnosno 252, zu155D5LC-5 prikazan kao SEK ID BR: 254, 256, odnosno 258, zu155D5LC-6, kako je navedeno kao SEK ID BR: 260, 262, i 264, respektivno, zu155D5LC-7 kako je navedeno kao SEK ID BR: 266, 268, odnosno 270, zu155D5LC-huVK2-40 kako je navedeno kao SEK ID BR 278, 280, odnosno 282, zu155D5LC-huVK4-1 kako je prikazano kao SEK ID BR 290, 292, odnosno 294, zu155D5LC-huVK6-21 kako je navedeno kao SEK ID BR 296, 298, odnosno 300, zu155D5LC-huVK6D-41 kako je navedeno kao SEK ID BR 302, 304, odnosno 306; ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 kako je navedeno kao SEK ID BR 308, 310, odnosno 312;
o. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi1E4HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 164, 166, odnosno 168, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi1E4LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 320, 322, odnosno 324;
1
p. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu1E4HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 170, 172, odnosno 174, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu1E4LC-CXXA kako je navedeno kao SEK ID BR: 332, 334, odnosno 336;
q. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi166B3HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 212, 214, odnosno 216, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi166B3LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 386, 388, odnosno 390; ili
r. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu166B3HC kako je navedeno kao SEK ID
BR: 218, 220, odnosno 222, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu166B3LC-CXXA, kako je navedeno kao SEK ID BR: 398, 400, odnosno 402.
[0163] Konjugovani imunoglobulin može da sadrži imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani TEM1 i fluorofor, fluorescentnu boju, polipeptid, imunoglobulin, antibiotik, nukleinsku kiselinu, radionuklid, hemijski linker, mali molekul, helator, lipid ili lek. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-fluorofor Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-fluorescentna boja Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-polipeptid Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-imunoglobulin Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-antibiotik Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-nukleinska kiselina Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-radionuklid Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-hemijski veznik Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-mali molekul Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-helator Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-lipidni Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je TEM1-lek Cis80 konjugat.
[0164] Pogodni imunoglobulini koji se imunospecifično vezuju za humani TEM1 koji mogu biti konjugovani na Cis80 sa bilo kojim od gore navedenih funkcionalnih agenasa uključuju:
a. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-139 od xi1-55-2HC (SEK ID BR: 56) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-129 od xi1-55-2LC (SEK ID BR: 108);
2
b. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-139 xi1-55-2HC (SEK ID BR: 56) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-129 od xi1-55-2LC (SEK ID BR.108); ili
c. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi1-55-2HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 158, 160, odnosno 162, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi1-55-2LC, kako je navedeno kao SEK ID BR: 314, 316, odnosno 318.
[0165] Konjugovani imunoglobulin može da sadrži imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani MSLN i fluorofor, fluorescentnu boju, polipeptid, imunoglobulin, antibiotik, nukleinsku kiselinu, radionuklid, hemijski linker, mali molekul, helator, lipid ili lek. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je MSLN-fluorofor Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je MSLN-fluorescentna boja Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je MSLN-polipeptid Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je MSLN-imunoglobulin Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je MSLN-antibiotik Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je Cis80 konjugat MSLN-nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je MSLN-radionuklid Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je MSLN-hemijski veznik Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je MSLN-mali molekul Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je MSLN-helator Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je MSLN-lipidni Cis80 konjugat. U nekim realizacijama, konjugovani imunoglobulin je MSLN-lek Cis80 konjugat.
[0166] Pogodni imunoglobulini koji se imunospecifično vezuju za humani MSLN koji mogu biti konjugovani na Cis80 sa bilo kojim od gore navedenih funkcionalnih sredstava uključuju:
a. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-142 od xi33O11HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-131 od xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
b. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-145 od zu33O11HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-131 od zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122);
c. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
d. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
e. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-132 xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi237N18LC (SEK ID BR: 128);
f. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 od xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi383I18LC (SEK ID BR: 130);
g. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-142 xi33O11HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca kao aminokiseline 20-131 xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
h. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-145 zu33O11HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-131 zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122);
i. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
j. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
k. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-132 xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi237N18LC (SEK ID BR: 128);
l. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi383I18LC (SEK ID BR: 130);
4
m. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi33O11HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 176, 178, i 180, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi33O11LC, kako je prikazano u SEK ID BR: 338, 340, odnosno 342;
n. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu33O11HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 182, 184, odnosno 186, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu33O11LC-CXXA kako je navedeno kao SEK ID BR: 350, 352, odnosno 354, ili zu33O11LC-CXXI kako je navedeno kao SEK ID BR: 356, 358, odnosno 360;
o. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi324O5HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 188, 190, odnosno 192, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi324O5LC kako je predstavljeno kao SEK ID BR: 362, 364, odnosno 366;
p. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi178F16HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 194, 196, odnosno 198, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi178F16LC kako su predstavljeni kao SEK ID BR: 368, 370, odnosno 372;
q. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi237N18HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 200, 202, odnosno 204, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi237N18LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 374, 376, odnosno 378;
ili
r. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi383I18HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 206, 208, odnosno 210, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi383I18LC kako su navedeni kao SEK ID BR: 380, 382, odnosno 384.
[0167] U nekim realizacijama, imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani MSLN može biti konjugovan sa malom molekulom antineoplastičnog agensa kao što je auristatin. U nekim aspektima, funkcionalni agens može biti auristatin F (AuF). Prema tome, otkriveni konjugovani imunoglobulini uključuju, bilo koji od gore otkrivenih imunoglobulina koji se imunospecifično vezuju za humani MSLN, pri čemu je imunoglobulin konjugovan sa auristatinom F (MSLN-AuF Cis80 konjugat).
[0168] U realizacijama u kojima imunoglobulin sadrži dva varijabilna regiona lakog lanca, konjugovani imunoglobulin može imati odnos imunoglobulin: funkcionalni agens od 2: 1, pri čemu svaki laki lanac ima funkcionalni agens konjugovan na Cis80.
Molekule za vezivanje antigena
[0169] Dalje su ovde otkrivene molekule za vezivanje antigena koje sadrže:
prvi konjugovani imunoglobulin koji sadrži varijabilni region prvog teškog lanca i varijabilni region prvog lakog lanca, varijabilni region prvog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 („Cis80<1>“), pri čemu je Cis80<1>konjugovan sa prvim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu, i
drugi konjugovani imunoglobulin koji sadrži varijabilni region drugog teškog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 („Cis80<2>), pri čemu je Cis802 konjugovan sa drugim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu.
[0170] Prvi konjugovani imunoglobulin i drugi konjugovani imunoglobulin mogu biti bilo koji od ovde opisanih konjugovanih imunoglobulina.
[0171] Pogodni varijabilni regioni lakog lanca uključuju, na primer, varijabilni region lakog lanca kapa. Varijabilni region prvog lakog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca su izvedeni od zeca. U nekim realizacijama, Cis80<1>, Cis80<2>, ili oboje, mogu biti prisutni u varijabilnom regionu nativnog lakog lanca zečjeg imunoglobulina. Primerni zečevi od kojih se varijabilni region prvog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca, ili oboje, mogu dobiti uključuju, ali nisu ograničeni na, Oryctolagus cuniculus. U nekim aspektima, na primer, varijabilni region (i) lakog lanca mogu biti dobijeni od novozelandskog belog (NZW) zeca. U drugim aspektima, varijabilni region (i) lakog lanca mogu biti dobijeni od zeca b9.
[0172] Cis80<1>, Cis80<2>, ili oboje mogu biti neupareni. Pogodna sredstva za neuparivanje Cis80<1>, Cis80<2>, uključuju, na primer, himerizaciju varijabilnog regiona lakog lanca (varijabilni region prvog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca ili oba) koji imaju Cis80 sa konstantnim domen koji ima aminokiselinski ostatak osim cisteina na položaju 171.
[0173] Prvi imunoglobulin, drugi imunoglobulin, ili oboje, mogu biti himerizovani. U nekim realizacijama, prvi imunoglobulin može biti himerizovan. U nekim realizacijama, drugi imunoglobulin može biti himerizovan. U nekim realizacijama, prvi imunoglobulin i drugi imunoglobulin mogu biti himerizovani.
[0174] Prvi imunoglobulin, drugi imunoglobulin, ili oba, mogu biti humanizovani. U nekim realizacijama, prvi imunoglobulin može biti humanizovan. U nekim realizacijama, drugi imunoglobulin može biti humanizovan. U nekim realizacijama, prvi imunoglobulin i drugi imunoglobulin mogu biti humanizovani.
[0175] U nekim realizacijama, prvi imunoglobulin može biti himerizovan, a drugi imunoglobulin može biti humanizovan. U nekim realizacijama, prvi imunoglobulin može biti humanizovan, a drugi imunoglobulin može biti himerizovan.
[0176] Aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca može biti aminokiselina izuzev Fen, Liz ili Cis ako je aminokiselina na položaju 83 Fen. Aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca može biti aminokiselina koja nije Fen, Liz ili Cis ako je aminokiselina na položaju 83 Fen. Aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca može biti aminokiselina koja nije Fen, Liz ili Cis ako je aminokiselina na položaju 83 Fen, a aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca može biti aminokiselina izuzev Fen, Liz ili Cis ako je aminokiselina na položaju 83 Fen. Aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca i/ili varijabilnog regiona drugog lakog lanca može biti alanin („Ala83“), valin („Val83“), izoleucin („Ile83“), treonin („Tre83“) , arginin („Arg83“), asparagin („Asn83“), asparaginska kiselina („Asp83“), glutaminska kiselina („Glu83“), glutamin („Gln83“), glicin („Gli83“), histidin („His83“), leucin („Leu83“), metionin („Met83“), prolin („Pro83“), serin („Ser83“), triptofan („Trp83“) ili tirozin („Tir83“). Aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca može biti ista kao i aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca. Suprotno tome, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca može biti različita od aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca.
[0177] U nekim realizacijama, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca može biti polarni ili hidrofobni ostatak koji nije Fen ako je aminokiselina na položaju 83 Fen. U nekim realizacijama, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca može biti polarni ili hidrofobni ostatak koji nije Fen ako je aminokiselina na položaju 83 Fen. U nekim realizacijama, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca može biti polarni ili hidrofobni ostatak koji nije Phe ako je aminokiselina na položaju 83 Phe, a aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca može biti polarni ili hidrofobni ostatak koji nije Phe ako je aminokiselina na položaju 83 Phe. Pogodne polarne ili hidrofobne aminokiseline uključuju, ali nisu ograničene na alanin, valin, izoleucin ili treonin. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca ili aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca i aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca može biti alanin („Ala83“). U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca ili aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca i aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca može biti valin („Val83“). U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca ili aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca i aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca može biti izoleucin („Ile83“). U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca, aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca ili aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona prvog lakog lanca i aminokiselina na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca može biti treonin („Tre83“). Polarna ili hidrofobna aminokiselina na položaju 83 u varijabilnom regionu prvog lakog lanca može biti ista kao ili različita od, polarne ili hidrofobne aminokiseline na položaju 83 u varijabilnom regionu drugog lakog lanca.
[0178] Prvi imunoglobulin i drugi imunoglobulin se mogu vezati za iste antigene. U nekim aspektima, prvi imunoglobulin i drugi imunoglobulin se mogu vezati za isti epitop istog antigena. U drugim aspektima, prvi imunoglobulin i drugi imunoglobulin mogu biti vezani za različite epitope istog antigena. U nekim realizacijama, na primer, prvi imunoglobulin i drugi imunoglobulin mogu biti imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani CA9, pri čemu su prvi imunoglobulin, drugi imunoglobulin ili oba konjugovani sa bilo kojim od fluorofora, fluorescentne boje, polipeptida, imunoglobulina, antibiotika, nukleinske kiseline, radionuklida, hemijskog linkera, malog molekula, helatora, lipida ili leka. U nekim realizacijama, prvi imunoglobulin i drugi imunoglobulin mogu biti imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani TEM1, pri čemu su prvi imunoglobulin, drugi imunoglobulin, ili oboje konjugovani sa bilo kojim od fluorofora, fluorescentne boje, polipeptida, imunoglobulina, antibiotika, nukleinske kiseline, radionuklida, hemijskog linkera, malog molekula, helatora, lipida ili leka. U nekim realizacijama, prvi imunoglobulin i drugi imunoglobulin mogu biti imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani MSLN, pri čemu su prvi imunoglobulin, drugi imunoglobulin ili oba konjugovani sa bilo kojim od fluorofora, fluorescentne boje, polipeptida, imunoglobulina, antibiotika, nukleinske kiseline, radionuklida, hemijskog linkera, malog molekula, helatora, lipida ili leka.
[0179] Prvi imunoglobulin i drugi imunoglobulin se mogu vezati za različite antigene. U nekim realizacijama, na primer, prvi konjugovani imunoglobulin može biti imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani CA9, pri čemu je prvi imunoglobulin koji se vezuje za humani CA9 konjugovan sa bilo kojim od fluorofora, fluorescentne boje, polipeptida, imunoglobulina, antibiotika, nukleinske kiseline, radionuklida, hemijskog veziva, malog molekula, helatora, lipida ili leka, dok drugi imunoglobulin može biti imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani TEM1 ili humani MSLN. U takvim realizacijama, drugi imunoglobulin može biti konjugovan sa bilo kojim od fluorofora, fluorescentne boje, polipeptida, imunoglobulina, antibiotika, nukleinske kiseline, radionuklida, hemijskog veziva, malog molekula, helatora, lipida ili leka. U nekim realizacijama, prvi konjugovani imunoglobulin može biti imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani TEM1, pri čemu je imunoglobulin konjugovan sa bilo kojim od fluorofora, fluorescentne boje, polipeptida, imunoglobulina, antibiotika, nukleinske kiseline, radionuklida, hemijskog veziva, malog molekula, helatora, lipida ili leka, dok drugi imunoglobulin može biti imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani CA9 ili humani MSLN. U takvim realizacijama, drugi imunoglobulin može biti konjugovan sa bilo kojim od fluorofora, fluorescentne boje, polipeptida, imunoglobulina, antibiotika, nukleinske kiseline, radionuklida, hemijskog veziva, malog molekula, helatora, lipida ili leka. U nekim realizacijama, prvi konjugovani imunoglobulin može biti imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani MSLN, pri čemu je imunoglobulin konjugovan sa bilo kojim od fluorofora, fluorescentne boje, polipeptida, imunoglobulina, antibiotika, nukleinske kiseline, radionuklida, hemijskog veziva, malog molekula, helatora, lipida ili leka, dok drugi imunoglobulin može biti imunoglobulin koji se imunospecifično vezuje za humani CA9 ili humani TEM1. U takvim realizacijama, drugi imunoglobulin može biti konjugovan sa bilo kojim od fluorofora, fluorescentne boje, polipeptida, imunoglobulina, antibiotika, nukleinske kiseline, radionuklida, hemijskog veziva, malog molekula, helatora, lipida ili leka.
[0180] Pogodne, tiol-reaktivne grupe uključuju haloacetile, maleimide, aziridine, akriloile, agense za arilovanje, vinilsulfone, piridil disulfide, TNB-tiole i agense za redukciju disulfida. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati maleimid. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati haloacetil. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati aziridin. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati akriloil. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati sredstvo za arilovanje. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati vinilsulfon. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati piridil disulfid. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiolreaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati TNB-tiol. U nekim realizacijama, prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe, mogu sadržati sredstvo za redukciju disulfida.
[0181] Prva tiol-reaktivna grupa, druga tiol-reaktivna grupa, ili obe mogu biti dodate linkeru. U nekim aspektima, prva tiol-reaktivna grupa može biti dodata vezniku („prvi veznik“). U nekim aspektima, druga tiol-reaktivna grupa može biti dodata vezniku („drugi veznik“). U još drugim aspektima, prva tiol-reaktivna grupa može biti dodata prvom vezniku, a druga tiol-reaktivna grupa može biti dodata drugom vezniku. Pogodni prvi i drugi linkeri mogu biti neodvojivi linkeri ili cepljivi linkeri. Primerni prvi i drugi linkeri uključuju, na primer, linkere koji sadrže disulfid, linkere na bazi acetala i linkere na bazi ketala. U nekim aspektima, prvi linker, drugi linker ili oba, mogu biti necepljivi linker. Pogodni necepljivi linkeri uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilenglikol (PEG) ili alkil. U nekim realizacijama, prvi linker, drugi linker ili oba, mogu sadržati PEG. U nekim aspektima, prvi povezivač, drugi povezivač, ili oba, mogu biti razdvojivi linker. Pogodni cepljivi linkeri uključuju, na primer, valin-citrulin-para aminobenzil. U nekim aspektima, prvi linker, drugi linker ili oba, mogu biti linker koji sadrži disulfid. U nekim aspektima, prvi linker, drugi linker ili oba mogu biti linker na bazi acetala. U nekim aspektima, prvi povezivač, drugi povezivač ili oboje mogu biti povezivači zasnovani na ketalu. Primeri povezivača kovalentno dodatih tiol-reaktivnoj grupu su obezbeđeni, na primer, u U.S. Publ. Br.20140050746.
[0182] Prvo tiol-reaktivno jedinjenje, drugo tiol-reaktivno jedinjenje, ili oba, mogu dalje da sadrže funkcionalno sredstvo. U nekim aspektima, prvo tiol-reaktivno jedinjenje može dalje da sadrži funkcionalno sredstvo („prvo funkcionalno sredstvo“). U nekim aspektima, drugo tiolreaktivno jedinjenje može dalje da sadrži funkcionalno sredstvo („drugo funkcionalno sredstvo“). U još nekim aspektima, prvo tiol-reaktivno jedinjenje može dalje da sadrži prvo funkcionalno sredstvo, a drugo tiol-reaktivno jedinjenje može dalje da sadrži drugo funkcionalno sredstvo.
[0183] Pogodni funkcionalni agensi uključuju, na primer, hemijske veznike. Poželjno je da se hemijski veznik prvog tiol-reaktivnog jedinjenja („prvi hemijski veznik“) i hemijski veznik drugog tiol-reaktivnog jedinjenja („drugi hemijski veznik“) mogu spojiti. Na primer, i bez namere da bude ograničavajući, jedan od prvog ili drugog hemijskog veznika može biti dibenzilciklooktin (DBCO), a drugi od prvog ili drugog hemijskog veznika može biti azid. U nekim realizacijama, na primer, prvi hemijski linker može biti DBCO, a drugi hemijski linker može biti azid. Suprotno tome, prvi hemijski veznik može biti azid, a drugi hemijski veznik može biti DBCO. DBCO i azid mogu biti kuplovani, što rezultira konjugacijom prvog imunoglobulina i drugog imunoglobulina. Na primer, prvi imunoglobulin i drugi imunoglobulin mogu biti konjugovani međusobno hemijom klika.
[0184] U primernoj realizaciji, tiol-reaktivna jedinjenja mogu da uključuju maleimido-PEG4-azid i maleimido-PEG4-dibenzociklooktin. U nekim aspektima, na primer, prvo tiol-reaktivno jedinjenje može biti maleimido-PEG4-azid, a drugo tiol-reaktivno jedinjenje može biti maleimido-PEG4-dibenzociklooktin. U nekim aspektima, prvo tiol-reaktivno jedinjenje može biti maleimido-PEG4-dibenzociklooktin, a drugo tiol-reaktivno jedinjenje može biti maleimido-PEG4-azid. Stoga, prvo tiol-reaktivno jedinjenje se može razlikovati od drugog tiol-reaktivnog jedinjenja.
[0185] Prvi imunoglobulin, drugi imunoglobulin, ili oba, mogu biti Fab-ovi. U nekim realizacijama, prvi imunoglobulin može biti jedan Fab („prvi Fab“). U nekim realizacijama, drugi imunoglobulin može biti jedan Fab („drugi Fab“). U još jednom izvođenju, prvi imunoglobulin može biti prvi Fab, a drugi imunoglobulin može biti drugi Fab.
Konjugovani mezotelinski imunoglobulini za upotrebu u postupcima lečenja raka kod subjekta
[0186] Takođe su ovde otkriveni postupci lečenja raka kod subjekta koji obuhvataju primenu farmaceutski efikasne količine konjugovanog mezotelinskog imunoglobulina kod subjekta, pri čemu konjugovani mezotelinski imunoglobulin sadrži:
bilo koji od ovde opisanih konjugovanih imunoglobulina mezotelina i tiol-reaktivno jedinjenje koje sadrži tiol-reaktivnu grupu, linker i funkcionalno sredstvo.
[0187] Podrazumeva se da su bilo koje karakteristike, osobine i realizacije koje se odnose na otkrivene konjugovane imunoglobuline jednako primenljive na one konjugovane imunoglobuline koji se koriste u otkrivenim metodama lečenja karcinoma. Shodno tome, otkriveni postupci mogu obuhvatati primenu kod subjekta farmaceutski efikasne količine konjugovanog mezotelinskog imunoglobulina, pri čemu konjugovani mezotelinski imunoglobulin sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, varijabilni region lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 („Cis80“) i aminokiselinu izuzev Fen, Liz ili Cis na položaju 83, gde je Cis80 konjugovan sa tiol-reaktivnim jedinjenjem, tiol-reaktivno jedinjenje koje sadrži tiol-reaktivnu grupu, linker i funkcionalno sredstvo. U nekim realizacijama, aminokiselina koja nije Fen, Liz ili Cis na položaju 83 je polarna ili hidrofobna aminokiselina.
[0188] Poželjno je da je rak karcinom koji izražava mezotelin. U nekim realizacijama, konjugovana antitela za upotrebu u otkrivenim metodama mogu sadržati:
1
a. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-142 xi33O11HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-131 od xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
b. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-145 zu33O11HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-131 od zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122);
c. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-137 xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
d. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
e. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-132 od xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi237N18LC (SEK ID BR: 128); ili
f. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 od xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-127 od xi383I18LC (SEK ID BR: 130).
[0189] Antitela (a)-(f) mogu biti konjugovana sa nizom pogodnih tiol-reaktivnih jedinjenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na ona koja imaju antineoplastično sredstvo, kao što je auristatin, kao funkcionalno sredstvo. Stoga, u nekim aspektima, postupci mogu da obuhvataju primenu farmaceutski efikasne količine konjugovanog imunoglobulina kod subjekta, pri čemu konjugovani imunoglobulin sadrži jedan ili više imunogloublina (a)-(f), od kojih je svaki konjugovan sa tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži auristatin F, pri čemu je tiol-reaktivno jedinjenje konjugovano sa varijabilnim regionom lakog lanca imunoglobulina na Cis80.
[0190] U nekim realizacijama, konjugovana antitela za upotrebu u otkrivenim metodama mogu sadržati:
2
a. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-142 xi33O11HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-131 xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
b. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-145 zu33O11HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca kako je prikazan kao aminokiseline 20-131 zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122);
c. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
d. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
e. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-132 xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi237N18LC (SEK ID BR: 128); ili
f. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi383I18LC (SEK ID BR: 130).
[0191] Antitela (a)-(f) mogu biti konjugovana sa nizom pogodnih tiol-reaktivnih jedinjenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na ona koja imaju antineoplastično sredstvo, kao što je auristatin, kao funkcionalno sredstvo. Prema tome, u nekim realizacijama, postupci mogu obuhvatati primenu farmaceutski efikasne količine konjugovanog imunoglobulina kod subjekta, pri čemu konjugovani imunoglobulin sadrži jedan ili više imunogloublina (a) - (f), od kojih je svaki konjugovan sa tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži auristatin F, pri čemu je tiolreaktivno jedinjenje konjugovano sa varijabilnim regionom lakog lanca imunoglobulina na Cis80.
[0192] U nekim realizacijama, konjugovana antitela za upotrebu u otkrivenim metodama mogu sadržati:
a. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi33O11HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 176, 178, i 180, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi33O11LC, kako je prikazano u SEK ID BR: 338, 340, odnosno 342;
b. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu33O11HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 182, 184, odnosno 186, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu33O11LC-CXXA kako je navedeno kao SEK ID BR: 350, 352, odnosno 354, ili zu33O11LC-CXXI kako je navedeno kao SEK ID BR: 356, 358, odnosno 360;
c. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi324O5HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 188, 190, odnosno 192, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi324O5LC kako su prikazani kao SEK ID BR: 362, 364, odnosno 366;
d. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi178F16HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 194, 196, odnosno 198, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi178F16LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 368, 370, odnosno 372;
e. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi237N18HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 200, 202, odnosno 204, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi237N18LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 374, 376, odnosno 378;
ili
f. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi383I18HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 206, 208, odnosno 210, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi383I18LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 380, 382, odnosno 384.
[0193] Antitela (a)-(f) mogu biti konjugovana sa mnoštvom pogodnih tiol-reaktivnih jedinjenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na ona koja imaju antineoplastično sredstvo, kao što je auristatin, kao funkcionalno sredstvo. Prema tome, u nekim realizacijama, postupci mogu da obuhvataju primenu farmaceutski efikasne količine konjugovanog imunoglobulina kod subjekta, pri čemu konjugovani imunoglobulin sadrži jedan ili više imunoglobulina (a)- (f), od kojih je svaki konjugovan sa tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži auristatin F, pri čemu je tiolreaktivno jedinjenje konjugovano sa varijabilnim regionom lakog lanca imunoglobulina na Cis80.
Metode za detektovanje raka
[0194] Ovde su takođe otkriveni postupci otkrivanja raka kod subjekta. U nekim aspektima, postupci mogu biti izvedeni na subjektu. Na primer, metode mogu da uključuju primenu farmaceutski efikasne količine konjugovanog imunoglobulina kod subjekta, pri čemu konjugovani imunoglobulin sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, varijabilni region lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 („ Cis80 ”) i aminokiselinu
4
koja nije Fen, Liz ili Cis na položaju 83, pri čemu je Cis80 konjugovan sa tiol-reaktivnim jedinjenjem, tiol-reaktivno jedinjenje koje sadrži tiol-reaktivnu grupu, linker i funkcionalno sredstvo. U nekim aspektima, aminokiselina izuzev Fen, Liz ili Cis na položaju 83 je polarna ili hidrofobna.
[0195] Alternativno, metode mogu biti izvođene na biološkom uzorku dobijenom od subjekta. Na primer, metode mogu da obuhvataju dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa konjugovanim imunoglobulinom, pri čemu konjugovani imunoglobulin sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca ima cistein na položaju 80 („Cis80“) i aminokiselinu osim Fen, Liz ili Cis na položaju 83, gde je Cis80 konjugovan sa tiolreaktivnim jedinjenjem, tiol-reaktivno jedinjenje koje sadrži tiol-reaktivnu grupu, linker i funkcionalno sredstvo. Aminokiselina koja nije Phe, Liz ili Cis na položaju 83 je polarna ili hidrofobna. U nekim aspektima, postupci se mogu izvoditi ex vivo. U nekim aspektima, postupci se mogu izvoditi in vivo.
[0196] Funkcionalno sredstvo je fluorofor ili fluorescentna boja.
[0197] Bilo koji od ovde otkrivenih imunoglobulina, može biti konjugovan sa fluoroforom ili fluorescentnom bojom i korišćen u otkrivenim metodama za detektovanje raka. U nekim aspektima, rak je kancer koji izražava CA9, a konjugovani imunoglobulin je CA9-fluorofor Cis 80 konjugat ili CA9-fluorescentna boja Cis80 konjugat koji sadrži:
a. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-141 od xi155D5HC (SEK ID BR: 52) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od xi155D5LC (SEK ID BR: 78);
b. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-144 od zu155D5HC (SEK ID BR: 54) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od zu155D5LC-3 (SEK ID BR: 84), zu155D5LC-4 (SEK ID BR: 86), zu155D5LC-5 (SEK ID BR: 88), zu155D5LC-6 (SEK ID BR: 90), zu155D5LC-7 (SEK ID BR: 92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEK ID BR: 96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEK ID BR: 100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEK ID BR: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEK ID BR: 104); ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEK ID BR: 106);
c. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-138 od xi1E4HC (SEK ID BR: 58) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od xi1E4LC (SEK ID BR: 110);
d. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-140 od zu1E4HC (SEK ID BR: 60) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od zu1E4LC-CXXA (SEK ID BR: 114);
e. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-142 od xi166B3HC (SEK ID BR: 74) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od xi166B3LC (SEK ID BR: 132);
f. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-145 od zu166B3HC (SEK ID BR: 76) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od zu166B3LC-CXXA (SEK ID BR: 136);
g. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-141 xi155D5HC (SEK ID BR: 52) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 xi155D5LC (SEK ID BR: 78);
h. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-144 zu155D5HC (SEK ID BR: 54) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 zu155D5LC-3 (SEK ID BR: 84), zu155D5LC-4 (SEK ID BR: 86), zu155D5LC-5 (SEK ID BR: 88), zu155D5LC-6 (SEK ID BR: 90), zu155D5LC-7 (SEK ID BR: 92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEK ID BR: 96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEK ID BR: 100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEK ID BR: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEK ID BR: 104); ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEK ID BR: 106);
i. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-138 od xi1E4HC (SEK ID BR: 58) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 od xi1E4LC (SEK ID BR: 110);
j. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-140 zu1E4HC (SEK ID BR: 60) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 zu1E4LC-CXXA (SEK ID BR: 114);
k. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-142 xi166B3HC (SEK ID BR: 74) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 xi166B3LC (SEK ID BR: 132);
l. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-145 zu166B3HC (SEK ID BR: 76) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 zu166B3LC-CXXA (SEK ID BR: 136);
m. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi155D5HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 146, 148, odnosno 150, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi155D5LC kako su predstavljeni kao SEK ID BR: 224, 226, odnosno 228;
n. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu155D5HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 152, 154, odnosno 156, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od zu155D5LC-3 kako je navedeno kao SEK ID BR: 242, 244, odnosno 246, zu155D5LC-4 prikazan kao SEK ID BR: 248, 250, odnosno 252, zu155D5LC-5 prikazan kao SEK ID BR: 254, 256, odnosno 258, zu155D5LC-6 prikazan kao SEK ID BR: 260, 262, i 264, respektivno, zu155D5LC-7 kako je navedeno kao SEK ID BR: 266, 268, odnosno 270, zu155D5LC-huVK2-40 kako je navedeno kao SEK ID BR 278, 280, odnosno 282, zu155D5LC-huVK4-1 kako je navedeno kao SEK ID BR 290, 292, odnosno 294, zu155D5LC-huVK6-21 kako je navedeno kao SEK ID BR 296, 298, odnosno 300, zu155D5LC-huVK6D-41 kako je navedeno kao SEK ID BR 302, 304 , odnosno 306; ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 kako je navedeno kao SEK ID BR 308, 310, odnosno 312;
o. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi1E4HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 164, 166, odnosno 168, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi1E4LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 320, 322, odnosno 324;
p. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu1E4HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 170, 172, odnosno 174, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu1E4LC-CXXA kako je navedeno kao SEK ID BR: 332, 334, odnosno 336;
q. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi166B3HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 212, 214, odnosno 216, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi166B3LC kako su navedeni kao SEK ID BR: 386, 388, odnosno 390; ili
r. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu166B3HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 218, 220, odnosno 222, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu166B3LC-CXXA kako je navedeno kao SEK ID BR: 398, 400, odnosno 402.
[0198] U nekim aspektima, rak je kancer koji izražava TEM1, a konjugovani imunoglobulin je TEM1-fluorofor Cis80 konjugat ili TEM1-fluorescentna boja Cis80 konjugat koji sadrži: a. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-139 od xi1-55-2HC (SEK ID BR: 56) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-129 od xi1-55-2LC (SEK ID BR: 108);
b. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-139 xi1-55-2HC (SEK ID BR: 56) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-129 od xi1-55-2LC (SEK ID BR: 108); ili
c. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi1-55-2HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 158, 160, odnosno 162, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi1-55-2LC, kako je navedeno kao SEK ID BR: 314, 316, odnosno 318.
[0199] U nekim aspektima, rak je kancer koji izražava MSLN, a konjugovani imunoglobulin je MSLN-fluorofor Cis80 konjugat ili MSLN-fluorescentna boja Cis80 konjugat koji sadrži:
a. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-142 xi33O11HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-131 od xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
b. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-145 zu33O11HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-131 od zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122); c. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-137 xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
d. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
e. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-132 od xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi237N18LC (SEK ID BR: 128);
f. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 od xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi383I18LC (SEK ID BR: 130);
g. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-142 xi33O11HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-131 xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
h. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-145 zu33O11HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-131 zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122);
i. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
j. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
k. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-132 xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi237N18LC (SEK ID BR: 128);
l. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi383I18LC (SEK ID BR: 130);
m. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi33O11HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 176, 178, i 180, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi33O11LC, kako je prikazano u SEK ID BR: 338, 340, odnosno 342;
n. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu33O11HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 182, 184, odnosno 186, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu33O11LC-CXXA kako je navedeno kao SEK ID BR: 350, 352, odnosno 354, ili zu33O11LC-CXXI kako je navedeno kao SEK ID BR: 356, 358, odnosno 360;
o. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi324O5HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 188, 190, odnosno 192, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi324O5LC kako su predstavljeni kao SEK ID BR: 362, 364, odnosno 366;
p. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi178F16HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 194, 196, odnosno 198, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi178F16LC kako su predstavljeni kao SEK ID BR: 368, 370, odnosno 372;
q. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi237N18HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 200, 202, odnosno 204, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi237N18LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 374, 376, odnosno 378;
ili
r. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi383I18HC kako je prikazano kao SEK ID BR: 206, 208, odnosno 210, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi383I18LC kako je prikazano kao SEK ID BR: 380, 382, odnosno 384.
[0200] Primeri fluorofora za konjugaciju sa imunoglobulinom uključuju, na primer, IRDye-800CW.
[0201] Metode mogu da uključuju, primenu konjugovanog imunoglobulina subjektu ili dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa konjugovanim imunoglobulinom i detektovanje vezivanja konjugovanog imunoglobulina za antigen (CA9, TEM1 ili MSLN) prisutan kod subjekta, ili u biološkom uzorku, respektivno. Pogodne metode detekcije uključuju, na primer, fluorescentno dijagnostičko slikanje. Otkrivanje vezivanja konjugovanog imunoglobulina za antigen (na primer, emisijom fluorescentnog signala) je indikativno za rak.
Farmaceutski preparati
[0202] Ovde su takođe obezbeđeni farmaceutski preparati. U nekim realizacijama, farmaceutski preparati mogu da sadrže bilo koji od ovde otkrivenih imunoglobulina. U nekim realizacijama, farmaceutski preparati mogu da sadrže bilo koji od ovde opisanih konjugovanih imunoglobulina.
[0203] Primena konjugovanog imunoglobulina u skladu sa ovde opisanim metodama lečenja ili dijagnoze može biti na bilo koji način poznata u tehnici.
Varijabilni regioni lakih lanaca za upotrebu u konjugovanim imunoglobulinima
[0204] Ovde su otkriveni varijabilni regioni lakog lanca za upotrebu u konjugovanom imunoglobulinu, varijabilni region lakog lanca koji ima cistein na aminokiselinskom položaju 80 („Cis80“) i aminokiselinski ostatak koji nije Fen, Liz ili Cis na aminokiselinskom položaju 83, pri čemu Cis80 nije uparen. U nekim realizacijama, aminokiselina koja nije Phe, Liz ili Cis na položaju 83 je polarna ili hidrofobna.
[0205] U poželjnim aspektima, laki lanac ima motiv Cis80-Xaa1-Xaa2-Xaa3, pri čemu Xaa3predstavlja aminokiselinu koja nije Fen, Liz ili Cis.
[0206] Pogodni varijabilni regioni lakog lanca uključuju, na primer, varijabilni region lakog lanca kapa. Varijabilni region lakog lanca je dobijen od zeca. U nekim aspektima, Cis80 može biti prisutan u nativnom varijabilnom regionu lakog lanca zečjeg imunoglobulina. Primerni zečevi od kojih se može dobiti varijabilni region lakog lanca koji ima Cis80 uključuju, ali nisu ograničeni na, Oryctolagus cuniculus. U nekim aspektima, na primer, varijabilni region lakog lanca može biti dobijen od novozelandskog belog (NZW) zeca. U ostalim aspektima, varijabilni region lakog lanca može biti dobijen od b9 zeca.
[0207] Cis80 može biti oslobođen, može biti uključen u intramolekularnu ili intermolekularnu disulfidnu vezu ili može imati pokrivajući cistein.
[0208] U nekim aspektima, varijabilni region lakog lanca može biti himerizovan. U drugim aspektima, varijabilni region lakog lanca može biti humanizovan.
[0209] Varijabilni region lakog lanca može da sadrži, sastoji se od ili suštinski sastoji od:
a. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od xi155D5LC (SEK ID BR: 78);
b. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 zu155D5LC-3 (SEK ID BR: 84), zu155D5LC-4 (SEK ID BR: 86), zu155D5LC-5 (SEK ID BR: 88), zu155D5LC-6 (SEK ID BR: 90), zu155D5LC-7 (SEK ID BR: 92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEK ID BR: 96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEK ID BR: 100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEK ID BR: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEK ID BR: 104); ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEK ID BR: 106); c. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-130 od xi1E4LC (SEK ID BR: 110);
d. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-130 zu1E4LC-CXXA (SEK ID BR: 114);
e. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-130 od xi166B3LC (SEK ID BR: 132);
f. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-130 zu166B3LC-CXXA (SEK ID BR: 136);
1
g. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-129 od xi1-55-2LC (SEK ID BR: 108);
h. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-131 od xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
i. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-131 od zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122);
j. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-127 od xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
k. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
l. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-127 od xi237N18LC (SEK ID BR: 128); ili
m. varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi383I18LC (SEK ID BR: 130).
Molekule nukleinskih kiselina koje kodiraju imunoglobuline i ćelije domaćina koje ih sadrže
[0210] Ovde su takođe obezbeđene molekule nukleinskih kiselina koje kodiraju imunoglobulin iz sadašnjeg pronalaska. U nekim realizacijama, molekule nukleinskih kiselina kodiraju imunoglobulin koji sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, varijabilni region lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 („Cis80“) i aminokiselinu koja nije Phe, Liz, ili Cis na položaju 83. U nekim realizacijama, aminokiselina koja nije Phe, Liz ili Cis na položaju 83 je polarna ili hidrofobna.
[0211] Otkrivene molekule nukleinskih kiselina mogu da kodiraju imunoglobulin koji se može imunospecifično vezati za humani CA9. U nekim realizacijama, molekula nukleinske kiseline kodira:
a. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-141 od xi155D5HC (SEK ID BR: 52) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-130 od xi155D5LC (SEK ID BR: 78);
b. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinama 20-144 od zu155D5HC (SEK ID BR: 54) i varijabilni region
2
lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od zu155D5LC-3 (SEK ID BR: 84), zu155D5LC-4 (SEK ID BR: 86), zu155D5LC-5 (SEK ID BR: 88), zu155D5LC-6 (SEK ID BR: 90), zu155D5LC-7 (SEK ID BR: 92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEK ID BR: 96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEK ID BR: 100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEK ID BR: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEK ID BR: 104); ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEK ID BR: 106);
c. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-138 xi1E4HC (SEK ID BR: 58) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od xi1E4LC (SEK ID BR: 110);
d. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-140 zu1E4HC (SEK ID BR: 60) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od zu1E4LC-CXXA (SEK ID BR: 114);
e. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-142 xi166B3HC (SEK ID BR: 74) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od xi166B3LC (SEK ID BR: 132); ili
f. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-145 zu166B3HC (SEK ID BR: 76) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-130 od zu166B3LC-CXXA (SEK ID BR: 136).
[0212] U nekim realizacijama, molekula nukleinske kiseline kodira:
a. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-141 xi155D5HC (SEK ID BR: 52) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 xi155D5LC (SEK ID BR: 78);
b. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-144 zu155D5HC (SEK ID BR: 54) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 zu155D5LC-3 (SEK ID BR: 84), zu155D5LC-4 (SEK ID BR: 86), zu155D5LC-5 (SEK ID BR: 88), zu155D5LC-6 (SEK ID BR: 90), zu155D5LC-7 (SEK ID BR: 92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEK ID BR: 96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEK ID BR: 100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEK ID BR: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEK ID BR: 104); ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEK ID BR: 106);
c. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-138 od xi1E4HC (SEK ID BR: 58) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-130 od xi1E4LC (SEK ID BR: 110);
d. varijabilni region teškog lanca naveden kao aminokiseline 20-140 zu1E4HC (SEK ID BR: 60) i varijabilni region lakog lanca naveden kao aminokiseline 20-130 zu1E4LC-CXXA (SEK ID BR: 114);
e. varijabilni region teškog lanca naveden kao aminokiseline 20-142 xi166B3HC (SEK ID BR: 74) i varijabilni region lakog lanca naveden kao aminokiseline 20-130 xi166B3LC (SEK ID BR: 132); ili
f. varijabilni region teškog lanca naveden kao aminokiseline 20-145 zu166B3HC (SEK ID BR: 76) i varijabilni region lakog lanca naveden kao aminokiseline 20-130 zu166B3LC-CXXA (SEK ID BR: 136).
[0213] U nekim realizacijama, molekula nukleinske kiseline kodira:
a. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi155D5HC kako je dalje navedeno kao SEK ID BR: 146, 148, odnosno 150, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi155D5LC kako je predstavljeno kao SEK ID BR: 224, 226, odnosno 228;
b. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu155D5HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 152, 154, odnosno 156, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu155D5LC-3 kako je navedeno kao SEK ID BR: 242, 244, odnosno 246, zu155D5LC-4 kako je navedeno kao SEK ID BR: 248, 250, odnosno 252, zu155D5LC-5 kao što je navedeno kao SEK ID BR: 254, 256, odnosno 258, zu155D5LC-6 kako je navedeno kao SEK ID BR: 260, 262, odnosno 264, zu155D5LC-7 kako je navedeno kao SEK ID BR: 266, 268, odnosno 270, zu155D5LC-huVK2-40 kao što je navedeno kao SEK ID BR: 278, 280, odnosno 282, zu155D5LC-huVK4-1 kako je navedeno kao SEK ID BR: 290, 292, odnosno 294, zu155D5LC-huVK6-21, kako je navedeno kao SEK ID BR: 296, 298, i 300, respektivno, zu155D5LC-huVK6D-41 kako je navedeno kao SEK ID BR: 302, 304, odnosno 306; ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 kako je navedeno kao SEK ID BR: 308, 310, odnosno 312;
c. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi1E4HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 164, 166, odnosno 168, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi1E4LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 320, 322, odnosno 324;
4
d. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu1E4HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 170, 172, odnosno 174, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu1E4LC-CXXA kako je navedeno kao SEK ID BR: 332, 334, odnosno 336;
e. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi166B3HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 212, 214, odnosno 216, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi166B3LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 386, 388, odnosno 390; ili
f. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu166B3HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 218, 220, odnosno 222, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu166B3LC-CXXA, kako je navedeno kao SEK ID BR: 398, 400, odnosno 402.
[0214] Otkrivene molekule nukleinskih kiselina mogu da kodiraju imunoglobulin koji može imunospecifično da se veže za humani TEM1. U nekim realizacijama, molekula nukleinske kiseline kodira varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-139 xi1-55-2HC (SEK ID BR: 56) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinska sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-129 xi1-55-2LC (SEK ID BR: 108). U nekim realizacijama, molekula nukleinske kiseline kodira varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-139 od xi1-55-2HC (SEK ID BR: 56) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20- 129 od xi1-55-2LC (SEK ID BR: 108). U nekim realizacijama, molekula nukleinske kiseline kodira CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi-55-2HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 158, 160, odnosno 162, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi1-55-2LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 314, 316, odnosno 318.
[0215] Otkrivene molekule nukleinske kiseline mogu da kodiraju imunoglobulin koji može imunospecifično da se veže za humani MSLN. U nekim realizacijama, molekula nukleinske kiseline kodira:
a. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-142 xi33O11HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-131 od xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
b. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-145 zu33O11HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-131 od zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122); c. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 od xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
d. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
e. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-132 xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi237N18LC (SEK ID BR: 128); ili
f. varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-137 xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinama 20-127 od xi383I18LC (SEK ID BR: 130).
[0216] U nekim realizacijama, molekula nukleinske kiseline kodira:
a. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-142 xi33O11HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-131 xi33O11LC (SEK ID BR: 116);
b. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-145 zu33O11HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca naveden kao aminokiseline 20-131 zu33O11LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33O11LC-CXXI (SEK ID BR: 122);
c. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
d. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
e. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-132 xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi237N18LC (SEK ID BR: 128); ili
f. varijabilni region teškog lanca prikazan kao aminokiseline 20-137 xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca prikazan kao aminokiseline 20-127 xi383I18LC (SEK ID BR: 130).
[0217] U nekim realizacijama, molekula nukleinske kiseline kodira:
a. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi33O11HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 176, 178, i 180, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi33O11LC, kako je prikazano kao SEK ID BR: 338, 340, odnosno 342;
b. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu33O11HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 182, 184, odnosno 186, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu33O11LC-CXXA kako je navedeno kao SEK ID BR: 350, 352, odnosno 354, ili zu33O11LC-CXXI kako je navedeno kao SEK ID BR: 356, 358, odnosno 360;
c. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi324O5HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 188, 190, odnosno 192, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi324O5LC kako je predstavljeno kao SEK ID BR: 362, 364, odnosno 366;
d. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi178F16HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 194, 196, odnosno 198, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi178F16LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 368, 370, odnosno 372;
e. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca xi237N18HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 200, 202, odnosno 204, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi237N18LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 374, 376, odnosno 378;
ili
f. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi383I18HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 206, 208, odnosno 210, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi383I18LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 380, 382, odnosno 384.
[0218] Takođe su otkrivene ćelije domaćina koje sadrže bilo koje od otkrivenih molekula nukleinske kiseline. Pogodne ćelije domaćina uključuju, ali nisu ograničene na, ćelije sisara, bakterijske ćelije, ćelije kvasca, ćelije gljivica, ćelije insekata, da pomenemo samo neke.
[0219] Sledeći primeri su obezbeđeni da dalje opisuju neke od realizacija koje su ovde otkrivene. Primeri su namenjeni da ilustruju, a ne da ograniče, obelodanjene realizacije.
PRIMERI
Primer 1– Primerne metode
Generisanje zečjih mAt-a specifičnih za humani TEM1 (endosialin/CD248)
[0220] Imunizacija zeca: Za generisanje zečjih mAt-a specifičnih za humani TEM1 (hTEM1), pripremljen je rastvorljivi fuzioni protein ekstracelularnog domena humanog endosialina i mišjeg Fc („humani endosialin/TEM1 ekstracelularni domen fuzionisan sa mišjim IgG2b Fc“). Vanćelijski domen hTEM1 je kloniran u okviru EcoRI/HpaI u pEF6-EK-IgG2b, koji je sadržao mesto cepanja enterokinaze praćeno mišjim IgG2b Fc gama fragmentom. CHO-K1 ćelije su transficirane sa ovim konstruktom i odabrane sa 5 μg/mL blasticidina. Izlučeni TEM1-Fc je elektroforeziran na 4-12% PAGE gelu i obojen Coomassie bojom, praćeno isecanjem traka. Komadi gela su emulgovani u potpunom/nepotpunom adjuvansu i injektovani novozelandskim belim zečevima svake 3 do 4 nedelje, četiri injekcije. Slezina iz zeca koja pokazuje najbolje titre protiv hTEM1 procenjene pomoću ELISA je uzeta za generisanje hibridoma.
[0221] Generisanje hibridoma: Fuzije su izvedene na sledeći način: ćelije slezine (1,5-3 x 10<8>) imunizovanih zečeva i fuzioni partner 240E 1-1-2 fuzionisani su u odnosu 2: 1 sa 50% PEG 4000 (EM Science, Cherry Hill, NJ) na 37 ° C, u medijumu bez seruma. Ćelije su postavljene u mikrotitarske ploče sa 48 bazenčića, sa približno 2x10<5>ćelija slezine po bazenčiću, u medijum sa 15% FCS. Nakon 72 sata, dodat je hipoksantin-aminopterin-timidin (HAT). Medijum je menjan svakih 5-6 dana. Supernatanti su pregledani pomoću ELISA tehnike na prisustvo antitela specifičnih za TEM-1 koristeći ploče obložene TEM1-Fc i kontra-skriningom protiv mišjeg Fc. Supernatanti iz hibridoma su pregledani na reaktivnost hTEM1 pomoću ELISA i odabran je klon 1-55-2 za rekombinantno kloniranje.
[0222] Amplifikacija anti-hTEM1 1-55-2 varijabilnih regiona lakog i teškog lanca: RNK je izolovana iz hibridoma zeca 1-55-2 korišćenjem RNeasy mini kompleta (Qiagen, Valencia, CA). Dva μg RNK je korišćeno za RT-PCR korišćenjem SuperScript III One-Step RT-PCR sistema sa Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen). Genski fragmenti zečjeg varijabilnog teškog lanca i lakog lanca pune dužine su amplifikovani korišćenjem parova prajmera N02937/N02898 i N02937/N02347, respektivno (tabela 1). Parametri ciklusa za RT-PCR amplifikaciju su bili sledeći: 55 ° C 30 min; 94 ° C 2 min; 30 ciklusa od (94 ° C 15 sek, 55 ° C 30 sek, 68 ° C 1 min); 68 ° C 2 min.
[0223] Ovi PCR proizvodi su naknadno korišćeni u drugom krugu PCR-a za amplifikovanje fragmenata podložnih generisanju himernih zečjih/humanih IgG-a, koristeći parove prajmera N02416/N02761 i N02417/N02764 (tabela 1). Parametri ciklusa za drugi krug PCR-a su bili sledeći: 94 ° C tokom 2 min; 30 ciklusa od (94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek, 68 ° C 1 min); 68 ° C 2 min,
Tabela 1. Prajmeri korišćeni za RT-PCR i kloniranje anti-hTEM11-55-2
[0224] PCR proizvodi su zatim odvojeni elektroforezom u agaroznom gelu. PCR proizvodi koji imaju tačne molekulske veličine za VL i VH proizvode su prečišćeni pomoću QIAquick® Gel kompleta za ekstrakciju (Qiagen, Valencia, CA) i klonirani kao što je opisano u nastavku.
Generisanje zečjih mAt-a specifičnih za humani CA9
[0225] Imunizacija zeca: Da bi se proizvela zečja antitela specifična za humani CA9, rekombinantno je generisan humani CA9 vanćelijski domen („humani CA9 vanćelijski domen“ ili „CA9-ECD“). Dva b9 zeca su imunizovana korišćenjem CA9-ECD. Ukratko, zečevima su subkutano injektovani antigeni svakih 21 dana. Svaki zec je primio 400 µg CA9-ECD i Freundov kompletan adjuvans (FCA) u prvoj injekciji i 200 µg CA9-ECD i Freund-ov nepotpuni adjuvans (FIA) u narednim pojačanjima. Prethodno i ispitivano krvarenje je prikupljeno za ispitivanje titra antitela.
[0226] Ispitivana je krv pre i posle imunizacije za vezivanje za CA9, korišćenjem enzimski povezanog imunosorbentnog ispitivanja (ELISA), kao što je ovde opisano. Krvarenja su serijski razblažena i dodata na mikroploče obložene proteinima CA9-ECD. Kada je titar dostigao 1: 15.000 nakon četiri injekcije, zečevi su konačno podstaknuti intravenskom injekcijom 400 µg CA9-ECD bez pomoćnog sredstva. Zečje slezine su sakupljene nedelju dana nakon konačnog pojačanja. U prisustvu antikoagulansa sakupljeno je do 100 ml eksangvinacionih iskrvarenja, i izolovani su limfociti iz slezine i limfnih čvorova svakog zeca.
[0227] Generisanje hibridoma: Zečji splenociti su brzo odmrznuti, centrifugirani na 1200 obrtaja u minuti, na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta i ponovo suspendovani u cIMDM plus 10% FBS koji sadrži 100 µg/mL DNaze. Ćelije su stimulisane sa 2,5 µg/mL pokeweed mitogena na 37 ° C tokom najmanje 1 sata. Nakon stimulacije, ćelije su centifugirane na 1200 obrtaja u minuti, na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta i ponovo suspendovane u svežem medijumu. Određen je broj ćelija i održivost.
[0228] Fuzione partnerske ćelije CBF7 su odmrznute i kultivisane na 37 ° C sa 5% CO2tokom nedelju dana pre fuzije. Odgovarajuće količine zečjih splenocita i fuzionih partnerskih ćelija CBF7 su pomešane u željenom odnosu (1: 1,55 ~ 1: 4) u epruvetama od 50 ml. Smeša ćelija je centrifugirana na 1000 obrtaja u minuti, na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta i isprana dva puta sa ledom hladnim CytoPulse fuzionim medijumom 20 mL (CPFM Formula C: CytoPulse Sciences # LCM-C) na 4 ° C. Ćelije su ponovo suspendovane u CPFM-u do 10<6>ćelija/ml.
[0229] Za fuziju je korišćen aparat za fuziju ćelija CytoPulse CEEF-50 (CytoPulse Sciences). Odgovarajući volumen ćelija je premešten u fuzionu komoru i fuzija je izvršena aktiviranjem visokonaponskog priključka. Nakon fuzije, ćelije su inkubirane u komori na sobnoj temperaturi 5 minuta, lagano ponovo suspendovane u post-fuzionom medijumu (RPMI1640 sa 10% FBS, koji sadrži glutamat, piruvat, neesencijalne aminokiseline, β-merkaptoetanol, penicilin, streptomicin, i bez fenol crvene) i zatim prebačene u bocu. Komora je isprana sa istom zapreminom post-fuzionog medijuma da bi se dobile dodatne ćelije. Ćelije su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 25 minuta, a zatim preko noći na 37 ° C, 5% CO2.
[0230] Jedan dan nakon fuzije, ćelije su razblažene u prethodno zagrejanom medijumu za zasejavanje (cIMDM plus 10% FBS-a koji sadrži IX hipoksantin-aminopterin-timidin) do željene gustine (35.000 ćelija/ml) i postavljene pri 200 µL/bazenčiću u mikroploče sa 96 bazenčića. Ploče su inkubirane na 37 ° C, 5% CO2i hranjene svežim medijumom nedeljno tokom 3-4 nedelje.
[0231] Skrining anti-CA9 mAt-a: B-ćelije iz splenocita zeca su fuzionisane sa fuzionim partnerskim ćelijama CBF7 da bi se generisali hibridomi, kao što je ovde opisano. Četiri nedelje nakon postavljanja ćelija, sakupljeni su supernatanti iz pojedinačnih kultura hibridoma i pregledani korišćenjem ELISA specifične za CA9. Ispitivane ploče (prozirna ploča Greiner Bio-One High Binding sa 384 bazenčića, kat # 655081) su obložene sa 1 µg/ml CA9 ECD preko noći na 4 ° C i blokirane sa test puferom IX (PBS plus 1% BSA, koji sadrži 0,05% Tween-20). Zatim je na blokirane ploče dodato 25 µL po bazenčiću supernatanata i kontrola i inkubirano preko noći na 4 C. Ispitivane ploče su isprane tri puta i na ploče je dodato 25 µL/bazenčiću sekundarnih antitela (HRP-konjugovani kozji anti-mišji IgG, Jackson # 115-035-146) razblaženih 1: 10.000 u puferu za ispitivanje. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi, tokom jednog sata, ispitivane ploče su isprane tri puta i na ploče je dodato 25 µL po bazenčiću TMB podloge (KPL # 52-000-04). Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta, dodato je 25 µL/bazenčić IX rastvora za zaustavljanje (1:10 H2SO4, VWR # EM-SX1244-75). Apsorbanca uzorka na 450 nm je izmerena korišćenjem čitača ploče Paradigm (Beckman). Pozitivni pogodci sa primarnog ekrana su potvrđeni drugom ELISA specifičnom za CA9.
Kloniranje i mutageneza
[0232] Amplifikacija VH i Vκ regiona CA9 i hTEM1 monoklonskih antitela: Ćelije hibridoma koje sekretuju zečja mAt-a od interesa su lizirane za ekstrahovanje RNK. RNK je zatim korišćena za DNK amplifikaciju varijabilnih regiona kappa (Vκ) i varijabilnih (VH) regiona teškog lanca, korišćenjem reverzne transkriptaze i metode lančane reakcije polimeraze (RT-PCR). 100 do 10.000 kultivisanih ćelija hibridoma je isprano sa ledeno hladnim PBS-om i lizirano dodavanjem 100 µL rastvora za lizu/vezivanje (Ambion, 8540G5) i pipetiranjem. Lizirane ćelije su brzo zamrznute na suvom ledu. RNK je izolovana sa Ambion RNAqueous kompletom prema proizvodnom postupku. Oko 5 ng RNK je bilo podvrgnuto prvom krugu RT-PCR koristeći prajmere navedene u Tabeli 2 u svakoj reakciji.
1
Tabela 2. Prajmeri korišćeni za prvi krug RT-PCR
[0233] Ciklični parametri a za RT-PCR amplifikaciju su bili sledeći: 55 ° C 30 min; 95 ° C 2 min; 30 ciklusa od (94 ° C 1 min, 54 ° C 50 sek, 68 ° C 1,5 min); 68 ° C 10 min.
[0234] Proizvodi iz prvog kruga RT-PCR su podvrgnuti drugom krugu PCR amplifikacije u odvojenoj reakciji za teški laki i laki lanac, koristeći prajmere navedene u Tabeli 3.
Tabela 3. Prajmeri korišćeni u drugom krugu PCR amplifikacije
2
[0235] Ciklični parametri za drugi krug PCR amplifikacije su bili su sledeći: 95 ° C 5 min; 40 ciklusa od (94 ° C 1 min, 54 ° C 50 sek, 68 ° C 1,5 min); 68 ° C 10 min; 4 º C kvašenje.
[0236] PCR proizvodi su zatim odvojeni elektroforezom na agaroznom gelu. PCR proizvodi koji imaju tačne molekulske veličine za VL i VH proizvode su prečišćeni pomoću QIAquick® Gel kompleta za ekstrakciju (Qiagen, Valencia, CA), a fragmenti su subklonirani u ekspresionom plazmidu koji sadrži humani gama (Cγ) ili kapa (Cκ) konstantni region koristeći InFusion HD komplet za kloniranje (Clontech). Svi klonovi su sekvencirani da bi se potvrdilo prisustvo i vernost umetaka.
[0237] Sinteza gena: Humanizovani VH domeni i zu155D5LC-1, -huVK1-39, - huVK2-40, -huVK3-11, -huVK4-1, -huVK5-2, -huVK6-21, -huVK6D-41, -huVK7-3, zu1E4LC-1 i zu166B3LC-1 Vκ domeni su kodonski optimizovani za ekspresiju u humanim ćelijama i sintetizovani su pomoću DNK 2.0. Varijabilni domeni su sintetizovani sa Kozakovom sekvencom i Ig vodećom sekvencom i uključivali su 15 parova baza na 5’i 3’ krajevima homolognim mestu kloniranja unutar vektora subkloniranja. Nakon ekscizije iz vektora DNK 2.0, fragmenti su subklonirani u ekspresioni plazmid koji sadrži humani Cγ ili Cκ region koristeći InFusion HD komplet za kloniranje. Svi klonovi su sekvencirani da bi se potvrdilo prisustvo i vernost umetaka.
[0238] QuikChange: Mutageneza kodon-optimizovanih Vκ domena je izvršena korišćenjem Stratagene-ovog QuikChange XL prema protokolu proizvođača. Svi klonovi su sekvencirani da bi se potvrdilo prisustvo mutacije.
Ćelijska kultura
[0239] Transfekcija i generisanje stabilnih ćelijskih linija: Jedan dan pre transfekcije, ćelije 293F su zasejane pri 6,0x10<5>ćelija/mL u medijumu 293FreeStyle (Thermo Fisher Scientific) u boci za trešenje i inkubirane na 37 ° C, 8% CO2, sa mućkanjem pri 125 o/min. Na dan transfekcije, ćelije su zasejane pri 1x10<6>ćelija/mL, kao što je gore navedeno. Ćelije su transficirane korišćenjem PEI (25 kDa, linearni; Polysciences) ili ExpiFectamine (Thermo Fisher Scientific). Za PEI transfekcije, 166,7 ng HC plazmida, 166,7 ng LC plazmida, 2,2 μg PEI i 50 μL OptiPro (Thermo Fisher Scientific) po ml transficiranih ćelija je inkubirano tokom 15 minuta na 22 ° C. Smeša DNK: PEI je dodata ćelijama uz centrifugiranje i inkubirana na 37 ° C, 8% CO2, trešenjem na 125 o/min. Posle 48-72 h, ćelije su hranjene pri konačnoj koncentraciji od 10 g/L Yeastolate (BD Biosciences), 5 mM valerične kiseline (Sigma Aldrich) i 1: 100 CD koncentrata lipida (Thermo Fisher Scientific).
[0240] Za svaki mL ćelija za transfekciju sa ExpiFectaminom, 333,3 ng HC plazmida i 333,3 ng LC plazmida je inkubirano tokom 10 minuta u 50 μL Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific). Slično tome, 2,67 μL ExpiFectamine je inkubiran u 50 μL Opti-MEM. Rastvor ExpiFectamine je dodat u smešu DNK i inkubiran tokom 30 minuta na 22 ° C. Smeša DNK: ExpiFectamine je dodata ćelijama uz vrtložno mešanje i inkubirana na 37 ° C, 8% CO2, mućkanjem na 125 o/min. Sledećeg dana, 3 μL pojačivača 1 i 30 μL pojačivača 2 po mL ćelija je dodato u transfekciju i nastavljeno je inkubiranje još 7 ili 10 dana, u zavisnosti od gustine ćelija.
[0241] Stabilni bazeni koji izražavaju antitela su odabrani dodavanjem 3 ml transfektanata u 12 ml DMEM-a u tikvici T75 sa 5 μg/mL blasticidina i 400 μg/mL zeocina (Thermo Fisher Scientific), jedan do tri dana nakon transfekcije. Nakon što su ćelije otporne na lekove porasle do konfluencije, medijum je zamenjen medijumom za ekspresiju FreeStyle 293. Nakon 24 ili 48 h, ćelije su fizički istisnute lakim udaranjem boce (tripsinizacija je rezultirala niskom održivošću; podaci nisu prikazani), a zatim su zasejane pri 6x10<5>ćelija/mL u 30 ml FreeStyle 293 ekspresionom medijumu u boci za trešenje od 125 ml. Kulture su inkubirane na 37 ° C u 8% CO2uz mućkanje pri 125 o/min.
[0242] Proizvodnja mAt-a: Proizvodnja antitela iz stabilnih bazena je izvedena pomoću jedne ili dve metode:
1. Bazeni stabilno transfektovanih ćelijskih linija su zasejani pri 0,6 do 1x10<6>ćelija/mL u medijumu 293FreeStyle. Dva dana nakon što je kultura dostigla gustinu od 1 x 10<6>ćelija/ mL, kulture su hranjene kao što je ovde opisano; ili
2. Bazeni stabilno transfektovanih ćelijskih linija su centrifugirani pri 1000 obrtaja u minuti u Beckman Allegra 6 centrifugi, tokom 5 minuta. Supernatant je uklonjen, a ćelije su resuspendovane u 1 L expi293 medijumu (Gibco) pri 0,5-0,8x10<6>ćelija/mL u boci za trešenje od 2,8 L. Ćelije su inkubirane na 37 ° C, 8% CO2, trešenje pri 125 o/min.
[0243] Za obe metode, kulture su inkubirane na 37 ° C u 8% CO2,uz mućkanje pri 125 o/min tokom 7-10 dana, u zavisnosti od toga kada je održivost ćelija pala na oko 50%, u to vreme su
4
kulture centrifugirane tokom 1 h pri 8000 o/min. u Beckman JLA8.1000 rotoru. Supernatant je zatim filtriran kroz 0,2 μm PES filter i čuvan na 4 ° C ili -20 ° C do prečišćavanja.
Prečišćavanje mAt
[0244] Prečišćavanje antitela afinitetnom hromatografijom proteina A: Koristeći AKTA Explorer (GE Healthcare), kolona proteina A (GE Healthcare) je uravnotežena sa 10 kolonskih zapremina (CV) od 20 mM natrijum fosfata, 10 mM EDTA, pH 7,2. Zatim je uzorak napunjen, praćen ispiranjem nevezanog materijala sa 10 CV ekvilibracionog pufera. Uzorak je eluiran upotrebom 5 CV od 0,1 M glicina pH 2,9. Frakcije koje sadrže mAt su objedinjene i dijalizovane u Dulbecco-ovom fosfatnom puferu (DPBS) korišćenjem MWCO 20K Slide-A-Lizera (Thermo Fisher Scientific).
[0245] Dekapiranje cisteina: Koristeći ÄKTA Explorer (GE Healthcare), kolona proteina A (GE Healthcare) je uravnotežena sa 10 CV od 20 mM natrijum fosfata, 10 mM EDTA, pH 7,2 (ekvilibracioni pufer). Zatim je uzorak napunjen, praćen ispiranjem nevezanog materijala sa 10 CV ekvilibracionog pufera. Kolona je isprana sa 16 CV od 20 mM natrijum fosfata, 10 mM EDTA, 5 mM cisteina, pH 7,2 pri 0,5 mL/min, tokom 16 h na 4 ° C da bi se uklonila pokrivajuća grupa. Kolona je zatim isprana sa 60 CV od 20 mM Tris-a, pH 7,5 pri 0,5 mL/min, tokom 60 h na 4 ° C. Uzorak je eluiran korišćenjem 5 CV 0,1 M glicina pH 2,9 i odmah neutralizovan korišćenjem 5% zapremine 2M Tris-a, pH 9,0. Frakcije koje sadrže mAt-a su objedinjene i dijalizovane u DPBS-u upotrebom MWCO 20K Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific).
Analize LC-MS/MS cisteinilacije i mapiranja disulfidne veze
[0246] MAt je puferski izmenjeno u 50 mM amonijum bikarbonatnog pufera, pH 7,8, koristeći Zeba vrtložnu kolonu za uklanjanje soli (Thermo-Fisher). Koncentracija je podešena na 1 mg/ mL, a RapiGest (Waters) je dodat do 0,1%. Zatim je mAt digestovano sa Glu-C (New England BioLabs) (25: 1 m/m) na 37 ° C tokom 4 h, praćeno digestijom sa Asp-N (New England BioLabs) (25: 1 m/m) na 37 ° C tokom 18 h. Nakon digestije, 5% trifluorosirćetne kiseline (TFA) dodato je u 0,5% i inkubirano na 37 ° C tokom 90 minuta. Uzorak je centrifugiran na 13.000 o/min tokom 30 minuta da bi se uklonile pelete i analiziran pomoću LC-MS/MS primenom MS<E>metodologije u drugoj fazi jonizacije. MS<E>metodologija koristi pojačani napon umesto fiksnog napona u drugoj fazi jonizacije za generisanje potpunog jonskog profila. Uzorci su analizirani korišćenjem Waters Acquity UPLC i Q-Tof Premier masenog spektrometra. Uzorci su injektovani na Waters BEH 300 C18, veličine pora 1,7 μm, 2,1 x 100 mm, eluirani iz kolone sa 3-minutnom ekvilibracijom u 97% mobilne faze A (0,1% mravlja kiselina u H2O), linearnim gradijentom od 55 minuta (3-45% mobilne faze B (0,1% mravlje kiseline u acetonitrilu)), 5-minutnim linearnim gradijentom (45%-90% mobilne faze B), 5-minutnom izokratskom fazom (90% mobilne faze B), 5 minutnim linearnim gradijentom (90%-3% mobilne faze B) i 5-minutnom ponovnom ekvilibracijom u 97% mobilne faze A, pri 0,05 mL/min. Maseni spektrometar Q-Tof je pokrenut u pozitivnom jonu, V-modu sa detekcijom u Opisegu 200-2000 m/z. Parametri izvora su bili sledeći: kapilarni napon, 3,0 kV, napon konusa za uzorkovanje, 40 V; temperatura izvora, 120 ° C; temperatura uklanjanja rastvarača iz rastvora, 250 ° C; protok gasa za uklanjanje rastvarača, 600 L/sat. Referentni standard mase raspršivača je bio glu-fib. MS<E>metoda je bila sledeća: vreme prikupljanja, 3-70 min; Opiseg podataka, 200-2000 m/z; vreme skeniranja, 1,5 sek; ekspresija, niska energija 6V, nagib visoke energije od 10-30V.
[0247] Agregacija antitela je analizirana isključivanjem veličine, metodom tečne hromatografije visoke performanse (SEC-HPLC) pomoću Agilent 1100. MAt je razblaženo do 1 mg/mL u DPBS-u. Antitelo (20 µL) je injektovano u zaštitnu kolonu TSKgel SuperSW (4,6 mm x 3,5 cm, veličine pora 4 μm, Tosoh Bioscience), praćeno kolonom TSKgel SuperSW3000 (4,6 mm x 30 cm, veličine pora 4 μm), eluirano iz kolone sa 0,1 M PBS-a koji sadrži 0,15 M NaCl i 0,05% NaN3, pri pH 7,4, pri brzini protoka od 0,3 mL/min tokom 20 min. Svi podaci su analizirani pomoću softvera Agilent ChemStation. Procenat agregacije je izračunat kao [PAagregata/PAukupna] * 100, gde je PA = integrisana površina pika.
UPLC/ESI-MS analiza malemida i biotina: konjugacija mAt
[0248] Prečišćena antitela su razblažena do 1 mg/mL u DPBS-u (uzorci su ostavljeni u prvobitnoj koncentraciji ako su ispod 1,0 mg/mL). Maleimid-PEG2-biotin ((mal)-PEG2-biotin) (Thermo Fisher Scientific) je rastvoren u DPBS-u da bi se dobio 20 mM matični rastvor, praćen razblaženjem do 1 mM u DPBS-u. Mal-PEG2-Biotin je dodat u 1 mL oslobođenog mAt pri odnosu konjugacije 5: 1 i inkubiran na 22 ° C uz nežno rotiranje tokom 2 sata. Reakcija je desalinizovana pomoću Zeba vrtložene kolone za desalinizaciju. Zatim su mAt-a deglikozilovana korišćenjem PNGase F (New England BioLabs). G7 pufer (10 μL) i PNGase F (2 μL) su dodati u mAt (90 μL). Reakcija je inkubirana u Discover mikrotalasnoj peći (CEM) tokom 2 ciklusa: 1) mikrotalasna snaga 10 W, 37 ° C, 10 min, praćena pauzom od 5 minuta; i 2) mikrotalasna snaga 2 W, 37 ° C, 10 min. Deo uzorka je redukovan dodavanjem ditiotreitola (DTT) do krajnje koncentracije od 20 mM, praćeno inkubacijom na 60 ° C tokom 3 minuta.
[0249] Uzorci su zatim analizirani korišćenjem Waters Acquity UPLC i Q-Tof Premier masenog spektrometra. Uzorci (0,5-2 μg svaki) su injektovani na MassPrep mikro desalinizacionu kolonu na 65 ° C, eluirani iz kolone sa 5-minutnom ravnotežom u 95% mobilne faze A, 10 min gradijentom (5-90% B), i 10 min ponovnom ravnotežom u 95% mobilne faze A, pri 0,05 mL/min. Mobilna faza A je bila 0,1% mravlja kiselina u vodi. Mobilna faza B bila je 0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu. Maseni spektrometar Q-Tof je proticao u pozitivnom jonu, V-modu, sa detekcijom u Opisegu od 500-4000 m/z. Parametri izvora su bili sledeći: kapilarni napon, 2,25 kV (netaknuto antitelo) -2,50 kV (redukovano antitelo); napon konusa za uzorkovanje, 65,0 V (netaknuto antitelo) ili 50,0 V (redukovano antitelo); temperatura izvora, 100 ° C; temperatura uklanjanja rastvarača, 250 ° C; protok gasa za desolvataciju, 550 L/sat. Proteinski pik je dekonvoluisan korišćenjem funkcije MassLynx MaxEnt 1. Efikasnost konjugacije izračunata je kao [Ibiotinilovano/(Ibiotinilovano+ Inemodifikovano)] * 100 dekonvoluiranog masenog spektra, gde I = intenzitet mase pika.
BIAcore analiza mAt: afinitet prema antigenu
[0250] Koncentracije antitela su podešene da generišu 30-40 RU signala kada se vezana za antigen. Humanizovana mAt-a prečišćena standardnom afinitetnom hromatografijom proteina A ili metodom uklanjanja kape su injektovani preko anti-humanog IgG senzora na BIAcore T100 (GE Healthcare) tokom 1 min pri brzini protoka od 10 μL/min. Površina senzora je isprana injektovanjem pufera HBS-P tokom 1 min, pri brzini protoka od 50 μL/min. Da bi se snimilo povezivanje antigena sa zarobljenim monoklonskim antitelom, injektovana je serija rastućih koncentracija antigena tokom 60 sekundi, pri brzini protoka od 50 μL/min. Disocijacija antigena je praćena tokom 30 minuta pri istoj brzini protoka. Površina senzora je regenerisana injektovanjem 3 M MgCl2u trajanju od 1 min, a zatim 30 sec, pri brzini protoka od 30 μL/min. Sensogrami su analizirani pomoću softvera za procenu Biacore T100 korišćenjem modela vezivanja Langmuir u odnosu 1: 1.
Dvovalentni/bispecifični Fab preparat
[0251] Fragmenti Fab izvedeni iz mAt-a su pripremljeni odvojeno korišćenjem imobilizovanog papaina, praćeno izolacijom čistih fragmenata Fab iz Fc/nedigestovanog mAt primenom proteinske A hromatografije. Sintetisan je maleimido-PEG4-azid kombinovanjem NHS-maleimida i azido-PEG4-amina u DMSO tokom 1 sata, u molarnom odnosu 1: 1. Neizreagovani NHS je ugašen dodavanjem Tris-HCl pufera da bi se sprečila homodimerizacija. Fab-ovi su konjugovani ili sa maleimido-PEG4-azidom ili sa maleimido-PEG4-dibenzociklooktinom (DBCO), pri molarnom odnosu maleimid: Fab od 5:1 i reagovali tokom 4 sata na 22 ° C. Modifikovani Fab fragmenti su desalinizovani dva puta svaki u DPBS-u da bi se uklonili svi neizreagovani proizvodi, a Fab fragmenti su kombinovani pri molarnom odnosu 1: 1 u konačnoj koncentraciji od 2 mg/mL i ostavljeni da obrazuju dimere preko noći na 22 ° C. Reakcija je analizirana pomoću SDS-PAGE i procenjena je efikasnost dimerizacije na 20%. Preparat dimera je prečišćen od neizreagovanog monomera pomoću S-200 gel filtracione hromatografije.
Analiza dvovalentnog/bispecifičnog okteta
[0252] Biotinilovani humani CA9 je uhvaćen na vrhovima streptavidinskog biosenzora (Pall) tokom 4 min. Nakon inkubacije u PBS-u tokom 2 min, vrhovi su inkubirani sa bivalentnim/ bispecifičnim Fab fragmentima, mAt-om samostalno ili Fab-om samostalno tokom 5 min. Nakon inkubacije u PBS-u tokom 2 minuta, vrhovi su inkubirani sa humanim endosialinom/ TEM-1 tokom 5 minuta. Na kraju, vrhovi su inkubirani u PBS-u još dodatnih 2 min. Do kraja je mereno povezivanje i razdvajanje proteina sa vrhovima.
Primer 2 – Cis 80 konjugacija
Cilj
[0253] Tehnologije konjugacije specifične za određeno mesto su poželjne za proizvodnju homogenog proizvoda sa definisanim odnosom leka i antitela (DAR). Vκ domen zečjeg mAt-a, kao što je onaj izveden iz Oryctolagus cuniculus, može sadržati cistein na položaju 80 (koji se naziva „Cis80“) (SL. 1A), a Cκ region može sadržati cistein na položaju 171 („Cis171 ”) (SL.
1B). Modeliranje in-silico je predvidelo da bi Cis80 i Cis171 mogli da obrazuju disulfidnu vezu, jer je predviđeno da dva S atoma budu odvojena približno 1,6 Å (SL. 2A). Humana monoklonska antitela imaju ostatke prolina, serina ili alanina u položaju 80 (SL. 1A) i serina u položaju 171 (SL. 1B), stoga ne postoji disulfidni most između varijabilnog i konstantnog regiona (SL.2B).
[0254] Kristalna struktura najbliža zečjim ili humanim Vκ i Cκ sekvencama je identifikovana korišćenjem baze podataka BLAST pdb i korišćena kao obrazac za modeliranje strukture 155D5 mAt. Modeli su generisani korišćenjem alata „Build Homology Models“ (Accelrys) kompanije Discovery Studio. Odabran je model sa najnižom ukupnom energijom, otkucan sa zaštitnim poljem CHARMm, a energija je dalje umanjena preko dva kruga minimizacije energije korišćenjem alata „Minimiziraj“. CDR petlje su zatim prečišćene korišćenjem alata „Model Antibody LoOpis“. Odabran je model sa najnižom ukupnom energijom, otkucan sa zaštitnim poljem CHARMm, a energija je dalje umanjena kao gore. Blizina Cis80 i Cis171 (SL. 2A) predviđa da ovi cisteini mogu da obrazuju disulfidnu vezu. Za predstavljanje ove disulfidne veze korišćen je alat „Build Mutants“.
[0255] Pošto su disulfidne veze kritične za održavanje sekundarnog i tercijarnog strukturnog integriteta, što je zauzvrat neophodno za biološku aktivnost antitela, bilo je važno dokazati da li predviđena veza Cis80-Cis171 zaista postoji. Stoga su sprovedeni ad hoc eksperimenti koji su nedvosmisleno pokazali da zečja mAt-a sadrže takvu vezu (Tabela 4).
Tabela 4. Demonstracija postojanja disulfidne veze Cis80-Cis171
[0256] Himerizovano mAt humane vrste nastaje fuzijom između: i) varijabilnog regiona iz vrste gde je mAt generisano; i ii) humanog konstantnog regiona. Ovaj proces se naziva himerizacija. Humanizovano mAt je uglavnom napravljeno od humanih varijabilnih i konstantnih regiona, osim onih ostataka neophodnih za vezivanje antigena, koji potiču od iste vrste domaćina iz koje je generisano mAt. Ovaj proces se naziva humanizacija. Za konstruisanje humanog himerizovanog ili humanizovanog mAt, pri čemu su mAt-a generisana u domaćinima koji pripadaju vrsti Oryctolagus cuniculus, čitavi konstantni domeni, kao i većina varijabilnih regiona (ako su humanizovani) su genetski zamenjeni sa humanim varijabilnim i humanim konstantnim sekvencama. Bilo nakon himerizacije ili humanizacije, Cis80 u Vκ više nije obrazovao disulfidnu vezu sa položajem 171 u Cκ (SL.2C), pa je stoga nesparen.
[0257] Familije germinativne linije NZW zečeva Vκ imaju cistein na položaju 80 kao što je prikazano na SL.3 (CDR regioni su izbrisani, a okvirni regioni (FWR) 1, 2 i 3 su poravnani).
Otkrivanje i karakterizacija nesparenog cisteina na položaju 80
[0258] Zečji konstantni regioni od 155D5 i 1E4 (anti-CA9), 1-55-2 (anti-hTEM1), kao i 33O11 (anti-MSLN), od kojih svi sadrže Cis80 i generisani kao što je opisano u primeru 1, zamenjeni su sa humanim konstantnim regionima IgG1κ da generišu zečja/humana himerizovana mAt-a, kao što je ovde opisano na drugom mestu. Specifično, zečji VH region 155D5 je fuzionisan sa humanim Cγ regionom da bi se generisao xi155D5HC, a zečji Vκ region 155D5 je fuzionisan sa humanim Cκ regionom da bi se generisao xi155D5LC. Zečje/humano himerizovano mAt 155D5 sa nesparenim Cis80 se ovde naziva xi155D5.
[0259] VH region iz 1-55-2 je fuzionisan sa humanim Cγ regionom da bi se generisao xi1-55-2H, a zečji Vκ region 1-55-2 je fuzionisan sa humanim Cκ regionom da bi se generisao xi1-55-2LC. Zečje/humano himerizovano mAt 1-55-2 sa nesparenim Cis80, ovde se naziva xi1-55-2.
[0260] Zečji VH region 1E4 je fuzionisan sa humanim Cγ regionom da bi se generisao xi1E4HC, a zečji Vκ region 1E4 je fuzionisan sa humanim Cκ regionom da generiše xi1E4LC. Zečje/humano himerizovano mAt 1E4 sa nesparenim Cis80 se ovde naziva xi1E4.
[0261] Zečji VH region 33O11 je fuzionisan sa humanim Cγ regionom da bi se generisao xi33O11HC, a zečji Vκ region 33O11 je fuzionisan sa humanim Cκ regionom da generiše xi33O11LC. Zečje/humano himerizovano mAt 33O11 (xi33O11) sa nesparenim Cis80 se ovde naziva xi33O11.
[0262] Pošto je Cis171 tokom himerizacije bio supstituisan sa Ser171, himerizovana antitela (xi155D5, xi1-55-2, xi1E4 i xi33O11) su sadržala nespareni cistein na položaju 80 u Vκ (koji se naziva „Cis80“). Kada je redukovan pod oštrim uslovima (20 mM DTT na 60 ° C tokom 5 minuta), molekulska težina (masa) lakog lanca mAt xi155D5 prečišćenog proteinom A je bila 23.382 Da (SL. 4A). Međutim, kada se podvrgne blago redukcionim uslovima (100 μM DTT, RT, 30 min), masa se povećala za 120 Da (SL. 4B). Ovo povećanje mase je sugerisalo da bi Cis80 mogao da obrazuje disulfidnu vezu sa slobodnim cisteinom, koji se naziva „pokrivajući cistein“. Ova molekularna struktura, koja je rezultat reakcije tzv „cisteinilacija“, naziva se „zatvoreni“ Cis80. Da bi se potvrdila ova hipoteza, xi155D5 mAt je digestirano sa Asp-N i Glu-C i analizirane su mase peptida. Analiza masene spektrometrije peptidnih fragmenata koji odgovaraju ostacima 71 do Cis80 (FTLTITGVQC) (SEK ID BR: 24), ukazuje na povećanu molekularnu težinu za 119 Da (tabela 5), potvrđujući time da je Cis80 pokriven.
Tabela 5. Masena spektrometrija fragmenata xi155D5 peptida 71-Cis80
[0263] Pošto bi nedostatak disulfidne veze Cis80-Cis171 mogao dovesti do nestabilnosti antitela, poremećaja vezivanja antigena ili oboje, sprovedeni su testovi stabilnosti antitela i vezivanja antigena. Stabilnost xi155D5 je ispitana korišćenjem SE-HPLC testa. Ovim testom se ispituje da li bi nedostatak disulfidne veze Cis80-Cis171 mogao dovesti do agregacije (usled mogućih intermolekularnih veza Cis80-Cis80) ili degradacije (usled povećane osetljivosti na proteaze). Prečišćeno antitelo pri 1 mg/mL u IX PBS-u je skladišteno na -80 ° C ili 37 ° C tokom 1 nedelje.10 µL xi155D5 je injektovano na kolonu SuperSW3000 (TOSOH Biosciences,
1
4,6 mm X 30 cm, veličine čestica 4 µm) opremljenom sa unutar-linijskom TSKgel 4,6 mm x 3,5 cm zaštitnom kolonom, pri brzini protoka od 0,3 mL/min sa 0,1 M natrijum fosfata, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3kao mobilna faza. Nije primećena značajna promena u agregaciji između dva uslova skladištenja (SL.5A i 5B). Nivo agregacije je bio u rasponu od 3-4%, a time i unutar normalnog Opisega tipičnog humanog IgG1 (podaci nisu prikazani). Pod bilo kojim uslovima skladištenja primećeno je malo ili odsustvo degradacionih proizvoda (SL. 5). Ovi rezultati sugerišu da je xi155D5 kome nedostaje disulfidna veza Cis80-Cis171 stabilan protein pod ispitivanim uslovima skladištenja.
[0264] Da bi se utvrdilo da li himerizacija, a time i gubitak disulfidne veze Cis80-Cis171, rezultira strukturnim poremećajima koji dovode do gubitka vezivanja antigena, afinitet vezivanja mAt-a 155D5, xi155D5, 1-55-2 i xi1-55-2 je ocenjen površinskom plazmonskom rezonancom. Biotinilovani ligand (biotin-hTEM1 za 1-55-2, biotin-CA9 za 155D5) je uhvaćen na obloženom biotinskom CAP BIAcore čipu (GE Healthcare, Piscataway, NJ) koristeći HBS-EP kao pufer za propuštanje. Konačni nivoi hvatanja antigena su bili 130 RU, odnosno 280 RU za biotin-TEM1 i biotin-CA9. Serijska razblaženja antitela (120 μL od 0-50 nM) propuštena su preko čipa obloženog ligandom. Disocijacija je primećena za 25 min. Površina čipa je regenerisana sa 6 M GuHCl, 250 mM NaOH. Dvostruko su referencirani senzogrami i određeni su kinetički parametri pomoću softvera BIAEvaluations (ver.4.1). Zabeležen je mali ili nikakav gubitak afiniteta vezivanja usled himerizacije dva različita mAt (Tabela 6), što sugeriše da nedostatak disulfidne veze Cis80-Cis171 ne dovodi do poremećaja vezivnog regiona.
Tabela 6. Kinetičke konstante himerizovanih i zečjih mAt-a
Procena korisnosti Cis80 za konjugaciju funkcionalnih agenasa
[0265] Nakon što je utvrđeno da nedostatak disulfidne veze Cis80-Cis171 ne dovodi do strukturnih poremećaja, istražena je mogućnost zamene pokrivajućeg cisteina sa tiol-reaktivnim jedinjenjem. Tiol-reaktivna grupa može biti vezana za linker, koji zauzvrat može biti vezan za molekul dijagnostičke ili terapijske upotrebljivosti, koji se ovde naziva „funkcionalno sredstvo.
2
”Funkcionalni agensi mogu da uključuju fluorofore, fluorescentne boje, polipeptide, imunoglobuline, antibiotike, nukleinske kiseline, radionuklide, hemijske veznike, male molekule (kao što su hemoterapeutski agensi), helatore, lipide i lekove.
[0266] Da bi se pokrivajući cistein zamenio sa funkcionalnim sredstvom, prvo je uklonjen cistein za zatvaranje. Izlaganje prečišćenog mAt-a redukcionim uslovima bi moglo da prekine disulfidnu vezu između Cis80 i zatvarajućeg cisteina, što se ovde naziva „oslobađanje. ”Međutim, neoptimalni uslovi redukcije, na primer oštri redukcioni uslovi, takođe mogu prekinuti među- i unutarlančane disulfidne veze, ugrožavajući na taj način strukturu i aktivnost mAt. Zbog toga je razvijena metoda uklanjanje kapice koja uključuje uklanjanje pokrivajućeg cisteina korišćenjem blage redukcije, praćeno reoksidacijom sa puferom koji sadrži Tris koji ne menja strukturu i aktivnost mAt, a istovremeno omogućava uklanjanje zatvarajućeg cisteina. U početku su procenjeni brojni redukcioni agensi, uključujući redukovani glutation, cistein, TCEP i DTT. Glutation nije efikasno uklonio pokrivajući cistein (podaci nisu prikazani). I DTT i TCEP su efikasno uklonili pokrivajući cistein, ali veće koncentracije su takođe rezultirale gotovo potpunim prekidom međulančanih disulfida i verovatno i nekih unutarlančanih disulfida (podaci nisu prikazani). Blagi redukcioni cistein efikasno uklanja pokrivajući cistein i primećen je samo ograničeni prekid međulanca. Reoksidacija je ispitana korišćenjem fosfatnog pufera, Tris pufera i jakog oksidansa CuSO4. Nije primećena ponovna oksidacija poremećenih međulančanih disulfida sa fosfatnim puferom, dok je CuSO4efikasno i brzo reformisao disulfide, ali nije dalje procenjen zbog svoje inherentne toksičnosti u poređenju sa Tris-om. Optimizovani uslovi su prilagođeni formatu kolone kako bi se omogućilo sekvencijalno prečišćavanje i oslobađanje iz sirovine. Ovom metodom, antitelo je vezano za protein A smolu i inkubirano sa ograničenim protokom (0,5 mL/min) sa puferom koji sadrži 5 mM cisteina, tokom 16 sati da redukuje (prekine) disulfidnu vezu Cis80-cistein, praćeno ispiranjem sa puferom koji sadrži Tris oslobođen cisteina tokom 60 h da ukloni cisteine oslobođene ovim tretmanom i ponovo oksiduje bilo koje redukovane međulančane disulfidne veze. Zatim se mAt eluira u glicinskom puferu sa niskim pH. U primernom eksperimentu u kome je metoda dekapiranja primenjena na xi155D5, određena je masa neredukovanog, prečišćenog mAt i nađeno je da je oslobođeno ~ 99% mAt, što je prikazano padom mase ekvivalentnom dvoma slobodnim cisteinima (SL. 6A i 6B). Analiza slobodnog tiola je potvrdila prisustvo dve tiolske grupe po mAt, takođe demonstrirajući efikasnu reoksidaciju (podaci nisu prikazani).
Oslobođeni Cis80 može biti konjugovan sa maleimidom
[0267] Cistein je α-aminokiselina sa nepolarnim bočnim lancem (tiol; -SH). Redukovani bočni lanac tiola u nesparenom cisteinu bi mogao da posluži kao nukleofil koji može da reaguje sa molekulom elektrofila kao što je maleimid, hemijsko jedinjenje sa formulom H2C2(CO)2NH. Dvostruka veza elektrofila u maleimidu lako reaguje sa nukleofilnom tiolskom grupom koja se nalazi na cisteinu da formira stabilnu tioetarsku vezu ugljenik-sumpor. Nepolarnost bočnog lanca tiola, u zavisnosti od okolnih ostataka, može dati cisteinu hidrofobno svojstvo koje može sprečiti izlaganje rastvaraču neophodno za hemijske modifikacije. Pored toga, lokacija cisteina u kontekstu sekundarne strukture peptida u kome se nalazi može dalje sprečiti pristup tiolreaktivnom molekulu. Izvršeno je eksperimentalno ispitivanje da bi se utvrdilo da li Cis80 može da reaguje sa tiol-reaktivnom molekulom nakon uklanjanja zaštite. Oslobođeni xi155D5 je inkubiran sa maleimid-PEG2-biotinom kako je ovde opisano na drugom mestu. Analiza masene spektrometrije je pokazala da je 94% mAt konjugovano sa maleimid-PEG2-biotinom, što je naznačeno povećanjem molekularne mase za 526 Da (SL. 7), što odgovara masi funkcionalnog agensa. Kako je pronađeno da je svaki laki lanac konjugovan (pik jedne mase, SL. 7), odnos maleimid-PEG2-biotin i xi155D5 je homogen jednak 2: 1. Jedan maleimid-PEG2-biotin je konjugovan sa Cis80 u svakom od dva laka lanca u himerizovanom mAt-u (Cis80<1>i Cis80<2>).
[0268] Ovi rezultati pokazuju da Cis80 i Cis171 obrazuju disulfidnu vezu koja povezuje Vκ i Cκ regione zečijih mAt-a. Kada su zečja mAt-a himerizovana, Cis171 je supstituisan sa Ser171 prisutnim u humanom Cκ regionu. Ovom supstitucijom ukinuta je disulfidna veza Cis80-Cis171. Kada su procenjeni efekti gubitka ovog disulfidnog mosta na strukturnu stabilnost i aktivnost rezultujućeg himerizovanog mAt-a u poređenju sa roditeljskim zečjim mAt-om, primećeno je da je himerizovano monoklonsko antitelo stabilno i aktivno. Otkriveno je da su oba Cis80<1>i Cis80<2>, koji su ostali neupareni u himerizovanom mAt-u, zatvoreni slobodnim cisteinom (pokrivajući cistein). Naknadno je razvijena metoda za uklanjanje pokrivajućeg cisteina (dekapiranje), uz održavanje strukturne stabilnosti i aktivnosti nastalog himera mAt. Pored toga, pokazano je da se visoki prinosi mAt konjugovanog sa maleimid-PEG2-biotinom mogu postići odnosom funkcionalnog agensa i mAt-a jednakom 2: 1.
Humanizacija zečjih monoklonskih antitela
[0269] Himerizovana mAt-a mogu biti imunogena kada se primenjuju ljudima, pa je poželjno humanizovati zečja mAt-a zamenom zečjih sekvenci humanim sekvencama u Vκ i VH regionima. Aminokiselinska sekvenca mAt 155D5 je analizirana korišćenjem BLAST pretrage prema bazi podataka humanog varijabilnog domena na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/ za
4
identifikaciju humane sekvence sa najvišom homologijom sa sekvencom zeca. IGHV3-64 *04 i IGKVI-5*03 su identifikovani kao najbolje sekvence za humanizaciju, jer bi njihova upotreba rezultirala najmanjim brojem supstitucija zečjih ostataka (SL.8).
[0270] Sekvence 155D5 koje odgovaraju domenima za vezivanje antigena, kako je identifikovano od strane Kabat i Chothia CDRH1, Chothia CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3, umetnute su u okvirne (FWR) regione humanog IGHV3-64*04 ili IGKV1-5*03 da bi se generisalo humanizovano mAt 155D5, nazvano zu155D5-1 (Tabela 7 i Tabela 8).
[0271] Tokom humanizacije 155D5LC (zu155D5LC), Cis80 je održan, koji je bio neuparen, jer humana kapa sekvenca ima Ser171 za razliku od Cis171. zu155D5-1 je proizveden i prečišćen korišćenjem standardnog protein A prečišćavanja, i utvrđeno je da je zatvoren, što je dokazano promenom mase nakon oslobađanja za 233 Da, približno odgovarajuće dvoma cisteinima za zatvaranje (SL. 9). Kao što je primećeno sa xi155D5, zu155D5-1 bi takođe mogao da se oslobodi sa efikasnošću blizu 100% (Tabela 9). Međutim, oslobađanje je dovelo do masivnih nivoa agregacije (70%) nasuprot samo 14% u xi155D5. Kada je zu155D5-1 reagovao sa maleimid-PEG2-biotinom, primećena je 0% konjugacija, dok je xi155D5 bio konjugovan 93% (Tabela 9). Ovi rezultati su bili iznenađujući, jer sugerišu da: 1) posedovanje cisteina u položaju 80, iako je neophodno, nije dovoljno da omogući konjugaciju funkcionalnog agensa specifičnu za mesto; i 2) u nekim uslovima, pokušaj konjugacije na Cis80 bi mogao dovesti do visoke agregacije koja nije kompatibilna sa proizvodljivošću leka. Međutim, pošto su otkrivene studije, koje su karakterisale xi155D5, pokazale da najmanje u nekim uslovima konjugacija funkcionalnog agensa na Cis80 može biti vrlo efikasna, dalje je istraženo kako ostaci koji okružuju Cis80 mogu uticati na efikasnost konjugacije. Shodno tome, generisani su strukturni modeli himerizovanog xi155D5 (SL. 10), koji su ukazivali da su ostaci Val11, Ala14, Gli17, Tre18, Liz63, Tre76, Gli77, Val78, Ala83, Glu103 i Leu104 bili u neposrednoj blizini (unutar 18 Å) prema Cis80 i stoga bi potencijalno mogli uticati na efikasnost njegove konjugacije.
[0272] Na osnovu gore pomenutih ostataka dizajnirane su dve verzije FWR1 (FWR1a-b), jedna verzija FWR2, tri verzije FWR3 (FWR3a-c) i dve verzije FWR4 (FWR4a-b) (Tabela 7).
Tabela 7. Verzije okvira izvedene iz humane Vκ familije IGKV1-5
[0273] Generisane su serije humanizovanih 155D5 varijanti koje su sadržale kombinacije ovih okvira i bilo Cis80-Xaa1-Xaa2-Fen83 (takođe se naziva C-X-X-F ili CXXF) ili Cis80-Xaa1-Xaa2-Ala83 (takođe označen I C-X-X-A ili CXXA) ), pri čemu „Xaa“ ili „X“ označava aminokiseline na položaju 81 ii 82 (tabela 8).
Tabela 8. Humanizovane varijante 155D5 izvedene iz familije IGKV1-5 humanog Vκ
[0274] Primećeno je da su, bez obzira na korišćenu verziju FWR, humanizovana mAt koja motiv C-X-X-F pokazivala visoku agregaciju (nakon uklanjanja zaštite) i slabu konjugaciju (Tabela 9). Suprotno tome, 4 od 5 varijanti monoklonskih antitela koje sadrže motiv C-X-X-A, i bez obzira na korišćenu verziju FWR, pokazalo je visok procenat efikasnosti konjugacije (≧ 80%) i nisku agregaciju (nakon oslobađanja) od <18% (tabela 9). Zu155D5-4 je ekstremni slučaj koji je ispoljio nizak procenat efikasnosti konjugacije i visoku agregaciju nakon oslobađanja. Primećeno je da antitelo zu155D5-4 ima tendenciju sakupljanja nezavisno od uklanjanja zaštite, što može biti odgovor za uočene rezultate. Ovi podaci sugerišu da je Phe83 umešan u izazivanje visoke agregacije nakon oslobađanja i nije pogodan za konjugaciju na Cis80.
Tabela 9. Nivoi agregacije i efikasnost konjugacije xi155D5 naspram različitih varijanti zu155D5
[0275] Poželjno je postići agregaciju od 25% ili manje kao polaznu tačku nishodnog procesa optimizacije, pri čemu se daljom optimizacijom parametara fermentacije, uslova prečišćavanja i formulacija lekova mogu postići poželjniji nivo agregacije od 5% ili niže. Takođe je poželjno postići 70% ili veću efikasnost konjugacije kako bi se minimizirao otpad proizvoda, trošak robe i povećala homogenost proizvoda. Od sada se istraživanje fokusiralo na ispunjavanje i premašivanje ovih specifikacija ekstrapolacijom pravila koja se primenjuju na metode humanizacije zečjih mAt-a.
[0276] 155D5-1 je generisan sledeći standardnu praksu, koja uključuje upotrebu sekvenci humanih germinativnih linija koje su najhomolognije roditeljskim sekvencama. Zbog ove prakse, humana Vκ podfamilija IGKV1-5 je korišćena za humanizovanje 155D5, koja ima procenat identičnosti od 70,5% (podaci nisu prikazani) i koja sadrži Phe83. Alternativne Vκ podfamilije, koje imaju sličan procenat identičnosti (podaci nisu prikazani), takođe su sadržale Phe83 (slika 8). Kako se činilo da ovaj ostatak negativno utiče na efikasnost konjugacije Cis80 i uzrokuje visoku agregaciju, procenjeno je prisustvo ili odsustvo Phe83 u drugim humanim Vκ familijama, uprkos činjenici da je najveća identičnost nađena u ovim familijama Vκ bila niža (68,4%), pa se stoga ne bi obično koristile za humanizovanje 155D5. Budući da sve humane Vκ familije osim IGKV4, IGKV5 i IGKV7 imaju više podfamilija, sve podfamilije su bile poravnane unutar njihove familije (podaci nisu prikazani). Nakon uklanjanja suvišnih sekvenci, ostala je samo jedna sekvenca za svaku od familija IGKV-4, -5, -6, -6D i -7, koja bi mogla biti korišćena za humanizaciju. Za familije IGKV-1, -2 i -3, podfamilija sa najbližom homologijom prema konsenzusu je izabrana kao okvir za humanizovanje 155D5. Preliminarna analiza je pokazala da dok su neke od ovih familija Vκ sadržale Phe83, druge nisu (Tabela 10).
[0277] Da bi se proučio efekat prisustva ili odsustva Phe83 u kontekstu ovih familija Vκ, CDR regioni 155D5 su genetski kalemljeni na humane okvire IGKV1-39*01, IGKV2-40*01, IGKV3-11*01, IGKV4-1*01, IGKV5-2*01, IGKV6-21*01, IGKV6D-41*01 i IGKV7-3*01. IGKV5-2*01 Asn20, koji sadrži N-povezano mesto glikozilacije na ostacima 20, i njegova varijanta Thr20 nisu bili obuhvaćeni ovom analizom, jer prvi zbog heterogenosti nije mogao da se analizira masenom spektrometrijom, a drugi se nije dobro izražavao. IGKV7-3*01 Asn81 nije bio uključen u analizu, jer nije mogao da se analizira masenom spektrometrijom. Međutim, u analizu je uključena varijanta IGKV7-3*01-Glu81. Iz analize su dobijeni sledeći rezultati (Tabela 10):
1. Humanizovano mAt sa sekvencom huIGKV1-39 i koje sadrži Phe83 pokazuje porast agregacije od 0 do 26% nakon oslobađanja; efikasnost konjugacije je bila granično prihvatljiva (68%), ali agregacija koja je > 25% nije;
2. Humanizovano mAt sa sekvencom huIGKV2-40 koje sadrži humane germinativne linije Val83; ovo mAt pokazuje agregaciju < 25% nakon uklanjanja zaštite (11%) i efikasnost konjugacije > 70% (92%). Ovi parametri su bili prihvatljivi, sugerišući da je Val83 humane germinativne linije pogodan za uparivanje sa Cis80 kako bi se omogućila konjugacija Cis80;
3. Humanizovano mAt sa sekvencom huIGKV3-11 je sadržalo Phe83 humane germinativne linije; dok je agregacija bila ispod 25%, efikasnost konjugacije je bila 55%, stoga ne ispunjava kriterijum od > 70%;
4. Humanizovano mAt sa sekvencom huIGKV4-1 je sadržalo je humanu germinativnu liniju Val83; ovo mAt pokazuje agregaciju < 25% nakon uklanjanja cisteinske zaštite (6%) i efikasnost konjugacije > 70% (82%). Ovi parametri su bili prihvatljivi, sugerišući da je humani Val83 pogodan za uparivanje sa Cis80 kako bi se omogućila konjugacija Cis80, kao što je viđeno sa sekvencom huIGKV2-40;
5. Humanizovana mAt-a sa sekvencama huIGKV6-21 ili huIGKV6D-41 koja oba sadrže Ala83 humane germinativne linije; ova mAt-a pokazuju agregaciju < 25% nakon uklanjanja cisteinske zaštite i efikasnost konjugacije > 70%. Ovi parametri su bili prihvatljivi, sugerišući da je Ala83 humane germinativne linije pogodan za uparivanje sa Cis80 kako bi se omogućila konjugacija Cis80, kao što je viđeno sa sekvencom xi155D5; i 6. Humanizovano mAt sa sekvencom huIGKV7-3-Glu81 koje sadrži humanu germinativnu liniju Thr83; ovo mAt pokazuje agregaciju < 25% nakon uklanjanja zaštite (6%) i efikasnost konjugacije blizu 100%. Ovi parametri su bili prihvatljivi, što sugeriše da je Thr83 humane germinativne linije pogodan za uparivanje sa Cis80 kako bi se omogućila konjugacija Cis80.
Tabela 10. Nivoi agregacije i efikasnost konjugacije različitih varijanti zu155D5 generisanih korišćenjem različitih humanih Vκ podfamilija
[0278] Ovi rezultati podržavaju otkriće da položaj 83 negativno utiče na efikasnost konjugacije Cis80 kada ga zauzima fenilalanin i ukazuju da, pored alanina, valin i treonin mogu da supstituišu Fen83 da omoguće konjugaciju Cis80.
[0279] Da bi se potvrdilo da je, u kontekstu drugih mAt-a, Phe83 uključen u izazivanje visoke agregacije nakon oslobađanja i nije pogodan za konjugaciju na Cis80, generisane su humanizovane varijante mAt 1E4 (anti-CA9), 166B3 (anti-CA9) i 33011 (anti-MSLN) koje sadrže ili C-X-X-F ili C-X-X-A.
[0280] Varijante monoklonskih antitela sa motivom C-X-K-F ispunjavaju specifikacije konjugacije, ali ne i specifikacije agregacije, dok su sve varijante humanizovanog mAt koje imaju C-X-X-A pokazale agregaciju manju od 25% i efikasnost konjugacije veću od 70% (tabele 11 i 12). Ove studije pokazuju da je C-X-X-(nije) F ili K motiv koji omogućava ispunjavanje specifikacija konjugacije.
Tabela 11. Nivoi agregacije i efikasnost konjugacije različitih varijanti humanizovanih mAtupoređujući C-X-X-F naspram C-X-X-A i C-X-X-I motiva
1
11
[0281] Pored Ala83, Val83 i Tre83, koji se mogu naći u Vκ sekvencama koje pripadaju huIGKV1-7 podfamilijama germinativne linije, Ile83 se takođe može naći, mada retko, u familiji huIGKV1 germinativne linije. Pošto su Ala83, Val83 i Tre83 već pronađeni kao pogodni za konjugaciju Cis80 (Tabela 9 i Tabela 11), ostalo je da se utvrdi da li će Ile83 biti pogodan ili nepogodan ostatak u odnosu na konjugaciju Cis80. Stoga je generisana humanizovana varijanta mAt 33011 koja sadrži motiv Cis80-Xaa1-Xaa2-Ile83 (takođe se naziva C-X-X-I ili CXXI), koja pokazuje agregaciju manju od 25% i efikasnost konjugacije veću od 70% (Tabela 11), dosledno sa prethodnim testiranim C-X-X-(ne) F motivima. Ovaj rezultat podržava otkriće da, pored Ala83, Val83 i Thr83, Ile83 takođe može da zameni Phe83 kako bi omogućio konjugaciju Cis80 istovremeno ispunjavajući specifikacije konjugacije.
[0282] Otkrivene studije pokazuju da, dok su himerizovana zečja mAt-a pogodna za konjugaciju specifičnu za mesto na Cis80, tek nakon primene otkrivene metode uklanjanja zaštite, kao što je prethodno razmatrano, humanizovana zečja mAt-a koja imaju motiv C-X-X-F ili motiv C-X-X-K nisu pogodna za takve modifikacije usled visoke agregacije nakon uklanjanja zaštite i/ili niske efikasnosti konjugacije. Pretpostavljeno je da ostaci koji okružuju Cis80 mogu igrati ulogu u ovom fenomenu. Budući da Vκ region obuhvata više od 100 ostataka, razumevanje međusobnog delovanja ključnih okolnih ostataka i Cis80 je zahtevalo upotrebu strukturnog modelovanja spojenog sa eksperimentalnim ispitivanjima. Otkriveno je da je Phe83 među ostacima u neposrednoj blizini Cis80 negativno uticao na efikasnost konjugacije Cis80. Takođe je primećeno da su sva zečja mAt-a sadržala Phe83 nakon humanizacije, koristeći klasični pristup humanizacije (SL. 11), uprkos činjenici da humane Vκ sekvence takođe, mogu da sadrže druge aminokiseline u položaju 83, uključujući alanin, treonin, valin i izoleucin. Kada su ove familije Vκ korišćene za humanizaciju, potvrđeno je da su Phe83 i Liz83 dovoljni da humanizovanom mAb daju neželjena svojstva, kao što su visoka agregacija i/ili niska efikasnost konjugacije, dok su preostali aminokiselinski ostaci (sa izuzetkom Cis, koji nije testiran zbog želje da se dobije pojedinačni Cis za konjugaciju) bili pogodni za Cis80 konjugaciju.
[0283] Ovi rezultati sugerišu da prilikom konjugacije na Cis80 treba izbegnuti C-X-X-F motiv i C-X-X-K motiv. Korišćenjem motiva C-X-X-(ne) F ili K, na primer motiva C-X-X-A, C-X-X-T, C-X-X-V i C-X-X-I preko supstitucije Phe83, generisana su himerizovana kao i humanizovana mAt-a koji ispunjavaju željene specifikacije konjugacije.
Afinitet xi155D5 i humanizovanih varijanti
[0284] xi155D5 i humanizovane varijante su prečišćene standardnom protein A hromatografijom ili metodom dekapiranja, a njihov afinitet je analiziran pomoću BIAcore
1 2
(Tabela 13). Postojalo je manje od dvostruke razlike u KD između himernog i humanizovanog 155D5, i mala razlika između uzoraka prečišćenih pomoću dve različite metode.
Tabela 13. BIAcore analiza vezivanja antigena od humanizovanih i himernih 155D5 mAt-a
Primer 3 - Generisanje monoklonskih antitela konjugovanih na mezotelin-auristatin
[0285] Mezotelin (MSLN) je protein na ćelijskoj površini izražen kod raka, uključujući određene tumore jajnika, pluća, pankreasa i mezotelioma. Da bi se poboljšala efikasnost agenasa koji ciljaju MSLN, razvijena su de novo anti-MSLN zečja monoklonska antitela (mAt), koja su potom konstruisana i konjugovana sa auristatinom F (AuF) na Cis80 da bi se dobio panel od MSLN-AuF konjugovanih mAt-a.
Generisanje i karakterizacija zečjih anti-MSLN mAt-a
1
[0286] Novozelandski zečevi (Oryctolagus cuniculus) su imunizovani u Aldevronu (Nemačka) korišćenjem plazmidske DNK koja kodira humani MSLN protein („MSLN“). 52. dana prikupljeni su životinjski serumi koji su kasnije testirani na MSLN vezivanje protočnom citometrijom koristeći ćelije sisara koje privremeno eksprimiraju humani MSLN. SL. 12-D pokazuje da su serumi obe životinje sadržali antitela koja vezuju MSLN. ELISA test je kasnije potvrdio ovaj rezultat (SL. 12E). Zatim su životinje žrtvovane, a sakupljene su mononuklearne ćelije periferne krvi iz krvi kao i limfociti iz slezine i limfnih čvorova i kriokonzervisani.
[0287] Limfociti iz prethodno zamrznutih limfnih čvorova su oporavljeni i tretirani sa DNaza I i Pokeweed mitogenom tokom jednog sata na 37 ° C/5% CO2. Ćelije su prebrojane i zasejane na 5 ćelija/40 µL/bazenčić u kompletnom IMDM medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i citokine (IL-2 i IL-21 pri 10,5 ng/ml) u ploče sa 384 bazenčića koje su prethodno zasejane sa CHO-K1 ćelijama koje izražavaju CD154 kao hranljive ćelije. Ćelije su ponovo hranjene dodavanjem 20 µL/bazenčić istog medijuma kao gore, nakon jedne nedelje. Dve nedelje nakon zasejavanja, sakupljeni su supernatanti kulture B ćelija za skrining kako bi se identifikovali klonovi sa specifičnom reaktivnošću za humani MSLN. Ploče sa ćelijama su zamrznute i čuvane na -80 ° C za buduću izolaciju RNK i amplifikaciju gena. Supernatanti kulture B ćelija su prvi put pregledani na proizvodnju IgG pomoću zečjeg IgG FRET testa. Klonovi koji proizvode IgG (5.775) su odabrani i pregledani upotrebom ELISA tehnike da bi se utvrdilo vezivanje za humani MSLN (prvi skrining). Neki od anti-MSLN-reaktivnih klonova su ponovo testirani (drugi skrining) za reaktivnost prema MSLN, ali ne i na kontrolni antigen (humani CD73). Izabrano je pet mAt i prikazana su u tabeli 14.
Tabela 14. Klonovi sa specifičnom reaktivnošću za humani MSLN
1 4
[0288] Ploče koje sadrže odabrana mAt-a su odmrznute, a B ćelije su lizirane da izoluju RNK pomoću RNAqueous kompleta (Ambion). RNK su korišćene za postavljanje RT-PCR reakcija za amplifikovanje varijabilnih regiona antitela. Dobijene DNK su sekvencirane, a prajmeri su dizajnirani za kompatibilnost sa sistemom kloniranja InFusion HD® kako je opisao proizvođač (Clontech, Mountain View, CA). PCR fragmenti varijabilnog regiona su klonirani u ekspresionom plazmidu koji sadrži ili humani gama ili kapa konstantni region. Ovi plazmidi su transficirani pomoću sistema za ekspresiju FreeStyle 293 (Thermo Fisher Scientific) da bi proizveli monoklonska antitela kako je ovde opisano na drugom mestu.
Generisanje i karakterizacija MSLN-AuF Cis80 konjugovanih mAt-a
[0289] Himerizovana mAt-a su generisana kako je opisano u primeru 2, gde je xi33O11 jedno od pet anti-MSLN mAt, a ostala četiri mAt su himerizovana sledeći isti postupak. Dakle, ova anti-MSLN mAt sadrže nespareni Cis80, specifično, motiv C-X-X-A. Ovde se nazivaju kao xi324O5, xi178F16, xi237N18, xi33O11 i xi383I18.
[0290] Nakon njihove proizvodnje, izabranih pet himerizovanih mAt-a je konjugovano sa auristatinom F (AuF), prema sledećim metodama, da bi se dobilo MSLN-AuF Cis80 konjugovano mAt.
[0291] Prečišćavanje antitela sa „dekapiranjem“: Dekapiranje zečijih/humanih mAt je korak potreban za konjugaciju sa Cis80. Korišćenjem ÅKTA Explorer (GE Healthcare), kolona proteina A (GE Healthcare) uravnotežena je sa 10 CV 20 mM natrijum fosfata, 10 mM EDTA, pH 7,2. Zatim je uzorak uložen, praćen ispiranjem nevezanog materijala sa 10 CV pufera za uravnoteženje. Kolona je isprana sa 16 CV 20 mM natrijum fosfata, 10 mM EDTA, 5 mM cisteina, pH 7,2 pri 0,5 mL/min tokom 16 h. Kolona je zatim isprana sa 60 CV 20 mM Tris-a, pH 7,5 pri 0,5 mL/min tokom 60 h. Uzorak je eluiran upotrebom 5 CV od 0,1 M glicina pH 2,9. Frakcije koje sadrže mAt su objedinjene i dijalizovane u DPBS-u koristeći MWCO 20K Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific). Oporavak proteina je određen BCA testom.
[0292] Konjugacija auristatina F: Prečišćena i oslobođena himerizovana MSLN-mAt-a koja sadrže motiv C-X-X-A su inkubirana sa maleimido-PEG2-auristatinom F (mal-PEG2-AuF) (struktura prikazana niže), razblažena od 10 mM osnovnog rastvora u DMSO (Concortis Biosystems, San Diego, CA) pri molarnom odnosu 5: 1 (AuF: MAt) pri konačnoj koncentraciji antitela od 5 mg/mL u 1x PBS. Konjugacija je izvršena tokom 2 sata na 22 ° C. Neizreagovani mal-PEG2-AuF je uklonjen prečišćavanjem isoljavanjem na AKTA FPLC-u opremljenom sa kolonom za desalinizaciju 26/10 (GE Healthcare) koristeći 1x PBS kao pufer proticanja.
1
Frakcije koje sadrže antitela su objedinjene i koncentracija proteina određena BCA testom.
[0293] Maleimido-PEG2-auristatin F:
[0294] UPLC / ESI-MS analiza: Uzorci su redukovani dodavanjem DTT-a do krajnje koncentracije od 20 mM, praćeno inkubacijom na 60 ° C tokom 3 min. Uzorci su zatim analizirani korišćenjem Waters Acquity UPLC i Q-Tof Premier masenog spektrometra. Uzorci (0,5-2 μg svaki) su injektovani u MassPrep mikro desalinizacionu kolonu na 65 ° C, eluirani iz kolone sa 5-minutnom ekvilibracijom u 95% mobilne faze A, 10-minutnim gradijentom (5-90% B), i 10 minutnom ponovnom ekvilibracijom u 95% mobilne faze A, pri 0,05 mL/min. Mobilna faza A je bila 0,1% mravlja kiselina u vodi. Mobilna faza B bila je 0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu. Maseni spektrometar Q-Tof je radio u pozitivnom jonu, V-modu, sa detekcijom u Opisegu od 500-4000 m/z. Parametri generatora su bili sledeći: kapilarni napon, 2,25 kV (netaknuto antitelo) -2,50 kV (redukovano antitelo); napon konusa za uzorkovanje, 65,0 V (netaknuto antitelo) ili 50,0 V (redukovano antitelo); temperatura izvora, 100 ° C; temperatura uklanjanja rastvarača, 250 ° C; protok gasa za uklanjanje rastvarača, 550 L/sat. Proteinski pik je dekonvoluisan upotrebom funkcije MassLynx MaxEnt 1. Reprezentativna analiza je prikazana na SL. 13. Tipično, ≧ 90% konjugovanih mAt-a je imalo odnos antitela i funkcionalnog agensa 2, što znači da svako himerizovano anti-MSLN mAt nosi molekul AuF konjugovan sa svakim od Cis80<1>i Cis80<2>.
In vitro citotoksičnost
[0295] A431-MSLN su ćelije izvedene od A431 ćelija (ATCC® CRL-1555™) koje stabilno izražavaju humani MSLN. A431-MSLN ćelije su sub-kultivisane i zasejane u ploče sa 96 bazenčića pri 10.000 ćelija/bazenčiću/100 μL u RPMI medijumu koji sadrži 10% FBS-a i inkubirane na 37 ° C, 5% CO2tokom 16 sati. MSLN-AuF Cis80 konjugovana mAt-a su serijski razblažena 1: 4 u 2 mL pločama za razblaživanje u dubokom bazenčiću. Razblažena jedinjenja (100 μL) su dodata na ćelijske ploče, sa krajnjim koncentracijama u rasponu od 0,28-75 μg/ mL. Mal-PEG2-AuF je korišćen pri ekvimolarnoj koncentraciji konjugovanih mAt-a. Na primer, 10 μg/mL MSLN-AuF Cis80 konjugovanog mAt-a (DAR = 2) ujednačava se sa 0,14 μg/mL mal-PEG2-AuF. Ploče su inkubirane na 37 ° C, 5% CO2tokom dodatnih 48 sati. Medijum je
1
odbačen, ploče su isprane jednom sa 200 μL DPBS-a, obojene sa 50 μL 0,2% rastvora kristal violet na 22 ° C tokom 15 minuta, a zatim oprane obilno vodom iz slavine. Ploče su osušene na vazduhu, a kristal violet je rastvorena sa 200 μL 1% rastvora SDS. Kolorimetrijska optička gustina je određena na 570 nm. Excel je korišćen za ekstrapolaciju broja ćelija iz optičkih gustina, a GraphPad Prism 6 za prikazivanje procenta citotoksičnosti.
[0296] Kada su MSLN-negativne A431 ćelije tretirane sa MSLN-AuF Cis80 konjugovanim monoklonskim antitelima, nije primećena značajna citotoksičnost, dok je mal-PEG2-AuF bio citotoksičan samo pri najvišoj ispitivanoj koncentraciji (SL. 14A). Kada su MSLN-pozitivne A431-MSLN ćelije tretirane sa MSLN-AuF Cis80 konjugovanim monoklonskim antitelima, primećena je značajna citotoksičnost. Na osnovu krive doze-odgovora (SL. 14B), MSLN-AuF Cis80 konjugovana mAt-a mogu biti kategorisana u 2 grupe: Srednje citotoksičnosti - xi324O5-AuF i xi178F16-AuF; i Visoke citotoksičnosti - xi237N18-AuF, xi33O11-AuF i xi383I18-AuF.
In vivo evaluacija - Inicijalna selekcija MSLN-AuF Cis80 konjugovanih mAt
[0297] In vivo efikasnost MSLN-AuF Cis80 konjugovanih mAt-a je ispitivana protiv tumora koji izražava MSLN, sa ciljem odabira nekoliko jedinjenja sa visokom efikasnošću i niskom toksičnošću.
[0298] A431-MSLN ćelije su odgajene u ćelijskoj kulturi, suspendovane u medijumu za rast bez seruma, pomešane 1: 1 sa Matrigel™, i 5 miliona ćelija/0,2 mL/miša je implantirano potkožno (s.c.) u atimične NCr nu/nu miševe. Zapremina tumora je određena merenjima pomoću kalibarskog šestara (mm) i korišćenjem formule za elipsoidnu sferu: Dužina x Širina<2>/ 2 = Zapremina (mm<3>). Kada se zapremina tumora kretala od 100-250 mm<3>, miševi su randomizovani u grupe za lečenje. Telesne težine i veličina tumora životinja su beležene dva puta nedeljno. Ukupan dizajn ove studije je rezimiran u Tabeli 15. MSLN-AuF Cis80 konjugovana mAt-a su primenjena intravenski (i.v.) Q7D počevši od dana randomizacije (dan 1), ukupno dve doze.
Tabela 15. Dizajn studije
1
[0299] SL.15 prikazuje prosečne zapremine tumora među različitim lečenim grupama, do dana 18. nakon implantacije, kada su 3 od 8 životinja morale biti eutanazirane u grupi koja je lečena fiziološkim rastvorom zbog velikog opterećenja tumorom i/ili ulceracije tumora. Četvrti dan nakon implantacije odgovara danu kada su miševi randomizovani u različite grupe za lečenje, sa prosečnom zapreminom tumora u Opisegu od 157-160 mm<3>u svim grupama. Ovoga dana je primenjena prva doza MSLN-AuF Cis80 konjugovanih mAt-a praćena drugom dozom 11. dana.
[0300] Sva MSLN-AuF Cis80 konjugovana mAt-a su pokazala antitumorski odgovor, što je dokazano činjenicom da je zapremina tumora 18. dana bila 20% ili manja u poređenju sa grupom koja je tretirana sa fiziološkim rastvorom (Tabela 16). Nasuprot tome, mal-PEG2-AuF nije pokazao antitumorski odgovor.
Tabela 16. Procenat zapremine tumora vs. fiziološkom rastvoru
[0301] Toksičnost je takođe procenjena posmatranjem bilo kog gubitka telesne težine 18. dana (na osnovu prosečne težine životinja u ispitivanju u svakoj grupi) u poređenju sa danom 4, kao i posmatranjem uginulih ili životinja na umoru (Tabela 17). U grupi koja je lečena xi324O5-AuF, primećen je gubitak telesne težine od 11% kod preživelih životinja, kao i kod dve uginule/životinje na umoru. U grupama tretiranim sa xi178F16-AuF, xi237N18-AuF i xi383I18-AuF nije primećen značajan gubitak telesne mase, ali je primećena jedna ili dve uginule/ životinje na umoru. Sve ostale tretmanske grupe nisu pokazale niti gubitak telesne težine, ni uginule/životinje na umoru.
1
Tabela 17. Procena ukupne toksičnosti
[0302] Na osnovu antitumorskih odgovora, kao i minimalne toksičnosti, izabrana su mAt-a xi33O11-AuF i xi237N18-AuF za dalju procenu.
Procena ciljne specifičnosti antitumorske aktivnosti posredovane od strane MSLN-AuF Cis80 konjugovanih mAt
[0303] Metoda korišćena za ovu studiju je bila ista kao što je gore opisano (In vivo evaluacijapočetna selekcija MSLN-AuF Cis80 konjugovanih mAt). Pored A431-MSLN ćelija, koje su implantirane na levi bok svakog miša 4. dana, MSLN-negativne A431 ćelije su implantirane istom mišu na suprotnom (desnom) boku 1. dana. Prve ćelije dovode do rasta tumora brže od drugih, pa su implantirane 3 dana kasnije, tako da je prva doza ispitivanog leka data kada je tumor na oba boka bio slične zapremine. Ukupan dizajn ove studije je rezimiran u Tabeli 18.
Tabela 18. Dizajn studije
[0304] MSLN-pozitivni tumori: SL. 16A prikazuje prosečne tumorske zapremine među različitim lečenim grupama, do 18. dana nakon implantacije, kada su 4 od 8 životinja morale biti
1
eutanazirane u grupi koja je tretirana fiziološkim rastvorom usled velikog opterećenja tumorom i/ili ulceracije tumora. Četvrti dan nakon implantacije odgovara danu kada su miševi randomizovani u različite tretmanske grupe, sa prosečnom zapreminom tumora A431-MSLN u rasponu od 169-178 mm<3>u svim grupama. Toga dana je primenjena prva doza konjugovanih mAt MSLN-AuF Cis80 praćena drugom dozom 11. dana.
[0305] xi33O11-AuF posredovani antitumorski odgovori koji su smanjili zapreminu tumora 18. dana na 12% u poređenju sa grupom koja je tretirana fiziološkim rastvorom (Tabela 19). xi237N18-AuF posredovani antitumorski odgovori koji su smanjili zapreminu tumora na 24% u poređenju sa grupom tretiranom fiziološkim rastvorom (Tabela 19). Neupareni dvostrani t- test je pokazao p vrednost od 0,00039, odnosno 0,00197, sugerišući da su su ovi antitumorski odgovori u odnosu na grupu koja je tretirana fiziološkim rastvorom bili statistički značajni. Suprotno tome, mal-PEG2-AuF ili xi1-55-2-AuF, koji ciljaju endosialin/TEM1, nisu pokazali značajne antitumorske odgovore.
Tabela 19. Procenat zapremine tumora A431-MSLN nasuprot grupi tretiranoj fiziološkim rastvorom
[0306] MSLN-negativni tumori: SL. 16B prikazuje prosečne tumorske zapremine među različitim tretmanskim grupama, do 21. dana nakon implantacije; ovaj dan odgovara 18. danu od A431-MSLN nakon implantacije, kao što je gore opisano, a 7. dan nakon implantacije odgovara danu kada su miševi randomizovani u različite lečene grupe, sa prosečnom zapreminom A431 tumora u rasponu od 174-184 mm<3>u svim grupama. xi33O11-AuF posredovani antitumorski odgovori koji su smanjili zapreminu tumora 21. dana na 78% u poređenju sa grupom tretiranom fiziološkim rastvorom (Tabela 20). xi237N18-AuF Cis80 konjugovano mAt posreduje antitumorske odgovore koji su smanjili zapreminu tumora 21. dana na 64% u poređenju sa grupom tretiranom fiziološkim rastvorom (Tabela 20). Neupareni, dvostrani t-test je pokazao p vrednost od 0,317, odnosno 0,091, sugerišući da ovi antitumorski odgovori u odnosu na grupu
11
koja je lečena fiziološkim rastvorom nisu bili statistički značajni. Ovi odgovori su bili slični onima koji su primećeni kod mal-PEG2-AuF ili xi1-55-2-AuF.
Tabela 20. Procenat zapremine A431 (MSLN-negativan) tumora u odnosu na grupu sa fiziološkim rastvorom
[0307] Toksičnost je takođe procenjena posmatranjem bilo kog gubitka telesne težine 21. dana nakon implantacije ćelija A431 u poređenju sa 7. danom, kao i posmatranjem bilo kojih uginulih ili životinja na izdisaju (Tabela 21). Nije primećen gubitak telesne težine ≧ 10% ni u jednoj od lečenih grupa. Dve smrti su primećene u grupi koja je lečena xi33O11-AuF i xi237N18-AuF.
Tabela 21. Procena ukupne toksičnosti
Zaključak
[0308] Generisana su monoklonska antitela konjugovana na Cis80 sa MSLN-AuF i posmatrana na osnovu in vitro citotoksičnosti i in vivo antitumorske aktivnosti. In vitro analiza citotoksičnosti je pokazala da ova jedinjenja ciljaju i ubijaju MSLN pozitivne, ali ne i MSLN negativne ćelije tumora.
[0309] Sva ispitivana MSLN-AuF Cis80 konjugovana monoklonska antitela su posedovala antitumorsku aktivnost, od kojih su neka pokazala da su potencijalno toksičnija od drugih. Priroda ove toksičnosti nije dalje okarakterisana. Primećeno je da i MSLN-AuF Cis80 konjugovana mAt-a ispitivana in vivo mogu da ciljaju MSLN-pozitivne tumore i inhibiraju njihov rast, dok nije primećen značajan efekat protiv tumora negativnih na MSLN na suprotnom boku. Dok je profil toksičnosti xi237N18 bio sličan u obe studije, tretman xi33O11-AuF nije pokazao toksičnost u prvoj studiji, ali je bio povezan sa dve smrti u drugoj studiji. Priroda ove toksičnosti nije dalje okarakterisana; međutim, kako su miševi tretirani sa xi33O11-AuF i dalje nosili veliki tumor negativan na MSLN na drugom boku i stoga su bili bolesniji od životinja u prvoj studiji, ovi miševi su možda bili osetljiviji na efekat masivne lize tumorskih ćelija nasuprot MSLN-pozitivnom tumoru.
Primer 4 - Stvaranje konjugata antitela i fluorescentne boje
[0310] Monoklonsko antitelo xi155D5 koje sadrži motiv C-X-X-A je konjugovano sa bojom 800CW (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE) da bi se generisalo xi155D5-800CW Cis80 konjugovano mAt koje ima dva molekula boje konjugovanih za Cis80<1>i Cis80<2>.
[0311] Konjugacija 800CW na Cis80 je izvedena upotrebom maleimid-(CH2)2-800CW (LiCor), pri čemu je (CH2)2alkil linker. Ukratko, maleimid-(CH2)2-800CW je rastvoren u 100% DMSO pri konačnoj koncentraciji od 10 mM. Maleimid-(CH2)2-800CV je dodat u xi155D5 (5 mg/ml u 1x PBS), pri molarnom odnosu boje: MAt od 5: 1 i inkubiran tokom 4 sata na sobnoj temperaturi. Boja koja nije inkorporirana je uklonjena desalinizacijom na PD-10 kolonama (Millipore). xi155D5-800CW je dalje poliran putem hromatografije za isključivanje veličine na Superdex 75. Ispražnjen zapreminski materijal je sakupljen, alikvotiran i zamrznut na -80 do upotrebe. SDS-PAGE i analize snimanja redukovanog xi155D5-800CW su pokazale da je boja konjugovana samo na lakom lancu, ali ne i na teškom lancu (SL.17).
[0312] NCR-golim ženkama miševa injektovane su potkožno bilo colo205 ili HT-29 humane tumorske ćelije u desne zadnje udove. Rast tumora je praćen merenjem pomoću kalibarskog šestara. Kada je zapremina tumora bila 200-300 mm<3>, xi155D5-800CW je injektovan preko repnih vena pri 0,1 mg/200 μL/mišu. Za praćenje distribucije xi155D5-800CW putem fluorescentnih živih slika, životinje su smeštene u komoru za anesteziju tokom približno 3-4 minuta uz upotrebu izofluorana/O2dok životinje nisu bile u nesvesti. Životinje su slikane korišćenjem fluorescentne postavke od 745 ekscitacija i 840 emisija u IVIS® Lumina II-Kinetic instrumentu (PerkinElmer, Waltham, MA). Slike leđne, desne, trbušne i leve strane su napravljene u različitim vremenskim tačkama kao što je prikazano na SL. 18. Nakon svake sledeće slike, životinji je omogućeno da se osvesti u komori za oporavak koja prima 100% punjenje kiseonikom praćeno normalnim vazduhom.
[0313] Korišćenjem modela colo205 ili HT-29, primećeno je da je xi155D5-800CW efikasno ciljao humane tumore, što je pokazano lokalizacijom njegovog fluorescentnog signala specifičnom za tumor (SL.18).
[0314] Ovi rezultati su pokazali da mAt koje sadrži motiv C-X-X-(ne) F, K ili C može biti konjugovano sa bojom i da konjugovano mAt može biti korišćeno za identifikaciju i praćenje tumorskog statusa.
Primer 5 - Stvaranje bivalentnih/bispecifičnih molekula za vezivanje antigena
[0315] Kada je mAt koje sadrži motiv C-X-X-(nije) F, K ili C digestovano papainom ili je rekombinantno eksprimirano kao Fab fragment, sadržaće jedan nespareni Cis80 pošto Fab sadrži samo jedan Vκ region. Koristeći ortogonalnu hemiju konjugacije, Fab fragmenti koji sadrže Cis80 mogu biti korišćeni za generisanje hemijski konjugovanih bivalentnih/ bispecifičnih molekula koji vezuju antigen, poput dvovalentnih / bispecifičnih Fab-Fab, koji se mogu koristiti za ciljanje dve nezavisne mete relevantne za bolest, uključujući dva liganda (citokini, hemokini), dva membranska receptora ili kombinacije ligand / receptor, da nabrojimo nekoliko.
[0316] Kao primer, Fab-ovi su generisani iz xi155D5 i xi1-55-2 koristeći ograničenu digestiju papainom, praćenu proteinskom A hromatografijom za uklanjanje Fc fragmenata i nedigestovanog mAt. Pokazalo se da su Fab-ovi potpuno oslobođeni pomoću masene spektrometrije (podaci nisu prikazani). Naknadno, xi155D5 i xi1-55-2 Fab-ovi su konjugovani odvojeno, koristeći maleimido-PEG4-dibenzilciklooktin (DBCO) i maleimido-PEG4-azid, respektivno. Nekonjugovano jedinjenje je uklonjeno desalinizacionom hromatografijom, a potpuna zauzetost položaja Cis80 je potvrđena masenom spektrometrijom (podaci nisu prikazani). Zatim su fragmenti xi155D5-maleimido-PEG4-DBCO i xi1-55-2-maleimido-PEG4-azida konjugovani jedni sa drugima pomoću hemije klike bez bakra promovisane sojem pomoću inkubacije u PBS na 22 ° C tokom 16 sati. Konjugovani proizvodi su frakcionisani upotrebom gel-filtracione hromatografije (SL.19A), a različite vrste su identifikovane pomoću SDS-PAGE na osnovu njihove očekivane molekulske veličine (SL.19B). Frakcije koje sadrže xi155D5/xi1-55-2 bivalentni / bispecifični molekul za vezivanje antigena su objedinjene, a identičnost xi155D5/xi1-55-2 bivalentnog/bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula je potvrđena masenom spektrometrijom na osnovu njegove očekivane mase (95.939 Da, SL.19C).
11
[0317] Bispecifičnost xi155D5/xi1-55-2 bivalentnog/bispecifičnog molekula za vezivanje antigena je potvrđena analizom bioslojne inferometrije (BLI) korišćenjem inverznog sendvič testa. Ova analiza je pokazala vezivanje za imobilisani humani CA9 (vezan od strane xi155D5 Fab ostatka), praćeno vezivanjem rastvorljivog TEM-1 (vezanog xi1-55-2 Fab ostatkom) (SL.
20). Kao što je očekivano, xi155D5 mAt, xi155D5 Fab i xi155D5/xi1-55-2 bivalentni/ bispecifični molekul za vezivanje antigena vezani za imobilizovani CA9. Samo CA9-imobilizovani xi155D5/xi1-55-2 bivalentni/bispecifični molekul koji vezuje antigen je bio sposoban da veže i humani endosialin/TEM-1, kao što je pokazano dodatnim pomeranjem posmatranog odgovora (SL. 20, dvostruka strelica). Analiza površinske plazmonske rezonance je pokazala da je afinitet xi155D5/xi1-55-2 za CA9 ili TEM-1 bio sličan ili neznatno redukovan, respektivno (Tabela 22).
[0318] Ovi rezultati pokazuju da: 1) mAt koje sadrži C-X-X-(ne) F može biti konjugovano sa polipeptidima, kao što je fragment antitela ili Fab; i 2) kada su dva mAt ili Fab fragmenti, različitih specifičnosti, koji sadrže C-X-X- (ne) F ortogonalno konjugovani, može biti generisano dvovalentno/bispecifično jedinjenje.
Tabela 22. Afinitet xi155D5/xi1-55-2 dvovalentnog/bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula za CA9 i TEM-1
Primer 6 - Generisanje konjugata antitela i peptida
[0319] xi33O11 i xi1-55-2 mAt koja sadrže motiv C-X-X-A su bila konjugovana sa azido modifikovanim peptidom Aβ (1-16) (SEK ID BR: 40) (Tabela 23).
Tabela 23. Aβ (1-16) Peptidna sekvenca
[0320] Konjugacija peptida Aβ (1-16) na Cis80 je izvedena korišćenjem postupka konjugacije u dva koraka, pri čemu je Cis80 prvo konjugovan sa maleimido-dibenzilciklooktinom (mal-DBCO). Azido-modifikovani peptid Aβ (1-16) je zatim konjugovan sa DBCO-modifikovanim mAt korišćenjem hemije klika bez bakra promovisane sojem. Ukratko, mAt (20 mg) je inkubirano sa mal-DBCO (Click Chemistry Tools, kat A108) pri molarnom odnosu mal-DBCO: MAt od 5: 1 tokom 16 sati na 22 ° C u 1x DPBS. Neuključeni mal-DBCO je uklonjen iz konjugovanog mAt desalinizacionom hromatografijom korišćenjem HiPrep 26/10 kolone sa 1xDPBS kao puferom proticanja. Efikasnost konjugacije od 100% (nema dokaza o nekonjugovanom lakom lancu) je potvrđena za oba mAt-a pomoću LC-MS (SL.21 i tabela 24). Svako mAt (50 µL/svako, 95 µg i 70 µg od xi1-55-2, odnosno xi33O11) je inkubirano sa peptidom Aβ (1-16) pri molarnom odnosu peptid: MAt od 20: 1 u 1X DPBS tokom 16 sati na 22 ° C. Konjugacije su analizirane pomoću SDS-PAGE. Uzorci su propuštani pod redukcionim uslovima, sa 20 mM DTT kao redukcionim agensom i zagrevanjem do 75 ° C tokom 10 minuta pre razdvajanja.
[0321] Analiza SDS-PAGE je ukazala na usporavanje migracije lakog lanca konjugovanog sa peptidom, praćeno neotkrivenim nekonjugovanim lakim lancem, što ukazuje na efikasnu konjugaciju (SL. 21). Nije primećena promena u pokretljivosti teškog lanca. Konjugacije su zatim desalinizovane pomoću 0,5 ml Zeba 40k MWCO vrtložne kolone za desalinizaciju (Thermo-Fisher) da bi se uklonio nekonjugovani peptid i analizirane pomoću LC-MS. Analiza
11
masene spektrometrije (SL. 22A-F) je pokazala da je peptid konjugovan sa lakim lancima xi1-55-2 i xi33O11 sa efikasnostima od 85% -100% (Tabela 24).
[0322] Ovi rezultati pokazuju da mAt koje sadrži motiv C-X-X-(ne) F, K ili C može biti efikasno konjugovano sa peptidima.
Tabela 24. Rezime konjugacije
Tabela 25. Monoklonska antitela i odgovarajući laki i teški lanac
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
�
�
�
�
11
��
�
��
�
[0323] Stručnjaci u ovoj oblasti će razumeti da se mogu izvršiti brojne promene i modifikacije u poželjnim realizacijama iz pronalaska. Stoga je namera da priloženi zahtevi pokrivaju sve takve ekvivalentne varijacije koje spadaju unutar obima pronalaska.
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
�
1
11
��
�
14
�
1
1
�
�
�
21
22
2
24
�
�
2
2
�
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
�
24
2
�
�
2
2
��
24
��
24
��
24
��
�
21
22
�
��
2
2
2
�
2
�
21
22
�
24
2
�
�
2
2
2
21
22
2
24
2
2
�
2
�
2
21
22
�
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
�
2
�
2
2
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
�
2
�
2
1
2
�
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
44
44
44
44
44
44
44
4
41
42
4
44
4
4
4
4

Claims (19)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Postupak za generisanje konjugovanog imunoglobulina, postupak koji obuhvata:
oslobađanje cisteina na aminokiselinskom položaju 80 („Cis80“) u varijabilnom regionu lakog lanca imunoglobulina izvedenog iz zeca, Cis80 baziran na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja, pri čemu imunoglobulin sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca; i
konjugaciju tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80, pri čemu tiol-reaktivno jedinjenje sadrži tiol-reaktivnu grupu.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, da oslobađanje cisteina obuhvata inkubiranje imunoglobulina sa redukcionim puferom, praćeno inkubiranjem imunoglobulina sa oksidacionim puferom.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 2, naznačen time, da postupak dalje sadrži imobilisanje imunoglobulina na matricu pre inkubiranja sa redukcionim puferom i eluiranje imunoglobulina iz matrice nakon inkubiranja sa oksidacionim puferom.
4. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da
(a) tiol-reaktivno jedinjenje je vezano za funkcionalno sredstvo, gde funkcionalno sredstvo sadrži fluorofor, fluorescentnu boju, polipeptid, imunoglobulin, antibiotik, nukleinsku kiselinu, radionuklid, hemijski linker, mali molekul, helator, lipid ili lek, i/ili (b) tiol-reaktivno jedinjenje je vezano za drugo tiol-reaktivno jedinjenje, drugo tiolreaktivno jedinjenje je vezano za drugi imunoglobulin koji ima varijabilni region drugog teškog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca koji ima cistein na aminokiselinskom položaju 80 („Cis80<2>“), Cis80<2>baziran na sistemu numerisanja prema Kabatu ili Chothia, pri čemu drugo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu vezanu za Cis80<2>, i/ili
(c) Cis80 je neuparen, i/ili
(d) postupak dalje obuhvata supstituisanje aminokiseline na položaju 83 sa aminokiselinskim ostatkom koji nije Fen, Liz ili Cis, položaj 83 baziran na
sistemu numerisanja prema Kabatu ili Chothia.
4
5. Postupak za generisanje molekula za vezivanje antigena, postupak koji obuhvata inkubiranje prvog konjugovanog imunoglobulina sa drugim konjugovanim imunoglobulinom da bi se generisao molekul za vezivanje antigena, naznačen time da:
prvi konjugovani imunoglobulin sadrži varijabilni region prvog teškog lanca i varijabilni region prvog lakog lanca, varijabilni region prvog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 („Cis80<1>“), pri čemu je Cis80<1>konjugovan sa prvim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu, a gde je imunoglobulin izveden iz zeca i Cis80<1>je baziran na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja; a drugi konjugovani imunoglobulin sadrži varijabilni region drugog teškog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 („Cis80<2>), pri čemu je Cis80<2>konjugovan sa drugim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu, a gde je imunoglobulin izveden iz zeca i Cis80<2>je baziran na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja.
6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time, da
(a) Cis80<1>, Cis80<2>ili oba nisu upareni, i/ili
(b) postupak dalje sadrži, pre koraka inkubacije,
oslobađanje Cis80<1>, Cis80<2>, ili oba; i
konjugovanje prvog tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80<1>, drugog tiol-reaktivnog jedinjenja sa Cis80<2>, ili oboje, pri čemu prvo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu i drugo tiol-reaktivno jedinjenje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu.
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5-6, naznačen time što
(a) prvo tiol-reaktivno jedinjenje dalje sadrži prvo funkcionalno sredstvo, drugo tiol-reaktivno jedinjenje dalje sadrži drugo funkcionalno sredstvo, ili oboje, i/ili (b) prvi imunoglobulin je prvi Fab, drugi imunoglobulin je drugi Fab, ili oba, i/ili (c) postupak dalje obuhvata supstituciju aminokiseline na položaju 83 varijabilnog
4
regiona prvog lakog lanca sa aminokiselinskim ostatkom koji nije Fen, Liz ili Cis, supstitucijom aminokiseline na položaju 83 varijabilnog regiona drugog lakog lanca sa aminokiselinskim ostatkom koji nije Fen, Liz ili Cis, ili oboje.
8. Molekul za vezivanje antigena proizveden prema metodi prema bilo kom od patenthih zahteva 5-7.
9. Imunoglobulin izveden iz zeca koji sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, varijabilni region lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 („Cis80“), gde Cis80 nije uparen i aminokiselinu koja nije Fen, Liz ili Cis na položaju 83, pri čemu su Cis80 i položaj 83 bazirani na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja.
10. Imunoglobulin prema patentnom zahtevu 9, gde je Cis80 oslobođen.
11. Imunoglobulin prema patentnom zahtevu 9 ili 10, naznačen time, da:
(A) imunoglobulin se imunospecifično vezuje za humani CA9 i sadrži:
a. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-141 od xi155D5HC (SEK ID BR: 52) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-130 od xi155D5LC (SEK ID BR: 78);
b. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-144 zu155D5HC (SEK ID BR: 54) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20 -130 od zu155D5LC-3 (SEK ID BR: 84), zu155D5LC-4 (SEK ID BR: 86), zu155D5LC-5 (SEK ID BR: 88), zu155D5LC-6 (SEK ID BR: 90), zu155D5LC-7 (SEK ID BR: 92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEK ID BR: 96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEK ID BR: 100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEK ID BR: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEK ID BR: 104); ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEK ID BR: 106);
c. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-138 od xi1E4HC (SEK ID BR: 58) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-130 od xi1E4LC (SEK ID BR: 110);
d. varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiseline 20-140 od zu1E4HC (SEK ID BR: 60) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-130 od zu1E4LC-CXXA (SEK ID BR: 114);
4 1
e. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-142 od xi166B3HC (SEK ID BR: 74) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20 -130 od xi166B3LC (SEK ID BR: 132); ili
f. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-145 od zu166B3HC (SEK ID BR: 76) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-130 od zu166B3LC-CXXA (SEK ID BR: 136), ili
(B) imunoglobulin se imunospecifično vezuje za humani CA9 i sadrži:
a. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi155D5HC kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 146, 148, odnosno 150, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi155D5LC kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 224, 226, odnosno 228;
b. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu155D5HC kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 152, 154, odnosno 156, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu155D5LC-3 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 242, 244, odnosno 246, zu155D5LC-4 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 248, 250, odnosno 252, zu155D5LC-5 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 254, 256, odnosno 258, zu155D5LC-6 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 260, 262, odnosno 264, zu155D5LC-7 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 266, 268, odnosno 270, zu155D5LC-huVK2-40 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 278, 280, odnosno 282, zu155D5LC-huVK4-1 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR 290, 292, odnosno 294, zu155D5LC-huVK6-21, kako je dalje navedeno kao SEK ID BR 296, 298, i 300, respektivno, zu155D5LC-huVK6D-41 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR 302, 304, odnosno 306; ili zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 308, 310, odnosno 312;
c. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi1E4HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 164, 166, odnosno 168, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi1E4LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 320, 322, odnosno 324;
d. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu1E4HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 170, 172, odnosno 174, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu1E4LC-CXXA kako je navedeno kao SEK ID BR: 332, 334, odnosno 336;
e. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi166B3HC kako je navedeno kao SEK ID BR: 212, 214, odnosno 216, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca xi166B3LC kako je navedeno kao SEK ID BR: 386, 388, odnosno 390; ili
f. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca zu166B3HC, kako je navedeno kao SEK ID BR: 218, 220, odnosno 222, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca zu166B3LC-CXXA, kako je navedeno kao SEK ID BR: 398, 400, odnosno 402, ili
(C) imunoglobulin se imunospecifično vezuje za humani TEM1 i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-139 od xi1-55-2HC (SEK ID BR: 56) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-129 od xi1-55-2LC (SEK ID BR: 108), ili
(D) imunoglobulin se imunospecifično vezuje za humani TEM1 i sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi1-55-2HC kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 158, 160, odnosno 162, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi1-55-2LC kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 314, 316, odnosno 318, ili
(E) imunoglobulin se imunospecifično vezuje za humani mezotelin i sadrži:
a. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-142 iz xi33011HC (SEK ID BR: 62) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-131 iz xi33011LC (SEK ID BR: 116);
b. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-145 iz zu33011HC (SEK ID BR: 64) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-131 zu33011LC-CXXA (SEK ID BR: 120) ili zu33011LC-CXXI (SEK ID BR: 122); c. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-137 od xi324O5HC (SEK ID BR: 66) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-127 iz xi324O5LC (SEK ID BR: 124);
d. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-137 od xi178F16HC (SEK ID BR: 68) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-127 od xi178F16LC (SEK ID BR: 126);
e. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-132 od xi237N18HC (SEK ID BR: 70) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-127 od xi237N18LC (SEK ID BR: 128); ili
f. varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiseline 20-137 od xi383I18HC (SEK ID BR: 72) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiseline 20-127 od xi383I18LC (SEK ID BR: 130), ili
(F) imunoglobulin se imunospecifično vezuje za humani mezotelin i sadrži:
4
a. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi33011HC, kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 176, 178, i 180, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi33011LC, kao što je dalje navedeno u SEK ID BR: 338, 340 i 342, respektivno; b. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od zu33011HC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 182, 184 i 186, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od zu33O11LC-CXXA kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 350, 352 i 354, respektivno, ili zu33011LC-CXXI kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 356, 358 i 360, respektivno;
c. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi324O5HC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 188, 190 i 192, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi324O5LC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 362, 364 i 366, respektivno; d. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi178F16HC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 194, 196 i 198, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi178F16LC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 368, 370 i 372, respektivno; e. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi237N18HC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 200, 202 i 204, respektivno, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi237N18LC, kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 374, 376 i 378, respektivno; ili
f. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca od xi383I18HC kao što je dalje navedeno kao SEK ID BR: 206, 208, odnosno 210, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca od xi383I18LC kao što je dalje izneto kao SEK ID BR: 380, 382, odnosno 384.
12. Konjugovani imunoglobulin koji sadrži:
imunoglobulin prema bilo kom od patentnih zahteva 9-11, naznačen time, da je cistein na položaju 80 konjugovan sa tiol-reaktivnim jedinjenjem, tiol-reaktivno jedinjenje koje sadrži tiol-reaktivnu grupu.
13. Konjugovani imunoglobulin prema patentnom zahtevu 12, naznačen time, da tiol-reaktivno jedinjenje dalje sadrži funkcionalno sredstvo, gde funkcionalno sredstvo sadrži fluorofor, fluorescentnu boju, polipeptid, imunoglobulin, antibiotik, nukleinsku kiselinu, radionuklid, hemijski linker, mali molekul, helator, lipid ili lek.
4 4
14. Konjugovani mezotelinski imunoglobulin za upotrebu u postupku za lečenje raka kod subjekta, naznačen time, da konjugovani mezotelinski imunoglobulin sadrži: imunoglobulin iz patentnih zahteva 11(E) ili 11(F), i
tiol-reaktivno jedinjenje koje sadrži tiol-reaktivnu grupu, linker i funkcionalno sredstvo, gde funkcionalno sredstvo sadrži fluorofor, fluorescentnu boju, polipeptid, imunoglobulin, antibiotik, nukleinsku kiselinu, radionuklid, hemijski linker, mali molekul, helator, lipid ili lek.
15. Konjugovani mezotelinski imunoglobulin za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, naznačen time, što je funkcionalno sredstvo auristatin F.
16. Molekul za vezivanje antigena koji sadrži:
prvi konjugovani imunoglobulin koji sadrži varijabilni region prvog teškog lanca i varijabilni region prvog lakog lanca, varijabilni region prvog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 („Cis80<1>“), pri čemu je Cis80<1>konjugovan sa prvim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži prvu tiol-reaktivnu grupu, a gde je imunoglobulin izveden iz zeca i Cis80<1>je baziran na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja; a drugi konjugovani imunoglobulin koji sadrži varijabilni region drugog teškog lanca i varijabilni region drugog lakog lanca, varijabilni region drugog lakog lanca koji ima cistein na položaju 80 („Cis80<2>“), pri čemu je Cis80<2>konjugovan sa drugim tiol-reaktivnim jedinjenjem koje sadrži drugu tiol-reaktivnu grupu, a gde je imunoglobulin izveden iz zeca i Cis80<2>je baziran na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja.
17. Molekul za vezivanje antigena prema patentnom zahtevu 16, naznačen time, što
(a) Cis80<1>, Cis80<2>ili oba, nije uparen, i/ili
(b) aminokiselina na položaju 83 prvog imunoglobulina, aminokiselina na položaju 83 drugog imunoglobulina, ili oba, je aminokiselinski ostatak koji nije Fen, Liz ili Cis, gde je položaj 83 baziran na Kabat ili Chothia sistemu numerisanja, i/ili
(c) prvo tiol-reaktivno jedinjenje dalje sadrži prvo funkcionalno sredstvo, drugo tiol-
4
reaktivno jedinjenje dalje sadrži drugo funkcionalno sredstvo, ili oboje, naznačeno time da prvo i drugo funkcionalno sredstvo sadrži fluorofor, fluorescentnu boju, polipeptid, imunoglobulin, antibiotik, nukleinsku kiselinu, radionuklid, hemijski linker, mali molekul, helator, lipid ili lek, i/ili
(d) prvi imunoglobulin, drugi imunoglobulin ili oba, je/su Fab.
18. Molekula nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulin prema bilo kom od patentnih zahteva 9-11.
19. Ćelija domaćina koja sadrži molekulu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 18.
4
RS20201246A 2015-06-19 2016-06-17 Cis80 konjugovani imunoglobulini RS60943B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562182020P 2015-06-19 2015-06-19
EP16736952.9A EP3310816B1 (en) 2015-06-19 2016-06-17 Cys80 conjugated immunoglobulins
PCT/US2016/038041 WO2016205618A1 (en) 2015-06-19 2016-06-17 Cys80 conjugated immunoglobulins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60943B1 true RS60943B1 (sr) 2020-11-30

Family

ID=56404289

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201246A RS60943B1 (sr) 2015-06-19 2016-06-17 Cis80 konjugovani imunoglobulini

Country Status (32)

Country Link
US (3) US10273310B2 (sr)
EP (2) EP3310816B1 (sr)
JP (2) JP6823606B2 (sr)
KR (1) KR102718129B1 (sr)
CN (1) CN107949575B (sr)
AU (1) AU2016280190B9 (sr)
CA (1) CA2989637C (sr)
CL (1) CL2017003273A1 (sr)
CO (1) CO2017013303A2 (sr)
CY (1) CY1123481T1 (sr)
DK (2) DK3310816T3 (sr)
ES (2) ES2967613T3 (sr)
HR (1) HRP20201489T1 (sr)
HU (2) HUE051315T2 (sr)
IL (1) IL256263B (sr)
LT (1) LT3310816T (sr)
MA (1) MA44207B1 (sr)
MD (1) MD3310816T2 (sr)
MX (1) MX389687B (sr)
MY (1) MY189024A (sr)
PE (1) PE20180498A1 (sr)
PH (2) PH12017502352B1 (sr)
PL (1) PL3310816T3 (sr)
PT (1) PT3310816T (sr)
RS (1) RS60943B1 (sr)
RU (1) RU2756101C2 (sr)
SG (1) SG10201913935RA (sr)
SI (1) SI3310816T1 (sr)
SM (1) SMT202000633T1 (sr)
UA (2) UA129321C2 (sr)
WO (1) WO2016205618A1 (sr)
ZA (2) ZA201708619B (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021090062A1 (en) * 2019-11-07 2021-05-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-mesothelin eribulin antibody-drug conjugates and methods of use
CN115335406B (zh) * 2020-02-12 2026-01-30 伊莱利利公司 抗体或抗原-结合片段的结晶
AU2021284401A1 (en) 2020-06-05 2023-01-05 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-BCMA antibody-drug conjugates and methods of use
CN112694521B (zh) * 2020-12-02 2023-01-17 杭州百凌生物科技有限公司 一种人工多肽lh、其抗体及在病理检测中的应用
CN120813607A (zh) 2023-02-28 2025-10-17 卫材R&D管理有限公司 抗psma抗体、缀合物和使用方法
TW202602943A (zh) 2024-03-22 2026-01-16 日商衛材R&D企管股份有限公司 抗ｔｒｏｐ２抗體藥物偶聯物及使用方法
WO2026044039A2 (en) 2024-08-21 2026-02-26 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-cd73 antibodies, conjugates, and methods of use
WO2026044149A2 (en) 2024-08-21 2026-02-26 Eisai R&D Management Co., Ltd. Synthesis of drug-linker combinations for antibody-drug conjugates
WO2026071051A1 (ja) * 2024-09-27 2026-04-02 東レ株式会社 免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片のキャップ除去のための還元剤

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EE05214B1 (et) * 1998-04-28 2009-10-15 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Polool-IFN- β konjugaat, selle valmistamismeetod ja farmatseutiline kompositsioon
US6904369B1 (en) * 2000-06-29 2005-06-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Conjugated ligands for the stimulation of blood cell proliferation by effecting dimerization of the receptor for stem cell factor
US7402409B2 (en) 2003-01-23 2008-07-22 Epitomics, Inc. Cell fusion method
AU2003259718A1 (en) * 2003-08-07 2005-03-07 Epitomics, Inc. Methods for humanizing rabbit monoclonal antibodies
WO2006017759A2 (en) 2004-08-05 2006-02-16 Kirin Brewery Co., Ltd. Tumor endothelial marker-1 (tem1) binding antibodies and uses thereof
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
GB0428012D0 (en) * 2004-12-22 2005-01-26 Hammersmith Imanet Ltd Radiolabelling methods
AU2008246442B2 (en) * 2007-05-04 2014-07-03 Technophage, Investigacao E Desenvolvimento Em Biotecnologia, Sa Engineered rabbit antibody variable domains and uses thereof
KR20170036814A (ko) * 2007-05-21 2017-04-03 앨더바이오 홀딩스 엘엘씨 신규한 래빗 항체 인간화 방법 및 인간화된 래빗 항체
BRPI0907046A2 (pt) * 2008-01-18 2015-07-28 Medimmune Llc Anticorpo de cisteína engenheirada, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, conjugado de anticorpo, composição farmacêutica, métodos de detecção de câncer, doenças ou distúrbios autoimunes, inflamatórios ou infecciosos em um indivíduo e de inibição de proliferação de uma célula alvo
DK2265283T3 (da) 2008-03-18 2014-10-20 Seattle Genetics Inc Auristatin-lægemiddel-linker-konjugater
WO2010118203A2 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Morphotek, Inc. Endosialin binding molecules
CA2799540A1 (en) * 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
RU2012157167A (ru) * 2010-07-12 2014-08-20 КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед Полифункциональные антительные конъюгаты
CN102008732B (zh) * 2010-11-08 2012-10-24 武汉华耀生物医药有限公司 一种叶酸偶联抗体药物及其制备方法与应用
EP3327037B1 (en) * 2012-08-21 2019-10-09 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Mesothelin domain-specific monoclonal antibodies and use thereof
HUE045144T2 (hu) * 2012-08-29 2019-12-30 Hoffmann La Roche Véragygát-shuttle
SG11201601424PA (en) 2013-08-28 2016-03-30 Stemcentrx Inc Site-specific antibody conjugation methods and compositions

Also Published As

Publication number Publication date
ES2829251T3 (es) 2021-05-31
KR20180021807A (ko) 2018-03-05
JP2020178717A (ja) 2020-11-05
CY1123481T1 (el) 2022-03-24
DK3310816T3 (da) 2020-10-12
AU2016280190B9 (en) 2022-05-19
MY189024A (en) 2022-01-20
CN107949575B (zh) 2022-03-08
UA129321C2 (uk) 2025-03-19
EP3310816A1 (en) 2018-04-25
CA2989637A1 (en) 2016-12-22
MA44207B1 (fr) 2020-11-30
JP7042876B2 (ja) 2022-03-28
PE20180498A1 (es) 2018-03-09
ZA202102093B (en) 2023-03-29
MX389687B (es) 2025-03-20
UA124830C2 (uk) 2021-12-01
PT3310816T (pt) 2020-10-19
EP3310816B1 (en) 2020-09-09
PH12021551939A1 (en) 2022-05-02
JP6823606B2 (ja) 2021-02-03
RU2017146220A (ru) 2019-07-19
SG10201913935RA (en) 2020-03-30
US20230001004A1 (en) 2023-01-05
RU2017146220A3 (sr) 2019-11-07
HUE051315T2 (hu) 2021-03-01
CA2989637C (en) 2023-01-10
US11129904B2 (en) 2021-09-28
ES2967613T3 (es) 2024-05-03
US10273310B2 (en) 2019-04-30
MA44207A (fr) 2018-12-26
AU2016280190B2 (en) 2022-04-28
CO2017013303A2 (es) 2018-03-20
LT3310816T (lt) 2020-11-25
EP3795591A1 (en) 2021-03-24
DK3795591T3 (da) 2024-01-02
EP3795591B1 (en) 2023-09-27
MX2017016674A (es) 2018-08-01
HRP20201489T1 (hr) 2020-12-11
ZA201708619B (en) 2022-11-30
IL256263B (en) 2022-06-01
DK3795591T5 (da) 2024-08-19
US20190202933A1 (en) 2019-07-04
HUE064407T2 (hu) 2024-03-28
MD3310816T2 (ro) 2021-01-31
US20160369011A1 (en) 2016-12-22
CL2017003273A1 (es) 2018-12-21
CN107949575A (zh) 2018-04-20
NZ738496A (en) 2023-08-25
WO2016205618A1 (en) 2016-12-22
IL256263A (en) 2018-02-28
RU2756101C2 (ru) 2021-09-28
PH12017502352B1 (en) 2023-05-26
JP2018526975A (ja) 2018-09-20
BR112017027252A2 (pt) 2018-08-28
HK1252625A1 (en) 2019-05-31
PH12017502352A1 (en) 2018-06-25
PL3310816T3 (pl) 2020-12-14
KR102718129B1 (ko) 2024-10-17
SMT202000633T1 (it) 2021-01-05
AU2016280190A1 (en) 2018-01-18
SI3310816T1 (sl) 2020-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11129904B2 (en) Cys80 conjugated immunoglobulins
US11753669B2 (en) Lysine conjugated immunoglobulins
KR102406610B1 (ko) 혈액-뇌 장벽을 통과이동하는 인간화 항체 및 그의 용도
JP2021523874A (ja) 抗メソセリン抗体およびその抗体薬物コンジュゲート
CN112437675A (zh) 用于消融造血干细胞的抗体药物缀合物
TW202600606A (zh) 抗體連接子結合物
HK40046837A (en) Cys80 conjugated immunoglobulins
HK1252625B (en) Cys80 conjugated immunoglobulins
BR112017027252B1 (pt) Método para geração de uma imunoglobulina conjugada, imunoglobulina derivada de coelho, imunoglobulina conjugada e uso das mesmas
WO2025146137A1 (zh) 抗liv-1抗体药物偶联物及其用途
NZ738496B2 (en) Cys80 conjugated immunoglobulins