RS61003B1 - Postupak za kontrolu koncentracije hi u toku ostatka - Google Patents

Description

KONJUGATI POLIMERA NEUBLASTINA I POSTUPCI ZA NJIHOVU UPOTREBU

Oblast<p>ronalaska

Pronalazak se generalno odnosi na polipeptide i još preciznije na modif i kovane neuro-trofne polipeptide i postupke za upotrebu ovih modifikovanih polipeptida.

Stanjetehnike

Neutrotrofni faktori su proteini koji se prirodno javljaju i koji unapređuju preživljavanje, održavaju fenotipsku diferencijaciju, sprečavaju degeneraciju i pojačavaju aktivnost neuronskih ćelija i tkiva. Neurotrofni faktori su izolovani iz neuralnog tkiva i iz ne-neuralnog tkiva koje je inervisano nervnim sistemom, i klasifikovano je u funkcionalno i strukturno srodne grupe, takođe označene kao familije, superfamilije ili podfamilije. Među superfamilijama neurotrofnih faktora su faktor rasta fibroblasta, neurotrofin i transformišući faktor rasta-(3 (TGF-P) superfamilije. Pojedi-načne vrste neurotrofnih faktora razlikuju se po fizičkoj strukturi, njihovim interakcijama sa sro-dnim receptorima i njihovim delovanjem na različite tipove nervnih ćelija. U TGF-P superfamiiiju klasifikovani su veznici neurotrofnog faktora izvedeni iz glijalnih ćelija (GDNF) koji uključuju GDNF, persefin (PSP) i neurturin (NTN).

Veznicima GDNF podfamilije zajednička je sposobnost da indukuju signaliranje putem RET receptora tirozin kinaze. Ova tri veznika GDNF podfamilije razlikuje se po svojim relativnim afinitetima za famoliju neurotrofnih receptora, GFRa receptore.

Nedavno opisani neurotrofni faktor je "neublastin" ili "NBN". Neublastin je klasifikovan u GDNF podfamiliju zato što ima zajedničke regione homologije sa drugim GDNF veznicima i zbog svoje sposobnosti da se vezuje i aktivira RET. Za razliku od drugih GDNF veznika, neublastin je visoko selektivan za GFRa3-RET kompleks receptora. Sem toga, NBN sadrži jedinstvene podregione u svojoj sekvenci amino kiseline.

Nažalost, neublastin se brzo uklanja u telu. Ovo brzo čišćenje može biti frustrirajuće za upotrebu neublastina u terapeutskim primenama. Prema tome, postoji potreba da se identifikuju varijante neublastina koje imaju povećanu biodostupnost.

Sadržaj<p>ronalaska

Predmetni pronalazak je delom zasnovan na otkriću novih oblika neublastina koji pokazuju poboljšanu farmakokinetiku i biodostupnostin vivo.Ovi novi oblici uključuju varijantu polipeptida neublastina konjugovanih za polimerne molekule.

U jednom aspektu pronalazak okarakteriše varijantu polipeptida neublastina ili polipeptid mutein neublastina, koja uključuje sekvencu amino kiseline koja ima jednu ili više supstitucija amino kiseline na pozicijama izloženim rastvaraču zrelog neublastinskog dimera. Predmetne supstitucije uvode u prirodni polipeptid neublastina na jednom ili više mesta na kojima supstance, kao što su prirodni ili sintetički polimeri, mogu biti pričvršćeni za polipeptid tako da povećaju njegovu rastvorljivost i na taj način njegovu biodostupnost,in vivo.Poželjno, predmetna varijanta polipeptida uključuje sekvencu amino kiseline najmanje 70% identičnu sa amino kiselinama 8-113 SEQ ID BR:1. Varijanta. polipeptida neublastina uključuje jednu ili više supstitucija amino kiseline varijante polipeptida u kojoj se na poziciji 14 javlja druga amino kiselina, a ne arginin u sekvenci amino kiseline varijante polipeptida, u kojoj se na poziciji 39 javlja druga amino kiselina a ne arginin u sekvenci amino kiseline varijante polipeptida, u kojoj se na poziciji 68 javlja druga amino kiselina a ne arginin u sekvenci amino kiseline varijante polipeptida, ili se na poziciji 95 varijante polipeptida javlja druga amino kiselina a ne asparagin, kada je pozicija amino kiselina numerisana u skladu sa sekvencom polipeptida SEQ ID BR:1.

Onako kako se ovde koristi "neublastin divljeg-tipa" ili "dt-NBN" odnosi se na polipeptidnu sekvencu neublastina koja se javlja u prirodi ili koja je prirodna, kao što je ona od pacova, miša ili humanog neublastina (vidi, npr., SEQ ID BR:2, 3 ili 4). Specifične varijante polipeptida neublastina označene su ovde kao "NBN-X1N,X2" ili "XlN,X2-NBN" gde se X, odnosi na amino kiselinu divljeg tipa polipeptida neublastina, N, odnosi se na numeričku poziciju X, amino kiseline u sekvenci, numerisano prema SEQ ID BR:1. X2se odnosi na amino kiselinu koja supstituiše divlji tip amino kiseline na naznačenoj numeričkoj poziciji u sekvenci. Tako, na primer, NBN-N95K identifikuje varijantu polipeptida neublastina u kojoj je asparagin na poziciji 95 zamenjen sa lizinom.

Varijanta polipeptida neublastina može biti obezbeđena kao multimerni polipeptid. Na primer, varijanta polipeptida neublastina može biti obezbeđena kao dimer koji. uključuje najmanje., jednu varijantu polipeptida neublastina. U nekim oblicima dimer je homodimer varijante polipepti-

da neublastina. U drugim oblicima, dimer je heterodimer koji uključuje jednu varijantu polipeptida neubalstina i jedan polipeptid neublastina divljeg tipa. Drugi dimeri mogu uključiti dva različita oblika varijanti polipeptida neublastina.

U nekim oblicima, varijanta polipeptida neublastina uključuje amino kiseline 1-7 SEQ ID BR:1 u dodatku na amino kiseline 8-113.

U poželjnim oblicima, varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, vezuje GFRa.3. U dodatnim poželjinim oblicima, varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, stimuliše fosforilaciju tirozina RET polipeptida, bilo samog bilo kada je vezan za GFRa3.

U još nekim drugim poželjnim oblicima varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, poboljšava preživljavanje neurona, npr., poboljšava preživljavanje senzornog neurona.

U još nekim drugim poželjnim oblicima varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, normalizuje patološke promene neurona, kao što je senzorni neuron.

U još daljim poželjnim oblicima varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, poboljšava preživljavanje neurona, npr., autonomnog neurona ili dopaminergičnog neurona.

U nekim oblicima, varijanta polipeptida uključuje dve, tri ili više supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od amino kiseline koja nije arginin na poziciji 14 u sekvenci amino kiseline varijante polipeptida, amino kiseline koja nije arginin na poziciji 39 u sekvenci amino kiseline varijante polipeptida, amino kiseline koja nije arginin na poziciji 68 u sekvenci amino kiseline varijante polipeptida, amino kiseline koja nije asparagin na poziciji 95 varijante polipeptida.

U poželjnim oblicima amino kiselina na jednoj ili više pozicija 14, 39, 68 i 95 je lizin.

Poželjno, amino kiseline 8-94 i 96-113 varijante polipeptida neublastina su najmanje 90% identične sa amino kiselinama 8-94 i 96-113 SEQ ID BR:1. Još poželjnije, su sekvence amino kiselina identične sa njim 95%. Najpoželjnije, sekvence amino kiseline"varijante polipeptida neublastina uključuju sekvencu amino kiseline koja se prirodno javlja u polipeptidu neublastina pacova, čoveka ili miša na amino kiselinama 8-94 i 96-113 varijante polipeptida neublastina. Na primer, amino kiseline 8-94 i 96-113 varijante polipeptida neublastina mogu uključiti sekvencu amino kiseline amino kiselina 8-94 i 96-113 SEQ ID BR:2, SEQ ID BR;3, ili SEQ ID BR:4.

Pronalaskom su takođe obezbeđeni fuzioni protein ili polipeptid koji uključuje varijantu polipeptida neublastina ili polipeptid neublastina divljeg tipa, ili protein koji je dimer dva fuziona proteina neublastina. Fuzioni proteini neublastina takođe imaju pojačane farmakokinetičke karakteristike i biodostupnostin vivo.

U drugom aspektu pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira varijantu polipeptida neublastina. Nukleinska kiselina koja kodira varijantu polipeptida neublastina je poželjno obezbeđena u vektoru, npr., kao ekspresioni vektor. Varijanta nukleinske kiseline neublastina ili vektor koji je uključuje, mogu se obezbediti u ćeliji. Ćelija može biti, npr., sisarska ćelija, ćelija gljive, ćelija kvasca, ćelija insekta ili bakterijska ćelija. Preferirana sisarska ćelija je ćelija ovarijuma kineskog hrčka (,,CHO ćelija").

Pronalazak takođe obezbeđuje postupak za pripremanje varijante polipeptida neublastina kultivisanjem ćelije koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira varijantu nukleinske kiseline neublastina pod uslovima koji obezbeđuju ekspresiju varijante polipeptida neublastina. Ako je potrebno, varijanta polipeptida neublastina može se obnoviti. Pronalazak dalje uključuje .varijantu polipeptida' "neublastina produkovanu od strane ćelije. Slične nukleiske kiseline, vektori, ćelije domaćini i postupci za produkciju polipeptida su otkriveni ovde za fuzione proteine (kao što su neubiastin-serum albumin fuzioni proteini) ovog pronalaska.

Pronalaskom je takođe obezbeđen preparat koji uključuje polipeptid neublastina ili varijantu polipeptida neublastina spojenu u polimer koji se ne javlja prirodno. Varijanta polipeptida neublastina u jedinjenju poželjno uključuje sekvencu amino kiseline najmanje 70% identičnu ami-

no kiselinama 8-113 SEQ ID BR:1, pod uslovom da varijanta polipeptida neublastina uključuje jednu ili više supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od amino kiselina na poziciji 14 koja nije arginin u sekvenci varijante polipeptida, amino kiseline na poziciji 39 koja nije arginin u sekvenci varijante polipeptida, amino kiseline na poziciji 68 koja nije arginin u sekvenci varijante polipeptida i amino kiseline na poziciji 95 koja nije asparagin varijante polipeptida, gde je pozicija amino kiselina numerisana u skladu sa sekvencom polipeptida SEQ ID BR:1.

U poželjnim oblicima polimer sadrži polialkilen glikolnu grupu, npr., polietilen glikol grupu

(PEG).

U poželjnim oblicima polialkilen glikol grupa je sparena sa amino grupom polipeptida neublastina ili lizinom u varijanti polipeptida neublastina.

Sparivanje se može odigrati preko aktivnog estra N-hidroksilsukcinimida (NHS). Aktivni estar može biti, npr., PEG sukcinimidil sukcinat (SS-PEG), sukcinimidil butirat (SPB-PEG) ili sukcinimidil propionat (SPA-PEG).

Polialkilen glikol grupa može biti, npr., karboksimetil-NHS, norleucin-NHS, SC-PEG, trezilat, aldehid, epoksid, karbonilimidazol ili PNP karbonat.

U nekim oblicima, polialkilen glikol grupa je sparena sa grupom cisteina neblastin polipeptida ili varijante polipeptida neublastina. Na primer, sparivanje se može odigrati preko maleimidne grupe, vinilsulfon grupe, haloacetat grupe i tiol grupe.

U nekim oblicima polipeptid neublastina ili varijanta polipeptida neublastina u preparatu je glikozilirana. Kada je polipeptid neublastina ili varijanta polipeptida neublastina glikozilirana, može biti sparen sa ugljovodoničnom grupom glikoziliranog polipeptida neublastina ili varijantom polipeptida neublastina. Na primer, polimer može biti sparen sa glikoziliranim polipeptidom neublastina ili varijantom polipeptida neublastina nakon oksidacije hidrazol grupe ili amino grupe glikoziliranog polipeptida neublastina ili varijante polipeptida neublastina ili oksidacijom reaktivne grupe polimera.

U različitim oblicima polipeptid neublastina ili varijanta polipeptida neublastina sadrže jednu, dve, tri ili četiri PEG grupe.

U poželjnim oblicima polipeptid neublastina, varijanta polipeptida neublastina ili konjugovani polimer imaju duži polu-život u serumu u odnosu na polu-život polipeptida ili varijante polipeptida u odsustvu polimera.

U poželjnim oblicima polipeptid neublastina, varijanta polipeptida neublastina ili konjugovani polimer u kompleksu ima fiziološku aktivnost odabranu iz grupe koja se sastoji od: GFRo.3 vezivanja, RET aktivacije, normalizacije patoloških pramena neurona ili poboljšanja preži-vljavanja neurona.

Pod "normalizacijom patoloških promena neurona" podrazumeva se da prisustvo konjugata naznačava promenu u jednom ili više od siedećih ćelijskih parametara: ekspresiji nivoa strukturnih proteina, receptora neurotrofnog faktora, jonskog kanala, ili neurotransmitera, ili, indukuje promene u ćelijskoj morfologiji," u svakom slučaju,~tako da gotovu u potpunosti obnavlja takav parametar do njegovog nivoa u neuronu istog ili sličnog fenotipa koji nije narušen bolešću, degeneracijom, povredom ili ranom. Normalizacija patoloških promena neurona može biti praćena imunohistohemijski ili praćenjem promena u nivou sekrecije ispuštanja ćelijskih produkata, ili utvrđivanjem promenain vivo,u fiziologiji ponašanja koja se može pripisati funkciji pogođenog neurona. Na primer, u slučaju patoloških promena vezanih sa sindromom neuropatskog bola mogu biti praćena bolna ponašanja kao što su hiperalgezija, hipoalgezija ili alodinija.

Pod "poboljšavanjem neuronskog preživljavanja" podrazumeva se proširivanje preživlja-vanja pogođenih neurona preko perioda preživljavanja zapaženog kod odgovarajućih neurona pogođenih istim tipom bolesti, poremećaja, povrede ili rane, ali koji nisu tretirani sa konjugatom neublastina ili fuzionim proteinom ovog pronalaska.

U nekim oblicima polimer je konjugovan sa polipeptidom na mestu na neublastinu koje je N terminus. U nekim oblicima polimer je konjugovan za polipeptid na mestu ne-terminalne amino kiseline polipeptida neublastina ili varijante polipeptida neublastina.

U poželjnim oblicima, polimer je sparen sa amino kiselinom izloženom rastvaraču polipeptida neublasina ili varijante polipeptida neublastina.

U poželjnim oblicima, polimer je sparen sa polipeptidom neublastina ili varijantom polipeptida neublastina na ostatku odabranom iz grupe koja se sastoji od amino terminalne amino kiseline varijante polipeptida, poziciji 14 u amino kiselinskoj sekvenci polipeptida neublastina ili varijanti polipeptida neublastina, poziciji 39 u amino kiselinskoj sekvenci polipeptida neublastina ili varijanti polipeptida neublastina, poziciji 68 u amino kiselinskoj sekvenci polipeptida neublastina ili varijanti polipeptida neublastina i poziciji 95 u amino kiselinskoj sekvenci polipeptida neublastina ili varijanti polipeptida neublastina.

Takođe je pronalskom obezbeđen farmaceutski preparat koji sadrži fiziološki prihvatljiv nosač koji sadrži ili ima u sebi dispergovan polipeptid neublastina, varijantu polipeptida neublastina, ili konjugat predmetnog pronalaska.

U daljem aspektu, pronalazak uključuje stabilan, u vodi rastvorljiv konjugovani polipeptid neublastina ili varijantu kompleksa polipeptida neublastina koja sadrži polipeptid neublastina ili varijantu polipeptida. neublastina sparenu sa polietilen glikol grupom, gde je polipeptid neublastina ili varijanta polipeptida neublastina sparena sa polietilen glikol grupom labilnom vezom. U nekim oblicima labilana veza je prekinuta bijohemijskom hidrolizom, proteolizom ili sulfhidrilnim isecanjem. U poželjnim oblicima labilna veza je raskinuta u uslovimain vivo.

Pronalaskom je takođe obezbeđen postupak za pripremanje modifikovanog polipeptida neublastina koji ima produženu aktivnostin vitroiliin vivou odnosu na neubalstin divljeg-tipa obezbeđivanjem polipeptid neublastina ili varijante polipeptida neublastina i sparivanjem polipeptida ili modifikovane varijante neublastina polipeptida za grupu polimera koja se ne javlja u prirodi obezbeđujući tako formiranje polipeptidnog preparata sparenog polimera neublastina.

U daljem aspektu pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje ili prevenciju poremećaja nervnog sistema kod subjekta (kao što je čovek) davanjem subjektu, koji za to ima potrebu, terapeutski efektivne količine varijante polipeptida neublastina, preparata koji sadrži polipeptid neublastina ili varijantu polipeptida neublastina sparenu sa polimerom ili kompleksa koji uključuje stabilan u vodi rastvorljiv konjugovani polipeptid neublastina ili varijantu polipeptida neublastina kompleks koji sadrži polipeptid neublasatina ili varijantu polipeptida neublastina sparenu sa polietilen glikol grupom.

Poželjno, poremećaj nervnog sistema je periferni nervni poremećaj, kao što je periferna ~ neurotrofija ili neuropatski sindrom bola. 'Ljudi su poželjni subjeki za tretman.

Davanje može biti, npr., sistemsko ili lokalno.

Sem ako je drugačije definisano svi tehnički ili naučni termini upotrebljeni ovde imaju isto značenje, kao što je uobičajeno od strane onih sa iskustvom u praksi, kojoj ovaj pronalazak proipada. I ako postupci i materijali slični ili ekvivalentni onim opisanim ovde mogu biti upotrebljeni u primeni ili testiranju pronalaska, pogodni postupci i materijali opisani su niže. Sve publikacije, patentne prijave, patenti i druge reference pomenute ovde inkorporirane su referencom u celini. U slučaju konflikata predmetna specifikacija, uključujući definicije, biće kontrola. Sem toga, matreijali, postupci i primeri su samo ilustracija i nemaju nameru da budu ograničavajući.

Drge karakteristike i prednosti pronalaska biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.

Detaljni o<p>is<p>ronalaska

Pronalazak obezbeđuje novu varijantu polipeptida neublastina koja može biti modifikovana tako da poboljša svoje farmakokinetičke karakteristike i biodostupnost. Preferirana varijanta polipeptida neublastina ima izmenjene sekvence amino kiseline koje olakšavaju sparivanje polimernih agenas kao što je polialkilen glikol polimer.

Varijanta polipeptida neublastina

Pronalazak obezbeđuje polipeptide neublastina koji imaju drugi oblik sekvenci amino kiseline u odnosu na sekvencu polipeptida neublastina divljeg-tipa. Sekvence amino kiseline polipeptida neublastina čoveka i miša otkrivene su u WO 00/01815. Primeri varijante polipeptida neublastina, prema pronalasku, prikazane su u tabeli 1.

Poželjno, izmenjeni ostaci u varijanti polipeptida neublastina odabrani su tako da olakšaju sparivanje polimera kao što je polimer polialkilen glikola na lokaciji modifikovane amino kiseline. Poželjna mesta modifikacije polipeptida neublastina su one na regionima polipeptida neublastina koja su dostupna rastvaraču. Takva mesta mogu biti odabrana na osnovu ispitivanja kristalne strukture srodnog neurotrofnog faktora, GDNF, čija kristalna struktura je opisana u Nat. Struct. Biol. 4:435-38, 1997. Mesta se takođe mogu odabrati na osnovu strukturno-funkcionalne informacije obezbeđene za persefin/neublastin himerične proteine. Ove himere su opisane u J. Biol. Chem. 275:3412-20,^2000. Primerni spisak amino kiselina neublastina koje su dostupne rastvaraču ili površinski izložene, identifikovanih ovom metodologijom dat je u tabeli 2.

Pronalazak uključuje varijantu polipeptida neublastina koja uključuje sekvencu amino kiseline koja je najmanje 70% identična sa amino kiselinama 8-113 SEQ ID BR:1, koja je prikazana u tabeli 1. U nekim oblicima, jedan ili više arginina na poziciji 14, poziciji 39, poziciji 68 ili aspargin na poziciji 95, u sekvenci amino kiseline polipeptida su zamenjeni amino kiselinom koja nije arginin ili asparagin. Poželjno je da je amino kiselina divljeg-tipa zamenjena sa lizinom ili cisteinom.

Konsenzus sekvence:

Ala Gli Xaa, Xaa2Xaa3Arg Ala Arg Xaa4Xaa5Xaa6Ala Arg Gli Cis Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Xaa7Ala Leu Gli His Xaa8Ser Asp Glu Leu Xaag Arg Fen Cis Ser Gli Ser Cis Arg Arg Ala Xaa9Ser Xaa10His Asp Leu Ser Leu Leu Gli Ala Gli Ala Leu Arg XaanPro Pro Gli Ser Arg Pro Xaa12Ser Gln Pro Cis Cis Arg Pro Tre Arg Tir Glu Ala Val Ser Fen Met Asp Val Liz Ser Tre Trp Trp Arg Tre Val Asp Xaa13Leu Ser Ala Tre Ala Cis Gli Cis Leu Gli

gde •

Xaa, je Gli ili Tre

Xaa2je Pro ili Arg

Xaa3je Gli ili Ser

Xaa4je Ala ili Tre

Xaa5je Ala ili Tre

Xaa5je Gli ili Asp

Xaa7 je Arg ili Ser

Xaa8je Arg ili Ser

Xaa9je Val ili Ile

Xaa10 je Pro ili Gln

Xaa,, je Pro ili Ser

Xaa12 je Val ili Ile

Xaa13 je Arg ili His

Tabela 2 obezbeđuje spisak ostataka i brojeva humnog neublastina za koje se očekuje

da su površinski izloženi. Površinski izloženi ostatci su određeni ispitivanjem strukture pacovskog GDNF dimera formiranog od lanaca A i B (PDB kod 1AGQ) i određivanjem da li je ostatak bio

na površini strukture. Ova struktura je zatim upoređena sa poravnatom sekvencom GDNF neublastina u Baloh i sar., Neuron, vol. 21, str 1291, 1998 da se odrede odgovarajući ostatci u neublastinu. Shema numerisanja je ona prikazana u tabeli 1.

n/a naznačava da ostatci nisu prisutni u strukturi GDNF. To je ili zbog dizajna konstrukta, fleksibilnih regiona ili inserata u neublastinu u odnosu na GDNF (ostatci 68-71). - naznačava da su ostatci zatrpani i nisu na površini ili su cisteinski ostatci uključeni u disulfidne veze. Pošto je ovaj protein cisteinski čvor, velika većina ostataka je na površini.

+ naznačava da je taj ostatak izložen na površini u GDNF strukturi i prema tome je predviđen da je na površini izložen u neublastinu, i ako ostatci koji sadrže petlju ostataka 66-75 su vidljivi u samo jednom od GDNF- monomera (verovatno fleksibilni). Ova petlja takođe sadrži 4 ostatka inserta u neublastinu u odnosu na GDNF.

Onako kako se ovde koristi "identičnost" i "homologni" ili "homologija" koriste se naizmenično i odnose se na sličnost 'sekvenci-između dva pilipeptida, molekula ili između dve nukleinske kiseline. Kada je pozicija kod obe od upoređenih sekvenci zauzeta sa istom bazom ili subjedinicom monomera amino kiseline (na primer, ako je pozicija na svakom od dva molekula DNK zauzeta sa adeninom, ili je pozicija na svakom od dva polipeptida zauzeta sa lizinom) onda su odgovarajući molekuli homologi na toj poziciji. Procenat homologije između dve sekvence je funkcija broja poklapanja ili homologih pozicija koje su zajedničke za dve sekvence podeljen sa brojem pozicija koje su upoređene x 100. Na primer, ako je 6 od 10 pozicija u dve sekvence poklopljeno ili su homologe, tada su dve sekvence 60% homologe. Tako na primer, sekvence DNK CTGACT i CAGGTT imaju 50% homologije (3 od 6 ukupnih pozicija se preklapaju). Generalno, poređenje se pravi kada su dve sekvence poredane tako da se dobije maksimalna homologija. Takvo poklapanje može se obezbediti koristeći, na primer, postupak Needleman-a i sar., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), konvencionalno implemetiranog računarskim programima kao što je Align program (DNAstar, Inc.). "Slične" sekvence su one koje, kada su poredane, dele identične ili slične amino kiselinske ostatke, gde su slični ostatci konzervativne supstitucije za, ili "omogućene tačkaste mutacije" od odgovarajućih ostataka amino kiseline u poklopljenoj referentnoj sekvenci. U tom smislu "konzervativna supstitucija" ostatka u referentnoj sekvenci je supstitucija ostatkom koji je fizički ili funkcionalno sličan odgovarajućem referentnom ostatku, npr., koji ima sličnu veličinu, oblik, naelektrisanje, hemijske karakteristike, uključujući sposobnost da formira kovalentne ili vodonične veze ili tome slično. Tako "varijanta konzervativne supstitucije" sekvence je ona koja se razlikuje od referentne sekvence ili sekvence divljeg tipa u tome što su prisutne jedna ili više konzervativnih supstitucija ili dozvoljenih tačkastih mutacija.

U poželjnim oblicima, polipeptid prema pronalasku je 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% identičan amino kiselinama 8-113 SEQ ID BFi:1. U nekim oblicima sekvenca amino kiseline varijante polipeptida neublastina uključuje sekvencu amino kiseline koja se prirodno javlja u polipeptidu neublastina kod pacova, čoveka ili miša na amino kiselinama 1-94 i 96-113 varijante polipeptida neublastina, npr., polipeptid ima sekvencu amino kiseline SEQ ID BR:2, 3 ili 4 na tim pozicijama.

Varijanta polipeptida neublastina koja se razlikuje u sekvenci od one otkrivene u SEQ ID BR:1-4 može uključivati jednu ili više konzervativnih supstitucija amino kiseline. Alternativno, ili u dodatku, varijanta polipeptida neublastina može se razlikovati po jednoj ili više ne konzervativnih supstitucija amino kiseline, ili po delecijama ili insercijama. Poželjno, supstitucije, insercije ili delecije ne ukidaju biološku aktivnost izolovanih proteina.

Konzervativne supstitucije obično uključuju supstituciju amino kiseline sa drugom sa sličnim karakteristikama kao što su supstitucije sa sledećim grupama: valin, alanin i glicin; leucin, valin i izoleucin; asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; asparagin i glutamin; serin, cistein i treonin; lizin i arginin; i fenilalanin i tirozin. Ne polarne hidrofobne amino kiseline uklju-čuju alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan i metionin. Polarne neutralne amino kiseline uključuju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin. Pozitivno naelektrisane (bazne) amino kiseline uključuju arginin, lizin i histidin. Negativno naelektrisane (kisele) amino kiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. Bilo koja supstitucija jednog člana gore pomenutih polarnih, baznih ili kiselih grupa drugim članom iste grupe smatra se konzervativnom supstitucijom.

Druge supstitucije mogu biti lako identifikovane od strane onih sa iskustvom u praksi. Na primer, za amino kiselinu alanin, za supstituciju se može upotrebiti bilo koja od D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteina i D-cisteina. Za lizin zamena može biti bilo koja od D-lizina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina ili D-ornitina. Generalno,

supstitucije u funkcionalno važnim regionima za koje se može očekivati da indukuju promene u karakteristikama izolovanih polipeptida su one u kojima: (i) polarni ostatak, npr., serin ili treonin,

je supstituisan za (ili sa) hidrofobnim ostatkom, npr., leucinom, izoleucinom, fenilalaninom ili

alaninom; (ii) cisteinski ostatak je supstituisan za (ili sa) bilo kojim drugim ostatkom; (iii) ostatak koji ima elektropozitivan bočni lanac, npr., lizin, arginin ili histidin, je supstituisan za (ili sa) ostatkom koji ima elektronegativni bočni lanac, npr., glutaminskom kiselinom ili asparaginskom kiselinom; ili (iv) ostatak koji ima ogroman bočni lanac, npr., fenilalanin je supstituisan za (ili sa) jednim koji nema takav bočni lanac, npr., glicinom. Verovatnoća da jedna od pomenutih ne-konzervativnih supstitucija može izmeniti funkcionalne karakteristike proteina je takođe korelisana sa pozicijom supstitucije u odnosu na funkcionalno važne regione proteina: neke ne-konzervativne supstitucije mogu prema tome imati malo ili biti bez efekta na biološke karakteristike.

Multimerni polipeptidi koji uključuju varijantu neubalstin polipeptida su takođe obezbeđeni pronalaskom. Multimerni polipeptidi su poželjno obezbeđeni kao prečišćeni multimerni polipeptidi. Primeri multimernih kompleksa uključuju, npr., dimerne komplekse. Multimerni kompleks može

biti obezbeđen kao heteromerni ili heteromerni kompleks. Tako, multimerni kompleks može biti heterodimerni kompleks uključujući jednu varijantu polipeptida neuolastina i jednu ne-varijantu neuoblastina ili heterodimerni kompleks uključujući dve ili više varijanti polipeptida neublastina.

U nekim oblicima, varijanta polipeptida neublastina vezuje GFRa3. Poželjno, vezivanje varijante polipeptida neublastina stimuliše fosforilaciju RET polipeptida. Za određivanje da li poli-

"■• peptid vezuje GFRa3, "može biti izveden'ogled kako je" opisano u VVO00/01815. Na "primer,~

prisustvo neublastina u supernatantu medijuma CHO ćelijske linije može biti opisano korišćenjem izmenjenog oblika izabranog kompleksnog ogleda koji su opisali Sanicola i sar. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 6238). U ovom ogledu sposobnost molekula nalik na GDNF može

biti procenjena za sposobnost posredovanja u vezivanju između ekstracelularnog domena RET i različitih ko-receptora, GFRa.1, GFRa2 i GFRa3. Rastvorljivi oblici RET i ko-receptora se stvaraju kao fuzioni proteini. Opisani su fuzioni proteini između ekstracelularnog domena pacovskog RET i placentalne alkalne fosfataze (RET-AP) i fuzioni proteini između ekstracelularnog domena pacovskog GFRa-1 (otkrivenih u objavljenoj prijavi VV09744356; 27 novembar, 1997, ovde inkorporirane referencom) i Fc domen humanog IgGl (rGFR(ccl-lg) (Sanicola i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 6238).

U nekim oblicima, varijanta polipeptida neublastina pomaže preživljavanje neurona, ili normalizaciju patoloških promena neurona ili i jedno i drugo. Ogledi za određivanje da li polipeptid poboljšava preživljavanje neurona, ili normalizaciju patoloških promena neurona su opisani u, npr., VVO00/01815. Poželjno, neuron je senzorski neuron, autonomni neuron, ili dopaminergičnineuron.

Sinteza i izolacija varijante.polipeptida .neublastina

Varijanta polipeptida neublastina može biti izolovana koristeći postupke poznate u praksi.

Polipeptidi neublastina koji se prirodno javljaju mogu se izolovati iz ćelija ili tkiva kao izvora bilo kojom odgovarajućom shemom prečišćavanja koristeći standardne tehnike prečišćavanja proteina. Alternativno, varijanta polipeptida neublastina može biti sintetizovana hemijski koristeći standarne tehnike sinteze peptida. Sinteza kratkih sekvenci amino kiselina je dobro utvrđena u praksi peptida. Vidi, npr., Stevvart i sar., Sinteza čvrste faze peptida (2 izd., 1984).

U drugom obliku, varijante polipeptida neublastina su produkovane tehnikama rekombi-nantne DNK. Na primer, molekul nukleinske kiseline koji kodira varijantu polipeptida neublastina može biti ubačen u vektor, npr., ekspansioni vektor i nukleinska kiselina može biti uneta u ćeliju. Pogodne ćelije uključuju, npr., sisarske ćelije (kao što su ćelije čoveka ili ćelije ovarijuma kineskog hrčka), ćelije gljiva, ćelije kvasca, ćelije insekata i bakterijske ćelije. Kada su ekspri-mirane u rekombinantnoj ćeliji, ćelija je poželjno kultivisana pod uslovima koji omogućuju ekspresiju varijante polipeptida neublastina. Varijanta .polipeptida neublastina može se obnoviti iz suspenzije ćelija ako je potrebno. Pod "obnavljanjem" se podrazumeva da je varijanta polipeptida uklonjena iz onih komponenti medijuma ćelijske kulture u kojima je prisutna pre procesa obnavljanja. Proces obnavljanja može uključiti jedno ili više ponavljanja koraka prečišćavanja.

Varijante polipeptida neublastina mogu se konstruisati koristeći bilo koji od nekoliko metoda poznatih u praksi. Jedan od takvih postupaka je mutageneza usmerena na mesto, u kojoj je specifični nukleotid (ili, ako je potrebno mali broj specifičnih nukleotida) promenjen sa ciljem da se promeni pojedinačna amino kiselina (ili, ako je potrebno mali broj prethodno određenih ostataka amino kiseline) u kodiranom polipeptidu neublastina. Oni sa iskustvom u praksi prepoznaće da je mutageneza usmerena na mesto rutinska i široko korišćena tehnika. U stvari, mnogi kitovi za mutagenezu usmerenu na mesto su komercijalno dostupni. Jedan takav kit je "Transformer Site Directed Mutagenesis Kit" koji prodaje Clontech Laboratories (Palo Alto, Kalifornija).

Praksa predmetnog pronalaska će upotrebiti, sem ako je drugačije naglašeno, konvenci-onalne tehnike ćelijske biologije, ćelijske kulture, molekularne biologije, mikrobiologije, rekombi-nantne DNK, hernije proteina i imunologije, koje su u okviru iskustva u praksi. Takve tehnike su opisane u literaturi. Vidi, na primer, Molekularno kloniranje: Laboratorijski praktikum. (Sambrook, Fritsch i Maniatis, izd.), Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1989; Kloniranje DNK, volumeni I i II (D.N. Glover, izd.), 1985; Sinteza oligonukleotida, (M.J. Gait, izd.) 1984; U.S. Patent br. 4,683,195 (Mullis i sar.,); Hibridizacija nukleinskih kiselina (B.D. Haines i S.J. Higgins,/izd.), Transkripcija i translacija (B.D. Hames i S.J. Higgins, izd.), 1984; Kultura ćelija životinja (R.l. Freshnev, izd). Alan R. Liss, Inc., 1987; Imobilisane ćelije i enzimi, IRL Press, 1986; Praktični vodič za molekularno kloniranje (13.Perbal), 1984; Metodi u enzimologiji, volumeni 154 i 155 (Wu i sar., izd.), Academic Press, New York; Vektori za transfer gena za sisarske ćelije (J.H. Miller i M.P. Calos, izd.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratorv; Immunohernički metodi za ćeliju i molekularnu biologiju (Mayer i Walker, izd.), Academic Press, London, 1987; Praktikum eksperimentalne imunologije, volumeni l-IV (D.M. Weir i C.C. Blackvvell, izd.), 1986; Manipuli-sanje sa embrionom miša, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1986.

Varijanta fuzionog proteina., neublastina

Ako je potrebno, varijanta polipeptida neublastina može se obezbediti kao fuzioni protein. Fuzioni polipeptidi derivati proteina pronalaska takođe uključuju različite strukturne oblike primarnog proteina koji zadržavaju biološku aktivnost. Onako kako se ovde koristi "fuzioni" se odnosi na ko-linearnu kovalentnu vezu dva ili više proteina ili njihovih fragmenata putem njihovih pojedinačnih peptidnih kostura, najpoželjnije preko genetičke ekspresije polinukleotidnog molekula koji kodira ove proteine u istom okviru čitanja (tj., "u okviru"). Poželjno je da proteini ili njihovi fragmenti budu iz različitih izvora. Tako, preferirani fuzioni proteini uključuju varijantu proteina neublastina ili fragmenta koja je kovalentno vezana za drugu grupu koja nije varijanta neublastina. Poželjno, druga grupa je izvedena iz polipeptida koji postoji kao monomer i dovoljna je da donese poboljšane karakteristike rastvorljivosti i/ili biodostupnosti polipeptida neublastina.

Na primer, "varijanta neublastina/fuzioni humani serum albumun" je protein koji sadrži varijantu polipeptida neublastina pronalaska ili njen fragment, čiji je N-terminus ili C-terminus vezan u okvir za humani polipetid serum albumin (vidi Syed i sar, Blood, 1997, 89-3243 i Yeh i sar., P.N.A.S. USA, 89:1904) i US Patente br. 5,876,696 i 5,302,697. Termin "fuzioni protein" dodatno uključuje varijantu neublastina hemijski vezanu preko mono- ili hetero-funkcionalni molekul za drugu grupu koja nije varijanta proteina neublastina i napravljena je de novo iz prečišćenog proteina kao što je opisano niže.

Fuzioni neublastin-serum albumin može se konstruisati koristeći postupke poznate u praksi. Bilo koji od jednog broja unakrsnih-veznika koji sadrži reaktivnu grupu odgovarajuće amino kiseline i tiol reaktivnu grupu, može se upotrebiti da se veže neublastin za serum albumin. Primeri pogodnih veznika uključuju amin reaktivne unakrsne-veznike koji ubacuju tiol reaktivni-maleimid. Oni uključuju, npr., SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH,

KMUS ili GMBS. Drugi pogodni veznici ubacuju tiol reaktivnu-holoacetat grupu.. One uključuju, npr., SBAP, "SIA, SIAB i to obezbeđuje zaštićeni ili nezasićeni tiol za reakciju sa sulfhidrilnim grupama da se produkuje reducibilna veza i takođe SPDP, SMPT, SATA ili SATP koje su sve komercijalno dostupne (npr., Pierce Chemicals). Neko sa iskustvom u praksi može predvideti na sličan način alternativne strategije koje će povezati N-terminus neublastian sa serum albuminom.

Takođe je predviđeno da neko sa iskustvom u praksi može generisati konjugate za serum albumin koji nisu ciljni na N- terminusu NBN ili na tiol grupi na serum albuminu. Ako je potrebno fuzioni NBN-serum albumin može biti generisan koristeći tehnike genetičkog inženje-ringa, gde je NBN fuzionisan sa geno serum albumina na njegovom N-terminusu, C-terminusu ili na oba kraja.

Dalje je zamišljeno da bilo koji NBN konjugat koji rezultira produktom sa produženim poluživotom kod životinja (uključujući čoveka) može biti generisan koristeći sličnu strategiju.

Drugi derivati varijante neublastina uključuju kovelentne ili agregatne konjugate varijante neublastina ili njegovih fragmenata sa drugim proteinima ili polipeptidima kao što je putem sinteze u rekombinantnoj kulturi kao dodatni N-termini ili C-termini. Na primer, konjugovani peptid može biti signalna (ili lider) polipeptidna sekvenca na N-terminalnom regionu proteina koja ko-translatorno ili post-translatorno usmerava transfer proteina_ sa njegovog _mesta sinteze na 'njegovo mestcT fuhkcijonisanja unutar ili izvan ćelijske membrane ili zida (npr., alfa-faktor lider kvasca). Receptorni proteini neublastina mogu sadržati peptide dodate da se olakša prečišćava-

nje ili identifikacija neublastina (npr., fuzioni histidin/neublastin). Sekvenca amino kiseline neublastina može takođe biti vezana za peptid Asp-Tir-Liz-Asp-Asp-Asp-Asp-Liz (DYKDDDDK) (Hoop i sar., Biotechnologv 6:1204, 1988). Poslednja sekvenca je visoko antigena i obezbeđuje epitop reverzibirno vezan specifičnim monoklonalnim antitelom, omogućujući brzo analiziranje i olakšava prečišćavanje eksprimiranog rekombinantnog proteina.

Ova sekvenca se takođe specifično iseca goveđom mukozalnom enterokinazom na ostatku koji sledi odmah nakon Asp-Liz sparivanja.

Varijanta polipeptida. neublastina.konju<g>ovana u polimer

Ako je potrebno, pojedinačni molekul polimera se može upotrebiti za konjugaciju sa polipeptidom neublastina i ako je takođe zamišljeno da više od jednog molekula polimera može takođe biti pričvršćeno. Preparati konjugovanog neublastina pronalaska mogu naći primenu iin vivokao i une-/'n vivoprimenama. Sem toga, biće prepoznato da konjugovani polimer može upotrebiti bilo koje druge grupe, ili druge konjugovane vrste, kao što je odgovarajuće za krajnju primenu. Putem primera može biti korisno u nekim primenama da se kovalentno vezuju za polimer i funkcionalnu grupu dajući otpornost na UV degradaciju, ili antioksidaciju ili druge karakteristike ili osobine polimeru. Kao dalji primer može biti korisno u nekim primenama da se funkcionalizuje polimer da ga učini po osobinama reaktivnim ili sposobnim za unakrsno-vezivanje, da pojača različite karakteristike ili osobine ukupnog konjugacionog materijala. Shodno tome polimer može sadržati bilo koju funkcionalnost ponovljive grupe, veznike ili druge gradivne strukture koje ne sprečavaju efikasnost konjugovanog preparata neublastin muteina u njegovoj namenjenoj svrsi.

Ilustrativni polimeri koji se mogu uobičajno upotrebiti da se postignu ove željene karakteristike opisani su ovde niže u primernim reakcionim shemama. U kovalentno vezanim peptidnim primenama polimer.može biti funkcionalizovan i zatim sparen sa slobodnom amino kiselinom (kiselinama) peptida da se formiraju labilne veze.

U nekim oblicima polipeptid neublaastina je vezan za polimer preko terminalne reaktivne grupe na polipeptidu. Alternativno, ili u dodatku polipeptid neublastina može biti vezan preko amino grupe bočnog lanca untrašnjeg ostatka lizina, npr., ostatka lizina uvedenog u sekvencu amino kiseline polipeptida neublasatina koji se prirodno javlja. Tako, konjugacije mogu takođe biti razgranate od ne terminalnih reaktivnih grupa. Polimer sa reaktivnom grupom(ama) je ovde označen kao "aktivirani polimer". Reaktivna grupa selektivno reaguje sa slobodnom amino ili drugim reaktivnim grupama na proteinu.

Pričvršćivanje se može odigrati na aktiviranom polimeru na bilo kojoj dostupnoj amino grupi neublastina kao što su alfa amino grupe ili epsilon amino grupe ostatka lizina ili ostaci uvedeni u sekvencu amino kiseline polipeptida neublastina ili njegove varijante. Slobodne karboksilne grupe pogodno aktivirane karbonilne grupe, hidroksil, guanidil, imidazol, oksidisane ugljovodonične grupe i merkapto grupe neublastina (ako su dostupne) mogu se takođe upotrebiti kao mesta pričvršćivanja.

Generalno se upotreblajva oko 1.0 do oko 10 mola aktiviranog polimera po molu proteina, u zavisnosti od koncentracije proteina. Konačna količina je balans između maksimi-zovanja obima reakcije dok se minimizuju ne-specifične modifikacije produkta i, istovremeno, definiše hernija koja će održati optimum aktivnosti, dok se istovremeno optimizuje, ako je moguće, polu-život proteina. Poželjno, najmanje oko 50% biološke aktivnosti proteina je očuvano i najpoželjnije blizu 100% je očuvano.

Reakcije se mogu odigrati bilo kojim pogodnim postupkom koji se koristi za reakcije biološki aktivnih materijala sa inertnim polimerima, poželjno na oko pH 5-8, npr., pH 5, 6, 7 ili 8 ako su reaktivne grupe na alfa amino grupi na N-terminusu. Generalno proces uključuje pripremanje aktiviranog polimera i nakon toga reagovanje proteina sa aktiviranim polimerom da se produkuje rastvoreni protein pogodan za formulaciju. Gornja modifikaciona reakcija može se izvesti sa nekoliko postupaka koji mogu uključiti jedan ili više koraka.

Polimer se može spariti sa varijantom polipeptida neublastina koristeći postupke poznate u praksi. Na primer, u jednom obliku, polialkilen glikol grupa je sparena sa grupom lizina polipeptida neublastina ili varijante polipeptida neublastina. Unakrsno vezivanje grupe lizina može se izvesti sa N-hidrokisilsukcinimid (NHS) aktivnim estrom kao što je PEG sukcinimidil sukcinat (SS-PEG) i sukcinimidil propionat (SPA-PEG). Pogodne polialkilen glikol grupe uključuju, npr., karboksimetil-NHS, norleucin-NHS, SC-PEG, trezilat, aldehid, epoksid, karbonilimidazol i PNP karbonat.

Dodatni amin reaktivni PEG veznici mogu biti supstituisani sa sukcinimidil grupom. Oni uključuju, npr., izotiocijanate, nitrofenilkarbonate, epokside i benzotriazol karboanate. Uslovi su poželjno odabrani tako da maksimizuju selektivnost i obim reakcije. Linearni i razgranati oblici PEG mogu se upotrebiti kao i drugi alkil oblici. Dužina PEG se može varirati. Najčešći oblici variraju u dužini od 2K-100K. Dok predmetni primeri iznose da usmerena pegelacija na N-terminusu ne utiče na farmakokinetičke karakteristike, činjenica da materijali zadržavaju fiziološke funkcije naznačava da modifikacija na mestu ili mestima otkrivena ovde nije štetna. Kao posle-dica u generisanju mutantnih oblika NBN koji mogu obezbediti dodatna mesta pričvršćivanja putem insercije lizinskih ostataka, verovatni rezultat će biti da će ovi oblici biti pegilirani i na lizinskom i na N-terminusu, se smatra prihvatljivim.

Ako je potrebno varijante polipeptida neublastina mogu sadržati tag, npr., tag koji naknadno može biti oslobođen proteolizom. Tako, liznska grupa može biti selektivno modifikovana prvo reagovanjem sa negovom his-tag varijantom sa veznikom male molekularne težine kao što je Traut-ov reagens (Pierce) koji će reagovati i sa lizinom i sa N-terminusom i zatim oslobađanjem ovog taga. Polipeptid će tada sadržati slobodnu SH grupu koja može biti selektivno modifikovana sa PEG koji sadrži tiol reaktivnu glavnu grupu kao što je meleimidna grupa, vinilsulfon grupa, holacetat grupa ili slobodna ili zaštićena SH.

Traut-ov reagens može-biti zamenjen sa bilo kojim veznikom koji će postaviti specifično mesto za pričvršćivanje PEG. Na način dat u primerima, Traut-ov reagens može biti zamenjen

sa SPDP, SMPT, SATA ili SATP (svi dostupni od Pierce). Na sličan način protein može reagovati sa amin reaktivnim veznikom koji ubacuje maleimid (na primer SMCC, AMAS, BMPS,

MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS ili GMBS), haloacetat grupa (SBAP, SIA, SIAB) ili vinilsulfon grupa i reagovanjem nastalog produkta sa PEG koji sadrži slobodnu SH. Jedino ograničenje za veličinu veznika koji se upotrebljava je da on ne može blokirati naknadno uklanjanje N-terminalnog taga.

Tako, u drugim oblicima, polialkilen glikol grupa je sparena sa cistein grupom polipeptida neublastina ili varijentom polipeptida neublastina. Sparivanje može biti obavljeno koristeći, npr., maleimid grupu, vinilsulfon grupu, holoacetatnu grupu i tiol grupu.

Jedno ili više mesta na varijanti polipeptida neublastina može biti spareno sa polimerom.

Na primer, jedna, dve, tri, četiri ili pet PEG grupa može biti pričvršćeno za polimer. U nekim oblicima PEG grupa je pričvršćena na amino terminus i/ili amino kiseline 14, 39, 68 i 95 polipeptida neublastina numerisanih kao što je prikazano u tabeli 1.

U poželjnim oblicima varijanta polipeptida neublastina u preparatu ima duži polu-život u serumu u odnosu na polu-život varijente polipeptida u odsustvu polimera. Alternativno, ili u dodatku, varijente polipeptida neublastina u preparatu vezuje GFRa3, aktivira RET, normalizuje patološke promene neurona ili poboljšava preživljavanje neurona _ ili pokazuje. kombinacije ovih_... fizioloških funkcija.

U poželjnim oblicima preparat je obezbeđen kao stabilan, u vodi rastvorljiv konjugovani polipeptid neublastina ili varijenta polipeptida neublastina kompleks koji saadrži polipeptid neublastin ili varijentu polipeptida neublastina sjedinjenu sa polietilen glikol grupom. Ako je potrebno polipeptid neublastin varijenta polipeptida neublastina može biti sjedinjen sa grupom polietilen glikola labilnom vezom. Labilna veza može biti isečena npr., bijohemijskom hidrolizom, proteolizom ili sulfhidrilnim isecanjem. Na primer, veza može biti isečena uin vivo(fiziološkim uslovima).

Farmaceutski preparati koji sadrže konjugate varijante polimera neublastina

Takođe su obezbeđeni farmaceutski preparati uključujući konjugate varijente polipeptida neublastina predmetnog pronalaska. "Farmaceutski preparat" onako kako se koristi ovde defini-san je tako da sadrži protein neublastin ili konjugat pronalaska, dispergovan u fiziološki prihva-tljivom nosaču sadržeći po potrebi, jedan ili više drugih fiziološki kompatibilnih sastojaka. Farmaceutski preparat tako može sadržati ekscipijent, kao što je voda, jedan ili više minerala, šećere, deterdžente i jedan ili više nosača, kao što je inertni protein (npr., heparin ili albumin).

Konjugati polimera neublastina pronalaska mogu se davati sami, kao i u obliku farmaceutski prihvatljivih estara, soli i drugih njihovih fiziološki funkcionalnih derivata. U takvim farmaceu-tskim i medikamentnim formulacijama konjugat varijente neublastina poželjno se koristi zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i po potrebi bilo kojim drugim terapeutskim sastojcima.

Nosači mogu biti farmaceutski prihvatljivi u smislu da su kompatibilni sa drugim sastojcima formulacije i nisu prekomerno štetni za svog primaoca. Varijanta neublastina je obezbeđena u količini efektivnoj da dostigne željeni farmakološki efekt ili medicinski koristan efekt, kao što je ovde opisano i u količini odgovarajućoj da se dostigne željena biodostupnostin vivodoze ili koncentracije.

Formulacija uključuje one pogodne za parenteralno kao i za ne parenteralno davanje i specifični modaliteti davanja uključuju oralno, rektalno, bukalno, površinsko, nazalno, oftalmično, subkutano, intramuskularno, intravenozno, transdermalno, intratrahealno, intraartikularno, intraarte-rijalno, subarahnoidno, bronhijalno, limfatično, vaginalno i intrauterarno davanje. Preferirane su formulacije pogodne za aerosolno i parenteralno davanje, i lokalno i sistemski.

Kada se koristi varijenta neublastina u formulaciji koja sadrži tečni rastvor, korisno je da se formulacija daje oralno, bronhijalno ili parenteralno. Kada se neublastin koristi u formulaciji tečne suspenzije ili kao prah u biokmpatibilnoj nosećoj formulaciji, može biti korisno da se formulacija daje oralno, rektalno ili bronhijalno. Alternativno, ona se može davati nazalno ili bronhijalno, putem nebulizacije praha u nosećem gasu, da se formira gasna disperzija praha koju udiše pacijent iz pumpe za udisanje koju sadrži pogodna naprava nebulizer.

Formulacije koje sadrže proteine predmetnog pronalaska mogu biti konvencionalno predstavljene u oblicima jedinične doze i mogu biti pripremljene bilo kojim od postupaka poznatih u farmacetuskoj praksi. Takvi metodi generalno uključuju korak dovođenja aktivnog sastojka u kontakt sa nosačem koji sadrži jedan ili više aktivnih sastojaka.

Obično su formulacije pripremljene dovodeći uniformno i intimno aktivne sastojke u aso-cijaciju sa tečnim nosačem, konačnim razdvajanjem čvrstog nosača ili oba i zatim, ako je nephodno, oblikovanjem produkta u oblike doze željene formulacije.

Formulacije predmetnog pronalaska pogodne za oralno davanje mogu biti predstavljene kao pojedinačne jedinice, kao što su kapsule, kesice, tablete ili lozenge od kojih svaka sadrži prethodno određenu količinu aktivnog sastojka, kao praha ili granula; ili suspenzije u vodenoj tečnosti ili ne vodenoj tečnosti, kao što je sirup, eliksir, emulzija ili napitak.

Formulacije pogodne za parenteralno davanje konvencionalno sadrže sterilne vodene preparacije aktivnog konjugata, koji je poželjno izotoničan sa krvi primaoca (npr., fiziološki rastvor soli). Takve formulacije mogu uključiti agense suspendovanja i agense popunjavanja ili druge sisteme mikročestica, koji su dizajnirani da usmere jedinjenje u komponenete krvi ili jedan ili više organa. Formulacije mogu biti prezentirane u jediničnoj dozi ili više doznom obliku.

Formulcije nazalnog spreja sadrže prečišćene vodene rastvore aktivnog konjugata sa agensima za očuvanje i izotoničnim agensima. Takve formulacije su poželjno doterane do pH i izotoničnog stanja kompatibilnog sa membranama nazalnog mukusa.

Formulcije za rektalno davanje mogu biti predstavljene kao suspozitorije, sa pogodnim nosačem, kao što je kakao puter, hidrogenizovane masnoće, ili hidrogenizovana masna karbo-ksilična kiselina. Oftalmične formulacije kao što su kapi za oči su pripremljene sličnim postupkom, kao nazalni sprej, sem što su pH i izotonični faktori poželjno doterani tako da se pokla-paju sa onima za oko.

Površinske formulacije sadrže konjugate pronalaska rastvorene ili suspendovane u jednom ili više medijuma kao što su mineralna ulja, petrolej, polihidroksi alkoholi, ili druge baze, koje se koriste za površinske farmaceutske formulacije.

U dodatku na gore pomenute sastojke formulacije ovog pronalaska mogu dalje uključiti jedan ili više dodatnih sastojaka odabranih od razblaživača, pufera, agensa za ukus, dezinte-granata, površinski aktivnih agenasa, popunjivača, podmazivača, prezervativa (uključujući antioksidante) i tome slično. Prethodna razmatranja odnose se takođe na fuzione proteine neublastina pronalaska (npr., fuzione neublastin-HSA).

Shodno tome, predmetni pronalazak obuhvata pribavljanje pogodnih fuzionih proteina za stabilizacijuin vitrokonjugata varijante neublastina u rastvoru kao poželjne ilustrativne primene pronalaska. Fuzioni proteini se mogu upotrebiti, na primer, da se poveća rezistencija na enzi-matsku degradaciju varijente polipeptida neublastina i obezbeđuju načine poboljšanja veka trajanja, stabilnost na sobnoj temperaturi i tome slično. Shavaćeno je da se gore pomenuta razmatranja primenjuju takođe na fuzione proteine neublastin-serum albumina (uključujući humane fuzione proteine neublastin-serum albumina) pronalaska.

P.o_s_tup_ci imtmajia

Varijenta polipeptida neublastina kao i fuzioni proteini ili njihovi konjugati mogu se upotrebiti za tretiranje ili olakšavanje poremećaja ili bolesti živog tela životinje, poželjno sisara, još poželjnije primata uključujući čoveka, poremećaja ili bolesti koji su odgovori na neuropatske agense.

Preparati pronalaska mogu se koristiti direktno preko, npr., injekcija, implatanata ili igestija farmaceutskih preparata da se tretira patološki proces koji reaguje na polipeptide neublastina. Preparati se mogu koristiti za olakšanje poremećaja ili bolesti tela živih životinja, uklju-čujući čoveka, poremećaja i bolesti koje reaguju na aktivnost neurotrofnih agenasa. Poremećaj ili bolest mogu poseno biti oštećenje nervnog sistema uzrokovano traumom, hirurškom intervencijom, ishemijom, infekcijom, metaboličkim bolestima, deficijencijom ishrane, malignitetom ili toksičnim agensima i genetičkim ili idiopatskim procesima.

Šteta posebno može da se dešava na senzornim neuronima ćelija retinalne ganglije, uključujući neurone u dorzalnom korenu ganglije kičmenog stuba ili u bilo kom od sledećih tkiva: genikulatu-, ■ petrozalu i nodoznoj gangliji; vestibuloakustičnom - kompleksu -osmog kranijalnog nerva; ventrolateralnom polu maksilomandibularnog režnja trigeminalne ganglije; i mezence-faličnom trigeminalnom nukleusu.

U poželjnom obliku postupka pronalaska, bolest ili poremećaj je neurodegenerativna bolest koja uključuje lezirane ili tarumatizovane neurone, kao što su traumatske lezije perifernih nerava, medule i/ili kičmene moždine, cerebralne ishemične neuronske štete, neuropatije i posebno periferne neuropatije, tarume perifernog nerva ili povrede, ishemijskog udara, akutnog oštećenja mozga, akutnog oštećenja kičmene moždine, tumora nervnog sistema, multiple skleroze, izlaganja neurotoksinima, metaboličkih bolesti kao što je dijabetes ili bubrežne disfunkcije i štete uzrokovana infektivnim agensima, neurodegenerativnim poremećajima uključujući Alzheimerovu bolest, Hungtington-ovu bolest, Parkinson-ovu bolest, Parkinson-plus sindrome, progresivni supranuklearni Palsy (Steele-Richardson-Olszevvski sindrom), olivoponto-cerebelarna atrofija (OPCA), Shy-Drager sindrom (multipla sistemska atrofija), Guamanian parkinsonizam kompleksna demencija, amiotrofična lateralna skleroza, ili bilo koja druga kongenitalna ili neurodegenerativna bolest, i nedostatak pamćenja vezan za demenciju.

U poželjnom obliku može biti tretiran senzorni i/ili autonomni sistem neurona. Posebno mogu biti tretirani nociceptivni i mehanoreceptivni neuroni, još određenije delta fiber i C-fiber neuroni. Sem toga, mogu biti tretirani simpatrični i parasimpatrički neuroni autonomnog sistema.

U drugom poželjnom obliku mogu biti tretirane bolesti motornih neurona kao što su amiotrofna lateralna skleroza ("ALS") i spinalna muskularna atrofija. U još jednom poželjnom obliku, neoblastin molekuli ovog pronalaska mogu biti korišćeni da se postigne oporavak nerva nakon traumatske povrede. Alternativno ili u dodatku, nervni provodni kanali sa matriksom koji sadrži varijantu polipeptida neublastina ili fuzioni ili konjugate varijante polipeptida neuroblastina mogu biti korišćeni u postupcima opisanim ovde. Takvi nerni sprovodni kanali su otkriveni, npr., patent Sjedinjenih Država br. 5,834,029, inkorporiran ovde referencom.

U poželjnom obliku preparati otkriveni ovde (i farmaceutski preparati koji sadrže isti) su korišćeni u tretmanu perifernih neuropatija. Među perifernim neuropatijama predviđenim za tretman sa molekulima ovog pronalaska su neuropatije indukovane traumom, npr., one uzro-kovane fizičkom povredom ili bolesnim stanjem, fizičkim oštećenjem mozga, fizičkim oštećenjem kičmene moždine, udarom povezanim sa oštećenjem mozga i nurološkim poremećajima vezanim sa neurodegeneracijom. Ovde su takođe uključene one neuropatije sekundarne u odnosu na infekciju, izlaganje ■ toksinima i izlaganje lekovima. Ovde su još uključene one neuropatije sekundarne u odnosu na sistemsku ili metaboličku bolest. Ovde otkriveni preparati mogu takođe biti korišćeni za tretman neuropatija indukovanih hemo terapijom (kao što su one izazvane davanjem hemoterapeutskih agenasa, npr., taksol ili cisplatin); neuropatija indukovanih toksinom, neuropatija indukovanih lekom, neuropatija indukovanih deficijencijom vitamina; idiopatskih neuropatija; i dijabetskih neuropatija. Vidi, npr., patent Sjedinjenih Država 5,496,804 i 5,916,555 koji su svi ovde inkorporirani referencom.

Dodatna stanja koja se mogu tretirati upotrebom ovde otkrivenih preparata su mono-neuropatije, mono-mulipleksneuropatije i poli-neuropatije, uključujući aksonske demijelinizirajuće neuropatije, upotrebom ovde otkrivenih preparata.

U drugom poželjnom obliku, preparati pronalaska (i farmaceutski preparati koji ih sadrže) se koriste u tretmanu različitih poremećaja u očima uključujući gubitak foto receptora u retini kod pacijenta pogođenog sa makularnom degeneracijom, retinitis pigmentosa, glaukomom i sličnim bolestima.

Pronalazak će dalje biti ilustrovan primerima koji slede i koji nisu ograničavajući.

Primer1 -Biodostupnost N-terminalnog pegiliranog neublastina

Zapaženo je da se rekombinatntini humani neublastin izveden iz CHO ćelija brzo očistio iz cirkulacije kada je dat intravenozno pacovima. Proteini nisu uopšte detektovani u serumu nakon subkutanog davanja. Da se poveća biodostupnost neublastina konstruisani su pegilirani oblici.

Pošto nema lizina NBN sekvenci, amin-specifična hernija pegilacije rezultiraće u pegilaciji NBN polipeptida na njegovom amino terminusu. Tako će za svaki neublastinski dimer dve PEG grupe biti pričvršćene. Shodno tome, PEG oblici su prvo usmereni na N-terminus preko amin specifične hernije. Iznenađujuće pegilacija čak sa dva, 20 K pričvršćenih PEG-ova imala je malo koristi u odnosu na polu život, indicirajući da je za mehanizam načina čišćenja najvažniji bio polu život za koji se očekivalo da bude postignut pegilacijom.

Primer2 -Konstrukcija pegiliranog neublastin muteina N95K

Dalje je ispitana biodostupnost NBN mutantnih oblika pegiliranih na unutrašnjim ostacima amino kiselina. Serija od četiri mutanta koji zamenjuju ostatke koji se prirodno javljaju na pozicijama 14, 39, 68 i 95 je dizajnirana da se ubace lizini na odabrana mesta u sekvenci. Lizini bi obezbedili alternativna mesta za pričvršćivanje PEG. Ova mesta su odabrana koristeći kristalnu strukturu GNDF (Nat. Struct. Biol. 4:435-8, 1997) kao mreža da se identifikuju površinski ostaci i ispita mutageneza himere persefin/neublastin (J. Biol. Chem., 275:3412-20, 2000) da se identifikuju funkcionalno važni regioni strukture koja treba da se izbegne.

Dve od mutacija (R39 i R68) su naciljane u regionu koji na osnovu distribucije pozitivnih naelektrisanja na površini može predstavljati mesto vezivanja heparina, karakteristika proteina koja verovatno doprinosi njegovom brzom čišćenju. Treće mesto je naciljano na N95, prirodnom mesto glikozilacije u divljem tipu NBN. Ovo mesto je prirodno modifikovano sa kompleksnom ugljovodoničnom strukturom. Prema tome, nije očekivano da modifikacija sa PEG na tom mestu deluje na funkciju.. Četvrto mesto (R14) je odabrano u regionu koji nije bio pokriven sa bilo kojom drugom modifikacijom. Mutant u kojem je ostatak asparagina na poziciji 95 zamenjen sa lizinom ("N95K mutant") je odabran za ispitivanja koja su ovde obelodanjena.

Konstruisana su četiri različita pacovska muteina koji su sadržali jedan ili više supstituenata u sekvenci divljeg-tipa polipeptida neublastina. Muteini uključuju pojedinačni N95K mutein i muteini koji sadrže pojedinačne supstitucije na drugim mestima u sekvenci amino kiseline neublastina pacova: R14K; R68K'; i R39K. U "X,N,X2" nomenklaturi X, se odnosi na amino kiselinu divljeg tipa polipeptida neublastina, N, se odnosi na numeričke pozicije, X, amino kiselina u sekvenci, numerisano prema SEQ ID BR:1. X2odnosi se na amino kiseline koje su supstituisale amino kiseline divljeg-tipa na identičnim numeričkim pozicijama u sekvenci.

Da se konstruiše pacovska N95K neublastin mutacija, obavljena je mutageneza usmerena na mesto na pCMB020, plazmidu koji kodira neublastin pacova divljeg-tipa. Sekvence amino kiseline neublastina pacova divljeg tipa polipeptida kodiranog njime su predstavljene niže:

Mutageneza pCM020 koristeći oligonukleotide KD2-310 i KD3-211 rezultirala je formira-njem plazmida pCMB027:

U pCMB027, kodon koji kodira asparagin na poziciji 95 je zamenjen sa kodonom koji kodira lizin.

AR14K mutein neublastina formiran zamenom kodona koji kodira arginin na poziciji 14 sa kodonom koji kodira lizin u sekvenci koja kodira neublastin pCMB020. Mutageneza usmerena na mesto je izvedena na pCMB020 koristeći oligonukleotide KD3-254 i KD3-255:

Nastali konstrukt imenovan je pCMB029.

AR68K mutein neublastina formiran zamenom kodona koji kodira arginin na poziciji 68 sa kodonom koji kodira lizin u sekvenci pCMB020 koja kodira neublastin. Mutageneza usmerena na mesto je izvedena na pCMB020 koristeći oligonukleotide KD3-258 i KD3-259:

Nastali konsrukt imenovane je pCMB030

AR39K mutein neublastina formiran zamenom arginina na amino kiselini 39 sa lizinom u sekvenci pCMB020 koja kodira neublastin. Mutageneza usmerena na mesto pCMB027 je izvedena na koristeći oligonukleotide KD3-256 i KD3-257:

Za ekspresiju i prečišćavanje, plazmid koji kodira pacovski NBN N95K mutein je ekspri-miran uE. colikao His-usmereni fuzioni protein sa enterokinaznim mestom kidanja odmah do početka zrele 113 sekvence amino kiseline NBN.E colije odgajena u fermentoru od 500 L obezbeđen je prenos zamrznutih ćelija. ĆelijeE. colisu lizirane u Manton Gaulin Press i pacovski NBN NK je obnovljen iz nerastvoeljivog dela isprane frakcije taloga.

NBN je ekstrahovan iz taloga sa guanidin hlorovodonikom, ponovljen i njegov tag je uklonjem sa enterokinazom. Produkt je zatim podvrgnut hromatografiji na Ni NTA agarozi (Giagen) i na Bakerbond WP CBXkatjon izmenjivačkoj smoli.

Enterokinazni tretman njegovog tagovanog produkta rezultirao je aberantnim isecanjem proteina na argininu 7 u zreloj sekvenci. Nastali des 1-7 NBN produkt bio je potpuno aktivan u KIRA ELISA i strukturno se nije razlikovao od zrelog oblika u njegovoj osetljivosti na dena-turaciju izvanu guanidinom i prema tome je upotrebljen za rad koji sledi.

Pacovski NBN N95K je pegiliran na prošeku od 3.3 PEG grupe/molekulu koristeći metoksilpoli (etilan glikol)-sukcinimidil propionat (SPA-PEG) sa molekularnom masom od 10,000 Da kao reaktantom. Nastali pegilirani produkt je podvrgnut ekstenzivnoj karakterizaciji uključujući analizu sa SDS-PAGE hromatogafiju isključivanja veličine (SEC), HPLC reverzne faze, matriksom posredovane laserske razgradnje/jonizacije masene spektrometrije (MALD/IMS), peptidnog mapiranja, ispitivanja aktivnosti u KIRA ELISA i određivanja sadržaja endotoksina. Čistoća NBN N95K produkta pre pegilacije merena sa SDS-PAGE i SEC bila je viša od 95%. NBN N95K produkt je migrirao pod neredukujućim uslovima kao dimer, konzistentno sa predviđenom strukturom. Nakon pegilacije, nastali produkt se sastojao od serije modifikovanih aduktora koji su sadržali 2 PEG-a/molekul 5% produkta, 3 PEG-a/molekul 60% produkta, 4 PEG-a/molekul 30% produkta i nekoliko minornih oblika više mase. U pegiliranom uzorku nije bilo dokaza o postojanju agregata. Preostali nivoi nemodifikovanog NBN u produktu bili su ispod granica kvantifikacije. Sadržaj endotoksina materijala bio je rutinski manji od 1 EU/mg. Specifična~aktivnost pegiliranog NBN u KIRA EILISA je 10 nM. Pegilirani produkt je formulisan na 1.1 mg/mL u PBS pH 6.5. Materijal, koji je sličan po potencijalu za dt-NBN, može biti isporučen-kao zamrznuta tečnost, koja se čuva na -70°C.

R14K, R39K i R68K muteini su eksprimirani uE. colii mogu biti podvrgnuti istim postupcima prečišćavanja, pegilacije i procene funkcije kao što je opisano gore za N95K-NBN.

P r i prema n je p.egUi r a nag NBN

230 mL ponovo udvostručenog pacovskog NBN N95K (2.6 mg/mL) koji je produkovan uE. colii čuvan na 4°C u 5mM natrijum fosfata pH 6.5, 100 mM NaCI je razblažen sa 77 mL vode, 14.4 mL 1M HEPES pH 7.5 i 2.8 g (10 mg/mL konačno) PEG SPA 10,000 Da (Shearwater Povmers, Inc.). Uzorak je inkubiran na sobnoj temparaturi tokom 4 časa u mraku, zatim tretiran sa 5mM imidazola (konačno), filtriran i čuvan preko noći na 4°C. Produkt je generisan u dva dozatora od kojih je jedan sadržao 130 mL NBN N95K mase i drugi koji je sadržao 100 mL mase. Pegilirani NBN je prečišćen iz reakcione mešavine na Fractogel EMD S03" (M) (EM Industires). Kolona je puštena na sobnoj temparaturi. Svi puferi su pripremljeni bez pirogena. Reakcionoj mešavini je dodan je natrijum hlorid do konačne koncentracije od 87 mM i uzorak je napunjen u Fractogel kolonu od 45 mL (5 cm unutračnji prečnik).

Kolona je isprana sa jednom zapreminom kolone od 5 mM natrijum fosfata pH 6.5, 80 mM NaCI/zatim sa tri zapremine jedne kolone alikvota od 5 mM natrijum fosfata koji je sadržao 50 mM NaCI. Smola je preneta u kolonu prečnika 2.5 cm i pegilirani NBN je ispran iz kolone sa šest koraka od 10 mL koji su sadržali 5 mM natrijum fosfata pH 6.5, 400 mM NaCI, tri koraka koji su sadržali 500 mL NaCI i šest koraka koji su sadržali 600 mM NaCI. Frakcije ispiranja su analizirane na sadržaj proteina apsorpcijom na 280 nm i zatim na obim modifikacije sa SDS-PAGE. Odabrane frakcije su pulirane, filtrirane kroz 0.2 u.m filter i razblažene sa vodom do 1.1 mg pegiliranog pacovskog NBN/mL. Nakon procenjivanja nivoa endotoksina u pojedi-načnim dozama, one su pulirane i ponovo filtrirane kroz 0.2 iim membrane. Konačni materijal je alikvotovan i čuvan na -70°C.

UV spektar prečišćenog pegiliranog NBN NK

UV spektar (240-340 nm) pegiliranog NBN NK je uzet u neto uzorku. Uzorak je analiziran u triplikatu. Pegilirani uzorak pokazao je maksimum apsorpcije na 275-277 nm i minimum apsorpcije na 247-249. Ovaj rezultat je u skladu sa onim koji je opažen za nemodifikovanu masu NBN intermedijera. Koncentracija proteina pegiliranog produkta je procenjena iz spektra koristeći kojeficijent ekstinkcije od Z280<01%>=0.50. Koncentracija proteina pegilirane NBN mase je 1.1 mg/mL. Nije bila prisutna turbidnost u uzorku što je evidentno iz nedostatka apsorbovanja na 320 nm.

Karakterizacija pegiliranog. NBN NK._s.a_ S.DS-PAGE

Alikvoti pegiliranog NBN koji su sadržali 3, 1.5, 0.75 i 0.3u.g produkta bili su podvrgnuti SDS-PAGE na gelu 4-20% gradijenta (Owl). Gel je obojen sa Coomassie briliant blue R-250. Markeri molekularne težine (GIBCO-BRL) su pušteni paralelno.

SDS-PAGE analiza pegiliranog NBN NK pod redukujućim uslovima dala je seriju traka koje odgovaraju modifikacijama 2, 3, 4 i više od 4 PEG-a/molekul. Glavna traka sa očiglednom masom od 98kDa sadrži 3PEG-a/molekul. U prečišćenom pegiliranom produktu nemodifikovani NBN nije detektovan. Prisustvo mešavine produkata sa pričvršćenih 2, 3 i 4 PEG-a verifikovano je sa MALDI masenom spektrometrijskom analizom. Odnos produkta koji je sadržao 2, 3 i 4 PEG-a je određen densitometrijom i određeno je da je 7, 62 i 30 procenta od ukupnog, respektivno.

KatalitexLz_a_cjla_.p_e^

Pegilirani NBN je podvrgnut hromatografiji isključenja veličinena analitičkoj Superose 6 HRIo/30 FPLC koloni koristeći 5 mM MES pH 6.5, 300 mM NaCI kao mobilnu fazu. Kolona je puštena na 20 mL/h. Frakcija ispiranja je praćena u odnosu na apsorpciju na 280 nm. Pegilirani NBN ispran kao pojedinačni pik sa očiglednom molekulskom težinom od oko 200 kDa konziste-ntan je sa velikom hidrodinamičkom zapreminom PEG. Nisu zapaženi dokazi stvaranja agregata. Slobodni NBN koji je ispran sa očiglednom molekulskom masom od oko 30 kDa nije detektovan u preparaciji.

Analiza p_e g i I i ran_o_g„_N B_N.._r_e v.ejrz n_o_m _fazo m H P LC

Pegilirani NBN NK je podvrgnut HPLC reverzne faze na Vydac C4(5u.m, 1x 250 nm) koloni. Kolona je razvijena koristeći 60 mm gradijent od 40 do 60% B (pufer A: 0.1% TFA, pufer B: 75% acetonitril/0.085% TFA). Efluent kolone je praćen na apsorpciju na 214 nm i frakcije su sakupljene za naknadnu analizu. Pegilirani NBN NK je frakcionisan u svoje različite di (60.5 mm), tri (63.3 mm) i tetra (67.8 mm) pegilirane komponenti sa HPLC reverzne faze na C4koloni. Relativni intenziteti pikova sugerišu da su odnosi komponenti 5.4, 60.5 i 30.1%, respektivno. Identiteti pikova su potvrđeni sa MALDI-MS. Nisu postojali dokazi o ne pegiliranim NBN NK (ispiranje na 5-15 mm) u produktu.

Analiza pegiliranog. NBN masenom spektrometrijom

Pegilirani NBN NK je destiliran na C4Zip Tip i analiziran masenom spektrometrijom na Voyager-DE™ STR (PerSeptive Byosistems) matriksom asistiranom laserskom desorpcijom/joni-zacijom time-of-flight (MALDI-TOF) masenim spektrometrom koristeći sinapiničnu kiselinu kao matriks. Na ciljnoj ploči 0.5 uL prečišćenog proteina je izmešano sa 0.5 uL matriksa. Masena spektrometrija pegiliranog NBN je otkrila pojedinačna i dupla naelektrisanja adukta. Zapažene mase od 43803 Da, 54046 Da i 64438 Da su konzistentne sa modifikacijama 2, 3 i 4 PEG-a/molekul.

Ana li za _p_e g i I j ra n_og_N BN _m a pitao jfim_p_e.pt. Ld.a

Specifičnost reakcije pegilacije je procenjena mapiranjem peptida. Pegilirani NBN je razdvojen u di, tri i tetra komponente, koje su zatim redukovane, alkilirane i dalje razdvojene u njihove pojedinačne komponente lanca sa HPLC na C4kolone. Ove komponente i redukovani i alkilirani ne modifikovani NBN NK kao kontrola su digestirani sa Asp-N proteinazom i nastali produkt isecanja je frakcionisan sa HPLC reverzne faze na Vydac C,8(5Lim x 250 mm) koloni koristeći gradijent od 60 mm od 0 do 60% (pufer A: TFA, pufer B: 75% acetonitril/0.085% TFA). Efluent kolone je praćen za apsorpciju na 214 mm.

Pacovska NBN sekvenca sadrži četiri unutrašnje aspartične kiseline i tako je očekivano da daje profil jednostavnog isecanja kada se digestira sa endoproteinazom Asp-N. Svi pikovi iz Asp-N digesta pacovskog NBN NK su identifikovani masenom spektrometrijom i/ili Edman N-terminalnim skvenciranjem i tako se peptidna mapa može upotrebiti kao jednostavno oruđe za probu za mesta modifikacije prisustvom ili odsustvom pika. Identitet različitih pikova je sumarizovan dole u tabeli 3.

Pošto NBN postoji kao homodimer, pacovski NBN NK produkt sadrži četiri potencijalna mesta za pegilaciju, dva N-terminalana amina iz svakog od lanaca i dva N95K mesta koja su ugrađena u konstrukt. U peptidnoj mapi dipegiliranog lanca samo jedan pik koji sadrži peptid sa NK mutacijom je izmenjen sa PEG modifikacijom. Ni jedan od drugih pikova nije pogođen PEG modifikacijom. Podaci mapiranja, prema tome, ukazuju da je PEG grupa specifično pričvršćena za taj peptid, a ne za bilo koje druge peptide koji su pregledani. Drugo potencijalno mesto pričvršćivanja, N-terminus je na peptidu koji je dugačak samo tri amino kiseline i nije detektovan u peptidnoj mapi. Zaključeno je da su dotatna PEG pričvršćivanja na tom mestu. Konzistentno sa ovim zapažanjem je da mali procenat pacovskog NBN NK nije odbačen i sadrži zrelu Ala-1 sekvencu. Ovaj peptid se ispira na 30 um i vidljiv je na peptidnoj mapi iz ne-pegiliranog digesta, ali je odsutan iz pegiliranih NBN NK digesta.

Primer 3. Određivanje potentnosti interno pegiliranog neublastina u aktivaciji receptora kinaze (KIRA) ELISA

Potentnost pegiliranog pacovskog NBN je merena koristeći NBN zavisnu aktiva-ciju/fosforilaciju c-Ret kao reportera za NBN aktivnost u ELISA koja je bila specifična za prisustvo fosforilisanih RET. NB41A3-mRL3 ćelija, pričvršćena mišja ćelijska linija neuroblastoma koja eksprimira Ret i GFRa3, su postavljeni na 2 x 10<5>ćelija po bunarčiću u ploče sa 24 bunarčića u Dulbecco modifikovanom eagle medijumu (DMEM), snabdevenom sa 10% fetalnim goveđim serumom i kultivisanim tokom 18 č na 37°C i 5% C02.

Ćelije su isprane sa PBS, i tretirane sa serijskim razblaženjima NBN u 0.25 mL DMEM tokom 10 min na 37°C i 5% C02. Svaki uzorak je analiziran u duplikatu. Ćelije su isprane sa 1mL PBS i lizirane tokom 1 č na 4°C sa 0.30 mL 10 mM Tris HCI, pH 8.0, 0.5 % Nonidet P40, 0.2% natrijum deoksiholata, 50 mM NaF, 0.1 mM Na3V04, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida uz nežno protresanje ploča. Lizati su dalje mućkani ponovljenim pipetiranjima i 0.25 mL uzorka je preneto u ELISA ploče sa 96-bunarčića koje su bile obavijene sa 5 u.g/mL anti-Ret mAb (AA.GE7.3) u 50 mM karbonatnog pufera, pH 9.6 na 4°C tokom 18 č i blokirani na sobnoj temperaturi tokom jednog časa sa puferom za blokiranje (20 mM Tris HCI pH 7.5, 150 mM NaCI, 0.1 % Tween-20 (TBST) koji je sadržao 1 % normalnog mišjeg seruma i 3 % goveđeg serum albumina).

Nakon dva časa inkubacije na sobnoj temperaturi, bunarčići su isprani 6 puta sa TBST.

Fosforilisani Ret je detektovan inkubiranjem bunarčića na sobnoj temperaturi tokom 2 č sa 2 : g/mL peroksidaze rena (HRP)-konjugovanog anti-fosfotirozin 4G10 antitela u puferu za blokiranje, ispiranje 6 puta sa TBST i merenje HRP aktivnosti na 450 nm sa kolorimetrijskim detekcionim reagensom. Vrednosti apsorpcije iz bunarčića tretiranih sa lizatom ili sa puferom za liziranje merene su i korekcioni signal pozadine je plotovan kao funkcija koncentracije NBN prisutnog u aktivacionoj mešavini. Poientnost pegiliranog NBN u KIRA ELISA bila je 10 nM, što se ne "može razlikovati od NBN NK polaznog materijala. Nije bilo efekta od dva ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja na potentnost i nakon tog tretmana nije bilo značajnog povećanja turbidnosti uzorka, naznačavajući da se uzorci mogu bezbedno odmrznuti za ispitivanje. U nezavisnim ispitivanjima procene aktivnosti produkta sa tri i četiri kDa PEG-a/molekul odvojeno, određeno je da je aduktor sa tri PEG-a bio potpuno aktivan, dok su četiri PEG produkta imala redukovanu aktivnost.

Primer 4. Farmakokinetičke studije interno pegiliranog neublastina kod pacova i miša

Farmakokinetiče karakteristike različitih peiliranih i ne pegiliranih NBN produkata ispitane

su u pacovskim i mišjim modelima.

Podaci su pokazali da je pegilacija NBN NK pacova sa 3.3, 10000 Da PEG-ovima rezultirala značajnim efektom u odnosu na polu život i biodostupnost neublastina. Nakon davanja 1 mg/kg IV kod Sprague Dawley pacova, pik nivoi pegiliranog NBN od 3000 ng/mL detektovani su nakon 7 minuta i nivoi od 700 ng/mL detektovani su nakon 24 č, 200 ng/mL nakon 48 č i 100 ng/mL nakon 72 č. Suprotno u odnosu na ne pegilirane NBN nakon davanja 1 mg/kg IV

nivoi od 1500 ng/mL detektovani su nakon 7 minuta ali su zatim nivoi brzo pali na 70 ng/mL nakon 3 č i nisu se mogli detektovati nakon 7 č. Efekti pegilacije su bili još izraženiji kod -— - životinja tretiranih sa pegiiiranim NBN subkutanim davanjem.

Nakon s.k. davanja 1 mg/kg IV nivoa pegiliranog NBN u cirkulaciji dostigli su maksimum

od 200 ng/mL nakon 24 č i ostali su na tom nivou tokon tri dana istraživanja. Nasuprot tome nisu zapaženi detektabilni NBN u bilo kojoj vremenskoj tački nakon davanja ne modifikovanog

NBN.

Analiza pegiliranih NBN uzoraka je komplikovana prisustvom adukta koji sadrži 2, 3 i 4 PEG-a po molekulu, svaki od kojih će pokazati različit PK profil. U ranim PK ispitivanjima miševi

su upotrebljeni da se olakša skrining kroz mnoštvo kandidata i načina davanja. Ispitivanja na miševima dala su dramatične razlike u biodostupnosfi kandidata. Međutim, kada je adukt 3.3 10

K PEG procenjen kod pacova, nađeno je da ima manju biodostupnost kod pacova nego kod miševa. Ova razlika u biodostupnosti je posebno izražena nakon i.p. davanja. Nivoi kod miševa su dostigli 1600 ng/mL nakon 7 č i ostali su na 400 ng/mL nakon 24 č. Nasuprot tome, nivoi kod pacova su konstantno bili na 100 ng/mL tokom 4-48 č.

I pacoski neublastin divljeg tipa (dt-NBN) i neublastin sa Asn-u-Liz supstitucijom na poziciji 95 (NK-NBN) su ponovo udvostručeni i prečišćeni do >95% radi efikasnog testiranja u modelu STZ pacovske dijabetske neuropatije. Dt-NBN je formulisan da ide direktno u životinju koja se testira dok je NK-NBN pripremljen za pegilaciju sa 10 kDa PEG-SPA. Da se obavi ovaj cilj ponovnog udvostručavanja i prečišćavanja, razvijen je metod ponovnog udvostručavanja koji koristi hromatografiju isključivanja veličine (SEC) koji je omogućio renaturaciju NBN iz inkluzionih telaE. coliu velikim količinama i visokoj koncentraciji. U dodatku na SEC, upotrebljeni su koraci i NiNTA i CM silika kolonske hromatografije da se poveća konačna čistoća proteina. Pro-

teini su podvrgnuti ekstenzivnoj karakterizaciji uključujući analizu sa SDS-PAGE, hromatografiju isključene dužine, ESMS, procenjvanju aktivnosti sa KIRA ELIZA i određivanju sadržaja endotoksina. SDS-PAGE i SEC konačnih produkata proteina naznačili su čistoću veću od 95%.

Nivo endotoksina za svaki produkt bio je <0.2 EU/mg. Specifična aktivnost oba proteina u KIRA ELISA bila je približno 10 nM. Dt-NBN je formulisana na 10 mg/ml i NK-NBN je formulisan na

2.6 mg/ml u slanom rastvoru fosfatnog pufera (PBS) pH 6.5. Dt-NBN je alikvotovan u tube od 15 ml i čuvan zamrznut na -70°C dok je NK-NBN podvrgnut pegilaciji pre aiikvotovanja i zamrzavanja.

Primer 5. Redefinisanje neubla stina divljeg-tipa i N95K muteina neublastina

Oba NBN oblika su eksprimirana uE. colikao His-tagovani fuzioni proteini sa enterokinaznim mestom isecanja neposredno u susedstvu početka zrele sekvence 113 amino kiselina. Bakterije koja je eksprimirala bilo Dt-(1.8 kg talog) ili NK-NBN (2.5 kg talog) bile su podvrgnute lizisu u 2 litra PBS koristeći Gaulin-ovu presu. Nakon centrifugiranj (10,000 rpm) da se istalože inkluziona tela, supernatanti iz svake preparacije su odbačeni. Taloži inkluzionih tela su isprani dva puta sa puferom (0.02M Tris-HCI pH 8.5, 0.5 mM EDTA) zatim isprani dva puta sa istim puferom koji je sadržao Triton X-100 (2%, v/v) praćeno sa dva dodatna ispiranja puferom bez deterdženta. Oba taloga su rastvorena koristeći 6M guanidin hlorovodonik, 0.1 M Tris pH 8.5, 0.1 M DTT i 1 mM EDTA. Da se doprinese procesu rastvaranja svaki talog je podvrgnut homogenizaciji koristeći politronski homogenizator parćeno mešanjem preko noći na sobnoj temperaturi. Rastvorljivi proteini su očišćeni centrifugiranjem pre denaturacione hromatografije kroz Superdex 200 (kolona od 5.5 litara uravnotežena sa 0.05M glicin/H3P04pH 3.0 sa 2M guanidin-HCI) na 20 ml po minutu.

Denaturisani NBN je identifikovan sa SDS-PAGE. Frakcije koje su sadržale bilo Dt-NBN ili NK-NBN su pulirane i koncentrisane do približno 250 mL koristeći Amicon koncentrator ćelija od 2.5-litar sa mešanjem. Nakon filtriranja da se ukloni bilo kakav talog, koncentrisani protein je podvrgnut hromatografiji renaturacije veličine kroz Superdex 200 uravnotežen sa 0.1 M tris-HCI pH 7.8, 0.5M guanidin-HCI, 8,8M redukovani-glutation i 0.22 mM oksidisani glutation. Kolona je razvijena koristeći 0.5M guanidin-HCI na 20 mL po minutu. Frakcije koje su sadržale renaturisani dt-NBN ili NK-NBN su identifikovane sa SDS-PAGE, pulirane i čuvane na 4°C sve dok nije bilo potrebno za uklanjanje His taga.

Koncentrisanje NBN sa Ni-NTA hromatografijom (TR5919-138)

Renaturisani NBN je čuvan na 4°C najmanje 24 časa pre produžetka prečišćavanja da se promoviše formiranje disulfida između monomera NBN. Tokom tog vremena formiran je talog i uklonjen je filtriranjem kroz 0.2 u. PES filter jedinicu. Da se smanji nespecifično vezivanje, rastvor proteina je unet u 20 mM imidazol pre punjenja u 100 ml Ni-NTA (Oiagen) kolonu uravno-teženu sa puferom za kolonu (0.5M guanidin i 20 mM imidazol) pri 50 ml na minut. Nakon primene proteina kolona je isprana do polazne osnove koristeći isti pufer. NBN je ispran iz smo-le koristeći približno 300 mL pufera za ispiranje koji je sadržao 0.5M guanidin-HCI i 0.4M imidazola. Nakon ispiranja NBN je dijaliziran preko noći (koristeći 10 kDa tubiranje za dijalizu) na sobnoj temperaturi prema deset volumena od 5 mM HCI. Dijaliza promoviše hidrolizu kontami-nirajućih supstanci i smanjuje koncentraciju guanidin-HCI i imidazola na 0.05M i 0.04M respektivno.

lsj3£a_njeJiis„te^

Sledećeg dana bilo koji talog koji se formirao tokom dijalize uklonjen je filtracijom.

Uzorak proteina je napravljen od 0.1 M NaCI dodavanjem 5 M štoka konačnoj koncentraciji soli uključujući preostalu guanidin-HCI od približno 150 mM. Ova koncentracija je potvrđena koristeći kondukto metar. Sem toga, 1 N HEPES pH 8 je dodan radi konačne koncentracije od 25 mM. Da se iseče tag dodata je lizil endopeptidaza u dt-NBN i enterokinaza je dodata u NK-NBN, obe u približnom odnosu 1:300 proteaze prema NBN. Enterokinaza je upotrebljena umesto lizil endopeptidaze za NK-NBN zbog dodatnog proteaznog isecanja mesta u mutiranom proteinu na Liz95. Uzorci su mešani na sobnoj temperaturu tokom 2 časa i digestije praćene sa SDS-PAGE.

U k I a n j a n j e. H i s. Ja g_s.a_N LNT A_nmm.ato_ rafijom

NBN tretiran proteazom primenjen je na kolonu od 100ml Ni-NTA uravnoteženu sa 0.5M guanidin-HCI i 20 mM imidazola na 50 mL po minutu. Kolona je isprana do polazne osnove sa~istim puferom. Ispirci bilo kog proteina kolone su pulirani sa puštanjem mlaza kroz protein koji je sadržao NBN bez His taga.

CM silika_.hromaIo.g_afjja

Nakon Ni-NTA hromatografije protein je odmah podvrgnut daljem prečišćavanju kroz CM

silika smolu. Kolona od 20 mL CM silika uravnotežena sa puferom za punjenje (5 mM fosfat pH

6.5, 150 mM NaCI) je napunjena sa NBN pri 20 mL po minutu. Kolona je isprana sa 20 kolonskih zapremina pufera za ispiranje (5 mM fosfat pH 6.5, 400 mM NaCI) i proteinski korak ispiranja sa puferom za ispiranje koji je sadržao 5 mM fosfat pH 6.5, ali sa 1 M NaCI. Isprani protein je dijaliziran preko noći protiv samog fosfata da se koncentracija soli spusti do 100 mM

za NK-NBN i 150 mM dt-NBN. Oba uzoraka su filtrirana kroz 0.2 u. PES filter jedinicu, analizi-

rana sa SDS-PAGE i čuvana na 4°C sve dok nisu bila potrebna za dalju karakterizaciju i/ili pegilaciju.

dt-NBN i NK-NBN su podvrgnuti analizi UV spektrom da se proceni njihova apsorpcija

na 280. Koristeći mikro kvare kivetu i sam pufer kao šlepu probu, 100 (il bilo dt-NBN ili NK-

NBN je kontinuirano skanirano od 230-330 nm koristeći Beckman-ov spektrofotometar. Na osnovu ove analize određeno je da dt-NBN ima koncentraciju od 1.1 mg/ml i NK-NBN na 2.6 mg/ml (A 280 nm-E<ol%>=0.5 upotrebljeno za svaki protein). Manje od 1% istaloženog materijala je identifikovano na osnovu apsorpcije na 330 nm/ "

Da se proceni čistoća obe proteinske preparacije svaki uzorak (0.5 mg) je podvrgnut hromatografiji isključenja veličine kroz kolonu 16/30 Supradex 75. Kolona je uravnotežena sa 5

mM fosfatom pH 6.5 koji je sadržao 400 mM NaCI i razvijena sa 1.5 mL stopom protoka po minutu. Na osnovu apsorpcije na 280 nm i dt- i NK-NBN migrirali su kao pojedinačni pikovi sa očekivanom molekulskom težinom (23-24 kDa) i nisu sadržali bilo kakve značajne proteinske kontaminacije.

I dt- i NK-NBN su redukovani u 2.5 M guanidin-HCI, 60 mM Tris pH 8.0 i 16 mM DTT. Redukovani uzorci su desalinizovani kroz kratku C4kolonu i analizirani direktno sa ESMS koristeći trostruki četvoropolni instrument. Grubi podaci ESMS su dekonvulirani sa MaxEnt pro-gramom da se generiše maseni spektar. Ova procedura omogućuje višestruko naelektrisane signale da se pretvore u jedan pik koji direktno odgovara molekulskoj masi u kilo daltonima (kDa). Dekonvultirani maseni spektar za dt-NBN pokazao je da je predominantni tip 12046 kDa,

što je u skladu sa predviđenom molekulskom težinom od 12046.7 kDa za proteinski oblik od 113 amino kiselina. Takođe je zapažena minorna komponenta (12063 kDa) koja sugeriše prisu-

stvo oksidacionog produkta. Tri pika su identifikovana u NK-NBN uzorku. Glavna komponenta pokazala je očiglednu molekulsku masu od 11345 kDa u skaldu sa predviđenom masom za protein od 106 amino kiselina. Druga dva pika imala su mase od 11362 i 12061 kDa sugerišući oksidaciju NK-NBN i prisustvo oblika od 113 amino kiselina respektivno.

Prisustvo oblika od 106 i 113 oblika amino kiselina u NK-NBN preparaciji se može pripisati digestiji sa enterokinazom. Ova proteaza iz Biozvme je preparacija prirodnog enzima prečišćene intestinalne mukuze i izneto je da sadrži neznatnu kontaminaciju tripsinom (0.25 ng tripsina na ug eneterokinaze). Tako tripsin može delovati na NK-NBN na karboksi terminalnoj strani Arg7 da produkuje predominantni oblik od 106 amino kiselina. S druge strane Lizil endopeptidaza upotrebljena da se iseče dt-NBN je proteaza koja pojedinačno deluje na karboksi terminalnu stranu ostatka lizina koja se nalazi u His tag da produkuje zreli oblik NBN od 113 amino kiselina. I oblik od 106 i oblik od 113 amino kiselina NBN su podjednako aktivni u svim ogledima testiranja i ponašaju se slično u testovima stabilnosti guanidin-HCI.

Aktivnost NBN je određena njegovom sposobnošću da stimuliše cRet fosforilaciju u NB41 A3-mRL3 ćelijama koristeći KIRA ELISA opisanu u primeru -3. Fosforilisani Ret je detektovan inkubiranjem (2 časa) uhvaćenog receptora sa HRP-konjugovanim fosfotirozinskim antitelom (4

G10; 0.2 u.g po bunarčiću). Nakon inkubacije bunarčići su isprani šest puta sa TBST i HRP aktivnost je detektovana na 450 nm sa kolorimetrijskim ogledom. Vrednosti apsorpcije iz buna-rčića tretiranih sa lizatom ili samim puferom za liziranje su mereni, korigovana pozadina i podaci su plotovani kao funkcija koncentracije prisutnog neublastina u aktivacionoj mešavini. Podaci pokazuju da je prečišćeni NBN koji je nastao u prisustvu fosforilisanog Ret indicirajući da je prečišćeni NBN bio aktivan u ovom ogledu.

Primer 6... Pnepara^cjj.a konjug.aja^

Pacovski neublastin divljeg tipa u koncentraciji od 1 mg/ml u PBS je tretiran sa 1 mM sulfo-SMCC (Pierce) i desalinizovan da se ukloni višak unakrsnog veznika. Pošto protein NBN divljeg tipa sadrži samo pojedinačni amin na svom N-terminusu i nema slobodne sulfhidrilne grupe očekivano je da reakcija sa SMCC rezultira modifikacijom specifičnom za mesto NBN sa SMCC pričvršćenim na njegovom N-terminusu. 60Lig NBN-SMCC konjugata je inkubirano sa 120 u.g goveđeg serum albumina i anali-., zirano za obim unakrsnog vezivanja sa SDS-PAGE. BSA sadrži jednu slobodnu SH grupu i prema tome očekivano je da reakcija sa NBN-SMCC konjugatom rezultira modifikacijom na tom mestu preko maleimida na SMCC. Pod ovim uslovima dve dodatne trake više molekulske težine su bile zapažene što je većinom konzistentno sa modifikacijom NBN sa pojedinačnom BSA grupom i sa dva BSA molekula pošto svaki NBN molekul sadrži dva N-terminusa koji mogu proću kroz reakciju i prema tome su u skaladu sa ovim zapažanjem. U saglasnosti sa formi-ranjem ovih traka bilo je smanjenje intenziteta NBN-SMCC i BSA traka. Na osnovu intenziteta preostale NBN trake izgleda da se reakcija kompletirala 70-80%.

Monosuspstituisani produkt je prečišćen iz reakcione mešavine podvrgavanjem materijala hromatografiji katjonske razmene i hromatografiji isključenja veličine na Supredex 200 koloni (Pharmacia) u osnovi, kao što je opisano za ispitivanja pegilacije prethodno diskutovane. Kolonske frakcije iz propuštenih filtracija gela su analizirane sa SDS-PAGE i one koje su sadržale monosupstituisani produkt su analizirane na sadržaj proteina apsorpcijom na 280 nm. Pošto je masa BSA približno dvostruka od neublastina dobijena koncentracija je podeljena sa faktorom 3 da se dobije ekvivalent NBN. Ova frakcija je podvrgnuta toj analizi za funkcionisanje u KIRA ELISA. IC50 vrednosti i za dt- i BSA- konjugovani NBN bile su 3-6 nM, naznačavajući da konju-gacija BSA nije kompromitovala funkciju.

Pošto su ova preliminarna istraživanja generisana sa BSA, odgovarajući serum albumin proteini pacova i čoveka takođe sadrže slobodni SH. Shodno tome, sličan pristup se može pri-meniti da se generiše pacovski konjugat pacoskog serum albumin NBN za izvođenje PK i studije efikasnosti kod pacova i humani serum albumin čoveka NBN za izvođenje kliničkih trijala. SMCC može biti na sličan način zamenjen sa bilo kojim brojem unakrsnih veznika koji sadrže amino reaktivnu grupu na jednoj strani i tiol reaktivnu grupu na drugoj strani. Primeri amin reaktivnih unakrsnih veznika koji ubacuju tiol reaktivni-maleimid su AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPB, SMPH, KMUS ili GMBS, oni koji ubacuju tiol reaktivnu holoacetatnu grupu su SBAP, SIA, SIAB i koji obezbeđuju zaštićeni i nezaštićeni tiol za reakciju sa sulfhidril grupama da se produkuje redukujuća veza su SPDP, SMPT, SATA, ili SATP koji su svi dostupni od Pierce. Ovakvi unakrsni veznici su jednostavno primerni i mnoge alternativne strategije su predviđene za vezivanje N-terminusa NBN sa serum albuminom. Oni sa iskustvom u praksi mogu generisati konjugate sa serum albuminom koji nisu ciljni na N-terminusu NBN ili na tiol grupi serum albumina. Fuzioni NBN-serum albumin kreirani koristeći genetički inženjering gde je NBN fuzionisan za gen'serum albumina na svom N-terminusu, C-terminusu ili na oba kraja, su takođe očekivani da budu funkcionalni.

Ovaj postupak se može proširiti putem rutinskih prilagođavanja na bilo koji konjugat NBN-serum albumina koji će rezultirati produktom sa produženim polu-životom kod životinja i prema tome i ljudi.

Claims (84)

1. Varijanta polipeptida neublastina, naznačena time što sadrži sekvencu amino kiseline najmanje 70% identičnu amino kiselinama 8-113 SEQ ID BR:1, pod uslovom da varijanta polipeptida neublastina uključuje jednu ili više supstitucija amino kiseline odabranih iz grupe koja se sastoji od: amino kiseline koja nije arginin na poziciji 14 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiseline koja nije arginin na poziciji 39 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiseline koja nije arginin na poziciji 68 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiseline koja nije asparagin na poziciji 95 pomenute varijante polipeptida, gde su pozicije pomenutih amino kiselina numerisane u skladu sa sekvencom polipeptida SEQ ID BR:1.

2. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina dalje sadrži amino kiseline 1-7 SEQ ID BR:1.

3. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, vezuje GFRa3.

4. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, stimuliše fosforilaciju tirozina RET polipeptida.

5. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, poboljšava preživljavanje neurona.

6. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, poboljšava preživljavanje senzornog neurona.

7. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, normalizuje patološke promene neurona.

8. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, normalizuje patološke promene senzornog neurona.

9. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, poboljšava preživljavanje autonomnog neurona.

10. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina, kada je dimerizovana, poboljšava preživljavanje dopami-nergičnog neurona.

11. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta ~ varijanta polipeptida uključuje dve ili više supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od: amino kiseline koja nije arginin na poziciji 14 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiseline koja nije arginin na poziciji 39 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiseline koja nije arginin na poziciji 68 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiseline koja nije asparagin na poziciji 95 pomenute varijante polipeptida.

12. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida uključuje tri ili više supstitucija amino kiselina odabranih od grupe koja se sastoji od amino kiseline koja nije arginin na poziciji 14 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiseline koja nije arginin na poziciji 39 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiseline koja nije arginin na poziciji 68 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiseline koja nije asparagin na poziciji 95 pomenute varijante polipeptida.

13. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida uključuje amino kiselinu koja nije arginin na poziciji 14 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, • amino kiselinu koja nije arginin na poziciji 39 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiselinu koja nije arginin na poziciji 68 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiselinu koja nije asparagin na poziciji 95 pomenute varijante polipeptida.

14. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što je amino kiselina na poziciji 95 pomenute varijante polipeptida neublastina druga amino kiselina a ne asparagin.

15. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 14, naznačena time što je amino kiselina na poziciji 95 pomenute varijante polipeptida neublastina lizin.

16. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 14, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina dalje sadrži supstituciju odabranu iz grupe koja se sastoji od druge amino kiseline koja nije arginin na poziciji 14; druge amino kiseline koja nije arginin na poziciji 39; i druge amino kiseline koja nije arginin na poziciji 68.

17. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu-16, naznačena time što je pomenuta supstitucija na poziciji 14, 39 ili 68, lizin.

18. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 14, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina dalje sadrži dve supstitucije odabrane iz grupe koja se sastoji od druge amino kiseline koja nije arginin na poziciji 14; druge amino kiseline koja nije arginin na poziciji 39; i druge amino kiseline koja nije arginin na poziciji 68.

19. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 18, naznačena time što su dve pomenute supstitucije lizin.

20. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 14, naznačena time što pomenuta varijanta polipeptida neublastina dalje sadrži tri sledeće supstitucije: druge amino kiseline koja nije arginin na poziciji 14; druge amino kiseline koja nije arginin na poziciji 39; i druge amino kiseline koja nije arginin na poziciji 68.

21. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 20, naznačena time što su tri pomenute "supstitucije lizin. ~ ~" """

22. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 15, naznačena time što amino kiseline 8-94 i 96-113 pomenute varijante polipeptida neublastina su najmanje 90% identične amino kiselinama 8-94 i 96-113 SEQ ID BR:1.

23. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 14, naznačena time što amino kiseline 8-94 i 96-113 pomenute varijante polipeptida neublastina su najmanje 95% identične amino kiselinama 8-94 i 96-113 SEQ ID BR:1.

24. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 22, naznačena time što sekvenca amino kiseline pomenute varijante polipeptida neublastina uključuje sekvencu amino kiseline koja se prirodno javlja kod polipeptida neublastina pacova, čoveka ili miša na amino kiselinama 8-94 i 96-113 pomenute varijante polipeptida neublastina.

25. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 23, naznačena time što su amino kiseline 8-94 i 96-113 pomenute varijante polipeptida neublastina odabrane iz grupe koja se sastoji od sekvence amono kiselina 8-94 i 96-113 SEQ ID BR:2, SEQ ID BR:3 i SEQ ID BR:4.

26. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 15, naznačena time što polipeptid sadrži amino kiseline 8-113 SEQ ID BR:2.

27. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 1, naznačena time što je pomenuta varijanta polipeptida neublastina fuzioni protein.

28. Varijanta polipeptida neublastina prema zahtevu 27, naznačena time što pomenuti fuzioni protein sadrži sekvencu himanog serum albumina fuzionisanu u okviru sa pomenutom varijantom polipeptida neublastina.

29. Fuzioni protein, naznačen time što sadrži polipeptid neublastin operativno vezan za protein humani serum albumin.

30. Molekul nukleinske kiseline, naznačen time što kodira varijantu polipeptida neublastina prema zahtevu 1.

31. Vektor, naznačen time što sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 30.

32. Vektor prema zahtevu 30, naznačen time što je pomenuti vektor ekspresioni vektor.

33. Ćelija, naznačena time što sadrži vektor prema zahtevu 32.

34. Ćelija prema zahtevu 33, naznačena time što je pomenuta ćelija odabrana iz grupe koja se sastoji od sisarske ćelije, ćelije gljiva, ćelije kvasca, ćelije insekta i bakterijske ćelije.

35. Ćelija prema zahtevu 34, naznačena time što što pomenuta sisarska ćelija je ćelija ovarijuma kineskog hrčka.

36. Postupak za pripremanje varijante polipeptida neublastina, naznačen time što postupak sadrži kultivisanje ćelije prema zahtevu 33 pod uslovima koji omogućuju ekspresiju varijante polipeptida neublastina.

37. Postupak prema zahtevu 36, naznačen time što dalje sadrži obnavljanje pomenute varijante polipeptida neublastina.

38. Varijanta polipeptida neublastina, naznačena time što je produkovana postupkom prema zahtevu 36.

39. Molekul nukleinske kiseline, naznačen time što kodira varijantu polipeptida neublastina prema zahtevu 28.

40. Vektor, naznačen time što sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 39.

41. Vektor prema zahtevu 40, naznačen time što je pomenuti vektor ekspresioni vektor.

42. Ćelija, naznačena time što sadrži vektor prema zahtevu 41.

43. Ćelija prema zahtevu 42, naznačena time što je pomenuta ćelija odabrana iz grupe koja se sastoji od sisarske ćelije, ćelije gljiva, ćelije kvasca, ćelije insekta i bakterijske ćelije.

44. Ćelija prema zahtevu 43, naznačena time što što pomenuta sisarska ćelija je ćelija ovarijuma kineskog hrčka.

45. Postupak za pripremanje varijante polipeptida neublastina, naznačen time što postupak sadrži kultivisanje ćelije prema zahtevu 42 pod uslovima koji omogućuju ekspresiju varijante polipeptida neublastina.

46. Postupak prema zahtevu 45, naznačen time što dalje sadrži obnavljanje varijante polipeptida neublastina.

47. Varijanta polipeptida neublastina, naznačena time što je produkovana postupkom prema zahtevu 46.

48. Preparat multimernog polipeptida, naznačen time što sadrži varijantu polipeptida neublastina prema zahtevu 1.

49. Preparat multimernog polipeptida prema zahtevu 48, naznačen time što je pomenuti preparat multimernog polipeptida dimer.

50. Preparat multimernog polipeptida prema zahtevu 49, naznačen lime _što je pomenuti preparat multimernog polipeptida homodimer.

51. Preparat multimernog polipeptida prema zahtevu 48, naznačen time što je pomenuti preparat multimernog polipeptida heterodimer.

52. Preparat, naznačen time što sadrži polipeptid neublastin ili varijantu polipeptida neublastina sparenu u polimer koji se prirodno ne javlja.

53. Preparat prema zahtevu 52, naznačen time što je pomenuti polimer koji se prirodno ne javlja sparen sa pomenutim polipeptidom preko amino kiseline izložene rastvaraču pomenutog polipeptida.

54. Preparat prema zahtevu 52, naznačen time što pomenuti preparat sadrži varijantu polipeptida neublastina koja sadrži sekvencu amino kiseline najmanje 70% identičnu amino kiselinama 8-113 SEQ ID BR:1, pod uslovom da varijanta polipeptida neublastina uključuje jednu ili više supstitucija amino kiseline odabranih iz grupe koja se sastoji od: amino kiseline koja nije arginin na poziciji 14 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiseline koja nije arginin na poziciji 39 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, "' "' amino kiseline koja nije arginin na poziciji 68 u sekvenci amino kiseline pomenute varijante polipeptida, amino kiseline koja nije asparagin na poziciji 95 pomenute varijante polipeptida, gde su pozicije pomenutih amino kiselina numerisane u skladu sa sekvencom polipeptida SEQ ID BR:1.

55. Preparat prema zahtevu 52, naznačen time što pomenuti polimer sadrži polialkilen glikol grupu.

56. Preparat prema zahtevu 55, naznačen time što je pomenuta polialkilen glikol grupa polietilen glikol grupa (PEG).

57. Preparat prema zahtevu 55, naznačen time što je pomenuta polialkilen glikol grupa sparena sa amin grupom pomenutog polipeptida neublastina ili lizinom ili drugom amino grupom varijante polipeptida neublastina.

58. Preparat prema zahtevu 57, naznačen time što je pomenuta polialkilen glikol grupa sparena sa aktivnim estrom N-hidroksilsukcinimida (NHS).

59. Preparat prema zahtevu 58, naznačen time što je aktivni estar odabran od grupe koja se sastoji od PEG sukcinimidil sukcinata (SS-PEG), sukcinimidil butirata (SPB-PEG) i sukcinimidil propionata (SPA-PEG).

60. Preparat prema zahtevu 57, naznačen time što je pomenuta polialkilen glikol grupa odabrana od grupe koja se sastoji od karboksimetil-NHS, norleucin-NHS, SC-PEG, trezi-lata, aldehida, epoksida, karbonilimidazola i PNP karbonata.

61. Preparat prema zahtevu 55, naznačen time što je pomenuta polialkilen glikol grupa sparena sa grupom cisteina pomenutog polipeptida neublastina ili varijantom polipeptida neublastina.

62. Preparat prema zahtevu 61, naznačen time što je pomenuta polialkilen glikol grupa sparena putem grupe odabrane od grupe koja se sastoji od maleimidne grupe, vinilsulfon grupe, haloacetatne grupe i tiol grupe.

63. Preparat prema zahtevu 52,-naznačen time što je pomenuti -polipeptid neublastina ili varijanta polipeptida neublastina glikozilirana.

64. Preparat prema zahtevu 63, naznačen time što je pomenuti polimer sparen sa ugljovo-doničnom grupom pomenutog glikoziliranog polipeptida neublastina ili varijante polipeptida neublastina.

65. Preparat prema zahtevu 64, naznačen time što je pomenuti polimer sparen sa pomenutim glikoziliranim polipeptidom neublastina ili varijantom polipeptida neublastina nakon oksidacije hidrazolne grupe ili amino grupe pomenutog glikoziliranog polipeptida neublastina ili varijantom polipeptida neublastina.

66. Preparat prema zahtevu 52, naznačen time što pomenuti polipeptid neublastin ili varijanta polipeptida neublastina sadrži jednu, dve, tri ili četiri PEG grupe.

67. Preparat prema zahtevu 52, naznačen time što polipeptid neublastin ili varijanta polipeptida neublastina ima duži polu-život u serumu u odnosu na polu-život pomenutog polipeptida neublastina ili varijante polipeptida neublastina u odsustvu pomenutog polimera.

68. Preparat prema zahtevu 52, naznačen time što polipeptid neublastin - ili varijanta polipeptida neublastina kada je dmerizovana, ima fiziološku aktivnost odabranu iz grupe koja se sastoji od GFFia.3 vezivanja, RET aktivacije, normalizacije patoloških promena neurona i poboljšanja preživljavanja neurona.

69. Preparat prema zahtevu 68, naznačen time što je pomenuti polimer sparen sa pomenutim polipeptidom na njegovom N terminusu.

70. Preparat prema zahtevu 68, naznačen time što je pomenuti polimer sparen sa pomenutim polipeptidom na njegovoj ne-terminalnoj amino kiselini,

71. Preparat prema zahtevu 68, naznačen time što je pomenuti polimer sparen sa amino kiselinom izloženom rastvaraču polipeptida neublastina ili varijanti polipeptida neublastina.

72. Preparat prema zahtevu 68, naznačen time što je pomenuti polimer sparen sa pomenutim polipeptidom neublastina ili varijantom polipeptida neublastina na ostatku odabranom od grupe koja se sastoji od: amino terminusa pomenute varijante polipeptida, pozicije 14 u sekvenci amino kiseline pomenutog polipeptida neublastina ili varijante polipeptida neublastina, pozicije 39 u sekvenci amino kiseline pomenutog polipeptida neublastina ili varijante polipeptida neublastina, pozicije 68 u sekvenci amino kiseline pomenutog polipeptida neublastina ili varijante polipeptida neublastina i pozicije 95 u sekvenci amino kiseline pomenutog polipeptida neublastina ili varijante polipeptida neublastina.

73. Farmaceutski preparat, naznačen time što sadrži fiziološki prihvatljiv nosač koji ima ovde dispergovan preparat, prema zahtevu 68.

74. Stabilni, u vodi rastvorljivi konjugovani polipeptid neublastin ili varijanta polipeptida neublastina, naznačen time što kompleks sadrži dimerni polipeptid neublastina ili dimernu varijantu polipeptida neublastina sparenu sa poietilen glikol grupom, gde je polipeptid neublastina ili varijanta polipeptida neublastina sparena sa polietilen glikol grupom labilnom vezom.

75. Kompleks prema zahtevu 74, naznačen time što je pomenuta labilna veza isečena sa biohemijskom hidrolizom, proteolizom ili sulfhidrilnim isecanjam.

76. Kompleks prema zahtevu 75, naznačen time što je pomenuta labilna veza isečena uin vivo uslovima.

77. Postupak za pravljenje modifikovanog polipeptida neublastina koji kada je dimerizovan ima produženu aktivnostin vitroiin vivou odnosu na polipeptid neublastina divljeg tipa kada je dimerizovan, naznačen time što sadrži obezbeđibanje polipeptida neublastina ili varijante polipeptida neublastina; i sparivanja pomenutog polipeptida neublastina ili modifikovane varijante polipeptida neublastina sa grupom polimera koja se ne javlja prirodno, formirajući tako preparat sparenog polimera polipeptida neublastina.

78. Postupak za tretiranje ili prevenciju poremećaja nervnog sistema kod subjekta, naznačen time što postupak sadrži davanje subjektu, koji ima potrebu za to, terapeutski efektivne količine: dimera koji sadrži polipeptid prema zahtevu 1, preparata prema zahtevu 52 koji sadrži dimer pomenutog polipeptida neublasina ili konjugata varijante polipeptida neublasina, farmaceutskog preparata prema zahtevu 69 ili kompleksa prema zahtevu 74.

79. Postupak prema zahtevu 78, naznačen time što je pomenuti nervni poremećaj periferni nervni poremećaj.

80. Postupak prema zahtevu 78, naznačen time što je pomenuti poremećaj periferna neuropatija.

81. Postupak prema zahtevu 78, naznačen time što je pomenuti poremećaj neuropatski sindrom bola.

82. Postupak prema zahtevu 78, naznačen time što je pomenuti subjekt čovek.

83. Postupak prema zahtevu 78, naznačen time što je davanje sistemsko.

84. Postupak prema zahtevu 78, naznačen time što je davanje lokalno.