RS61034B1 - Il-17a vezujuće sredstvo i njegove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni opis se odnosi na IL-I7A vezujuće sredstvo i njegovu upotrebu kao terapeutskog sredstva, naročito kao terapeutskog sredstva u različitim inflamatornim ili autoimunim bolestima.

OSNOVA

[0002] Citokini iz interleukin-17 familije su imenovani kao IL-17A do IL-17F, respektivno. Istovremeno, familija njihovih receptora, IL-17 receptor A do 1L-17 receptora E, takođe je otkrivena: ovi IL-17 citokini se vezuju za odgovarajući receptor, čime posreduju u različitim inflamatornim odgovorima.

[0003] Najtipičniji član familije je IL-17A. Limfociti koji migriraju na mesta infekcije ili povrede mogu izlučivati 1L-17A. Sa jedne strane, IL-17A indukuje ekspresiju inflamatornih citokina i hemokina, čime se regrutuje više imunskih ćelija na mestu inflamacije i pojačava se inflamatorni odgovor; sa druge strane, IL-17A indukuje ekspresiju istih faktora relevantnih za popravku tkiva, čime se ubrzava opravak organizma. Iako interleukin- 17A ima efekat na pojačanje odbrambenog imunskog odgovora i zaštitu organizama tokom procesa anti-infekcije i popravke tkiva kod domaćina, kod mnogih pacijenata koji pate od autoimunih bolesti i kancera, interleukin-17A je visoko eksprimiran, prekomerna ekspresija interleukina- 17A igra ulogu koja pogoršava patološki razvoj, jer može indukovati ekspresije različitih inflamtornih faktora. Mnogi eksperimenti na životinjama su dokazali da patološka težina različitih autoimunih bolesti može biti efikasno suprimirana sa deficijencijom interleukina-17A ili neutralizacijom sa antitelima na interleukin-17A. Postoje dokazi da je IL-17 signal pokazivao određeni efekat kao target za tretiranje autoimunih bolesti, uključujući reumatoidni artritis (RA), psorijazu, Crohn-ovu bolest, multiplu sklerozu (MS), psorijaznu bolest, astmu i lupus (videti, na primer, Aggarwal et al., J.Leukoc.Biol, 71 (1): 1-8 (2002); Lubberts et al.).

[0004] Humani 1L-17 je gen koji kodira polipeptid koji ima do 155 aminokiselina. Polipeptid sadrži signalnu sekvencu od 19-aminokiselina i zreli deo od 132-aminokiselina. Sa relativnom molekulskom težinom od 17,000Da, humani IL-17A je glikoprotein koji postoji u obliku homodimera ili heterodimera (Spriggs et al, J.Clin.Imunol, 17: 366-369 (1997)). IL-17F, homolog, može se kombinovati sa 1L-17A da bi formirao 1L-17A/F heterodimer. Aminokiselinska sekvenca IL- 17F (IL-24, ML-1) ima do 55% sličnosti sa onom od IL-17A, ali imaju isti receptor, IL-17R. IL-17R je sveprisutno eksprimiran u različitim ćelijama, uključujući vaskularne endotelne ćelije, periferne T ćelije, B ćelije, fibroblaste, mijelomonocite i stromalne ćelije kostne srži (Kolls et al, Imunity, 21: 467-476 (2004); Kawaguchi et al, J.Allergy Clin.Imunol, 114 (6): 1267-1273 (2004); Moseley et al, Cytokine Growth Factor Rev, 14 (2): 155-174 (2003)).

[0005] WO 2010/034443 А1 se odnosi na vezivanje antitela sa IL- 17 što se karakteriše vezivanjem za isti IL- 17 epitop za koje se vezuje monoklonsko antitelo 3C1, i humani lgGl je izotipa modifikovanog u regionu zgloba na aminokiselinskom položaju 216-240, između CH1 i CH2 i/ili u inter-domenu drugog regiona na aminokiselinskom položaju 327-331 između CH2 i СНЗ, za tretman inflamatornih bolesti.

[0006] WO 2007/070750 А1 se odnosi na anti-IL-17 antitela koja karakteriše visok afinitet i spora stopa disocijacije za humani IL-17, za tretiranje autoimunih, inflamatornih, proliferativnih ćelijskih i razvojnih poremećaja.

[0007] WO 2006/013107 А1 se odnosi na 1L-17 vezujući molekul, naročito na antitelo na humani IL-17, za upotrebu u tretmanu IL-17 posredovane bolesti ili poremećaja, npr. reumatoidnog artritisa.

[0008] WO 2008/021156 A2 se odnosi na konstruisana antitela na humani IL-17A.

[0009] WO 2009/136286 A2 se odnosi na potpuno humana monoklonska antitela koja prepoznaju 1L-17F, IL-17F homodimer, IL-17A, IL-17A homodimer, i/ili heterodimemi IL-17A/IL-17F proteinski kompleks, i dodatno na postupke za korišćenje takvih monoklonskih antitela kao terapeutika, dijagnostika, i profilaktika.

[0010] WO 2011/053763 A2 se odnosi na antagoniste interleukin-17A (1L-17A) antitela, polinukleotide koji kodiraju antagoniste IL- 17A antitela ili njihove fragmente, i postupke za njihovo stvaranje i upotrebu.

[0011] WO 2008/047134 A2 se odnosi na molekule antitela koja imaju specifičnost za antigene determinante i IL-17A i IL-17F, terapeutske upotrebe molekula antitela i postupke za proizvodnju pomenutih molekula antitela.

[0012] Od otkrivanja interleukina-17A, do sada, pronađena su različita anti-IL-17A antitela, kao što su CN101001645A, CN1 01326195A, CN101646690A, ali i dalje postoji potreba za razvojem različitih vrsta poboljšanih antitela da bi se efikasno smanjila ili eliminisala IL-17 aktivnost u inflamatornom odgovoru i autoimunim bolestima.

REZIME PRONALASKA

[0013] Pronalazak je definisan sa patentnim zahtevima.

[0014] Predmetni opis obezbeđuje anti-lL-17A antitelo sa višim afinitetom i dužim poluživotom.

[0015] Predmetni opis obezbeđuje IL-17A vezujuće sredstvo, koje sadrži:

varijabilni region lakog lanca antitela, koji sadrži 0-3 LCDR regiona izbranih od onih prikazanih u SEQ 1D NO: 13, SEQ 1D NO: 14, i SEQ ID NO: 15; i

varijabilni region teškog lanca antitela, koji sadrži 0-3 HCDR regiona izabranih od onih prikazanih u SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, i SEQ ID NO: 12;

gde brojevi regiona CDR varijabilnog regiona lakog lanca antitela i varijabilnog regiona teškog lanca antitela nisu istovremeno 0.

[0016] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži SEQ ID NO: 13.

[0017] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži SEQ ID NO: 14.

[0018] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži SEQ ID NO: 15.

[0019] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži SEQ ID NO: 10.

[0020] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži SEQ ID NO: 11.

[0021] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži SEQ ID NO: 12.

[0022] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži jedan LCDR region izabran od SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15.

[0023] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo, sadrži jcdan HCDR region izabran od SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12.

[0024] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IE-17A vezujuće sredstvo sadrži dva LCDR regiona izabrana od SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15.

[0025] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži dva HCDR regiona izabrana od SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12.

[0026] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži tri LCDR regiona, gde je aminokiselinska sekvenca LCDR1 prikazana u SEQ 1D NO: 13, aminokiselinska sekvenca LCDR2 je prikazana u SEQ ID NO: 14, aminokiselinska sekvenca LCDR3 je prikazana u SEQ ID NO: 15.

[0027] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži tri HCDR regiona, aminokiselinska sekvenca HCDR1 je prikazana u SEQ ID NO: 10, aminokiselinska sekvenca HCDR2 je prikazana u SEQ ID NO: 11, aminokiselinska sekvenca HCDR3 je prikazana u SEQ ID NO: 12.

[0028] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo, gde varijabilni region lakog lanca dodatno sadrži FR region lakog lanca izveden iz mišjeg κ, λ lanca ili njegove varijante. U nekim aspektima, aminokiselinska skvenca varijabilnog regiona lakog lanca antitela je SEQ ID NO: 2. Dodatno, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži konstantni region lakog lanca izveden iz mišjeg к, X lanca ili njegove varijante.

[0029] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo, gde varijabilni region teškog lanca antitela dodatno sadrži FR region teškog lanca izveden iz mišjeg IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili njegove varijante. U nekim aspektima, aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antitela je SEQ ID NO: 1. Dodatno, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži konstantni region teškog lanca izveden iz mišjeg IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili njegove varijante.

[0030] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo, gde njegov varijabilni region lakog lanca dodatno sadrži FR region lakog lanca izveden iz humanog к, X lanca ili njegove varijante; U nekim aspektima, FR region lakog lanca varijabilnog regiona lakog lanca antitela je AIO FR region lakog lanca humane klicine linije čije su aminokiseline prikazane u SEQ ID NO: 4, ili njegova varijanta. U nekim aspektima, varijanta FR regiona varijabilnog regiona lakog lanca antitela odnosi se na A10 FR region lakog lanca humane klicine linije sa 0-10 aminokiselinskih mutacija. U nekim aspektima, aminokiselinska mutacija u varijanti FR regiona varijabilnog regiona lakog lanca je jedna ili više izabrana iz grupe koja se sastoji od F71Y, K49Y, Y36F, i L47W. U nekim aspektima, laki lanac antitela je izabran od SEQ ID NO: 9 i njegove varijante. Dodatno, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži konstantni region lakog lanca izveden iz humanog κ, λ lanca ili njegove varijante.

[0031] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, IL-17A vezujuće sredstvo, gde njegov varijabilni region teškog lanca antitela dodatno sadrži FR region teškog lanca izveden iz humanog IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili njegove varijante; U nekim aspektima, FR region teškog lanca varijabilnog regiona teškog lanca antitela je FR region je VHl-18 teškog lanca humane klicine linije, čija je aminokiselinska sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 3, ili njegova varijanta; U nekim aspektima, varijanta FR regiona varijabilnog regiona teškog lanca antitela odnosi se na VHl-18 teški lanac humane klicine linije sa 0-10 aminokiselinskih mutacija; U nekim aspektima, aminokiselinska mutacija u varijantama FR regiona varijabilnog regiona teškog lanca je jedna ili više izabrana iz grupe koja se sastoji od: A93T, T71A, M48I, V67A, M69L, T73D, i S76N; U nekim aspektima, težak lanac antitela je izabran od SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8. Dodatno, IL-17A vezujuće sredstvo sadrži konstantni region teškog lanca izveden iz humanog IgG1, IgG2, IgG3, lgG4 ili njegove varijante.

[0032] Dodatno, prema nekim aspektima predmetnog opisa, obezbeđen je vektor koji eksprimira prethodno pomenuti IL-17A. Ćelija domaćin eksprimira i izlučuje IL-I7A vezujuće sredstvo nakon što je transficirana sa vektorom.

[0033] Prema nekim aspektima predmetnog opisa, vektor sadrži nukleotide koji kodiraju IL-17A vezujuće sredstvo prema predmetnom opisu.

[0034] Dodatno, prema nekim aspektima predmetnog opisa, obezbeđena je farmaceutska kompozicija, koja sadrži IL-I7A vezujuće sredstvo kao što je pretohodno opisano i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, razblaživač ili nosač.

[0035] Dodatno, prema nekim aspektima, predmetni opis takođe obezbeđuje upotrebu prethodnog IL-17A vezujućeg sredstva, ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži isto, za pripremu medikamenta za tretman IL-17 posredovanih bolesti ili poremećaja. Bolesti su inflamatorne ili autoimune bolesti; bolesti su izabrane od psorijaze, psorijatičkog artritisa, ankiloznog spondilitisa, multiple skleroze, inflamatornog artritisa; inflamatorna bolest je poželjno inflamatorni artritis. Inflamatorni artritis je izabran od osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, reumatskog artritisa ili osteoporoze, poželjno reumatskog artritisa.

[0036] Prema nekim aspektima, predmetni opis takođe obezbeduje upotrebu prethodnog IL-17A antitela, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži isto, za pripremu medikamenta za tretman IL-17 posredovanih bolesti ili poremećaja. Bolesti su inflamatorne ili autoimune bolesti. Inflamatorna bolest je poželjno inflamatorni artritis. Inflamatorni artritis je izabran od osteoartritisa, reumatoidnog artritisa ili osteoporoze.

[0037] Prema nekim aspektima, predmetni opis takođe obezbeđuje postupak za tretiranje bolesti ili poremećaja posredovanog sa IL-17, koji sadrži primenu na subjekta kome je to potrebno terapeutski efikasne količine IL-17A vezujućeg sredstva kao što je opisano prethodno ili humanizovanog IL-17A antitela ili farmaceutske kompozicije koja sadrži isto.

[0038] Kako bi se lakše shvatio pronalazak, određeni tehnički i naučni termini su specifično definisani u nastavku. Ukoliko na drugom mestu u ovom dokumentu nije specifično definisano, svi drugi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju značenje uobičajeno podrazumevano od strane stručnjaka iz oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak.

I. TERMINI

[0039] Kao što je ovde korišćeno, kod od jednog slova i kod od tri slova za aminokiseline su kao što je opisano u J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558.

[0040] Kao što je ovde korišćeno, "vezujuće sredstvo" odnosi se na rastvorljivi receptor ili njegove fragmente ili analoge, ili antitela ili njihove fragmente ili anlaoge koji su sposobni da se vezuju za target. "IL-17A vezujuće sredstvo" prema predmetnom opisu, odnosi se na antitelo ili njegov fragment ili anlaog koji je sposoban da specifično prepoznaje IL-17A i vezuje se za 1L-17A

[0041] Termin "IL-17A" se generalno odnosi na prirodni ili rekombinantni humani IL-17A, i ne-humane homologe humanog 1L-17A. Ukoliko nije drugačije naznačeno, molekulska težina 1L-17A homodimera je usvojena (na primer, 30KDa za humani 1L-17A) za izračunavanje molarne koncentracije IL-17A.

[0042] Kao što je ovde korišćeno, "antitelo" se odnosi na imunoglobulin, strukturu lanca od četiri peptida koja se sastoji od dva identična teška lanca i dva identična laka lanca povezana preko disulfidne veze. Konstantni regioni teškog lanca imunoglobulina pokazuju različite aminokiselinske komponente i rasporede, stoga prikazujući različitu antigenost. Shodno tome, imunoglobulini se mogu podeliti u pet kategorija, ili nazvani imunoglobulinski izotipovi, odnosno IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Prema svojim aminokiselinskim komponentama zglobnog regiona i broju i položaju disulfidnih veza teškog lanca, Ig u istoj kategoriji mogu se dodatno podeliti u različite pod-tipove, na primer, IgG se može podeliti na IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. Laki lanac se može podeliti na κ ili λ lanac po različitim konstantnim regionima.

[0043] Region od oko 110 aminokiselinskih sekvenci blizu N-terminusa teških i lakih lanaca antitela, uveliko se menja, poznat kao varijabilni region (V region); region ostatka aminokiselinske sekvence blizu C-terminusa je relativno stabilan, poznat kao konstantni region (C region). Varijabilni region sadrži tri hipervarijabilna regiona (HVR) i četiri relativno konzervativna FR regiona (FR). Tri hipervarijabilna regiona određuju specifičnost antitela, takođe poznat kao region koji određuje komplementarnost (CDR). Svaki varijabilni region lakog lanca (LCVR) i svaki varijabilni region teškog lanca (HCVR) je sastavljen od tri CDR regiona i četiri FR regiona, sekvencijalni redosled od amino terminusa do karboksi terminusa je: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4. Tri CDR regiona lakog lanca, odnosno hipervarijabilni regioni lakog lanca (LCDR), odnose se na LCDR1, LCDR2, i LCDR3; tri CDR regiona teško lanca, odnosno hipervarijabilni regioni teškog lanca (LCDR), odnose se na HCDR1, HCDR2 i HCDR3. Broj i položaj aminokiselinskih ostataka CDR regiona u LCVR i HCVR regionima antitela ili antigen vezujućeg fragmenta ovde je u saglasnosti sa Kabat kriterijumom za numerisanje (LCDRl-3, HCDE2-3), ili je u saglasnosti sa kabat i chothia kriterijumom za numerisanje (HCDR1).

[0044] Kao što je ovde korišćeno, "antigen-vezujući fragment" odnosi se na Fab fragment, Fab’ fragment, F(ab’)2 fragment ili jedan Fv fragment koji ima antigen-vezujuću aktivnost. Fv antitelo je minimalni fragment antitela koji sadrži varijabilni region teškog lanca, varijabilni region lakog lanca i sva antigen-vezujuća mesta, bez konstantnog regiona. Generalno, Fv antitelo dodatno sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena, i sposoban je da formira strukturu neophodnu za vezivanje antigena.

[0045] Kao što je ovde korišćeno, termin "antigena determinanta" prema predmetnom opisu, odnosi se na trodimenzionalna mesta, koja su diskretna na antigenu, i prepoznaju se od strane antitela ili antigen vezujućeg fragmenta prema predmetnom opisu.

[0046] "Primena" i "tretman," kao što se primenjuju na životinje, ljude, eksperimentalne subjekte, ćelije, tkiva, organe, ili biološku tečnost, odnose se na kontakt životinja, ljudi, eksperimentalnih subjekata, ćelija, tkiva, organa, ili biološke tečnosti sa egzogenim medikamentima, terapeutskim sredstvima, dijagnostičkim sredstvima, ili kompozicijama. "Primena" i "tretman" mogu se odnositi na, npr., terapeutske, farmakokinetičke, dijagnostičke, istraživačke, i eksperimentalne postupke. Tretman ćelija obuhvata dovođenje u kontakt ćelija sa sredstvom, kao i dovođenje u kontakt tečnosti sa sredstvom, gde je tečnost u kontaktu sa ćelijama. "Primena" i "tretman" takođe označavaju in vitro i ех vivo tretman, npr., ćelija, sa sredstvom, dijagnostičkom ili vezujućom kompozicijom, ili sa drugim ćelijama. "Tretman", kao što se primenjuje na humane, veterinarske, ili istraživačke subjekte, odnosi se na terapeutski tretman, profilaktičke ili preventivne mere, za istraživačke i dijagnostičke primene. "Tretman" kao što se primenjuje na humane, veterinarske, ili istraživačke subjekte, ili ćelije, tkiva, ili organe, obuhvata dovođenje u kontakt humanih ili životinjskih subjekata, ćelija, tkiva, fizioloških kompartmana, ili fiziološke tečnosti sa IL- 17A agonistom ili IL-17 A antagonistom. "Tretman ćelija" takođe obuhvata situacije gde 1L-17A agonist ili IL-17A antagonist je doveden u kontakt sa IL-17A receptorom, npr., u fluidnoj fazi ili koloidnoj fazi, i takođe obuhvata situacije gde agonist ili antagonist nije doveden u kontakt sa ćelijama ili receptorima.

[0047] "Tretirati" označava primenu terapeutskog sredstva, kao što je kompozicija koja sadrži bilo koje od vezujućih jedinjenja prema predmetnom opisu, interno ili eksterno na pacijenta koji ima jedan ili više simptoma bolesti za koju sredstvo ima poznatu terapeutsku aktivnost. Tipično, sredstvo se primenjuje u količini efikasnoj da ublaži jedan ili više simptoma bolesti kod pacijenta ili populacije koja se tretira, ili indukcijom povlačenja ili inhibicijom napredovanja takvog simptoma (ili više njih) u klinički merljivom stepenu. Količina terapeutskog sredstva koja je efikasna da ublaži bilo koji određeni simptom bolesti (takođe označeno kao "terapeutski efikasna količina") može varirati u skladu sa različitim faktorima, kao što su stanje bolesti, starost, i težina pacijenta, i sposobnost leka da izazove željeni odgovor kod pacijenta.

[0048] Četiri varijante humanog IL-17 A proteina su spomenute ovde:

1) Kao što je ovde korišćeno, termini "humani IL-17A (huIL-17A)" i "prirodni humani IL-17A" odnose se na zrele oblike (tj. ostatke 24-155) humanog IL-17A proteina sa pristupnim brojevima NP 002181 i AAT22064, i varijante koje se javljaju u prirodi i njihove polimorfizme.

2) Kao što je ovde korišćeno, termin "rhIL-17A" odnosi se na rekombinantni humani IL-17A, ova nomenklatura je usvojena zbog pogodnosti u odnosu na različite oblike IL-17 A, i ne mora da se poklapa sa upotrebom u literaturi.

3) Kao što je ovde korišćeno, termin "His-huIL-17A" odnosi se na rekombinantni humani IL-17A koji imaju dodati N-terminalni His tag, "FLAG-huIL-17A" odnosi se na rekombinantni humani IL-17A koji ima dodati N-terminalni FLAG tag. U nekim eksperimentima FLAG- huIL-17A je biotinilovan.

4) R&D Systems humani IL-17A pomenut ovde je rekombinantni humani IL-17A kupljen od R&D Systerms.

[0049] Kao što je ovde korišćeno, termin "monoklonsko antitelo" odnosi se na antitelo izlučeno od strane klona izvedenog iz jedne ćelije. Monoklonska antitela su visoko specifična i usmerena su protiv jednog epitopa. Ćelija nije ograničena na eukariotske, prokariotske, ili fagne klonske ćelijske linije.

[0050] Monoklonsko antitelo ovde specifično uključuje "himerno" antitelo, u kojem jc deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela izvedenim iz određenih vrsta ili koje pripadaju određenom tipu ili podtipu antitela, dok je ostatak lanca (lanaca) identičan sa ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela izvedenim iz druge vrste ili koje pripadaju drugom tipu ili podtipu antitela, kao i fragment takvog antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost.

[0051] Kao što je ovde korišćeno, termin "humanizovano antitelo" je oblik sa modifikovanim varijabilnim regionom mišjeg antitela prema predmetnom opisu, koje ima CDR regione izvedene iz (ili suštinski izvedeni iz) ne-humanog antitela (poželjno mišjeg monoklonskog antitela), i FR regiona i konstantnog regiona suštinski izvedenog iz humanog antitela; odnosno, sekvence CDR regiona mišjeg antitela su graftovane na različite tipove okvirnih sekvenci antitela humane klicine linije. Takve okvirne sekvence mogu se dobiti iz javnih DNK baza podataka ili publikovanih referenci koje uključuju sekvence gena antitela klicine linije. Na primer, DNK sekvence gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca i gena varijabilnog regiona lakog lanca mogu se naći u bazi podataka za sekvence humane klicine linije "VBase" (dostupne na Internet www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), kao i u Kabat, EA, etc.1991 Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. Kako su CDR sekvence odgovorne za najveći deo interakcija antitelo-antigen, moguće je konstruisati ekspresioni vektor da eksprimira rekombinantno antitelo koje može imitirati specifične osobine antitela koje se javlja u prirodi.

[0052] "Izborni" ili "izborno" označava da se sledeći događaj ili situacija može ali se ne mora obavezno dogoditi, i opis uključuje instance u kojima se događaj ili situacija može ili ne mora desiti. Na primer, "izborno sadrži 1-3 varijabilna regiona teškog lanca antitela" označava da varijabilni region teškog lanca antitela sa specifičnim sekvencama može biti, ali ne mora obavezno biti, prisutan, ukoliko je prisutan, može biti 1, 2 ili 3.

[0053] Transformacija ćelije domaćina sa rekombinantnom DNK može se izvesti konvencionalnim tehnikama dobro poznatim stručnjacima. Dobijeni transformanti su kultivisani korišćenjem konvencionalnih postupaka za ekspresiju polipeptida kodiranog sa genom prema opisu. Medijum kulture se može izabrati od različitih konvencionalnih medijuma za kulturu na osnovu korišćenih ćelija domaćina. Rast ćelija domaćina pod odgovarajućim uslovima.

II. Antitela specifična za humani IL-17A

[0054] Predmetni opis obezbeđuje konstruisana anti-IL-17A antitela i njihove upotrcbe za tretiranje različitih inflamatornih, imunih i proliferativnih poremećaja, uključujući reumatoidni artritis (RA), osteoartritis, reumatoidni artritis osteoporozu, inflamatornu fibrozu (npr., skleroderma, fibroza pluća, i ciroza), inflamatorne poremećaje creva (npr., Crohn.ovu bolest, ulcerativni kolitis i inflamatornu bolest creva), astmu (uključujući alergijsku astmu), alergije, COPD, multiplu sklerozu, psorijazu i kancer.

[0055] Bilo koji pogodan postupak za stvaranje monoklonskih antitela može se koristiti za stvaranje anti-lL-17A antitela prema predmetnom opisu. Na primer, životinjski primalac može biti imunizovan sa vezanim ili npr. IL-17A homodimerom koji se javlja u prirodi, ili njegovim fragmentom. Može se koristiti bilo koji pogodan postupak za imunizaciju. Takvi postupci mogu uključivati ađuvante, druge imunostimulante, ponovljene buster imunizacije, i upotrebu jednog ili više puteva imunizacije.

1

[0056] Bilo koji pogodni oblik IL-17A može se koristiti kao imunogen (antigen) za stvaranje ne-humanog antitela specifičnog za IL-17A, može se izvršiti skrining antitela u odnosu na njegovu biološku aktivnost. Imunogen koji izaziva reakciju može biti zreli humani IL-17A pune dužine, uključujući povezane homodimere koji se javljaju u prirodi, ili njihove peptide koji obuhvataju jedan epitop ili više epitopa. Imunogen se može koristiti zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više sredstava koja pojačavaju imunogenost poznatih u tehnici. Imunogen može biti prečišćen iz prirodnog izvora ili proizveden u genetički modifikovanim ćelijama. DNK koja kodira imunogen može biti izvedena iz genomskih ili ne-genomskih (npr., cDNK) DNK. Pogodni genetički vektori se mogu koristiti za ekspreisju DNK koje kodiraju imunogen, pri čemu pomenuti vektori uključuju ali nisu ograničeni na adenovirusne vektore, adeno-povezane virusne vektore, bakulovirusne vektore, plazmide, i ne-virusne vektore.

[0057] Primer postupka proizvodnje anti-humanih IL-17A antitela prema predmetnom opisu je opisan u Primeru 1.

III. Humanizacija IL-17A specifičnih antitela

[0058] Humanizovano antitelo može biti izabrano od bilo kog tipa imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA, i IgE. U jednom primeru izvođenja, antitelo je IgG antitelo. Bilo koji izotip IgG se može koristiti, uključujući IgGl, IgG2, IgG3, i IgG4. Varijante IgG izotipova su takođe predvidene. Humanizovano antitelo može sadržati sekvence izvedene iz više od jednog tipa ili izotipa. Optimizacija neophodnih sekvenci konstantnog domena da bi se stvorila željena biološka aktivnost lako se postiže skriningom antitela u biološkim analizama opisanim u nastavku u Primerima.

[0059] Slično tome, bilo koji tip lakog lanca može se koristiti u jedinjenjima i postupcima ovde. Specifično, kapa (κ), lambda (), ili njihova varijanta je korisna u predmetnim jedinjenjima i postupcima.

[0060] Primer postupka humanizacije anti-humanog IL-I7A antitela prema predmetnom opisu je opisan u Primeru 2.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0061] Ovde je predmetni pronalazak dodatno opisam u odnosu na primere; međutim, obim predmetnog pronalaska nije ograničen na njih. Do stepena do kog primeri uključuju bilo koji predmet koji je van obima patentnih zahteva, on je uključen samo kao referentni.

[0062] U primerima opisanim ovde, gde nisu opisani specifični uslovi, eksperimenti su generalno izvedeni pod konvencionalnim uslovima, ili pod uslovima predloženim od strane proizvođača materijala ili proizvoda. Videti Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protokols in Molecular Biology, Ausubel et al, Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY. Tamo gde nije dat specifično izvor reagenasa, reagensi su komercijalno dostupni konvencionalni reagensi.

Primer 1 mišje anti-humano IL-17A monoklonsko antitelo

[0063] Monoklonska antitela protiv humanog IL-17A su dobijena kao što sledi. 6-8 nedelja stare ženke BALB/c miševa (Shanghai Super B&K Laboratory Animal Corp. Ltd, laboratory animal production Certificate No: SCXK (HU) 2008-0016) i 6-8 nedelja stare ženke SJL miševa (Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co. Ltd, laboratory animal production Certificate No: SCXK (Beijing) 2012-0001) podeljene su u dve grupe, grupu sa visokom dozom i grupu sa niskom dozom. 10 BALB/c miševa i 10 SJL miševa su bili za svaku grupu.

[0064] Grupa sa visokom i niskom dozom su serijski imunizovane sa prirodnom hIL-17A varijantom (His-hIL-17A, aminokiselinska sekvenca hlL -17A odnosi se na humani 1L-17A protein Genbank pristupni broj NP-002181, rezultujući protein je prečišćen sa Ni afinitetnom kolonom (Superdex) 75SEC sekvencijalno), koje su dodatno His-tagovane na N-terminusu i stvorene sa HEK293E (293-EBNA, Invitrogen, Lot Num: 493985) ekspresionim sistemom. Inokulacije su izvedene na dan 0, 14, 35, i 56.

[0065] Na dan 0, na grupu sa visokom dozom je primenjen His-huIL-17A, 500mg/mišu, preko potkožne (s.c.) injekcije, i primenjen je kompletni Freund-ov ađuvant (CFA) preko intraperitonealne (i.p.) injekcije u isto vreme. Na dan 14 i 35, 25 mg/mišu His-hIL-17A je primenjen preko s.c. injekcija, u isto vreme, nekompletni Freund-ov ađuvans (IFA) je primenjen preko i.p. injekcije. Na dan 56, pre fuzionisanja splenocita, izveđena je buster imunizacija sa i.p. injekcijom sa 25 mg/mišu His-hIL-17A rastvorenim u fiziološkom rastvoru. Vremenski raspored i postupak za imunizaciju za grupu sa niskom dozom su isti kao oni za grupu sa visokom dozom, izuzev što je primenjena doza HishlL- 17A na dan 0 bila 10 mMg/mišu, primenjena doza His-hIL-17A na dan 14, 35, i 56 bila je 5mg/mišu.

[0066] Testiranje krvi je izvedeno na dan 22 i dan 43. Mišji serum je testiran sa ELISA testom opisanim u Primeru 1 da bi se odredio titar antitela u serumu. Na dan 56, miševi sa višim titrom antitela u serumu su izabrani za fuziju splenocita. Hibridom je dobijen fuzijom limfocita slezine sa ćelijama mijeloma Sp2/0 ćelija (ATCC® CRL- 8287™) korišćenjem

[0068] Primarni skrining rezultujućih hibridoma je izveden sa antigen-antitelo indirektnim ELISA testom u Test Primeru 1. Monoklonski ćelijski sojevi su dobijeni ograničavanjem razblaženja pozitivnih ćelijskih sojeva.

[0069] Izvršen je dodatni skrining dobijenih monoklonskih ćelijskih linija, uključujući:

1

1. Test blokiranja receptora, videti Test Primer 2, rezultati su prikazani u Tabeli 5, izvršen je skrinig i dobijena je monoklonska ćelijska linija lL17-mAb049 koja ima superiornu aktivnost u odnosu na pozitivnu kontrolu;

2. Test afiniteta: videti Test Primer 3, rezultati su prikazani u Tabeli 6, koji su otkrili da je monoklonska ćelijska linija IL17-mAb049 pronađena skrinigom i dobijena u predmetnom opisu pokazivala uporedivu ili bolju aktivnost kada je poređena sa pozitivnom kontrolom; 3. Bioanaliza na ćelijskom nivou (GROa analiza): videti Test Primer 4, rezultati su prikazani u Tabeli 8, koji su otkrili da je monoklonska ćelijska linija IL17-mAb049 pronađena skrinigom i dobijena u predmetnom opisu pokazivala uporedivu ili bolju aktivnost kada je poređena sa pozitivnom kontrolom.

[0070] Dvanaest monoklona je dodatno studirano nakon prvog i drugog skrininga. Jedan vodeći monoklon (vodeći mAb) od IL17-mAb049 je izabran grupisanjem epitopa, biološkim testom aktivnosti. Specifične sekvence teškog lanca (VH) i lakog lanca (LH) mišjeg IL-17A mišjeg antitela mAb049 (IL-17mAb) bile su kao što sledi:

IL-17 mAb049 VH SEQ ID NO: 1 HVQLQQSGADLVRPGASVTLSCKASGYIFTDYEVH WVKQTPVHGEEWIGVIDPGTGGVAYNQKFEGKATLTADDSSNTAYMELRSETSEDS AVYYCTRYSLFYGSSPYAMDYWGQGTSVTVSS

IL-17mAb049 VL SEQ ID NO: 2 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSV NYMHWFQQKPGTSPKLWIYRTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYY CQQRSSYPWTFGGGTNLEIK

Primer 2 Humanizacija mišjeg anti-humanog IL-17A antitela

[0071] Humanizacija mišjeg anti-humanog IL-17A monoklonskog antitela mAb049 je izvedena suštinski kao što je opisano u više literaturnih izvora javno poznatih u tehnici. Ukratko, humani konstantni domeni su korišćeni za zamenu roditeljskih (mišje antitelo) konstantnih domena. Sekvence humane klicine linije korišćene za humanizaciju izabrane su prema homologiji između mišjeg antitela i humanog antitela.

1. CDR regioni mišjeg anti-IL-17A antitela

[0072] VH/VL CDR aminokiselinski ostaci su identifikovani i označeni Kabat sistemom

2. Selekcija FR sekvenci humane klicine linije

[0073] Na osnovu tipičnih struktura dobijenih VH/VL CDRs mišjeg antitela, sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca poređene su sa bazom podataka za antitela. VHl-18 teškog lanca humane klicine linije (SEQ ID NO: 3) i AIO lakog lanca (SEQ ID NO: 4) sa visokom homologijom su dobijene i korišćene kao humanizovane FR sekvence. Specifične sekvence su kao što sledi:

VHl-18 SEQ ID NO: 3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGIS WVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSD DTAVYYCAR

AIO SEQ ID NO: 4 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWY QQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQSSSLP

3. Dizajn humanizovanog antitela:

[0074] Određeni su minokiselinski ostaci koji obrazuju konformaciju prstena i VH interfejs. Uzimajući u razmatranje sledeće faktore, Q1E mutacija bila je da se eliminiše formiranje N-terminalne piroglutaminske kiseline. Mutacije takođe uključuju one koje održavaju konzistentnost unutar izabrane VH familije, da bi se održala tipična struktura CDR i VH/VL interfejs, i izbegao N-glikozilovani obrazac (N-{P}-S/T) prisutan u humanizovanoj strukturi.

1

�

�

Primer 3 In vivo farmakokinetički i farmakodinamski test humanizovanog anti-IL-17 antitela

[0078] Humani IL-17 se može vezati za i stimulisati mišji IL-17 receptor, što dovodi do povećanja i nakon toga sekrecije hemokina kod mužjaka miševa KC (CXCL1). Eksperimenti sa različitim vremenima i različitim dozama su izvedeni da bi se identifikovala optimalna doza humanog IL-17 i najbolje vreme za indukovanje KC miševa (videti Test Primer 5). Ovi eksperimenti pokazuju da 150mg/kg humanog IL-17 i 2 časa nakon IL-17 primene indukuje najviši nivo KC u serumu miša. Antitela pune dužine prema predmetnom opisu su intravenski primenjena na miševe u koncentracijama od 3, 30, 300, 3000 μg/kg, 20 časova pre potkožne injekcije humanog IL-17. 2 časa nakon primene humanog IL-17, miševi su žrtvovani i KC nivo je određen korišćenjem komercijalno dostupnog kompleta, sa ELISA prema uputstvima proizvođača (Mouse CXCL1 / KC Quantikine ELISA Kit, R & D SYSTEM, # SMKC00B). Antitelo odgovarajućeg izotipa korišćeno je kao negativna kontrola. Antitela blokiraju sposobnost humanog IL-17 da stimuliše mišji IL-17 receptor, što rezultuje u inhibiciji povećanog KC na dozno zavisni način kod miševa. U poređenju sa neefikasnim kontrolnim antitelom, antitelo Hu049-18 prema predmetnom pronalasku smanjilo je prosečni KC nivo do oko 1/6 pod odgovarajućim uslovima na dozi od 3000 μg/mice.

[0079] Farmakokinetika u serumu pacova i rezus majmuna je određena nakon intravenske ili potkožne primene antitela Hu049-18 prema predmetnom pronalasku (videti Test Primer 6). Kod pacova, polu-život je bio 9.91 dana nakon intravenske primene 5mg/kg, i polu-život je

1

bio 11.5 dana nakon potkožne primene 5mg/kg. Kod makakija, polu-život je bio 24.4 dana nakon intravenske primene 1mg/kg.

Test Primeri

Test Primer 1 Indirektna ELISA

Svrha:

[0080] Postupak indirektne ELISA je izabran za osiguravanje selekcije antitela koja mogu prepoznati konformacioni epitop, i za skrining mišjih hibridoma iz Primera 1 prema predmetnom opisu.

Materijali:

[0081] Humani IL-17A (hIL-17A) je kloniran u skladu sa postupcima poznatim u tehnici, korišćenjem sekvenci humanog IL-17A proteina sa Genbank pristupnim br. NP-002181, i prolazno transfektovanim u HEK293E ćelije za ekspresiju.

[0082] Humani IL-17A/F (heterodimer, hIL-17A/F) je kloniran u skladu sa postupcima poznatim u tehnici, korišćenjem sekvenci humanog IL-17A proteina sa Genbank pristupnim br. NP-002181 i sekvencama humanog IL-17F proteina sa Genbank pristupnim br. NP 443104, i prolazno transfektovan u HEK293E ćelije za ekspresiju.

[0083] Kao pozitivne kontrole, Lilly i Novartis mišja anti-IL-17 antitela (Lilly mAb, Novartis mAb) klonirana su preko mišjih sekvenci opisanih u US7,838,638132 (LY 2439821) i US 7,807,155B2 (AIN 457), respektivno, i prolazno transfektovana u HEK293E ćelije za ekspresiju.

[0084] Mišja antitela mAbs izvedena iz mišjeg hibridoma opisanog u Primeru 1 predmetnog opisa.

Protokol:

[0085]

1. Mikrotitarske ploče su direktno obložene sa 1 μg/ml streptavidina, na 4 °C preko noći; 2. Mikrotitarska ploča je blokirana sa 300 μl PBST koji sadrži 2% BSA (zapr/zapr),

1

termostatski inkubirana na 37°C lč, dok su neobloženi bunarčići blokirani kao kontrola;

3. Ispiranje sa PBST tri puta, sva ispiranja su izvedena na Biotek (Elx 405) za automatsko ispiranje;

4. 100 μl PBS koji sadrži hIL-17A ili hIL-17A/F (1 μg/ml) je dodato svakom bunarčiću, termostatski inkubirano na 37 °C 1č;

5. PBST ispiranje 3 puta.

6. Pozitivne kontrole Lilly mAb i Novartis mAb ili mišje antitelo mAbs prema predmetnom opisu su titrirani pod 1: 5 razblaženjem, inicijalna koncentracija je 1 μg/ml. U svaki bunarčić je dodato 100 μl razblažene pozitivne kontrole ili mišjeg antitela prema predmetnom opisu, termostatski inkubirano na 37 °C 1č. Svaka koncentracija je titrovana u duplikatu bunarčića; 7. PBST ispiranje 3 puta;

8. 100 μl HRP anti-mišjeg sekundarnog antitela (Santa Cruz Cat.No.sc-2005) (1: 5000) je dodato u svaki bunarčić, termostatski inkubirano na 37 °C lč;

9. PBST ispiranje 3 puta. 100 μl TMB supstrata je dodato u svaki bunarčić, termostatski inkubirano na 37 °C 5 min. Zatim je reakcija zaustavljena sa dodavanjem 100 μl 2M H<2>SO<4>u svaki bunarčić;

10. OD vrednost na 450nm talasnoj dužini je očitana na ELISA čitaču mikroploča (Molecular Devices, Spectra Мах).

11. OD vrednosti mAbs mišjeg antitela su poređene sa onima od pozitivnih kontrola. Izvršen je skrining monoklonskih ćclijskih linija sa odnosom većim od 1, pri čemu je uključen IL17-mAb049.

Test Primer 2 Analiza blokiranja IL-17 receptora (RBA)

Svrha:

[0086] Svrha analize blokiranja receptora je da se izaberu antitela koja su sposobna da blokiraju vezivanje IL-17 sa IL-17 receptorom (npr., hIL-17RA). Test je zasnovan na funkcionalnom testu, i može se koristiti za skrining hibridoma sa velikim prolazom.

Materijali i oprema:

[0087] Anti-humano Fc antitelo (kozje anti-humani IgG-Fc fragment specifično antitelo (dostupno do Jackson Imunoresearch, 109-005-008))

[0088] Humani IL-17RA-Fc korišćen ovde je kloniran u skladu sa postupcima poznatim u

2

tehnici, korišćenjem aminokiselinskih sekvenci humanog IL- 17A receptora sa Genbank ID No. ADY 18334.1, i prolaznim transfektovanjem u HEK293E ćelije za ekspresiju, pri čemu su Fc fragmenti dobijeni iz humanog IgG 1.

[0089] Kao pozitivne kontrole, Lilly i Novartis mišja anti-IL-17 antitela (Lilly mAb, Novartis mAb) su klonirana prema mišjim sekvencama opisanim u US 7,838,638B2 (LY 2439821) i US 7,807,155B2 (AIN 457), i prolazno transfektovana u HEK293E ćelijama za ekspresiju. mlgG: Mišji IgG (Millipore Cat.No.PP54), korišćen kao blanko kontrola ELISA čitač ploča:

Molecular Devices, Spectra Мах

Mišji monoklonski ćelijski sojevi dobijeni iz Primera 1 prema predmetnom opisu.

Protokol:

[0090]

1. Mikrotitarske ploče su direktno obložene sa 10 μg/ml anti-humanog Fc antitela, inkubirane na 4°C preko noći;

2. Mikrotitarske ploče su blokirane sa 300 μl PBST koji sadrži 2% BSA (zapr/zapr), termostatski inkubirane na 37 °C Ič, dok je neobloženi bunarčić blokiran kao kontrola;

3. Ispiranje sa PBST tri puta, sva ispiranja su izvedena na Biotek (E1x 405) za automatsko ispiranje;

4. 100 μl PBS koji sadrži IL-17 RA-Fc (60 ng/ml) dodato je u svaki bunarčić, termostatski inkubirao na 37 °C 2č;

5. PBST ispiranje 3 puta.

6. Pozitivne kontrole Lilly mAb i Novartis mAb ili antitela prema predmetnom opisu su razblažene na odnosu od 1:5, inicijalna koncentracija je bila 40 μg/ml. mlgG je razblaženo sa istim postupkom. U svaki bunarčić je dodato 50 μl razblažene pozitivne kontrole ili mišjeg antitela prema predmetnom opisu ili mlgG je dodat svakom bunarčiću, u međuvremenu, 50 μl 0. 2nM biotin obeleženog IL-17A je dodato razblaženoj pozitivnoj kontroli ili antitelu prema predmetnom opisu, promešano nežno i termostatski inkubirano na 37 °С 1č.

7. PBST ispiranje 3 puta;

8. Svakom bunarčiću je dodato 100 μl HRP-obeleženog streptavidin kompleksa (1:5000), termostatski inkubirano na 37 °C 1č;

9. PBST ispiranje 3 puta.100 μl TMB supstrata je dodato svakom bunarčiću, termostatski inkubirano na 37 °C 5 min. Zatim je reakcija zaustavljena dodavanjem 100 μl 2M H2SO4svakom bunarčiću;

10. OD vrednost na 450nm talasnoj dužini je očitana na ELISA čitaču mikroploča.

11. IC<50>vrednost antitela koje se testira izračunata je za blokiranje vezivanja 1L-17 sa IL-17 receptorom.

[0091] IC<50>vrednost (koncentracija antitela kada je OD vrednost smanjena do 50%, tj. RBA) dobijena je u skladu sa gradijentom krive OD vrednosti nasuprot koncentracije antitela.

Eksperimentalni rezultati:

[0092] U skladu sa prethodnim postupkom, izvršen je skrining hibridoma dobijenog u Primeru 1 da bi se dobilo mišje monoklonsko antitelo, označeno kao IL17-mAb049, rezultati su kao što sledi:

[0093] Zaključak: lzvršeni skrining mišjeg antitela IL17-mAb 049 iz hibridoma pokazao je bolju aktivnost od pozitivnih antitela Lilly mAb i Novartis mAb.

Test Primer 3 Test afiniteta

Svrha:

[0094] BIACORE postupak je korišćen u eksperimentu za određivanje antigen-antitelo vezujuće kinetike i afiniteta.

Materijali i oprema:

[0095]

1.1 Proteini:

Humani IL-17A (hIL-17A) je kloniran u skladu sa postupcima poznatim u tehnici, korišćenjem sekvenci humanog 1L-17A proteina sa Genbank pristupnim br. NP-002181, i prolazno transfektovan u HEK293E ćelije za ekspresiju. Humani IL-17A/F (heterodimer, hlL- 17A/F) je kloniran u skladu sa postupcima poznatim u tehnici, korišćenjem sekvenci humanog IL- 17A proteina sa Genbank pristupnim br. NP-002181 i sekvenci humanog IL- 17F proteina sa Genbank pristupnim br. NP_443104, i prolazno transfektovan u HEK293E ćelijama za ekspresiju. Mišji IL-17A (Mu IL-17A) i IL-17A pacova (pacovski IL-17A) su klonirani u skladu sa postupcima poznatim u tehnici, korišćenjem sekvenci IL-17A proteina sa Genbank Pristupnim br. NP_034682 i pacovskog IL-17A proteina sa Genbank pristupnim br. NP_00l 100367, respektivno, i prolazno transfektovani u HEK293E ćelije za ekspresiju. Kao pozitivne kontrole, Lilly i Novartis mišja anti-lL-17 antitela (Lilly mAb, Novartis mAb) su kloniran u skladu sa mišjim sekvencama opisanim u US 7,838,638B2 (LY 2439821) i US 7,807,155B2 (AIN 457), respektivno, i prolazno transfektvani u HEK293E ćelijma za ekspresiju. Kao pozitivna kontrola, Lilly humanizovano anti-lL-17 antitelo (Lilly mAb(hu),) je klonirano prema humanizovanim sekvencama opisanim u US 7,838,638B2 (LY 2439821), i prolazno transfektovano u HEK293E ćelijama za ekspresiju. Mišji monoklonski ćelijski sojevi su dobijeni iz Primera 1 prema predmetnom opisu. Humanizovana IL-17 antitela dobijena iz Primera 2 prema predmetnom opisu.

1.2 BIACORE Model: BIACORE X 100, GE;

1.3 BIACORE čipovi i reagensi (komercijali nazivi su navedeni ovde, bez potvrđenog prevoda):

2

Protokol:

[0096]

1. Antitelo prema predmetnom opisu je imobilisano na CM5 čipu: 1:150m NHS: 200m EDC je pripremljen i injektiran u FC2 (Protočna ćelija 2) kanal sa stopom od 10 mML/min, 7min, da bi se aktivirao CM5 senzorni čip. Antitelo prema predmetnom opisu je rastvoreno u puferu 10 mM natrijum acetata na koncentraciji od 30μg/ml, PH 5.0, i injektirano u aktivirani čip (HBS-EP pufer pokretne faze: 10 m HEPES, 150 m NaCl, 3.4 m EDTA, 0.005% surfaktant P20, pH 7.4) na stopi od 5μL/min. 1M etanolamin je injektiran sa stopom od 10μL/min, 7min, da bi se zapečatili preostali aktivirani kuplujući položaji. Oko 8000RU je generisano.

2. Test kinetike vezivanja: FCl (Protočna ćelija 1) je korišćena kao referentni kanal, FC2 (Protočna ćelija 2) je korisna kao kanal za uzorak, mišje ili humanizovano kontrolno antitelo ili antitelo prema predmetnom opisu je uhvaćeno na FC2 kanalu u 300RU, praćeno sa injekcijom različitih koncentracija od IL-17 (uključujući hlL-17A, MuIL-17, Rat 1L-17). Uslovi ciklusa su bili: injektiranje analita u sve FC kanale sa 30μl /min 3min, disocijacija 20min, injektiranje 10 mM glicina, pH 1.5, 60s (na stopi od 10μl/min) za regeneraciju površine. Razlika između signala sa zarobljenim antitelom i signala bez zarobljenog antitela je izračunata sa Biacore Х100 softverom za procenu ver 2.0 (Biacore), tekući pufer je bio 10 mM Hepes, 650m NaCl, Зт EDTA, 0.05% Tween-20.

Eksperimentalni rezultati:

[0097]

1. Prema prethodnom postupku, izvršen je skrining hibridoma dobijenih u Primeru 1, rezultati su kao što sledi:

Zaključak: Afinitet humanizovanog antitela bio je povećan 10 puta u odnosu na onaj od Lilly pozitivnog antitela (1.48E- 11M).

Test Primer 4 Bioanaliza na ćelijskom nivou (GROα analiza)

Svrha:

[0098] Namera je da sledeći eksperiment detektuje ćelijsku biološku aktivnost anti-lL-17A antitela preko inhibicije IL-17-stimulisane sekrecije GROα from iz Hs27 ćelija sa anti-lL-17A antitelom.

2

Materijali i oprema:

[0099] Hs27 ćelije: ATCC Cat.No.CRL-1634 (Napomena: ćelije kultivisane više od šest nedelja nisu preporučljive za bioanalizu);

Hs27 meduijum kulture ćelija: DMEM 10% FBS DMEM: ATCC Cat.No.30-2002;

FBS: GIBCO Cat.No.10099, lot 8122818;

Rekombinantni humani IL-17A (rhIL-17A): R&D Systems Cat.No.317-ILB, lot SOA161109B;

Rekombinantni humani IL-17A/F (rhIL-17A/F): R&D System Cat No.5194-IL/CF, lot RXT101109A;

Humani CXCLl/GRO alpha Quantikine PharmPak kit: R&D system Cat. No. PDGR00 Oprema: Biotek ELx808 čitač mikroploča.

[0100] Mišji monoklonski ćelijski soj dobijen iz Primera 1 prema predmetnom opisu.

[0101] Humanizovano IL-17 antitelo dobijeno iz Primera 2 prema predmetnom opisu.

Protokol:

[0102]

1. Hs27 ćelijska kultura:

Hs27 ćelije su kultivisane u 50ml DMEM 10%FBS medijum u T175 boci; ćelije (gustina od oko 90%) su kultivisane u razblaženju na odnosu od 1:3 svaka 3 dana; ćelije su korišćene za bioanalizu unutar mesec dana, ili su ponovo odmrznute iz tenog azota; zatim ponovo odmrznute ćelije treba da budu kultivisane skoro nedelju dana pre bioanalize

2. Eksperimentalna bioanaliza (IL-17A)

2.1 Hs27 ćelije su centrifugirane na 950rpm 4min (kompletno uklanjanje tripsin-EDTA) i sakupljene. Vijabilnost ćelija je analizirana sa tripan plavom bojom, samo ćelije sa > 80% vitalnosti su uzete za eksperiment;

2.2 Medijum je dodat u ploču sa 96 bunarčića sa 50 μl/bunarčiću;

2.3 Hs27 ćelije su razblažene sa DMEM+10% FBS i dodate u ploču sa 96 bunarčića na gustini od 10000 ćelija/50 μl/bunarčić;

2.4 25 μ1 IL-17 humanog antitela je odato u svaki dupikat bunarčića; antitelo je razblaženo u odnosu 1:3 sa inicijalnom koncentracijom od 10nM;

2.5 25 μl rekombinantnog humanog 1L-17A je dodato u svaki bunarčić sa finalnom

2

koncentracijom od 0.3nМ. Ploča sa 96-bunarčića je centrifugirana na 500rpm lmin; 2.6 Ćelije su termostatski inkubirane na 37 °C 17 č;

2.7 Sakupljen je supernatant ćelijske kulture, koncentracija GROα je detektovana u supernatantu sa humanim CACL1/GRO alpha Quantikine kit (prema uputstvima proizvođača);

3. Eksperimentalne procedure bioanalize (IL-17A/ F):

[0103] Procedure IL-17A/F bioanalize su slične onima za 1L-17A bioanalizu, izuzev što je IL-17A supstituisan sa IL-17A/F.

Eksperimentalni rezultati:

[0104]

1. Prema prethodnim postupcima, hibridom dobijen u Primeru 1 je podvrgnut skriningu, rezultati su kao što sledi:

2

[0105] Zaključak: Ovi rezultati ukazuju da sva humanizovana antitela pokazuju ćelijsku biološku aktivnost. Hu049-17, 18, 19 i 20 imaju IC50(0.04nM-0.066nM) sličnu onoj od pozitivnog antitela (0.04nM). Dodatno, ova antitela prikazuju unakrsnu reakciju sa makaki IL-17A (IC50je 0.03 nM-0.039 nM). Aktivnost sa humanim IL-17A/F je oko 10 puta slabija nego ona sa IL-17A.

Test Primer 5 Test neutralizacije humanih IL-17 in vivo

Svrha:

[0106] Cilj in vivo testa neutralizacije je da se verifikuje da antitela prema opisu mogu in vivo blokirati vezivanje IL-17 sa IL-17 receptorom (npr., hIL-17RA), čime inhibiraju CXCR1 ekspresiju indukovanu sa IL-17.

Materijali i opreme:

[0107] Protein: Humani 1L-17A (hIL-17A) je kloniran u skladu sa postupcima poznatim u tehnici, korišćenjem sekvenci humanog IL- 17A proteina sa Genbank pristupnim br. NP-002181, i prolaznom transfekcijom u HEK293E ćelijama za ekspresiju.

[0108] Kao pozitivna kontrola, Lilly humanizovano anti-IL-17 antitelo (Lilly mAb (hu),) je klonirano u skladu sa humanizovanim sekvencama opisanim u US 7,838,638B2 (LY 2439821), i prolazno transfektovano u HEK293E ćelije za ekspresiju.

[0109] Humani IgG (HulgG): (Millipore Cat.No,AG711).

]0110] Životinje: 7-nedelja-stari C57/B6 mužjaci miševa (kupljeni od SINO-BRITSH SIPPR/BK LAB. ANIMAL LTD., CO, Certificate NO.: SCXK (Shanghai) 2008-0016), 6 miševa u svakoj grupi.

2

[0111] Reagensi: Ab rastvor za razblaživanje: citratni pufer (pH 5.0): 10 mM natrijum citrat, 50mM NaCl

[0112] hIL-17A rastvor za razblaživanje: PBS (natrijum fosfat pufer, pH 7.2).

[0113] Mišji CXCL1/KC Quantikine ELISA Kit, ploče sa 6-bunarčića, R&D SYSTEM, #SMKC00B.

Protokol:

[0114]

1) Miševi su podeljeni u 15 grupa, 6 u svakoj grupi.

2) 100μL Hu049-18 ili kontrolnog antitela (HuIgG ili Lilly mAb (hu)) ili razblaženog rastvora je intraperitonealno (I.P.) primenjeno na savakog miša, doze leka za primenu bile su 3000mg/kg, 300mg/kg, 30ug/kg i 3mg/kg, respektivno.

3) 20 časova kasnije, hIL-I7A je injektiran potkožno (SC) sa 150mg/kg, svakom mišu je injektirano 100uL.

4) 2 časa kasnije, sakupljeni su uzorci krvi, stavljeni na sobnu temperaturu 2 časa, do koagulacije, ili 2-8 °C preko noći, do koagulacije, i zatim centrifugirani na 2000x g 20 min. Supernatant je odbačen, detekcija je izvedena neposredno ili su alikvoti uzorka uskaldišteni na -20 °C. Izbegavati ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje.

5) Uzorci dobijeni iz Koraka 4 su mereni sa mišjim CXCL1/KC Quantikine ELISA Kit.

Eksperimentalni rezultati:

[0115] Prema prethodnom postupku, humanizovano antitelo Hu049-18 dobijeno iz Primera 2 je testirano, rezultati su kao što sledi:

2

prema predmetnom pronalasku smanjuje prosečni KC nivo do oko 1/6 na dozi od 3000mg/mišu

pod opisanim uslovima. U poređenju sa kontrolnim antitelom, Hu-049-18 antitelo prema

predmetnom pronalasku pokazuje sposobnost da inhibira KC na dozi od 3000mg/mišu pod

opisanim islovima.

Test Primer 6 Određivanje polu-života (Т1/2) antitela in vivo

Svrha:

[0117] Određivanje farmakokinetičkih parametara antitela Hu049-18 prema predmetnom

pronalasku kod pacova ili makaki majmuna in vivo.

Materijali i reagensi:

[0118] Protein: Humani IL-17A (hIL-17A) je kloniran prema postupcima poznatim u tehnici,

upotrebom sekvenci humanog IL- 17A proteina sa Genbank pristupnim br. NP-002181, i

prolazno transfektovan u HEK293E ćelije za ekspreisju.

[0119] Kao pozitivna kontrola, Lilly humanizovano anti-IL-17 antitelo (Lilly mAb (hu),)

klonirano je prema humanizovanim sekvencama opisanim u US 7,838,638B2 (LY 2439821), i

prolazno transfektovano u HEK293E ćelije za ekspresiju.

[0120] Humani IgG (HuIgG): Humani IgG, poliklonski, Millipore Cat.No.AG711 Životinje:

230-250g SD mužjaci pacova (kupljeni od Shanghai SLAC laboratory Animal Co., Ltd.,

Certificate NO: SCXK (Shanghai) 2007-0005), podeljeni u dve grupe sa intravenskom

injekcijom (IV) grupa (dorzalni deo stopala) i potkožnom injekcijom (SC) grupa, 5 pacova po

svakoj grupi.

Makaki: 2-3kg makaki majmuni (Hainan Jingang Biotechnology Co., Ltd. Certificate NO:

SCXK (HN) 2010-0001, 0000152.)

Reagensi: rastvor za razblaživanje antitela: citratni pufer (pll 5.0): 10 mM natrijum citrat,

50mM NaCl hIL-17A rastvor za razblaživanje: PBS (natrijum fosfat pufer, pH 7.2)

Kozje anti-humano IgG (Fab-specifično) peroksidaza konjugovano antitelo, Sigma Cat,No.l21M4811

Protokol:

1. Procedure za detekciju kod pacova:

(1) In vivo primena

SD pacovi su randomizovano podeljeni u dve grupe (intravenska injekcija (IV) (dorzalna strana stopala) grupa i potkožna injekcija (SC) grupa), 5 pacova po svakoj grupi;

Pod sterilnim uslovima, Hu049-18 je rastvoren u citratnom puferu (pH 5.0) do finalne koncentracije od 2.5mg/mL;

Na svakog pacova je IV ili SC primenjena doza od 5mg/kg;

Za IV grupu, uzorak krvi je uzet preko repne vene 0min, 5min, I5min, 30min, lč, 2č, 4č, 8č, 24č, 2d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21d, 28d nakon primene, 200 uL (ekvivalentno 80uL seruma) svaki put;

Za SC grupu, uzorak krvi je uzet preko repne vene 0min, 30min, lč, 2č, 4č, 8č, 12č, 24č, 2d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21 d, 28d nakon primene, 200 uL (ekvivalentno 80uL seruma) svaki put; Uzorci krvi su sakupljeni i ostavljeni pola časa na sobnoj tmperaturi do koagulacije, i zatim su centrifugirani na 4 °C, na 100003g 5 minuta. Supernatant je sakupljen za neposredni test ili alikvoti uzorka su uskladišteni na -80°C. Izbegavati ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje. (2) Uzorci seruma dobijeni u koraku (1) su detektovani sa ELISA

1) Standardna kriva

a) Mikrotitarska ploča je direktno obložena sa 1 μg/ml streptavidina, na 4 °C preko noći; b) Mikrotitarska ploča je blokrana sa 300 μl PBST koji sadrži 2% BSA (zapr/zapr), termostatski inkubirana na 37 °C 1č, dok je neobloženi bunarčić blokiran kao kontrola;

c) Ispiranje sa PBST tri puta, svi koraci ispiranja su izvedeni na Biotek (Elx 405) za automatsko ispiranje;

d) 100 μl PBS koji sadrži hIL-17A (0.2 μg/mL) je dodato u svaki bunarčić, termostatski inkbirano na 37 °C lč;

e) PBST ispiranje 3 puta.

f) Hu049-18 titracija: razblaživanje u odnosu od 1: 2 sa razblaženjem antitela, inicijalna koncentracija je bila 0.8 μg/ml. 100 μl razblaženog Hu049-18 je dodato u svaki bunarčić, formirana je standardna kriva. Ploča sa 96-bunarčića je termostatski inkubirana na 37 °C lč. g) PBST ispiranje 3 puta;

h) 100 μl kozjeg anti-humanog IgG (Fab-specifično) peroksidaza konjugovanog antitela (Sigma Cat. No. 121M4811) (1:5000) dodato je u svaki bunarčić, termostatski inkubirano na 37 °C lč;

i) PBST ispiranje 3 puta.100 μl TMB supstrata je dodato u svaki bunarčić, termostatski

1

inkubirano na 37 °C 5min. Zatim je reakcija zaustavljena dodavanjem 100 μl 1M HCl svakom bunarčiću;

j) OD vrednost na 450nm/630nm talasnoj dužini je očitana na ELISA čitaču mikrotitarskih ploča (Molecular Devices, Spectra Мах).

2) Testiranje uzorka:

a) Mikrotitarska ploča je direktno obložena sa 1 μg/ml streptavidina, na 4 °C preko noći; b) Mikrotitarska ploča je blokirana sa 300 μl PBST koji sadrži 2% BSA (zapr/zapr), termostatski inkubirana na 37 °C lč, dok je neobloženi bunarčić bio blokiran kao kontrola; c) Ispiranje sa PBST tri puta, svi koraci ispiranja su izvedeni na Biotek (Elx 405) za automatsko ispiranje;

d) 100 μl PBS koji sadrži hIL-17A (0.2 μg/mL) dodato je u svaki bunarčić, termostatski inkubirano na 37 °C lč;

e) PBST ispiranje 3 puta.

f) Titracija uzorka seruma: Pre eksperimenta, uzorak seruma pacova je razblažen u različitim odnosima da bi se dobio optimalni odnos razblaženja na kojem je koncentracija antitela u serumu bila baš u sredini standardne krive. Uzorci seruma su razblaženi u skladu sa optimalnim odnosom razblaženja, dok je Hu049-18 razblaženo do 25ng/mL. 100 μl razblaženog uzorka seruma i Hu049-18 su dodati u svaki bunarčić, i termostatski inkubirani na 37 °C 1č. Svaka koncentracija je titrovana u duplikatu bunarčiću;

g) PBST ispiranje 3 puta;

h) 100 μl kozjeg anti-humanog IgG (Fab-specifično) peroksidaza konjugovanog antitela (Sigma Cat. No. 121M4811) (1:5000) dodato je u svaki bunarčić, termostatski inkubirano na 37 °C lč;

i) PBST ispiranje 3 puta. 100 μl TMB supstrata je dodato u svaki bunarčić, termostatski inkubirano na 37 °C 5min. Zatim je reakcija zaustavljena sa dodavanjem 100 μl 1M HCl u svaki bunarčić;

j) OD vrednost na 450nm/630nm talasnoj dužini je očitana na ELISA čitaču mikroploča (Molecular Devices, Spectra Мах).

2. Procedure detckcije za makaki majmune:

[0122] Procedure in vivo detekcije za makake (Macaca fascicularis) bile su slične onima za pacove, razlike su bile sledeće: primena na makaki majmune bila je samo preko intravenske

2

injekcije (IV) sa dozom od lmg/kg, uzorak krvi je uzet preko repne vene na 0min, 5min, 15min, 30min, lč, 2č, 4č, 8č, 24č, 32č, 3d, 4d, 5d, 6d, 9d, 12d, 14d, 17d, 21d, 28d, 35d nakon primene, 500 μL svaki put. Uzorak seruma nakon centrifugiranja je podeljen u tri dela (osigurati da svaki od 2 dela sadrži 60 μL uzorka), i zamrznuti na -80°C za test.

Eksperimentalni rezultati:

[0123] Prema prethodnom postupku, humanizovano antitelo Hu049-18 dobijeno iz Primera 2 je detektovano, rezultati su kao što sledi:

[0124] Zaključak: Ovi rezultati pokazuju da, u poređenju sa kontrolnim antitelom Lilly (Т1/2vrednost pozitivnog antitela kod makaki majmuna je zabeleženo kao 6.5 dana (iv) i 10.3 dana (sc)), antitelo Hu049-18 prema predmetnom pronalasku značajno je produžilo in vivo poluživot pod opisanim uslovima.

�

�

�

Claims (7)

Patentni zahtevi

1. IL-17A vezujće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koje sadrži:

varijabilni region lakog lanca antitela, koji sadrži LCDRl, LCDR2 i LCDR3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, i SEQ ID NO: 15 respektivno; i varijabilni region teškog lanca antitela, koji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 kao što je prikazano u SEQ 1D NO: 10, SEQ 1D NO: 11, i SEQ ID NO: 12, respektivno; naznačeno time da je varijabilni region teškog lanca antitela izabran od varijabilnog regiona teškog lanca prikazanog u SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 7; i naznačeno time da varijabilni region lakog lanca antitela je izabran od varijabilnog regiona lakog lanca u SEQ ID NO: 9.

2. IL-17A vezujuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, koje dodatno sadrži konstantni region lakog lanca izveden iz humanog κ lanca, ili konstantni region lakog lanca izveden iz humanog λ lanca.

3. IL-17A vezujuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koje dodatno sadrži konstantni region teškog lanca izveden iz humanog IgGl, konstantni region teškog lanca izveden iz humanog IgG2, konstantni region teškog lanca izveden iz humanog IgG3, ili konstantni region teškog lanca izveden iz humanog IgG4.

4. Vektor koji eksprimira IL-17A vezujuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

5. Vektor prema patentnom zahtevu 4, koji sadrži nukleotid koji kodira IL-17A vezujuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

6. Farmaceutska kompozicija, koja sadži: IL-17A vezujuće antitelo ili njegov antigenvezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva 1-3; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, razblaživač ili nosač.

7. The IL-17A vezujuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva 1-3, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 6, za upotrebu u tretmanu 1L-17 posredovane inflamatorne ili autoimune bolesti;

naznačeno time da je bolest izabrana od psorijaze, psorijatičkog artritisa, ankiloznog spondilitisa, multiple skleroze ili inflamatornog artritisa.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5