RS61047B1 - Postupci za lečenje kancera sa hemizigotnim gubitkom gena tp53 - Google Patents

Postupci za lečenje kancera sa hemizigotnim gubitkom gena tp53

Info

Publication number
RS61047B1
RS61047B1 RS20201349A RSP20201349A RS61047B1 RS 61047 B1 RS61047 B1 RS 61047B1 RS 20201349 A RS20201349 A RS 20201349A RS P20201349 A RSP20201349 A RS P20201349A RS 61047 B1 RS61047 B1 RS 61047B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
polr2a
cancer
cells
gene
cell
Prior art date
Application number
RS20201349A
Other languages
English (en)
Inventor
Xiongbin Lu
Yunhua Liu
Original Assignee
Univ Texas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Texas filed Critical Univ Texas
Publication of RS61047B1 publication Critical patent/RS61047B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6831—Fungal toxins, e.g. alpha sarcine, mitogillin, zinniol or restrictocin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/57595—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving intracellular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4748—Details p53
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Virology (AREA)

Description

Opis
OSNOV PRONALASKA
[0001] Ova prijava zahteva pravo prvenstva od privremene SAD prijave serijski br. 62/128,480, podnete 4.3. 2015.
1. Oblast pronalaska
[0002] Predmetni pronalazak se uopšteno odnosi na oblast medicine i biologije kancera. Konkretnije, odnosi se na postupke za lečenje kancera koji nose hemizigotni gubitak TP53.
2. Opis stanja tehnike
[0003] TP53, dobro poznati tumor-supresorski gen, često je inaktiviran mutacijom ili delecijom u velikom broju tumora kod ljudi (Petitgean et al., 2007; Vazquez et al., 2008). U terapijama kancera ulažu se ogromni napori da se obnovi aktivnost p53 (Chene, 2003; Wade et al., 2013). Iako je genska terapija upotrebom adenovirusnih vektora koji eksprimiraju divlji tip p53 pokazala aktivnost u nekoliko kliničkih ispitivanja, promenljiva i nedovoljna isporuka gena u svaku tumorsku ćeliju i prisustvo antitela domaćina na adenovirus ograničavaju njenu kliničku upotrebu (Lane et al., 2010; Haupt and Haupt, 2004). Razvijen je i veliki broj malih hemijskih jedinjenja koja pojačavaju aktivnost p53. Međutim, ona mogu da se primene samo kod humanih kancera koji imaju divlji tip p53 (Cheok et al., 2011; Goldstein et al., 2011).
[0004] Mook et al. (2009) opisuje siRNKs usmerene na POLR2A; takođe opisuje da je ovaj gen smešten veoma blizu p53 gena, koji često ispoljava LOH (tj. hemizigotan je) u ćelijama kancera. siRNK mogu selektivno da inhibiraju ekspresiju POLR2A i da inhibiraju proliferaciju kancerskih ćelija i rast tumora kod golih (nude) miševa (videti apstrakt). Fluiter et al. (2002) koriste antisens oligonukleotide umesto siRNKs. Fluiter et al. (2003) se odnosi na inhibiciju specifičnu za alel kao pristup u lečenju genetskih poremećaja ciljnim delovanjem na gene koje su kancerske ćelije izgubile.
[0005] Davis et al. (1981) opisuju konjugat alfa-amanitina i monoklonskog imunoglobulina G usmerenog na Thy 1.2 antigen, koji je selektivno toksičan za T limfom. Dodatni konjugati antitela sa lekom opisani su kod Adair et al. (2012). U WO2014/135282 A1 otkriveno je da obrazovanje prstena preko dva atoma kiseonika vezana za γ- i δ- C-atome aminokiseline 3 amatoksina može da poboljša tolerabilnost konjugata amatoksina sa fragmentom koji se vezuje za ciljno mesto, bez ometanja interakcija takvih amatoksina sa njihovim ciljnim molekulom. Konjugati antitela sa toksinom za lečenje kancera pankreasa, holangiokarcinoma, ili kolorektalnog kancera koji sadrže antitelo specifično za EpCam, amatoksin i opciono linker opisani su u WO2010/115630 A1.
[0006] Međutim, nijedna efikasna terapija zasnovana na p53 nije uspešno prevedena u kliničko lečenje kancera zbog složenosti regulatora p53 i njihove male primenljivosti kao lekova. Zbog toga, potrebne su nove strategije za lečenje kancera kojima nedostaje p53.
REZIME PRONALASKA
[0007] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima.
[0008] Prema otkriću predmetne specifikacije, obezbeđeni su postupci za lečenje pacijenta koji ima kancerske ćelije koje ispoljavaju (i) hemizigotni gubitak gena TP53; (ii) hemizigotni gubitak gena POLR2A; i/ili (iii) snižen nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo ekspresije (npr., nivo ekspresije u nekanceroznom uzorku), pri čemu postupak obuhvata davanje terapijski efikasne količine inhibitora POLR2A takvom pacijentu. U određenim aspektima, pacijent ima kancerske ćelije koje ispoljavaju hemizigotni gubitak gena TP53. U određenim aspektima, pacijent ima kancerske ćelije koje ispoljavaju hemizigotni gubitak gena POLR2A. U određenim aspektima, pacijent ima kancerske ćelije koje ispoljavaju sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo ekspresije.
[0009] U određenim aspektima, inhibitor POLR2A sadrži alfa-amanitin. U nekim aspektima, alfa-amanitin je konjugovan sa antitelom, kao što je antitelo usmereno na kancerske ćelije (npr., antitelo protiv antigena povezanog sa tumorom). U nekim aspektima, antitelo može da bude specifično za EpCAM.
[0010] U određenim aspektima, proizvod gena POLR2A je iRNK. Nivo ekspresije iRNK može da se odredi metodom Northern blotting, kvantitativnom PCR metodom reverzne transkriptaze u realnom vremenu (RT-qPCR), testom zaštite nukleaze, analizom transkriptoma, testom hibridizacije, ekspresionom platformom na bazi čipa, ili testom na bazi platforme „invader“ RNK. U određenim aspektima, proizvod gena POLR2A je protein. Nivo ekspresije proteina može da se odredi masenom spektrometrijom, analizom western blot, ELISA testom, imunoprecipitacijom, imunohistohemijom, ili radioimunoesejem. U određenim aspektima, detektuje se broj kopija u genomu da bi se odredio hemizigotni gubitak gena TP53 ili hemizigotni gubitak gena POLR2A. U nekim aspektima, broj kopija u genomu određuje se tehnikom genomske hibridizacije (npr. FISH analiza), PCR analizom (npr., PCR u realnom vremenu), ili analizom restrikcionih fragmenata.
[0011] U određenim aspektima, kancer je kancer pluća, kancer mozga, kancer dojke, kancer jetre, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer prostate, ili kancer pankreasa. U određenim aspektima, kancer je metastatski kancer, rekurentni kancer, ili kancer otporan na više lekova.
[0012] Prema otkriću predmetne specifikacije, postupci dalje obuhvataju davanje najmanje druge antikancerske terapije subjektu. U određenim aspektima, druga antikancerska terapija je hirurška terapija, hemoterapija, terapija zračenjem, krioterapija, hormonska terapija, terapija toksinom, imunoterapija, ili terapija citokinima. U određenim aspektima, hemoterapija je 5-fluorouracil, oksaliplatin, ili SN-38.
[0013] U određenim aspektima, pacijent je čovek. U određenim aspektima, pacijent je sisar koji nije čovek.
[0014] U određenim aspektima, pacijent se leči najmanje drugi put. U određenim aspektima, pacijent se leči tokom perioda od 1 nedelje do 6 meseci. U određenim aspektima, pacijent je prethodno bio podvrgnut najmanje jednom ciklusu antikancerske terapije.
[0015] Prema otkriću predmetne specifikacije, obezbeđeni su postupci za lečenje pacijenta koji ima kancer koji obuhvataju (a) odabir pacijenta za koga je utvrđeno da ima kancerske ćelije koje uključuju (i) hemizigotni gubitak gena TP53; (ii) hemizigotni gubitak gena POLR2A; i/ili (iii) sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo; i (b) davanje terapijski efikasne količine inhibitora POLR2A pacijentu.
[0016] U određenim aspektima, odabir terapije lekom za pacijenta sa kancerom obuhvata uzimanje uzorka kancera i utvrđivanje da li ćelije kancera sadrže (i) hemizigotni gubitak gena TP53; (ii) hemizigotni gubitak gena POLR2A; i/ili (iii) sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo. U određenim aspektima, postupci dalje uključuju pružanje izveštaja o utvrđivanju. U određenim aspektima, izveštaj je pisani ili elektronski izveštaj. U određenim aspektima, izveštaj se daje pacijente, obvezniku zdravstvene zaštite, lekaru, agentu osiguranja, ili se unosi u elektronski sistem.
[0017] U određenim aspektima, odabir terapije lekom za pacijenta sa kancerom obuhvata dobijanje rezultata testa kojim se utvrđuje da li ćelije kancera sadrže (i) hemizigotni gubitak gena TP53; (ii) hemizigotni gubitak gena POLR2A; i/ili (iii) sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo.
[0018] U određenim aspektima, ćelije kancera sadrže hemizigotni gubitak gena TP53. U određenim aspektima, ćelije kancera sadrže hemizigotni gubitak gena POLR2A. U određenim aspektima, ćelije kancera imaju sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo (npr., nivo ekspresije u uzorku koji nije kancerozan).
[0019] U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su postupci za odabir terapije lekom za pacijenta sa kancerom koji obuhvataju (a) uzimanje uzorka kancera; (b) detekciju prisustva (i) hemizigotnog gubitka gena TP53; (ii) hemizigotnog gubitka gena POLR2A; i/ili (iii) sniženog nivoa ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo, u ćelijama kancera; i (c) odabiranje inhibitora POLR2A ako je (i) otkriven hemizigotni gubitak gena TP53; (ii) otkriven hemizigotni gubitak gena POLR2A; i/ili (iii) sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo otkriven u ćelijama kancera.
[0020] Prema otkriću predmetne specifikacije, postupci dalje obuhvataju davanje terapijski efikasne količina inhibitora POLR2A pacijentu.
[0021] U određenim aspektima, ćelije kancera sadrže hemizigotni gubitak gena TP53. U određenim aspektima, ćelije kancera sadrže hemizigotni gubitak gena POLR2A. U određenim aspektima, ćelije kancera imaju sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo (npr., nivo ekspresije u uzorku koji nije kancerozan).
[0022] U nekim primerima izvođenja, obezbeđene su kompozicije koje sadrže inhibitor POLR2A za upotrebu u lečenju kancera kod subjekta, pri čemu je za ćelije kancera utvrđeno da sadrže (i) hemizigotni gubitak gena TP53; (ii) hemizigotni gubitak gena POLR2A; ili (iii) sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo (npr., nivo ekspresije u ćelijama uzorka koji nije kancerozan).
[0023] Prema otkriću predmetne specifikacije, obezbeđena je upotreba inhibitora POLR2A u proizvodnji leka za lečenje kancera, pri čemu je za ćelije kancera utvrđeno da sadrže (i) hemizigotni gubitak gena TP53; (ii) hemizigotni gubitak gena POLR2A; ili (iii) sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo (npr., nivo ekspresije u ćelijama uzorka koji nije kancerozan).
[0024] Kako se ovde koristi, "suštinski bez", u smislu navedene komponente, upotrebljava se u značenju da nijedna od navedenih komponenti nije namenski formulisana u kompoziciji i/ili je prisutna samo kao kontaminant ili u tragovima. Ukupna količina navedene komponente nastala nenamernom kontaminacijom kompozicije je prema tome znatno ispod 0.05%, poželjno ispod 0.01%. Najpoželjnija je kompozicija u kojoj standardnim analitičkim postupcima ne može da se detektuje nikakva količina navedene komponente.
[0025] Kako se koristi u ovoj specifikaciji, pojam u jednini može da označava jedno ili više. Kako se ovde koristi u patentnom zahtevu/patentnim zahtevima, kada se koriste zajedno sa rečju "koji sadrži", pojmovi u jednini mogu da znače jedno ili više.
[0026] Upotreba pojma "ili" u patentnim zahtevima ima značenje "i/ili", osim ako nije izričito naznačeno da se odnosi samo na alternative, ili se alternative međusobno isključuju, iako otkriće podržava definiciju koja se odnosi samo na alternative i "i/ili". Kako se ovde koristi, "drugi" može da znači najmanje drugi ili više.
[0027] U ovoj prijavi, pojam "oko" se koristi da označi da vrednost uključuje svojstvenu varijaciju vrednosti greške uređaja, metode koja se koristi za određivanje vrednosti, ili varijaciju koja postoji među ispitivanim subjektima.
[0028] Ostali ciljevi, karakteristike i prednosti ovog pronalaska postaće očigledni iz detaljnog opisa koji sledi. Treba, međutim, razumeti da su detaljan opis i konkretni primeri, iako ukazuju na poželjne primere izvođenja pronalaska, dati samo kao ilustracija.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0029] Crteži koji slede čine deo predmetne specifikacije i uključeni su da dodatno prikažu određene aspekte predmetnog pronalaska. Pronalazak se može bolje razumeti uz pozivanje na jedan ili više od ovih crteža u kombinaciji sa detaljnim opisom specifičnih primera izvođenja predstavljenih u ovom dokumentu.
SL. 1A-H. Ekspresija POLR2A, ali ne i TP53, u korelaciji je sa brojem kopija gena.
(SL. 1A) Analiza baze podataka TCGA pokazuje učestalosti hemizigotne delecije lokusa TP53 kod različitih kancera čoveka. (SL. 1B) Šematski dijagram gena smeštenih blizu TP53 u humanom genomu. (SL. 1C) Istovremena delecija POLR2A u kolorektalnim tumorima koji imaju hemizigotni gubitak TP53. (SL. 1D) Dijagrami rasipanja broja kopija POLR2A naspram ekspresije iRNK kod kliničkih kolorektalnih tumora u TCGA i kancerskim ćelijskim linijama u CCLE. Prikazana je linearna regresija i Pirsonov koeficijent korelacije (r). (SL. 1E) Kvantitativno određivanje nivoa proteina POLR2A u podudarnim normalnim i uzorcima tkiva CRC (neutralno ili sa hemizigotnim gubitkom POLR2A). (SL. 1F) Varijacije broja kopija POLR2A i TP53 u ćelijskim linijama CRC čoveka. Leve kolone su TP53; desne kolone su POLR2A. (SL. 1G) Relativni nivoi ekspresije POLR2A u ćelijskim linijama CRC (normalizovani prema HCT116). (SL.1H) Nivoi proteina POLR2A, p53 i β-aktina u ćelijskim linijama CRC.
SL. 2A-J. Ćelije POLR2A<loss>su veoma osetljive na inhibiciju POLR2A. (SL. 2A) Ćelije POLR2A<loss>(SW837, SNU283) su značajno osetljivije na tretman α-amanitinom od ćelija POLR2A<neutral>(HCT116, SW480). Prikazano je bojenje ćelija kristal-violet bojom. (SL. 2B) Ćelijska proliferacija ćelija POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>pri tretmanu αamanitinom. (SL. 2C) Dox-indukovana supresija POLR2A inhibira proliferaciju ćelija SNU283, ali ne i ćelija HCT116. (SL. 2D) Korelacija između ekspresije POLR2A iRNK i ćelijske proliferacije ćelija HCT116 i SNU283 koje eksprimiraju Dox-inducibilne POLR2A shRNKs. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SD. Leve kolone su POLR2A iRNK; desne kolone predstavljaju proliferaciju. (SL. 2E i 2F) Krive preživljavanja ćelija SUN283 i SW837 kao odgovor na povećanje doza tretmana α-amanitinom posle transfekcije rastućim količinama DNK ekspresionog vektora za PORL2A. (SL. 2G) POLR2Aloss HCT116 ćelije su značajno osetljivije na tretman α-amanitinom od parentalnih ćelija POLR2A<neutral>HCT116. Prikazano je bojenje ćelija kristal-violet bojom. (SL. 2H) Ćelijska proliferacija ćelija POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>HCT116 tretiranih α-amanitinom. (SL. 2I i 2J) Korelacija između ekspresije POLR2A iRNK i proliferacije ćelija (SL. 2I; leve kolone su POLR2A iRNK; desne kolone predstavljaju proliferaciju) ili apoptoze (SL. 2J; leve kolone su shKontr; srednje kolone su shRNK-1; desne kolone su shRNK-2) u ćelijama POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>HCT116. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SD.
SL. 3A-E. Osetljivost ćelija POLR2A<loss>na inhibiciju POLR2A je nezavisna od p53.
(SL. 3A) Nivoi proteina POLR2A, p53, EpCAM i β-aktina na panelu xhCRC ćelijskih linija izogenog humanog primarnog kolorektalnog kancera. (SL. 3B) Kriva rasta POLR2Aneutral i POLR2Aloss xhCRC ćelija. (SL. 3C) Ćelijska proliferacija POLR2A<neutral>i POLR2Aloss xhCRC ćelija tretiranih α-amanitinom. (SL.3D) Osetljivost POLR2A<neutral>i POLR2Aloss xhCRC ćelija na tretman 5-FU, oksaliplatinom (Oxa) ili SN-38, kombinovan sa, ili bez kombinovanja sa tretmanom α-amanitinom. (SL. 3E) Ćelijska proliferacija POLR2Aneutral i POLR2Aloss xhCRC ćelija tretiranih sa ama-HEA125 (anti-EpCAM) konjugatom antitela sa lekom u različitim koncentracijama.
FIGS 4A-E. Supresija POLR2A selektivno inhibira rast tumora POLR2Aloss. (SL.
4A) Krive rasta ksenotransplantata tumora poreklom od subkutano implantiranih ćelija HCT116 (1x106 ćelija) i SNU283 (2x10<6>ćelija). Obe ćelijske linije eksprimiraju kontrolne ili Dox-inducibilne POLR2A shRNKs. Posle početnog uspostavljanja tumora (100 mm3), miševi su tretirani sa 1 µg ml<-1>Dox u vodi za piće. n = 5 miševa po grupi. (SL. 4B i 4C) Krive rasta tumora (SL. 4B) ksenotransplantata tumora poreklom od ortotopično implantiranih ćelija POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>HCT116 (ubrizgano je 1x10<6>ćelija) koje eksprimiraju Dox-inducibilnu kontrolnu ili POLR2A shRNK. Posle početnog uspostavljanja tumora, miševi su tretirani sa 1 µg ml<-1>Dox u vodi za piće. Težine tumora (SL. 4C) su izmerene (n = 5 miševa po grupi). **p < 0.01. (SL. 4D i 4E) Krive rasta tumora ksenotransplantata tumora poreklom od ortotopično implantiranih ćelija POLR2Aneutral i POLR2Aloss HCT116 (SL.4D; ubrizgano 1.0x106 ćelija) ili xhCRC (SL.
4E; ubrizgano 0.5x106 ćelija) kod miševa koji su primili dvostruke intraperitonealne injekcije anti-EpCAM antitela (3.6 mg kg1) ili konjugata antitelo-lek ama-HEA125 (3, 10, 30 i 90 µg kg-1 , što odgovara 0.12, 0.4, 1.2 i 3.6 mg IgG kg<-1>). n = 10 miševa po grupi.
SL. 5A-B. Ekspresija POLR2A je u korelaciji sa brojem kopija njegovog gena u tumorima debelog creva čoveka. FISH analiza sa dvostrukim bojenjem sprovedena je upotrebom probe za centromeru hromozoma 17 i probe specifične za lokus za POLR2A na mikromatrici tkiva debelog creva čoveka. Određivan je hemizigotni gubitak gena POLR2A i rezultati su prikazani u tabeli 2. (SL.5A) Kvantitativno određivanje ekspresije POLR2A u uzorcima normalnog tkiva debelog creva čoveka, uzorcima tumorskog tkiva POLR2A-neutral (neutralnog) ili -loss (gubitak POLR2A). Stubići greške, s.d. (SL. 5B) Nivoi proteina POLR2A i β-aktina u podudarnim uzorcima normalnog i CRC tkiva.
SL. 6A-C. Ekspresija TP53 nije povezana sa brojem kopija njegovog gena. (SL.6A i 6B) Dijagrami rasipanja broja kopija TP53 naspram ekspresije proteina (SL. 6A) ili ekspresije iRNK (SL. 6B) u kolorektalnim tumorima u bazi podataka TCGA. Prikazani su Pirsonov koeficijent korelacije (r) i p vrednost. (SL. 6C) Relativna ekspresija iRNK TP53 u kolorektalnim kancerskim ćelijskim linijama (normalizovana u odnosu na onu kod ćelijske linije HCT116). Podaci predstavljaju srednju vrednost i s.d. tri nezavisna eksperimenta.
SL. 7A-G. Ćelije POLR2A<loss>su veoma osetljive na inhibiciju POLR2A. (SL. 7A) Ćelijska proliferacija ćelija POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>tretiranih aktinomicinom D. (SL.
7B) Efikasnost POLR2A-specifičnih shRNKs u nishodnoj regulaciji ekspresije gena (eng - knockdown) u ćelijama HCT116, SW480, SW837 i SNU283. (SL.7C) Efekat nishodne regulacije ekspresije gena POLR2A na proliferaciju četiri ćelijske linije kolorektalnog kancera. Ćelije koje eksprimiraju GFP i kontrolne ili POLR2A-specifične shRNKs su sortirane i pomešane sa kontrolnim GFP-negativnim ćelijama (1:1), i GFP-pozitivne ćelije su kvantifikovane u pasažama 2, 4 i 6. **p < 0.01, ns: nije značajno. (SL. 7D) Nivoi proteina POLR2A i β-aktina u ćelijama HCT116 i SNU283 koje eksprimiraju Doxinducibilne POLR2A shRNKs (1.0 µg ml-1 Dox). (SL. 7E) Ćelijska proliferacija ćelija HCT116 i SNU283 koje eksprimiraju Dox-inducibilnu POLR2A shRNK u prisustvu 300 ng ml-1 Dox. **p < 0.01. (SL.7F i 7G) Profili ćelijskih ciklusa (SL.7F; gornji deo svake kolone je G2/M; srednji deo svake kolone je S; donji deo svake kolone je G0/G1) i apoptoza (SL. 7G) kontrolnih ili ćelija HCT116 i SNU283 koje eksprimiraju POLR2A shRNK. **p < 0.01. Podaci predstavljaju srednju vrednost i s.d. tri nezavisna eksperimenta.
SL. 8A-B. Ektopična ekspresija POLR2A obnavlja rezistenciju ćelija POLR2A<loss>na tretman α-amanitinom. (SL. 8A) Nivoi proteina POLR2A i β-aktina u ćelijama SNU283 i SW837 koje eksprimiraju rastuće količine egzogenog POLR2A. (SL. 8B) Bojenje kristal-violet bojom ćelija SNU283 i SW837 tretiranih rastućim dozama αamanitina posle transfekcije rastućim količinama DNK ekspresionog vektora za POLR2A.
SL. 9A-H. Monoalelno funkcionalno isključivanje (eng – knockout) gena POLR2A senzibilizuje ćelije HCT116 na inhibiciju POLR2A. (SL. 9A) Šematska ilustracija ciljnih mesta za Cas9/sgRNK u genu POLR2A. Prikazane su dve sgRNK usmerene sekvence (strelica pokazuje smer; sekvence su date kao SEQ ID NOs: 25-26), a sekvence protospejser-susednog motiva (PAM) su poslednja tri nukleotida svake sekvence. (SL.
9B) Efikasnost cepanja POLR2A posredstvom Cas9 u ćelijama HCT116 merena testom Surveyor. (SL. 9C) Sekvence mutantnih alela POLR2A u ćelijama kolonija 14 i 5 (sekvence su date kao SEQ ID NOs: 27-30). (SL.9D) Nivoi proteina POLR2A i β-aktina u ćelijama POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>HCT116. (SL. 9E) Krive rasta ćelija POLR2Aneutral i POLR2Aloss HCT116. (SL. 9F). Relativna proliferacija ćelija POLR2Aneutral i POLR2Aloss tretiranih aktinomicinom D. (SL. 9G) Efekat nishodne regulacije ekspresije gena POLR2A na ćelije POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>HCT116. Eksperimenti su sprovedeni kao što je opisano na SL. 7C. **p < 0.01, ns: nije značajno. (SL. 9H) Dox-indukovana delimična supresija POLR2A inhibirala je rast ćelija POLR2Aloss HCT116, ali ne i parentalnih POLR2Aneutral HCT116 ćelija. Podaci predstavljaju srednju vrednost i s.d. tri nezavisna eksperimenta.
SL. 10A-G. Osetljivost ćelija POLR2A<loss>na inhibiciju POLR2A je nezavisna od p53. (SL. 10A) Šematska ilustracija ciljnih mesta Cas9/sgRNK u genu TP53. Prikazane su dve sgRNK usmerene sekvence (strelica pokazuje smer; sekvence su date kao SEQ ID NOs: 31-32) i PAM sekvence su poslednja tri nukleotida svake sekvence. (SL. 10B) Efikasnost cepanja TP53 posredovanog Cas9 u HCT116 ćelijama merena testom Surveyor. (SL. 10C) Nivoi proteina POLR2A, p53 i β-aktina u panelu izogenih ćelija HCT116. (SL. 10D) Krive rasta ćelija POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>HCT116. (SL. 10E i 10F) Slike kristalnog bojenja (SL. 10E) i krive preživljavanja ćelija (SL. 10F) POLR2Aneutral i POLR2Aloss HCT116 ćelija posle tretmana α-amanitinom. (SL. 10G) Krive preživljavanja ćelija POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>HCT116 ćelija kao odgovor na tretman sa ama-HEA125.
SL. 11A-C. Dozno-zavisna supresija POLR2A inhibira tumorigenezu kod POLR2Aloss, ali ne i POLR2Aneutral tumora. (SL. 11A) Kvantitativno određivanje nivoa ekspresije POLR2A iRNK u subkutanim ksenotransplantatima HCT116 i SNU283 tumora koji eksprimiraju kontrolnu ili POLR2A shRNK (n = 5 miševa po grupi). **p < 0.01. (SL. 11B) Imunohistohemijskim bojenjem su kvantitativno određene ćelije pozitivne na Ki67 (ćelijska proliferacija) ili otcepljenu kaspazu-3 (apoptoza) po vidnom polju i ekspresija POLR2A. **p < 0.01. Podaci predstavljaju srednju vrednost i s.d. (SL. 11C) Kvantifikacija veličina tumora ksenotransplantata tumora koji potiču od subkutano implantiranih ćelija POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>HCT116 (ubrizgano je 1x10<6>ćelija). Obe ćelijske linije eksprimiraju kontrolne ili Dox-inducibilne POLR2A shRNKs. Posle početnog uspostavljanja tumora (100 mm<3>), miševi su tretirani sa (0.5, 1, i 2 µg ml<-1>) Dox u vodi za piće. n = 5 miševa po grupi. Podaci predstavljaju srednju vrednost i s.d.
SL. 12A-F. Supresija POLR2A pomoću POLR2A siRNK inkapsuliranih u DOPC inhibira rast tumora POLR2Aloss. (SL. 12A) Western blotovi za POLR2A i β-aktin nakon transfekcije kontrolne siRNK ili POLR2A siRNKs (#1 i #2) u HCT116 ćelije. (SL.
12B) Šematska ilustracija ortotopične injekcije ćelija HCT116 (1x10<6>ćelija) praćene intervalima tretmana nanolipozomima DOPC. (SL. 12C i 12D) Krive rasta tumora ortotopičnih ksenotransplantata tumora koji potiču od ćelija POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>HCT116 (SL. 12C predstavlja siPol2-1; SL. 12D predstavlja siPol2-2) kod miševa koji su primali intraperitonealne injekcije kontrolnih (1 000 µg kg-1) ili POLR2A siRNKs (125, 250, 500 i 1000 µg kg-1) dva puta nedeljno. n = 10 miševa po grupi. (SL. 12E i 12F) Reprezentativni nivoi proteina POLR2A i β-aktina u ksenotransplantatima tumora nakon kontrolnog tretmana ili tretmana sa POLR2A siRNK (SL. 12E predstavlja siPol2-1; SL.12F predstavlja siPol2-2).
SL. 13A-D Supresija POLR2A selektivno inhibira rast tumora POLR2Aloss (SL. 13A i 13B) Merene su težine tumora ortotopično implantiranih HCT116 (SL. 13A) i xhCRC (SL. 13B) tumora (n = 10 miševa po grupi). (SL. 13C i 13D) Zabeležene su telesne težine (SL. 13C) i enzimi jetre (SL. 13D) uključujući alanin aminotransferazu (ALT), aspartat aminotransferazu (AST) i alkalnu fosfatazu u perifernoj krvi kao što je opisano u odeljku metode. Prikazani podaci predstavljaju srednje vrednosti za pet miševa u svakoj grupi.
1
SL. 14A-F. Supresija POLR2A pomoću ama-HEA125 inhibira rast tumora POLR2Aloss. (SL. 14A, 14C i 14E) Nivoi proteina POLR2A i β-aktina u ćelijama HCT116 (SL. 14A), SW480 (SL. 14C), ili SW837 (SL. 14E). Ove ćelijske linije su POLR2A-neutral, POLR2A-loss, ili POLR2A-restored (sa ponovo uspostavljenom funkcijom). (SL. 14B, 14D i 14F) Krive rasta tumora ortotopičnih ksenotransplantata tumora poreklom od odgovarajućih ćelija kao što je naznačeno. Kod svih njih su primenjene dvostruke intraperitonealne injekcije anti-EpCAM antitela (3.6 mg kg-1) ili konjugata antitelo-lek ama-HEA125 (10 i 90 µg kg-1 , što odgovara 0.4 i 3.6 mg IgG kg<-1>). n = 10 miševa po grupi.
OPIS ILUSTRATIVNIH PRIMERA IZVOĐENJA
[0030] Studije predstavljene u ovom dokumentu pokazuju da genomska delecija TP53 često obuhvata susedne esencijalne gene, čineći kancerske ćelije sa hemizigotnom delecijom TP53 osetljivim na dodatnu supresiju takvih gena. POLR2A je identifikovan kao takav esencijalni „housekeeping“ gen koji se praktično istovremeno deletira sa TP53 kod mnogih vrsta kancera čoveka. On kodira najveću i katalitičku subjedinicu kompleksa RNK polimeraze II, koju αamanitin specifično inhibira (Bensaude, 2011; Lindell et al., 1970). Stoga, umesto farmakološkog delovanja na p53 ili njegove regulatore, princip kolateralne osetljivosti na inhibiciju POLR2A pruža sasvim novu strategiju za terapiju kancera.
[0031] Predmetna analiza kliničkih uzoraka i kancerskih ćelijskih linija u Atlasu genoma kancera (TCGA) i Enciklopediji kancerskih ćelijskih linija (CCLE) otkriva da su nivoi ekspresije POLR2A u snažnoj korelaciji sa brojem njegovih genskih kopija kod humanih kolorektalnih tumora. Supresija POLR2A α-amanitinom, malim interferirajućim RNK, ili kratkim RNK u obliku ukosnice, selektivno inhibira proliferaciju, preživljavanje i tumorogeni potencijal ćelija kolorektalnog kancera sa hemizigotnim gubitkom TP53 na način nezavisan od p53. Osim toga, predmetne pretkliničke studije sa α-amanitinom predviđaju terapijsku efikasnost lekova na bazi α-amanitina ili inhibitora POLR2A za lečenje kolorektalnog kancera i oni bi trebalo da budu primenljivi na mnoge vrste humanih kancera sa hemizigotnim gubitkom TP53.
[0032] Prethodne kliničke primene α-amanitina bile su ograničene zbog njegove toksičnosti za jetru (Letschert et al., 2006). Slobodni α-amanitin je toksičan za jetru jer ga specifično vezuje OATP1B3, transportni molekul koji se isključivo eksprimira na membrani hepatocita (Letschert et al., 2006). Međutim, kada je α-amanitin konjugovan sa specifičnim antitelima, on više ne predstavlja supstrat za OATP1B3 (Letschert et al., 2006; Moldenhauer et al., 2012; Faulstich and Fiume, 1985). U ovom dokumentu pokazano je da niske doze konjugata α-amanitina sa antitelom (npr., α-amanitin-konjugovano anti-EpCAM (adhezioni molekul epitelnih ćelija) antitelo) dovode do regresije tumora u murinskim modelima humanog kolorektalnog kancera sa hemizigotnom delecijom POLR2A. Inhibicija POLR2A je novi terapijski pristup za lečenje kancera koji imaju takve uobičajene genomske izmene.
I. Konjugati usmereni na ćelije
[0033] Može da bude poželjno konjugovati molekul α-amanitina (ili bilo koji amatoksin) sa najmanje jednim agensom usmerenim na ćelije za poboljšanje upotrebljivosti α-amanitina i smanjenje njegove toksičnosti za jetru. Takav konjugat može da bude označen kao "imunotoksin". Na primer, kako bi se povećala efikasnost i korisnost α-amanitina kao terapijskog agensa, on može da bude konjugovan ili kovalentno vezan za željeni fragment usmeren na ćeliju. Takav fragment može da bude bilo koji fragment sa dovoljno selektivnosti, specifičnosti, ili afiniteta za ciljno delovanje na željeni tip ćelija vezivanjem za spoljni receptor ili vezujuće mesto na navedenim tipovima ćelija, kao što je kancerska ćelija (SAD patentna objava br.
2009/0304666). Primeri takvih fragmenata uključuju, ali nisu ograničeni na antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente, antitelu-slične proteine i aptamere. Primeri antigen-vezujućih fragmenata antitela uključuju bez ograničenja: (i) Fab fragment, koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) "Fd" fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iii) "Fv" fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog antitela; (iv) "dAb" fragment, koji se sastoji od VH domena; (v) izolovane CDR regione; (vi) F(ab’)2 fragmente, bivalentni fragment koji sadrži dva vezana Fab fragmenta; (vii) jednolančane Fv molekule ("scFv"), u kojima su VH domen i VL domen vezani peptidnim linkerom koji omogućava da se dva domena udruže tako da obrazuju vezujući domen; (viii) bispecifične jednolančane Fv dimere (videti SAD patent br. 5,091,513) i (ix) diatela, multivalentne ili multispecifične fragmente konstruisane genskom fuzijom (SAD patentna objava br. 2005/0214860). Fv, scFv ili molekuli diatela mogu da budu stabilizovani ugradnjom disulfidnih mostova koji vezuju VH i VL domene. Fragment usmeren na ćeliju može specifično da se vezuje za bilo koji antigen povezan sa tumorom, kao što su, na primer, CD19, CD20, CD30, CD33, CD52, EpCAM, karcinoembrionski antigen, alfafetoprotein, gpA33, Mucini, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, ERBB2, ERBB3, c-Met, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascin, AKT, Her2/neu, Her3, epitelni tumorski antigen, antigen povezan sa melanomom, mutirani p53, mutirani ras, Dektin-1, gp100, MART-1/MelanA, TRP-1 (gp75), Tirozinaza, TAG-72, CAIX, PSMA, protein koji se vezuje za folat, gangliozidi (npr., GD2, GD3, GM2), MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N-acetilglukozaminiltransferaza-V, p15, β-katenin, MUM-1, CDK4, HPV-E6, HPV-E7, ZFP161, Ubikvilin-1, HOX-B6, IFI27, YB-1, KIAA0136, Osteonektin, jedinstveni protein 21 F-boksa, ILF3, SSX-2, PSMA, NY-ESO-1, PRAME, mezotelin, VEGF, VEGFR, Integrin alfaVbeta3, Integrin alfa5beta1, ili PLK1.
[0034] U stanju tehnike poznato je nekoliko postupaka za vezivanje ili konjugaciju fragmenta usmerenog na ćeliju (npr., antitela usmerenog na antigen povezan sa tumorom) sa konjugatom (npr., α-amanitinom) (videti PCT objavu WO2012/119787). Na primer, imunotoksin može da uključuje odvojivi disulfidni linker koji je dobro poznat u stanju tehnike. Toksin može da bude konjugovan sa fragmentom usmerenim na ćeliju tretiranjem toksina tako da se obezbede sulfhidrilne grupe i fragmenta usmerenog na ćeliju tako da se obezbede piridil-disulfidne rezidue. Ostale veze koje se obično koriste i za koje se očekuje da budu korisne za konjugaciju toksina sa fragmentima usmerenim na ćeliju su iminotiolan/sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilatne i karbodiimidne veze. Mnoge druge veze za konjugaciju proteina različitih dužina, stabilnosti, fleksibilnosti i hemijske reaktivnosti dobro su poznate u stanju tehnike i u mnogim slučajevima su komercijalno dostupne. Neki primeri postupaka za vezivanje uključuju upotrebu reakcije disulfidne izmene; formiranje tioetarske veze; kompleksa metalnog helata upotrebom, na primer, organskog helirajućeg agensa, kao što je anhidrid dietilentriaminpentasirćetne kiseline (DTPA); etilentriamintetrasirćetna kiselina; N-hloro-ptoluensulfonamid; i/ili tetrahloro-3-6α-difenilglikouril-3 vezan za fragment usmeren na ćeliju. Fragmenti usmereni na ćeliju mogu takođe da reaguju sa enzimom u prisustvu agensa za kuplovanje kao što je glutaraldehid ili perjodat. Poželjno je da svaki konjugat α-amanitinfragment usmeren na ćeliju bude stabilan pri produženom izlaganju serumu. Kao takav, αamanitin može da bude konjugovan sa lizinskom reziduom fragmenta usmerenog na ćeliju pomoću stabilnog linkera na bazi uree koji je stabilan u serumu, ali će otpustiti slobodni αamanitin unutar ciljne ćelije nakon lizozomske degradacije fragmenta usmerenog na ćeliju.
II. Lečenje bolesti
[0035] Određeni aspekti predmetnih primera izvođenja mogu da se koriste za prevenciju ili lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa hemizigotnim gubitkom TP53 i pridruženim gubitkom POLR2A. Funkcionisanje POLR2A može da se redukuje pogodnim supstancama za lečenje kancera koji ima hemizigotni gubitak TP53 i/ili POLR2A. Primeri takvih supstanci mogu da budu bilo koji amatoksin, α-amanitin, ili fragmenti usmereni na ćeliju konjugovani sa bilo kojim amatoksinom ili α-amanitinom.
[0036] Kancer koji ima hemizigotni gubitak TP53 i/ili POLR2A ne mora da bude homogen u pogledu gubitka TP53 i/ili POLR2A. U različitim aspektima, oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%,
1
30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% ćelija koje čine kancer može da ima hemizigotni gubitak TP53 i/ili POLR2A. Prema tome, u nekim aspektima, oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% ćelija koje čine kancer može da sadrži obe kopije TP53 i/ili POLR2A. U drugim aspektima, različiti procenti ćelija koje čine kancer mogu da imaju homozigotni gubitak TP53 i hemizigotni gubitak POLR2A.
[0037] "Tretman" i "lečenje" se odnose na davanje ili primenu terapijskog agensa kod subjekta ili sprovođenje procedure ili modaliteta na subjektu u cilju dobijanja terapijske koristi kod bolesti ili zdravstvenog stanja. Na primer, tretman može da uključuje davanje farmaceutski efikasne količine supstance koja inhibira funkciju POLR2A.
[0038] "Subjekt" se odnosi na čoveka ili na subjekt koji nije čovek, kao što su primati, sisari i kičmenjaci. U određenim primerima izvođenja, subjekt je čovek.
[0039] Izraz "terapijska korist" ili "terapijski efikasno", kako se koristi u ovoj prijavi, odnosi se na bilo šta što podstiče ili poboljšava dobrobit subjekta u pogledu medicinskog tretmana ovog stanja. To uključuje, ali nije ograničeno na smanjenje učestalosti ili ozbiljnosti znakova ili simptoma bolesti. Na primer, lečenje kancera može da uključuje, na primer, smanjenje veličine tumora, smanjenje invazivnosti tumora, smanjenje brzine rasta kancera, ili sprečavanje pojave metastaza. Lečenje kancera može da se odnosi i na produžavanje preživljavanja subjekta koji ima kancer.
[0040] Konjugat α-amanitina može da se primeni za lečenje kancera. Kanceri kod kojih su predmetni postupci za lečenje korisni uključuju bilo koji tip malignih ćelija, kao što su one prisutne u solidnom tumoru ili hematološkom tumoru. Primeri solidnih tumora mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na tumor organa odabranog iz grupe koja se sastoji od pankreasa, debelog creva, slepog creva, želuca, mozga, glave, vrata, jajnika, bubrega, grkljana, sarkoma, pluća, bešike, melanoma, prostate i dojke. Primeri hematoloških tumora uključuju tumore kosne srži, malignitete T ili B ćelija, leukemije, limfome, blastome, mijelome, i slično. Dodatni primeri kancera koji mogu da se leče upotrebom ovde obezbeđenih postupaka uključuju, ali nisu ograničeni na kancer pluća (uključujući sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća), kancer peritoneuma, želudačni ili stomačni kancer (uključujući gastrointestinalni kancer i gastrointestinalni kancer strome), kancer pankreasa, kancer grlića materice, kancer jajnika, kancer jetre, kancer bešike, kancer dojke, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, karcinom endometrijuma ili materice, karcinom pljuvačne žlezde, bubrežni ili renalni kancer, kancer prostate, kancer vulve, tiroidni kancer, različite tipove kancera glave i vrata i melanom.
[0041] Kancer može specifično da bude sledećeg histološkog tipa, mada nije ograničen na njih: neoplazma, maligna; karcinom; karcinom, nediferencirani; karcinom gigantskih i vretenastih ćelija; sitnoćelijski karcinom; papilarni karcinom; karcinom skvamoznih ćelija; limfoepitelni karcinom; karcinom bazalnih ćelija; pilomatriksni karcinom; karcinom prelaznih ćelija; karcinom papilarnih prelaznih ćelija; adenokarcinom; gastrinom, maligni; holangiokarcinom; hepatocelularni karcinom; kombinovani hepatocelularni karcinom i holangiokarcinom; trabekularni adenokarcinom; adenoidni cistični karcinom; adenokarcinom u adenomatoznom polipu; adenokarcinom, familijarna polipoza debelog creva; solidni karcinom; karcinoidni tumor, maligni; bronhiolo-alveolarni adenokarcinom; papilarni adenokarcinom; hromofobni karcinom; acidofilni karcinom; oksifilni adenokarcinom; bazofilni karcinom; adenokarcinom bistrih ćelija; karcinom granularnih ćelija; folikularni adenokarcinom; papilarni i folikularni adenokarcinom; neinkapsulirani sklerozirajući karcinom; adreno-kortikalni karcinom; endometroidni karcinom; karcinom adneksa kože; apokrini adenokarcinom; sebaceozni adenokarcinom; ceruminozni adenokarcinom; mukoepidermoidni karcinom; cistadenokarcinom; papilarni cistadenokarcinom; papilarni serozni cistadenokarcinom; mucinozni cistadenokarcinom; mucinozni adenokarcinom; „signet ring cell“ karcinom; infiltrirajući duktalni karcinom; medularni karcinom; lobularni karcinom; inflamatorni karcinom; Pagetova bolest mlečne žlezde; karcinom acinarnih ćelija; adenoskvamozni karcinom; adenokarcinom sa skvamoznom metaplazijom; timom, maligni; tumor strome jajnika, maligni; tekom, maligni; tumor granuloznih ćelija, maligni; androblastom, maligni; karcinom Sertolijevih ćelija; tumor Lejdigovih ćelija, maligni; tumor lipidnih ćelija, maligni; paragangliom, maligni; ekstramamarni paragangliom, maligni; feohromocitom; glomangiosarkom; maligni melanom; amelanotični melanom; melanom sa površinskim rasprostiranjem; lentigo maligni melanom; akralni lentiginozni melanomi; nodularni melanomi; maligni melanom u gigantskom pigmentisanom nevusu; melanom epitelioidnih ćelija; plavi nevus, maligni; sarkom; fibrosarkom; fibrozni histiocitom, maligni; miksosarkom; liposarkom; leiomiosarkom; rabdomiosarkom; embrionalni rabdomiosarkom; alveolarni rabdomiosarkom; stromalni sarkom; mešani tumor, maligni; Milerov mešani tumor; nefroblastom; hepatoblastom; karcinosarkom; mezenhimom, maligni; Brenerov tumor, maligni; filoidni tumor, maligni; sinovijalni sarkom; mezoteliom, maligni; disgerminom; embrionalni karcinom; teratom, maligni; struma jajnika, maligna; horiokarcinom; mezonefrom, maligni; hemangiosarkom; hemangioendoteliom, maligni; Kapošijev sarkom; hemangiopericitom, maligni; limfangiosarkom; osteosarkom; jukstakortikalni osteosarkom; hondrosarkom; hondroblastom, maligni; mezenhimalni hondrosarkom; tumor gigantskih ćelija kosti; Juingov sarkom; odontogeni tumor, maligni; ameloblastni odontosarkom; ameloblastom, maligni; ameloblastni
1
fibrosarkom; pinealom, maligni; hordom; gliom, maligni; ependimom; astrocitom; protoplazmatski astrocitom; fibrilarni astrocitom; astroblastom; glioblastom; oligodendrogliom; oligodendroblastom; primitivni neuroektodermalni tumor; sarkom malog mozga; ganglioneuroblastom; neuroblastom; retinoblastom; olfaktorni neurogeni tumor; meningiom, maligni; neurofibrosarkom; neurilemom, maligni; tumor granularnih ćelija, maligni; maligni limfom; Hočkinova bolest; Hočkin; paragranulom; maligni limfom malih limfocita; maligni limfom velikih ćelija, difuzni; maligni limfom, folikularni; fungoidna mikoza; drugi specifikovani ne-Hočkinovi limfomi; B-ćelijski limfom; ne-Hočkinov limfom niskog stepena/folikularni (NHL); NHL malih limfocita (SL); NHL intermedijarnog stepena/folikularni; difuzni NHL intermedijarnog stepena; imunoblastni NHL visokog stepena; limfoblastni NHL visokog stepena; NHL visokog stepena malih nezarezanih ćelija; NHL sa voluminoznom tumorskom masom; limfom mantle ćelija; limfom povezan sa AIDS-om; Waldenstromova makroglobulinemija; maligna histiocitoza; multipli mijelom; sarkom mastocita; imunoproliferativna bolest tankog creva; leukemija; limfoidna leukemija; leukemija plazma ćelija; eritroleukemija; limfosarkomatozna leukemija; mijeloidna leukemija; bazofilna leukemija; eozinofilna leukemija; monocitna leukemija; leukemija mastocita; megakarioblastna leukemija; mijeloidni sarkom; leukemija vlasastih ćelija; hronična limfocitna leukemija (CLL); akutna limfoblastna leukemija (ALL); akutna mijeloidna leukemija (AML); i hronična mijeloblastna leukemija.
III. Kombinovani tretmani
[0042] U određenim primerima izvođenja, kompozicije i postupci predmetnog pronalaska uključuju fragmente usmerene na ćeliju konjugovane sa α-amanitinom, u kombinaciji sa drugom ili dodatnom terapijom. Takva terapija može da se primeni u lečenju bilo koje bolesti koja je povezana sa hemizigotnim gubitkom TP53 i/ili POLR2A. Na primer, bolest može da bude kancer.
[0043] Postupci i kompozicije uključujući kombinovane terapije poboljšavaju terapijsko ili zaštitno dejstvo, i/ili povećavaju terapijsko dejstvo druge antikancerske ili antihiperproliferativne terapije. Terapijski i profilaktički postupci i kompozicije mogu da se obezbede u kombinovanoj količini koja je efikasna za postizanje željenog dejstva, kao što je ubijanje kancerske ćelije i/ili inhibicija ćelijske hiperproliferacije. Ovaj postupak može da uključuje i dovođenje u kontakt ćelija sa fragmentom usmerenim na ćeliju konjugovanim sa α-amanitinom i drugu terapiju. Tkivo, tumor, ili ćelija može da se dovede u kontakt sa jednom ili više kompozicija ili farmakoloških formulacija koje uključuju jedan ili više agenasa (tj., antikancerski agens), ili da
1
se tkivo, tumor, i/ili ćelija dovede u kontakt sa dve ili više posebnih kompozicija ili formulacija, pri čemu jedna kompozicija obezbeđuje 1) fragment usmeren na ćeliju konjugovan sa αamanitinom; 2) antikancerski agens, ili 3) i fragment usmeren na ćeliju konjugovan sa αamanitinom i antikancerski agens. Takođe, smatra se da takva kombinovana terapija može da se koristi zajedno sa hemoterapijom, radioterapijom, hirurškom terapijom, ili imunoterapijom.
[0044] Pojmovi "doveden u kontakt" i "izložen", kada se primenjuju na ćeliju, u ovom dokumentu se koriste da opišu postupak kojim se terapijsko antitelo i hemoterapijski ili radioterapijski agens dostavljaju do ciljne ćelije ili stavljaju u direktan kontakt sa ciljnom ćelijom. Da bi se postiglo ubijanje ćelija, na primer, oba agensa se dostavljaju u ćeliju u kombinovanoj količini koja efikasno ubija ćeliju ili sprečava njenu deobu.
[0045] Fragment usmeren na ćeliju konjugovan sa α-amanitinom može da se primeni pre, tokom, posle, ili u različitim kombinacijama navedenog, u odnosu na antikancerski tretman. Primene mogu da budu u intervalima u rasponu od istovremeno, do minuta, dana i nedelja. U primerima izvođenja kada se inhibitor ekspresije gena daje pacijentu odvojeno od antikancerskog agensa, uopšteno treba osigurati da između vremena svake isporuke ne prođe značajan vremenski period, tako da dva jedinjenja i dalje mogu da imaju pogodno kombinovano dejstvo na pacijenta. U takvim slučajevima, smatra se da pacijentu mogu da se daju fragment usmeren na ćeliju konjugovan sa α-amanitinom i antikancerska terapija unutar oko 12 do 24 ili 72 časa međusobnog razmaka i, konkretnije, unutar oko 6-12 časova međusobnog razmaka. U nekim slučajevima može da bude poželjno da se vremenski period lečenja značajno produži, pri čemu između odgovarajućih primena protekne nekoliko dana (2, 3, 4, 5, 6 ili 7) do nekoliko nedelja (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8).
[0046] U određenim primerima izvođenja, trajanje lečenja će iznositi 1-90 dana, ili više (ovaj raspon uključuje interventne dane). Smatra se da jedan agens može da se primeni bilo kog dana od 1. dana do 90. dana (ovaj raspon uključuje interventne dane) ili u bilo kojoj njihovoj kombinaciji, a drugi agens se primenjuje bilo kog dana od 1. dana do 90. dana (ovaj raspon uključuje interventne dane) ili u bilo kojoj njihovoj kombinaciji. Tokom jednog dana (24-časovni period), agens/agensi mogu da se daju pacijentu jednom ili više puta. Osim toga, podrazumeva se da nakon lečenja postoji vremenski period tokom koga se ne primenjuje nikakav antikancerski tretman. Ovaj vremenski period može da traje 1-7 dana, i/ili 1-5 nedelja, i/ili 1-12 meseci ili više (ovaj raspon uključuje interventne dane), u zavisnosti od stanja pacijenta, kao što je njegova prognoza, snaga, zdravstveno stanje, itd. Očekuje se da se ciklusi tretmana ponove ako je neophodno.
1
[0047] Mogu da se koriste različite kombinacije. U primeru ispod, terapija pomoću fragmenta usmerenog na ćeliju konjugovanog sa α-amanitinom je "A", a antikancerska terapija je "B":
A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A
[0048] Primena bilo kog jedinjenja ili terapije kod pacijenta, kao što je opisano u otkriću predmetne specifikacije, pratiće opšte protokole za primenu takvih jedinjenja, uzimajući u obzir toksičnost agenasa, ako ona postoji. Prema tome, u nekim primerima izvođenja postoji korak praćenja toksičnosti koja se može pripisati kombinovanoj terapiji.
[0049] U specifičnim aspektima, podrazumeva se da će standardna terapija uključivati hemoterapiju, radioterapiju, imunoterapiju, hiruršku terapiju ili gensku terapiju i da može da se koristi u kombinaciji sa inhibitornim antitelom, antikancerskom terapijom, ili i inhibitornim antitelom i antikancerskom terapijom, kao što je ovde opisano.
A. Hemoterapija
[0050] Različiti hemoterapijski agensi mogu da se koriste u skladu sa predmetnim pronalaskom. Pojam "hemoterapija" odnosi se na upotrebu lekova za lečenje kancera. "Hemoterapijski agens" se koristi da označi jedinjenje ili kompoziciju koja se primenjuje pri lečenju kancera. Ovi agensi ili lekovi su klasifikovani prema mehanizmu delovanja u ćeliji, na primer, prema tome da li utiču na ćelijski ciklus, i u kojoj fazi. Alternativno, agens može da se okarakteriše na osnovu sposobnosti da direktno umreži DNK, interkalira u DNK, ili indukuje hromozomske i mitotičke aberacije ometajući sintezu nukleinske kiseline. Većina hemoterapijskih agenasa pripada sledećim kategorijama: alkilirajući agensi, antimetaboliti, antitumorski antibiotici, mitotički inhibitori i nitrozouree.
[0051] Primeri hemoterapijskih agenasa uključuju alkilirajuće agense kao tiotepa i ciklofosfamid; alkil sulfonate, kao busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine, kao benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperite, kao hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid,
1
mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozuree, kao karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike, kao enediinske antibiotike (npr., kaliheamicin, posebno kaliheamicin gama1I i kaliheamicin omega1I; dinemicin, uključujući dinemicin A; bisfosfonate, kao klodronat; esperamicin; kao i hromofor neokarcinostatina i hromofore srodnih hromoproteinskih enediinskih antiobiotika, aklacinomizine, aktinomicin, autrarnicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicin, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine kao mitomicin C, mikofenolnu kiselinu, nogalarnicin, olivomicine, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite, kao metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline, kao denopterin, pteropterin, trimetreksat; analoge purina, kao fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina, kao ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene, kao kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antiadrenalne supstance, kao mitotan, trilostan; sredstvo za popunjavanje nedostatka folne kiseline, kao folinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bizantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elformitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidainin; majtanzinoide, kao majtanzin i ansamitocine; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; podofilinsku kiselinu; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK-polisaharidni kompleks; razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikvon; 2,2’,2"-trihlorotrietilamin; trihotecene (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; taksoide, npr., paklitaksel i docetaksel gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; koordinacione komplekse platine, kao cisplatin, oksaliplatin i karboplatin; vinblastin; platinu; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; novantron; tenipozid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kselodu; ibandronat; irinotekan (npr., CPT-11); inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoide, kao retinoinsku kiselinu; kapecitabin; karboplatin, prokarbazin, plikomicin, gemcitabin, navelbin, inhibitore farnezil-protein tansferaze, transplatinu i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate svega gore navedenog.
1
[0052] U ovu definiciju uključeni su i antihormonski agensi koji deluju tako što regulišu ili inhibiraju dejstvo hormona na tumore, kao što su antiestrogeni i selektivni modulatori estrogenskog receptora (SERMs), uključujući, na primer, tamoksifen, raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen; inhibitore aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koja reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao, na primer, 4(5)-imidazole, aminoglutetimid, megestrol acetat, egzemestan, formestan, fadrozol, vorozol, letrozol i anastrozol; i antiandrogene, kao flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; kao i troksacitabin (nukleozidni analog citozina 1,3-dioksolan); antisens oligonukleotide, naročito one koji inhibiraju ekspresiju gena signalnih puteva uključenih u aberantnu ćelijsku proliferaciju, kao, na primer, PKC-alfa, Ralf i H-Ras; ribozime, kao što je inhibitor ekspresije VEGF i inhibitor ekspresije HER2; vakcine kao vakcine za gensku terapiju i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate svega gore navedenog.
B. Radioterapija
[0053] Drugi faktori koji izazivaju oštećenje DNK i intenzivno se koriste uključuju ono što uobičajeno znamo kao γ-zrake, X-zrake i/ili usmerenu isporuku radioizotopa u tumorske ćelije. Obuhvaćeni su i drugi oblici faktora koji oštećuju DNK, kao što su mikrotalasi, zračenje snopom protona (SAD patenti 5,760,395 i 4,870,287) i UV zračenje. Najverovatnije je da svi ovi faktori utiču na širok spektar oštećenja u DNK, u prekursorima DNK, na replikaciju i popravku DNK i na sklapanje i održavanje hromozoma. Rasponi doza X-zračenja variraju od dnevnih doza od 50 do 200 rendgena tokom produženih vremenskih perioda (3 do 4 nedelje), do pojedinačnih doza od 2000 do 6000 rendgena. Rasponi doza za radioizotope široko variraju, i zavise od polu-života izotopa, jačine i vrste emitovanog zračenja i preuzimanja u neoplastične ćelije.
[0054] Pojmovi "doveden u kontakt" i "izložen", kada se primenjuju na ćeliju, u ovom dokumentu se koriste da opišu postupak kojim se terapijski konstrukt i hemoterapijski ili radioterapijski agens dostavljaju do ciljne ćelije ili stavljaju u direktan kontakt sa ciljnom ćelijom. Da bi se postiglo ubijanje ćelija, na primer, oba agensa se dostavljaju u ćeliju u kombinovanoj količini koja efikasno ubija ćeliju ili sprečava njenu deobu.
C. Imunoterapija
[0055] U kontekstu lečenja kancera, imunoterapeutici se, uopšteno, zasnivaju na upotrebi imunoloških efektorskih ćelija i molekula koji ciljno deluju i uništavaju ćelije kancera. Trastuzumab (Herceptin™) predstavlja takav primer. Imunološki efektor može da bude, na primer, antitelo specifično za neki marker na površini tumorske ćelije. Samo antitelo može da
2
ima ulogu efektora u terapiji, ili može da privlači druge ćelije da konkretno utiču na ubijanje ćelije. Antitelo takođe može da bude konjugovano sa lekom ili toksinom (hemoterapeutik, radionuklid, lanac ricina A, toksin kolere, toksin pertusisa, itd.) i služi samo kao agens za usmeravanje. Alternativno, efektor može da bude limfocit koji nosi površinski molekul koji interaguje, bilo direktno ili indirektno, sa ciljnom tumorskom ćelijom. Različite efektorske ćelije uključuju citotoksične T ćelije i NK ćelije. Kombinacija terapijskih modaliteta, tj., direktne citotoksične aktivnosti i inhibicije ili redukcije ErbB2 obezbedila bi terapijsku korist u lečenju kancera koji prekomerno eksprimiraju ErbB2.
[0056] Druga imunoterapija bi takođe mogla da se koristi kao deo kombinovane terapije sa terapijom za utišavanje gena koja je gore razmatrana. U jednom aspektu imunoterapije, tumorska ćelija mora da nosi neki marker koji je podložan ciljnom delovanju, tj., nije prisutan na većini drugih ćelija. Postoje mnogi tumorski markeri i bilo koji od njih mogu da budu pogodni za ciljno delovanje u kontekstu predmetnog pronalaska. Uobičajeni tumorski markeri uključuju karcinoembrionski antigen, prostata-specifični antigen, antigen povezan sa tumorom urinarnog trakta, fetalni antigen, tirozinazu (p97), gp68, TAG-72, HMFG, sijalil-Lewis antigen, MucA, MucB, PLAP, estrogeni receptor, receptor za laminin, erb B i p155. Alternativni aspekt imunoterapije predstavlja kombinovanje antikancerskih dejstava sa imunostimulatornim dejstvima. Postoje i imunostimulatorni molekuli koji uključuju citokine, kao IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF i gama-IFN, hemokine, kao MIP-1, MCP-1, i IL-8 i faktore rasta, kao FLT3 ligand. Pokazalo se da kombinovanje imunostimulatornih molekula, bilo u vidu proteina, ili upotrebom isporuke gena, u kombinaciji sa supresorom tumora pojačava antitumorska dejstva (Ju et al., 2000). Osim toga, antitela protiv bilo kog od ovih jedinjenja mogu da se koriste za usmeravanje antikancerskih agenasa koji su ovde razmatrani.
[0057] Primeri imunoterapija koje se trenutno ispituju ili se koriste su imunološki adjuvansi npr., Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitrohlorobenzen i aromatična jedinjenja (SAD patenti 5,801,005 i 5,739,169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), citokinska terapija, npr., interferoni α, β i γ; IL-1, GM-CSF i TNF (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998) genska terapija, npr., TNF, IL-1, IL-2, p53 (Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; SAD patenti 5,830,880 i 5,846,945) i monoklonska antitela, npr., antigangliozid GM2, anti-HER-2, anti-p185 (Hanibuchi et al., 1998; SAD patent 5,824,311). Podrazumeva se da jedna ili više antikancerskih terapija može da se koristi sa ovde opisanim terapijama za utišavanje gena.
[0058] U aktivnoj imunoterapiji primenjuje se antigeni peptid, polipeptid ili protein, ili kompozicija autologih ili alogenih tumorskih ćelija ili "vakcina", uopšteno sa posebnim bakterijskim adjuvansom. U adoptivnoj imunoterapiji, cirkulišući limfociti ili limfociti koji infiltriraju tumor pacijenta se izoluju in vitro, aktiviraju limfokinima, kao što je IL-2, ili transdukuju genima za nekrozu tumora, i ponovo daju pacijentu.
D. Hirurška intervencija
[0059] Približno 60% osoba sa kancerom biće podvrgnuto hirurškoj intervenciji nekog tipa, što uključuje preventivnu hirurgiju, dijagnostičku hirurgiju ili hirurgiju za određivanje stadijuma bolesti, kurativnu i palijativnu hirurgiju. Kurativna hirurgija predstavlja lečenje kancera koje može da se koristi zajedno sa drugim terapijama, kao što je lečenje prema predmetnom pronalasku, hemoterapija, radioterapija, hormonska terapija, genska terapija, imunoterapija i/ili alternativne terapije.
[0060] Kurativna hirurgija uključuje resekciju kod koje se celo, ili deo kanceroznog tkiva, fizički uklanja, iseca, i/ili uništava. Resekcija tumora se odnosi na fizičko uklanjanje najmanje dela tumora. Pored resekcije tumora, hirurško lečenje uključuje lasersku hirurgiju, kriohirurgiju, elektrohirurgiju i mikroskopski kontrolisanu hirurgiju (Mosova hirurgija). Dalje se podrazumeva da određeni aspekti predmetnog pronalaska mogu da se koriste zajedno sa uklanjanjem površinskih kancera, prekancera, ili incidentnih količina normalnog tkiva.
[0061] Nakon isecanja dela ili svih kanceroznih ćelija, tkiva, ili tumora, u telu može da se formira šupljina. Lečenje može da se ostvari perfuzijom, direktnim ubrizgavanjem ili lokalnim tretiranjem područja dodatnom antikancerskom terapijom. Takav tretman može da se ponavlja, na primer, na svakih 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 dana, ili na svakih 1, 2, 3, 4 i 5 nedelja ili na svakih 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci. Ovi tretmani mogu da se razlikuju i prema dozama.
E. Drugi agensi
[0062] Podrazumeva se da drugi agensi mogu da se koriste u kombinaciji sa određenim aspektima predmetnog pronalaska kako bi se poboljšala terapijska efikasnost tretmana. Ovi dodatni agensi uključuju imunomodulatorne agense, agense koji dovode do ushodne regulacije receptora ćelijske površine i GAP spojeva, citostatske i diferencijacione agense, inhibitore ćelijske adhezije, agense koji povećavaju osetljivost hiperproliferativnih ćelija na induktore apoptoze, ili druge biološke agense. Imunomodulatorni agensi uključuju faktor nekroze tumora; interferon alfa, beta, i gama; IL-2 i druge citokine; F42K i druge analoge citokina; ili MIP-1, MIP-1beta, MCP-1, RANTES i druge hemokine. Dalje se smatra da bi ushodna regulacija receptora ćelijske površine ili njihovih liganda kao Fas / Fas ligand, DR4 ili DR5 / TRAIL (Apo-2 ligand) pojačala mogućnosti indukovanja apoptoze predmetnog pronalaska uspostavljanjem autokrinog ili parakrinog dejstva na hiperproliferativne ćelije. Porast međućelijskog prenosa signala povećanjem broja GAP spojeva povećao bi antihiperproliferativna dejstva na susednu populaciju hiperproliferativnih ćelija. U drugim primerima izvođenja, citostatski ili diferencijacioni agensi mogu da se koriste u kombinaciji sa određenim aspektima predmetnog pronalaska za poboljšanje antihiperproliferativne efikasnosti tretmana. Smatra se da inhibitori ćelijske adhezije poboljšavaju efikasnost predmetnog pronalaska. Primeri inhibitora ćelijske adhezije su inhibitori fokalne adhezione kinaze (FAKs) i Lovastatin. Dalje se pretpostavlja da bi drugi agensi koji povećavaju osetljivost hiperproliferativnih ćelija na apoptozu, kao antitelo c225, mogli da se koriste u kombinaciji sa određenim aspektima predmetnog pronalaska za poboljšanje efikasnosti lečenja.
[0063] Hormonska terapija može takođe da se koristi zajedno sa određenim aspektima predmetnog pronalaska, ili u kombinaciji sa bilo kojom drugom prethodno opisanom terapijom kancera. Upotreba hormona može da se koristi u lečenju određenih kancera kao što je kancer dojke, prostate, jajnika, ili grlića materice da bi se snizio nivo ili blokirala dejstva određenih hormona, kao što su testosteron ili estrogen. Ovaj tretman se često koristi u kombinaciji sa najmanje jednom dodatnom terapijom kancera kao opcija lečenja, ili za smanjenje rizika od metastaza.
IV. Primeri
[0064] Primeri koji slede uključeni su da prikažu poželjne primere izvođenja pronalaska. Stručnjak u ovoj oblasti zna da tehnike opisane u primerima koji slede predstavljaju tehnike za koje je pronalazač utvrdio da dobro funkcionišu pri praktičnom izvođenju pronalaska, i stoga se može smatrati da čine poželjne načine njegovog izvođenja. Međutim, stručnjaci u ovoj oblasti treba, u svetlu predmetnog otkrića, da znaju da u specifične primere izvođenja koji su opisani mogu da se uvedu mnoge izmene.
Materijali i metode
[0065] Ćelijska kultura, antitela i western blot analiza. Ćelijske linije HCT116, SW480, SW837, HT29, DLD1 i HT29 su nabavljene iz Američke kolekcije tipova kultura i gajene pod standardnim uslovima koje je naznačio proizvođač. Ćelijske linije SNU283 i SNU1197 su nabavljene iz Korejske banke ćelijskih linija i gajene u medijumu RMPI 1640 obogaćenom sa 10% FBS i 2 mM L-glutamina. Izolovanje, gajenje i održavanje humanih ksenotransplantata primarnih CRC (xhCRC) ćelija sprovedeno je kao što je prethodno opisano (Lu et al., 2013). Ukratko, ksenotransplantati koji potiču od pacijenta su sakupljeni pod sterilnim uslovima i
2
mehanički usitnjeni, nakon čega su 30 min inkubirani u kolagenazi II na 37°C. Uzorak je filtriran kroz sterilni filter promera 100 µm. Crvena krvna zrnca su uklonjena pomoću hipoosmotskog pufera za liziranje crvenih krvnih zrnaca (eBioscience). Mišje ćelije u uzorcima ksenotransplantata humanih CRC uklonjene su negativnom selekcijom upotrebom antitela H-2K protiv mišjeg MHC molekula klase I praćenom upotrebom kompleta za prečišćavanje sa magnetnim perlama (Miltenyi). Fibroblasti su uklonjeni negativnom selekcijom upotrebom kompleta za prečišćavanje sa magnetnim perlama MACS (Miltenyi). Sveže izolovane xhCRC ćelije su održavane na pločama za kulturu obloženim kolagenom-1 (BD Biosciences) i gajene u MEM obogaćenom sa 10% FBS, vitaminima (1x), neesencijalnim aminokiselinama (1x), Pen-Strep (1x), natrijum piruvatom (1x) i L-glutaminom (1x). Svi dodaci za medijum su nabavljeni od kompanije Sigma.
[0066] Antitela protiv POLR2A su nabavljena od kompanije Santa Cruz (#sc-47701) i Abcam (#ab140509). Antitelo protiv Ki67 (#D3B5) i antitelo protiv otcepljene kaspaze-3 (Asp175, #5A1E) su nabavljena od kompanije Cell Signalling. Antitela protiv p53 (#sc-126), protiv βaktina (#sc-1616), HRP konjugat protiv kozjeg IgG (#sc-2020), HRP konjugat protiv zečjeg IgG (#sc-2054) i HRP konjugat protiv mišjeg IgG (#sc-2055) su nabavljeni od kompanije Santa Cruz. Priprema ćelijskog lizata, SDS-PAGE i Western blotting su sprovedeni kao što je prethodno opisano (Liu et al., 2012).
[0067] Izolovanje RNK i kvantitativna PCR. Ukupna RNK je izolovana upotrebom TRIzol reagensa (Life Technologies), a zatim reverzno transkribovana upotrebom kompleta za sintezu cDNK iScript (Bio-Rad). Dobijena cDNK je upotrebljena za qPCR korišćenjem iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) sa prajmerima specifičnim za gene i rezultati su normalizovani u odnosu na β-aktin kao kontrolu. U testovima RT-PCR, sekvence prajmera za TP53 su: 5’-GAGGTTGGCTCTGACTGTACC-3’ (SEQ ID NO: 1) i 5’-TCCGTCCCAGTAGATTACCAC-3’ (SEQ ID NO: 2), a za POLR2A su: 5’-TTGTATCCGTACCCACAGCA-3’ (SEQ ID NO: 3) i 5’-CATGATCAGCTCCCCATTCT-3’ (SEQ ID NO: 4).
[0068] Nishodna regulacija ekspresije gena POLR2A posredstvom shRNK. Klonovi shRNK specifične za POLR2A su nabavljeni od kompanije MD Anderson shRNK and ORFeome Core Facility (poreklom od kompanije Open Biosystems). Ispitano je dvanaest shRNKs usmerenih na POLR2A, od kojih su dve shRNKs snižavale nivoe proteina za najmanje 50% u sve četiri ispitivane ćelijske linije kolorektalnog kancera. Identifikacioni brojevi klonova i sekvence shRNK su V3LHS_645674 (5’-TTAGCTTTGTTCTTCCCGA-3’ [SEQ ID NO: 5]) i V3LHS_64029 (5’-TGTTGTCCATCTCCTCCCC-3’ [SEQ ID NO: 6]). Sekvence ukosnice u vektoru GIPZ klonirane su u vektor TRIPZ (Dharmacon) upotrebom protokola koji je dao proizvođač. Vektor TRIPZ je Dox-inducibilni sistem sa crvenim fluorescentnim reporterskim proteinom.
[0069] Generisanje ćelija koje stabilno eksprimiraju Dox-inducibilne shRNKs. Rekombinantne lentivirusne čestice su proizvedene iz ćelija 293T. Ukratko, 72 µg vektorske DNK koja kodira shRNK, 54 µg vektorske DNK za Delta 8.9 i 18 µg vektorske DNK koja kodira VSVG transficirano je u ćelije 293T (zasejane u posudi od 245 mm<2>) upotrebom X-tremeGENE (Roche). Supernatant koji sadrži virusne čestice je sakupljen i filtriran 72 časa posle transfekcije, koncentrovan ultracentrifugiranjem na 90000g, i ponovo suspendovan u medijumu za rast ćelija. Da bi se dobile stabilne Dox-inducibilne ćelije, HCT116 i SNU283 ćelije su inficirane virusnim česticama koje eksprimiraju shRNK pri multiplicitetu infekcije (MOI) od 1. Rastvori sa virusima su dodati medijumu za kulturu ćelija koji sadrži 4 µg/mL polibrena. Ćelije su selektovane 48 časova posle infekcije pomoću 2 µg/mL puromicina. Pojedinačne kolonije su gajene i umnožavane, i kolonije koje nose jednu kopiju inserta lentivirusne DNK su identifikovane i ispitana je efikasnost nishodne regulacije ekspresije gena.
[0070] Test kompeticije upotrebom POLR2A shRNK. Jedna lentivirusna kopija koja eksprimira bilo shRNK-1 ili shRNK-2 bila je dovoljna da suprimira nivoe ekspresije POLR2A u sve četiri ispitivane ćelijske linije kolorektalnog kancera (SL. 6A). Kancerske ćelije su inficirane lentivirusima koji eksprimiraju kontrolne ili POLR2A shRNK (pGIPZ okvir koji eksprimira GFP) pri MOI od 2. Dva dana posle infekcije, ćelije pozitivne na GFP su sortirane upotrebom uređaja za sortiranje ćelija BD FACSJazz™ (BD Biosciences) na odeljenju za protočnu citometriju i snimanje ćelija centra MD Anderson. Zatim, ćelije pozitivne na GFP su pomešane sa neinficiranim i GFP-negativnim ćelijama u odnosu 1:1 i gajene u šest pasaža. Broj ćelija koje su pozitivne na GFP i ukupnih ćelija u svakoj pasaži analiziran je i kvantifikovan protočnom citometrijom i izračunati su procenti ćelije pozitivnih na GFP.
[0071] Generisanje vektora koji eksprimiraju sgRNK i test Surveyor. Bicistronski ekspresioni vektor koji eksprimira Cas9 i sgRNK digestiran je enzimom BbsI i obrađen alkalnom fosfatazom, i linearizovani vektor je prečišćen na gelu, za kloniranje DNK koja kodira sgRNK (Cong et al., 2013). Par oligo DNK za svaku sgRNK usmerenu na TP53 ili POLR2A je hibridizovan, fosforilisan i ligiran u linearizovani vektor. Sekvence oligo DNK su navedene u tabeli 1. Test Surveyor je sproveden da bi se ispitala efikasnost uređivanja genoma kako je prethodno opisano (Ran et al., 2013; Guschin et al., 2010). Ukratko, ćelije su zasejane na ploče sa šest bunarčića pri gustini od 2x10<5>ćelija po bunarčiću. Dan nakon početnog zasejavanja, ćelije su transficirane sa 2 µg vektorske DNK koja eksprimira Cas9/sgRNK i sakupljene 48
2
časova posle transfekcije. Genomska DNK je izolovana i DNK fragment od 1kb koji sadrži ciljno mesto sgRNK je umnožen pomoću PCR metode visoke vernosti i digestiran enzimom T7 endonukleaza I. Genomska DNK izolovana iz ćelija HCT116 transficiranih kontrolnom vektorskom DNK upotrebljena je kao kontrola. Da bi se omogućilo sparivanje lanaca koji su komplementarni, ali sadrže greške sparivanja, proizvodi PCR su inkubirani na temperaturama od 95 °C tokom 5 min, 95 °C do 85 °C po stopi od -2 °C s-1 i 85 °C do 25 °C po stopi od -0.1 °C s-1. Dodata je T7 endonukleaza I i uzorci su inkubirani na 37 °C tokom 60 min za digestiju sparenih proizvoda PCR na mestima pogrešnog sparivanja. PCR proizvodi podvrgnuti digestiji T7 endonukleazom I analizirani su elektroforezom na agaroznom gelu. Oligonukleotidne sekvence upotrebljene za PCR amplifikaciju navedene su u tabeli 1. PCR proizvodi iz pozitivnih klonova su ligirani u vektor pGEM-T Easy Vector (Promega) i dodatno potvrđeni DNK sekvenciranjem.
Tabela 1. Sekvenca oligonukleotida za sgRNKs i testove Surveyor.
[0072] Ćelijska proliferacija i test preživljavanja. Jednak broj ćelija je zasejan na ploče sa 12 bunarčića u triplikatu. Ćelije su fiksirane 10% metanolom i obojene 0.1% kristal violetom (rastvorenim u 10% metanola) u naznačena vremena. Posle bojenja, bunarčići su oprani tri puta PBS-om i odbojeni sirćetnom kiselinom. Apsorbanca rastvora kristal violeta merena je na 590 nm. Za test preživljavanja ćelija, ćelije su zasejane u koncentraciji od 1000 ćelija po bunarčiću u ploče sa 96 bunarčića i tretirane naznačenim koncentracijama α-amanitina ili aktinomicina D 24
2
časa kasnije. Vijabilnost ćelija je kvantifikovana upotrebom reagensa WST-1 (Roche) prema uputstvu proizvođača. Svi eksperimenti su sprovedeni u triplikatu.
[0073] Apoptoza i analiza ćelijskog ciklusa. Ćelijske linije HCT116 i SNU283 su tretirane sa, ili bez α-amanitina 2 dana ili doksiciklinom 4 dana u naznačenim koncentracijama i obojene aneksinom V-PE i 7-AAD (Biovision). Apoptoza je analizirana protočnom citometrijom upotrebom protočnog citometra Guava EasyCyte (Millipore) prema protokolu proizvođača. I pre-apoptotske (aneksin V-pozitivne i 7-AAD-negativne) i apoptotske (aneksin V-pozitivne i 7-AAD-pozitivne) ćelije su uključene u analize. Za analizu ćelijskog ciklusa, ćelije su fiksirane u 75% etanolu na -20 °C preko noći. Ćelije su oprane hladnim PBS-om, obrađene sa 100 µg RNaze A (Qiagen), i obojene sa 50 µg propidijum jodida (Roche). Profili ćelijskih ciklusa su analizirani protočnom citometrijom upotrebom protočnog citometra Guava EasyCyte (Millipore).
[0074] Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH). FISH analiza je sprovedena upotrebom probe za POLR2A obeležene fluoresceinom (crveno) i kontrolne probe za centromere (hr. 17, zeleno) kompanije Empire Genomics. Hibridizacija i detekcija su urađene prema protokolima proizvođača. Slajdovi su kontrastno obojeni pomoću DAPI, i napravljeni su snimci upotrebom mikroskopa Nikon E800 opremljenog kamerom na bazi uređaja sa spregnutim naelektrisanjem (CCD) sa hlađenjem. Da bi se utvrdilo postojanje hemizigotnog gubitka gena POLR2A, analizirano je po 100 pojedinačnih jedara za svaki od slučajeva. Interfazna jedra su fiksirana i obrađena upotrebom sistema Quantitative Image Processing System (Applied Imaging).
[0075] Uzorci uzeti od pacijenata. Podudarni uzorci normalnog tkiva i tkiva kolorektalnog tumora od pacijenata nabavljeni su od onkološkog centra MD Anderson (MDACC) putem odgovarajućih informisanih pristanaka nakon odobrenja institucionalnog odbora za reviziju (IRB# PA11-0767). Da bi se utvrdili nivoi ekspresije proteina POLR2A, uzorci tkiva (20-40 mg) su stavljeni u epruvete koje sadrže keramičke perle i homogenizovani upotrebom uređaja za homogenizaciju Precellys 24 (Bertin Technologies). Lizati su dva puta centrifugirani (15 min, 16 000g) i supernatant je sakupljen.
[0076] Izolacija genomske DNK i validacija broja kopija. Ukupna genomska DNK je ekstrahovana iz uzoraka humanog tkiva i ćelijskih linija upotrebom kompleta DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) prema uputstvima proizvođača za prečišćavanje. Svi uzorci DNK su skladišteni na -20°C. Varijacije broja kopija za POLR2A su utvrđene upotrebom TaqMan proba (Hs02023849_cn i Hs01252684_cn) i standardnog kompleta TaqMan za PCR pomoću sistema Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection System. Istovremeno je kvantifikovan i referentni gen TERT u istoj epruveti za svaki DNK uzorak.
2
[0077] Konjugacija α-amanitina sa anti-EpCAM antitelom (HEA125). Konjugat antitelo-lek ama-HEA125 konstruisan je kuplovanjem α-amanitina sa lizinskim reziduama HEA125 antitela preko stabilne linkerske strukture. HEA125 se vezuje za ćelije koje eksprimiraju EpCAM sa visokim afinitetom (KDod približno 2.2 x 10-9 M) i visokom specifičnošću. HEA125 je prečišćeno afinitetnom hromatografijom upotrebom kolone protein A-sefaroza CL-4B (GE Healthcare). α-Amanitin je vezan za molekule imunoglobulina putem karbamidne veze stabilne u plazmi koja je predviđena da otpusti slobodni α-amanitin unutar tumorske ćelije posle lizozomalne degradacije fragmenta antitela. Odnos lek-antitelo (DAR) α-amanitina : molekulu IgG bio je 4:1. Biohemijske karakteristike ama-HEA125 su ocenjene pomoću tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) upotrebom HPLC sistema PlatinBlue (Knauer). Pored toga, HEA125 i ama-HEA125 su analizirani pomoću redukujuće SDSPAGE analize i bojenjem Komazi bojom uobičajenim postupcima. Verifikacija opterećenja lekom urađena je tehnikom imunoblotinga sa antitelom protiv amanitina sa 30 ng HEA125 i ama-HEA125 upotrebom standardnih tehnika.
[0078] Priprema lipozomskih nanočestica. siRNKs za in vivo isporuku su inkapsulirane u DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin). DOPC i siRNK su pomešani u prisustvu viška tercijarnog butanola u odnosu od 1:10 (tež./tež.) siRNK/DOPC. U smešu je dodat Tween 20 u odnosu od 1:19 Tween 20:siRNK/DOPC. Smeša je promešana na vorteksu, zamrznuta u kupatilu sa mešavinom aceton/suvi led i liofilizovana. Pre primene in vivo, ovaj preparat je hidratisan PBS-om na sobnoj temperaturi u koncentraciji od 150-1000 µg siRNK/kg po injekciji (svaki miš je primio 200 µL rastvora DOPC:siRNK:PBS intraperitonealnim putem).
[0079] Ispitivanje ksenotransplantata tumora. Ženke miševa NOD/SCID starosti četiri do šest nedelja nabavljene su od kompanije Jackson Laboratories i čuvane u uslovima bez patogena. Sva ispitivanja je odobrio i nadgledao Institucionalni komitet za negu i upotrebu životinja onkološkog centra MD Anderson. Kada su korišćeni u proračunima snage testa, eksperimenti za određivanje veličine predmetnog uzorka pokazali su da 5 miševa po grupi može da obezbedi identifikaciju očekivanog dejstva POLR2A na veličinu i težinu tumora (p < 0.05) sa 90% snage testa. Životinje su nasumično podeljene u različite grupe. Dox-inducibilne HCT116 (1x10<6>) i SNU283 (2x106) ćelije u 50 µl medijuma za rast (pomešanog sa matrigelom u odnosu 1:1) ubrizgane su subkutano u bok životinje upotrebom Hamiltonovog mikrolitarskog šprica od 100 µl. Veličina tumora je merena na svakih pet dana upotrebom kalipera, i zapremina tumora je izračunavana upotrebom standardne formule: 0.5 x L x W<2>, gde je L najduži prečnik, a W je najkraći prečnik. Za ortotopični mišji model, miševi SCID su anestezirani i koža je zasečena tako da slepo crevo bude vidljivo. Dox-inducibilne HCT116 ćelije (1x10<6>) koje eksprimiraju
2
luciferazu su ubrizgane u zid slepog creva upotrebom Hamiltonovog mikrolitarskog šprica od 100 µl, a zatim je rez zatvoren upotrebom kopči za zatvaranje rana. Tumori su praćeni sistemom IVIS nakon ubrizgavanja luciferina tokom 15 min. Posle početnog uspostavljanja tumora (100 mm3 za subkutane implantate i 2x108 fotona/sekundi ukupnog fluksa za ortotopične implantate), miševi su tretirani sa 1 µg ml<-1>doksiciklina u vodi za piće tokom 3 do 4 nedelje. Voda sa doksiciklinom je menjana svakog drugog dana.
[0080] Za ispitivanje ksenotransplantata tumora upotrebom siRNKs inkapsuliranih u DOPC, izogeni parovi HCT116 (1x106) ćelija su transplantirani u zid slepog creva upotrebom Hamiltonovog mikrolitarskog šprica od 100 µl. Deset dana posle ubrizgavanja ćelija, miševi su nasumično podeljeni i određeni da prime ili kontrolnu siRNK-DOPC ili POLR2A siRNK-DOPC. Sekvence siRNK su sledeće: kontrolna siRNK (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’ [SEQ ID NO: 19] i 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’ [SEQ ID NO: 20]); POL2 siRNK-1 (5’-CCAACAUGCUGACAGAUAU-3’ [SEQ ID NO: 21] i 5’-AUAUCUGUCAGCAUGUUGG-3’ [SEQ ID NO: 22]); POL2 siRNK-2 (5’-CCAAGAAGCGGCUCACACA-3’ [SEQ ID NO: 23] i 5’-UGUGUGAGCCGCUUCUUGG-3’ [SEQ ID NO: 24]). Doza od 150 do 1000 µg siRNK/kg težine miša primenjena je intraperitonealno u intervalima dva puta nedeljno. Ovaj raspon koncentracija osigurava efikasnu isporuku i nishodnu regulaciju ekspresije ciljnih gena, kao što je prethodno opisano (Pecot et al., 2014).
[0081] Za ispitivanje ksenotransplantata tumora upotrebom konjugata antitelo-lek (ADC) αamanitin-HEA125, izogeni parovi HCT116 (1x106), xhCRC (0.5x106), SW480 (1x106) ili SW837 (2x106) ćelija su transplantirani u zid slepog creva upotrebom Hamiltonovog mikrolitarskog šprica od 100 µl. Miševi sa tumorima starim 10 dana su nasumično raspoređeni u pet grupa (n = 10 miševa/grupi) i primili su dve intraperitonealne doze (razdvojene 1 nedelju) sledećeg: 1) kontrolnog nekonjugovanog mAb HEA125 u dozi od 3.6 mg kg<-1>telesne težine; 2) Ama-HEA125 u dozi od 90 µg kg-1 izraženo pomoću α-amanitina (što odgovara 3.6 mg kg<-1>IgG); 3) Ama-HEA125, 30 µg kg-1 izraženo pomoću α-amanitina (što odgovara 1.2 mg kg<-1>IgG); 4) Ama-HE125, 10 µg kg-1 izraženo pomoću α-amanitina (što odgovara 0.4 mg kg<-1>IgG); i 5) Ama-HEA125, 3 µg kg-1 izraženo pomoću α-amanitina (što odgovara 0.12 mg kg<-1>IgG). Tumori su praćeni sistemom za snimanje uživo IVIS dva puta nedeljno posle ubrizgavanja luciferina tokom 15 min. Telesne težine su beležene na svaka četiri dana. Krv je uzimana retroorbitalnim krvarenjem posle anestezije 21. dana i nivoi enzima jetre u krvi (AST: aspartat amino transferaza, ALT: amino alanin transferaza i alkalna fosfataza) su određeni na odeljenju za kliničku patologiju, veterinarsku medicinu i hirurgiju onkološkog centra MD Anderson.
2
[0082] Miševi su eutanazirani kada su ispunili institucionalne kriterijume za eutanaziju za veličinu tumora i ukupno zdravstveno stanje. Tumori su uklonjeni, fotografisani i izmerena im je težina. Sveže disekovano tkivo tumora fiksirano je u 10% puferisanom formalinu preko noći, oprano PBS-om, prebačeno u 70% etanol, obloženo parafinom, izrezano na isečke i obojeno hematoksilinom i eozinom. Ispitivačima je bio nepoznat raspored grupa tokom eksperimenta i pri proceni ishoda.
[0083] Imunohistohemija i mikromatrica tkiva humanog debelog creva. Mikromatrica tkiva kancera debelog creva (BC051110a) nabavljena je od kompanije Biomax, uključujući 110 uzoraka tumora debelog creva i 10 uzoraka tkiva normalnog debelog creva. Uzorci su oslobođeni parafina i rehidratisani. Antigen je izolovan upotrebom 0.01 M natrijum-citratnog pufera (pH 6.0) na temperaturi ispod tačke ključanja tokom 10 min nakon ključanja u mikrotalasnoj pećnici. Da bi se sprečila aktivnost endogene peroksidaze, isečci su inkubirani sa 3% hidrogen peroksidom 10 min. Posle 1 časa preinkubacije u 5% normalnom kozjem serumu za sprečavanje nespecifičnog bojenja, uzorci su inkubirani sa antitelom protiv POLR2A (#sc-47701, Santa Cruz), Ki67, (#D3B5, Cell Signaling), ili otcepljene kaspaze-3 (#5A1E, Cell Signaling) na 4 °C preko noći. Isečci su inkubirani sa biotinilisanim sekundarnim antitelom (biotinilisano antitelo 4Plus protiv mišjeg ili zečjeg IgG, BioCARE), a zatim inkubirani sa rastvorom kompleksa avidin-biotin peroksidaze i razvijeni upotrebom kompleta DAB (diaminobenzidin) supstrata (#550880, BD Biosciences) prema protokolu proizvođača. Kontrastno bojenje je sprovedeno upotrebom hematoksilina modifikovanog po Harrisu. Svi imunološki obojeni slajdovi su skenirani sistemom Automate Cellular Image System III (ACIS III) za kvantifikaciju digitalnom analizom slike.
[0084] Bioinformatička analiza. Korelacija između broja genskih kopija i odgovarajuće ekspresije gena analizirana je upotrebom podataka dobijenih sa CCLE (na internet adresi broadinstitute.org/ccle) i TCGA (na internet adresi cbioportal.org/public-portal/) kao što je prethodno opisano (Nijhawan et al., 2012). Obogaćivanje Pirsonovih koeficijenata korelacije određeno je permutovanjem naziva gena. Da bi se utvrdilo da li deletirani gen funkcioniše kao „housekeeping“ gen, prvo su analizirani njegovi profili ekspresije u tumorskom i normalnom tkivu, kao i njegove glavne funkcije navedene u literaturi. Drugo, konzervativnost gena među vrstama i letalnost izazvana funkcionalnim isključivanjem gena proverene su pretraživanjem dostupnih baza podataka za model-organizme (Saccharomyces Genome Database, WormBase, FlyBase i Mouse Genome Informatics). Treće, proverena je blizina potencijalnog ciljnog gena i gena TP53 i njegova istovremena delecija sa TP53 u humanim kancerima je analizirana. Najzad, identifikovane su kancerske ćelijske linije sa delecijom TP53 i ciljnog gena da bi se ispitala predmetna hipoteza.
[0085] Statistička analiza. Svaki eksperiment je ponovljen tri puta ili više. Ako nije drugačije napomenuto, podaci su predstavljeni kao srednja vrednost i standardna devijacija (s.d.) ili standardna greška srednje vrednosti (s.e.m.), a za poređenje dve grupe nezavisnih uzoraka upotrebljavan je Studentov t-test (nesparen, dvosmerni). U nesparenom t-testu, pretpostavljena je jednaka varijansa i ni jedan uzorak nije isključen iz analize. Statističke metode upotrebljene za analizu podataka TCGA opisane su u tekstu iznad. p < 0.05 je smatrano statistički značajnim.
Primer 1 - Ekspresija POLR2A, ali ne i TP53, korelisana je sa brojem kopija gena
[0086] Genomska delecija tumor-supresorskog gena često obuhvata nekoliko susednih gena koji možda ne doprinose razvoju kancera, ali su esencijalni za proliferaciju i preživljavanje ćelija (Negrini et al., 2010). Pretpostavlja se da ovaj delimični gubitak takvih „housekeeping“ gena čini kancerske ćelije veoma osetljivim na dodatnu inhibiciju ovih gena (Nijhawan et al., 2012). Analiza TCGA je otkrila da se hemizigtna delecija TP53 gena često javlja kod širokog opsega humanih kancera (SL. 1A). POLR2A je identifikovan kao „housekeeping“ gen u neposrednoj blizini TP53 (udaljen je ∼ 200 kilobaza u humanom genomu) koji je od suštinskog značaja za preživljavanje ćelija (SL. 1B). Istovremena delecija POLR2A se javlja kod praktično svih humanih kolorektalnih tumora koji imaju hemizigotnu deleciju TP53 (SL.1C).
[0087] Od dvanaest subjedinica kompleksa humane RNK polimeraze II, POLR2A kodira najveću subjedinicu koja je neophodna za aktivnost polimeraze u sintezi iRNK (Shalem et al., 2014). Inhibicija POLR2A specifičnim inhibitorom, α-amanitinom, izaziva intenzivno umiranje ćelija, a pored toga, homozigotna delecija POLR2A je letalna u humanim ćelijama (Lindell et al., 1970; Shalem et al., 2014). Nađeno je da 104 (53%) od 195 slučajeva kolorektalnog kancera (CRC) imaju delimični gubitak regiona 17p13, što rezultuje istovremenom delecijom TP53 i POLR2A (SL. 1C). Međutim, nije zapažena homozigotna delecija POLR2A, što je u skladu sa zapažanjem da je POLR2A neophodan za preživljavanje ćelija. Analiza baza podataka TCGA i CCLE otkrila je da je ekspresija POLR2A u snažnoj korelaciji sa brojem njegovih genskih kopija (SL. 1D). Ova pozitivna korelacija validirana je i na dvadeset parova odgovarajućih uzoraka normalnog i CRC tkiva i na mikromatrici humanog CRC tkiva (SL. 1E, 5A i 5B i tabela 2). Broj kopija POLR2A određen je u nizu ćelija kolorektalnog kancera (SL. 1F) i nađeno je da sve tri ćelijske linije POLR2Aloss (hemizigotni gubitak POLR2A) eksprimiraju proteine POLR2A na značajno nižim nivoima od ćelijskih linija POLR2A<neutral>(SL. 1G i 1H). Za razliku od POLR2A, nivoi p53 određeni su složenošću posttranskripcionih i posttranslacionih događaja (Toledo and Wahl,
1
2006). Uprkos korelaciji između broja kopija TP53 i ekspresije iRNK, nivoi proteina p53 nisu povezani sa brojem kopija gena u kolorektalnim tumorima i ćelijskim linijama (SL. 6A-6C i 1H).
Tabela 2. Hemizigotni gubitak POLR2A u mikromatrici humanog kancera debelog creva (#BC051110a, Biomax) određen je FISH metodom
2
4
Primer 2 – Ćelije POLR2A<loss>su veoma osetljive na inhibiciju POLR2A
[0088] Da bi se ocenila osetljivost ćelija sa, ili bez hemizigotnog gubitka TP53/POLR2 na inhibiciju POLR2A, panel POLR2Aneutral (HCT116, SW480) i POLR2Aloss (SW837, SNU283) ćelija tretiran je α-amanitinom. Tretman α-amanitinom u visokim koncentracijama (≥ 1 µg ml<-1>) drastično je inhibirao rast ćelija i izazvao potpunu ćelijsku smrt kod sve četiri ćelijske linije. Međutim, u koncentracijama od 0 do 1.0 µg ml<-1>, inhibicija α-amanitinom imala je značajno viši nivo delovanja u smislu ubijanja ćelija na ćelije POLR2A<loss>ćelije nego na kontrolne ćelije POLR2Aneutral (SL. 2A i 2B). Koncentracija koja odgovara polovini maksimalne inhibicije (IC50) bila je -1.0 µg ml-1 za POLR2Aneutral ćelije, što je bilo 10 puta više nego za POLR2A<loss>ćelije. Nasuprot tome, POLR2A<loss>ćelije nisu pokazale veću osetljivost na tretman aktinomicinom D, nespecifičnim inhibitorom transkripcije (SL. 7A). Zatim, ocenjivana je osetljivost POLR2Aloss ćelija upotrebom testa direktne kompeticije. Upoređene su brzine ćelijske proliferacije kontrolnih ćelija i GFP-pozitivnih ćelija koje eksprimiraju kontrolne ili POLR2A-specifične shRNK. Dve nezavisne shRNKs dovele su do nishodne regulacije ekspresije POLR2A za 50%-70% u svim ispitivanim ćelijskim linijama (SL. 7B). Posle kultivacije u šest pasaža, POLR2Aneutral ćelije (HCT116, SW480) koje stabilno eksprimiraju POLR2A shRNKs imale su samo umereno smanjenu proliferaciju, u poređenju sa onom kod odgovarajućih ćelija koje eksprimiraju kontrolne shRNKs (SL.7C). Međutim, utišavanje POLR2A u POLR2A<loss>ćelijama (SNU283, SW837) dovelo je do izrazito smanjene proliferacije, što ukazuje na to da hemizigotni gubitak POLR2A čini kancerske ćelije podložnijim daljoj inhibiciji POLR2A. Generisane su ćelijske linije HCT116 i SNU283 koje stabilno eksprimiraju doksiciklin (Dox)-inducibilne POLR2A shRNKs (SL. 7D). Uprkos značajnoj nishodnoj regulaciji ekspresije POLR2A, HCT116 ćelije su nastavile da proliferišu, dok su SNU283 ćelije ispoljile ozbiljan zastoj u G1 fazi ćelijskog ciklusa i apoptozu (SL. 2C, 2D, i 7E-7G). Smanjenje ekspresije POLR2A od približno 50% (uz dodatak 30-100 ng ml<-1>Dox) značajno je smanjilo proliferaciju SNU283 ćelija, ali je imalo samo umereno dejstvo na HCT116 ćelije (SL. 2D). Nakon toga, sprovedeni su eksperimenti oporavka na ćelijskim linijama POLR2A<loss>SNU283 i SW837. Postepena ponovna ekspresija egzogenog POLR2A u obe ćelijske linije ponovo je uspostavila njihovu otpornost na α-amanitin do nivoa uporedivog sa onim kod POLR2A<neutral>HCT116 i SW480 ćelija (SL. 2E, 2F, i 8A-8B).
[0089] Kako bi se isključio uticaj faktora različite genetske pozadine među ćelijskim linijama, upotrebljen je sistem CRISPR (grupisani kratki palindromski ponovci na jednakim rastojanjima)/Cas9 za stvaranje izogene HCT116 ćelijske linije sa hemizigotnim gubitkom POLR2A (Wang et al., 2014; Wang et al., 2013). Konstruisane su dve jednomolekulske vodeće (eng – single-guide) RNKs (sgRNKs) usmerene na drugi egzon gena POLR2A (SL.9A). Obe su pokazale efikasno ciljno delovanje i narušile funkciju gena POLR2A, kako je pokazano analizom Surveyor (SL. 9B). Pojedinačne kolonije HCT116 ćelija sa monoalelnom delecijom POLR2A su selektovane i potvrđene sekvenciranjem DNK (SL.9C). Mala delecija u ciljnom regionu vodila je pomeranju otvorenog okvira čitanja, što je rezultovalo stvaranjem samo kratkog segmenta N-terminalnog peptida bez svih funkcionalnih domena POLR2A. Kao rezultat, ekspresija POLR2A je značajno smanjena kod POLR2A<loss>ćelija (SL. 9D). Ćelije POLR2A<loss>i POLR2A<neutral>HCT116 ispoljile su slične brzine proliferacije (SL. 9E), ukazujući na to da je jedan alel POLR2A dovoljan za održavanje proliferacije i preživljavanja ćelija. Međutim, hemizigotna delecija POLR2A značajno je povećala osetljivost HCT116 ćelija na tretman α-amanitinom sa IC50od ∼ 0.1 µg ml-1 , što je 8 puta niže nego kod parentalnih HCT116 ćelija (SL.2G i 2H). Što se tiče kontrola, nisu zapažene značajne razlike u njihovoj osetljivosti na aktinomicin D (SL.
9F). Rezultat testa direktne kompeticije pokazao je da je nishodna regulacija ekspresije POLR2A dovela do značajno smanjene proliferacije POLR2A<loss>ćelija, ali ne i izogenih POLR2A<neutral>ćelija (SL. 9G). Generisane su i ćelije POLR2A<loss>i POLR2A<neutral>HCT116 koje eksprimiraju Dox-inducibilne POLR2A shRNK. Povećane koncentracije Dox postepeno su redukovale ekspresiju POLR2A. Dok je niska doza Dox (100 ng ml-1) bila dovoljna da dovede do značajne smrti POLR2Aloss ćelija, visoke doze Dox imale su samo minimalno dejstvo na POLR2A<neutral>ćelije (SL.2I, 2J i 9H).
Primer 3 - Osetljivost ćelija POLR2A<loss>na inhibiciju POLR2A je nezavisna od p53
[0090] Blokiranje RNK polimeraze može da dovede do nakupljanja i aktivacije p53 (Derheimer et al., 2007). Da bi se ispitala dejstva p53 na ćelijski odgovor na inhibiciju POLR2A, ponovljena je istovremena delecija TP53 i POLR2A u ćelijskim linijama HCT116 i xhCRC (SL. 3A i 10A-10C). Ćelijska linija xhCRC (TP53+/+; POLR2A+/+) je uspostavljena iz sveže izolovanog ksenotransplantata humanog kolorektalnog tumora, koji je pokazao pojačanu tumorogenost in vivo (Lu et al., 2013). Osim blago povećane ćelijske proliferacije, nisu zapažene značajne promene osetljivosti na α-amanitin ni kod jedne od ćelijskih linija xhCRC i HCT116 sa hemizigtnom delecijom TP53. Nasuprot tome, hemizigotni gubitak POLR2A značajno je povećao osetljivost ovih ćelija na tretman α-amanitinom bez obzira na njihov TP53 status (SL.
3B, 3C i 10D-10F). RNK polimeraza II odgovorna je za sintezu iRNK, esencijalnu funkciju za bilo koji tip ćelija uključujući tumorske ćelije otporne na terapiju. Ispitivana je osetljivost na lek ćelija POLR2A<neutral>i POLR2A<loss>za tri glavna hemoterapijska leka za kolorektalni kancer (5-fluorouracil (5-FU), oksaliplatin i SN-38). Inhibicija POLR2A α-amanitinom značajno je pojačala citotoksično dejstvo sva tri leka u ćelijama POLR2A<loss>xhCRC, ali nije imala uočljive efekte na POLR2Aneutral ćelije (SL. 3D), ukazujući na terapijsku osetljivost POLR2A<loss>kolorektalnih tumora u terapiji kancera. Slobodni α-amanitin je toksičan za jetru jer se specifično vezuje za OATP1B3, transportni molekul koji se eksprimira isključivo na membrani hepatocita (Letschert et al., 2006). Međutim, α-amanitin, kada je konjugovan sa specifičnim antitelima, više ne predstavlja supstrat za OATP1B3 (Letschert et al., 2006; Moldenhauer et al., 2012; Faulstich and Fiume, 1985). Ovom strategijom prevazilazi se toksičnost α-amanitina za kliničke primene. Korišćen je α-amanitin konjugovan sa monoklonskim antitelom (HEA125) protiv EpCAM (ama-HEA125), antigena kancera koji se prekomerno eksprimira kod većine adenokarcinoma (Moldenhauer et al., 2012; Went et al., 2004). Konjugat ama-HEA125 je selektivno ubijao POLR2Aloss xhCRC i HCT116 kancerske ćelije mehanizmom nezavisnim od p53 i redukovao efikasne doze α-amanitina za najmanje 10000 puta (IC50∼ 0.01 ng ml-1) in vitro (SL.3E i 10G).
Primer 4 - Supresija POLR2A selektivno inhibira rast tumora POLR2Aloss
[0091] Da bi se ispitalo antitumorsko dejstvo inhibicije POLR2A in vivo, ćelije HCT116 i SNU283 koje eksprimiraju Dox-inducibilne POLR2A shRNK ubrizgane su subkutano u imunokompromitovane SCID BALB/c miševe. Nakon uspostavljanja početnog tumora, davanje Dox u vodi za piće suprimiralo je ekspresiju POLR2A i posledično inhibiralo rast tumora poreklom od SNU283 (SL. 4A). Međutim, nisu zapažene značajne razlike između kontrole i tumora poreklom od HCT116 sa nishodno regulisanim POLR2A. Histopatološke analize pokazale su da SNU283 tumori sa nishodno regulisanim POLR2A (Dox: 1.0 µg ml-1) imaju značajno sniženu ćelijsku proliferaciju (bojenje Ki67), ali više apoptotskih ćelija (bojenje otcepljene kaspaze-3), u poređenju sa odgovarajućim kontrolnim tumorima (SL. 11A-11B). Nasuprot tome, nisu zapažene značajne promene kod kontrole ili HCT116 tumora sa nishodno regulisanim POLR2A. Međutim, heterozigotna delecija POLR2A senzitizovala je POLR2A+/-tumore poreklom od HCT116 na supresiju Dox-inducibilnom POLR2A shRNK (SL. 11C). Zatim, za ispitivanje dejstva inhibicije POLR2A korišćen je model ortotopičnog tumora. POLR2Aneutral i POLR2Aloss HCT116 ćelije su ubrizgane u zid slepog creva SCID miševa. Kada su ortotopični tumori uspostavljeni, miševima je dat Dox (1.0 µg ml<-1>) u vodi za piće. In vivo bioluminescentno snimanje tumora pokazalo je da Dox-indukovana inhibicija POLR2A dovodi do značajnog smanjenja kinetike rasta tumora kod POLR2A<loss>tumora, ali ne i kod kontrolnih POLR2Aneutral tumora (SL. 4B-C). Posle 3-nedeljnog tretmana sa Dox, veliki tumori su bili vidljivi u grupi POLR2Aneutral tumora, dok je značajno smanjen rast tumora ili odsustvo vidljivog tumora zapaženo u grupi POLR2A<loss>. Kako bi se dodatno ispitala efikasnost utišavanja POLR2A in vivo, za sistemsku isporuku POLR2A siRNKs upotrebljena je platforma na bazi nanolipozomske isporuke, DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin) (Pecot et al., 2014). Dve specifične POLR2A siRNKs ispoljile su nishodnu regulaciju proteina POLR2A u izogenim ćelijskim linijama HCT116 veću od 80% (SL. 12A). Deset dana nakon ortotopičnog ubrizgavanja 1.0x106 izogenih HCT116 ćelija, miševi su nasumično raspoređeni u tretmanske grupe (n = 10 miševa/grupi). Započeto je davanje, dva puta nedeljno, siRNKs ugrađenih u DOPC nanolipozome (SL. 12B). Posle četiri nedelje sistemske terapije, u poređenju sa tretmanom kontrolnom siRNK-DOPC, miševi u tretmanskim grupama od 125 µg kg<-1>POLR2A siRNK-DOPC imali su izraženo smanjenje rasta POLR2A<loss>tumora, dok su POLR2A<neutral>tumori ispoljili značajnu inhibiciju rasta tek pri dozi od 1 000 µg kg<-1>POLR2A siRNK-DOPC (SL.
12C-F).
[0092] Konjugat ama-HEA125 ispoljio je visok nivo selektivnosti za POLR2Aloss kancerske ćelije in vitro (SL. 3E i 10G). Nakon toga, ispitivana je antitumorska aktivnost ama-HEA125 u ortotopičnim modelima tumora uspostavljenim pomoću izogenih parova TP53/POLR2A<neutral>i TP53/POLR2Aloss xhCRC i HCT116 ćelija (SL. 4D-4E i 13A-13B). U eksperimentu sa povećanjem doze, ama-HEA125 je dat miševima koji imaju tumor u vidu dvostrukih intraperitonealnih injekcija u dozi od 3, 10, 30, ili 90 µg u odnosu na α-amanitin po kg telesne težine miša (n = 10 miševa po grupi). Kontrolni miševi su primili nekonjugovano HEA125 mAb (n = 10 miševa). Kod miševa koji imaju POLR2A<loss>tumore, kontrolni miševi tretirani sa HEA125 ispoljili su kontinuirani rast tumora tokom 25 dana posle ubrizgavanja antitela. Tretman pomoću ama-HEA125 pokazao je snažnu inhibiciju rasta tumora čak i pri najnižoj dozi od 3 µg kg-1. Svi POLR2Aloss tumori su odgovorili na tretman sa ama-HEA125, i zapremina tumora se značajno smanjila (SL.4D-4E). Potpuna regresija tumora zapažena je kod 10 od 10 (90 µg kg<-1>), 8 od 10 (30 µg kg-1), i 6 od 10 (10 µg kg-1) miševa sa POLR2A<loss>HCT116 tumorima 25 dana posle prve primene ama-HEA125 (SL. 4D). Nasuprot tome, značajna inhibicija tumora zapažena je kod miševa sa POLR2A<neutral>tumorima samo pri najvišoj dozi od 90 µg kg<-1>, ali ne pri dozama od 3-30 µg kg-1. Slični rezultati zapaženi su kod miševa sa tumorima poreklom od xhCRC (SL.
4E). U skladu sa prethodnim studijama (Moldenhauer et al., 2012), tretman sa ama-HEA125 u ispitivanim dozama nije ispoljio primetnu toksičnost in vivo. Analiza telesnih težina i enzima jetre u krvi nije otkrila nikakve suštinske razlike između grupe koja je primala ama-HEA125 i kontrolne grupe koja je primala HEA125 (SL. 13C i 13D), što ukazuje na zanemarljivu sistemsku toksičnost konjugata ama-HEA125. Pored toga, antitumorska aktivnost ama-HEA125 dodatno je ispitivana u ortotopičnim tumorima poreklom od POLR2A<neutral>SW480 ćelija i POLR2Aloss SW837 ćelija (SL. 14A-14F). Primena ama-HEA125 u dozi od 10 µg kg<-1>bila je dovoljna da inhibira rast tumora kod svih POLR2Aloss tumora, dok su POLR2Aneutral (SW480) ili POLR2Aloss tumori sa ponovno uvedenim POLR2A (SW837 koje eksprimiraju egzogeni POLR2A) bili značajno inhibirani samo primenom ama-HEA125 u dozi od 90 µg kg<-1>.
[0093] Svi postupci koji su opisani i za koje se traži patentna zaštita u ovom dokumentu mogu da se sprovedu i izvrše bez nepotrebnog eksperimentisanja u svetlu predmetnog otkrića. Iako su kompozicije i postupci ovog pronalaska opisani u smislu poželjnih primera izvođenja, stručnjacima u ovoj oblasti biće očigledno da mogu da se primene varijacije u postupcima i koracima ili u redosledu koraka ovde opisanih postupaka. Specifičnije, biće očigledno da ovde opisani agensi mogu da se zamene određenim agensima koji su hemijski i fiziološki srodni, uz postizanje istih, ili sličnih rezultata.
REFERENCE
[0094] Sledeće reference su povezane sa gore navedenim.
U.S. Patent No.4,870,287
U.S. Patent No.5,091,513
U.S. Patent No.5,739,169
U.S. Patent No.5,760,395
U.S. Patent No.5,801,005
U.S. Patent No.5,824,311
U.S. Patent No.5,830,880
U.S. Patent No.5,846,945
U.S. Patent Publn. No.2005/0214860
U.S. Patent Publn. No.2009/0304666
PCT Publn. No. WO2012/119787
PCT Publn. No. WO2014/135282
PCT Publn. No. WO2010/115630
Adair et al., "Antibody-drug conjugates - a perfect synergy", Expert Opinion on Biological Therapy. 12(9):1191-1206, 2012.
Austin-Ward and Villaseca, Revista Medica de Chile, 126(7):838-845, 1998.
Bensaude, "Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity?" Transcription, 2(3):103, 2011.
Bukowski et al., Clinical Cancer Res., 4(10):2337-2347, 1998.
Chene, "Inhibiting the p53-MDM2 interaction: an important target for cancer therapy," Nat. Rev. Cancer, 3(2):102, 2003.
Cheok et al., "Translating p53 into the clinic," Nat. Rev. Clin. Oncol., 8(1):25, 2011.
Christodoulides et al., Microbiology, 144(Pt 11):3027-3037, 1998.
Cong et al., "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems," Science, 339:819-823,2013.
Davidson et al., J. Immunother., 21(5):389-398, 1998.
Davis et al., "A conjugate of [alpha]-amanitin and monoclonal immunoglobulin G to Thy 1.2 antigen is selectively toxic to T lymphoma cells", Science, 213:1385-1388, 1981.
Derheimer et al., "RPA and ATR link transcriptional stress to p53," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(31): 12778, 2007.
Faulstich and Fiume, "Protein conjugates of fungal toxins," Methods Enzymol., 112:225, 1985. Fluiter et al., "Tumor genotype-specific growth inhibition in vivo by antisense oligonucleotides against a polymorphie site of the large subunit of human RNA polymerase II", Cancer Research, 62(7):2024-2028, 2002.
4
Fluiter et al., "Killing cancer by targeting genes that cancer cells have lost: allele-specific inhibition, a novel approach to the treatment of genetic disorders", Cellular and Molecular Life Sciences, 60(5):834-843, 2003.
Goldstein et al., "Understanding wild-type and mutant p53 activities in human cancer: new landmarks on the way to targeted therapies," Cancer Gene Ther., 18(1):2, 2011.
Guschin et al., "A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification," Methods Mol. Biol., 649:247-256, 2010.
Hanibuchi et al., Int. J. Cancer, 78(4):480-485, 1998.
Haupt and Haupt, "Manipulation of the tumor suppressor p53 for potentiating cancer therapy," Semin. Cancer Biol., 14(4):244, 2004.
Hellstrand et al., Acta Oncologica, 37(4):347-353, 1998.
Hui and Hashimoto, Infection Immun., 66(11):5329-5336, 1998.
Lane et al., "p53-based cancer therapy," Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2(9):a001222, 2010.
Letschert et al., "Molecular characterization and inhibition of amanitin uptake into human hepatocytes," Toxicol. Sci., 91(1):140, 2006.
Lindell et al., "Specific inhibition of nuclear RNA polymerase II by alpha-amanitin," Science, 170(3956):447, 1970.
Liu et al., "Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-encoded microRNA miR-K12-11 attenuates transforming growth factor beta signaling through suppression of SMAD5," Journal of Virology, 86:1372-1381, 2012.
Lu et al., "Endothelial cells promote the colorectal cancer stem cell phenotype through a soluble form of Jagged-1," Cancer Cell, 23(2):171, 2013.
Moldenhauer et al., "Therapeutic potential of amanitin-conjugated anti-epithelial cell adhesion molecule monoclonal antibody against pancreatic carcinoma," J. Natl. Cancer Inst., 104(8):622, 2012.
Mook et al., "Allele-specific cancer cell killing in vitro and in vivo targeting a single-nucleotide polymorphism in POLR2A", Cancer Gene Therapy, 16(6):532-538, 2009.
Negrini et al., "Genomic instability--an evolving hallmark of cancer," Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 11(3):220, 2010.
Nijhawan et al., "Cancer vulnerabilities unveiled by genomic loss," Cell, 150(4):842-854, 2012.
Pecot et al., "Therapeutic Silencing of KRAS Using Systemically Delivered siRNAs," Mol. Cancer Ther., 13(12):2876-2885, 2014.
Petitjean et al., "Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database," Hum. Mutat., 28(6):622, 2007.
Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(24):14411-14416, 1998.
Ran et al., "Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system," Nature Protocols, 8:2281-2308, 2013.
Shalem et al., "Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells," Science, 343(6166):84, 2014.
Toledo and Wahl, "Regulating the p53 pathway: in vitro hypotheses, in vivo veritas," Nat. Rev. Cancer, 6(12):909, 2006.
Vazquez et al., "The genetics of the p53 pathway, apoptosis and cancer therapy," Nat. Rev. Drug Discov., 7(12):979, 2008.
Wade et al., "MDM2, MDMX and p53 in oncogenesis and cancer therapy," Nat. Rev. Cancer, 13(2):83, 2013.
Wang et al., "Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system," Science, 343(6166):80, 2014.
Wang et al., "One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Casmediated genome engineering," Cell, 153(4):910, 2013.
Went et al., "Frequent EpCam protein expression in human carcinomas," Hum. Pathol., 35(1): 122, 2004.
4
4
4
4
4
4

Claims (11)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija za upotrebu u lečenju pacijenta koji ima kancer, pri čemu su ćelije kancera ispitane na: (i) hemizigotni gubitak gena TP53; (ii) hemizigotni gubitak gena POLR2A; ili (iii) sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo ekspresije, gde kompozicija sadrži terapijski efikasnu količinu inhibitora POLR2A,
pri čemu inhibitor POLR2A sadrži amatoksin, i pri čemu je amatoksin konjugovan sa antitelom koje se specifično vezuje za antigen povezan sa tumorom.
2. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je amatoksin alfaamanitin.
3. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što referentni nivo ekspresije predstavlja nivo ekspresije u ćelijama koje nisu kancerozne.
4. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što ćelije kancera ispoljavaju hemizigotni gubitak gena TP53 ili hemizigotni gubitak gena POLR2A.
5. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što pacijent ima ćelije kancera koje ispoljavaju sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo ekspresije.
6. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što ćelije kancera predstavljaju ćelije kancera pluća, kancera mozga, kancera dojke, kancera jetre, kancera jajnika, kolorektalnog kancera, kancera prostate, ili kancera pankreasa.
7. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što su ćelije kancera metastatske, rekurentne, ili otporne na više lekova.
8. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 za upotrebu u postupku za lečenje pacijenta koji ima kancer koji obuhvata:
(a) odabir pacijenta za koga je utvrđeno da ima ćelije kancera koje sadrže (i) hemizigotni gubitak gena TP53; (ii) hemizigotni gubitak gena POLR2A; ili (iii) sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo; i
(b) davanje terapijski efikasne količine inhibitora POLR2A pacijentu,
pri čemu inhibitor POLR2A sadrži amatoksin, i pri čemu je amatoksin konjugovan sa antitelom koje se specifično vezuje za antigen povezan sa tumorom.
9. In vitro postupak za odabir terapije lekom za pacijenta sa kancerom koji obuhvata:
(a) detekciju, u uzorku kancera, prisustva (i) hemizigotnog gubitka gena TP53; (ii) hemizigotnog gubitka gena POLR2A; ili (iii) sniženog nivoa ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo, u ćelijama kancera; i
(b) odabir inhibitora POLR2A ako je (i) otkriven hemizigotni gubitak gena TP53; (ii) otkriven hemizigotni gubitak gena POLR2A; ili (iii) sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo otkriven u ćelijama kancera,
pri čemu inhibitor POLR2A sadrži amatoksin, i pri čemu je amatoksin konjugovan sa antitelom koje se specifično vezuje za antigen povezan sa tumorom.
10. Postupak prema patentnom zahtevu 9, naznačen time, što ćelije kancera sadrže hemizigotni gubitak gena TP53 ili hemizigotni gubitak gena POLR2A.
11. Postupak prema patentnom zahtevu 9, naznačen time, što ćelije kancera sadrže sniženi nivo ekspresije proizvoda gena POLR2A u odnosu na referentni nivo.
1
RS20201349A 2015-03-04 2016-03-03 Postupci za lečenje kancera sa hemizigotnim gubitkom gena tp53 RS61047B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562128480P 2015-03-04 2015-03-04
PCT/US2016/020687 WO2016141185A1 (en) 2015-03-04 2016-03-03 Methods of treating cancer harboring hemizygous loss of tp53
EP16710890.1A EP3265565B1 (en) 2015-03-04 2016-03-03 Methods of treating cancer harboring hemizygous loss of tp53

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61047B1 true RS61047B1 (sr) 2020-12-31

Family

ID=55586424

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201349A RS61047B1 (sr) 2015-03-04 2016-03-03 Postupci za lečenje kancera sa hemizigotnim gubitkom gena tp53

Country Status (24)

Country Link
US (2) US10563204B2 (sr)
EP (2) EP3741855A1 (sr)
JP (2) JP6811718B2 (sr)
KR (1) KR102697493B1 (sr)
CN (1) CN107847553A (sr)
AU (1) AU2016226133B2 (sr)
BR (1) BR112017018861A2 (sr)
CA (1) CA2978632C (sr)
CY (1) CY1123489T1 (sr)
DK (1) DK3265565T3 (sr)
ES (1) ES2831157T3 (sr)
HR (1) HRP20201791T1 (sr)
HU (1) HUE051776T2 (sr)
IL (2) IL284264B (sr)
LT (1) LT3265565T (sr)
MX (1) MX379585B (sr)
PL (1) PL3265565T3 (sr)
PT (1) PT3265565T (sr)
RS (1) RS61047B1 (sr)
RU (1) RU2721953C2 (sr)
SG (2) SG10201907746TA (sr)
SI (1) SI3265565T1 (sr)
WO (1) WO2016141185A1 (sr)
ZA (1) ZA201706459B (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3265565T3 (pl) 2015-03-04 2021-01-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Sposoby leczenia nowotworu z hemizygotyczną utratą tp53
IL263744B2 (en) 2016-06-17 2023-11-01 Magenta Therapeutics Inc Compositions and methods for the depletion of cd117 plus cells
EP3571230A4 (en) 2017-01-20 2020-12-16 Magenta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELETION OF CD137 + CELLS
EP3873541A4 (en) * 2018-10-30 2022-08-31 Ohio State Innovation Foundation PH-ACTIVATED NANOPARTICLES
CA3128526A1 (en) 2019-02-01 2020-08-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Monoclonal antibodies against mhc-bound human dickkopf-1 peptides and uses thereof
MX2022000052A (es) 2019-07-01 2022-04-06 Eisai R&D Man Co Ltd Sistema para aumentar el cumplimiento terapéutico del compuesto antineoplásico e7766.
CN111569076B (zh) * 2020-06-28 2022-05-17 中国农业科学院特产研究所 Polr2a抑制剂在制备药物中的应用
CN114875107B (zh) * 2021-05-19 2025-05-27 中南大学 Polr2a作为治疗肿瘤疗效的生物标志物
CN113702648B (zh) * 2021-09-13 2024-06-04 中南大学湘雅三医院 Polr2a在作为预测抗肿瘤药物的抗肿瘤疗效的生物标志物上的应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5824311A (en) 1987-11-30 1998-10-20 Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of tumors with monoclonal antibodies against oncogene antigens
US4870287A (en) 1988-03-03 1989-09-26 Loma Linda University Medical Center Multi-station proton beam therapy system
US5801029A (en) 1993-02-16 1998-09-01 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
GB9506466D0 (en) 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
US5760395A (en) 1996-04-18 1998-06-02 Universities Research Assoc., Inc. Method and apparatus for laser-controlled proton beam radiology
US5739169A (en) 1996-05-31 1998-04-14 Procept, Incorporated Aromatic compounds for inhibiting immune response
US20020064528A1 (en) 2000-01-28 2002-05-30 Zhenping Zhu Antibodies specific to KDR and uses thereof
US20070207158A1 (en) 2003-06-17 2007-09-06 Harrison Roger G Conjugate for the specific targeting of anticancer agents to tumor cells or tumor vasculature and production thereof
JP5518062B2 (ja) * 2008-07-24 2014-06-11 ネルビアーノ・メデイカル・サイエンシーズ・エツセ・エルレ・エルレ オーロラキナーゼ阻害剤および抗悪性腫瘍剤を含む治療用組み合わせ
AU2010234335A1 (en) * 2009-04-08 2011-10-13 Deutsches Krebsforschungszentrum Amatoxin-armed target-binding moieties for the treatment of cancer
EP2497499A1 (en) 2011-03-10 2012-09-12 Heidelberg Pharma GmbH Amatoxin-conjugates with improved linkages
EP2774624A1 (en) 2013-03-04 2014-09-10 Heidelberg Pharma GmbH Amatoxin derivatives
EP3215519A1 (en) * 2014-11-06 2017-09-13 Novartis AG Amatoxin derivatives and conjugates thereof as inhibitors of rna polymerase
PL3265565T3 (pl) 2015-03-04 2021-01-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Sposoby leczenia nowotworu z hemizygotyczną utratą tp53

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170125954A (ko) 2017-11-15
US11479774B2 (en) 2022-10-25
US20180044681A1 (en) 2018-02-15
RU2721953C2 (ru) 2020-05-25
SI3265565T1 (sl) 2020-12-31
NZ736027A (en) 2023-09-29
JP6811718B2 (ja) 2021-01-13
AU2016226133A1 (en) 2017-10-26
KR102697493B1 (ko) 2024-08-23
ZA201706459B (en) 2020-03-25
HRP20201791T1 (hr) 2021-04-16
EP3265565A1 (en) 2018-01-10
CN107847553A (zh) 2018-03-27
RU2017134347A3 (sr) 2019-09-23
EP3741855A1 (en) 2020-11-25
JP7090933B2 (ja) 2022-06-27
LT3265565T (lt) 2020-11-25
IL254271A0 (en) 2017-10-31
PL3265565T3 (pl) 2021-01-25
MX379585B (es) 2025-03-11
HUE051776T2 (hu) 2021-03-29
IL254271B (en) 2021-12-01
JP2018508532A (ja) 2018-03-29
CY1123489T1 (el) 2022-03-24
EP3265565B1 (en) 2020-08-12
MX2017011298A (es) 2018-06-19
US10563204B2 (en) 2020-02-18
DK3265565T3 (da) 2020-11-09
IL284264B (en) 2022-09-01
US20200063140A1 (en) 2020-02-27
IL284264A (en) 2021-07-29
JP2021020952A (ja) 2021-02-18
PT3265565T (pt) 2020-11-17
WO2016141185A1 (en) 2016-09-09
SG10201907746TA (en) 2019-09-27
ES2831157T3 (es) 2021-06-07
AU2016226133B2 (en) 2021-12-02
HK1249138A1 (zh) 2018-10-26
SG11201707097RA (en) 2017-09-28
BR112017018861A2 (pt) 2018-04-24
CA2978632A1 (en) 2016-09-09
CA2978632C (en) 2023-10-31
RU2017134347A (ru) 2019-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7090933B2 (ja) Ｔｐ５３のヘミ接合性喪失を保有するがんを処置する方法
US10428159B2 (en) Blocking monoclonal antibodies to AGR2 and its receptor C4.4A
US20250025489A1 (en) Methods of vaccination in premalignant settings
US20220047596A1 (en) Combination of parp inhibitor and brd4 inhibitor for the treatment of cancer
US20200164034A1 (en) Methods for improving sex-dimorphic responses to targeted therapy in melanoma
US20230293587A1 (en) Targeting of src-3 in immune cells as an immunomodulatory therapeutic for the treatment of cancer
US20240409934A1 (en) Foxo1-targeted therapy for the treatment of cancer
US20220175744A1 (en) Combinations of transcription inhibitors and immune checkpoint inhibitors for treatment of disease
HK40040560A (en) Methods of treating cancer harboring hemizygous loss of tp53
HK1249138B (en) Methods of treating cancer harboring hemizygous loss of tp53
US20230167453A1 (en) Rna aptamers and use thereof for treating cancer
NZ736027B2 (en) Methods of treating cancer harboring hemizygous loss of tp53
US10870854B2 (en) Inhibitory RNA-based therapeutics targeting ANLN for cancer treatment
Huang The Role of HuR in Mediating Ovarian Cancer Treatment