RS61052B1 - Obogaćivanje cirkulišućih ćelija tumora osiromašenjem belih krvnih zrnaca - Google Patents

Obogaćivanje cirkulišućih ćelija tumora osiromašenjem belih krvnih zrnaca

Info

Publication number
RS61052B1
RS61052B1 RS20201358A RSP20201358A RS61052B1 RS 61052 B1 RS61052 B1 RS 61052B1 RS 20201358 A RS20201358 A RS 20201358A RS P20201358 A RSP20201358 A RS P20201358A RS 61052 B1 RS61052 B1 RS 61052B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
white blood
cells
blood cells
marker
enriched
Prior art date
Application number
RS20201358A
Other languages
English (en)
Inventor
Galla Chandra Rao
Brad Foulk
Denis Smirnov
Karl Nielsen
Original Assignee
Menarini Silicon Biosystems Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Menarini Silicon Biosystems Spa filed Critical Menarini Silicon Biosystems Spa
Publication of RS61052B1 publication Critical patent/RS61052B1/sr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/583—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with non-fluorescent dye label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
Stanje tehnike
[0001] Cirkulišuće ćelije tumora (CTC) epitelnog porekla prisutne su u krvi pacijenata sa karcinomom na vrlo niskom nivou učestalosti (<10/ml krvi). Otkrivanje cirkulišućih ćelija tumora može biti od značaja za kontrolisanje bolesti karcinoma. Otkrivanje ćelija niske učestalosti zahteva veliku zapreminu krvi za obradu. Da bi se izbrojale i okarakterisale CTC iz velike količine krvi, neophodno je obogaćivanje CTC-a.
[0002] Postoji nekoliko metoda za obogaćivanje CTC-a na osnovu veličine, gustine i antigena. Komercijalni proizvod koji se dobro pokazao za obogaćivanje retkih ćelija je Veridex CellSearch CTC test. CTC CellSearch test koristi magnetne čestice konjugovane sa molekulom protiv adhezije ćelija epitela (EpCAM) za hvatanje CTC iz 7,5 ml krvi. Obogaćeni uzorci se boje korišćenjem DAPI, bojom za nukelinske kiseline, da bi se identifikovale ćelije sa nukleusom, antitela anti-citokeratina konjugovana sa fikoeritrinom da bi se identifikovale ćelije epitelnog porekla i antitela anti-leukocita konjugovana sa alofikocijaninom radi identifikacije svih leukocita. Uzorci se analiziraju na CellTracks Analizatoru II radi brojanja CTC-a.
[0003] Krajnji uzorak nakon obogaćivanja sadrži CTC i mali broj belih krvnih zrnaca (1000 – 5000 ćelija). Metodom obogaćivanja uklanja se više od 99% belih krvnih zrnaca (eng.white blood cells, WBC). Prisustvo belih krvnih zrnaca tokom brojanja retkih ćelija nije problem i ne utiče negativno na postupak. WBC se mogu obeležiti leukocitnim markerom (CD45) kako bi se napravila razlika između WBC i CTC. Međutim, ukoliko želimo da molekularno okarakterišemo izbrojane CTC kako bismo definisali njihov genotip pojačavanjem nukleinskih kiselina prisutnih u takvim CTC-ima, prisustvo belih krvnih zrnaca negativno utiče na ovakvu karakterizaciju. Imajući u vidu da je odnos belih krvnih zrnaca u izbrojanoj frakciji visok u poređenju sa brojem CTC- a, nukleinske kiseline takvih belih ćelija se pojačavaju sa CTC, bilo je teško odrediti izvor nukleusnih kiselina, tačnije CTC ili belih krvnih zrnaca. Kao rezultat, dalje prečišćavanje obogaćenih uzoraka za uklanjanje belih krvnih zrnaca (smanjenje odnosa belih krvnih zrnaca prema CTC) bio bi glavna prekretnica u razvoju pouzdanih alata za molekularnu karakterizaciju. Predmetni pronalazak zadovoljava ovu potrebu.
[0004] Yang et al. (Biotechnology Bioengineering 2009. 1. februar; 102 (2): 521-34) govori o optimizaciji postupka obogaćenja cirkulišićih ćelija tumora iz krvi pacijenata sa rakom glave i vrata osiromašenjem normalnih ćelija. Chen at al. (Lab Chip. 2011. 7. februar; 11 (3): 474-83) govori o razdvajanju i otkrivanju retkih ćelija na mikrofluidnom disku putem negativne selekcije. Peeters et al. (British Journal of Cancer. 2013. 2. april; 108 (6): 1358-67) govori o poluautomatizovanoj izolaciji i molekularnoj karakterizaciji pojedinačnih ili visoko prečišćenih tumorskih ćelija iz uzoraka krvi obogaćenih CellSearch-om korišćenjem dielektroforetskog sortiranja ćelija.
[0005] Ne postoje dostupne metode za uklanjanje belih krvnih zrnaca nakon obogaćivanja CTC-a. Potrebna je jedinstvena metoda jer se neće koristiti isti princip korišćen za obogaćivanje CTC-a. Na primer, ako metod za obogaćivanje u prvom koraku koristi imunomagnetnu metodu, mora se upotrebiti druga metoda pored imunomagnetne metode.
Kratak opis pronalaska
[0006] Pronalazak obezbeđuje metod uklanjanja belih krvnih zrnaca iz uzorka koji sadrži obogaćene retke ćelije i bela krvna zrnca, a koji se sastoji od: (a) tretiranja takvog uzorka obogaćenog imunomagnetnim metodama i koji se sastoji od obogaćenih retkih ćelija obeleženih imunomagnetnim markerom i belih krvnih zrnaca leukocitnim markerom konjugovanim sa haptenom pod uslovima koji obeležava takva bela krvna zrnca takvim leukocitnim markerom konjugovanim sa haptenom, pri čemu je leukocitni marker antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za CD45; i (b) tretiranja sastava iz koraka (a) sa drugim medijumom koji prijanja na tako obeležena bela krvna zrnca i razdvajanja drugog medijuma i obeleženih belih krvnih zrnaca na koja je prionuo iz sastava koraka (b), gde su obogaćene retke ćelije selektovane iz grupe koja se sastoji od CTC, CEC, CMMC i CMC-a; i pri čemu način uklanjanja belih krvnih zrnaca iz obogaćenog uzorka ne obuhvata imunomagnetne metode.
[0007] Dalje, pronalazak obezbeđuje upotrebu kompleta za uklanjanje belih krvnih zrnaca iz uzorka koji sadrži obogaćene retke ćelije i bela krvna zrnca, pri čemu takav komplet sadrži leukocitni marker koji je konjugovan sa haptenom i drugi marker, osim leukocitnog markera, gde je leukocitni marker antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za CD45 i gde drugi marker sadrži antitela na hapten.
[0008] Dodatno, pronalazak obezbeđuje upotrebu kompleta za uklanjanje belih krvnih zrnaca iz uzorka koji sadrži obogaćene retke ćelije i bela krvna zrnca, pri čemu takav komplet sadrži reagense za imunomagnetno obeležavanje retkih ćelija i belih krvnih zrnaca, leukocitni marker koji je konjugovan sa haptenom, gde je leukocitni marker antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za CD45 i drugi marker, osim markera leukocita, gde drugi marker sadrži antitela na takve haptene.
Detaljan opis slika nacrta
[0009]
Slika 1 Prikaz uklanjanja belih krvnih zrnaca zasnovan na haptenu
Slika 2 Analiza belih krvnih zrnaca pre i posle inkubacije sa anti-FITC
Slika 3 Procenat uklanjanja belih krvnih zrnaca
Slika 4 Molekularno merenje osiromašenih i neosiromašenih uzoraka
Slika 5 Otkrivanje nakon osiromašenja CD45
Slika 6 Korelacija između dodatih VCaP ćelija sa osiromašenjem belih krvnih zrnaca i kultivisanih VCaP ćelija
Slika 7 Efekat osiromašenja zrnaca
Detaljan opis
[0010] Kada se upotrebljava u ovom tekstu, izraz "markeri leukocita" se odnosi na supstance koje obeležavaju bela krvna zrnca a ne retke ćelije, a primeri markera leukocita uključuju, ali se ne ograničavaju na, antitela na CD 45, CD 19, CD15, glikoforin A, CD2, CD14, CD16, CE38 i CD66b. Poželjni marker leukocita je anti CD45. Hapteni uključuju, ali se ne ograničavaju, na fluoresceinsku boju (“FITC“), fikoeritrin (“PE“), alofikocijanin (“APC“) i biotin. Poželjni hapten je FITC. U daljem tekstu, termin antitela uključuje sva antitela, monoklonska i poliklonska, fragmente antitela koji se vezuju za određene haptene, bispecifična antitela koja se vezuju za određene haptene. Poželjna antitela su monoklonska antitela.
[0011] U daljem tekstu, "drugi medijum" označava bilo koju površinu koja sadrži drugi marker, osim markera leukocita. Takav drugi marker se vezuje za hapten koji je konjugovan za leukocitni marker. Primeri drugih markera uključuju, ali se ne ograničavaju na, antitela na FITC, PE, APC. Poželjni drugi markeri su antitela na FITC. Primeri površina koja se mogu koristiti su mikrotitarska ploča.
[0012] U daljem tekstu, "retke ćelije" su ćelije koje imaju malu frekvenciju u krvi. Primeri retkih ćelija uključuju, ali se ne ograničavaju na, cirkulišuće ćelije tumora (CTC), cirkulišuće endotelske ćelije (CEC), cirkulišuće ćelije multiplog mijeloma (CMMC) i cirkulišuće ćelije melanoma (CMC). Poželjne retke ćelije su CTC i CEC. Posebno poželjne retke ćelije su CTC. Obogaćene frakcije ovih retkih ćelija mogu se proizvesti iz cele krvi poznatim metodama. Takve metode uključuju, ali nisu ograničene na, metode i reagense otkrivene u sledećim patentima i patentnim prijavama: US patent br.7,901,950; 6,365,362, US Pat. objava br. US 2009/0136946; US 2013/0189675; US 2014/0011685. Poželjni metod za dobijanje obogaćenih CTC ćelija je korišćenjem imunomagnetnih metoda otkrivenim u referencama kao što su US patent br.6,365,362 i metodama linije proizvoda CELL SEARCH.
[0013] Princip osiromašenja belih krvnih zrnaca iz obogaćene frakcije CTC-a prikazan je na Slici 1. CTC i bela krvna zrnca su obeležena anti-EpCAM ferofluidom, a bela krvna zrnca su obeležena leukocitom konjugovanim sa haptenom kao što je prikazano na Slici 1.
[0014] Ovde je dalje opisan komplet za uklanjanje belih krvnih zrnaca iz uzorka koji sadrži obogaćene retke ćelije i bela krvna zrnca gde takav komplet sadrži leukocitni marker koji je konjugovan sa haptenom i drugi marker, osim markera leukocita, pri čemu je marker leukocita antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za CD45, i pri čemu drugi marker sadrži antitela na takve haptene.
[0015] Svi definisani termini imaju iste definicije i poželjne primere kao što je prethodno opisano.
[0016] U tekstu je dalje opisan komplet za uklanjanje belih krvnih zrnaca iz uzorka koji sadrži obogaćene retke ćelije i bela krvna zrnca pri čemu takav komplet sadrži reagense za imunomagnetno obeležavanje retkih ćelija i belih krvnih zrnaca, leukocitni marker koji je konjugovan sa haptenom, pri čemu je leukocitni marker antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za CD45 i drugi marker, osim markera leukocita, u kome drugi marker sadrži antitela na takve haptene.
[0017] Svi definisani termini imaju iste definicije i poželjne primere kao što je prethodno opisano.
Primeri
PRIMER 1 : Osiromašenje belih krvnih zrnaca pomoću oblaganja sa anti-CD45 na mikrotitarskim pločama
[0018] Ovaj primer pokazuje osiromašenje belih krvnih zrnaca korišćenjem anti-CD45. CD45 je uobičajeni leukocitni marker prisutan u belim krvnim zrncima i očekuje se da se sva bela krvna zrnca vežu za anti-CD45. Koristili smo anti-CD45 za vezivanje belih krvnih zrnaca i posebno za uklanjanje iz smeše belih krvnih zrnaca i CTC-a koristeći čvrstu fazu obloženu anti-CD45. Anti-CD45 je obložen na čvrstu fazu na sledeći način:
Anti-CD45 (Veridex) je razblažen na 50 ug/ml u 50 mM natrijum bikarbonatnom puferu pH 8,5.0,8 ml rastvora antitela na anti- CD45 je zatim dodato na mikrotitarsku ploču sa 6 bunarčića, inkubirano 3 sata na sobnoj temperaturi (RT) praćeno preko noći na 2-8 ° C. Posle inkubacije preko noći, aspirirano je anti-CD45 antitelo i bunarčići su blokirani sa 1 ml PBS/1% BSA na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Pufer je aspiriran i bunarčići su isprani sa 2 ml PBS-a 2 puta. Posle ispiranja, aspiriran je čitav pufer i ploča je sušena 1 sat. Ploča je čuvana suva u zatvorenoj plastičnoj kesi na 2-8 ° C do upotrebe.
[0019] U ovom primeru su rađena dva eksperimenta za ispitivanje principa razdvajanja belih krvnih zrnaca od ostalih krvnih zrnaca. U jednoj studiji, čista bela krvna zrnca su pripremljena iz pune krvi nakon liziranja crvenih krvnih zrnaca koristeći BD reagens za liziranje. Ovaj uzorak je korišćen kao pozitivna kontrola. U drugoj studiji, 7,5 ml krvi je obrađeno na CellTracks AutoPrep sistemu pomoću kompleta CellSearch CTC Profile. Komplet CTC Profile sadrži molekul protiv adhezije ćelija epitela (EpCAM) konjugovan sa ferofluidnim magnetnim česticama za hvatanje cirkulišućih tumorskih ćelija. Posle obogaćenja ciljnih ćelija, uzorci su resuspendovani u 900ul PBS /1%BSA pufera.Obogaćeni uzorci će sadržati ciljne ćelije, a takođe i bela krvna zrnca. Pre dodavanja uzoraka u bunarčiće na mikrotitarskoj ploči, ploča je dovedena na sobnu temperaturu (najmanje 30 minuta), bunarčići su isprani dva puta sa 2 ml PBS/5% BSA. Pufer iz posude je zatim aspiriran pre dodavanja uzorka. Uzorak CTC testa od 900ul i čista bela krvna zrnca iz pune krvi dodati su u dva odvojena bunarčića ploče. Posle 1 sata inkubacije uz blago mešanje svakih 15 minuta uklanja se 300 ul supernatanta da bi se odredio broj belih krvnih zrnaca. Broj belih krvnih zrnaca prisutnih u uzorku određuje se protočnim citometrom FACSCalibur (Beckton Dickinson), pri čemu se kao prag uzima unapred određeno rasejanje. Ako se bela krvna zrnca vežu za anti-CD45 u bunarčićima, onda broj belih krvnih zrnaca u supernatantu treba smanjiti u poređenju sa uzorkom pre koraka inkubacije. Nevezane ćelije treba da budu u supernatantu. Rezultati su prikazani u tabeli 1a.
Tabela 1a: Broj belih krvnih zrnaca pre i posle inkubacije sa anti- CD45 obloženim na mikrotitarskoj ploči
[0020] Prethodni rezultati pokazuju da se čista bela krvna zrnca mogu ukloniti dodavanjem na mikrotitarsku ploču obloženu anti-CD45-om. Međutim, u supernatantu uzorka CTC testa pronađena su bela krvna zrnca. Ovo sugeriše da se bela krvna zrnca iz uzorka CTC testa nisu vezala za anti-CD45 u obloženim bunarčićima. Razlika između dva uzorka je da su bela krvna zrnca u uzorku CTC testa obeležena ferofluidnim magnetnim česticama. Moguće je da ferofluidne magnetne čestice prisutne na belim krvnim zrncima sprečavaju vezivanje za anti-CD45 na ploči zbog sterne smetnje. Da bi se prevazišao ovaj problem, uzorci iz CTC testa prvo su obeleženi anti-CD45 konjugovanim sa haptenom pomoću vezujuće grupe (eng.linker) (videti primere). Uzorci koji sadrže bela krvna zrnca prethodno obeleženi anti- CD45-tagom su zatim dodati na mikrotitarsku ploču obloženu anti-haptenom.
PRIMER 2: Oblaganje anti-fluorescein izotiocijanata (FITC) na mikrotitarsku ploču
[0021] Anti-FITC je kupljen od BD Biosciences i razblažen do 50 ug/ml u 50 mM natrijum bikarbonata, pH 8,5. 800ul anti-FITC je dodato na mikrotitarske ploče sa 6 bunarćića, inkubirano na sobnoj temperaturi 3 sata, a zatim tokom noći na 2-8 ° C. Posle inkubacije tokom noći, ploča je dovedena na ST. Supernatant je aspiriran, a zatim je ploča isprana dva puta PBS-om. Bunarčići su zatim blokirani sa 1 ml PBS/1% BSA tokom 4 sata na sobnoj temperaturi. Pufer je aspiriran i bunarčići su isprani sa 2 ml PBS-a 2 puta. Posle ispiranja, čitav pufer je aspiriran i ploča je osušena tokom 1 sata. Ploča je čuvana suva u zatvorenoj plastičnoj vrećici na 2-8 ° C do upotrebe. Ploča je dovedena na ST (najmanje 30 minuta) na dan upotrebe. 2 ml PBS/1% BSA je dodato u bunarčiće i inkubirano 15 minuta. Nakon aspiracije ploča je još jednom isprana sa 2 ml PBS/1% BSA. Pufer je aspiriran pre dodavanja uzorka u bunarčić.
PRIMER 3: Uklanjanje belih krvnih zrnaca iz uzorka CTC testa gde su bela krvna zrnca obeležena anti-CD45 konjugovanim sa FITC i mikrotitarske ploče obložene anti-FITC-om
[0022] 7,5 ml EDTA krvi u koje su dodate SKBR3 ćelije obrađeno je na AutoPrep-u pomoću CellSeach CTC kompleta. Ovako obogaćeni uzorak iz CTC testa obojen je anti-CD45-FITC u finalnoj koncentraciji od 2 ug/ml. Višak CD45-FITC je uklonjen pranjem uzorka 2 puta sa 2 ml PBS/1% BSA magnetnim odvajanjem tokom 15 minuta. Konačni uzorak je resuspendovan u 900ul PBS/5% BSA i zatim nanet na bunarčiće obložene anti-FITC-om. Uzorci su inkubirani 1 sat uz blago mešanje svakih 15 minuta. Posle jednog sata je bilo 300ul supernatanta izvađenog iz bunarčića i protočnim citometrom određen je broj belih krvnih zrnaca i SKBR3 ćelija. Kako bi se otkrile SKBR3 ćelije protočnom citometrijom, ćelije su obeležene anti-Her2/neu konjugovanim sa alofikocijanin bojom (APC). Bela krvna zrnca su otkrivena u FITC kanalu pošto su obeležena anti-CD45-FITC-om. Ćelije otkrivene pre i posle osiromašenja su prikazane na slici 2.
[0023] Slika 2 prikazuje broj tumorskih ćelija i ćelija belih krvnih zrnaca pre i posle osiromašenja ćelija belih krvnih zrnaca. Broj ćelija belih krvnih zrnaca pre i posle osiromašenja je 3594, odnosno 354, što približno ukazuje na to 90% belih krvnih zrnaca je osiromašeno iz uzorka. S druge strane, broj ćelija tumora pre i posle osiromašenja je 2094, odnosno 1924, što ukazuje da su sve ćelije tumora (> 90%) prisutne u supernatantu. Ovaj primer pokazuje da se ćelije belih krvnih zrnaca prisutne u uzorku CTC testa nakon obogaćivanja tumorskih ćelija mogu ukloniti pomoću pronalaska.
[0024] Ovo je testirano na 6 uzoraka, a rezultati su prikazani na slici 3. Rezultati pokazuju da više od 90% belih krvnih zrnaca se može ukloniti uz minimalan gubitak (<15%) tumorskih ćelija (SKBR3).
PRIMER 4: Osiromašenje belih krvnih zrnaca u testu cirkulišućih endotelnih ćelija (CEC)
[0025] Ovaj primer pokazuje da se princip osiromašenja belih krvnih zrnaca može primeniti na druge testove retkih ćelija. CellSearch CEC test obogaćuje CEC iz krvi pomoću CellSearch CEC kompleta. Komplet sadrži anti-CD146 konjugovan sa ferofluidnim magnetnim česticama za hvatanje CEC-a. U analizi se koristi sistem CellTracks AutoPrep za pripremu uzorka slično CTC testu. Iako su CECs prisutni sa niskom učestalošću u normalnim zdravim uzorcima krvi, oni su povišeni različitim uslovima kao što su rak, kardiovaskularni problemi i infekcije.
[0026] Test je korišćen za testiranje efekta principa osiromašenja na CEC prisutnih sa niskom učestalošću (1-20 ćelija po testu) pored efikasnosti osiromašenja WBC.
[0027] 4 ml EDTA krvi obrađeno je na sistemu CellTracks AutoPrep korišćenjem CellSearch CEC testa. Obogaćene ćelije su obojene bojom za nukleinske kiseline (DAPI) i anti-CD105 konjugovanim sa fikoeritrinskom bojom (PE) da bi se identifikovale sve ćelije, odnosno CIK. U ovom primeru, anti-CD45-FITC je korišćen za obeležavanje belih krvnih zrnaca. Posle koraka bojenja, uzorak je ponovo suspendovan u 320 ul pufera i prebačen u CellSearch kertridž za analizu na CellTracks II. CellTracks Analizator II je fluorescentni mikroskop u 4 boje koji skenira u 4 različita boje, analizira slike i predstavlja slike koje su pozitivne u DAPI i CD105-PE. Pozitivne ćelije za DAPI i CD105, a negativni za CD45 računaju se kao CEC. Ukupan broj belih krvnih zrnaca prisutnih u uzorku je prebrojan na osnovu pozitivnosti na DAPI.
[0028] Za korak osiromašenja, nakon obogaćivanja i bojenja, uzorci su resuspendovani u 900ul PBS-a/1% BSA. Uzorci su zatim dodati na mikrotitarsku ploču obloženu anti-FITC kako je opisano u primeru 4. Posle jednog sata, uzorak je aspiriran i koncentrovan na 320 ul upotrebom magnetnog separatora. Tada je uzorak (320ul) prebačen u kertridž za analizu na CellTracks Analizatoru II. Broj CEC i belih krvnih zrnaca je utvrđen je kao što je prethodno napisano. Broj CEC-a i belih krvnih zrnaca upoređivan je pre i posle osiromašenja belih krvnh zrnaca VBC-a. Rezultati iz ove studije prikazani su u Tabeli 4a.
Tabela 4a: Broj CEC i belih krvnih zrnaca pre i nakon osiromašenja belih krvnih zrnaca
[0029] Rezultati jasno ukazuju da se bela krvna zrnca takođe mogu ukloniti (> 75%) iz CEC-a nakon obogaćivanja u CEC testu. Pored toga, nije bilo razlike u broju CEC-a (8,6 nasuprot 8) pre i posle osiromašenja. Podaci ukazuju da se ciljne ćelije ne uklanjaju čak i kada su prisutne na vrlo niskoj frekvenciji (<20 ćelija).
PRIMER 5: Molekularna merenja osiromašenja belih krvnih zrnaca u obogaćenih u kompletu CellSearch Profile
[0030] Duplikat 7,5 ml EDTA krvi od 6 zdravih davalaca obrađen je na AutoPrep-u korišćenjem modifikovanog kompleta CTC profila Cell-Seach. PBS/biotinski reagens u kompletu za profil je dopunjen anti-CD45-FITC u konačnoj koncentraciji reagensa od 2 ug/ml, tako da se obeležavanje belih krvnih zrnaca odvija na AutoPrep-u. Nakon obogaćivanja AutoPrep-om, po jedna epruveta od svakog davaoca podvrgnuta je ili protokolu „osiromašenog“ kojim se uklanjaju bela krvna zrnca iz uzorka ili protokolu „ne-osiromašenog“ koji služi kao kontrola za merenje zagađenosti belih krvnih zrnaca u uzorku bez postupka osiromašenja.
Protokol bez osiromašenja
[0031] Uzorci se uklanjaju iz AutoPrepa-a i stavljaju u magnet na 15 minuta. Pufer se aspirira i ćelije se liziraju u RLT puferu ((Qiagen).
Protokol sa osiromašenjem
[0032] Nakon AutoPre obogaćivanja, višak CD45-FITC uklonjen je ispiranjem uzorka 2 puta sa 2 ml PBS/1% BSA sa magnetnim razdvajanjem u trajanju od 15 minuta. Konačni uzorak je resuspendovan u 900ul PBS/ 5%/BSA i zatim je nanet na bunarčiće obložene anti-FITC-om. Uzorci su inkubirani 1 sat uz blago mešanje svakih 15 minuta. Posle jednog sata, iz bunarčića je uklonjeno 300 ul supernatanta i ćelije su stavljene u magnet na 15 minuta. Pufer se uklanja i ćelije su lizirane u RLT puferu (Qiagen).
[0033] I za osiromašeni i za neosiromašeni uzorak, RNK je prečišćena pomoću Qiagen AllPrep kompleta i reverzno transkribovana pomoću kompleta za reverznu traskripciju DNK velikog kapaciteta (eng.High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Life Technologies)). Prateći DNK je pojačan upotrebom TakMan® PreAmp Master Mik kompleta (Life Technologies) i setova prajmera kao za gene iz spiska u tabeli 5a. Kvantitativni PCR je izveden na amplifikovanim uzorcima za dva gena za koja je poznato da su eksprimuju u belim krvnim zrncima (CD45 (zvani PTPRC) i BST1), kao i ispoljenog gena “čuvarkuće” (B-Actin). Efikasnost osiromašenja belih krvnih zrnaca je izmerena gubitkom belih krvnih zrnaca i održavanjem specifičnih genetskih signala u osiromašenom uzorku u odnosu na neosiromašeni uzorak.
[0034] Na Slici 4 krugovi i kvadrati predstavljaju pojedinačna merenja na osiromašenim i neosiromašenim uzorcima, redom. Linije predstavljaju srednje vrednosti merenja za svaku vrstu uzorka. Vrednost P predstavlja rezultate studentovog T-testa izvedenih između osiromašenih i neosiromašenih uzoraka za svaki izmereni gen. T-testovi između osiromašenih i neosiromašenih uzoraka su pokazali značajan gubitak gena specifičnih za bela krvna zrnca i gena “čuvarkuće” kao rezultat osiromašenja CD45. Srednja delta Ct merenja> 2 ciklusa ukazuju na> 75% smanjenje signala belih krvnih zrnaca u CD45 osiromašenim uzorcima.
Tabela 5a....Geni testirani metodom osiromašenja CD45 :
PRIMER 6: Unapređenje otkrivanja CTC-a nakon osiromašenja belih krvih zrnaca
[0035] Jedna potencijalna prednost metode osiromašenja CD45 je poboljšana sposobnost otkrivanja CTC ili karakterizacije ekspresije CTC gena kada postoji nivo pozadinske ekspresije gena kome doprinose bele krvna zrnca. Osiromašenje belih krvnih zrnaca trebalo bi da smanji ekspresiju pozadinskog gena i poboljša sposobnost otkrivanja transkripta u manjem broju CTC-a.
[0036] Da bi se demonstrirao ovaj princip, pripremljena su četiri uzorka za svakog od šest davalaca. U dva uzorka je dodato 10 VCaP ćelija, a u dva uzorka nije. Pripremljen je po jedan uzorak sa dodatim ćelijama i bez dodatih ćelija za „Osiromašeni“ i „Neosiromašeni“ protokol kako je opisano u Primeru 5. Ekstrakcija RNK, reverzna transkripcija i pre-amplifikacioni set su izvedeni kao u primeru 5. Javne baze podataka su istraživane da bi se identifikovao panel potencijalnih CTC markera koji bi mogli biti korisni za merenje upotrebljivosti metode osiromašenja belih krvnih zrnaca. Odabrani su geni koji su imali umerenu do visoke ekspresiju u VCaP ćelijama i opseg ekspresije u belim krvnim zrncima. Rezultati RT-PCR za potencijalne CTC markere S100A13 i AKR1C3. Bez osiromašenja belih krvnih zrnaca (neosiromašeni uzorci) oba gena ne pokazuju značajnu razliku u ekspresiji između kompleta uzoraka sa dodatim i kompleta uzoraka u koji nisu dodate ćelije. U osiromašenom setu pozadina kojoj doprinose bela krvna zrnca je smanjena i postoji značajna razlika između kompleta uzoraka u koji nisu dodate ćelije i kompleta uzoraka u koji je dodato 10 ćelija.
PRIMER 7: Primena osiromašenja belih krvnih zrnaca za molekularnu karakterizaciju CTC-a nakon osiromašenja belih krvnih zrnaca
[0037] Glavna prednost metode osiromašenja CD45 je omogućavanje poboljšane molekularne karakterizacije CTC i minimiziranje ekspresije pozadinskog gena čemu doprinose bela krvna zrnca
[0038] Da bi se demonstrirala ova primena, pripremljeno je osam uzoraka od osam davalaca i po dva uzorka u koje je dodato 100, 50, 25 i 10 VCaP ćelija. Pored toga, četiri uzorka koja sadrže samo VCap ćelije, na primer 100, 50, 25 i 10 ćelija su korišćene kao pozitivne kontrole. Ekstrakcija RNK, reverzna transkripcija i set za pre-amplifikaciju su izvedeni kao u primeru 6. Gen za androgeni receptor (AR), dve spojene varijante AR (ARV1 i ARV3/7), TMPRSS2 i TMPRSS2: ERG spojene varijante su odabrane kao geni za testiranje za VCaP ćelije. Postojala je dobra korelacija u otkrivanju ovih ekspresija gena kandidata u ćelijama VCap između ćelija čiste kulture VCaP i krvi u koje su dodate VCap ćelije nakon osiromašenja belih krvnih zrnaca sa koeficijentom korelacije (r2)> 0,9. Rezultati su prikazani na slici 6.
PRIMER 8: Osiromašenje belih krvnih zrnaca korišćenjem filtracije zasnovane na zrncima
[0039] Ovaj primer opisuje alternativni metod za osiromašenje kontaminirajućih belih krvnih zrnaca prisutnih u uzorcima koji su obogaćeni CellSearch Profile Kit-om. Nakon imunomagentnog obogaćenja zasnovanog na EpCAM-u, kontaminirajući CD45 bela krvna zrnca su obeleženi plastičnim zrncima. Bela krvna zrnca se odvajaju od CTC propuštanjem tečnosti kroz filter koji zadržava CD45 ćelije vezane za zrnca i prolazi nevezani CTC. CTC su tada dostupni za molekularnu ili ćelijsku analizu sa osiromašenjem zagađujućih belih krvnih zrnaca.
[0040] Da bi se demonstrirao postupak, 10.000 VCAP ćelija je dodato u šest epruveta sa zdravom krvlju davaoca i obogaćeno koristeći komplet Cell Search Profile. Tri uzorka su odmah lizirana u Qiagen RLT puferu (neosiromašeni uzorci), a preostala tri uzorka su osiromašena dole opisanom metodom na bazi zrna. Obogaćena frakcija koji sadrži CTC i kontaminira bela krvna zrnca pomešane su sa plastičnim zrncima od 30 mikrona koje su obložene antitelom specifičnim za molekul CD45 (pluriBead, pluriSelect). Smeša zrna/ćelija se mućka pri 8-10 obrtaja u minuti jedan sat na sobnoj temperaturi. Uzorak je filtriran kroz filter veličine 27 mikrona pora (pluriStrainer, pluriSelect). Filter je ispran dva puta i ćelije prikupljene pri proticanju analizirane su pomoću RT-PCR na specifični marker PTPRC (aka CD45) za bela krvna zrnca i specifični marker tumorskih ćelija androgenog receptora (AR). Vrednosti Delta Ct su dobijene oduzimanjem nivoa ekspresije (vrednost 40-Ct) osiromašenog uzorka od nivoa ekspresije neosiromašenog uzorka. Delta Ct od 3,1 ciklusa za marker belih krvnih zrnaca PTPRC ukazuje da je nivo belih krvnih zrnaca značajno smanjen protokolom osiromašenja sa zrncima u odnosu na neosiromašeni uzorak. Delta CT od samo 0,4 ciklusa za AR marker specifičan za tumorske ćelije ukazuje
1
na to da protokol osiromašenja sa zrncima nema velikog uticaja na nivo specifičnih tumorskih markera. Rezultati su prikazani na slici 7, koja pokazuje RT-PCR rezultate za bela krvna zrnca i markeri tumorskih ćelija prisutni u uzorcima koji su i nisu bili podvrgnuti postupku osiromašenja zrna. AR = Androgeni receptor; PTPRC = Proteinska tirozin fosfataza, tip receptora, C.

Claims (10)

Patenti zahtevi
1. Postupak uklanjanja belih krvnih zrnaca iz uzorka koji sadrži obogaćene retke ćelije i bela krvna zrnca, postupak obuhvata
(a) tretiranje takvog uzorka obogaćenog imunomagnetnim metodama i koji sadrži obogaćene retke ćelije obeležene imunomagnetnim markerom i bela krvna zrnca leukocitnim markerom koji je konjugovan sa haptenom pod uslovima koji obeležavaju takva bela krvna zrnca takvim leukocitnim markerom konjugovanim sa haptenom, pri čemu je marker leukocita antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za CD45; i
b) tretiranje kompozicije iz koraka (a) drugim medijumom koji prijanja za tako obeležena bela krvna zrnca, i odvajanje drugog medija i njegovih obeleženih belih krvnih zrnaca za koje je prionuo iz kompozicije koraka (a) pri čemu su obogaćene retke ćelije odabrane iz grupe koja se sastoji od CTC, CEC, CMMC i CMC; I pri čemu postupak uklanjanja belih krvnih zrnaca iz obogaćenog uzorka ne obuhvata imunomagnetne metode.
2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu su obogaćene retke ćelije odabrane iz grupe koju čine CTC i CEC.
3. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu su obogaćene retke ćelije CTC.
4. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu su obogaćene retke ćelije CEC.
5. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je leukocitni marker fragment antitela koji vezuje CD45.
6. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je hapten izabran iz grupe koju čine fluoresceinska boja ("FITC"), fikoeritrin ("PE"), alofikocijanin ("APC") i biotin.
7. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je hapten FITC.
8. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu su obogaćene retke ćelije CTC, a hapten biotin.
9. Upotreba kompleta u postupku prema zahtevu 1, pri čemu takav komplet sadrži leukocitni marker koji je konjugovan sa haptenom i drugi marker, koji je drugačiji od markera leukocita, pri čemu je marker leukocita antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za CD45, a pri čemu drugi marker sadrži antitela na hapten.
10. Upotreba kompleta u postupku prema zahtevu 1, pri čemu takav komplet sadrži reagense za imunomagnetno obeležavanje retkih ćelija i belih krvnih zrnaca, leukocitni marker koji je konjugovan sa haptenom, pri čemu je leukocitni marker antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za CD45, i drugi marker, koji je drugačiji od markera leukocita u kome drugi marker sadrži antitela na takve haptene.
RS20201358A 2013-03-15 2014-03-14 Obogaćivanje cirkulišućih ćelija tumora osiromašenjem belih krvnih zrnaca RS61052B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361787611P 2013-03-15 2013-03-15
PCT/US2014/027701 WO2014152758A1 (en) 2013-03-15 2014-03-14 Enrichment of circulating tumor cells by depleting white blood cells
EP14721102.3A EP2972359B1 (en) 2013-03-15 2014-03-14 Enrichment of circulating tumor cells by depleting white blood cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61052B1 true RS61052B1 (sr) 2020-12-31

Family

ID=50631046

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201358A RS61052B1 (sr) 2013-03-15 2014-03-14 Obogaćivanje cirkulišućih ćelija tumora osiromašenjem belih krvnih zrnaca

Country Status (21)

Country Link
US (2) US9823238B2 (sr)
EP (1) EP2972359B1 (sr)
JP (1) JP6563379B2 (sr)
CN (1) CN105026934A (sr)
AU (1) AU2014239168A1 (sr)
BR (1) BR112015022962A2 (sr)
CA (1) CA2906900A1 (sr)
CY (1) CY1123698T1 (sr)
DK (1) DK2972359T3 (sr)
ES (1) ES2846224T3 (sr)
HK (2) HK1216442A1 (sr)
HR (1) HRP20201907T1 (sr)
HU (1) HUE052519T2 (sr)
LT (1) LT2972359T (sr)
MX (1) MX365713B (sr)
PL (1) PL2972359T3 (sr)
PT (1) PT2972359T (sr)
RS (1) RS61052B1 (sr)
SI (1) SI2972359T1 (sr)
SM (1) SMT202000652T1 (sr)
WO (1) WO2014152758A1 (sr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108061804B (zh) * 2016-11-09 2020-05-12 北京大学人民医院 用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物
CN109991410B (zh) * 2017-12-29 2022-07-05 上海白泽医学检验所有限公司 一种含抗cd45单抗的组合物及其使用方法
JP7494460B2 (ja) * 2018-11-02 2024-06-04 東ソー株式会社 細胞に結合可能な担体の製造方法
CN109439732B (zh) * 2018-12-25 2024-04-12 迈迪速能医学技术（天津）有限公司 一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒
US11890616B2 (en) 2019-03-26 2024-02-06 The Curators Of The University Of Missouri Microfluidic device for capture of micrometer scale objects and methods of using the device
KR102346111B1 (ko) * 2020-02-07 2022-01-03 주식회사 싸이토딕스 Ctc 분리용 마그네틱 비드 및 이를 이용한 ctc 분리방법
US20230311128A1 (en) * 2020-09-02 2023-10-05 Menarini Silicon Biosystems S.P.A. System, kit, method and process for handling a sample

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05501612A (ja) * 1989-11-13 1993-03-25 チルドレンズ・メデイカル・センター・コーポレーシヨン 胎児ｄｎａ単離および検出のための非侵入性方法
BR9907852A (pt) 1998-02-12 2000-10-24 Immunivest Corp Processos para detectar e enumerar células raras e cancerosas em uma população celular mista, para diagnosticar câncer de estágio precoce em um paciente de teste, para determinar a probabilidade de recorrência de câncer em um paciente humano anteriormente tratado de câncer, para distinguir um carcinoma confinado ao órgão de um carcinoma com propriedades metastáticas, para acompanhar a situação de remissão em um paciente humano com câncer que passa pelo tratamento de terapia contra o câncer e para aumentar quantidades de células epiteliais circulantes em uma amostra de sangue, partìcula magnética revestida, composição, conjuntos de teste para avaliar uma amostra de paciente quanto a presença de células raras circulantes, quanto a presença de células de tumor circulantes, quanto a presença de células de câncer de mama circulantes, quanto a presença de células de câncer de próstata circulantes, quanto a presença de células de câncer de cólon circulantes, quanto a presença de células de câncer de bexiga circulantes e para monitorar um paciente quanto a recorrência de câncer, e, fração de sangue periférico enriquecido quanto a células neoplásticas circulantes
US6342344B1 (en) * 1998-07-31 2002-01-29 Stemcell Technologies Inc. Antibody composition for isolating human cells from human-murine chimeric hematopoietic cell suspensions
US7364921B1 (en) * 1999-01-06 2008-04-29 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Method and apparatus for separating biological materials and other substances
CA2381732A1 (en) * 1999-08-21 2001-03-01 John S. Fox High sensitivity biomolecule detection with magnetic particles
CN1871517A (zh) 2002-02-19 2006-11-29 免疫公司 快速有效分离循环癌细胞的方法和试剂
CA2504279A1 (en) * 2005-04-15 2006-10-15 University Of Saskatchewan Materials and method of modulating the immune response using t helper-antigen presenting cells
US7901950B2 (en) 2005-08-12 2011-03-08 Veridex, Llc Method for assessing disease states by profile analysis of isolated circulating endothelial cells
EP2201134B1 (en) * 2007-09-19 2018-11-21 The Research Foundation of State University of New York Gene expression signatures in enriched tumor cell samples
EP2225563B1 (en) 2007-11-27 2015-01-21 Janssen Diagnostics, LLC Automated enumeration and characterization of circulating melanoma cells in blood
US20090191535A1 (en) * 2007-12-22 2009-07-30 Mark Carle Connelly Method of assessing metastatic carcinomas from circulating endothelial cells and disseminated tumor cells
CN101469310B (zh) * 2007-12-28 2014-03-19 北京百奥科生物技术有限公司 从生物学样品富集靶细胞的方法及除去白细胞的方法
US8569077B2 (en) * 2008-05-19 2013-10-29 Veridex, Llc Imaging of immunomagnetically enriched rare cells
US9034658B2 (en) * 2009-11-23 2015-05-19 The General Hospital Corporation Microfluidic devices for the capture of biological sample components
WO2012011113A2 (en) * 2010-07-22 2012-01-26 Shai Yarkoni Regulatory immune cells with enhanced targeted cell death effect
WO2013013222A1 (en) 2011-07-21 2013-01-24 Veridex, Llc Assay to capture and detect circulating multiple myeloma cells from blood
JP6346602B2 (ja) * 2012-03-21 2018-06-20 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート， インコーポレイテッド ヒトリンパ器官由来の抑制性ストローマ細胞の単離および使用
US20140011685A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Yixin Wang Genomic diagnostics using circulating endothelial cells

Also Published As

Publication number Publication date
HUE052519T2 (hu) 2021-05-28
DK2972359T3 (da) 2020-11-09
BR112015022962A2 (pt) 2017-07-18
PL2972359T3 (pl) 2021-03-08
CY1123698T1 (el) 2022-03-24
HK1219776A1 (zh) 2017-04-13
US20180045712A1 (en) 2018-02-15
MX365713B (es) 2019-06-11
EP2972359B1 (en) 2020-09-23
SI2972359T1 (sl) 2021-01-29
SMT202000652T1 (it) 2021-01-05
MX2015012341A (es) 2016-06-06
ES2846224T3 (es) 2021-07-28
HK1216442A1 (zh) 2016-11-11
AU2014239168A1 (en) 2015-10-29
LT2972359T (lt) 2020-12-10
WO2014152758A1 (en) 2014-09-25
US9823238B2 (en) 2017-11-21
JP6563379B2 (ja) 2019-08-21
HRP20201907T1 (hr) 2021-01-22
JP2016519286A (ja) 2016-06-30
CA2906900A1 (en) 2014-09-25
PT2972359T (pt) 2020-10-29
EP2972359A1 (en) 2016-01-20
US20140335542A1 (en) 2014-11-13
CN105026934A (zh) 2015-11-04
US10365266B2 (en) 2019-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS61052B1 (sr) Obogaćivanje cirkulišućih ćelija tumora osiromašenjem belih krvnih zrnaca
US20090081689A1 (en) Reagents and methods to enrich rare cells from body fluids
US20150132738A1 (en) Method For Identification Of Non-Hematogeneous Karocytes Enriched From Body Fluid Of Humans Or Animals
CN103869060A (zh) 基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒
WO2015101163A1 (zh) 抗hla-g的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用
US8263404B2 (en) Method for enriching rare cell subpopulations from blood
JP7778749B2 (ja) 胎児細胞を単離、検出及び解析する組成物及び方法
CN107475202A (zh) 一种肺癌循环肿瘤细胞捕获与活性检测、分析方法及其应用
CN106996976B (zh) 基于微流控技术的ctc蛋白质分型试剂盒
CA3148731A1 (en) Multimodal analysis of stabilized cell-containing bodily fluid samples
JP2018105645A (ja) 希少細胞の検出方法
RU2834057C2 (ru) Композиции и способы для выделения, обнаружения и анализа клеток плода
US20020019004A1 (en) Method for isolating molecules, cells and other particles which are specifically bound to a large particle
US10060914B2 (en) Methods for separating cells
CN115197914A (zh) 一种分离和检测循环肿瘤细胞的方法
JPWO2016027842A1 (ja) 幹細胞の分化状態の判定方法及びこれに用いられる新規な分化マーカー
CN121712886A (zh) 循环肿瘤细胞的富集方法、分析方法和试剂盒
EP3639032A1 (en) Detection of leukocyte-derived microvesicles by fluo-sensitive flow cytometry