RS61056B1

RS61056B1 - Ćelijska kultura

Info

Publication number: RS61056B1
Application number: RS20201266A
Authority: RS
Inventors: Fiona Oakley; Lee Borthwick; Clive Griffiths; Michael Drinnan
Original assignee: Fibrofind Ip Ltd
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2020-12-31
Also published as: PL3365107T3; SI3766582T1; ES2917874T3; US12049611B2; EP3365107B1; HUE054259T2; EP3766582A1; LT3365107T; EP3766582B1; CY1125242T1; US20190002809A1; US20250115839A1; RS63284B1; DK3766582T3; ES2827526T3; SMT202000613T1; HRP20201713T1; EP3365107B8; PL3766582T3; LT3766582T

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Aspekti predmetnog pronalaska odnose se na aparat za upotrebu u tehnikama kulture ćelija i tkiva. Posebno, mada ne i isključivo, primeri izvođenja predmetnog pronalaska odnose se na aparat koji doprinosi obezbeđivanju dinamične sredine za ćelijsku kulturu. U ovom tekstu objavljeni su i metodi kultivacije ćelija i/ili tkiva, zajedno sa in vitro metodima testiranja efikasnosti lekova, kao i drugi predmetni sadržaji.

Osnov pronalaska

[0002] Kultura ćelija i tkiva ima prilično važnu ulogu u osnovnim i primenjenim istraživanjima nauka o životu. Ploča sa većim brojem bunarčića je standardni uređaj koji se koristi za kultivaciju ćelija i tkiva ili za izvođenje hemijskih testova ili testova sa ćelijama. Postoje različiti formati ploča sa većim brojem bunarčića. Za opštu primenu u kultivaciji ćelija i tkivnom inženjeringu, najčešće se koriste formati sa 6, 12, 24, 48 i 96 bunarčića, mada su u upotrebi i ploče sa većom gustinom bunarčića, npr., sa 384, 1536, ili više bunarčića. Ploče sa većim brojem bunarčića koriste se u mnogim formatima bioloških testova jer su dosta pogodne za istovremeni skrining većeg broja uzoraka. Automatizovana laboratorijska oprema, na primer čitači ploča, aparat za visokopropusni skrining i slično, razvijena je specifično za korišćenje sa formatom sa više bunarčića. Kao rezultat toga, ploča sa većim brojem bunarčića postala je standardni format bioloških testove.

[0003] Nedostatak prilikom korišćenja konvencionalnih ploča sa većim brojem bunarčića je taj što se ne uspostavlja složeno fiziološko okruženje. Na primer, in vivo postoji stalna perfuzija tkiva i organa tela krvnim i limfnim sistemom. Ta perfuzija omogućava stalno uklanjanje otpadnih proizvoda ćelija i snabdevanje novim nutrijentima. Tipične statične ćelijske kulture nisu verne predstave ovakvog sistema čak ni kada se medijum redovno uklanja i zamenjuje. Pored toga, danas poznate ploče sa više bunarčića ćelijama koje su smeštene u njih ne obezbeđuju ni jedan vid dinamičnog hemijskog ili fizičkog stimulusa kao što su koncentracioni gradijenti, protok, pritisak ili mehanički stres. Kao rezultat toga, in vitro testiranje uz korišćenje konvencionalnih ploča sa većim brojem bunarčića često ne reprezentuje in vivo okruženje.

[0004] Zbog toga postoji rastuća zainteresovanost za razvijanje dinamičnijih kultivacionih sistema koji će omogućiti da se okruženje ćelija ili tkiva u kulturi menja tokom eksperimenta.

[0005] U cilju što vernijeg predstavljanja in vivo okruženja, dizajnirani su brojni bioreaktori. Ovi "dinamični" bioreaktori namenjeni su obezbeđivanju vernijih modela oboljenja kod ljudi, koji bi, na primer, služili za testiranje efikasnosti i toksičnosti kandidatskih molekula lekova.

[0006] Primer bioreaktorskog sistema koji počiva na mehanizmu pumpanja obezbedila je kompanija Kirkstall Limited, Ujedinjeno Kraljevstvo. U ovom sistemu koristi se veliki broj "modularnih" komora za ćelijsku kulturu, elektronsko upravljačko kolo i peristaltička pumpa koja vrši pumpanje tečnosti, npr. medijuma za ćelijsku kulturu, kroz komoru.

[0007] Oblast razvoja lekova primer je oblasti za koju razvoj dinamičnih in vitro sistema može biti koristan. Projekti razvoja lekova često se završavaju posle skupih kliničkih studija na ljudima, kada postanu evidentni neprihvatljivi sporedni efekti, toksičnost ili nedostatak terapijske efikasnosti. Poželjno je da se razviju in vitro sistemi koji bi omogućili da se pre otpočinjanja in vivo kliničkih ispitivanja precizno predvide bezbednost i efikasnost lekova kod ljudi.

[0008] Terapijska oblast od interesa je razvijanje antifibroznih jedinjenja za lečenje fibroznih poremećaja. Trenutni istraživački alati koji se smatraju za zlatne standarde u istraživačkim alatima za razumevanje fibroznog oboljenja i testiranje antifibroznih kandidatskih molekula ograničeni su na 2D ćelijske kulture koje formiraju ožiljak i in vivo molekule fibroze kod glodara. Ovi pristupi nose sa sobom brojne slabosti. Prvo, fibroza je kompleksan poremećaj koji uključuje veći broj tipova ćelija, od kojih mnoge izostaju u 2D kultivacionim sistemima. Pored toga, preklinički modeli na glodarima ne prikazuju verno oboljenja ljudi jer ne poseduju neke važne odlike humane kliničke patologije.

[0009] Idealno, u in vitro kultivacionim sistemima upotrebljavali bi se preseci ljudskog organa npr. preseci jetre. Međutim, tehnike koje uključuju upotrebu preseka organa trenutno su ograničene zbog ograničenog životnog veka u kulturi. Životni vek može se produžiti upotrebom postojećih dinamičnih sistema ćelijske kulture u kojima se za stvaranje protoka tečnosti u sistemu koriste složeni mehanizmi pumpanja. Međutim, postojeći sistemi imaju ograničenja zbog svoje visoke cene i vremena potrebnog da se sistem postavi i pokrene. Pored toga, ograničen je broj preseka organa koji se mogu kultivisati istovremeno.

[0010] US 5 422 270A odnosi se na jednostepeni test na tacni za oslobađanje solubilnih medijatora.

[0011] US 2003/017582 A1 odnosi se na uređaj i metod za praćenje migracije leukocita.

[0012] WO 03/078565 A1 odnosi se na uređaj za ispitivanje pokretljivosti ćelija i hemotaksu.

[0013] WO 2011/161480 A1 odnosi se na testnu ploču sa više bunarčića.

[0014] WO 2006/097749 A1 odnosi se na fluidne uređaje za kultivaciju ćelija i embriona. WO2003/083044 objavljuje metode kultivacije ćelija i tkiva, koji uključuju upotrebu mikroploče sa bunarčićima sa umecima kulture koja može da se stavi na mešalicu sa ljuljajućom platformom ili rotirajućom pločom.

[0015] WO2016/163315 odnosi se na sistem za propagiranje ćelija. Ćelijske kulture nisu fluidno povezane.

[0016] Cilj aspekata predmetnog pronalaska je da se bar delimično ublaže problemi udruženi sa postojećim stanjem tehnike.

[0017] Cilj određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska je obezbediti isplativi bioreaktorski sistem pogodan za kultivaciju ćelija i/ili tkiva, npr. tkivnih preseka.

[0018] Cilj određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska je obezbediti sistem i metod koji će vernije odražavati in vivo okruženje oboljenja, na primer.

[0019] Cilj određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska je obezbediti aparat koji koristi malu zapreminu medijuma za kulturu ćelija.

Kratak opis nekih primera izvođenja pronalaska

[0020] U ovom tekstu objavljen je aparat za kultivaciju ćelija i/ili tkiva, koji sadrži:

telo držača koje sadrži veći broj komora sa medijumom za ćelijsku kulturu, pri čemu telo držača uključuje najmanje jedan put za fluidnu komunikaciju koji se pruža između najmanje dve od više komora, svaki put za fluidnu komunikaciju dopušta dvosmerni protok fluida između najmanje dve komore.

[0021] Ovaj aparat može da se označi i kao "aparat za kulturu" ili ploča sa više bunarčića. Prema tome, aparat za kulturu opisan u ovom tekstu može uključivati ploču sa više bunarčića. Izraz "ploča sa više bunarčića" poznat je u struci i takve ploče tipično sadrže veći broj komora ili bunarčića.

[0022] U prvom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je aparat kako je zahtevano u patentnom zahtevu 1.

[0023] Prema tome, određeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska obezbeđuju isplativi bioreaktorski sistem srednje ili visoke propusnosti. Pogodno, sistem uvodi dvosmerni protok kultivacionog medijuma kroz komore na ploči, bez potrebe za postojanjem pumpe. Pogodno, za sistem su dovoljne male zapremine medijuma, što može biti korisno pri otkrivanju lekova.

[0024] Dati aparat konfigurisan je tako da obezbedi dvosmerni protok tečnosti i uključuje aparat koji sadrži:

nosač tela držača; i

najmanje jedan pogonski element postavljen tako da ljulja telo držača oslonjeno na nosač čime se ponavljano podižu i spuštaju suprotni krajevi tela držača, a koji se može nazvati "aparat za ljuljanje".

[0025] U određenim primerima izvođenja, telo držača može da se odvoji odnosača tela držača i/ili najmanje jednog pogonskog elementa. Pogodno, telo držača je locirano u blizini površine nosača tela držača.

[0026] Pogodno, komore su pravilno uređene. Pogodno, komore su konfigurisane tako da se u njih smeste kultura ćelija ili tkiva i unapred određena zapremina medijuma za ćelijsku kulturu. Kao što je navedeno u ovom tekstu, izraz "tkivo" može da se odnosi na deo tkiva npr. presek organa.

[0027] U jednom primeru izvođenja, svaka od pomenutih više komora uključuje bazalni element i najmanje jedan element bočnog zida. Pogodno, put za fluidnu komunikaciju uključuje prolazni kanal koji se pruža između bazalnog elementa ili elementa bočnog zida prve od više komora do bazalnog elementa ili elementa bočnog zida sledeće od više komora.

[0028] Pogodno, put za fluidnu komunikaciju uključuje prolazni prorez koji se pruža između bazalnog elementa ili elementa bočnog zida prve od više komora do bazalnog elementa ili elementa bočnog zida sledeće od više komora. U određenim primerima izvođenja, prva komora nalazi se pored sledeće komore. U određenim primerima izvođenja, prva komora i sledeća komora povezane su putem za fluidnu komunikaciju sa jednom ili više dodatnih komora, od većeg broja komora.

[0029] U određenim primerima izvođenja, telo držača uključuje veći broj puteva za fluidnu komunikaciju, svaki put za fluidnu komunikaciju pruža se između najmanje dve od većeg broja komora.

[0030] Pogodno, svaki od većeg broja puteva za fluidnu komunikaciju suštinski je paralelan sa svim drugim putevima za fluidnu komunikaciju i od njih je odvojen.

[0031] U određenim primerima izvođenja, svaka od većeg broja komora konfigurisana je za smeštaj komorskog umetnutog elementa koji je konfigurisanog kao podloga za ćelijski skafold.

[0032] U određenim primerima izvođenja, svaka od većeg broja komora uključuje otvor za prijem i/ili uklanjanje medijuma za kulturu tkiva i/ili odgovarajući komorski umetnuti element.

[0033] U određenim primerima izvođenja, aparat sadrži još i najmanje jedan obično cilindrični komorski umetnuti element sa velikim brojem prirubnica koje se pružaju radijalno ka spolja, za podupiranje komorskog umetnutog elementa u odgovarajućoj komori, od većeg broja komora. U jednom primeru izvođenja, aparat za kulturu sadrži veliki broj komora, svaka komora sadrži umetnuti element.

[0034] Pogodno, svaki respektivni umetnuti komorski element uključuje još i ćelijski skafold. Pogodno, ćelijski skafold sadrži veliki broj pora, pomenute brojne pore imaju prosečan dijametar između oko 8 μm i 150 μm. U određenim primerima izvođenja, prosečna veličina pore može biti na primer 8 μm, 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm ili 150 μm. U određenim primerima izvođenja, pore imaju prosečan dijametar od oko 8 μm do oko 100 μm. Pogodno, pore se nalaze na donjoj površini ćelijskog skafolda.

[0035] U određenim primerima izvođenja, ćelijski skafold sadrži unutrašnju površinu, pri čemu je unutrašnja površina obložena biološkim molekulom. Biološki molekul može biti, na primer, protein skafolda, kao što je na primer kolagen.

[0036] U određenim primerima izvođenja, telo držača sadrži najmanje dvanaest komora, npr.

12, 24, 96, ili više. U jednom primeru izvođenja, telo držača sadrži 24 komore.

[0037] U određenim primerima izvođenja, telo držača sadrži spoljni obodni zidni element. Pogodno, spoljni obodni zidni element sadrži udubljeni deo spoljne ivice. Pogodno, spoljni obodni zidni element je kontinuirani spoljni obodni zidni element. Pogodno, kontinuirani spoljni obodni zidni element je ravan. Dakle, u određenim primerima izvođenja, telo držača ne zahteva spoj sa pumpom ili cevima i prema tome uključuje spoljni ivični region koji ne sadrži ulazne ili izlazne elemente. Pored toga, telo držača ne sadrži elemente konfigurisane za vezu sa cevi, na primer.

[0038] Pogodno, telo držača sadrži donju površinu sa regionom udubljene ivice koji je konfigurisan da stoji u odnosu na udubljeni deo spoljne ivice tela držača, tako da tela držača budu uklopljena. U određenim primerima izvođenja, veći broj tela držača može se vertikalno naslagati jedno na drugo, na primer u odnosu međusobnog uklapanja.

[0039] Pogodno, telo držača sastoji se suštinski od velikog broja komora, najmanje jednog puta za fluidnu komunikaciju, spoljnog obodnog zidnog elementa, pri čemu je svaka od pomenutog velikog broja komora spojena putem mreže materijala.

[0040] U određenim primerima izvođenja, telo držača sačinjeno je od materijala odabranog između polistirena, polikarbonata, polietilena, polipropilena, PMMA, celuloza acetata, Zeonex™, Zeonor™ i stakla.

[0041] U određenim primerima izvođenja, svaka od većeg broja komora duboka je između oko 16 mm i 19 mm, npr.16 mm, 16.5 mm, 17 mm, 17.5 mm, 18 mm, 18.5 mm ili 19 mm.

[0042] U primeru izvođenja, kanal je širok približno 1.5 mm do 3.5 mm npr. pribl. 2 mm. U jednom primeru izvođenja, kanal je dug između oko 3 mm i oko 5 mm. U jednom primeru izvođenja, kanal je dug pribl.3.5 mm do pribl.4 mm.

[0043] U određenim primerima izvođenja, svaka komora može biti duboka između oko 16 mm i 19 mm, npr. 16 mm, 16.5 mm, 17 mm, 17.5 mm, 18 mm, 18.5 mm, ili 19 mm. U jednom primeru izvođenja, komora je duboka približno 18 mm. U jednom primeru izvođenja, komora je duboka približno 16.5 mm.

[0044] U određenim primerima izvođenja, aparat za kulturu uključuje još i poklopac koji je pomerljivo smešten preko tela držača, poklopac obezbeđuje suštinski ravan pokrivač koji se pruža preko više komora.

[0045] U određenim primerima izvođenja, više komora uređeno je u redovima i kolonama u respektivnom ortogonalnom odnosu sa telom držača.

[0046] U određenim primerima izvođenja, aparat za kulturu može da se postavi na najmanje još jedan aparat za kulturu.

[0047] Pogodno, nosač tela držača uključuje obrtni element oko kojeg se telo držača ljulja.

[0048] Aparat pronalaska uključuje platformu poduprtu nosačem tela držača, platforma je konfigurisana tako da zadrži telo držača na fiksiranom mestu tokom ljuljanja. Platforma je konfigurisana da nosi i/ili zadrži više tela držača fiksiranih u mestu tokom ljuljanja. Pogodno, više tela držača zadržava se u aranžmanu jedan do drugoga uz gornju površinu platforme. U određenim primerima izvođenja, aparat uključuje više vertikalno naslaganih tela držača.

[0049] Pogodni pogonski element aparata pronalaska konfigurisan je tako da ljulja telo držača brzinom od približno 1 minuta do 20 minuta po potpunom pokretu ljuljanja.

[0050] U određenim primerima izvođenja, pogonski element sadrži linearni pokretač. Pogodno, platforma uključuje prvi krajnji region i drugi krajnji region, odvojen od prvog krajnjeg regiona, pri čemu je linearni pokretač smešten na prvom krajnjem regionu ili drugom krajnjem regionu.

[0051] U određenim primerima izvođenja, aparat sadrži još i bazalni element, pri čemu bazalni element sadrži žleb u koji može da se smesti obrtni element.

[0052] U određenim primerima izvođenja, ni aparat za kulturu ni aparat za ljuljanje ne uključuju pumpu za podsticanje protoka tečnosti između susednih komora.

[0053] U ovom tekstu objavljen je i aparat za ponavljajuće ljuljanje tela držača, pomenuto telo držača sadrži više komora u kojima će se nalaziti medijum za kulturu ćelija ili tkiva, pri čemu telo držača sadrži najmanje jedan put za fluidnu komunikaciju, koji se pruža između najmanje dve od više komora, svaki put za fluidnu komunikaciju dopušta dvosmerni protok tečnosti između pomenute najmanje dve komore, pomenuti aparat sadrži:

nosač tela držača; i

najmanje jedan pogonski element postavljen tako da ljulja telo držača poduprto nosačem, kako bi se time ponavljano podizali i spuštali suprotni krajevi tela držača.

[0054] U sledećem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je in vitro metod kultivacije ćelija i/ili tkiva ili njegovog dela, metod uključuje:

a) obezbeđivanje aparata za kulturu, pronalaska; i

b) tokom unapred određenog vremenskog perioda, primenu pokreta ljuljanja na aparat za kulturu.

[0055] U sledećem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je in vitro metod kultivacije ćelija i/ili tkiva ili njegovog dela, metod uključuje:

a) obezbeđivanje aparata pronalaska; i

[0056] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje još i smeštanje najmanje jedne ćelije u najmanje jednu od većeg broja komora. Pogodno, metod uključuje još i smeštanje dela tkiva koje sadrži najmanje jednu ćeliju u najmanje jednu od većeg broja komora.

[0057] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje smeštanje dela tkiva stavljanjem najmanje jednog komorskog umetnutog elementa koji podupire deo tkiva, u najmanje jednu komoru tela držača. Pogodno, u ćelijskoj kulturi obezbeđena je najmanje jedna ćelija.

[0058] U određenim primerima izvođenja, ćelijska kultura poduprta je ćelijskim skafoldom, a metod uključuje još i smeštanje ćelijske kulture stavljanjem najmanje jednog komorskog umetnutog elementa koji nosi ćelijski skafold, u najmanje jednu komoru tela držača.

[0059] U određenim primerima izvođenja, najmanje jedna ćelija bira se između eukariotskih ćelija i prokariotskih ćelija, npr. biljnih ćelija, sisarskih ćelija, ćelija kvasca, ćelija gljiva i/ili bakterijskih ćelija. Pogodno, najmanje jedna ćelija je sisarska ćelija odabrana između epitelnih ćelija, tumorskih ćelija, hepatocita, fibroblasta, matičnih ćelija, miokardiocita, ćelija bubrega, ćelija pluća, neuronskih ćelija, adipocita, crevnih ćelija, ćelija kože i imunskih ćelija, bilo samih ili u kombinaciji.

[0060] Pogodno, najmanje jedna ćelija nalazi se u delu tkiva npr. u preseku organa. Pogodno, deo tkiva je uzorkovan iz tkiva odabranog između pluća, jetre, bubrega, srca, mozga, kože, pankreasa. U određenim primerima izvođenja, ćelijska kultura i/ili deo tkiva uključuju više tipova ćelija.

[0061] U određenim primerima izvođenja, najmanje jedna komora je prva od više komora, pri čemu je prva komora povezana sa najmanje još jednom komorom od više komora, putem za fluidnu komunikaciju koji se pruža između njih, put za fluidnu komunikaciju dopušta dvosmerni protok tečnosti između prve komore i sledeće komore.

[0062] Pogodno, komorski umetnuti element uključuje bazalnu površinu koja sadrži više pora. Pogodno, više pora konfigurisano je tako da se kroz njih omogući dvosmerni protok tečnog medijuma za ćelijsku kulturu.

[0063] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje:

obezbeđivanje tečnog medijuma za ćelijsku kulturu za prvu i/ili sledeću komoru i; primenu ljuljajućih pokreta tokom unapred određenog vremenskog perioda tako da tečni medijum za ćelijsku kulturu ponavljano protiče iz najmanje jedne komore u sledeću od više komora i nazad.

[0064] Pogodno, metod uključuje obezbeđivanje između oko 0.5 ml do 5 ml npr.0.5 ml, 0.75 ml, 1 ml, 1.25 ml, 1.5 ml, 1.75 ml, 2 ml, 2.25 ml, 2.5 ml, 3 ml, 3.25 ml, 3.5 ml, 3.75 ml, 4 ml, 4.25 ml, 4.5 ml, 4.75 ml ili 5 ml tečnog medijuma za ćelijsku kulturu po komori, za prvu i/ili sledeću od više komora.

[0065] Pogodno, metod uključuje obezbeđivanje između oko 1.5 ml i 4 ml tečnog medijuma za kulturu ćelija po komori, za prvu i/ili sledeću od većeg broja komora. U određenim primerima izvođenja, količina tečnog medijuma za ćelijsku kulturu dodata u svaku komoru zavisiće od veličine komore i/ili veličine pore obezbeđene umetkom sa ćelijskim skafoldom.

[0066] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje još i smeštanje ćelijske kulture, pri čemu se ćelijska kultura uspostavlja najmanje jednom ćelijom, i elementa ćelijskog skafolda u najmanje dve većeg broja komora, i pri čemu je ćelijska kultura smeštena u prvoj respektivnoj komori uspostavljena ćelijama istog ili različitog tipa u odnosu na ćelijsku kulturu smeštenu u sledećoj respektivnoj komori.

[0067] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje:

smeštanje aparata za kulturu opisanog u ovom tekstu tako da ga podupire platforma aparata prema pronalasku;

obezbeđivanje pogonske sile pogonskom elementu; i

ponavljano podizanje i spuštanje suprotnih krajeva tela držača tako da se na telo držača primenjuje ljuljajuće kretanje.

[0068] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje primenu ljuljajućeg kretanja tokom najmanje 24 sata, npr.48 sati, 72 sata, ili više.

[0069] Pogodno, metod uključuje još i određivanje vijabilnosti ili drugog merljivog parametra ćelije/ćelija u kulturi ćelija. Pogodno, svaka kultura ćelija uključuje hepatocite, i pri čemu korak određivanja vijabilnosti ćelija ili drugog merljivog parametra uključuje merenje proizvodnje albumina od strane ćelije/ćelija ćelijske kulture/kultura.

[0070] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje smeštanje većeg broja aparata za kulturu na platforme aparata za ljuljanje. Pogodno, metod uključuje smeštanje većeg broja aparata za kulturu na podlogu u aranžmanu jedan do drugoga, na gornjoj površini platforme.

[0071] U još jednom dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je metod in vitro testiranja sredstva toksičnog za jetru, koji uključuje:

a) obezbeđivanje aparata za kulturu prema pronalasku;

b) smeštanje ćelijske kulture ili tkiva ili njegovog dela koji sadrže najmanje jedan hepatocit, i ćelijski skafold u najmanje jednu od većeg broja komora;

c) dodavanje najmanje jednog sredstva koje će se testirati, u pomenutu najmanje jednu komoru;

d) tokom unapred određenog vremenskog perioda, primenjivanje ljuljajućeg kretanja na aparat; i

e) praćenje najmanje jednog efekta sredstva na hepatocitu.

[0072] U određenim primerima izvođenja, praćenje najmanje jednog efekta sredstva uključuje praćenje efekta sredstva na proliferaciju i/ili diferencijaciju i/ili funkciju hepatocita, kao meru toksičnosti sredstva.

[0073] Pogodno, hepatocit se nalazi u preseku jetre. Hepatociti mogu biti humanog ili nehumanog porekla. Hepatociti, npr. presek jetre, mogu obuhvatati primarne hepatocite. Alternativno ili dodatno, hepatociti npr. presek jetre, mogu uključivati hepatocite koji nisu primarni, npr. hepatocite izvedene iz matične ćelije ili hepatocite izvedene iz progenitorske

1

ćelije. Hepatociti mogu biti sveže uzorkovani iz pacijenta ili donora ili više donora ili mogu biti izvedeni iz krioprezerviranog uzorka.

[0074] Metod može uključivati dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu u komore. Metod može uključivati i dodavanje sredstva hepatocitima stavljenim u komoru. Može se dodati kombinacija sredstava. Sredstvo može na primer biti kandidatski lek.

[0075] U sledećem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je metod in vitro modelovanja bolesti tkiva koji uključuje:

a) obezbeđivanje aparata za kulturu prema pronalasku;

b) smeštanje dela tkiva koji sadrži najmanje jednu ćeliju i ćelijskog skafolda u najmanje jednu komoru od više komora;

c) tokom unapred određenog perioda vremena, primenu ljuljajućeg kretanja na aparat za kulturu; i

d) praćenje najmanje jedne karakteristike dela tkiva.

[0076] Pogodno, oboljenje je kancer. Pogodno, oboljenje je fibroza. Pogodno, bolest tkiva je fibroza npr. plućna fibroza, bubrežna fibroza ili fibroza jetre. Pogodno, bolest tkiva je bolest jetre.

[0077] Pogodno, deo tkiva je presek jetre, presek bubrega i/ili presek pluća. U određenim primerima izvođenja, metod uključuje određivanje aktivacije tipa ćelije u delu tkiva. Pogodno, metod uključuje određivanje aktivacije miofibroblasta jetre u delu tkiva. Pogodno, metod uključuje identifikovanje markera miofibroblasta jetre. Pogodno, marker je α-aktin glatkih mišićnih ćelija.

[0078] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje određivanje ekspanzije ćelijskog tipa udruženog sa bolesnim stanjem. Pogodno, presek tkiva je deo jetre, a metod uključuje određivanje ekspanzije duktusnih ćelija. Pogodno, metod uključuje korak histološke analize dela tkiva. U određenim primerima izvođenja, metod uključuje određivanje prisustva ili odsustva imunske ćelije u delu tkiva. Pogodno, imunska ćelija je Kupfferova ćelija.

[0079] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje smeštanje dela tkiva i skafolda ćelijske kulture smeštanjem najmanje jednog komorskog umetnutog elementa koji podupire element skafolda ćelijske kulture sa delom tkiva, u pomenutu najmanje jednu komoru tela držača.

[0080] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje još i dodavanje jedne ili više ćelija u komoru. Pogodno, jedna ili više ćelija su imunske ćelije. U određenim primerima izvođenja, metod uključuje dodavanje jedne ili više kancerskih ćelija u komoru.

[0081] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje smeštanje ćelijske kulture i elementa skafolda ćelijske kulture smeštanjem najmanje jednog komorskog umetnutog elementa koji podupire element skafolda ćelijske kulture sa delom tkiva, u pomenutu najmanje jednu komoru tela držača.

[0082] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje još i:

dodavanje tečnog medijuma za ćelijsku kulturu u najmanje jednu od više komora i primenu ljuljajućeg kretanja tokom unapred određenog perioda vremena tako da tečni medijum za ćelijsku kulturu ponavljano protiče iz pomenute komore u sledeću od više komora i ponovo nazad.

[0083] Pogodno, metod uključuje još i:

smeštanje aparata za kulturu na platformu aparata prema pronalasku; obezbeđivanje pogonske sile za pogonski element; i

ponavljano podizanje i spuštanje suprotnih krajeva tela držača tako da se ljuljajuće kretanje primeni na telo držača.

[0084] U ovom tekstu objavljen je i umetnuti element za podupiranje ćelije i/ili dela tkiva, pri čemu je umetnuti element obično cilindričan i sadrži više prirubnica koje se pružaju radijalno ka spolja za podupiranje komorskog umetnutog elementa u odgovarajućoj komori aparata, kako je opisano u ovom tekstu, i dalje, pri čemu respektivni komorski umetnuti element uključuje još i ćelijski skafold koji sadrži veći broj pora, pomenuti veći broj pora imaju prosečan dijametar između oko 8 μm i oko 150 μm.

[0085] Pogodno, veći broj pora ima prosečan dijametar od oko 8 μm do oko 100 μm.

[0086] Određeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska mogu obezbediti in vitro model jetre. In vitro modeli jetre su važan alat u razvoju farmaceutskih lekova i razumevanju patofiziologije jetre. Određeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska obezbeđuju sistem koji predstavlja verniji model fibroze organa i koji se može koristiti za testiranje antifibroznih kandidatskih molekula.

[0087] U određenim primerima izvođenja, aparat i metod služe za modelovanje oboljenja jetre. Mnogi ljudi sa cirozom jetre i drugim bolesnim stanjima povezanim sa jetrom nemaju simptome u ranim stadijumima bolesti. Međutim, kako ožiljačno tkivo zamenjuje zdravo, funkcije jetre počinju da opadaju i osoba može osetiti umor, iscrpljenost, gubitak apetita, mučninu, slabost i gubitak težine. Sa napredovanjem bolesti, mogu se razviti komplikacije koje su rezultat gubitka funkcija jetre.

[0088] Kako se koristi u ovom tekstu izraz "bolesti povezane sa jetrom" može se odnositi na jednu ili više bolesti, stanja ili simptoma ili podložnost bolestima, stanjima ili simptomima koji uključuju direktno ili indirektno, jetru, žučne kanale, hepatične kanale, kanale žučne kesice ili žučnu kesicu uključujući sledeće: akutno otkazivanje rada jetre, Alagilleov sindrom, alkoholno oboljenje jetre, deficijenciju alfa 1-antitripsina, autoimunski hepatitis, bilijarnu atreziju, hronični hepatitis, cirozu, holestatsku bolest jetre, cističnu bolest jetre, masnu jetru, galaktozemiju, kamen u žučnoj kesi, Gilbertov sindrom, hemohromatozu, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, kancer jetre, neonatalni hepatitis, nealkoholnu masnu jetru, nealkoholni steatohepatitis, porfiriju, primarnu bilijarnu cirozu, primarni sklerotizujući holangitis, Reyeov sindrom, sarkoidozu, steatohepatitis, tirozinemiju, bolest skladištenja glikogena tipa I, virusni hepatitis i/ili Wilsonovu bolest.

[0089] U određenim primerima izvođenja, metod je metod modelovanja masne jetre. Masna jetra može biti nealkoholno masno oboljenje jetre (non-alcohol related fatty liver disease, NAFLD) ili alkoholno oboljenje jetre i može se karakterisati neželjenim nagomilavanjem masti u subjektovoj jetri. Tokom vremena, nagomilavanje masti rezultuje zapaljenjem jetre i fibrozom.

[0090] NAFLD može dovesti do nealkoholnog steatohepatitisa (non-alcohol dteatohepatitis, NASH). Prema tome, u određenim primerima izvođenja, metod je metod modelovanja NASH i/ili progresije od NAFLD do NASH.

[0091] U određenim primerima izvođenja, metod modelovanja masne jetre uključuje dodavanje jednog ili više lipida delu tkiva. Pogodno, jedan ili više lipida bira se između palmitinske kiseline, oleinske kiseline i linoleinske kiseline i njihovih kombinacija. Pogodno, lipid je konjugovan sa goveđim serum albuminom (bovine serum albumin, BSA). Pogodno, metod uključuje kultivaciju dela tkiva sa jednim ili više lipida u trajanju do četiri dana, npr.1, 2, 3 ili 4 dana.

[0092] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje kultivaciju dela tkiva sa faktorom koji stimuliše fibrozu, recimo transformišućim faktorom rasta-β (transforming growth factorβ, tgfβ) ili faktorom rasta poreklom iz krvnih pločica-bb (platelet derived growth factor-bb, pdgf-bb). Pogodno, metod uključuje korak kultivacije dela tkiva sa faktorom koji stimuliše fibrozu, u trajanju do 4 dana, npr.1, 2, 3 ili 4 dana.

[0093] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje kultivacije dela tkiva sa medijatorom zapaljenja. Pogodno, medijator zapaljenja bira se između molekularnih obrazaca

1

udruženih sa patogenima (pathogen-associated molecular patterns, PAMP) npr. lipopolisaharid (lipopolysaccharide, LPS) ili poli IC, i molekularnih obrazaca udruženih sa oštećenjem (damage associated molecular patterns, DAMP), npr. apoptotske ili oštećene ćelije. Pogodno, korak kultivacije dela tkiva sa medijatorom zapaljenja traje do 4 dana, npr.1, 2, 3 ili 4 dana.

[0094] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje kultivaciju dela tkiva sa hepatotoksičnim sredstvom npr. acetaminofenom (koji dovodi do otkazivanja rada jetre) ili žučnim kiselinama (koje dovode do bilijarnog oboljenja) u trajanju, ali bez ograničavanja, do 4 dana.

[0095] U određenim primerima izvođenja, jedno ili više stimulišućih sredstava može se dodati delu tkiva. Na primer, metod može uključivati dodavanje jednog ili više od: lipida, zapaljenskog sredstva i sredstva koje stimuliše fibrozu. Jedno ili više stimulišućih sredstava mogu biti kako je opisano u ovom tekstu.

[0096] U određenim primerima izvođenja, metod uključuje održavanje standardnih normoksičnih uslova za kultivaciju delova tkiva (21% kiseonika, 5% ugljen-dioksida i 74% azota). U određenim primerima izvođenja, npr. da bi se imitiralo hipoksično oštećenje do kojeg dolazi tokom fibroze tkiva i kancera, delovi tkiva mogu da se drže na samo 0.1% kiseonika (hipoksija).

[0097] Postojeći in vitro modeli u kojima se koriste preseci organa ljudi u kulturi imaju ograničenu vrednost zbog toga što organ brzo gubi funkciju u kulturi. Na primer, zbog hipoksije i degradacije tkiva, preseci jetre koji se kultivišu ma Transwells® imaju životni vek od 2 dana do 3 dana. Primer dinamičnog inkubacionog sistema za testiranje citotoksičnosti određenih jedinjenja opisan je u Leeman et al, Toxic. In Vitro, Vol. 9, No. 3, pp. 291-298. Međutim, ovaj sistem ne obezbeđuje dvosmerni protok između susednih komora. Rezultati koje su saopštili Leeman et al sugerišu da se vijabilnost ćelija naglo smanjuje posle 72 sata. Leeman et al su tokom kultivacije koristili visoku koncentraciju kiseonika (40%).

[0098] Rezultat ovoga je da preseci jetre trenutno imaju ograničenu vrednost u otkrivanju lekova. Nasuprot postojećem stanju tehnike, određeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska mogu biti pogodni za produženje životnog veka preseka jetre u kulturi i prema tome povećati njihovu korisnost u testiranju kandidatskih molekula lekova i modeliranju bolesti npr. poremećaja povezanih sa jetrom, kako je detaljno opisano ranije u ovom tekstu, uključujući, na primer fibrozno oboljenje jetre.

[0099] Pored toga, određeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska mogu obezbediti isplativi bioreaktorski sistem male ili srednje propusnosti, koji vernije predstavlja in vivo okruženje, uključujući na primer stanja bolesti.

[0100] Pored toga, određeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska mogu obezbediti 3D dinamični model bolesti čoveka ili životinja, koji se može koristiti za testiranje kandidatskih molekula. Određeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska obezbeđuju aparat i bioreaktorske sisteme koji omogućavaju poboljšanje vijabilnost ćelija i/ili tkiva u kulturi.

[0101] Posebno, određeni primeri izvođenja omogućavaju da se dužina ćelijske vijabilnosti npr. vijabilnosti hepatocita produži, na 72 sata ili više. Kao rezultat toga, aparat, sistemi i metodi opisani u ovom tekstu mogu se koristiti za održavanje ćelija i tkiva tokom dovoljno dugog vremenskog perioda da bi se testirala efikasnost kandidatskog jedinjenja, i slično.

Detaljan opis primera izvođenja pronalaska

[0102] Primeri izvođenja predmetnog pronalaska biće opisani u nastavku ovog teksta, samo putem primera, uz pozivanje na pridružene crteže u kojima:

"CMR" se odnosi na dvosmerni sistem prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska.

"CMR2" se odnosi na dvosmerni sistem prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska.

Slika 1 predstavlja ilustraciju aparata koji se sastoji od ploče sa više bunarčića prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska;

Slika 2 predstavlja pogled odozgo na susedne komore aparata koji se sastoji od ploče sa više bunarčića prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska;

Slika 3a predstavlja šematski prikaz aparata za ljuljanje koji nosi aparat koji se sastoji od ploče sa više bunarčića prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska. Kako je pokazano strelicama, razmena medijuma može se odvijati preko pora umetka unutar bunarčića ploče. Pored toga, razmena medijuma može se odvijati preko kanala između bunarčića.

Slika 3b predstavlja ilustraciju aparata za ljuljanje ("CMR") prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska;

1

Slike 4a i 4b predstavljaju ilustracije umetnutog elementa sa ćelijskim skafoldom, za upotrebu u određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska;

Slika 5 predstavlja šematski prikaz aparata za ljuljanje sa Slike 3;

Slika 6 grafički prikazuje upoređivanje proizvodnje albumina (ng/ml) u tanko isečenim presecima jetre, uz korišćenje aparata sa 12 komora opisanog u ovom tekstu (u daljem tekstu "CMR"), sa proizvodnjom albumina uz korišćenje statičnog Transwell® umetka (u daljem tekstu "umetak"). Vijabilnost ćelija povećana je korišćenjem aparata iz primera izvođenja pronalaska. N=8. Levi stubić prikazuje upotrebu aparata primera izvođenja predmetnog pronalaska, a desni stubić prikazuju upotrebu statičnog Transwell® umetka. Podaci pokazuju da aparat iz određenih primera izvođenja do 4 dana održava sposobnost preseka da sintetišu i sekretuju albumin, što ukazuje na poboljšanje funkcije jetre i produžen životni vek preseka tkiva. Ljuljanje ploče bioreaktora promoviše razmenu medijuma između dve komore povezane kanalom. Svaka komora sadrži umetak na kojem je presek tkiva u unutrašnjem bunarčiću. Ljuljanje ne samo da omogućava razmenu medijuma između dve komore nego dopušta i razmenu medijuma preko pora u membrani umetka za kulturu, koji razdvaja unutrašnje i spoljašnje bunarčiće. Ovaj drugi put razmene medijuma stvara protok oko/preko preseka tkiva što omogućava oksigenisanje i uklanjanje toksičnih metabolita, što dalje verovatno povećava vijabilnost i funkciju tkiva (proizvodnju albumina).

Slika 7 grafički ilustruje vijabilnost ćelija i sposobnost sinteze albumina uz korišćenje umetnutog elementa sa ćelijskim skafoldom, kako je opisano u ovom tekstu, koji ima prosečnu veličinu pora membrane 3 μm, što nije veličina dovoljna za omogućavanje efikasne razmene medijuma između unutrašnjosti umetka i spoljne komore, kroz pore umetka, i što za rezultat ima izostanak poboljšanja funkcije preseka u odnosu na statične umetske. "CMR"označava upotrebu aparata primera izvođenja predmetnog pronalaska, dok "Ins" označava statičnu (tj. neljuljajuću) postavku;

Slika 8 predstavlja grafikon koji ilustruje proizvodnju albumina (ng/ml) u ćelijama kultivisanim uz korišćenje umetnutog elementa sa ćelijskim skafoldom, koji ima prosečnu veličinu pora membrane 8 μm. Umeci sa porama veličine 8 μm omogućavaju efikasnu razmenu medijuma između unutrašnjost umetka i spoljašnje komore, kroz pore umetka, čime se postiže poboljšanje funkcije preseka u poređenju sa statičnim umecima. Pored toga, ljuljanje CMR bioreaktorske ploče ("CMR") održava funkciju jetre i sekreciju albumina.

1

Proizvodnja albumina značajno je smanjena na statičnoj bioreaktorskoj ploči ("CMR stat"), na statičnim umecima (Ins R), ili umecima standardne ploče sa 12 bunarčića koja se ljulja ("Ins"). Ovo sugeriše da je razmena medijuma između dva bunarčića komore u CMR ploči izazvana ljuljanjem, neophodna za održavanje sekrecije albumina.

Slika 9 predstavlja grafikon koji ilustruje proizvodnju albumina u ćelijama kultivisanim uz korišćenje umetnutog elementa sa ćelijskim skafoldom, koji ima prosečnu veličinu pora 100 μm. Umeci sa porama veličine 100 μm obezbeđeni u aparatu određenih primera izvođenja (CMR) dovoljni su da omoguće efikasnu razmenu medijuma između unutrašnjosti umetka i spoljne komore, kroz pore umetka, što za rezultat ima poboljšanje funkcije preseka u poređenju sa statičnim umecima. Ponovo, za održavanje sekrecije albumina potrebna je razmena medijuma između dva bunarčića komore ("CMR"). Obrnuto, proizvodnja albumina značajno je smanjena na statičnoj bioreaktorskoj ploči sa porama umetka od 100 μm (CMR Stat), na statičnim umecima sa porama od 100 μm ("Ins R"), ili umecima sa porama od 100 μm na standardnoj ploči sa 12 bunarčića koja se ljulja ("Ins").

Slika 10 predstavlja grafikon koji ilustruje uticaj veličine pora umetka sa ćelijskim skafoldom i ljuljanja bioreaktorske ploče za uvođenje dvosmernog protoka i razmene medijuma, na sekreciju albumina (ng/ml). Zaključak: proizvodnja albumina i vijabilnost tkiva poboljšavaju se dvosmernim protokom na umecima sa veličinom pora između 8 μm i 100 μm. Umeci sa porama od 3 μm ne poboljšavaju funkciju preseka, n=1.

Slika 11 je grafikon koji upoređuje efekat jednosmernog protoka uz korišćenje sistema koji se može nabaviti od Kirkstall Limited, UK, ("Kirkstall") i dvosmernog protoka (ljuljajuća CMR ploča, "CMR") uz korišćenje umetaka sa veličinom pora 3 μm, 8 μm ili 100 μm, na sekreciju albumina (ng/ml). Zaključak: dvosmerni protok rezultuje sekrecijom albumina koja je stabilna duže vreme. Minimalna veličina pora za poboljšanje funkcije potrebna je za poboljšanje sinteze i sekrecije albumina.

Slika 12 predstavlja grafikon koji uporedno prikazuje efekat jednosmernog sistema protoka ("uniflow", crni stubići) i dvosmernog protoka (ljuljajuća CMR ploča, sa porama od 8 μm) na sekreciju albumina (ng/ml). Podaci dobijeni za jednosmerni sistem protoka ("uniflow") u poređenju sa CMR I i statični umetak, ukazuju da je sekrecija albumina stabilna duže vreme ako se obezbedi dvosmerni protok.

1

Slika 13 je grafikon koji prikazuje proizvodnju albumina (ng/ml) u CMR bioreaktorskoj ploči sa umecima koji imaju pore od 8 μm i uz ljuljanje, sa zapreminama medijuma za kulturu u komori koje rastu od 0.5 ml/bunarčiću (ukupna zapremina komore 1 ml) do 4 ml/bunarčiću (ukupna zapremina komore 8 ml). Opseg zapremine medijuma koji poboljšava funkciju jetre i održava sekreciju albumina je između oko 1.5 ml i 4 ml.

Slika 14 je grafikon koji ilustruje da je oštećenje jetre, kvantifikovano curenjem jetrinog enzima aspartat aminotransferaze iz oštećenih hepatocita (arbitrarne jedinice), smanjeno u presecima kultivisanim na CMR, u poređenju sa statičnim uslovima ili uslovima obezbeđenim primenom jednosmernog sistema protoka ("uniflow"). Ljuljanje CMR bioreaktorske ploče sa umecima sa porama od 8 μm ("CMR 8") poboljšava vijabilnost preseka u poređenju sa statičnim uslovima ("CMR 8S") ili jednosmernim sistemom protoka ("uniflow"), što sugeriše da je dvosmerni protok važan za prvenciju smrti preseka jetre. Kako je naznačeno, serumske transaminaze se smanjuju korišćenjem CMR ploče prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska (8 μm u poređenju sa statičnim umecima (Ins 1.5) ili sistemom jednosmernog protoka ("uniflow")). N=3. Statistički test je neparni t-test u odnosu na statične umetke;

Slika 15 je grafikon koji ilustruje da je oštećenje jetre, kvantifikovano curenjem jetrinog enzima aspartat aminotransferaze iz oštećenih hepatocita (arbitrarne jedinice), smanjeno u presecima kultivisanim na CMR, u poređenju sa statičnim uslovima kada je zapremina medijuma u CMR između 1.5 ml i 2 ml. Zapremina medijuma ispod 1.5 ml ne sprečava smrt tkiva. Korišćeni su umeci sa porama od 8 μm. Zaključak: Serumske transaminaze su smanjene kada su hepatociti bili kultivisani korišćenjem CMR (1.5 ml-2 ml medijuma), što sugeriše manje oštećenje preseka. Stubići sleva nadesno označeni su odozgo nadole.

Slika 16 je grafikon koji ilustruje proizvodnju uree u presecima jetre kultivisanim u statičnim umecima (Ins 1.5), bunarčići imaju pore od 8 μm, u pločama prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska i onim koji su kultivisani u sistemu jednosmernog protoka ("uniflow"). Zaključak: Funkcija jetre se poboljšava u CMR-kultivisanim isečcima u poređenju sa statičnim uslovima. Proizvodnja uree "UREA" (mg/dl) je povećana na CMR (8 μm) u poređenju sa statičnim umecima (Ins 1.5) ili sistemom jednosmernog protoka ("uniflow"). n=2 (CMR i statični umetak) n=1 "uniflow".

1

Slika 17 je grafikon koji ilustruje proizvodnju uree (mg/dl) u CMR sa bunarčićima koji imaju umetke sa porama od 8 μm, u poređenju sa statičnim umecima, u rasponu zapremine medijuma 0.5 ml-4 ml. Podaci sugerišu da dinamični raspon od 1.5 ml do 4 ml/bunarčiću, n=1 i zapremine medijuma između 1.5 ml i 4 ml na ljuljajućoj CMR ploči održavaju sintezu i sekreciju uree. Stubići sleva nadesno označeni su odozgo nadole;

Slika 18: je grafikon koji ilustruje područje tkiva obojeno α-aktinom glatkih mišićnih ćelija (a-SMA), markerom hepatičnih miofibroblasta, na histološkim presecima uzoraka jetre, na t-0 (posle sečenja, bez kultivacije) ili kultivisanih na CMR (umeci sa porama od 8 μm) (CMR stubići) u poređenju sa statičnim umecima ("Static" stubići) u rasponu zapremine medijuma 0.5 ml-4 ml. Podaci sugerišu da su, u CMR, hepatični miofibroblasti aktivni do dana 4 u zapreminama medijuma od 1.5 ml do 4 ml, n=1.

Slika 19 prikazuje reprezentativne slike histoloških preseka uzoraka jetre na t-0 (posle sečenja, bez kultivacije) ili kultivisanih na CMR (umeci sa porama od 8 μm) u 1.5 ml ili 3 ml medijuma, u poređenju sa statičnim umecima, obojenih na α-aktin glatkih mišićnih ćelija (a-SMA), marker miofibroblasta jetre. Ovo sugeriše da su hepatični miofibroblasti aktivni do dana 4 u, n=1. Ovo može biti korisno za modelovanje oboljenja jetre i fibroze.

Slika 20 je grafikon koji ilustruje područje tkiva obojeno citokeratinom 19 (CK19), markerom duktusnih ćelija, na histološkim presecima uzoraka jetre na t-0 (posle sečenja, bez kultivacije) ili kultivisanih na CMR (umeci sa porama od 8 μm), u poređenju sa statičnim umecima, u rasponu zapremine medijuma 0.5 ml-4 ml. Podaci sugerišu da do duktusne ekspanzije može doći do dana 4 u >1.5 ml, u CMR, n=1. Ovo može biti korisno za modelovanje oboljenja jetre i fibroze.

Slika 21 je grafikon koji uporedno prikazuje područje tkiva obojeno na CD68, marker Kupfferovih ćelija (makrofagi jetre), na histološkim presecima uzoraka jetre na t-0 (posle sečenja, bez kultivacije) ili kultivisanih na CMR (umeci sa porama od 8 μm) (plavi stubići) i statičnim umecima (zeleni stubići), u rasponu zapremine medijuma 0.5 ml-4 ml. Podaci sugerišu da se makrofagi održavaju u presecima do dana 4, u CMR i statičnim umecima (static), n=1. Ovo može biti korisno za modelovanje oboljenja jetre i fibroze.

Slika 22 prikazuje reprezentativne slike histoloških preseka na t-0 (posle sečenja, bez kultivacije) ili kultivisanih na CMR (umeci sa porama od 8 μm) u 1.5 ml medijuma (desno) i

1

obojenih na CD68, markerom Kupfferovih ćelija (makrofagi jetre). Zaključak: makrofagi se održavaju u presecima do dana 4 u CMR.

Slika 23 je grafikon koji ilustruje proizvodnju albumina (ng/ml) uz korišćenje statične ploče za kulturu ćelija i aparata prema određenim primerima izvođenja pronalaska. Zaključak: verzija CMR ploče koja sadrži kanaliće između komora (CMR) i primer izvođenja koji uključuje proreze između komora (CMR III), rade jednako dobro i održavaju stabilnu sintezu i sekreciju albumina do 7 dana, n=1. Upotrebljen je umetak sa porama od 8 μm.

Slika 24 je grafikon na kojem se upoređuje proizvodnja albumina u presecima jetre veličine 6 mm kultivisanim u CMR (12 bunarčića) sa umecima sa porama od 8 μm, i CMR (24 bunarčića) sa umecima sa porama od 8 μm. Podaci pokazuju da CMR sistem sa 24 bunarčića funkcioniše kao i CMR sistem sa 12 bunarčića.

Slika 25 predstavlja grafikon koji prikazuje kvantifikovanje proizvodnje albumina u tanko isečenim presecima jetre (precision cut liver slices, PCLS), kultivisanim na CMR u poređenju sa statičnim transvelovim kulturama (25A), ili CMR2 u poređenju sa statičnim transvelovim kulturama (25B), tokom do 7 dana, uz svakodnevnu promenu medijuma. Slično kao CMR, CMR2 bioreaktor održava proizvodnju albumina, u poređenju sa presecima kultivisanim na statičnim transvelovim umecima. Stubići sleva nadesno označeni su kako je navedeno odozgo nadole.

Slika 26 predstavlja grafikon koji prikazuje proizvodnju albumina u PCLS kultivisanim na CMR2 i stimulisanim /- 3 ng/ml transformišućeg faktora rasta beta 1 (TGFb1), 48 h posle perioda mirovanja od 24 h (Slika 26A). Slika 26B prikazuje da tretman PCLS korišćenjem 3 ng/ml TGFb1 u trajanju od 48 h indukuje ekspresiju gena fibroze, kolagena I, alfa-aktina glatkih mišićnih ćelija (aSMA) i tkivnog inhibitora metaloproteaze 1 (tissue inhibitor of metalloprotease 1, TIMP1), u odnosu na kontrolu (bez tretmana). Stubići sleva nadesno označeni su kako je navedeno odozgo nadole.

Slika 27 prikazuje proizvodnju albumina u PCLS kultivisanim na CMR2 i stimulisanim /-mašću, mašću lipopolisaharidom (LPS) ili goveđim serum albuminom (BSA, prenosnik), tokom 48 h posle perioda mirovanja od 24 h. Tretman korišćenjem masti i LPS nije uticao na proizvodnju albumina.

2

Slika 28 je slika koja prikazuje da tretman mašću indukuje akumulaciju masti i deponovanje kolagena u PCLS.

Slike 29A, 29B i 29C predstavljaju poglede iz različitih uglova na aparat prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska (ovde označen kao CMR2).

Slika 30A i Slika 30B prikazuju različite komponente aparata sa Slike 29.

Slika 31 je grafikon koji prikazuje ekspresiju gena fibroze prokolagena 1, alfa-aktina glatkih mišićnih ćelija (aSMA) i tkivnog inhibitora metaloproteinaze 1 (TIMP1) u tanko isečenim presecima (PCLS) kultivisanim u CMR2 i stimulisanim /- transformšućeg faktora rasta beta (TGFb) i /- faktora rasta krvnih pločica b (PDGF-bb), tokom 72 h posle perioda mirovanja od 24 h. Tretman korišćenjem oba stimulusa indukuje ekspresiju gena fibroze.

Slika 32 je grafikon koji prikazuje kvantifikaciju oslobađanja laktat dehidrogenaze (lactate dehydrogenase, LDH) u tanko isečenim presecima bubrega (precision cut kidney slices, PCKS) kultivisanim u CMR u odnosu na statične kulture na transvelovim umecima u trajanju do 5 dana uz svakodnevnu zamenu medijuma. Oštećenje PCKS određeno oslobađanjem LDH smanjeno je kod preseka kultivisanih u CMR u poređenju sa statičnim kulturama preseka na Transwell® umecima.

Definicije

[0103] Iako je u ovoj patentnoj prijavi upotrebljena terminologija standardna za oblast, ovde su date definicije određenih izraza da bi se osigurale jasnoća i određenost značenja patentnih zahteva. Jedinice, prefiksi i simboli mogu se navesti u obliku prihvaćenom prema SI. Brojčani opsezi navedeni u ovom tekstu uključuju brojeve koji definišu opseg i uključuju i podržavaju svaki celi broj unutar definisanog opsega. U ovoj objavi, sledeće izraze, ako nije drugačije naznačeno, treba razumeti sa sledećim značenjima: Podrazumeva se da su izrazi "komora" i "bunarčić", kako se koriste u ovom tekstu, međusobno zamenljivi, dati su kao primer i neograničavajući su. Pominjanje jednog izraza ne isključuje supstituciju drugih izraza u opisanom primeru izvođenja. Kako se koristi u ovom tekstu, komora je otvor na telu držača koji tipično sadrži pljosnatu ravnu bazu i gornji otvor. Komora može biti cilindričnog oblika i imati jedan ili više bočnih zidova. Drugi detalji primera komora dati su u ovom tekstu.

[0104] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ćelijska kultura" ili "kultura" odnosi se na održavanje, rast, diferencijaciju i/ili produženu vijabilnost ćelija u veštačkom, in vitro okruženju. Ćelije mogu biti sadržane u tkivu ili njegovom delu npr. preseku tkiva ili organa. Ćelijska kultura može biti dvodimenzionalna ćelijska kultura ili trodimenzionalna ćelijska kultura. U jednom primeru izvođenja presek organa može bitin na primern presek jetre, presek bubrega ili presek pluća.

[0105] "Presek organa" ili "presek tkiva" je in vitro model koji predstavlja višećelijske, strukturne i funkcionalne osobine in vivo tkiva. Preseci tkiva mogu predstavljati model za karakterisanje mehanizama oštećenja izazvanog lekovima i za identifikovanje biomarkera oštećenja organa, što može biti klinički značajno.

[0106] Određeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska mogu biti posebno korisni za kultivaciju preseka tkiva koji sadrže različite tipove ćelija tokom produženih vremenskih perioda i prema tome mogu obezbediti in vitro model in vivo okruženja tkiva ili organa. Regionalne razlike i promene morfologije mogu se lako evaluirati histološki i specijalnim bojenjima, slično kao i kod tkiva dobijenih iz in vivo studija.

[0107] Tkivni preseci mogu biti bilo koje pogodne veličine. U određenim primerima izvođenja, tkivni presek je dijametra između oko 4 mm i 10 mm. Pogodno, tkivni presek može imati dijametar oko 6 mm. Pogodno, presek tkiva je presek jetre ili bubrega debljine 200-300 μm i prečnika jezgra između oko 4 i 8 mm. Pogodno, tkivni presek je presek pluća debljine 200-500 μm i prečnika jezgra između oko 4 i 8 mm.

[0108] U određenim primerima izvođenja, preseci tkiva jetre mogu biti korisni kao modeli jer zadržavaju strukturu jetre, sadrže sve ćelijske tipove nađene in vivo, imaju dobru korelaciju in vitro / in vivo metabolizma ksenobiotika i održavaju zonski specifičnu aktivnost citohroma (omogućavajući ćelijsku i zonsku toksičnost) i mehanizme toksičnosti.

[0109] Trodimenzionalna kultura ćelija ili tkiva može se diferencirati od dvodimenzionalne kulture ćelija ili tkiva koja je tipično obezbeđena u vidu ravnog sloja ćelija podržanih bazalnom površinom komore bunarčića. Trodimenzionalne ćelijske kulture su pogodno ćelijske mreže u kojima su ćelije okrugle i organizovane u tri dimenzije, okruženje i morfologija ćelija mnogo su sličnije onome što se nalazi in vivo. 3-D ćelijskoj kulturi može biti obezbeđen skafold.

[0110] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "ćelijski skafold " i "tkivni skafold" odnose se na veštačku trodimenzionalnu poroznu čvrstu strukturu. Ovi skafoldi služe da imitiraju aktuelno in vivo mikrookruženje u kojem ćelije interaguju i ponašaju se prema mehaničkim signalima dobijenim iz okolnog 3D okruženja. Za ćelijski skafold na raspolaganju su različiti materijali. Pogodni materijali uključuju na primer, polimerna mikrovlakna ili nanovlakna npr. elektrospinovana nanovlakna. Pogodni polimeri uključuju npr. poli(L-laktid) (poly(L-lactide), PLLA) i poli(D,L-laktid) (poly(D,L-lactide), PDLLA). Skafold se može napraviti korišćenjem konvencionalnih tehnika kao što su, na primer, silicijumska procesna tehnologija, mikromašinska tehnologija, injekciono livenje u kalupe i tehnike brze izrade dodavanjem slojeva.

[0111] Kako se koriste u ovom tekstu, iskazi "medijum", "medijum za ćelijsku kulturu", "medijum za tkivnu kulturu", "medijum za kulturu" (množina "medijumi", u svakom od slučajeva) i "formulacija medijuma" odnose se na nutritivni rastvor pogodan za kultivaciju ćelija ili tkiva, npr. sisarskih ćelija. Ovi iskazi mogu se koristiti naizmenično. Formulacije medijuma za ćelijsku kulturu dobro su poznate u struci. Tipično, medijum za ćelijsku kulturu sastavljen je od brojnih sastojaka i ovi sastojci mogu varirati od medijuma do medijuma. Medijumi za ćelijsku kulturu tipično sadrže pufere, soli, uglljene hidrate, amino-kiseline, vitamine i esencijalne elemente u tragovima. Izbor medijuma za ćelijsku kulturu zavisiće npr. od tipa ćelija i drugih faktora.

[0112] Medijum za ćelijsku kulturu može, ali ne mora sadržati serum, pepton i/ili proteine. Različiti medijumi za tkivnu kulturu, uključujući medijume za kulturu koji ne sadrže serum i definisane medijume za kulturu, komercijalno su dostupni, na primer, može se koristiti bilo koji od sledećih medijuma za ćelijsku kulturu ili njihova kombinacija: RPMI-1640 medijum, RPMI-1641 medijum, Eagleov medijum modifikovan po Dulbeccou (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM), minimalni esencijalni medijum po Eagleu, F-12K medijum, Hamov F12 medijum, Dulbeccov medijum modifikovan po Iscoveu, McCoyev 5A medijum, Williamsov E medijum, Leibovitzev L-15 medijum, i medijumi koji ne sadrže serum kao EX-CELL™ 300 Series (JRH Biosciences, Lenexa, Kans.), između ostalih. Medijumi za ćelijsku kulturu mogu se dopuniti dodatnim ili povećanim koncentracijama komponenti kao što su amino-kiseline, soli, šećeri, vitamini, hormoni, faktori rasta, puferi, antibiotici, lipidi, elementi u tragovima i slično, zavisno od zahteva ćelija koje će se kultivisati i/ili željenih parametara ćelijske kulture.

[0113] Pogodno, metodi određenih primera izvođenja mogu biti namenjeni za kultivaciju ćelija iz bilo kojeg izvora uključujući eukariotske ćelije i prokariotske ćelije, npr. biljne ćelije, sisarske ćelije, ćelije kvasca, ćelije gljiva i/ili bakterijske ćelije. Pogodno, ćelijska kultura uključuje sisarske ćelije koje se biraju između epitelnih ćelija, tumorskih ćelija, hepatocita, fibroblasta, matičnih ćelija, miokardiocita, ćelija bubrega, ćelija pluća, neuronskih ćelija, adipocita, crevnih ćelija, ćelija kože, imunskih ćelija, samih ili u kombinaciji.

[0114] U određenim primerima izvođenja, sisarske ćelije se biraju između tumorskih ćelija, matičnih ćelija i primarnih epitelnih ćelija (npr., keratinocita, ćelija epitela cerviksa, ćelija

2

bronhijalnog epitela, epitelnih ćelija traheje, bubrežnih epitelnih ćelija i epitelnih ćelija retine).

[0115] Pogodno, sisarske ćelije mogu biti humane. Sisarske ćelije mogu biti poreklom iz osobe npr. pacijenta obolelog od određenog poremećaja. U određenim primerima izvođenja, ćelije (npr. u preseku organa) se mogu izolovati iz pacijenta koji je oboleo ili kod kojeg postoji rizik za fibrozno oboljenje. Fibrozno oboljenje može biti na primer fibrozno oboljenje koje zahvata jetru, bubreg ili pluća. Pacijent može biti oboleo od poremećaja koji može da se razvije u fibrozno oboljenje.

[0116] U određenim primerima izvođenja, ćelije mogu biti poreklom iz uspostavljenih ćelijskih linija. U određenim primerima izvođenja, ćelije mogu biti genetički modifikovane. U određenim primerima izvođenja, ćelije su iz uspostavljene ćelijske linije, na primer, 293 embrionske ćelije bubrega, HeLa ćelije epitela cerviksa i PER-C6 ćelije retine, MDBK (NBL-1) ćelije, CRFK ćelije, MDCK ćelije, CHO ćelije, Chang ćelije, Detroit 562 ćelije, HeLa 229 ćelije, HeLa S3 ćelije, Huh7, Hep3b, A549, BEAS-2B, Calu-3, Hep-2 ćelije, KB ćelije, LS 180 ćelije, LS 174T ćelije, NCI-H-548 ćelije, RPMI 2650 ćelije, SW-13 ćelije, T24 ćelije, WI-28 VA13, 2RA ćelije, WISH ćelije, BS-C-I ćelije, LLCMK2 ćelije, klon M-3 ćelije, 1-10 ćelije, RAG ćelije, TCMK-1 ćelije, Y-1 ćelije, LLC-PK1 ćelije, PK(15) ćelije, GH.sub.1 ćelije, GH3 ćelije, L2 ćelije, LLC-RC 256 ćelije, MH1C1 ćelije, XC ćelije, MDOK ćelije, VSW ćelije i TH-I, B1 ćelije, ili njihovi derivati), fibroblasti iz bilo kojeg tkiva ili organa (uključujući, ali ne ograničavajući se na srce, jetru, bubreg, kolon, crevo, ezofagus, želudac, nervno tkivo (mozak, kičmenu moždinu), pluća, vaskularno tkivo (arterija, vena, kapilar), limfoidno tkivo (limfna žlezda, adenoid, krajnik, kostna srž i krv), slezina i fibroblastne i fibroblastima slične ćelijske linije (npr., CHO ćelije, TRG-2 ćelije, IMR-33 ćelije, Don ćelije, GHK-21 ćelije, Dempsey ćelije, Detroit 551 ćelije, Detroit 510 ćelije, Detroit 525 ćelije, Detroit 529 ćelije, Detroit 532 ćelije, Detroit 539 ćelije, Detroit 548 ćelije, Detroit 573 ćelije, HEL 299 ćelije, IMR-90 ćelije, MRC-5 ćelije, WI-38 ćelije, WI-26 ćelije, MiCl1 ćelije, CHO ćelije, CV-1 ćelije, COS-1 ćelije, COS-3 ćelije, COS-7 ćelije, Vero ćelije, DBS-FrhL-2 ćelije, BALB/3T3 ćelije, F9 ćelije, SV-T2 ćelije, M-MSV-BALB/3T3 ćelije, K-BALB ćelije, BLO-11 ćelije, NOR-10 ćelije, C.sub.3H/IOTI/2 ćelije, HSDM1C3 ćelije, KLN2O5 ćelije, McCoy ćelije, mišje L ćelije, soj 2071 (mišje L) ćelije, L-M soj (mišje L) ćelije, NCTC klonovi 2472 i 2555, SCC-PSA1 ćelije, Swiss/3T3 ćelije, ćelije indijskog muntjaka, SIRC ćelije, CII ćelije i Jensen ćelije, ili njihovi derivati.

[0117] U određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, aparat i/ili metod mogu uključivati upotrebu i/ili kultivaciju tkiva ili njegovog dela. Tkivo može biti, na primer, organ ili njegov deo. U jednom primeru izvođenja, deo tkiva je presek organa. Pogodno, organ može biti na primer, srce, bubreg, jetra, pluća, pankreas, želudac, mozak. U određenim primerima izvođenja, tkivo može biti na primer, skeletno tkivo, mišićno tkivo, vezivno tkivo, nervno tkivo, epitelno tkivo i/ili mineralizovano tkivo. U određenim primerima izvođenja, deo tkiva je presek bubrega ili presek jetre. Pogodno, presek tkiva može uključivati još i više tipova ćelija, uključujući na primer imunske ćelije. Pogodno tkivo je humani organ i deo tkiva je njegov presek ili njegov deo.

[0118] U ovom tekstu objavljen je i metod testiranja efikasnosti kanidatskog terapijskog molekula. "Kandidatski terapijski molekul" i "kandidatski molekul" može delovati kao modulator koncentracije ciljnog molekula ili funkcije ciljnog molekula u sistemu. "Modulator" može agonizovati (tj., pozitivno regulisati) ili antagonizovati (tj., negativno regulisati) koncentraciju ciljnog molekula u sistemu delimično ili potpuno, utičući na ćelijske funkcije kao što su replikacija DNK i/ili obrada DNK (npr., metilacija DNK ili reparacija DNK), transkripcija RNK i/ili obrada RNK (npr., uklanjanje intronskih sekvenci i/ili translokacija splajsovane iRNK iz nukelusa), proizvodnja polipeptida (npr., translacija polipeptida na osnovu iRNK), i/ili posttranslaciona modifikacija polipeptida (npr., glikozilacija, fosforilacija i proteoliza propolipetida). Modulator može takođe agonizovati ili antagonizovati biološku funkciju ciljnog molekula delimično ili potpuno, pri čemu funkcija može uključivati usvajanje određene strukturne konformacije, interagovanje sa jednim ili više vezujućih partnera, vezivanje sa ligandom, katalizu (npr., fosforilaciju, defosforilaciju, hidrolizu, metilaciju i izomerizaciju) i efekat na ćelijski događaj.

[0119] U jednom primeru izvođenja, kandidatski molekul može biti bilo koje antifibrozno jedinjenje, kako je opisano u ovom tekstu.

[0120] U vezi sa Slikama, određeni primeri izvođenja aparata prema predmetnom pronalasku ilustrovani su na Slici 1, na primer.

[0121] Na Slici 1 ilustrovan je aparat 1 prema određenim primerima izvođenja. Aparat 1 je pogodno aparat sa većim brojem bunarčića, kako je detaljno opisano u ovom tekstu. Ploča sa većim brojem bunarčića 1 uključuje telo držača 10 koje sadrži veći broj komora 12. Telo držača je pravougaonog oblika i ima donju ravnu površinu (nije prikazano).

[0122] U jednom primeru izvođenja, aparat je ploča sa većim brojem bunarčića. Pogodno, aparat sadrži površinu osnove definisanu standardima Udruženja za biomolekularne nauke (npr. Standards ANSI SLAS-1 do 4). Ploča sa većim brojem bunarčića može se izraditi korišćenjem poznatih tehnika uključujući, na primer, brzu izradu prototipa, izlivanje u kalup i slično.

2

[0123] Komore se mogu označiti i kao "bunarčići". U ilustrovanim primerima izvođenja, svaka komora je cilindrična. Drugi oblici komore npr. kockasti, predviđeni su i obuhvaćeni okvirom određenih primera izvođenja pronalaska. Komore mogu biti aranžirane za primanje i/ili uklanjanje medijuma za ćelijsku kulturu. Pored toga, komore mogu biti konfigurisane tako da prime i/ili podupiru umetnuti element, kako je detaljnije opisano u nastavku ovog teksta.

[0124] Svaka komora 12 sadrži donju ravnu osnovu 20, kako je pokazano na Slici 2. Donja ravna osnova u određenim primerima izvođenja može alternativno da se definiše osnovom (nije prikazano) tela držača. Svaka komora uključuje i gornji otvor 14 koji se nalazi na gornjoj površini 18 tela držača. Pogodno, gornji otvor je takve veličine da omogući dodavanje medijuma za ćelijsku kulturu u komoru i/ili uklanjanje medijuma iz nje. Prema tome, zasejavanje ćelija/tkiva, dodavanje sredstva, uklanjanje uzorka, dodavanje i uklanjanje medijuma, mogu se izvoditi preko otvora komore. Dodavanje komponenti može se vršiti pipetom ili robotom, na primer.

[0125] U određenim primerima izvođenja, svaka komora duboka je između oko 15 mm i 20 mm, npr. 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 mm. U određenim primerima izvođenja mogu se koristiti druge dubine.

[0126] Komora 12 sadrži i bočni zid 16 koji se pruža između donje površine i gornjeg otvora. Zidni element ne mora samo definisati delove zida nego i razdvajati najmanje deo komore od najmanje dela susedne komore.

[0127] Zavisno od primene aparata, baza i bočni zidovi svake komore mogu biti sačinjeni od providnog, delimično providnog ili neprovidnog materijala. Pogodni materijali uključuju, na primer, Zeonex™, Zeonor™, polistiren, polikarbonat, polietilen, polipropilen, PMMA, celuloza acetat i staklo.

[0128] Komora može biti obezbeđena u bilo kojoj količini i sa bilo kojom površinom koju zauzima. Pogodno, komore su uniformno aranžirane na telu držača tj. komore su aranžirane u redovima i kolonama. Aparat može biti na primer ploča sa 12 bunarčića, ploča sa 24 bunarčića, ploča sa 48 bunarčića ili ploča sa 96 bunarčića. Telo držača može imati bilo koju veličinu, uključujući, na primer, standardne dimenzije za upotrebu u laboratorijama opremljenim robotima.

[0129] Kako je prikazano na Slici 1, par susednih komora 12a i 12b fluidno je povezan prolaznim putem 22. Prolazni put 22 obezbeđuje put za fluidnu komunikaciju između unutrašnjosti prve komore 12a i unutrašnjosti druge komore 12b. Put za fluidnu komunikaciju je pogodno prolaz i može biti na primer prorez za prolaz kako je pokazano na Slici 1, koji ima

2

visinu i pruža se po gornjoj površini 18 tela držača između dve susedne komore i ravno sa donjim ravnim osnovama respektivnih komora.

[0130] U alternativnom primeru izvođenja, prolazni put 22 može biti prorez za prolaz koji ima visinu koja se pruža samo delom rastojanja između gornje površine tela držača i donjih ravnih baza respektivnih komora.

[0131] U određenim primerima izvođenja, prorez za prolaz je širok približno 2 mm i dug približno 4 mm. U drugim primerima izvođenja, prorez za prolaz je širok približno 2 mm i dug približno 3.5 mm. Predviđene su i druge dimenzije proreza za prolaz.

[0132] U još jednom primeru izvođenja, prolazni put 22 je otvor za prolaz koji se nalazi između bočnog zida 16a prve komore 12a i bočnog zida 16b druge komore 12b. Prolazni otvor može biti obezbeđen na donjem delu respektivnih bočnih zidova.

[0133] Prolazni put treba da bude takve veličine da omogući kretanje tečnosti između respektivnih susednih komora. Ta tečnost uključuje, na primer, tečni medijum za ćelijsku kulturu. Medijum za ćelijsku kulturu može sadržati veći broj komponenti uključujući, na primer, komponente koje ćelije i/ili tkiva sekretuju unutar jedne ili obeju komora. Prema tome, prolazni put omogućava da se između komora aparata sa većim brojem bunarčića vrši razmena medijuma za ćelijsku kulturu i komponenti sadržanih u njemu.

[0134] U ilustrovanom primeru izvođenja, obezbeđen je prolazni put između dve susedne komore. Podrazumeva se da u određenim primerima izvođenja prolazni put može postojati između tri ili više komora. Pogodno, prolazni put sadrži više proreza za prolaz i/ili otvora za prolaz, pri čemu je prvi prorez ili otvor obezbeđen između bočnog zida ili baze prve komore i susedne druge komore, a sledeći prorezi i/ili otvori obezbeđeni su između prve ili druge komore i sledeče susedne komore i opciono između sledečih susednih komora. U takvim primerima izvođenja, prolazni put obezbeđen je između više komora u linearnom neugaonom smeru.

[0135] Telo držača uključuje još i spoljni obodni zid 24. Spoljni obodni zid može uključivati udubljeni deo spoljne ivice 26 koji daje površinu 28. Donja ravna površina tela držača može sadržati udubljeni ivični region (nije prikazano) konfigurisan da leži i da se nalazi na površini 28 udubljenog dela spoljne ivice sledećeg tela držača, tako da tela držača budu smeštena u međusobnom odnosu uklopljenosti. U određenim primerima izvođenja, više tela držača može biti u odnosu vertikalne uklopljenosti.

[0136] U određenim primerima izvođenja, aparat sadrži još i jedan ili više umetnutih elemenata 30 konfigurisanih tako da nose jednu ili više ćelija. U određenim primerima izvođenja, umetnuti element može biti Transwell® koji se može nabaviti od Corning, US.

2

Ćelije mogu biti u vidu dela tkiva, npr. preseka tkiva. Umetnuti element može obezbeđivati 3D ćelijski skafold. Kako je prikazano na Slici 4, umetnuti element 30 ima telo 32 koje je obično cilindričnog oblika. Veličina umetnutog elementa odgovara veličini komore. Umetnuti element sadrži i više prirubnica koje se pružaju radijalno ka spolja 34a, 34b, 34c koje, kada se umetnuti element stavi u komoru, dolaze u kontakt i leže na gornjoj površini tela držača tako da drže umetnuti element unutar komore.

[0137] Pogodno, kada je podržan prirubnicama koje leže na gornjoj površini, umetnuti element je smešten unutar komore tako da ne dodiruje bočni zid ili bazu komore. Kao rezultat, kada se komora ispuni tečnošću npr. medijumom za ćelijsku kulturu, umetnuti element je bar delimično okružen tečnošću. U drugim primerima izvođenja, umetnuti element može biti u kontaktu sa bazom komore, na primer. Umetnuti element može sadržati membranu donje površine 40 sa porama.

[0138] Pogodno, prosečan dijametar pora je između oko 8 μmi oko 150 μm. U jednom primeru izvođenja, prosečan dijametar pora je oko 8 μm. Umetnuti element može biti obložen matriksnim materijalom npr. kolagenom ili slično.

[0139] Prilikom upotrebe, gornja površina tela držača može biti prekrivena zajedničkim uklonjivim poklopcem (nije prikazano). Poklopac može da se ukloni da bi se dodale ili uklonile komponente komora kao što su ćelijski umeci, ćelijski skafoldi, medijum za ćelijsku kulturu i slično.

[0140] Na Slikama 3 i 5, ilustrovan je aparat za ljuljanje 100 prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska.

[0141] Slika 3a prikazuje aparat za obezbeđivanje dvosmernog protoka tečnosti koji uključuje aparat za ljuljanje koji drži aparat sa pločom sa više bunarčića prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska. Kako je pokazano strelicama, razmena medijuma može se vršiti preko pora umetaka u bunarčićima aparata sa pločom. Pored toga, dvosmerna razmena medijuma može se vršiti preko kanala između bunarčića. Presek tkiva u komorama prikazan je na Slici 3a.

[0142] Aparat za ljuljanje može se alternativno označiti kao aparat tipa "klackalice". Šema aparata za ljuljanje 100 prikazana je na Slici 5. Aparat za ljuljanje sadrži nosač tela držača 102 koji direktno ili indirektno nosi telo držača 10. Pogodno, nosač tela držača uključuje fiksirani obrtni element ili uporište koje podupire pomerljivu platformu 104. Platforma 104 uključuje gornju površinu za podupiranje tela držača 10. Platforma i fiksirani obrtni element mogu biti načinjeni od bilo kojeg pogodnog materijala uključujući, na primer, plastiku, metal ili drvo. Platforma uključuje prvi krajnji region 106 i drugi krajnji region 108 udaljen od prvog kraja.

2

[0143] Aparat za ljuljanje 100 može biti konfigurisan da naginje platformu 104 npr. podizanjem i spuštanjem suprotnih krajnjih regiona. Pogodno, platforma 104 preteže nadole jednim od svojih krajnjih regiona npr. težinom obezbeđenom na odgovarajućem krajnjem regionu. Opterećeni kraj preteže nadole u mirujuću poziciju. Pogodno, opterećenje je minimalno, taman dovoljno da pretegne u odnosu na težinu suprotonog završnog regiona.

[0144] Aparat 100 sadrži i pogonski element aranžiran tako da ljulja telo držača na nosaču da bi se na taj način vršilo ponavljano podizanje i spuštanje naspramnih krajeva tela držača. U jednom primeru izvođenja, aparat za ljuljanje sadrži pogonski element sa linearnim pokretačem 110 obezbeđen na prvom krajnjem tegionu 106. U jednom posebnom primeru izvođenja, linearni pokretač je konfigirisan tako da naginje platformu, a time i ploču sa više bunarčića. Pod normalnim uslovima će, dakle, ovaj kraj platforme mirovati u donjem položaju. Pokretač je aranžiran tako da se pomera od baze tako da kada se pokrene podiže taj kraj platforme i spušta suprotni kraj.

[0145] U nekim primerima izvođenja, linearni pokretač sam obezbeđuje težinu za pretezanje i tako se može koristiti za pasivno vraćanje platforme u mirujući položaj, sa prvim krajem 106 u donjem položaju, tako da pogonski element treba aktivno da vrši pokretanje samo u jednom smeru.

[0146] U jednom posebnom primeru izvođenja, linearni pokretač je konfigurisan da naginje platformu, a time i ploču sa više bunarčića, brzinom koja iznosi između oko 10 sekundi i oko 20 minuta npr. oko 2 minuta po jednom pokretu ljuljanja tj. približno dva minuta za pokretanje prvog kraja tela držača iz prve pozicije npr. donje pozicije u drugu poziciju npr. podignutu poziciju.

[0147] Linearni pokretač može koristiti, na primer, energiju baterije ili mrežnu struju.

[0148] Podrazumeva se da Slika 5 predstavlja samo šematski prikaz i da ugao nagiba platforme može biti manji nego što je prikazano na Slici 5. Na primer, ugao nagiba platforme može biti u opsegu od 0 stepeni do oko /-20 stepeni ili manje npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 stepeni.

[0149] Naginjanje aparata za ljuljanje omogućava da tečnost, npr. tečni medijum za ćelijsku kulturu, protiče od prve komore, preko puta za fluidnu komunikaciju, do druge komore i natrag. U određenim primerima izvođenja, npr. kada svaka komora ima bunarčiće dijametra približno 20 mm, ljuljanje tela držača omogućava da tečnost protiče između susednih komora brzinom od oko 15 do oko 20 ml/sekundi preko prolaznog puta. U određenim primerima izvođenja, u svim stadijumima pokreta ljuljanja, ćelijska ili tkivna kultura unutar komore ostaje bar delimično pokrivena medijumom za kulturu ćelija.

2

[0150] Ljuljanje ne samo da dopušta razmenu medijuma između dveju komora nego dopušta i razmenu medijuma preko pora u membrani umetka kulture, koji razdvaja unutrašnji i spoljni bunarčić. Ova druga razmena medijuma stvara protok oko/preko preseka tkiva, koji pomaže pri oksigenaciji i uklanjanju toksičnih metabolita, što će zatim verovatno povećati vijabilnost i funkciju tkiva.

[0151] Ploča sa više bunarčića i aparat za ljuljanje opisani u ovom tekstu mogu se koristiti u različitim metodima obezbeđivanja dinamičnog okruženja za ćelijsku kulturu, koje će vernije predstavljati in vivo uslove i, dakle, bolje podržati rast i održavanje ćelija i/ili tkiva u kulturi.

[0152] Slike 29 i 30 prikazuju aparat 1000 prema određenim primerima izvođenja pronalaska. Aparat 1000 uključuje platformu 1010 konfigurisanu tako da podrži veći broj aparata za kulturu ili ploča sa više bunarčića, opisanih u ovom tekstu. Platforma može sadržati više udubljenih regiona 1020a, 1020b, 1020c koji su odgovarajuće veličine da se u svaki od njih smesti ploča sa više bunarčića. Prisutan je i obodni region 1030 koji se pruža suštinski oko periferije platforme i odvaja svaki udubljeni region. Obodni region sprečava klizanje aparata za kulturu tokom ljuljanja. U nekim primerima izvođenja, više ploča sa većim brojem bunarčića može se naslagati jedna na drugu, kao što je prikazano na Slici 29.

[0153] Aparat 1000 sadrži obrtni element 1040 koji se nalazi na centralnom žlebu 1050 na bazalnom delu 1060 aparata. Linearni pokretač 1070 pokreće platformu gore i dole oko obrtnog elementa 1040 da bi naginjao aparat za kulturu gore i dole, kao što je opisano ranije u ovom tekstu.

[0154] Određeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska u vezi sa metodom kultivisanja ćelija i/ili tkiva, opisani su u nastavku ovog teksta:

Primeri

[0155] Hepatociti često predstavljaju izazov u kultivisanju ćelija, a poznato je da usled odsustva pogodnog mikrookruženja brzo gube fenotipsku ekspresiju in vitro. Sledeći primeri usmereni su na određivanje da li aparat određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska može da se koristi za prevenciju ili odlaganje gubitka fenotipske ekspresije kod hepatocita. Izrazi "CMR", "CMR2" i "CMR ploče za kulturu tkiva" upotrebljeni u ovom tekstu odnose se na aparat sa pločom iz određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska.

Izolacija i kultivisanje tanko isečenih uzoraka

[0156] Tkivo jetre stavi se u posudu prečnika 10 cm, koja sadrži Hanksov puferisani slani rastvor (Hanks buffered saline solution, HBSS+, Lonza, BE10-508F). Uzorci tkiva jetre veličine jezgra četiri do osam mm naprave se korišćenjem Stiefelovog instrumenta za biopsiju. Uzorci se zatim prenesu u metalni kalup i preliju 2.5-3.0% agarozom koja se želatinizuje na niskoj temperaturi (Sigma, A9414) i zatim se stave na led 2-5 minuta.

[0157] Posle toga, uzorci se montiraju na držač kalupa vibratoma i unesu u komoru sa medijumom, u ledeno hladnom HBSS+, pre sečenja na Leica VT1200 S potpuno automatizovanom mikrotomu sa vibrirajućim sečivom. Uzorci tkiva jetre seku se brzinom od 0.3 mm/s, pri amplitudi od 2 mm i debljini (veličini koraka) 250 μm. Mogu se koristiti i preseci debljine 200-400 μm.

[0158] Preseci se prenesu na umetke sa porama veličine 3 μm, 8 μm ili 100 μm koji se nalaze u statičnim (Griener) ili CMR pločama za kulturu tkiva. CMR ploče za kulturu tkiva primera izvođenja pronalaska ili sadrže otvore između susednih bunarčića ili se brzo prototipizuju iz CAD dizajna da sadrže proreze između bunarčića. Bunarčići sadrže medijum za kultivisanje preseka. Preseci se kultivišu pod statičnim, jednosmernim ili ljuljajućim uslovima, na 37 °C, u prisustvu 5% ugljen-dioksida, u humidifikovanom inkubatoru za kulturu tkiva. Korišćene su CMR ploče za kulturu tkiva sa dvanaest ili dvadeset četiri bunarčića, kako je naznačeno.

Medijum za kulturu preseka

[0159] Medijum za kulturu preseka sadrži sledeće komponente:

• Williamsov medijum E (Sigma, W4128)

• 2% toplotom inaktivirani fetalni goveđi serum (Gibco)

• Penicilin-streptomicin (Sigma, P0781)

• L-glutamin (Sigma, G7513)

• Piruvat (Sigma, S8636)

• 0.5 μM mešavine insulin/transferin selen (Gibco51500-056)

• 0.1 μM deksametazona (Sigma, D4902)

Test uree (Universal Biologicals Cambridge)

[0160] 50 μl medijuma za kulturu preseka iz uzoraka u statičnoj ili CMR kulturi upotrebljeno je za kvantifikovanje oslobađanja uree korišćenjem QuantiChromTM Urea Assay Kit (kataloški broj DIUR-500), prema uputstvima proizvođača.

1

Elisa test na albumin (Bethyl laboratories)

[0161] 100 μl medijuma za kultivisanje preseka u razblaženju 1:250 ukloni se iz bunarčića sa presecima na statičnoj ploči za kulturu, jednosmernom sistemu ili CMR aparatu sa pločom za kulturu koja se ljulja korišćenjem aparata za ljuljanje, kako je opisano u ovom tekstu. Medijum se koristi za kvantifikovanje oslobađanja albumina korišćenjem Rat Albumin ELISA Quantitation Set (kataloški broj E110-125) ili Human Albumin ELISA Quantitation Set (kataloški broj E80-129), prema uputstvima proizvođača.

Kit za test citotoksičnosti sa LDH (Cytotoxicity Assay Kit, Pierce)

[0162] 50 μl medijuma ukloni se iz bunarčića koji sadrže preseke, aparata sa statičnom pločom za kulturu ili CMR aparata sa pločom za kulturu koja se ljulja aparatom za ljuljanje kao što je ovde opisano. Medijum se koristi za kvantifikovanje oslobađanja laktat dehidrogenaze (lactate dehydrogenase, LDH) korišćenjem LDH Cytotoxicity Assay Kit (kataloški broj 88953), prema uputstvima proizvođača.

Aspartat aminotransferaza (Aspartate aminotransferase, AST)

[0163] 200 μl medijuma iz statične ili CMR kulture preseka poslato je u Odeljenje za kliničku patologiju, ambulanta Royal Victoria, Newcastle Upon Tyne. AST je merena kliničkim kolorimetrijskim enzimskim testom.

[0164] Rezultati su prikazani na Slikama 6 do 28 i 31 do 32.

[0165] U opisu i patentnim zahtevima ove specifikacije, reči "uključuje" i "sadrži" i njihove varijacije znače "uključuju, ali se ne ograničavaju na" i nisu namenjene isključivanju i ne isključuju druge delove, aditive, komponente, cele brojeve ili korake. U opisu i patentnim zahtevima ove specifikacije, jednina obuhvata i množinu, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije. Posebno, kada se koristi neodređeni član, specifikaciju treba razumeti tako da razmatra i množinu i jedninu, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije.

[0166] Odlike, cele brojeve, karakteristike ili grupe, opisane u vezi sa posebnim aspektom, primerom izvođenja ili primerom pronalaska, treba razumeti tako da se mogu odnositi na neki drugi aspekt, primer izvođenja ili primer opisan u ovom tekstu, ukoliko nije sa njim inkompatibilan. Sve osobine objavljene u ovoj specifikaciji (uključujući sve priložene patentne zahteve, apstrakt i crteže), i/ili svi objavljeni koraci svakog metoda ili procesa, mogu se kombinovati na bilo koji način, osim kombinacija u kojima su bar neke od osobina i/ili koraka uzajamno isključivi. Pronalazak nije ograničen na neki od detalja bilo kojeg od napred

2

navedenih primera izvođenja. Pronalazak se proširuje na svaku novi osobinu ili novu kombinaciju osobina objavljenih u ovoj specifikaciji (uključujući sve proložene patentne zahteve, apstrakt i crteže), ili na svaki novi korak ili novu kombinaciju koraka iz nekog od objavljenih metoda ili procesa.

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Aparat za obezbeđivanje dvosmernog protoka tečnosti, naznačen time, što aparat uključuje:

aparat za kulturu (1) za kultivaciju ćelija i/ili tkiva ili njegovog dela i koji sadrži telo držača (10), telo držača sadrži više komora (12) za medijum za kulturu tkiva i najmanje jedan put za fluidnu komunikaciju (22) koji se pruža između najmanje dve respektivne komore od više komora,

nosač tela držača (102); i

najmanje jedan pogonski element aranžiran da ljulja telo držača poduprto nosačem da bi se time ponavljano podizali i spuštali udaljeni krajevi tela držača, pri čemu je aparat konfigurisan da ponavljano ljulja telo držača; koji se karakteriše time da svaki put za fluidnu komunikaciju dopušta dvosmerni protok tečnosti između pomenute najmanje dve komore, i pri čemu aparat uključuje još i platformu poduprtu nosačem tela držača, pomenuta platforma je konfigurisana tako da zadrži telo držača fiksirano u mestu tokom ljuljanja i, dalje, pri čemu je pogonski element konfigurisan da ljulja telo držača brzinom od približno 1 do 20 minuta po celom pokretu ljuljanja.

2. Aparat prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što svaka komora od pomenutih više komora sadrži bazalni element i najmanje jedan bočni zidni element.

3. Aparat prema patentnom zahtevu 2, naznačen time, što:

(i) put za fluidnu komunikaciju uključuje kanal za prolaz koji se pruža između bazalnog elementa ili bočnog zidnog elementa prve od više komora do bazalnog elementa ili bočnog zidnog elementa sledeće od više komora, (ii) put za fluidnu komunikaciju uključuje otvor za prolaz koji se pruža između bazalnog elementa ili bočnog zidnog elementa prve od više komora do bazalnog elementa ili bočnog zidnog elementa sledeće od više komora; i/ili (iii) prva komora nalazi se pored sledeće komore.

4. Aparat prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što uključuje još i jednu ili više od sledećih odlika:

4

(i) telo držača sadrži više puteva za fluidnu komunikaciju, svaki put za fluidnu komunikaciju pruža se između najmanje dve komore od više komora, opciono pri čemu je svaki put za fluidnu komunikaciju od više puteva za fluidnu komunikaciju suštinski paralelan i na rastojanju od svakog drugog puta za fluidnu komunikaciju;

(ii) svaka komora od više komora sadrži otvor za primanje i/ili uklanjanje medijuma za kulturu tkiva i/ili respektivnog komorskog umetnutog elementa; (iii) svaka komora od više komora konfigurisana je da prihvati komorski umetnuti element konfigurisan da podrži ćelijski skafold, opciono sadrži još i najmanje jedan obično cilindrični komorski umetnuti element koji sadrži više prirubnica koje se pružaju radijalno ka spolja za podupiranje komorskog umetnutog elementa u respektivnoj komori od više komora, opciono pri čemu respektivni komorski umetnuti element sadrži još i ćelijski skafold, opciono pri čemu ćelijski skafold sadrži veći broj pora, pomenuti veći broj pora ima prosečan dijametar između oko 8 μm i oko 150 μm, opciono pri čemu veći broj pora ima prosečan dijametar između oko 8 μm i oko 100 μm;

(iv) telo držača sadrži najmanje dvanaest komora, npr. najmanje dvadeset četiri komore;

(v) aparat za kulturu odvojiv je od nosača tela držača i od najmanje jednog pogonskog elementa;

(vi) telo držača sadrži spoljašnji obodni zidni element, i dalje pri čemu spoljašnji obodni zidni element uključuje ka unutra povučen deo konfigurisan da omogući da se više tela držača naslaže vertikalno, opciono, pri čemu se telo držača sastoji suštinski od više komora, najmanje jednog puta za fluidnu komunikaciju, spoljašnjeg obodnog zidnog elementa, pri čemu je svaka od pomenutih više komora povezana mrežom materijala;

(vii) telo držača sačinjeno je od materijala odabranog između Zeonex™, Zeonor™, polistirena, polikarbonata, polietilena, polipropilena, PMMA, celuloza acetata i stakla;

(viii) svaka respektivna komora od više komora duboka je između oko 16 mm i 19 mm;

(ix) aparat za kulturu uključuje još i poklopac koji se može ukloniti, postavljen preko tela držača, poklopac obezbeđuje suštinski ravan pokrivač koji se pruža preko više komora;

(x) više komora aranžirano je u redovima i kolonama u respektivnom ortogonalnom odnosu u okviru tela držača;

(xi) nosač tela držača sadrži obrtni element oko kojeg se telo držača ljulja; (xii) platforma je konfigurisana da zadrži više tela držača, svaki na fiksiranom položaju tokom ljuljanja;

(xiii) pogonski element sadrži linearni pokretač, opciono pri čemu platforma sadrži prvi krajnji region i sledeći krajnji region udaljen od prvog krajnjeg regiona, i pri čemu je linearni pokretač smešten na prvom krajnjem regionu ili drugom krajnjem regionu; i/ili

(xiv) pri čemu je nosač tela držača sačinjen od materijala koji može da se autoklavira.

5. In vitro metod kultivisanja ćelija i/ili tkiva ili njegovog dela, naznačen time, što uključuje:

a) obezbeđivanje aparata prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva; i b) tokom unapred određenog perioda vremena, primenjivanje pokreta ljuljanja na aparat za kulturu.

6. Metod prema patentnom zahtevu 5, naznačen time, što uključuje još i:

smeštanje najmanje jedne ćelije u najmanje jednu komoru od više komora; opciono pri čemu je najmanje jedna ćelija obezbeđena u ćelijskoj kulturi, opciono, pri čemu je ćelijska kultura poduprta ćelijskim skafoldom, i metod uključuje još i smeštanje ćelijske kulture smeštanjem najmanje jednog komorskog umetnutog elementa u kojem se nalazi ćelijski skafold u pomenutu najmanje jednu komoru tela držača,

opciono pri čemu je pomenuta najmanje jedna ćelija odabrana između eukariotskih ćelija i prokariotskih ćelija, npr. biljnih ćelija, sisarskih ćelija, ćelija kvasca, ćelija gljivica i/ili bakterijskih ćelija,

opciono pri čemu je pomenuta najmanje jedna ćelija sisarska ćelija odabrana između epitelnih ćelija, tumorskih ćelija, hepatocita, fibroblasta, matičnih ćelija, miokardiocita, bubrežnih ćelija, ćelija pluća, nervnih ćelija, adipocita, crevnih ćelija, ćelija kože, imunskih ćelija, bilo samih ili u kombinaciji.

7. Metod prema patentnom zahtevu 5, naznačen time, što predstavlja in vitro metod modelovanja bolesti, metod uključuje:

a) obezbeđivanje aparata prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4;

b) smeštanje dela tkiva, deo tkiva sadrži pomenutu najmanje jednu ćeliju u najmanje jednoj komori od više komora; i

c) tokom unapred određenog perioda vremena, primenjivanje pokreta ljuljanja na aparat za kulturu.

8. Metod prema patentnom zahtevu 7, naznačen time, što uključuje još i:

smeštanje dela tkiva smeštanjem najmanje jednog komorskog umetnutog elementa koji podržava deo tkiva, u pomenutu najmanje jednu komoru tela držača,

opciono pri čemu je deo tkiva poreklom od tkiva koje se bira između pluća, jetre, srca, mozga, pankreasa i opciono pri čemu deo tkiva sadrži više tipova ćelija.

9. Metod prema bilo kojem od patentnih zahteva 5 do 8, naznačen time, što je najmanje jedan komora prva od više komora i dalje pri čemu je prva komora povezana sa najmanje jednom sledećom komorom od više komora putem za fluidnu komunikaciju koji se pruža između njih, put za fluidnu komunikaciju dopušta dvosmerni protok tečnosti između pomenute prve komore i sledeće komore, opciono pri čemu metod uključuje još i:

obezbeđivanje tečnog medijuma za ćelijsku kulturu pomenutoj prvoj i/ili sledećoj komori i;

primenjivanje ljuljajućeg kretanja tokom unapred određenog perioda vremena tako da tečni medijum za ćelijsku kulturu ponavljano protiče od pomenute najmanje jedne komore do sledeće od više komora i ponovo nazad,

opciono pri čemu metod uključuje obezbeđivanje između oko 0.5 i 5 ml tečnog medijuma za ćelijsku kulturu po komori za pomenutu prvu i/ili sledeću komoru od više komora,

opciono pri čemu metod uključuje obezbeđivanje između oko 1.5 i 4 ml tečnog medijuma za ćelijsku kulturu po komori za pomenutu prvu i/ili sledeću komoru od više komora.

10. Metod prema bilo kojem od patentnih zahteva 5 do 9, naznačen time, što uključuje još i smeštanje najmanje jedne ćelije u najmanje dve komore od više komora, pri čemu je najmanje jedna ćelija smeštena u prvoj respektivnoj komori istog ili različitog ćelijskog tipa u odnosu na najmanje jednu ćeliju smeštenu u sledećoj respektivnoj komori, opciono koji uključuje smeštanje dela tkiva koje sadrži najmanje jednu ćeliju u najmanje dve komore od više komora,

opciono koji uključuje obezbeđivanje pogonske sile pogonskom elementu aparata prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4 i ponavljano podizanje i spuštanje udaljenih krajeva tela držača tako da se primeni ljuljajuće kretanje na telo držača, opciono koji uključuje primenu ljuljajućeg kretanja tokom najmanje 24 sata, npr. 48 sati, 72 sata, ili duže,

opciono koji uključuje još i određivanje vijabilnosti ili drugog merljivog parametra najmanje jedne ćelije/ćelija,

opciono pri čemu najmanje jedna ćelija uključuje hepatocit, i dalje, pri čemu korak određivanja ćelijske vijabilnosti ili drugog merljivog parametra uključuje merenje proizvodnje albumina ćelijom/ćelijama, pri čemu je opciono ćelijska kultura predstavljena presekom jetre.

11. Metod prema bilo kojem od patentnih zahteva 5 do 10, naznačen time, što predstavlja metod modelovanja oboljenja jetre,

opciono koji je metod modelovanja bolesti masne jetre i uključuje još i korake: kultivacije preseka jetre sa jednim ili više lipida, u trajanju do oko četiri dana, opciono pri čemu se jedan ili više lipida biraju između palmitinske kiseline, oleinske kiseline i linoleinske kiseline konjugovanih za goveđi serum albumin (BSA) i njihovih kombinacija,

opciono koji uključuje još i korake: kultivisanja preseka jetre sa jednim ili više faktora koji stimulišu fibrozu u trajanju do oko četiri dana, pri čemu se opciono jedan ili više faktora koji stimulišu fibrozu biraju između transformišućeg faktora rasta-β (tgfb), faktora rasta krvnih pločica-bb (pdgf-bb) i njihovih kombinacija,

opciono koji uključuje još i korake: kultivisanja preseka jetre sa jednim ili više medijatora zapaljenja u trajanju do oko četiri dana pri čemu se opciono, medijator zapaljenja bira između molekularnih obrazaca udruženih sa patogenima (PAMP) npr. lipopolisaharid (LPS) ili poli IC i molekularnih obrazaca udruženih sa oštećenjem (damage associated molecular patterns, DAMP), npr. apoptotske ili oštećene ćelije,

opciono koji uključuje još i korake: kultivisanja preseka jetre sa jednim ili više hepatotoksičnih sredstava u trajanju do oko 4 dana, pri čemu se opciono hepatotoksično sredstvo bira između acetaminofena, žučnih kiselina i njihove kombinacije.

12. Metod prema patentnom zahtevu 5, naznačen time, što predstavlja metod in vitro testiranja toksičnosti sredstva za jetru, metod uključuje:

a) obezbeđivanje aparata prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4; b) smeštanje najmanje jednog hepatocita, i ćelijskog skafolda u najmanje jednu komoru od više komora;

c) dodavanje najmanje jednog sredstva koje će se testirati u pomenutu najmanje jednu komoru;

d) tokom unapred određenog perioda vremena, primenjivanje pokreta ljuljanja na aparat za kulturu; i

e) praćenje najmanje jednog efekta sredstva na hepatocitu.

13. Metod prema patentnom zahtevu 12, naznačen time, što je najmanje jedan hepatocit sadržan u preseku jetre, metod uključuje smeštanje preseka jetre u najmanje jednu komoru, i pri čemu opciono presek jetre uključuje još i više ćelijskih tipova, opciono pri čemu praćenje najmanje jednog efekta sredstva uključuje praćenje efekta sredstva na proliferaciju i/ili diferencijaciju i/ili funkciju hepatocita kao meru toksičnosti sredstva,

opciono koji uključuje smeštanje najmanje jedne ćelije i skafolda za ćelijsku kulturu smeštanjem najmanje jednog komorskog umetnutog elementa koji podržava skafold za ćelijsku kulturu koji nosi najmanje jednu ćeliju, u pomenutu najmanje jednu komoru tela držača.

14. Metod prema patentnom zahtevu 12 ili 13, naznačen time, što uključuje još i:

dodavanje tečnog medijuma za kulturu ćelija u pomenutu najmanje jednu komoru od više komora i;

primenjivanje pokreta ljuljanja tokom unapred određenog perioda vremena tako da tečni medijum za kulturu ćelija ponavljano protiče iz pomenute komore u sledeću od više komora i ponovo nazad.

15. Metod prema bilo kojem od patentnih zahteva 12 do 14, naznačen time, što uključuje;

obezbeđivanje pogonske sile pogonskom elementu; i

ponavljano podizanje i spuštanje udaljenih krajeva tela držača tako da se na telo držača primeni ljuljajuće kretanje.

4