RS61108B1 - Jedinjenja 7-feniletilamino-4h-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona kao inhibitori idh1 i idh2 mutanta - Google Patents

Description

Opis

[0001] Protein izocitrat dehidrogenaza (IDH) je važan enzim u ciklusu citratne kiseline (trikarboksilna kiselina ili Krebs). Ciklus citratne kiseline je od ključne važnosti za mnoge biohemijske puteve i jedan je od najranije utvrđenih komponenti ćelijskog metabolizma.

[0002] Izocitrat dehidrogenaze katalizuju oksidativnu dekarboksilaciju izocitrata u αketoglutarat (2-oksoglutarat). Ovi enzimi pripadaju dvema psoebnim subklasama, od kojih jedna koristi nikotinamid adenin dinukleotid (NAD(+)) kao akceptor elektrona a druga nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADP(+)). Tri izocitrat dehidrogenaze su registrovane kod sisara: jedna NAD(+)-zavisna izocitrat dehidrogenaza, multisubjedinica enzima koja se lokalizuje u mitohondrijalnom matriksu i dve NADP(+)-zavisne izocitrat dehidrogenaze, od kojih je jedna mitohondrijalna a druga predominantno citozolna. Svaki NADP(+)-zavisni izoenzim je dimer. Protein enkodiran sa IDH1 genom je NADP(+)-zavisna izocitratna dehidrogenaza nađena u citoplazmi i peroksizomima. Citoplazmatični enzim igra značajnu ulogu u citoplazmatičnoj produkciji NADPH. IDH1 se ekspresuje kod velikog broja vrsta i u organizmima koja nemaju potpun ciklus citratne kiseline.

[0003] U skorije vreme su mutacije u IDH1 i povezanom obliku IDH2 nađene u više vrsta kancera. Nađeno je da se mutacije dešavaju na sekvencama specifičnih amino kiselina duž proteina i ekspresuju se heterozigotno, u skladu sa stvaranjem funkcija. Ove mutacije se dešavaju na funkcionalno očuvanim ostacima a biohemijske studije mutantnih oblika IDH1 i IDH2 pokazuju gubitak normalne funkcije, reverzibilne konverzije izocitrata u α-ketoglutarat. Rezultat ovih mutacija je da se omogući nova (ili neomorfna) konverzija α -ketoglutarata (αKG) u 2-hidroksiglutarat (2HG). Kao rezultat toga, u kancerogenim ćelijama u kojima se sakupljaju mutantni oblici IDH1 ili IDH2 se formiraju značajno veće koncentracije 2HG. Veće vrednosti 2HG dovode do blokiranja diferencijacije ćelija što može da se preokrene inhibicijom mutanta IDH1 ili IDH2.

[0004] Prijava PCT/US2016/043264 orktiva kovalentne inhibitore mutanta IDH1. Prijava PCT/IB2012/055133 takođe otkriva inhibitore mutanta IDH proteina. I dalje postoji potreba za jedinjenjima koja selektivno inhibiraju mutant IDH1 i IDH2 enzim za tretman različitih kancera. Takođe i dalje postoji potreba za jedinjenjima koja selektivno inhibiraju mutant IDH1 i IDH2 enzim ispoljavajući neomorfoličnu aktivnost prema izvornom tipu IDH1 i IDH2 za tretman različitih kancera. Ovaj pronalazak obezbeđuzje jedinjenja Formule I ili Ia koja su inhibitori mutanta IDH1 i IDH2. Jedinjenja Formule I ili Ia su kovalentni inhibitori koji selektivno inhibiraju mutant IDH1 i IDH2.

[0005] Jedan aspekt ovog otkrića je da obezbedi jedinjenja inhibitore mutanta IDH1 i IDH2 enzima Formule:

pri čemu:

R<1>je -CH2CH(CH3)2, -CH2CH3, -CH2CH2OCH3ili -CH2-ciklopropil;

R<2>je -CH3ili -CH2CH3;

X je N ili CH; ili

njihovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0006] Jedan aspekt pronalaska je da obezbedi jedinjenja inhibitore mutanta IDH1 i IDH2 enzima Formule:

pri čemu

R<1>je -CH2CH(CH3)2, -CH2CH3, -CH2CH2OCH3ili -CH2-ciklopropil;

R<2>je -CH3ili -CH2CH3; ili

njihovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0007] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje jedinjenje Formule Ia koje je:

7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-Ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on;

7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on;

1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on, izomer 1;

1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on, izomer 2;

ili farmaceutski prihvatljivu so bilo koga od njih.

[0008] Naredni aspekt pronalaska je jedinjenje Formule Ia, koje je 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0009] Naredni aspekt pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje Formule Ia ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, inhibitor mutanta IDH1 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0010] Naredni aspekt ovog otkrića obezbeđuje postupak za lečenje kancera u kojima se ekspresuje mutant IDH1 ili mutant IDH2 koji je glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforma, astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, fibrosarkom, angioimunoblastična limfoma T ćelija (AITL), mijelodisplastični sindrom (MDS), akutna limfoblastična leukemija B ćelija (B-ALL), tiroidni kancer, kolorektalni kancer, akutna mijeloidna leukemija (AML), melanoma, kancer prostate, hondrosarkom ili holangiokarcinom kod pacijenta, uključujući primenu na pacijentu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine jedinjenja Formule I ili Ia ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0011] Naredni aspekt ovog otkrića obezbeđuje postupak za lečenje kancera u kojima se ekspresuje mutant IDH1 ili mutant IDH2 koji je fibrosarkom, akutna mijeloidna leukemija, glioma ili glioblastoma kod pacijenta, uključujući primenu na pacijentu kome je to potrebno terapeutski efektivne kolčine jedinjenja Formule I ili Ia ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0012] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje jedinjenje Formule Ia ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u terapiji.

[0013] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje jedinjenje Formule Ia ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u tretmanu kancera u kojima se ekspresuje mutant IDH1 ili mutant IDH2 koji je glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforma, astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, fibrosarkom, angioimunoblastična limfoma T ćelija (AITL), mijelodisplastični sindrom (MDS), akutna limfoblastična leukemija B ćelija (B-ALL), tiroidni kancer, kolorektalni kancer, akutna mijeloidna leukemija (AML), melanoma, kancer prostate, hondrosarkom ili holangiokarcinom.

[0014] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje jedinjenje Formule Ia ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u tretmanu kancera u kojima se ekspresuje mutant IDH1 ili mutant IDH2 koji je fibrosarkom, akutna mijeloidna leukemija, glioma ili glioblastoma.

[0015] Naredni aspekt ovog otkrića obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formule I ili Ia ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju medikamenta za tretman kancera u kojima se ekspresuje mutant IDH1 ili mutant IDH2 koji je glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforma, astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, fibrosarkom, angioimunoblastična limfoma T ćelija (AITL), mijelodisplastični sindrom (MDS), akutna limfoblastična leukemija B ćelija (B-ALL), tiroidni kancer, kolorektalni kancer, akutna mijeloidna leukemija (AML), melanoma, kancer prostate, hondrosarkom ili holangiokarcinom.

[0016] Naredni aspekt ovog otkrića obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formule I ili Ia ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman kancera u kojima se ekspresuje mutant IDH1 ili mutant IDH2 koji je fibrosarkom, akutna mijeloidna leukemija, glioma ili glioblastoma.

[0017] Naziv "pacijent" označava sisara a "sisar" uključuje, ali se ne ograničava samo na, ljude.

[0018] "Terapeutski efektivna količina" označava dozu jedinjenja Formule I ili Ia ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, potrebnu da inhibira mutant IDH1 ili mutant IDH2 kod pacijenta sa kancerom, dovodeći do prestanka blokiranja diferencijacije što dovodi do inhibicije rasta ćelija tumora i eliminisanja ili usporavanja ili zaustavljanja progresije kancera kod pacijenta. Predviđene doze jedinjenja Formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli su u rasponu od 1 mg/pacijent/dan do 2000 mg/pacijent/dan. Preferirane predviđene doze su u rasponu od 5 mg/pacijent/dan do 1800 mg/pacijent/dan. Najveću prednost imaju predviđene doze u rasponu od 40 mg/pacijent/dan do 1600 mg/pacijent/dan. Tačno potrebnu dozu za lečenje pacijenta i dužinu trajanja tretmana će da odredi lekar u zavisnosti od stanja i težine bolesti kao i od specifičnih potreba i odgovora pojedinačnog pacijenta. Mada su doze prikazane kao dnevna potreba, primena doza može da se podesi tako da se dobije mnogo optimalnija korist za pacijenta i da se kontroliše ili poboljša bilo koja toksičnost povezana sa lekom. Pored dnevnog doziranja, može da se prihvati doziranje dva puta dnevno (B.I.D.); doziranje tri puta dnevno (T.I.D.); doziranje svaki drugi dan (Q2D); svaki drugi dan u periodu od pet dana a nakon toga dva dana bez doziranja (T.I.W.); ili svaki treći dan (Q3D).

[0019] Nazivi "tretman," "lečiti" i "lečenje," označavaju potpuni spektar intervencija za kancer od koga je pacijent oboleo, kao što je primena aktivnog jedinjenja za ublažvanja, usporavanje ili preobražaj jednog ili više simptoma i usporavanje progresije kancera čak i ukoliko kancer nije potpuno eliminisan.

[0020] Naziv -CH2CH(CH3)2označava 2-metilpropil, naziv -CH2CH2OCH3označava 2-metoksietil i naziv -CH2-ciklopropil označava ciklopropilmetil grupu.

[0021] Jedinjenje Formule I ili Ia ili njegova farmaceutski prihvatljiva so je prvenstveno formulisana kao farmaceutska kompozicija upotrebom farmaceutski prihvatljivog nosača i primenjuje se različitim načinima. Preferirano, ovakve kompozicije su za oralnu primenu. Ovakve farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. Videti, na primer, REMINGTON: SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, L.V. Allen, Editor, 22nd Edition, Pharmaceutical Press, 2012.

[0022] U posebnom ostvarenju, farmaceutska kompozicija uključuje 7-{[(1S)-1-{4-[(1S)-1-(4-akriloilpiperazin-1-il)-2-ciklopropiletil]fenil}etil]amino}-1-etil-1,4-dihidro-2Hpirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i opciono drugim terapeutskim sastojcima, posebno za opšti tretman kancera ili tretman specifičnog tipa kancera.

[0023] Jedinjenje Formule I ili Ia ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, može da se primeni ili istovremeno sa ili pre ili nakon, jednog ili više drugih terapeutskih sredstava. Jedinjenje Formule I ili Ia ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kada se primenjuju sa jednim ili više drugih terapeutskih sredstava, može da se primeni odvojeno, istim ili različitim načinom primene ili zajedno u istoj farmaceutskoj kompoziciji kao drugo terapeutsko sredstvo(a). Kada se primenjuje jedno ili više dodatnih terapeutskih sredstava, primena svakog terapeutskog sredstva može da bude istovremena, odvojena ili po redu.

[0024] Jedinjenje Formule I ili Ia je sposobno da reaguje sa brojnim neorganskim i organskim kiselinama da formira farmaceutski prihvatljive soli nastale dodatkom kiseline. Ovakve farmaceutski prihvatljive soli i uobičajena metodologija za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. Videti , na primer, P. Stahl, i saradnici,, HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, i saradnici,, "Pharmaceutical Salts, "Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.66, No.1, January 1977.

[0025] Jedinjenje Formule I ili Ia ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, može da se izradi različitim procedurama poznatim u tehnici, kao što su one koje su niže opisane. Specifične faze sinteze za izradu jedinjenja Formule I ili Ia ili njegove farmaceutski prihvatljive soli mogu da se kombinuju po različitom redosledu.

[0026] Pored toga, neki međuproizvodi opisani u niže datim izradama mogu da sadrže jednu ili više zaštitnih grupa azota. Jasno je da zaštitne grupe mogu da budu različite po proceni stručnjaka sa iskustvom u tehnici u zavisnosti od određenih uslova reakcije i određenih transformacija koje se vrše. Uslovi zaštite i deprotekcije su dobro poznati stručnjaku sa iskustvom i opisani su u literaturi (videti na primer "Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis", Fifth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley i Sons, Inc. 2014).

[0027] Jedinjenja Formule I ili Ia imaju nazive u skladu sa IUPAC i mogu takođe da se označe u skladu sa CAS, a i drugi nazivi mogu da se koriste za nedvosmislenu identifikaciju jedinjenja Formule I ili Ia ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0028] Razumljivo je da jedinjenje Formule I ili Ia može da se opiše kao pojedinačni stereoizomer. Postoje dva asimetrična centra što omogućava postojanje četiri diastereomera.

Kako se ovde koristi, reference za pojedinačni stereoizomer treba takođe da obuhvate stereoizomerne smeše uključujući navedeno ili opisano jedinjenje Formule I ili Ia. U ovoj prijavi, mogu da se koriste Cahn-Ingold-Prelog označavanja (R)- i (S)- da označe specifične stereoizomere. Specifični stereoizomeri mogu da se izrade stereospecifičnim sintezama koristeći enantiomerno čiste ili obogaćene početne materijale. Specifični stereoizomeri ili početni materijali, međuproizvodi ili racematne smeše koje uključuju jedinjenja Formule I ili Ia mogu da se razdvoje tehnikama dobro poznatim u tehnici kao što je dato u Stereochemistry of organic Compounds, E. I. Eliel and S. H. Wilen (Wiley 1994) i Enantiomers, Racemates and Resolutions, J., Jacques, A. Collet and S. H. Wilen (Wiley 1991), uključujući hromatografiju na asimetričnoj stacionarnoj fazi, enzimatičku rezoluciju ili frakcionu kristalizaciju ili hromatografiju diastereomera formiranih u tu svrhu, kao što su diastereomerne soli. Za jedinjenja Formule I ili Ia koja imaju konfiguraciju sa svim pokazanim stereocentrima, "skoro potpuno enantiomerno čist" označava da je izomerna čistoća veća od 90% enantiomernog viška. U narednom ostvarenju jedinjenja Formule I ili Ia, izomerna čistoća je veća od 95% enantiomernog viška. U još jednom ostvarenju jedinjenja Formule I ili Ia, izomerna čistoća je veća od 98% enantiomernog viška. U još jednom ostvarenju jedinjenja Formule I ili Ia, izomerna čistoća je veća od 99% enantiomernog viška. Svi stereoizomeri, pojedinačno i uključujući diastereomerne smeše jedinjenja Formule I ili Ia su razmatrani u okviru ovog pronalaska. Oznake "izomer 1" i "izomer 2" i "diastereomer 1" i "diastereomer 2" se odnose na jedinjenja koja eluiraju kao prvo i drugo pri asimetričnoj hromatografiji, tim redom a ukoliko je asimetrična hromatografija započeta ranije u procesu sinteze, ista oznaka se odnosi na naredne Međuproizvode i Primere.

[0029] Jedinjenja korišćena kao inicijalni početni materijali u sintezama jedinjenja Formule I ili Ia su dobro poznata i ukoliko nisu raspoloživa na tržištu, lako se sintetišu po obezbeđenim specifičnim referencama, po standardnim procedurama koje obično koristi stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici ili se nalaze u tekstovima opštih referenci.

[0030] Primeri poznatih procedura i postupaka uključuju one opisane u tekstovima opšte reference kao što su Comprehensive organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of organic Synthetic Methods, Volumes 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced organic Chemistry, Reactions Mechanisms and Structure, 5th Edition, Michael B. Smith and Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced organic Chemistry, 4th Edition, Part B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer Academic / Plenum Publishers, 2000, itd. i ovde navedeni kao reference.

[0031] Neke skraćenice su definisane na sledeći način: "ACN" označava acetonitril; " αKG" označava Alfa-ketoglutarat ili 2-ketoglutarat; "alloc" označava aliloksikarbonil; "ATCC" označava American Tip Culture collection; "BCA" označava bicinhoninsku kiselinu; "BSA" označava albumin seruma govečeta; "CDI" označava 1,1’-karbonildiimidazol; "DCC" označava 1,3-dicikloheksilkarbodiimid; "DCM" označava dihlormetan; "DEAD" označava dietil azodikarboksilat; "DIAD" označava diizopropil azodikarboksilat; "DIC" označava diizopropilkarbodiimid; "DIPEA" označava diizopropiletilamin ili N-etil-N- izopropil-propan-2-amin; "DMAP" označava dimetilaminopiridin; "DMF" označava dimetilformamid;

"DMSO" označava dimetil sulfoksid; "DTT" označava ditiotreitol; "EDC" označava EDAC, EDCI ili 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid; "EDTA" označava etilendiamintetrasirćetnu kiselinu; "EGTA" označava etilen glikol tetrasirćetnu kiselinu;

"EtOAc" označava etil acetat; "EtOH" označava etanol ili etil alkohol; "Ex" označava Primer; "HATU" označava (dimetilamino)-N,N-dimetil(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-iloksi)metaniminijum heksafluorofosfat; "HBTU" označava 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat; "2HG" označava 2-hidroksiglutarat; " d5-3HG" označava 3-hidroksi-1,5-pentandioatnu-2,2,3,4,4-d5kiselinu; "HILIC" označava hidrofilnu interakciju tečne hromatografije; "HOAt" označava 1-hidroksi-7-azobenzotriazol; "HOBt" označava 1-hidroksilbenzotriazol hidrat; "HPLC’ označava visoko efikasnu tečnu hromatografiju; "IC50" označava koncentraciju sredstva koja produkuje 50% maksimalnog mogućeg inhibitornog odgovora za to sredstvo; "mCPBA" označava meta-hloroperbenzoevu kiselinu; "MeOH" označava metanol ili metil alkohol; "NADP<+>i NADPH" označava oksidovane ili redukovane oblike nikotinamid adenin dinukleotid fosfata tim redom; "NMP" označava N-metil-2-pirolidon; "PG" označava zaštitnu grupu; "Prep" označava izradu;

"PyBOP" označava benzotriazol-1-iloksitripirolidino-fosfonijum heksafluorofosfat; "PyBrop" označava bromo-tris-pirolidino fosfonijumheksafluoro fosfat; "rpm" označava obrtaje po minutu; "(R)-RUCY®- XylBINAP" označava RuCl[(R)-daipena][(R)-ksilbinap; "SNAr" označava nukleofilnu aromatičnu supstituciju; "TEA" označava trietilamin; "TFA" označava trifluorosirćetnu kiselinu; "THF" označava tetrahidrofuran; i "Tris" označava tris(hidroksimetil)aminometan.

[0032] Jedinjenja Formule I ili Ia ili njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da se izrade različitim procedurama poznatim u tehnici, od kojih su neke ilustrovane u niže datim Šemama, Izradama i Primerima. Specifične faze sinteze za svaki od opisanih načina mogu da se kombinuju na različite načine ili zajedno sa fazama iz različitih šema da se izrade jedinjenja Formule I ili Ia ili njihove farmaceutski prihvatljive soli. Produkti svake faze u niže datim šemama mogu da se obnove uobičajenim postupcima dobro poznatim u tehnici, uključujući ekstrakciju, evaporaciju, precipitaciju, hromatografiju, filtraciju, trituraciju i kristalizaciju. U niže datim šemama, svi supstituenti, ukoliko nije drugačije navedeno, su kako je prethodno definisano. Reagense i početne materijale stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici može lako da nabavi.

Šema 1

Oksi

[0033] U Šemi 1, serije reakcija dovode do 1-supstituisanog-7-(metilsulfonil)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5- d][1,3]oksazin-2-ona, (4), produkta iz Faze C gde je R<2>kako je prethodno definisano. "PG" je zaštitna grupa uvedena za amino grupu ili okso grupu kao što je za karbamate, amide ili estre. Na primer, 5-hidroksi metil 4-amino- 2-metilsulfanil-pirimidin može da se ciklizuje pod standardnim uslovima karbamoilacije u oksazin-2-on upotrebom trifozgena i organske baze kao što su DIPEA ili TEA, na temperaturi od približno -30 do -35 °C da se dobije Jedinjenje (2), produkt iz Faze A. Alternativno, dihalid karbonil ili dipseudohalid karbonil kao što su CDI, fozgen ili difozgen, mogu da se koriste umesto trifozgena da se završi proces karbomoilacije. Amin oksazina može da se alkiluje sa odgovarajuće supstituisanim alkil halidom kao što je jod reagens u rastvaraču kao što je NMP i organskoj bazi kao što je K2CO3, na temperaturi od približno 50-65 °C da se dobije Jedinjenje (3), produkt iz Faze B. Alternativno, može da se izvrši Mitsunobu reakcija da se alkiluje amin oksazina upotrebom odgovarajućeg alkohola kao što je MeOH. Mitsunobu reakcije su dobro poznate u tehnici i njima može da se konvertuje hidroksilna grupa u odlazeću grupu koja je zamenjena različitim tipovima nukleofila kao što je karbamat, koristeći

1

trifenilfosfin i azodikarboksilat, kao što su DIAD ili DEAD, u rastvaraču kao što je THF, da se dobije Jedinjenje (3). Sulfid može da se oksiduje u sulfon pod uslovima dobro poznatim u tehnici kao što su mCPBA ili kalijum peroksimonosulfat, na temperaturi od približno 10 do 25 °C, u rastvaraču kao što su ACN ili DCM, da se dobije Jedinjenje (4), produkt Faze C.

Šema 2

1. Protekcija

2. Karbonilacija

Faza D

a

va Faza I Hlorinacija

Hlorinacija

Faza H

1. Protekcija

Faza J 2. Alkilacija

3. Deprotekcija

[0034] U Šemi 2, (4-(1-aminoetil)fenil)metanol (7) može da se generiše preko nekoliko faza od aril halida kao što je bromid (5) koristeći procedure dobro poznate stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Amin može da se zaštiti u podfazi 1, Faza D, gde je "PG" zaštitna grupa uvedena za amino grupu kao što je amid. Zaštićeni aril bromid (5) može da se konvertuje u keton pod uslovima litijum karbonilacije da se dobije aril keton (6) u podfazi 2, Faza D. Keton može nakon toga da se redukuje pomoću redukcionog sredstva kao što je natrijum borohidrid, u rastvaraču kao što je MeOH, u podfazi 1, Faza E. Amin može da se deprotektuje u ovoj Fazi (podfaza 2, Faza E) ili u kasnijoj tački sinteze da se dobije Jedinjenje (7). Alternativno, Jedinjenje (6) može direktno da se konvertuje u Jedinjenje (12) reduktivnom aminacijom koristeći titanijum(IV) izopropoksid, u rastvaraču kao što je THF i uz zagrevanje do približno 60 °C a nakon toga hlađenjem i dodavanjem MeOH i redukcionog sredstva kao što je natrijum cijanoborohidrid, da se dobije Jedinjenje (12). Jedinjenje (7) može da se konvertuje u benzil halid kao što je hlorid pod standardnim uslovima halogenacije, upotrebom sredstva za halogenaciju kao što su tionil hlorid ili POCl3, u rastvaraču kao što je DCM, da se dobije jedinjenje (10), Faza I. Jedinjenje (10) može da se zaštiti ukoliko je potrebno i alkiluje u Fazi J. Na primer, amin (10) može da se zaštiti u podfazi 1 Faze J koristeći zaštitnu grupu kao što su trifluoroacetil ili CBZ. Ovakve zaštitne grupe su dobro poznate i primenljive u tehnici. Alternativno, Jedinjenje 10 može da se izradi od aldehida, Jedinjenje (8). Jedinjenje (8) može da se izradi oksidacijom odgovarajućeg benzil alkohola pod takvim uslovima kao što je Dess-Martin perjodinan, u rastvaraču kao što je DCM, da se dobije aldehid (8). Grignard-ova reakcija može da se izvrši u Fazi G na aldehidu da se dobije Jedinjenje (7). Jedinjenje (7) iz Faze G može da se hlorinuje u Fazi H da se dobije Jedinjenje (10) kako je prethodno diskutovano za Fazu 1. Hlorid Jedinjenja (10) može u dve faze da se zameni sa monozaštićenim piperazinom, u toku jedne procedure. Nije uvek neophodno da se zaštiti amin, ali ukoliko je izabrana zaštita, prednost je da se koristi različita zaštitna grupa na 1-feniletilaminu umesto piperazin amin produkta (11), Faza J, podfaza 1, za selektivnu deprotekciju jedne ili druge PG u željenoj Fazi. Na primer, 1-feniletilamin može da reaguje sa trifluorosirćetnim anhidridom upotrebom organske baze kao što je TEA, u rastvaraču kao što je DCM, na temperaturi od približno 0-5 °C, da se dobije zaštićeni amin produkt podfaze 1, Faza J.

Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da razume da na aminu mogu da se koriste druge zaštitne grupe kao što je CBZ. Zamena hlorida može nakon toga da se izvrši pod uslovima dobro poznatim stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Na primer, halid može da se zameni zaštićenim ili nezaštićenim piperazinom upotrebom neorganske baze kao što je K2CO3i koristeći KI ili NaI kao nukleofilni katalizator za ubrzanje reakcije. Smeša može da se zagreje na približno 60-80 °C u rastvaraču kao što je ACN da se dobije zaštićeno Jedinjenje (11) podfaze 2, Faza J. Zaštitna grupa na 1-feniletilaminu može da se ukloni sa bazom kao što je vodeni rastvor kalijum hidroksida da se dobije Jedinjenje (11) podfaze 3, Faza J.

Šema 3

a

[0035] U Šemi 3, Jedinjenje (11) može da reaguje sa Jedinjenjem (4), Šema 1, u SNAr reakciji koristeći organsku bazu kao što su DIPEA, CsF za ubrzanje reakcije, rastvarač kao što je DMSO i temperaturu od približno 70-80 °C da se dobije produkt Faze L. U Fazi M, podfaza 1, terc-butoksi zaštićeni piperazin može da se deprotektuje upotrebom kiseline kao što je HCl u dioksanu i MeOH ili TFA u DCM pri čemu ovako zaštićeni piperazin može da se deprotektuje u prisustvu izvora paladijuma kao što je katalitički tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) u rastvaraču kao što je THF koristeći blagi nukleofil kao što je dimedon da se dobije deprotektovani piperazin podfaze 1, Faze M. U podfazi 2, Faza M, piperazin može da se amiduje sa akriloil hloridom na temperaturi od približno -50 do -78 °C sa ili bez organske baze kao što je TEA ukoliko je amin so kiseline, u rastvaraču kao što je DCM da se dobiju jedinjenja Formule Ia. Alternativno, udvajanje amida može da se izvede sa akrilnom kiselinom i odgovarajućim aminom u rastvaraču kao što je DMF sa reagensom za udvajanje kao što je EDC i aditivom kao što je HOBt. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da prepozna da postoji veliki broj postupaka i reagenasa za formiranje amida nastalih iz reakcije karboksilnih kiselina i amina. Na primer, reakcijom odgovarajućeg amina i akrilne kiseline u prisustvu reagensa za udvajanje sa ili bez organske baze kao što su DIPEA ili TEA može da se dobije jedinjenje Formule Ia. U druge reagense za udvajanje spadaju karbodiimidi, kao što su DCC, DIC ili karbonildiimidazol kao što je CDI. Drugi aditivi za udvajanje amida, kao što je HOAt mogu takođe da se koriste za pojačavanje reakcije. Pored toga, uronijum ili fosfonijum soli ne-nukleofilnih anjona, kao što su HBTU, HATU, PyBOP i PyBrOP, mogu da

1

se koriste umesto mnogo češće korišćenih reagenasa za udvajanje. Aditiv kao što je DMAP može da se koristi za ubrzanje željene reakcije amidacije.

Šema 4

Hlorinacija Faza O

Faza Q 1. Deprotecija

2. Amidacija

[0036] Alternativno, u Šemi 4, amin deprotektovanog produkta Jedinjenja (7), Šema 2 može da reaguje sa Jedinjenjem (4) kako je opisano u Šemi 3, Faza L u SNAr alkilaciji da se dobije Jedinjenje 13. Hidroksil može da se hlorinuje kako je opisano u Fazi I, Šeme 2 da se dobije Jedinjenje 14, Faza O. Hlor u Jedinjenju (14) može da se zameni alkilacijom sa piperazinom kako je opisano u Šema 2, Faza 11, podfaza 2, da se dobije Jedinjenje (5). Zaštićeni piperazin može da se deprotektuje a piperazin nakon toga amiduje kako je opisano u Šemi 3, Faza M da se dobiju jedinjenja Formule Ia.

Šema 5

1. Protekcija

2. Karbonilacija

Faza D

PG = zaštitna grupa

1.

2.

<Faza I> Hlorinacija

1. Alkilacija

Faza J (PG-piperazin)

2- Deprotekcija

[0037] U Šemi 5, asimetrični (4-(1-aminoetil)fenil)metanol (7a) može da se generiše preko nekoliko faza od asimetričnog alil halida kao što je bromid (5a) po procedurama dobro poznatim stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Amin može da se zaštiti u podfazi 1, Faza D, gde je "PG" zaštitna grupa dobijena od amino grupe kao što je amid. Aril bromid (5a) može da se konvertuje u keton pod uslovima karbonilacije litijuma da se dobije aril keton (6a) u podfazi 2, Faza D. Nakon toga, keton može asimetrično da se redukuje pomoću asimetričnog

1

redukcionog sredstva kao što je (R)-RUCY-XylBINAP, u rastvaraču kao što je EtOH, da se dobije jedinjenje 7a u podfazi 1, Faza E. Jedinjenje (7a) može da se konvertuje u asimetrični benzil halid kao što je hlorid, pod standardnim uslovima halogenacije upotrebom sredstva za halogenaciju kao što je benzoil hlorid u rastvaraču kao što je t-butil etar da se dobije jedinjenje (10a), Faza I. Jedinjenje (10a) prvo reaguje sa zaštićenim piperazinom (PG-piperazin) u prisustvu baze kao što je natrijum bikarbonat, u rastvaraču kao što je acetonitril, da se dobije zaštićeni oblik u podfazi 1, Faza J. Zaštićeni oblik se nakon toga deprotektuje sa bazom kao što je vodeni rastvor kalijum hidroksida u rastvaraču kao što je EtOH da se dobije jedinjenje (11a), podfaza 2, Faza J.

Šema 6

[0038] U Šemi 6, serija reakcija dovodi do 1-supstituisanog-7-hloro-4H-pirido[4,3-d][1,3]oksazin-2-ona (18), produkta Faze C gde je R<2>kako je prethodno definisano. Na primer, etil 4,6-dihloropiridin-3-karboksilat (15) može da reaguje sa aminom pod standardnim uslovima u rastvaraču kao što je acetonitril da se dobije 6-hloro-4-(amino)piridin-3-karboksilat (16). Redukcijom estarske grupe u Jedinjenju (16) pomoću hidrid reagensa kao što je litijum aluminijum hidrid, u rastvaraču kao što je THF, dobija se (4-amino-6-hloro-3-piridil)metanol (17). Jedinjenje kao što je 17 može da se ciklizuje pod standardnim uslovima karbamoilacije u oksazin-2-on upotrebom trifozgena i organske baze kao što su DIPEA ili TEA na temperaturi od približno -20 °C, da se dobije Jedinjenje (18), produkt Faze C.

Alternativno, dihalid karbonil ili di-pseudohalid karbonil kao što su CDI, fozgen ili difozgen mogu da se koriste umesto trifozgena za završetak karbamoilacije. Jedinjenje 11, izrađeno kako je prethodno pokazano u Šemama 2 ili 5 ili kako je opisano u alternativama za druge Šeme, može da reaguje sa Jedinjenjem 18 pod standardnim uslovima alkilacije. Dobijeno međuproizvod jedinjenje se nakon toga deprotektuje i amiduje kako je prethodno opisano u Šemama 3 ili 4, da se dobiju jedinjenja Formule I gde je X CH grupa.

[0039] U opcionoj Fazi, farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja Formule I ili Ia može da se formira reakcijom odgovarajuće slobodne baze Formule I ili Ia sa odgovarajućom

1

farmaceutski prihvatljivom kiselinom, u pogodnom rastvaraču pod standardnim uslovima. Pored toga, formiranje ovakvih soli može da se izvede istovremeno nakon deprotekcije zaštitne grupe azota. Formiranje ovakvih soli je dobro poznato i primenjuje se u tehnici. Videti, na primer, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., i saradnici, "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); i Berge, S.M., i saradnici,, "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Stručnjak sa iskustvom u tehnici će znati da se jedinjenje Formule I ili Ia lako konvertuje u i može lako da se izdvoji kao farmaceutski prihvatljiva so.

Izrada 1

7-Metilsulfanil-1,4-dihidropirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on

[0040]

[0041] Trifozgen (859 g, 2.9 mol) se na -30 °C 15 minuta dodaje u rastvor (4-amino-2-metilsulfanil-pirimidin-5-il)metanola (900 g, 5.26 mol) u THF (22.5 L). DIPEA (2.449 g, 18.92 mol) se dodaje u toku 1 sat, održavajući temperaturu reakcije između -35 i -30 °C. Reaktivna smeša se nakon toga sipa preko ledene vode (30 L) i doda se 2-metiltetrahidrofuran (10 L). Organska faza se ispere sa vodom i slanim rastvorom. Organska faza se suši preko Na2SO4i koncentruje do sušenja. Sirovi produkt se suspenduje u smeši petrol etar / EtOAc (1:1), filtrira i koncentruje da se dobije žuta čvrsta supstanca koja se dalje koristii bez naknadnog prečišćavanja (890.5 g, 1.62 mol, 83% čistoće, 86% prinos). MS (m/z): 198 (M+H).

Izrada 2

1-etil-7-(metiltio)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on

1

[0043] U rastvor 7-metilsulfanil-1,4-dihidropirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona (280 g, 1.42 mol) u NMP (2.24 L) se na sobnoj temperaturi dodaju K2CO3(294.2 g, 2.13 mol) i etil jodid (336.3 g, 1.99 mol). Smeša se meša 16 sati na 50 °C i nakon toga razblaži sa DCM (3 L) i vodom (6 L). Organska faza se izdvoji i ispere sa vodom i slanim rastvorom i koncentruje do sušenja da se dobije sirovo naslovljeno jedinjenje (286 g, 1.27 mol, 83% čistoće, 91% prinos). MS (m/z): 226 (M+H).

Izrada 3

1-Metil-7-metilsulfanil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on

[0044]

[0045] U rastvor trifenilfosfina (1.61 g, 6.08 mmol) i 7-metilsulfanil-1,4-dihidropirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona (1.00 g, 5.07 mmol) u THF (25 mL) se doda MeOH (0.248 mL, 6.08 mmol) a nakon toga se u kapima na temperaturi sredine doda DIAD (1.21 mL, 6.08 mmol). Nakon mešanja u toku noći, rastvarač se ukloni pod vakuumom i dobijeno žuto ulje se prečisti hromatografijom na silika gelu (40-50% EtOAc/heksani) da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (1.08 g, 5.11 mmol, kvantitativno). MS (m/z): 212 (M+H).

Izrada 4

1-etil-7-(metilsulfonil)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on

1

[0047] U izmešani rastvor 1-etil-7-(metiltio)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona (286 g, 1.24 mol) u ACN (2.8 L) i vodi (1.4 L) se 20 minuta dodaje kalijum peroksimonosulfat (1526 g, 2.48 mol) kao čvrsta supstanca i dobijena smeša se meša 16 sati na 10-20 °C. Reaktivna smeša se filtrira i dobijena filter pogača se ispere sa DCM.

Kombinovani filtrat i DCM se isperu sa 5% Na2SO3, vodom i slanim rastvorom. Organska faza se suši preko Na2SO4i koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje (133.8 g, 93% čistoće, 41% prinos). MS (m/z): 258 (M+H).

[0048] Naredno jedinjenje se u osnovi izrađuje po postupku za Izradu 4.

Izrada 6

N-[(1S)-1-(4-Bromofenil)etil]-2,2,2-trifluoro-acetamid

[0049]

[0050] Trifluorosirćetni anhidrid (165 mL, 1.17 mol) se u kapima na 5 °C doda u rastvor (1S)-1-(4-bromofenil)etanamina (213 g, 1.06 mol) u ACN (1.3 L) a nakon toga se u kapima 1 sat dodaje TEA (326 mL, 2.34 mol). Posle 30 minuta, dodaju se voda (3 L) i slani rastvor (1 L)

1

što za rezultat ima formiranje bezbojnog precipitata. Suspenzija se meša 15 minuta a čvrsta supstanca se nakon toga filtrira, ispere sa vodom i heksanima i suši u struji vazduha i zatim suši na 40 °C pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (290 g, 92%).<1>H NMR (d6-DMSO) δ 1.44 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 4.98 (dddd, 1H, J= 7.6, 7.1, 7.1, 7.1 Hz), 7.30 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.55 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.91 (d, 1H, J = 7.6 Hz).

Izrada 7

N-[(1S)-1-[4-(2-Ciklopropilacetil)fenil]etil]-2,2,2-trifluoro-acetamid

[0051]

[0052] n-Butil litijum (2.5 M rastvor u heksanima, 53 mL, 130 mmol) se u kapima na -78 °C doda u rastvor N-[(1S)-1-(4-bromofenil)etil]-2,2,2-trifluoro-acetamida (18.00 g, 60.79 mmol) u THF (600 mL) tako da se unutrašnja temperatura održava ispod -70 °C. Po završenom dodavanju, smeša se meša 45 minuta na -78 °C a nakon toga se doda 2- ciklopropil-N-metoksi-N-metil-acetamid (11.4 g, 79.6 mmol) kao rastvor u THF (10 mL). Smeša se meša 45 minuta na -78 °C, doda se zasićeni vodeni rastvor amonijum hlorida i smeša se zagreje na sobnu temperaturu. Slojevi se razdvoje i organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. U čvrstu supstancu se doda mala količina DCM i smeša se kratko zagreva da se rastvore čvrste supstance. Smeša se koncentruje neposredno pre precipitacije a nakon toga se u kapima dodaju heksani (150 mL) uz energično mešanje da se dobije bezbojna čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem, ispere sa malom količinom heksana i suši pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (13.82 g, 76%) kao bezbojna čvrsta supstanca. MS (m/z): 298.3 (M-H).

[0053] Naredno jedinjenje se u osnovi izrađuje po postupku za Izradu 7.

2

Tabela 2

Izrada 9

1-[4-[(1S)-1-Aminoetil]fenil]-2-ciklopropil-etanol

[0054]

[0055] Natrijum borohidrid (0.1411 g, 2 equiv., 3.729 mmol,) se doda u rastvor N-[(1S)-1-[4-(2-ciklopropilacetil)fenil]etil]-2,2,2-trifluoroacetamida (558 mg, 1.86 mmol) u MeOH (15 mL) ohlađenom u kupatilu sa ledenom vodom. Smeša se meša približno 2.5 sata a nakon toga se doda kalijum hidroksid (800 mg, 14.2 mmol) u vodi (3 mL). Smeša se meša na sobnoj temperaturi približno 20 sati. Smeša se koncentruje i podeli između DCM i vode. Organski sloj se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida, suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje (354 mg, 1.38 mmol, 74%) kao bela čvrsta supstanca. Materijal se koristi bez daljeg prečišćavanja. ES/MS (m/z): 189.0 (M-OH).

Izrada 10

2,2,2-Trifluoro-N-[(1S)-1-(4-formilfenil)etil]acetamid

[0057] Dess-Martin perjodinan (20.9 g, 49.3 mmol) se na 0 °C doda u rastvor 2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(hidroksimetil)fenil]etil]acetamida (11.1 g, 44.9 mmol) u DCM (450 mL).

Reaktivna smeša se meša u toku noći i ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu. Reaktivna smeša se razblaži sa dodatnom količinom DCM i ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3, zasićenim vodenim rastvorom Na2S2O3i slanim rastvorom. Kombinovane organske supstance se suše (Na2SO4), filtriraju i koncentruju da se dobije ostatak koji se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa gradijentom 0-50% EtOAc/heksani da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (9.5 g, 39 mmol, 86%). ES/MS (m/z): 244 (M-H).

Izrada 10a

2,2,2-Trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(hidroksimetil)fenil]etil]acetamid

[0058]

[0059] Trifluorosirćetni anhidrid (12 mL, 85.4 mmol) se na 0 °C doda u rastvor [4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]metanola (10.8 g, 71.4 mmol) u CH2Cl2(150 mL). Nakon 10 minuta, u kapima se u toku 30 minuta dodaje trietilamin (24 mL, 172 mmol) u CH2Cl2(8 mL), kupatilo za hlađenje se ukloni i reakcija se meša u toku noći. Reaktivna smeša se koncentruje pod vakuumom, razblaži sa novom količinom CH2Cl2i ispere sa 1 N vodenim rastvorom HCl i vodom. Organska faza se suši (Na2SO4), filtrira i koncentruje. Sirovi materijal se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa gradijentom 0-50% EtOAc/heksani da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (11.1 g, 44.9 mmol, 63%). ES/MS (m/z): 246 (M-H).

Izrada 11

2,2,2-Trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(1-hidroksi-3-metil-butil)fenil]etil]acetamid

[0060]

[0061] U rastvor 2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-(4-formilfenil)etil]acetamida (1.72 g, 7.01 mmol) u THF (35 mL) ohlađenom u ledenom kupatilu se doda izobutilmagnezijum bromid (2 M rastvor u dietil etru, 7.0 mL, 14.0 mmol) i meša približno 30 minuta. Smeša se neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida i podeli između EtOAc i vode. Organski sloj se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida, suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje kao ulje (1.40 g, 4.15 mmol, 59%) koje se koristi bez naknadnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 302.0 (M-H).

[0062] Naredno jedinjenje se u osnovi izrađuje po postupku za Izradu 11.

Tabela 3

2

Izrada 13

terc-Butil 4-[2-ciklopropil-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-karboksilat

[0063]

[0064] Titanijum(IV) izopropoksid (60 mL, 200 mmol) se doda u rastvor N-[(1S)-1-[4-(2-ciklopropilacetil)fenil]etil]-2,2,2-trifluoro-acetamida (12.0 g, 40.1 mmol) i terc-butil piperazin-1-karboksilata (17.9 g, 96.1 mmol) u THF (80 mL) i smeša se meša na 60 °C u toku noći. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu i doda se MeOH (80 mL) a nakon toga se u porcijama doda natrijum cijanoborohidrid (5.3 g, 80 mmol). Smeša se meša 8 sati na sobnoj temperaturi a nakon toga se dodaju voda i MeOH i smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Smeša se filtrira da se uklone čvrste supstance i čvrste supstance se isperu sa MeOH i vodom. Filtrat se delimično koncentruje da se ukloni najveći deo MeOH i ostatak se ekstrahuje sa EtOAc (2x). Kombinovani organski ekstrakti se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom. Sirovi materijal se prečisti hromatografijom na koloni uz eluiranje sa gradijentom 0% do 30% EtOAc u rastvaraču B gde je rastvarač B smeša 1:1 heksani:DCM da se dobije naslovljeno jedinjenje (10.5 g, 56%) kao bezbojna čvrsta supstanca. MS (m/z): 470.3 (M+H).

Izrada 14

terc-Butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciklopropil-etil]piperazin-1-karboksilat

[0065]

[0066] Vodeni rastvor kalijum hidroksida (5 M, 69 mL, 350 mmol) se doda u rastvor tercbutil 4-[2-ciklopropil-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]etil] piperazin-1-karboksilata (32.24 g, 68.67 mmol) u EtOH (350 mL) i dobijena smeša se meša 4 sata na sobnoj temperaturi. EtOH se ukloni pod sniženim pritiskom i u ostatak se doda zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata i smeša se ekstrahuje sa DCM. Kombinovani organski ekstrakti se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (24.33 g, 96.5% čistoće sadrži 3.5% preostalog DCM, 92% prinos) kao bezbojno viskozno ulje. MS (m/z): 374.3 (M+H).

[0067] Naredno jedinjenje se u osnovi izrađuje po postupku za Izradu 14.

Tabela 4

2

Alternativna Izrada 14

[0068] Rastvor kalijum hidroksida (1.28 g, 22.9 mmol) u vodi (4 mL) se doda u rastvor tercbutil 4-[2-ciklopropil-1-[4-[(1s)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-karboksilata (2.15 g, 4.58 mmol) u EtOH (23 mL) i smeša meša na sobnoj temperaturi. Nakon približno 6 sati, smeša se koncentruje. Ostatak je podeli između DCM i zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata. Organski sloj se ispere sa vodom i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida, suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje kao ulje koje se koristi bez prečišćavanja (1.73 g, 4.49 mmol, 98%). ES/MS (m/z): 374.2 (M+H).

Izrada 18

terc-Butil 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciklopropil-etil]piperazin-1-karboksilat, dijastereomer 1

[0069]

Izrada 19

terc-Butil 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciklopropil-etil]piperazin-1-karboksilat, dijastereomer 2

[0070]

2

[0071] 1:1 smeša terc-butil 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciklopropil-etil]piperazin-1-karboksilata, dijastereomer 1 i terc-butil 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciklopropiletil]piperazin-1-karboksilata, dijastereomer 2 (3.23 g) se rastvori u MeOH (40 mL) i razdvoji na pojedinačne dijastereomere preparativnom asimetričnom HPLC hromatografijom po sledećim uslovima: kolona Chiralpak AD, 20 µm, (8 x 33 cm); zapremina injekcije 10 mL; eluent 100% MeOH sa 0.2% DMEA; talasna dužina detekcije 220 nm; brzina protoka 400 mL/min. Izrada 12, terc- butil 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciklopropiletil]piperazin-1-karboksilat, dijastereomer 1, se dobija iz prvog pika eluacije kao bistro viskozno ulje (1.50 g, 46%, >99% de). MS (m/z): 374.3 (M+H). Izrada 13, terc-butil 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciklopropil-etil]piperazin-1-karboksilat, dijastereomer 2, se dobija iz drugog pika eluacije kao bistro viskozno ulje (1.46 g, 45%, >98.2% de). MS (m/z): 374.3 (M+H).

Izrada 20

N,3-Dimetoksi-N-metil-propanamid

[0072]

[0073] Rastvor 3-metoksipropanoatne kiseline (62 g, 577.7 mmol) u DCM (1200 mL) se u porcijama polako tretira sa 1,1’-karbonildiimidazolom (103 g, 635.2 mmol) i meša 2 sata na sobnoj temperaturi. Doda se N,O-dimetilhidroksilamin hidrohlorid (62 g, 635.6 mmol) i smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Smeša se ispere sa vodom (2x), 0.1M aq HCl (2x) i sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (2x), suši preko

2

magnezijum sulfata, filtrira i koncentruje do sušenja da se dobije sirovi materijal. Sirovi materijal se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa gradijentom 20-40% aceton u heksanima. Dobijeno ulje se suši u toku noći pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (69.5g, 81.7%).<1>H NMR (CDCl3) δ 2.72 (t, 2H), 3.2 (s, 3H), 3.38 (s, 3H), 3.7 (m, 5H).

Izrada 21

2,2,2-Trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(1-hidroksi-3-metoksi-propil)fenil]etil]acetamid

[0074]

[0075] 2,2,2-Trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(3-metoksipropanoil)fenil]etil]acetamid (23.62 g, 73.98 mmol, 95 maseni %) se rastvori u MeOH (700 mL) i tretira sa natrijum borohidridom (5.6 g, 150 mmol). Nakon 2 sata mešanja na sobnoj temperaturi smeša se tretira sa zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida i MeOH se upari. Dobijeni materijal je podeli između vode i EtOAc, razdvoji i kombinovane organske supstance se suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju do sušenja. Sirovi materijal se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa 40% EtOAc u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (17.82g, 79%). MS (m/z): 306 (M+H).

Izrada 22

terc-Butil 4-[3-metoksi-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]propil]piperazin-1-karboksilat

[0076]

2

[0077] 2,2,2-Trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(1-hidroksi-3-metoksi-propil)fenil]etil]acetamid (21.76g, 71.27 mmol) se rastvori u DCM (350mL) i ohladi na -10 °C. U kapima se doda tionil hlorid (26.12 g, 16 mL, 219.6 mmol) i reakcija se meša 2 sata. Smeša se koncentruje do sušenja, ponovo rastvori u DCM i ponovo koncentruje. Sirovi materijal se rastvori u ACN (300 mL) i dodaju se t-butil piperazin-1-karboksilat (26.55 g, 142.6 mmol), kalijum karbonat (39.5 g, 286 mmol) i kalijum jodid (12.0 g, 72.3 mmol). Smeša se zagreva 72 sata na 80 °C. Dobijena bela čvrsta supstanca se filtrira i ispere sa EtOAc. Kombinovani filtrati se isperu sa vodenim rastvorom amonijum hlorida, suše preko magnezijum sulfata, filtriraju i koncentruju. Sirovi materijal se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa gradijentom 40-80% EtOAc u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela pena (29.63g, 88%). MS (m/z): 474 (M+H).

Izrada 23

terc-Butil 4-[1-[4-(1S)-1-aminoetil]fenil]-3-metoksi-propil]piperazin-1-karboksilat, dijastereomer 1

[0078]

Izrada 24

2

terc-Butil 4-[1-[4-(1S)-1-aminoetil]fenil]-3-metoksi-propil]piperazin-1-karboksilat, dijastereomer 2

[0079]

[0080] U rastvor terc-butil 4-[3-metoksi-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]-etil]propil]piperazin-1-karboksilata (29.60 g, 62.5 mmol) u EtOH (310 mL) se doda aq kalijum hidroksid (63 mL, 5 M). Rastvor se meša 4 sata na sobnoj temperaturi a nakon toga se smeša koncentruje do sušenja. Sirovi ostatak se tretira sa vodom i zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonat i ekstrahuje sa DCM (3x). Kombinovani organski ekstrakti se suše preko natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju da se dobije naslovljeno jedinjenje (23.6g) koje se rastvori u MeOH (236 mL) i razdvoji na pojedinačne dijastereomere asimetričnom SFC hromatografijom pod sledećim uslovima: kolona: Lux Celuloza- 1, (5 x 25 cm); zapremina injekcije: 1 mL svaka 2.5 minuta, eluent 15% MeOH/CO2, talasna dužina detekcije 230 nm; brzina protoka 300 g/min; temperatura kolone: 40 °C; BPR polazna tačka: 100 bar; BPR temperatura: 40 °C. Naslovljeno jedinjenje iz Izrade 28 se dobija iz prvog pika eluacije kao bistro viskozno žuto ulje (10.1 g, 42.8%, 96.6% de). MS (m/z): 378 (M+H). Jedinjenje iz Izrade 29 se izdvoji kao drugi pik eluacije kao bistro viskozno žuto ulje (10.3 g, 43.6%, 95.2% de). MS (m/z): 378 (M+H).

Izrada 25

7-[[(1S)-1-[4-(1-Hloro-2-ciklopropil-etil)fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on

[0081]

[0082] Tionil hlorid (0.23 mL, 3.219 mmol) se doda u smešu 7-[[(1S)-1-[4-(2-ciklopropil-1-hidroksi-etil)fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona (432 mg, 1.03 mmol) i kalijum karbonata (741 mg, 5.37 mmol) u DCM (20 mL) i smeša se meša 20 minuta na sobnoj temperaturi. Smeša se filtrira kroz diatomejsku zemlju i koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje (518 mg, 1.07 mmol, 100%) kao bela pena, koja se koristi bez naknadnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 401.2/403.2 (M+H).

[0083] Naredna jedinjenja se u osnovi izrađuju po postupku za Izradu 25.

Tabela 5

1

Izrada 29

terc-Butil 4-[(1R)-2-ciklopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-okso-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-karboksilat

[0084]

[0085] U rastvor terc-butil 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciklopropil-etil]piperazin-1-karboksilata (864 mg, 3.35 mmol) i 1-etil-7-(metilsulfonil)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona (1.14 g, 3.05 mmol), u DMSO (15 mL) se dodaju CsF (1.39 g, 9.15 mmol) i DIPEA (0.80 mL, 4.6 mmol). Smeša se meša 1.5 sat na 60 °C. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, razblaži sa EtOAc i ispere sa vodom (2x). Kombinovani vodeni ispirci se ekstrahuju sa EtOAc a kombinovani organski ekstrakti se suše (Na2SO4), filtriraju i koncentruju do sušenja. Dobijeni sirovi produkt se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa gradijentom 55% do 95% EtOAc u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bezbojna čvrsta supstanca (1.47 g, 88%). MS (m/z): 551.3 (M+H).

[0086] Naredna jedinjenja se u osnovi izrađuju po postupku za Izradu 29.

Tabela 6

2

(nastavlja se)

(nastavlja se)

Izrada 39

7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-Ciklopropil-1-piperazin-1-il-etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on

[0087]

[0088] Hlorovodonična kiselina (95 mL, 5.5 M rastvor u izopropanolu, 520 mmol) se u kapima na 40 °C dodaje u rastvor terc-butil 4-[(1R)- 2-ciklopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-okso-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1- karboksilata (29.45 g, 53.48 mmol) u EtOAc (570 mL). Smeša se ostavi da se meša 3 sata na sobnoj temperaturi, a nakon toga se doda voda (300 mL). Slojevi se razdvoje i organski sloj se ekstrahuje sa vodom (2 x 150 mL). pH kombinovanih vodenih ekstrakta se podesi na pH 10

4

dodavanjem 5 N rastvora NaOH što za rezultat ima formiranje bezbojne čvrste supstance. Čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem, ispere sa vodom i suši na vazduhu da se dobije naslovljeno jedinjenje (25.18 g, 99%) kao bezbojna čvrsta supstanca. MS (m/z): 451.2 (M+H).

[0089] Naredno jedinjenje se u osnovi izrađuje po postupku za Izradu 39.

Tabela 7

Izrada 41

7-[[(1S)-1-[4-(2-Ciklopropil-1-piperazin-1-il-etil)fenil]etil]amino]-1-metil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on, dijastereomer 1

[0090]

[0091] terc-Butil 4-[2-ciklopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-metil-2-okso-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-karboksilat, dijastereomer 1 (245 mg, 0.46 mmol) se rastvori u DCM (2.5 mL). Doda se TFA (0.7 mL, 9 mmol) i reakcija se meša 90 minuta na sobnoj temperaturi. Smeša se neutrališe sa 20% aq K2CO3i ekstrahuje sa DCM (3x). Kombinovani organski ekstrakti se suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju do sušenja pod visokim vakuumom u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela pena, (196 mg, 88.5%). MS (m/z): 437 (M+H).

[0092] Naredna jedinjenja se u osnovi izrađuju po postupku za Izradu 41.

Tabela 8

(nastavlja se)

Izrada 49

7-[[(1S)-1-[4-(2-Ciklopropil-1-piperazin-1-il-etil)fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on

[0093]

[0094] Smeša 7-[[(1S)-1-[4-(1-hloro-2-ciklopropil-etil)fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona (518 mg, 1.07 mmol), kalijum karbonata (445 mg, 3.217 mmol), natrijum jodida (161 mg, 1.07 mmol) i piperazina (277 mg, 3.22 mmol) u ACN (3 mL) se zagreva u zatvorenoj bočici na 70 °C. Nakon ~8 sati, smeša se ohladi na sobnu temperaturu, razblaži sa EtOAc, filtrira kroz diatomejsku zemlju i koncentruje. Sirovi materijal se prečisti na silika gelu uz eluiranje sa gradijentom 1% do 7% 3 M NH3/MeOH u DCM da se dobije naslovljeno jedinjenje (306 mg, 0.66 mmol, 62%) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 451.2 (M+H).

[0095] Naredna jedinjenja se u osnovi izrađuju po postupku za Izradu 49 koristeći odgovarajuće zaštićen piperazin.

Tabela 9

Izrada 53

terc-Butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]propil]piperazin-1-karboksilat, izomer 1

[0096]

Izrada 54

terc-Butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]propil]piperazin-1-karboksilat, izomer 2

[0097]

[0098] terc-Butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]-fenil]propil]piperazin-1-karboksilat (29.2 g, 65.8 mmol) se rastvori u MeOH (584 mL) i razdvoji asimetričnom SFC hromatografijom po sledećim uslovima: kolona: Chiralpak AD-H, 5x25 cm; eluent 85/15 CO2/MeOH sa 0.5% dimetiletilamina; brzina protoka 300 g/min; talasna dužina detekcije 230 nm; temperatura kolone 40 °C; BPR polazna tačka 100 bar; 40 °C temperatura rastvarača. Izomer 1 se izdvoji kao prvi pik eluacije (14.15 g, 31.9 mmol). ES/MS (m/z): 444 (M+H). Izomer 2 se izdvoji kao drugi pik eluacije (13.87 g, 31.3 mmol). ES/MS (m/z): 444 (M+H).

Izrada 55

terc-Butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-okso-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-7-il)amino]etil]fenil]-3-metil-butil]piperazin-1-karboksilat, izomer 1

[0099]

Izrada 56

terc-Butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-okso-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-7-il)amino]etil]fenil]-3-metil-butil]piperazin-1-karboksilat, izomer 2

[0100]

[0101] terc-Butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-okso-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-7-il)amino]etil]fenil]-3-metil- butil]piperazin-1-karboksilat (2.6 g, 4.70 mmol) se rastvori u smeši 4:1 izopropanol:hloroform (50 mL) i razdvoji asimetričnom SFC hromatografijom po sledećim uslovima: kolona: Chiralpak AD-H, 5x25 cm; zapremina injekcije 1 mL; eluent 75/25 CO2/IPA sa 0.5% dimetiletilamina; brzina protoka 280 g/min; talasna dužina detekcije 240 nm; temperatura kolone 40 °C; BPR polazna tačka 100 bar; 40 °C temperatura rastvarača. Izrada 45 se izdvoji kao prvi pik eluacije (1.02 g, 1.89 mmol). ES/MS (m/z): 553.4 (M+H). Izrada 46 se izdvoji kao drugi pik eluacije (1.05 g, 1.90 mmol). ES/MS (m/z): 553.4 (M+H).

Primer 1

7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-Ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5- d][1,3]oksazin-2-on

[0102]

4

[0103] Akriloil hlorid (305 µL, 3.75 mmol, u 2 mL DCM) se u kapima na -78 °C doda u rastvor 7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-ciklopropil-1-piperazin-1-il-etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona (1.73 g, 3.26 mmol) u DCM. Nakon 2 minuta na -78 °C se doda nekoliko kapi MeOH a zatim se doda zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata i smeša se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu. Doda se DCM, slojevi se razdvoje i vodeni sloj se ekstrahuje sa DCM. Kombinovani organski ekstrakti se suše (Na2SO4), filtriraju i koncentruju do sušenja. Dobijeni sirovi produkt se prečisti hromatografijom na silika gelu (25% do 40% rastvarač A u rastvaraču B gde je Rastvarač A 10% MeOH/aceton i Rastvarač B je heksan) da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bezbojna čvrsta supstanca (1.16 g, 70%). MS (m/z): 505.3 (M+H).

[0104] Naredna jedinjenja se u osnovi izrađuju po postupku iz Primera 1 (pri čemu Primeri 9 i 10 nisu deo pronalaska).

Tabela 11

(nastavlja se)

Određivanje strukture kristala IDH1 X-zracima u kompleksu sa 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-onom.

[0105] Kristalna struktura IDH1 u kompleksu sa 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-onom se određuje rezultatima difrakcije X-zraka sakupljenih sa sinhrotronom eksperimentalnom stanicom APS 31-ID koja radi na Advanced Photon Source pri Argonne National Laboratory, Argonne, IL 60439. IDH1 protein sa R132H mutacijom je komercijalno raspoloživ iz više izvora. Alternativno, IDH1 R132H protein može da se izoluje iz komercijalno raspoložive ćelijske linije koja dovodi do mutacije dobro poznatim tehnikama i rutinski se koristi od strane stručnjaka sa iskustvom u tehnici. Kristali su dobijeni iz ploča sa udubljenjima za kapi podešenim na 21 °C sa IDH1 proteinom sa mutacijm R132H u koncentraciji od 15 mg/ml u puferu koji sadrži 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM natrijum hlorid, 10% glicerol, 5 mM ditiotreitol i 2 mM 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on i meša sa istom zapreminom rezervoara rastvora koji sadrži 100mM Bis Tris pH 5, 5% DMSO, 22% PEG 3350 i 200mM amonijum sulfat. Kristali se natope u toku noći u rastvoru koji sadrži 3 mM 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-

4

4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona, nakon toga prenesu u rastvor obogaćen sa 22% etilen glikol i brzo zamrznu da se dobiju rezultati. Rezultati difrakcije za rezoluciju od 2.8 Å se dobijaju sa radijacijom X-zraka na talasnoj dužini od 0.9793 Å. Kristali pripadaju Space Group P43212 sa ćelijskim parametrima a=82.74 Å, b=82.74 Å, c=299.4Å, α=β=γ=90°. Struktura je određena molekularnom zamenom i sadrži jednu dimer molekulu IDH1. Mape razlike gustine elektrona izračunate nakon modeliranja IDH1 proteina imaju jasnu gustinu za dve vezane molekule 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]phenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona.

[0106] Stereohemija 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona je određena iz gustine elektrona i obe molekule 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona su modelirane a struktura ko-kompleksa prečišćena za R-faktore Rwork= 0.192 i Rfree=0.228.

Tabela 12

4 Primer 13

1. Etil-7-[[(1S)-1-[4-[3-metoksi-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on, dijastereomer 1

[0107]

[0108] terc-Butil 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-okso-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-7-il)amino]etil]fenil]-3-metoksi-propil]piperazin-1-karboksilat (1.372 g, 2.473 mmol) se rastvori u DCM (15 mL) i doda se TFA (10 mL, 15.08 g, 132.3 mmol). Reakcija se meša 1 sat a nakon toga koncentruje do sušenja. Sirovi materijal se rastvori u DCM (12 mL) i DIPEA (1.25 mL, 7.17 mmol) i smeša se ohladi na -78 stepeni. U kapima se doda akriloil hlorid (0.18 mL, 0.20 g, 2.2 mmol). Nakon 10 minuta, doda se nekoliko kapi metanola da se neutrališe preostali akriloil hlorid i reakcija koncentruje do sušenja (hladna). Sirovi materijal se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa gradijentom 50-70% aceton u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela pena (867mg, 73%). MS (m/z): 509 (M+H)

[0109] Naredno jedinjenje se u osnovi izrađuje po postupku iz Primera 13.

4

Tabela 13

Primer 15

7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-Ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5- d][1,3]oksazin-2-on disulfat

[0110]

[0111] 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-Ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on (188 mg) se prenese u 5 mL acetona uz mešanje na 1000 opm/60°C. Uzorak je bistar rastvor. U kapima se doda 45 µL sumporne kiseline (razblažene u 2 mL acetona). Nakon nekoliko kapi dobija se gusta bela suspenzija. Nakon dodavanja polovine sumporne kiseline, konzistencija suspenzije se menja. U kapima se polako doda druga polovina sumporne kiseline. Suspenzija postaje blago gumasta pre prelaska u sjajno belu slobodno protočnu suspenziju čvrste supstance. Zagrevanje ploče se prekine nakon 30 minuta i uzorak ohladi na sobnu temperaturu, da se dobije gusta suspenzija bele čvrste supstance. Bela čvrsta supstanca se izdvoji filtriranjem pod vakuumom. Dobijena pogača je sjajno bela čvrsta supstanca. Uzorak se suši 20 minuta u struji vazduha na

4

mestu filtera, a nakon toga na 70°C u vakuumskoj pećnici u toku noći. Povrati se 266 mg (96.9% prinos).

Primer 16

7-[[(1S)-1-[4-[2-Ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on 4-hidroksibenzoeva kiselina

[0112]

[0113] 4-Hidroksibenzoeva kiselina (0.023 g, 0.165 mmol) se doda u rastvor 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciklopropil-1-(4-prop- 2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-ona (84 mg, 0.165 mmol) u dihlormetanu (5 ml). Nakon 5 minuta mešanja, rastvarač se polako upari u struji azota. Dobijena čvsta supstanca se dalje suši pod vakuumom da se dobije 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on 4-hidroksibenzoat (105 mg, 0.1617 mmol) kao bela čvrsta supstanca. MS (m/z): 423.2 (M+H).

Izrada 57

2-Ciklopropil-N-metoksi-N-metilacetamid

[0114]

4

[0115] U bocu okruglog dna zapremine 500 mL se sipa dihlormetan (160 mL, 8 zapremina) i 1,1’-karbonildiimidazol (35.63g, 1.1 equiv.). Heterogena smeša se ohladi na 15 °C i u smešu se sipa rastvor 2-ciklopropilsirćetne kiseline (20.0g, 1.0 equiv.) u dihlormetanu (40 mL, 2 zapremine) takvom brzinom da se kontroliše unutrašnja temperatura na ispod 20 °C. Dobijeni rastvor se zagreje na 25 °C i meša 2 sata. Rastvor se nakon toga ohladi na 15 °C i u njega se u porcijama sipa N,O-dimetil hidroksilamin hidrohlorid (21.43g, 1.1 equiv.), održavajući unutrašnju temperaturu ispod 20 °C. Dobijena heterogena smeša se zagreje na 25 °C i meša 15 sati. Reaktivna smeša se nakon toga razblaži sa vodom (160 mL, 8 zapremina) i meša 15 minuta. Mešanje se zaustavi i niži vodeni sloj se izdvoji. Dobijeni vodeni sloj se još dva puta ekstrahuje sa dihlormetanom (100 mL, 5 zapremina x 2) i organski slojevi se kombinuju. Kombinovani organski sloj se ispere dva puta sa 1.5 N HCl (100 mL, 5 zapremina x 2).

Organski sloj se nakon toga ispere dva puta sa 10% vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (100 mL, 5 zapremina x 2). Organski sloj se nakon toga ispere sa vodom (100 mL, 5 zapremina) a zatim sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (100 mL, 5 zapremina). Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata (1.0% m/m). Masa se filtrira i ispere sa dihlormetanom (20 mL, 1 zapremina) a nakon toga koncentruje pod vakuumom. Dobijena čvrsta supstanca se suši 5 sati pod visokim vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (25.9g, 90.5% prinos). ES/MS m/z 144.1 (M+H).

Alternativne sinteze Izrade 6

(S)-N-(1-(4-bromofenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamid

[0116]

4

[0117] U bocu okruglog dna zapremine 250 mL se sipa dihlormetan (100 mL, 10 zapremina) a zatim (S)-(-)- 1-(4-bromofenil)etilamin (10.0g, 1.0 equiv.). Rastvor se ohladi na 0 °C i u ohlađeni rastvor se polako doda trifluoroacetatni anhidrid (13.12g, 1.25 equiv.), održavajući unutrašnju temperaturu ispod 5 °C. Dobijeni heterogena smeša se meša 2 sata na 0 °C za koje vreme se polako dodaje trimetilamin (12.64g, 2.5 equiv.), održavajući unutrašnju temperaturu ispod 5 °C. Smeša se meša još jedan sat a nakon toga neutrališe dodavanjem vode (30 mL, 3 zapremina). Dvofazna smeša se zagreje na 25 °C i meša 30 minuta. Slojevi se nakon toga razdvoje i vodeni sloj se dalje dva puta ekstrahuje sa dihlormetanom (50 mL, 5 zapremina x 2). Kombinovani organski slojevi se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (50 mL, 5 zapremina) i suše preko anhidrovanog natrijum sulfata (1mt%). Osušeni rastvor se filtrira i ispere sa dihlormetanom (10 mL, 1 zapremina) i rastvor koncentruje pod vakuumom da se dobije sirova bela čvrsta supstanca. Sirova bela čvrsta supstanca se suspenduje u petrol etru (100 mL, 10 zapremina) u toku 2 sata na 25 °C i čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem. Ovlažena čvrsta supstanca se suši pod vakuumom 8 sati na 40 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (13.3 g, 90% prinos). ES/MS m/z 295.3 (M+H).

Izrada 58

(S)-N-(1-(4-(2-ciklopropilacetil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamid

[0118]

[0119] U reaktivnu posudu zapremine 10 L reakcija sa stubnom mešalicom se sipa metil tercbutil etar (1500 mL, 15 zapremina). U izmešani rastvor se doda (S)-N-(1-(4-bromofenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamid (100g, 1.0 equiv.). Heterogena smeša se meša 30 minuta na 25 °C a nakon toga se doda tetrahidrofuran (500 mL, 5 zapremina). Dobijeni homogeni rastvor se ohladi na -83 °C. U rastvor se polako dodaje n-butil litijum (297 mL, 2.2 equiv.) održavajući temperaturu ispod -78 °C i dobijeni rastvor se meša 1.5 sat na -83 °C. U ohlađeni rastvor se doda rastvor 2-ciklopropil-N-metoksi-N-metilacetamida (53.19g, 1.1 equiv.) in metil tercbutil etru (200 mL, 2 zapremina), održavajući unutrašnju temperaturu ispod -78 °C. Dobijeni rastvor se meša 1.5 sat na -83 °C za koje vreme se rastvor zagreje na -30 °C i neutrališe dodavanjem zasićenog vodenog rastvora amonijum hlorida (5 L, 5 zapremina). Neutralisana reaktivna smeša se zagreje na 25 °C i slojevi se razdvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje sa metil terc-butil etrom (500 mL, 5 zapremina). Kombinovani organski slojevi se isperu sa vodom (500 mL, 5 zapremina), zatim sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (500 mL, 5 zapremina) a nakon toga suše preko anhidrovanog natrijum sulfata (50g, 0.5% m/m). Masa se filtrira i ispere sa metil terc-butil etrom (50 mL, 0.5 zapremina). Dobijeni rastvor se koncentruje pod vakuumom dok ne preostane približno 1 zapremina rastvora. U koncentrovanu smešu se doda petrol etar (1500 mL, 15 zapremina) i dobijena suspenzija se meša 2 sata na ispod 30 °C. Čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem i suši pod vakuumom 8 sati na 40 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (65.9 g, 67% prinos). ES/MS m/z 298.0 (M-H).

Izrada 59

N-((S)-1-(4-((S)-2-ciklopropil-1-hidroksietil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamid

[0120]

[0121] U hidrogenator reaktor se sipa apsolutni etanol (7.89 kg, 10 zapremina). U izmešani rastvor se doda (S)-N-(1-(4-(2-ciklopropilacetil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamid (1.0 kg, 1.0 equiv.). U rastvor se doda rastvor kalijum terc-butoksida (1.0 M in tBuOH, 0.41 kg, 0.5 zapremina) održavajući unutrašnju temperaturu ispod 30 °C. U rastvor se nakon toga doda (R)-RUCY®-XylBINAP (0.0675 kg, 0.017 equiv.). Hidrogenator se dva puta pročisti sa gasom vodonikom, uz mešanje na 25 °C. Nakon pročišćavanja, rastvor se meša pod pritiskom vodonika od 4.5 kg 5 sati na 25 °C. Nakon 5 sati, rastvor se ozrači a nakon toga koncentruje

1

do ulja pod vakuumom na 42 °C. Ulje se rastvori u metil terc-butil etru (11.115 kg, 15 zapremina) a nakon toga koncentruje do ulja pod vakuumom na 45 °C. Ulje se rastvori u metil terc-butil etru (11.115 kg, 15 zapremina) a nakon toga koncentruje do ulja pod vakuumom na 45 °C. U ulje se na 25 °C doda metil terc-butil etar (22.23 kg, 30 zapremina). Dobijeni rastvor je ispere sa vodom (15.0 kg, 15 zapremina) a zatim sa rastvorom NaCl u vodi (5.4kg NaCl u 15.0 L vode). Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata (1.5kg, 1.5 m/m) a nakon toga filtrira i ispere sa metil terc-butil etrom (1.112 kg, 1.5 zapremina). U filtrirani rastvor se doda aktivni ugalj (0.3 kg, 0.3 m/m) i smeša se 2 sata meša i zagreva na 40 °C. Smeša se nakon toga filtrira i ispere sa metil terc-butil etrom (1.112 kg, 1.5 zapremina). Filtrat se koncentruje do ulja pod vakuumom na 45 °C. Ulje se rastvori u petrol etru (9.84 kg, 15 zapremina) i koncentruje do ulja pod vakuumom na 45 °C. Ulje se rastvori u petrol etru (9.84 kg, 15 zapremina) i koncentruje do ulja pod vakuumom na 45 °C. U ulje se doda petrol etar (19.68 kg, 30 zapremina) i smeša se meša 3 sata na 30 °C a dobijena čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem i ispere sa petrol etrom (9.84 kg, 15 zapremina). Izdvojena čvrsta supstanca se suši 5 sati pod vakuumom na 40 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (0.79 kg, 79%). ES/MS m/z 300.0 (M-H).

Izrada 60

N-((S)-1-(4-((R)-1-hloro-2-ciklopropiletil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamid

[0122]

[0123] U reaktor se dodaju metil terc-butil etar (4.45 kg, 6 zapremina) i N-((S)-1-(4-((S)-2-ciklopropil-1-hidroksietil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamid (1.0 kg, 1.0 equiv.). Rastvor se ohladi na 10 °C i u to se polako cdodaje 1-formilpirolidin (0.066 kg, 0.2 equiv.) održavajući unutrašnju temperaturu ispod 13 °C. U rastvor se nakon toga polako dodaje benzoil hlorid (0.56 kg, 1.2 equiv.) održavajući unutrašnju temperaturu ispod 13 °C. Dobijeni rastvor se

2

zagreje na 25 °C i meša do 36 sati (reakcija može da se prati u toku trajanja reakcije i ukoliko stane, mogu da se dodaju nove količine 1-formilpirolidina i benzoil hlorida). Završena reakcija se nakon toga koncentruje do ulja pod vakuumom na 40 °C. Ulje se ohladi na 15 °C a nakon toga neutrališe sa 10% vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (22.0 kg, 20 zapremina) i meša 3 sata na 25 °C. U dvofaznu smešu se doda petrol etar (6.56 kg, 10 zapremina). Organski sloj se izdvoji. Vodeni sloj se ekstrahuje sa petrol etrom (6.56 kg, 10 zapremina). Kombinovani organski slojevi se tri puta isperu sa 10% vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (5.0 L, 5 zapremina). Organski sloj se nakon toga ispere sa vodom (5.0 L, 5 zapremina) a zatim sa slanim rastvorom (5.0 L, 5 zapremina). Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata (0.5 kg, 0.5 m/m). Smeša se nakon toga filtrira i ispere sa petrol etrom (0.33 kg, 0.5 zapremina). Filtrat se koncentruje do ulja pod vakuumom na 40 °C. Ulje se rastvori u acetonitrilu (3.93 kg, 5 zapremina) i koncentruje do ulja pod vakuumom na 40 °C. Ulje se rastvori u acetonitrilu (3.93 kg, 5 zapremina) i koncentruje do ulja pod vakuumom na 40 °C. Ulje se rastvori u acetonitrilu (7.86 kg, 10 zapremina) i dobijeni rastvor naslovljenog jedinjenja se koristi sirov u sledećoj Fazi. ES/MS m/z 318.0 (M-H).

Izrada 61

terc-Butil 4-((S)-2-ciklopropil-1-(4-((S)-1-(2,2,2-trifluoroacetamido)etil)fenil)etilpiperazin-1-karboksilat

[0124]

[0125] U prethodno dobijeni rastvor N-((S)-1-(4-((R)-1-hloro-2-ciklopropiletil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamida se doda N-Boc-piperazin (0.924 kg, 1.5 equiv.) a zatim natrijum bikarbonat (1.1 kg, 4.0 equiv.). Dobijena smeša se zagreva 60 sati na 85 °C. Napomena: uzima se uzorak reakcije svaka 24 sata i nakon uzimanja svakaog od uzoraka, u reakciju se doda dodatna količna N-Boc-piperazina (0.31 kg, 0.5 equiv.). Kada je završena, reakcija se koncentruje pod vakuumom na 45 °C da se dobije ulje. Ulje je razblaži sa vodom (10.0 kg, 10 zapremina) i metil terc-butil etrom (7.41 kg, 10 zapremina). Dobijena dvofazna smeša se razdvoji i vodeni sloj se ekstrahuje sa metil terc-butil etrom (7.41 kg, 10 zapremina).

Kombinovani organski slojevi se pet puta ekstrahuju sa 30% limunskom kiselinom (5.0 L, 5 zapremina). Kombinovani vodeni slojevi se dva puta isperu sa petrol etrom (6.56 kg, 10 zapremina). Vodeni sloj se dovede do pH 9 dodavanjem natrijum karbonata (približno 25.0 kg, 25 m/m) na 15 °C. Zaalkalisani vodeni sloj se ekstrahuje sa metil terc-butil etrom (7.41 kg, 10 zapremina). Kombinovani organski slojevi se isperu sa vodom (5.0 L, 5 zapremina) i slanim rastvorom (5.0 L, 5 zapremina). Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata (0.5 kg, 50% m/m). Smeša se filtrira i ispere sa metil terc-butil etrom (0.37 kg, 0.5 zapremina). Filtrat se koncentruje do ulja pod vakuumom na 40 °C. Dobijeno ulje se rastvori u apsolutnom etanolu (3.95 kg, 5 zapremina) i sirovi rastvor naslovljenog jedinjenja se koristi direktno u sledećoj Fazi. ES/MS m/z 374.3 (M+H- CF3CO).

Izrada 62

terc-Butil 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciklopropiletil)piperazin-1-karboksilat

[0126]

[0127] U prethodno dobijeni rastvor terc-butil 4-((S)-2-ciklopropil-1-(4-((S)-1-(2,2,2-trifluoroacetamido)etil)fenil)etilpiperazin-1-karboksilata se doda apsolutni etanol (3.7 kg, 3.7 m/m). Rastvor se ohladi na 20 °C i u to se doda 1 M vodeni rastvor kalijum hidroksida (0.168 kg KOH u 3.0 kg vode). Dobijena smeša se meša 10 sati na 25 °C a nakon toga neutrališe sporim dodavanjem 30% vodenog rastvora limunske kiseline (5.0 kg, 5 m/m) održavajući unutrašnju temperaturu ispod 30 °C. U neutralisani rastvor se doda metil terc-butil etar (7.41 kg, 7.41 m/m). Slojevi se razdvoje i organski sloj se ekstrahuje sa 30% vodenim rastvorom limunske kiseline (5.0 kg, 5 m/m). Vodeni sloj se podesi na pH 8 dodavanjem natrijum

4

karbonata (približno 25.0 kg, 25 m/m) na 15 °C. Zaalkalisani vodeni sloj se dva puta ekstrahuje sa etil acetatom (7.41 kg, 7.41 m/m). Kombinovani organski slojevi se isperu sa vodom (5.0 kg, 5 m/m) a nakon toga sa slanim rastvorom (5.0 kg, 5 m/m). Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata (0.5 kg, 50mt%), zatim filtrira i ispere sa etil acetatom (0.37 kg, 0.37 m/m). Rastvor se koncentruje do ulja pod vakuumom na 45 °C.

Dobijeno ulje se rastvori u izopropil alkoholu (2 L, 2 zapremina) i dobijeni rastvor koncentruje do ulja pod vakuumom na 45 °C. Dobijeno ulje se rastvori u izopropil alkoholu (1.2 L, 1.2 zapremina) i sirovi rastvor naslovljenog jedinjenja se koristi direktno u sledećoj fazi prečišćavanja. ES/MS m/z 374.2 (M+H).

[0128] U bocu okruglog dna zapremine 1000 mL se doda rastvor terc-butil 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciklopropiletil)piperazin-1-karboksilata (30.0 g, 1.0 equiv.) u izopropil alkoholu (270 mL, 9 zapremina). U izmešani rastvor se na 20-30 °C doda L-dibenzoil vinska kiselina (L-DBTA, 34.5 g, 1.2 equiv.). Rastvor se meša 2-4 sata na 20-30 °C. Dobijena suspenzija se ostavi da se meša 8-12 sati na 20-30 °C. U retku suspenziju se doda MTBE (300 mL, 10 zapremina). Dobijena suspenzija se ostavi da se meša i zgusne na 20-30 °C u toku 12-16 sati. Čvrsta supstanca se nakon toga sakupi filtriranjem i ispere sa MTBE (150 mL, 5 zapremina). Čvrsta supstanca se suši pod sniženim pritiskom 12 sati na 45-55 °C da se dobije terc-butil 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciklopropiletil)piperazin-1-karboksilat L-dibenzoil so vinske kiseline kao bela čvrsta supstanca (48.8 g, 83% prinos, >98:2 dr).

[0129] U bocu okruglog dna zapremine 1000 mL sa mešalicom se doda terc-butil 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciklopropiletil)piperazin-1-karboksilat L-dibenzoil so vinske kiseline (40.0 g, 1.0 equiv.) a zatim dihlormetan (400 mL, 10 zapremina). U izmešani rastvor se na 15-25 °C doda 10% vodeni rastvor Na2CO3(dovoljno da se dobije pH 8-10, približno 6-8 zapremina). Dvofazna smeša se meša 1 sat na 15-25 °C a nakon toga se slojevi razdvoje u levku za razdvajanje. U organski sloj se doda DMSO (240 mL, 6 zapremina). Rastvor se koncentruje pod sniženim pritiskom na ispod 40 °C da se ukloni dihlormetan. Rastvor slobodne baze terc-butil 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciklopropiletil)piperazin-1-karboksilata u DMSO se nakon toga koristi direktno u sledećoj Fazi.

Izrada 63

etil 6-hloro-4-(metilamino)piridin-3-karboksilat

[0131] Metil amin (16 mL, 11.6 mol/L u vodi, 186 mmol) se u kapima na 0 °C doda u rastvor etil 4,6-dihloropiridin-3-karboksilata (20 g, 92 mmol) u acetonitrilu (300 mL). Reaktivna smeša se ostavi 2 h da se zagreje na sobnu temperaturu. U reaktivnu smešu se dodaju voda i etil acetat i vodeni sloj se ekstrahuje sa etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti se suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i koncentruju do sušenja. Dobijeni sirovi materijal se prečisti hromatografijom na silika gelu (0-100% EtOAc/heksani) da se, nakon koncentracije odgovarajućih frakcija, dobije etil 6-hloro-4-(metilamino)piridin-3-karboksilat kao bela čvrsta supstanca (10.46 g, 52.14 mmol, 57% prinos). MS (m/z): 201 (M+H).

Izrada 64

[6-Hloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol

[0132]

[0133] Rastvor etil 6-hloro-4-(metilamino)piridin-3-karboksilata (10.46 g, 52.14 mmol) u THF (100 mL) se u kapima na 0 °C doda u smešu litijum aluminijum hidrida (78.2 mL, 1.0 mol/L u THF, 78.2 mmol). Reaktivna smeša se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu u toku 1.5 h. U reaktivnu smešu se dodaju voda (3 mL), 15% vodeni rastvor NaOH (3 ml) a nakon toga voda (9 mL). Nakon mešanja, reaktivna smeša se filtrira kroz celite ploču. Filtrat se razblaži sa vodom i ekstrahuje sa dihlormetanom. Kombinovani organski ekstrakti se suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i koncentruju do sušenja da se dobije [6-hloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol kao bledo žuta čvrsta supstanca (2.78 g, 27% prinos). Celite filter pogača se dalje ispere sa metanolom i filtrat koncentruje do sušenja. Čvrste supstance sa filter pogače se sakupe i izmešaju sa dihlormetanom i filtriraju kroz Celite. Filtrat se kombinuje sa ostatkom od metanol ispiraka i materijal koncentruje do sušenja i sačuva. U sakupljene čvrste supstance nakon filtriranja se doda smeša 4:1 hloroform: izopropil alkohol i smeša se meša u toku noći. Smeša se filtrira kroz celite ploču, filtrat se kombinuje sa sačuvanim ostatkom i koncentruje do sušenja da se dobije dodatna količina [6-hloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanola kao bledo žuta čvrsta supstanca (5.07 g, 56% prinos).

Ukupno povraćen [6-hloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol je 7.85 g, 83% prinos). MS (m/z): 173 (M+H).

Izrada 65

7-Hloro-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oksazin-2-on

[0134]

[0135] Trifozgen (6.04 g, 20.4 mol) se na -20 °C doda u rastvor [6-hloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanola (5.07 g, 29.1 mol) i DIPEA (51.2 mL, 291 mmol) u THF (100 mL). Hladno kupatilo se ukloni i smeša se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu. Nakon 30 minuta, doda se voda i smeša se ekstrahuje sa dihlormetanom. Kombinovani organski ekstrakti se suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i koncentruju do sušenja. Dobijeni sirovi materijal se prečisti hromatografijom na silika gelu (0-100% EtOAc/heksani) da se nakon koncentracije dobiju odgovarajuće frakcije, 7-hloro-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oksazin-2-ona kao narandžasta čvrsta supstanca (5.13 g, 24.5 mmol, 84% prinos). MS (m/z): 199 (M+H).

Izrada 66

terc-Butil 4-[2-ciklopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-metil-2-okso-4H-pirido[4,3-d][1,3]oksazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-karboksilat, dijastereomer 1

[0137] U rastvor terc-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciklopropiletil]piperazin-1-karboksilata (1.30 g, 3.48 mmol), 7-hloro-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oksazin-2-ona (864 mgs, 4.35 mmol) i cezijum karbonata (2.27 g, 6.96 mmol) u toluenu (17.4 mL) se u atmosferi azota doda dihloro[1,3-bis(2,6-di-3-pentilfenil)imidazol-2-iliden](3- hloropiridil)paladijum(II) (291 mgs, 0.348 mmol) i smeša se zagreva na 75 °C u toku noći. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, smeša se filtrira kroz ploču silika gela i eluira sa etil acetatom. Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom i dobijeni ostatak se prečisti hromatografijom na silika gelu (20-100% EtOAc/heksani). Smeša frakcija se ponovo prečisti hromatografijom na silika gelu (50-100% metil terc-butil etar/heksani) i kombinovane čiste frakcije iz obe kolone se koncentruju da se dobije terc-butil 4-[2-ciklopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-metil-2-okso-4H-pirido[4,3-d][1,3]oksazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-karboksilat, dijastereomer 1 kao beličasta pena (1.312 g, 2.400 mmol, 69% prinos). MS (m/z): 536 (M+).

[0138] Kancer se sve više prepoznaje kao zbir heterogenih bolesti čiji je početak i razvoj indukovan nenormalnom funkcijom jednog ili više gena koji regulišu obnavljanje DNK, stabilinost genoma, proliferaciju ćelija, smrt ćelija, adheziju, angiogeneze, invaziju i metastaze u mikrosredini ćelija i tkiva. Promenljiva ili nenormalna funkcija "kancer" gena može da da bude rezultat prirodno nastalog polimorfizma DNK, promena u broju kopija genoma (umnožavanjem, odbacivanjem, gubitkom hromozoma ili dupliranjem), promena u strukturi gena i hromozoma (preko hromozomalne translokacije, inverzije ili drugih preraspodela koje dovode do neregulisane ekspresije gena) i položaja mutacija. Kancerogene neoplazme mogu da budu indukovane jednom nenormalnom funkcijom gena i održavanjem iste nenormalne funkcije gena ili održavanjem i progresijom pogoršanja dodatnim nenormalnim funkcijama gena.

[0139] Pored prethodno navedene genetičke hromozomalne nenormalnosti, svaki od kancera može takođe da uključi epigenetičke modifikacije genoma uključujući metilaciju DNK, genemično obeležavanje i modifikaciju histona acetilacijom, metilacijom ili fosforilacijom.

Epigenetičke modifikacije mogu da igraju ulogu u indukciji i/ili održavanju maligniteta.

[0140] Sastavljeni su opsežni katalozi citonegetskih nenormalnosti humanih kancera i održavaju se i redovno ažuriraju onlajn (Videti Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at US National Cancer Institute (NCI) Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) Web site). Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project detaljno održava "Cancer Gene Census" svih humanih gena koji su uzročno povezani sa tumorogenezama kao i COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) bazom podataka somatskih mutacija humanog kancera. Naredni izvor koji sadrži mnoštvo informacija o citogenetskim promenama uzročno povezanih sa različitim kancerima je Atlas of Genetics i Cytogenetics in Oncology and Haematology.

[0141] Dijagnoze kancerogenih maligniteta biopsijom, imunofenotipizacijom i drugim testovima su poznate i rutinski se koriste. Pored visoke rezolucije različitog bojenja hromozoma i naprednih tehnologija snimanja hromozoma, aberacije hromozoma u sumnjivim slučajevima kancera mogu da se odrede citogenetskim analizama kao što su fluorescencija hibridizacije in situ (FISH), kariotipizacija, spektralna kariotipizacija (SKY), višestruki FISH (M-FISH), komparativna genomska hibridizacija (CGH), nizovi polimorfizma pojedinačnih nukleotida (SNP Chips) i drugi dijagnostički i analitički testovi poznati i primenjeni od strane stručnjaka sa iskustvom u tehnici.

[0142] Mutacije u IDH1 i IDH2 su identifikovane u više tipova kancerogenog tumora, uključujući ali bez ograničenja na, gliomu, glioblastomu multiforme, astrocitome, oligodendrogliome, parangliome, mijelodisplastični sindrom (MDS), akutnu limfoblastičnu leukemiju B ćelija (B-ALL), tumor tiroidee, kolorektalni tumor, akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), Dang i saradnici,, TrendsMol. Med., 2010, 16: 387-397; Ward i saradnici,, Oncogene, 2012, 31(19): 2491-2498; melanom, Shibata i saradnici, Am. J. Pathol., 2010, 178(3): 1395-1402; kancer prostate, Flaherty i saradnici,, J. Clin. Oncol., 2014, 32 (suppl.4; Abstract 213); Cairns i saradnici,, Cancer Discovery, 2013, 3: 730-741; hondrosarkom i holangiokarcinom, Balss i saradnici,, Acta Neuropathol., 2012, 124: 883-891; Cairns i saradnici,, Cancer Discovery, 2013, 3: 730-741; angioimunoblastični limfom T-ćelija (AITL), Cairns i saradnici, Blood, 2012.119(8):1901-1903. Mutacije su nađene na ili pored određenih ostataka u aktivnom delu: G97D, R100, R132H, R132C, R132S, R132V, R132G, V71I, R132L i G123R za IDH1, Dang i saradnici,, Trends Mol. Med., 2010, 16: 387-397; Ward i saradnici,, 2012 i dopunska Tabela 2.

[0143] Pokazano je da mutantni oblici IDH1 i IDH2 imaju neomorfičnu aktivnost (dobijaju funkciju) redukcije α-ketoglutarata u 2-hidroksiglutarat. Endogena produkcija 2-hidroksiglutarata je enantiospecifična i dovodi do generisanja D-enantiomera (takođe označen kao (R) enantiomer. Normalno, ćelije imaju nisku vrednost 2-hidroksiglutarata dok ćelije u kojima se dešavaju IDH1 ili IDH2 mutacije pokazuju značajno povećane vrednosti 2-hidroksiglutarata. Značajno povećane vrednosti 2-hidroksiglutarata su pronađene u tumorima u kojima se dešavaju mutacije i u plazmi pacijenata sa mutantom IDH1 ili IDH2. Visoke vrednosti 2-hidroksiglutarata su povezane sa hipermetilacijom fenotipa što za rezultat ima blokiranje diferencijacije što dovodi do pojačanih tumorogeneza.

[0144] Aktivnost specifičnog ireverzibilnog kovalentnog inhibitora se definiše njegovim vezivanjem za cilj (IDH1 ili IDH2), i određena je pomoću KIi maksimalne potencijalne brzine formiranja kovalentne veze, definisane pomoću kinact. Ova dva faktora nisu različiti entiteti, već radije deluju zajedno da se dobije željeni efekat formiranja kovalentne veze. Ovo je ilustrovano pomoću naredne 3 tačke.

[0145] Prvo, činjenica da elektrofil, na primer, akrilamid, mora da bude odgovarajuće pozicioniran u odnosu na nukleofil na primer, cistein, je fundamentalna komponenta formiranja kovalentne veze u organskoj hemiji. Postoji precizan ugao i distanca pod kojima nukleofil mora da pristupi elektrofilu da se formira kovalentna veza. Jednostavno stavljanje elektrofila pored nukleofila nije dovoljno za formiranje kovalentne veze.

[0146] Drugo, kada inkorporiranje reaktivne grupe na jezgro koje sadrži vodonik vezujuće grupe za stabilizaciju vezivanja inhibitora za enzim na primer, orijentaciono jezgro, stručnjak sa iskustvom mora da razmotri kako se orijentaciono jezgro vezuje za cilj i pozicije elektrofila u odnosu na nukleifil u svetlu optimalnog ugla i distance kako je prethodno navedeno.

Ponavljamo, jednostavno pozicioniranje elektrofila pored nukleofila nije dovoljno za formiranje kovalentne veze. Promene u orijentacionom jezgru mogu da utiču na sposobnost inhibitor jedinjenja da formira kovalentnu vezu.

[0147] Treće, kada se prethodne dve tačke razmatraju zajedno, samo prisustvo elektrofilne grupe na orijentacionom jezgru nije dovoljno da ukaže da će da bude formirana kovalentna veza.

[0148] Naredne in vitro i in vivo studije pokazuju inhibitornu aktivnost na mutant IDH1 i IDH2 proteinu i efikasnost testiranih jedinjenja Formule I ili Ia u odnosu na različite specifične ćelijske linije kancera. Ova ispitivanja su generalno poznata stručnjaku sa iskustvom u tehnici kao indikativna za humanu kliničku terapeutsku aktivnost. Veruje se da će inhibicija mutanta IDH1 ili IDH2 neomorfnih proteina u otkrivenim studijama biti efikasna protiv narednih mutanta IDH1 i IDH2 neomorfnih proteina. Ispitivanja koja evidentiraju inhibitornu aktivnost i efikasnost na mutante IDH1 ili IDH2 mogu da se izvedu u potpunosti kako je niže navedeno ili sličnim ispitivanjima, da se dobiju slični rezultati.

[0149] Rezultati narednih ispitivanja pokazuju da su primerna i testirana jedinjenja korisna kao inhibitori IDH1 i IDH2 mutanta i da mogu da budu korisna u lečenju kancera u kojima se ekspresuje mutant IDH1 ili IDH2.

Biohemijska ispitivanja IDH1 i IDH2 mutanta Enzima

[0150] IDH1-R132H, IDH1-R132C, IDH2-R172K i IDH2-R140Q mutant enzimi katalizuju konverziju aKG u 2HG.2HG se analizira ekstrakcijom uzoraka čvrstvom fazom i masenom spektrometrijom. Ove analize se izvode u RapidFire® instrumentu zajedno sa 6460 trostrukim kvadropolnim masenim spektrometrom (G6460A Agilent).

[0151] IDH1 mutant (R132H i R132C) i IDH2 mutant (R140Q i R172K) proteini koji sadrže His-oznaku N-terminusa se ekspresuju u E.coli i prečiste nikl afinitetnom hromatografijom. Ispitivanje enzima se izvodi u polipropilenskim pločama sa 96 udubljenja V-dna koje sadrže 100 mM Tris-HCl pufera, 1 mM DTT, 0.005% TRITON™ X-100, 120 mM NaCl. Za IDH1 R132H, su uključeni α-ketoglutarat, NADPH i MnCl2u finalnim koncentracijama od 300 µM, 2.5 µM i 300 µM tim redom. Za IDH1 R132C, uključeni su α-ketoglutarat, NADPH i MnCl2u finalnim koncentracijama od 100 µM, 10 µM i 100 µM tim redom. Za IDH2 R172K su uključeni α-ketoglutarat, NADPH i MnCl2u finalnim koncentracijama od 150 µM, 10 µM i 150 µM tim redom. Za IDH2 R140Q su uključeni α-ketoglutarat, NADPH i MnCl2u finalnim koncentracijama od 3000 µM, 10 µM i 100 µM tim redom. Konačni pH = 7.0.

Osnovni rastvor test jedinjenja u DMSO se razblaži u reaktivnoj mešavini do finalne koncentracije DMSO od 4%. Jedinjenja se tstiraju u formatu odgovora na dozu. Ispitivanje se započinje dodavanjem enzima. Enzimi se koriste u sledećim finalnim koncentracijama: IDH1 R132H, 2 nM; IDH1 R132C, 0.5 nM; IDH2 R172K, 1.2 nM; IDH2 R140Q, 1.2 nM. Nakon 90 minuta, reakcija se neutrališe dodavanjem ACN (50:50) koji sadrži 3-hidroksi-1,5-pentandioatnu-2,2,3,4,4-d5kiselinu (5d5-3HG) kao unutrašnji standard za analize masenom spektrometrijom i kvantifikaciju produkta reakcije.2-Hidroksiglutarat (2HG) u neutralisanim uzorcima se izdvoji hromatografijom na koloni jakog izmenjivača anjona (Phenomenex Strata-X-A SecurityGuard) i analizira masenom spektrometrijom u 6460 trostrukom kvadropolnom masenom spektrometru (G6460A Agilent). Detektovani signal 2HG se

1

transformiše u koncentraciju analiza pomoću generisane kalibracione krive koristeći poznate koncentracije 2HG. Za svako testirano jedinjenje se izračunava % inhibicije koristeći kontrolni uzorak DMSO kao 0% inhibicije a kontrolu bez enzima kao 100% inhibicije. IC50vrednosti su dobijene od vrednosti pojedinačnih % inhibicije pri različitim koncentracijama jedinjenja koristeći 4-parametarsku jednačinu. Ova izračunavanja se izvode Activity Base (IDBS) ili Screener (Genedata) programima za analizu rezultata.

[0152] Rezultati ovog ispitivanja pokazuju da primerna i testirana jedinjenja inhibiraju aktivnost mutanta IDH1 u odnosu na IDH1/R132H i IDH1/R132C i inhbiraju aktivnost mutanta IDH2 u odnosu na IDH2/R140Q i IDH2/R172K .

[0153] Naredni primeri su u osnovi testirani kako je prethodno opisano i ispoljavaju aktivnost u odnosu na mutant IDH1 i mutant IDH2 kako je pokazano u niže datoj Tabeli 14.

Tabela 14

2

(nastavlja se)

Biohemijska analiza izvornog tipa IDH1 i IDH2 enzima

[0154] IDH1 i IDH2 enzimi katalizuju konverziju izocitrata u αKG. Izvorni tip IDH1 (National Center for Biotechnology Information, Accession: NP_001269316.1) i IDH2 (National Center for Biotechnology Information, Accession: EAX02082.1) proteini koji sadrže His-završetak N-terminusa su ekspresovani u E. coli i prečišteni nikl-afinitetnom hromatografijom. Ispitivanja enzima se izvode u polipropilenskim pločama sa 96 udubljenja V-dna koje sadrže 100 mM Tris- HCl pufera na pH 7.5, 1 mM DTT, 0.005% TRITON™ X-100, 120 mM NaCl. Za ispitivanje izvornog tipa IDH1, uključeni su izocitrat, NADP<+>i MnCl2u koncentracijama od 85 µM, 50 µM i 20 µM tim redom. Za ispitivanje izvornog tipa IDH2 uključeni su izocitrat, NADP<+>i MnCl2u koncentracijama od 30 µM, 50 µM i 10 µM tim redom. Inhibitori rastvoreni u osnovnom rastvoru DMSO se razblaže u reaktivnoj smeši do finalne koncentracije DMSO od 4%. Ispitivanje enzima se završava (neutrališe) dodavanjem ACN (50:50) koji sadrži d6-2-ketopentandioatnu kiselinu (d6- αKG) kao unutrašnji standard za analizu masenom spektrometrijom. Deset mikrolitara reaktivne smeše se kombinuje sa 100 µL vode, 50 µL 1M O-benzilhidroksilamina u piridin puferu (8.6% piridin, pH 5) i 50 µL 1M N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilkarbodiimid hidrohlorida (EDC) u piridin puferu. Nakon 1 sat derivatizacije na sobnoj temperaturi, uzorci se ekstrahuju sa 600 µM EtOAc. Ukloni se 400 µL gornjeg sloja, suši pod zagrejanim azotom i rekonstituiše sa 100 µL smeše MeOH/voda (1:1). Deset µL derivatizovanog uzorka se injektuje na LC-MS sistem koji se sastoji od Shimadzu Prominence 20A HPLC sistema i Thermo Quantum Ultra™ trostrukog kvadropolnog masenog spektrometra. Analiti se razdvoje na Waters XBridge™ C18 koloni (2.1 x 50 mm, 3.5 µm) uz brzinu protoka od 0.6 mL/minut. Mobilna faza A je 0.1% mravlja kiselina u vodi i mobilna faza B je MeOH. Detektovani aKG signal se transformiše u koncentraciju analita koristeći kalibracionu krivu generisanu pomoću poznatih koncentracija αKG. Za svako testirano jedinjenje se izračunava % inhibicije koristeći DMSO kontrolni uzorak kao 0% inhibicije a kontrolu bez enzima kao 100% inhibicije. IC50vrednosti su dobijene od vrednosti pojedinačnih % inhibicije pri različitim koncentracijama jedinjenja koristeći 4-parametarsku jednačinu. Ova izračunavanja se izvode Activity Base (IDBS) ili Screener (Genedata) programima za analizu rezultata.

[0155] Rezultati ovog ispitivanja pokazuju da su primerna i testirana jedinjenja manje aktivna za inhibiciju IDH1 izvornog tipa enzima u poređenju sa IDH1 R132H ili R132C mutant enzimima i manje su aktivna za inhibiciju IDH2 izvornog tipa enzima u poređenju sa IDH2 R140Q ili R172K mutant enzimima.

[0156] Niže dati Primeri u Tabeli 15 su testirani u potpunosti kako je prethodno opisano i manje su aktivni pri inhibiciji izvornog tipa enzima u poređenju sa mutant enzimima.

Tabela 15

Biohemijsko ispitivanje IDH1 (R132H) porastom razblaženja

4

[0157] Liofilizirana jedinjenja iz primera se rekonstituišu do 10 mM ili 100 mM sa 100% DMSO i čuvaju na sobnoj temperaturi do testiranja. IDH1(R132H)-His protein se ekspresuje i prečisti postupcima dobro poznatim i često korišćenim od strane stručnjaka sa iskustvom u tehnici. Reagensi za ispitivanje uključuju sledeće: α-ketoglutarnu kiselinu (Sigma Cat# K1875), MnCl2- Fisher Scientific Cat# M87-100, NADPH - Sigma-Aldrich Cat# N7505, Tris-HCl (Invitrogen, Cat#15567-027), NaCl (Sigma, S3014), ditiotreitol (Sigma, D5545) i TRITON™ X100 (Peirce, 28314). NAD(P)H-Glo™ Kit od Promega (G9061).

[0158] Korišćeni pufer za analizu sadrži 100 mM Tris-HCl pH 7.0, 120 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.005% TRITON™ X-100 i 2% DMSO (od dodatka test jedinjenja). IC50svakog jedinjenja je određena inkubacijom odgovora na dozu jedinjenja, izrađenom na Echo555, sa 1.5 nM IDH1(R132H), 1 mM α-ketoglutarata, 1 mM MnCl2i 15 µM NADPH u puferu za analizu. Reakcija se inkiubira 2 sata na sobnoj temperaturi, zatim zaustavlja pomoću 6-ciklopropil-5-(izohinolin-5-il)-2-[(3R)-4-(3-metoksipropanoil)-3-metilpiperazin-1-il]piridin-3-karbonitrila (10 µM). Koncentracije NADPH se mere pomoću NAD(P)H-Glo™ kita, po uputstvu dobavljača. Signal luminescencije se očitava na Envision (Perkin Elmer; 0.1 sec/Luminescense Mirror/Lum700 WL400-700 filter). U narednom eksperimentu porasta razblaženja, koncentracija jedinjenja ekvivalentna sa 10x IC50se prethodno inkubira sa 100 nM IDH1(R132H). Koncentracija jedinjenja je uvek veća od ili jednaka sa koncentracijm enzima. Nakon 2 sata na sobnoj temperaturi, ova smeša se razblaži 1:100 u rastvoru koji sadrži α-ketoglutarat (10 mM), MnCl2(10 mM) i NADPH (15 µM). Ova finalna reakcija enzima sadrži 1 nM IDH1(R132H) i 0.1 x [IC50]. Nakon 2 sata inkubacije na sobnoj temperaturi, koncentracija NADPH se meri kako je prethodno navedeno koristeći 6-ciklopropil-5-(izohinolin-5-il)-2-[(3R)-4-(3-metoksipropanoil)-3-metilpiperazin-1-il]piridin-3-karbonitril i NAD(P)H-Glo™ kit. Uključene su tri kontrole: 1) "10x Kontrola" koja sadrži 10xIC50jedinjenja u preinkubaciji i ispitivanju enzima bez 1 mM α-ketoglutarata, 1 mM MnCl2a 15 µM NADPH se koristi u finalnom ispitivanju merenjem aktivnosti enzima, 2) "Kontrola maksimalne aktivnosti" koja sadrži DMSO umesto jedinjenja i u preinkubaciji i u ispitivanju enzima i 3) "0.1x Kontrola" koja sadrži DMSO umesto jedinjenja u preinkubaciji i 0.1xIC50jedinjenja u ispitivanju enzima. "Kontrola minimalne aktivnosti" ne uključuje enzim, ali je inače ekvivalentna sa "Kontrolom maksimalne aktivnosti". Drugi set Kontrola maksimalne i minimalne aktivnosti se izvodi pomoću 1 mM α-ketoglutarata, 1 mM MnCl2i 15 µM NADPH. Svaki uslov analize se testira u triplikatu i uređano je 32 replikata za Kontrolu maksimalne aktivnosti (10 mM) i Kontrolu minimalne aktivnosti (10 mM) dok je 16 replikata urađeno za Kontrolu maksimalne aktivnosti (1 mM) i Kontrolu minimalne aktivnosti (1 mM).

[0159] Koncentracija NADP (produkta) dobijenog u svakom eksperimentu/kontroli se određuje preko procenta smanjenja u uočenom signalu u odnosu na Kontrolu minimalne aktivnosti, koja sadrži 15 µM NADPH. Kontrola minimalne aktivnosti (1 mM i 10 mM) i Kontrola maksimalne aktivnosti (1 mM i 10 mM) su uprosečene i za svaku je izračunata standardna devijacija. Signal za svaki porast razblaženja i za 0.1x Kontrole se množi sa 15 a nakon toga deli sa prosečnim brojem udubljenja za Kontrolu minimalne aktivnosti (10 mM). Ovaj broj se oduzme od 15 za izračunavanje NADP (µM produkta). Ista izračunavanja se koriste za 10x Kontrole ali se koriste Kontrole minimalne aktivnosti (1 mM). µMoli produkta za Kontrole maksimalne aktivnosti (1 mM i 10 mM) se izračunavaju množenjem prosečnih brojeva sa 15 a nakon toga deljenjem sa respektivnim Kontrolama minimalne aktivnosti (1 mM i 10 mM). µM NADP za svako udubljenje se deli sa prosečnom Kontrolom maksimalne aktivnosti (1 mM ili 10 mM) a nakon toga pomnoži sa 100 da se odredi % IDH aktivnosti za porast razblaženja jedinjenja, 10x Kontrola i 0.1x Kontrola. Zadovoljavajuće jedinjenje mora da pokaže <30% aktivnosti za 10x Kontrola – pokazujući da je preinkubaciona koncentracija dovoljna za zasiti enzim sa jedinjenjem. Pored toga, jedinjenje mora da pokaže >70-80% aktivnosti za 0.1x Kontrola potvrđujući da nema inhibicije pri 0.1x/koncentracija razblaženog jedinjenja.

[0160] Jedinjenja iz primera su testirana u osnovi kako je prethodno opisano i ispoljavaju % rezultata obnavljanja za IDH1/R132H u ovoj analizi. Jedinjenja iz primera i test jedinjenja iz ovog pronalaska inhibiraju enzim 2 sata nakon razblaženja nasuprot postojećem jedinjenju(ima) koje ne enhibira enzim 2 sata nakon razblaženja sa % obnavljanja. Rezultati ovog ispitivanja pokazuju da testirana jedinjenja iz ovog pronalaska deluju na način konzistentan sa kovalentnom inhibicijom mutanta IDH1 dok razblaženje inhibitora ne dovodi do obnavljanja aktivnosti enzima.

Ispitivanje inhibitora mutanta IDH1 na bazi ćelija

[0161] Za test ćelijske inhibicije IDH1 mutanta R132C, koristi se ćelijska linija fibrosarkom HT1080 (nabavljena od ATCC). Za testiranje inhibicije mutacije R132H na bazi ćelije, ćelijska linija U87MG gliome (ATCC) se stabilno transfektuje sa DNK sklopom u kome se ekspresuje R132H mutant enzim postupcima koji su dobro poznati i rutinski korišćeni od strane stručnjaka sa iskustvom u tehnici.

Ispitivanje HT1080 ćelija:

[0162] Petnaest hiljada ćelija se nanese u ploče sa 96 udubljenja obložene sa poli-D-liz (15,000 ćelija/udubljenje) 18-24 sata pre tretmana sa jedinjenjima. Četiri sata pre tretmana jedinjenjem, ćelije se ostave bez glutamina uklanjanjem normalnog medijuma i zamenom sa medijumom bez glutamina. Nakon gladovanja, ćelije se tretiraju sa različitim koncentracijama test jedinjenja (20 µM do 1 nM; ili 0.2 µM do 0.01 nM) rastvorenim u medijumu bez glutamina koji sadrži DMSO u finalnoj koncentraciji od 0.2%. Početna inkubacija jedinjenja je 1 sat na 37 °C/5% CO2. Nakon 1 sat, glutamin se doda do finalne koncentracije od 2 mM i ćelije se tretiraju a nakon toga inkubiraju narednih 18 sati na 37 °C/5% CO2. Nakon 18 sati inkubacije, u ćelijskim lizatima se analiziraju intracelularni 2HG i aKG. Lizati su izrađeni nakon uklanjanja medijuma i dodavanja pufera koji sadrži 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA/1% TRITON™- X 100 u ćelije. Alikvot lizata se doda u smešu d6-αKG i d5-3HG kao unutrašnjeg standarda i smeša se tretira sa O-benzilhidroksilaminom u prisustvu N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilkarbodiimid hidrohlorida (EDC) i piridina. Derivati analita se nakon toga ekstrahuju sa EtOAc, suše i zatim rekonstituišu sa 50% MeOH u H2O. Uzorci izrađeni kako je opisano se injektuju u HPLC da se razdvoje derivati 2HG i aKG (i odgovarajući unutrašnji standardi) koristeći reverzno faznu hromatografiju u C18 koloni. Analiza uzoraka se izvodi koristeći 6460 trostruki kvadropolni maseni spektrometar (G6460A Agilent). Detektovani 2HG i aKG signali se prevode u koncentraciju analita koristeći odnos αKG/d6-αKG i odnos 2HG/d5-3HG čija se vrednost dobija preko kalibracione krive. Procenat inhibicije za svaki pojedinačni uzorak je dobijen nakon normalizacije izračunate koncentracije 2HG ili aKG za maksimum i minimum referenci dobijenih u prisustvu i bez prisustva glutamina u toku tretmana ćelija sa jedinjenjima. IC50vrednosti su dobijene od pojedinačnog % inhibicije korišćenjem sigmoidalne 4-parametarske jednačine za odgovor na dozu. Ova izračunavanja se vrše automatski korišćenjem Activity Base (IDBS) ili Screener (Genedata) programa za analizu rezultata.

[0163] Rezultati ovih ispitivanja pokazuju da testirani Primeri u Tabeli 15 inhibiraju produkciju 2-hidroksiglutarata, što ukazuje na inhibiciju mutanta IDH1 R132C u ćelijama pri ovom ispitivanju. Inhibitori ne utiču negativno na αKG, metabolit generisan izvornim tipom IDH1, što u ovom ispitivanju ukazuje da su jedinjenja selektivna za mutant IDH1 u odnosu na izvorni tip IDH1 u ćelijama. Dobijene IC50vrednosti za naredne Primere su pokazane u Tabeli 16. Za one analize u kojima kriva inhibicije nije dostigla 50%, pokazana je najveća testirana koncentracija (na primer IC50>20 µM ili >0.2 µM).

Tabela 16

Ispitivanje U87MG/IDH1R132H ćelija

[0164] Ćelije se nanesu u ploče sa 96 udubljenja obložene sa poli-D-liz (12,000 ćelija/udubljenje) 18-24 sata pre tretmana sa jedinjenjima. Četiri sata pre tretmana jedinjenjem, ćelije se ostave bez glutamina uklanjanjem normalnog medijuma i zamenom sa medijumom bez glutamina. Nakon gladovanja, ćelije se tretiraju sa različitim koncentracijama test jedinjenja (20 µM do 1 nM) rastvorenih u medijumu bez glutamina koji sadrži DMSO u finalnoj koncentraciji od 0.2%. Početna inkubacija jedinjenja je 1 sat na 37 °C/5% CO2.

Nakon 1 sat, doda se glutamin do finalne koncentracije od 2 mM i tretirane ćelije se nakon toga inkubiraju narednih 18 sati na 37 °C/5% CO2. Analizira se intracelularni 2HG u ćelijskim lizatima dobijenim nakon uklanjanja medijuma i tretmanom sa puferom za lizu (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA/1% TRITON™-X 100). Ćelijski lizati se konzerviraju na -80 °C do upotrebe. Za ekstrakciju analita, alikvot otopljenog lizata se prenese u duboke ploče sa 96 udubljenja i tretira sa hladnim MeOH koji sadrži d5-3HG kao unutrašnjim standardom a nakon toga hloroformom i H2O (1:4:3:2). Nakon razdvajanja se gornja faza sakupi i injektuje u HPLC da se izdvoji 2HG (i unutrašnji standard) upotrebom hidrofilne interaktivne hromatografije (HILIC) zajedno sa MS/MS detekcijom u 6460 trostrukom kvadropolnom masenom spektrometru. Procenat inhibicije za svaki pojedinačni uzorak je dobijen nakon normalizacije izračunate koncentracije 2HG za maksimum i minimum referenci dobijenih u prisustvu i bez prisustva glutamina u toku tretmana ćelija sa jedinjenjima. IC50vrednosti su dobijene od pojedinačnog % inhibicije korišćenjem sigmoidalne 4-parametarske jednačine za odgovor na dozu. Ova izračunavanja se vrše automatski korišćenjem Activity Base (IDBS) ili Screener (Genedata) programa za analizu rezultata.

[0165] U ovom ispitivanju su naredni Primeri testirani u potpunosti kako je prethodno opisano i ispoljavaju aktivnost inhibicije prema mutantu IDH1/R132H u U87MG ćelijama kako je pokazano u niže datoj Tabeli 17.

Tabela 17

(nastavlja se)

In Vivo analiza 2-hidroksiglutarata

[0166] Za in vivo testiranje IDH1 inhibitora, subkutanozni ksenograft tumori su uzgajani u atimičnim golim miševima (20-22g, Harlan Laboratories) nakon implantacije ili HT1080 ćelija (fibrosarkom koji ima R132C mutant IDH1) ili TB08 ćelija (sekundarni glioblastom koji ima R132H mutant IDH1). Miševima je hrana i voda bila dostupna po želji i aklimatizovani su 1 nedelju pre implantacije ćelija. Ćelije tumora (HT1080) ili fragmenti tumora (TB08) su implantirani u desni zadnji bok miševa. Za HT1080, implantirano je 5.0 x 10<6>ćelija u smeši 1:1 sa matrigelom u finalnoj zapremini od 0.2 ml. Za TB08,fragmenti tumora generisani od uzoraka prethodno uzgajanog tumora su implantirani direktno u zadnji bok. Zapremine tumora su merene kaliperom dva puta nedeljno a zapremina tumora je izračunata preko 0.536 x L x W<2>, gde je L=dužina a W=širina. Kada zapremine tumora dostignu 150-400 mm<3>, životinje se po slučajnom uzorku podele u grupe (n=3-6 po grupi) i doziraju sa IDH1 inhibitorima ili kontrolnim vehikulumom. Za IDH1 inhibitore, jedinjenja su formulisana u vehikulumu koji sadrži ili 1% hidroksietilcelulozu/0.25% Tween™ 80/0.05% anti-peneće sredstvo ili 10% akaciju sa 1.1 mol ekvivalentom HCl. Jedinjenja se soniciraju u kupatilu da se dobije suspenzija. Jedinjenja se doziraju kao miligram po kilogramu (mpk) oralnom gavažom u finalnoj zapremini od 0.2 ml. Za određivanje inhibicije 2HG, jedinjenja se doziraju dva puta dnevno (BID) u toku 3 dana (ukupan broj doza = 6). Nakon tretmana jedinjenjem, miševi se eutaniziraju anestezijom izofluoranom i odseče im se glava. Tumori se izrežu, stave u označene epruvete i trenutno zamrznu u tečnom azotu. Tumori se čuvaju na -80 °C do upotrebe.

Izrada lizata tumora

[0167] XY Lite pufer se izrađuje u vodi molekularnog stepena i sadrži sledeće komponente: 25 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% TRITON™ X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. U XY Lite (40 ml), se doda 800 µL koktela Halt proteaze i inhibitora fosfataze (Halt™ Protease i Fosfataze Inhibitor Cocktail, EDTA-Free Thermo Scientific, Cat# 78441). Uzorci se centrifugiraju a nakon toga ohlade na ledu. Narandžasti zatvarač lizing-A epruveta se obeleži i stavi u stalak sa ledom. Keramički tarionik i pistil se stave na suvi led da se ohlade. Kvadrat aluminijumske folije dimenzije 2 x 2 inča se stavi na dno tarionika. Uzorci tumora se prenesu na kvadrat folije u prethodno ohlađeni tarionik. Doda se tečni azot (približno 5 ml) i ostavi da upari, čime se tumor super brzo zamrzne. Drugi komad folije se stavi preko tumora i tumor usitni na male delove keramičkim pistilom. Usitnjeni tumor se brzo prenese u epruvetu za liziranje. U svaku epruvetu se doda ledeno hladan XY Lite (500 µM) i zatvori. Tumori se nakon toga procesuiraju na FastPrep-24 MP Biomedicals rotiranjem dva puta po 35 sekundi pri brzini podešenoj na 5. Uzorci se nakon toga centrifugiraju u Beckman Microfuge R, 30 minuta na 4 °C pri 14,000 opm. Supernatant se prenese u prethodno ohlađenu ploču sa 96 dubokih udubljenja. Pelete se odbace.

Ispitivanje proteina

[0168] Za ispitivanje razblaženja proteina, ploča se prvo generiše dodavanjem XY pufera (145 µL) u nesterilnu Corning ploču sa 96 udubljenja okruglog dna. U ovo se doda lizat tumora (5 µL) i pažljivo izmeša. Ploča se čuva na ledu. Serijska razblaženja BSA standarda (Thermo Scientific cat.23209 2 mg/mL) se podese na sledeći način: pet epruveta zapremine 0.5 mL se stavi na stalak i u svaku se doda XY pufer (60 µL). U prvu epruvetu se doda osnovni BSA (60 µL) i centrifugira.60 µL iz prve epruvete se prenese u narednu epruvetu, centrifugira i tako dalje, sve dok se ne završi serija razblaženja na sledeći način: epruveta 1 = osnovni BSA, epruvete 2-5 su serijska razblaženja 1:2, epruveta 6= samo XY pufer. Thermo BCA Protein Assay reagensi se izmešaju u skladu sa uputstvom proizvođača. Izmešani BCA Reagens (200 µL) se doda u svaki uzorak i inkubira 15 minuta. Rezultati analize proteina se očitavaju na SOFTmax Pro Plate čitaču. Na osnovu rezultata analize proteina, odgovarajuća količina XY pufera se doda u svaki lizat tumora da se dobije finalna koncentracija proteina od 5 mg/mL. Svi uzorci se obeleže i čuvaju na -80 °C.

1

Analize metabolita u lizatima tumora

[0169] In vivo efekti inhibicije IDH1 na koncentracije ukupnog 2HG i aKG se određuju analizama tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (LC-MS) ksenografta tumora. Postupak koristi derivatizaciju sa O-benzilhidroksilaminom pre analize pomoću LC-MS. Deset mikrolitara lizata svakog tumora se prenese u ploču sa 96 dubokih udubljenja i kombinuje sa 100 µL rastvora unutrašnjeg standarda koji sadrži 10 µM d5-3HG i 10 µM d6-αKG. U svaki uzorak se doda 50 µL 1 M O-benzilhidroksilamina u piridin puferu (8.6% piridina, pH 5) i 50 µL 1 M N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilkarbodiimid hidrohlorida (EDC) u piridin puferu. Reakcija derivatizacije se izvodi jedan sat na sobnoj temperaturi. Pomoću Beckman Biomek FX automatske pipete se u svaki uzorak doda po 600 µL EtOAc. Ploče se pokriju i mućkaju 5 minuta a nakon toga centrifugiraju 5 minuta pri 4000 opm u Eppendorf 5810R centrifugi.400 µL gornjeg sloja se prenese u novu ploču sa 96 udubljenja. Uzorci se suše pod zagrejanim azotom na 50 °C i rekonstituišu sa 100 µL smeše MeOH/voda (1:1). Jedan mikrolitar derivatizovanog uzorka se injektuje na LC- MS sistem koji se sastoji od Shimadzu Prominence 20A HPLC sistema i Thermo Quantum Ultra™ trostrukog kvadropolnog masenog spektrometra. Analiti se razdvoje na Water XBridge™ C18 koloni (2.1 x 50 mm, 3.5 µm) uz brzinu protoka od 0.6 mL/minut. Mobilna faza A je 0.1% mravlja kiselina u vodi a mobilna faza B je MeOH. Profil gradijenta je: 0 minuta, 5% B; 3 minuta, 100% B; 4.00 minuta, 100% B; 4.1 minut, 5% B; 5.50 minuta, kraj. Maseni spektrometar koristi HESI-II probu koja radi u modalitetu praćenja reakcije izabranog pozitivnog jona. Kalibracione krive se konstruišu nanošenjem koncentracija analita prema odnosima analit/oblast pika unutrašnjeg standarda i vrši se nanošenjem kvadrata rezultata koristeći 1/ težinska koncentracija sa Xcalibur™ softverom. Koncentracije analita za nepoznate se ponovo izračunavaju iz kalibracionih krivih. Rezultat metabolita iz LC-MS analize je izražen u nmol/mg proteina. Prosečna vrednost 2HG u grupi tretiranoj vehikulumom se koristi za određivanje 0% kontrolne inhibicije. % Inhibicije u svakoj životinji tretiranoj inhibitorom se nakon toga odredi u odnosu na vehikulum kontolu. Rezultati se analiziraju u JMP softveru za određivanje prosečnog % inhibicije u svakoj doznoj grupi, standardne devijacije i standardne greške.

[0170] Rezultati koji pokazuju in vivo inhibiciju 2-hidroksiglutarata u IDH1 mutantu ksenograft miševa sa jedinjenjima iz primera i testiranim jedinjenjima su pokazani u niže datoj Tabeli 18.

2

Tabela 18

(nastavlja se)

4

Claims (7)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje Formule:

   naznačeno time što: R<1>je -CH2CH(CH3)2, -CH2CH3, -CH2CH2OCH3ili -CH2-ciklopropil; R<2>je -CH3ili -CH2CH3; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to: 7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-Ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on; 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on; 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on, izomer 1; 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on, izomer 2; ili farmaceutski prihvatljiva so bilo koga od njih.
3. 3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačeno time što je to 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciklopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oksazin-2-on ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
4. 4. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač.
5. 5. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
6. 6. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu kancera u kojima se ekspresuje mutant IDH1 ili mutant IDH2 koji je glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforma, astroci tome, oligodendrogliome, paraganglioma, fibrosarkom, angioimunoblastična limfoma T-ćelija (AITL), mijelodisplastični sindrom (MDS), akutna limfoblastična leukemija B ćelija (B-ALL), kancer tiroidne žlezde, kolorektalni kancer, akutna mijeloidna leukemija (AML), melanom, kancer prostate, hiondrosarkom i holangiokarcinom.
7. 7. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačeno time što je kancer u kome se ekspresuje mutant IDH1 ili mutant IDH2 fibrosarkom, akutna mijeloidna leukemija, glioma ili glioblastoma. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5