RS61257B1 - Jedinjenja izvedena iz hitozana - Google Patents

Description

Opis

PODRUČJE PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se u opštem odnosi na viskoelastične glikovirane hitosanske formulacije, imunoadjuvant koji sadrži viskoelastičnu glikovanu hitozansku formulaciju prema pronalasku i viskoelastičnu glikovanu hitozansku formulaciju prema pronalasku za upotrebu u lečenju karcinoma.

STANJE TEHNIKE

[0002] Hitozan je derivat hitina, jedinjenja koje se obično izoluje iz školjki nekih rakova poput jastoga i škampa. Hitin je linearni homopolimer sastavljen od N-acetilglukozaminskih jedinica spojenih b 1 → 4 glikozidne veze. Hitin, hitozan (delimično deacetilirani hitin) i njihovi derivati obdareni su zanimljivim hemijskim i biološkim svojstvima koja su dovela do različitog i sve već eg broja industrijskih i medicinskih primena. Glikirani hitozan, opisan u US 5,747,475 („Biomaterijali izvedeni iz hitozana“) jedan je od takvih derivata hitozana.

[0003] Karcinom se može razviti u bilo kom tkivu bilo kog organa u bilo kojoj dobi. Jednom kada se postavi nedvosmislena dijagnoza karcinoma, odluke o lečenju postaju najvažnije. Iako nijedan pristup lečenju nije primenljiv na sve karcinome, uspešne terapije moraju biti usmerene i na primarni tumor i na njegove metastaze. Istorijski gledano, lokalna i regionalna terapija, poput hirurgije ili zra čenja, koristile su se u lečenju karcinoma, zajedno sa sistemskom terapijom, npr. lekovima za hemoterapiju. Uprkos određenom uspehu, konvencionalni tretmani nisu efikasni do željenog stepena, a potraga je nastavljena za efikasnijim terapijama. Jasno je da postoji značajna nezadovoljena potreba za efikasnijim terapijama karcinoma.

[0004] Konvencionalni glikovani hitozanski preparati, kako je opisano u US 5,747,475 („Biomaterijali izvedeni iz hitozana“), pokazali su značajnu efikasnost kao imunoadjuvant u lečenju metastatskih tumorskih modela na životinjama.

[0005] US 2006/189573 A1 otkriva glikovane preparate hitozana. Mi i saradnici (2006), Polimer, 47 (12): 4348-4358, otkrivaju sintezu i karakterizaciju glikovanog hitosana. US 2010/152430 A1 otkriva postupak za pripremu jedinjenja hitozana, saharifikovanog amino šeć erom. Chen i sar. (2004), Zbornik radova SPIE, 5319: 80-86, otkriva poboljšanje glikovanog hitozana u laserskom lečenju karcinoma. Zhou i sar. (2011), Journal of XRai Science and Technology, 19 (2): 285-292, otkrivaju imunostimulirajuć a svojstva glikovanog hitosana. US 591200A otkriva metode i kompozicije za potenciranje imunolo škog odgovora, koji uključuju hitosan kao pomoć no sredstvo za pojačavanje imuniteta. Tommeraas i sar. (2011), Carhohidrate Polimers 83 (4): 1558-1564, otkrivaju pripremu i karakterizaciju razgranatih hitozana. EP 1152013 A1 otkriva funkcionalni derivat hitozana. Song i sar. (2009), Immunopharmacologi and Immunotokicologi, 31 (2): 202-208, otkrivaju glikovani hitosan kao netoksični imunološki stimulans. Ruel-Gariepi i sar. (2004), European Journal of Pharmaceuticals and Biopharmaceutics, 57 (1): 53-63, otkriva termosenzitivni hidrogel na bazi hitozana za lokalnu isporuku paklitaksela. Jeon i sar. (2002), Journal of Microbiologi and Biotechnologi, 12 (3): 503-507, otkriva antitumorsku aktivnost hitosan oligosaharida proizvedenih u ultrafiltracionom membranskom reaktorskom sistemu. Chen i sar. (1997), Cancer Letters, 115 (1): 25-30, otkrivaju imunoterapiju potpomognutu laserskim fotosenzibilizatorom. Ta et al. (2008), Journal of Controlled Release, 126 (3): 205-216, otkrivaju hidrogelove hitozana za injekcije za lokalizovanu terapiju karcinoma.

[0006] Međutim, uobičajene glikovane hitozanske preparate, kada se disperguju, suspenduju ili rastvore u vodenim rastvorima, često je veoma teško ubrizgati ili izdati u biomedicinskim aplikacijama u koje se stavljaju. Štaviše, konvencionalne glikovane hitozanske preparate, kako je opisano u US 5,747,475 („Biomaterijali izvedeni iz hitozana“), gotovo je nemoguć e sterilnim filtrirati, čine ć i ih neprikladnim za industrijsku proizvodnju prema trenutnoj dobroj proizvodnoj praksi (cGMP), a samim tim i neprikladnim za ljude upotreba. Stoga je cilj ovog pronalaska da obezbedi pobolj šane viskoelastične glikovane hitozanske preparate koji su daleko manje podložni napred navedenim nedostacima.

SUŠTINA PRONALASKA

[0007] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima i slede ć im realizacijama.

[0008] U jednoj realizaciji, ovaj pronalazak se odnosi na viskoelastičnu glikovanu hitozansku formulaciju, koja se sastoji od glikovanog hitozan polimera kao vodenog rastvora, pri čemu glikovani hitozan polimer ima molekulsku težinu između 50.000 daltona i 250.000 daltona, pri čemu se stepen glikacije slobodnih amino grupa polimera hitozana kreć e od jedne desetine jednog procenta do sedam procenata, pri čemu stepen deacetilacije hitinskog roditelja viskoelastičnog glikovanog hitozana je osamdeset procenata i pri čemu formulacija ima pH od 5 do 6.

[0009] U daljem rešenju, ovaj pronalazak se odnosi na viskoelastičnu glikovanu hitozansku formulaciju pronalaska za upotrebu u lečenju karcinoma.

[0010] U daljem rešenju, ovaj pronalazak se odnosi na imunoadjuvant koji sadrži viskoelastičnu glikovanu hitozansku formulaciju iz pronalaska.

KRATAK OPIS SLIKA

[0011] Ovi i/ili drugi aspekti i prednostii pronalaska postać e očigledni i lakše ć e se videti iz slede ć eg opisa ostvarenja, preuzetog zajedno sa prate ć im crtežima:

Slika 1 prikazuje jedan uobičajeni primer glikovanog hitozana, npr. galaktohitozana.

Slika 2 prikazuje jednu primernu strukturu viskoelastičnog glikovanog hitozana iz ovog pronalaska, pri čemu je deacetilacija matičnog hitozana 80 %, a glikacija ukupnih raspoloživih deacetiliranih amino grupa 12,5 %.

DETALJAN OPIS

[0012] Pronalazak se u opštem odnosi na terapeutske formulacije koje sadrže kompozicije izvedene iz hitozana i koriste se u vezi sa postupcima za lečenje neoplazmi i drugih medicinskih poreme ć aja.

[0013] Sada ć e se detaljno uputiti na određene realizacije ovog pronalaska, čiji su primeri ilustrovani na prate ć im crtežima, pri čemu se slični referentni brojevi u celosti odnose na slične elemente.

GLIKIRANI HITOZAN

[0014] Glikirani hitozan je proizvod glikacije (tj. neenzimatske glikozilacije) slobodnih amino grupa hitozana, nakon čega sledi stabilizacija redukcijom. Glikacija daje hitozanu povoljne karakteristike rastvorljivosti i viskoznosti koje olakšavaju upotrebu derivata zajedno sa laserski potpomognutom imunoterapijom i drugim primenama derivata. Glikacija hitozana tako đe čini hitozan hidrofilnijim pri čemu polimer apsorbuje i zadržava više vode nego što bi to inače bio slučaj.

[0015] U skladu sa poželjnim rešenjima ovog pronalaska, biomaterijal izveden iz hitosana sadrži linearni homopolimer deacetiliranog hitina (hitozan), pri čemu deacetilirani hitin ima niz inače slobodnih amino grupa povezanih sa karbonilnom grupom redukujuć eg monosaharida ili oligosaharid da bi se stvorio glikovani hitozan. Tako se glikovani hitosan može dobiti kao proizvod reakcije između karbonilne grupe redukujuć eg monosaharida ili oligosaharida i slobodnih amino grupa deacetiliranog hitina. Prema tome, termin "glikovani hitosan", kako se ovde koristi, namenjen je proizvodu glikacije, tj. Neenzimatske glikozilacije, slobodnih amino grupa hitozana, nakon čega sledi stabilizacija redukcijom. Uopšteno govoreć i, glikacija (ili ne-enzimska glikozilacija) namenjena je procesu koji se javlja kada se molekul šeć era, poput fruktoze ili glukoze, veže za supstrat, poput molekula proteina ili lipida, bez doprinosa dejstvu nekog enzim. Jedan takav primer je neenzimatska reakcija šeć era i aminske grupe proteina da bi se dobio glikoprotein.

[0016] Glikirani hitozan, prema tome, u opštem uključuje proizvode koji su rezultat reakcije između slobodnih amino grupa hitozana i karbonilnih grupa reduktivnih monosaharida i/ili oligosaharida. Proizvodi ove reakcije, koji su uglavnom mešavina Schiff-ovih baza (tj. atom ugljenika iz karbonilne grupe sada je dvostruko vezan za azot iz slobodnog amina koji oslobađa jedan molekul vode) i amadori proizvodi (tj. atom ugljenika navedene karbonil grupa je pojedinačno vezan za atom azota navedene amino grupe, dok je susedni atom ugljenika dvostruko vezan za atom kiseonika) može se koristiti kao takav ili nakon stabilizacije redukcijom hidridima, kao što su sredstva za redukciju borahidrida, na primer NaBH4, NaBH3CN, NaBH(OAc)3, itd., Ili izlaganjem vodoniku u prisustvu odgovaraju ć ih katalizatora.

[0017] Prisustvo primarnih i sekundarnih alkoholnih grupa i primarnih amino grupa u hitozanu olak šava brojne pristupe hemijskim modifikacijama napravljenim uglavnom za postizanje njihove solubilizacije i davanje posebnih svojstava za specifične primene.

[0018] Solubilizacija hitina i hitozana može se postić i delimičnom hidrolizom u oligosaharide. Za hitozan, tretman raznim kiselinama, organskim i neorganskim, dovodi do stvaranja u vodi rastvorljivih soli hitozonija protonacijom slobodnih amino grupa. Dodatne modifikacije amino grupa uklju čuju uvođenje hemijskih grupa kao što su karboksimetil, gliceril, N-hidroksibutil i druge. Glikacija, tj. neenzimatska glikozilacija slobodnih amino grupa hitozana, prać ena stabilizacijom redukcijom, nudi po željni pristup za pripremu različitih farmaceutskih formulacija koriš ć enih u ovom pronalasku.

[0019] U ilustrativne svrhe, jedan uobičajeni primer glikovanog hitosana, npr. galaktohitozana, prikazan je na Slici 1, koja je takođe opisana i ilustrovana u US 5,747,475.

[0020] Slika 1 je primer strukture konvencionalnog glikovanog hitozana, gde je molekulska težina približno 1,500,000 daltona, a sve amino grupe su glikovane.

[0021] US 5,747,475 je vrlo ograničen u svom opisu i opisuje samo jedan specifični galaktohitozan u pogledu molekulske težine; konkretno, US 5,747,475 opisuje samo galaktohitozan sa molekulskom težinom od 1500 kDa.

[0022] Za razliku od konvencionalnog galaktohitozana od 1500 kDa opisanog u US 5,747,475, jasno se podrazumeva da je glikovani hitozan iz ovog pronalaska kako je ovde opisano namenjen da uklju čuje glikovani hitozan molekulske težine manje od 1500 kDa. Štaviše, za razliku od konvencionalnih hitozana, glikovani hitozani ovog pronalaska su potpuno drugačiji i novi sastav materije sa nizom iznenađujuć e neočekivanih svojstava, blagodati i prednosti, uključujuć i neočekivano korisna viskoelastična svojstva.

[0023] Glikovani hitozan iz prikazanog pronalaska je u obliku Schiffove baze, proizvoda Amadori, ili poželjno, u njihovom redukovanom sekundarnom aminu, odnosno alkoholu. U jo š jednom izvođenju, glikovani hitozan uključuje karbonil reaktivnu grupu. Poželjno je da se glikovani hitozan ovog pronalaska dobije reakcijom hitozana sa monosaharidom i/ili oligosaharidom, po željno u prisustvu sredstva za zakiseljavanje, tokom vremena dovoljnog da se postigne stvaranje Schiffove baze između karbonilne grupe šeć era i primarne amino grupe hitozana (ovde se takođe naziva glikacija amino grupe) do stepena kojim se postiže od oko 0,1 % do oko 30 % (i najpoželjnije iznad 2 %) glikacije amino grupa hitozanskog polimera. Poželjno je da sledi stabilizacija redukcijom Schiff-ovih baza i njihovih preuređenih derivata (proizvodi Amadori) do sekundarnih amina ili alkohola.

[0024] Ovaj pronalazak je prva demonstracija kojom se postiže od oko 0,1 % do oko 30 % (i najpoželjnije iznad 2 %) glikacije polimera hitozana. Suprotno ovom pronalasku, drugi nisu uspeli da postignu ili prepoznaju ovaj značajan rezultat. Prema tome, prema jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje viskoelastičnu glikovanu hitozansku formulaciju, koja se u osnovi sastoji od glikovanog hitozan polimera, pri čemu glikovani hitozan polimer ima molekulsku težinu između od oko 50000 daltona do oko 1500000 daltona, i dalje u kojoj glikovani hitozan polimer poseduje od oko jedne desetine procenta do oko trideset procenata glikacije svojih inače slobodnih amino grupa.

[0025] Proizvodi koji su rezultat neenzimatske glikozilacije slobodnih amino grupa hitozana su, prema tome, uglavnom smeša Schiff-ovih baza, tj. atom ugljenika početne karbonilne grupe dvostruko vezan za atom azota amino grupe (takođe poznat kao iminska funkcionalna grupa) i proizvodi amadori, tj. atom ugljenika početne karbonilne grupe vezan za atom azota navedene amino grupe jednostrukom vezom, dok je susedni atom ugljenika dvostruko vezan na atom kiseonika koji formira ketonsku grupu. Ovi proizvodi (koji su rezultat neenzimatskog procesa glikozilacije) mogu se koristiti kao takvi, ili nakon stabilizacije redukcijom hidridima, kao što su sredstva za redukciju borhidrida, na primer NaBH4,NaBH3CN, NaBH (OAc)3itd., Ili izlaganje vodoniku u prisustvu odgovaraju ć ih katalizatora.

[0026] Deaminiranje hitozana sa azotnom kiselinom može se koristiti za stvaranje redukujuć ih aldoza i oligosaharida pogodnih za glikaciju hitosana. Deaminiranje deacetiliranih ostataka glukozaminila azotnom kiselinom dovodi do selektivnog cepanja njihovih glikozidnih veza sa stvaranjem 2,5-anhidro-D-manoznih ostataka. U zavisnosti od sastava određenih područja lanca hitozana, anhidro heksoza bi mogla da se oslobodi kao monosaharid ili da zauzme redukujuć i kraj oligosaharida. Oslobađanje slobodnog N-acetilglukozamina takođe se može desiti iz nekih regiona hitosanskog lanca. Sličan tretman N-deacetiliranih glikoproteina i glikolipida može se koristiti za dobijanje oligosaharida definisanog hemijskog sastava i biološke aktivnosti za posebne preparate glikovanog hitosana.

[0027] Razni proizvodi dobijeni glikozacijom hitozana bić e upotrebljeni kao takvi ili ć e reagovati sa drugim prirodnim ili sintetičkim materijalima, npr. reakcija derivata glikovanog hitozana koji sadr že aldehid sa supstancama koje sadrže dve ili više slobodnih amino grupa, kao na bočnim lancima aminokiselina bogatih ostacima lizina kao u kolagenu, ostacima heksosamina kao u hitozanu i deacetiliranim glikokonjugatima ili prirodnim i sintetičkim diaminima i poliaminima. Očekuje se da ć e ovo generisati umrežavanje kroz formiranje Schiffove baze i naknadna preuređenja, kondenzaciju, dehidrataciju itd. Stabilizacija modifikovanih glikovanih hitosanskih materijala mo že se izvršiti hemijskom redukcijom ili očvršć avanjem koje uključuje preuređivanje, kondenzaciju ili dehidraciju, bilo spontano ili inkubacijom pod različitim uslovima temperature, vlažnosti i pritiska. Hemija Amadori preuređenja, Schiffove baze i Leukart-Wallach-ova reakcija detaljno su opisani u The Merck Indek, Ninth Edition (1976), str. ONR-3, ONR-55 i ONR-80, Biblioteka Kongresne kartice br. 76-27231. Hemija reakcija nukleofilnih adicija, primenljiva na ovaj pronalazak, detaljno je opisana u poglavlju 19 Morrison and Boid, Organic Chemistry, drugo izdanje (osmo štampanje 1970), Biblioteka Kongresne kartice br. 66-25695.

[0028] Kao što je ovde dalje opisano, iznenađujuć e je utvrđeno da određeni tipovi (npr. određeni tipovi redukujuć ih še ć era) i stepeni glikacije daju hitozanu neočekivane i povoljne karakteristike rastvorljivosti koje olakšavaju upotrebu glikovanog hitozana zajedno sa laserski potpomognutom imunoterapijom i druge terapijske primene. Glikacija hitozana takođe povoljno čini hitozan hidrofilnijim pri čemu polimer apsorbuje i zadržava više vode nego što bi to inače bio slučaj. Derivat D-galaktoze hitozana je posebno poželjan ukoliko D-galaktoza ima relativno već u učestalost svog oblika otvorenog lanca u prirodi. Glikovirani hitozan se može pripremiti u bilo kom broju poželjnih formulacija, uključujuć i, na primer, oblik praha, viskoznu formulaciju ili formulaciju u bilo kom drugom pogodnom obliku.

[0029] U skladu sa drugim poželjnim rešenjima pronalaska, hitozan može biti neenzimski glikovan koristeć i bilo koji od niza istih ili različitih redukuju ć ih še ć era, npr., isti ili različiti monosaharidi i/ili oligosaharidi. Primeri takvih sredstava za glikozilaciju monosaharida su prirodnije prisutne D-trioze, D-tetroze, D-pentoze, D-heksoze, D-heptoze i slično, poput D-glukoze, D-galaktoze, D-fruktoze, D -manoza, D-aloza, D-altroza, D-idoza, D-taloza, D-fukoza, D-arabinoza, D-guloza, D-hammeloza, D-liksoza, D-riboza, D-ram nos, D -treoza, D-ksiloza, D-psikoza, D-sorboza, D-tagatoza, D-gliceraldehid, dihidroksiaceton, D-eritroza, D-treoza, D-eritruloza, D-manoheptuloza, D-sedoheptuloza i slično. Poželjni oligosaharidi uključuju fruktooligosaharide (FOS), galaktooligosaharide (GOS), mananoligosaharide (MOS) i slično.

Poželjna viskoelastična svojstva

[0030] Konvencionalno proizvedeni proizvodi od hitozana, kada se disperguju, suspenduju ili rastvore u vodenim rastvorima, vrlo je teško proizvesti u skladu sa GMP standardima i imaju brojne nedostatke u pogledu administracije i druge namene.

[0031] Poželjne realizacije ovog pronalaska prevazilaze davno nezadovoljene potrebe za pobolj šanim terapijskim hitosanskim proizvodima pružanjem poboljšanih viskoelastičnih glikovanih hitozanskih preparata koji nisu podložni nedostacima konvencionalnih pristupa.

[0032] Termin "viskoelastičan", kako se ovde koristi, odnosi se na viskoznost određenog sastava, preparata ili formulacije. Viskoznost se dobro razume kao mera otpora tečnosti koja se deformiše bilo pri naprezanju ili zateznom naprezanju. Drugim rečima, viskoznost opisuje unutrašnji otpor tečnosti prema protoku i može se smatrati merom trenja tečnosti.

a. Neočekivana poboljšanja u injektibilnosti GC preparata

[0033] Iznenađujuć e i neočekivano je otkriveno da injektibilnost formulacija glikovanog hitozana (GC), na primer rastvora ili suspenzija, očigledno zavisi od viskoznosti i reoloških svojstava GC. Ova svojstva su, pak, u velikoj meri zavisna od molekularne težine GC, stepena polimerizacije matičnog hitina do hitozana, stepena deacetiliranja matičnog hitina i stepena glikacije hitosana. Ova poslednja svojstva određuju stepen zapletenosti polimernih lanaca GC kao i stepen intramolekularne vodoni čne veze usled broja i prirode supstituenata prisutnih na GC molekulu (tj. acetil i saharid), koji oboje doprinose zna čajno na viskoznost i druga reološka svojstva rastvora pripremljena od toga.

[0034] Iznenađujuć e i neočekivano je otkriveno da poboljšani preparati viskoelastičnog glikovanog hitozana iz ovog pronalaska poseduju brojne prednosti, na primer, (i) primena netoksi čnog preparata za lečenje neoplazme kod pacijenta; (ii) daleko bolju injektibilnost (npr. putem razli čitih igala) u kliničkim uslovima u poređenju sa konvencionalnim tretmanima; (iii) pobolj šana sterilna filtracija viskoelastičnih preparata; i (iv) manje bolna i samim tim poboljšana opcija lečenja za pacijente. Termin "injektibilnost", kako se ovde koristi, odnosi se na lakoć u sa kojom se formulacija ili preparat, na primer, formulacija koja sadrži glikovirani hitosan (GC), injektira u subjekt.

[0035] Prema jednom poželjnom rešenju, pronalazak obezbeđuje viskoelastični preparat za injekcije koji sadrži približno 1 % mase napred opisanog glikovanog hitozana dispergovanog, suspendovanog ili rastvorenog u vodenom rastvoru.

[0036] Poželjna ostvarenja pronalaska uključuju preparate glikovanog hitozana, uključujuć i na primer rastvore ili suspenzije, koji imaju viskoznost koja omoguć ava da se preparati lako ubrizgavaju kroz iglu sa relativno velikim meračem igle (G), smanjujuć i tako bol i nelagodnost za ispitanika. Poželjni primeri relativno velikih igala uključuju igle koje imaju sledeć e dimenzije: nominalni unutra šnji prečnik od oko 0,337 mm (23 G) do oko 0,210 mm (27 G).

[0037] Prema jednom primeru, viskoelastični glikovani hitozan preparat se daje injekcijom pomoć u injekcione igle prečnika od oko 20 G do oko 22 G, a efektivna dužina cevi injekcione igle je oko 1.000 mm ili više takav da se brzina dotoka injekcionog preparata, kada se injektira pod pritiskom od oko dve do oko tri atmosfere kroz navedenu injekcionu iglu, kreć e od oko 0,05 ml/sekundi do 0,1 ml/sekundi. Prema drugom primeru, viskoelastični glikovirani hitozan preparat se takođe može davati injekcijom pomoć u injekcione igle prečnika od oko 25G do oko 27G. Takođe treba razumeti da se takođe može primeniti i viskoelastični glikovirani hitozan preparat prema ovom pronalasku koristeć i bilo koju drugu odgovaraju ć u iglu ili instrument.

[0038] Iznenađujuć e je otkriveno da se viskoelastični glikovirani hitozan preparati ovog pronalaska, na primer, rastvori ili suspenzije, injektiraju u relativno širokom opsegu koncentracija kroz katetere ili igle najčeš ć e koriš ć enih merača.

[0039] Takođe je otkriveno da ovi poboljšani viskoelastični glikovani hitozan preparati (tj. Poboljšanjem viskoznosti i reoloških svojstava glikovanih hitosanskih kompozicija) takođe neočekivano poboljšavaju ukupnu lakoć u davanja preparata subjektu; efikasnost primene od strane pojedinca koji daje formulaciju (na primer, medicinska sestra, lekar ili drugi zdravstveni radnik), kao i usagla šenost i efikasnost glikovanih hitosanskih formulacija takođe mogu biti poboljšani.

b. Neočekivana poboljšanja u proizvodnji i filtraciji

[0040] Iznenađujuć e je takođe otkriveno da se sterilna filtracija neočekivano poboljšava upotrebom poboljšanih viskoelastičnih glikovanih hitosanskih preparata ovog pronalaska. Uobičajeni glikovani hitozan preparati, kako je opisano u US 5,747,475 („Biomaterijali izvedeni hitozanom“), pokazali su da je vrlo teško kroz sterilni filter od 0,22 um, što ga čini neprikladnim za komercijalnu proizvodnju cGMP. Nasuprot tome, pokazalo se da je poboljšani viskoelastični glikovani hitozan, za koji je otkriveno da ima neočigledna reološka svojstva, veoma pogodan za sterilnu filtraciju, proizvodnju cGMP i upotrebu za ljude.

[0041] Dalje, iznenađujuć e je otkriveno da se dijafiltracija i ultrafiltracija neo čekivano poboljšavaju upotrebom poboljšanih viskoelastičnih glikovanih hitozanskih preparata ovog pronalaska. Konvencionalne preparate glikovanog hitozana bilo je teško dijafiltrirati i ultrafilter, zbog čega se filter začepio, što ga je učinilo neprikladnim za komercijalnu proizvodnju cGMP-a. S druge strane, pobolj šani viskoelastični glikovirani hitozan bio je izuzetno pogodan za diafiltraciju i ultrafiltraciju, čime je značajno poboljšan proizvodni proces.

Poželjni metodi za određivanje viskoznosti

[0042] Bilo koji broj pogodnih tehnika u hemijskom stanju tehnike može se koristiti za pouzdano i tačno određivanje viskoznosti glikovanog hitozanskog preparata.

[0043] Podrazumeva se da se viskoznost može pouzdano meriti raznim vrstama instrumenata, npr. viskozimetrima i reometrima. Reometar se koristi za one tečnosti koje se ne mogu definisati jednom vrednošć u viskoznosti i zato zahtevaju podešavanje i merenje više parametara nego što je to slučaj sa viskozimetrom. Za precizna merenja neophodna je bliska kontrola temperature te čnosti, posebno u materijalima poput maziva, čija se viskoznost može udvostručiti promenom od samo 5 °C.

[0044] U skladu sa ovim pronalaskom, viskozitet glikovanog preparata hitozana može se odrediti bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u tehnici.

[0045] Na primer, viskoznost se može pouzdano meriti u jedinicama centipoaze. Stanje je jedinica dinamičke viskoznosti u centimetrskom gramu drugog sistema jedinica. Centipoaza je jedna stotinka držanja i jedna millipascal-sekunda (mPa · s) u SI jedinicama (1 cP = 10-2 P = 10-3 Pa · s). Centipoaza je pravilno skrać eno cP, ali se često vide i alternativne skra ć enice cps, cp i cPs. Viskozimetar se mo že koristiti za merenje centipoaze. Pri određivanju centipoaze, tipično je da su sve ostale tečnosti kalibrisane na viskoznost vode.

Primer određivanja viskoznosti glikovanih preparata hitozana

[0046] Brojni su faktori koji utiču na viskoznost rastvora i, posebno, rastvora polimera, osim molekularne težine. U slučaju glikovanog hitozana (GC), injektibilnost rastvora GC u velikoj meri zavisi od viskoznosti i reoloških svojstava GC u rastvoru. Ova svojstva su, pak, u velikoj meri zavisna od molekularne težine GC, stepena polimerizacije matičnog hitina do hitozana, stepena deacetiliranja mati čnog hitina i stepena glikacije hitozana. Ova poslednja svojstva određuju stepen upletenosti polimernih lanaca GC, kao i stepen intramolekularne vodonične veze usled broja i prirode supstituenata prisutnih na GC molekulu (tj. acetil i saharid), oba koji značajno doprinose viskoznosti rastvora pripremljenih od njih.

[0047] Iznenađujuć e je otkriveno da poboljšana viskoznost i reološka svojstva glikovanih hitozanskih preparata, zauzvrat, veoma zavise od određenih fiziohemijskih svojstava glikovanog hitosana. Termin "fiziohemijska svojstva" kako se ovde koristi podrazumeva da uključuje, ali nije ograničen na, bilo koja fizička, hemijska ili fizičko-hemijska svojstva molekularne strukture, kao što je glikovani hitozan. Kao što je ovde dalje opisano, nekoliko primera ovih fiziohemijskih svojstava su:

(i) molekularna težina glikovanog hitozana;

(ii) stepen polimerizacije matičnog hitina u hitozan;

(iii) stepen deacetilacije matičnog hitina; i

(iv) stepen glikacije hitozana.

[0048] Slika 2 prikazuje jedan primer viskoelastičnog glikovanog hitozana iz ovog pronalaska, gde je molekulska težina približno 250 kDa, stepen deacetilacije matičnog hitina oko 80 %, a stepen glikacije slobodnih amino grupa na hitozan je oko 12,5 %.

[0049] Slika 2 je primer strukture viskoelastičnog glikovanog hitozana iz ovog pronalaska, gde je deacetilacija matičnog hitozana oko 80 %, a glikacija ukupnih raspoloživih deacetiliranih amino grupa je oko 12,5 %.

(i) Molekularna težina glikovanog hitozana

[0050] Bilo koji broj poželjnih tehnika u hemijskom stanju tehnike može se koristiti za pouzdano i tačno određivanje molekularne težine (MV) glikovanog hitozana.

[0051] U aspektima pronalaska, poželjno je da viskoelastični glikovani hitozan preparat pripremljen kao injekciona formulacija sadrži glikozirani hitozan sa molekulskom težinom (MV) manjom od oko 1500 kDa. Primeri viskoelastičnih glikovanih hitozanskih preparata sadrže glikovirani hitozan sa molekulskom težinom (MV) između oko 50 kilodaltona (kDa) i oko 1500 kDa.

[0052] U određenim aspektima pronalaska, viskoelastični glikovani hitozan preparat sadrži glikovirani hitozan sa molekulskom težinom (MV) između oko 100 kDa i oko 1000 kDa; i još poželjnije, između oko 100 kDa i oko 300 kDa. Za tačno određivanje molekulske težine mogu se koristiti razne tehnike.

[0053] Pronalazak obuhvata kompozicije izvedene iz hitozana koje sadrže derivate hitozana koji su rastvorljivi u vodi ili se disperguju u vodi. U skladu sa ovim pronalaskom, takođe je iznenađujuć e pronađeno da je u određenim realizacijama, sa poveć anjem molekularne težine (MV), potrebno više vode za rastvaranje glikovanog hitozana (GC). To zauzvrat znači da je manja količina vode „slobodna“, tj. nije vezana vodonikom za GC (pod pretpostavkom da se u rastvor ne dodaje dodatna voda), što samo po sebi doprinosi već oj viskoznosti. Kao što je prikazano u primeru 3 dole, neočekivano je utvrđeno da ovaj rezultat dodaje poveć anju viskoznosti koje se dobija pove ć anjem veličine molekula, daju ć i eksponencijalni (ili nešto slično), a ne linearni odnos između viskoznosti i MV (kada koncentracija se nadoknađuje).

(ii) Stepen polimerizacije (DP) matičnog hitina do hitozana

[0054] Stepen polimerizacije (DP) matičnog hitina u hitozan može se pouzdano i tačno odrediti u skladu sa bilo kojim brojem pogodnih postupaka ili tehnika poznatih u hemijskoj struci.

[0055] U jednom pristupu, poželjno je da se stepen polimerizacije (DP) određuje podelom molekularne težine hitozana sa molekularnom težinom veze glukozamina.

(iii) Stepen deacetilacije matčnog hitina

[0056] Sledeć e fiziohemijsko svojstvo je stepen deacetilacije matičnog hitina. Bilo koji broj odgovarajuć ih tehnika u hemijskoj umetnosti može se koristiti za pouzdano i tačno određivanje stepena deacetilacije roditelja hitina.

[0057] NMR je jedna tehnika koja se može koristiti za određivanje stepena deacetiliranja hitina ili hitozana.

(iv) Stepen glikacije hitozana

[0058] Bilo koji broj poželjnih tehnika u hemijskom stanju tehnike može se koristiti za pouzdano i tačno određivanje stepena glikacije hitozana.

[0059] NMR je jedna tehnika koja se može koristiti za otkrivanje i merenje vezivanja monosaharida i/ili oligosaharida za polimer hitozana.

[0060] Analiza elementarnog sagorevanja C/N je druga tehnika koja se može koristiti za određivanje procenta glikacije glikovanog hitozana upoređivanjem odnosa C/N glikovanog hitozana u odnosu na matični hitozan.

[0061] Enzimska probava u kombinaciji sa HPLC je još jedna tehnika koja se može koristiti za određivanje procenta glikacije.

[0062] Podrazumeva se da se i druge pogodne analitičke metode i instrumentacija mogu koristiti za simultano otkrivanje, merenje i identifikaciju vi še komponenata u uzorku, npr. za istovremeno otkrivanje, merenje i identifikaciju glikovanih i neglikovanih hitozana u uzorku.

[0063] Kolorimetrijsko merenje hemikalija vezanih za preostale slobodne amino grupe, kao što je reakcija ninhidrina, može se koristiti za procenu stepena glikacije.

[0064] Tako je utvrđeno da glikovirani hitozani koji preferiraju molekularne težine, stepene polimerizacije matičnog hitina u odnosu na hitozan, stepene deacetiliranja mati čnog hitina i stepene glikacije hitozana omoguć avaju poboljšanu pripremu glikovanih hitozanskih rastvora mogu se injektirati u relativno širokom opsegu koncentracija glikovanog hitozana kroz katetere ili igle često koriš ć enih merača.

Poželjni metodi pripreme glikovanog hitozana

[0065] Još drugi aspekti pronalaska se odnose na postupke za pripremu glikovanih hitozanskih formulacija. Glikovani hitozan se poželjno dobija reakcijom hitozana sa monosaharidom i/ili oligosaharidom, po željno u prisustvu sredstva za zakiseljavanje, tokom vremena dovoljnog da se postigne stvaranje Schiffove baze između karbonilne grupe šeć era i primarnih amino grupa hitozana (takođe u daljem tekstu označen kao glikacija amino grupe) do stepena kojim se postiže najmanje neki procenat (na primer, dva procenta ili ve ć i) glikacije polimera hitozana. Poželjno je da sledi stabilizacija redukcijom Schiff-ovih baza i njihovih preuređenih derivata (proizvodi amadori) na njihove sekundarne amine, odnosno alkohole. NMR tragovi se mogu koristiti za verifikovanje vezivanja monosaharida i/ili oligosaharida sa hitozan polimerom, dok se hemijsko merenje preostalih slobodnih amino grupa, poput reakcije ninhidrina, mo že koristiti za procenu stepena glikacije.

[0066] U poželjnim realizacijama, uslovi se mogu prilagoditi po potrebi da bi se pobolj šali željeni rezultati tokom proizvodnje glikovanog hitozana. Na primer, neočekivano je otkriveno, u skladu sa ovim pronalaskom, da se poboljšanja u proizvodnji glikovanog hitozana mogu postić i kontrolisanjem pH vrednosti, kao što je opisano na primer u Primeru 4.

[0067] Prema jednom primeru pripreme glikovanog hitozana za upotrebu u ovom pronalasku, pribli žno tri grama redukcionog monosaharida (npr. glukoza, galaktoza, riboza) ili ekvivalentna koli čina redukujuć eg oligosaharida rastvara se u 100 ml destilovane vode pod laganim magnetnim me šanjem u Erlenmajerovoj posudi. Zatim se doda približno jedan gram hitozana, a nakon toga se zatim mogu izvršiti odgovarajuć i koraci postupka da bi se dobio glikovani hitozan preparat sa željenim viskoelastičnim svojstvima i sa željenim karakteristikama čisto ć e.

[0068] Jedan primeren postupak za industrijsku proizvodnju hitozana uključuje sledeć a četiri koraka: demineralizacija (DM), deproteinizacija (DP), dekoloracija (DC) i deacetilacija (DA). Ekstrakcija hitina, na primer iz školjki rakova, vrši se alkalno-kiselinskim tretmanom. Uzorci se deproteinizuju tretiranjem alkalnom formulacijom, deminerališu kiselinom i obezboje organskim rastvaračem (npr. acetonom), nakon čega sledi izbeljivanje (npr. natrijum hipohloritom). Deacetilacija hitina se izvodi upotrebom, na primer, formulacije natrijum hidroksida. Stepen polimerizacije hitozana pode šava se depolimerizacijom; najpo\eljniji postupci su (1) razgradnja azotne kiseline u deuterisanoj vodi. Reakcija je selektivna, stehiometrijska u odnosu na GlcN, brza i lako kontrolisana, (2) depolimerizacija kiselinskom hidrolizom ili (3) enzimska razgradnja komercijalnim preparatom (Pectinek Ultra Spl). Enzimska metoda daje krać e fragmente sa već im udelom potpuno deacetiliranih hitooligomera. Suprotno tome, kisela hidroliza početnog hitozana rezultira fragmentima sa stepenima polimerizacije do šesnaest i više monoacetiliranih ostataka nego enzimatskim postupkom.

Polimerizovani glikovani amino še ć eri

[0069] Kao što je ovde opisano, hitozan (delimično deacetilirani hitin) je derivat hitina (linearni homopolimer sastavljen od N-acetilglukozamin jedinica pridruženih b 1 → 4 glikozidne veze). Jedinjenja izvedena iz hitozana tako sadrže homopolimer delimično deacetiliranog hitina, pri čemu delimično deacetilirani hitin ima niz inače slobodnih amino grupa povezanih sa karbonilnom grupom redukcionog monosaharida ili oligosaharida stvarajuć i iminsku vezu ( Schiffova baza) ili srodni proizvod (amadori) i oslobađanje jednog molekula vode.

[0070] Obzirom da su hitin i hitozan polimeri glukozamina, ovaj pronalazak takođe razmatra neenzimatski glikovani glukozamin, na primer, glikovani glukozaminski monomer ili glikovirane glukozaminske jedinice. Drugim rečima, ovaj pronalazak takođe podrazumeva neenzimatsku glikaciju monomera amino šeć era uopšte.

[0071] Na primer, jedan primer je glikovani glukozamin u kome je N-supstituent galaktoza. Po željno je da se glikacija monomera glukozamina izvodi nakon što se najmanje procenat monomera glukozamina inicijalno deacetilira.

[0072] Štaviše, ovaj pronalazak takođe podrazumeva (1) polimere glikovanih glukozaminskih jedinica (polimerizovani glikovani amino šeć eri), (2) kombinovane polimere glikovanih i neglikovanih glukozamina i (3) kombinacije glikovanih i neglikovanih polimera glukozamina pri čemu: (i) procenat nedeacetiliranih monomera glukozamina je od oko 1 % do oko 30 %; (ii) stepen polimerizacije (različitih kombinacija deacetiliranih, nedeacetiliranih, glikovanih i neglikovanih glukozaminskih jedinica) je od oko Xn = od 300 do oko Xn = 8000, najpoželjnije oko Xn = 1500; i / ili (iii) procenat glikacije slobodnih amino grupa deacetiliranog polimerizovanog glukozamina je od oko 0,1 % do oko 30 %.

[0073] Ovaj pronalazak takođe razmatra upotrebu polimerizovanih glikovanih polimera glukozamina koji su isti ili slični upotrebi glikovanog hitozana. To uključuje, na primer, imunoadjuvantna svojstva i upotrebu, npr. u kontekstu “na mestu” vakcina protiv karcinoma (inCVAKS) kao što je imunoterapija potpomognuta laserom (LIT).

Eksperimentalne formulacije i primene

[0074] Primeri različitih vrsta farmaceutski prihvatljivih formulacija ili preparata koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom uključuju, na primer, rastvore, suspenzije i druge vrste tečnih ili polutečnih formulacija za injektiranje viskoelastičnih glikovanih hitosanskih preparata. Na primer, farmaceutski prihvatljive formulacije ili preparati mogu da uključuju glikovani hitozan dispergovan, suspendovan ili rastvoren u osnovi vodenim formulacijama. Korišć enjem termina "suštinski vodeni rastvor" podrazumeva se da formulacije ili preparati, u određenim realizacijama, mogu da sadrže određeni procenat jedne ili više nevodenih komponenti i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

[0075] Prema jednom primeru, viskoelastični preparat je poželjno formulisan kao vodeni rastvor koji poseduje pH između oko 5,0 i oko 7.

[0076] Viskoelastični preparat se takođe može formulisati kao vodeni rastvor koji sadrži puferisani fiziološki fiziološki rastvor koji se sastoji u osnovi od glikovanog hitozana.

[0077] Viskoelastični preparat se takođe može formulisati tako da se sastoji u osnovi od glikovanog hitozan polimera, pri čemu glikovani hitozan polimer poseduje od oko jedne desetine (0,1) procenta do oko trideset (30) procenata glikacije svojih inače slobodnih amino grupa.

[0078] U sledeć oj realizaciji, viskoelastični preparat se može formulisati tako da se sastoji u osnovi od glikovanog hitozan (GC) polimera, pri čemu glikovani hitozan polimer poseduje oko dva (2) procenta glikacije svojih inače slobodnih amino grupa.

[0079] U sledeć em aspektu pronalaska, viskoelastični preparat se može formulisati tako da se sastoji u osnovi od glikovanog polimera hitozana, pri čemu glikovani hitozan polimer ima molekulsku težinu između od oko 50000 do oko 1500000 daltona.

[0080] Sledeć i primer uključuje viskoelastični GC preparat koji sadrži oko jedan (1) težinski procenat glikovanog hitozan polimera raspršenog u vodenom rastvoru, pri čemu navedeni vodeni rastvor ima viskoznost između oko jednog (1) i oko sto (100) cetistokova izmerene na oko 25 °C.

[0081] Još jedan primer uključuje vodeni rastvor koji ima oko jedan maseni procenat glikovanog hitozana i od oko jedne desetine (0,1) procenta do oko trideset (30) procenata glikacije ina če slobodnih amino grupa pomenutog glikovanog hitozana, pri čemu vodeni rastvor ima viskoznost od oko jednog (1) centistoka do približno sto (100) centistoka.

[0082] U još jednom izvođenju, viskoelastični preparat se može formulisati tako da se sastoji u osnovi od glikovanog polimera hitozana kao vodenog rastvora, koji sadrži oko ili više masenih procenata glikovanog hitozan polimera dispergovanog u vodenom rastvoru, pri čemu glikovani hitozan polimer poseduje oko dva (2) procenta glikacije svojih inače slobodnih amino grupa, i pri čemu vodeni rastvor ima viskoznost pogodnu za lako ubrizgavanje i davanje subjektu.

[0083] U još jednom izvođenju, viskoelastični preparat se može formulisati tako da se sastoji u osnovi od glikovanog polimera hitozana kao vodenog rastvora koji dodatno sadrži jedan ili više različitih viskoelastičnih materijala koji se mešaju u vodenom rastvoru. Primeri pogodnih viskoelastičnih materijala uključuju, ali nisu ograničeni na, hijaluronsku kiselinu, hondroitin sulfat i karboksimetilcelulozu.

[0084] Viskoelastični preparat može da uključuje glikovani hitozan polimer koji sadrži monosaharid vezan za inače slobodnu amino grupu. Glikovirani hitozan polimer može imati bilo koji pogodan oblik, kao što je Schiffova baza, Amadori proizvod ili njihove smeše. Glikovani hitozan polimer takođe može biti u obliku redukovane Schiffove baze (sekundarni amin), redukovanog Amadori proizvoda (alkohol) ili njihovih smeša.

[0085] Viskoelastični preparat se takođe može formulisati u tome što glikovani hitozan polimer poseduje niz hemijski modifikovanih supstituenata monosaharida ili oligosaharida. U jednom aspektu, monosaharid sadrži galaktozu.

[0086] Formulacije ili preparati prema pronalasku takođe poželjno sadrže glikovani hitosan u fiziološki kompatibilnom nosaču. Pod "fiziološki kompatibilnim", kako se ovde koristi, treba razumeti da se odnosi na materijale koji u kontaktu sa tkivima u telu nisu štetni za njih. Termin je namenjen u ovom kontekstu da uključuje, ali nije ograničen na, vodene formulacije (npr. rastvori) koje su približno izotonične sa fiziološkim okruženjem od značaja. Neizotonične formulacije (npr. rastvori) ponekad mogu biti i klinički korisne, kao što su, na primer, sredstva za dehidrataciju. Dodatne komponente inventivnih re šenja mogu da uključuju razne soli kao što su, na primer, puferi na bazi NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2i Na.

[0087] Gornji i drugi ciljevi ostvareni su ovim pronalaskom, čija se određena poželjna ostvarenja odnose na glikovane hitozanske preparate koji imaju posebna fiziohemijska svojstva koja daju neo čekivana i iznenađuju ć e korisna svojstva.

[0088] Ovaj pronalazak takođe obuhvata širok spektar primena viskoelastičnih glikovanih hitozanskih preparata koji imaju iznenađujuć a i neočekivana svojstva kao imunoadjuvanti, na primer, u vezi sa “na mestu” autolognim vakcinama protiv karcinoma, kao što je laserska imunoterapija za karcinom, kako je opisano dalje ovde.

[0089] Poželjne realizacije pronalaska pružaju imunoadjuvante koji sadrže injekcionu viskoelastičnu formulaciju pronalaska. Stoga je sledeć i cilj ovog pronalaska da obezbedi pobolj šane viskoelastične glikovane hitozanske preparate za druge terapijske primene, uključujuć i terapijsku upotrebu kao imunoadjuvant i imunomodulator.

[0090] Predmetni pronalazak takođe obuhvata različite načine davanja viskoelastičnih glikovanih hitozan imunoadjuvantnih formulacija, kao što je injekcija. U poželjnom pristupu, imunoadjuvant se poželjno priprema kao formulacija za injekciju u ili oko tumorske mase. Treba, međutim, prepoznati da bi druge metode mogle biti dovoljne za lokalizaciju imunoadjuvanta na mestu tumora. Jedno od takvih alternativnih sredstava za davanje je konjugacija imunoadjuvanta sa tkivom specifi čnog antitela ili tkivno specifičnim antigenom, tako da je poboljšano davanje na mesto tumora. Bilo koja metoda ili kombinacija različitih metoda lokalizacije imunoadjuvanta na mestu tumora je prihvatljiva sve dok mehanizam davanja osigurava dovoljnu koncentraciju imunoadjuvanta u neoplazmi.

1

[0091] Prema nekim poželjnim rešenjima, ovaj pronalazak obezbeđuje različite farmaceutske formulacije koje sadrže viskoelastični glikovirani hitozan koji se koristi “na mestu” autolognim vakcinama protiv karcinoma (inCVAKS), kao što je imunoterapija potpomognuta laserom, terapija fotodinami čnim zracima (PDT) i/ili druge metode imunoterapije tumora, kako su ovde detaljnije opisane. Primeć eno je da je poželjno koristiti glikovane hitozanske preparate koji imaju odgovarajuć u viskoznost koja omogu ć ava njihovu upotrebu kao injekcije ili drugu formulaciju kao imunoadjuvant u aplikacijama kao što su inCVAKS i/ili PDT i/ili metode imunoterapije tumora. Takve primene obično uključuju injekciju viskoelastične glikovane hitozanske formulacije u korpus pacijenta. Termin "imunoadjuvant" kako se ovde koristi odnosi se na bilo koji molekul, kompoziciju ili supstancu koji deluju da pojačaju odgovor imunog sistema na antigen; na primer, glikovani hitozan koji deluje da poboljša reakciju imunog sistema na tumorski antigen.

[0092] Imunoadjuvantna kompozicija može dalje da uključuje antitelo specifično za tumor konjugovano sa glikovanim hitozanom. Imunoadjuvantna kompozicija može takođe da sadrži tumorski specifični antigen konjugovan sa glikovanim hitozanom. Glikovirani hitozan može dalje da uključuje karbonil reaktivnu grupu.

[0093] Prema jednoj poželjnoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje imunoadjuvant koji uključuje suspenziju ili rastvor viskoelastične glikovane hitozanske formulacije prema pronalasku. Viskoelastični glikovirani hitozan se u ovom poželjnom ostvarenju koristi u vezi sa fototermalnim tretmanom neoplazme bez upotrebe hromofora, gde se svetlosna energija isporučuje direktno. Svetlosna energija se može isporučiti lokalno ako je neoplazma dostupna na površini tkiva (na primer melanom) ili ako je izložena hirurškim putem. Svetlosna energija se takođe može isporučiti u neoplazmu pomoć u fiberoptike, na primer ako je neoplazma prisutna ispod površine tkiva (na primer karcinom dojke) i nije izložena hirurškim zahvatom.

[0094] Prema još jednom izvođenju, i kao što je ovde detaljnije opisano, imunoadjuvantne formulacije ovog pronalaska mogu dalje da uključuju pogodan hromofor. Izbor odgovarajuć eg hromofora uglavnom je stvar koordinacije sa prihvatljivom laserskom talasnom dužinom zračenja. Talasna dužina zračenja koje se koristi mora, naravno, biti komplementarna sa fotosvojstvima (tj. vrhom apsorpcije) hromofora. Ostali kriterijumi za odabir hromofora uključuju sposobnost stvaranja toplotne energije, razvijanja singletnog kiseonika i drugih aktivnih molekula ili toksičnosti, kao što je cis-platina. U ovom pronalasku, poželjna talasna dužina zračenja je 805 ± 10 nm. Željeni hromofori imaju snažnu apsorpciju u crvenom i blizu infracrvenom spektralnom području za koje je tkivo relativno prozirno. Još jedna prednost ove talasne dužine je što se izbegavaju potencijalni mutageni efekti na koje nailaze senzoribilizatori pobu đeni UV-om. Ipak, talasne dužine između 150 i 2000 nm mogu se pokazati efikasnim u pojedinačnim slučajevima. Poželjni hromofor je indocijanin zeleni. Mogu se koristiti i drugi hromofori, me đutim, njihov izbor se zasniva na željenim fotofizičkim i fotohemijskim svojstvima od kojih zavise efikasnost fotosenzibilizacije i fotocitotoksičnosti. Primeri alternativnih hromofora uključuju, ali nisu ograničeni na, jednoslojne nanocevi od ugljenika (SVNT), bukminsterfullereni (C60), indocijanin zeleno, metilen plavo, DHE (polihematoporfrin ester/etar), mm-THPP (tetra(meta-hidroksifenil)) porfirin), AlPcS4(aluminijum ftalocijanin tetrasulfonat), ZnET2 (cink aetio-purpurin) i Bchla (bakterio-hlorofila).

[0095] U jednom aspektu, imunoadjuvantni sastav je formulisan kao rastvor ili suspenzija. Rastvor ili suspenzija mogu sadržati, na primer, oko 0,25 % mase hromofora i oko 1% mase glikovanog hitozana.

[0096] Prema još jednom poželjnom ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u kondicioniranju neoplazme za tandemski fotofizički i imunološki tretman, koja sadrži imunoadjuvant, pri čemu je imunoadjuvant konjugovan sa tumorskim specifičnim antigenom, a pri čemu je imunoadjuvant glikovani hitozan.

[0097] Prema još jednom ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u kondicioniranju neoplazme za tandemski fotofizički i imunološki tretman, koja sadrži kombinaciju hromofora i imunoadjuvanta, pri čemu su hromofor i imunoadjuvant konjugovani sa specifičnim tumorskim antigenom, i pri čemu je imunoadjuvant glikovani hitozan.

[0098] Prema još jednoj poželjnoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u kondicioniranju neoplazme za tandemski fotofizički i imunološki tretman, koja sadrži imunoadjuvant, pri čemu je imunoadjuvant konjugovan sa antitelom specifičnim za tumor, i pri čemu je imunoadjuvant glikovani hitozan. Imunoadjuvant se u određenim slučajevima može sastojati u osnovi od glikovanog hitozana. Glikovirani hitozan takođe može dalje da uključuje karbonil reaktivnu grupu.

[0099] Prema još jednom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u kondicioniranju neoplazme za tandemski fotofizički i imunološki tretman, koja sadrži kombinaciju hromofora i imunoadjuvanta, pri čemu su hromofor i imunoadjuvant konjugovani sa antitelom specifi čnim za tumor, i pri čemu je imunoadjuvant glikovani hitozan. Imunoadjuvant se u određenim slučajevima može sastojati u osnovi od glikovanog hitozana. Glikovirani hitozan takođe može dalje da uključuje karbonil reaktivnu grupu.

[0100] Predmetni pronalazak tako obezbeđuje injekcione formulacije za kondicioniranje neoplazme za tandemski fotofizički i imunološki tretman, koji u određenim slučajevima mogu da uključuju kombinaciju ili smešu hromofora i imunoadjuvanta, pri čemu je imunoadjuvant glikovani hitozan .

[0101] Sastav se dalje može pripremiti za upotrebu u kondicioniranju neoplazme za tandemski fotofizi čki i imunološki tretman, koji sadrži imunoadjuvant, pri čemu je imunoadjuvant konjugovan sa specifičnim za tumorski antigen, a gde je imunoadjuvant viskoelastični glikovirani hitosan sa molekulskom težinom ( MV) između oko 100 kDa i oko 1000 kDa; i još poželjnije, između oko 100 kDa i oko 300 kDa.

[0102] Sastav se takođe može pripremiti za upotrebu u kondicioniranju neoplazme za tandemski fotofizički i imunološki tretman, koji sadrži kombinaciju hromofora i imunoadjuvanta, pri čemu su hromofor i imunoadjuvant konjugovani sa antigenom specifičnim za tumor, i pri čemu imunoadjuvant je viskoelastični glikovirani hitozan sa molekulskom težinom (MV) između oko 100 kDa i oko 1000 kDa; i još poželjnije, između oko 100 kDa i oko 300 kDa.

[0103] Dalje, rastvor za injekcije može se pripremiti za kondicioniranje neoplazme za tandemski fotofizički i imunološki tretman koji sadrži imunoadjuvant u kome je imunoadjuvant viskoelastični glikovirani hitozan sa molekulskom težinom (MV) između oko 100 KDa i oko 1000 kDa; i još poželjnije, između oko 100 kDa i oko 300 kDa.

[0104] Rastvor za injekcije se takođe može pripremiti za kondicioniranje neoplazme za tandemski fotofizički i imunološki tretman koji sadrži smešu hromofora i imunoadjuvanta, pri čemu je imunoadjuvant viskoelastični glikovirani hitozan sa molekulskom težinom (MV) između oko 100 kDa i oko 1000 kDa; i još poželjnije, između oko 100 kDa i oko 300 kDa.

[0105] U jednom primeru, viskoelastični glikovani hitozan jedninjenja iz ovog pronalaska se koristi kao imunoadjuvant u novom lečenju karcinoma. Fototermalne i imunološke terapije kombinuju se zračenjem neoplazme direktno na tumor bez upotrebe hromofora i naknadnim uvođenjem imunoadjuvanta dobijenog hitozanom u ili oko ozračene metastaze. Nakon primene lasera sa zračenjem dovoljnim za indukciju neoplastičneć elijske destrukcije, imunoadjuvantna komponenta stimuli še (poboljšava) ć elijski i humoralni imuni odgovor na tako oslobođene neoplastične antigene.

[0106] U drugom primeru, fotodinamička i imunološka terapija se kombinuju uvođenjem i hromofora i imunoadjuvanta dobijenog iz hitozana (takođe nazvanog imunomodulator ili imunopotenziator) na metastazu. Nakon primene lasera sa zračenjem dovoljnim za indukciju neoplastične ć elijske destrukcije, imunoadjuvantna komponenta stimuliše (poboljšava) ć elijski i humoralni imuni odgovor na tako oslobođene neoplastične antigene.

[0107] Hromofor i imunoadjuvant mogu se kombinovati u rastvoru za injekcije u centar tumorske mase ili odvojeno ubrizgati u masu tumora. Treba priznati da bi druge metode mogle biti dovoljne za lokalizaciju hromofora i imunoadjuvanta na mestu tumora. Jedno takvo alternativno sredstvo za davanje je konjugacija hromofora ili imunoadjuvanta ili oboje na specifi čno antitelo tkiva ili specifični antigen tkiva, tako da je pojačano davanje na mesto tumora. Bilo koji metod ili kombinacija različitih metoda lokalizacije hromofore i imunoadjuvanta na mestu tumora je prihvatljiva sve dok mehanizam isporuke osigurava dovoljnu koncentraciju komponenata u neoplazmi.

[0108] Prema drugom aspektu pronalaska, postupak za lečenje neoplazme kod čoveka ili drugog životinjskog domać ina sadrži: (a) odabir imunoadjuvanta, pri čemu imunoadjuvant sadrži viskoelastični glikovani hitozan; (b) zračenje uslovljene neoplazme pri čemu se indukuje neoplastično ć elijsko uništavanje uslovljene neoplazme, proizvodeć i fragmentirano neoplastično tkivo i ć elijske molekule; i (c) uvođenje imunoadjuvanta u ili oko neoplazme, što stimuliše samoimunološki odbrambeni sistem domać ina da obrađuje usitnjeno neoplastično tkivo i ć elijske molekule, kao što su tumorski antigeni, i na taj način stvara imunitet protiv neoplastičnog ć elijskog razmnožavanja.

[0109] Prema još jednom aspektu pronalaska, postupak za lečenje neoplazme kod čoveka ili drugog životinjskog domać ina sadrži: (a) odabir hromofora i imunoadjuvanta, pri čemu imunoadjuvant sadrži viskoestonski glikovani hitozan; (b) uvođenje hromofora i imunoadjuvanta u neoplazmu da bi se dobila uslovljena neoplazma; i (c) zračenje uslovljene neoplazme pri čemu se indukuje neoplastično ć elijsko uništavanje uslovljene neoplazme, proizvodeć i fragmentirano neoplastično tkivo i ć elijske molekule u prisustvu imunoaduvanta koji stimuliše samoimunološki odbrambeni sistem domać ina od neoplastičnog ć elijskog umnožavanja.

[0110] U još jednom aspektu pronalaska, postupak za proizvodnju tumorskih specifičnih antitela u domać inu koji nosi tumor, uključuje ozračivanje tumora laserom talasne dužine u vidljivom, bliskom infracrvenom ili infracrvenom opsegu, u stepenu dovoljnom da indukuje neoplasti čno ć elijsko uništavanje i generiše fragmentirano neoplastično tkivo i ć elijske molekule, pra ć eno uvođenjem imunoadjuvanta u ili oko neoplazme putem injekcije, tako da se imuni sistem domać ina stimuli še da komunicira i obrađuje fragmentirano neoplastično tkivo i ć elijske molekule na kome se indukuje sistemski antitumorski odgovor.

[0111] U drugom aspektu pronalaska, postupak stvaranja antitela specifičnih za tumor u domać inu koji nosi tumor, uključuje istovremeno uvođenje hromofora i imunoadjuvanta u neoplazmu intratumorskom injekcijom da bi se dobila uslovna neoplazma, pri čemu je hromofor pogodan za generisanje toplotne energija nakon aktivacije u bliskom infracrvenom ili infracrvenom opsegu talasnih du žina; i aktiviranje hromofora laserom talasne dužine u bliskom infracrvenom ili infracrvenom opsegu do stepena dovoljnog da aktivira hromofor da proizvede fototermalnu reakciju koja indukuje neoplasti čno ć elijsko uništavanje i generiše fragmentirano neoplastično tkivo i ć elijske molekule.

[0112] Primer za fotofizičko uništavanje neoplazme i istovremeno stvaranje na mestu autohtone vakcine u domać inu koji nosi tumor uključuje: (a) odabir imunoadjuvanta; (b) zračenje neoplazme laserom talasne dužine u vidljivom, bliskom infracrvenom ili infracrvenom opsegu, snage i tokom trajanja dovoljnog da proizvede fototermalnu reakciju koja izaziva neoplastično ć elijsko uništavanje i generiše fragmentirano neoplastično tkivo i ć elijske molekule; (c) formiranje “na mestu” vakcine uvođenjem imunoadjuvanta u neoplazmu intratumornom injekcijom, pri čemu “na mestu” vakcina sadrži amalgam fragmentiranog tkiva i ć elijskih molekula i imunoadjuvant; i (d) stimulisanje samoimunolo škog odbrambenog sistema od neoplastičnogć elijskog umnožavanja lokalnom prezentacijom vakcine da bi sistemski izazvao antitumorski odgovor u domać inu.

[0113] Još jedan primer fotofizičkog uništavanja neoplazme i istovremeno stvaranja “na mestu” autologne vakcine u domać inu koji nosi tumor, uključuje: (a) odabir hromofora i imunoadjuvanta, pri čemu je hromofor pogodan za stvaranje toplotne energije nakon aktivacije u bliskom infracrvenom ili infracrvenom opsegu talasnih dužina; (b) uvođenje hromofora u neoplazmu intratumorskom injekcijom; (c) zračenje neoplazme laserom talasne dužine u vidljivom, bliskom infracrvenom ili infracrvenom opsegu, snage i tokom trajanja dovoljnog da aktivira hromofor da proizvede fototermalnu reakciju koja izaziva neoplastično ć elijsko uništavanje i generiše fragmentiranu neoplastiku molekuli tkiva i ć elija; (d) formiranje “na mestu” vakcine uvođenjem imunoadjuvanta u neoplazmu intratumornom injekcijom, pri čemu “na mestu” vakcina sadrži amalgam fragmentiranog tkiva i ć elijskih molekula i imunoadjuvant; i (e) stimulisanje samoimunološkog odbrambenog sistema od neoplastične ć elijske multiplikacije lokalnom prezentacijom vakcine da sistemski indukuje antitumorski odgovor u doma ć inu.

[0114] Još jedan primeran postupak fotofizičkog uništavanja neoplazme i istovremeno generisanja autološke vakcine “na mestu” u domać inu koji nosi tumor, uključuje: (a) odabir hromofora i imunoadjuvanta, pri čemu je hromofor pogodan za stvaranje toplotne energije nakon aktivacije u talasne dužine bliskog infracrvenog ili infracrvenog zračenja; (b) istovremeno ili odvojeno uvođenje hromofora i imunoadjuvanta u neoplazmu intratumornom injekcijom da bi se dobila uslovna neoplazma; (c) formiranje vakcine “na mestu” zračenjem uslovljene neoplazme laserom talasne dužine u bliskom infracrvenom ili infracrvenom opsegu snage i tokom vremena dovoljnog da aktivira hromofor da proizvede fototermalnu reakciju koja izaziva neoplastično ć elijsko uništavanje i generiranje fragmentirano neoplastično tkivo i ć elijski molekuli, pri čemu “na mestu” vakcina sadrži amalgam fragmentiranog tkiva i ć elijskih molekula i imunoadjuvant; i (d) stimulisanje samoimunološkog odbrambenog sistema od neoplastičnog ć elijskog umnožavanja lokalnom prezentacijom vakcine i omoguć avanjem sistemskog širenja vakcine unutar doma ć ina.

[0115] Kao što je ovde opisano, postupak može dalje da uključuje konjugaciju imunoadjuvanta sa antitelom specifičnim za tumor, čime se formira konjugat i administrira konjugat domać inu. Alternativno, postupak može dalje da uključuje konjugaciju imunoadjuvanta sa specifičnim antigenom za tumor, formirajuć i tako konjugat i davanje konjugata doma ć inu. Mo že se koristiti bilo koji broj pogodnih hromofora, na primer, indocijanin zeleni, DHE, m-THPP, AlPcS4, ZnET2 i Bchla.

[0116] Dalje, postupak može da uključuje konjugaciju kombinacije hromofora i imunoadjuvanta sa antitelom specifičnim za tumor, čime se formira konjugat i administrira konjugat domać inu. Alternativno, postupak može dalje da uključuje konjugaciju hromofora i imunoadjuvanta sa specifičnim antigenom za tumor, formirajuć i tako konjugat i davanje konjugata doma ć inu. Mo že se koristiti bilo koji broj pogodnih hromofora, na primer, indocijanin zeleni, DHE, m-THPP, AlPcS4, ZnET2 i Bchla.

[0117] Preparati i formulacije ovog pronalaska, uključujuć i preparate viskoelastičnog glikovanog hitozana (GC), takođe se mogu koristiti zajedno sa fotodinamičkom terapijom (PDT). Fotosenzibilizujuć a jedinjenja pokazuju fotohemijsku reakciju kada su izložena svetlosti. Fotodinamička terapija (PDT) koristi takva fotosenzibilna jedinjenja i lasere za proizvodnju nekroze tumora. Lečenje solidnih tumora PDT obično uključuje sistemsku primenu fotosenzibilizujuć ih jedinjenja koja lokalizuju tumor i njihovu naknadnu aktivaciju laserom. Nakon upijanja svetlosti odgovarajuć e talasne du žine, senzibilizator se pretvara iz stabilne atomske strukture u pobuđeno stanje. Citotoksičnost i eventualno uništavanje tumora posreduju se interakcijom između senzibilizatora i molekularnog kiseonika unutar tretiranog tkiva radi stvaranja citotoksičnog singlet kiseonika.

[0118] Dve dobre opšte reference koje se odnose na PDT, biomedicinske lasere i fotosenzibilizujuć a jedinjenja, uključujuć i isporuku svetlosti i parametre doziranja, su Fotosenzibilna jedinjenja: njihova hemija, biologija i klinička upotreba, objavljene 1989. od strane John Wilei and Sons Ltd., Chichester, UK

1

, ISBN 0 471 92308 7, i Fotodinamička terapija i biomedicinski laseri: Zbornik radova sa Međunarodne konferencije o fotodinamičkoj terapiji i primeni medicinskih lasera, Milano, 24. i 27. juna 1992. , u izdanju Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, Holandija, ISBN 0444814302.

[0119] US patenti koji se odnose na PDT uključuju US br. 5,095,030 i 5,283,225 od Lewi et al .; US 5,314,905 Pandei et al .; US 5,214,036 od Allison et al; i US br. 5,258,453 od Kopecek et al. Lewi-jevi patenti otkrivaju upotrebu fotosenzibilizatora na koje deluje talasna du žina između 670-780 nm konjugovanih sa antitelima specifičnim za tumor, kao što su ligandi specifični za receptor, imunoglobulini ili imunospecifični delovi imunoglobulina. Pandei-jevi patenti su usmereni na pirofeoforbidna jedinjenja za upotrebu u standardnoj fotodinamičkoj terapiji. Pandei takođe otkriva konjugovanje svojih kompozicija sa ligandima i antitelima. Allisonov patent je sličan Lewijevim patentima po tome što su zeleni porfirini konjugovani sa lipokompleksima da bi se poveć ala specifičnost porfirinskih jedinjenja za ciljane tumorske ć elije. Patent Kopecek takođe otkriva kompozicije za lečenje kancerogenih tkiva. Ove kompozicije se sastoje od dva leka, leka protiv karcinoma i leka koji se može aktivirati, prikačenih na kopolimerni nosač. Jedinjenja ulaze u ciljane ć elije pinocitozom. Lek protiv karcinoma deluje nakon što je napadnuta ciljana ć elija. Posle određenog vremenskog perioda, izvor svetlosti se koristi za aktiviranje fotosenzibilisanog supstituenta.

Dalje primene za imunoterapiju tumora

[0120] Preparati i formulacije ovog pronalaska, uključujuć i preparate viskoelastičnog glikovanog hitozana (GC), mogu se koristiti, npr, kao imunoadjuvanti, u kontekstu imunoterapije tumora.

[0121] Glavne funkcije imunog sistema su razvijanje koncepta „sebe“ i uklanjanje onoga što je „ne-sam“. Iako su mikroorganizmi glavni neentiteti sa kojima se svakodnevno susreć u, imuni sistem takođe radi na uklanjanju metastaza i transplantacija.

[0122] Postoji nekoliko različitih vrsta imuniteta. Nespecifični ili urođeni imunitet odnosi se na inherentni otpor koji manifestuje vrsta koja nije imunizovana (osetljiva ili alergi čna) prethodnom infekcijom ili vakcinacijom. Njegova glavna ć elijska komponenta je fagocitni sistem, čija je funkcija da guta i svari napadajuć e mikroorganizme. Fagociti uključuju neutrofile i monocite u krvi i makrofage u tkivima. Proteini komplementa su glavna rastvorljiva komponenta nespecifičnog imuniteta. Reaktanti akutne faze i citokini, poput interferona, takođe su deo urođenog imuniteta.

[0123] Specifični imunitet je imuni status u kome postoji izmenjena reaktivnost usmerena isklju čivo na antigenske odrednice (infektivni agens ili druge) koji su ga stimulisali. Ponekad se naziva ste čenim imunitetom. Može biti aktivan i specifičan kao rezultat prirodno stečene (očigledne ili nevidljive) infekcije ili namerne vakcinacije; ili može biti pasivan, stečen prenosom antitela od druge osobe ili životinje. Specifični imunitet ima obeležja učenja, prilagodljivosti i pamć enja. Ć elijska komponenta je limfocit (npr. T- ć elije, B- ć elije, ć elije prirodnih ubica (NK), a imunoglobulini su rastvorljiva komponenta.

[0124] Delovanje T-ć elija i NK- ć elija u prepoznavanju i uništavanju parazitizovanih ili stranih ć elija naziva se ć elijski posredovanim imunitetom. Suprotno od imuniteta posredovanog ć elijama, humoralni imunitet je povezan sa cirkulacijom antitelima koja B- ć elije proizvode nakon složenog procesa prepoznavanja.

[0125] Što se tiče imunologije tumora, više puta je pokazan značaj limfoidnih ć elija u imunosti tumora. Ć elijski posredovani odgovor doma ć ina na tumore uključuje koncept imunološkog nadzora, kojim ć elijski mehanizmi povezani sa ć elijski posredovanim imunitetom uništavaju novo transformisane tumorske ć elije nakon prepoznavanja antigena povezanih sa tumorom (antigeni povezani sa tumorskim ć elijama koji nisu uočljivi u normalnim uslovima ć elije). Ovo je analogno procesu odbacivanja presađenih tkiva od neidentičnog davaoca. Kod ljudi je rast tumorskih čvorova inhibiran in vivo mešanjem suspenzija limfocita periferne krvi pacijenta i tumorskih ć elija, što ukazuje na reakciju na tumor posredovanu ć elijama. Studije in vitro pokazale su da limfoidne ć elije pacijenata sa određenim neoplazmama pokazuju citotoksičnost prema odgovarajuć im humanim ć elijama tumora u kulturi. Ove citotoksične ć elije, koje su obično T-ć elije, pronađene su sa neuroblastomom, malignim melanomima, sarkomima i karcinomima debelog creva, dojke, grlić a materice, endometrijuma, jajnika, testisa, nazofarinksa i bubrega. Makrofagi takođe mogu biti uključeni u ć elijski posredovani odgovor doma ć ina na tumore u prisustvu tumora povezanih antigena, limfokina ili interferona.

[0126] Humoralna antitela koja reaguju sa tumorskim ć elijama in vitro proizvedena su kao odgovor na niz životinjskih tumora indukovanih hemijskim karcinogenima ili virusima. Hibridoma tehnologija in vitro omoguć ava otkrivanje i proizvodnju monoklonskih antitumorskih antitela usmerenih protiv razli čitih životinjskih i ljudskih neoplazmi. Zaštita posredstvom antitela protiv rasta tumora in vivo, međutim, bila je vidljiva samo kod određenih leukemija i limfoma životinja.

[0127] Suprotno tome, zaštita posredovana limfoidnim ć elijama in vivo javlja se u širokom spektru životinjskih tumorskih sistema. O imunoterapiji karcinoma najbolje je razmi šljati kao o širem predmetu, naime o biološkoj terapiji, ili o primeni modifikatora biološkog odgovora. Ovi agensi deluju kroz jedan ili više različitih mehanizama (1) da stimulišu antitumorski odgovor domać ina pove ć avanjem broja efektorskih ć elija ili stvaranjem jednog ili više rastvorljivih medijatora; (2) da služi kao izvršitelj ili posrednik; (3) da se smanje mehanizmi za suzbijanje domać ina; (4) da promene tumorske ć elije kako bi poveć ale njihovu imunogenost ili pove ć ale verovatno ć u da budu o šte ć ene imunološkim procesima; ili (5) za poboljšanje tolerancije domać ina na citotoksične supstance ili terapiju zračenjem. Do sada je fokus imunoterapije tumora posredovanih ć elijama bio na reinfuziji limfocita pacijenta nakon ekspanzije in vitro izlaganjem interleukinu-2. Jedna varijacija uključuje izolovanje i širenje populacija limfocita koji su infiltrirani u tumore in vivo, takozvani limfociti koji infiltriraju tumor. Druga je istovremena upotreba interferona, za koji se smatra da pojačava ekspresiju antigena histokompatibilnosti i antigena povezanih sa tumorom na ć elijama tumora, pove ć avaju ć i tako ubijanje tumorskih ć elija infuziranim efektorskim ć elijama.

[0128] Humoralna terapija se dugo koncentrisala na upotrebu antitumorskih antitela kao oblika pasivne imunoterapije, za razliku od aktivne stimulacije sopstvenog imunog sistema domać ina. Druga varijacija je konjugacija monoklonskih antitumorskih antitela sa toksinima, kao što su ricin ili difterija, ili sa radioizotopima, tako da ć e antitela dostaviti ove toksične agense posebno u ć elije tumora. Aktivna imunizacija tumorskim ć elijama doma ć ina, nakon zračenja, neurami. Takođe je pokušano lečenje nidazom, konjugacija haptena ili hibridizacija. Kliničko poboljšanje primeć eno je kod manjine tako lečenih pacijenata. Tumorske ć elije drugih su koriš ć ene nakon njihovog zračenja zajedno sa pomo ć nim sredstvima u akutnoj limfoblastnoj leukemiji i akutnoj mijeloblastnoj leukemiji nakon remisije. U nekim serijama je zabeleženo produženje remisije ili poboljšana stopa reindukcije, ali u već ini ne. Interferoni, faktor tumorske nekroze i limfotoksini takođe su korišć eni da utiču na imunološki posredovane mehanizme. Nedavni pristup, koji koristi i ć elijski i humoralni mehanizam, je razvoj "heterocros-povezanih antitela", uključujuć i jedno antitelo koje reaguje sa ć elijom tumora povezano sa drugim antitelom koje reaguje sa citotoksičnom efektorskomć elijom, čine ć i ovo drugo specifičnije ciljanim na tumor. Prijavljena je infiltracija imunih ć elija doma ć ina u PDT lečenog PDT-om.

Kombinovani PDT i imunoterapija

[0129] U skladu sa ovim pronalaskom, poželjno je koristiti preparate glikovanog hitozana (GC) koji imaju odgovarajuć u viskoznost koja omogu ć ava njihovu upotrebu kao injekcionog materijala u dodatnim primenama, kao što su kombinovana fotodinamička terapija karcinoma (PDT) i tumor metoda imunoterapije.

[0130] Potencijal za kombinovanje PDT-a sa imunoterapijom istraživali su Korbelik, Krosl, Dougherti i Chaplin. Videti fotodinamičku terapiju i biomedicinske lasere, supra, str. 518-520. U svojoj studiji istraživali su moguć nost pojačanja imune reakcije na PDT i njen pravac ka sveprisutnijem uni štavanju lečenih tumora. Tumor, skvamozni karcinom SCCVII, uzgajan je na ženkama miševa C3H. Sredstvo za imunoaktivaciju SPG (B-glukan visoke molekulske težine koji stimuliše makrofage i limfoidne ć elije da postanu mnogo reaktivniji na stimuluse citokina i drugih imunolo ških signala) primenjeno je intramuskularno u 7 dnevnih doza, bilo da se završava jedan dan pre PDT ili započinje neposredno nakon PDT . Upotrebljen je PDT zasnovan na fotofrinu; fotofrin je dat intravenozno 24 sata pre tretmana svetlom. Pokazano je da SPG imunoterapija pojačava efekat direktnog ubijanja PDT-a. Indirektni efekat ubijanja (viđen kao smanjenje preživljavanja tumorskih ć elija ostavljenih in situ) bio je, međutim, mnogo izraženiji kod tumora životinja koje nisu primale SPG. Razlika u efikasnosti imunoterapije SPG kada se izvodi pre i posle PDT sugerisala je da se maksimalna interakcija postiže kada imunološka aktivacija dostigne vrhunac u vreme isporuke svetlosti ili neposredno nakon toga. Sa SPG-om koji po činje nakon PDT-a (i postizanjem optimalne imunološke aktivacije 5-7 dana kasnije), kada je očigledno prekasno za blagotvornu reakciju.

[0131] U drugoj studiji je ispitivana upotreba PDT za pojačavanje efekta bioreaktivnih lekova koji su citotoksični pod hipoksičnim uslovima. Videti Fotodinamičku terapiju i biomedicinske lasere, supra, str.

698-701. Otkriveno je da se antitumorska aktivnost takvih lekova može pojačati in vivo kada su se koristili u kombinaciji sa tretmanima koji poveć avaju hipoksiju tumora. Le čenje karcinoma fotodinamičkom terapijom, u kombinaciji sa imunoadjuvansom.

[0132] U skladu sa ovim pronalaskom, poželjno je da se koriste viskoelastični glikovirani hitozan (GC) formulacije pronalaska koji imaju odgovarajuć u viskoznost kao materijali za injekcije za upotrebu u lečenju karcinoma. To se može postić i na bilo koji pogodan način, na primer, zajedno sa aplikacijama kao što su kombinovana fototermalna ili fotodinamička terapija karcinoma (PDT) i metode imunoterapije tumora. Termin karcinom, kako se ovde koristi, opšti je pojam koji treba da obuhvati bilo koji od niza različitih vrsta malignih promena, od kojih već ina napada invazivna tkiva, mo že metastazirati na nekoliko mesta i verovatno ć e se ponoviti nakon pokušaja uklanjanja i da uzrokuje smrt pacijenta ukoliko se ne leči na odgovarajuć i način. Neoplazma, kako se ovde koristi, odnosi se na abnormalno tkivo koje raste

1

ć elijskom proliferacijom brže nego normalno. Nastavlja da raste čak i nakon što se podražaj koji je inicirao njegov rast rasprši. Neoplazme pokazuju delimični ili potpuni nedostatak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom i obično formiraju posebnu masu koja može biti ili benigna ili maligna.

[0133] U skladu sa ovim pronalaskom, određeni primeri karcinoma koji se mogu lečiti preparatima glikovanog hitozana (GC) koji imaju odgovarajuć u viskoznost kao materijali za injekcije uklju čuju, ali nisu ograničeni na, karcinom grlić a materice, dojke, bešike, debelog creva, prostate, grkljana, endometrijuma, jajnika, usne duplje, bubrega, testisa (neseminatoznog) i plu ć a (nemalih ć elija).

[0134] Štaviše, u skladu sa ovim pronalaskom, lečenje se takođe može primeniti na pogodan način u kombinaciji sa drugim vrstama lečenja karcinoma, na primer, lečenjem zračenjem. Zračenje igra ključnu ulogu, na primer, u saniranju Hodgkinove bolesti, nodularnih i difuznih neHodgkinovih limfoma, skvamoznih ć elija karcinoma glave i vrata, medijastinalnih tumora klica, seminoma, raka prostate, ranog stadijuma raka dojke , rani stadijum karcinoma pluć a i meduloblastoma. Zračenje se takođe može koristiti kao palijativna terapija kod karcinoma prostate i karcinoma dojke kada su prisutne metastaze u kostima, kod multiplog mijeloma, karcinoma pluć a i ezofagaringealnog stadijuma, karcinoma želuca i sarkoma, kao i kod metastaza u mozgu. Karcinom koji se može lečiti uključuje, na primer, Hodgkinovu bolest, rani stadijum ne-Hodgkinovih limfoma, karcinom testisa (seminomalni), prostate, grkljana, grlić a materice i, u manjoj meri, karcinom nazofarinksa, nazalnih sinusa, dojke, jednjaka i pluć a.

[0135] Lečenje se takođe može primeniti na pogodan način zajedno sa drugim vrstama antineoplastika i droge. Antineoplastični lekovi uključuju one koji sprečavaju deljenje ć elija (mitozu), razvoj, sazrevanje ili širenje neoplastičnih ć elija. Idealan antineoplastični lek uništio bi ć elije karcinoma bez štetnih efekata ili toksičnosti na normalne ć elije, ali takav lek ne postoji. Uprkos uskom terapijskom indeksu mnogih lekova, međutim, kod nekih pacijenata je moguć e lečenje, pa čak i izlečenje. Utvrđeno je da su određeni stadijumi horiokarcinoma, Hodgkinove bolesti, difuzni limfom velikih ć elija, Burkittov limfom i leukemija podložni antineoplasticima, kao i karcinomi testisa (neseminomati čni) i pluć a (male ć elije). Uobičajene klase antineoplastičnih lekova uključuju, ali nisu ograničene na, alkilirajuć a sredstva, antimetabolite, biljne alkaloide, antibiotike, nitrosoureje, neorganske jone, enzime i hormone.

“Na mestu” autologne vakcine protiv karcinoma, kao što je imunoterapija uz pomo ć lasera

[0136] Sastavi izvedeni iz hitozana i, posebno, viskoelastični glikovirani hitozanski preparati ovog pronalaska, efikasni su u lečenju promena i drugih medicinskih poremeć aja. Dodatna upotreba glikovanog hitozana, samostalno ili u kombinaciji sa drugim lekovima, uključuje upotrebu kao imunostimulansa u lečenju imunokompromitovanih pacijenata, uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na karcinom i sindrom stečene imunodeficijencije.

[0137] Jedinjenja izvedena iz hitozana prema ovom pronalasku su stoga korisni u bezbroj primena, uključujuć i na primer kao imunoadjuvanti ili kao komponenta imunoadjuvanta, kako je ovde detaljno opisano. Bez obzira na druge namene, osnovna upotreba jedinjenja izvedenih iz hitozana je kao imunoadjuvanti u vezi sa “na mestu” autolognim vakcinama protiv karcinoma (inCVAKS), kao što je imunoterapija potpomognuta laserom (LIT), i u ovom kontekstu jedinjenja izvedena iz hitozana kako su ovde detaljno opisana.

[0138] Kao što je ovde dalje opisano, dodatne realizacije ovog pronalaska usmerene su na upotrebu glikovanih hitosanskih preparata iz ovog pronalaska kao imunoadjuvanti u sprezi sa inCVAKS uop šte, a posebno LIT, za lečenje karcinoma. Imunoterapija potpomognuta laserom, koju koristi ovaj pronalazak, poželjno obuhvata uvođenje u ili oko neoplazme imunoadjuvanta koji sadrži viskoelastične kompozicije izvedene iz hitozana, koje prate fototermalno zračenje istog tumora. Fototermalno dejstvo se izvodi pri zračenju dovoljnom za indukovanje neoplastične ć elijske destrukcije, koje se može izvesti sa ili bez intratumoralne injekcije ili drugim načinima isporuke hromofora i kombinovati sa injekcijom ili drugim datim sredstvima viskoelastičnog glikovanog hotozina indukuovanog jedinjenjima iz ovog pronalaska, ć elijski posredovani i humoralni imunološki antitumorski odgovori.

[0139] U poželjnim rešenjima, obezbeđen je poboljšani LIT pri čemu poboljšanje obuhvata upotrebu ovde opisanih injekcionih viskoelastičnih glikovanih hitozanskih preparata iz ovog pronalaska. Ovaj pronalazak takođe razmatra metode in vivo aktivacije specifičnih komponenata imunog sistema u sprezi sa inCVAKS uopšte, ili posebno LIT, koji obuhvataju tretman viskoelastičnim glikovanim preparatom hitozana.

[0140] Kao što je ovde dalje opisano, utvrđeno je da LIT obezbeđuje “na mestu” autolognu vakcinu protiv karcinoma (inCVAKS) koja prevazilazi ograničenja trenutnih imunoterapija i vakcina protiv karcinoma. Generalno, dva principa u osnovi LIT-a su (1) lokalno zagrevanje primarnog tumora laserom za devitalizaciju tumora i oslobađanje tumorskih antigena i (2) lokalna injekcija snažnog i netoksičnog imunoadjuvanta koji sadrži glikovani hitozan (GC), koji stupa u interakciju sa oslobođenim antigenima tumora da bi indukovao imuni odgovor protiv karcinoma. Dakle, LIT efikasno funkcioni še kao “na mestu”

1

autologna vakcina koja koristi cele ć elije tumora kao izvore tumorskih antigena od svakog pojedina čnog pacijenta bez prethodne selekcije tumorskih antigena ili ex vivo preparata.

[0141] U skladu sa ovim pronalaskom, još jedna prednost korišć enja ovde opisanih injekcionih preparata viskoelastičnog glikovanog hitozana iz ovog pronalaska, zajedno sa LIT, je ta što korišć enjem ovog LIT pristupa dolazi do aktivacije dendritičnih ć elija (DC), a zatim izlaganje aktiviranog DC tumorskim antigenima in vivo. LIT stoga predstavlja povoljan pristup drugim vakcinacijama protiv karcinoma celih ć elija, eliminišu ć i potrebu za ex vivo preparatima, i korišć enjem LIT-a zajedno sa viskoelastičnim glikovanim hitozanskim preparatima kao imunoadjuvansima.

[0142] Jedna primerna formulacija preparata glikovanog hitozana proizvedena je pod imenom PROTECTIN. Primeć eno je da PROTECTIN u saradnji sa LIT stimuliše imuni sistem i indukuje specifični za tumor imunitet 1) aktivirajuć i dendritične ć elije, 2) pove ć avaju ć i interakciju između tumorskih ć elija i dendritičnih ć elija i 3) pove ć avaju ć i prezentaciju antigena tumora imunolo škom sistemu.

[0143] Ostali viskoelastični glikovani hitozanski preparati ovog pronalaska takođe funkcionišu da stimulišu imuni sistem i indukuju tumorski specifični imunitet 1) aktiviranjem dendritičnih ć elija, 2) pove ć anjem interakcije između tumorskih ć elija i dendritičnih ć elija i 3) pove ć anjem tumora prezentacija antigena imunom sistemu.

[0144] Prema tome, u skladu sa poželjnom realizacijom pronalaska, formulacije viskoelastičnog glikovanog hitozana aktiviraju jednu ili više komponenata imunog sistema, posredujuć i u željenim terapijskim efektima.

[0145] Kao što je ovde dalje opisano, određene komponente imunog sistema koje se aktiviraju uključuju komponente nespecifičnog ili urođenog imuniteta, naime fagocitni sistem, uključujuć i neutrofile i monocite u krvi i makrofage u tkivima; proteini komplemenata, glavna rastvorljiva komponenta nespecifičnog imuniteta; i reaktanti akutne faze i citokini, kao što je interferon, takođe su deo urođenog imuniteta. Postoji mnogo različitih komponenti specifičnog imuniteta, na primer, limfociti (npr. T-ć elije, B-ć elije, prirodne ćelije ubice (NK)) i imunoglobulini. Formulacije glikovanog hitozana prema pronalasku takođe deluju sa limfoidnim ć elijama da bi podstakle imunitet tumora. Makrofagi tako đe mogu biti uključeni u ć elijski posredovani odgovor doma ć ina na tumore u prisustvu povezanih tumorskih antigena, limfokina ili interferona.

[0146] Specifične komponente imunog sistema aktiviraju se nakon "fototermalnog" tretmana. Kada se dogodi fototermalno uništavanje, fragmentirano tkivo i ć elijski molekuli se raspršuju unutar doma ć ina u prisustvu imunološki potencirajuć eg materijala, kao što je hitozan. U stvari, formira se vakcina “na mestu”. Ova mešavina materijala zatim cirkuliše u domać inu i detektuje je sistem imunološkog nadzora. Sledi trenutna mobilizacija ć elijski posredovanog imuniteta koji obuhvata NK- ć elije i regrutovane T- ć elije ubice. Ove ć elije migriraju na mesta sličnih antigena ili hemikalija. Vremenom ć elijski posredovani imunitet prelazi na humoralni imunitet stvaranjem citotoksi čnih antitela. Ova antitela slobodno cirkulišu telom i vežu se za ć elije i materijale za koje su kodirana. Ako se ovo vezivanje dogodi u prisustvu faktora komplementa, rezultat je ć elijska smrt.

[0147] Viskoelastični glikovani hitozanski preparati prema ovom pronalasku imaju neočekivanu korist u „na mestu” vakcinama protiv karcinoma, koje se zasnivaju na “na mestu” aktivaciji ć elija koje predstavljaju antigen (npr. dendritične ć elije i makrofagi) i naknadnom izlaganju tumorskih antigena ć elijama koje predstavljaju antigen. Viskoelastični glikovani hitozan preparati prema ovom pronalasku takođe aktiviraju druge ć elijske medijatore, uključuju ć i, ali bez ograničenja, faktor nekroze tumora (npr. TNFa) i azotni oksid koji doprinose terapijskim efektima.

[0148] Sledeć a prednost koriš ć enja ovde opisanih injekcionih viskoelastičnih glikovanih hitozanskih preparata ovog pronalaska, zajedno sa LIT, je ta što korišć enjem ovog pristupa ovaj metod nezavisno pokreć e imuni odgovor kod svakog pojedinca i on ne zavisi od unakrsne reaktivnosti u ekspresiji antigena specifičnog za tumor između domać ina (kao što je potrebno u konvencionalnoj imunoterapiji antitelima i vakcinaciji). Histohemijske studije su otkrile da su serumi pacova koji su nosili tumor izle čen sa LIT sadržali antitela koja su se vezala za plazemsku membranu kako živih, tako i očuvanih tumorskih ć elija. “Western blot” analiza proteina tumorskih ć elija koriš ć enjem seruma (pacova uspešno lečenih pomo ć u LIT) kao izvora primarnih antitela pokazala je različite trake, ukazujuć i na indukciju antitela selektivnih na tumor. Takođe je pokazano da uspešno lečeni pacovi mogu steć i dugotrajnu otpornost na ponovno izazivanje tumora, a usvojeni imunitet može se preneti pomoć u ć elija slezine sa uspešno lečenih pacova, što ukazuje na tumorski specifični imunitet.

[0149] Prema tome, korišć enjem ovde opisanih injekcionih viskoelastičnih glikovanih hitozanskih preparata ovog pronalaska, postoji nekoliko prednosti koje zadovoljavaju kritične potrebe u pružanju efikasnog lečenja karcinoma. Ovo je posebno povoljno za pacijente sa karcinomom, jer ovaj pronalazak takođe nudi iznenađujuć e i neočekivano korisne preparate koji se lako daju injekcijom, a samim tim poveć avaju usaglašenost i pružaju efikasne alternative lečenju konvencionalnim pristupima koji ne pružaju (1) efikasan, (2) netoksičan i (3) praktičan tretman metastatskog karcinoma u kasnoj fazi. Kritično

1

pitanje u terapiji karcinoma dojke je da se svi pacijenti ne le če trenutnim, konvencionalnim metodologijama, a oni kojima se dijagnostikuje u kasnim fazama imaju lo šu prognozu, sa još manje valjanih opcija za lečenje. I dok je poslednjih godina postignut veliki napredak u lečenju karcinoma dojke, ključni problemi ostaju. Viskoelastični glikovani hitozan preparati u injekcijama, kako su ovde opisani, pružaju nekoliko prednosti koje ispunjavaju kritične potrebe u pružanju efikasnog lečenja karcinoma.

[0150] Pokazano je da LIT indukuje sazrevanje dendritičnih ć elija (procenjeno pomo ć u ekspresije CD80), pojačava proliferaciju T-ć elija, pove ć ava sekreciju IFN-i i pove ć ava ekspresiju HSP70. Dalje, pokazano je da kombinovani efekti LIT-a (na primer, zagrevanje tumora laserom i injekcija glikovanih hitosanskih preparata u skladu sa ovim pronalaskom) indukuju tumorski specifični imunitet, uz infiltraciju citotoksičnih CD4 i CD8 specifičnih za tumor ć elije u tumore nakon tretmana.

[0151] Kao što je ovde detaljnije opisano, LIT stoga pruža brojne prednosti, uključujuć i, ali ne ograničavajuć i se na:

• Eliminiše lečene primarne tumore

• Eliminiše nelečene metastaze

• Izaziva dugoročni imunitet i preživljavanje

• Stvara otpornost na ponovno pojavljivanje tumora

• Nije toksičan i siguran je za upotrebu kod ljudi u terapijskim dozama

[0152] U skladu sa jednim aspektom pronalaska, promena, poput malignog tumora, ozračena je vidljivom, infracrvenom ili infracrvenom svetlošć u snage i trajanja dovoljnog da povisi temperaturu neoplazme na nivo koji indukuje neoplastično ć elijsko uništavanje i stimuliše samoimunološki odbrambeni sistem od neoplastičnog celularnog umnožavanja. Da bi se olakšalo zagrevanje tumora, hromofor sa vrhovima apsorpcije koji odgovaraju talasnoj dužini primenjene svetlosti može se ubrizgati pre primene tretmana svetlošć u. Nakon zračenja svetloš ć u, daje se viskoelastični glikovani imunoadjuvant dobijen hitozanom, na primer injekcijom, u tumor ili tkivo koje neposredno okružuje tumor.

[0153] U skladu sa drugim aspektom pronalaska, rastvor indocijanin zelenog (ICG) i glikovanog hitozana se priprema u koncentraciji od 0,1 % do 2 % ICG hitozana. Rastvor se ubrizgava u neoplazmu, a zatim se promena zrači laserom snage oko 5 vati i talasne dužine zračenja sposobnog za lako prodiranje u normalna ć elijska tkiva bez značajnih poreme ć aja. Zračenje se nastavlja od oko jednog do desetak minuta, što je dovoljno da se temperatura neoplazme povisi na nivo koji indukuje neoplasti čnu ć elijsku destrukciju i stimuliše ć elijski posredovani i humoralni imuni odgovor.

[0154] Kao što je ovde dalje opisano, ovaj pronalazak ima nekoliko prednosti u odnosu na druge konvencionalne i nekonvencionalne načine lečenja. Ključna je kombinacija uništavanja tumora i adjuvanta imunostimulacije. Najznačajnija prednost je kombinovano akutno i hronično uništavanje tumora. Akutni gubitak tumora uzrokovan je fotovaporizacijom, fotoablacijom ili termi čkim ubijanjem neoplastičnog tkiva, u velikom i kontrolisanom obimu, u neposrednoj blizini, smanjujuć i teret tumora, a time i osnovu množenja, tako da sistem samoodbrane može boriti se sa slabijim „neprijateljem“. Kada se dogodi lokalno uništavanje tumora, fragmentirano tkivo i ć elijski molekuli se lokalno raspršuju unutar doma ć ina u prisustvu imunološki potencirajuć eg materijala, kao što je glikovani hitozan. U stvari, formira se vakcina “na mestu”. Sledi trenutna mobilizacija ć elijski posredovanog imuniteta koji obuhvata NK- ć elije i regrutovane T-ć elije ubice. Ove ć elije migriraju na mesta sličnih antigena ili hemikalija. Vremenom ć elijski posredovani imunitet prelazi na humoralni imunitet stvaranjem citotoksi čnih antitela. Ova antitela slobodno cirkulišu telom i vežu se zać elije i materijale za koje su kodirana. Ako se ovo vezivanje dogodi u prisustvu faktora komplementa, rezultat je ć elijska smrt. Vremenski okviri za ova dva imunolo ška načina delovanja su od 0 do 2 nedelje za reakciju posredovanu ć elijama, dok humoralni krak sazreva pribli žno 30 dana i treba da traje dugo, sve do kraja životnog veka domać ina.

[0155] Ukratko, dugoročno preživljavanje sa potpunom eradikacijom karcinoma može se postić i upotrebom viskoelastičnih glikovanih hitozanskih preparata ovog pronalaska. To je kombinovani rezultat smanjenog optereć enja tumora usled ablativnih (na primer fototermalnih) interakcija i poja čanog odgovora imunog sistema zbog prisustva glikovanog hitozana ili drugih imunomodulatora.

[0156] Prema drugim aspektima pronalaska, glikovani hitozanski preparati ovog pronalaska mogu se takođe koristiti za antimikrobne i/ili hemostatske primene. Tako se preparati glikovanog hitozana (GC) mogu formulisati, na primer, kao antimikrobni hemostatski sprej, pri čemu GC formulacija ima viskoznost i pokazuje reološka svojstva koja omoguć avaju prskanje iz konvencionalnih kontejnera. Štaviše, GC se može uključiti u druge formulacije pod uslovom da se primenjuje u antimikrobnim i/ili hemostati čkim efektivnim koncentracijama i sa viskozitetima/reološkim svojstvima koja omoguć avaju njegovu izdašnost iz kontejnera pogodnih za tu namenu.

[0157] Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan sledeć im primerima. Ovi primeri su dati kao ilustracija i nisu ni na koji način namenjeni ograničavanju obima pronalaska. Primere stoga ne treba tumačiti kao ograničenja

1

obima pronalaska, ve ć ih treba posmatrati kao primere poželjnih njegovih izvođenja.

PRIMERI

Primer 1. Primer procesa pripreme glikovanog hitozana (GC)

[0158] Glikovani hitozan se dobija reakcijom hitozana sa monosaharidom i/ili oligosaharidom, po željno u prisustvu sredstva za zakiseljavanje, tokom vremena dovoljnog da se postigne stvaranje Schiffove baze između karbonilne grupe šeć era i primarnih amino grupa hitozana (ovde se takođe naziva glikacija amino grupe) do unapred određenog stepena, pri čemu se postiže unapred određeni procenat (%) glikacije polimera hitozana. Nakon toga sledi stabilizacija smanjenjem Schiff-ovih baza i njihovih preuređenih derivata (proizvodi Amadori). NMR tragovi se koriste za verifikaciju vezivanja monosaharida i/ili oligosaharida sa hitozan polimerom, dok se hemijsko merenje preostalih slobodnih amino grupa, na primer putem ninhidrinske reakcije, koristi za procenu stepena glikacije.

Primer 2. Sterilna filtracija

[0159] Iako je konvencionalni galaktohitozan od 1500 kDa, opisan u US patentu 5,747,475, relativno jednostavan za sintezu, sterilizacija, na primer, filterom od 0,22 mikrona, je nemoguć a bez naru šavanja integriteta filtra, čime se konvencionalni glikovani hitozan čini neprikladan za proizvodnju GMP i ljudsku upotrebu. Suprotno tome, novi ovde opisani viskoelastični glikovirani hitozan ima značajne prednosti u pogledu proizvodnje GMP i sterilne filtracije zbog neočekivanih i korisnih fiziohemijskih svojstava. Na primer, pri molekulskoj težini (M.V.) od 250.000 Da (250 kDa), sterilna filtracija sa filterom od 0.22 mikrona je vrlo izvodljiva, sa brzinom protoka od 100 ml/min bez gubitka materijala tokom filtracije. Primer 3. Viskoznost glikovanog hitozana (GC)

[0160] GC preparati već e molekulske mase pokazuju ve ć e viskoznosti (mereno u Cp):

[0161] Grafikon ispod prikazuje viskoznost (u Cp; osa i) u odnosu na molekularnu težinu (u kDa; osa x) u uzorcima GC sa molekularne težine u rasponu od 100 kDa do 1500 kDa. Koncentracija GC u rastvoru u ovom eksperimentu opadala je sa porastom molekulske mase, u rasponu od 0,6 % (100 kDa) do 0,11 % (1,500 kDa).

1

[0162] Vrlo iznenađujuć e, utvrđeno je da se viskoznost linearno pove ć ava sa pove ć anjem molekularne težine samo ako se koncentracija GC u uzorku smanji sa poveć anjem molekulske te žine. Donja tabela i grafikon pokazuju procenat GC u rastvoru uzoraka korišć enih u gornjem eksperimentu viskoznosti.

[0163] Rezultati jasno pokazuju da 1) GC preparati već e molekulske težine koreliraju sa višim viskozitetima (mereno u Cp) i 2) korelacija između viskoznosti i molekulske težine nije linearna ako se koncentracija održava konstantnom. Drugim rečima, viskoznost se neproporcionalno poveć ava sa poveć anjem molekularne težine, što čini glikovane hitozane ve ć e molekulske težine (kao što su oni otkriveni u US 5,747,475) neprikladnim za injekcije ili sterilnu filtraciju.

[0164] Viskoelastični glikovani hitozan preparati koji sadrže nižu molekulsku težinu (tj. Ispod ∼ 400 kDa) glikovirani hitozan tako obezbeđuju poboljšanu injektibilnost; ovi preparati su korisni, na primer, za lečenje karcinoma koji koriste fotodinamičku terapiju i imunoterapiju uz pomoć lasera za indukovanje neoplastične ć elijske destrukcije i za stimulisanje sistema samoimunološke odbrane od neoplastičnih ć elija.

Primer 4.

Poboljšanje proizvodnje

[0165] U ovoj primernoj studiji, utvrđeno je da se eksperimentalni uslovi mogu prilagoditi po potrebi kako bi se poboljšao ukupni prinos tokom proizvodnje glikovanog hitozana. Neočekivano je otkriveno da bi se proizvodnja GC mogla poboljšati kontrolom pH stanja, a time i kontrolom procenta glikacije. Konkretno, utvrđeno je da je zbog toga što je poluživot natrijum borohidrida (NaBH4)proporcionalan pH, što znači da je pri nižim pH poluvreme NaBH4izuzetno kratko, a samo pri višem pH NaBH4je nešto stabilniji . Tako je utvrđeno da NaBH4nije toliko efikasan u stabilizaciji glikovanog hitozana redukcijom Schiff-ovih baza i proizvoda Amidori-a pri nižim pH. Na primer, kada se pH održavao ispod pet (pH <5), vreme poluraspada NaBH4je izuzetno kratko, pa je stoga smanjenje Schiff-ovih baza i proizvoda Amadori bilo manje efikasno, a procenat glikacije GC je tako opao.

[0166] Utvrđeno je, međutim, da se sa višim pH, formulacija "želira". Na primer, kada se pH održavao iznad šest (pH> 6), primeć eno je da se formulacija želira i stoga je šarža morala biti odbačena. Drugim rečima, da bi se postigao cilj efikasne proizvodnje GC, pH se nije održavao toliko visoko da bi se

2

formulacija „želirala“, ali pH takođe nije bio toliko nizak da je procenat glikacije minimiziran zbog kratkog poluvremena NaBH4.

Primer 5.

Lečenje imunoterapijom pomo ć u lasera (LIT) u ispitivanju na ljudima

[0167] Ispitivanje karcinoma dojke izvedeno je na 10 pacijenata sa uznapredovalim karcinomom dojke (5 stadijum IV, 5 stadijum III). Već ina pacijenata je lo še reagovala ili uopšte nije reagovala na konvencionalne modalitete i primila je najmanje jedan tretman imunoterapije laserskim potpomognutim postupkom (LIT) u kome je viskoelastični glikovirani hitozan korišć en kao imunoadjuvant. Dva (2) pacijenta su se prevremeno povukla iz nepovezanih razloga, ostaviv ši 8 procenjivih pacijenata. Nezavisni ispitivači su pre završetka stekli odobrenja IRB-a i vlade. Za procenu primarnih lezija i metastaza koriš ć ene su biopsije i medicinsko snimanje (CT skeniranje itd.).

[0168] Primarni parametar efikasnosti bio je najbolji ukupni odgovor procenama ispitiva ča koji su koristili kriterijume za ocenu odgovora u čvrstim tumorima (RECIST). Kompletni odgovor (CR) definisan je kao nestanak ili nedostatak odgovarajuć e metaboličke aktivnosti svih ciljnih lezija. Delimični odgovor (PR) je definisan kao smanjenje aktivnosti za ≥30% u odnosu na osnovnu liniju ili u zbiru najdužeg prečnika ciljnih lezija. Progresivna bolest (PD) definiše se kao poveć anje od ≥ 20% u zbiru najdužeg prečnika ciljnih lezija ili pojave 1 ili više novih lezija. Stabilna bolest (SD) nije definisana ni kao dovoljno smanjenje da bi se kvalifikovalo za PR, niti kao dovoljno poveć anje da bi se kvalifikovalo za PD.

[0169] Od 8 pacijenata sa karcinomom dojke dostupnih za procenu, CR je primeć en kod 1 pacijenta, PR kod 4 pacijenta i SD kod 1 pacijenta. Kod pacijenata dostupnih za procenu, objektivna stopa odgovora (CR PR) bila je 62,5 %, a klinički korisna stopa odgovora (CR PR SD) bila je 75 %. PD je primeć en kod 2 pacijenta. Sve lokalne lezije ozračene laserom reagovale su na LIT. Pored toga, već ina udaljenih metastaza ovih pacijenata odgovorila je na LIT. Prečnici i aktivnost metastaza u limfnim čvorovima, plu ć ima i jetri kod nekoliko pacijenata drastično su se smanjili.

[0170] Lokalna i sistemska toksičnost je ocenjena prema Nacionalnim institutima za lečenje karcinoma, zajedničkim kriterijumima toksičnosti, verzija 3.0. Periodično su vršeni laboratorijski pregledi i fizički pregledi. Neželjeni događaji su se pažljivo pratili i beležili tokom čitavog perioda studije. LIT je samo indukovao lokalne reakcije unutar područja lečenja kod pacijenata sa karcinomom dojke, od kojih je već ina bila povezana sa toplotnim efektima lokalnog laserskog tretmana. Crvenilo, bol, edemi i ulceracije područja lečenja bili su česti neželjeni događaji (AE). Nisu primeć eni neželjeni događaji stepena 3 ili 4. Kod pacijenata koji nisu prethodno primali terapiju zračenjem, otok je bio neznatan. Kod pacijenata koji su prethodno primili terapiju zračenjem, otok je bio značajniji sa dužim trajanjem.

Primer 6.

Imunoterapija glikovanim hitozanom uz pomoć lasera demonstrira antitumorski imunitet protiv B16 melanomskih tumora na miševima

[0171] Ženke miševa C57BC/6 (starosti 8 nedelja; 12 miševa/grupa) subkutano su inokulirane tumorom B16-F1 melanoma (106 održivih tumorskih ć elija) u području leđa. Tumori su dostigli veličinu (prečnika 7 do 8 mm) oko 7 dana nakon implantacije. Pet studija (12 ženskih miševa/grupa) bilo je uključeno u studiju: nelečena kontrola; kontrola lečenja imunoterapijom uz pomoć lasera; i terapija imunoterapijom uz pomoć lasera sa 0,2 ml 1 % glikovanog hitozana peritumorno ubrizganom 24 sata pre, neposredno posle ili 24 sata posle laserskog tretmana. Diodni laser od 805 nm je korišć en za lasersko zračenje, sa podešavanjima parametara od 2 W u trajanju od 10 minuta. Laser je usmeren kroz opti čko vlakno sa sočivom difuzora na kraju do mesta tretmana, a vrh lasera je održan na udaljenosti od 4 mm od kože.

[0172] Procenjeno je preživljavanje životinja. Zatamnjenje i očvršć avanje kože miša na mestu tretmana primeć eno je nakon laserskog tretmana. Ponavljanje tumora se obično dešavalo nekoliko dana nakon lečenja. Termička obrada u kombinaciji sa primenom glikovanog hitozana rezultirala je značajnim poboljšanjem preživljavanja životinja glikovanim hitozanom primenjenim 24 sata pre laserskog zračenja, pokazujuć i najznačajnija poboljšanja (videti tabelu dole).

Primer 7.

Intersticijska imunoterapija potpomognuta laserom u metastatskom modelu mlečnih žlezda koriš ć enjem lasera od 805 nm i glikovanog hitozana

[0173] Sprovedeno je istraživanje za određivanje optimalne intersticijske doze lasera i optimalne doze glikovanog hitozana. Ženkama pacova Wistar Furth (starosti od 5 do 6 nedelja, 100 do 125 g) subkutano je ubrizgan transplantabilni metastatski tumor dojke DMBA-4 (105 održivih tumorskihć elija) u područje leđa. DMBA-4 tumori, prvobitno hemijski indukovani, su visoko metastatski i slabo imunogeni. Tumori metastaziraju duž limfatika i brzo formiraju višestruke metastaze na udaljenim mestima, ubijajuć i sve pacove 30 do 40 dana nakon implantacije tumora. Kada je primarni tumor bio od 0,2 do 0,5 cm<3>, dlaka preko tumora je ošišana i imunoterapija laserskom potporom izvedena je na životinjama pod anestezijom (2 % izofluorana). Diodni laser od 805 nm je korišć en za isporuku infracrvene svetlosti za ciljne tumore. Neprekidna laserska snaga isporučivala se kroz optička vlakna sa aktivnim cilindričnim vrhom. Korišć en je aktivni vrh od 1,0 cm, sa providnom plastičnom ovojnicom za zaštitu aktivnog vrha. Za umetanje vrha aktivnog vlakna korišć ene su metode uvođenja pomo ć u igle ili probijanja. Intratumorski položaj vlakana je verifikovan digitalnom kamerom, koja može da uhvati infracrvenu svetlost od lasera od 805 nm. Pacovi su posmatrani svakodnevno, a tumori su mereni dva puta nedeljno u periodu od najmanje 100 dana. Kriterijum za uspešno lečenje bilo je 100-dnevno preživljavanje nakon implantacije tumora. Optimalna intersticijska doza lasera određena je procenom efekata u kontroli (9 pacova, bez lečenja); intersticijalne snage lasera od 1, 1,5, 2, 2,5 i 3 W/cm<2>tokom 10 minuta (14 pacova/grupa); i intersticijalna snaga lasera od 2 W/cm<2>tokom 30 minuta (14 pacova/grupa). Čini se da su pacovi u 3 W za 10 min i 2 W za 30 min imali prosečne stope preživljavanja već e od ostalih grupa. Optimalna doza glikovanog hitozana utvrđena je procenom preživljavanja nakon primene 0,1, 0,2, 0,4 i 0,6 ml 1 % glikovanog hitozana nakon intersticijske imunoterapije uz pomoć lasera na 2,5 W tokom 20 minuta. Kao kontrola je uključena grupa pacova koja nije bila lečena. Najbolje preživljavanje, od 42 %, zabeleženo je nakon doze glikovanog hitozana od 0,2 ml (videti donju sliku).

Primer 8.

Indukovani antitumorski imunitet protiv metastatskih tumora mlečnih žlezda DMBA-4 kod pacova primenom laserske imunoterapije

[0174] Ženke pacova Wistar Furth (starosti od 6 do 7 nedelja, 110 do 130 g) inokulirane su DMBA-4 transplantabilnim metastatskim tumorom mlečne žlezde (105 održivih tumorskih ć elija) u ingvinalno područje. Primarni tumor se obično pojavio od 7 do 10 dana nakon inokulacije i iznosio je približno od 1 do 5 g u roku od 3 nedelje. Tumor je metastazirao kroz limfatike u ingvinalne i aksilarne limfne čvorove. Lečenje je započeto kada je primarni tumor iznosio od 0,2 do 0,5 cm<3>, obično od 10 do 15 dana nakon inokulacije. Pacovima je davano 0,25 % indocijanin zelenog i 1 % glikovanog rastvora hitozana (0,20 ml) ubrizgano direktno u centar tumora pre zračenja. Za lasersko zračenje korišć en je diodni laser od 805 nm, sa podešavanjima parametara od 2 W u trajanju od 10 minuta. Laser je usmeren kroz opti čko vlakno do mesta tretmana. Nakon zračenja, životinje su bile smeštene pojedinačno i dva puta nedeljno su zabeležena posmatranja i merenja tumora. Pacovi koji su uspe šno lečeni (izlečeni pacovi) ponovo su ponovo izazivani istim ć elijama tumora u nivoima doze tumora od 105 do 107 održivih tumorskih ć elija po pacovu i životinje su posmatrane tokom 4 meseca za razvoj tumora. Od 32 pacova lečenih imunoterapijom uz pomoć lasera, osam pacova je uspešno lečeno za >120 dana nakon inokulacije bez tumora. Kod svih izlečenih pacova metastaze su se nastavile razvijati i nakon lečenja, a zatim su postepeno opadale i na kraju nestale bez dodatnog tretmana. Sedam uspešno lečenih pacova ponovo je izazvano do tri puta sa nivoima doze u rasponu od 105 do 107 održivih tumorskih ć elija po injekciji. Nije bilo ponovnog pojavljivanja primarnog ili metastatskog tumora ni kod jedne od ovih životinja i životinje su preživele za > 120 dana, dok su nelečeni kontrolni pacovi razvili primarne i metastatske tumore i prosečno preživeli 30 dana.

Primer 9.

Poboljšanje laserskog lečenja karcinoma imunoadjuvantom dobijenim hitosanom

[0175] Efekat imunoadjuvanta tokom tretmana imunoterapijom uz pomoć lasera procenjen je kod pacova koristeć i četiri različita imunoadjuvanta. Ženke pacova Wistar Furth (starosti od 6 do 8 nedelja, od 150 do 200 g) subkutano su inokulirane DMBA-4 transplantabilnim metastatskim tumorom mlečne žlezde (105 održivih tumorskih ć elija) u ingvinalnu masnu podlogu, od 7 do 10 dana pre tretmana. Primarni tumor je generalno postao opipljiv za od 5 do 7 dana, a udaljene ingvinalne i aksilarne metastaze pojavile su se od 15 do 20 dana nakon inokulacije. Tretman imunoterapijom uz pomoć lasera započet je kada je primarni tumor dostigao veličinu od 0,2 do 0,5 cm<3>. Lasersko lečenje se generalno izvodi 10. dana. Imunoaduvansi uključuju vodeni 1 % rastvor glikovanog hitozana (doza 0,2 ml; n = 48 pacova u dva eksperimenta), 50 % kompletnog Freund-ovog adjuvanta (doza 0,2 ml; n = 33 pacova), 50 % nepotpuni Freundov adjuvant (doza

2

0,2 ml; n = 30 pacova) i Corinebacterium parvum (C. parvum; 35 mg/doza pacova; n = 32 pacova). Imunoadjuvanti su pomešani sa 0,25 % indocijaninskog zelenog i ubrizgani direktno u središte tumora 2 sata pre zračenja laserskim diodama od 805 nm. Životinje su anestezirane pre zračenja i ošišana je dlaka iznad primarnog tumora. Parametri lasera iznosili su 2 W tokom 10 minuta sa mestom laserskog tretmana prečnika 3 mm, što je rezultiralo fluencijom od 96 J/cm<2>za tumor prečnika 1 cm. Životinje su pojedinačno smeštene, posmatrane svakodnevno, a merenja optereć enja tumora sakupljana su dva puta nedeljno.

[0176] Podaci iz ove studije upoređivani su sa podacima kontrolnih pacova koji su nosili tumore (n = 38 pacova) u nekoliko različitih eksperimenata. Svi imunoadjuvanti imali su statistički značajan porast stope preživljavanja u poređenju sa kontrolnim podacima (p < 0,05). Čini se da je 1 % glikovanog hitozana najefikasniji imunoadjuvant sa stopom dugoročnog preživljavanja od 29 % (videti tabelu dole). Statistički značaj je primeć en kada je glikovani hitozan-adjuvant upoređen sa C stopom (p = 0,009) i nepotpunim Freund-ovim adjuvantom (p = 0,03). Iako nije značajno, primeć eno je primetno poboljšanje preživljavanja u poređenju sa kompletnim Freundovim adjuvantom koji je imao uporedivu stopu izle čenja (18 %). Relativna slaba stopa preživljavanja primeć ena je nakon lečenja nepotpunim Freundovim adjuvantom i C. parvuom.

Primer 10.

Poboljšanje fotodinamičke terapije imunoadjuvantom dobijenim hitozanom

[0177] Da bi se procenila fotodinamička terapija kao metoda za direktno uništavanje tumora u kombinaciji sa glikovanim hitozanom, kombinacijom fotodinamičke terapije i glikiranog fotra-isupstituisanog tetra (meta-hidroksi-fenil) hlorin-(mTHPC), injekcija hitozana prou čavana je na EMT6 sarkomu dojke, odnosno modelu adenokarcinoma pluć a linije 1 plu ć a. U svakom modelu, BALB/c mi ševi su subkutano inokulirani sa 10<6>održive tumorske ć elije u donjem delu leđa. Tumori su bili veličine tretmana (od 7 do 8 mm) nakon 7 dana.

[0178] U EMT6 modelu sarkoma dojke, procenjene grupe lečenja detaljno su opisane u donjoj tabeli. Photofrin (Mont-Saint-Hilaire, Quebec, Kanada) je pripremljen u 5 % sterilnoj dekstrozi do koncentracije od 1 mg/mL. Doza fotofrina od 5 mg/kg intravenozno je primenjena 24 sata pre zračenja. Životinje su zaštić ene od direktnog svetla neposredno nakon injekcije fotosenzibilizatora do 3 dana nakon fotodinamičkog tretmana. Miševi su bili zadržani bez anestezije u držačima koji su izlagali leđa tokom lečenja svetlošć u. Svetlost (630 nm) se isporučuje kroz tečni svetlovodnik prečnika 8 mm. Gustina snage je podešena na 100 mW/cm<2>, za ukupnu dozu svetlosti od 60 J/cm<2>. Odmah nakon zračenja svetlom, ako je primenljivo, životinjama je data peritumoralna doza od 0,5 ili 1,5 % glikovanog hitozana. Životinje su posmatrane za pojavu tumora svaka 2 dana do 90 dana nakon fotodinamičkog tretmana, a promene u zapremini tumora utvrđivane su 3 puta nedeljno.

[0179] Svi fotodinamični i fotodinamični glikovani hitozanom tretirani pacovi imali su potpunu regresiju tumora dan nakon tretmana. Ponavljanje tumora je generalno otkriveno u roku od 2 nedelje nakon tretmana. Efikasnost standardne fotodinamičke terapije bila je 37,5 %, što je poveć ano nakon primene 0,5 i 1,5 % glikovanog hitozana sa vrednostima od 62,5, odnosno 75 %. Glikovirani hitozan značajno je poveć ao stopu preživljavanja kod miševa koji nose tumore u poređenju sa samo fotodinamičkim lečenjem (p < 0,05).

[0180] U modelu tumora pluć a linije 1, grupe za lečenje bile su predstavljene u slede ć oj tabeli. mTHPC je pripremljen u smeši etanola, polietilenglikola 400 i vode u omjeru 2: 3: 5 (v/v/v) za krajnju koncentraciju od 0,02 mg/ml. Doza mTHPC od 0,1 mg/kg intravenozno je primenjena 24 sata pre zračenja. Životinje su bile zaštić ene od direktnog svetla odmah nakon injekcije fotosenzibilizatora do 3 dana nakon fotodinamičkog tretmana. Miševi su bili zadržani bez anestezije u držačima koji su izlagali leđa tokom lečenja svetlošć u. Svetlost 652 nm od diodnog lasera od 0,25 W isporučena je kroz vodilicu tečne svetlosti prečnika 8 mm. Gustina snage je postavljena na 110 mW/cm<2>, za ukupnu dozu svetlosti od 30 J/cm<2>. Odmah nakon zračenja svetlom, ako je primenljivo, životinjama je data peritumoralna doza od 1,67 % glikovanog hitozana. Životinje su posmatrane za pojavu tumora na svaka 2 dana do 90 dana nakon fotodinamičkog tretmana i utvrđene su promene veličine tumora 3 puta nedeljno.

2

[0181] Ponovne pojave tumora su primeć ene kod svih miševa u roku od 3 nedelje. Nakon fotodinamičke terapije zasnovane na mTHPC, primena 1,67 % glikovanog hitozana rezultirala je stopom pre življavanja od 37,5 %, dok ostale kombinacije nisu bile efikasne. Model tumora pluć a modela 1 smatran je slabo imunogenim modelom tumora. Efekat lečenja glikovanim hitozanom lokalizovanog na tumor na odgovor tumora mišje linije 1 na fotodinamičku terapiju zasnovanu na mTHPC predstavljen je na donjoj slici.

[0182] Rezultati ovih studija pokazuju da je potrebna aktivna imunolo ška stimulacija da bi se poveć ala efikasnost fototerapije.

Primer 11.

Efekat različitih komponenata imunoterapije uz pomoć lasera u lečenju metastatskih tumora kod pacova

[0183] U ovoj studiji su ispitivane razne kombinacije tri komponente sistema imunoterapije uz pomo ć lasera, koristeć i ženske i muške pacove koji nose metastatske tumore dojke, odnosno prostate. Sistem imunoterapije uz pomoć lasera sastojao se od blizu infracrvenog laserskog diodnog lasera sa maksimalnom izlaznom snagom od 25 W; boja za upijanje lasera, indocijanin zelena; i imunoadjuvantni, glikovani hitozan. Kada je primarni tumor iznosio od 0,2 do 0,5 cm<3>, započeto je lečenje kod pacova koji su nosili tumor. Rastvor od 0,2 ml GC i/ili ICG ubrizgan je u centar primarnog tumora u svim grupama. Kod pacova koji su primali laserski tretman, injekcije su se davale 2 sata pre ozračavanja, a životinje su bile

2

anestezirane, a dlaka prekrivena tumorom. Laserska podešavanja su bila 2 W i 10 minuta, pri čemu je vrh laserskog vlakna održavao udaljenost od 4 mm od prekrivene kože i laserska energija usmerena na mesta tretmana kroz optička vlakna.

[0184] Životinje su pojedinačno smeštene nakon tretmana. U studijama preživljavanja, životinje su pojedinačno smeštene nakon tretmana. U studijama preživljavanja, pacovi sa karcinomom dojke ili prostate koji su nosili tumor dojke posmatrani su svakodnevno i tri dimenzije svakog tumora merene su nedeljno. Ženke pacova Wistar Furth (starosti od 5 do 6 nedelja, od 100 do 125 g) subkutano su inokulirane sa DMBA-4 transplantabilnim metastatskim tumorom mlečne žlezde (105 održivih tumorskih ć elija) u jednu ingvinalnu masnu podlogu svakog pacova. Primarni tumor pojavio se od 7 do 10 dana nakon inokulacije. Metastatski tumori duž limfe i na udaljenim mestima obično postaju opipljivi za otprilike 2 nedelje. Bez lečenja, pacovi koji nose tumore imaju prosečno vreme preživljavanja od 35 dana. Osam grupa pacova metastatskih tumora dojke tretirano je različitim komponentama sistema imunoterapije uz pomoć lasera, kako je detaljno prikazano u donjoj tabeli. Stopa pre življavanja i primarni i metastatski tumorski profili određeni su za pojedinačne komponente i različite kombinacije komponenata. Pored toga, tri grupe ženki pacova (n = 16/grupa) su tretirane sa 0,5, 1,0 i 2,0 % glikovanog hitozana da bi se procenio uticaj koncentracije imunoadjuvanta na preživljavanje pacova.

[0185] U metastatskim pacovima koji su nosili tumor dojke, jednokomponentno lečenje rezultiralo je da svi pacovi u indocijanin zelenoj i samo laserskoj grupi umiru, sa prosečnim vremenima preživljavanja sličnim kontrolnoj grupi. Dva pacova u glikovanoj hitosanskoj grupi su preživela, s tim da se jedan pacov smatrao dugotrajno preživelim, a drugi pacovom sa produženim životom ( > 120 dana). Posle tretmana sa dve komponente, 1 i 2 dugoročno preživela su primeć ena u laserima, plus glikovani hitozan i indocijanin zeleni, odnosno glikovani hitozan. Nije bilo statističke značajnosti u vremenu preživljavanja kada su jedno- ili dvokomponentne grupe lečenja upoređivane sa kontrolnom grupom. Devet pacova imalo je dugoročno preživljavanje nakon tretmana trokomponentnom imunoterapijom uz pomoć lasera (tj. fototermalna primena u kombinaciji sa glikovanim hitozanom), što je rezultiralo sa približno 30 % izlečenja u dva odvojena eksperimenta sa 31 pacova. Primeć ena je značajna razlika (p < 0,0001) u srednjem vremenu preživljavanja lečenih pacova u poređenju sa kontrolnim pacovima. Stopa preživljavanja pacova nakon tretmana sa jednom, dve ili tri komponente sistema imunoterapije uz pomo ć lasera predstavljena je na donjoj slici. Metastatski tumori su se obično javljali 2 nedelje nakon inokulacije primarnog tumora i dostigli su vrhunac pre regresije.

2

Primer 12.

Antitumorski imunitet indukovan imunoterapijom uz pomo ć lasera i njenim usvojenim transferom

[0186] Da bi se istražio mehanizam antitumorskog imuniteta indukovanog imunoterapijom uz pomo ć lasera, izvršen je usvojeni prenos primenom imunih ć elija slezine. Ženke pacova Wistar Furth supkutano su inokulirane DMBA-4, transplantabilnim metastatskim tumorom dojke (105 održivih tumorskih ć elija) u jednu ingvinalnu masnu podlogu svakog pacova, od 7 do 10 dana pre tretmana imunoterapijom uz pomo ć lasera. Bez lečenja, pacovi koji su nosili tumore preživeli su u proseku približno 30 dana. Pacovima tretiranim laserom davano je 0,2 ml rastvora koji sadrži i 0,25 % zelenog indocijanina i 1 % glikovanog hitozana direktno u primarni tumor pre laserskog tretmana. Za zračenje je korišć en laser od 805 nm pri 2 W tokom 10 minuta. Zaštitna sposobnost indukovanog imuniteta procenjena je u nekoliko grupa uspe šno lečenih pacova koji su nosili tumore i koji su više puta izazivani poveć anim dozama inokulacije održivih tumorskih ć elija. Pored toga, kod nekih pacova procenjena je otpornost na tumorske izazove nakon imunoterapije uz pomo ć lasera i inhibicija rasta tumora.

[0187] Petnaest pacova koji su uspešno lečeni imunoterapijom uz pomoć lasera ponovo su izabrani sa 10<6>održivih tumorskih ć elija 120 dana nakon početne inokulacije. Osamnaest nekih starosnih grupa pacova (starih 25 nedelja) inokulirano je sa 10<6>održivih tumorskih ć elija za uporedne svrhe. Svi uspešno lečeni pacovi pokazali su potpunu otpornost na izazov, a nisu primeć eni ni primarni tumori ni metastaze; međutim, kontrolni pacovi koji se podudaraju sa uzrastom razvili su primarne i metastatske tumore i umrli u roku od 30 dana nakon inokulacije. Odvojena grupa mladih pacova (starosti pribli žno 8 nedelja) inokulirana je sa 10<5>održivih tumorskih ć elija. Čini se da je preživljavanje zavisilo od doze tumora, a kontrolni pacovi inokulirani sa 10<5>i 10<6>održivih ć elija tumora preživeli su u proseku 33, odnosno 28 dana. Uspešno lečeni pacovi obično su imali postepenu regresiju i kod lečenog primarnog tumora i kod nelečenih metastaza.

[0188] Posle prvog ponovnog izazova, pacove iz nekoliko eksperimentalnih grupa pratila su dva sledeć a izazova u vremenskom intervalu od od 1 do 5 meseci, sa 10<6>održivih tumorskih ć elija. Pacovi uspešno lečeni imunoterapijom uz pomoć lasera bili su potpuno otporni na tri izaziva tumora. Ovi podaci su predstavljeni u donjoj tabeli. Suprotno tome, kontrolni pacovi koji su odgovarali uzrastu razvili su višestruke metastaze u udaljenim ingvinalnim i aksilarnim oblastima i uginuli u roku od 35 dana. Vi šestruke metastaze razvijene u svih 20 kontrolnih pacova inokuliranih sa 10<5>održivih tumorskih ć elija; međutim,

2

ovi pacovi su imali malo duže vreme preživljavanja u poređenju sa starosnim kontrolnim pacovima koji su inokulirani sa već om dozom od 10<6>održivih tumorskih ć elija. Otpor prema ponovnom izazivanju tumora kod uspešno lečenih pacova snažno sugeriše tumor-selektivni imunitet.

[0189] Za usvojeni eksperiment imunizacije, održivo tumorsko tkivo prikupljeno od živih DMBA-4 pacova koji nose tumore i raspršeno je u suspenziju jednoć elija mlevenjem u olabavljenom mlevenom staklenom homogenizatoru. Davno preživeli pacovi su žrtvovani 28 dana nakon ponovnog izazivanja tumora sa 10<6>održivih tumorskih ć elija, a njihova slezina je secirana bez masti. Izvedena su dva odvojena eksperimenta primenom splenocita kontrolnih pacova koji su nosili tumor. Ć elije slezine sakupljene su 22, odnosno 39 dana nakon inokulacije tumora u prvom, odnosno drugom eksperimentu. Suspenzije ć elija su pripremljene mehaničkim prekidom u medijum sa 10 % fetalnog teleć eg seruma. Ć elije slezine su takođe sakupljene od nekih pacova bez prethodnog izlaganja ć elijama tumora. Ć elije slezine i odr žive tumorske ć elije su brojane na hemocitometru pre mešanja u odnos 400 : 1 slezine: tumorskih ć elija. Neki pacovi su inokulirani smešom koja sadrži 4 x 10<7>ć elija slezine i 10<5>održivih tumorskih ć elija u zapremini od 0,2 ml. Za eksperimente sa usvojenim prenosom imuniteta, 4 grupe naivnih ženki pacova Wistar Furth inokulirane su tumorskim ć elijama. Tretirane grupe su bili kontrolni pacovi grupe A koji su nosili tumor, inokulirani sa 10<5>održivih tumorskih ć elija bez lečenja; pacovi grupe B inokulirani ć elijama tumora pome šanim sa ć elijama slezine kontrolnog pacova koji je nosio tumor; pacovi grupe C inokulirani ć elijama tumora pomešanim sa ć elijama slezine pacova koji nose tumor, uspešno lečeni imunoterapijom uz pomo ć lasera, 28 dana nakon ponovnog izazivanja tumora; i pacovi grupe D inokulirani ć elijama tumora pome šanim sa ć elijama slezine naivnog pacova bez prethodnog izlaganja tumoru. Eksperiment je izveden u duplikatu, a preživljavanje pacova iz oba eksperimenta je kombinovano i prikazano je na donjoj slici. Nije primeć en primarni ili metastatski tumor kod pacova grupe C što ukazuje da su ć elije slezine iz imunoterapije uz pomoć lasera uspešno lečile pacove pružaju ć i 100 % zaštitu primaocima. Višestruke metastaze i smrt u roku od 35 dana od inokulacije tumora primeć ene su kod svih kontrolnih pacova grupe A koji su nosili tumor. Nije bilo zaštite koju su pružaleć elije slezine od zdravog pacova u grupi D. Preživeo je jedan pacov od 10 pacova u grupi B; međutim, ovaj pacov je kasnije razvio i primarni tumor i metastaze. Svi pacovi grupe C su ponovo izabrani 60 dana nakon usvojenog prenosa imuniteta i svi su izdr žali izazov. Imunske ć elije slezine pacova iz Grupe C su sakupljene i pomešane sa ć elijama tumora u istom odnosu kao u prvom usvojenom prenosu kako bi se procenila sposobnost ć elija slezine ovih životinja u zaštiti naredne grupe normalnih pacova primalaca Wistar Furth (n = 6) koji su inokulirani ovom sme šom. Imunske ć elije pacova grupe C zaštitile su od 5 od 6 nekih pacova, jer nisu primeć eni ni primarni ni metastatski tumori. Pacov koji je uginuo imao je produženo vreme preživljavanja (60 naspram 30 dana) i odloženu pojavu tumora nakon inokulacije (37 naspram 7 do 10 dana), u poređenju sa kontrolnom grupom.

2

[0190] Otpor uspešno lečenih pacova kada je tumor ponovo izabran snažno sugeriše da tumor-selektivni imunitet ima dugotrajan efekat.

Primer 13.

Kombinacija imunoterapije uz pomo ć lasera i hemoterapije u malim dozama

[0191] U jednoj primernoj kliničkoj studiji, dva pacijenta sa karcinomom dojke su primala ciklofosfamid nedeljno (posle tretmana inCVAKS) u dozi između 150 i 200 mg/m<2>. Pacijenti su u početku dobro reagovali na lečenje smanjenjem tumora i minimalnim neželjenim reakcijama. Posle nekoliko meseci odgovor se usporio, pa je onkolog promenio nisku dozu hemoterapije u nedeljni re žim Paclitaksela od 75 mg/m<2>, i opet je odgovor bio vrlo dobar kod smanjenja tumora. Nisu se pojavile nove metastaze. Pacijenti su nastavili da primaju hemoterapiju u malim dozama. Treć i pacijent je postao operativan nakon hemoterapije u malim dozama, a urađena je i mastektomija, pa je kombinacija sa operacijom takođe bila opcija.

Claims (7)

Patentni zahtevi

1. Formulacija viskoelastičnog glikovanog hitozana, obuhvatajući polimer glikovanog hitozana kao vodenog rastvora, pri čemu polimer glikovanog hitozana ima molekulsku težinu između 50,000 daltona do 250,000 daltona, pri čemu stepen glikacije slobodnih amino grupa polimera hitozana varira od jedne desetine jednog procenta do sedam procenata, pri čemu je stepen deacetilacije hitinskog roditelja viskoelastičnog glikovanog hitozana osamdeset procenata, i pri čemu formulacija ima pH od 5 do 6.

2. Formulacija viskoelastičnog glikovanog hitozana prema patentnom zahtevu 1, pri čemu polimer glikovanog hitozana poseduje dva procenta glikacije svojih inače slobodnih amino grupa.

3. Formulacija viskoelastičnog glikovanog hitozana prema patentnom zahtevu 1, pri čemu vodeni rastvor sadrži puferisani fiziološki rastvor.

4. Formulacija viskoelastičnog glikovanog hitozana prema patentnom zahtevu 1, pri čemu viskoelastična formulacija sadrži jedan procenat mase polimera glikovanog hitozana dispergovanog u vodenom rastvoru, pri čemu navedeni vodeni rastvor ima viskozitet između jedan do jedne stotine mm<2>/s izmeren na 25 stepeni Celzijusa.

5. Formulacija viskoelastičnog glikovanog hitozana prema patentnom zahtevu 1, pri čemu sadrži najmanje jedan procenat mase polimera glikovanog hitozana dispergovanog u vodenom rastvoru, pri čemu polimer glikovanog hitozana poseduje pet procenata glikacije svojih inače slobodnih amino grupa.

6. Formulacija viskoelastičnog glikovanog hitozana kako je definisana u patentnom zahtevu 1, za upotrebu u lečenju karcinoma.

7. Imunoadjuvant obuhvatajući formulaciju viskoelastičnog glikovanog hitozana prema patentnom zahtevu 1.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5