RS61286B1

RS61286B1 - Anti-transglutaminazna 2 antitela

Info

Publication number: RS61286B1
Application number: RS20210033A
Authority: RS
Inventors: Tim Johnson; Phil Watson; David Matthews; Alex Brown
Original assignee: Lifearc
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2021-02-26
Also published as: IN2014MN02231A; US20180355060A1; SG11201407053YA; AU2013265025A1; UA117657C2; JP2018166510A; EP3521315B1; CA2874488A1; IL235369B; CL2014003125A1; SI3521315T1; RS59135B1; SMT201900407T1; MY185966A; US10005846B2; ECSP14030942A; US11718686B2; MX367517B; BR112014029089B1; KR102091223B1

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na inhibitore TG2 i metode za dobijanje i primenu takvih inhibitora.

[0002] Transglutaminaza tipa 2 (TG2; takođe poznata i kao tkivna transglutaminaza, tTg) je deo šire 9-člane familije transglutaminaza koja obuhvata Faktor Xllla, koji je kritičan za zgrušavanje krvi, kao i keratinocitnu transglutaminazu (TG1) i epidermalnu transglutaminazu (TG3) koje su uključene u terminalnu diferencijaciju keratinocita. Pored toga, postoje i drugi članovi TG familije, kao što su TG tipovi 4 do 7, čija definitivna uloga do danas nije identifikovana.

[0003] TG2 funkcioniše primarno kao enzim za unakrsno vezivanje proteina katalizom formiranja ε(γ-glutamil) lizin izo-dipeptidnih veza. Povećana ekspresija TG2 dovodi do nenormalnog umrežavanja proteina koje je povezano sa nekoliko patologija, koje obuhvataju različite tipove stvaranja ožiljaka na tkivu, formiranje neurofibrilarnih klubadi kod nekoliko moždanih poremećaja i otpornost na hemoterapiju kod nekih kancera. TG2 je takođe u stanju da deamiduje proteine. TG2 deamiduje gliadin, a kompleks TG2/gliadin je primarni autoantigen u celijačnoj bolesti. Pored toga, TG2 ima GTP vezujuću funkciju i može delovati kao GTPaza, mada ovo nije povezano sa patološkom ulogom.

[0004] Povećana TG2 aktivnost je primarno povezana sa abnormalnim zarastanjem rana [1] što dovodi do fibroze jetre [2], pluća [3], srca [4] i bubrega, [5], kao i do ateroskleroze [6]. Proces stvaranja ožiljaka i fibroze je povezan sa povećanom sintezom, a najbitnije, sa povećanim eksportom TG2 u intersticijalni prostor. Kada se jednom nađe izvan ćelije, TG2 može da se umreži sa proteinima ekstracelularne matrice (ECM), kao što su fibronektin i kolagen [7] inkorporiranjem ε(γ-glutamil) lizin di-peptidne veze [8]. Studije su pokazale da ovo može ubrzati deponovanje raspoloživih ECM komponenata, što istovremeno prenosi rezistenciju na proteolitički klirens pomoću sistema matrične metaloproteinaze (MMP) [9, 10]. Sve ovo zajedno izaziva akumulaciju ECM proteina, a shodno tome, i pojavu ožiljnog tkiva [9]. Dalje, TG2 ima rastuću ulogu u nastajanju latentnog TGF-β1 u procesu stvaranja ožiljaka [11] i takođe je povezano sa putanjama aktivacije interleukina-6 [12] i faktora-α nekroze tumora [13].

[0005] Inhibicija TG2 in vitro smanjuje nivoe ekstracelularnog matriksa [14], dok ćelije koje potiču od miša sa inaktiviranim TG2 imaju niže nivoe zrelog ECM [9]. In vivo primena pan TG inhibitora u modelima hronične bubrežne bolesti smanjuje razvoj glomeruloskleroze i tubulointersticijalne fibroze, čime se čuva bubrežna funkcija [15, 16].

[0006] Slične koristi su uočene kod miša sa inaktiviranim TG2 koji je podvrgnut unilateralnoj ureterskoj opstrukciji [17].

[0007] Postoji nekoliko neurodegenerativnih bolesti karakterisanih prisustvom proteinskih agregata u degenerativnom regionu mozga kod kojih je u formiranje uključen TG2. Najbolje je karakterisan kod Hantingtonove horeje. Hantingtonov protein (htt) sadrži ekspandovana poliglutaminska ponavljanja na svom N-terminalnom domenu. Prirodni tip htt sadrži manje od 35 uzastopnih glutamina, dok htt koji je povezan sa bolesti obično ima preko 40 uzastopnih glutamina, što ga čini odličnim TG2 supstratom. Zbog toga se formiraju nerastvorljivi agregati u strijatumu i korteksu pacijenata sa Hantingtonovom bolesti. Učestanost agregata dobro koreliše sa ozbiljnošću bolesti.

[0008] Alchajmerova bolest je karakterisana prisustvom ekstracelularnih senilnih plakova koji se sastoje od agregiranog amiloidnog β-proteina i intracelularnih neurofibrilarnih klubadi koja se sastoje od visoko fosforilovanog oblika proteina tau. Ovi plakovi sadrže velike količine ε(γglutamil) lizin izo-dipeptidnih veza.

[0009] Konačno, glavna odlika Parkinsonove bolesti je prisustvo alfa-sinukleinskih agregata, koji se nazivaju Levijevim telima, u citoplazmi pogođenih neurona koji ponovo sadrže ε(γglutamil) lizin izo-dipeptidne veze. Svi gore pomenuti proteini su dobri supstrati za TG2 in vitro. Pored toga, kod istih pacijenata pogođeni region mozga sadrži više nivoe TG2 proteina od regiona u mozgu koji nisu pogođeni. Korelacija između specifičnosti supstrata za TG2 za agregirane proteine relevantne za bolest i povećanje nivoa TG2 ekspresije sugeriše ulogu enzimski aktivnog TG2 u svakoj bolesti.

[0010] Pokazano je da TG inhibitori imaju terapeutske efekte u više bioloških modela neurodegenerativnih bolesti. U modelu Parkinsonove bolesti na ćelijskoj kulturi sa istovremenom transfekcijom COS-7 ćelija sa alfa-sinukleinom i TG2, formiraju se kovalentni -sinukleinski agregati, koji nalikuju Levijevim telima kod Parkinsonove bolesti, i zavise od enzimski aktivnog TG2, pošto C277S neaktivni TG2 mutant nije uspeo da indukuje formiranje agregata. Tretiranje ovih kotransfektovanih ćelija sa cistaminom značajno je smanjilo alfasinukleinske agregate, kao i procenat ćelija koje sadrže agregate. Postoje dva druga izveštaja u kojima su proteini sa normalnom dužinom i proteini sa ekspandovanim poliglutaminskim ponavljanjima, koji su reprezentativni za širenje CAG bolesti, kao što je Hantingtonova bolest, bili transfektovani u ćelijske linije i pokazano je da se formiraju agregati. Tretiranje ovih ćelijskih linija sa TG kompetitivnim inhibitorom monodansilkadaverinom dovelo je do smanjenja nuklearne fragmentacije, dok je tretiranje cistaminom dovelo i do smanjenja nuklearne fragmentacije, i do smanjenja formiranja proteinskih agregata. Primer pan TG inhibitora je 1,3-dimetil-2-[(2-okso-propil)tio]imidazolijum hloride, koji se može nabaviti od firme Zedira GmbH i koji je u nekoliko publikacija naveden kao NTU283 ili r283.

[0011] Cistamin ima koristan terapeutski efekat in vivo kada se dozira u mišjim modelima Hantingtonove bolesti. Hantington R6/2 miševi kojima je bio doziran cistamin su ispoljili poboljšanje motorne funkcije, manje ozbiljan gubitak težine i povećano preživljavanje u poređenju sa netretiranim kontrolama. Važno je da je ex vivo TG2 aktivnost u homogenatima mozga bila niža posle doziranja sa cistaminom najmanje 60 min posle injekcije. U drugačijem mišjem modelu Hantingtonove bolesti, YAC128 soju, cistamin je bio u stanju da smanji nivo strijatalne atrofije, ali nije mogao da poboljša težinu ili motornu funkciju životinje, što ukazuje na korisni efekat cistamina na nivou ćelija i tkiva, ali ne i na simptome bolesti.

[0012] Verovatno najubedljiviji dokaz da je korisni terapeutski efekat cistamina za Hantingtonove miševe nezavisan od TG2 inhibicije je dobijen ukrštanjem R6/2 Hantingtonovog miša sa mišem sa inaktiviranim TG2 da bi se dobio soj koji je podložan neurodegeneraciji u odsustvu TG2. Kada su R6/2 TG2<-/->miševi bili tretirani cistaminom, onda poboljšana motorna funkcija i produženi životni vek nisu bili statistički različiti od poboljšanja viđenog kod R6/2 TG2<+/+>miševa tretiranih cistaminom. Dodatno tome, R6/1 i R6/2 TG2<-/->miševi su imali povećane neuronske nivoe proteinskih agregata u poređenju sa R6/1 i R6/2 TG2<+/+>miševima, što sugeriše da je mehanizam agregacije proteina nezavisan od TG2 transamidacione aktivnosti u ovim modelima. Međutim, vredno pažnje je da su R6/2 TG2<-/->miševi ispoljili odlaganje pojave motorne disfunkcije i poboljšano preživljavanje u poređenju sa R6/2 TG2<+/+>miševima, što ukazuje na ulogu TG2 u patogenezi neurodegeneracije u R6/2 modelu.

[0013] TG2 je takođe veoma mnogo uključen u celijačnu bolest koja pogađa 1 od 100 ljudi u Zapadnoj Evropi. Celijakija je T ćelijama-posredovani zapaljenski poremećaj tankog creva izazvan klasom proteina zvanih prolamini, koji se nalaze u pšenici, ječmu i raži. Visoki sadržaj prolina i glutamina u ovim proteinima ih čini otpornim na prirodne želudačne, pankreasne i intestinalne proteaze, i peptidaze u toku varenja. Rezultujući fragmenti peptida ostaju nesvareni duboko u tankom crevu i dobijaju pristup u intestinalnu lamina propria gde, posle modifikacije sa TG2, oni mogu da stimulišu T ćelijama-posredovanu imunu reakciju, što dovodi do zapaljenja i razaranja intestinalne arhitekture. Intestinalni TG2 deamiduje specifične glutaminske ostatke u prolaminskim peptidima u glutamatne ostatke. Kod HLA-DQ2/8 pojedinaca ovi modifikovani peptidi se prezentuju odgovarajućim autoreaktivnim T ćelijama pomoću klase II MHC molekula. Mada prolamini imaju visoki sadržaj glutamina (oko 30-35%), humani TG2 cilja samo na nekoliko od ovih glutaminskih ostataka. Odlična korelacija između specifičnosti TG2 supstrata, afiniteta vezivanja DQ2, i T ćelijskog stimulatornog potencijala prolamina tretiranih sa TG2 jako sugerišu da je deamidacija peptida posredovana sa TG2 i da igra značajnu ulogu u određivanju ozbiljnosti bolesti. Dalje, pacijenti sa celijakijom generišu reakciju autoantitela na komplekse TG2-gliadin. Ova anti-TG2 antitela su nađena i u tankom crevu, gde je pokazano da su ko-lokalizovana sa ekstracelularnim TG2, i u krvi, gde se primenjuju kao dijagnostički marker bolesti.

[0014] Uprkos nedostatku životinjskih modela celijačne bolesti, ex vivo eksperimenti ukazuju da TG2 inhibicija ima potencijal da bude korisna za pacijente sa celijakijom. Kultivacija biopsija tankog creva celijačnih pacijenata bilo sa TG2 tretiranim (deamidovanim) ili ne-TG2 tretiranim (ne-deamidovanim) glutenskim digestatima rezultovala je generisanjem pacijentovih T-ćelijskih linija koje su prevashodno prepoznavale deamidovane glutenske peptide u odnosu na nedeamidovane glutenske peptide. Takođe, blokiranjem aktivnosti endogenog TG2 u celijačnim biopsijama sa cistaminom, više od polovine rezultujućih T-ćelijskih linija je imalo smanjene proliferativne reakcije u poređenju sa kontrolama koje nisu bile tretirane cistaminom. Ćelijske linije nisu dobro reagovale na neamidovane digestate. Ovi rezultati ukazuju da su populacije T-ćelija koje reaguju na gluten u celijačnim intestinalnim biopsijama prirodno sklone prepoznavanju deamidovanih glutenskih peptida za razliku od ne-deamidovanih peptida, da endogena TG2 aktivnost u ovim biopsijama može rezultovati deamidacijom glutenskih peptida in situ i da tretman celijačnih biopsija sa TG2 inhibitorima može smanjiti proliferativnu reakciju T ćelija koje reaguju na gluten.

[0015] Sledeća studija je pokazala da je pan-TG inhibitor 2-[(2-oksopropil)tio]-imidazolijumski inhibitor bio u stanju da spreči in situ unakrsno vezivanje glutenskih peptida za endogene proteine u sekcijama tkiva tankog creva uzetim od pacijenata sa celijakijom i kontrola. Još važnije, autori su pokazali da je inkubacija intaktnih biopsija celijačnog tankog creva sa 2-[(2-oksopropil)tio]imidazolijumom sprečila aktivaciju T-ćelija indukovanu ne-deamidovanim oblikom imunodominantnog glutenskog peptida. Nasuprot tome, TG inhibicija je bila neefikasna za kontrolu aktivacije T-ćelija kada su biopsije bile inkubirane sa deamidovanom verzijom istog peptida. Ovi rezultati sugerišu da inhibicija endogenog TG2 u biopsijama celijačnih pacijenata može sprečiti deamidaciju glutenskog peptida i, shodno tome, da može smanjiti aktivaciju T-ćelija.

[0016] Nekoliko opservacija podržava hipotezu da TG2 igra ulogu u razvoju izvesnih tipova kancera. Više studija je pokazalo da je TG2 protein prekomerno regulisan u kanceroznom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kod kancera kao što su glioblastomi, maligni melanomi, i pankreasni duktalni adenokarcinomi, da pomenemo samo neke. Bila je pokazana pozitivna korelacija između rezistencije na hemoterapeutike i metastatičkog potencijala izvesnih kancera sa nivoima ekspresije TG2, dok je u izvesnim tipovima ćelija pokazano da TG2 ispoljava antiapoptotičke efekte na ćelije, dok siRNK smanjena regulacija nivoa ekspresije TG2 proteina ili tretiranje sa TG2 inhibitorima čini ove ćelije osetljivim na apoptozu. Sa druge strane, takođe je bilo izveštaja o smanjenoj regulaciji ekspresije TG2 kod izvesnih tipova kancera [18]. Nedavno je pokazano da je TG2 partner za vezivanje GPR56, proteina koji je smanjeno regulisan u visoko-metastatičkim kancerskim ćelijama, što sugeriše da TG2 može da deluje kao protein koji potiskuje tumore usled svoje interakcije sa GPR56 [18].

[0017] Aktuelni inhibitori transglutaminaze spadaju u 3 glavne klase: 1) kompetitivni aminski inhibitori (npr. cistamin i spermin) koji se nadmeću sa prirodnim aminskim supstratima; 2) reverzibilni alosterni inhibitori, kao što su GTP i novootkrivena klasa jedinjenja sa tieno[2,3-d] pirimidin-4-on acilhidrazidnim skeletom; i 3) ireverzibilni inhibitori, uključujući 2-[(2oksopropil)tio]imidazolijumske derivate (acetilatni mesno aktivni cistein), 3-halo-4,5-dihidroizoksazole (oblik stabilnog iminotioetra na aktivnom mestu) i karbobenziloksi-L-glutaminil glicinski analozi sa umetnutim različitim reaktivnim grupama.

[0018] Većina je bila korišćena u eksperimentalnim sistemima i pokazala je korisne ishode. Međutim, ni jedan od ovih inhibitora nije pokazao specifičnost za TG izoforme, pošto svi oni ciljaju očuvanu katalitičku trijadu unutar katalitičkog jezgra familije transglutaminaza. Shodno tome, svi potencijalno imaju nedostatak ko-inhibicije Faktora Xllla, TG1 i TG3, što efektivno sprečava njihovu primenu kod humane bolesti, zbog neželjenih dejstava koja se mogu očekivati.

[0019] WO 2006/100679 opisuje specifično anti-TG2 antitelo proizvedeno rekombinantnom tehnologijom od uzoraka uzetih od tri odrasla celijačna pacijenta sa visokim titrima anti-TG2 antitela.

[0020] CUB7402 (ab2386) je antitelo koje se može komercijalno nabaviti od firme Abcam.

[0021] Lai et al., 2007; FASEB 21(14):4131-4143 opisuju identifikaciju dva GTP nezavisna naizmenično spojena oblika tkivne transglutaminaze u humanim leukocitima, vaskularnom glatkom mišiću, i endotelnim ćelijama.

[0022] WO 2010/113025 opisuje selektivnu dijagnozu glutenom-indukovanih autoimunih bolesti testovima vezivanja uz korišćenje glavnog celijačnog epitopa koji je prisutan na proteinima iz familije transglutaminaza.

[0023] WO 02/068616 opisuje transglutaminazu 6 kao dijagnostički indikator autoimunih bolesti.

[0024] Di Niro et. Al., 2005; Biochem. J.388 (4): 889-894 opisuje karakterizaciju monoklonskih epitopa antitela prikazom faze filtriranog fragmenta gena

[0025] Di Niro et. Al., , 2007; BMC Biotechnologi 7 (46): 1-10 opisuje konstrukciju minijantijela za in vivo proučavanje humanih autoimunih bolesti na životinjskim modelima.

[0026] WO 2010/116196 opisuje selektivnu dijagnozu autoimunih bolesti izazvanih glutenom analizom vezivanja koristeći glavni celijakijski epitop prisutan na proteinima iz porodice transglutaminaza. WO 2010/116196 takođe opisuje lečenje autoimunih bolesti izazvanih glutenom inhibiranjem vezivanja celijačnih autoantitela terapijskim jedinjenjima.

[0027] Simon-Vescsei et. Al., 2012; PNAS 109 (2): 433-434 opisuje da je pojedinačni epitop konformacione transglutaminaze 2 koji daju tri domena presudan za vezivanje i efekte celijakijskih antitela.

[0028] Sblattero et. Al ., 2002; EUR. J Biochem 269 (12): 5177-5178 opisuje analizu fine specifičnosti antitela celijaklijske bolesti koristeći fragmente tkivne transglutaminaze.

[0029] S obzirom na povezanost TG2 sa brojnim bolestima i uverljive podatke o nespecifičnim inhibitorima, postoji potreba za visoko selektivnim i visoko efikasnim inhibitorima TG2 sa minimalnim nepredviđenim efektima na nepredviđene mete .

[0030] Navođenje rasprava o naizgled prethodno objavljenom dokumentu u ovoj specifikaciji ne bi se nužno trebalo shvatiti kao potvrda da je dokument deo stanja tehnike ili da je opštepoznat.

SUŠTINA PRONALASKA

[0031] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se selektivno vezuje za epitop unutar jezgra regiona humane transglutaminaze tipa 2 (TG2) i inhibira aktivnost čoveka TG2, pri čemu se navedeni deo jezgra sastoji od aminokiselina 143 do 473 humanog TG2, pri čemu se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment selektivno vezuje za region koji sadrži aminokiseline 304 do 326 humanog TG2, a gde je inhibirana aktivnost humanog TG2 TG2 umrežavanje lizina i glutamina sa Ne ( g-glutamil) lizin izopeptidne veze.

[0032] U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ne inhibira aktivnost TG1, TG3, TG13 i / ili TG7. U jednom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment: a. sadrži ili se sastoji od netaknutog antitela, ili b. sadrži ili se sastoji od antigen-vezujućeg fragmenta izabranog iz grupe koju čine: Fv fragment (na primer Fv fragment jednog lanca ili Fv fragment vezan za disulfid); fragment Fab; i fragment sličan Fabu (na primer fragment Fab ’ili fragment F (ab) 2).

[0033] U jednom izvođenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se vezuje za isti epitop kao i antitelo koje sadrži sledeće CDR sekvence:

KASQDINSYLT (LCDR1);

RTNRLFD (LCDR2);

LQYDDFPYT (LCDR3);

SSAMS (HCDR1);

TISVGGGKTYYPDSVKG (HCDR2); I

LISLY (HCDR3).

[0034] U jednoj realizaciji, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se takmiči i remeti vezivanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji ima promenljivi region lakog lanca odabranog iz sledećih sekvenci:

DIQMTQTPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLF DGVPSRFSGSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK;

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLF DGVPSRFSGSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK;

EIVLTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFD GVPSRFSGSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK;

DIQMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLF DGVPSRFSGSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK;

EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWYQQKPGKAPKLLIYRTNRLFD GVPSRFSGSGSGTDFFFTISSLQPEDFGTYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK;

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKSLIYRTNRLF DGVPSRFSGSGSGTDFFLTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIK;

AIKMTQSPSSMYASLGERVIITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYLTNRLM DGVPSRFSGSGSGQEFLLTISGLEHEDMGIYYCLQYVDFPYTFGGGTKLEIK;

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKSLIYLTNRLM DGVPSRFSGSGSGTDFFLTISSLQPEDFATYYCLQYVDFPYTFGQGTKVEIK;

DIKMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKTLIYLTNRLM DGVPSRFSGSGSGQEFLLTISSLQPEDFATYYCLQYVDFPYTFGQGTKVEIK;

DITMTQSPSSIYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKILIYLVNRLVD GVPSRFSGSGSGQDYALTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK;

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKSLIYLVNRLV DGVPSRFSGSGSGTDFFLTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIK;

DITMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKILIYLVNRLVDGVPS RFSGSGSGQDYALTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIK;

varijabilni region teškog lanca izabran iz sledećih sekvenci:

EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVG GGKTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTV SS;

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVG GGKTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTV SS;

EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVG GGKTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTV SS;

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVSTISVG GGKTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISLYWGQGTLVTV SS;

AVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGIIFSSSAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGG RSTYYPDSVKGRFTVSRDSAKNTLYLQMDSLRSEDTAIYYCAKLISPYWGQGTTLTVSS

;

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSG GRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISPYWGQGTLVTV SS;

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIIFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVATISSGG RSTYYPDSVKGRFTVSRDSSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISPYWGQGTLVTVS

S;

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSTHAMSWVRQTPEKRLEWVATISSG GRSTYYPDSVKGRFTISRDNVKNTLYLQLSSLRSEDTAVYFCARLISTYWGQGTTLTVS

S;

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTHAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSG GRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISTYWGQGTLVTV SS;

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSTHAMSWVRQAPGKGLEWVATISS GGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARLISTYWGQGTLVT VSS.

[0035] U jednoj realizaciji, vezivanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta za humani TG2 je inhibirano ili smanjeno kada antitelo koje ima promenljivi region lakog lanca odabrano iz sledećih sekvenci:

DITMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKILIYLVNRLV DGVPSRFSGSGSGQDYALTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIK; and

varijabilni region teškog lanca izabran iz sledećih sekvenci:

1

;

S;

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSTHAMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGRST YYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARLISTYWGQGTLVTVSS is se vezuje za humani TG2.

[0036] Predmetnim pronalaskom je takođe realizovan polinukleotid koji kodira antitelo ili antigen-vezujući fragment prema predmetnom pronalasku.

[0037] Pored toga, predmetnim pronalaskom je realizovano jedinjenje koje sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku i neku drugu grupu, na primer, lako detektabilnu grupu, i/ili direktno ili indirektno citotoksičnu grupu.

[0038] Predmetnim pronalaskom je takođe realizovana farmaceutska kompozicija/formulacija koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema predmetnom pronalasku, ili polinukleotid prema predmetnom pronalasku, ili jedinjenje prema predmetnom pronalasku, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, adjuvansom, razređivačem ili nosačem, koja opciono dalje sadrži jedan ili više drugih aktivnih sastojaka, a pri čemu je kompozicija/formulacija prvenstveno formulisana za intravensko, intramuskularno, ili subkutano davanje pacijentu.

[0039] Predmetnim pronalaskom je takođe realizovan kit od delova koji sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema predmetnom pronalasku, ili polinukleotid prema predmetnom pronalasku, ili jedinjenje prema predmetnom pronalasku; i neki drugi agens.

[0040] Predmetnim pronalaskom je takođe realizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema predmetnom pronalasku, ili polinukleotid prema predmetnom pronalasku, ili jedinjenje prema predmetnom pronalasku, za primenu u medicini.

[0041] Pored toga, predmetnim pronalaskom je realizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema predmetnom pronalasku, ili polinukleotid prema predmetnom pronalasku, ili jedinjenje prema predmetnom pronalasku, za primenu u lečenju i/ili dijagnozi celijačne bolesti, abnormalnog zarastanja rana, stvaranja ožiljaka, hipertrofičnih ožiljaka, okularnog stvaranja ožiljaka, zapaljenske bolesti creva, makularne degeneracije, psorijaze, bolesti povezanih sa fibrozom (npr. fibroza jetre, plućna fibroza, kao što su intersticijalna bolest pluća i fibrotična bolest pluća, kardijalna fibroza, mijelofibroza, fibroza bubrega, kao što su glomeruloskleroza i tubulointersticijalna fibroza), ateroskleroze, restenoze, zapaljenskih bolesti, autoimunih bolesti, neurodegenerativnih/neuroloških bolesti bolesti (kao što su npr. Hantingtonova bolest, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, poliglutaminska bolest, spinobulbarna mišićna atrofija, dentatorubro-palido-lujzijanska atrofija, spinocerebralne ataksije 1, 2, 3, 6, 7 i 12, rubropalido atrofija, spinocerebralna paraliza), glioblastoma, kao što su glioblastom u Li-Fraumeni sindromu i sporadični glioblastom, maligni melanomi, pankreasni duktalni adenokarcinomi, mijeloidna leukemija, akutna mijelogena leukemija, mijelodisplastični sindrom, mijeloproliferativni sindrom, ginekološki kancer, Kapošijev sarkom, Hansenova bolest i/ili kolageni kolitis.

[0042] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema pronalasku, postupak koji uključuje izolovanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta iz ex-vivo uzorka dobijenog od nehumane životinje koja je prethodno imunizovana koristeći:

a) jedinjenje koje sadrži:

i) polipeptidnu sekvencu koja se sastoji od polipeptidne sekvence aminokiselina 143 do 473 humanog TG2, ili

ii) sekvencu polipeptida koja se sastoji od aminokiselina 304 do 326 humanog TG2; i, b) opciono adjuvanta;

i pri čemu postupak dalje uključuje korak izbora antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen na osnovu njegovog selektivnog vezivanja za region koji sadrži aminokiseline 304 do 326 humanog TG2 do TG2 i njegove inhibicije aktivnosti humanog TG2, pri čemu Inhibirana aktivnost TG2 je umrežavanje lizina i glutamina sa Nε(γ-glutamil)lizin izopeptidnim vezama TG2.

DETALJAN OPIS

[0043] Predmetnim pronalaskomje realizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se selektivno vezuje za epitop unutar regiona jezgra humanog transglutaminaze tipa 2 (TG2).

[0044] Predočava se da se ovde opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu selektivno vezivati za epitop unutar regiona jezgra humanog TG2, pacovskog TG2, i/ili mišjeg TG2.

[0045] Kompletne aminokiselinske sekvence humanog, pacovskog i mišjeg TG2 se mogu naći pod Genbank pristupnim brojevima NM_004613, NM_019386.2 i NM_009373.3. Kodirajući delovi ovih sekvenci su kao što sledi:

Humana TG2 nukleotidna sekvenca:

1

Humana TG2 aminokiselinska sekvenca:

Pacovska TG2 nukleotidna sekvenca:

Pacovska TG2 aminokiselinska sekvenca:

Mišja TG2 nukleotidna sekvenca:

Mišja TG2 aminokiselinska sekvenca:

1

[0046] Aktuelni pronalazači su izazvali antitela protiv TG2 imunizacijom miševa sa rekombinantnim proteinom koji je sadržao aminokiseline 143 do 473 humanog jezgra TG2. Bio je izvršen skrining hibridoma u pogledu TG2 specifičnosti i inhibicije sa bilo kojim podesnim kloniranim kandidatima. Iz njih je bio prečišćen IgG da bi se izračunala efikasnost, a ciljni epitop je mapiran pretraživanjem humane TG2 biblioteke putem prikazivanja faga.

[0046] Predmetni pristup za proizvodnju antitela protiv TG2 korišćenjem rekombinantnog proteinskog jezgra TG2 nije bio ranije pokušan i kao iznenađujuće je doveo do izolacije i karakterizacije antitela za TG2 koja su bila visoko selektivna za TG2 i ispoljila su jake inhibitorne karakteristike. Prethodni pokušaji da se stvore antitela za TG2 su doveli do izolacije relativno neselektivnih antitela koja unakrsno-reaguju sa drugim članovima familije transglutaminaza, a shodno tome, ne bi predstavljala obećavajuća antitela za kliničku upotrebu. Antitela prema predmetnom pronalasku, sa druge strane, predstavljaju obećavajuće kandidate za klinička ispitivanja za bolesti koje pogoršava ili posreduje TG2 aktivnost.

[0047] Iznenađujuće je da je pristup u predmetnoj prijavi doveo do proizvodnje mnogo efektivnijih antitela od onih koja su ranije proizvedena. Nije bilo garancije da bi bilo moguće realizovati antitela koja su efektivni inhibitori TG2 imunizacijom sa regionom jezgra. Kao što je gore navedeno, antitela koja su efektivni inhibitori ne moraju biti dovoljno specifična za TG2 da bi se efektivno koristila u medicini. Iznenađujuće je da su antitela za divergentne regione (a naročito regione jezgra koji koja blago divergiraju među različitim članovima familije transglutaminaza TG2) efektivni i selektivni inhibitori TG2.

[0048] Bez želje za vezivanjem za bilo koju teoriju, mislimo da stvaranjem antitela za manji protein koji pokriva samo centralno jezgro, nismo eliminisali samo neke korisne imunološke epitope prisutne u proteinu cele dužine, već da smo takođe iznudili ciljanje jezgra. Izgleda da ovo povećava raznovrsnost antitela koja su raspoloživa za selekciju i obezbeđuje šire pokrivanje jezgra.

[0049] Imunizacija samo sa jezgrom TG2 je uklonila veći deo tercijarne strukture enzima (a naročito dva karboksi terminalna domena beta bačve). Moguće je da neki od epitopa koji možda mogu biti manje raspoloživi ili imunogeni unutar prirodnog TG2 molekula cele dužine

1

mogu biti atraktivniji epitopi sa jezgrom u ovde opisanom formatu. Ovde opisana antitela prepoznaju linearne epitope (tj. vezane za TG2 na redukujućem SDS PAGE gelu), dok je 80 % antitela koja smo prethodno izolovali korišćenjem TG2 cele dužine kao imunogena bilo konformaciono zavisno. Bili smo u stanju da pokažemo da je rekombinantni domen jezgra zadržao enzimsku aktivnost, i tako je izolacija inhibitornih antitela verovatno pomogla izlaganje prethodno manje korisnih epitopa lociranih u ili blizu aktivnog mesta. Interesantno i iznenađujuće je da su inhibitorna antitela za humani TG2 bila stvorena imunizacijom sa jezgrom, imajući u vidu da rekombinantna proteinska jezgra nisu mogla da demonstriraju iste karakteristike savijanja kao protein cele dužine.

[0050] TG katalitičko jezgro je visoko očuvano među članovima TG familije i među vrstama. Ovo sugeriše da razvoj ne samo specifičnih malih molekula inhibitora, već takođe i inhibitora na bazi antitela može biti tehnički izazovan. Ipak, predmetnim otkrivanjem su realizovana antitela koja su visoko selektivna. Da je ovo moguće može pokazati činjenica da postoje neki regioni unutar TG2 katalitičkog domena gde postoji izvesna heterogenost. Predmetna antitela zato mogu koristiti ove male razlike. Iznenađujuća selektivnost predmetnih antitela može omogućiti razvoj terapeutika koji efikasno mogu remetiti TG2 aktivnost, a shodno tome, obezbeđuju potencijalno efektivne terapije za stanja pogoršana ili izazvana TG2 aktivnošću tamo gde sada ne postoji zadovoljavajuća terapeutska opcija.

[0051] Radi poređenja, za antitela opisana u WO 2006/100679, koja su bila proizvedena rekombinantnom tehnologijom od uzoraka tri odrasla celijačna pacijenta sa visokim titrima anti-TG2 antitela, se pokazalo da imaju malu efikasnost kada su bila testirana od strane aktuelnih pronalazača (Primer 2). Antitela prema predmetnom pronalasku su bila daleko superiornija u poređenju sa onima iz WO 2006/100679 u pogledu selektivnosti za TG2 i u pogledu inhibitorne aktivnosti. Na primer, aktuelni pronalazači su generisali Fab fragment antitela iz WO 2006/100679, koji je bio primenjen u istoj koncentraciji u testovima TG2 inhibicije kao i antitela prema predmetnom pronalasku. Količina Fab fragmenta u testovima je bila dvostruka molska u odnosu na onu od antitela prema predmetnom pronalasku, ali oni još uvek nisu uspeli da ispolje bilo kakvu inhibiciju TG2 aktivnosti. Kada je bilo testirano WO 2006/100679 antitelo cele dužine u pogledu inhibicije u našem standardnom testu inkorporiranja putrescina, nije bila pronađena inhibicija TG2 aktivnosti. Shodno tome, metodi prema predmetnom pronalasku i antitela proizvedena tim metodima su superiorni u odnosu na one koji su prethodno opisani.

[0052] Pod "antitelom" podrazumevamo u suštini intaktne molekule antitela, kao što su himerična antitela, humanizovana antitela, humana antitela (pri čemu je najmanje jedna aminokiselina mutirana u odnosu na prirodna humana antitela), jednolančana antitela, bispecifična antitela, teške lance antitela, lake lance antitela, homodimere i heterodimere teških i/ili lakih lanaca antitela, i antigen vezujuće fragmente i derivate istih. Takođe obuhvatamo

1

varijante, fuzije i derivate antitela i njegovih antigen-vezujućih fragmenata u okviru značenja izraza "antitelo" i "njegovi antigen-vezujući fragmenti".

[0053] Izraz "antitelo" takođe obuhvata sve klase antitela, uključujući IgG, IgA, IgM, IgD i IgE. Shodno tome, antitelo može biti IgG molekul, kao što je IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 molekul. Prvenstveno, antitelo prema pronalasku je IgG molekul, ili njegov antigen-vezujući fragment, ili varijanta, fuzija ili derivat. Još poželjnije, antitelo je IgG2 molekul.

[0054] Antitela, kompozicije, primene i metode koji su ovde opisani obuhvataju varijante, fuzije i derivate definisanih antitela i njihovih antigen-vezujućih fragmenata, kao i fuzije pomenutih varijanti ili derivata, uz uslov da takve varijante, fuzije i derivati imaju specifičnost vezivanja za TG2.

[0055] Pošto antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti obuhvataju jednu ili više polipeptidnih komponenti, varijante, fuzije i derivati antitela i njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji su ovde definisani mogu biti napravljeni korišćenjem metoda proteinskog inženjeringa i mesnousmerene mutageneze koji su dobro poznati u odgovarajućoj oblasti uz korišćenje rekombinantnih polinukleotida (vidi, na primer, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3. izdanje, Sambrook & Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[0056] Shodno tome, varijante, fuzije i derivati antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji su ovde definisani mogu biti napravljeni na bazi polipeptidne komponente antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0057] Pod "fuzijom" obuhvatamo pomenuti polipeptid koji je fuzionisan sa bilo kojim drugim polipeptidom. Na primer, pomenuti polipeptid može biti fuzionisan sa polipeptidom kao što je glutation-S-transferaza (GST) ili protein A da bi se olakšal prečišćavanje pomenutog polipeptida. Primeri takvih fuzija su dobro poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Slično tome, pomenuti polipeptid se može fuzionisati sa oligo-histidinskim tagom, kao što je His6, ili sa epitopom koga prepoznaju antitela, kao što je dobro poznati Myc-tag epitop. Fuzije sa bilo kojom varijantom ili derivatom pomenutog polipeptida su takođe obuhvaćene. Shvatljivo je da su poželjne fuzije (ili njihove varijante ili derivati) koje zadržavaju poželjna svojstva, kao što su da imaju specifičnost vezivanja za TG2.

[0058] Fuzija može sadržati ili se sastojati od sledećeg dela koji prenosi poželjnu karakteristiku na pomenuti polipeptid; na primer, taj deo može biti koristan za detekciju ili izolaciju polipeptida, ili promociju ćelijske resorpcije polipeptida. Taj deo može biti, na primer, biotin grupa, radioaktivna grupa, fluorescentna grupa, na primer, mali fluoroforni ili zeleni fluorescentni protein (GFP) fluorofor, kao što je dobro poznato stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Grupa može biti imunogeni tag, na primer, Myc-tag, kao što je poznato stručnjacima iz odgovarajuće oblasti ili može biti lipofilni molekul ili polipeptidni domen koji može da stimuliše ćelijsku resorpciju polipeptida, kao što je poznato stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

1

[0059] Pod "varijantama" pomenutog polipeptida podrazumevamo polipeptid kod koga se na jednoj ili više pozicija nalaze aminokiselinske insercije, delecije, i/ili supstitucije, bilo konzervativne ili nekonzervativne, uz uslov da takve promene rezultuju proteinom čija osnovna svojstva, kao što su, na primer, svojstva vezivanja, termostabilnost, aktivnost u izvesnom pH-opsegu (pH-stabilnost) nisu značajno promenjena. "Značajno" u ovom kontekstu znači da bi stručnjak iz odgovarajuće oblasti rekao da svojstva varijante mogu biti još različita, ali da nisu neočigledna u odnosu na ona od originalnog proteina. Shodno tome, obuhvatili smo varijante polipeptida gde promene suštinski ne menjaju aktivnost pomenutog polipeptida. Naročito smo obuhvatili varijante polipeptida gde promene suštinski ne menjaju specifičnost vezivanja za TG2.

[0060] Pod "konzervativnim supstitucijama" su obuhvaćene kombinacije kao što su Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; i Phe, Tyr.

[0061] Takve varijante mogu biti napravljene korišćenjem metoda proteinskog inženjeringa i mesno-usmerene mutageneze.

[0062] Polipeptidna varijanta može imati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75% identičnost sa jednom ili više ovde datih aminokiselinskih sekvenci, na primer, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnost sa jednom ili više ovde specifikovanih aminokiselinskih sekvenci.

[0063] Procentualna identičnost sekvenci dva polipeptida se može odrediti korišćenjem podesnih kompjuterskih programa, na primer, GAP programa od University of Wisconsin Genetic Computing Group i smatraće se da je procentualna identičnost izračunata za polipeptide čije sekvence su optimalno poravnate.

[0064] Alternativno tome, poravnanje može biti izvedeno korišćenjem Clustal W programa (kao što je opisano u Thompson et al., 1994, Nucl. Acid Res.22:4673-4680).

[0066] Upotrebljeni parametri mogu biti kao što sledi:

- Parametri brzog poravnanja dve sekvence: K-struka(reč) veličina; 1, veličina prozora; 5, kazna za prazninu; 3, broj gornjih dijagonala;

5. Metod vrednovanja: x procenat.

- Parametri višestrukog poravnanja: kazna za otvorenu prazninu; 10, kazna za produženu prazninu; 0.05.

- Matrica za vrednovanje: BLOSUM.

[0067] Alternativno tome, može se upotrebiti BESTFIT program za određivanje lokalnih poravnanja sekvenci.

1

[0068] Antitelo, antigen-vezujući fragment, varijanta, fuzija ili derivat upotrebljeni u metodama ili primenama prema pronalasku mogu sadržati ili se sastojati od jedne ili više aminokiselina koje su modifikovane ili derivatizovane.

[0069] Hemijski derivati jedne ili više aminokiselina se mogu realizovati reakcijom sa funkcionalnom bočnom grupom. Takvi derivatizovani molekuli obuhvataju, na primer, one molekule kod kojih su slobodne amino grupe derivatizovane tako da formiraju aminske hidrohloride, p-toluen sulfonil grupe, karboksibenzoksi grupe, t-butiloksikarbonilne grupe, hloroacetilne grupe ili formil grupe. Slobodne karboksilne grupe mogu biti derivatizovane tako da formiraju soli, metil i etil estre ili druge tipove estara i hidrazida. Slobodne hidroksilne grupe mogu biti derivatizovane tako da formiraju O-acil ili O-alkil derivate. Takođe su kao hemijski derivati obuhvaćeni oni peptidi koji sadrže derivate prirodnih aminokiselina od dvadeset standardnih aminokiselina. Na primer: 4-hidroksiprolin može biti supstituisan sa prolinom; 5-hidroksilizin može biti supstituisan sa lizinom; 3-metilhistidin može biti supstituisan sa histidinom; homoserin može biti supstituisan sa serinom i ornitin sa lizinom. Derivati takođe obuhvataju peptide koji sadrže jednu ili više adicija ili delecija sve dok je zadržana potrebna aktivnost. Druge obuhvaćene modifikacije su amidacija, amino terminalna acilacija (npr. acetilacija ili amidacija tioglikolne kiseline), terminalna karboksilamidacija (npr. sa amonijakom ili metilaminom), i slične terminalne modifikacije.

[0070] Dalje će stručnjaci iz odgovarajuće oblasti shvatiti da mogu biti korisna peptidomimetička jedinjenja takođe. Shodno tome, pod ’polipeptidom’ smo obuhvatili peptidomimetička jedinjenja koja mogu da se vezuju za epitop unutar regiona jezgra TG2. Izraz ’peptidomimetik’ se odnosi na jedinjenje koje podražava konformaciju i željena svojstva specifičnog peptida kao terapeutskog agensa.

[0071] Na primer, pomenuti polipeptid ne sadrži samo molekule u kojima su aminokiselinski ostaci spojeni peptidnim (-CO-NH-) vezama, već takođe i molekule u kojima je peptidna veza preokrenuta. Takvi retro-inverzo peptidomimetici mogu biti napravljeni korišćenjem metoda koji su poznati u odgovarajućoj oblasti, na primer, kao što su oni koji su opisani u Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Ovaj pristup obuhvata pravljenje pseudo-peptida koji sadrže promene, uključujući i skelet, a ne orijentaciju bočnih lanaca. Retro-inverzni peptidi, koji sadrže NH-CO veze umesto CO-NH peptidnih veza, su mnogo otporniji na proteolizu. Alternativno tome, pomenuti polipeptid može biti peptidomimetičko jedinjenje, pri čemu su jedan ili više aminokiselinskih ostataka povezani pomoću -y(CH2NH)- veze umesto uobičajene amidne veze.

[0072] U sledećoj varijanti, peptidna veza može biti sasvim izostavljena, dok je predviđeno da se upotrebi odgovarajuća linker grupa koja održava rastojanje između atoma ugljenika u aminokiselinskim ostacima; može biti poželjno da linker grupa ima u suštini istu raspodelu naelektrisanja i u suštini istu planarnost kao peptidna veza.

2

[0073] Shvatljivo je da pomenuti polipeptid može biti podesno blokiran na svom N- ili C-terminusu, što pomaže smanjenju podložnosti egzo-proteolitičkoj digestiji.

[0074] Takođe se upotrebljavaju različite nekodirane ili modifikovane aminokiseline, kao što su D-aminokiseline i N-metil aminokiseline, za modifikaciju sisarskih peptida. Pored toga, pretpostavljena bioaktivna konformacija može biti stabilizovana kovalentnom modifikacijom, kao što je ciklizacija ili inkorporiranjem laktama ili drugih tipova mostova, na primer, vidi Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636 i Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm.111:166.

[0075] Zajednička tema među mnogim strategijama za sintezu je uvođenje neke ciklične grupe u okvir na bazi peptida. Ciklična grupa ograničava konformacioni prostor peptidne strukture, a ovo često rezultuje povećanjem specifičnosti peptida za specifični biološki receptor. Dodatna prednost ove strategije je ta što uvođenje ciklične grupe u peptid takođe može rezultovati peptidom koji ima smanjenu osetljivost za ćelijske peptidaze.

[0076] Shodno tome, ilustrativni polipeptidi koji su korisni u metodima i primenama prema pronalasku obuhvataju ili se sastoje od terminalnih cisteinskih aminokiselina. Takav polipeptid može postojati u heterodetnom cikličnom obliku zahvaljujući formiranju disulfidne veze merkaptidnih grupa u terminalnim cisteinskim aminokiselinama ili u homodetnom obliku zahvaljujući formiranju amidne peptidne veze između terminalnih aminokiselina. Kao što je gore navedeno, ciklizacijom malih peptida pomoću disulfidnih ili amidnih veza između cisteina N- i C-terminusa se mogu izbeći problemi specifičnosti i poluživota koji se povremeno uočavaju kod linearnih peptida, smanjenjem proteolize, a takođe i povećanjem krutosti strukture, što može dati jedinjenja veće specifičnosti. Polipeptidi koji su ciklizovani disulfidnim vezama imaju slobodne amino- i karboksi-terminuse koji još uvek mogu biti podložni proteolitičkoj degradaciji, dok su peptidi ciklizovani formiranjem amidne veze između N-terminalnog amina i C-terminalnog karboksila i zato više ne sadrže slobodne amino- ili karboksi terminuse. Shodno tome, peptidi mogu biti povezani bilo C-N vezom ili disulfidnom vezom.

[0077] Predmetni pronalazak ni na koji način nije ograničen metodom ciklizacije peptida, već obuhvata peptide čija ciklična struktura može biti realizovana bilo kojim podesnim metodom sinteze. Shodno tome, heterodetne veze mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na formiranje pomoću disulfidnih, alkilenskih ili sulfidnih mostova. Metode sinteze cikličnih homodetskih peptida i cikličnih heterodetskih peptida, koji sadrže disulfidne, sulfidne i alkilenske mostove, su opisani u US 5,643,872. Drugi primeri metoda ciklizacije su razmotreni i opisani u US 6,008,058.

[0078] Sledeći pristup sintezi cikličnih stabilizovanih peptidomimetičkih jedinjenja je metateza sa zatvaranjem prstena (RCM). Ovaj metod obuhvata korake sinteze peptidnog prekursora i njegovo dovođenje u kontakt sa RCM katalizatorom da bi se dobio konformaciono ograničeni peptid. Podesni peptidni prekursori mogu sadržati dve ili više nezasićenih C-C veza. Ovaj metod može biti izveden korišćenjem tehnika sinteze peptida u čvrstoj fazi. U ovom primeru izvođenja, prekursor, koji je pričvršćen za čvrsti nosač, se dovodi u kontakt sa RCM katalizatorom, a proizvod se onda odvaja od čvrstog nosača da bi se dobio konformaciono ograničeni peptid.

[0079] Sledeći pristup, koji su opisali D. H. Rich u Protease Inhibitors, Barrett i Selveson, eds., Elsevier (1986), je bio da se konstruišu peptidni mimetici, primenom koncepta analoga prelaznog stanja u konstruisanju inhibitora enzima. Na primer, poznato je da sekundarni alkohol stalina podražava tetrahedralno prelazno stanje scisilne amidne veze pepsinskog supstrata.

[0080] Ukratko, terminalne modifikacije su korisne, kao što je dobro poznato, za smanjenje podložnosti digestiji proteinazom i zbog toga za produžavanje poluživota peptida u rastvorima, a naročito u biološkim fluidima gde mogu biti prisutne proteaze. Polipeptidna ciklizacija je takođe korisna modifikacija, jer se ciklizacijom formiraju stabilne strukture i sa stanovišta bioloških aktivnosti uočenih za ciklične peptide.

[0081] Shodno tome, pomenuti polipeptid može biti cikličan. Međutim, prema jednoj varijanti, pomenuti polipeptid može biti linearan.

[0082] Pod "selektivno se vezuje za epitop unutar regiona jezgra TG2" podrazumevamo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji je sposoban za selektivno vezivanje za epitop u regionu jezgra TG2. Pod "sposoban za selektivno vezivanje" podrazumevamo takve vezujuće grupe koje potiču od antitela, a koje se vezuju najmanje 10-struko jače za jezgro TG2 nego za druge proteine; na primer, najmanje 50-struko jače, ili najmanje 100-struko jače. Vezujuća grupa može biti sposobna za selektivno vezivanje za epitop u jezgru TG2 pod fiziološkim uslovima, npr. in vivo.

[0083] Takva specifičnost vezivanja se može odrediti metodama koje su dobro poznate u odgovarajućoj oblasti, kao što je enzimski-vezani imunosorbentni test (ELISA), imunohistohemija, imunotaloženje, vestern blot i protočna citometrija uz korišćenje transfektovanih ćelija koje izražavaju TG2 ili jezgro TG2, ili njegov fragment. Podesne metode za merenje relativnih jačina vezivanja obuhvataju imunotestove, na primer, gde je vezujuća grupa antitelo (vidi Harlow & Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Habor Laboratory Press, Njujork). Alternativno tome, vezivanje se može ispitati korišćenjem kompetitivnih testova ili korišćenjem Biacore® analize (Biacore International AB, Švedska).

[0084] Poželjno je da se antitelo ili antigen-vezujući fragment prema pronalasku vezuje isključivo za TG2.

[0082] Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da se specifičnost vezivanja antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta prenosi prisustvom regiona koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) unutar varijabilnih regiona konstituentnih teških i lakih lanaca. Kao što je razmotreno dole, prema posebno poželjnoj realizaciji, antitela ili njihava antigen vezujući fragmenti ovde definisani specifično su vezani za TG2 se prenosi prisustvom jednog ili više identifikovanih CDR-ova. Na primer, sekvence koje mogu sadržati ili se mogu sastojati od CDR sekvenci od AB-1 VL i VH sadrže KASQDINSYLT, RTNRLFD, LQYDDFPYT, SSAMS, TISVGGGKTYYPDSVKG, i LISLY. U sledećem primeru, sekvence koje mogu sadržati ili se mogu sastojati od CDR sekvenci od BB-7 VL i VH sadrže KASQDINSYLT, LTNRLMD, LQYVDFPYT, SSAMS, TISSGGRSTYYPDSVKG i LISPY. Sekvence koje mogu sadržati ili se mogu sastojati od CDR sekvenci od DC-1 VL i VH sadrže KASQDINSYLT, LVNRLVD, LQYDDFPYT, THAMS, TISSGGRSTYYPDSVKG, i LISTY. Poželjno je da antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde definisani sadrže ili se sastoje od CDR sekvenci, ili CDR i susednih sekvenci, koje su definisane u Tabeli 24A. Najpoželjnije je da ovde definisana antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti sadrže ili se sastoje od CDR sekvenci, ili CDR i susednih sekvenci, ilustrativnog antitela AB-1, ili BB-7, ili DC-1 (kao što je definisano, na primer, u Tabeli 24A).

[0086] Poželjno je da antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment zadrži specifičnost vezivanja za TG2 originalnog antitela. Pod "zadrži specifičnost vezivanja" podrazumevamo da antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može da se nadmeće za vezivanje za TG2 sa ilustrativnim antitelima prema opisu, na primer, AB-1, AG-1, AG-9, AH-1, AH-3, BB-7, DC-1, EH-6, JE-12, IA-12, DF-4, DH-2, DD-6 i/ili DD-9 (vidi priložene Primere). Na primer, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se mogu vezivati za isti epitop na TG2 kao i antitelo koje sadrži sledeće sekvence: KASQDINSYLT, RTNRLFD, LQYDDFPYT, SSAMS, TISVGGGKTYYPDSVKG, i LISLY.

[0087] Pod "epitopom" ovde treba da se podrazumeva mesto na molekulu za koje se vezuje antitelo, tj. molekulski region antigena. Epitop može biti linearni epitop, koji je određen npr. aminokiselinskom sekvencom, tj. primarnom strukturom, ili trodimenzionalni epitop, koji je definisan sekundarnom strukturom, npr. savijanjem peptidnog lanca u beta ploču ili alfa zavojnicu, ili tercijarnom strukturom, npr. načinom na koji se zavojnice ili ploče savijaju ili postavljaju da bi se dobila trodimenzionalna struktura antigena.

[0088] Metode za određivanje da li testirano antitelo može da se nadmeće za vezivanje sa sekundarnim antitelom su dobro poznate u odgovarajućoj oblasti (kao što je, na primer, sendvič-ELISA ili reverzna-sendvič-ELISA tehnike) i opisane su, na primer, u Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane (1988, CSHL, NY, ISBN 0-87969-314-2).

[0089] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, sa specifičnosti vezivanja za epitop u regionu jezgra TG2 takođe može zadržati jedno ili više istih bioloških svojstava kao originalno antitelo (kao što su ilustrativna antitela navedena u Primerima).

[0090] Kao što je gore objašnjeno, TG2 je kalcijum-zavisni multi-funkcionalni protein koji katalizuje formiranje Nε-(γ-glutamil)lizin izopeptidnih veza između lizinskih i glutaminskih ostataka. TG2 sadrži N terminalni beta sendvič domen koji sadrži mesta vezivanja (npr.

2

fibronektin) i sekvence koje su potrebne za eksportovanje enzima. Ovo je povezano sa domenom katalitičkog jezgra. Centralno u odnosu na domen se nalazi katalitička trijada koja se sastoji od Cys 277, Asp 358, i His 355, plus nekoliko pretpostavljenih mesta vezivanja kalcijuma. Ovo je povezano sa trećim domenom, beta bačvom 1 gde se nalazi mesto za vezivanje GTP koje prenosi enzimu GTPaznu aktivnost. Beta bačva 1 takođe sadrži mesto za vezivanje integrina koje se koristi u ćelijskoj adheziji. Beta Bačva 1 je zajedno sa četvrtim TG2 domenom, Beta bačvom 2, uključena u promenu konformacije kod TG2 koja je potrebna za njegovu aktivaciju. U okruženju bogatom kalcijumom, a siromašnom sa GTP, Bačve 1 i 2 se spuštaju iz zatvorenog i savijenog neaktivnog oblika da bi obezbedile TG2 linearnu strukturu otvaranjem katalitičkog jezgra, što omogućava aktivaciju (Pinkas et al (2007) PLoS Biol. Transglutaminase 2 undergoes a large conformational change upon activation.5(12): e327).

[0091] Pod "regionom jezgra transglutaminaze tipa 2 (TG2)" podrazumevamo region TG2 koji sadrži gore opisanu katalitičku trijadu, izuzev beta sendvič domena i beta bačvi 1 i 2. U smislu ovog pronalasa, region jezgra sadrži ili se sastoji od aminokiselina 143 do 473 humanog TG2, ili njegovog fragmenta.

[0089] Aminokiseline 143 do 473 humanog TG2 se sastoje od sledeće sekvence:

[0092] Shodno tome, u ovom pronalsku region jezgra se može sastojati od aminokiselina 143 do 473 humanog TG2. Epitop antitela bi, kako je ovde opisano, mogao biti bilo koji epitop unutar regiona definisanog aminokiselinama 143 do 473 humanog TG2. Shodno tome, epitop može biti fragment ove sekvence ili bi mogao biti napravljen od različitih aminokiselinskih ostataka unutar ovog fragmenta koji ne moraju biti međusobno susedni u primarnoj strukturi aminokiseline, ali su lokalizovani jedan uz drugi u sekundarnoj, tercijarnoj ili čak kvaternarnoj strukturi proteina, što bi shvatio stručnjak iz odgovarajuće oblasti.

[0091] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ovog pronalaska selektivno su vezani u celini ili delu za region koja sadrži aminokiseline 304 do 326 humanog TG2. Ovaj region (aminokiseline 304 do 326 humanog TG2) se naziva Grupom 1 na Slici 5 i sadrži aminokiselinsku sekvencu AHDQNSNLLIEYFRNEFGEIQGD.

[0093] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ovog opisa se mogu selektivno vezivati u celini ili delu za region koja sadrži aminokiseline 351 do 365 humanog TG2. Ovaj region (aminokiseline 351 do 365 humanog TG2) se naziva Grupom 2 na Slici 5 i sadrži aminokiselinsku sekvencu YEGWQALDPTPQEKS.

[0094] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ovog opisa se mogu selektivno vezivati u celini ili delu za region koji sadrži aminokiseline 450 do 467 humanog TG2. Ovaj region (aminokiseline 450 do 467 humanog TG2) se naziva Grupom 3 na Slici 5 i sadrži aminokiselinsku sekvencu SEEREAFTRANHLNKLAE.

[0095] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku inhibira aktivnost humanog TG2.

[0096] Realizacijom pronalaka antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati jednu ili više sledećih aminokiselinskih sekvenci

KASQDINSYLT; i/ili

RTNRLFD; i/ili

LQYDDFPYT; i/ili

SSAMS; i/ili

TISVGGGKTYYPDSVKG; i/ili

LISLY.

[0097] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ovog pronalaska može sadržati jednu ili više sledećih aminokiselinskih sekvenci

TCKASQDINSYLTWF; i/ili

TLIYRTNRLFDGVP ili TLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF; i/ili YCLQYDDFPYTFG; i/ili

FTLSSSAMSWVR ili CXAXXFTLSSSAMSWVR; i/ili WVATISVGGGKTYYPDSVKGRFTISR ili WVATISVGGGKTYYPDSVKGRFTISRXNXXXXL; i/ili

YCAKLISLYWG, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.

[0098] Smatra se da sekvence koje neposredno prethode sadrže regione koji određuju komplementarnost lakih i teških varijabilnih regiona ilustrativnog antitela AB-1 (vidi Primer 1) i izvesne specifikovane humanizovane varijante AB-1 antitela. U daljoj realizaciji antitelo može sadržati aminokiselinsku sekvencu KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXRTNRLFDXXXXXXXXXXXXXXXFXXXXXXXXXX XXXXXXLQYDDFPYT; ili KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXF; ili RTNRLFDXXXXXXXXXXXXXXXF; ili

FXXXXXXXXXXXXXXXXLQYDDFPYT, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.

2

[0099] U daljoj realizaciji antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati aminokiselinsku sekvencu TCKASQDINSYLTWF ili TCKASQDINSYLTWY; i/ili LLIYRTNRLFDGVP ili SLIYRTNRLFDGVP ili LLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF or SLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF; i/ili YCLQYDDFPYTFG; i/ili FTFSSSAMSWVR ili CXAXXFTFSSSAMSWVR;

i/ili WVSTISVGGGKTYYPDSVKGRFTISR ili WVSTISVGGGKTYYPDSVKGRFTISRXNXXXXL; i/ili YCAKLISLYWG, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.

[0099] Time, u realizaciji antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži sledeće sekvence: KASQDINSYLT; i RTNRLFD; i LQYDDFPYT

U daljoj realizaciji antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži sledeće sekvence: SSAMS; i TISVGGGKTYYPDSVKG; i LISLY.

[0100] U jednom primeru izvođenja pronalaska antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMTQTPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFDGVPSRFS GSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK ili DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFDGVPSRFSG SGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK. Ovi varijabilni regioni lakog lanca odgovaraju onima koji se nalaze u ilustrativnom antitelu AB-1 (Slike 7 i 18).

[0101] Alternativno tome, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

EIVLTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFDGVPSRFSG SGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK (AB-1_VK) ili DIQMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFDGVPSRFS GSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK (AB-1_VK1).

[0102] U posebno poželjnom primeru izvođenja antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWYQQKPGKAPKLLIYRTNRLFDGVPSRFSG SGSGTDFFFTISSLQPEDFGTYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK (hAB-1_RKE); ili DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKSLIYRTNRLFDGVPSRFS GSGSGTDFFLTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIK (hAB-1_RKJ). Ove sekvence su humanizovane varijante sekvenci lakog lanca gore navedenog AB-1.

[0103] U jednom primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVGGGKTYYP DSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTVSS ili

2

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVGGGKTYYP DSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTVSS. Ovi varijabilni regioni teškog lanca odgovaraju onima koji se nalaze u ilustrativnom antitelu AB-1 (Slike 7 i 18).

[0104] Alternativno tome, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVGGGKTYYP DSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTVSS (AB-1_VH).

[0105] U posebno poželjnom primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVSTISVGGGKTYYP DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISLYWGQGTLVTVSS (hAB-1_RHA). Ova sekvenca je humanizovana varijanta sekvence teškog lanca gore navedenog AB-1.

[0106] Shodno tome, predočava se da antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ovog otkrivanja može imati:

i) najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

DIQMTQTPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFDGVPSR

FSGSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK ili

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFDGVPSR

FSGSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK, ili EIVLTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKS

PKTLIYRTNRLFDGVPSRFSGSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKL

EIK (AB-1_VK), ili

DIQMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFDGVPSR

FSGSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK (AB-1_VK1), ili

EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWYQQKPGKAPKLLIYRTNRLFDGVPSRF

SGSGSGTDFFFTISSLQPEDFGTYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK (hAB-1_RKE), ili

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKSLIYRTNRLFDGVPSR

FSGSGSGTDFFLTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIK (hAB-1_RKJ); i ii) najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVGGGKTY

YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTVSS ili

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVGGGKTY

YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTVSS, ili

2

EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVGGGKTY

YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTVSS (AB-

1_VH), ili

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVSTISVGGGKTY

YPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISLYWGQGTLVTVSS (hAB-1_RHA).

[0107] U svakoj realizaciji bilo kog aspekta ovog pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati jednu ili više sledećih aminokiselinskih sekvenci

KASQDINSYLT; i/ili

LTNRLMD; i/ili

LQYVDFPYT; i/ili

SSAMS; i/ili

TISSGGRSTYYPDSVKG; i/ili

LISPY.

[0108] Smatra se da sekvence koje neposredno prethode realizaciji sadrže regione koji određuju komplementarnost lakih i teških varijabilnih regiona ilustrativnog antitela BB-7 (vidi Sliku 19). U daljoj realizaciji, antitelo može sadržati aminokiselinsku sekvencu KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXLTNRLMDXXXXXXXXXXXXXXFXXXXXXXXXXXXXXX XXLQYVDFPYT; ili KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXF; ili LTNRLMDXXXXXXXXXXXXXXF; ili

FXXXXXXXXXXXXXXXXXLQYVDFPYT, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.

[0109] U svakoj realizaciji bilo kog aspekta ovog pronalaska antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži sledeće sekvence: KASQDINSYLT; i LTNRLMD; i LQYVDFPYT.

U svakoj realizaciji bilo kog aspekta ovog pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži sledeće sekvence: SSAMS; i TISSGGRSTYYPDSVKG; i LISPY.

[0110] U jednom primeru izvođenja bilo kod aspekta predmetnog pronalaska antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu AIKMTQSPSSMYASLGERVIITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYLTNRLMDGVPSRFSG SGSGQEFLLTISGLEHEDMGIYYCLQYVDFPYTFGGGTKLEIK. Ovaj varijabilni region lakog lanca odgovara onome koji se nalazi u ilustrativnom antitelu BB-7 (Slika 19).

[0111] U jednom primeru izvođenja bilo kod aspekta predmetnog pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži

2

aminokiselinsku sekvencu AVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGIIFSSSAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGRSTYYPDS VKGRFTVSRDSAKNTLYLQMDSLRSEDTAIYYCAKLISPYWGQGTTLTVSS. Ovaj varijabilni region teškog lanca odgovara onome koji se nalazi u ilustrativnom antitelu BB-7 (Slika 19).

[0112] Shodno tome, predočava se da, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment otkrica može imati:

AIKMTQSPSSMYASLGERVIITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYLTNRLMDGVPSRF

SGSGSGQEFLLTISGLEHEDMGIYYCLQYVDFPYTFGGGTKLEIK; i

ii) najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

AVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGIIFSSSAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGRSTYY

PDSVKGRFTVSRDSAKNTLYLQMDSLRSEDTAIYYCAKLISPYWGQGTTLTVSS.

[0113] Dalje se predočava da, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom otkricu gmože imati:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKSLIYLTNRLMDGVPSR

FSGSGSGTDFFLTISSLQPEDFATYYCLQYVDFPYTFGQGTKVEIK ili

DIKMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKTLIYLTNRLMDGVPSR

FSGSGSGQEFLLTISSLQPEDFATYYCLQYVDFPYTFGQGTKVEIK; i/ili

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGRSTY

YPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISPYWGQGTLVTVSS ili

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIIFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGRSTYY

PDSVKGRFTVSRDSSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISPYWGQGTLVTVSS. Ove sekvence odgovaraju humanizovanim varijantama antitela BB-7 (vidi Tabele 23, 24 i 24A).

[0114] U jednom primeru izvođenja bilo kod aspekta predmetnog pronalaska antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati jednu ili više sledećih aminokiselinskih sekvenci

KASQDINSYLT; i/ili

LVNRLVD; i/ili

LQYDDFPYT i/ili

THAMS; i/ili

TISSGGRSTYYPDSVKG; i/ili

2

LISTY.

[0115] Smatra se da sekvence koje neposredno prethode realizaciji sadrže regione koji određuju komplementarnost lakih i teških varijabilnih regiona ilustrativnog antitela DC-1 (vidi Sliku 20). U daljej realizaciji antitelo može sadržati aminokiselinsku sekvencu KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXLVNRLVDXXXXXXXXXXXXXXXAXXXXXXXXXXXXXX XXLQYDDFPYT ili KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXA; ili LVNRLVDXXXXXXXXXXXXXXXA;

ili AXXXXXXXXXXXXXXXXLQYDDFPYT, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.

[0116] U jednom primeru izvođenja bilo kod aspekta predmetnog pronalaska antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži sledeće sekvence: KASQDINSYLT; i LVNRLVD; i LQYDDFPYT, U daljoj realizaciji bilo kog aspekta predmetnog pronalaska antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu imati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži sledeće sekvence: THAMS; i TISSGGRSTYYPDSVKG; i LISTY.

[0117] U jednom primeru bilo kog aspekta izvođenja predmetnog pronalaska antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu DITMTQSPSSIYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKILIYLVNRLVDGVPSRFSGS GSGQDYALTISSLEY EDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK. Ovaj varijabilni region lakog lanca odgovara onome koji se nalazi u ilustrativnom antitelu DC-1 (Slika 20).

[0118] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSTHAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGRSTYYPD SVKGRFTISRDNVKNTLYLQLSSLRSEDTAVYFCARLISTYWGQGTTLTVSS. Ovaj varijabilni region teškog lanca odgovara onome koji se nalazi u ilustrativnom antitelu DC-1 (Slika 20).

[0119] Shodno tome, predočava se da, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ovog opisa može imati:

DITMTQSPSSIYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKILIYLVNRLVDGVPSRFS

GSGSGQDYALTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK; i

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSTHAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGRSTY

YPDSVKGRFTISRDNVKNTLYLQLSSLRSEDTAVYFCARLISTYWGQGTTLTVS.

[0120] Dalje se predočava da u jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKSLIYLVNRLVDGVPSR

FSGSGSGTDFFLTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIK ili

DITMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKILIYLVNRLVDGVPSRF

SGSGSGQDYALTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIK; i/ili

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTHAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGRSTY

YPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISTYWGQGTLVTVSS ili

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSTHAMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGRSTY

YPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARLISTYWGQGTLVTVSS. Ove sekvence odgovaraju humanizovanim varijantama DC-1 navedenim u Tabelama 23, 24 i 24A.

[0121] Ovde opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati jednu ili više sledećih aminokiselinskih sekvenci

KASQDINSYLT; i/ili

XXNRLXD; i/ili

LQYXDFPYT; i/ili

XXAMS; i/ili

TISXGGXXTYYPDSVKG; i/ili

LISXY, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.

[0122] Ovde opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati jednu ili više sledećih aminokiselinskih sekvenci

(K/Q/R)ASQ(D/G)I(N/S/R)(S/N)YL(T/N/A); i/ili (R/L/V/D/A)(T/V/A)(N/S)(R/N)L(F/M/V/E/Q)(D/T/S); i/ili (L/Q)Q(Y/H)(D/V/N)(D/T)(F/Y)P(Y/L/W)T; i/ili

(S/T)(S/H/Y)AMS; i/ili

(T/A)IS(V/S/G)(G/S)G(G/R)(K/S)TYY(P/A)DSVKG; i/ili

(L/D)(I/G)(S/G)(L/P/T/V)Y.

1

[0123] Ovde opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVDYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSG SGSGTSYSLTISRMGAEDAATYYCQQWNSSPLTFGAGTKLELK. Ovaj varijabilni region lakog lanca odgovara onome koji se nalazi u ilustrativnom antitelu DD-9 (Slika 25).

[0124] Dalje se predočava da antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQSSGKGLEWLAHIYWDDDKRYN PSLKSRITISKDSSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARSWTTAPFAFWGQGTLVTVSA. Ovaj varijabilni region teškog lanca odgovara onome koji se nalazi u ilustrativnom antitelu DD-9 (Slika 25).

[0125] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati:

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVDYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVR

FSGSGSGTSYSLTISRMGAEDAATYYCQQWNSSPLTFGAGTKLELK; i

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQSSGKGLEWLAHIYWDDDKR

YNPSLKSRITISKDSSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARSWTTAPFAFWGQGTLVTVSA.

[0126] Ovde opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSG SGSGTSYSLTISRMEAEDAATFYCQQWSSSPLTFGAGTKLELK. Ovaj varijabilni region lakog lanca odgovara onome koji se nalazi u ilustrativnom antitelu DH-2 (Slika 26).

[0127] Dalje se predočava da antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYN PSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARSGTTAPFAYWGQGTLVTVSA. Ovaj varijabilni region teškog lanca odgovara onome koji se nalazi u ilustrativnom antitelu DH-2 (Slika 26).

[0128] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati:

2

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVR

FSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATFYCQQWSSSPLTFGAGTKLELK; i

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKR

YNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARSGTTAPFAYWGQGTLVTVSA.

[0129] Predočava se da antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati:

i) najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara bilo kojoj od VK sekvenci navedenih na bilo kojoj od Slika 18 do 28; i/ili ii) najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara bilo kojoj od VH sekvenci navedenih na bilo kojoj od Slika 18 do 28 ili njen fragment, varijantu ili derivat.

[0130] Kao što je gore navedeno, predočava se da antitelo ili antigen-vezujući fragment iz prethodnog opisa može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75% identičnosti sa jednom ili više gore datih aminokiselinskih sekvenci, na primer, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sa jednom ili više gore specifikovanih aminokiselinskih sekvenci. Takođe se predočava da antitelo ili antigen-vezujući fragment može sadržati do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više insercija, delecija, konzervativnih supstitucija i/ili nekonzervativnih supstitucija.

[0131] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment moze da sadrži jednu ili više od sledećih aminokiselinskih sekvenci:

KASQDINSYLT; i/ili

XXNRLXD; i/ili

LQYXDFPYT; i/ili

XXAMS; i/ili

TISXGGXXTYYPDSVKG; i/ili

LISXY, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.

[0132] Realizacija antitela ili njegovog antigena-vezujućeg fragmenta sadrži jednu ili više od sledećih aminokiselinskih sekvenci:

(S/T)(S/H/Y)AMS; i/ili

(T/A)IS(V/S/G)(G/S)G(G/R)(K/S)TYY(P/A)DSVKG; i/ili

(L/D)(I/G)(S/G)(L/P/T/V)Y.

[0133] Realizacija antitela ili njegovog antigena-vezujućeg fragmenta sadrži jednu ili više od sledećih aminokiselinskih sekvenci:

KASQDINSYLT; i/ili

RTNRLFD; i/ili

LQYDDFPYT; i/ili

SSAMS; i/ili

TISVGGGKTYYPDSVKG; i/ili

LISLY.

[0134] Realizacija antitela ili njegovog antigena-vezujućeg fragmenta sadrži jednu ili više sledećih aminokiselinskih sekvenci

TCKASQDINSYLTWF; i/ili

TLIYRTNRLFDGVP ili TLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF; i/ili YCLQYDDFPYTFG; i/ili

YCAKLISLYWG, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.

[0135] Smatra se da sekvence koje prethode sadrže regione koji određuju komplementarnost lakih i teških varijabilnih regiona ilustrativnog antitela AB-1.

[0136] U daljoj realizaciji antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati aminokiselinsku sekvencu KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXRTNRLFDXXXXXXXXXXXXXXXFXXXXXXXXXX XXXXXXLQYDDFPYT; ili KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXF; ili RTNRLFDXXXXXXXXXXXXXXXF; ili

FXXXXXXXXXXXXXXXXLQYDDFPYT, pri čemu je X bilo koja aminokiselina.

[0137] U daljoj realizaciji antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati aminokiselinsku sekvencu TCKASQDINSYLTWF ili TCKASQDINSYLTWY; i/ili LLIYRTNRLFDGVP ili SLIYRTNRLFDGVP ili LLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF ili

4

SLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF; i/ili YCLQYDDFPYTFG; i/ili FTFSSSAMSWVR ili CXAXXFTFSSSAMSWVR;

[0138] U daljoj realizaciji antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži sledeće CDR-ove: KASQDINSYLT; i RTNRLFD; i LQYDDFPYT. U daljoj realizaciji antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može imati i najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži sledeće CDR-ove: SSAMS; i TISVGGGKTYYPDSVKG; i LISLY.

[0139] U sledećem primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema drugom aspektu može imati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMTQTPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFDGVPSRFS GSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK ili DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFDGVPSRFSG SGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK, ili EIVLTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFDGVPSRFSG SGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK (AB-1_VK), ili DIQMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPKTLIYRTNRLFDGVPSRFS GSGSGQDFFLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK (AB-1_VK1), ili EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWYQQKPGKAPKLLIYRTNRLFDGVPSRFSG SGSGTDFFFTISSLQPEDFGTYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK (hAB-1_RKE), ili DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKSLIYRTNRLFDGVPSRFS GSGSGTDFFLTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIK(hAB-1_RKJ).

[0140] Prema još jednom drugom primeru izvođenja drugog aspekta, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment može imati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVGGGKTYYP DSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTVSS ili EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVGGGKTYYP DSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTVSS, ili EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTLSSSAMSWVRQTPDRRLEWVATISVGGGKTYYP DSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCAKLISLYWGQGTTLTVSS (AB-1_VH), ili EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVSTISVGGGKTYYP DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISLYWGQGTLVTVSS (hAB-1_RHA).

[0141] Ovde je dalje prikazano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koje ima najmanje jedan varijabilni region lakog lanca prema drugom aspektu i najmanje jedan varijabilni region teškog lanca prema drugom aspektu.

[0142] Da bi se izbegla sumnja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku može sadržati bilo koju aminokiselinsku sekvencu realizovanu u vezi prvog aspekta. Shodno tome, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati bilo koji VK i/ili VK region koji je ilustrovan na bilo kojoj od Slika 18 do 28 ili Tabela 14 do 24 i 24A, ili bilo koju njihovu varijantu, fragment ili derivat.

[0143] Dalje, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment bilo kog aspekta ovog pronalaska može biti ili može sadržati bilo koje ovde opisano humanizovano ili himerično antitelo, a naročito antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati ili se sastojati od bilo koje od sekvenci navedenih u Tabelama 14 do 24 i 24A.

[0144] Predočava se da ovde opisano antitelo ili antigen-vezujući fragment može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75% identičnost sa jednom ili više gore datih aminokiselinskih sekvenci, na primer, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sa jednom ili više gore specifikovanih aminokiselinskih sekvenci. Takođe se predočava da antitelo ili antigen-vezujući fragment može sadržati do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više insercija, delecija, konzervativnih supstitucija i/ili nekonzervativnih supstitucija.

[0145] U poželjnom primeru izvođenja bilo kog aspekta pronalaska, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment može sadržati ili se sastojati od intaktnog antitela. Alternativno tome, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se u suštini sastojati od intaktnog antitela. Pod "u suštini se sastojati od" podrazumevamo da se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sastoji od dela intaktnog antitela koji je dovoljan za prikazivanje specifičnosti vezivanja za TG2.

[0146] Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema pronalasku može biti antitelo koje se ne pojavljuje u prirodi. Naravno, kada antitelo jeste antitelo koje se pojavljuje u prirodi, onda je predviđeno u izolovanom obliku (tj. različitu od onog koje se nalazi u prirodu).

[0147] U jednom primeru izvođenja bilo kog aspekta pronalaska, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment može sadržati ili se sastojati od antigen-vezujućeg fragmenta izabranog iz grupe koja se sastoji od: Fv fragmenta; Fab fragmenta; i Fab-sličnog fragmenta. U sledećem primeru izvođenja, Fv fragment može biti jednolančani Fv fragment ili disulfidno-vezani Fv fragment. Prema još jednom drugom primeru izvođenja, Fab-sličan fragment može biti Fab’ fragment ili F(ab)2fragment.

[0148] Varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) domeni antitela su uključeni u prepoznavanje antigena, što je činjenica koja je prvo prepoznata u eksperimentima rane proteazne digestije. Dalja potvrda je bila otkrivena "humanizacijom" glodarskih antitela. Varijabilni domeni glodarskog porekla mogu biti fuzionisani sa konstantnim domenima humanog porekla, tako da rezultujuće antitelo zadržava antigensku specifičnost glodarskog-roditeljskog antitela (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855).

[0149] Antigenska specifičnost se prenosi pomoću varijabilnih domena i nezavisna je od konstantnih domena, kao što je poznato iz eksperimenata koji su obuhvatali bakterijsku ekspresiju fragmenata antitela, od kojih su svi sadržali jedan ili više varijabilnih domena. Ovi molekuli obuhvataju Fab-slične molekule (Better et al (1988) Science 240, 1041); Fv molekule (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); jednolančane Fv (ScFv) molekule, gde su VHi VLpartnerski domeni povezani preko fleksibilnog oligopeptida (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) i jednodomenska antitela (dAbs) koja sadrže ili se sastoje od izolovanih V domena (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Opšti pregled tehnika koje su uključene u sintezu fragmenata antitela koja zadržavaju svoja specifična mesta vezivanja se mogu naći u Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

[0150] Shodno tome, pod "antigen-vezujućim fragmentom" podrazumevamo funkcionalni fragment antitela koji je sposoban za vezivanje za TG2.

[0151] Ilustrativni antigen-vezujući fragmenti mogu biti izabrani iz grupe koja se sastoji od Fv fragmenata (npr. jednolančani Fv i disulfidno vezani Fv), i Fab-sličnih fragmenata (npr. Fab fragmenti, Fab’ fragmenti i F(ab)2fragmenti).

[0152] U jednom primeru izvođenja pronalaska, antigen-vezujući fragment je scFv.

[0153] Prednosti upotrebe fragmenata antitela, umesto celih antitela, su višestruki. Manja veličina fragmenata može dovesti do poboljšanih farmakoloških svojstava, kao što je bolje prodiranje u čvrsto tkivo. Pored toga, antigen-vezujući fragmenti, kao što su Fab, Fv, ScFv i dAb fragmenti antitela mogu biti izraženi u E. coli i izlučeni iz nje, čime je omogućena laka proizvodnja velikih količina pomenutih fragmenata.

[0154] Takođe su obuhvaćene modifikovane verzije antitela i njihovih antigen-vezujućih fragmenata, npr. modifikovana kovalentnim vezivanjem polietilen glikola ili drugog podesnog polimera.

[0155] Posebno je poželjno da je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment rekombinantni molekul.

[0156] Metodi generisanja antitela i fragmenata antitela su dobro poznati u odgovarajućoj oblasti. Na primer, antitela se mogu generisati pomoću bilo koje od nekoliko metoda koje primenjuju indukciju in vivo produkcije molekula antitela, skrining imunoglobulinskih biblioteka (Orlandi. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299) ili generisanje molekula monoklonskih antitela pomoću ćelijskih linija u kulturi. Ove obuhvataju, ali nisu ograničene na tehniku hibridoma, tehniku hibridoma humanih B-ćelija i tehniku hibridoma Epštajn-Barovog virusa (EBV) (Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol.62:109-120).

[0157] Podesno je što je pronalaskom realizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu je antitelo rekombinantno antitelo (tj. pri čemu se ono proizvodi rekombinantnim putem).

[0158] U posebno poželjnom primeru izvođenja bilo kog aspekta pronalaska, antitelo može biti monoklonsko antitelo.

[0159] Podesna monoklonska antitela za izabrane antigene se mogu pripremiti poznatim tehnikama, na primer, onima koje su opisane u "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) i u "Monoclonal Hybridoma

Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982). Ilustrativna monoklonska antitela prema pronalasku i podesene metode za njihovu proizvodnju su date dole u Primerima.

[0160] Fragmenti antitela se takođe mogu dobiti korišćenjem metoda koji su dobro poznati u odgovarajućoj oblasti (vidi, na primer, Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Njujork). Na primer, fragmenti antitela prema predmetnom pronalasku se mogu pripremiti proteolitičkom hidrolizom antitela ili ekspresijom DNK koja kodira fragment u E. coli ili sisarskim ćelijama (npr. kulturi jajnih ćelija kineskog hrčka ili drugim sistemima za ekspresiju proteina). Alternativno tome, fragmenti antitela se mogu dobiti pepsinskom ili papainskom digestijom celih antitela uobičajenim metodama.

[0161] U jednom primeru izvođenja bilo kog aspekta pronalaska, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment može biti humano antitelo ili humanizovano antitelo.

[0162] Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti, a to je humana terapija ili dijagnostika, će shvatiti da se mogu koristiti humanizovana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su genetski modifikovana himerična antitela ili fragmenti antitela koji imaju minimalne-delove koji potiču od nehumanih antitela. Humanizovana antitela obuhvataju antitela u kojima su regioni za određivanje komplementarnosti humanog antitela (recipijentnog antitela) zamenjeni ostacima regiona za određivanje komplementarnosti nehumane vrste (donorskog antitela), kao što je mišje, pacovsko ili zečije koje ima željenu funkcionalnost. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvira humanog antitela su zamenjeni odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela takođe mogu sadržati ostatke koji se ne nalaze ni u recipijentnom antitelu, ni u uvedenim sekvencama regiona koji određuje komplementarnost ili okvira. Generalno, humanizovano antitelo će u suštini sadržati sve od najmanje jednog, a obično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili u suštini svi regioni koji određuju komplementarnost odgovaraju onima od nehumanog antitela i svi, ili u suštini svi, regioni okvira odgovaraju onima od odgovarajuće humane konsenzusne sekvence. Humanizovana antitela takođe optimalno sadrže bar deo konstantnog regiona antitela, kao što je Fc region, koji obično potiče od humanog antitela (vidi, na primer, Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596).

[0163] Metodi za humanizaciju nehumanih antitela su dobro poznati u odgovarajućoj oblasti. Generalno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji su uvedeni u njega iz izvora koji je nehuman. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci, koji se često nazivaju uvedenim ostacima, se obično uzimaju iz uvedenog varijabilnog domena. Humanizacija u suštini može biti izvedena kao što je opisano (vidi, na primer, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536I; US 4,816,567) supstitucijom humanih regiona koji određuju komplementarnost sa odgovarajućim glodarskim regionima koji određuju komplementarnost. Shodno tome, takva humanizovana antitela su himerična antitela, pri čemu je u suštini manji od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisan sa odgovarajućom sekvencom od nehumane vrste. U praksi, humanizovana antitela mogu biti tipična humana antitela u kojima su ostaci regiona koji određuju komplementarnost i opciono ostaci dela okvira supstituisani ostacima sa analognih mesta u glodarskim antitelima.

[0164] Humana antitela takođe mogu biti identifikovana korišćenjem različitih tehnika koje su poznate iz odgovarajuće oblasti, uključujući biblioteke za prikazivanje faga (vidi, na primer, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al., 1985, u: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str.77; Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147:86-95, Soderlind et al., 2000, Nat Biotechnol 18:852-6 i WO 98/32845).

[0165] Izraz "aminokiselina" kada se ovde koristi obuhvata standardnih dvadeset genetski kodiranih aminokiselina i njihove odgovarajuće stereoizomere u ’D’ obliku (u poređenju sa prirodnim ’L’ oblikom), omega-aminokiseline drugačije od prirodnih aminokiselina, nekonvencionalne aminokiseline (npr. α,α-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, itd.) i hemijski derivatizovane aminokiseline.

[0166] Kada je neka aminokiselina specifično označena, kao što je "alanin" ili "Ala" ili "A", onda se taj izraz odnosi i na L-alanin i D-alanin, osim ako eksplicitno nije navedeno drugačije. Druge nekonvencionalne aminokiseline takođe mogu biti podesne komponente za polipeptide prema predmetnom pronalasku, sve dok je željeno funkcionalno svojstvo zadržano od strane polipeptida. Za prikazane peptide, svaki označeni aminokiselinski ostatak, gde je primenljivo, predstavljen je jednoslovnom oznakom, koja odgovara trivijalnom imenu uobičajene aminokiseline.

[0167] U jednom primeru izvođenja, polipeptidi, koji su ovde definisani, sadrže ili se sastoje od L-aminokiselina.

[0168] Kada se jednom dobiju podesna antitela, ona mogu biti testirana u pogledu aktivnosti, kao što je specifičnost vezivanja ili biološka aktivnost antitela, na primer, pomoću ELISE, imunohistohemije, protočne citometrije, imunotaloženja, Vestern blotova, itd. Biološka aktivnost može biti testirana u različitim testovima sa očitavanjima za tu specifičnu karakteristiku.

[0169] Prema sledećem aspektu, predmetnim pronalaskom je realizovan polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku.

[0170] Ovde je opisan izolovani polinukleotid koji sadrži ili se sastoji od nukleotidnih sekvenci:

i)

GACATCCAGATGACACAGACTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCA

CTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAACCTGGTTCCAGCAGAAA

CCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTACAAATAGATTGTTTGATGGGGTCC

CATCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTTTTTTCTCACCATCAGCAGCCT

GGAATATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGACTTTCCGTACACGTT

CGGAGGGGGGACCAAACTGGAAATAAAA; i/ili

ii)

GAAGTACAGCTGGAGGAGTCAGGGGGGGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAA

ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTCTCAGTTCCTCTGCCATGTCTTGGGTTCGC

CAGACTCCGGACAGGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGTTGGTGGTGGTAAA

ACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGTCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGA

ACACCCTCTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTG

TGCAAAACTAATCAGTCTCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA.

[0171] Ovde je takođe opisan izolovani polinukleotid koji sadrži ili se sastoji od bilo koje od sekvenci nukleinske kiseline navedenih na bilo kojoj od Slika 18 do 28.

[0172] Shodno tome, ovde je opisan izolovani polinukleotid koji sadrži ili se sastoji od nukleotidnih sekvenci:

i)

GCCATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCA

TCATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATAAATAGTTATTTAACCTGGTTCCAACAGAAA

CCAGGAAAGTCTCCTAAGACCCTGATCTATCTTACAAATAGATTGATGGATGGGGTCC

CATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGAATTTTTACTCACCATCAGCGGCCT

GGAACATGAAGATATGGGCATTTATTATTGTCTCCAGTATGTTGACTTTCCGTACACGT

TCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA; i/ili ii)GCAGTGCAACTGGTAGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGA

AACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCATTTTCAGTTCCTCTGCCATGTCTTGGGTTCGC

CAGACTCCGGAAAAGAGACTGGAGTGGGTCGCAACTATTAGTAGTGGTGGTCGTTCC

ACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCGTCTCCAGAGACAGTGCCAAGA

ACACCCTATACCTGCAAATGGACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATTTATTACTG

TGCAAAACTAATCAGTCCCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA.

4

[0173] Dalje, ovde je opisan izolovani polinukleotid koji sadrži ili se sastoji od nukleotidnih sekvenci:

i)

GACATCACGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATATATGCATCTCTGGGAGAGAGAGTCA

CTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAACCTGGTTCCAGCAGAAA

CCAGGGAAATCTCCTAAGATCCTGATCTATCTTGTAAATAGATTGGTAGATGGGGTCCC

ATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATGCTCTCACCATCAGCAGTCTG

GAATATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAATATGATGACTTTCCGTACACGTTC

GGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA; i/ili

ii)

GAAGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA

CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTCTCAGTACCCATGCCATGTCTTGGGTTCGCC

AGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTCGTTCCA

CCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACTATCTCCAGAGACAATGTCAAGAA

CACCCTATATCTGCAACTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTTCTGT

GCAAGACTAATCAGTACCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA.

[0174] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku inhibira TG2 aktivnost. Antitelo prema pronalasku inhibira TG2 enzimsku aktivnost i, shodno tome, sprečava njegovo funkcionisanje u pogledu unakrsnog vezivanja lizinskih i glutaminskih ostataka sa Nε-(γ -glutamil)lizinom izopeptidnim vezama. Poželjno je da enzimska aktivnost TG2 bude potpuno ukinuta, ali se predočava da inhibicija može biti delimična inhibicija u slučajevima gde je ova delimična inhibicija dovoljna za obezbeđivanje korisnog terapeutskog ili neterapeutskog ishoda. Stručnjak bi bio u stanju da odredi da li je stepen inhibicije efektivan za ostvarivanje željenog ishoda.

[0175] Poželjno je da antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment bude specifičan za TG2 inhibiciju. Shodno tome, poželjno je da antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ne inhibira TG1, TG3, TG13 i/ili TG7 aktivnost. Predočava se da antitelo koje efektivno inhibira TG2 aktivnost, ali je dovoljno selektivno tako da ne inhibira značajno TG1, TG3, TG13 i/ili TG7 aktivnost, može biti posebno korisno u medicini. Shodno tome, poželjno je da antitelo isključivo inhibira TG2 aktivnost.

[0176] Takođe je ovde opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment čije vezivanje za TG2 (na primer, humani TG2) je inhibirano ili smanjeno kada se antitelo prema bilo kom prethodnom aspektu veže za TG2 (na primer, humani TG2).

[0177] Shodno tome, ovde je opisano bilo koje antitelo koje se selektivno vezuje za epitop unutar regiona TG2 tako da može da se nadmeće i da prekine vezivanje bilo kog antitela prema prethodnim aspektima.

[0178] Prema sledećem aspektu, predmetnim pronalaskom je realizovano jedinjenje koje sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema predmetnom pronalasku i neku drugu grupu.

[0179] Neka druga grupa može biti direktno ili indirektno citotoksična grupa.

[0180] Pod "direktno citotoksičnom" podrazumevamo značenje da je to grupa koja je kao takva citotoksična. Pod "indirektno citotoksična" podrazumevamo značenje da je to grupa koja, mada sama nije citotoksična, može indukovati citotoksičnost, na primer, svojim dejstvom na druge molekule ili svojim daljim dejstvom.

[0181] Citotoksična grupa može biti izabrana iz, ali nije ograničena na grupu koja sadrži direktno citotoksični hemoterapeutski agens, direktno citotoksični polipeptid, grupu koja je u stanju da pretvori relativno netoksični prolek u citotoksični lek, radiosenzitizer, direktno citotoksičnu nukleinsku kiselinu, molekul nukleinske kiseline koji kodira direktno ili indirektno citotoksični polipeptid, molekul nukleinske kiseline koji kodira terapeutski polipeptid, ili radioaktivni atom. Predočava se da radioaktivni atom može biti bilo koji od fosfora-32, joda-125, joda-131, indijuma-111, renijuma-186, renijuma-188 ili itrijuma-90.

[0182] Citotoksični hemoterapeutski agensi, kao što su antikancerski agensi, obuhvataju: alkilujuće agense koji obuhvataju azotne mustarde, kao što su mehloretamin (HN2), ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan (L-sarkolizin) i hlorambucil;

etilenimine i metilmelamine, kao što su heksametilmelamin, tiotepa; alkil sulfonate, kao što je busulfan; nitrozouree, kao što su karmustin (BCNU), lomustin (CCNU), semustin (metil-CCNU) i streptozocin (streptozotocin); i triazene, kao što je dekarbazin (DTIC; dimetiltriazenoimidazolkarboksamid); antimetabolite uključujući analoge folne kiseline, kao što su metotreksat (ametopterin); pirimidinske analoge, kao što su fluorouracil (5-fluorouracil; 5-FU), floksuridin (fluorodeoksiuridin; FUdR) i citarabin (citozin arabinozid); i purinske analoge i srodne inhibitore, kao što su merkaptopurin (6-merkaptopurin; 6-MP), tiogvanin (6-tiogvanin; TG) i pentostatin (2’-deoksikoformicin). Prirodni proizvodi, uključujući vinka alkaloide, kao što su vinblastin (VLB) i vinkristin; epipodofilotoksini, kao što su etopozid i tenipozid; antibiotici, kao što su daktinomicin (aktinomicin D), daunorubicin (daunomicin; rubidomicin), doksorubicin, bleomicin, plicamicin (mitramicin) i mitomicin (mitomicin C); enzimi, kao što je L-asparaginaza; i modifikatori bioloških reakcija, kao što su interferon alfenomi. Različiti agensi uključujući koordinatne komplekse platine, kao što su cisplatin (cis-DDP) i karboplatin; antracendion, kao što su mitoksantron i antraciklin; supstituisana urea, kao što je hidroksiurea; metil hidrazinske derivate, kao što je prokarbazin (N-metilhidrazin, MIH); i adrenokortikalni supresivi, kao što su mitotan (o,p’-DDD) i aminoglutetimid; taksol i analoge/derivate; i hormonske agoniste/ antagoniste, kao što su flutamid i tamoksifen.

[0183] Različiti od ovih agenasa su prethodno bili vezani za antitela i druge agense za isporuku na ciljno mesto, a takva jedinjenja prema pronalasku koja sadrže ove agense može lako napraviti stručnjak iz odgovarajuće oblasti. Na primer, konjugacija karbodiimida (Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159) se može primeniti za konjugaciju različitih agenasa, uključujući doksorubicin, sa antitelima.

[0184] Citotoksične peptidne ili polipeptidne grupe obuhvataju bilo koju grupu koja dovodi do smrti ćelija. Citotoksične peptidne i polipeptidne grupe su dobro poznate u odgovarajućoj oblasti i obuhvataju, na primer, ricin, abrin, Pseudomonas egzotoksin, tkivni faktor i slično. Metode za njihovo vezivanje za ciljne grupe, kao što su antitela takođe su poznate iz odgovarajuće oblasti. Upotreba ricina kao citotoksičnog agensa je opisana u Burrows & Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8996-9000, a primena tkivnog faktora, koja dovodi do lokalizovanog zgrušavanja krvi i infarkta tumora, bila je opisana od strane Ran et al (1998) Cancer Res. 58, 4646-4653 i Huang et al (1997) Science 275, 547-550. Tsai et al (1995) Dis. Colon Rectum 38, 1067-1074 opisuje abrin A lanac konjugovan sa monoklonskim antitelom. Drugi proteini koji inaktiviraju ribozome su opisani kao citotoksični agensi u WO 96/06641. Pseudomonas egzotoksin se takođe može upotrebiti kao citotoksična polipeptidna grupa (vidi, na primer, Aiello et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10457-10461).

[0185] Izvesni citokini, kao što su TNFα i IL-2, takođe mogu biti korisni kao citotoksični agensi.

[0186] Izvesni radioaktivni atomi takođe mogu biti citotoksični ako se isporuče u dovoljnim dozama. Shodno tome, citotoksična grupa može sadržati radioaktivni atom koji, pri upotrebi, isporučuje dovoljnu količinu radioaktivnosti na ciljno mesto tako da bude citotoksična. Podesni radioaktivni atomi obuhvataju fosfor-32, jod-125, jod-131, indijum-111, renijum-186, renijum-188 ili itrijum-90, ili bilo koji drugi izotop koji emituje dovoljno energije da uništi susedne ćelije, organele ili nukleinsku kiselinu. Prvenstveno, izotopi i gustina radioaktivnih atoma u jedinjenju prema pronalasku su takvi da se doza veća od 4000 cGy (prvenstveno najmanje 6000, 8000 ili 10000 cGy) isporučuje na ciljno mesto, a prvenstveno ćelijama na ciljnom mestu i njihovim organelama, a naročito nukleusu. Radioaktivni atom može biti vezan za antitelo na poznate načine. Na primer, EDTA ili drugi helatirajući agens mogu biti vezani za antitelo i upotrebljeni za vezivanje<111>In ili<90>Y. Tirozinski ostaci mogu biti obeleženi sa<125>I ili<131>I.

[0187] Citotoksična grupa može biti podesna za indirektno citotoksični polipeptid. U posebno poželjnom primeru izvođenja, indirektno citotoksični polipeptide je polipeptid koji ima enzimsku aktivnost i koji može da pretvori relativno netoksični prolek u citotoksični lek. Kada je ciljna grupa antitelo, onda se ovaj tip sistema često naziva ADEPT (na antitelo-usmerena enzimska terapija prolekom). Ovaj sistem zahteva da ciljna grupa locira enzimski deo na željeno mesto u telu pacijenta (tj. mestu koje izražava MR, kao što je novo vaskularno tkivo koje je povezano sa tumorom) i posle vremena omogućavanja da se enzim lokalizuje na mestu, davanje proleka koji je supstrat za enzim, pri čemu je krajnji proizvod katalize citotoksično jedinjenje. Cilj ovog

4

pristupa je da se maksimizira koncentracija leka na željenom mestu i da se minimizira koncentracija leka u normalnim tkivima (vidi Senter, P.D. et al (1988) "Anti-tumor effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phosphate" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842-4846; Bagshawe (1987) Br. J. Cancer 56, 531-2; i Bagshawe, K.D. et al (1988) "A cytotoxic agent can be generated selectively at cancer sites" Br. J. Cancer.

58, 700-703.)

[0188] Citotoksična supstanca može biti bilo koji postojeći anti-kancerski lek, kao što je alkilujući agens; agens koji se umeće u DNK; agens koji inhibira bilo koje ključne enzime, kao što su dihidrofolat reduktaza, timidin sintetaza, ribonukleotidna reduktaza, nukleozidne kinaze ili topoizomeraze; ili agens koji utiče na smrt ćelija sadejstvom sa bilo kojim drugim ćelijskim konstituentom. Etopozid je primer inhibitora topoizomeraze.

[0189] Navedeni sistemi prolekova obuhvataju: fenol mustard prolek aktiviran pomoću E. coli βglukuronidaze (Wang et al, 1992 i Roffler et al, 1991); doksorubicinski prolek aktiviran pomoću humane β-glukuronidaze (Bosslet et al, 1994); druge doksorubicinske prolekove aktivirane pomoću α-galaktozidaze iz zrna kafe (Azoulay et al, 1995); daunorubicinske prolekove, aktivirane pomoću α-D-galaktozidaze iz zrna kafe (Gesson et al, 1994); 5-fluorouridinski prolek aktiviran pomoću E. coli β-D-galaktozidaze (Abraham et al, 1994); i metotreksatne prolekove (npr. metotreksat-alanin) aktivirane pomoću karboksipeptidaze A (Kuefner et al, 1990, Vitols et al, 1992 i Vitols et al, 1995). Ovi i drugi su uključeni u Tabelu 1.

Tabela 1

[0190] (Ova tabela je adaptirana iz Bagshawe (1995) Drug Dev. Res. 34, 220-230, iz koga se mogu dobiti potpune reference za ove različite sisteme; derivat taksola je opisan u Rodrigues, M.L. et al (1995) Chemistry & Biology 2, 223).

[0191] Podesni enzimi za formiranje dela enzimskog dela prema pronalasku obuhvataju: egzopeptidaze, kao što su karboksipeptidaze G, G1 i G2 (za glutamilovane mustard prolekove), karboksipeptidaze A i B (za prolekove na bazi MTX) i aminopeptidaze (za 2-α-aminocil MTC prolekove); endopeptidaze, kao što je npr. trombolizin (za trombinske prolekove); hidrolaze, kao što su fosfataze (npr. alkalne fosfataze) ili sulfataze (npr aril sulfataze) (za fosfilovane ili sulfatirane prolekove); amidaze, kao što su penicilin amidaze i arilacil amidaze; laktamaze, kao što su β-laktamaze; glikozidaze, kao što su β-glukuronidaza (za β-glukuronomid antracikline), α-galaktozidaza (za amigdalin) i β-galaktozidaza (za β-galaktoza antraciklin); deaminaze, kao što je citozin deaminaza (za 5FC); kinaze, kao što su urokinaza i timidin kinaza (za ganciklovir); reduktaze, kao što su nitroreduktaza (za CB1954 i analoge), azoreduktaza (za azobenzen mustarde) i DT-dijaforaza (za CB1954); oksidaze, kao što su glukoza oksidaza (za glukozu), ksantin oksidaza (za ksantin) i laktoperoksidaza; DL-racemaze, katalitička antitela i ciklodekstrine.

[0192] Prolek je relativno netoksičan u poređenju sa citotoksičnim lekom. Obično, on ima manje od 10% toksičnosti, a prvenstveno manje od 1% toksičnosti, mereno podesnim in vitro testom citotoksičnosti. Verovatno je da će grupa koja može da pretvori prolek u citotoksični lek biti aktivna u izolaciji od ostatka jedinjenja, ali je neophodno da ona bude aktivna samo kada (a) je u kombinaciji sa ostatkom jedinjenja i (b) jedinjenje je vezano, u susedstvu je ili se nalazi unutar ciljnih ćelija.

[0193] Kada je svaka grupa jedinjenja polipeptid, onda dva dela mogu biti međusobno povezana na bilo koji od uobičajenih načina za unakrsno vezivanje polipeptida, kao što su oni koji su generalno opisani u O’Sullivan et al (1979) Anal. Biochem. 100, 100-108. Alternativno tome, jedinjenje može biti proizvedeno kao fuziono jedinjenje rekombinantnim DNK tehnikama, tako da deo DNK sadrži odgovarajuće regione koji kodiraju dve grupe jedinjenja prema pronalasku, bilo međusobno susedne ili razdvojene regionom koji kodira linker peptid, a koji ne poništava željena svojstva jedinjenja. Shvatljivo je da dva dela jedinjenja mogu da se preklapaju u potpunosti ili delimično.

[0194] Citotoksična grupa može biti radiosensitizer. Radiosensitizeri obuhvataju fluoropirimidine, analoge timidina, hidroksiureu, gemcitabin, fludarabin, nikotinamid, halogenovane pirimidine, 3-aminobenzamid, 3-aminobenzodiamid, etaniksadol, pimonidazol i

4

mizonidazol (vidi, na primer, McGinn et al (1996) J. Natl. Cancer Inst. 88, 1193-11203; Shewach & Lawrence (1996) Invest. New Drugs 14, 257-263; Horsman (1995) Acta Oncol.34, 571-587; Shenoy & Singh (1992) Clin. Invest. 10, 533-551; Mitchell et al (1989) Int. J. Radiat. Biol. 56, 827-836; Iliakis & Kurtzman (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 1235-1241; Brown (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 987-993; Brown (1985) Cancer 55, 2222-2228).

[0195] Takođe, isporuka gena u ćelije ih može radiosenzitizovati, na primer, isporuka p53 gena ili ciklina D (Lang et al (1998) J. Neurosurg.89, 125-132; Coco Martin et al (1999) Cancer Res.

59, 1134-1140).

[0196] Sledeća grupa može biti ona koja postaje citotoksična, ili oslobađa citotoksičnu grupu, posle zračenja. Na primer, bor-10 izotop, kada se adekvatno ozrači, oslobađa α čestice koje su citotoksične (vidi, na primer, US 4,348,376 nosioca Goldenberg; Primus et a/ (1996) Bioconjug. Chem.7, 532-535).

[0197] Slično tome, citotoksična grupa može biti ona koja je korisna u fotodinamičnoj terapiji, kao što je fotofrin (vidi, na primer, Dougherty et al (1998) J. Natl. Cancer Inst.90, 889-905).

[0198] Citotoksična grupa može biti molekul nukleinske kiseline koji je direktno ili indirektno citotoksičan. Na primer, molekul nukleinske kiseline može biti antisensni oligonukleotid koji, posle lokalizacije na ciljnom mestu može da uđe u ćelije i da dovede do njihove smrti. Oligonukleotid, stoga, može biti onaj koji sprečava ekspresiju esencijalnog gena, ili onaj koji dovodi do promene u ekspresiji gena koja izaziva apoptozu.

[0199] Primeri podesnih oligonukleotida obuhvataju one koji su usmereni na bcl-2 (Ziegler et al (1997) J. Natl. Cancer Inst. 89, 1027-1036), i DNK polimerazu α i topoizomerazu IIα (Lee et al (1996) Anticancer Res.16, 1805-1811.

[0200] Peptidne nukleinske kiseline mogu biti korisne umesto uobičajenih nukleinskih kiselina (vidi Knudsen & Nielsen (1997) Anticancer Drugs 8, 113-118).

[0201] U jednom primeru izvođenja jedinjenja prema pronalasku, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment i citotoksična grupa mogu biti polipeptidi koji su fuzionisani. Shodno tome, ovde je opisan polinukleotid koji kodira takvo jedinjenje.

[0202] U sledećem primeru izvođenja, sledeća grupa može biti lako detektabilna grupa. Predočava se da lako detektabilna grupa može sadržati podesnu količinu bilo kog od joda-123, joda-131, indijuma-111, fluora-19, ugljenika-13, azota-15, kiseonika-17, tehnecijuma-99m, gadolinijuma, mangana ili gvožđa.

[0203] Pod "lako detektabilnom grupom" podrazumevamo značenje da je grupa ona koja, kada je locirana na ciljnom mestu posle administracije jedinjenja prema pronalasku u pacijentu, može biti detektovana, obično neinvazivno, izvan tela i da može biti locirano mesto cilja. Shodno tome, jedinjenja prema ovom primeru izvođenja pronalaska su korisna za snimanje i dijagnozu.

4

[0204] Obično, lako detektabilna grupa jeste ili sadrži radioaktivni atom koji je koristan za snimanje. Podesni radioaktivni atomi obuhvataju tehnecijum-99m ili jod-123 za scintigrafijske studije. Druge lako detektabilne grupe obuhvataju, na primer, spin markere za snimanje magnetnom rezonancom (MRI) kao što su jod-123 ponovo, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe. Jasno je da jedinjenje prema pronalasku mora imati dovoljno podesnih atomskih izotopa da bi se molekul mogao lako detektovati.

[0205] Radio- ili drugi markeri mogu biti inkorporirani u jedinjenje prema pronalasku na poznate načine. Na primer, ako je antitelo polipeptid, onda može biti biosintetizovano ili može biti sintetizovano hemijskom sintezom aminokiselina uz korišćenje podesnih aminokiselinskih prekursora, uključujući, na primer, fluor-19 umesto vodonika. Markeri kao što su<99m>Tc,<123>I,<186>Rh,<188>Rh i<111>In mogu biti vezani, na primer, preko cisteinskih ostataka u antitelu. Itrijum-90 može biti vezan preko lizinskog ostatka. IODOGEN metod (Fraker er al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57) se može primeniti za inkorporiranje joda-123. Referenca ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989) detaljno opisuje druge metode.

[0206] Ovde je opisan vektor koji sadrži bilo koji polinukleotid prema pronalasku.

[0207] Tipični prokariotski vektorski plazmidi su: pUC18, pUC19, pBR322 i pBR329 koji se mogu nabaviti od Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 i pRIT5 koji se mogu nabaviti od Pharmacia (Piscataway, NJ, USA); pBS vektori, Phagescript vektori, Bluescript vektori, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A koji se mogu nabaviti od Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, USA).

[0208] Tipični vektorski plazmid od sisarske ćelije je pSVL koji se može nabaviti od Pharmacia (Piscataway, NJ, USA). Primer induktibilnog sisarskog ekspresionog vektora je pMSG, koji se takođe može nabaviti od Pharmacia (Piscataway, NJ, USA).

[0209] Korisni kvaščevi plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 i generalno se mogu nabaviti od Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, USA). Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su Kvaščevi integrišući plazmidi (YIps) i u njih su inkorporirani kvaščevi selektabilni markeri HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su Kvaščevi centromerni plazmidi (YCps).

[0210] Metode koje su dobro poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti se mogu koristiti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu i, na primer, podesne transkripcione ili translacione kontrole.

[0211] Dalje, ovde je opisana ćelija domaćin koja sadrži bilo koji ovde opisan polinukleotid ili vektor.

[0212] Poznati su mnogi ekspresioni sistemi, uključujući sisteme koji koriste: bakterije (npr. E. coli i Bacillus subtilis) transformisane, na primer, sa rekombinantnim bakteriofagnim,

4

plazmidnim ili kozmidnim DNK ekspresionim vektorima; kvasce (npr. Saccharomyces cerevisiae) transformisane, na primer, sa kvaščevim ekspresionim vektorima; insektne ćelijske sisteme transformisane, na primer, sa virusnim ekspresionim vektorima (npr. bakulovirusom); biljni ćelijski sistemi transfektovani, na primer, sa virusnim ili bakterijskim ekspresionim vektorima; životinjski ćelijski sistemi transfektovani, na primer, sa adenovirusnim ekspresionim vektorima.

[0213] Vektori mogu sadržati prokariotski replikon, kao što je Col E1 ori, za propagaciju u prokarioti, čak i ako taj vektor treba da bude upotrebljen za ekspresiju u drugom, neprokaritskom tipu ćelija. Vektori takođe mogu sadržati podesni promoter, kao što je prokariotski promoter koji može da usmerava ekspresiju (transkripciju i translaciju) gena u bakterijskoj ćeliji domaćinu, kao što je E. coli, koja se njime transformiše.

[0214] Promoter je kontrolni element ekspresije koji formira DNK sekvencu koja dozvoljava da dođe do vezivanja RNK polimeraze i transkripcije. Promoterske sekvence koje su kompatibilne sa ilustrativnim bakterijskim domaćinima su obično predviđene u plazmidnim vektorima koji sadrže podesna restrikciona mesta za inserciju ovde opisanog DNK segmenta.

[0215] Polinukleotid u podesnoj ćeliji domaćinu može biti izražen da bi se proizvelo antitelo ili jedinjenje prema pronalasku. Shodno tome, polinukleotid se može koristiti u skladu sa poznatim tehnikama, podesno modifikovan sa stanovišta ovde sadržanih otkrivanja, da bi se konstruisao ekspresioni vektor, koji se onda upotrebljava za transformaciju podesne ćelije domaćina radi ekspresije i proizvodnje antitela ili jedinjenja prema pronalasku. Takve tehnike obuhvataju one koje su opisane u US patentima br. 4,440,859; 4,530,901; 4,582,800; 4,677,063; 4,678,751; 4,704,362; 4,710,463; 4,757,006; 4,766,075; i 4,810,648.

[0216] Polinukleotid može biti pridružen širokom spektru drugih DNK sekvenci radi uvođenja u podesnog domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i da li je poželjno epizomalno održavanje ili integracija.

[0217] Generalno, polinukleotid se umeće u ekspresioni vektor, kao što je plazmid, pravilno orijentisan i sa adekvatnim okvirom za čitanje radi ekspresije. Ako je potrebno, DNK može biti vezana za podesne transkripcione i translacione regulatorne kontrolne nukleotidne sekvence koje prepoznaje željeni domaćin, mada su takve kontrole generalno raspoložive u ekspresionom vektoru. Shodno tome, DNK insert može biti operativno povezan sa podesnim promoterom. Bakterijski promoteri obuhvataju E. coli lacl i lacZ promotere, T3 i T7 promotere, gpt promoter, fagne λ PR i PL promotere, phoA promoter i trp promoter. Eukariotski promoteri obuhvataju CMV imedijerni rani promoter, HSV timidin kinazni promoter, rani i kasni SV40 promoter i promotere retrovirusnih LTRs. Drugi podesni promoteri će biti poznati stručnjaku iz odgovarajuće oblasti. Ekspresioni konstrukti će takođe prvenstveno sadržati mesta za inicijaciju i terminaciju transkripcije, i u transkribovanom regionu, mesto za vezivanje ribozoma radi

4

translacije. (Hastings et al, međunarodna prijava patenta br. WO 98/16643, objavljena 23. aprila 1998.).

[0218] Onda se vektor uvodi u domaćina pomoću standardnih tehnika. Generalno, neće svi domaćini biti transformisani vektorom i zato će biti neophodno da se selekcionišu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje u ekspresioni vektor DNK sekvence-markera, sa proizvoljnim nephodnim kontrolnim elementima, koji kodiraju selektabilno svojstvo u transformisanoj ćeliji. Ovi markeri obuhvataju dihidrofolatnu reduktazu, G418 ili neomicinsku rezistenciju za eukariotske ćelijske kulture, i gene tetraciklinske, kanamicinske ili ampicilinske rezistencije za kultivaciju u E. coli i drugim bakterijama. Alternativno tome, gen za takvo selektabilno svojstvo može biti na drugom vektoru, koji se upotrebljava za ko-transformaciju željene ćelije domaćina.

[0219] Ćelije domaćini koje su transformisane rekombinantnom DNK se onda kultivišu tokom dovoljno dugog vremena i pod podesnim uslovima koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti sa stanovišta ovde opisanih otkrivanja da bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji se onda može rekuperisati.

[0220] Antitelo ili jedinjenje se mogu rekuperisati i prečistiti iz kultura rekombinantnih ćelija dobro poznatim metodama uključujući amonijum sulfatno ili etanolsko taloženje, kiselu ekstrakciju, anjonsko ili katjonsko izmenjivačku hromatografiju, fosfoceluloznu hromatografiju, hidrofobnu interaktivnu hromatografiju, afinitetnu hromatografiju, hidroksilapatitnu hromatografiju i lektinsku hromatografiju. Najpoželjnije je da se za prečišćavanje koristi tečna hromatografija visokih performansi ("HPLC").

[0221] Dalje, ovde je opisana stabilna ćelijska linija domaćin koja proizvodi antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom prethodnom aspektu ili jedinjenje prema pronalasku koje nastaje inkorporiranjem u ćelijsku liniju ovde opisanog egzogenog polinukleotida ili vektora.

[0222] Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije su poželjne prokariotske ćelije domaćini i obično su soj od Escherichia coli kao što su, na primer, E. coli sojevi DH5 koji se mogu nabaviti od Bethesda Research Laboratories Inc., Betezda, MD, USA, i RR1 koje se mogu nabaviti od American Tip Culture Collection (ATCC) iz Rokvila, MD, USA (No ATCC 31343). Poželjne eukariotske ćelije domaćini obuhvataju kvaščeve i sisarske ćelije, a prvenstveno ćelije kičmenjaka, kao što su one od mišje, pacovske, majmunske ili humane fibroblastične ćelijske linije. Kvaščeve ćelije domaćini obuhvataju YPH499, YPH500 i YPH501 koje se generalno mogu nabaviti od Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Poželjne sisarske ćelije domaćini obuhvataju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO) koje se mogu nabaviti od ATCC kao CCL61, NIH mišje embrionske ćelije švajcarskog tipa NIH/3T3 koje se mogu nabaviti od ATCC kao CRL 1658, i COS-1 ćelije koje potiču od majmunskih bubrega, a koje se mogu nabaviti od ATCC kao CRL 1650.

4

[0223] Pored samih transformisanih ćelija domaćina, predmetno otkrivanje takođe obuhvata kultivaciju tih ćelija, a prvenstveno monoklonsku (klonski homogenu) kulturu, ili kulturu koja potiče od monoklonske kulture, u hranljivom medijumu.

[0224] Prema sledećem aspektu, predmetnim pronalaskom je realizovana farmaceutska kompozicija/formulacija koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom aspektu pronalaska, ili polinukleotid prema pronalasku, ili jedinjenje prema pronalasku, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, adjuvansom, razređivačem ili nosačem.

[0225] Pod "farmaceutski prihvatljivim" se smatra da je formulacija sterilna i bez pirogena. Podesni farmaceutski nosači su dobro poznati u oblasti farmacije. Nosač, odnosno nosači moraju biti "prihvatljivi" u smislu da su kompatibilni sa jedinjenjem prema pronalasku i da nisu škodljivi za njegove primaoce. Tipično, nosači će biti voda ili slani rastvor koji će biti sterilni i bez pirogena; međutim, mogu se primeniti i drugi prihvatljivi nosači.

[0226] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija/formulacija prema pronalasku može dalje sadržati drugi aktivni sastojak, tj. terapeutski aktivni agens drugačiji od antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema pronalasku. Predočava se da jedan ili više dodatnih aktivnih agenasa mogu povećati efikasnost farmaceutske kompozicije/formulacije protiv ciljne bolesti, ako je podesno. U jednom primeru izvođenja, dodatni aktivni sastojak može biti terapeutski agens izabran između agenasa uključenih u smanjenje stvaranja ožiljaka na tkivu, smanjenje neurofibrilarnih klubadi, i/ili smanjenje rezistencije na hemoterapiju.

[0227] U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija/formulacija može biti formulisana za intravensko, intramuskularno, ili subkutano davanje pacijentu.

[0228] Poželjno je da farmaceutska kompozicija/formulacija sadrži količinu antitela ili antigenvezujućeg fragmenta prema pronalasku koja je efektivna za lečenje različitih stanja koja su opisana gore i dalje u nastavku.

[0229] Sledećim aspektom pronalaska je realizovan kit od delova koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom aspektu pronalaska, ili polinukleotid prema pronalasku, ili jedinjenje prema pronalasku; i jedan ili više drugih agenasa. Predočava se da drugi agensi mogu biti bilo koji drugi aktivni sastojci koji su opisani gore ili bilo koji drugi podesni agens.

I daljem aspektu, prnalazak obezbedjuje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom aspektu pronalaska, ili polinukleotida prema pronalasku, ili jedinjenja, farmaceutske kompozicije/formulacije, za primenu u medicini.

[0230] TG2 je jasno multifunkcionalni enzim i on je povezan sa nizom ćelijskih funkcija uključujući nuklearnu stabilizaciju i transport [28, 29], endocitozu [30, 31], GTPaznu signalizaciju [32-34], apoptozu [35, 36], ćelijsku adheziju [37-39], citoskeletni integritet [28, 29] i ECM stabilizaciju [9]. Mali molekulski inhibitori mogu remetiti sve ove funkcije, pošto oni generalno imaju slobodan pristup i ekstracelularnom prostoru i unutrašnjosti ćelije. Antitelo ne može da uđe u ćeliju i kao takve intracelularne uloge TG2 ne bi bile pod uticajem TG2 specifičnog antitela koje se daje in vivo.

[0231] Izgleda da je najvažnije što su patološke uloge TG2 ekstracelularne, kao što je njegova uloga u stvaranju ožiljaka na tkivu i fibrozi, celijačnoj bolesti i kanceru. Shodno tome, korišćenje antitela koje selektivno vezuje TG2 u medicini bi doprinelo dodatnom stepenu selektivnosti koja sprečava nepoželjne intracelularne efekte koji bi se preneli u neželjena dejstva terapije.

[0232] Zbog toga bi antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku imali kliničke prednosti u odnosu na prethodno raspoložive lekove, na primer, za blokiranje TG2 kod fibrotičnih i ožiljnih bolesti gde TG2 unakrsno vezuje ECM proteine, kod celijačne bolesti, gde se gliadin deamiduje u ekstracelularnom prostoru i kod hemo-rezistencije kod kancera, gde izgleda da je ćelijska adhezija zaštitni faktor. Dalje, mali fragmenti antitela prema pronalasku, na primer, Fab fragmenti bi mogli da prođu kroz barijeru krv mozak i da inhibiraju TG2 u mozgu i da potencijalno obezbede efektivne terapije za neurološke patologije u koje je uključen TG2.

[0233] Shodno tome, ovde je dalje opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom aspektu pronalaska, ili polinukleotid prema pronalasku, ili jedinjenje, farmaceutska kompozicija/formulacija, ili kit od delova prema pronalasku, za primenu u smanjenju ili inhibiciji TG2 enzimske aktivnosti kod pojedinca kome je to potrebno.

[0234] Dalje, ovde je opisana primena antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom aspektu pronalaska, ili polinukleotida prema pronalasku, ili jedinjenja, farmaceutske kompozicije/formulacije, ili kita od delova prema pronalasku, u proizvodnji leka za smanjenje ili inhibiciju TG2 enzimske aktivnosti kod pojedinca kome je to potrebno.

[0235] Takođe ovde je opisan metod za smanjenje ili inhibiciju TG2 enzimske aktivnosti kod pojedinca kome je to potrebno, pri čemu taj metod sadrži korak administracije antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, ili njegove varijante, fuzije ili derivata prema bilo kom aspektu pronalaska, ili polinukleotida prema pronalasku, ili jedinjenja, farmaceutske kompozicije/formulacije, ili kita od delova prema pronalasku, pojedincu.

[0236] Dalji aspekt ovog pronalaska obzbedjuje antitela ili njihova antigen-vezujuće fragmente prema bilo kom aspektu pronalaska, ili polinukleotida prema pronalasku, ili jedinjenja, farmaceutska kompozicija/formulacija, za primenu u lečenju i/ili dijagnozi celijačne bolesti, abnormalnog zarastanja rana, stvaranja ožiljaka, hipertrofičnih ožiljaka, okularnog stvaranja ožiljaka, zapaljenske bolesti creva, makularne degeneracije, psorijaze, bolesti povezanih sa fibrozom (npr. fibroza jetre, plućna fibroza, kao što su intersticijalna bolest pluća i fibrotična bolest pluća, kardijalna fibroza, kožna fibroza, mijelofibroza, fibroza bubrega, kao što su glomeruloskleroza i tubulointersticijalna fibroza), ateroskleroze, restenoze, zapaljenskih bolesti, autoimunih bolesti, neurodegenerativnih/neuroloških bolesti (kao što su npr. Hantingtonova bolest, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, poliglutaminska bolest, spinobulbarna mišićna atrofija, dentatorubro-palido-lujzijanska atrofija, spinocerebralne ataksije 1, 2, 3, 6, 7 i

1

12, rubro-palido atrofija, spinocerebralna paraliza), glioblastoma, kao što su glioblastom u Li-Fraumeni sindromu i sporadični glioblastom, maligni melanomi, pankreasni duktalni adenokarcinomi, mijeloidna leukemija, akutna mijelogena leukemija, mijelodisplastični sindrom, mijeloproliferativni sindrom, ginekološki kancer, Kapošijev sarkom, Hansenova bolest, i/ili kolageni kolitis.

[0237] Takođe ovde je opisana primena terapeutski efektivne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom aspektu pronalaska, ili polinukleotida prema pronalasku, ili jedinjenja, farmaceutske kompozicije/formulacije, ili kita od delova prema pronalasku, u proizvodnji leka za lečenje i/ili dijagnozu celijačne bolesti, abnormalnog zarastanja rana, stvaranja ožiljaka, skleroderme, keloida i hipertrofičnih ožiljaka, okularnog stvaranja ožiljaka, zapaljenske bolesti creva, makularne degeneracije, Grejvsove oftalmopatije, ergotizma indukovanog lekovima, psorijaze, bolesti povezanih sa fibrozom (npr. fibroza jetre, plućna fibroza, kao što su intersticijalna bolest pluća i fibrotična bolest pluća, kardijalna fibroza, mijelofibroza, fibroza bubrega, kao što su glomeruloskleroza i tubulointersticijalna fibroza), ateroskleroze, restenoze, zapaljenskih bolesti, autoimunih bolesti, neurodegenerativnih/neuroloških bolesti (kao što su npr. Hantingtonova bolest, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, poliglutaminska bolest, spinobulbarna mišićna atrofija, dentatorubro-palido-lujzijanska atrofija, spinocerebralne ataksije 1, 2, 3, 6, 7 i 12, rubro-palido atrofija, spinocerebralna paraliza), i/ili kancera (npr. glioblastoma, kao što su glioblastom u Li-Fraumeni sindromu i sporadični glioblastom, maligni melanomi, pankreasni duktalni adenokarcinomi, mijeloidna leukemija, akutna mijelogena leukemija, mijelodisplastični sindrom, mijeloproliferativni sindrom, ginekološki kancer, Kapošijev sarkom, Hansenova bolest, kolageni kolitis).

[0238] Dalje, ovde je opisan metod za lečenje i/ili dijagnozu celijačne bolesti, abnormalnog zarastanja rana, stvaranja ožiljaka, skleroderme, keloida i hipertrofičnih ožiljaka, okularnog stvaranja ožiljaka, zapaljenske bolesti creva, makularne degeneracije, Grejvsove oftalmopatije, ergotizma indukovanog lekovima, psorijaze, bolesti povezanih sa fibrozom (npr. fibroza jetre, plućna fibroza, kao što su intersticijalna bolest pluća i fibrotična bolest pluća, kardijalna fibroza, kožna fibroza, mijelofibroza, fibroza bubrega, kao što su glomeruloskleroza i tubulointersticijalna fibroza), ateroskleroze, restenoze, zapaljenskih bolesti, autoimunih bolesti, neurodegenerativnih/neuroloških bolesti (kao što su npr. Hantingtonova bolest, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, poliglutaminska bolest, spinobulbarna mišićna atrofija, dentatorubro-palido-lujzijanska atrofija, spinocerebralne ataksije 1, 2, 3, 6, 7 i 12, rubro-palido atrofija, spinocerebralna paraliza), i/ili kancera (npr. glioblastoma, kao što su glioblastom u Li-Fraumeni sindromu i sporadični glioblastom, maligni melanomi, pankreasni duktalni adenokarcinomi, mijeloidna leukemija, akutna mijelogena leukemija, mijelodisplastični sindrom, mijeloproliferativni sindrom, ginekološki kancer, Kapošijev sarkom, Hansenova bolest, kolageni

2

kolitis) kod pacijenta, pri čemu taj metod sadrži administraciju terapeutski efektivne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom aspektu pronalaska, ili polinukleotida prema pronalasku, ili jedinjenja, farmaceutske kompozicije/formulacije, ili kita od delova prema pronalasku, pacijentu.

[0239] Pod "tretmanom" podrazumevamo i terapeutski, i profilaktički tretman na subjektu/pacijentu. Izraz "profilaktički" se upotrebljava tako da obuhvati primenu ovde opisanog antitela, leka, jedinjenja, kompozicije, ili kita koja sprečava ili smanjuje verovatnoću pojave ili razvoja stanja ili poremećaja (kao što je poremećaj povezan sa fibrozom) kod pojedinca.

[0240] Poželjno je da pacijent bude čovek, ali pacijent takođe može biti bilo koji drugi sisar koji može imati koristi od tretmana. Na primer, pacijent može biti miš, pacov, hrčak, zec, mačka, pas, koza, ovca, majmun ili primat.

[0241] "Terapeutski efektivna količina", ili "efektivna količina", ili "terapeutski efektivna", kada se ovde koriste, označavaju količinu koja obezbeđuje terapeutski efekat za dato stanje i režim administracije. Ovo je prevashodno količina aktivnog materijala za koju je izračunato da proizvodi željeni terapeutski efekat zajedno sa potrebnim aditivom i razređivačem, tj. nosačem ili pomoćnom materijom za administraciju. Dalje, ona treba da označava količinu koja je dovoljna da smanji ili spreči klinički značajan deficit u aktivnosti, funkciji i reakciji domaćina. Alternativno tome, terapeutski efektivna količina je dovoljna za izazivanje poboljšanja klinički značajnog stanja kod domaćina, na primer, sisara.

[0242] Agensi (tj. antitelo, njegov antigen-vezujući fragment, varijanta, fuzija ili derivat), lekovi, jedinjenja, farmaceutske kompozicije/formulacije i kitovi prema pronalasku se mogu isporučivati korišćenjem injektabilnih sistema za isporuku lekova sa odloženim oslobađanjem. Oni su projektovani specifično tako da smanje učestalost injekcija. Jedan takav sistem je Nutropin Depot u kome je rekombinantni humani hormon rasta (rhGH) kapsuliran u biodegradabilnim mikrosferama koje, kada se ubrizgaju, polako oslobađaju rhGH tokom produženog perioda. Prvenstveno se isporuka izvodi intramuskularno (i.m.) i/ili sub-kutano (s.c.) i/ili intravenski (i.v.).

[0243] Agensi, lekovi, jedinjenja, farmaceutske kompozicije/formulacije i kitovi prema pronalasku se mogu davati hirurški implantiranim uređajem koji oslobađa lek direktno na željeno mesto. Na primer, Vitrasert oslobađa ganciklovir direktno u oko radi lečenja CMV retinitisa. Direktnom primenom ovog toksičnog agensa na mestu bolesti se ostvaruje efektivna terapija bez značajnih sistemskih neželjenih dejstava leka.

[0244] Prvenstveno, lekovi i/ili farmaceutske kompozicije/formulacije prema predmetnom pronalasku su jedinična doza koja sadrži dnevnu dozu ili jedinicu, dnevnu poddozu ili njen podesni deo, aktivnog sastojka, odnosno sastojaka.

[0245] Agensi, lekovi, jedinjenja, farmaceutske kompozicije i kitovi prema pronalasku će se normalno davati bilo kojim parenteralnim putem, u obliku farmaceutske kompozicije koja sadrži aktivni sastojak, odnosno sastojke, opciono u obliku netoksične organske, ili neorganske kiseline ili baze, adicione soli, u farmaceutski prihvatljivom doziranom obliku. U zavisnosti od poremećaja i pacijenta koji treba da se leči, kao i od načina administracije, kompozicije se mogu davati u različitim dozama.

[0246] U humanoj terapiji, agensi, lekovi, jedinjenja, farmaceutske kompozicije/formulacije, i kitovi prema pronalasku se mogu davati sami, ali se generalno daju u smeši sa podesnim farmaceutskim ekscipijensom, razređivačem ili nosačem u zavisnosti od ciljnog načina administracije i standardne farmaceutske prakse.

[0247] Agensi, lekovi, jedinjenja, farmaceutske kompozicije/formulacije i kitovi prema pronalasku se mogu davati parenteralno, na primer, intravenski, intra-arterijski, intraperitonealni, intra-tekalno, intra-muskularno ili subkutano, ili se mogu davati tehnikama infuzije. Oni se najbolje primenjuju u obliku sterilnog vodenog rastvora koji može sadržati druge supstance, na primer, dovoljno soli ili glukoze da bi se napravio rastvor koji je izotoničan sa krvlju. Vodeni rastvori bi trebalo da budu podesno puferovani (prvenstveno na pH od 3 do 9), ako je potrebno. Priprema podesnih parenteralnih formulacija pod sterilnim uslovima se lako ostvaruje standardnim farmaceutskim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

[0248] Lekovi i farmaceutske kompozicije koji su podesni za parenteralnu administraciju obuhvataju vodene i nevodene sterilne injekcione rastvore koji mogu sadržati antioksidante, pufere, bakteriostate i rastvorljive materije koje čine formulaciju izotoničnom sa krvlju ciljnog primaoca; i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu sadržati sredstva za suspendovanje i zgušnjavače. Lekovi i farmaceutske kompozicije mogu biti prezentovani u kontejnerima za pojedinačnu dozu ili više doza, kao što su, na primer, zatvorene ampule i bočice, i mogu se čuvati u zamrzavanjem osušenom (liofilizovanom) stanju koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer, vode za injekcije, neposredno pre upotrebe. Gotovi injekcioni rastvori i suspenzije se mogu pripremiti od sterilnih praškova, granula i tableta prethodno opisane vrste.

[0249] Za parenteralnu administraciju humanim pacijentima, nivo dnevnih doza agenasa, lekova i farmaceutskih kompozicija prema pronalasku će obično biti od 1 μg do 10 mg po odrasloj osobi dnevno koje se daju u jednoj ili podeljenim dozama. Lekar će u svakom slučaju odrediti aktuelnu dozu koja će biti najpodesnija za bilo kog individualnog pacijenta i variraće u zavisnosti od starosti, težine i reakcije konkretnog pacijenta. Gornja doziranja su ilustrativna za prosečan slučaj. Naravno, mogu postojati individualni slučajevi gde su potrebni viši ili niži opsezi doza i oni se nalaze u okviru ovog pronalaska.

[0250] Obično će lekovi, farmaceutske kompozicije/formulacije i kitovi prema pronalasku sadržati agens prema pronalasku u koncentraciji između približno 2 mg/ml i 150 mg/ml ili između približno 2 mg/ml i 200 mg/ml. U poželjnom primeru izvođenja, lekovi, farmaceutske

4

kompozicije/formulacije i kitovi prema pronalasku će sadržati agens prema pronalasku u koncentraciji od 10 mg/ml.

[0251] Generalno, kod ljudi je parenteralna administracija agenasa, lekova, jedinjenja, farmaceutskih kompozicija/formulacija i kitova prema pronalasku poželjan način primene, budući da je najpodesniji.

[0252] Za veterinarsku primenu, agensi, lekovi, jedinjenja, farmaceutske kompozicije/formulacije, i kitovi prema pronalasku se daju kao podesne prihvatljive formulacije u skladu sa normalnom veterinarskom praksom, a veterinarski hirurg će odrediti režim doziranja i način administracije koji će biti najpodesniji za specifičnu životinju.

[0253] Predmetni pronalazak takođe obuhvata farmaceutske kompozicije/formulacije koje sadrže farmaceutski prihvatljive kisele ili bazne adicione soli polipeptidnih veznih grupa prema predmetnom pronalasku. Kiseline koje se upotrebljavaju za pripremanje farmaceutski prihvatljivih kiselih adicionih soli gore navedenih baznih jedinjenja koje su korisne u ovom pronalasku su one koje formiraju netoksične kisele adicione soli, tj. soli koje sadrže farmakološki prihvatljive anjone, kao što su hidrohloridne, hidrobromidne, hidrojodidne, nitratne, sulfatne, bisulfatne, fosfatne, kisele fosfatne, acetatne, laktatne, citratne, kisele citratne, tartratne, bitartratne, sukcinatne, maleatne, fumaratne, glukonatne, saharatne, benzoatne, metansulfonatne, etansulfonatne, benzensulfonatne, p-toluensulfonatne i pamoatne [tj. 1,1’-metilenbis-(2-hidroksi-3 naftoatne)] soli, između ostalih.

[0254] Farmaceutski prihvatljive bazne adicione soli se takođe mogu koristiti za proizvodnju farmaceutski prihvatljivih oblika soli agenasa (tj. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta) prema predmetnom pronalasku.

[0255] Ove hemijske baze koje se mogu upotrebiti kao reagensi za pripremanje farmaceutski prihvatljivih baznih soli predmetnih agenasa koji su kiseli po prirodi su one koje formiraju netoksične bazne soli sa takvim jedinjenjima. Takve netoksične bazne soli obuhvataju, ali nisu ograničene na one koje potiču od takvih farmakološki prihvatljivih katjona, kao što su katjoni alkalnih metala (npr. kalijuma i natrijuma) i katjoni zemnoalkalinih metala (npr. kalcijuma i magnezijuma), amonijum ili vodorastvorne aminske adicione soli, kao što su N-metilglukamin-(meglumin), i niži alkanolamonijum i druge bazne soli farmaceutski prihvatljivih organskih amina, između ostalog.

[0256] Agensi i/ili polipeptidne vezujuće grupe prema pronalasku se mogu liofilizovati radi čuvanja i rekonstituisati u podesnom nosaču pre upotrebe. Mogu se primeniti bilo koji podesni metodi liofilizacije (npr. sušenje raspršivanjem, sušenje kolača) i/ili tehnike rekonstitucije. Stručnjacima iz odgovarajuće oblasti će biti shvatljivo da liofilizacija i rekonstitucija mogu dovesti do različitog stepena gubitka aktivnosti antitela (npr. kod uobičajenih imunoglobulina, IgM antitela imaju tendenciju većeg gubitka aktivnosti od IgG antitela) i da se nivoi za upotrebu moraju podesiti naviše da bi se to kompenzovalo. U jednom primeru izvođenja, liofilizovana (zamrzavanjem osušena) polipeptidna vezna grupa ne gubi više od oko 20%, ili ne više od oko 25%, ili ne više od oko 30%, ili ne više od oko 35%, ili ne više od oko 40%, ili ne više od oko 45%, ili ne više od oko 50% svoje aktivnosti (pre liofilizacije) kada se rehidrira.

[0257] Prvenstveno, pronalaskom su realizovani antitelo, jedinjenje, farmaceutska kompozicija/formulacija, kit, primena ili metod, pri čemu je efektivna količina antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta između oko 0.0001 mg/kg do 50 mg/kg antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0258] Kao što će shvatiti stručnjaci iz odgovarajuće oblasti, precizna količina jedinjenja može varirati u zavisnosti od njegove specifične aktivnosti. Podesne količine za doze mogu sadržati unapred određenu količinu aktivne kompozicije za koju je izračunato da proizvodi željeni terapeutski efekat zajedno sa potrebnim razređivačem. U metodama i primeni za proizvodnju kompozicija prema pronalasku, predviđena je terapeutski efektivna količina aktivne komponente. Terapeutski efektivnu količinu može odrediti prosečan medicinski ili veterinarski radnik na osnovu pacijentovih karakteristika, kao što su starost, težina, pol, stanje komplikacije, druge bolesti, itd, kao što je dobro poznato u odgovarajućoj oblasti.

[0259] Dalje je ovde opisan in vitro metod za smanjenje ili inhibiciju TG2 enzimske aktivnosti, pri čemu taj metod sadrži administraciju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom aspektu pronalaska, ili polinukleotida prema pronalasku, ili jedinjenja ili kita prema pronalasku, uzorku koji sadrži TG2.

[0260] "Uzorak" može biti bilo koji uzorak koji je dobijen iz odgovarajućeg izvora, na primer, sisarskog izvora. Na primer, uzorak može biti uzorak tkiva ili ćelija koji sadrže TG2. Ilustrativna tkiva obuhvataju tkiva dobijena iz pacijentovog mozga, gastro-intestinalnog trakta, pluća, pankreasa, jetre, kože, bubrega, oka, srca, krvnih sudova, limfnih čvorova, kičme, i skeletnog ili glatkog mišića.

[0261] Takođe ovde je opisan metod za smanjenje ili inhibiciju TG2 enzimske aktivnosti kod pojedinca kome je to potrebno, pri čemu taj metod sadrži administraciju efektivne količine polinukleotida koji kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom aspektu pronalaska, pojedincu.

[0262] Dalje, ovde je opisana primena polinukleotida koji kodira antitelo ili njegov antigenvezujući fragment prema bilo kom aspektu pronalaska, u proizvodnji leka za smanjenje ili inhibiciju TG2 enzimske aktivnosti pojedincu kome je to potrebno.

[0263] Ovde je opisan in vitro metod za smanjenje ili inhibiciju TG2 enzimske aktivnosti, pri čemu taj metod sadrži administraciju polinukleotida koji kodira antitelo ili njegov antigenvezujući fragment prema bilo kom aspektu pronalaska, uzorku koji sadrži TG2, na primer, uzorku tkiva ili ćelija koji sadrži TG2.

[0264] Takođe je ovde opisan metod za proizvodnju antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta prema pronalasku, ili jedinjenje prema pronalasku koje sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment prema pronalasku, pri čemu taj metod sadrži ekspresiju polinukleotida prema pronalasku, ili kultivaciju stabilne ćelijske linije domaćina koja je ovde opisana.

[0265] Ovde je opisan metod za selekciju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji selektivno vezuje protein transglutaminaze, pri čemu taj metod sadrži korak izbora antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji selektivno vezuje polipeptid koji sadrži transglutaminazni region jezgra/katalitički domen, ali koji ne sadrži transglutaminazni domen bačve ili sendviča.

[0266] Ovde je opisan metod za selekciju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, ili jedinjenja koje sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment, pri čemu taj metod sadrži korak izbora antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji selektivno vezuje polipeptidnu sekvencu se sastoji od polipeptidne sekvence aminokiselina 143 do 473 humanog TG2 ili njegovog fragmenta.

[0267] Metod može biti izveden korišćenjem prikazivanja faga antitela. Poželjno je da je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment inhibitorno antitelo koje inhibira katalitičku aktivnost transglutaminaznog proteina.

[0268] Dalje, ovde je opisan metod za proizvodnju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji selektivno vezuje transglutaminazni protein, pri čemu taj metod sadrži administraciju nehumanoj životinji jedinjenja koje sadrži:

i) polipeptid koji sadrži transglutaminazni region jezgra/katalitički domen, ali koji ne sadrži transglutaminazni domen bačve ili sendviča, ili njegov fragment; i, opciono,

ii) adjuvans.

[0269] Predočava se da će polipeptid koji sadrži transglutaminazni region jezgra/katalitički domen, ali koji ne sadrži transglutaminazni domen bačve ili sendviča sadržati gore opisanu katalitičku trijadu, i opciono, takođe mesto vezivanja GTP na transglutaminaznom proteinu.

[0270] Metod može dalje sadržati korak selekcije antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta na bazi njegovog selektivnog vezivanja za transglutaminazni protein.

[0271] Ovde je opisan metod za selekciju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji selektivno vezuje transglutaminazni protein, pri čemu taj metod sadrži korak selekcije antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji selektivno vezuje polipeptidnu sekvencu koja se sastoji od polipeptidne sekvence aminokiselina 143 do 473 humanog TG2 ili njegovog fragmenta.

[0272] Ovde je opisan metod za proizvodnju antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži administraciju nehumanoj životinji jedinjenja koje sadrži:

i) polipeptidnu sekvencu koja se sastoji od polipeptidne sekvence aminokiselina 143 do 473 humanog TG2 ili njegovog fragmenta; i opciono,

ii) adjuvans.

[0273] Metod može dalje sadržati korak selekcije antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta na bazi njegovog selektivnog vezivanja za TG2, na primer, humani TG2.

[0274] Dalje, ovde je opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se mogu dobiti bilo kojim od prethodnih metoda za proizvodnju ili selekciju antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta.

[0275] Pod "adjuvansom" podrazumevamo bilo koji farmakološki ili imunološki agens koji pojačava primaočevu imunu reakciju na polipeptid prema pronalasku. Imunološki adjuvansi se dodaju vakcinama da bi stimulisali reakciju imunog sistema na ciljni antigen, ali oni sami ne prenose imunitet. Primeri adjuvanasa obuhvataju uljane emulzije, neorganska jedinjenja, kao što su soli aluminijuma, na primer, aluminijum hidroksid ili aluminijum fosfat, organska jedinjenja kao što je skvalen, virozome, ili bilo koje drugo podesno jedinjenje ili jedinjenja koja bi mogao podrazumevati stručnjak iz odgovarajuće oblasti.

[0276] Ovde je opisan izolovani polipeptid koji se sastoji od:

i) polipeptidne aminokiselinske sekvence 143 do 473 humanog TG2;

ii) polipeptidne aminokiselinske sekvence 304 do 326 humanog TG2;

iii) polipeptidne aminokiselinske sekvence 351 do 365 humanog TG2;

iv) polipeptidne aminokiselinske sekvence 450 do 467 humanog TG2; ili

njenog fragmenta, derivata ili polipeptidnog mimika.

[0277] Takođe je ovde opisan izolovani polinukleotid koji kodira polipeptid prema neposredno prethodnom aspektu.

[0278] Ovde je opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za primenu u lečenju stanja povezanog sa TG2 aktivnosti u suštini kao što je ovde opisano sa pozivom na opis i nacrt.

[0279] Ovde je opisana primena antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u suštini kao što je ovde opisano sa pozivom na opis i nacrt.

[0280] Kada se ovde koriste, izrazi u jednini "jedan", "i", i "taj" obuhvataju i pozivanje na množinu, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije. Shodno tome, na primer, navođenje "antitela" obuhvata mnoštvo takvih antitela, a navođenje "doze" obuhvata jednu ili više doza i njihovih ekvivalenata koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, i tako dalje.

[0281] Pronalazak će sada biti detaljnije opisan sa pozivom na sledeće neograničavajuće Slike i Primere.

Slika 1: Generisanje humanog TG2 rekombinantnog proteina

A: TG2 katalitičko jezgro kDNK je bilo generisano pomoću PCR od pClineo-hTG2 vektora i umetnuto je u pET 21a plazmid. Posle amplifikacije u E.Coli on je bio digestiran sa Nhe I i Hind III da bi se oslobodilo kDNK jezgra TG2 i propustilo na 1% agaroza gelu (traka 3). Stupci su bili sortirani poređenjem sa lestvicama od 100 bp (traka 1) i markerom DNK molekulske težine (traka 2).

B: Vektor pET21a sa jezgrom TG2 je bio upotrebljen za transformaciju E. coli soja BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL. Ekspresija je bila indukovana korišćenjem IPTG tokom 4 sata. TG2 proteinska jezgra su formirala nerastvorna tela koja su bila rekuperisana iz lizata centrifugiranjem. Ona su bila ponovo rastvorena, pa je sa 37 kDa His markirano jezgro TG2 bilo prečišćeno na koloni sa niklom. 10 ng je bilo izdvojeno pomoću SDS-PAGE, pa je vestern blotovano i testirano je sa CUB7402 anti TG2 antitelom (traka 2) uz poređenje preciznosti plus markera molekulske težine (traka 1).

Slika 2: Imunološka reakcija kod miševa na rhTG2 protein jezgra

A: Uzorci krvi za testiranje su bili uzeti od 4 miša imunizovana katalitičkim jezgrom na dan 45 posle prve imunizacije i 10 dana posle drugog pojačanja. Serum je bio serijski razređen, pa je reaktivnost prema imobilizovanim TG2 proteinskim jezgrima proverena pomoću ELISE.

B Reaktivnost je dalje bila proverena skriningom domena humanih rh TG2 i rh TG2 katalitičkih jezgara. 20, 40, 80 ng proteina je bilo frakcionisano pomoću SDS PAGE i vestern blotirano je na PVDF membrani. Ovo je bilo imunotestirano sa 1:1000 razređenjem seruma. Vezivanje antitela je bilo otkriveno korišćenjem anti-mišjeg γlančanog specifičnog HRP. Za određivanje veličine je bilo upotrebljeno poređenje preciznosti plus markera molekulske težine (traka 1).

Slika 3: Reaktivnost hibridoma protiv članova TG familije

A: ELISA je bila izvedena korišćenjem ploča obloženih sa rekombinantnim TGs (100 ng /bunarčiću) da bi se odredila specifičnost za TG tip u 109 hibridoma supernatanata koji su ispoljili dobru reaktivnost na TG2. Vezivanje antitela je bilo otkriveno uz korišćenje anti-mišjeg γ-lančanog specifičnog HRP. Prikazana je slučajna selekcija onih koji su bili podvrgnuti skriningu, uključujući EF4, CG9 & FD8 koji su ispoljili unakrsnu reaktivnost. B: Devet izabranih hibridoma je bilo dvostruko klonirano. IgG je bio prečišćen i testiran u pogledu reaktivnosti sa 0.1ug/ml prema rekombinantnim humanim TG1, TG2, TG3, TG7 i Faktorom XIIIa uz korišćenje ELISE sa pločama obloženim sa 100ng svakog TG. Podaci predstavljaju srednju OD vrednost od 3 odvojene ELISE ±SEM.

Faktor XIIIa je na grafikonima označen sa TG13.

Slika 4: Identifikacija hibridoma sa inhibitornom aktivnosti za TG2

Kondicionirani medijumi iz 32 hibridoma bunarčića sa specifičnošću za TG2 su bili podvrgnuti skriningu u pogledu svojih efekata na aktivnost 100ng rhTG2 uz korišćenje testa sa inkorporiranjem<3>H putrescina. Hemijski trijažni TG2 inhibitor 1,3-dimetil-2-[(2-oksopropil)tio]imidazolijum hlorid je bio upotrebljen kao pozitivna kontrola za inhibiciju. RPMI (nekondicionirani medijum) je bio upotrebljen kao negativna kontrola. 500 ng TG2 inhibitornog antitela koje je testirao Quark biotechnology bilo je uključeno radi poređenja. Podaci predstavljaju srednji CPM inkorporiran tokom 30 min od najmanje tri eksperimenta izvršena u duplikatu ±SEM. Stupci sive boje pokazuju značajnost TG2 inhibicije (p<0.05).

Slika 5: Mapiranje epitopa inhibitornog antitela.

Svako inhibitorno monoklonsko antitelo je bilo vezano za ELISA ploču i podvrgnuto je selekciji u odnosu na biblioteku humanih TG2 faga. Vezivanje faga za antitelo je bilo sačuvano, pa je amplifikovano, i podvrgnuto je još 4 ciklusa selekcije. Fragmenti iz TG2 biblioteke u fazima su onda bili sekvencirani, a preklapajuće sekvence su bile upotrebljene za određivanje epitopa za svako antitelo. Onda su zajedničke sekvence antitela bile upotrebljene za određivanje konsenzusne sekvence za specifični inhibitorni epitop i antitela su bila grupisana u skladu sa time. Bila su identifikovana 3 inhibitorna epitopa.

Slika 6: Strukturna lokacija inhibitornih epitopa sa TG2 katalitičkim jezgrom

TG2 aminokiselinska sekvenca je uvedena u Pymol i generisan je 3D grafički prikaz strukture u njenom otvorenom, sa Ca<2+>aktiviranom stanju sa pretpostavljenim mestima vezivanja kalcijuma (tirkizno) i katalitičkom trijadom (sivo) prikazanom radi poređenja (levi panel). Onda su bili dodati konsenzusni inhibitorni epitopi sa plavim (Antitelo grupa 1 - AB1 mesto), crvenim (antitelo grupa 2 - DF4 mesto) i žutim (antitelo grupa 3, DD9 mesto).

Slika 7: VL sekvenca inhibitornih antitela

RNK iz svakog inhibitornog hibridoma je bio ekstrahovan, reverzno transkribovan i amplifikovan pomoću PCR korišćenjem degeneratnih FR1 prajmera, MH1 i MH2 prajmera i prajmera 3 konstantna regiona da bi se amplifikovali VH geni. Rezultujuće VH i VK sekvence su prikazane za AB1.

Slika 8. Efikasnost AB1 u inhibiranju TG2 aktivnosti u ćelijskom homogenatu

A: Hep2G ćelije su bile lizirane, pa je 45 ug proteina bilo pomešano sa 750 ng IgG od AB1, DH2, DD9, BB7, DC1 i EH6 tokom 20 minuta. Ovo je zatim bilo testirano primenom testa TG aktivnosti inkorporiranjem<3>H putrescina uzimanjem uzoraka tokom 1 sata. Bila je izračunata brzina reakcije i izražena je kao procenat istog lizata inkubiranog sa slučajnim antitelom (MAB002). Podaci predstavljaju srednju procentualnu inhibiciju ± SEM iz 2 odvojena eksperimenta izvršena u duplikatu. * p<0.05

B: HepG2 ćelije su bile izložene rastućim koncentracijama glukoze tokom 96 sati da bi se više regulisala TG2 ekspresija. Ćelije su bile sakupljene, pa su lizirane i 25 ug lizata je frakcionisano pomoću SDS-PAGE, pa je vestern blotirano, a zatim je imunotestirano sa 1ng/ml rastvora AB1 IgG uz korišćenje hemiluminiscentne krajnje tačke.

Slika 9. (Tabela 1): Upoređivanje IC50 vrednosti za TG2 inhibitorna antitela

Da bi se odredila IC50 vrednost za svako antitelo prema čoveku, pacovu i mišu bio je upotrebljen test sa<3>H putrescinom.100 ng humanog TG2 ili 25 ng mišjeg i pacovskog TG2 je bilo upotrebljeno za generisanje reakcije gde je približno 3000 cpm Putrescina na sat bilo inkorporirano u 10ul reakcione smeše. Serijska razređivanja svakog antitela su onda bila naneta, počevši od dodavanja 500ng (5ug/ml finalne koncentracije) reakcionoj smeši i inkubirana su sa TG220 minuta pre aktivacije reakcije. IC50 vrednosti su bile izračunate određivanjem koncentracije za koju je enzimska brzina reakcije bila smanjena za 50% korišćenjem odgovarajućeg fitovanja krive u graphpad prism-u. Vrednosti su izražene kao količina IgG u mg/ml u reakciji koja bi inhibirala 1 ng TG2.

Slika 10. Ekstracelularna TG aktivnost u HK2 ćelijama kao reakcija na TG2 inhibiciju.

HK2 ćelije su bile zasejane na fibronektin i onda su bile inkubirane 2 sata u prisustvu 0.1M biotin kadaverina sa 4ng/μl humanog anti-TG2 antitela (AB1) (deo A), 4ng/μl humanog anti-TG2 antitela (DC1) (deo B) ili 400μM mesno specifičnog trijažnog TG inhibitora 1,3-dimetil-2-[(2-okso-propil)tio]imidazolijum hlorida. Ekstracelularna TG aktivnost je bila izmerena inkorporacijom biotin kadaverina u fibronektin sa inkorporacijom otkrivenom korišćenjem ekstravadin-HRP i TMB supstrata. Promene optičke gustine su bile izmerene na 450nm u čitaču ploča sa 96 bunarčića. Podaci predstavljaju srednji OD na 450nm korigovan na 1 mg ćelijskog proteina. n = 6 bunarčića po eksperimentalnoj grupi.

Slika 11. Poređenje TG2 inhibicije pomoću antitela AB1 sa fab fragmentom Quark-ovog TG2 inhibitornog antitela korišćenjem testa sa inkorporiranjem<3>H putrescina

1

100ng hTG2 je bilo testirano u pogledu TG2 aktivnosti na bazi inkorporiranja<3>H Putrescina u dimetilkazein u toku perioda od 60 minuta uz dodavanje bilo 1μg fab fragmenta antitela koji je opisao Quark u WO2006/100679 i sintetizovanog na Univerzitetu u Šefildu ili 500ng AB1. Podaci predstavljaju srednju TG aktivnost kao inkorporiranje<3>H putrescina (CPM) ± SEM iz 3 nezavisna eksperimenta izvršena u duplikatu.

Slika 12. Procentualno poređenje TG2 inhibicije pomoću antitela AB1 sa fab fragmentom Quark-ovog TG2 inhibitornog antitela korišćenjem testa sa inkorporiranjem<3>H putrescina Podaci sa Slike 11 su alternativno tome izraženi kao procenat TG aktivnosti u svakom vremenskom trenutku da bi se prikazala relativno komparativno smanjenje TG2 aktivnosti primenom AB1 i fab fragmenta Quark antitela.

Slika 13. Poređenje TG2 inhibicije pomoću antitela AB1 sa rekombinantnim pacovskim IgG Quark-ovog TG2 inhibitornog antitela korišćenjem testa sa inkorporiranjem<3>H putrescina 100ng hTG2 je bilo ispitano u pogledu TG2 aktivnosti na bazi inkorporiranja<3>H Putrescina u dimetilkazein u toku perioda od 60 minuta uz dodavanje 500 ng rekombinantne pacovske verzije TG2 inhibitornog antitela koje je opisao Quark u WO2006/100679 i sintetizovano je u Medical Research Council Technology ili 500ng AB1. Podaci predstavljaju srednju TG aktivnost kao inkorporiranje<3>H putrescina (CPM) ± SEM iz 3 nezavisna eksperimenta izvršena u duplikatu.

Slika 14. Procentualno poređenje TG2 inhibicije pomoću antitela AB1 sa rekombinantnim pacovskim IgG Quark-vog TG2 inhibitornog antitela korišćenjem testa sa inkorporiranjem<3>H putrescina

Podaci sa Slike 13 su alternativno tome izraženi kao procenat TG aktivnosti u svakom vremenskom trenutku da bi se prikazala relativno komparativno smanjenje TG2 aktivnosti primenom AB1 i Quark rekombinantnog pacovskog IgG.

Slika 15. Efekat AB1 na ECM nivoe u HK2 ćelijama

Nivoi zrelog kolagena u HK-2 ćelijama su bili izmereni inkorporiranjem<3>H prolina u ECM u toku perioda od 76 sati, sa ili bez dodavanja TG2 inhibitornog antitela AB1. Podaci predstavljaju inkorporiranje<3>H prolina po mg ćelijskog proteina izraženog kao procenat srednjeg nivoa u netretiranim ćelijama ± SEM. n=2.

Slika 16. ELISA za vezivanje humanizovanih verzija antitela.

Supernatanti HEK293F ćelija ko-transfektovanih sa različitim kombinacijama vektora humanizovanih lakih lanaca i teških lanaca su bili testirani u anti-humanoj IgG ELISI da bi

2

se odredila koncentracija i u anti huTG2 ELISI. Svaki supernatant je bio testiran u triplikatu i određeni su IC50. Najpotentnija kombinacija je bila izabrana za dalje studije i kao humanizovano antitelo kandidat.

Slika 17. Testiranje MRC Quark CTD190 na humanom Tg2 pomoću ELISE.

Ploče sa 96 bunarčića su bile zasejane sa hTG2 (1μg/ml) u karbonatnom puferu preko noći, pa je izvršena ELISA detekcija korišćenjem 100ng/ml primarnog antitelo. Detekcija je bila izvršena korišćenjem anti-mišjeg IgG (SIGMA 3673) za CUB i anti-pacovskog IgG (SIGMA A5795) za Quark (oba 1:5000). Quark antitelo napravljeno pomoću MRC T reaguje sa humanim TG2.

Slika 18: RNK iz AB1 hibridoma je bila ekstrahovana, pa je reverzno transkribovana i amplifikovana je pomoću PCR korišćenjem degeneratnog prajmera signalne sekvence MHV4 sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca MHCG1, ili korišćenjem degeneratnog prajmera signalne sekvence MKV4 sa prajmerom konstantnog regiona kapa lakog lanca MKC. Prikazane su rezultujuće VH i VK sekvence.

Slika 19: RNK iz BB7 hibridoma je bila ekstrahovana, pa je reverzno transkribovana i amplifikovana je pomoću PCR korišćenjem degeneratnog prajmera signalne sekvence MHV4 sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca MHCG1, ili korišćenjem degeneratnog prajmera signalne sekvence MKV4 sa prajmerom konstantnog regiona kapa lakog lanca MKC. Prikazane su rezultujuće VH i VK sekvence.

Slika 20: RNK iz DC1 hibridoma je bila ekstrahovana, pa je reverzno transkribovana i amplifikovana je pomoću PCR korišćenjem degeneratnog prajmera signalne sekvence MHV4 sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca MHCG1, ili korišćenjem degeneratnog prajmera signalne sekvence MKV4 sa prajmerom konstantnog regiona kapa lakog lanca MKC. Prikazane su rezultujuće VH i VK sekvence

Slika 21: RNK iz JE12 hibridoma je bila ekstrahovana, pa je reverzno transkribovana i amplifikovana je pomoću PCR korišćenjem 5’ RACE PCR sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca MHCG1, ili korišćenjem prajmera signalne sekvence MKV1 sa prajmerom konstantnog regiona kapa lakog lanca MKC. Prikazane su rezultujuće VH i VK sekvence

Slika 22: RNK iz EH6 hibridoma je bila ekstrahovana, pa je reverzno transkribovana i amplifikovana je pomoću PCR korišćenjem 5’ RACE PCR sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca MHCG2B, ili korišćenjem prajmera signalne sekvence MKV sa prajmerom konstantnog regiona kapa lakog lanca MKC. Prikazane su rezultujuće VH i VK sekvence

Slika 23: RNK iz AG9 hibridoma je bila ekstrahovana, pa je reverzno transkribovana i amplifikovana je pomoću PCR korišćenjem degeneratnog prajmera signalne sekvence MHV7 sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca MHCG1, ili korišćenjem smeše degeneratnih prajmera signalne sekvence MKV1 - 11 sa prajmerom konstantnog regiona kapa lakog lanca MKC. Prikazane su rezultujuće VH i VK sekvence

Slika 24: RNK iz AH3 hibridoma je bila ekstrahovana, pa je reverzno transkribovana i amplifikovana je pomoću PCR korišćenjem degeneratnog prajmera signalne sekvence MHV7 sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca MHCG2B, ili korišćenjem prajmera signalne sekvence MKV1 sa prajmerom konstantnog regiona kapa lakog lanca MKC. Prikazane su rezultujuće VH i VK sekvence.

Slika 25: RNK iz DD9 hibridoma je bila ekstrahovana, pa je reverzno transkribovana i amplifikovana je pomoću PCR korišćenjem 5’ RACE PCR sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca MHCG2A, ili korišćenjem degeneratnog prajmera signalne sekvence MKV5 sa prajmerom konstantnog regiona kapa lakog lanca MKC. Prikazane su rezultujuće VH i VK sekvence.

Slika 26: RNK iz DH2 hibridoma je bila ekstrahovana, pa je reverzno transkribovana i amplifikovana je pomoću PCR korišćenjem 5’ RACE PCR sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca MHCG2B, ili korišćenjem degeneratnog prajmera signalne sekvence MKV45 sa prajmerom konstantnog regiona kapa lakog lanca MKC. Prikazane su rezultujuće VH i VK sekvence.

Slika 27: RNK iz DD6 hibridoma je bila ekstrahovana, pa je reverzno transkribovana i amplifikovana je pomoću PCR korišćenjem 5’ RACE PCR sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca MHCG2B, ili korišćenjem 5’ RACE PCR sa prajmerom konstantnog regiona lambda lakog lanca MLC. Prikazane su rezultujuće VH i VL sekvence.

Slika 28: RNK iz IA12 hibridoma je bila ekstrahovana, pa je reverzno transkribovana i amplifikovana pomoću PCR uz korišćenje degeneratnog prajmera signalne sekvence MHV9 sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca MHCG1, ili uz korišćenje

4

degeneratnog prajmera signalne sekvence CL14 sa prajmerom konstantnog regiona kapa lakog lanca MKC. Prikazane su rezultujuće VH i VK sekvence.

Slika 29. Krive doza reakcija i IC50 vrednosti za enzimsku inhibiciju rekombinantnog humanog TG2 pomoću himeričnih anti-TG2 antitela, (a) cAB003 , (b) cBB001, (c) cDC001, (d) cDD9001, (e) cDH001 i (f) komercijalnog TG2 antitela CUB7402. IC50 vrednosti su srednja vrednost iz 3 nezavisna eksperimenta.

Slika 30. Krive doza reakcija i IC50 vrednosti za enzimsku inhibiciju rekombinantnog makakijevog TG2 pomoću himeričnih anti-TG2 antitela (a) cDC001 i (b) komercijalnog TG2 antitela CUB7402.

Slika 31. Krive doza reakcija i IC50 vrednosti za enzimsku inhibiciju rekombinantnog humanog TG2 pomoću humanizovanih anti-TG2 antitela, (a) hBB001AA, (b) hBB001BB, (c) hAB005 i (d) hAB004.

Slika 32. Krive doza reakcija i IC50 vrednosti za enzimsku inhibiciju rekombinantnog makakijevog TG2 pomoću humanizovanih anti-TG2 antitela (a) hBB01AA i (b) hAB004.

Slika 33. Krive doza reakcija i IC50 vrednosti za enzimsku inhibiciju rekombinantnog humanog TG2 pomoću mišjih monoklonskih anti-TG2 antitela, (a) mAB003, (b) mBB001, (c) mDC001, (d) mDD9001, (e) mDH001 i (f) mDD6001.

Slika 34 - ELISA za vezivanje humanizovanih verzija AB1 antitela.

Supernatanti od HEK293F ćelija ko-transfektovanih sa različitim kombinacijama vektora humanizovanih AB1 lakih lanaca i AB1 teških lanaca su bili testirani u anti-humanoj IgG ELISI da bi se odredila koncentracija i u anti huTG2 ELISI. Svaki supernatant je bio testiran u triplikatu i određeni su IC50. Najpotentnija kombinacija je bila izabrana za dalje studije i kao humanizovano antitelo kandidat.

Slika 35. Krive vezivanja doza reakcija za ELISU i EC50 podaci za vezivanje antitela za humani TG2 (a) himerična antitela cDD9001, cDH001, cDC001, komercijalno TG2 antitelo CUB7402 i izotipski odgovarajuća kontrola, (b) himerično antitelo cBB001 i izotipski odgovarajuća kontrola i (c) himerično antitelo cAB003 i izotipski odgovarajuća kontrola.

Slika 36. Krive vezivanja doza reakcija za ELISU i EC50 podaci za vezivanje antitela za makakijev TG2 (a) himerična antitela cDD9001, cDH001, cDC001, komercijalno TG2 antitelo CUB7402 i izotipski odgovarajuća kontrola, (b) himerično antitelo cBB001 i izotipski odgovarajuća kontrola i (c) himerično antitelo cAB003 i izotipski odgovarajuća kontrola.

Slika 37. Krive vezivanja doza reakcija za ELISU i EC50 podaci za vezivanje antitela za humani TG2 (a) humanizovana antitela hBB001AA, HBB001BB, komercijalno TG2 antitelo CUB7402 i izotipski odgovarajuća kontrola i (b) humanizovano antitelo hAB004.

Slika 38. Krive vezivanja doza reakcija za ELISU i EC50 podaci za vezivanje antitela za makakijev TG2 (a) humanizovana antitela hBB001AA, HBB001BB, komercijalno TG2 antitelo CUB7402 i izotipski odgovarajuća kontrola i (b) humanizovano antitelo hAB004 i izotipski odgovarajuća kontrola.

Slika 39: Aktivnost vezivanja humanizovanog AB1 za ekstracelularni TG2. Inhibicija ekstracelularne TG2 aktivnosti koji su proizvodile HK2 ćelije je bila ispitana korišćenjem ELISA merenja inkorporiranja biotin kadaverina u fibronektin. Prikazana je ilustrativna kriva koja pokazuje inhibiciju TG2 aktivnosti pomoću humanizovanog AB1 (hAB005) i dobijeni IC.

Slika 40: Aktivnost vezivanja humanizovanog BB7 za ekstracelularni TG2.

Inhibicija ekstracelularne TG2 aktivnosti koji su proizvodile HK2 ćelije je bila ispitana korišćenjem ELISA merenja inkorporiranja biotin kadaverina u fibronektin. Prikazana je ilustrativna kriva koja pokazuje inhibiciju TG2 aktivnosti pomoću verzija humanizovanog BB7 (hBB001AA i hBB001BB) i dobijeni IC.

Slika 41: Rezultati testa sa ogrebotinama za citohalasin D, R281 i ZDON kontrole i komercijalno antitelo CUB7402.

Testovi sa ogrebotinama su bili izvedeni korišćenjem WI-38 ćelije, posle zasejavanja i rasta preko noći, ćelije su bile isprane u medijumu bez seruma i ogrebotine su napravljene korišćenjem Essen Wound Maker-a. Medijum je bio odstranjen i zamenjen sa 95 ul/bunarčiću medijuma bez seruma koji je sadržao kontrole i testirana antitela. Ploča je bila stavljena u Essen Incycte, a zatvaranje rane je analizirano korišćenjem Incucyte softvera. Relativna gustina rane prema vremenu je bila grafički prikazana za kontrole citohalasin D, R281 i Z -Don (panel A) i komercijalno antitelo CUB7402 i citohalasin (panel B).

Slika 42: Rezultati testa sa ogrebotinama za humanizovano BB7.

Testovi sa ogrebotinama su bili izvedeni korišćenjem WI-38 ćelija, a posle zasejavanja i rasta preko noći, ćelije su bile isprane u medijumu bez seruma i ogrebotine su napravljene korišćenjem Essen Wound Maker-a. Medijum je bio odstranjen i zamenjen sa 95 ul/bunarčiću medijuma bez seruma koji je sadržao kontrole i testirana antitela. Ploča je bila stavljena u Essen Incycte, a zatvaranje rane je analizirano korišćenjem Incucyte softvera. Relativna gustina rane prema vremenu je bila grafički prikazana za humanizovani hBB001 AA i kontrolu citohalasin D (panel A) i hBB001BB i kontrolu citohalasin D (panel B).

Slika 43: Rezultati testa sa ogrebotinama za humanizovano AB1.

Testovi sa ogrebotinama su bili izvedeni korišćenjem WI-38 ćelija, a posle zasejavanja i rasta preko noći, ćelije su bile isprane u medijumu bez seruma i ogrebotine su napravljene korišćenjem Essen Wound Maker-a. Medijum je bio odstranjen i zamenjen sa 95 ul/bunarčiću medijuma bez seruma koji je sadržao kontrole i testirana antitela. Ploča je bila stavljena u Essen Incycte, a zatvaranje rane je analizirano korišćenjem Incucyte softvera. Relativna gustina rane prema vremenu je bila grafički prikazana za humanizovani hAB005 i kontrolu citohalasin D.

Slika 44: Rezultati testa sa ogrebotinama za himerično DC1.

Testovi sa ogrebotinama su bili izvedeni korišćenjem WI-38 ćelija, a posle zasejavanja i rasta preko noći, ćelije su bile isprane u medijumu bez seruma i ogrebotine su napravljene korišćenjem Essen Wound Maker-a. Medijum je bio odstranjen i zamenjen sa 95 ul/bunarčiću medijuma bez seruma koji je sadržao kontrole i testirana antitela. Ploča je bila stavljena u Essen Incycte, a zatvaranje rane je analizirano korišćenjem Incucyte softvera. Relativna gustina rane prema vremenu je bila grafički prikazana za himerično antitelo cDC001 i kontrolu citohalasin D.

Slika 45: Vezivanje humanog TG2 za cAB003 imobilizovano antitelo pomoću Biacore. Faze asocijacije humanih TG2 injekcija prema biosenzoru obloženom sa cAB003 za 25, 50, 100 i 200nM, uključujući u duplikatu za 50nM, prikazane su na levoj strani. Iz istog eksperimenta su uzete dve faze duge disocijacije, kao što je prikazano na desnoj strani. Fitovanja su prikazana kao pune crne linije, a rezultati su prikazani u Tabeli 25.

Slika 46: Vezivanje makakijevog TG2 za hAB004 imobilizovano antitelo pomoću Biacore. Faze asocijacije makakijevih TG2 injekcija prema biosenzoru obloženom sa hAB004 za 25, 50, 100, 200 i 400nM, uključujući u duplikatu za 50nM, prikazane su na levoj strani. Iz istog eksperimenta su uzete dve faze duge disocijacije, kao što je prikazano na desnoj strani. Fitovanja su prikazana kao pune crne linije, a rezultati su prikazani u Tabeli 26.

Slika 47: Vezivanje humanog TG2 za cDH001 imobilizovano antitelo pomoću Biacore u odsustvu kalcijuma. Faze asocijacije humanih TG2 injekcija prema biosenzoru obloženom sa cDH001 za 25, 50, 100 i 200nM, uključujući u duplikatu za 50nM, prikazane su na levoj strani. Iz istog eksperimenta su uzete dve faze duge disocijacije, kao što je prikazano na desnoj strani. Fitovanja su prikazana kao pune crne linije, a rezultati su prikazani u Tabeli 25.

Primer 1: Razvoj TG2 inhibitornog antitela podesnog za terapeutsku primenu kod čoveka sa identifikacijom 3 specifična inhibitorna epitopa.

[0282] Transglutaminaza tip 2 (TG2) katalizuje formiranje ε-(γ-glutamil)-lizin izopeptidne veze između susednih peptida ili proteina, uključujući one iz ekstracelularnog matriksa (ECM). Povišeni ekstracelularni TG2 dovodi do ubrzanog ECM deponovanja i smanjenog klirensa koji se nalaze u osnovi stvaranja ožiljaka na tkivu i fibroze. Ovo je takođe povezano sa celijačnom bolesti, neurodegenerativnim poremećajima i nekim kancerima. Iako su bila razvijena brojna jedinjenja koja inhibiraju transglutaminaze, nijedno od njih nije specifično za TG2, tako da do izvesne mere inhibiraju sve transglutaminaze. Mada je ovo obezbedilo dokaz konceptualnih studija uloge TG2 u ovim patologijama, nedostatak specifičnosti za izoforme je sprečio njihovu primenu kod čoveka. Da bi se ovo rešilo, krenuli smo u razvoj visokoafinitetnog TG2 specifičnog antitela koje bi inhibiralo samo TG2 aktivnost.

[0283] Rekombinantni protein koji obuhvata aminokiseline 143 do 473 humanog jezgra TG2 je bio proizveden u Escherichia coli, pa je ponovo savijen i 100 μg je injektirano u 4 miša sa pojačanjima posle 2, 5, 7, i 10 nedelja. Slezine su bile uzete 4 dana posle finalnog pojačanja i splenociti su fuzionisani sa Sp2/0-Ag-14 mijeloma ćelijama. Sedamdeset pet supernatanata hibridoma je ispoljilo specifičnost za TG2. Ovi supernatanti hibridoma su bili podvrgnuti skriningu u pogledu svoje sposobnosti inhibiranja TG2 aktivnosti u testu inkorporiranja putrescina koji je sadržao 100 μg TG2. Deset TG2 specifičnih supernatanata su bili inhibitorni. Oni su bili posle toga dvostruko klonirani. Korišćenjem prikazivanja faga za skrining biblioteke TG2 fragmenata, svako antitelo je bilo mapirano radi preciznog određivanja epitopa u domenu jezgra TG2 i 3 karakteristična inhibitorna epitopa. Bila je određena količina antitela za smanjenje aktivnosti od 100 ng TG2 za 50 %.

[0284] 2 najefikasnija antitela, AB1 i DC1 se vezuju za aminokiseline 304 do 327 i imala su IC50od 1.1 x 10<-5>mg/ml IgG po ng rekombinantnog TG2. Primena AB1 & DC1 je bila u stanju da uspešno inhibira TG2 u humanim Hep2G ćelijama i ekstracelularni TG2 u humanim HK-2 ćelijama kada se primene na kulture u medijumima.

[0285] Shodno tome, imunizacija miševa sa domenom jezgra TG2 je kao iznenađujuće omogućila generaciju monoklonskih antitela koja ciljaju prethodno nenavedene epitope unutar katalitičkog jezgra. Ova antitela su specifična, efektivno inhibiraju TG2 aktivnost i podesna su za in vivo primenu.

Materijali i metode

Proizvodnja domena katalitičkog jezgra transglutaminaze 2

[0286] Domen katalitičkog jezgra humanog TG2 (ostaci Cys143 - Met 473 od TG2) je bio izražen, pa je ponovo savijen i prečišćen da bi se omogućila imunizacija kod miševa. Domen katalitičkog jezgra (PCR sensni prajmer GCG CGC GCT AGC TGC CCA GCG GAT GCT GTG TAC CTG GAC, anti-sensni GCG CGC AAG CTT CAT CCC TGT CTC CTC CTT CTC GGC CAG) je bio kloniran u ekspresioni vektor pET21a(+) i izračunat je kao nerastvorljiva inkluziona tela u E. coli soju BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL (Agilent Technologies). Ukratko, 50 μl kompetentnih BL21 (DE3) pLysS ćelija je bilo transformisano sa 1 μl ekspresionog plazmida (30 ng/μl) i zasejano je na LB agar ploče koje su sadržale selektivne antibiotike (100 μg/ml ampicilina, 34 μg/ml hloramfenikola) i 1 % glukoze i inkubirano je preko noći na 37°C. Samo jedna kolonija je uzeta da bi onda bilo zasejano 10 ml svežeg LB medijuma koji je sadržao 100 μg/ml ampicilina, 34 μg/ml hloramfenikola i 1 % glukoze u inkubatoru sa mućkanjem na 37 °C i sa 200 rpm. Posle rasta preko noći, kulture su bile prenete u 100 ml 2xYT medijuma sa 1% glukoze i gajeno je do OD600nmod 0.8 i zatim je preneto u 1L 2xYT medijuma sve dok OD600nmnije ponovo dostigao 0.8. Posle 4 sata indukcije pod 1mM IPTG da bi se stimulisala ekspresija, izvršeno je peletiranje, pa su bakterije bile lizirane dejstvom ultrazvuka u puferu A (10 mM Tris; 1 mM EDTA; 10 mM DTT; 1 mM PMSF; 0.5 mg/ml tableta inhibitora lizozim proteaze (Roche), pH 8.0). Inkluziona tela su bila sakupljena centrifugiranjem na 40,000 x g i isprana su tri puta u puferu za ispiranje B (50 mM Tris; 1 mM EDTA; 10 mM DTT; 2% natrijum deoksiholat, pH 8.0) pre finalnog ispiranja sa dejonizovanom vodom.

[0287] Inkluziona tela su bila rastvorena u 3.5ml pufera za ponovno rastvaranje (40 mM Tris-HCI, 8 M urea, i 10 mM DTT pH12) i ponovo su savijana u toku perioda od 16 sati u puferu za ponovno savijanje (40 mM Tris HCl; 150 mM NaCl; 20% glicerol; 5 mM cistein;0.5 mM cistin pH 8) na 4°C u mraku.

[0288] Ponovo rastvorena inkluziona tela su bila stavljena na kolonu sa niklom od 1ml. Ukratko, kolona je bila prethodno uravnotežena sa puferom za vezivanje (40 mM Tris; 300 mM NaCl; 10 mM imidazola), pa su naneta inkluziona tela. Kolona je bila intenzivno ispirana (40 mM Tris; 300 mM NaCl; 30 mM imidazola). Rekombinantni protein je bio eluiran sa puferom sa visokom koncentracijom imidazola (40 mM Tris; 300 mM NaCl; 300 mM imidazola). Eluirane frakcije koje su sadržale protein su bile sakupljene i dijalizirane su preko noći prema podesnom puferu (40 mM Tris; 300 mM NaCl pH 8). Protein je bio ispiran korišćenjem Bredfordovog proteinskog testa.

HepG2 ćelijske kulture & lizati

[0289] HepG2 ćelije su bile pribavljene ljubaznošću Richard Ross-a (Univerzitet u Šefildu). Ćelije su bile rutinski gajene na 37°C u 95 % ovlaženoj atmosferi sa 5 % CO2u DMEM/4.5g po litru glukoze kojoj je bilo dodato 10 % fetusnog telećeg seruma (FCS), 100 IU penicilina i 100 μg/ml streptomicina, 2 mM I-glutamina (sve GIBCO). Dva miliona ćelija je bilo zasejano u šolje od 10cm, pa je gajeno 48 sati. Ćelije su bile lizirane u 250 μl STE pufera (0.32M saharoze, 5mM Tris, 1 mM EDTA koji je sadržao inhibitore proteaze fenilmetilsulfonil fluorid (1 mM), benzamidin (5 mM), i leupeptin (10 μg/ml) i izložene su dejstvu ultrazvuka na ledu da bi se dobio ćelijski lizat koji je mogao da se upotrebi u testiranju TG2 aktivnosti.

Humane bubrežne 2 (HK2) ćelije:

[0290] HK-2 ćelije (bubrežni proksimalni tubularni epitel) su bile kupljene od European cell culture collection sa propuštanjem 3. Ćelije su bile rutinski gajene na 37°C u 95 % ovlaženoj atmosferi sa 5 % CO2u keratinocitnom medijumu bez seruma (KSFM, Gibco 17005-042) sa L-glutaminom kome su bili dodati rekombinantni EGF (0.1-0.2ng/ml) i goveđi hipofizni ekstrakt (20-30ug/ml). Za propuštanje je medijum bio odstranjen, pa je ispran jednom sa 1 x PBS pre tripsinizacije sa 1ml 0.25% tripsina/EDTA (T75 balon) 1 minut na 37°C. Ćelije su bile ponovo suspendovane u 10 ml KSFM i centrifugirane su sa 400g 1 minut. Medijum je bio odstranjen, pa su ćelije bile zasejane u KSFM (1:3 do 1:5 podela je normalna). Ćelije su bile upotrebljene eksperimentalno sa propuštanjima 5-14. Ćelije su obično dobro rasle do 95% konfluencije.

Coomassie bojenje i vestern bloting

[0291] Čistoća rekombinantnih proteina je bila proverena propuštanjem 5 μg rekuperisanog proteina na 10% (w/v) poliakrilamidnom denaturišućem gelu i bojenjem sa Coomassie Brilliant Blue R rastvorom za bojenje (Sigma).

[0292] Potvrda sinteze jezgra TG2proteina, kao i nivoi reaktivnosti TG2 i jezgra TG2 posle imunizacije su bili izmereni pomoću vestern blotiranja. Rekombinantni proteini (10 do 80 ng) su bili stavljeni na 10 % (w/v) poliakrilamidni denaturišući ili nedenaturišući gel po potrebi i preneti su na PVDF membrane (Transblot SD, Biorad, UK) tokom jednog sata na 100 V. Membrane su bile blokirane preko noći na 4°C sa 3 % (w/v) BSA u TBS/0.1% (v/v) Tween 20. Membrane su onda bile isprane i testirane sa monoklonskim mišjim anti-transglutaminaznim antitelima u TBS/Tween-u koji je sadržao 1 % BSA.

[0293] Za dokazivanje rekombinantnog jezgra TG2 proteina i kao pozitivna kontrola za antitelo je bio upotrebljen skrining komercijalnog antitela Cub7402 (neomarkeri) sa razređenjem od 1:1000. Vezivanje primarnog antitela je bilo detektovano sa antimišjim gama-lancem-HRP povezanim sekundarnim antitelom (Sigma, Poole, UK). Stupci su bili vizualizovani uz korišćenje ECL hemiluminescentnog detekcionog sistema (Amersham, UK).

Imunizacija miševa i fuzija

[0294] Svaki miš je bio imunizovan sa smešom od 50 μg antigena (dopunjenog do zapremine od 50 μl sa sterilnim PBS) i 50 μl kompletnog Frojndovog adjuvansa. Četiri (8-12 nedelja stara) BALB/C miša su primila injekcije. Dve dodatne imunizacije su bile izvršene (dan 14 i dan 35) uz korišćenje iste procedure, sa izuzetkom što je za ove injekcije bio korišćen nekompletni Frojndov adjuvans. Na dan 45, bila je uzeta krv za testiranje od svih životinja i ispitana je u pogledu reaktivnosti na TG2 pomoću ELISE.

[0295] Dve životinje koje su najbolje reagovale su dalje dobile dalje pojačanje injekcijom od 100 μg proteina jezgra (u PBS) ponovo pomešanog sa nekompletnim Frojndovim adjuvansom posle 10 nedelja, a 4 dana kasnije životinje su bile usmrćene radi uzimanja splenocita i fuzije sa Sp2/0-Ag-14 mijeloma ćelijama. Od ove fuzije, približno 1000 bunarčića je bilo podvrgnuto skriningu u pogledu reaktivnosti na TG2 protein pomoću ELISE.

Skrining TG2 specifičnosti

[0296] Kondicionirani medijum ili prečišćeni IgG su bili testirani u pogledu reaktivnosti na članove familije transglutaminaza. Sposobnost svakog od njih da se vezuje za svaku transglutaminazu (TG1, TG2, TG3, TG5, TG7 i Faktor XIIIa; svi Zedira) je bila određena korišćenjem testa vezivanja za ploču. Mikrotitarske ploče (Costar, Kembridž, UK) su bile obložene rekombinantnim TG (Zedira, Darmštat, Nemačka) u 50 μl 0.1 M bikarbonatnog/karbonatnog pufera (pH 9.6) preko noći na 4°C. Ploče su bile blokirane 2 h na 37°C sa 200 μl PBS koji je sadržao 3 % w/v BSA. Ploče su bile isprane tri puta sa PBS koji je sadržao 0.05 % Tween 20 (pufer za ispiranje) i 100 μl razređenog kondicioniranog medijuma (razređenje 1:5 do 1:20) ili je bilo dodato prečišćeno anti-TG2 katalitičko jezgro mAbs. Ploče su bile inkubirane još 1 h na sobnoj temperaturi. Korak ispiranja je bio ponovljen, pa je bila dodavana anti-mišja gama lanac-ren peroksidaza (1:5000) u PBS koja je sadržala 0.05 % Tween 20 (v:v) i 1 % BSA (w:v) (Sigma, Poole UK) 1 h. Posle osam ispiranja, vezivanje je bilo otkriveno sa 50 μl 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidinskog supstrata. Reakcija je bila zaustavljena dodavanjem 25 μl 0.1 M H2SO4i bila je određena apsorbansa na 450.

Skrining TG2 inhibicije

1

[0297] TG aktivnost je bila izmerena pomoću inkorporiranja<3>H-putrescine zavisnog od Ca<2+>u N’,N’-dimetilkazein. Rekombinantni humani TG2 (100 ng) je bio prethodno inkubiran dvadeset minuta na sobnoj temperaturi sa testiranim uzorkom (kondicionirani medijum ili prečišćeni IgG) pre početka reakcije. Dvadeset pet μl reakcione smeše (5 μl 25 mM CaCl2, 5 μl 40 mM ditiotreitola, 5 μl<3>H-putrescinske smeše, i 10 μl 25 mg/ml N,N’ dimetilkazeina (zamena 25 mM CaCl2sa 100 mM EDTA za neenzimsku kontrolu) je bilo dodato da bi reakcija počela, pa su uzorci inkubirani na 37°C do 1 sat. Alikvoti od 10 μl su bili tačkasto stavljeni na traku od 3 MM Whatman filterskog papira i odmah uronjeni u ledeno hladnu 10 % trihlorosirćetnu kiselinu (TCA) da bi se istaložili unakrsno-umreženi proteini obično u trenucima 0, 10, 30 i 60 minuta od početka reakcije. Posle tri obimna ispiranja u ledeno hladnom 5 % TCA, praćenim sa 3 ispiranja sa ledeno hladnim 95 % etanolom, filter osušen na vazduhu je bio izmeren u 2 ml scintilacionog fluida (Ultima Gold Packard, Perkin Elmer). Bila je izračunata brzina reakcije. 1 TG jedinica je ekvivalentna inkorporiranju 1 nmol putrescina po satu na 37°C.

[0298] Isti protokol je bio upotrebljen za određivanje TG inhibicije u ćelijskim lizatima zamenom 25 μl rekombinantnog proteina sa 25 μl ćelijskog lizata.

Kloniranje hibridoma & prečišćavanje antitela iz kondicioniranog medijuma

[0299] Izolacija monoklonskih antitela je bila izvedena iz kloniranih inhibitornih hibridoma. Inicijalno identifikovani hibridoma bunarčići su bili dvostruko klonirani procesom ograničenog razređivanja (da bi se obezbedila stabilnost i klonabilnost) u skladu sa uobičajenim metodama (Loirat MJ et al, 1992) sa sub-klonovima testiranim kao što je opisano za skrininge pomoću ELISE i aktivnost. Selektovana antitela koja su proizvodila klonove su bila ekspandovana u balonima od 25 i 75 cm<2>i dodat im je medijum bez seruma (Hyclone, Fisher Scientific, Loughborough, UK). Pošto su ćelije bile ekspandovane, kondicionirani medijum je bio sakupljen radi IgG prečišćavanja korišćenjem afinitetne hromatografije na protein G koloni (Amersham Life Sciences). Kondicionirani medijum je bio razređen u jednakoj zapremini od 10 mM natrijum fosfata, pH 7.25, i nanet je na protein G kolonu sa protokom od 1.0 do 2.0 ml/min. Kolona je bila ekstenzivno ispirana sa 10 zapremina kolone istog pufera. Vezano antitelo je bilo eluirano u glicinskom rastvoru (0.1 M; pH 2.7) i neutralizovano je sa 0.15% zapremina 1M Tris / HCI pH 9. Uzorci su bili dijalizirani protiv 1000 zapremina fosfatnog puferskog slanog rastvora tokom 24 sata sa 2 promene pufera.

Mapiranje epitopa antitela prikazivanjem faga

[0300] Kodirajuća sekvenca humanog TG2 cele dužine je bila amplifikovana pomoću polimerazne lančane reakcije uz korišćenje sledećih prajmera; TG2-FL-1 5’

2

ATGGCCGAGGAGCTGGTCTTAGAGA 3’ i TG2-FL-2 5’ GGCGGGGCCAATGATGACATTCCGGA 3’. Približno 2 kb proizvoda amplifikacije je bilo prečišćeno uz korišćenje Quiagen PCR cleanup kita (Qiagen) i digestirano je u slučajne fragmente uz korišćenje RQ DNAse I (Promega). RQ DNAse reakcija je bila tretirana sa Klenow fragmentom DNK polimeraze I i T4 DNK polimeraze da bi se generisali fragmenti sa otvorenim krajevima. Ovi su bili prečišćeni pomoću gel elektroforeze, a fragmenti u opsegu od 50-150 bp su bili ekstrahovani uz korišćenje Qiagen gel recovery kita (Qiagen, Crawley UK).

[0301] Vektor za prikazivanje faga je bio digestiran sa EcoRV, pa je bio tretiran sa alkalnom fosfatazom i prečišćen je pomoću gel elektroforeze i Qiagen gel recovery kita. 100 ng prečišćenog vektora je bilo ligatirano za 15 ng pripremljenih otvorenih fragmenata humanog TG2 kDNK. Rezultujuća ligacija je bila elektroporirana u XL1-Blue elektrokompetentnim ćelijama (Agilent Technologies), a biblioteka fragmenata je bila sačuvana pomoću VCSM13 pomoćničkog faga (Agilent). Čestice faga su bile istaložene sa 2 % glukoze i 4 % PEG 6000 i ponovo su suspendovane u PBS 0.1 % Tween 20 (v:v) 1 % BSA (w:v).

[0302] Mapiranje epitopa je bilo izvršeno korišćenjem sledeće procedure. ELISA bunarčići su bili obloženi preko noći na 4 °C sa 30 μg monoklonskog antitela u 100 ml pufera za oblaganje. Obloženi bunarčić je bio ispran sa PBS/Tween i onda je blokiran sa 400 μl 3 % BSA u PBS (w:v) 1 h na sobnoj temperaturi. Približno 10<10>čestica faga (100 μl) je bilo dodatu u blokirani bunarčić i inkubirano je na sobnoj temperaturi 1 h. Bunarčić je bio ispran 8 puta sa 400 μl PBS/0.5 % Tween (v:v) i prionuli fag je eluiran sa 0.2 M glicina pH 2.2. Eluirani fazi su bili upotrebljeni za inficiranje 1 ml XL1-Blue host-a, a uzorci su bili zasejani na LB agar (60 μg/ml ampicilin, 15 μg/ml tetraciklin), preostali domaćin je bio dopunjen do 100 ml LB medijumom (60 μg/ml ampicilina, 15 μg/ml tetraciklina) i gajeno je preko noći na 37°C u inkubatoru sa mućkanjem na 200 rpm da bi se generisala obogaćena biblioteka izabranih fragmenata. Ovaj proces obogaćivanja je bio ponovljen 5 puta, a slučajne kolonije iz finalnog kruga su bile izabrane za sekvenciranje.

Određivanje sekvence VL regiona antitela

Prajmeri

[0303] Sensni prajmeri teškog lanca - Par visoko degenerativnih FR1 prajmera, MH1 i MH2 (Wang et al 2000), bio je kombinovan sa prajmerima 3 konstantnog regiona da bi se amplifikovali VH geni.

MH1 5’ CGCGCGCTCGAGSARGTNMAGCTGSAGTC 3’

MH2 5’CGCGCGCTCGAGSARGTNMAGCTGSAGSAGTC 3’

Mišji -G15’ AGGCGCAGTACTACAATCCCTGGGCACAATTTTCTTGTCCACC 3’ Mišji-G2a 5’ AGGCGCAGTACTACAGGGCTTGATTGTGGGCCCTCTGGG 3’

Mišji -G2b 5’ AGGCGCAGTACTACAGGGGTTGATTGTTGAAATGGGCCCG 3’

Kapa prajmeri

[0304]

VK1 5’ CGCTGCGAGCTCGATATTGTGATGACBCAGDC 3’

VK2 5’ CGCTGCGAGCTCGAGRTTKTGATGACCCARAC 3’

VK3 5’ CGCTGCGAGCTCGAAAATGTGCTCACCCAGTC 3’

VK4 5’ CGCTGCGAGCTCGAYATTGTGATGACACAGTC 3’

VK5 5’ CGCTGCGAGCTCGACATCCAGATGACACAGAC 3’

VK6 5’ CGCTGCGAGCTCGAYATTGTGCTSACYCARTC 3’

VK7 5’ CGCTGCGAGCTCGACATCCAGATGACYCARTC 3’

VK8 5’ CGCTGCGAGCTCCAAATTGTTCTCACCCAGTC 3’

K-CONST 5’ GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA 3’

[0305] Ukupna RNK je bila ekstrahovana iz monoklonskih hibridoma ćelija (~ 10<5>ćelija) korišćenjem Trizola (GIBCO) u skladu sa protokolom proizvođača i kvantifikovana je sa A260nm. kDNK je bila sintetizovana uz korišćenje ImProm II reverzne transkriptaze (Promega) i slučajnih heksamernih prajmera. Reakciona smeša je bila kao što sledi; 1 μg ukupne RNK, 0.1 μg oligo (dN)6, 12 μl ImProm II pufera, 1 μl 10 mM dNTPs (Promega), 8 μl 25 mM MgCl2, 4 μl ImProm II reverzne transkriptaze (Promega), DEPC tretirana H2O do ukupne reakcione zapremine od 60 μl. RNK i smeša slučajnih prajmera je bila zagrevana na 70 °C 10 min, a onda je stavljena na led. Bile su dodate preostale reakcione komponente, a zatim su inkubirane na 20 °C 10 min, pa onda na 40 °C sledećih 40 min.

[0306] Amplifikacija VH i VK gena je bila izvedena sa GoTaq polimerazom (Promega). Svakih 50 μl reakcije je sadržalo sledeće; kDNK 2 μl, 20 pmol sensnih i antisensnih prajmera, 10 μl GoTaq reakcionog pufera, 1 μl 10 mM dNTPs, 5 μl 25 mM MgCl2, 2.5 u GoTaq polimeraze, H2O do finalne zapremine od 50 μl. Reakcije su bile ciklizovane 35 puta uz korišćenje sledećih uslova: inicijalna denaturacija na 95 °C 2 min; denaturacija na 94 °C 1 min, anelacija na 56 °C 1 min, ekstenzija 72 °C 1 min. PCR proizvodi su bili analizirani gel elektroforezom, pa su klonirani korišćenjem TOPO TA kita za kloniranje (Invitrogen). Za sekvenciranje su bili izabrani slučajni miniprepovi teškog i lakog lanca PCR proizvoda.

Merenje ekstracelularne TG aktivnosti

4

[0307] Ekstracelularna TG aktivnost je bila izmerena modifikovanom ćelijskom ELISOM. HK-2 epitelne ćelije su bile sakupljene uz korišćenje 0.1M EDTA ili 0.25% tripsina/EDTA i zasejane su sa gustinom od 81X0<4>ćelija/bunarčiću u medijumu bez seruma u ploču sa 96 bunarčića koja je bila preko noći obložena sa 100 μl/bunarčiću fibronektina (5 μg/ml u 50 mM Tris-HCl pH 7.4) (Sigma, Poole UK). Ćelijama je bilo dozvoljeno da se pričvrste tokom 2.5 h na 37 °C u prisustvu 0.1 mM biotin kadaverina [N-(5 amino pentil biotinamid) trifluorosirćetna kiselina] (Molecular Probes, Eugene OR, USA). Ploče su bile isprane dva puta sa 3 mM EDTA/PBS i ćelije su bile odstranjene sa 0.1% (w/v) deoksiholata u 5 mM EDTA/PBS. Supernatant je bio sakupljen i upotrebljen za određivanje proteina. Ploče su bile isprane sa 50mMTris- HCI, a inkorporirani biotin kadaverin je otkriven korišćenjem 1:5000 ekstravidina HRP (Sigma, Poole, UK) tokom 1 h na sobnoj temperaturi, što je bilo praćeno pomoću TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin) supstrata. Reakcija je bila zaustavljena sa 50 μl 2.5 M H2SO4, a apsorbansa je bila očitana na 450 nm.

Merenje nivoa kolagena radioobeležavanjem

[0308] Ćelije su bile zasejane sa gustinom od 3.75X10<1>/10 cm<2>u Petrijevu šolju ili 1X10<6>/bunarčiću u ploču sa 6 bunarčića. ECM kolagen je bio određen obeležavanjem sa 20 iCi<3,4>H prolina (1.0 mCi/ml, ICN). Obeležavanje je bilo izvedeno u toku 72 h pod standardnim uslovima za kultivaciju ćelija. Posle obeležavanja, medijum je bio odstranjen, pa su ćelije bile isprane sa PBS i odstranjene su sa 2 ml 0.25 M amonijum hidroksida u 50 mM Tris pH 7.4 na 37 °C tokom 10 min. Rastvorljiva frakcija je bila sakupljena, pa je određena koncentracija proteina korišćenjem testa sa bicinhoninskom kiselinom (BCA). Šolje su bile ekstenzivno ispirane sa rastućim zapreminama PBS pre nego što je ECM bio rastvoren sa 2 ml 2.5% (w/v) SDS u 50 mM Tris pH 6.8. Šolja je bila ostrugana da bi se obezbedilo potpuno uklanjanje ECM i 200 il je bilo izmereno za radioaktivnost u brojaču beta scintilacije. Brojanja su bila korigovana po mg rastvorenog ćelijskog proteina i izražena su kao procenat srednje vrednosti kontrole.

Generisanje rekombinantno ratifikovanog Quark IgG

[0309] Za eksperimentalne svrhe je bilo generisano humano-pacovsko himerično antitelo od sekvence ’humanog’ jednolančanog Fv antitela protiv humane transglutaminaze tipa-II. Antitelo je nazvano QPCDTGII (skraćeno na QCT), a sekvence varijabilnih regiona se mogu naći u WO 2006/100679A2.

[0310] Pacovska γ2a potklasa je bila izabrana za konstantne regione teškog lanca, uklanjanjem mesta glikozilacije da bi se smanjila šansa za ADCC reakciju kod pacova kao testiranih životinja. Izabrani pacovski konstantni region za teški lanac je bio 013593 (Bruggemann, M. Gene 74: 473-482 (1988); Bruggemann, M.,Free, J.,Diamond, A.,Howard, J.,Cobbold, S. i Waldmann, H. Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 6075-6079 (1986)) iz the Kabat baze podataka (Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., i Foeller, C. Sekvence proteina od imunološkog interesa. (NIH National Technical Information Service, 1991)). Onaj za kapa laki lanac je bio 013718 (Sheppard, H. W. i Gutman, G. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7064-7068 (1981)) iz Kabata.

[0311] Ukratko, kodirajuće sekvence teškog lanca i kapa lanca su bile generisane DNK sintezom (korišćenje kodona je bilo prilagođeno pristrasnosti sisarskog korišćenja kodona).

[0312] Proizvod sinteze gena teškog lanca je bio amplifikovan pomoću PCR korišćenjem prajmera QCT_HindIII i QCT_H_rev. PCR-proizvod je bio isečen sa Hindlll i NgoMIV i ligatiran je u MRCT ekspresioni vektor. Klonovi kompetentnih DH5α bakterija hemijski transformisani pomoću proizvoda ligacije su bili izloženi PCR-skriningu uz korišćenje prajmera HCMVi i pacovskog_gama1. Tri klona koja su generisala PCR proizvod predviđene veličine su bila sekvencirana.

[0313] Proizvod sinteze gena kapa lanca je bio amplifikovan pomoću PCR korišćenjem prajmera QCT_HindIII i QCT_L_rev. PCR-proizvod je bio isečen sa Hindlll i PpuMI i ligatiran je u ekspresioni vektor pKN100. Klonovi kompetentnih DH5α bakterija hemijski transformisani pomoću proizvoda ligacije su bili izloženi PCR-skriningu uz korišćenje prajmera HCMVi i pacovskog_kapa. Bila su sekvencirana tri klona koja su generisala PCR proizvod predviđene veličine.

[0314] Ekspresioni vektor sa dvostrukim insertom koji je kodirao i teški, i kapa lanac bio je generisan i transfektovan je u HEK293T ćelije. Supernatanti ćelijskih kultura od dve HEK293T transfekcije u velikim razmerama su bili sakupljeni i afinitetno prečišćeni na 1ml Protein L-agaroza koloni uz korišćenje ÄKTA Explorer hromatografskog sistema, u skladu sa protokolima proizvođača. Samo jedan OD 280nm pik eluiran je sa IgG Elution Puferom, pa je bio dijaliziran prema dve izmene PBS. Ovo je bilo testirano i sa UV apsorpcijom na 280nm, i pomoću pacovske IgG2aELISE. Ukupan prinos je bio približno 700 μg (pomoću OD280nm); 303.5 μg (pomoću ELISE).

Humanizacija AB1 antitela

Baze podataka humanih VH i VK kDNK

[0315] Sekvence proteina humanih i mišjih imunoglobulina iz International Immunogenetics Database 2009<101>i Kabat baze podataka izdanje 5 Sekvenci proteina od imunološkog interesa (poslednje ažuriranje 17-nov-1999)<102>bile su upotrebljene za kompilaciju baze podataka sa humanim imunoglobulinskim sekvencama u Kabat poravnanju. Naša baza podataka sadrži 10,606 VH i 2,910 VK sekvence.

Molekulski model AB1

[0316] Homologi model varijabilnih regiona mišjeg antitela AB1 je bio izračunat korišćenjem Modeller programa<103>koji je radio u automatskom modu. Atomske koordinate od 1 MQK.pdb, 3LIZ.pdb i 1MQK.pdb su bile strukturne sekvence najveće identičnosti za Interfejs, VL i VH, respektivno, kao što je bilo određeno Blast analizom na bazi podataka Accelrys antibody pdb structures. Ove strukture su bile upotrebljene za generisanje 20 inicijalnih modela, od kojih je najbolji bio doteran modeliranjem svake CDR petlje sa njene 3 najbolje strukture petlje.

Selekcija okvira hAB1

[0317] Program za analizu sekvenci, gibsSR, bio je upotrebljen za pretraživanje baza podataka sa humanim VH i VK za AB1 VHc, VKc i VKc<1>proteinske sekvence korišćenjem različitih kriterijuma selekcije. FW ostaci unutar 5Å CDR ostatka (Kabat definicija) u homologom modelu mišjeg antitela AB1 su bili identifikovani i označeni su kao "5Å bliski" ostaci.

[0318] AF06220 je bio izabran kao FW na kome je baziran inicijalni humanizovani AB1 VHc konstrukt. Tabela 1 prikazuje poravnanje i identitet ostataka AF06220 prema mišjim Ab1. Tabela 2 prikazuje 5Å bliski omotač sekvenci. AF062260 ima samo 1 somatsku mutaciju u odnosu na svoj VH gen germinativne linije Z12347 (Tabela 3).

[0319] AY247656 je bio izabran kao FW na kome je baziran inicijalni humanizovani AB1 VKc konstrukt. Poravnanje i identičnost ostataka u odnosu na mišji AB1 su prikazani u Tabeli 4; Tabela 5 prikazuje 5Å bliski omotač sekvenci. Sekvenca ima 5 somatskih mutacija u odnosu na svoj VK gen germinativne linije X93620 (Tabela 6).

[0320] AF193851 je bio izabran kao FW na kome je baziran inicijalni AB1 VKc<1>konstrukt. Poravnanje i identičnost ostataka u odnosu na mišje AB1 su prikazani u Tabeli 7. Tabela 8 prikazuje 5Å bliski omotač sekvenci. Sekvenca nema somatskih mutacija u odnosu na svoj VK gen germinativne linije J00248 (Tabela 9).

ELISA za vezivanje

[0321] HEK 293F ćelije su bile ko-transfektovane sa kombinacijama različitih vektora sa humanizovanim lakim lancem zajedno sa vektorima sa različitim humanizovanim teškim lancem. Rekombinantni humani TG2 je bio upotrebljen za merenje vezivanja antitela pomoću ELISE. Rezultati su pokazali da je RHA verzija teškog lanca (Tabela 10), u kombinaciji sa RKE i RKJ verzijama lakog lanca (Tabela 11) (predstavljaju različite verzije humanizovanog lakog lanca) pokazala optimalno vezivanje (Slika 16).

[0322] RHA verzija teškog lanca je nemodifikovani graft mišjih CDR regiona AB1 antitela na humanoj donorskoj sekvenci. Međutim, obe verzije lakog lanca, RKE i RKJ, imaju istu samo jednu povratnu mutaciju koja se nalazi u 5Å blizini, F72 (Kabat numeracija - prikazana zeleno). Ova povratna mutacija leži izvan Vernijeovih<4>, Kanonskih<5>ili Interfejs<6>ostataka (vidi Tabelu 11).

101. Lefranc,M.P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database(R). Nucleic Acids Res. 31, 307-310 (2003).

102. Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H.M., Gottesman,K.S. & Foeller,C. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH National Technical Information Service, (1991).

103. Eswar,N. et al. Comparative protein structure modeling using Modeller. Curr. Protoc. Bioinformatics. Chapter 5:Unit 5.6., Unit (2006).

104. Foote, J. & Winter, G. (1992). Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J Mol. Biol.224, 487-499.

105. Morea, V., Lesk, A. M. & Tramontano, A. (2000). Antibody modeling: implications for engineering and design. Methods 20, 267-279.

106.Chothia, C., Novotny, J., Bruccoleri, R. & Karplus, M. (1985). Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains. J Mol. Biol.186, 651-663.

TABELE

[0323]

�

REZULTATI

Generisanje jezgra rh TG2 proteina.

[0324] Da bi se podstaklo generisanje antitela za koja bi bilo verovatnije da ciljaju epitope koji su kritični za TG2 aktivnost, umesto na korisna mesta na TG2 molekulu, imunizovali smo miševe sa TG2 katalitičkim jezgrom umesto sa TG2 molekulom cele dužine. Da bi se generisao rekombinantni TG2 domen, bio je generisan PCR konstrukt koji se pružao od baza 329 do 1419 i umetnut je u Pet21+(a) vektor (Slika 1A). Insercija i ekspresija ovog vektora u BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL bakteriju rezultovala je generisanjem nerastvorljivog proteina koji je obuhvatao aminokiseline 143 do 473 koje obuhvataju celo katalitičko jezgro. Ovaj protein je bio rastvoren, pa je ponovo savijen u 40 mM Tris HCl; 150 mM NaCl; 20 % glicerola; 5 mM cisteina; 0.5 mM cistina pH 8.10 ng ovoga je bilo pušteno na neredukujući poliakrilamidni gel, vestern blotirano je i imunotestirano sa CUB7402. Jasan stubac je bio vidljiv na 37 kDa, što je konzistentno sa predviđenom veličinom jezgra TG2 (Slika 1B). Veći stupci su takođe bili imunoreaktivni sa CUB7402, a najverovatnije predstavljaju agregate proteinskog jezgra koji nisu bili prisutni kada je bio pušten redukujući gel (podaci nisu prikazani).

Imunizacija i fuzija.

[0325] Četiri miša su bila imunizovana sa 50 mg jezgra rhTG2. Približno pet i devet nedelja posle imunizacije, bio je uzet uzorak seruma od svakog miša i testiran je u pogledu reaktivnosti protiv rh TG2 pomoću ELISE uz korišćenje nekoliko serijskih razređenja seruma. Svi miševi su ispoljili jaku imunu reakciju na jezgro rhTG2, čak i kada je bilo upotrebljeno najveće razređenje (1: 51000) (Slika 2A). Da bi se potvrdilo da bi antitela takođe prepoznala TG2 cele dužine, rhTG2 i rhTG2 protein jezgra su bili pušteni na nedenaturišući gel, pa su vestern blotirani i imunotestirani sa 1 u 1000 razređenjem mišjeg seruma (Slika 2B). Miševi sa najjačom reaktivnosti (miš C) protiv oba proteina su dobili pojačanje, a splenociti su rekuperisani za fuziju korišćenjem hibridoma servisa Univerziteta u Šefildu, Bioserv.

Selekcija pozitivnih hibridoma i kloniranje.

[0326] Od 400 hibridoma bunarčića izabranih od strane Bioserv-a kao najviše pozitivnih, supernatanti iz 109 su ispoljili istrajnu reaktivnost na TG2, međutim, samo 34 nije reagovalo sa drugim ključnim članovima familije TG kada su bili testirani u ELISI (reprezentativni primeri su prikazani na Slici 3A). Od onih koji su bili specifični za TG2 supernatant je podvrgnut skriningu pomoću testa inkorporiranja<3>H-putrescina u pogledu sposobnosti da inhibiraju TG2 aktivnost koja je rezultovala od 100 ng TG2 (Slika 4). Ovaj inicijalni skrining je ukazao da je 10 hibridoma supernatanata bilo sposobno za inhibiranje TG2 aktivnosti (AB1; DC1; BB7; EH6; DH2; DD9; JE12; AG9; AH3; DF4). Devet od deset je bilo uspešno klonirano ograničenim razređivanjem. Za klon DF4, mada su posle kloniranja bili izolovani klonovi, izgleda da oni nisu bili inhibitorni. Posle kloniranja, bio je prečišćen IgG od svakog kloniranog hibridoma i ponovo je testiran u pogledu selektivne reaktivnosti na TG2 (Slika 3B).

TG2 inhibitorni potencijal.

[0327] Za svaki klonirani hibridom je testiran njegov IgG u pogledu TG2 inhibitorne aktivnosti protiv humanog, pacovskog i mišjeg TG2 i izračunat je IC50na osnovu količine IgG potrebne za inhibiranje 1 ng TG2. Postojao je približno 12-struki opseg IC50vrednosti protiv humanog TG2 u rasponu od najefektivnijeg AB-1 sa 1.1x10<-5>mg/ml IgG do najmanje efektivnog JE12 sa 12.3 1.1x10<-5>mg/ml IgG (Slika 9; Tabela 1). Interesantno je da smo bili u stanju da odredimo IC50samo za 4 antitela (DH2, DD9, EH6 i BB7) protiv pacovskog TG2 sa najboljim, DH2 koji je imao IC50od 2.23 x 10<-4>mg/ml IgG, što je otprilike 6-struko manje aktivno od onog protiv humanog TG2 i uporedivo 38-struko manje aktivno od najboljeg AB-1 inhibitora protiv TG2 (Slika 9; Tabela 1). Nijedno od inhibitornih antitela nije bilo u stanju da inhibira mišje TG2, verovatno zbog imune tolerancije.

Mapiranje epitopa inhibitornog antitela

[0328] Da bi se utvrdilo koji epitopi u TG2 su bili imunološki jedinstveni za TG2, pri čemu su inhibitorni, kao i da bi se utvrdilo da li je ovih 10 antitela bilo usmereno na ista ili različita mesta, svako antitelo je bilo mapirano korišćenjem prikazavanja faga. Biblioteka TG2 faga je bila konstruisana i selekcionisana je protiv svakog mAb. Epitop je onda bio određen konsenzusnim sekvenciranjem vezujućih faga.

[0329] Izgleda da se AB1, AG1, AH1, BB7, DC1, EH6 i JE12 svi vezuju u celini ili delimično za samo jedan epitop (Slika 5) koji obuhvata aminokiseline 304 do 326 i izgleda da se nalazi ispred aktivnog mesta unutar džepa za vezivanje supstrata (Slika 6). Ovaj region smo nazvali AB-1 mesto, a antitela koja ciljaju ovo mesto smo nazvali Grupa 1 antitela.

[0330] DF4 je jedini ciljao sekvencu koja se pruža od aminokiseline 351 do 365 (Slika 5) koja se pruža od prednje do zadnje strane jezgra obuhvatajući Asp 358 u katalitičkoj trijadi (Slika 6). Ovo smo nazvali Grupa 2.

[0331] DH2 i DD9 su se vezivali za sekvencu koja obuhvata aminokiseline 450 do 467 (Slika 5). Ova Grupa 3 antitela se vezuje za region na zadnjoj strani jezgra u blizini spoja sa β bačvom-1,

1

koji smo nazvali DH2 mesto. Epitop obuhvata pretpostavljeno mesto vezivanja kalcijuma (Slika 6).

Sekvenciranje antitela

[0332] Da bismo odredili sekvencu varijabilnog lakog lanca za svako antitelo, bila je ekstrahovana RNK iz svakog inhibitornog hibridoma, reverzno je transkribovana, te je amplifikovana pomoću PCR korišćenjem para visoko degenerativnih FR1 prajmera, MH1 i MH2 prajmera kombinovanih sa prajmerima 3 konstantnog regiona da bi se amplifikovali VH geni.

[0333] Rezultujuće VH i VK sekvence su prikazane na Slici 7 za AB1.

Sposobnost AB1 da inhibira TG2 aktivnost u proteinskoj smeši in vitro.

[0334] Najpotentnije inhibitorno antitelo protiv rekombinantnog TG2 je AB1. Da bi bilo terapeutski vredno, ono mora da bude sposobno ne samo da inhibira TG2 aktivnost u čistom rastvoru, već takođe i u kompleksnom proteinskom rastvoru i da se ni na koji način ne povezuje sa drugim proteinima. Da bi se ovo testiralo, bio je pripremljen homogenat humane hepatocitne ćelijske linije HepG2. Primena 0.5 μg AB1 je bila u stanju da inhibira 70 % TG2 aktivnosti (Slika 8A). Međutim, BB7 je proizvelo znatno bolju inhibiciju inaktivirajući 90 % TG2 aktivnosti. Imunotestiranjem 25 μg ovog lizata sa AB1 nije otkriveno nikakvo vanciljno povezivanje sa samo jednim imunoreaktivnim stupcem za veličinu koji je odgovarao TG2 (Slika 8B).

Sposobnost AB1 i DC1 da inhibiraju ekstracelularnu TG2 aktivnost.

[0335] Da bi se utvrdilo da li bi ova antitela mogla da inhibiraju TG2 aktivnost u ćelijskom sistemu. AB1 (Slika 10a) i DC1 (Slika 10b) su bili primenjeni na humane bubrežne 2 (HK-2) tubularne epitelne ćelije u kulturi i ekstracelularna TG aktivnost je ispitana korišćenjem testa sa biotin kadaverinom. AB1 je bio u stanju da ostvari 60% inhibicije, a DC1 55% inhibicije aktivnosti kada je bio primenjen sa 4ng/ul u medijumu za kulture što je bilo uporedivo sa hemijskim pan TG inhibitorom 1,3-dimetil-2-[(2-okso-propil)tio]imidazolijum hloridom primenjenim sa 400uM.

Poređenje antitela AB1 sa drugim poznatim inhibitornim antitelima

[0336] Da bi se testirala efektivnost AB1 u poređenju sa drugim poznatim TG2 inhibitornim antitelima, bili su testirani fab fragmenti (Slike 11,12) i ceo IgG (Slike 13, 14) antitela kao što je opisano od strane Quark biotechnology u prijavi patenta broj WO2006/100679 u pogledu

2

inhibicije TG2 aktivnosti u testu inkorporiranja<3>H Putrescina. Aktivnost 100ng humanog TG2 je mogla biti inhibirana za 60 do 80% pomoću 500ng AB1. Radi poređenja, ni fab fragment, ni ceo IgG Quark antitela nije mogao da značajno inhibira TG2 u ovom testu.

Diskusija

[0337] Postoji jasna potreba da se validira TG2 kao terapeutski cilj kod čoveka u vezi niza bolesti kod kojih su eksperimentalne studije sugerisale njegovu uključenost. One obuhvataju stvaranje ožiljaka na tkivu, celijačnu bolest, neurodegenerativne bolesti i hemo-rezistenciju kod nekih kancera. Ograničavajuće za ovo je bilo nedostatak jedinjenja koja su stvarno specifična za TG2, a koja mogu selektivno inhibirati TG2 aktivnost kod čoveka.

[0338] U ovoj studiji smo po prvi put imunizovali miševe sa fragmentom TG2 sa ciljem da budemo u mogućnosti da izolujemo širi spektar anti TG2 antitela protiv katalitičkog jezgra enzima u potrazi za inhibitornim epitopom. Ovo je pobudilo dobru imunu reakciju sa antitelima koja prepoznaju i jezgro rhTG2 i prirodni TG2, ali ne i drugi TG.

[0339] 10 od izolovanih antitela je ispoljilo inhibitornu aktivnost. Ona su zatim bila mapirana na 3 TG2 specifična, ali još uvek inhibitorna epitopa. Ova antitela su klonirana, pa su sekvencirana i izračunate su IC50vrednosti za izolovani IgG. Tri antitela (AB1, DC1 i BB7) koja ciljaju džep za supstrat pokazala su se kao posebno efektivni inhibitori. Najvažnije je da su ova antitela takođe dobro delovala i u ćelijskom lizatu, i u ćelijskoj kulturi, što ukazuje da ova antitela imaju potencijal da funkcionišu u okruženju bogatom proteinima, što je kritično za primenu in vivo.

[0340] Verujemo da je ključni element u uspešnom generisanju ovih inhibitornih antitela bila odluka da se izvrši imunizacija samo sa proteinskim jezgrom. Prema našem saznanju nijedno od komercijalnih TG2 antitela nema inhibitorni potencijal od značaja. Naši sopstveni pokušaji da se upotrebi TG2 cele dužine rezultovali su velikim brojem antitela, od kojih je mali broj bio specifičan za TG2, a nijedno nije bilo inhibitorno. Izgleda da je ovo zbog jasne imunogene preferencije prema proteinskim petljama unutar TG2 cele dužine, od kojih mnoge padaju na zadnju stranu katalitičkog jezgra na sličnim pozicijama u odnosu na najšire korišćeno anti TG2 antitelo, CUB7402 (aa447 aa478).

[0341] Iznenađujuće je da je naš pristup doveo do proizvodnje mnogo efektivnih antitela. Bez želje za vezivanjem za bilo koju teoriju, mi mislimo da se jednostavnim odgajanjem antitela za manji protein koji pokriva samo centralno jezgro, ne samo eliminišu neki od željenih imunoloških epitopa, već da se takođe vrši prisilno ciljanje jezgra. Ovo samo povećava raznovrsnost antitela koja se nalaze na raspolaganju za selekciju i shodno tome šire pokrivanje jezgra. Međutim, imunizacija samo sa jezgrom znači da je izgubljeno mnogo od savijanja jezgra, a shodno tome, i neki od epitopa koji su možda manje raspoloživi unutar celog TG2 molekula mogu biti atraktivniji epitopi sa jezgrom u ovom formatu. Imajući u vidu da je svih 10 antitela prepoznalo linearne epitope (tj. vezane za TG2 na redukujućem gelu), dok je 80 % antitela koja smo prethodno izolovali korišćenjem TG2 cele dužine kao imunogena bilo konformaciono zavisno, to sugeriše da ovo može biti glavni faktor.

[0342] Bilo je ranijih drugih studija koje su anticipirale ideju o TG2 inhibitornom antitelu za humanu primenu. Esposito i kolege su razvili rekombinantna antitela od pacijenata sa celijačnom bolesti, gde je bilo anticipirano da TG2 antitela mogu imati inhibitornu ulogu [19]. Jedno od ovih antitela je za komercijalnu upotrebu bilo razvijeno od strane Quark Biotechnology i podneta je prijava patenta (WO2006/100679). Ovo antitelo je ispoljilo izvesne uzbudljive rane podatke u vezi prevencije bubrežne fibroze u pacovskom UUO modelu. Međutim, mi smo proizveli rekombinantnu verziju ovog antitela, i dok je ono reagovalo sa TG2 u ELISI (Slika 17) i vestern blotu, ostvarili samo malu inhibiciju do 500 ng IgG po ng TG2 za ovo antitelo sa kojom su sva antitela razvijena u ovoj studiji blokirala u suštini svu TG2 aktivnost. Pored toga WO2006/100679 opisuje generisanje mišje verzije ovog humanog antitela, a kao takva, duga primena u priznatim pacovskim modelima bubrežne bolesti bi se pokazala teškom.

[0343] Od značaja u predmetnoj studiji je mapiranje 3 inhibitorna epitopa unutar jezgra TG2. AB1 epitop je daleko najpotentniji za ciljanje, što je možda iznenađujuće imajući u vidu poziciju epitopa. Ispitivanje njegove pozicije unutar predviđene TG2 aktivne strukture [20] sugeriše da se on vezuje na ulaznom portu za katalitičku trijadu u čemu može biti džep za supstrat. Imajući u vidu da su supstrati koje smo upotrebili u našem testu skrininga relativno mali (putrescin i dimetil kazein), možda je iznenađujuće da je ovo mesto tako efektivno. Međutim, pozicija epitopa mora biti takva da je veliki IgG (150 kDa) pozicioniran čvrsto u katalitičkom mestu. Iz podataka o epitopima može se predvideti da DD9 mesto može biti efektivnije, pošto je povezano sa pretpostavljenim mestom vezivanja kalcijuma [21]. Međutim, ispitivanje literature sugeriše 5 ili više pretpostavljenih mesta vezivanja Ca<2+>[21] i mada to ima jasno dramatični efekat, ipak nije kritično za svu TG2 aktivnost.

[0344] DF4 mesto bi bilo hipotetički najefektivniji epitop, pošto se antitelo vezuje za 1 od esencijalnih aminokiselina u katalitičkoj trijadi. Međutim, nije bilo moguće da se uspešno klonira DF4 koji je proizvodio ovo inhibitorno antitelo i kao takva proizvodnja dovoljno IgG za adekvatno izvođenje IC50testova nije bila moguća. U stvari može biti veoma teško da se kloniraju antitela koja imaju suviše veliku efikasnost imajući u vidu rad Gunzler et al (1982) FEBS Lett. 150(2): 390-6, koji sugeriše da je limfocitima potrebna TG2 aktivnost za proliferaciju, a shodno tome, antitela sa boljim inhibitornim potencijalom mogu biti moguća samo korišćenjem rekombinantnih pristupa ili kontinualnog IgG ekstrakcionog sistema.

[0345] Jedan od najviše frustrirajućih problema pri preduzimanju ovog rada je bila očigledna nesposobnost da sva razvijena antitela efikasno blokiraju nehumanu TG2 aktivnost, što je kritično za pretkliničko testiranje. Sva antitela su reagovala sa pacovskim i mišjim TG2 i u

4

vestern blotu, i u ELISI, u nekim slučajevima sa malom razlikom intenziteta. Međutim, od 9 antitela koja smo proizveli IgG, bilo je moguće odrediti IC50samo za 4 kod pacova i nijedno kod miševa.4 kod kojih je bio izračunat IC50protiv pacovskog TG2 su ispoljila 30-struki ili manji IC50protiv pacovskog TG2 od AB1 protiv humanog TG2, što znači da bi in vivo doza trebalo da bude preteran velika. Dalje, nijedno uopšte ne bi inhibiralo u lizatu pacovskih ćelija. Imajući u vidu reaktivnost u ELISI i vestern blotovima, plus da je bilo 5 nepodudaranja između vrsta za AB1 i 3 za DD9 značajna specifičnost inhibicije za vrste je bila iznenađujuća i jasno je ukazala na kritični značaj afiniteta za efektivnu inhibiciju. Shodno tome, zahvaljujući identifikaciji ovih inhibitornih epitopa za humani TG2, sada je kritično da se razvije analog antitela za ova mesta u pacovskoj TG2, ako njihova vrednost treba da bude određena u in vivo pretkliničkim modelima bolesti.

[0346] Postoji široki spektar raspoloživih TG inhibitora. Značajna su jedinjenja na bazi tiomidazola koja je originalno razvio Merke Sharpe Dome [22] CBZ-glutamil analozi koje su razvili Griffin i kolege [23] koji smo koristili veoma uspešno za tretiranje eksperimentalnog stvaranja ožiljaka na bubrezima [16] i dihidroizoksazolski tip inhibitora koji su razvili Khosla i kolege [24-27] koje smo uspešno koristili u različitim modelima kancera. Postoji nada da će kontinualno usavršavanje ovih jedinjenja možda dati vijabilni humani TG2 inhibitor, ali izgleda da su unakrsna reaktivnost TG familije ili potencijalno toksična priroda jedinjenja sprečile ovo. Nedavno su bili opisani acilidenoksoindoli kao nova reverzibilna klasa TG2 inhibitora [24], ali nedostaju podaci u vezi njihove unakrsne reaktivnosti sa drugim članovima TG familije. Na 2010 Gordon konferenciji o TG2 kod humanih bolesti Pasternack i kolege iz firme Zedira su prezentovali detalje niza jedinjenja koja koriste bočni lanac Michael-ovih akceptora kao TG2 inhibitore uz navode o podesnosti za primenu in vivo i TG2 selektivnosti, međutim, do danas nije bila materijalizovana kompletna publikacija o ovome. Na istom sastanku je rani rad autora Macdonald et al demonstrirao neke interesantne razvoje u vezi realizacije TG2 inhibitora za lečenje Hantingtonove horeje, ali se opet čeka kompletna publikacija. Bez sumnje mali molekul inhibitor TG2 bi bio veoma poželjan, ukoliko bi bio realizovan. Prodiranje u tkiva, sposobnost prelaska barijere krv mozak, proizvodnja, cena i lako doziranje su samo neke od koristi. Međutim, ovde razvijeni inhibitor antitela na neki način može biti poželjniji.

[0347] Jasno je da je TG2 multifunkcionalni enzim i on je povezan sa nizom ćelijskih funkcija, uključujući nuklearnu stabilizaciju i transport [28, 29], endocitozu [30, 31], GTPaznu signalizaciju [32-34], apoptozu [35, 36], prianjanje ćelija [37-39], citoskeletni integritet [28, 29] i ECM stabilizaciju [9]. Jasno je da mali molekul inhibitor može smetati svim ovim funkcijama, pošto oni generalno imaju slobodan pristup u ekstracelularni prostor i unutrašnjost ćelije. Antitelo ne može da uđe u ćeliju i zato ne bi uticalo na intracelularne uloge TG2. Najvažnije je što izgleda da su patološke uloge TG2 ekstracelularne, kao što je njegova uloga u stvaranju ožiljaka na tkivu i fibrozi, celijačnoj bolesti i kanceru. Shodno tome korišćenje antitela bi dovelo do dodatnog stepena selektivnosti, čime bi se sprečili nepoželjni intracelularni efekti. Zbog toga bi antitelo obezbedilo prednosti u blokiranju TG2 kod fibrotičnih i ožiljnih bolesti gde se TG2 unakrsno povezuje sa ECM proteinima, kod celijačne bolesti, gde se gliadin deamiduje u ekstracelularnom prostoru i kod hemo-rezistencije kod kancera, gde izgleda da je prianjanje ćelija zaštitni faktor. Međutim, ukoliko bi bio konstruisan mali Fab fragment tako da može da prođe barijeru krv-mozak, onda bi TG2 inhibirajuće antitelo bilo od male koristi u lečenju neuroloških patologija.

[0348] Kao zaključak, po prvi put smo bili sposobni da razvijemo TG2 inhibitorna antitela koja selektivno ciljaju na TG2. Takođe smo identifikovali 3 nova inhibitorna epitopa unutar domena jezgra TG2. Humanizacija antitela AB1 će po prvi put obezbediti mogućnost ciljane TG2 terapije kod čoveka.

Reference

[0349]

1. Tissue transglutaminase in normal and abnormal wound healing: review article. Verderio, E.A., T. Johnson, i M. Griffin, Amino Acids, 2004.26(4): str.387-404.

2. Transglutaminase-mediated cross-linking is involved in the stabilization of extracellular matrix in human liver fibrosis. Grenard, P., S. Bresson-Hadni, S. El Alaoui, M. Chevallier, D.A. Vuitton, i S. Ricard-Blum, J Hepatol, 2001.35(3): str.367-75.

3. Changes in transglutaminase activity in an experimental model of pulmonary fibrosis induced by paraquat. Griffin, M., L.L. Smith, i J. Wynne, Br J Exp Pathol, 1979. 60(6): str.

653-61.

4. Cardiac specific overexpression of transglutaminase II (G(h)) results in a unique hypertrophy phenotype independent of phospholipase C activation. Small, K., J.F. Feng, J. Lorenz, E.T. Donnelly, A. Yu, M.J. Im, G.W. Dorn, 2nd, i S.B. Liggett, J Biol Chem, 1999.

274(30): str.21291-6.

5. Tissue transglutaminase and the progression of human renal scarring. Johnson, T.S., A.F. El-Koraie, N.J. Skill, N.M. Baddour, A.M. El Nahas, M. Njloma, A.G. Adam, i M. Griffin, J Am Soc Nephrol, 2003.14(8): str.2052-62.

6. Thrombin upregulates tissue transglutaminase in endothelial cells: a potential role for tissue transglutaminase in stability of atherosclerotic plaque. Auld, G.C., H. Ritchie, L.A. Robbie, i N.A. Booth, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2001.21(10): str.1689-94.

7. Cross-linking of fibronectin to collagenous proteins. Mosher, D.F., Mol Cell Biochem, 1984.58(1-2): str.63-8.

8. Transglutaminases. Lorand, L. i S.M. Conrad, Mol Cell Biochem, 1984.58(1-2): str.9-35.

9. Modulation of tissue transglutaminase in tubular epithelial cells alters extracellular matrix levels: a potential mechanism of tissue scarring. Fisher, M., R.A. Jones, L. Huang, J.L. Haylor, M. El Nahas, M. Griffin, i T.S. Johnson, Matrix Biol, 2009.28(1): str.20-31.

10. Transglutaminase transcription and antigen translocation in experimental renal scarring. Johnson, T.S., N.J. Skill, A.M. El Nahas, S.D. Oldroyd, G.L. Thomas, J.A. Douthwaite, J.L. Haylor, i M. Griffin, J Am Soc Nephrol, 1999.10(10): str.2146-57.

11. Do changes in transglutaminase activity alter latent transforming growth factor beta activation in experimental diabetic nephropathy? Huang, L., J.L. Haylor, M. Fisher, Z. Hau, A.M. El Nahas, M. Griffin, i T.S. Johnson, Nephrol Dial Transplant, 2010.25(12): str.3897-910.

12. Expression induced by interleukin-6 of tissue-type transglutaminase in human hepatoblastoma HepG2 cells. Suto, N., K. Ikura, i R. Sasaki, J Biol Chem, 1993. 268(10): str.7469-73.

13. TNF-alpha modulates expression of the tissue transglutaminase gene in liver cells. Kuncio, G.S., M. Tsyganskaya, J. Zhu, S.L. Liu, L. Nagy, V. Thomazy, P.J. Davies, i M.A. Zern, Am J Physiol, 1998.274(2 Pt 1): str. G240-5.

14. Inhibition of transglutaminase activity reduces extracellular matrix accumulation induced by high glucose levels in proximal tubular epithelial cells. Skill, N.J., T.S. Johnson, I.G. Coutts, R.E. Saint, M. Fisher, L. Huang, A.M. El Nahas, R.J. Collighan, i M. Griffin, J Biol Chem, 2004.279(46): str.47754-62.

15. Transglutaminase inhibition reduces fibrosis and preserves function in experimental chronic kidney disease. Johnson, T.S., M. Fisher, J.L. Haylor, Z. Hau, N.J. Skill, R. Jones, R. Saint, I. Coutts, M.E. Vickers, A.M. El Nahas, i M. Griffin, J Am Soc Nephrol, 2007.

18(12): str.3078-88.

16. Transglutaminase inhibition ameliorates experimental diabetic nephropathy. Huang, L., J.L. Haylor, Z. Hau, R.A. Jones, M.E. Vickers, B. Wagner, M. Griffin, R.E. Saint, I.G. Coutts, A.M. El Nahas, i T.S. Johnson, Kidney Int, 2009.76(4): str.383-94.

17. Tissue transglutaminase contributes to interstitial renal fibrosis by favoring accumulation of fibrillar collagen through TGF-beta activation and cell infiltration. Shweke, N., N. Boulos, C. Jouanneau, S. Vandermeersch, G. Melino, J.C. Dussaule, C. Chatziantoniou, STR. Ronco, i J.J. Boffa, Am J Pathol, 2008.173(3): str.631-42.

18. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Xu, L., S. Begum, J.D. Hearn, i R.O. Hynes, Proc Natl Acad Sci USA, 2006.103(24): str.9023-8.

19. Anti-tissue transglutaminase antibodies from celiac patients inhibit transglutaminase activity both in vitro and in situ. Esposito, C., F. Paparo, I. Caputo, M. Rossi, M. Maglio, D.

Sblattero, T. Not, R. Porta, S. Auricchio, R. Marzari, i R. Troncone, Gut, 2002. 51(2): str.

177-81.

20. Transglutaminase 2 undergoes a large conformational change upon activation. Pinkas, D.M., P. Strop, A.T. Brunger, i C. Khosla, PLoS Biol, 2007.5(12): str. e327.

21. Functional significance of five noncanonical Ca2+-binding sites of human transglutaminase 2 characterized by site-directed mutagenesis. Kiraly, R., E. Csosz, T. Kurtan, S. Antus, K. Szigeti, Z. Simon-Vecsei, I.R. Korponay-Szabo, Z. Keresztessy, i L. Fesus, Febs J, 2009.276(23): str.7083-96.

22. 3,5 substituted 4,5-dihydroisoxazoles as transglutaminase inhibitors. Syntex, US Patent 4, 912, 120, 1990. March.

23. Griffin M, Coutts I G, i S. R, Novel Compounds and Methods of Using The Same., in International Publication Number WO 2004/113363,. 2004: GB patent PCT/GB2004/002569.

24. Acylideneoxoindoles: a new class of reversible inhibitors of human transglutaminase 2. Klock, C., X. Jin, K. Choi, C. Khosla, P.B. Madrid, A. Spencer, B.C. Raimundo, P. Boardman, G. Lanza, i J.H. Griffin, Bioorg Med Chem Lett.21(9): str.2692-6.

25. Transglutaminase 2 inhibitors and their therapeutic role in disease states. Siegel, M. i C. Khosla, Pharmacol Ther, 2007.115(2): str.232-45.

26. Structure-based design of alpha-amido aldehyde containing gluten peptide analogues as modulators of HLADQ2 and transglutaminase 2. Siegel, M., J. Xia, i C. Khosla, Bioorg Med Chem, 2007.15(18): str.6253-61.

27. Novel therapies for celiac disease. Sollid, L.M. i C. Khosla, J Intern Med. 269(6): str.

604-13.

28. Transglutaminase 2: an enigmatic enzyme with diverse functions. Fesus, L. i M. Piacentini, Trends Biochem Sci, 2002.27(10): str.534-9.

29. Transglutaminases: crosslinking enzymes with pleiotropic functions. Lorand, L. i R.M. Graham, Nat Rev Mol Cell Biol, 2003.4(2): str.140-56.

30. Transglutaminase 2 is needed for the formation of an efficient phagocyte portal in macrophages engulfing apoptotic cells. Toth, B., E. Garabuczi, Z. Sarang, G. Vereb, G. Vamosi, D. Aeschlimann, B. Blasko, B. Becsi, F. Erdodi, A. Lacy-Hulbert, A. Zhang, L. Falasca, R.B. Birge, Z. Balajthy, G. Melino, L. Fesus, i Z. Szondy, J Immunol, 2009.182(4): str.2084-92.

31. Transglutaminase is essential in receptor-mediated endocytosis of alpha 2-macroglobulin and polypeptide hormones. Davies, P.J., D.R. Davies, A. Levitzki, F.R. Maxfield, P. Milhaud, M.C. Willingham, i I.H. Pastan, Nature, 1980.283(5743): str.162-7.

32. GTP binding and signaling by Gh/transglutaminase II involves distinct residues in a unique GTP-binding pocket, lismaa, S.E., M.J. Wu, N. Nanda, W.B. Church, i R.M. Graham, J Biol Chem, 2000.275(24): str.18259-65.

33. The core domain of the tissue transglutaminase Gh hydrolyzes GTP and ATP. lismaa, S.E., L. Chung, M.J. Wu, D.C. Teller, V.C. Yee, i R.M. Graham, Biochemistry, 1997.36(39): str. 11655-64.

34. Gh: a GTP-binding protein with transglutaminase activity and receptor signaling function. Nakaoka, H., D.M. Perez, K.J. Baek, T. Das, A. Husain, K. Misono, M.J. Im, i R.M. Graham, Science, 1994.264(5165): str.1593-6.

35. Searching for the function of tissue transglutaminase: its possible involvement in the biochemical pathway of programmed cell death. Fesus, L. i V. Thomazy, Adv Exp Med Biol, 1988.231: str.119-34.

36. Induction and activation of tissue transglutaminase during programmed cell death. Fesus, L., V. Thomazy, i A. Falus, FEBS Lett, 1987.224(1): str.104-8.

37. Fibronectin-tissue transglutaminase matrix rescues RGD-impaired cell adhesion through syndecan-4 and beta1 integrin co-signaling. Telci, D., Z. Wang, X. Li, E.A. Verderio, M.J. Humphries, M. Baccarini, H. Basaga, i M. Griffin, J Biol Chem, 2008.

283(30): str.20937-47.

38. Regulated expression of tissue transglutaminase in Swiss 3T3 fibroblasts: effects on the processing of fibronectin, cell attachment, and cell death. Verderio, E., B. Nicholas, S. Gross, i M. Griffin, Exp Cell Res, 1998.239(1): str.119-38.

39. A novel RGD-independent cel adhesion pathway mediated by fibronectin-bound tissue transglutaminase rescues cells from anoikis. Verderio, E.A., D. Telci, A. Okoye, G. Melino, i M. Griffin, J Biol Chem, 2003.278(43): str.42604-14.

Primer 2: Sekvenciranje novih TG2 inhibitornih antitela prema pronalasku.

Sekvenciranje antitela

[0350] Da bi se odredile sekvence varijabilnih regiona za svako antitelo prema pronalasku, peleta hibridoma ćelija je bila prerađena korišćenjem Qiagen RNeasy Mini Kita da bi se ekstrahovala RNK praćenjem protokola proizvođača. Ekstrahovana RNK je bila reverzno transkribovana da bi se proizvela kDNK uz korišćenje 1<st>Strand cDNA Synthesis Kita (GE Healthcare), sa korišćenjem Notl-dT18prajmera, u skladu sa protokolima proizvođača. Preparat kDNK je bio prečišćen korišćenjem Qiagen PCR Purification Kita, u skladu sa protokolima proizvođača.

[0351] Da bi se odredila sekvenca teškog lanca, mišja kDNK je bila amplifikovana pomoću PCR uz korišćenje seta degeneratnih prajmera (MHV1-12) sa prajmerom konstantnog regiona (MHCG1, MHCG2A, MHCG2B, MHCG3, ili smeše ta četiri) kao što je prikazano u Tabeli 12. Slično tome, da bi se odredila sekvenca lakog lanca, mišja kDNK je bila amplifikovana uz korišćenje seta degeneratnih prajmera (MVK1-11) sa prajmerom konstantnog regiona MKC kao što je prikazano u Tabeli 13.

[0352] Ako nisu bili uočeni proizvodi amplifikacije pri korišćenju inicijalnog seta teškog lanca PCR onda je bio izveden 5’ RACE PCR (Invitrogen), uz korišćenje Notl-dT18prajmera da bi se generisala kDNK; i prajmera konstantnog regiona (MHCG1, MHCG2A, MHCG2B, MHCG3, ili smeše ta četiri) i 5’ RACE Anchor Prajmera, GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG (gde je I baza za deoksinozin) za PCR.

[0353] Rezultujući amplifikacioni stupci su bili ligatirani u pCR2.1®-TOPO® vektoru uz korišćenje TOPO-TA Cloning® kita (Invitrogen) sa korišćenjem protokola proizvođača i poslati su firmi GATC Biotech AG radi sekvenciranja.

Tabela 12: PCR prajmeri za kloniranje varijabilnih regiona mišjeg teškog lanca

1

[0354] MHV ukazuje na prajmere koji se hibridizuju sa lider sekvencama gena mišjeg varijabilnog regiona teškog lanca, MHCG ukazuje na prajmere koji se hibridizuju sa genima mišjeg konstantnog regiona.

Tabela 13: PCR prajmeri za kloniranje varijabilnih regiona mišjeg kapa lakog lanca

[0355] MKV označava prajmere koji se hibridizuju sa lider sekvencama gena mišjeg kapa varijabilnog regiona lakog lanca, a MKC označava prajmer koji se hibridizuje sa genom mišjeg kapa konstantnog regiona.

Podaci o sekvencama

[0356] Antitelo AB1 je bilo sekvencirano pored Antitela BB7, DC1, JE12, EH6, AG9, AH3, DD9, DH2, DD6 i IA12. Sekvence su prikazane na Slikama 18 do 28.

1 1

Primer 3: Konstrukcija i karakterizacija himeričnih i humanizovanih novih anti-TG2 antitela prema pronalasku.

[0357] Da bi se dalje karakterisala antitela prema pronalasku i da bi se omogućilo rangiranje i prioritizacija antitela za humanizaciju bio je konstruisan panel himeričnih TG2 antitela (mišji varijabilni regioni i humani IgG1 i humani kapa). Metodologija koja je upotrebljena za proizvodnju himeričnih antitela je data u nastavku.

Metode

Baze podataka sa humanim VH i VK kDNK

[0358] Proteinske sekvence humanih i mišjih imunoglobulina iz International Immunogenetics Database 2009<1>i Kabat Database Release 5 Sekvenci Proteina od Imunološkog Interesta (poslednje ažuriranje 17-nov-1999)<2>su bile upotrebljene za kompilaciju baze podataka sa humanim imunoglobulinskim sekvencama u Kabat poravnanju. Naša baza podataka sadrži 10,606 VH i 2,910 VK sekvenci.

Molekularni model AB1

[0359] Kao predstavnik Grupe 1 antitela (tj. antitela koja se vezuju za epitop koji obuhvata aminokiseline 304 do 326 humanog TG2), bio je izračunat homologi model varijabilnih regiona mišjeg antitela AB1 uz korišćenje Modeller programa<3>koji je radio u automatskom modu. Atomske koordinate od 1 MQK.pdb, 3LIZ.pdb i 1MQK.pdb su bile struktura sekvence najveće identičnosti za Interfejs, VL i VH, respektivno, kao što je bilo određeno Blast analizom na bazi podataka Accelrys antibody pdb structures. Ove strukture su bile upotrebljene za generisanje 20 inicijalnih modela, od kojih je najbolji bio doteran modeliranjem svake CDR petlje sa njene 3 najbolje strukture petlje.

Selekcija hAB1 okvira

[0360] Program za analizu sekvenci, gibsSR, bio je upotrebljen za pretraživanje baza podataka sa humanim VH i VK za AB1 VHc, VKc i VKc<1>, BB7 VHc i VKc i DC1 VHc i VKc proteinske sekvence korišćenjem različitih kriterijuma selekcije. FW ostaci unutar 5Å CDR ostatka (Kabat definicija) u homologom modelu mišjeg antitela AB1 su bili identifikovani i označeni su kao "5Å bliski" ostaci.

1 2

[0361] AF06220 je bio izabran kao FW na kome su bazirane inicijalne verzije humanizovanog teškog lanca. Tabela 14 prikazuje poravnanje i identitet ostataka AF06220 prema mišjim antitelima. Tabela 15 prikazuje „5Å bliski“ omotač sekvenci. AF062260 ima samo 1 somatsku mutaciju u odnosu na svoj VH gen germinativne linije Z12347 (Tabela 16).

[0362] AY247656 je bio izabran kao FW na kome je baziran inicijalni AB1 humanizovani kapa laki lanac. Poravnanje i identičnost ostataka u odnosu na mišji kapa laki lanac AB1 antitela su prikazani u Tabeli 17; Tabela 18 prikazuje 5Å bliski omotač sekvenci. Sekvenca pokazuje 5 somatskih mutacija u odnosu na svoj VK gen germinativne linije X93620 (Tabela 19).

[0363] AF193851 je bio izabran kao FW na kome su bazirani drugi konstrukti humanizovanog kapa lakog lanca. Poravnanje i identičnost ostataka u odnosu na mišja antitela su prikazani u Tabeli 20. Tabela 21 prikazuje 5Å bliski omotač sekvenci. Sekvenca ne pokazuje somatske mutacije u odnosu na svoj VK gen germinativne linije J00248 (Tabela 22).

Generisanje ekspresionih vektora

[0364] Konstrukcija himeričnih ekspresionih vektora iziskuje dodavanje podesne lider sekvence u VH i VL, kojima prethodi Hind III restrikciono mesto i Kozak sekvenca. Kozak sekvenca obezbeđuje efikasnu translaciju sekvence varijabilnog regiona. Ona definiše korektni AUG kodon od koga ribozom može započeti translaciju, a najkritičnija baza je adenin na poziciji -3, uzvodno od AUG starta.

[0365] Za teški lanac, konstrukcija himeričnih ekspresionih vektora iziskuje uvođenje 5’ fragmenta humanog γ1 konstantnog regiona, do prirodnog Apal restrikcionog mesta, koji je susedan 3’ kraju J regiona varijabilnog regiona. CH se kodira u ekspresioni vektor nizvodno od insertovane VH sekvence, ali mu nedostaje VC intron.

[0366] Za laki lanac, prirodno splajsno donorsko mesto i BamHI mesto se dodaju nizvodno od V regiona. Splajsna donorska sekvenca olakšava splajsovanje kapa V:C introna koje je neophodno za vezivanje VL za konstantni region unutar okvira.

[0367] DNK sekvence varijabilnih regiona su bile optimizovane i sintetizovane od strane GeneArt®. Bila je izabrana lider sekvenca kao ona koja obezbeđuje dobru ekspresiju antitela u kultivisanim sisarskim ćelijama.

[0368] Konstrukti varijabilnog regiona teškog lanca su bili isečeni iz klonirajućeg vektora uz korišćenje Hindlll Apal digestije, pa su prečišćeni i ligatirani u slično isečeni i fosfatazom tretirani MRCT ekspresioni vektor teškog lanca, a onda su bili upotrebljeni za transformaciju TOP10 bakterija.

[0369] Konstrukti varijabilnog regiona kapa lakog lanca su bili isečeni uz korišćenje HindIII BamHI digestije, pa su prečišćeni, ligatirani u slično isečeni i fosfatazom tretirani ekspresioni vektor MRCT kapa lakog lanca, a onda su bili upotrebljeni za transformaciju TOP10 bakterija.

1

Ekspresija antitela

[0370] Ekspresioni vektor sa dvostrukom insercijom koji je kodirao i teške i kapa lance bio je generisan i transfektovan je u HEK293T ćelije. Supernatant ćelijske kulture je bio prečišćen afinitetnom hromatografijom na Protein G-agarozi u skladu sa protokolima proizvođača.

ELISA za vezivanje

[0371] HEK 293F ćelije su bile ko-transfektovane sa kombinacijama različitih vektora sa humanizovanim lakim lancem zajedno sa vektorima sa humanizovanim teškim lancem. Rekombinantni humani TG2 je bio upotrebljen za merenje vezivanja antitela pomoću ELISE. Rezultati su pokazali da je RHA verzija teškog lanca (Tabela 23), u kombinaciji sa RKE i RKJ verzijama lakog lanca (Tabela 24) (predstavljaju različite verzije humanizovanog lakog lanca) pokazala optimalno vezivanje (Slika 34), i zbog toga je bila izabrana za dalju karakterizaciju. Sličan pristup je bio primenjen za identifikaciju optimalnih parova humanizovanih BB7 teških i lakih lanaca, i humanizovanih DC1 teških i lakih lanaca.

[0372] RHA verzija teškog lanca je nemodifikovani graft mišjih CDR regiona AB1 antitela na humanoj donorskoj sekvenci. Međutim, obe verzije lakog lanca, RKE i RKJ, imaju istu samo jednu povratnu mutaciju koja se nalazi u 5Å blizini, F72 (Tabela 24). Ova povratna mutacija leži izvan Vernijeovih<4>, Kanonskih<5>ili Interfejs<6>ostataka.

Reference

[0373]

1. Lefranc,M.P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database(R). Nucleic Acids Res.

31, 307-310 (2003).

2. Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H.M., Gottesman,K.S. & Foeller,C. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH National Technical Information Service, (1991).

3. Eswar,N. et al. Comparative protein structure modeling using Modeller. Curr. Protoc. Bioinformatics. Chapter 5:Unit 5.6., Unit (2006).

4. Foote, J. & Winter, G. (1992). Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J Mol. Biol.224, 487-499.

5. Morea, V., Lesk, A. M. & Tramontano, A. (2000). Antibody modeling: implications for engineering and design. Methods 20, 267-279.

1 4

6.Chothia, C., Novotny, J., Bruccoleri, R. & Karplus, M. (1985). Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains. J Mol. Biol.186, 651-663.

[0374] Sledeća tabela A rezimira himerična i humanizovana antitela proizvedena sa unakrsnim pozivanjem na identifikatore korišćene na slikama.

TABELE

[0375]

[0376] Tabela 14 prikazuje poravnanje i identitet ostataka AF062260 prema mišjim antitelima. Identiteti ostataka su prikazani karakterom tačka (.). Razlike između ostataka su prikazane tamo gde je to primenljivo. Razmaci (-) se upotrebljavaju za održavanje Kabat numeracije, i za pokazivanje insercije ili delecije ostataka, tamo gde je to primenljivo.

1

[0377] Tabela 15 prikazuje ostatke u okviru teškog lanca antitela koji leže unutar 5Å omotača CDR-ova. Identiteti ostataka su prikazani karakterom tačka (.). Razlike između ostataka su prikazane tamo gde je to primenljivo.

[0378] Tabela 16 prikazuje AF062260 koji ima 1 somatsku mutaciju VH germinativne linije gena Z12347. Identiteti ostataka su prikazani karakterom tačka (.). Razlike između ostataka su prikazane tamo gde je to primenljivo.

[0379] Tabela 17 prikazuje poravnanje i identitet ostataka AY247656 prema mišjem AB1 antitelu. Identiteti ostataka su prikazani karakterom tačka (.). Razlike između ostataka su prikazane tamo gde je to primenljivo. Razmaci (-) se upotrebljavaju za održavanje Kabat numeracije, i za pokazivanje insercije ili delecije ostataka, tamo gde je to primenljivo.

[0380] Tabela 18 prikazuje ostatke okvira kapa lakog lanca AB1 antitela koji leže unutar 5Å omotača CDR-ova. Identiteti ostataka su prikazani karakterom tačka (.). Razlike između ostataka su prikazane tamo gde je to primenljivo.

1

[0381] Tabela 19 prikazuje AY247656 koji ima 5 somatsku mutaciju VK germinativne linije gena X93620. Identiteti ostataka su prikazani karakterom tačka (.). Razlike između ostataka su prikazane tamo gde je to primenljivo.

[0382] Tabela 20 prikazuje poravnanje i identitet ostataka AF193851 prema mišjem antitelu. Identiteti ostataka su prikazani karakterom tačka (.). Razlike između ostataka su prikazane tamo gde je to primenljivo. Razmaci (-) se upotrebljavaju za održavanje Kabat numeracije, i za pokazivanje insercije ili delecije ostataka, tamo gde je to primenljivo.

[0383] Tabela 21 prikazuje ostatke okvira kapa lakog lanca antitela koji leže unutar 5Å omotača CDR-ova. Identiteti ostataka su prikazani karakterom tačka (.). Razlike između ostataka su prikazane tamo gde je to primenljivo.

[0384] Tabela 22 prikazuje AF193851 koji nema somatsku mutaciju VK germinativne linije gena J00248. Identiteti ostataka su prikazani karakterom tačka (.). Razlike između ostataka su prikazane tamo gde je to primenljivo.

1

[0385] Tabela 23 prikazuje poravnanje sekvenci finalnih humanizovanih verzija AB1, BB7 i DC1 teških lanaca. Razmaci (-) se upotrebljavaju za održavanje Kabat numeracije, i za pokazivanje insercije ili delecije ostataka, tamo gde je to primenljivo.

[0386] Tabela 24 prikazuje poravnanje sekvenci finalnih humanizovanih verzija AB1, BB7 i DC1 kapa lakih lanaca. Razmaci (-) se upotrebljavaju za održavanje Kabat numeracije, i za pokazivanje insercije ili delecije ostataka, tamo gde je to primenljivo.

TABELA 24A

[0391]

1

Karakterizacija himeričnih i humanizovanih antitela

[0392] Himerična i humanizovana Abs su bila ispitana u pogledu vezivanja za humani i makakijev TG2 i u pogledu enzimske inhibicije ovih enzima u skladu sa dole opisanom metodologijom.

METODE

ELISA test za TG2 vezivanje

[0393] Vezivanje antitela za humani i makakijev TG2 je bilo određeno u ELISA testu. Providne polistirenske ploče "Maxisorp" sa 96-bunarčića (Nunc) su bile obložene sa 50ng prečišćenog humanog ili makakijevog TG2 u 50μl 0.05 M karbonat-bikarbonatnog pufera pH 9.6 na 4°C preko noći. Kontrolni bunarčići su bili obloženi sa 50μl 100μg/ml goveđeg serumskog albumina (BSA). Ploče su bile isprane 3x sa 300 μl fosfatnog-puferovanog slanog rastvora pH7.4 (PBS) koji je sadržao 0.1% Tween 20 (PBST) i blokirane su sa 300 μl 3% w/v Marvelovog obranog mleka u PBS 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle 3x ispiranja sa PBST, 50ml proteinom-A prečišćenih himeričnih ili humanizovanih anti-TG2 antitela ili humanog IgG1 kapa izotopskog kontrolnog antitela ili CUB7402 (Abcam) su bili serijski razređeni 4-struko od najveće koncentracije od 50nM u PBS, i onda su dodata u ploču u duplikatu. Posle 1 sat na sobnoj temperaturi, ploče su bile isprane 3x u PBST i onda su inkubirane sa 50μl peroksidazomkonjugovanog kozjeg anti-humanog IgG (Fc) (Serotec) razređenog 1/5,000 u 3% w/v Marvelovog obranog mleka u PBS ili za bunarčiće koji su sadržali CUB7402 peroksidazomkonjugovanog 1/5,000 kozjeg anti-mišjeg IgG (Fc) (Sigma) 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle 3x ispiranja sa PBST, ploče su bile razvijene sa 50μl TMB supstrata (Sigma) 5 min na sobnoj temperaturi pre zaustavljanja reakcije sa 25μl 0.5M H2SO4 i očitavanja apsorbanse na 450nM u čitaču mikrotitarskih ploča (BioTek EL808). Bile su analizirane krive doza reakcija, pa su EC50 vrednosti i drugi statistički parametri određeni korišćenjem 4-parametarskog logističkog fitovanja podataka (GraphPad Prism).

11

Fluorescentno-bazirani transglutaminazni test TG2 inhibicije pomoću antitela prema pronalasku.

[0394] Transglutaminazne aktivnosti prečišćenih humanih (Zedira) ili makakijevih TG2 enzima (Trenzim) bile su izmerene inkorporiranjem dasilovanog lizina KxD (Zedira) u N,N-dimetilovani kazein (DMC, Sigma). Humani ili makakijev TG2 su bili razređeni u transamidacionom puferu (25mM HEPES pH 7.4 koji je sadržao 250mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM CaCl2, 0.2mM DTT i 0.05% v/v Pluronic F-127) do 1nM i 10nM, respektivno, pa su mešani sa različitim koncentracijama proteinom-A prečišćenih mišjih, himeričnih ili humanizovanih TG2 antitela tokom 180 min na sobnoj temperaturi u crnim mikrotitarskim pločama sa 384-bunarčića (Corning). Reakcije su bile inicirane dodavanjem DMC i KxD do finalne koncentracije od 10uM i 20uM, respektivno, i finalne reakcione zapremine od 30ul, i pa je pušteno da se nastavi na ST 180min i praćeno je povećanje fluorescencije (RFU) (pobuda na 280nm, emisija na 550nm) korišćenjem Tecan Safire<2>čitača ploča. Podaci su bili normalizovani prema procentualnoj aktivnosti gde je %aktivnosti=(RFU testiranog antitela -RFU nižih kontrola)/ RFU viših kontrola -RFU nižih kontrola) x 100, gde su niže kontrole sadržale sve komponente osim enzima, a više kontrole su sadržale sve komponente osim antitela.

[0390] Krive doza reakcija za antitelo su bile nacrtane korišćenjem GraphPad prism softvera, pa su fitovane korišćenjem 4-parametarskog logističkog modela da bi se dobili IC50 i drugi statistički parametri. Rezultati su prikazani na Slikama 29 do 33.

Rezultati i diskusija eksperimenata inhibicije enzima i ELISA vezivanja sa humanizovanim i mišjim anti-TG2 antitelima

[0395] Sposobnost himeričnih i humanizovanih TG2 antitela da inhibiraju transamidaciju pomoću humanog TG2 je bila određena od doze-zavisnom inhibicijom TG2-zavisnom inkorporacijom dansilovanog lizina u N,N-dimetilovani kazein (ilustrovano na slikama 29 i 31). I himerična, i humanizovana antitela iz grupe 1 (npr. cAB003, cBB001, cDC001, hBB001AA, hAB001BB, hAB005 i hAB004) ispoljavaju potentnu inhibiciju TG2 aktivnosti u niskom nanomolskom opsegu, konzistentnu sa ELISA podacima koji prikazuju vezivanje za imobilizovani humani TG2 u istom opsegu (slike 35 i 37). Nasuprot tome, komercijalno antitelo CUB7402 nije uspelo da inhibira humane ili makakijeve TG2 enzimske aktivnosti (slike 29F i 30B), uprkos uporedivom vezivanju za grupu 1 antitela u ELISA testovima (slike 35A, 36A, 37A i 38A) konzistentno sa prepoznavanjem pomoću CUB7402 epitopa koji ne remeti funkciju transamidacije enzima. Zbog toga se grupa 1 antitela može razlikovati po svojoj sposobnosti da inhibira enzimsku funkciju od drugih antitela kao što je CUB7402, koje se vezuje, ali nema efekat na enzimsku aktivnost. Slično tome, mišja i himerična antitela koja predstavljaju grupu 3 (npr. mDD9001, mDH001, cDD9001 i cDH001) konzistentno su inhibirala humanu TG2 transamidaciju, ali sa nižom potencijom od grupe 1 antitela (slike 29 i 33). Inhibicija humanog TG2 pomoću ilustrativnih roditeljskih mišjih monoklonskih antitela iz grupe 1 i grupe 3 (slika 33) pokazuje uporedive potencije sa njihovim himeričnim i humanizovanim verzijama, što ukazuje da je funkcionalna potencija mišjih antitela zadržana u humanizovanim verzijama. Slično tome, podaci o ELISA vezivanju za humani TG2 za ilustrativna humanizovana antitela hBB001AA, hBB001BB i hAB004 (slika 37) pokazuju uporedive EC50 vrednosti sa onima koje su dobijene za himerične verzije cBB001 i cAB003, što ukazuje da je afinitet vezivanja bio takođe očuvan u humanizovanim verzijama. Himerična i humanizovana antitela takođe odlikuje potentna inhibicija makakijevog TG2 (slike 30 i 32) i uporedivi ELISA EC50’s (slike 36 i 38) između različitih vrsta, konzistentno sa konzervacijom srodnog epitopa u makakijevom TG2, koji ima sveukupnu identičnost sekvence od 99%. Za razliku od toga CUB7402 prikazuje uporedivo vezivanje za TG2 obe vrste, kao i grupa 1 antitela, ali ne inhibira enzimsku aktivnost (slike 35-38 i 29-30).

Testovi bazirani na ćelijama

[0396] Vezivanje antitela prema pronalasku za ekstracelularni TG2 iz HK-2 epitelnih ćelija je bilo ispitano korišćenjem sledećeg protokola.

Merenje ekstracelularne TG aktivnosti

[0397] Ekstracelularna TG aktivnost je bila merena pomoću modifikovane ćelijske ELISE. HK-2 epitelne ćelije su bile uzete uz korišćenje Accutase i zasejane su sa gustinom od 2X10<4>ćelija/bunarčiću u medijumu bez seruma na ploči sa 96 bunarčića koja je bila obložena preko noći sa 100 μl/bunarčiću fibronektinom (5 μg/ml u 50 mM Tris-HCl pH 7.4) (Sigma, Poole UK). Bilo je dopušteno da se ćelije pričvrste za O/N na 37 °C. Medijum je bio zamenjen sa DMEM (Life Technologies) i jedinjenjima, pa su bili dodati antitela ili kontrole i dozvoljeno je da se vežu na 37°C. 0.1 mM biotin kadaverina [N-(5 amino pentil biotinamid) trifluorosirćetna kiselina] (Zedira) je bio dodat u bunarčiće, pa je ploča bila vraćena na 37°C 2 sata. Ploče su bile isprane dva puta sa 3 mM EDTA/PBS, te su ćelije bile odstranjene sa 0.1% (w/v) deoksiholata u 5 mM EDTA/PBS. Supernatant je bio sakupljen i upotrebljen za determinaciju proteina. Ploče su bile isprane sa PBS/Tween, a inkorporirani biotin kadaverin je otkriven korišćenjem 1:5000 ekstravidina HRP (Sigma, Poole, UK) tokom 1 h na sobnoj temperaturi, što je bilo praćeno sa K Blue supstratom (SkyBio). Reakcija je bila zaustavljena sa Red Stop (SkyBio), a apsorbansa je bila očitana na 4650 nm. Svako antitelo je bilo testirano u najmanje tri odvojene prilike.

[0398] Rezultati su prikazani na Slikama 39 i 40 i prikazuju ilustrativnu krivu i tabelu IC50 vrednosti dobijenih za testirana antitela. Slika 39 prikazuje rezultate sa humanizovanim AB1, a Slika 40 prikazuje rezultate sa humanizovanim BB7.

[0399] hAB005 je inhibirao ekstracelularni TG2 od HK2 ćelije sa IC50 od 71.85nM i maksimalnom inhibicijom od oko 30% aktivnosti kontrole. hBB001AA je inhibirao aktivnost sa IC50 od 19.8nM i maksimalnom inhibicijom od 40% aktivnosti kontrole. hBB001BB je imao bolji IC50 od 4.9nM, ali maksimalnu inhibiciju od oko 55% kontrole.

Testovi sa grebanjem

[0401] Takođe su bili izvedeni testovi sa ogrebotinama da bi se ispitala aktivnost vezivanja humanizovanih i ili himeričnih anti-TG2 antitela prema pronalasku.

[0402] Pokazalo se da TG2 ima važnu ulogu u plućnoj fibrozi i miševi sa inaktiviranim TG2 pokazuju smanjeno stvaranje ožiljaka i fibrozu u bleomicinskom modelu. (Keith C. Olsen, Ramil E. Sapinoro, R. M. Kottmann, Ajit A. Kulkarni, Siiri E. lismaa, Gail V. W. Johnson, Thomas H. Thatcher, Richard P. Phipps, i Patricia J. Sime. (2011) Transglutaminase 2 and Its Role in Pulmonary Fibrosis. Am.J of Respiratory & Critical Care Med. 1840699-707) Migracija ćelija miševa sa inaktiviranim TG2 na rani je bila smanjena u poređenju sa prirodnim tipom. Testovi sa ogrebotinama su bili izvedeni da bi se ispitao efekat humanizovanih i/ili himeričnih anti-TG2 antitela prema pronalasku na brzinu zatvaranja rane u sloju normalnih plućnih fibroblasta (WI-38 ćelije).

Protokol testova sa grebanjem:

[0403] WI-38 ćelije (normalni humani plućni fibroblasti ATCC kat#CCL-75) su bili zasejani u Image Lock ploči sa 96 bunarčića (Essen kat#4379) sa 2 x 10<4>/bunarčiću u αMEM medijum (Life Technologies kat#32561) sa 10% FBS i gajeni su O/N do >97% konfluencije. Ćelije su bile isprane 2X sa αMEM medijumom bez seruma i ogrebotina je bila napravljena korišćenjem Essen Wound Maker-a i protokola proizvođača. Medijum je bio odstranjen i zamenjen je sa 95ml/bunarčiću medijuma bez seruma. Kontrole i testirana antitela su bili dodati u bunarčiće. Ploča je bila stavljena u Essen Incucyte i zatvaranje rane je bilo analizirano korišćenjem protokola ogrebotine.

[0404] Citohalasin D je bio upotrebljen kao kontrola testa sa 0.1μM. R281, mali molekul nespecifični inhibitor transglutaminaze, bio je testiran sa 100μM. Z DON, peptidom nereverzibilnim inhibitorom transglutaminaze sa 10μM i 100μM. Komercijalno raspoloživo TG2 antitelo Cub7402 (ABcam kat#ab2386) je bilo testirano sa 5μg/ml. Antitela prema pronalasku su bila testirana u najmanje tri prilike u različitim koncentracijama kao što je navedeno. U svim

11

eksperimentima kontrole su bile Citohalasin D sa 0.1uM i ZDON sa dve koncentracije da bi se pokazao efekat zavisan od doze.

[0405] Ilustrativni rezultati testova sa ogrebotinama su prikazani na Slikama 41 do 44. Kao što se može videti na Slici 41, Citohalasin D, R281 i ZDON su svi inhibirali zatvaranje rane (za ZDON je pokazano da inhibira na način zavisan od doze), ali antitelo Cub7402 nije inhibiralo zatvaranje rane. Humanizovano BB7, Humanizovano AB1 i Himerično DC1 su sva inhibirala zatvaranje rane.

Afiniteti himeričnih i humanizovanih anti TG2 Abs

[0406] Afiniteti vezivanja (Kds i off vrednosti) za panel himeričnih i humanizovanih Abs prema pronalasku protiv humanog TG2 i cijano TG2 su bili određeni korišćenjem Biacore tehnika. Protokoli i rezultati su opisani u nastavku i prikazani su na Slikama 45 do 47.

Biacore metode

[0407] Rekombinantni humani TG2 je bio dobijen od firme Zedira GmbH (kat. br.: T002). Rekombinantni makakijev TG2 je bio dobijen od firme Trenzim. Površinska plazmonska rezonanca (SPR) je bila izmerena na Biacore T200 instrumentu (GE Healthcare). CM5 čipovi (GE Healthcare kat.br.: BR-1006-68) su bili obloženi sa monoklonskim mišjim anti-humanim IgG1 (Fc) (MAH) antitelom (GE Healthcare kat.br.: BR-1008-39) aminskim kuplovanjem kao što je opisano u instrukcijama proizvođača. HBS-EP+ pufer (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v Surfactant P20) i HBS-P+ pufer (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.05 % surfaktant P20) su bili nabavljeni od GE Healthcare kao 10x radni rastvori (kat.br.: BR-1006-69 i BR-1006-71). Rastvor kalcijum hlorida je bio dobijen od firme Sigma Aldrich (kat.br.:21115).

[0408] Metod koji je upotrebljen za određivanje afiniteta anti-TG2 antitela je obuhvatao hvatanje himeričnih ili humanizovanih antitela na CM5 čipu obloženom sa MAH, koje je bilo praćeno injekcijom niza TG2 uzoraka u tekućem puferu. Tekući pufer je bio 1x HBS-P+ koji je sadržao 1 mM CaCl2, ili 1x HBS-EP+ za eksperimente bez kalcijuma. Hvatanje antitela je bilo izvedeno u toku kontaktnog vremena od 120 sekundi sa protokom od 10 μl/min, što je rezultovalo hvatanjem približno 40-80 RU. TG2 je bio injektiran preko imobilizovanog antitela u koncentracijama u opsegu od 25 nM do 400 nM sa kontaktnim vremenom do 600 sekundi, sa protokom od 30 μl/min. Disocijacija TG2 je obično bila merena do 5400 sekundi (1.5 sat). Onda je bila izvršena regeneracija čipa uz korišćenje 3 M MgCl2, za kontaktno vreme od 60 sekundi, sa protokom od 30 μl/ml, što je bilo praćeno periodom stabilizacije od 300s pre sledećeg uzorka. Za svaki od humanog i makakijevog TG2, bilo je izvedeno najmanje 5 injektiranja sa različitim koncentracijama u najmanje dva odvojena eksperimenta.

[0409] Kinetički podaci su bili eksportovani iz Biacore T200 Evaluation softvera i analizirani su korišćenjem GraphPad Prism, gde su faze asocijacije i faze disocijacije bile analizirane odvojeno uz korišćenje jednofaznog modela asocijacije i jednofaznog eksponencijalnog modela raspada, respektivno. Stepeni asocijacije (kon) su bili izračunati za svaku krivu pojedinačno, a vrednosti stepena disocijacije (koff) na osnovu sakupljenih podataka za dugu fazu disocijacije. Tamo gde je bilo izračunato da su koffvrednosti < 1x10<-5>s<-1>, te vrednosti su bile podešene/postavljene na 1x10<-5>za analizu, pošto sporije vrednosti od ove ne bi mogle biti precizno određene. Vrednosti za koni koffsu prezentovane u tabelama dole kao srednja vrednost od pojedinačno izračunatih vrednosti za svako antitelo za svaku TG2 vrstu od više koncentracija /- 1 standardnim odstupanjem. KDvrednosti su izračunate kao srednja vrednost koff/ srednja vrednost kon.

Rezultati Biacore eksperimenata

[0410]

Tabela 25

[0411] Tabela 25 prikazuje kinetičke podatke dobijene protiv humanog TG2. Tamo gde je bilo izračunato da su koffvrednosti manje od 10<-5>s<-1>, onda su vrednosti bile postavljene na 10<-5>s<-1>radi analize, pošto vrednosti sporije od ove nisu mogle biti precizno određene.

11

Tabela 26

[0412] Tabela 26 prikazuje kinetičke podatke dobijene protiv makakijevog TG2. Tamo gde je bilo izračunato da su koffvrednosti manje od 10<-5>s<-1>, onda su vrednosti bile postavljene na 10<-5>s<-1>radi analize, pošto vrednosti sporije od ove nisu mogle biti precizno određene.

[0413] Slike 45 do 47 prikazuju primer Biacore setova podataka. Kao što se može videti, humanizovana i himerična antitela cAB003, cBB001, hAB004, hAB005, hBB001AA, hBB001BB, cDC001 za TG2 su imala odličan afinitet za humani i makakijev TG2, sa KDvrednostima od 120pM ili boljim. Himerična antitela cDH001 i cDD9001 odlikuju sporiji stepeni asocijacije za humani i makakijev TG2 i slabiji sveukupni afinitet. Ispitivanje selekcije antitela u odsustvu kalcijuma prikazuje da postoji mali efekat ili da ga nema, izuzev u slučaju cDH001 i cDD9001, gde je vezivanje slabije zbog većih stepena disocijacije (koff).

11

��

12

��

12

�

11

12

1

14

1

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

2

21

22

2

24

2

21

22

2

21

22

2

24

2

24

2

21

22

Claims

Patentni zahtevi 1.Antitelo ili njegov antigen – vezujući fragment i koji se selektivno vezuje za epitop unutar jezgra regiona humane transglutaminaze tipa 2 (TG2) i inhibira humanu TG2 aktivnost, pri čemu se navedeni deo jezgra sastoji od aminokiselina 143 do 473 humanog TG2, pri čemu se antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment selektivno vezuje za region koji sadrži aminokiseline 304 do 326 humanog TG2, a pri čemu je inhibirana humana TG2 aktivnost, koja je inhibirana, TG2 umrežavanje lizina i glutamina sa Ne (i-glutamil) lizin izopeptidnim vezama. 2.Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, koji ne inhibira TG1, TG3, TG13 i/ili TG7 aktivnost. 3.Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu antitelo ili njegov antigen vezujući fragment: a. Sastoji se od ili sadrži netaknuto antitelo, ili b. Sastoji se ili sadrži antigen – vezujući fragment, odabran iz grupe : Fv fragmenta (npr. jednolančani Fv fragment ili Fv fragment vezan disulfidom); fragment Fab; i fragment sličan Fabu (na primer fragment Fab ’ili fragment F(ab)2). 4.Antitelo ili antigen - vezujući fragment se prema bilo kom patentnom zahtevu, koje se vazuje za isti epitope kao I antitelo koje sadrži sledeće CDR- sekvence: KASQDINSYLT (LCDR1); RTNRLFD (LCDR2); LQYDDFPYT (LCDR3); SSAMS (HCDR1); TISVGGGKTYYPDSVKG (HCDR2); i LISLY (HCDR3). 5.Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje se nadmeće i narušava vezivanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji ima promenljivi region lakog lanca odabran iz sledećih sekvenci: 2

varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu

6. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, čije je vezivanje za humani TG2 inhibirano ili umanjeno kada antitelo imajući region lakog varijabilnog lanca odabran iz sledećih sekvenci:

2

varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu:

2

je vezan za humani TG2. 7. Polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva. 8.Jedinjenje koje sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kojem od prethodno navedenih zahteva 1 do 6 i neku drugu grupu, na primer lako detektabilnu grupu, i / ili direktno ili indirektno citotoksični deo. 2 9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodno navedenih patentnih zahteva od 1 do 6, ili polinukleotid prema patentnom zahtevu 7 ili jedinjenje prema zahtevu 8, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, adjuvansom, razblaživačem ili nosačem, opciono koji sadrži jedan ili više dodatnih aktivnih sastojaka. 10. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 9, prema kojem je kompozicija/formulacija formulisana za intravensku, intramuskularnu ili potkožno davanje pacijentu. 11.Kit od delova koji sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 6, ili polinukleotid prema patentnom zahtevu 7, ili jedinjenje prema patentnom zahtevu 8; i neki drugi agens. 12 . Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 6, ili polinukleotid prema patentnom zahtevu 7, ili jedinjenje prema patentnom zahtevu 8, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9 ili 10, za upotrebu u medicini. 13. Antitelo ili njegov antigen – vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 6, ili polinukleotid prema patentnom zahtevu 7, ili jedinjenje prema zahtevu 8, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9 ili 10, za upotrebu u lečenju i / ili dijagnozi celijačne bolesti, abnormalnog zarastanja rana, ožiljaka, hipertrofičnih ožiljaka, okularnog stvaranja ožiljaka, zapaljenskih bolesti creva, makularne degeneracije, psorijaze, bolesti povezanih sa fibrozom (npr. fibroza jetre, plućna fibroza kao što su intersticijalna bolest pluća i fibrotična bolest pluća, kardijalna fibroza, mijelofibroza, fibroza bubrega kao što su glomeruloskleroza i tubulointersticijska fibroza), ateroskleroza, restenoze, zapaljenskih bolesti, autoimune bolesti, neurodegenerativne / neurološke bolesti (npr. Huntingtonova bolest, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, poliglutaminska bolest, spinobulbarna mišićna atrofija, dentatorubropalido-lujzijanska atrofija, spinocerebralne ataksije 1, 2, 3, 6, 7 i 12, rubro-palido atrofija, spinocerebelarna paraliza), glioblastomi poput glioblastoma kod Li-Fraumenijevog sindroma i sporadični glioblastom, maligni melanomi, pankreasni duktalni adenokarcinomi, mijelodisplastični sindrom, mijeloproliferativni sindrom, ginekološki kancer, Kapošijev sarkom, Hansenova bolest i/ili kolageni kolitis. 14. Postupak za proizvodnju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačen time što se sastoji od izolovanja antitela ili njegovog antigen- 2 vezujućeg fragmenta iz ex-vivo uzorka dobijenog od ne-humane životinje koja je prethodno bila imunizovana korišćenjem: a) Jedinjenje koje sadrži: i) polipeptidna sekvenca koja se sastoji od polipeptidne sekvence aminokiselina 143 do 473 humanog TG2, ili ii) ii) polipeptidna sekvenca koja se sastoji od aminokiselina 304 do 326 humanog TG2; i, b) Opciono adjuvanta; i pri čemu metoda dalje obuhvata korak izbora antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta na osnovu njegovog selektivnog vezivanja za region koji sadrži aminokiseline 304 do 326 humanog TG2 do TG2 i njegove inhibicije humane aktivnosti TG2, pri čemu je Inhibirana aktivnost TG2 umrežavanje lizina i glutamina sa Nε(γ-glutamil)lizin izopeptidnim vezama. 2