RS61363B1 - Postupak za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana u preživarima - Google Patents

Description

Opis

POLJE PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na postupak za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana u preživarima.

POREKLO PRONALASKA

[0002] Metan (CH4) je gas staklene bašte (GHG) koji primarno produkuju metanogenični mikrobi nađeni u prirodnim ekosistemima (na primer močvare, okeani i jezera) i u gastrointestinalnom traktu bezkičmenjaka i kičmenjaka, kao što su termiti i preživari. Svake godine ~429-507 Tg CH4se ukloni iz atmosfere i ~40 Tg iz stratosfere reakcijama sa hidroksilnim (OH) radikalima; a ~30 Tg bakterijama u zemlji koje oksidišu CH4.

[0003] Uprkos tome, antropogenične emisije GHG su se brzo povećavale, uz koncentraciju CH4u atmosferi koja je sada više od dva puta veća nego u ranim 1800-tim. Metan je veoma efikasan u apsorpciji sunčevog infracrvenog zračenja i ima potencijal globalnog zagrevanja 25 puta veći nego CO2. Zbog toga njegova akumulacija u atmosferi značajno doprinosi klimatskim promenama. Jedan od glavnih izvora antropogeničnog CH4može da se pripiše agrokulturnim aktivnostima, uključujući uzgajanje preživara.

[0004] U skladu sa novim izveštajem UN, uzgoj goveda generiše više globalnog zagrevanja gasovima staklene bašte, merenjem CO2kao ekvivalentom, nego transport. U Australiji se procenjuje da preživari učestvuju ~10% ukupne GHG emisije. Preživari produkuju CH4kao sporedni produkt anaerobne mikrobiološke fermentacije hrane u buragu i, u manjoj meri, u debelom crevu. Mikrobna zajednica preživara je veoma raznolika i sastavljena od bakterija, protozoa, gljivica i bakteriofaga koji kolektivno deluju na fermentaciju unete organske materije (OM), što dovodi do oslobađanja CO2, H2, isparljivih masnih kiselina (VFAa) i formata. Metanogena arhea prisutna u buragu koristi ove krajnje produkte i produkuje CH4. Mada produkcija CH4smanjuje parcijalni pritisak H2, što bi s druge strane moglo da inhibira fermentciju u buragu, ona takođe smanjuje količinu energije i ugljenika raspoloživog za formiranje VFAa bitnih za ishranu preživara. Najveći deo CH4koji se stvara u preživarima životinja izdahne i izbaci i to predstavlja gubitak od do 12% od ukupne unete energije. Dubois i saradnici, (American Journal of Plant Sciences, 2013 (4):34-43) su razmatrali efekte tropskih algi kao aditiva na in vitro stvaranje gasa u buragu i na karakteristike fermentacije.

[0005] Strategije ublažavanja kojom se smanjuje formiranje enteričnog CH4su važne, a postupci za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana u preživarima predstavljaju veliki izazov.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

[0006] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ne-terapeutski postupak za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana u preživarima, uključujući efektivnu količinu najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi za primenu na tim preživarima, pri čemu su navedene vrste crvenih morskih makroalgi Asparagopsis vrste.

[0007] U jednom ostvarenju vrsta Asparagopsis je A. taxiformis.

[0008] U jednom ostvarenju, efektivna količina najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi se primenjuje na navedenom preživaru obogaćivanjem hrane namenjene navedenoj životinji sa navedenom efektivnom količinom najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi.

[0009] U nekim ostvarenjima se održavaju efektivne vrednosti poželjnih isparljivih masnih kiselina.

[0010] U jednom ostvarenju, smanjen je odnos acetata prema propionatu.

[0011] U narednom ostvarenju, održava se nivo razgrađene organske materije i/ili suve materije.

[0012] U još jednom ostvarenju, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi se primenjuje u dozi od najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.250.125 ili 0.067% organske materije primenjene na preživaru.

[0013] Količina ukupne produkcije gasa fermentacijom preživara in vitro može da se smanji za najmanje 61% u odnosu na količinu ukupne produkcije gasa kada se oguljeno seme pamuka podvrgne fermentaciji preživara in vitro.

[0014] U narednom aspektu, produkcija metana u preživarima je smanjena za najmanje 11% u odnosu na količinu produkovanog metana u preživarima kojima se daje oguljeno seme pamuka.

[0015] U narednom aspektu, produkcija metana u preživarima je smanjena za najmanje 15% ud odnosu na količinu produkovanog metana u preživarima kojima se daje oguljeno seme pamuka.

[0016] Količina produkovanog metana fermentacijom preživara in vitro može takođe da se smanji za najmanje 98.8% u odnosu na produkciju metana kada se oguljeno seme pamuka podvrgne fermentaciji preživara in vitro.

[0017] U narednom aspektu, produkcija metana u preživarima je smanjena za najmanje 53% u odnosu na količinu produkovanog metana u preživarima podvrgnutih ishrani sa lupinom.

[0018] U jednom ostvarenju, navedeni preživar je izabran iz grupe Ruminantia and Tylopoda podgrupe. U narednom ostvarenju, navedeni preživar je govedo ili ovca. U narednom ostvarenju, navedeni preživar je govedo.

[0019] U narednom ostvarenju, postupak dalje uključuje primenu na navedenom preživaru efektivne količine najmanje jedne vrste makroalgi izabrane iz grupe koja se sastoji od Dictyota spp (na primer Dictyota bartayresii), Oedogonium spp, Ulva spp i C. patentiramea.

[0020] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ne-terapeutsku upotrebu dodatka hrani za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana u preživarima, a navedeni dodatak uključuje efektivnu količinu najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi, pri čemu su navedene vrste crvenih morskih makroalgi Asparagopsis vrste. U narednom ostvarenju, vrsta Asparagopsis je A. taxiformis.

[0021] U narednom ostvarenju, dodatak dalje uključuje efektivnu količinu najmanje jedne vrste makroalgi izabrane iz grupe koja se sastoji od Dictyota spp (na primer Dictyota bartayresii), Oedogonium spp, Ulva spp i C. patentiramea.

[0022] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ne-terapeutsku upotrebu hrane za smanjenje produkcije metana u preživarima, pri čemu je navedena hrana obogaćena sa dodatkom hrani koji je ovde opisan.

[0023] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ne-terapeutski postupak za smanjenje produkcije metana u preživarima, a navedeni postupak uključuje da se ovde opisani dodatak hrani ili hrana koja je ovde opisana primenjuje na toj životinji.

KRATAK OPIS SLIKA

[0024]

Slika 1 pokazuje ukupnu produkciju gasa (TGP) (ml.g<-1>OM) pri anaerobnoj fermentaciji in vitro u prisustvu vrsta makroalgi nakon 72 h inkubacionog perioda. Traka sa greškama predstavlja ±SE (n=4). Potpuni nazivi vrsta su dati u Tabeli 1. Ova slika pokazuje da Dictyota i Asparagopsis spp. smanjuju ukupnu produkciju gasa pri anaerobnoj fermentaciji.

Slika 2 pokazuje produkciju metana (CH4) (ml.g<-1>OM) pri anaerobnoj fermentaciji in vitro za 24, 48 i 72 h u prisustvu vrsta makroalgi. Traka sa greškama predstavlja ±SE (n=3-4). Potpuni nazivi vrsta su dati u Tabeli 1. Ova slika pokazuje da Dictyota i Asparagopsis spp. smanjuju produkciju metana pri anaerobnoj fermentaciji.

Slika 3 pokazuje analizu višedimenzionalnog skaliranja (MDS) za ilustraciju sličnosti između vrsta makroalgi na osnovu biohemijskih i post-fermentaionih parametara. (A) MDS grafik (pritisak = 0.11) distribucije vrsta u okviru prostora delovanja. Vrste unutar sive grupe imaju najveću produkciju TGP i CH4, dok vrste unutar isprekidane linije sive grupe imaju najmanju produkciju TGP i CH4. (B) pokazuje MDS vektore sa Pearson-ovim koeficijentima korelacije (r) večim od 0.7 superimponirano. (C) pokazuje parametre superimponiranih vektora postfermentacije (zabeleženi svi koeficijenti korelacije manji od 0.7, videti Tabelu 2). Beli i plavi trouglovi: zelene slatkovodne alge, zeleni trouglovi: zelene morske alge, braon kružići: smeđe alge, crveni rombovi: crvene alge; i kvadratići: DSC. Puni nazivi vrsta su dati u Tabeli 1. Ova slika pokazuje da su vrste (na primer Dictyota, Asparagopsis spp.) koje smanjuju produkcije metana i/ili TGP pri anaerobnoj fermentaciji rasprostranjene u celom MDS bi-grafiku, a ove promenljive nisu u čvrstoj korelaciji sa bilo kojom od glavnih biohemijskih promenljivih koje ometaju širenje vrsta u okviru MDS.

Slika 4 pokazuje višestruke varijante klasifikacije i regresije u modelu stabla. Ovaj CART se zasniva na biohemijskim promenama koje objašnjavaju 79.1 % promenljivosti u ukupnoj produkciji gasa (TGP), produkciji CH4i molarnim odnosima acetata (C2) i propionata (C3). Rezultat je transformisan kao četvrti koren. Brojevi u zagradama pokazuju broj vrsta grupisanih u svakoj terminalnoj grani. Ova slika pokazuje da je cink bio nezavisna promenljiva i da je bio od najveće važnosti u multivarijantnom CART modelu, što ukazuje da cink može da uzajamno deluje sa drugim biohemijskim promenljivim specifičnim za Dictyota i Asparagopsis vrste.

Slika 5 pokazuje linearni odnos između ukupne produkcije gasa (ml.g<-1>OM) i CH4(ml.g<-1>OM) in vitro za vrste mikroalgi u poređenju sa brašnastim oljuštenim semenom pamuka (DCS). Pojedinačne tačke rezultata predstavljaju srednje vrednosti (mg.g<-1>OM, 6 SE) za svaku vrstu.

Slika 6 pokazuje ukupnu produkciju gasa za Asparagopsis (A) i Oedogonium (B) in vitro nakon 72 h perioda inkubacije. Traka sa greškama predstavlja ±SE (n=4). Ova slika pokazuje da Asparagopsis i Oedogonium spp. smanjuju ukupnu produkciju gasa anaerobne fermentacije in vitro. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis i Oedogonium spp. smanjuju ukupnu produkciju gasa anaerobne fermentacije u zavisnosti od doza.

Slika 7 pokazuje ukupnu produkciju gasa u prisustvu Asparagopsis, Oedogonium i trave Rodos (kontrola) za 72 h. Ova slika pokazuje da Asparagopsis i Oedogonium spp. smanjuju ukupnu produkciju gasa anaerobne fermentacije in vitro. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis i Oedogonium spp. smanjuju ukupnu produkciju gasa anaerobne fermentacije u zavisnosti od doze. Traka sa greškama predstavlja ±SE.

Slika 8 pokazuje razgradnju organske materije (%) u prisustvu Asparagopsis, Oedogonium i trave Rodos (kontrola) nakon 72 h anaerobne inkubacije in vitro. Ova slika pokazuje da Asparagopsis i Oedogonium spp. anaerobnom fermentacijom smanjuju količinu razgrađene organske materije u zavisnosti od doze. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis spp. ne smanjuje količinu razgrađene organske materije u dozama koje inhibiraju ukupnu produkciju gasa i metana. Traka sa greškama predstavlja ±SE.

Slika 9 pokazuje razgradnju suve materije (%) u prisustvu Asparagopsis, Oedogonium i trave Rodos (kontrola) nakon 72 h anaerobne inkubacije in vitro. Ova slika pokazuje da Asparagopsis i Oedogonium spp. anaerobnom fermentacijom smanjuju količinu razgrađene suve materije u zavisnosti od doze. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis ne smanjuje količinu razgrađene suve materije u dozama Asparagopsis koje inhibiraju ukupnu produkciju gasa i metana. Traka sa greškama predstavlja ±SE.

Slika 10 pokazuje prosečnu produkciju CH4kao % ukupne produkcije gasa za 24 i 72 h anaerobne inkubacije in vitro. Ova slika pokazuje da Asparagopsis smanjuje produkciju CH4kao % TGP anaerobne fermentacije. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis smanjuje produkciju CH4kao % TGP anaerobme fermentacije u zavisnosti od doze. Traka sa greškama predstavlja ±SE

Slika 11 pokazuje prosečnu produkciju CH4u (ml.g<-1>OM) Asparagopsis-a, Oedogoniuma i trave Rodos (kontrola) za 24 i 72 h anaerobne inkubacije in vitro. Traka sa greškama predstavlja ±SE. Ova slika pokazuje da Asparagopsis smanjuje produkciju CH4anaerobne fermentacije. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis smanjuje produkciju CH4anaerobne fermentacije u zavisnosti od doze. Traka sa greškama predstavlja ±SE

Slika 12 pokazuje odnos između ukupne produkcije gasa (ml.g<-1>OM) i metana (ml.g<-1>OM) Asparagopsis-a, Oedogoniuma i trave Rodos (kontrola) za 24 i 72 h anaerobne inkubacije in vitro. Traka sa greškama predstavlja ±SE.

Slika 13 pokazuje prosečnu produkciju (A) ukupnih isparljivih masnih kiselina (VFA) i odnose acetata i propionata (B) u in vitro eksperimentu odgovora na dozu. Ova slika pokazuje da Asparagopsis ne smanjuje količinu VFAa u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju ukupnu produkciju gasa i metana. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis ne smanjuje količinu VFAa u dozama Asparagopsis-a koje anaerobnom fermentacijom ne smanjuju količinu razgrađene organske materije ili suve materije. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis smanjuje odnos acetata i propionata u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju ukupnu produkciju gasa i metana. Zajedno sa Tabelom 8, ovi rezultati takođe pokazuju da Asparagopsis povećava količinu propionata u dozama Asparagopsis-a koje anaerobnom fermentacijom ne smanjuju količinu razgrađene organske materije ili suve materije. Zajedno sa Tabelom 8, ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis smanjuje količinu acetata u dozama Asparagopsis-a koje anaerobnom fermentacijom ne smanjuju količinu razgrađene organske materije ili suve materije.

Slika 14 pokazuje prosečnu produkciju metana za volove hranjene Flinders travom (Iseilema sps.) kao osnovnom hranom ili hranjenih Flinders travom (Iseilema sps.) sa Asparagopsis kao osnovnom hranom. Traka sa greškama predstavlja SD. Ova slika pokazuje da primena Asparagopsis spp. smanjuje produkciju metana in vivo u životinjama hranjenih stočnom hranom niskog kvaliteta.

Slika 15 pokazuje prosečnu produkciju metana u g.kg<-1>DMI (A) i g.d<-1>(B) za volove koji ispoljavaju konzistentni odgovor na tretman Asparagopsis-om. Ova slika pokazuje da Asparagopsis smanjuje produkciju metana in vivo. Traka sa greškama predstavlja ±SE. Broj u zagradama pokazuje broj volova po tretmanu.

Slika 16 pokazuje prosek uzimanja hrane u toku sedam dana za volove izraženo kao unošenje suve materije (kg.d<-1>). Broj u zagradama pokazuje broj volova po tretmanu. Ova slika pokazuje da Asparagopsis ne smanjuje unošenje suve materije in vivo. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis ne smanjuje unos suve materije in vivo u dozama Asparagopsis koje inhibiraju ukupnu produkciju gasa i metana in vivo. Traka sa greškama predstavlja ±SE.

Slika 17 pokazuje prosek ukupne produkcije (A) isparljivih masnih kiselina (VFA) i odnose acetata i propionata (B) kod volova. Traka sa greškama predstavlja ±SE (n=2). Ova slika pokazuje da Asparagopsis ne smanjuje količinu produkcije ukupnih VFA (indikator funkcije buraga) u dozama Asparagopsis-a kojima inhibira produkciju metana in vivo. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis ne smanjuje ukupnu VFA u dozama Asparagopsis-a kojima ne smanjuje količinu unosa suve materije in vivo. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis smanjuje odnos acetata i propionata u dozama Asparagopsis-a kojima inhibira ukupnu produkciju gasa i metana nakon 15 i 30 dana tretmana. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis smanjuje odnos acetata i propionata u dozama Asparagopsis-a kojima se ne smanjuje količina uzimanja organske materije ili suve materije.

Slika 18 pokazuje prosečnu produkciju metana u g.kg<-1>DMI za ovce hranjene peletiranom hranom obogaćenom sa ili bez Asparagopsis-a na dnevnom nivou. Pokazane su različite doze Asparagopsis-a (kao % organske materije). Ova slika pokazuje da Asparagopsis smanjuje produkciju metana in vivo. Odgovor na dozu je značajan, sa povećanjem doza Asparagopsis-a (kao % organske materije) iznad 0.5% ba bazi OM, što dovodi do smanjenja produkcije metana između 53% i 80%. Traka sa greškama predstavlja ±SE. Zajedno sa Tabelama 10 i 11, ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis smanjuje količinu produkovanog metana u dozama Asparagopsis-a kojima ne smanjuje količinu razgrađene organske materije ili suve materije anaerobnom fermentacijom i da Asparagopsis smanjuje količinu produkovanog metana u dozama Asparagopsis-a koje ne utiču negativno na molarnu koncentraciju propionata i kojima se smanjuje odnos acetata i propionata.

DETALJAN OPIS

[0025] Postupci i upotrebe za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana u preživarima u skladu sa pronalaskom su ne-terapeutski postupci i upotrebe.

[0026] Ovaj pronalazak se odnos i na ne-terapeutski postupak za smanjenje ukupne produkcije gasa (TGP) i/ili produkcije metana (CH4) u preživarima. Preciznije, naši pronalazači su pokazali da crvene morske makroalge poseduju osobinu za smanjenje produkcije metana u preživarima.

[0027] Slike 1, 6 i 7 pokazuju smanjenje ukupne produkcije gasa in vitro anaerobnom fermentacijom (ovde takođe označena kao fermentacija buraga) u prisustvu crvenih morskih makroalgi. Slika 2, 10 i 11 pokazuju smanjenje produkcije metana in vitro pri anaerobnoj fermentaciji u prisustvu crvenih morskih makroalgi. Slike 14, 15 i 18 pokazuju smanjenje produkcije metana u preživarima in vivo primenom crvenih morskih makroalgi.

[0028] Pronalazak se prema tome odnosi na ne-terapeutski postupak za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana u preživarima koji uključuje efektivnu količinu najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi za primenu na navedenim preživarima, pri čemu je navedena vrsta crvenih morskih makroalgi Asparagopsis vrsta.

[0029] Kako se ovde koristi, izraz "smanjenje" uključuje smanjenje količine supstance u poređenju sa referencom. Na primer, smanjenje količine produkovanog ukupnog gasa i/ili metana u preživarima ili životinja na kojima je primenjena kompozicija koja sadrži crvene morske makroalge u skladu sa ovim pronalaskom, u odnosu na životinju ili životinje na kojima nije primenjena kompozicija koja sadrži kompoziciju crvenih morskih makroalgi iz ovog pronalaska. Smanjenje može da se meri in vitro sa sistemom veštačkog buraga koji simulira anaerobnu fermentaciju, ili in vivo sa životinjama zatvorenim u respiracionim komorama. Stručnjaci sa znanjem i iskustvom u tehnici mogu da procene enteričke metanogeneze preživara.

[0030] Kako se ovde koristi, izraz "anaerobna fermentacija" treba da obuhvati anaerobnu fermentaciju in vivo, na primer, u preživarima.

[0031] Kako se ovde koristi, izraz ’smanjenje ukupne produkcije gasa’ se odnosi na smanjenje ukupne količine produkovanog gasa, na primer ukupnu količinu gasa produkovanog u gastrointestinalnom traktu. Naziv uključuje ukupnu zapreminu svih gasova nastalih kao rezultat anaerobne fermentacije, na primer, u sistemima koji su ovde opisani. Fermentacija u buragu i crevima preživara dovodi do porasta produkcije gasa, uključujući metan. Ovaj pronalazak ima za cilj da smanji ovaj proces, tako da smanji ukupnu količinu gasa produkovanog u gastrointestinalnom traktu. Stručnjak sa znanjem i iskustvom u tehnici će znati da proceni ukupnu produkciju gasa u preživarima.

[0032] Kako se ovde koristi, izraz ″smanjenje produkcije metana″ se odnosi na smanjenje produkcije metana u gastrointestinalnom traktu. Naziv uključuje specifičnu zapreminu metana nastalog kao rezultat anaerobne fermentacije, na primer, u sistemima koji su ovde opisani. Fermentacija u buragu i crevima preživara dovodi do porasta produkcije metana. Ovaj pronalazak ima za cilj da smanji ovaj proces, tako da smanji ukupnu količinu metana produkovanog u gastrointestinalnom traktu. Stručnjak sa znanjem i iskustvom u tehnici će znati da proceni ukupnu produkciju metana u preživarima.

[0033] Ova studija daje prvi dokaz da makroalge mogu efikasno da smanje produkciju metana a naši pronalazači su pokazali da sve vrste imaju sličnu ili manju produkciju TGP i CH4u odnosu na pozitivnu kontrolu oguljenog semena pamuka (DCS). Važno je da se oguljeno seme pamuka koristi kao dodatak hrani za goveda zbog toga što značajno smanjuje produkciju CH4u poređenju sa drugim visoko energetskim žitaricama. Smanjenje ukupne produkcije gasa, u poređenju sa DCS, je slično među vrstama, što ukazuje da makroalge smanjuju produkciju TGP i CH4preživara u odnosu na visoko energetske žitarice, a neke makroalge smanjuju produkciju TGP i CH4preživara u odnosu na DCS pozitivnu kontrolu.

[0034] Na primer, naši pronalazači su pokazali da Cladophora patentiramea ima najmanji TGP od zelenih morskih makroalgi, produkujući ukupno 79.7 mL.g<-1>OM (Slika 1b). Dictyota je najefikasnija vrsta smeđih makroalgi, koja redukuje TGP za 59.4 mL.g<-1>OM nakon 72 h (Slika 1c), što za rezultat ima značajno manji TGP (53.2%) nego za oguljeno seme pamuka (DCS) kao pozitivne kontrole (Slika 1c, Tukey’s HSD 72 h, p<0.0001). Ovaj rezultat je čak veći za 24 h (TGP = 76.7 % manje nego DCS). Druge smeđe makroalge smanjuju TGP za >10%, sa Padina, Cystoseira i Colpomenia značajno redukujući TGP u poređenju sa DCS (Tabela 2, Tukey’s HSD 72 h, p<0.02). Najefikasnija od svih makroalgi je crvena alga Asparagopsis (Slika 1d) sa najmanjim TGP, 48.4 mL.g<-1>OM.

1

[0035] Osim toga, naši istraživači su pokazali da produkcija CH4generalno prati isti obrazac za TGP, kako je prethodno opisano i u Primerima i ono što je značajno, produkcija CH4je direktno i u velikoj meri povezana sa TGP vrednostima. Na primer, pozitivna kontrola DCS ima najveći učinak CH4, produkujući 18.1 mL.g<-1>OM za 72 h. Asparagopsis, Dictyota i C. patentiramea takođe imaju jako izraženi efekat na smanjenje produkcije CH4in vitro. C. patentiramea ima učinak CH4od 6.1 mL.g<-1>OM (Tabela 1) i produkuje 66.3% manje CH4nego DCS (Slika 2b, Tukey’s HSD 72 h, p<0.0001). Dictyota produkuje1.4 mL.g<-1>OM i ima najveći efekat od smeđih makroalgi, smanjujući učinak CH4za 92% (Slika 2c, Tabela 2, Tukey’s HSD 72 h, p<0.001) i koncentraciju CH4u TGP, 23.4 mL.L<-1>, za 83.5% u poređenju sa DCS (Tabela 2).

[0036] Asparagopsis ima najmanji učinak CH4od svih vrsta makroalgi produkujući maksimum od 0.2 mL.g<-1>OM u toku celog perioda inkubacije (Tabela 2, Tukey’s HSD 72 h, p<0.001). To je smanjenje od 98.9% učinka CH4u poređenju sa DCS (Slika 2d), nezavisno od vremena. Značajno je, Asparagopsis takođe ima najmanju koncentraciju CH4u TGP produkujući samo 4.3 mL.L<-1>CH4po litri TGP nakon 72 h, čime se izdvaja od svih drugih vrsta (Tabela 2).

[0037] U preferiranim ostvarenjima pronalaska, količina ukupno produkovanog gasa je smanjena za najmanje 90%, 80%, 70%, 61%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ili 10% u poređenju sa referencom. U jednom ostvarenju, referenca je količina ukupno produkovanog gasa kada se na životinjama ne primenjuje efektivna količna bar jedne vrste crvenih morskih algi. U narednom ostvarenju, referenca je količina ukupno produkovanog gasa kada se na životinjama primenjuje oguljeno seme pamuka. U narednom ostvarenju, referenca je količina ukupno produkovanog gasa kada je oguljeno seme pamuka podvrgnuto anaerobnoj fermentaciji in vitro.

[0038] U jednom ostvarenju, količina ukupno produkovanog gasa fermentacijom u buragu in vitro je smanjena za najmanje 61.8% u odnosu na količinu ukupno produkovanog gasa kada je oguljeno seme pamuka podvrgnuto fermentaciji u buragu in vitro.

[0039] U preferiranim ostvaranjima pronalaska, količina produkovanog metana je smanjena za najmanje 90%, 80%, 70%, 61%, 60%, 53%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 11% ili 10% u poređenju sa referencom. U jednom ostvarenju, referenca je količina produkovanog metana kada na životinjama nije primenjena efektivna količna najmanje jedne vrste crvenih morskih algi. U narednom ostvarenju, referenca je količina produkovanog metana kada se na životinjama primenjuje oguljeno seme pamuka. U narednom ostvarenju, referenca je količina produkovanog metana kada se na životinjama primeni peletirana komercijalno isporučena hrana na bazi lupina, ovsa, ječma, pšenice sa žitnom slamom kao sirovom komponentom [hemijska kompozicija (g/kg DM) pepeo, 72; sirovi protein (CP) 112; prirodna deterdžentska vlakna (aNDFom) 519; kisela deterdžentska vlakna (ADFom) 338 i bez kobalta, selena i modifikatora buraga], sa dodatnom količinom usitnjenih lupina ovde označenih kao ″lupin hrana″. U narednom ostvarenju, referenca je količina produkovanog metana kada je lupin ishrana podvrgnuta anaerobnoj fermentaciji in vitro.

[0040] U jednom ostvarenju, količna produkovanog metana fermentacijom u buragu in vitro je smanjena za najmanje 98.8% u poređenju sa količinom produkovanog metana kada je fermentaciji u buragu podvrgnuto oguljeno seme pamuka in vitro.

[0041] U jednom ostvarenju, količna produkovanog metana je smanjena za najmanje 10% u poređenju sa količinom produkovanog metana kada se na preživaru primeni oguljeno seme pamuka.

[0042] U jednom ostvarenju, količna produkovanog metana je smanjena za najmanje 15% u poređenju sa količinom produkovanog metana kada se na preživaru primeni oguljeno seme pamuka.

[0043] Naši pronalazači su takođe pokazali da Asparagopsis može efikasno da smanji produkciju metana u odnosu na pozitivnu kontrolu lupin hrane kod ovaca. U jednom ostvarenju, količna produkovanog metana je smanjena za najmanje 53% u poređenju sa količinom produkovanog metana kada se na preživaru primeni lupin hrana.

[0044] Pod "efektivnom količinom" se podrazumeva količina najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi dovoljna da omogući poboljšanje, na primer smanjenje količine produkovanog metana u poređenju sa referencom ili kontrolom, smanjenje količine ukupno produkovanog gasa u poređenju sa referencom ili kontrolom, održavanje efektivne vrednosti poželjnih isparljivih masnih kiselina u poređenju sa referencom ili kontrolom, smanjenje odnosa acetata i propionata u poređenju sa referencom ili kontrolom, održavanje težinu žive vage, unošenja suve materije i/ili unošenja organske materije u poređenju sa referencom ili kontrolom. U okviru značenja u ovom pronalasku, reduktivni efekat na metan u buragu može da se meri sa sistemom veštačkog buraga, kao što su opisali T. Hano., J. Gen. Appl.

Microbiol., 39, 35-45,1993 ili oralnom primenom na preživarima in vivo.

[0045] Prema tome, najmanje jedna vrsta crvenih morskih algi može da se primeni u dozi od preferirano najmanje 16.67, 10, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.250.125 ili 0.067% organske materije primenjene na preživaru.

[0046] U preferiranom ostvarenju, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi se primenjuje u dozi od preferirano najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.250.125 ili 0.067% organske materije primenjene na preživaru.

[0047] Na primer, ukoliko preživar težine 450 kg (na primer vo) uzima hranu u količini od 2.5% do 3% svoje telesne težine dnevno, tada se najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi primenjuje u dozi proporcionalnoj sa količinom organske materije koja se primenjuje na preživaru. U slučaju preživara težine 450 kg i kada 80% hrane čini organska materija, ukoliko životinja konzumira približno 2.5% svoje telesne težine dnevno, tada se najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi primenjuje u dozi od približno 0.27, 0.18, 0.09, 0.045, 0.0225, 0.01125 ili 0.00603 kg po danu da se dobije doza od najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.250.125 ili 0.067% primenjene organske materije na preživaru.

[0048] U slučaju preživara težine 450 kg, ukoliko životinja uzima hranu u količini od približno 3% od svoje telesne težine dnevno i kada je 80% hrane organska materija, tada se najmanje jedna vrsta crvenih morskih algi primenjuje u dozi od približno 0.324, 0.216, 0.108, 0.054, 0.027, 0.0135 ili 0.007236 kg po danu da se dobije doza od najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.25 0.125 ili 0.067% organske materije primenjene na preživaru.

[0049] Efektivna količina najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi može da se odredi postupcima koji su ovde opisani, uključujući ovde opisane in vitro i in vivo studije odgovora na dozu. Na primer, naši istraživači su pokazali da in vitro fermentacija u buragu može da se koristi za ispitivanje efekta količine najmanje jedne vrste crvenih morskih algi na vrednosti isparljivih masnih kiselina, uključujući acetat i propionat, produkciju metana i ukupnu produkciju gasa. Prema tome, in vitro fermentacija u buragu može da se koristi za karakterizaciju doza najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi koje u efektivnoj količini mogu da budu dovoljne da omoguće poboljšanje, na primer smanjenje količine produkovanog metana u poređenju sa referencom ili kontrolom, smanjenje količine ukupno produkovanog gasa u poređenju sa referencom ili kontrolom, održavanje efektivnih vrednosti željenih isparljivih masnih kiselina u poređenju sa referencom ili kontrolom ili smanjenje odnosa acetata i propionata u poređenju sa referencom ili kontrolom.

[0050] Preživari su sisari iz roda Artiodactyla koji uzimaju biljnu hranu tako što je prvo omekšavaju i delimično fermentišu u prvoj komori želuca životinje, a nakon toga vraćaju polusvarenu masu, poznatu kao prežvakana hrana i ponovo je žvaću.

[0051] Proces ponovnog žvakanja prežvakane hrane za dalje usitnjavanje biljne mase i stimulaciju varenja se naziva "prežvakavanje". Preživari imaju digestivni trakt sa četiri

1

komore, označene kao burag, mrežavac, listavac i sirište. U prve dve komore, buragu i mrežavcu, hrana se meša sa pljuvačkom i razdvaja u slojeve čvrstog i tečnog materijala. Čvrsti materijali se skupe zajedno i formiraju prežvakanu masu ili bolus. Prežvakana masa se nakon toga povrati, polako žvaće do potpunog mešanja sa pljuvačkom, koja dalje razgrađuje vlakna. Vlakna, posebno celuloza, se u ovim komorama razgrađuje u glukozu simbiotskim anaerobnim bakterija, protozoama i gljivicama. Razgrađena vlakna, koja su sada u tečnom delu sadržaja, nakon toga prolaze kroz burag u sledeću komoru želuca, listavac. U listavcu se hrana vari slično kao da je u monogastričnom želucu. Svareni sadržaji creva se konačno šalju u tanko crevo gde dolazi do apsorpcije hranljivih sastojaka. Skoro svu količinu glukoze dobijenu razgradnjom celuloze koriste simbiotske bakterije. Preživari dobijaju svoju energiju od isparljivih masnih kiselina kratkog lanca (VFAa) koje produkuju bakterije, to jest, od acetata, propionata, butirata, valerata i izovalerata.

[0052] Važno je da su pronalazači pokazali da crvene morske makroalge poseduju osobinu da smanjuju ukupnu produkciju gasa i/ili produkciju metana preživara bez ugrožavanja fermentacije u buragu.

[0053] Na primer, pronalazači su pokazali da crvene morske makroalge poseduju osobinu da smanjuju ukupnu produkciju gasa i/ili produkciju metana preživara bez ugrožavanja fermentacije u buragu, na primer, uz održavanje efektivnih nivoa željenih isparljivih masnih kiselina.

[0054] Pronalazači su takođe pokazali da crvene morske makroalge poseduju osobinu da smanjuju ukupnu produkciju gasa i/ili produkciju metana preživara bez ugrožavanja fermentacije u buragu, na primer, a da pritom značajno ne poremete dnevno uzimanje hrane i/ili težinu životinje.

[0055] Kako se ovde koristi, izraz "efektivne vrednosti", uključuju količinu supstance u životinji ili životinjama nakon tretmana (na primer primene najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi) koja se značajno ne razlikuje od kontrole ili reference, uključujući količinu supstance u životinji ili životnjama na kojima nije primenjena kompozicija koja sadrži crvene morske makroalge u kompoziciji iz ovog pronalaska.

[0056] Na primer, "efektivna količina isparljivih masnih kiselina" treba da uključi količinu jedne ili više isparljivih masnih kiselina koju produkuje preživar ili životinje na kojima nije primenjena kompozicija sa crvenim morskim makroalgama u skladu sa ovim pronalaskom.

[0057] Metabolizam ugljenih hidrata obezbeđuje energiju za rast mikroba u buragu prvenstveno fermentacijom celuloze i skroba. Nerastvorljivi polimeri se konvertuju u oligosaharide i rastvorljive šećere ekstracelularnim enzimima iz mikroorganizama buraga. Nastali šećeri se nakon toga fermentuju u jedan od različitih oblika isparljivih masnih kiselina, ugljen dioksid i vodonik. Kako se ovde koristi, isparljive masne kiseline, sirćetna kiselina, propanoatna kiselina i butirna kiselina takođe su označene kao acetat, propionat i butirat, tim redom.

[0058] Životinje koriste isparljive masne kiseline kao izvore primarnog ugljenika i energije sa različitim stepenom efikasnosti. Poželjne su visoke vrednosti propionatne kiseline zato što je propionatna kiselina primarni metabolički prekursor za glukogeneze kod životinja.

Fermentacija šećera sa 6-ugljenika u sirćetnu kiselinu je relativno neefikasna zbog toga što se u ovom procesu gube ugljenik i vodonik eruktacijom u obliku ugljen dioksida ili još važnije, metana. Sa druge strane, produkcija propionatne kiseline koristi vodonik i za rezultat nema gubitak ugljenika ili metana.

[0059] Tako postaje moguće da se poboljša efikasnost iskorišćenosti hrane i/ili brzina rasta preživara porastom molarne proporcije propionatne kiseline u odnosu na sirćetnu kiselinu, ili u narednom ostvarenju, povećanjem ukupne koncentracije isparljivih masnih kiselina (to jest, zbir sirćetne, propionatne i butiratne kiseline) u buragu.

[0060] Naši pronalazači su pokazali smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana anaerobnom fermentacijom in vitro i in vivo u prisustvu crvenih morskih makroalgi bez negativnog uticaja na produkciju ukupnih VFA kod goveda. Slika 13 A pokazuje da Asparagopsis održavaju efektivn vrednosti VFAa u toku anaerobne fermentacije in vitro. Ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis smanjuje odnos acetata i propionata u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju ukupnu produkciju gasa i metana. Zajedno sa Tabelom 8, ovaj rezultat takođe pokazuje da Asparagopsis smanjuju količinu acetata i povećavaju količinu propionata u dozama Asparagopsis-a koje anaerobnom fermentacijom ne smanjuju količinu razgrađene organske materije ili suve materije. Slika 17 pokazuje da Asparagopsis ne utiču negativno na količinu VFAa u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju produkciju metana in vivo u govedima i dozama Asparagopsis-a koje ne smanjuju količinu unosa suve materije in vivo. Ovi rezultati takođe pokazuju da Asparagopsis smanjuju odnos acetata i propionata u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju ukupnu produkciju gasa i metana za 15 i 30 dana tretmana, a Asparagopsis smanjuju odnos acetata i propionata u dozama Asparagopsis-a koje ne smanjuju količinu unosa organske materije ili suve materije.

[0061] Važno je da su naši pronalazači pokazali da Asparagopsis ne smanjuje količinu VFAa kod goveda: u dozama Asparagopsis-a koje ne smanjuju količinu unete/razgrađene organske

1

materije ili suve materije; u dozama koje smanjuju odnos acetata i propionata; u dozama koje smanjuju količinu acetata; u dozama koje povećavaju količinu propionata; i/ili u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju ukupnu produkciju gasa i metana, in vitro i in vivo.

[0062] Važno je da su naši pronalazači pokazali da Asparagopsis ne smanjuje količinu VFAa u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju ukupnu produkciju gasa i metana u govedima.

[0063] Naši pronalazači su takođe pokazali da Asparagopsis ne smanjuje količinu uzete/razgrađene organske materije ili suve materije kod ovaca; u dozama Asparagopsis-a koje ne smanjuju količinu unete/razgrađene organske materije ili suve materije kod ovaca; u dozama koje smanjuju odnos acetata i propionata; u dozama koje smanjuju količinu acetata; u dozama koje povećavaju količinu propionata; i/ili u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju produkciju metana, in vitro i in vivo. Na primer, naši pronalazači su pokazali da Asparagopsis ne smanjuje količinu unosa/razgradnje organske materije ili suve materije u hrani za ovce, uz 1.2 puta veću energija održavanja.

[0064] Zajedno sa Tabelama 10 i 11, Slika 18 pokazuje da Asparagopsis smanjuje količinu acetata; povećava količinu propionata; i smanjuje odnos acetata i propionata u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju produkciju metana u ovcama.

[0065] Zajedno sa Tabelama 10 i 11, Slika 18 pokazuje da Asparagopsis smanjuje količinu acetata; povećava količinu propionata; i smanjuje odnos acetata i propionata u dozama Asparagopsis-a koje ne utiču na težinu životinje ili na dnevni unos hrane ovaca.

[0066] Prema tome, u jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana preživara, uključujući primenu efektivne količine najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi na navedenim preživarima, pri čemu je ta vrsta crvenih morskih makroalgi Asparagopsis vrsta i pri čemu se održavaju efektivne vrednosti željenih isparljivih masnih kiselina.

[0067] U jednom ostvarenju, poželjne isparljive masne kiseline su acetat i propionat.

[0068] Kako se ovde koristi, izraz "isparljive masne kiseline" ("VFA") uključuje završni produkt anaerobne mikrobne fermentacije sastojaka hrane u buragu. Uobičajene VFAe uključuju acetat, propionat, butirat, izobutirat, valerat i izovalerat. VFA’e se apsorbuju u želucu i koriste za energiju životinje i sintezu lipida.

[0069] U preferiranim ostvarenjima pronalaska, ukupna količina VFA produkovana fermentacijom u buragu u prisustvu efektivne količine najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi je najmanje 80 mmol/L.

[0070] U narednim ostvarenjima pronalaska, ukupna količina VFA produkovana

1

fermentacijom u buragu u prisustvu efektivne količine najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi je najmanje 65 mmol/L.

[0071] Naši pronalazači su takođe pokazali da Asparagopsis ne smanjuje količinu VFAa u govedima u dozama Asparagopsis-a koje ne smanjuju količinu razgrađene organske materije ili suve materije fermentacijom u buragu ili unos suve materije. Naši pronalazači su takođe pokazali da Asparagopsis ne smanjuje količinu unete suve materije ili telesnu težinu ovaca. Na primer, naši pronalazači su pokazali da Asparagopsis ne smanjuje količinu unosa suve materije ili telesnu težinu hranjenih ovaca uz 1.2 puta veće održavanje energije. Ovo pokazuje da crvene morske makroalge smanjuju ukupnu produkciju gasa i/ili produkciju metana u preživarima bez ugrožavanja fermentacije u buragu.

[0072] Prema tome, u jednom aspektu se pronalazak odnosi na postupak za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana upreživarima, uključujući primenu efektivne količine najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi na navedenim preživarima, pri čemu je najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi Asparagopsis vrsta i pri čemu se održava količina razgrađene organske materije i/ili suve materije. U narednom ostvarenju se održava se količina unete suve materije.

[0073] Kako se ovde koriste nazivi, "organska materija" i "suva materija" označavaju količinu hrane (organske ili na bazi suve hrane, tim redom) koju životinje uzimaju u datom vremenskom periodu, obično 24 sata. U tehnici je poznato kako da se izračuna unos i/ili razgradnja organske materije i suve materije. Na primer, suva materija i organska materija mogu da čine 90% i 80% količine hrane, tim redom

[0074] Najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi može da se primeni u dozi od preferirano najmanje 16.67, 10, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.250.125 ili 0.067% organske materije primenjene na preživaru.

[0075] U preferiranom ostvarenju, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi može da se primeni u dozi od preferirano najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.250.125 ili 0.067% organske materije primenjene na preživaru da se održi količina razgrađene organske materije i/ili suve materije.

[0076] U narednom ostvarenju, održava se i količina razgrađene organske materije ili suve materije i održavaju se efektivne vrednosti željenih ispravljivih masnih kiselina.

[0077] U prerferiranom ostvarenju, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi može da se primeni u dozi od preferirano najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.250.125 ili 0.067% organske materije primenjene na preživaru da se održe efektivne vrednosti željenih isparljivih masnih

1

kiselina.

[0078] Važno je da su naši pronalazači pokazali da Asparagopsis povećava količinu propionata u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju ukupnu produkciju gasa i metana i da Asparagopsis povećava količinu propionata u dozama Asparagopsis-a koje ne smanjuju količinu razgrađene organske materije ili suve materije.

[0079] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana preživara koji uključuje fazu primene na navedenim preživarima efektivne količine najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi pri čemu se održava količina razgrađene organske materije ili suve materije a odnos acetata i propionata je smanjen.

[0080] U preferiranom ostvarenju, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi se primenjuje u dozi od preferirano najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.250.125 ili 0.067% primenjene organske materije za preživare da se smanji odnos acetata i propionata.

[0081] U jednom ostvarenju primena efektivne količine najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi nema negativnog uticaja na odnos acetata i propionata (C2/C3 odnos). U narednom ostvarenju, odnos acetata i propionata (C2/C3 odnos) je smanjen nakon primene efektivne količine najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi.

[0082] U preferiranom ostvarenju pronalaska, odnos acetata i propionata (C2/C3 odnos) nije veći od 5 nakon primene efektivne količne najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi. U narednom ostvarenju, odnos acetata i propionata (C2/C3 odnos) nije veći od 4 nakon primene efektivne količne najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi. U narednom ostvarenju, odnos acetata i propionata (C2/C3 odnos) nije veći od 3 nakon primene efektivne količne najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi. U narednom ostvarenju, odnos acetata i propionata (C2/C3 odnos) nije veći od 2 nakon primene efektivne količne najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi.

[0083] U narednom ostvarenju, nema negativnog uticaja na molarnu koncetraciju propionata.

[0084] Na primer, Slika 17 pokazuje da nema negativnog uticaja na ukupnu koncentraciju VFA nakon primene Asparagopsis-a na preživarima (goveda), sa ukupnim koncentracijama VFA ekvivalentnim sa 73.5, 75.5 i 102.3 mmol.L<-1>za kontrolu na dan 1, nakon 15 d i 30 d, tim redom.

[0085] Tabela 11 pokazuje da nema negativnog uticaja na koncentraciju propionata nakon primene Asparagopsis-a na preživarima (ovce), uz značajno veće koncentracije propionata nakon uvođenja Asparagopsis-a u hranu u dozama od 0.5, 1, 2 i 3% unete organske materije

1

po danu.

[0086] Naši pronalazači su pokazali efekat zavisnosti oddoze na ukupnu produkciju VFA i/ili odnos acetata i propionata. Na primer, Slika 13 pokazuje efekat zavisnosti doze od doze na ukupnu produkciju VFA i/ili odnos acetata i propionata. Slika 17 pokazuje da primena najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi na preživarima smanjuje odnos acetata i propionata. Tabela 11 pokazuje da unošenje Asparagopsis-a u hranu za životinje smanjuje odnos acetata i propionata u preživarima (ovce).

[0087] Fermentacija hrane nisko kvalitetnih vlakana u buragu je glavni izvor produkcije metana u preživarima.

[0088] Primeri preživara su niže navedeni. Međutim, preferirano se crvene morske makroalge koriste kao aditiv hrani za domaću stoku kao što su goveda, koze, ovce i lame. Ovaj pronalazak je posebno koristan za goveda i ovce. Prema tome, u jednom ostvarenju, navedeni preživar je izabran od članova podgrupa Ruminantia i Tylopoda. U narednom ostvarenju, navedeni preživar je goveče ili ovca. U još jednom ostvarenju, navedeni preživar je goveče.

[0089] Pod "primena" i "primenjeno", se podrazumeva delovanje unošenja najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi u skladu sa pronalaskom u gastrointestinalni trakt životinje. Još preciznije, ova primena je primena oralnim putem. Ova primena može posebno da se izvede dodavanjem navedene najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi u hranu namenjenu za životinje, a ovako obogaćenu hranu će životinja da proguta. Primena može takođe da se izvede upotrebom želudačne sonde ili bilo kog drugog načina koji omogućava direktno unošenje navedene najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi u gastrointestinalni trakt životinje.

[0090] Naši pronalazači su pokazali smanjenu ukupnu produkciju gasa i/ili produkciju metana pri anaerobnoj fermentaciji u prisustvu efektivne količine crvene morske makroalge.

[0091] Kako je prethodno rečeno, u preferiranim ostvarenjima pronalaska, efektivna količna najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi je najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.250.125 ili 0.067% organske materije primenjene na preživaru.

[0092] Na primer, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi se primenjuje u dozi od preferirno najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.250.125 ili 0.067% organske materije raspoložive u ishrani preživara.

[0093] Na primer, ukoliko preživar dnevno unosi hranu u količini od približno 2.5-3% svoje telesne težine, preživar težine 400 kg može da unese 10-12 kg hrane dnevno.

[0094] Kako je prethodno rečeno, u preferiranim ostvarenjima pronalaska, efektivna količna

1

najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi je najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.250.125 ili 0.067% organske materije primenjene na preživaru po danu. Preferirano, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi se primenjuje u dozi od preferirano najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.25 0.125 ili 0.067% organske materije primenjene na preživaru po danu.

[0095] Prema tome, ukoliko preživar težine 400kg konzumira približno 10 kg organske materije dnevno, efektivna količina najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi je najmanje približno 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, ili 0.0067 kg najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi po danu. Ove doze su ekvivalentne sa 0.00075, 0.0005, 0.00025, 0.000125, 0.0000625, 0.0000325 ili 0.00001675 kg po kg telesne težine po danu.

[0096] Efektivna količina može da se primeni na navedenom preživaru u jednoj ili više doza.

[0097] Efektivna količna može takođe da se primeni na navedenom preživaru u jednoj ili više doza po danu.

[0098] U narednom preferiranom ostvarenju, dat je postupak kako je ovde prethodno definisano, pri čemu je doza najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi u rasponu od 0.0005-1.8 g/kg telesne težine po danu, još poželjnije u rasponu od 0.05-0.9 g/kg telesne težine po danu, a najpoželjnije 0.1-0.45 g/kg telesne težine po danu.

[0099] U narednom preferiranom ostvarenju, dat je postupak kako je ovde prethodno definisano, pri čemu je doza najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi u rasponu od 0.025-8 g/kg telesne težine po danu, još poželjnije 0.05-4 g/kg telesne težine po danu, još poželjnije 0.1-5 g/kg telesne težine po danu.

[0100] Doze koje su ovde definisane kao količina po kg telesne težine po danu se odnose na prosečnu količinu najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi u toku datog perioda tretmana, na primer u toku nedeljnog ili mesečnog tretmana. Najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi može prema tome da se primenjuje svaki dan, svaki drugi dan, svaka druga dva dana, itd., bez odstupanja od okvira pronalaska. Ipak je poželjno da postupak uključuje dnevnu primenu najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi u prepisanim dozama. Čak je još poželjnije da se najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi primenjuje u toku hranjenja životinje svaki put kada se životinja hrani u količinama koje su prethodno date kao dnevne doze.

[0101] Postupak iz ovog pronalaska može da uključi primenu najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi u skladu sa prethodno opisanim režimom doziranja u periodu od najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250 ili 350 dana. Jedan aspekt pronalaska se zasniva na činjenici da dati postupci obezbeđuju vrlo perzistentnu efikasnost u smanjenju enteričkih metanogeneza, na

2

primer efekat se ne umanjuje nakon produženog perioda tretmana, na primer kao rezultat povećanja rezistencije buraga ili mikroorganizama creva, čime se postiže posebno ostvariv dugotrajni tretman preživara.

[0102] Pod "najmanje jedna vrsta" se podrazumeva pojedinačna vrsta ali takođe smeše vrsta koje uključuju najmanje dve vrste crvenih morskih makroalgi.

[0103] Kada se koristi smeša vrsta, odnosi mogu da variraju od najmanje 1 % do 99%, mnogo pogodnije od 25% do 75% a čak još povoljnije približno 50% za svaku vrstu.

[0104] Kako je ovde opisano, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi je izabrana od vrsta koje pripadaju jednoj od pet vrsta crvenih morskih algi iz familije Bonnemaizoniaceae (Asparagopsis, Bonnemaizonia, Delisea, Ptilonia, Leptophyllis).

[0105] U jednom ostvarenju, vrsta crvenih morskih makroalgi je Asparagopsis vrsta.

[0106] Asparagopsis ima heteromorfnu životnu istoriju sa dve odvojene faze životne istorije -gametofit (oblik velike folioze) i sporofit (ili tetrasporofit – manji filamentozni oblik).

Istorijski – tetrasporofite se prepoznaju kao odvojeni rod (Falkenbergia). Prema tome, kako se ovde koristi, naziv "Asparagopsis" se odnosi na rod Asparagopsis i druge taksonomne klasifikacije za koje se sada zna da pripadaju rodu Asparagopsis-a.

[0107] Postoje dve poznate vrste Asparagopsis, jedna tropska/subtropska (Asparagopsis taxiformis) i jedna umerena (Asparagopsis armata) i rasprostranjene su u celom svetu.

[0108] Prema tome, u jednom ostvarenju, vrste roda Asparagopsis su izabrane iz vrsta:

a. Asparagopsis armata

b. Asparagopsis taxiformis

[0109] Bez namere vezivanja za teoriju, pet rodova crvenih morskih algi iz familije Bonnemaizoniaceae (Asparagopsis, Bonnemaizonia, Delisea, Ptilonia, Leptophyllis), produkuju i nagomilavaju bioaktivne halogenizovane prirodne produkte. Ovi sekundarni metaboliti imaju funkciju prirodne odbrane od predatora, zagađivanja organizmima i mikroorganizmima i nadmetanja unutar vrsta.

[0110] Dictyota (ovde takođe data) produkjuje niz sekundarnih metabolita, posebno, izoprenoida (terpena). Asparagopsis produkuje halogenizovana jedinjenja male molekulske težine, posebno bromisane i hlorisane halooblike. Mnoga od ovih jedinjenja imaju jake antimikrobne karakteristike i inhibiraju veliki broj mikroorganizama, uključujući Grampozitivne i Gram-negativne bakterije kao i aktivnost mikobakterija i gljivica i stoga mogu da budu uključene da doprinesu efektima koji su ovde opisani. Sekundarni metaboliti iz Asparagopsis-a takođe inhibiraju protozoe.

[0111] U skladu sa tim, polazeći od značajnih efekata Asparagopsis-a koji su ovde opisani uključujući učinak smanjenja ukupne produkcije gasa i CH4, u jednom ostvarenju se bar jedna vrsta crvenih morskih makroalgi preferirano primenjuje u obliku koji dovodi do ovde opisanih efekata (na primer učinak smanjenja CH4) bez negativnog uticaja na nutritivno značajne parametre fermentacije.

[0112] U narednom ostvarenju, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi se preferirano primenjuje u obliku u kome se zadržava efikasnost sekukndarnih metabolita.

[0113] U skladu sa ostvarenjem iz pronalaska, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi je osušena zamrzavanjem i samlevena u prašak. Na primer, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi je osušena zamrzavanjem i usitnjena kroz sito (na primer sito 1mm).

[0114] U skladu sa narednim ostvarenjem pronalaska, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi je osušena na vazduhu i krupno samlevena.

[0115] Najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi može da se primeni na preživaru jednim od više načina. Najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi može da se primeni u čvrstom obliku kao veterinarski lek, može da se distribuira u podlozi i direktno nahrani životinja, može da bude fizički izmešana sa hranom u suvom obliku ili najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi može da bude u obliku rastvora i takav rastvor se rasprši po hrani. Smatra se da je način primene najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi na životinji u domenu stručnja sa iskustvom.

[0116] Kada se koristi u kombinaciji sa hranom, hranljivi materijal je preferirano na bazi žitarica/sena/silaže/trave. Pored ovakvih hranljivih materijala uključene su poboljšana i/ili krma na bazi tropske trave ili mahunarki koja se direktno pase ili je izrađena kao sačuvano krmno seno, bilo koji hranljivi sastojci i hrana ili nusproizvodi industrije hrane kao i nusproizvodi industrije biogoriva i kukuruznog brašna i njihove smeše ili hrana za tov i mlečni obroci kao što su oni sa visokim sadržajem žitarica.

[0117] Vreme primene najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi nije krucijalno sve dok se uočava efekat smanjenja produkcije metana. Sve dok se hrana zadržava u buragu, moguća je primena u bilo koje vreme. Međutim, kako je najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi preferirano prisutna u buragu približno u vreme produkcije metana, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi se preferirano primenjuje sa hranom ili neposredno pre hrane.

[0118] U posebnom ostvarenju pronalaska, navedena efektivna količina najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi se primenjuje na preživaru obogaćivanjem hrane namenjene toj životinji sa navedenom količinom najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi. Pod "obogaćivanjem", u okviru značenja iz pronalaska, se podrazumeva postupak inkorporiranja efektivne količine najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi u skladu sa pronalaskom direktno u hranu namenjenu životinji. Prema tome, kada životinja uzima hranu, proguta najmanje jednu vrstu crvene morske makroalge koja se koristi u skladu sa pronalaskom, koja nakon toga može da deluje da poveća, na primer, svarljivost vlakana i/ili žitarica koje se nalaze u hrani za životinje.

[0119] Ovde je takođe opisan dodatak hrani za preživare koji sadrži najmanje jednu vrstu crvenih morskih makroalgi.

[0120] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ne-terapeutsku upotrebu dodatka hrani za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana u preživarima, dodatak koji uključuje efektivnu količinu najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi, pri čemu je navedena vrsta crvenih morskih makroalgi Asparagopsis vrsta.

[0121] U jednom ostvarenju, efektivna količina najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi se primenjuje na navedenom preživaru dodavanjem hrani namenjenoj toj životinji sa navedenom količinom najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi.

[0122] U jednom ostvarenju, vrsta Asparagopsis je A. taxiformis.

[0123] Kako je prethodno razmatrano, u jednom ostvarenju ovog pronalaska se održavaju vrednosti VFAa u preživarima. Prema tome, ovaj postupak dozvoljava da preživari održavaju energiju iz hrane na bazi, na primer, vlakana i žitarica i kao rezultat toga, počevši od unosa iste količine kalorija, održavaju energiju raspoloživu iz metabolizma uz umanjenje ukupne produkcije gasa i CH4.

[0124] Ovo predstavlja prednost za uzgajivače stoke koji na ovaj način mogu da optimiziraju cenu hrane po jedinici raspoložive metaboličke energije. Ovo takođe predstavlja značajnu ekonomsku korist.

[0125] Naši pronalazači su pokazali da primena efektivne količine Asparagopsis-a na preživarima ne utiče negativno na spontani unos hrane. Na primer, Slika 16 pokazuje da primena efektivne količine Asparagopsis-a na preživarima u dozi ekvivalentnoj u proseku sa 2.9% unete suve materije po danu ne utiče negativno na spontani unos hrane uz razliku u uzimanju hrane između kontrole i životinja hranjenih obogaćenom hranom koja nije veća od

2

5.6% nakon 30 dana tretmana. Tabela 11 pokazuje da primena efektivne količine Asparagopsis-a na preživarima u dozi ekvivalentnoj sa prosečno 0.5%, 1%, 2% ili 3% unete organske materije po danu ne utiče negativno na spontani unos hrane.

[0126] Prema tome, ovde je takođe opisan postupak kojim se održava vrednost razgrađene organske materije i/ili suve materije.

[0127] Kako se ovde koristi, izraz "dodatak hrani za životinje" se odnosi na koncentrovani premiks aditiva koji uključuje aktivne sastojke, pri čemu premiks ili dodatak može da se doda u hranu za životinje u takvom opsegu da formira obogaćenu hranu u skladu sa ovim pronalaskom. Smatra se da nazivi "premiks hrane za životinje," "dodatak hrane za životinje," i "aditiv hrani za životinje" imaju slična ili identična značenja i generalno se smatraju međusobno zamenljivim. Uobičajeno, obogaćena hrana za životinje iz ovog pronalaska je u obliku praška ili kompaktne ili granulirane čvrste supstance. U praksi, stoka može uobičajeno da se hrani obogaćenom hranom za životinje direktnim dodavanjem te hrane u obrok, na primer takozvanim posipanjem po površini, ili može da se koristi u izradi ili proizvodnji složene hrane za životinje ili blokova za lizanje, koji će u daljem tekstu biti detaljnije opisani. U vezi sa ovim, pronalazak nije posebno ograničen. Dodatak u skladu sa pronalaskom se obično daje životinji u količini u rasponu od 16-2500 g/životinja/dan.

[0128] U jednom ostvarenju, dodatak za upotrebu u skladu sa pronalaskom se primenjuje u količini na osnovu stvarnog pojedinačnog unosa hrane životinje (na primer g /kg DM unosa).

[0129] Dodatak hrani za životinje iz ovog pronalaska uključuje najmanje jednu vrstu crvenih morskih makroalgi i formulisan je tako da kada se doda u hranu, najmanje jedna vrsta crvene mnorske makroalge je prisutna u količini od najmanje 0.067, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5, 10 ili 16.67% organske materije u hrani.

[0130] Na primer, ukoliko preživar uzima približno 5 kg organske materije dnevno, dodatak hrani za životinje uključuje najmanje jednu vrstu crvenih morskih makroalgi i formulisan je tako da kada se doda u hranu, najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi je prisutna u dozi od 3.35, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 150, 250, 500 ili 833.5 grama po danu, tim redom.

[0131] U preferiranim ostvarenjima pronalaska, dodatak uključuje najmanje jednu vrstu crvenih morskih makroalgi koja je prisutna u količini u rasponu od 10-100 mt%, preferirano je ta količina veća od 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97 ili 99 mt%, na bazi suve materije.

[0132] Obučeni profesionalac će znati da odredi tačnu idealnu količinu komponenti uključenih u dodatak i količine dodatka koje se koriste pri određivanju odnosa ili izradi složene hrane za životinje, itd., uzimajući u obzir specifičan tip životinje i okolnosti pod kojima se ona čuva. Preferirane doze svake od komponenti su ovde date.

[0133] Dodaci hrani za životinje iz ovog pronalaska mogu da uključe bilo koji od niže datih sastojaka bez udaljavanja od okvira pronalaska. Oni mogu obično da uključe dobro poznate podloge koje su neophodne za izradu željenih oblika produkta i mogu da uključe druge aditive potrebne za poboljšanje kvaliteta hrane i/ili poboljšanje učinka životinja koje konzumiraju dodatak. Odgovarajući primeri ovakvih podloga uključuju nosače ili punioce kao što su laktoza, saharoza, manitol, skrob, kristalna celuloza, natrijum hidrogen karbonat, natrijum hlorid i slično i vezivna sredstva kao što su arapska guma, tragakanta, natrijum alginat, skrob, PVP i derivati celuloze, itd. Primeri dodataka hrani poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici uključuju vitamine, amino kiseline i mikro elemente, pojačivače varenja i stabilizatore crevne flore i slično.

[0134] Osim toga, naši pronalazači su otkrili da su dobri rezultati dobijeni kada se koriste druge makroalge. Na primer, naši pronalazači su pokazali da Dictyota, Oedogonium i Cladophora patentiramea smanjuju ukupnu produkciju gasa i produkciju CH4nastalih fermentacijom u buragu.

[0135] Prema tome, u narednom ostvarenju, postupak dalje uključuje efektivnu količinu najmanje jedne vrste makroalge izabrane iz grupe koja se sastoji od Dictyota spp (na primer Dictyota bartayresii), Oedogonium spp, Ulva spp i C. patentiramea, za primenu na preživarima.

[0136] Generalno, morske alge su mnogo efikasnije nego slatkovodne alge u smanjenju produkcije CH4. Slatkovodne makroalge imaju sličnu biohemijsku kompoziciju sa DCS, međutim učinak CH4u odnosu na DCS je smanjen za 4.4% za Spirogyra i 30.3% za Oedogonium nakon 72 h inkubacije. Međutim, ne postoji korelacija između biohemijske kompozicije slatkovodnih makroalgi i smanjenja u CH4. Mada je smanjen CH4nema očiglednih negativnih efekata na promenu fermentacije. Nasuprot tome, slatkovodne makroalge imaju značajno veću ukupnu koncentraciju VFA nego DCS sa sličnom razgradivošću organske materije (OMd), što pokazuje da proces fermentacije nije kompromitovan.

[0137] Morske alge značajno smanjuju produkciju CH4, sa dve vrste, smeđom makroalgom Dictyota i crvenom makroalgom Asparagopsis koje imaju najveće efekte. Dictyota inhibira TGP za 53.2% i produkciju CH4za više od 92% u poređenju sa DCS, dok Asparagopsis ima mnogo efikasniji tretman smanjujući TGP za 61.8% i produkciju CH4za 98.9% u poređenju

2

sa DCS. Dictyota i Asparagopsis takođe produkuju najnižu ukupnu koncentraciju VFA kada se primene u dozi od 16.67% organske materije in vitro i najveću molarnu koncentraciju propionata od svih vrsta, što pokazuje da ove doze značajno utiču na fermentaciju.

[0138] Smanjenje koncentracije ukupnih VFAa je često povezano sa anti-nutritivnim faktorima koji ometaju fermentaciju u buragu. Asparagopsis, u koncentracijama testiranim na govedima, je više od 17 puta efikasnija u smanjenju odnosa CH4u ukupno produkovanom gasu nego kopnene biljke bogate taninima, ili neka hrana od žitarica ili mahunarki.

[0139] Asparagopsis ima sličnu (primarnu) biohemijsku kompoziciju kao DCS izuzev visoke vrednosti cinka i niskog sadržaja PUFA. I Asparagopsis i Dictyota imaju visoke koncentracije cinka, međutim, Halymenia takođe ima sličnu koncentraciju ali produkuje 47.9% više TGP i 89.5% više CH4nego Dictyota. Značajno je, kada se cink doda u ishranu u koncentraciji iznad 250 mg.kg<-1>DM, on može in vitro da smanji razgradivost substrata i poveća molarnu proporciju propionata, koji su indikativni parametri smanjenog učinka metana. Međutim, koncentracija cinka u Dictyota je 0.099 mg.kg<-1>DM a u Asparagopsis 0.15 mg.kg<-1>DM i ove koncentracije su daleko ispod granice od 250 mg.kg<-1>DM. Prema tome, malo je dokaza koji podržavaju da cink smanjuje produkciju CH4do nivoa u kome se javlja kod Dictyota i Asparagopsis. Bez želje da se vežemo za teoriju, moguće je međutim da cink deluje sinergistički sa sekundarnim produktima metabolita obe vrste algi u smanjenju produkcije CH4. Neki elementi mogu da povećaju koncentracije sekundarnog metabolita biljaka čak i pri niskim graničnim koncentracijama.

[0140] Bez želje da se vežu za teoriju, naši pronalazači su zaključili da su sekundarni metaboliti sa jakim antimikrobnim osobinama bogati kod Asparagopsis i Dictyota, a nedostatak jake veze između produkcije gasa i metana i bilo kog od >70 analiziranih primarnih biohemijskih parametara sugerišu da smanjenje ukupne produkcije gasa i CH4može da bude povezano sa sekundarnim metabolitima.

[0141] U skladu sa tim, u jednom ostvarenju, postupak za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana u preživarima uključuje efektivnu količinu najmanje jedne vrste Asparagopsis-a i druge vrste morskih makroalgi za primenu na navedenom preživaru.

[0142] U jednom ostvarenju, druga vrsta morskih makroalgi je izabrana iz grupe koja se sastoji od Dictyota spp (na primer Dictyota bartayresii), Oedogonium spp, Ulva spp i C. patentiramea.

[0143] Ovde su takođe opisani produkti kao što su složena hrana za životinje i blokovi za lizanje, koji uključuju dodatak kako je ovde prethodno definisano.

2

[0144] Naziv “složena kompozicija hrane za životinje”, kako se ovde koristi, označava kompoziciju koja je pogodna za upotrebu kao hrana za životinje i koja je smeša različitih prirodnih ili ne-prirodnih baza ili sirovih materijala i/ili aditiva. Stoga, preciznije, naziv “složeno” se ovde koristi da odvoji ove kompozicije hrane za životinje od bilo kog drugog prirodnog sirovog materijala. Ova izmešana ili složena hrana je formulisana u skladu sa specifičnim zahtevima za određenu životinju. Glavni sastojci korišćeni u komercijalno izrađenoj složenoj hrani obično uključuju pšenične mekinje, pirinčane mekinje, kukuruzno brašno, zrna žitarica, kao što su ječam, pšenica, raž i zob, sojino brašno, alfaalfa brašno, brašno semena pamuka, pšenični prah i slično. Komercijalna složena hrana obično uključuje ne manje od 15% sirovog proteina i ne manje od 70% svarivih ukupnih nutricijenata, mada pronalazak nije posebno ograničavajući u vezi sa ovim. Tečne, čvrste kao i polu-čvrste kompozicije složene hrane za životinje su obuhvaćene okvirom ovog pronalaska, a posebno su preferirani čvrsti i polu-čvrsti oblici. Ove kompozicije se obično proizvode u obliku brašna, peleta ili mrvica. U praksi, stoka se uobičajeno hrani kombinacijom složene hrane, kao što je ova iz pronalaska i silaže ili sena i slično. Obično se složena hrana za životinje daje u količini u rasponu od 0.3-10 kg/životinja/dan. Iskusni profesionalac će znati da odredi tačne količine ovih komponenti koje su uključene u složenu hranu za životinje, uzimajući u obzir tip životinje i okolnosti pod kojima se nalaze.

[0145] Kompozicije složene hrane za životinje mogu da uključe bilo koji drugi hranljivi aditiv koji se obično koristi u tehnici. Kako je stručnjaku sa iskustvom u tehnici poznato, naziv “dodatak hrani” u ovom kontekstu se odnosi na produkte korišćene u ishrani životinja sa ciljem poboljšanja kvaliteta ishrane i kvaliteta hrane životinjskog porekla ili da se poboljšaju osobine životinja, na primer obezbeđivanjem povećane svarljivosti hranljivog materijala. Neograničavajući primeri uključuju tehnološke aditive kao što su konzervansi, antioksidansi, emulgatori, stabilizatori, regulatori kiselosti i dodaci silaži; senzorni aditivi, posebno za ukus i boje; (dalje) nutricioni aditivi, kao što su vitamini, amino kiseline i mikroelementi; i (dalje) zootehnički aditivi kao što su pojačivači svarljivosti i stabilizatori crevne flore.

[0146] Kao što je jasno stručnjaku sa iskustvom u tehnici, kompozicije složene hrane za životinje iz ovog pronalaska mogu da uključe bilo koji drugi sastojak ili dodatak.

[0147] Ovde su takođe opisani kamen za lizanje ili blok za lizanje koji čine dodatak pronalasku. Kao što je poznato stručnjaku sa iskustvom u tehnici, ovakvo kamenje ili blokovi za lizanje su posebno pogodni za uzimanaje mineralnih dodataka (kao i proteina i ugljenih hidrata) u preživarima na ispaši ili na prirodnom ili kultivisanom pašnjaku ili na oba. Ovakvi

2

blokovi za lizanje ili kamenje za lizanje obično pored crvenih makroalgi sadrže različite tipove vezivnih sredstava, na primer cement, gips, kreč, kalcijum fosfat, karbonat i/ili želatin; i opciono druge aditive kao što su vitamini, mikroelementi, mineralne soli, senzorni aditivi, itd.

[0148] Ovde je takođe opisan postupak za smanjenje produkcije gastrointestinalnog metana u preživaru, pri čemu navedeni postupak uključuje primenu kompozicije koja sadrži najmanje jednu vrstu crvene morske makroalte.

[0149] Naziv “smanjenje gastrointestinalne metanogeneze” i “smanjenje produkcije gastrointestinalnog metana” kako se ovde koristi, se odnosi na smanjenje produkcije gasa metana u gastrointestinalnom traktu. Kako je ovde prethodno objašnjeno, fermentacija u buragu i crevima preživara dovodi do povećanja produkcije metana gasa takozvanom metanogenezom. Ovaj pronalazak ima za cilj da smanji ovaj proces, tako što će da smanji izdvajanje metana direktno iz gastrointestinalnog trakta. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će znati da proceni izlučivanje metana iz životinje. Kako je prethodno objašnjeno, produkcija metana u buragu i crevima je proces koji se normalno dešava u zdravim životinjama a smanjenje metanogeneze ne povećava ili ne umanjuje opšte stanje zdravlja ili blagostanja preživara.

[0150] Prema tome, postupci za tretman iz ovog pronalaska su ne-terapeutski postupci za tretman, to jest, postupci ne poboljšavaju zdravlje životinje koja pati od određenog stanja, ne sprečavaju određene bolesti ili stanja, niti u bilo kojoj meri utiču na zdravlje preživara na bilo koji drugi način, u poređenju sa preživarima na kojima se ne primenjuju postupci tretmana iz ovog pronalaska. Prednosti postupaka iz ovog pronalaska su ograničene na aspekte očuvanja životne sredine i/ili ekonomske aspekte kako je ovde prethodno opisano.

[0151] Kako je iz prethodnog jasno, postupak iz ovog pronalaska uključuje oralnu primenu najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi. Preferirano, ne-terapeutski tretman uključuje oralnu primenu kompozicije složene hrane za životinje i/ili dodatke produktima hrane za životinje kako je ovde prethodno definisano, mada i druge tečne, čvrste ili polu-čvrste kompozicije koje mogu oralno da se unesu mogu da se koriste bez odstupanja iz okvira pronalaska, što je jasno stručnjaku sa iskustvom u tehnici.

[0152] U skladu sa prethodnim, ovde je takođe opisana upotreba kompozicije koja sadrži najmanje jednu vrstu crvene morske makroalge za ne-terapeutsko smanjenje produkcije gastrointestinalnog metana u preživarima.

[0153] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ne-teraputsku upotrebu

2

hrane za smanjenje produkcije metana u preživarima, pri čemu je navedena hrana obogaćena dodatkom ishrani u skladu sa upotrebom koja je ovde opisana.

[0154] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ne-terapeutski postupak za smanjenje produkcije metana u preživarima, pri čemu taj postupak uključuje da se dodatak hrani u skladu sa ovde opisanom upotrebom ili hrana u skladu sa ovde opisanom upotrebom primenjuje na navedenoj životinji.

[0155] Pronalazak će dalje biti opisan preko Primera, koji treba da služe kao ispomoć stručnjaku sa uobičajenim iskustvom u tehnici u primeni pronalaska bez namere da na bilo koji način ograniči polje pronalaska.

PRIMER 1: Materijali i postupci

Prikupljanje i izrada uzoraka algi

[0156] Dvadeset vrsta morskih i slatkovodnih makroalgi je izabrano za ovu studiju na osnovu njihove prisutnosti i rasprostranjenosti u sistemima vodenih kultura i intertidalnim oblastima oko Townsville, Queensland, Australia (Tabela 3). Sedam vrsta makroalgi je sakupljeno iz velike skale kultura na James Cook University, Townsville. Preostale vrste su sakupljene sa oblasti dva intertidalna grebena: Nelly Bay, Magnetic Island (19°16’ S; 146°85’ E) uz GBRMPA dozvolu broj GO2/20234.1; Rowes Bay (19°23’ S, 146°79’ E, Townsville) uz DPIF dozvolu broj 103256; i iz objekata morske i slatkovodne akvakulture u Townsville i okolini.

[0157] Sve makroalge su isprane svežom vodom da se uklone pesak, otpaci i epifite. Biomasa se centrifugira (MW512; Fisher & Paykel) 5 min na 1000 opm da se ukloni višak vode i izmeri. Sub-uzorak svake vrste se konzervira u 4% formalinu za taksonomnu identifikaciju, dok se preostala biomasa osuši zamrzavanjem na -55°C i 120 µbar (VirTis K benchtop freezedrier) u toku najmanje 48 h. Suvo zamrznuti uzorci se samelju u analitičkom mlinu kroz sito promera 1mm i čuvaju u kontejnerima zaštićeno od svetlosti na -20°C do inkubacije.

Biohemijski parametri substrata

[0158] Potpuna i elementarna kompozicija (ovde u daljem tekstu označena kao bihoemijski parametri) makroalgi, brašna oguljenog semena pamuka (DCS) i sena od Flinder trave

2

(Iseilema sp.) su ispitane u duplikatu (Tabela 3 i Tabela 4). Sadržaj vlage je određen pomoću digitalnog analizatora vlage (A&D, MS-70, Tokyo, Japan), pri čemu se 2 g uzorka zagreva na 105°C do konstantne težine. Sadržaj suve materije (DM) se određuje oduzimanjem sadržaja vlage od ukupne težine uzoraka. Sadržaj organske materije (OM) se određuje sagorevanjem 2 g uzorka u prigušnoj peći u toku 6 h na 550°C. Ugljenik, vodonik, kiseonik, azot, fosfor i sumpor (CHONS) su kvantifikovani analizama elemenata (OEA laboratory Ltd., UK).

Frakcija sirovog proteina (CP) je procenjena koristeći ukupni sadržaj azota (mt%) biomase sa faktorima azota od 5.13, 5.38 i 4.59 za zelene, smeđe i crvene makroalge, tim redom a 6.25 za DCS i seno od Flinders trave. Ukupni sadržaj lipida se ekstrahuje i kvantifikuje koristeći Folch postupak. Masne kiseline se ekstrahuju postupkom jednofazne ekstrakcije/transesterifikacije i kvantifikuju kao metil estri masne kiseline (FAME) sa gasom GC/MS/FID (Agilent 7890 GC sa FID - Agilent 5975C EI/TurboMS), kako je opisano u (Tabeli 5). Sadržaj ugljenih hidrata je određen kao razlika u skladu sa jednačinom (1):

Ugljeni hidrati (mt%) = 100 – (pepeo vlaga ukupni lipidi sirovi proteini) (1)

[0159] Gde su pepeo, vlaga, ukupni lipidi i sirovi proteini izraženi kao procenat DM,.

[0160] Ukupan sadržaj energije (GE) svakog uzorka se izračunava u skladu sa Channiwala and Parikh, na osnovu kompozicije elemenata:

GE (Mj kg<-1>DM) = 0.3491*C 1.1783*H 0.1005*S – 0.1034*O – 0.0151*N – 0.0211*pepeo

[0161] Kako makroalge akumuliraju esencijalne mineralne elemente i teške metale koji mogu da inhibiraju anaerobno varenje, koncentracije 21 elementa su takođe kvantifikovane na 100 mg uzorka koristeći ICP-MS analize.

PRIMER 2: eksperimentalni koncept in vitro

[0162] Tečnost buraga je sakupljena iz buraga tri kanulirana bika rase Bos indicus (632 ± 32.62 kg žive vage) koji su uzgajani u School of Biomedical and Veterinary Sciences, JCU, u skladu sa eksperimentalnim protokolima odobrenim od strane CSIRO Animal Ethics Committee (A5/2011) i u skladu sa Australian Code of Practice za čuvanje i upotrebu životinja u naučne svrhe (NHMRC, 2004). Bikovi su u toku studije hranjeni senom Flinders trave (Iseilema spp.) bez ograničenja zbog održavanja konzistentne mikrobioloke aktivnosti u inokulumu. Približno 1 L tečnosti i čvrstog sadržaja buraga je sakupljeno od svake životinje pre jutarnjeg obroka i preneto u prethodno zagrejane termose. Izvučena tečnost iz buraga se blendira 30 sekundi na visokoj brzini koristeći ručni blender da se osigura potpuno mešanje čvrste i tečne faze i odvajanje partikulata povezanog sa bakterijama u suspenziji, a nakon toga se procedi kroz otvore promera 1 mm. Proceđena tečnost buraga se kontinuirano prečišćava sa N2velike čistoće i čuva na 39°C. Medijum buraga se izradi upotrebom tečnosti buraga i prethodnodno zagrejanog rastvora pufera [Goering H, Van Soest PJ (1970) Forage fiber analyses (apparatus, reagents, procedures i some applications): US Agricultural Research Service Washington, DC] (bez dodatka triptikaze) u odnosu 1:4 (v:v).

[0163] Inkubacije serija kulture se izvode da se proceni efekat vrsta makroalgi na fermentaciju u buragu/ukupnu produkciju gasa i koncentraciju CH4u neispunjenom prostoru upotrebom Ankom RF Gas Production System (Ankom Technology, New York, USA).

Uzorci od po 0.2 g OM makroalgi se izmere u prethodno zagrejanim Schott bocama zapreine 250 mL sa 1 g OM Flinders trave (usitnjena kroz sito 1 mm), čime se dobija 0.2/1.2g OM i 125 mL medijuma buraga. Prema tome, Asparagopsis se primenjuje u dozi od 16.67% OM. Za optimizaciju anaerobnih uslova, boce se pročiste sa N2, zatvore i inkubiraju na 39°C u tri inkubatora/šejkera sa kontrolisanom temperaturom (Ratek, OM11 Orbital Mixer/Incubator, Australia), sa oscilacijom podešenom na 85 opm. U svakom inkubatoru se nalazi slepa i pozitivna kontrola, boca koja sadrži 1 g OM Flinders-ove trave i 0.2 g OM DCS. Inkubacije se ponavljaju u tri različite situacije sa četiri ponavljanja. Za svaku izvršenu inkubaciju, boce se po slučajnom uzorku izdvajaju i stave unutar inkubatora. Na svaku bocu se stavi Ankom RF modul i prati 72 h uz periode očitavanja od 20 minuta da se dobiju TGP krive. Svaki modul sadrži ventil pritiska podešen na 5 psi. Uzorak gasa u neispunjenom prostoru se sakuplja iz svakog modula direktno u prethodno ispražnjene egzetajnere zapremine 10 mL (Labco Ltd, UK) svaka 24 h. TGP uzorka iz neispunjenog prostora se iz očitavanja pritiska konvertuje u mL/g OM.

Post-fermentacioni parametri

[0164] Nakon 72 h inkubacije, beleži se pH (PHM220 Lab pH Meter, Radiometer Analytical, Lyon, France) a preostali uzorci tečnosti se čuvaju na -20°C do ispitivanja. VFAa su kvantifikovane na University of Queensland (Ruminant Nutrition Lab, Galton College,

1

Queensland, Australia) po standardnim procedurama [Cottyn BG, Boucque CV (1968) Rapid method for the gas-chromatographic determination of volatile fatty acids in rumen fluid. Journal of Agri cultural i Food Chemistry 16: 105-107; Ottenstein D, Bartley D (1971) Separation of free acids C2-C5 in dilute aqueous solution column technology. Journal of Chromatographic Science 9: 673-681; Playne MJ (1985) Determination of ethanol, volatile fatty acids, lactic i succinic acids in fermentation liquids by gas chromatography. Journal of the Science of Food i Agriculture 36: 638-644]. Ukupna koncentracija VFA se izračunava oduzimanjem koncentracije ukupne VFA u inicijalnom inokulumu (puferovana tečnost buraga) od koncentracije ukupne VFA u rezidualnoj tečnosti. Rezidualne tečnosti se takođe ispituju na ukupnu koncentraciju amonijuma upotrebom polu-automatske kolorimetrije (Tropwater Analytical Services, JCU, Townsville). Čvrsti ostaci su analizirani na očiglednu razgradljivost organske materije (OMd), izračunatu kao proporcionalna razlika između inkubirane i povraćene organske materije nakon 72 h. Koncentracija CH4u sakupljenim uzorcima gasa se meri gasnom hromatografijom (GC-2010, Shimadzu), opremljenom sa Carbosphere 80/100 kolonom i plamenim jonizujućim detektorom (FID). Temperatura kolona, injektor i FID su podešeni na 129°C, 390°C i 190°C, tim redom. Helijum i H2su korišćeni kao nosač i zapaljivi gasovi, tim redom. Četiri eksterna standarda poznate kompozicije: 1) CH40% i CO20% u N2; 2) CH43% i CO27% u N2; 3) CH48.89%, CO215.4% i H216.8% u N2; i 4) CH419.1%, CO227.1% i H238.8% u N2(BOC Ltd, Australia) su dnevno injektovani za izradu standardnih krivi i korišćeni za kvantifikaciju koncentracije CH4. Standardi su sakupljeni po istoj proceduri i koriščeni za sakupljanje uzoraka fermentacionog gasa. Pored toga, standard 2 (CH43% i CO27% u N2) se injektuje svaka 2 h između uzastopnih uzoraka gasa za verifikaciju očitavanja GC gasne kompozicije. Uzorci iz neispunjenog prostora (1 mL) se automatski injektuju u GC da se odrede koncentracije CH4. Oblasti pika se određuju automatskom integracijom. Izmereni CH4se stavljaju u odnos sa produkcijom TGP da se procene relativne koncentracije.

Rezultati analiza

[0165] Korigovani TGP rezultati se nanose na modifikovan ne-linearni sigmoidalni model Gompertz [Bidlack J, Buxton D (1992) Content i deposition rates of cellulose, hemicellulose i lignin during regrowth of forage grasses i legumes. Canadian Journal of Plant Science 72: 809-818]:

2

gde je y kumulativna ukupna produkcija gasa (mL), A je maksimalna produkcija gasa (mL.g<-1>), B je period zaostajanja pre početka eksponencijalne produkcije gasa (h), C je specifična brzina produkcije gasa (mL.h<-1>) u vremenu t (h). Parametri produkcije gasa A, B i C, se izračunavaju pomoću ne-linearne procedure SASa (JMP 10, SAS Institute, Cary, NC, USA). Jednosmerne analize varijanci (ANOVA) se koriste za poređenje razlika u ukupnoj produkciji gasa (TGP) i produkciji CH4između vrsta za 72 h. Post-hoc poređenja su izvršena pomoću Tukey-sovih HSD višestrukih komparacija.

[0166] Po ANOVAa, multivarijantne analize se koriste za istraživanje odnosa između biohemijskih i post-fermentacionih parametara. Koriste se dve komplementarno multivarijantne tehnike. Za ispitivanje korelacija između varijabila koristi se nemetrična multidimenzionalna skala (MDS; Primer v6 [Clarke KR, Gorley RN (2006) PRIMER v6: User Manual/Tutorial: PRIMER-E Ltd, Plymouth, UK. 190 p.]) a za ispitivanje mogućeg praga vrednosti za efekte se koristi stablo klasifikacije i regresije (CART; TreesPlus software).

[0167] Za MDS, uzorci koji su međusobno bliži na dijagramu imaju sličnu kompoziciju. Prema tome, MDS bi-dijagram se izrađuje za ispitivanje korelacija između biohemijskih i post-fermentacionih parametara vrsta nakon 72 inkubacije. Rezultati su ponovo uređeni u Bray-Curtis matriksu sličnosti koristeći srednje vrednosti za svaku vrstu.

[0168] Podaci o jačini i prirodi korelacije biohemijskih ili post-fermentacionih parametara sa distribucijom vrste unutar MDS prostora su predstavljeni kao vektori u ordinati bi-dijagrama. Uzeti su parametri koji imaju najjaču korelaciju sa MDS prostorom, na osnovu Pearson-ovih koeficijenata korelacije (PCC) većih od 0.7, (Tabela 1 i 2).

[0169] Zbog toga što nema sveobuhvatnog odnosa između glavnih primarnih kompozicionih varijabila i TGP, CH4i drugih post-fermentacionih varijabila (videti rezultate, Primer 3) izvodi se multivarijantni CART za testiranje direktnih efekata biohemijskih kompozicionih vrednosti za svaku vrstu na TGP, produkciju CH4, koncentracije acetata i propionata. U ovom slučaju, CART se koristi da se istaknu nezavisne varijabile koje mogu da imaju suptilne ili interaktivne efekte na post-fermentacione parametre. Rezultati su dobijeni korišćenjem 10-ostruke unakrsne validacije zasnovane na minimiziranju zbira kvadrata grešaka. Zbir kvadrata je ekvivalentan sa najmanjim kvadratima linearnih modela. Modeli finalnog stabla su izabrani na osnovu ± 1SE pravila, koje obezbeđuje 2 ključne nezavisne varijabile za razdvajanje.

PRIMER 3: Ukupna produkcija gasa i metana

[0170] Ukupna produkcija gasa (TGP) je manja za sve vrste makroalgi u poređenju sa DCS (Slika 1, ANOVA: 72 h, F20,63=14.36, p<0.001). Zelena slatkovodna makroalga Spirogyra (Slika 1a) i morska zelena makroalga Derbesia (Slika 1b) imaju najveći TGP od svih vrsta, produkujući ukupno 119.3 mL.g<-1>OM i 119.7 mL.g<-1>OM, tim redom i ne razlikuju se značajno od DCS (Tabela 2, Tukey’s HSD 72 h, p>0.05). Oedogonium je jedina zelena slatkovodna makroalga koja se značajno razlikuje od DCS (Slika 1a, Tukey’s HSD 72 h, p<0.05), smanjujući TGP za do 20.3% nakon 72 h inkubacije. Cladophora patentiramea ima najmanji TGP od zelenih morskih makroalgi, produkujući ukupno 79.7 mL.g<-1>OM (Slika 1b). Efekat je bio najizraženiji nakon 24 h kada je TGP smanjen za 68.9% u poređenju sa DCS i TGP je značajno smanjen nakon 72 h, (Slika 1b, Tukey’s HSD 72 h, p<0.0001).

[0171] Dictyota je najefikasnija vrsta od smeđih makroalgi, smanjujući TGP na 59.4 mL.g<-1>OM nakon 72 h (Slika 1c), što za rezultat ima značajno manji TGP (53.2%) nego za DCS (Slika 1c, Tukey’s HSD 72 h, p<0.0001). Ovaj efekat je čak veći za 24 h (TGP = 76.7 % manji od DCS). Mada druge smeđe makroalge nisu efikasne kao Dictyota, one ukupno smanjuju TGP za >10%, sa Padina, Cystoseira i Colpomenia koje značajno smanjuju TGP u poređenju sa DCS (Tabela 2, Tukey’s HSD 72 h, p<0.02). Najefikasnija od svih makroalgi je crvena alga Asparagopsis (Slika 1d) sa najmanjim TGP, 48.4 mL.g<-1>OM.

[0172] Mada Asparagopsis ima sličan trend kao Dictyota i C. patentiramea za prvih 48 h, njena efikasnost se održava kroz ceo period inkubacije, produkujući 61.8% manje TGP nego DCS nakon 72 h.

[0173] Produkcija CH4generalno prati isti model kao TGP i značajno je da je produkcija CH4direktno i značajno u korelaciji sa TGP vrednostima (Slika 12). DCS ima najveći učinak CH4, produkujući 18.1 mL.g<-1>OM za 72 h. Svi tretmani makroalgama su, u proseku, manji nego DCS nakon 72 h (Slika 2, ANOVA: 72 h, F20,55= 10.24, p<0.0001). Na sličan način sa TGP, zelena slatkovodna makroalga Spirogyra (Slika 2a) i morska zelena makroalga Derbesia (Slika 2b) imaju najveću produkciju CH4od svih vrsta i u grupi su sa DCS (Tabela 2, Tukey’s HSD 72 h, p>0.05). Asparagopsis, Dictyota i C. patentiramea takođe imaju najizraženiji efekat na smanjenje produkcije CH4in vitro. C. patentiramea ima učinak CH4od 6.1 mL.g<-1>OM (Tabela 1) i produkuje 66.3% manje CH4nego DCS (Slika 2b, Tukey’s HSD 72 h,

4

p<0.0001). Dictyota produkuje 1.4 mL.g<-1>OM i najefikasnija je od smeđih makroalgi, smanjujući učinak CH4za 92% (Slika 2c, Tabela 2, Tukey’s HSD 72 h, p<0.001) i koncentraciju CH4u okviru TGP, 23.4 mL.L<-1>, za 83.5% u poređenju sa DCS (Tabela 2).

[0174] Asparagopsis ima najmanji učinak CH4od svih vrsta makroalgi produkujući maksimum od 0.2 mL.g<-1>OM kroz ceo period inkubacije (Tabela 2, Tukey’s HSD 72 h, p<0.001). To je smanjenje od 98.9% učinka CH4u poređenju sa DCS (Slika 2d), nezavisno od vremena. Značajno je da Asparagopsis takođe ima najnižu koncentraciju CH4u okviru TGP produkujući samo 4.3 mL.L<-1>CH4po litru TGP nakon 72 h, što je čini posebnom od svih drugih vrsta (Tabela 2).

Drugi post-fermentacioni parametri

[0175] Postoje značajni efekti makroalgi na produkciju VFA između vrsta (ANOVA: 72 h, F20, 60=2.01, p=0.02). Spirogyra produkuje 36.59 mmol.L<-1>VFA, što je najveća ukupna produkcija VFA od svih vrsta i 31.6% više nego DCS. Oedogonium, C. vagabunda, Caulerpa, Chaetomorpha, Ulva sp., Sargassum i Hypnea takođe produkuju 2.3% do 20.4% više VFA nego kontrolni DCS (Tabela 2). Dictyota i Asparagopsis imaju najmanju ukupnu produkciju VFA. Smanjenje ukupnih VFA je posledica uticaja inhibicije produkcije acetata (C2) što dovodi do smanjenja C2:C3 odnosa. Asparagopsis ima najmanji C2:C3 odnos, 0.92, a zatim Dictyota sa skoro dvostruko većom vrednošću, 1.73 (Tabela 2).

[0176] Produkcija amonijaka (NH3) značajno varira između vrsta (ANOVA: 72 h, F20,63= 3.37, p<0.0001). DCS ima najveću koncentraciju NH3od 9.5 mg N.L<-1>, dok Asparagopsis i Hypnea imaju najmanju koncentraciju NH3od 6.7 mg N.L<-1>. Mada vidljiva razgradljivost organske materije (OMd) varira od minimum 58% za Dictyota to maksimum 64% za DCS, ova razlika nije značajna (p>0.05). Slično tome, pH varira od minimum 6.85 za Spirogyra do maksimum 7.13 za Dictyota (Tabela 2), ova razlika nije značajna i sve vrednosti su u opsegu potrebnom da se maksmizira varenje vlakana za preživare.

Biohemijski i post-fermentacioni parametri

[0177] MDS bi-plot između biohemijskih parametara i post-fermentacionih parametara nakon 72 h pokazuje da su Oedogonium i Derbesia usko grupisane sa DCS, a ovo grupisanje je najsličnije sa C. vagabunda, C. coelothrix, Asparagopsis i Spirogyra (Slika 3a).

Biohemijski parametri sa najvećom korelacijom sa MDS prostorom su pepeo, C, GE i H i oni čine najvažnije parametre u diferencijaciji algi (Tabela 1). Vrste smeštene u vrhu desnog ugla MDS bi-plot (Slika 3a) su u pozitivnoj korelaciji sa elementima C, N, H i GE, ukupnim masnim kiselinama, polinezasićenim masnim kiselinama (PUFA) i C:16 (Slika 3b). Najveći broj smeđih makroalgi je grupisan zajedno u vrhu levog ugla MDS plot (Slika 3a) sa Padina, Colpomenia i Sargassum koje imaju najveće koncentracije stroncijuma od >1.5 g.kg<-1>DM (Tabela 1). Vrste sa većom produkcijom TGP i CH4su grupisane na levoj strani MDS bi-plot (grupa pune linije, Slika 3a). Međutim, vrste sa malom produkcijom TGP i CH4su rasprostranjene preko bi-plot (grupa isprekidane linije, Slika 3a), ukazujući da ove varijabile nisu u jakoj korelaciji sa bilo kojom od glavnih biohemijskih varijabila koje utiču na širenje vrsta u okviru MDS (r < 0.19 i 0.42, tim redom; Slika 3a). Slično tome, drugi postfermentacioni parametri nisu u jakoj korelciji sa bilo kojim biohemijskim parametrom u MDS bi-plot (Slika 4b, Tabela 2).

[0178] Multivarijantni CART model je izrađen za ispitivanje direktnog efekta biohemijskih parametara na glavne parametre fermentacije, TGP, produkciju CH4, koncentraciju acetata i propionata (Slika 4). Najbolji model stabla, koji objašnjava 79.1% varijabilnosti u rezultatima, pokazuje da je cink nezavisna varijabila sa najvećim relativnim značajem (100%), odvajajući Asparagopsis i Dictyota, koji imaju koncentraciju cinka ≥ 0.099 g. kg<-1>DM, od preostalih vrsta (Tabela 1). Ove dve vrste imaju najmanji TGP i produkciju CH4i najveći odnos propionata. Međutim, Halymenia ima sličnu koncentraciju cinka, 0.099 g.kg<-1>DM i najveći učinak TGP i CH4od bilo koje vrste crvenih i smeđih makroalgi (Tabela 1). Ovo ukazuje da je prag cinka u interakciji sa drugim biohemijskim varijabilama, posebno za Asparagopsis i/ili Dictyota, što utiče na ove parametre fermentacije. Nedostatak linearnog odnosa je takođe potvrđen malom korelacijom cinka sa MDS prostorom (r = 0.21). Za vrste sa koncentracijom cinka < 0.099 g.kg<-1>DM, razlike u koncentraciji polinezasićenih masnih kiselina (PUFA) generisanih drugim odvajanjem, ukazuju da vrste sa PUFA > 12.64 g.kg<-1>DM imaju veću produkciju CH4nego vrste sa koncentracijom PUFA ispod ove vrednosti. Međutim, PUFA ima relativno značajnih 14.8% cinka što ukazuje da je mali uticaj PUFA u modelu.

PRIMER 4: Primena Asparagopsis-a za smanjenje produkcije metana in vivo.

[0179] Četiri kanulirana bika (Bos indicus, 320 do 380 Kg telesne težine) su korišćena za in vivo ispitivanje ishrane sprovodene u Lansdown istraživačkoj stanici, CSIRO. Sve životinje su kanulirane i prilagođene u respiratornim komorama pre početka eksperimentalnog perioda. Inicijalno su bikovi držani na senu od Flinders trave, u zajedničkoj štali (dvorište za stoku) u toku četiri dana. Nakon toga su bikovi podeljeni u dve grupe i izdvojeni u grupe za tretman, kontrolnu grupu (samo seno do Flinders trave) i grupu sa Asparagopsis kao dodatkom hrane. Određivanje doze alge (2% od unete OM po danu) je zasnovano na rezultatima dobijenim iz prethodnih in vitro studija ispitivanja potencijalnog smanjenja metana. Bikovi su izdvojeni u pojedinačne štale u istraživačkoj stanici sa neograničenim pristupom senu od Flinders trave i vodi. Životinje tretirane sa suplementom algi su dozirane direktno u burag pre jutarnjeg obroka da se osigura potpuni unos morske alge za tretman i konzistentnost uzimanja alge za tretman između životinja. Bikovi su imali period prilagođavanja od 14 dana na različitu ishranu pre ulaska u otvorene respiratorne komore za merenje produkcije metana u toku 48 h. Produkcija metana životinja se takođe meri nakon 21 i 29 dana tretmana za procenu efikasnosti Asparagopsis-a u smanjivanju produkcije metana u životinjama u toku vremena. Nakon 31 dan zaustavlja se tretman algama i životinje se vraćaju u ograđene pašnjake. Uzorci buraga se uzimaju 4 h nakon intra-ruminalnog unosa algi za tretman na dan 1, 15 i 30 tretmana algama za procenu promena u produkciji VFA i odnosima acetata i propionata. Telesna težina i ponuđena hrana i preostala hrana se mere dnevno a unos ukune suve materije (DM) i unos ukupne organske materije (OM) se izračunava da se odredi prosečan pojedinačni unos DM i OM. Rezultati su pokazani na Slikama 14, 15, 16 i 17 i Tabeli 9. U svakoj testiranoj vremenskoj tački, prosečna produkcija metana je smanjena za preko 10%. Za dane 15-18, prosečna produkcija metana u govedu je smanjena za preko 15%.

[0180] Pokazano je da primena Asparagopsis spp. smanjuje produkciju metana in vivo u životinjama (Slika 14). Slika 15 pokazuje prosečnu produkciju metana za bikove koji najbolje reaguju na tretman algama. Važno je, kako je pokazano na Slici 16, da Asparagopsis ne smanjuje razgradnju suve materije in vivo u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju produkciju metana in vivo. Osim toga, kako je pokazano na Slici 17, Asparagopsis ne smanjuje količinu VFAa u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju produkciju metana in vivo. Međutim, ova slika takođe pokazuje da Asparagopsis povećava količinu propionata u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju ukupnu produkciju gasa i metana za 15 i 30 dana tretmana.

PRIMER 5: Primena Asparagopsis-a za smanjenje produkcije metana in vivo kod ovaca.

Metodologija

[0181] Ispitivanje je izvedeno u CSIRO Centre for Environment i Life Sciences Floreat WA između septembra i decembra 2014. Eksperimentalni protokol je odobren od lokalnog etičkog komiteta za životinje (AEC1404).

[0182] Dvadeset i četiri merino uškropljena ovna [prosek ± sem žive vage (LW); 65.8 ± 1.03 kg] su podeljena u jednu od pet grupa na osnovu dnevne brzine inkluzije (organska materija, OM baza) crvene makroalge Asparagopsis sp. (Asparagopsis taxiformis) [0 (kontrola), 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 %]. Brzine inkluzije (% unete OM) su ekvivalentne sa 0, 13, 26, 58 i 80 g/d unosa alge, tim redom.

[0183] Ovnovi su držani pod uslovima smeštaja za životinje i hranjeni peletiranom komercijalnom hranom za ovce na bazi lupina, zobi, ječma, pšenice sa slamom žitarica kao sirovom komponentom [hemijska kompozicija (g/kg DM) pepeo, 72; sirovi protein (CP) 112; prirodna deterdžentna vlakna (aNDFom) 519; kisela deterdžentna vlakna (ADFom) 338 i bez kobalta, selena i modifikatora buraga] uz održavanje 1.2 X u toku studije. Svim ovnovima je pre početka eksperimentalnog perioda dat Co bullet.

[0184] Biomasa divlje Asparagopsis taxiformis u fazi bentičnog gametofita je sakupljena na mestu blizu Humpy Island, Keppel Bay (23° 13’S, 150° 54.8’E) na Capricorn Coast. Biomasa se inicijalno suši vazduhom na ventiliranim policama u hladu a nakon toga se suši u solarnim pećima (45-50°C) do konstantne težine. Osušena biomasa se nakon toga pakuje u lotove od približno 1 kg i šalje u CSIRO Floreat. Mali uzorak svake serije algi se uzima za elementarnu i nutricionu analizu. Preostala biomasa algi se melje kroz sito promera 5 mm i ponovo pakuje pre uključivanja u dnevni obrok. Ovnovi su postepeno prilagođeni na unošenje algi u toku početne dve nedelje mešanjem usitnjenog materijala sa 200g izmrvljenih lupina (lupin hrana). Smeša alge/lupin se nakon toga doda u peletirani obrok, meša i daje kao hrana narednih 75 dana.

[0185] Unos hrane se beleži svakoga dana a telesna težina (LW) se meri u intervalima od 14 dana u toku ispitivanja.

[0186] Izvedena su tri merenja produkcije metana u pojedinačnim životinjama (g/kg DM unos), prvo nakon 30 dana unosa algi a nakon toga u intervalima od 21 dan u toku perioda ispitivanja. U toku 24 h merenja metana upotrebom otvorenih respiratornih komora kako su opisali Li (2013) [PhD thesis; Eremophila glabra reduced metan production in sheep, University of Western Australia] ponuđena hrana (pelete/lupini) je proporcionalno smanjivana do 1.0 X održavanja da se osigura konzistentno uzimanje hrane.

[0187] Nakon svakog merenja metana, stomačnom sondom se uzima do 50 mL tečnosti buraga za određivanje koncentracije isparljivih masnih kiselina (VFA).

Statistička analiza

[0188] Statistička analiza je izvedena uklapanjem linearnih mešovitih modela za svaki odgovor varijabile. Ovi modeli su sposobni da objasne sklop eksperimenta (raspored životinja u određene grupe), strukturu rezultata (ponovljena merenja) i nedostajuće vrednosti koje su se dogodile. "Fiskni efekti" u mešovitom modelu se sastoje od efekta tretmana (pet nivoa uključivanja Asparagopsis taxiformis), efekta vremena (tri datuma uzimanja uzoraka), interakcije tretmana i vremena i bilo koje kovarijante. Početna telesna težina je uključena kao kovarijanta kada se ispituje telesna težina. Težina se takođe testira kao potencijalna kovarijanta za druge odgovore varijabila, ali nije značajna, pa zbog toga nije uključena u finalni model.

[0189] Analize su dale značenja za sve kombinacije tretmana i vremena, prilagođeno svim ostalim terminima u modelu. P-vrednosti su izračunate za testiranje ukupnog efekta vremena, tretmana i njihovih inteakcija. Najmanje značajne razlike (P= 0.05) su izračunate za poređenje parova značenja.

Rezultati

[0190] Biomasa izvornih Asparagopsis taxiformis u fazi bentičnog gametofita je sakupljena na mestu blizu Humpy Island, Keppel Bay i sadrži približno 0.22 mg/g DM halogenizovanih metabolita, uglavnom: 57% dibromsirćetne kiseline; 26% bromooblika; i 17% dibromohlormetana.

[0191] Ovce su hranjene sporim uvođenjem Asparagopsis-a (< 2.0 %) i utrošile su sve alge na dnevnoj bazi kada su izmešane sa ukusnom podlogom. Veće doze Asparagopsis-a su generalno dovele do stvarnog unosa materijala samlevenih algi od približno 30 g/dan po ovci.

[0192] Kako je pokazano u Tabeli 10, uključivanje Asparagopsis-a u hranu ne smanjuje razgradnju suve materije in vivo u ovcama, uključujući doze Asparagopsis-a koje inhibiraju produkciju metana in vivo. Prosečan (± sem) dnevni unos DM za sve grupe je 1040 ± 11.2 g/d u toku 75 dana. Ovce koje su dobijale Asparagopsis u nivou 0.5% su uzimale približno 20 g/d više nego kontrolne životinje (0% Asparagopsis). Ovce koje su dobijale Asparagopsis u nivou 3% su uzimale približno 20 g/d manje nego kontrolne životinje (0% Asparagopsis) (Tabela 10). Mada postoje numeričke razlike između tretmana, ni efekat tretmana (doza algi) niti efekat tretmana x vreme nije značajan (P>0.05). Dodavanje merino uškropljenim ovnovima povećanih vrednosti Asparagopsis od 0 do 3% (na bazi OM) nije uticalo na prosečan dnevni unos DM. Ovi rezultati pokazuju da uključivanje Asparagopsis-a u hranu održava količinu razgrađene suve materije. Ovi rezultati takođe pokazuju da uključivanje Asparagopsis-a u hranu ne kompromituje fermentaciju buraga.

[0193] Kako je pokazano u Tabeli 10, uključivanje Asparagopsis-a u hranu ne utiče na telesnu težinu ovaca, uključujući doze Asparagopsis-a koje inhibiraju produkciju metana in vivo. Prosek ± sem žive vage (LW) je bio 65.8 ± 1.03 kg pre raspoređivanja u jednu od pet grupa na bazi dnevnog nivoa unosa Asparagopsis sp. Po završetku ispitivanja prosek ± sem žive vage (LW) je bio 71.4 ± 0.99 kg; kako je pokazano u Tabeli 10, ni efekat tretmana (doza algi) niti efekat tretmana x vreme nije značajan (P>0.05). Dodavanje merino uškropljenim ovnovima povećanih vrednosti Asparagopsis od 0 do 3% (na bazi OM) nije uticalo na telesnu težinu životinje. Ovi rezultati pokazuju da uključivanje Asparagopsis-a u hranu ne utiče na telesnu težinu životinje. Ovi rezultati takođe pokazuju da uključivanje Asparagopsis-a u hranu ne kompromituje fermentaciju buraga.

[0194] Kako je pokazano u Tabeli 11, uključivanje Asparagopsis-a u hranu utiče na koncentraciju ukupne VFA i molarne odnose pojedinačnih VFA, izuzev izo-butirata, kod ovaca. Koncentracija ukupnih VFA i molarne proporcije masnih kiselina kratkog lanca su pokazani u Tabeli 11. Efekat ukupnog tretmana je od velikog značaja (P < 0.001) za ukupnu koncentraciju VFA i molarne proporcije pojedinačnih VFA, izuzev izo-butirata. Za razliku od rada sa govedima kako je prethodno opisano, gde su goveda dobijala hranu ad libitum, zbog merenja produkcije metana i VFA u toku 24 sata, ovcama je bila ograničena ishrana da bi se osigurao konzistentan unos hrane i sa uključivanjem Asparagopsis-a u hranu, a ne da se primeni u burag kanuliranih životinja (Primer 4). Bez ograničenja teorijom, ove razlike mogu da se pripišu uočenim razlikama u vrednostima ukupnih VFA. Fermentacija u ovcama nije kompromitovana, a telesna težina nije značajno različita između kontrolnih i tretiranih grupa, kako je pokazano u Tabeli 10.

[0195] Povećanje udela uključenog Asparagopsis-a na dnevnom nivou dovodi do smanjenja acetata (%) i povećanja propionata (%) u poređenju sa kontrolom; ukupna koncentracija VFA i molarni odnos acetata je značajno veći za kontrolni tretman (0%) u poređenju sa vrednostima povezanim sa uključivanjem Asparagopsis-a na dnevnom nivou, prosečna

4

molarna proporcija propionata je značajno veća našta ukazuje alternativno smanjenje vodonika u buragu kada se Asparagopsis uključi na dnevnom nivou u poređenju sa vrednostima povezanim sa kontrolnom grupom. Važno je da ovi rezultati ukazuju da uvođenje Asparagopsis-a u hranu ne utiče negativno na molarnu koncentraciju propionata. Uvođenje Asparagopsis-a u hranu povećava količinu propionata u dozama Asparagopsis-a koje inhibiraju produkciju metana in vivo.

[0196] Uključivanje Asparagopsis-a u hranu takođe značajno smanjuje prosečan odnos acetat:propionat; prosečan odnos acetat:propionat je značajno veći za kontrolu u poređenju sa grupama tretiranim Asparagopsis-om. Nema značajne razlike u odnosu acetat:propionat između grupa tretiranih Asparagopsis-om. Ovce koje su dobijale 1.0% ili 3.0% Asparagopsis (na bazi OM) su imale numerički niži odnos acetat:propionat, što odgovara većoj molarnoj proporciji propionata (31.5 % i 32 %, tim redom). Ovi rezultati pokazuju da uvođenje Asparagopsis-a u hranu održava efektivne vrednosti željenih isparljivih masnih kiselina.

[0197] Kako je pokazano na Slici 18, uključivanje Asparagopsis-a u hranu takođe značajno smanjuje produkciju metana od strane ovaca. Pojedinačne emisije metana (g/kg unosa DM) su merene nakon početnog perioda od 30 dana unosa algi u hranu a nakon toga u intervalima od 21 dan u toku eksperimentalnog perioda (Slika 18). Uključivanje Asparagopsis-a u ishranu ima značajan efekat (P < 0.001) na produkciju metana u poređenju sa kontrolom. Prosečna produkcija metana kod kontrolnih (0% Asparagopsis) ovaca je 14.6 g/kg unosa DM, u poređenju sa 12.8, 6.8, 5.7 i 2.9 g/kg unosa DM za ovce kojima je davan Asparagopsis uz nivo uključivanja od 0.5, 1.0, 2.0 i 3.0 % (na bazi OM), tim redom. Nema značajne razlike (P>0.05) u emisiji metana za kontrolu i kada je Asparagopsis uključen u količini od 0.5 % (na bazi OM). Nema značajne razlike (P>0.05) u emisiji metana pri unosu Asparagopsis-a od 1.0% u poređenju sa emisijom metana uz uvođenje Asparagopsis-a od 2.0 % (na bazi OM).

[0198] Nivo uvođenja Asparagopsis-a u hranu od 1.0 %, 2.0 % i 3.0 % (na bazi OM) pokazuje konzistentno smanjenje emisije metana u svakoj vremenskoj tački u poređenju sa kontrolom, ekvivalentno sa 53 %, 62% i 80 %, tim redom. Kod ovaca, vreme uvođenja Asparagopsis-a nema značajan efekat na prosečnu produkciju metana, mada nakon 72 dana od uvođenja, emisija se smanjuje u proseku za 0.5%, numerički za 35% u poređenju sa 30 dana i 51 dan.

[0199] Ovi rezultati pokazuju da primena Asparagopsis-a na ovcama smanjuje produkciju metana.

[0200] Marine i Aquaculture Research Facility Unit, Macroalgal Biofuels i Bioproducts Research Group, James Cook University (19.33°S; 146.76°E); B Good Fortune Bay Fisheries, barramundi farm (19.36°S; 146.70°E); C Pacific Reef Fisheries, Tiger prawn farm (19.58°S, 147.40°E); D Nelly Bay, intertidalna zona koralnog grebena koji se nalazi na Magnetic Island (19.16°S; 146.85°E), E Rowes Bay, intertidalna zona koralnog grebena koji se nalazi na Townsville (19.23°S, 146.79°E).

[0201] Parametri su izračunati u g.kg<-1>DM, ukoliko nije drugačije navedeno; FW:DW, odnos težina sveže i suve materije; DM, suva materija; OM, organska materija; CP, sirovi protein (faktori azota od 5.13, 5.38 i 4.59 za zelene, smeđe i crveme makroalge, tim redom [Bach SJ, Wang Y, McAllister TA (2008) Effect of feeding sun-dried seaweed (Ascophyllum nodosum) on fecal shedding of Escherichia coli O157:H7 by feedlot cattle i on growth performance of lambs. Animal Feed Science i Technology 142: 17-32] i 6.25 za seme pamuka i seno Flinders trave); TL, ukupni lipidi; GE, bruto energija; (n = 2).

4

[0202] Parametri su izračunati u mg.kg<-1>DM; (n = 2-5); * elementi koji su toksični ili nepotrebni za goveda; ^minerali potrebni za goveda; podebljani brojevi su vrlo blisko ili iznad maksimuma prihvatljivih koncentracija za goveda (NRC, 2000);

4

Tabela 5: FAME profil (±SD) vrsta makroalgi samlevenog oljuštenog semena pamuka (DCS) i sena Flinders trave

(nastavlja se)

[0203] Parametri su izračunati u mg.g<-1>DM; (n = 2); ukupne FA, ukupne masne kiseline; PUFA, polinezasićene masne kiseline; MUFA, mononezasićene masne kiseline; SFA; zasićene masne kiseline

Tabela 8. Prosečna produkcija isparljive masne kiseline kratkog lanca nakon 72 h inkubacije in vitro.

Tabela 9. Prosečna telesna težina, unos suve materije (DMI), nivo doze i produkcija metana (na bazi DMI) za Brahman volove dozirane intra-ruminalno sa crvenim makroalgama (±SD).

Tabela 10. Prosečan unos hranljive mase (DM) u toku 75 d i svaki eksperimentalni period za ovce hranjene peletiranom hranom sa i bez dodatka Asparagopsis-a uz različite vrednosti unosa.

1

<1>Prosečne pokazane vrednosti su izvedeni proseci za tri uzorkovanja u intervalima od približino 21 dan u toku eksperimentalnog perioda;

<2>Samo glavni efekti;

<3>Acetat : propionat

2

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Ne-terapeutski postupak za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana u preživarima naznačen time što uključuje efektivnu količinu najmanje jedne vrste crvenih morksih makroalgi za primenu na navedenim preživarima, pri čemu je navedena vrsta crvenih morskih makroalgi Asparagopsis vrsta.

2. Ne-terapeutski postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je vrsta Asparagopsis-a A. taxiformis ili A. armata.

3. Ne-terapeutski postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se navedena efektivna količina najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi primenjuje na navedenom preživaru dodavanjem u hranu namenjenu toj životinji navedene efektivne količine najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi.

4. Ne-terapeutski postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se održavaju efektivne vrednosti traženih isparljivih masnih kiselina.

5. Ne-terapetuski postupak u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačen time što je smanjen odnos acetata i propionata.

6. Ne-terapeutski postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se održava nivo razgrađene organske materije i/ili suve materije.

7. Ne-terapeutski postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi primenjuje u dozi od najmanje 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 ili 0.067% organske materije primenjene na preživaru.

8. Ne-terapeutski postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je produkcija metana u preživaru smanjena za najmanje 11% u odnosu na količinu produkovanog metana u preživarima na kojima je primenjeno oljušteno seme pamuka.

9. Ne-terapeutski postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je produkcija metana u preživaru smanjena za najmanje 53% u odnosu na količinu produkovanog metana u preživaru na kome se primenjuje lupin ishrana.

10. Ne-terapeutski postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je navedeni preživar izabran od članova Ruminantia i Tylopoda podgrupe.

11. Ne-terapeutski postupak u skladu sa patentnim zahtevom 10, naznačen time što je preživar govedo ili ovca.

12. Ne-terapeutski postupak u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačen time što je preživar govedo.

13. Ne-terapeutski postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što postupak dalje uključuje primenu na navedenom preživaru efektivne količine najmanje jedne vrste makroalgi izabrane iz grupe koja se sastoji od Dictyota spp (na primer Dictyota bartayresii), Oedogonium spp, Ulva spp i C. patentiramea.

14. Ne-terapeutska upotreba dodatka hrani za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije metana u preživaru, pri čemu dodatak uključuje efektivnu količinu najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi, naznačeno time što je navedena vrsta crenih morskih makroalgi Asparagopsis vrsta.

15. Ne-terapeutska upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačena time što je vrsta Asparagopsis A.taxiformis ili A.armata.

16. Ne-terapeutska upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 14 ili 15, naznačena time što dodatak dalje uključuje efektivnu količinu najmanje jedne vrste makroalgi izabranih iz grupe koja se sastoji od Dictyota spp (na primer Dictyota bartayresii), Oedogonium spp, Ulva spp i C. patentiramea.

17. Ne-terapeutska upotreba hrane za preživare za smanjenje produkcije metana u preživaru,

4

naznačena time što je hrana obogaćena dodatkom hrani u skladu sa ne-terapeutskom upotrebom iz bilo kog od patentnih zahteva 14-16.

18. Ne-terapeutski postupak za smanjenje produkcije metana u preživaru, naznačen time što se postupak koji uključuje taj dodatak hrani u skladu sa ne-terapeutskom upotrebom prema jednom od patentnih zahteva 14-16 ili hrani u skladu sa ne-terapeutskom upotrebom prema zahtevu 17, primenjuje na toj životinji.

19. Ne-terapeutska upotreba najmanje jedne vrste crvenih morskih makroalgi za smanjenje ukupne produkcije gasa i/ili produkcije meteana u preživaru, naznačena time što je najmanje jedna vrsta crvenih morksih makroalgi Asparagopsis vrsta i pri čemu je najmanje jedna vrsta crvenih morskih makroalgi u obliku u kome sekundarni metaboliti ostaju efektivni.